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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE E DA QUALIDADE DAS ÁGUAS DO AÇUDE DE LUCRÉCIA/RN.

Alexandre Endres Marcon

Natal/RN

2011





Alexandre Endres Marcon

Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte - Centro de Ciências da Saúde para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

ORIENTADORA: Profa. Dra. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros.

Natal/RN

2011

CATALOGAÇÃO NA FONTE

M321a

Marcon, Alexandre Endres.

Avaliação da genotoxicidade e da qualidade das águas do açude

de Lucrécia/RN / Alexandre Endres Marcon. – Natal, 2011.

178p.:il.

Orientadora: Profª Drª Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros.

Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências da

Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio

Grande do Norte.

1. Água superficial – tese. 2. Micronúcleos e Alterações

nucleares - testes – tese. 3. Biomonitoramento – tese. 4.

Genotoxicidade – tese. 5. Oreochromius niloticus – tese. 6. Humano

– tese. 7. Cianobactéria – tese. 8. Metais – tese. 9. Radioatividade -

tese. I. Medeiros, Sílvia Regina Batistuzzo de. II. Título.

RN-UF/BS-CCS CDU: 543.31:628.113(813.2(043.2)

iii





Coordenadora do Curso de Pós-Graduação:

Profa. Dra. Técia Maria de Oliveira Maranhão

iv


Presidente da Banca: Prof. Dra. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros.

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________

Prof. Dra. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros

(PPgCSA/CS/UFRN – Orientadora)

______________________________________________

Profa. Dra. Maria Aparecida Marin Morales

(PPgBCM/IB/UNESP – Examinadora Externa à Instituição)

______________________________________________

Prof. Dra. Renata de Fátima Panosso

(PPgE/CB/UFRN – Examinadora Externa ao Programa)

______________________________________________

Profa. Dra. Vera Maria Ferrão Vargas

(FEPAM/RS – Examinadora Externa à Instituição)

______________________________________________

Profa. Dra. Viviane Souza do Amaral

(PPgGBM/CB/UFRN – Examinadora Externa ao Programa)

v

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho em especial a minha esposa Paula Stein, aos meus avôs

maternos Ernesto Endres e Idê Becker Endres e aos paternos Henrique Marcon e

Leoncina Vargas da Silveira, e a minha mãe Nina Rosa Becker Endres pelo apoio,

incentivo e ajuda durante mais esta importante etapa da minha vida.

vi

AGRADECIMENTOS

A Profa. Dra. Silvia Batistuzzo de Medeiros pela orientação no doutorado;

Ao Dr. Erivan Sales do Amaral e ao Douglisnilson Ferreira do Lab. de Recursos

Naturais/IFRN pelas avaliações de metais nas amostras de água;

A Profa. Dra. Maria de Fátima de Moura e a bolsista Ângela Fagundes do Depto.

de Química/UFRN pela avaliação de metais nos dos peixes;

Ao Dr. Henrique Takuji Fukuma do Lab. de Poços de Caldas/CNEN pelas

quantificações de radiação alfa e beta total nas amostras de água;

A Profa. Dra. Ivaneide Soares do Depto. de Microbiologia e Parasitologia/UFRN

pelas análises de densidade de cianobactérias;

Ao Prof. Dr. Thomas Campos do Depto. Geologia/UFRN pela ajuda

A Profa. Dra. Viviane Souza do Amaral pelas contribuições ao trabalho;

A Profa. Dra. Lucymara Agnez-Lima pela colaboração na pesquisa;

A Prefeitura de Lucrécia pela colaboração e apoio durante as coletas;

A mestranda Anuska Fagundes Garcia pelas pesquisas na área de estudo;

Ao bolsista Daniel Andrade pelo apoio nas coletas;

Aos colegas do LAMA/UFRN pelo incentivo ao estudo;

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde/UFRN pelo apoio a

pesquisa e

Ao Banco do Nordeste e ao CT-Hidro/CNPq pelo suporte financeiro e pela bolsa

de doutorado.

vii

EPÍGRAFE

Se tens que lidar com água, consulta primeiro a experiência, depois a razão.

Leonardo da Vinci

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Mapa de localização do açude de Lucrécia na região do médio

oeste do Rio Grande do Norte. 9

Figura 2 Mapa da bacia hidrográfica Apodi-Mossoró na região do médio

oeste Potiguar, na qual estão inseridos a sub-bacia do Umari e

o açude de Lucrécia (círculo vermelho). Fonte: SEMARH/RN. 10

Figura 3 Mapa Geológico simplificado do açude de Lucrécia na micro-

região de Umarizal (RN). Modificado de Araújo (1995):

Mapeamento Geológico da região de Lucrécia/RN. 11

Figura 4 Dados pluviométricos da série histórica (1961 a 2009) do posto

de Patu/RN. 12

Figura 5 Imagens de satélite ®LandSat do açude de Lucrécia e região

durante as estações secas em agosto de 1989 e 2001 Fonte:

Serra et al. (2006). 13

Figura 6 Imagem de satélite em três dimensões (3D) do açude de

Lucrécia demonstrando a inserção dos principais afluentes do

reservatório no relevo acentuado da região. Fonte: Serra et al.

(2006). 14

Figura 7 Células de mucosa oral dos doadores de Lucrécia de núcleo

normal (A), micronucleado (B), binucleado (C), com brotamento

nuclear (D), cariolíse (E), piquinólise (F) e fragmentado (G). A=

400X. Fotos: Marcon, A. E. 52

ix

Figura 8 Eritrócitos branquiais de peixes (O. niloticus) do açude de

Lucrécia de núcleo normal (A), micronucleado (B) e com

brotamento nuclear (C). A= 2500X. Fotos: Marcon, A. E.

52

Artigo 1

Figura 1 Location of the Lucrécia dam study area in the western region of

Rio Grande do Norte – Brazil. 56

Artigo 2

Figura 1 Mapa Geológico simplificado da região de Lucrécia na micro-

região Umarizal (RN). Modificado de Araújo (1995).

Mapeamento Geológico da região de Lucrécia. 70

Figura 2 Distribuição geográfica (isolinha) do background da

concentração média de radiação gama (cpm) detectada em

ambos os períodos analisados (chuvoso/2009 e seco/2010) no

município de Lucrécia (A) e em detalhe (µR h-1) na área urbana

(B). 84

x

LISTA DE TABELAS

Artigo 1

Tabela 1 Cyanobacteria density (cells mL-1) of water samples from

different points of the Lucrécia dam. 57

Tabela 2 Concentrations (mgL-1) of the metals assessed in the water

samples from different points at the Lucrécia dam. 59

Tabela 3 Concentrations of total alpha and beta radiation in water

samples from different points of the Lucrécia dam. 59

Tabela 4 Concentration of Cd, Cr, Cu, Fe, Ni, Pb and Zn assessed in the

biological samples of gills and liver (in natura) with the

respective weights (g) of the fish (O. niloticus) from the Lucrécia

dam. 60

Tabela 5 Frequency of micronucleus and nuclear abnormalities in the gill

erythrocyte cells of fish (O. niloticus), collected at the Lucrécia

dam. 61

Artigo 2

Tabela 1 Densidade de cianobactéria (cells mL-1) das amostras de água

de abastecimento de Lucrécia. 74

Tabela 2 Concentração (mg L-1) dos metais avaliados nas amostras de

água de abastecimento de Lucrécia e Natal, e controle negativo. 77

xi

Tabela 3 Concentrações de radiação alfa e beta total (Bq L-1) nas

amostras de água de abastecimento de Lucrécia e Natal, e o

Controle negativo. 80

Tabela 4 Variação, média e desvio padrão da concentração do gás Rn-

222 (Bq m-3) nas habitações (in door) da área urbana do

município de Lucrécia. 82

Tabela 5 Características gerais dos doadores de mucosa oral humana da

área de estudo de Lucrécia (N=48) e do grupo controle em

Natal (N=49). 85

Tabela 6 Freqüência média de micronúcleos e alterações nucleares (‰)

analisados em células de mucosa oral humana de Lucrécia e

Natal (grupo controle). 85

xii

LISTA DE SIGLAS

ANOVA Análise de Variação

APHA American Public Health Association

CAERN Companhia de Água e Esgotos do Rio Grande do Norte

DL50 50% da Dose Letal

DNA Ácido Desoxi-ribonucléico

EMPARN Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte

EPI Equipamento de Proteção Individual

RNS Espécies Reativas de Nitrogênio

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

FUNASA Fundação Nacional de Saúde

LCM Limite de Concentração Máxima

LPS Proteína lipopolissacarídica

IFRN Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio

Grande do Norte

INCA Instituto do Câncer do Brasil

I.P. Intraperitonial

MN Micronúcleo

MOA Matéria Orgânica Amorfa

NA Alterações Nucleares

NORM Materiais Radioativos de Ocorrência Natural

NRC U. S. National Research Council

SPD Subproduto de Desinfecção

xiii

STX Saxitoxinas

TENORM Materiais Radioativos de Ocorrência Natural Modificados

Tecnologicamente

TDI Ingestão Diária Tolerável

THM Trihalometanos

UNSCEAR United Nations Scientific Comitte on the Efftect Atomic

Radiation

xiv

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA v

AGRADECIMENTOS vi

EPÍGRAFE vii

LISTA DE FIGURAS viii

LISTA DE TABELAS x

LISTA DE SIGLAS xii

RESUMO xvii

ABSTRACT xviii

1. INTRODUÇÃO 1

1.1. OBJETIVOS 7

1.1.1 Objetivo Principal 7

1.1.2 Objetivos Específicos 7

1.2. CARACTERIZAÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO 8

1.3. CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA 14

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 17

2.1 CIANOBACTÉRIAS 17

2.1.1 Cianotoxinas 20

2.2. METAIS 25

2.2.1 Cádmio 33

xv

2.2.2 Cobre 34

2.2.3 Cromo 35

2.2.4 Níquel 38

2.2.5 Zinco 40

2.2.6 Bioacumulação de metais em peixes 42

2.3. RADIAÇÃO IONIZANTE 44

2.4. BIOINDICADOR AQUÁTICO 46

2.4.1 Peixes 46

2.5. TESTE DE GENOTOXICIDADE 49

2.5.1 Teste de Micronúcleo (MN) 49

2.5.2 Teste de Alteração Nuclear (NA) 51

3. ARTIGOS 53

3.1. ARTIGO 1: GENOTOXIC ANALYSIS IN AQUATIC

ENVIRONMENT UNDER INFLUENCE OF CYANOBACTERIA,

METAL AND RADIOACTIVITY

54

3.2. ARTIGO 2: ANÁLISE DA QUALIDADE DA ÁGUA DE

ABASTECIMENTO E DA GENOTOXICIDADE HUMANA EM

LUCRÉCIA, RIO GRANDE DO NORTE, BRASIL.

64

4. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES 96

5. APÊNDICE 99

5.1 Lista de Publicações em Eventos 99

5.2 Trabalho apresentado na 10th International Conference on

Environmental Mutagens, Florence, Italy: COMET ASSAY IN GILL

ERYTHROCYTES (OREOCHOMIUS NILOTICUS) FOR

xvi

EVALUATION OF GENOTOXICITY IN DAM OF LUCRÉCIA, RIO

GRANDE DO NORTE – BRAZIL.

102

5.3 Artigo da dissertação de mestrado de Anuska Conde Fagundes

Soares Garcia em submissão na Revista internacional Science of

Total Environmental: STUDY ON WATER QUALITY AND

MUTAGENICITY OF A SURFACE WATER FROM A SEMI-ARID

REGION BY MICRONUCLEUS ASSAYS

106

5.4 Capítulo de livro do Prodema sobre meio ambiente e saúde

humana: Açude de Lucrécia como modelo da problemática da

água no semiárido brasileiro: estudos genotóxicos e a relação

entre saúde ambiental e humana.

135

REFERÊNCIAS 161

xvii

RESUMO

A ocorrência de câncer humano na região do município de Lucrécia (RN, Brasil)

tem mostrado freqüências elevadas (INCA, 2007). Foram aplicados testes de

micronúcleos (MN) e alterações nucleares (NA) para avaliar o potencial genotóxico

das águas do açude de Lucrécia, que está localizado numa região semi-árida sob

influência de irrigação agrícola e precipitação irregular. Foram coletadas amostras

de água nesse manancial para análise da concentração de cianobactérias, metais

e radioatividade. Foram coletados eritrócitos de tilápia do Nilo (Oreochromis

niloticus) no manancial e células de mucosa oral humana na área urbana desse

município para os bioensaios de MN e NA. Nos peixes também foram analisadas

as concentrações de metais em amostras de brânquias e fígado. Os testes de

genotoxicidade com amostras biológicas de peixes e humanos mostraram

aumentos significantivos nas freqüências de MN e NA (p ≤ 0,05) e são indicativos

de aumento nos danos ao DNA em relação aos grupos controles. Concluindo, os

resultados obtidos com as amostras de água e biológicas do açude de Lucrécia

indicam a presença de poluentes químicos e microbiológicos, e também aumento

do potencial genotóxico na população humana desse município. Sugerimos a

execução de tratamento hídrico avançado, para prevenir futura degradação desse

ambiente aquático e redução da qualidade de vida. Esta pesquisa de avaliação da

qualidade ambiental foi executada de forma a contemplar uma abordagem multi e

interdisciplinar da característica deste recurso hídrico e os danos genotóxicos que

possam induzir nos organismos desta região em estudo.

Palavras-chave: Água Superificial, Micronúcleo, Alterações Nucleares,

Oreochromius niloticus, População Humana.

xviii

ABSTRACT

The occurrence of human cancer in the municipality of Lucrécia (RN, Brazil) has

shown high frequencies (INCA, 2007). Tests of micronucleus (MN) and nuclear

abnormalities (NA) were performed to assess the genotoxic potential of water from

the Lucrécia dam, which is located in a semi-arid region under the influence of crop

irrigation and irregular rainfall. Water samples were collected in this source for

analyzing the concentration of cyanobacteria, metals and radioactivity.

Erythrocytes of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) were collected in dam and cells

of human oral mucosa in the urban area of this municipality for the bioassays of

MN and NA. In fish were also analyzed concentrations of metals in samples of liver

and gills. The genotoxicity tests with biological samples of fish and humans have

shown significant increases in the frequencies of MN and NA (p ≤ 0.05) and are

indicative of increased DNA damage in relation to the control groups. In conclusion,

the results obtained from water samples and biological municipality of Lucrécia

indicates that the presence of chemical and microbiological pollutants, and

increase of genotoxic in human of this municipality. We suggest the implementation

of advanced water treatment, to prevent further degradation of the aquatic

environment and decrease in the life quality. This research of environmental quality

assessment was performed in order to contemplate a multi and interdisciplinary

character of this water resource and that can induce genotoxic damage in the

organisms in this study region.

Keywords: Superficial Water, Micronucleus, Nuclear abnormalities, Oreochromis

niloticus, Human Population.

Avaliação da Genotoxicidade e da Qualidade das Águas do Açude de Lucrécia/RN.

Alexandre Endres Marcon – PPgCSA/CCS/UFRN 1

1. INTRODUÇÃO

A contaminação dos mananciais por efluentes domésticos e industriais é uma

das principais causas da poluição dos recursos hídricos e degradação ambiental.

O desenvolvimento urbano e o conseqüente adensamento populacional trouxeram

a necessidade de eliminação das águas residuais provenientes das atividades

sócio-econômicas. Inicialmente, estes efluentes ainda são lançados em muitos

países, sob a forma bruta, nos corpos de água (rios, lagos e oceanos) e no solo

através das fossas sépticas e sumidouros. O lançamento in natura acarretou

elevados custos ambientais, sanitários e econômicos; decorrendo no aumento da

mortalidade humana, diminuição da expectativa de vida, acréscimo dos gastos

médicos, deterioração ambiental, flagelo dos ecossistemas e queda da renda

proveniente do turismo numa região poluída, entre muitos outros (Jha, 2004).

O laçamento de esgotos nos reservatórios de abastecimento humano leva a

contaminação das águas por microorganismos patogênicos, ao aumento dos

casos de doenças de vinculação hídrica, a poluição dos mananciais e compromete

seriamente a saúde pública das populações e dos ecossistemas (Soller et al.,

2010). Conforme, o trabalho de revisão de Ohe et al. (2004), na medida em que os

poluentes atingem o meio ambiente aquático, as populações abastecidas por esse

recurso hídrico se tornam vulneráveis aos impactos negativos dessa deterioração,

como o aumento do surgimento de doenças infecciosas e cânceres, como

exemplos.

As regiões semi-áridas do nordeste do Brasil são caracterizadas pela

escassez de recursos hídricos, que é agravada pela precária distribuição de água

e saneamento básico (Amr e Yassin, 2008).



Na região nordeste do Brasil os reservatórios artificiais superficiais

constituem uma importante alternativa de suprimento hídrico público, entretanto,

sofrem com a intensa degradação de suas águas. Trabalhos realizados para

garantir a potabilidade das águas, como os tratamentos hídricos convencionais

com posterior desinfecção com cloro podem ser ineficazes e/ou ainda gerar

subprodutos que também possuem potencial genotóxico, podendo, inclusive

aumentar a toxicidade de alguns poluentes (Tjusi et al., 1997; Komulainem, 2004;

Maffei et al., 2009).

O açude de Lucrécia é um dos principais reservatórios hídricos superficial do

estado do Rio Grande do Norte, e sua água abasteceu, por décadas, a população

humana da microregião de Umarizal/RN, depois de a mesma passar por

tratamento convencional e cloração, que era efetuado pela Companhia de

Abastecimento de Águas e Esgotos do Estado do Rio Grande do Norte (CAERN).

A partir de 2011 a população humana dessa região é abastecida pela CAERN,

através de adutora proveniente da barragem Santa Cruz em Apodi/RN.

Diversos poluentes e misturas químicas, bem como os seus metabólitos,

sendo que muitos ainda não apresentam caracterização química e risco de

exposição bem classificados. Alguns desses poluentes possuem múltiplas ações e

impactos sobre a saúde humana e ambiental, logo a avaliação dos possíveis

impactos negativos e danos causados pela exposição a essas substâncias sobre

os organismos aquáticos são essenciais para o biomonitoramento da qualidade

dos ambientes naturais e dos recursos de uso público (ATSDR, 1990; Van der

Oost et al., 2003; Pohl e Abadin, 2008).

A presença de metais nos recursos hídricos de abastecimento representa

uma significativa fonte de contaminação humana e ambiental. Esses elementos



químicos que são potencialmente genotóxicos e cancerígenos (e.g., cádmio),

passíveis de bioacumulação e biomagnificação, podem elevar os danos oxidativos

nos organismos expostos, acarretando em mutagenicidade ambiental e na

ocorrência de diversas doenças degenerativas nas populações expostas, tais

como, vários tipos de câncer (Halliwell e Gutteridge, 1989; Mena et al., 2008;

Rana, 2008).

Geralmente a presença de concentrações elevadas de metais está

relacionada à redução drástica da qualidade dos recursos hídricos. A sua origem

pode estar associada a causas antrópicas ou naturais (Seoane e Dulout, 2001;

Beyersmann e Hartwig, 2008).

Alguns elementos metálicos radioativos estão naturalmente presentes em

rochas, como por exemplo, os do grupo do urânio (U), do tório (Th), do rádio (Ra),

e do potássio (K), cujos decaimentos radioativos pode gerar, além de emissões

radioativas (e.g., partícula alfa), subprodutos de radiação, como o gás radônio (Rn-

222) que também é genotóxico e passível de acumulação nas águas e na

atmosfera, sendo também emissor de partículas radioativas (ATSDR, 1990; NCR,

1999 e 1998; UNSCEAR, 2000).

Aliado a esses impactos negativos da radiação de fonte natural, o aumento

da carga orgânica e de poluentes advindos de ações antrópicas, como o

lançamento de esgotos nos afluentes do manancial e resíduos oriundos de

incrementos agropecuários, podem favorecer a intensa proliferação de

cianobactérias e o possível aumento da concentração de cianotoxinas nessas

águas (Chellappa e Costa, 2003; Sotero-Santos et al., 2006).

A elevação na biomassa de cianobactérias está diretamente associada à

eutrofização da água, condição que geralmente leva a efeitos negativos para a



biota aquática e das populações consumidoras desses recursos hídricos. Durante

as florações (“blooms”), o teor de cianotoxinas nas águas superficiais pode

aumentar expressivamente, elininar outras comunidades fitoplanctônicas e levar

ao predomínio de poucas ou mesmo uma única espécie de cianobactéria

produtora de toxinas ou metabólitos tóxicos (Fitzgerald et al., 1999).

A ocorrência de cianobactérias em reservatórios hídricos de abastecimento

público, associado à alta capacidade desse tipo de microorganismo se reproduzir

e liberar toxinas intracelulares (cianotoxinas) no ambiente pode afetar a saúde

humana através da ingestão de água e alimentos contaminados (e.g., peixes e

crustáceos), e também pelo contato direto, durante atividades recreacionais.

Contudo, a ingestão da água sem tratamento adequado para a remoção dessas

toxinas ainda é a principal via de intoxicação humana (Fleming et al., 2002;

Sotero-Santo et al., 2006).

Vários trabalhos mostram que a poluição aquática implica em aumento

expressivo da freqüência de câncer na população humana e de mutações nos

organismos expostos, e que conseqüentemente todos os ecossistemas podem ser

afetados em regiões com mananciais poluídos (Nakayama et al., 2010; Mena et

al., 2009; Lemos e Terra, 2003).

A biota desses ambientes degradados pode sofrer danos genéticos, além de

distúrbios na sua síntese protéica, que poderá acarretar disfunções estruturais,

regulatórias, catalíticas e/ou fisiológicas dentro das células dos organismos

expostos e até mesmo o desaparecimento de espécies de uma determinada

população local (Bonassi e Au, 2002; Pellacani et al., 2006; Hernandez et al.,

2009; Lam et al., 2009).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nakayama%20SM%22%5BAuthor%5D



Uma maneira de se estudar os efeitos negativos em populações expostas a

poluentes, é conduzir estudos de biomonitoramento, utilizando, por exemplo,

parâmetros biológicos pertinentes, tais como, ensaios citogenéticos (e.g., teste de

micronúcleo), que podem identificar alterações cromossomais e genéticas

resultantes da exposição a agentes genotóxicos de forma ambiental ou

ocupacional (Fenech et al., 1999).

Porém, os estudos dos danos citotóxicos, genéticos e fisiológicos causados

pela exposição e consumo de águas poluídas ainda é bastante deficiente no

Brasil, tanto no nível das populações humanas quanto de biotas expostas

(Friedberg, 2003).

A espécie exótica de peixe Oreochromis niloticus, conhecida popularmente

por tilápia do Nilo, tem siso muito difundida para estudos de genotoxicidade, tendo

em vista que esta espécie introduzida possui alta mobilidade na coluna de água e

nos mananciais, hábito de alimentação onívora, apresenta acentuada capacidade

de adaptação e amplamente distribuída nas diferentes regiões do mundo (Çavas e

Ergene-Gozukara, 2005).

As avaliações das lesões no núcleo celular são parte da pesquisa

ecogenotoxicidade, visto que as alterações genéticas no DNA são eventos

significativos no processo de carcinogênese e de outras doenças degenerativas.

Muito embora o conhecimento da complexidade dos mecanismos envolvidos na

estrutura cromossômica seja ainda incompleto, vários trabalhos sugerem que as

alterações nucleares (e.g., micronúcleos) são conseqüências e manifestações

diretas de dano ao DNA ou de defeitos no mecanismo de reparo genético (Fenech

et al., 2000; Buccianti et al., 2009).



Os testes de micronúcleo (MN) e de alterações nucleares (NA) são métodos

sensíveis para o biomonitoramento de várias substâncias genotóxicas que podem

estar presentes nos ambientes (Ma, 1979; Fenech et al., 1999).

Vários trabalhos recentes têm utilizado esses bioensaios em diversos

organismos aquáticos bioindicadores (Vargas et al., 2001;Torres de Lemos et al.,

2007; Nakayama et al., 2010) e em humanos para avaliar a genotoxicidade

ambiental (Torres de Lemos et al., 2007; Holland et al., 2008).

Nas últimas décadas o uso de ictiofauna como bioindicadora de

genotoxicidade ambiental e de poluição aquática tem se intensificado em diversos

países (Carrasco et al., 1990; Ferraro et al., 2004; Çavas e Ergene-Gozukara,

2005; Talapatra e Banerjee, 2007).

Além disto, os dados desses bioensaios com peixes têm evidenciado boa

correlação com resultados de genotoxicidade obtidos em células humanas

expostas a mutágenos. A espécie de peixes O. niloticus tem sido utilizada por

muitos cientistas em trabalhos de biomonitoramento hídrico em diferentes regiões

do Brasil (Cestari et al., 2004; Souza e Fontinatti, 2006; Hoshina et al., 2008;

Linde-Arias et al., 2008; Barbosa et al., 2010).

O biomonitoramento de populações humanas expostas à contaminação

hídrica e ambiental também é muito utilizado. Neste sentido, são muito

empregadas para determinação do potencial genotóxico ocupacional e ambiental

as avaliações de dano genético em mucosa oral humana, pois as características

fisiológicas dessas células epiteliais garantem um contato freqüente com

poluentes ingeridos e/ou aspirados (Fenech et al., 1999; Holland et al., 2008).

Considerando que a preservação dos ambientes aquáticos é um fator

limitante para o desenvolvimento sócio-econômico do país, é de fácil constatação




a necessidade de garantir, de maneira segura e confiável, a conservação hídrica

em nossos sistemas de abastecimento público. Mesmo que ainda, no que tange a

qualidade das águas, os principais problemas globais é a falta de síntese,

disseminação e disponibilização de informações sobre os diferentes aspectos

envolvidos com as causas e conseqüências da ocorrência de poluentes (van

Leeuwen et al, 2005).

1.1. OBJETIVOS

1.1.1. Objetivo Principal

O objetivo primordial deste trabalho foi contribuir na determinação do

potencial genotóxico e da qualidade das águas do açude de Lucrécia.

1.1.2. Objetivos Específicos

Determinação das:

Concentrações de Cianobactéria, metais e radioatividade nas amostras de

água;

Concentrações de Metais em materiais biológicos de espécimes de peixes

(brânquias e fígado);

Freqüências de micronúcleos (MN) e alterações nucleares (NA) em

eritrócitos branquiais de peixes (O. niloticus);

Freqüências de micronúcleos (MN) e alterações nucleares (NA) em mucosa

oral humana.



1.2. CARACTERIZAÇÂO DA ÁREA DE ESTUDO

Os estudos foram executados na área urbana e no açude de Lucrécia, que

constitui um dos principais reservatórios hídricos superficiais da região médio

oeste do estado do Rio Grande do Norte e está localizado próximo à fronteira

estadual com a Paraíba, entre os municípios de Lucrécia e Frutuoso Gomes/RN.

Este reservatório público foi construído em 1934 e tem capacidade máxima de

armazenamento de água de 27 milhões de metros cúbicos.

Na Figura 1 pode-se visualizar o mapa de localização da área de estudo,

com a identificação dos pontos de coleta de água:

P1(6o7’6.34’’ S; 37o40’8.31’’ W): localizado próximo à área de antiga

captação de água da CAERN no município de Lucrécia;

P2 (6o8’47.13’’ S; 37o43’54.’5’ ’W): localizado na área de confluência dos

principais afluentes do reservatório hídrico superficial público, no município de

Frutuoso Gomes/RN.



Figura 1. Mapa de localização do açude de Lucrécia na região do médio oeste do

Rio Grande do Norte.

Os afluentes que originam este reservatório público são tributários da sub-

bacia do Umari e integram a bacia hidrográfica Apodi-Mossoró, que é a segunda

maior do estado do RN, com uma área de drenagem de 14.276 km2 (Figura 2).



Figura 2. Mapa da bacia hidrográfica Apodi-Mossoró na região do médio oeste

Potiguar, na qual estão inseridos a sub-bacia do Umari e o açude de Lucrécia

(círculo vermelho). Fonte: SEMARH/RN.

No que tange a geologia da área, o açude de Lucrécia está inserido na

Província Borborema e na micro-região de Umarizal, onde afloram diversas

litologias do embasamento cristalino com ocorrência de vários minerais e metais,

que podem ser emissores de radiações ionizantes (CPRM - Serviço Geológico do

Brasil, 2006) (Figura 3).



Figura 3. Mapa Geológico simplificado da região de Lucrécia na micro-região de

Umarizal (RN). Modificado de Araújo (1995): Mapeamento Geológico da região de

Lucrécia/RN.

O clima na região é tropical continental sub-úmido, com inverno seco e verão

chuvoso, conforme classificação de Köppen, com precipitação pluviométrica média

anual de 1000 mm e temperatura de 28o C (EMPARN).

Conforme os dados de chuva da série histórica (1961 a 2009) do posto

pluviométrico de Patu/RN (EMPARN), posto mais próximo do açude de Lucrécia,

os anos de menor precipitação nessa área foram no período entre 1990 e 2001

(Figura 4).



Figura 4. Dados pluviométricos da série histórica (1961 a 2009) do posto de

Patu/RN (EMPARN).

Esse menor aporte de água para o manancial e as elevadas taxas de

evaporação dessa região Potiguar podem estar colaborando para a redução do

volume de armazenamento hídrico do açude de Lucrécia (Figura 5) (Serra et al.,

2006).



Figura 5. Imagens de satélite ®LandSat do açude de Lucrécia e região durante as

estações de seca em agosto de 1989 e 2001 (Serra et al., 2006).

As principais cidades e comunidades dos municípios dessa região foram

construídas junto às áreas de escoamento hídrico do manancial, como não

possuem saneamento básico, onde os esgotos domésticos in natura são

despejados nos afluentes do reservatório. Entre os principais municípios do Rio

Grande do Norte inseridos na sub-bacia Umari se destacam Almino Afonso,

Frutuoso Gomes, Lucrécia e Martins, que apresentam populações respectivas de

4.962, 4.360, 3.423 e 8.063 habitantes (IBGE, 2008).

Além disso, os principais afluentes do manancial estão inseridos numa região

de topografia com relevo acentuado (Figura 5). As características geomorfológicas

da área de entorno do açude de Lucrécia podem ser outro agravante, pois os

principais afluentes do manancial estão inseridos em locais com elevada

inclinação que podem facilitar a lixiviação e maximizar o aporte de poluentes para

o interior desse reservatório público, principalmente durante as intensas e

localizadas precipitações que ocorrem nas estações chuvosas.



Figura 6. Imagem de satélite ®LandSat em três dimensões (3D) mostrando a

geomorfologia da área de entorno do açude de Lucrécia e a inserção de seus

afluentes (setas) no relevo acentuado da região. Fonte: Serra et al. (2006).

1.3. CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA

No município de Lucrécia, desde a década de 70, são observadas taxas

elevadas de casos de câncer. O Instituto Nacional do Câncer (INCA/Brasil) em

2007 estimou para o estado do Rio Grande do Norte taxas brutas (homens e

mulheres) de ocorrência de câncer em 228,9 casos para cada 100.000 habitantes.

Para a capital Natal a taxa estimada de câncer foi de 363,5 casos para cada

100.000 habitantes. Neste mesmo período, Lucrécia destaca-se com uma taxa de

776,8 casos, isto é, com uma freqüência três vezes maior que o restante da média

estadual.



O açude de Lucrécia foi por muitas décadas o principal recurso hídrico

superficial de abastecimento de água para consumo humano da população do

município e região.

No intuito de avaliar as características físico-químicas das águas desse

importante manancial, vários trabalhos de pesquisa foram realizados nas últimas

décadas. Dentre as quais, se destacam as pesquisas de Malanca et al. (1998),

que demonstravam a presença de radioatividade alfa e beta nessas águas

superficiais; Serra et al. (2006), que indicaram a ocorrência de metais no

sedimento de fundo do reservatório e Campos et al. (2010), que advertiram para a

ocorrência de teores elevados de Rn-222 (>100 Bq m-3) e radiação gama na

atmosfera indoor das residências rurais e urbanas do município de Lucrécia.

Os fatores que desencadeiam o processo cancerígeno são multi-causais, e

essa elevada freqüência de tumores observada na população humana de Lucrécia

pode estar relacionada à poluição das águas desse reservatório público. Esses

poluentes, já observados anteriormente no açude de Lucrécia, podem estar

entrando em sinergia com outros contaminantes ambientais, tais como, POPs

(poluentes orgânicos persistentes) (Hernandez et al., 2009).

Todos estes poluentes ambientais que estão dispersos, podem vir a se

acumular nas águas e nos solos da região, além de bioacumular e biomagnificar

na biota da região. Desta forma, a presença de radioisótopos e seus subprodutos

de decaimento nessas águas expõem amplamente todas as populações, pois

essa exposição a radio-ionizantes gera danos diretos através da dieta e da

ingestão de água e/ou indiretamente pela inalação de subprodutos radioativos, tais

como, Rn-222 (NRC, 1999).



Logo, o consumo ou o uso desses recursos hídricos superficiais poluídos nas

atividades domésticas e sanitárias, provavelmente, acarretará em um perigo real e

pode comprometer a qualidade de vida e a saúde das populações humanas

abastecidas. Essa exposição a poluentes hídricos também poderá gerar danos

genéticos, originar doenças degenerativas, defeitos congênitos e esterilidade nos

organismos expostos (Mena et al., 2009; Bhattathri et al., 1996).

Estima-se que as análises hídricas e de genotoxicidade executados neste

trabalho possam servir de subsídio para o biomonitoramento e conservação das

águas e para melhora da qualidade de vida e saúde pública do município, fornecer

informações para dar suporte para a tomada de decisões pelos profissionais dos

setores de saúde e de saneamento básico do estado do Rio Grande do Norte,

visando mitigar os impactos ambientais negativos que têm sido observados nessa

região.



2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. CIANOBACTÉRIAS

As cianobactérias ou cianofíceas, também conhecidas popularmente como

algas azuis, são microorganismos aeróbicos fotoautotróficos, logo, os seus

processos biológicos requerem água, dióxido de carbono, substâncias inorgânicas

(macro e micronutrientes) e luz.

A fotossíntese é o principal modo de obtenção de energia metabólica dessas

bactérias. Sua morfologia celular demonstra que esses microorganismos são

procariontes (sem membrana envolvendo o material genético) e, portanto, muito

semelhantes bioquimicamente e estruturalmente às bactérias não

fotossintetizantes. A origem das cianobactérias foi estimada em cerca de 3,5

bilhões de anos, sendo provavelmente os primeiros produtores primários de

matéria orgânica a liberarem oxigênio elementar na atmosfera primitiva do planeta

(FUNASA, 2003).

A capacidade de crescimento e proliferação é uma das características

marcantes das cianobactérias. Entretanto, ambientes de água doce são os mais

favoráveis para o crescimento de cianobactérias, visto que a maioria das espécies

apresenta um melhor crescimento em águas neutroalcalinas (pH 6-9), temperatura

entre 15 a 30 ºC e alta concentração de nutrientes, principalmente nitrogênio e

fósforo. As principais fontes de eutrofização artificial dos ambientes aquáticos têm

sido identificadas como as descargas de efluentes domésticos e industriais nas

regiões metropolitanas e a poluição difusa originada nas regiões agricultáveis

(Lürling e Roessink, 2006).



As florações ou “blooms” de cianobactérias se caracterizam pelo intenso

crescimento desses microorganismos na superfície da água, formando uma densa

camada de células com vários centímetros de profundidade, mas frequetemente

essas células se distribuem em toda a coluna da água, com conseqüente aumento

dos riscos à saúde pública e degradação ambiental. É amplamente aceito pelos

microbiologistas e limnologistas que estudam a formação dessas florações, que a

carga de nutrientes, o tempo de retenção da água, a estratificação e a temperatura

são os principais fatores que influenciam a formação e intensidade das florações.

No país e no estado, este problema tem sido intensificado pelo fato de que a

maioria dos reservatórios superficiais de água para abastecimento apresenta as

características climáticas e ambientais necessárias para a proliferação de

cianobactérias durante grande parte do ano (Chellappa e Costa, 2003).

Já foi registrada a ocorrência de pelo menos 32 espécies de cianobactérias

potencialmente tóxicas no Brasil, incluídas em 14 gêneros, em diferentes

ambientes aquáticos (Sant’anna e Azevedo, 2000). Destes, a espécie Microcystis

aeruginosa apresenta 7 espécies e tem ampla distribuição no Brasil e o gênero

Anabaena tem grande número de espécies potencialmente tóxicas (A. circinalis, A.

flos-aquae, A. planctonica, A. solitaria e A. spiroides).

Entretanto, na última década tem sido observado um grande aumento na

ocorrência da espécie Cylindrospermopsis raciborskii, em diferentes regiões

brasileiras (FUNASA, 2003).

Vários gêneros e espécies de cianobactérias que formam florações

produzem toxinas intracelulares e muitas dessas substâncias permanecem na

água mesmo após tratamentos convencionais, podendo ser liberadas para o

recurso hídrico após a desinfecção por cloração e lise celular (Tsuji et al., 1997).



A eutrofização produz mudanças na qualidade hídrica, causando redução na

concentração de oxigênio dissolvido (OD), na biodiversidade aquática, na

qualidade cênica do ecossistema, a morte extensiva e contaminação de peixes,

bem como, aumento da ocorrência de florações de microalgas e cianobactérias.

Essas proliferações excessivas de microorganismos patogênicos elevam o custo

do tratamento da água de abastecimento humano, e conseqüentemente

representam sérios riscos à saúde pública (WHO, 2008).

Na maioria das vezes, as cianobactérias são menos eficientes na

assimilação de nutrientes no ambiente aquático do que as microalgas (e.g.,

clorofíceas ou diatomáceas), que não produzem toxinas e em condições normais,

se proliferam melhor. Contudo, dentre os fatores que possibilitam a predominância

das cianobactérias no ambiente aquático em relação aos outros grupos

fitoplanctônicos (e.g., microalgas verdes), ressaltam-se as características

fisiológicas de assimilação dos nutrientes da água (principalmente, N e P). Assim,

ao gerar descargas artificiais com aumento da carga orgânica e excesso de

nutrientes nos reservatórios hídricos a população humana propicia uma maior

biodisponibilidade de micro e macronutrientes, facilitando a assimilação dos

mesmos e a floração das cianobactérias (FUNASA, 2003).

O crescimento intenso desses microorganismos tóxicos na coluna de água,

geralmente ocorre com o predomínio de poucas ou mesmo uma única espécie de

cianobactéria produtora de toxinas, ou de outros metabólitos tóxicos, que inibem a

predação pelo zooplâcton (e.g., microcrustáceos), larvas de peixes, moluscos,

entre outros. Esses consumidores primários preferem predar os microorganismos

fotossintetizantes não tóxicos, que possuem maior valor nutricional.

Conseqüentemente, ocorre o declínio dessas populações de microalgas não



tóxicas e também da competição pelos nutrientes no meio ambiente aquático,

resultando na redução drástica das comunidades desses consumidores primários,

devido à intoxicação por cianotoxinas, levando ao desequilíbrio de toda a cadeia

ecológica e, na maioria dos casos, os mananciais eutrofizados findam com as

cianobactérias tóxicas como organismos fitoplanctônicos predominantes

(FUNASA, 2003).

Os mananciais de reduzida biodiversidade fitoplanctônica e com dominância

de cianobactérias, são muitas vezes, os recursos hídricos de abastecimento

disponíveis em muitas regiões do país e do mundo. O aumento da ocorrência de

florações de cianobactérias em reservatórios de abastecimento de água e a

capacidade desse tipo de microorganismos se reproduzir e liberar toxinas (e.g.,

cianotoxinas) no ambiente aquático pode afetar a saúde humana, tanto pela

ingestão de água ou de pescado contaminado, como no contato direto em

atividades de recreação. Contudo, o consumo da água sem tratamento adequado

para remoção de cianotoxinas é a principal via de intoxicação humana (Gkelis et

al., 2006).

2.1.1. Cianotoxinas

As toxinas de cianobactérias, denominadas cianotoxinas, que constituem

uma grande fonte de produtos naturais tóxicos produzidos por esses

microorganismos, embora ainda não estejam devidamente esclarecidas as causas

da sua produção, parece ter função protetora contra herbivoria, como acontece

com alguns metabólitos de plantas vasculares (WHO, 1999).

As cianotoxinas formam um grupo de substâncias químicas bastante

diversas, com mecanismos tóxicos específicos para vertebrados, algumas são



neurotóxicas (anatoxina-a e saxitoxinas), outras são hepatotóxicas (microcistinas,

nodularina e cilindrospermopsina). Outras ainda podem ser irritantes ao contato,

consideradas como endotoxinas pirogênicas como as toxinas de bactérias Gram

negativas, grupo no qual se encontram as principais bactérias patogênicas

(Carmichael, 1994).

Apesar dos estudos e avanços tecnológicos, os métodos eficientes de

remoção dessas cianotoxinas, pelo processo de tratamento da água, ainda são

caros e reduzidos. Os protocolos práticos de detecção de cianotoxinas ainda não

formam muito difundidos para o adequado monitoramento da qualidade das águas

de abastecimento e recreação (Sotero-Santos et al., 2006).

Algumas dessas toxinas são caracterizadas por sua ação rápida, causando a

morte de mamíferos por parada respiratória, após poucos minutos de exposição,

Têm sido identificadas como alcalóides, peptídeos ou organofosforados. Outras

atuam menos rapidamente e são identificadas como peptídeos ou alcalóides

hepatotóxicos. De acordo com suas estruturas químicas, as cianotoxinas podem

ser incluídas em três grandes grupos: os peptídeos cíclicos, os alcalóides e os

lipopolissacarídeos (FUNASA, 2003).

Alguns gêneros de cianobactérias também podem produzir toxinas irritantes

ao contato. Essas toxinas têm sido identificadas como lipopolissacarídeos (LPS)

que são também comumente encontrados nas membranas celulares de bactérias

Gram negativas. Essas substâncias (LPS), que são endotoxinas pirogênicas.

Porém, os poucos estudos disponíveis indicam que os lipopolissacarídeos

produzidos por cianobactérias são menos tóxicos que os de outras bactérias (e.g.,

Salmonella) (FUNASA, 2003).



As hepatotoxinas peptídicas já caracterizadas são heptapeptídeos cíclicos

conhecidos como microcistinas e os pentapeptídeos designados como

nodularinas.

As neurotoxinas já identificadas são produzidas por espécies e cepas

incluídas nos gêneros: Anabaena, Aphanizomenon, Arthrospira,

Cylindrospermopsis, Lyngbya, Oscillatoria, Phomitium e Planktothix. Já são

conhecidos três diferentes tipos de neurotoxinas produzidas a partir de espécies

desses gêneros:

Anatoxina-a é um alcalóide neurotóxico que age como um potente

bloqueador neuromuscular pós-sináptico de receptores nicotínicos e colinérgicos.

Esta ação se dá porque a anatoxina-a liga-se irreversivelmente aos receptores de

acetilcolina, pois não é degradada pela acetilcolinesterase. A DL50 por injeção

intraperitoneal (i.p.) em camundongos, para a toxina purificada, é de 200 µg.kg-1

de peso corpóreo, com um tempo de sobrevivência de 1 a 20 minutos (FUNASA,

2003).

Anatoxina-a(s) é um organofosforado natural (N-hidroxiguanidina fosfato de

metila) e tem um mecanismo de ação semelhante à anatoxina-a, pois inibe a ação

da acetilcolinesterase, impedindo a degradação da acetilcolina ligada aos

receptores. Em virtude da intensa salivação observada em animais intoxicados por

esta neurotoxina, ela foi denominada Anatoxina-a(s). A DL50 (i.p.) em

camundongos é de 20 µg.kg-1 de peso corpóreo e, portanto, dez vezes mais

potente que a anatoxina-a, porém não há registro de intoxicação humana por esta

toxina. Em conseqüência da pouca ocorrência deste tipo de neurotoxina, ainda

não foi estabelecido um limite máximo aceitável para consumo oral humano.



Entretanto, no Brasil já foi confirmada a inibição de acetilcolinesterase por

florações de Anabaena spiroides, no Rio Grande do Sul (FUNASA, 2003).

Saxitoxinas este é o nome genérico que se tem adotado para um grupo de

neurotoxinas conhecidas como “venenos paralisantes de mariscos” (toxinas do

tipo PSP) que foram primeiramente isoladas de dinoflagelados marinhos,

responsáveis pela ocorrência de marés vermelhas. Estas neurotoxinas são um

grupo de alcalóides carbamatos que podem ser não sulfatados (saxitoxinas), com

um único grupamento sulfato (G-toxinas) ou com dois grupamentos sulfatos (C-

toxinas). A toxicidade desse grupo de alcalóides varia muito. Por exemplo, a DL50

(i.p.) em camundongos para saxitoxina purificada é de 10 µg.kg-1 de peso

corpóreo, enquanto que por consumo oral a DL50 é de aproximadamente

263µg.kg-1 de peso corpóreo (Chorus e Bartram, 1999).

Essas neurotoxinas inibem a condução nervosa bloqueando os canais de

sódio, afetando a permeabilidade ao potássio ou a resistência das membranas. Os

sinais clínicos de intoxicação humana incluem tontura, adormecimento da boca e

de extremidades, fraqueza muscular, náusea, vômito, sede e taquicardia. Os

sintomas podem começar cinco minutos após a ingestão e o óbito pode ocorrer

entre 2 às 12 h. Em casos de intoxicação com dose não letal, geralmente os

sintomas desaparecem de um a seis dias. Entretanto, não se tem conhecimento

de efeitos crônicos por falta de estudos de longa duração com animais.

Embora a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2003) considere que

atualmente não há dados suficientes para o estabelecimento de um limite de

concentração máximo (LCM) aceitável para as saxitoxinas em água potável

(Chorus e Bartram, 1999), uma análise dos dados de eventos de intoxicações

humanas, demonstra que a maioria dos casos esteve associada ao consumo de



aproximadamente 200 µg de saxitoxinas (STX) por pessoa. Fitzgerald et al.(1999)

propuseram 3 µg.L-1 como o LCM aceitável de saxitoxinas em água para consumo

humano, e este limite já foi adotado por autoridades de saúde do sul da Austrália.

A toxicidade dessas microcistinas em animais de laboratório apresenta DL50

(i.p.) entre 25 e 150 mg.kg-1 de peso corpóreo e entre 5.000 e 10.900 µg.kg-1 de

peso corpóreo por administração oral (Chorus e Bartram,1999).

As nodularinas foram primeiramente identificadas na espécie Nodularia

spumigena; atualmente são conhecidas oito nodularinas distintas, classificadas de

acordo com as variações no grau de metilação, composição e isomerização de

seus aminoácidos. A DL50 (i.p.) em camundongos varia entre 50 a 200 µg.kg-1 de

peso corpóreo.

Tem sido demonstrado que várias microcistinas e nodularinas são potentes

inibidores de proteínas fosfatases tipo 1 e 2A de células eucariontes. Estas toxinas

são agora reconhecidas como potentes promotores de tumores hepáticos.

Baseado em estudos de toxicidade oral em níveis subcrônicos, realizados com

camundongos e com porcos, foi estabelecida como ingestão diária aceitável

(“tolerable daily intake”- TDI), para microcistina-LR, no valor de 0,04µg.kg-1 do

peso corpóreo (Chorus e Bartram, 1999).

A partir desse valor, um LCM aceitável de 1 µg.L-1 de microcistinas em água

para consumo humano foi adotado pela WHO e incorporado no adendo das

Normas para Qualidade da Água para Consumo Humano, publicado em 1998

(“Guideline for Drinking Water Quality, WHO – 1998”) (Dietrich e Hoeger, 2005).

Na última década, um alcalóide hepatotóxico, denominado

cilindrospermopsina, foi isolado de três espécies de cianobactérias:

Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans e Aphanizomenon ovalisporum



(Banker et al., 1997; Shaw et al., 1999). Seu mecanismo de ação inibe a síntese

protéica em células renais, pulmonares e cardíacas dos animais testados

(FUNASA, 2003).

Cilindrospermopsina é uma toxina de ação lenta, requerendo de cinco a sete

dias para produzir seu efeito tóxico máximo. Em camundongos a DL50 (i.p.), após

24 h, é de 2 mg.kg-1 de peso corpóreo, enquanto que após cinco dias a DL50 (i.p.)

passa a ser de 0,2 mg.kg-1 (Terao, 1994). Por administração via oral, a DL50, após

cinco dias, é de aproximadamente 6 mg.kg-1 (Seawright et al.,1999). De acordo

com Chorus e Bartram (1999), ainda não há dados suficientes para se estabelecer

um limite máximo aceitável para cilindrospermopsina em água para consumo

humano. Entretanto, estudos toxicológicos desenvolvidos por Shaw et al. (2000)

sugerem um limite máximo aceitável de 15 µg.L-1 para água potável.

2.2. METAIS

Na literatura científica são encontradas inúmeras definições para o termo

“metal pesado”: algumas delas baseiam-se na densidade atômica, outras no peso

ou número atômico, nas propriedades químicas, sendo que, muitas vezes, este

termo é empregado a um grupo de metais, tais como, cádmio (Cd), cobre (Cu),

chumbo (Pb), cromo (Cr), mercúrio (Hg), níquel (Ni) e zinco (Zn). Estes metais são

os que estão normalmente mais associados à poluição, degradação e eco-

genotoxicidade ambiental (USEPA, 2008).

Alguns autores têm argumentado contra o uso do termo “metal pesado”,

relatando várias definições descritas na literatura para o termo, concluindo que a

terminologia não é adequada, sugerindo nova definição baseada na avaliação da

toxicidade potencial dos elementos metálicos e de seus componentes. Contudo,



como ainda não existe um consenso sobre a terminologia correta a ser utilizada,

neste estudo optamos por usar apenas o termo: metal (Duffs, 2002 apud

Tomazelli, 2003).

A poluição ambiental por metais iniciou-se com o controle do uso do fogo,

pois a deposição de elementos liberados durante a queima da lenha alterou os

níveis de metais, já no ambiente das cavernas. Mas foi com a descoberta das

minas e de técnicas de extração de metal em épocas remotas que foi formada a

relação entre metais, poluição metálica e história humana (USEPA, 1992).

Durante o Império Romano, foram necessárias grandes quantidades de

metais, especialmente Cu (15.000 ton.ano-1), Pb (80.000 a 100.000 ton.ano-1) e Zn

(10.000 ton.ano-1), para sustentar o estilo e o padrão de vida daquela sociedade.

Apesar das minas ainda serem de pequena escala, a fundição descontrolada de

grandes quantidades de minérios em “fogos ao ar livre” resultou no aumento de

intensas emissões de metais para a atmosfera. Contudo, devido à grande

ocorrência de doenças relacionadas à mineração e fundição, o império romano

fechou várias minas na Itália e nas províncias, sendo muitas delas reabertas na

Europa Central no início do século XI (Nriagu, 1996 apud Tomazelli, 2003).

Os Impactos negativos de fundições e instalações industriais foram apliadas

significantemente com o desenvolvimento de grandes fornalhas, durante o século

XVI. Com a Revolução Industrial, houve um aumento ainda maior da demanda por

metais e um aumento exponencial na intensidade de emissões desses elementos

químicos para o meio ambiente, tanto em massa absoluta, como em número e

espécies tóxicas de metais (Nriagu, 1996 apud Tomazelli, 2003).



Geralmente a presença de concentrações elevadas de metais está

relacionada à redução drástica da qualidade dos recursos hídricos, e sua origem

pode estar relacionada a diversas causas naturais ou antrópicas (Hartwig, 1998).

Alguns metais avaliados neste trabalho, tais como o Cd, Cu, Cr, Ni e Zn, são

geralmente associados a problemas de poluição e contaminação do meio

ambiente, mesmo que suas fontes sejam naturais, pois possuem toxicidade e

propriedades de bioacumulação e biomagnificação nos biomas (Beyermann e

Hartwig, 2008).

Uma das mais importantes propriedades que diferencia o grupo dos metais

dos outros elementos químicos é a capacidade de formar ligações reversíveis com

diversas substâncias. A natureza química de tais substâncias nos sistemas pode

controlar o transporte, destino, persistência e a disponibilidade desses elementos

metálicos. Os metais não são biodegradáveis, mas participam do ciclo ecológico

global, no qual a água tem papel principal, e podem apresentar inúmeras origens,

ser transportados dinamicamente através da atmosfera, águas e solos, e também

ter a capacidade de permanecer nos ecossistemas por longos períodos

(Mendiguchía et al., 2007).

Os principais fatores que podem afetar a incorporação de metais pelos

organismos expostos são: complexação, precipitação, formação de colóides,

biofixação, interação com a matéria orgânica, mudanças no pH, potencial de

oxidação, salinidade, competição iônica e a natureza das fases absorventes

(USEPA, 2007).

A disponibilidade ambiental dos metais é a quantidade total desses

elementos que está disponível para influências de modificações físicas, químicas



ou biológicas (e.g., transporte) e que não está aderida a nenhuma matriz

ambiental (USEPA, 2007).

A bioacessibilidade aos metais se refere à quantidade desses elementos que

estão disponíveis no meio ambiente e que podem interagir com a superfície de

contato (e.g., membrana celular) dos organismos expostos tornando-se

potencialmente disponíveis para absorção ou adsorção pelo contato bioativo

(USEPA, 2007).

A biodisponibilidade dos metais se refere ao teor desses elementos que está

bioacessível para a absorção ou em contato com a membrana dos organismos.É

expressa como uma fração da quantidade total de metais que o organismo está

imediatamente exposto, durante um determinado tempo e dentro de condições

definidas (USEPA, 2007).

A bioacumulação de metais está relacionada à concentração desses

elementos que são retidos ou absorvidos num determinado tecido ou no próprio

organismo e que é resultado de toda a exposição ambiental média, incluindo a das

fases atmosférica, aquática ou sólida (e.g., solos e sedimentos) e também da dieta

(biomagnificação), e representa um balanço de massa entre a incorporação e a

eliminação dos metais pelos organismos (USEPA, 20079).

Já a bioconcentração, refere-se à rede de bioacumulação dos metais num

organismo. Assim, por exemplo, a resultante das incorporações diretas da água,

como aquela que são efetuadas através das membranas das brânquias dos

peixes ou de outra superfície externa nos organismos expostos (USEPA, 2007).

O processo de biomagnificação de metais é uma das formas pela qual estes

elementos químicos podem atingir altas concentrações na biota, uma vez que os

níveis de alguns metais aumentam progressivamente ao longo da cadeia



alimentar, atingindo níveis mais elevados nos organismos predadores que ocupam

o topo da cadeia trófica (Baird, 1995).

Na água, os metais podem estar presentes nas formas particulada (em

suspensão ou no sedimento de fundo), coloidal e dissolvida, sendo

constantemente redistribuídos entre estas fases durante o transporte.

Dependendo de sua forma química, podem ser bioacumulados pelos organismos

expostos. Devido a todo esse processo dinâmico de transporte e redistribuição dos

metais nas diferentes fases, mesmo as concentrações aparentemente baixas na

coluna da água e nos sedimentos, podem ser potencialmente disponíveis para

acúmulo pelos organismos, tornando-se eventualmente tóxicas (USEPA, 2009).

Os metais cádmio, cromo e níquel ocupam lugar de destaque entre os vários

elementos associados às contaminações do ambiente aquático e que podem

causar problemas de intoxicação aos organismos incluindo o homem. Estes

elementos metálicos podem reagir com moléculas e estruturas das membranas

celulares e, conforme as propriedades biogeoquímicas do meio aquático, podem

ser bioacumulados e biomagnificados na cadeia ecológica, sendo capazes de

persistir nos ecossistemas durante longos períodos, causando distúrbios nos

processos metabólicos dos organismos (USEPA, 2007).

Diversos fatores podem aumentar a susceptibilidade aos metais, dentre os

quais se destacam doenças hereditárias, polimorfismos e mutações genéticas.

Entre as doenças hereditárias mais conhecidas, duas são mais freqüentes na

população humana e afetam o metabolismo do Cu (e.g., doença de Wilson e

síndrome de Menkes) (Iarmarcovai et al., 2008).

A doença de Wilson é uma anomalia autossômica recessiva com prevalência

de casos de 1/30.000 pessoas, sendo o seu principal efeito são deficiências na



excreção biliar de Cu, podendo resultar em acúmulo deste metal e degeneração

tecidual, sobretudo no fígado, cérebro, rins e córneas, com perda protéica, além

de poder induzir anemia hemolítica (USEPA, 2007).

A síndrome de Menkes é uma desordem recessiva ligada ao cromossomo X

que também afeta o metabolismo do Cu (prevalência de 1/200.000), que se

assemelha a uma deficiência de Cu, independentemente do nível de consumo de

Cu na dieta (WHO/IPCS, 2002).

Outro distúrbio hereditário freqüente é a Hemocromatose, caracterizada pela

absorção excessiva de Fe, elevação da concentração plasmática deste metal e

distribuição alterada de suas reservas no organismo (cinética do elemento é

alterada), que, em longo prazo, pode causar cirrose hepática e aumentar os riscos

de câncer de fígado (NAS/IOM, 2003).

Outro polimorfismo genético relacionado ao Fe afeta as enzimas delta-

aminolevulínico desidratase, que são metabolizadoras de chumbo (Pb), que estão

relacionados à modificação nas taxas de transferência de Pb do sangue para os

ossos. Algumas pesquisas inferem que polimorfismos genéticos também afetam o

metabolismo do arsênio (As), embora esses mecanismos ainda não foram bem

determinados pelos cientistas (Iarmarcovai et al., 2008; Ames, 1999).

Já a doença crônica do berílio (Be) é uma deficiência na resposta imune do

organismo, caracterizada por causar uma maior sensibilidade de

histocompatibilidade em genes, da mesma forma que o aumento de sensibilidade

ao Ni está relacionado com um genótipo para antígenos leucocitários humanos.

Outro fator que pode influenciar a suscetibilidade aos metais é a dieta, que por sua

vez está estritamente relacionada aos padrões de variabilidade culturais,

geográficos e étnicos (USEPA, 2007).



Geralmente, os metais ocorrem no meio ambiente como componentes de

misturas, podendo estar associados com outros metais e também outras

substâncias inorgânicas e orgânicas. Porém, as informações e orientações sobre

os possíveis riscos oriundos da exposição a essas misturas metálicas ainda é

bastante limitada. Os órgãos de controle ambiental têm recomendando que os

pesquisadores sigam as orientações publicadas para avaliações de risco à saúde

humana devido às misturas químicas em geral e também para o risco acumulativo.

Contudo, os efeitos dos metais em misturas podem ser sinérgicos, aditivos,

subaditivos, potencializados e/ou antagônicos. As interações entre os metais

podem ocorrer por competição por locais de ligação nas enzimas ou sobre os

receptores celulares específicos, durante os processos de absorção, excreção,

armazenamento ou bioacumulação (USEPA, 2007).

A presença, quantidade e as interações de todos os metais são fatores

importantes quando se considera e avalia os efeitos resultantes dessa exposição e

os riscos para a saúde humana. Contudo, Atualmente ainda existem poucos

estudos controlados sobre as interações dos metais relevantes para os níveis

encontrados naturalmente no meio ambiente.

Recentes orientações da USEPA (2007) prevêem uma série de métodos

quantitativos para a caracterização dos riscos ambientais das misturas metálicas.

Covém ressaltar que o método padrão atual, que pressupõe as doses para cada

metal, poderá produzir estimativas excessivamente cautelosas. Esta abordagem

metodológica, que envolve o cálculo de um índice de perigo, é mais apropriada

para substâncias químicas que produzem efeitos similares a ação dos metais

sobre as proteínas de ligação com metais. Por exemplo, o Cd pode imitar e

substituir o Zn e o cálcio, e muitas proteínas dos organismos expostos, que se



complexam a metais podem modificar a sua toxicidade e cinética (e.g., alguns

metais, se ligam à albumina para fins de transporte no sistema circulatório,

membrana celular ou interior das células). Algumas dessas proteínas têm

diferentes cinéticas de ligação para os diversos metais, resultando em interações

específicas metal-proteína. Logo, os pesquisadores que avaliam riscos ambientais

devem estar familiarizados com as diferentes proteínas que complexam com

metais, para poder interpretar corretamente a biodisponibilidade individual destes

químicos, dentro de uma mistura e saber usar o potencial da expressão dessas

proteínas como um biomarcador de exposição (USEPA, 2007).

A WHO (2003) resumiu muitas dessas interações homeostáticas, que são

muitas vezes complexas (e.g., excesso de cálcio na dieta pode induzir sinais de

deficiência de Zn, mesmo com uma ingestão normal de Zn). Da mesma forma, o

excesso de Zn na dieta pode agravar a deficiência de ferro (Fe). Muitas das

interações entre os metais essenciais estão relacionados com mecanismos de

sinergismos e antagonismos, e com a manutenção de níveis ideais de nutrição,

tanto fisiológicos quanto extrínsecos (e.g., dieta).

As interações entre os metais essenciais e não essenciais também são muito

comuns, bem como, entre os íons. Assim, por exemplo, podem ocorrer mimetismo

dos íons sulfato e fosfato, com diferentes metais não-essenciais, os quais podem

competir pelo transporte passivo em locais comuns das membranas celulares;

com metais essenciais num sítio ativo de ligação; ou ainda um determinado metal

pode afetar um local específico, podendo interferir tanto no transporte ativo quanto

passivo ou em sítios de ligação (WHO, 2003).

Estes efeitos geralmente serão aditivos, e os pesquisadores devem também

estar familiarizados com as MOAs de cada um desses metais para terem pelo



menos uma compreensão geral sobre mecanismos de interação das misturas

metálicas sobre os organismos expostos (USEPA, 2007).

Os metais também podem ser ativos na maioria dos compostos orgânicos

tóxicos para as células, podendo intervir diretamente na ativação de um

determinado receptor, na regulamentação do canal iônico, na sinalização celular,

na adesão celular e na transcrição de genes. Assim, a toxicidade química dos

metais, quanto aos seus potenciais mecanismos de ação a nível fisiológico, celular

e molecular, são dificilmente distintos das substâncias orgânicas a qual estão

complexados (USEPA, 2007).

Além disso, a co-ocorrência de metais com substâncias orgânicas podem

alterar a biodisponibilidade e aumentar ou diminuir a absorção, por exemplo, na

dieta, onde citratos e histidina são conhecidas por aumentar a absorção de Zn,

enquanto que o ácido ascórbico pode modificar os antagonismos de Fe-Cu, o

baixo teor de proteína pode aumentar a absorção de Cd e Pb, e contraceptivos

orais podem influenciar o metabolismo de Fe, Cu e Zn (USEPA, 2007).

Logo, todos esses fatores e condições devem ser ponderados no intuito de

evitar que a estimativa dos possíveis riscos à saúde pública sejam super e/ou

subestimados (WHO, 2003).

Neste trabalho se optou por detalhar as principais características dos metais

que foram determinados acima do limite máximo permitido (LMP) estabelecido da

legislação brasileira, tanto nas águas e quanto nos materiais biológicos dos peixes

do açude de Lucrécia (Cd, Cu, Cr, Ni e Zn).



2.2.1. Cádmio

O Cádmio é um metal relativamente raro, ocorrendo na crosta terrestre em

concentrações de 0,1 a 0,2 mg.kg-1. A temperatura ambiente encontra-se no

estado sólido, foi descoberto em 1817 por Strohmeyer associado ao carbonato de

Zn. Em baixos teores pode atuar como micronutriente para plantas, mas é tóxico

para os organismos aquáticos, mesmo em pequenas concentrações. A principal

aplicação do Cd é como anticorrosivo, sendo também utilizado em pilhas e

baterias (Ni-Cd), defensivos agrícolas, pigmentos, e na fabricação de plásticos

(USEPA, 2007).

Diversos metais podem ser introduzidos nos sistemas aquáticos como o

resultado de processos naturais, como intemperismo, erosão e erupções

vulcânicas. O Cd pode atingir os ecossistemas principalmente por meio de fontes

antrópicas, tais como, efluentes agrícolas, subproduto do refinamento de Zn,

combustão de carvão, descartes de minas, processos de eletrodeposição,

produção de aço e inox, pigmentos, fertilizantes e pesticidas (USEPA, 2007).

No ambiente aquático, o Cd pode estar presente em várias formas, inclusive

associado ao material orgânico particulado ou dissolvido, as quais apresentam

diferentes fatores de bioacumulação e genotoxicidade. Em geral, a forma iônica

dissolvida é considerada a mais biodisponível para bioacumular na biota aquática

(Rana et al., 2008).

A toxicidade do Cd é principalmente aguda. A população humana é protegida

da bioacumulação crônica devido aos baixos níveis que são propiciados pelas

proteínas ricas em enxofre (metalotioninas), as quais têm função de regular o

metabolismo do Zn, tendo muitos grupos sulfidril que podem complexar quase

todo Cd ingerido, sendo o complexo, subseqüentemente, eliminado na urina. Se a

http://pt.wikipedia.org/wiki/S%C3%B3lido



quantidade consumida exceder a capacidade de complexar dessas proteínas, o

metal é estocado nos rins e fígado (Järup e Akesson, 2009).

Algumas manifestações de toxicidade do Cd podem incluir anemia fraca e

osteoporose, mas os efeitos prejudiciais mais pronunciados ocorrem nos rins. As

intoxicações crônicas por Cd em humanos estão ligadas ao comprometimento dos

rins, do sistema imunológico, câncer de próstata e déficit de aprendizado. Além

disso, pode provocar sérios danos ao esqueleto, causando a doença conhecida

por Itai-Itai, relatada inicialmente no Japão (Bertin e Averbeck, 2006).

Diversos mecanismos indiretos estão relacionados à atividade carcinogênica

do Cd, entre eles a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), inibição do

reparo e metilação do DNA, indução de morte celular programada (apoptose),

proto-oncogenes e tumores, interferência na ação de enzimas de defesa

antioxidante, na adesão celular e na transcrição de genes (Mitra et al., 2001;

Vargas et al., 2001; Martinez et al., 2003; Thévenod, 2009).

2.2.2. Cobre

O cobre é um metal de transição avermelhado, que apresenta alta

condutibilidade elétrica e térmica, só superada pela da prata. É possível que o

cobre tenha sido o metal mais antigo a ser utilizado pelo homem, pois se têm

encontrado objetos de cobre de 8.700 a.C.

Este metal em pó é utilizado como combustível, se inalado pode provocar

tosse, dor de cabeça e de garganta. Recomenda-se reduzir a exposição

ocupacional com a utilização de EPIs (equipamentos de proteção individual), tais

como, óculos, luvas e máscaras. As concentrações limites são de 1 mg.m-3 para o

http://pt.wikipedia.org/wiki/Combust%C3%ADvel



pó e de 0,2 mg.m-3 para vapor de cobre. Este metal pode reagir com oxidantes

fortes (e.g., cloratos, bromatos e iodatos) e originar explosões (WHO, 1998).

As águas com teores em Cu superiores a 1 mg.L-1 pode contaminar as

roupas e objetos lavados com ela, tendo que conteúdos acima de 5 mg.L-1 tornam

a água colorida e com sabor desagradável. A WHO (2009), no Guia para a

qualidade da água potável, recomenda um nível máximo de 2 mg.L-1 deste metal,

mesmo valor adotado na União Europeia. Já nos Estados Unidos a Agência de

Proteção Ambiental (USEPA, 2009) tem estabelecido um limite de 1,3 mg.L-1.

Porém, todos os compostos de cobre deveriam ser tratados como tóxicos, pois

uma quantidade de 30g de sulfato de cobre é potencialmente letal em humanos

(USEPA, 1992).

Existem poucos estudos sobre os efeitos agudos deste metal. Mesmo os

efeitos crônicos são raramente descritos, com exceção do Mal de Wilson (Van

Leeuwen et al., 2005).

Grillo et al. (2009) mostraram recentemente que tanto o tratamento in vitro

com cobre metálico quanto com íons do metal foram capazes de induzir

aberrações cromossômicas e alterar o índice mitótico das linhagens celulares de

CHO-K1.

2.2.3. Cromo

O cromo (Cr) é encontrado principalmente na forma do mineral crocoíta

(PbCrO4). Foi isolado com ácido clorídrico (HCl) na forma de óxico de Cr (CrO3)

em 1797 por Louis Nicolas Vauquelin.

Em princípio, se considera o Cr trivalente (estado de oxidação +3) um

elemento químico essencial a vida, ainda que não se conheça com exatidão suas

http://pt.wikipedia.org/wiki/Sulfato_de_cobre

http://pt.wikipedia.org/wiki/Croco%C3%ADta

http://pt.wikipedia.org/wiki/1797

http://pt.wikipedia.org/wiki/Louis_Nicolas_Vauquelin

http://pt.wikipedia.org/wiki/Elemento_qu%C3%ADmico_essencial



funções. Especula-se que possa participar do metabolismo dos lipídios e dos

hidratos de carbono, assim como em outras funções biológicas. Foi observado que

alguns dos complexos de Cr parecem participar da potencialização da ação da

insulina, sendo, por isso, denominado de "fator de tolerância à glicose", onde a

ausência de Cr pode provocar intolerância à glicose e, como conseqüência, o

aparecimento de diversos distúrbios. (USEPA, 2009).

Até hoje, não foi encontrada nenhuma metaloproteína com atividade

biológica que contenha Cr, por isso ainda não se pode explicar seu modo de ação.

No entanto, a carência nos seres humanos pode causar ansiedade, fadiga e

problemas de crescimento. Em contraposição, seu excesso (em nível de nutriente)

pode causar dermatites, úlcera, problemas renais e hepáticos. Geralmente, não se

considera que o Cr metálico e os compostos de Cr III representem um risco para a

saúde pública, pois se trata de um elemento essencial, contudo em altas

concentrações é toxico. Já os compostos de Cr hexavente (VI), que tem estado de

oxidação +6, são tóxicos quando ingeridos, sendo que a dose letal é baixa, e

mesmo em níveis não letais, o Cr VI é genotóxico e carcinógeno. A maioria dos

compostos de Cr VI irrita os olhos, pele e mucosas, e a exposição crônica a estes

compostos hexavalentes pode provocar danos permanentes nos olhos (Mertz et

al., 1993).

A WHO recomenda, desde 1958, uma concentração máxima de 0,05 mg.L-1

de Cr na água de consumo humano, sendo que este valor está sendo revisado,

devido aos novos estudos sobre os seus efeitos a saúde.

Quanto ao comportamento deste metal, destaca-se que a absorção de Cr

(VI) é maior que a do Cr (III), devido à alta permeabilidade à membrana do

primeiro, pois entra na célula por difusão facilitada, enquanto o segundo penetra

http://pt.wikipedia.org/wiki/Metabolismo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Lip%C3%ADdio

http://pt.wikipedia.org/wiki/Hidrato_de_carbono

http://pt.wikipedia.org/wiki/Insulina

http://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna

http://pt.wikipedia.org/wiki/F%C3%ADgado


http://pt.wikipedia.org/wiki/Veneno

http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2ncer

http://pt.wikipedia.org/wiki/Olho

http://pt.wikipedia.org/wiki/Pele

http://pt.wikipedia.org/wiki/Mucosa

http://pt.wikipedia.org/wiki/1958



por difusão passiva e pinocitose, e tem baixa penetração nas membranas. Este

metal tem valência variável, pode entrar na reação de Haber-Weiss e produzir

espécie reativas de oxigenio (ROS), aumentando o estresse oxidativo e a

lipoperoxidação celular. Vários autores sustentam que o Cr VI é mais genotóxico

que o trivalente (DeFlora et al. 1990; Matsumoto e Marin-Morales, 2005).

Seoane e Dulout (2001) mostraram que mesmo o Cr III foi capaz de induzir

significativamente micronúcleos (MN) in vitro em linhagens de fibroblastos

humanos.

Tagliari et al. (2004) mostraram que peixes (O. niloticus) e ratos (Winstar)

tratados (i.p.) com Cr VI aumenta o estresse oxidativo e causa lipoperoxidação no

fígado desses animais.

Çavas e Ergene-Gozukara (2005) mostraram aumento da freqüência de

micronúcleos (MN) em eritrócitos de peixes (O. niloticus) expostos a efluentes de

refinarias de petróleo contaminados com Cr.

Matsumoto et al. (2006) mostraram que águas contaminadas com Cr Têm

potencial mutagênico e genotóxico para plantas (A. cepa) e peixes (O. niloticus).

Dai et al., 2009 relataram que ambos os íons de Cr interferem na

proliferação, crescimento, inibindo a divisão e a síntese de DNA, com a inativação

de polimerases, redução das taxas de replicação e das enzimas de reparo, e

causam o aumento de diversos tipos de mutações na linhagem celular humana

tumoral (Hela).

No trabalho recente de Lushchak et al. (2009) foi observado aumento

significativo do estresse oxidativo no cérebro de peixes expostos cronicamente a

este metal.



Raghunathan et al. (2009) relataram que mesmo próteses de ligas metálicas

que contêm Cr representam risco de danos crônicos a este metal tóxico e podem

aumentar o estresse oxidativo em humanos.

2.2.4. Níquel

Níquel (Ni) é encontrado na natureza em diversos minerais, em meteoritos, e

em princípio e teoricamente existe níquel no núcleo do planeta Terra, contudo na

crosta terrestre estima-se que o níquel não exceda os 0,01 %, sendo o vigésimo

quarto elemento mais abundante (USEPA, 2007).

O uso do Ni pelo ser humano é conhecido desde a Antiguidade. Entretanto, a

sua utilização em larga escala verifica-se somente após a obtenção da primeira

amostra de metal puro por Richter (1804), e do desenvolvimento da liga sintética

de ferro-níquel por Michael Faraday e colaboradores em 1820. Em 1870, Fleitman

descobre que a adição de uma pequena quantidade de magnésio tornava o níquel

maleável (Nriagu, 1996).

Muitas das enzimas hidrogenases contém Ni, principalmente as que têm

função de oxidar o hidrogênio (H), indicando que ele participa como quelante na

estrutura do núcleo da enzima, que tem função ativa. Estudos mostram que esse

metal pode sofre mudanças no seu estado de oxidação, e está presente na

enzima metil redutase e em bactérias metanogênicas (USEPA, 2007).

Este metal tem função biológica parecida com o Fe, devido a sua

proximidade química. Porém, conforme a WHO (2009) a exposição ao Ni e seus

compostos solúveis não deve superar aos 0,05 mg.L-1. O níquel tetracarbonilo - Ni

(CO)4, gerado durante o processo de obtenção do metal, é um gás extremamente

tóxico e deve ser medido em níveis de Ni equivalente para uma exposição

http://pt.wikipedia.org/wiki/Mineral

http://pt.wikipedia.org/wiki/Meteorito

http://pt.wikipedia.org/wiki/Terra

http://pt.wikipedia.org/wiki/Hidrogenase

http://pt.wikipedia.org/wiki/Oxida%C3%A7%C3%A3o

http://pt.wikipedia.org/wiki/Hidrog%C3%AAnio

http://pt.wikipedia.org/wiki/Estado_de_oxida%C3%A7%C3%A3o

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Metil_CoM_redutase&action=edit&redlink=1

http://pt.wikipedia.org/wiki/Bact%C3%A9ria

http://pt.wikipedia.org/wiki/N%C3%ADquel_tetracarbonilo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Veneno



ocupacional de 8h/dia e 40h/semana. Dea acordo com a USEPA (1992), mesmo

intoxicações leves por Ni podem causar sintomas, tais quais, apatia, diarréia,

dores nos órgãos sexuais, febre, insônia e náuseas.

O Ni é reconhecidamente um metal cancerígeno e bioacumulativo, podendo

causar diversas doenças (e.g., dermatites, estomatites e fadiga crônica), alterar a

proliferação celular, expressão gênica, atividade de enzimas cálcio dependentes.

Interfere na metilação e reparo do DNA e na estrutura das histonas, além de

também induzir MN em peixes expostos (Buschini et al., 2009; Zhou et al., 2009).

2.2.5. Zinco

O zinco (Zn) é considerado o 23º elemento mais abundante na crosta

terrestre, com aproximadamente 75 ppm.

Os principais minerais que contém Zn são a blenda (sulfeto de zinco, ZnS), a

esmitsonita (carbonato de zinco, ZnCO3), a franklinita (zinco e ferro), a calamina

(silicato básico de zinco) e a zincita (óxido de zinco - ZnO). O Zn metálico não é

considerado tóxico, mas íons em solução são nocivos. A inalação de fumaça de

óxido de Zn, que pode ocorrer em soldas, deve ser evitada através do usado de

EPIs. A principal aplicação do Zn, cerca de 50 % do consumo anual, é para a

galvanização do aço ou ferro para protegê-los contra a corrosão, podendo também

ser usado em forma de óxido nos protetores solares, pois tem a capacidade de

bloquear a radiação solar; também é utilizado em desodorantes e talcos.

O Zn é um elemento químico essencial para a vida, é conhecido há muito

tempo como essencial para os microrganismos, mas a compreensão da

deficiência em humanos é relativamente recente. Este metal participa do

metabolismo de proteínas e ácidos nucléicos, estimula a atividade de mais de 100

http://pt.wikipedia.org/wiki/Galvaniza%C3%A7%C3%A3o

http://pt.wikipedia.org/wiki/A%C3%A7o

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ferro

http://pt.wikipedia.org/wiki/Corros%C3%A3o

http://pt.wikipedia.org/wiki/Filtro_solar


http://pt.wikipedia.org/wiki/Metabolismo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna

http://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_nucleico



enzimas, colabora no bom funcionamento do sistema imunológico, é também

necessário para cicatrização dos ferimentos, intervém nas percepções do sabor e

olfato e na síntese do DNA, é encontrado na estrutura da insulina, nas proteínas

dedo de Zn (zinc finger) e em diversas enzimas, tais como, a superóxido

dismutase (USEPA, 1992).

O Zn compõe diversos alimentos (e.g., ostras, carnes vermelhas, aves,

alguns pescados, mariscos, favas e nozes), e sua ingestão diária recomendada de

zinco é em torno de 10 mg, menor para bebês, crianças e adolescentes (devido ao

menor peso corporal), e maior para as mulheres grávidas e durante o aleitamento

(JECFA, 2003).

A deficiência de Zn pode gerar retardo no crescimento, atraso na maturação

sexual nos adolescentes e impotência sexual, hipogonadismo, anemia suave,

acuidade diminuída do paladar, alopecia, lesões na pele, acrodermatite

enteropática, imunodeficiências, diarréias, apatia, cansaço, depressão, lesões

oculares e de pele, inclusive acne, unhas quebradiças, amnésia, perda de apetite,

perda de peso, problemas de crescimento, retardo na cicatrização de ferimentos e

anomalias no sentido do olfato (USEPA, 2007).

As principais causas que podem provocar deficiências deste metal são a

insuficiência na dieta e dificuldades na sua absorção, que pode ocorrer em casos

de alcoolismo, quando Zn é eliminado pela urina ou, ainda, devido à excessiva

eliminação por causa de desordens digestivas. O excesso de Zn tem sido

relacionado com baixos níveis de cobre, alterações na função do Fe, diminuição

da função imunológica e dos níveis de L-colesterol, anemia, febre, distúrbios do

sistema nervoso central e em pacientes tratados por hemodiálise (Kornekova et

al., 2003).

http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima

http://pt.wikipedia.org/wiki/DNA


http://pt.wikipedia.org/wiki/Super%C3%B3xido_dismutase

http://pt.wikipedia.org/wiki/Super%C3%B3xido_dismutase

http://pt.wikipedia.org/wiki/Alimento

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ostra

http://pt.wikipedia.org/wiki/Carne

http://pt.wikipedia.org/wiki/Aves

http://pt.wikipedia.org/wiki/Peixe

http://pt.wikipedia.org/wiki/Marisco

http://pt.wikipedia.org/wiki/Miligrama

http://pt.wikipedia.org/wiki/Diarreia

http://pt.wikipedia.org/wiki/Olfato

http://pt.wikipedia.org/wiki/Alcoolismo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Urina

http://pt.wikipedia.org/wiki/Cobre

http://pt.wikipedia.org/wiki/Colesterol



Embora o elemento não seja considerado tóxico, existem certos sais deste

metal cuja ingestão provoca náuseas e diarréia (e.g., óxido e sulfeto). A inalação

de óxido de Zn pode provocar lesões nos pulmões e, de um modo geral, em todo

o sistema respiratório (USEPA, 2007).

2.2.6. Bioacumulação de metais em peixes

Os riscos da presença dos metais para a saúde humana e o meio ambiente

são evidentes nas ações e interações descritas, especialmente em se tratando de

produtos alimentares de origem aquática. Todas as formas de vida aquática

podem ser impactadas negativamente pela presença de metais nos mananciais,

mesmo que esses elementos sejam essenciais aos sistemas biológicos, pois sua

degradabilidade dependerá da dose e da forma química absorvida. Toda a

icitiofauna pode bioacumular os contaminantes metálicos, e com a

biomagnificação na cadeia trófica algumas espécies poderão apresentar elevados

teores desses elementos (Van der Oost et al., 2003).

Os peixes têm sido utilizados em vários estudos de segurança alimentar, pois

estes organismos são capazes de concentrar metais em níveis superiores aos

encontrados na água, são responsáveis por grande parte da dinâmica destes

poluentes nos mananciais. Alguns metais podem ter sua liberação e excreção

inibidas ao formar complexos com as substâncias orgânicas dos seres vivos e

podem vir a alcançar teores até 1000 vezes maiores do que sua concentração no

meio ambiente aquático (JECFA, 2003).

Os metais podem se ligar a grupos sulfidrílicos, hidroxílicos, carboxílicos,

imidazol, resíduos aminos de proteínas, peptídeos e aminoácidos, e os efeitos

desses poluentes podem ser letais ou subletais para todos os componentes da



biota, tais como fitoplânctons, zooplânctons, bentos, peixes, pássaros e

finalmente, o ser humano (Larini, 1997).

A toxicidade dos metais para os animais e para o homem, associado à

capacidade de se bioacumular na cadeia trófica por longo tempo, justificam a

determinação do nível destes elementos na ictiofauna, pois a captação e a

biocumulação de metais nos organismos aquáticos dependem das propriedades

químicas e físicas da água e do sedimento. Além disso, a idade, hábitos

alimentares dessa biota e a biodisponibilidade dos metais na água podem afetar

seu bioacúmulo nos peixes. Na icitiofauna a bioabsorção dos metais ocorre

através de duas rotas principais: i) aparelho digestivo com exposição através da

dieta e ii) aparelho respiratório com a exposição da superfície das brânquias na

água (FAO, 1983).

Posterior a bioabsorção dos metais ocorre à transferência e o transporte por

diferentes proteínas (e.g., transferrina) do sangue para outros órgãos-alvo. A

associação de metais com diferentes ligantes celulares pode influenciar na

distribuição destes elementos no organismo dos animais, além de afetar a

biodisponibilidade dentro da célula (Peralta-Videa et al., 2009).

Os metais, em sua grande maioria, quando ingeridos são distribuídos por

todo organismo, afetando múltiplos órgãos e interagindo em diversos sítios alvo,

tais como, enzimas, organelas e membranas celulares (Larini, 1997). Essas

incorporações de metais podem causar problemas neurológicos, hepáticos,

alterações na informação genética, diversas doenças (e.g., câncer), má formação

congênita e anomalias reprodutivas, podendo até causar a morte da biota exposta.

No entanto, a manifestação dos efeitos tóxicos está diretamente relacionada à

dose absorvida (Oga et al., 2008).



2.3. RADIAÇÃO INONIZANTE

As radiações ionizantes são radiações que ao atravessarem a matéria

modifica-a, tornando-a ionizada, isto é, eletricamente carregada. Nos organismos

esses íons podem causar danos genéticos, afetar os processos biológicos

normais, produzir doenças degenerativas e câncer. Geralmente, as principais

fontes de radiação são naturais (79 %), provenientes da desintegração radiativa

de alguns elementos químicos contidos nas rochas, água, solos e materiais de

construção (UNSCEAR, 2001).

Os radionuclídeos primordiais responsáveis pela radiação terrestre são o

Urânio (U), Tório (Th), Rádio (Ra), Potássio (K) e seus descendentes radioativos,

dentre os quais, deve-se dar particular atenção ao isótopo do gás nobre radioativo

Radônio (Rn) e seus produtos do decaimento radioativo (Polônio 218, Chumbo

214, Bismuto 214 e Polônio 214), os quais, por si só, são responsáveis por mais

de 43% da média anual de radiação natural. Durante todo o seu decaimento

radioativo, os radionuclídeos primordiais liberam gás radônio (Rn) e emitem

partículas de radiação ionizantes alfa e beta (NCR, 1999; UNSCEAR, 2000 e

2001).

O isótopo Ra 226, proviniente do decaimento do U 235, é um importante

emissor de partícula alfa e possui uma meia-vida de 1.622 anos. Os isótopos Ra

228 e Ra 224 provêm do decaimento do Th 232 e também são emissores de

partículas alfa e gama, caracterizado por uma meia-vida muito menor do que o seu

progenitor, respectivamente 6,7 anos e 3,7 dias. Já o Rn é um gás nobre radiativo,

pesado, incolor, inodoro, insípido e solúvel na água, presente naturalmente no

meio ambiente em rochas, solos, águas e ar. Porém diferentemente dos outros



gases nobres, ele não é completamente inerte, pois pode formar alguns

complexos químicos. A ocorrência de Rn na natureza é controlada por variáveis

físicas, tais como a pressão, temperatura, taxas de emissividade das rochas, bem

como, pelo tempo de meia-vida e pela geoquímica dos seus progenitores (226Rn,

228Rn e 224Rn) (Faure, 1991).

O isótopo Rn-222 possue um tempo de meia-vida (3,82 dias), de tal modo

que também é considerado um radionuclídeo importante, principalmente devido

aos seus efeitos sobre a saúde humana, visto que é descrito como responsável

pelo aparecimento de cânceres pulmonares (Ishikawa et al., 2003; Smerhovsky et

al., 2002; Oliveira e Cury, 2002; UNSCEAR, 2001). Tanto a Agência Internacional

para Pesquisa do Câncer (IARC) quanto a WHO classificaram o Rn-222 como um

carcinogênico humano (NRC, 1999).

O Rn-222 é transportável pela água, e nesse ambiente pode contribuir

amplamente para as exposições públicas, bem como, para toda os organismos

expostos. Para o ser humano, as exposições por ingestão de água expõem o

sistema gastrointestinal e considerando que o Rn-222 é volátil, quando inalado,

também estaria expondo os pulmões. De acordo com a NRC (1998 e 1999) as

águas subterrâneas são as que costumam ter maiores concentrações em Rn-222.

Considerando que o tempo que decorre entre a captação e o consumo da água

pode variar de poucas horas a alguns dias, e que o tempo de meia-vida desse

isótopo radiativo é de 3,82 dias, é passível de se afirmar que a exposição ao Rn-

222 na água de abastecimento, é significativamente mais importante no tocante a

sua inalação do que a sua ingestão (Jostes, 1996).

Nas regiões onde ocorre a prospecção de material radioativo (e.g., U), pode

haver contaminações do solo, da atmosfera e da água, podendo afetar toda a



cadeia ecológica dos ecossistemas, pois os processos de lixiviação e percolação

podem carrear várias substâncias emissoras de radioativos para os solos e

mananciais resultando em várias regiões impactadas (UNSCEAR, 2001)

A capacidade humana de alterar o meio ambiente leva freqüentemente ao

deslocamento de algum material crustal (e.g: minerais metálicos, não-metálicos,

carvão, petróleo, água, e outros). Esses minérios por vezes contêm materiais

radioativos de ocorrência natural (NORM), e a sua prospecção, exploração e

extração movem os "NORMs" dos locais inacessíveis para locais mais perto das

populações (FPTRPC, 2000). Desta forma, este fato leva a formação de materiais

radioativos de ocorrência natural modificados tecnologicamente (TENORM) para

área com pouca radioatividade. Esta transformação do ambiente natural pode

aumentar, substancialmente, o nível de exposição humana às radiações

ionizantes (Salama et al., 1999; Bonassi e Au, 2002; Joseph et al., 2004).

2.4. BIOINDICADOR AQUÁTICO

2.4.1. Peixes

Nos ambientes aquáticos, os peixes representam alguns dos organismos

mais freqüentemente empregados como bioindicadores da qualidade hídrica e em

programas de biomonitoramento da presença de metais e outros poluentes

(Udroiu et al., 2006; Torres de Lemos et al., 2007).

Esta fauna aquática, além de fornecer informações a respeito da

biodisponibilidade dos poluentes avaliados, fornece também indicações sobre os

teores disponíveis de alguns poluentes hídricos para biomagnificação (e.g.,

metais), uma vez que é parte constituinte da dieta humana. Contudo, é importante

ressaltar que mais de 90% do total de alguns metais determinados em peixes está



complexado (e.g., metilmercúrio), e, portanto, determinar as concentrações, por

exemplo, de Hg na ictiofauna, significa determinar os níveis de metilmercúrio que

esses organismos aquáticos estão bioacumulando e podem estar biomagnificando

via alimentação na cadeia ecológica (Fairbrother et al., 2007).

Dentre todas as espécies utilizadas para o biomonitoramento aquático, os

peixes com hábito alimentar piscívoro (predadores) são os mais utilizados, pois

ocupam o topo da cadeia alimentar e, portanto, que podem apresentar os maiores

teores de alguns elementos tóxicos, especialmente metais (Geiszinger et al.,

2009).

Contudo, nas últimas décadas o uso de ictiofauna com hábitos onívoros (e.g.,

gênero Oreochromius), como bioindicador de qualidade hídrica, tem aumentado

em vários países (Çavas et al., 2003; Fontanetti, 2006; Hoshina et al., 2008).

No Brasil, a espécie Oreochromis niloticus, conhecida popularmente por

tilápia do Nilo, tem sido empregada em diversos trabalhos de biomonitoramento

aquático, devido principalmente a sua grande presença espacial dentro dos

mananciais, distribuição e adaptabilidade nas diferentes regiões do país

(Matsumoto et al., 2006; Hoshina et al., 2008; Linde-Arias et al., 2008; Barbosa et

al., 2010).

A espécie Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758), pertence à Classe:

Actinopterygii, Ordem: Perciformes e Família: Cichlidae. Sua área de distribuição

nativa é na África, na bacia hidrográfica do Rio Nilo, desde o baixo Nilo até o delta,

mas também pode ocorrer, naturalmente, nos rios litorâneos de Israel. No seu

ambiente natural é bentopelágica, habita ambientes de água doce à ligeiramente

salgada com profundidade média de 5m. Porém, como espécie invasora, esses

peixes são oportunistas e se adaptam facilmente em ambientes lênticos, tolerando



grandes variações de temperatura e baixos níveis de oxigênio dissolvido na água.

Esta espécie introduzida se reproduz precocemente, é principalmente diurna, e

tem hábitos alimentares onívoro, mas é principalmente fitoplanctófaga,

alimentando-se principalmente de algas verdes (clorofíceas) (Costa-Pierce, 2003).

Nas características morfofisiológicas principais desta espécie africana

destacam-se a forma do corpo bem compresso e delgado, apresentando uma

linha lateral dividida em duas partes: a porção anterior mais alta em relação à

porção posterior, uma nadadeira dorsal longa e sem cortes, e nadadeira anal

afilando em uma ponta. Porém, a principal característica que distingue a espécie

O. niloticus de outras do seu gênero é a presença de listras por todo comprimento

da nadadeira caudal. O comprimento máximo publicado desta espécie foi de 60

cm, e o peso máximo de aproximadamente 4,3kg.

Todas essas características adaptativas resultam numa intensa predação de

várias espécies aquáticas nativas, e não só peixe, mas crustáceos, moluscos e

outras comunidades faunísticas dos mananciais nos quais são introduzidas.

Devido ao seu rápido aumento populacional com conseqüente competição por

alimento e espaço com as espécies de peixes nativas, esta espécie pode levar a

drástica redução da biodiversidade aquática de toda uma região.

Este espécie foi introduzida no Brasil para fins econômicos na década de 70,

mas além de competir com espécies nativas por alimento, o seu cultivo à base de

ração rica em fósforo (P), principalmente em tanques e gaiolas, causa a

eutrofização e poluição dos mananciais. Desta forma, levando a diversas

alterações no ambiente aquático, como por exemplo, a proliferação de

cianobactérias e conseqüente incorporação de cianotoxinas nas águas e nos

biomas desses recursos hídricos (Costa-Pierce, 2003).



2.5. TESTE DE GENOTOXICIDADE

2.5.1. Teste de Micronúcleo (MN)

Os micronúcleos são corpúsculos contendo DNA que se formam após as

mitoses celulares como partícula extranucleara, e podem ser oriundos de

fragmentos cromossômicos ou mesmo cromossomos inteiros, que foram perdidos

ou não são incluídos nos núcleos das células filhas, ficando localizados no

citoplasma dessas células, sem qualquer conexão estrutural com núcleo principal.

Logo, o teste de micronúcleo (MN) é um ensaio que avalia alterações nucleares,

resultantes da perda de informação genética do núcleo principal. Desta forma, os

MN estão relacionados diretamente a perda de cromatina em conseqüência de

dano cromossômico estrutural ou no aparelho mitótico (Fenech, 2000; Salvatori et

al., 2003).

O teste MN detecta alterações nucleares e defeitos estruturais no núcleo

depois que as células danificadas completam o primeiro ciclo mitótico celular. A

maior vantagem dessa análise de genotoxicidade, em relação ao tradicional teste

de aberrações cromossômicas (AC), é que o teste de MN pode detectar danos e

mutações causados por processos clastogênicos que não foram reparados pelos

mecanismos enzimáticos de reparo da informação contida no material nuclear

(Ma, 1979; Humpage et al., 2000; Majer et al., 2001; Joseph et al., 2004).

Este ensaio de genotoxicidade pode ser realizado com inúmeras espécies de

organismos, podendo também avaliar danos cromossômicos em diversos tipos de

células, tais como, células meristemáticas de plantas superiores (e.g.,

Tradescantia sp. e Allium cepa) (Ma, 1983), hemolinfa de crustáceos, eritrócitos de



peixes (Matsumoto el al., 2006; Egito el al., 2007), aves, repteis, mamíferos (e.g.,

roedores) (Ribeiro, 2003), além de linfócitos sangüíneos (Joseph et al., 2004;

Stephan et al., 2005) e células da mucosa oral humana (Majer et al., 2001; Holland

et al., 2008).

O teste de MN tem sido largamente utilizado por ser um marcador simples

que pode ser examinado em preparações citológicas de rotina com o uso de

material biológico de diversas populações expostas, e passou a existir como um

método preferencial por possibilitar a rápida avaliação do dano cromossômico,

visto que são biomarcadores que se manifestam em curto prazo, após exposição.

O aumento da sua freqüência pode se encontrar aumentada nas células dos

tecidos expostos, antes mesmo que qualquer sinal clínico seja evidente (Fenech,

2000; Holland et al., 2008).

Os eritrócitos branquiais de peixes são células ideais para o

biomonitoramento aquático (Lam, 2009), devido ao constante exposição hídrica

desse tecido respiratório e também porque essa fauna aquática geralmente é mais

sensível e responde de forma mais rápida à poluição aquática (Çavas et al., 2003

e 2005; Cestari et al., 2004; Tagliari et al., 2004; Matsumoto el al., 2006; Souza e

Fontanetti, 2006, Egito et al., 2007; Hoshina et al., 2008; Linde-Arias et al., 2008).

As células da mucosa oral humana também são recomendadas para o

biomonitoramento de populações humanas em exposição a poluentes ambientais

e ocupacionais, pois estas células estão geralmente expostas ao contato direto a

diversos poluentes que são ingeridos ou inalados (Fenech et al., 1999;

Smerhovsky et al., 2002; Maluf, 2004; Minozzo et al., 2004; Holland et al., 2008).



2.5.2. Teste de Alterações Nucleares (NA)

Vários outros trabalhos têm utilizado essa técnica de indicativo de avaria no

núcleo das células da biota aquática (Çavas et al., 2003; Souza e Fontanetti, 2006;

Talapatra e Banerjee, 2007; Holland et al., 2008).

O teste de alteração nuclear foi inicialmente descrito no trabalho de

biomonitoramento com peixes de Carrasco et al. (1990), no intuito de colaborar

para a detecção de danos genotóxicos em peixes.

Contudo, este bioensaio para a determinação de dano na estrutura nuclear

de células também tem sido recomendado para os estudos de biomonitoramento

de genotoxicidade humana (Holland et al., 2008; Musak et al. 2008; Sráma et al.

2008; Smerhovsky et al., 2002).


simples para a avaliação de danos genéticos e tem aplicação em diversas áreas

(Figura 6 e 7), tais como ecotoxicologia (Gauthier et al., 1999), nutrição (Fenech e

Ferguson, 2001), avaliação de risco de câncer (Scott et al., 1998; Heepchantree et

al., 2005), biomonitoramento de populações humanas expostas à diversos

poluentes ambientais e para identificação do potencial genotóxico de produtos

farmacêuticos, agroquímicos ou agentes químicos e físicos em geral (Fenech et

al., 1999; Salama et al., 1999; Fucic, et al., 2008; Holland et al., 2008).



Figura 6 – Células de mucosa oral de doadores de Lucrécia com núcleo normal

(A), micronucleado (B), binucleado (C), brotamento nuclear (D), cariolíse (E),

piquinólise (F) e fragmentado (G). A= 400X. Fotos: Marcon, A. E.

A B C

Figura 7 – Eritrócitos branquiais de peixes (O. niloticus) do açude de Lucrécia de

núcleo normal (A), micronucleado (B) e com brotamento nuclear (C). A= 2500X.

Fotos: Marcon, A. E.



3. ARTIGOS

3.1. ARTIGO 1

• Artigo Publicado na revista Chemosphere (ISSN: 0045-6535).

• Qualis CAPES: A2 em Medicina II.

• Fator de Impacto: 3,253.

• Publicado em 07 de Julho de 2010, volume 81, páginas 773-780.

• Título do artigo: Genotoxic analysis in aquatic environment under

influence of cyanobacteria, metal and radioactivity.



Chemosphere 81 (2010) 773–780

Contents lists available at Science Direct

Chemosphere

journal homepage: www.elsevier.com/locate/chemosphere

Genotoxic analysis in aquatic environment under influence of cyanobacteria, metal and radioactivity Alexandre Endres Marcona, Douglisnilson de Morais Ferreirab, Maria de Fátima Vitória de Mourac, Thomas Ferreira da Costa Camposd, Viviane Souza do Amarale, Lucymara Fassarella Agnez-Limaa,e, Sílvia Regina Batistuzzo de Medeirosa,e*

a Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil b Laboratório de Recursos Naturais, Instituto Federal de Tecnologia do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil c Departamento de Química, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil d Departamento de Geociências, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil e Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil A R T I C L E I N F O Article history: Received 16 November 2009 Received in revised form 24 June 2010 Accepted 7 July 2010 Available online 5 August 2010

Keywords: Genotoxicity Superficial water Cyanobacterium Metal Radioactivity

A B S T R A C T The micronucleus (MN) and nuclear abnormality (NA) tests were employed to evaluate the genotoxic potential of the Lucrecia dam (RN, Brazil) located in a semi-arid region and influenced by crop irrigation and irregular rainfall. The analyses of these water samples demonstrated the presence of several cyanobacteria as well as metals and radioactivity. The Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) was used for micronucleus and nuclear abnormality assays and analysis of metal concentrations in gills and liver samples. Genotoxic assays in source water fish showed a significant increase in the frequency of nuclear damage (MN and NA) in relation to the negative control group. In conclusion, the results obtained with water surface and biological samples from the Lucrecia dam suggest that this important water resource contains a number of chemical and microbiological pollutants with genotoxic potential and that these substances may be compromising the species inhabiting this ecosystem. Particular care must be taken to prevent further degradation of this water supply.

Capsule: A battery of assay was successfully applied to assess the water quality of Lucrecia dam from a Northeastern region of Brazil.

© 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved. 1. Introduction

The northeast of Brazil is characterized by a scarcity of water re-sources, aggravated by the poor distribution of water and precarious basic sanitation. The contamination of source waters can seriously compromise public health and ecosystems. Despite being polluted, the source waters in the northeast of Brazil are some-times the only public supply of water available in a given area. In some cases, conventional water treatments such as chlorine disin-fection are ineffective and/or generate subproducts that may also have genotoxic and mutagenic potential, possibly aggravating the toxicity of some pollutants ( Maffei et al., 2009).

The Lucrecia dam, located in northeast Brazil, is one of the main surface water reservoirs for public distribution in this region, and during periods of intense drought more than 70% of the volume * Corresponding author. Address: Departamento de Biologia Celular e Genética, CB – UFRN, Av. Salgado Filho, s/n – Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal, 59072-970, RN, Brazil. Tel.: +55 84 3211 9209; fax: 55 84 3215 3346.

E-mail address: [email protected] (S.R. Batistuzzo de Medeiros).

0045-6535/$ - see front matter ₃ 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi: 10.1016/j.chemosphere.2010.07.006

of stored water may be lost, owing to elevated evaporation rates and low rainfall. The region surrounding the reservoir is characterized by crystalline rocks and the occurrence of various minerals and metals (Geological Service of Brazil, 2006). It should be pointed out that some of these metal compounds may also have radioactive potential. A reduction in water volume in the Lucrecia dam may result in the progressive concentration of these unhealthy sub-stances, such as metals and cyanotoxins ( Serra et al., 2006). In addition, the increased organic load resulting from anthropogenic action favors the proliferation of cyanobacteria and in turn cyanotoxins ( Sotero-Santos et al., 2006). All of these pollutants contribute to the loss of water quality in these surface waters and compromise the public supply, given that their consumption poses risks to human health. Thus, it is crucial to determine the genotoxic potential of the water, as well as the density of the main species of cyanobacteria present in this important dam in the northeast of Brazil.

In the municipality of Lucrecia, Brazil and surrounding area, a large number of cancer cases have been recorded since the 1970s. In 2007, the National Cancer Institute ( INCA – Brazil)



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estimated that the raw rate of cancer in the state of Rio Grande do Norte (RN) was 228.9 per 100 000 inhabitants. The incidence of cancer in the state capital (Natal) was 363.5 cases, whereas in the city of Lucrecia it was 776.8 cases.

The main source water for human consumption in this region is the Lucrecia dam, whose water is supplied by CAERN, the state-run water company, to the population after conventional treatment and chlorination.

The increased biomass of cyanobacteria is directly associated to water eutrophication, a condition that generally causes intoxication of the aquatic biota and of the population consuming the water resource. The increase in cyanobacteria in water supply reservoirs and the capacity of this type of microorganism to reproduce and release toxins (cyanotoxins) into the environment may affect human health by the ingestion of water or of contaminated foods, in addition to direct contact during recreational activities ( Sotero- Santos et al., 2006).

Metals are another important source of aquatic and environ-mental pollution, and many are potentially genotoxic and carcinogenic. These exhibit passive bioaccumulation and may cause an increase in several degenerative diseases in the populations exposed, such as different types of cancer (Beyersmann, 2002). The presence of high concentrations of metals is related to the drastic reduction in water quality, and their origin may be associated to different natural or anthropic causes (Beyersmann and Hartwig, 2008).

In recent decades many researchers have used fish as a genetic model to monitor toxic pollutants and contaminants in aquatic environments ( Hoshina et al., 2008). The use of Oreochromis niloticus, an exotic fish species, for assessments is due mainly to its omnivorous feeding habits and its mobility in source waters, mak-ing it feasible for use in environmental genotoxicity studies ( Jha, 2004). The micronucleus (MN) and nuclear abnormalities (NA) test in the blood cells of fish is a sensitive method for various genotoxic substances, showing good correlation with the results obtained in human cells ( Vanzella et al., 2007).

In recent decades the use of ichthyofauna as bioindicators of water genotoxicity caused by pollution in aquatic environments has increased in several countries. O. niloticus has been recently used by a number of authors in studies assessing genotoxicity and water biomonitoring in different regions of Brazil ( Linde-Arias et al., 2008; Barbosa et al., 2010).

The aim of this study was to assess the quality, from the genotoxic viewpoint, of the water in the Lucrecia dam. Accordingly, the following concentrations were measured: (i) cyanobacteria, metals and total alpha and beta particle activity in the water samples, (ii) a number of metals in the biological material of fish specimens and (iii) analyses of micronucleus (MN) frequency and other nuclear abnormalities (NA) in gill erythrocytes of O. niloticus. 2. Materials and methods

2.1. Characterization of the study area and sampling sites The Lucrecia dam is located in northeast Brazil, a semi-arid

region in the western part of the state of Rio Grande do Norte. This public reservoir has a maximum capacity of around 27 million cubic meters and is the most important water reservoir in the region.

The two water sample collection points at the Lucrecia dam were: P1 (6o7’6.34”S; 37o49’8.31”W), located near the water up-take point for public distribution by CAERN; and P2 (6o8’17.13”S; 37o49’54.05”W), located at the confluence point of the main drain-age waters of this water reservoir, in Frutuoso Gomes, RN ( Fig. 1). The Lucrecia dam waters, classified as type 2, are available for human consumption after conventional treatment ( CONAMA, 2005).

All the water samples from the Lucrecia dam at the collection

points (P1 and P2) were obtained at 0.5 m in the water column, between 9 h and 10 h. 2.2. Water analysis 2.2.1. Cyanobacteria analysis

Two 500 mL water samples per sampling point (P1 and P2) were collected for microbiological analyses in the rainy and dry seasons. The quantification and identification of cyanobacteria (cells mL-1) in the Lucrecia dam water samples were carried out by the Department of Aquatic Microbiology of the Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), using the light microscopy technique (Nikon microscope-Eclipse 200), following the method-ology described by the American Public Health Association ( APHA et al., 2005). 2.2.2. Metal analysis

To determine metal levels, 1000 mL water samples were collected at each sampling point. The sampling occurred during the rainy and dry seasons. The readings were done using flame atomic absorption spec-trometry – FAAS (Varian model 50B) after acid digestion of the sample. The assessment followed APHA (2005) guidelines.

2.2.3. Analysis of total alpha and beta radiation

For analyses of total alpha and beta radiation, 2000 mL of water was collected per point. The samples were collected in the rainy and dry seasons. Analysis of the distilled water sample as control was conducted only in the sampling campaign of 15 March, 2007 (rainy season). Quantification of the total alpha and beta radiation was conducted using the scintillation counting technique with an Eberline SAC-4 alpha counter and FHT – 770T beta counter.

2.3. Biological samples 2.3.1. Fish analysis

Fish from the species O. niloticus (Perciformes, Cichlidae) was used. Four collection campaigns took place; during the dry season 11 fish (N = 11) were sampled and during the rainy season 14 fish (N = 14) were collected. The control group fish were kept for 120 d in an acclimatized aquarium with 90 L of chlorine-free water.

To carry out the genotoxicity tests, fish blood was collected immediately after sampling by gills puncture, using heparinized syringes. Just after blood collection, slides for micronucleus and nuclear abnormalities test were prepared. All assays using fish were conducted in accordance with National and Institutional guidelines for animal welfare.

2.3.2. Analysis of metals in fish

To quantify the metals in the fish, we assessed seven metals (Cd, Cr, Cu, Fe, Ni, Pb and Zn). The estimate was made in samples of biological material from the gills and liver of the O. niloticus collected on 23 August, 2007 (dry season) and analyzed in triplicate by flame atomic absorption spectrometry –FAAS (Varian, model 50B).

In the samples of biological material from the control group fish and from those collected in the rainy season at the Lucrecia dam, the inductively coupled argon plasma, emission optical spectrometry technique was used to measure the metals (ICP–OES spectrometer – ICAP 6000 series).

The emission lines used followed recommendations for each of the metals. The results were com-pared to standards and the ICP–OES was calibrated with NIST traceable standard solution. The mean contents found in the biolog-ical material of the fish (O. niloticus) in the two collection seasons



A.E. Marcon et al. / Chemosphere 81 (2010) 773–780 775

Fig. 1. Location of the Lucrecia dam study area in the western region of Rio Grande do Norte – Brazil. at the Lucrecia dam were statistically compared (p 6 0.05), using Dunnett’s t-test, with the means obtained in the biological samples of the fish from the negative control group. 2.3.3. Micronucleus and nuclear abnormalities tests

The criteria for identification and quantification of the gill erythrocytes of O. niloticus with micronuclei were based on Çavas and Ergene-Gozukara (2005). Nuclear abnormalities such as binucleated cells with blebbed (BL), lobed (LB) and notched (NT) nuclei, were classified according to Carrasco et al. (1990).

Two hundred microliter of gill blood was applied onto each slide, totaling four slides per fish. The slides were then dried at room temperature for 2 h, fixed with absolute ethanol for 10 min and then transported to the laboratory in histological boxes for staining with 10% Giensa for 15 min.

A total of 3000 gill erythrocytes per fish from each sampling period were assessed using a 1000x oil-immersion lens. The mean frequency of MN and NA and the respective standard deviations (SD) were expressed in thousands (‰). The results were statisti-cally compared with those of the control group using Dunnett’s t-test (p ≤ 0.05).

3. Results and discussion 3.1. Water analysis 3.1.1. Cyanobacteria density

The results of cyanobacteria density (cells mL-1) are shown in Table 1. In the rainy season point P1 yielded the potentially toxic species, Sphaerocavum brasiliensis, with cell density above the maximum permitted limit (MPL) of cyanobacteria established by Bra-zilian law ( CONAMA, 2005) or WHO (2003), and three potentially toxic species with high cell density: Aphanocapsa sp., Microcystis aeruginosa and Cylindrospermopsis raciborskii. At this sampling point, these four species show respective levels of 52%, 18%, 16% and 8% of total cyanobacteria density observed. At point P2, four

potentially toxic species were found with cell density above the MPL of total cyanobacteria for class 2 freshwater systems: S. brasiliensis, C. raciborskii, Microcystis panniformes and M. aeruginosa. These four species accounted for 47%, 22%, 14% and 12% respectively, of the total cyanobacteria density observed.

At point P1 and P2 in the dry season three potentially toxic species were found with cell density above the MPL of total cyanobac-teria for class 2 freshwater bodies: Sphaerocavum sp., C. raciborskii and Microcystis aeruginosa and three potentially toxic species with high densities: Microcystis protocystes, Pseudanabaena moniliformis and Aphanocapsa sp.

These six species accounted for 39%, 28%, 15%, 8%, 5% and 5% respectively for point P1 and 44%, 15%, 14%, 6%, 5% and 4%, respectively for point P2. The total density of cyanobacteria, in all seasons and points analyzed, was higher than the MPL (>50 x 103 cells mL-1) permitted for class 2 freshwater bodies, according to CONAMA (2005) and several times above the moderate-to-high risk level (<100 x 103 cells mL-1), according to the World Health Organization ( WHO, 2003).

These data corroborate a number of studies on water quality with respect to the diversity and concentration of cyanobacteria in assorted surface reservoirs in Brazil ( Sotero-Santos et al., 2006).

The constant and significant density of cyanobacteria indi-cates the need for monitoring these organisms in the source water under study, given the potential release of cyanotoxins such as microcystins and saxitoxins.

The quantification of cyanotoxins and the carrying out of bioassays in conventionally treated and publicly distributed water is needed, given that long-term human contamination by microcystins and their bioaccumulation from the ingestion of fish and other organisms may potentially promote tumors in the population consuming these resources (Humpage et al., 2000).

In a host of surface water reservoirs in the country, the constant problem of pollution and loss of water quality caused by the presence of cyanobacteria has been observed. These problems have been exacerbated by the fact that most surface reservoirs for public distribution have the climatic and environmental characteristics needed for cyanobacterial proliferation throughout most of the



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Table 1 Cyanobacteria density (cells mL-1) of water samples from different points of the Lucrecia dam.

Sampling point/season Rainy – 3/15/2007 Dry – 8/23/2007 Cyanobacteria (cells mL-1)

P1 Pseudanabaena sp. 300 Cylindrospermopsis raciborskii 95 760 a, b Raphidiopsis sp. 4100 Geitlerinema unigranulatum 4560 Cylindrospermopsis raciborskii 21 000 Pseudanabaena moniliformis 8740 Geitlarinema unigranulatum 750 Chroococcus minutos 38 Aphanocapsa sp. 44 200 Aphanocapsa sp. 1558 Chroococcus minutos 100 Microcystes aeruginosa 51 908 a, b Cyanodicton sp 1950 Merismopedia sp. 2736 Sphaerocavum brasiliensis 128 800 a, b Diplochloris decussata 798 Microcystes aeruginosa 41 250 Chroococcus sp. 6612 Synechocystes sp. 400 Coelomorum sp. 4978 Merismopedia sp. 5400 Microcystes protocystes 29 146 Sphaerocavum sp. 131 024 a, b Total 248 250 Total 337 858

P2 Pseudanabaena sp. 50 Cylindrospermopsis raciborskii 66 150 a, b Raphidiopsis sp. 3850 Geitlerinema unigranulatum 5040 Cylindrospermopsis raciborskii 139 000 a, b Pseudanabaena moniliformis 19 320 Geitlarinema unigranulatum 150 Cylindrospermopsis sp. 4410 Planktothrix sp. 1500 Anabaenopsis sp. 714 Planktothrix aghardii 150 Pseudanabaena sp. 1638 Pseudanabaena galeata 50 Pseudanabaena sp. 1218 Pseudanabaena sp. 50 Aphanocapsa sp. 18 144 Oscilatoriales sp. 100 Microcystes aeruginosa 61 026 a, b Aphanocapsa sp. 10 200 Merismopedia sp. 5712 Aphanocapsa delicatissima 1400 Cyanodiction sp. 4536 Chroococcus minutos 200 Chroococcus sp. 8904 Cyanodicton sp. 750 Coelomorum sp. 17 976 Sphaerocavum brasiliensis 301 700 a, b Microcystes protocystes 26 460 Microcystes aeruginosa 77 850 a, b Sphaerocavum sp. 191 100 a, b Microcystes panniformes 90 000 a, b Microcystes protocystes 4400 Synechocystes sp. 400 Merismopedia sp. 6200

Total 638 000 Total 432 348

a Values above those permitted by Brazilian law, according to Resolution 357 (CONAMA, 2005). b Values above those permitted by Guidelines for safe recreational water environments (WHO, 2003)



year ( Sotero-Santos et al., 2006). Therefore, the presence of these toxic microorganisms in this source water likely collaborated in micronucleus induction and nuclear abnormalities in the erythrocytes of the sampled fish (O. niloticus) ( Ergene et al., 2007).

3.1.2. Analysis of metals in water The concentrations of the seven metals analyzed are shown in

Table 2. Manganese, nickel, chromium and copper were the metals found in the water samples from the Lucrecia dam at both sam-pling points in the different seasons analyzed. These were above the MPL for class 2 and 3 waters, according to CONAMA (2005) and above the CMC (Criteria Maximum Concentration) for freshwater ( WHO/IPCS, 1998). Besides copper and chromium, zinc and cadmium were also observed above the permitted limits at a number of sampling sites. The concentration of cadmium in the rainy sea-son (03/15/2007) was more than 120 times higher than the MPL al-lowed by Brazilian law for class 2 bodies of water and 12 times greater than the MPL for class 3 source waters (CONAMA, 2005) and 60 timer higher than the CMC ( US EPA, 2009). Point P2 showed the presence of cadmium during the dry season (8/22/2007) at a concentration 20 times higher than the MPL established by CONAMA (2005) and 10 times higher than the CMC ( US EPA, 2009).

The presence of metals in water resources is another factor that compromises the water quality of public reservoirs in different regions of Brazil. This is mainly due to the presence of mineralization near the drainage points, intensive

agriculture with inadequate irrigation in the vicinity of the dam, uneven rain distribution, high evaporation rates and the geological complexity of the region. High densities of a number of metals, above the maximum limits per-mitted by CONAMA (2005) and US EPA (2009) were observed in the water samples from the Lucrecia dam. Among the toxic metals included on the list of main pollutants are: cadmium, chromium and nickel. The presence of metallic elements in these waters may be one of the factors that increases genetic damage in the blood cells of the source water fish analyzed ( Udroiu, 2006) given that the presence of cadmium, chromium and nickel in these waters is related to interference in enzymatic action and the inhi-bition of DNA repair in the exposed organisms ( Peralta-Videa et al., 2009; Zhou et al., 2009).

3.1.3. Analysis of total alpha and beta radiation

Another worrisome indicator of water quality degradation and possible collaborator in the increased potential for water genotox-icity in the dam was the elevated presence of total alpha and beta radiation. The concentrations of total alpha and beta radiation are shown in Table 3. Total alpha and beta radiation obtained in water sam-ples from both sampling points at the Lucrecia dam during the first collection in the rainy season (3/15/2007) showed a significantly increased concentration compared to the negative control. For the other collection seasons, only the P1 sampling point showed a significant increase and only for total alpha radiation. The mean levels of total alpha and beta radiation in the water samples from the Lucrecia dam collected in the rainy season also showed a significant difference (p≤0.01) compared to the mean levels obtained in collections in the dry and rainy seasons of 2007 and 2008, respectively.




Table 2 Concentrations (mg L-1) of the metals assessed in the water samples from diferent points at the Lucrecia dam.

Note: < Represent metal concentrations (mg L-1) below the detection limit of the analytical technique (FAAS). a Represent metal concentrations (mg L-1) above the MPL for class 2 bodies of water, according to Resolution 357 ( CONAMA, 2005). b Represent metal concentrations (mg L-1) above the CMC for freshwater, according to National Recommended water quality criteria ( US EPA, 2009).

Table 3 Concentrations of total alpha and beta radiation in water samples from different points of the Lucrecia dam.

Season Samples Radiation (Bq L-1)

Total alpha Total beta – Negative control 0.14 ± 0.0 0.36 ± 0.07

Rainy3/15/2007 P1 1.35 ± 0.48** 2.05 ± 0.3** P2 0.87 ± 0.0** 1.50 ± 0.23**

Dry– 8/23/2007 P1 0.17 ± 0.0** 0.47 ± 0.08 P2 0.13 ± 0.0 0.37 ± 0.07

Rainy – 4/5/2008 P1 0.41 ± 0.0** 0.45 ± 0.07 P2 0.12 ± 0.0 0.25 ± 0.04 Mean ± Standard deviation

Note: values marked with ** represent statistical difference compared to the negative control, using the Student’s t-test (p ≤ 0.01).

According to Gastaldo et al. (2008), beta radioactivity, in addi-tion to generate DNA lesions as strand breaks, interferes in the rate of DNA repair. Ishikawa et al. (2003) related alpha radiation withchromosomal breaks and with the appearance of cancer in the human population. The occurrence of alpha and beta radiation on the surface and subterranean waters of the Lucrecia region was re-ported by Malanca et al. (1998).

3.2. Biological samples 3.2.1. Analysis of metals in fish

The mean levels and standard deviations (μg g-1) of the seven metals and the weights (g) of the samples (in natura) of gills and liver of O. niloticus, are presented on Table 4.

All the metals assessed in the samples of gills and liver of O. niloticus

from the negative control were found at low levels or not detected at all. The negative control group fish showed no bioaccumulation of any of the seven metals assessed.

The metal accumulation in fish was higher in the dry season than in the rainy season, in both organs analyzed, probably due to the high evaporation rates that take place in the dry season, resulting in a sharp reduction in source water. The accumulation pattern of metals in the fish during the dry season follows the sequence: Zn > Pb > Cr > Cu > Ni for the gills and Cu > Zn > Pb > Cr > Ni for the liver. In the rainy season, the gill showed: Zn > Cr and the liver: Cu > Fe > Zn > Cr > Pb > Ni. These data indicate that this exo-tic ichthyofauna may be undergoing chronic bioaccumulation, mainly of copper in both seasons. The metal concentrations in the gill samples also suggest likely acute contamination exposure from five metals (Zn, Pb, Cr, Cu, Ni) in the fish in both seasons at this important public reservoir in the northeast of Brazil.

Nakayama et al. (2010) found copper and zinc in high concen-trations in the sediment as well as in fish (O. niloticus) in Lake Itezhi-tezhi, located near a mining area, in Zambia. Falusi and Olanipekun (2007) also reported higher values for Cu and Zn than those for Ni and Pb in the tropical crab (Carcinus sp.).

Metals such as iron, copper, manganese, zinc, cobalt, selenium and nickel are essential for normal body functions ( Alemdaroglu et al., 2003). Field and laboratory studies showed that accumulation of heavy metals in a tissue is mainly dependent upon water concentrations of metals and exposure period, although other environmental factors such as salinity, pH, hardness and tempera-ture play significant roles in metal accumulation (Barlas et al., 2005).

However, metals form a particularly complex class of muta-gen, since they can interact in different ways with the cellular machinery. They can compete with other metals, by binding to DNA, to specific amino-acids or to specific sites ( Mateuca et al., 2006).

3.2.2. Micronucleus and nuclear abnormalities tests The results of mean frequencies per thousand cells (‰) and the

standard deviations of micronuclei and of nuclear abnormalities are shown in Table 5. Fish from Lucrecia dam showed a significant increase in both micronucleus and nuclear abnormalities, in all periods analyzed.

The presence of metals and cyanobacteria above levels allowed by environmental regulatory agencies is a strong indicator of anthropogenic activities ( Mendiguchía et al., 2007).

All the parameters analyzed in this study (cyanobacteria, metals in water and fish as well as alpha and beta radiation) may be responsible, alone or in association, for the mutagenicity observed, particularly from the generation of reactive oxygen species (ROS), which subsequently attack DNA and proteins (Mateuca et al., 2006; Campos and Vasconcelos, 2010). Tubuline disruption may also be a consequence of metals and can induce malsegregation of chromatide/ chromosome by interfering with the accurate functioning of the mitotic spindle ( Mateuca et al., 2006).

In this study, copper showed concentrations above the MPL for waters ( CONAMA, 2005 and WHO/IPCS, 1998) and in the liver of fish from both Lucrecia dam collections. This region contains copper mineralizations at the main drainage points of the sub-basins that form this public reservoir ( Geological Service of Brazil, 2006).

Grillo et al. (2009) recently demonstrated that in vitro treat-ment with both metallic copper and copper ions induced chromo-somal abnormalities and altered the mitotic index of CHO-K1 cell lines.

Chromium was found above the MPL ( CONAMA, 2005) in both samples analyzed (water and fish). With respect to the behavior of this metal, it was found that the absorption of hexavalent chromium is greater than that of trivalent chromium, owing to the high solubility of the former, since it enters the cell by facilitated diffusion, whereas trivalent chromium penetrates by passive diffusion and phagocytosis and has low membrane penetration. This element has variable valence and may enter into the Haber–Weiss

Season Metal (mg L-1) Lucrecia dam Negative control

P1 P2 (NC)

10/3/2006 – Dry Cd <0.02 <0.02 <0.02 Cr <0.06 <0.06 <0.06 Cu 0.05 a, b <0.03 <0.03 Mn 0.97 a 0.25 a <0.02 Ni 0.13 a 0.11 a <0.1 Pb <0.1 <0.1 <0.1 Zn 0.32 a, b 0.14 b <0.01

3/15/2007 – Rainy Cd 0.12 a, b <0.02 <0.02 Cr 0.17 a 0.15 a <0.06 Cu 0.04 a 0.04 a <0.03 Mn 0.07 0.09 <0.02 Ni <0.1 <0.1 <0.1 Pb <0.1 <0.1 <0.1 Zn 0.02 <0.01 <0.01

8/23/2007 – Dry Cd <0.02 0.02 a <0.02 Cr 0.08 a <0.06 <0.06 Cu <0.03 <0.03 <0.03 Mn 0.15 a 0.15 a <0.02 Ni <0.1 <0.1 <0.1 Pb <0.1 <0.1 <0.1 Zn <0.01 0.17 <0.01

4/5/2008 – Rainy Cd <0.02 <0.02 <0.02 Cr 0.06 a <0.06 <0.06 Cu <0.03 <0.03 <0.03 Mn <0.02 0.03 <0.02 Ni <0.1 <0.1 <0.1 Pb <0.1 <0.1 <0.1 Zn 0.02 0.04 <0.01



Note 1: mean and standard deviation (X ± SD) of the metal levels (μg g-1 of samples) evaluated by FAAS and by ICP–OES. Note 2: na = metal not assessed by ICP–OES. Note 3: nd = metal not detected (μg g-1 of samples) by FAAS technique. Note 4: values marked by the letters (a) p ≤ 0.05; (b) p ≤ 0.01; (c) p ≤ 0.005; (d) p ≤ 0.001; (e) p ≤ 0.0005; and (f) p ≤ 0.0001 represent statistical differences in relation to the negative control group, using the Student’s t-test.

Tabl

e 4

Con

cent

ratio

n of

Cd,

Cr,

Cu,

Fe,

Ni,

Pb a

nd Z

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11/

15/2

007

M

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g)

Cd

Cr

Cu

Fe

Ni

Pb

Zn

778

1

Gill

5.39

3 2.

06E-

06

9.40

E-06

1.

33E-

05

2

6.13

5 2.

80E-

06

3.08

E-06

1.

68E-

05

3

4.83

2 1.

24E-

05

3.77

E-06

8.

06E-

05

4

6.99

7 nd

9.

70E-

06

7.56

E-06

5

4.

315

8.81

E-06

8.

27E-

06

8.75

E-05

6

6.

907

1.98

E-06

0.

00E+

00

1.03

E-05

7

4.

565

5.43

E-06

6.

24E-

06

2.76

E-05

8

4.

237

8.71

E-06

6.

89E-

06

8.31

E-05

9

2.

174

1.06

E-05

2.

47E-

05

1.74

E-04

X ±

SD

5.06

± 1

.51

5.9E

-06

± 4.

4E-0

6 8.

0E-0

6 ±

7.0E

-06

5.5E

-05

± 5.

6E-0

5 1

Live

r 1.

470

1.63

E-04

3.

85E-

05

1.20

E-02

2

2.

788

1.64

E-04

2.

02E-

05

1.33

E-02

3

1.

143

1.91

E-04

5.

79E-

05

1.31

E-02

4

0.

848

1.19

E-04

4.

93E-

05

7.55

E-03

5

1.

365

2.13

E-04

3.

43E-

05

1.88

E -02

6

1.

599

1.99

E-04

3.

90E-

05

1.28

E-02

7

1.

439

1.66

E-04

2.

86E-

05

9.29

E-03

8

0.

975

1.34

E-04

5.

13E-

05

1.16

E-05

9

0.

756

1.60

E-04

3.

51E-

05

6.21

E-03

X ±

SD

1.37

± 0

.6

1.7E

-04

± 3.

0E₃

0 3.

9E- 0

5 ±

1.2E

-05

1.0E

-02

± 5.

5E-0

4 Th

e Lu

crec

ia d

am (F

AA

S) –

8/2

3/20

07

1

Gill

5.98

1 1.

09E-

03

2.79

E-02

1.

96E-

02

2

5.87

6 nd

3.

52E -

02

2.72

E-02

3

5.

516

1.10

E-03

3.

14E-

02

2.30

E-02

4

5.

986

1.47

E -03

3.

25E-

02

3.34

E-02

5

5.

986

1.66

E-03

3.

72E-

02

3.62

E-02

6

5.

079

1.00

E-02

2.

38E-

02

4.32

E-02

X ±

SD

5.74

± 0

.37

2.5E

-03

± 3.

7E-0

3 3.

1E-0

2 ±

4.8E

-03f

3.0E

-02

± 8.

8E-0

3e

1 Li

ver

2.03

3 nd

7.

05E-

03

4.91

E -01

2

1.

645

nd

1.39

E-03

7.

85E-

01

3

2.11

0 nd

1.

24E -

03

1.03

E+00

4

2.

365

nd

3.25

E-03

9.

66E-

01

5

1.71

1 nd

7.

07E-

03

nd

6

1.76

1 nd

7.

16E-

03

5.03

E-01

X ±

SD

1.95

± 0

.28

nd

4.5E

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± 2.

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± 3.

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02

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2

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2.

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02

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02

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1.

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02

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± 0

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nd

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-02

± 6.

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03

1.28

E-01

6.

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03

1.46

E-01

3.

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3

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03

1.12

E-01

5.

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2.36

5 3.

25E-

03

3.16

E-02

3.

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01

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± 0

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-02

± 3.

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2 1.

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1 ±

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3.

5E+0

1 ±

2.4E

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1.

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3.60

E-06

4.

37E

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5.20

E-06

3.

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6.87

E-06

5.

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E-06

2.

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06

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05 6.

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06

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03 9.

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06

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03 2.

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05

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6 ±

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4.93

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03 3.

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05

1.64

E₃

03 1.

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05

3.15

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03 9.

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04

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05

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03 3.

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05

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03 3.

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05

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03 3.

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05

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03 9.

29E-

04

5.06

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03 5.

25E-

05

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2.

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4 ±

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-04

na

8.71

E-03

na

9.

08E-

03

na

5.11

E-03

na

6.

00E-

03

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1.08

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1.

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02

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± 2.

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9.

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0 4

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2.

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± 1.

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nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

nd

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5.

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02

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2.

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02

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± 1.

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3.7E

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± 1.

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5.

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4.

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04

1.2E

-04

± 1.

4E-0

4 2.

29E-

03

1.19

E-03

3.

73E-

03

3.47

E-03

2.

20E-

03

2.25

E-03

2.

93E-

03

3.62

E-03

5.

22E-

03

3.0E

-03

± 1.

2E-0

3

4.46

E-02

5.

15E-

02

3.03

E-02

4.

03E-

02

3.77

E-02

4.

76E-

02

4.2E

-02

± 7.

5E-0

3f

4.88

E-02

3.

65E-

02

1.53

E-02

1.

98E -

02

3.53

E-02

3.

00E-

02

3.

1E-0

2 ±

1.2E

-02ª

nd

nd

nd

nd

nd nd

3.98

E-02

1.

10E-

01

4.97

E-02

5.0E

-02

± 4.

5E-0

2

4.79

E-04

3.

04E-

04

1.40

E-03

1.

80E-

04

1.98

E-03

3.

97E-

04

6.75

E-04

1.

91E-

03

2.91

E -03

1.5E

-03

± 1.

9E-0

3 3.

19E-

03

2.10

E-03

3.

08E-

03

3.44

E-03

3.

50E-

03

2.36

E-03

2.

88E-

03

3.15

E-03

5.

30E-

03

3.2E

-03

± 9.

0E-0

4

4.25

E-01

4.

42E-

01

3.60

E-01

5.

06E-

01

6.31

E-01

5.

33E -

01

4.8E

-01

± 9.

5E-0

2f

1.85

E-01

1.

86E-

01

1.79

E-01

1.

79E-

01

1.83

E-01

1.

69E-

01

1.

8E-0

1 ±

6.4E

-03f

3.24

E-02

3.

63E-

0 nd

2.

96E-

02

2.4E

-02

± 1.

6E-0

2a

8.

94E+

00

3.61

E+01

1.

31E+

01

1.11

E+01

1.7E

+01

± 1.

2E+0

1a

A.E.Marconetal./Chemosphere81(2010)773–780




Table 5 Frequency of micronucleus and nuclear abnormalities in the gill erythrocyte cells of fish (O. niloticus), collected at the Lucrecia dam.

Season Sample N Micronucleus Nuclear abnormalities

– Negative control 9 0.9 ± 0.8 4.9± 2.7

Dry Lucrecia dam 5 3.4 ± 1.5* 9.4± 3.5*

Rainy 10 2.9 ± 1.6** 12.1 ± 5.4* Dry 6 2.8 ± 1.8* 12.2 ± 5.0*

Rainy 4 3.2 ± 1.1* 13.8 ± 5.2* Mean (‰) ± Standard deviation

Note: values marked with * and ** represent statistical differences of p ≤ 0.05 and p ≤ 0.01 respectively in relation to the negative control, using Dunnett’s t-test.

reaction and produce ROS, thereby increasing oxidative stress and lipoperoxidation. A number of authors report that hexavalent chromium is more genotoxic than trivalent ( DeFlora et al., 1990). Seoane and Dulout (2001) showed that trivalent chromium significantly induced MN in vitro in human fibroblast cell lines. Dai et al., 2009 reported that both chromium ions interfere in proliferation and growth, in addition to inhibiting DNA division and synthesis in human cell lines (HeLa).

Moreover, they inhibit DNA polymerases, reduce DNA replication and repair and increase dif-ferent types of mutations. The increased frequency of micronuclei in the erythrocytes of fish exposed to oil refinery wastewaters con-taminated with chromium was demonstrated by Çavas and Ergene-Gozukara (2005).

The results of a recent study by Lushchak et al. (2009) showed a significant increase in oxidative stress in the brains of fish chronically exposed to chromium.

Nickel is a carcinogenic and bioaccumulative metal that may cause a number of diseases, alter cell proliferation, genetic expression and calcium dependent enzyme activity, interfere in DNA methylation and repair and in the histones, in addition to inducing MN in fish ( Buschini et al., 2009; Zhou et al., 2009).

The high contamination levels of the waters and the genetic damage observed in fish suggest that all the organisms in this region, including the human population supplied by the Lucrecia dam, are being affected by environmental contamination. 4. Conclusion

During the entire monitoring of genotoxicity using fish, the occurrence of MN and NA was significantly higher than in the neg-ative control. The high content of some metals, the significant occurrence of elevated levels of toxic cyanobacteria and radioactivity indicators in these waters are some of the factors that may be increasing genetic damage in the fish of the Lucrecia dam.

Further-more, the bioaccumulation of genotoxic metals in the biological samples analyzed of O. niloticus may be another aggravating factor for the increased induction of genetic alterations analyzed.

Therefore, the presence of these environmental pollutants is likely associated to the genotoxic potential of these waters.

Acknowledgements

We thank Dr. Erivan Sales do Amaral from the Natural Re-sources Laboratory/IFRN for his collaboration in determining the metals in the water samples, Dra. Ivaneide Soares from the Department of Microbiology and Parasitology/UFRN for her contributions in assessing cyanobacteria density, and Dr. Henrique Takuji Fuku-ma from the CNEN (Poços de Caldas) for the analyses of total alpha and beta radiation in the water samples. We are also grateful to the Banco do Nordeste and CT-Hidro/CNPq for financial support and the doctoral scholarship.

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3.2. ARTIGO 2

• Manuscrito para submissão a revista Internacional

• Título do artigo: Análise da água de abastecimento e da genotoxicidade

humana em Lucrécia, Rio Grande do Norte, Brasil.



Análise da genotoxicidade humana, da qualidade ambiental e da água

de abastecimento no município de Lucrécia/RN, Brasil.

Alexandre Endres Marcon a, Marcos Felipe de Oliveira Galvão b, Anuska Conde Fagundes

Soares Garcia b, Thomas Ferreira da Costa Campos c, Thiago de Melo Cabral b, Renata

Panosso d e Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros a,b*.

a Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da

Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil

b Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil

c Departamento de Geologia, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil

d Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil

* Contato do autor:

Dra. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros.

Departamento de Biologia Celular e Genética, CB – UFRN

Av. Salgado Filho, s/n - Campus Universitário, Lagoa Nova

Natal, 59072-970, RN, Brazil

Tel.: # 55.84.3211-9209; Fax # 55.84.3215-3346

E-mail address: [email protected] (S. Batistuzzo de Medeiros)

mailto:[email protected]



RESUMO

O município de Lucrécia está localizado na região semi-árida do Rio Grande do

Norte/Brasil numa área impactada negativamente por regime de chuvas irregulares e

prolongados períodos de seca. As taxas de câncer neste município têm demonstrado

freqüências elevadas (777 casos/ano) desde a década de 70 (INCA, 2007). Foram

coletadas neste município amostras de água de abastecimento público sazonalmente e

amostras de mucosa oral humana (N=26) de ambos os sexos (média etária de 25 anos).

Os resultados obtidos nas amostras de água abastecimento indicaram a presença de

poluentes (cianobactérias tóxicas, metais e radioatividade) e na atmosfera do interior das

residências da área urbana foram detectadas radiações ionizantes acima do LMP (OMS,

2009). A análise da freqüência de micronúcleos e alterações nas células de mucosa oral

da população humana estudada no município de Lucrécia mostrou diferença significativa

(p≤0.05) em relação à população de Natal com o teste t Student’s. Os diversos poluentes

que ocorreram na água de abastecimento de Lucrécia provavelmente estão colaborando

para o aumento do potencial genotóxico nessa população humana. Futuras pesquisas

nesta área deverão investigar as fontes desses passivos ambientais no município para

que se estabeleçam ações mitigadoras que melhorarem a qualidade de vida na região.

Palavras chave: Micronúcleos, Alterações Nucleares; Mucosa Oral Humana;

Cianobactéria; Metais; Radioatividade.



ABSTRACT

The municipality of Lucrécia is located in semi-arid region of Rio Grande do Norte/Brazil in

a local impacted negatively by irregular rainfall and prolonged dry periods. Cancer rates in

this municipality have shown high frequencies (777 cases/year) since the 70s (INCA,

2007). The samples of public water supplies were collected seasonally and samples of

human oral mucosa (N = 26) of both sexes (age mean of 25 years).The results obtained in

water supply samples showed the presence of pollutants (toxic cyanobacteria, metals and

radioactivity) and in the atmosphere in door residences were detected ionizing radiations.

Analysis of micronucleus frequency and nuclear abnormalities in oral cells of the studied

population of the municipality of Lucrécia was significantly different (p ≤0.05) compared to

the population of Natal/RN with the Student’s t test. The various polluting that ocurred in

the water supply of Lucrécia is probably contributing to the increase of the genotoxic

potential in this human population. Further researches in this area should investigate the

sources of these environmental passives to be established mitigating actions that improve

the quality of life in region.

Keywords: Micronucleus, Nuclear Abnormalities, Human Buccal Cells; Cyanobacteria;

Metals; Radioactivity.



1. Introdução

O município de Lucrécia na região semi-árida do nordeste do Brasil possui

aproximadamente 3.200 habitantes, sendo que 70 % destes residem na área rural

e 30 % na área urbana (IBGE, 2008). Nesta região são relatados elevados casos

de câncer desde a década de 70. Em 2007, o Instituto Nacional do Câncer (INCA -

Brasil) estimou freqüência de câncer no município de Lucrécia 3 vezes mais alta

que a capital do estado (Natal/RN). Durante décadas a principal fonte de

abastecimento hídrico humano desse município foi açude de Lucrécia, que foi

construído em 1934, e tem mostrado indícios de poluição (Malanca et al., 1998;

Serra et al., 2006).

A presença de cianobactérias em reservatórios hídricos está diretamente

associada à eutrofização do manancial (Sotero-Santos et al., 2006). Esses

microorganismos podem liberar cianotoxinas na água de abastecimento, afetando

tanto a biota aquática quanto a saúde das populações humanas consumidoras

desse recurso hídrico poluído (FUNASA, 2003). As formas de exposição humana

podem ocorrer pelo consumo de água e/ou pescado contaminado por cianotoxinas

e também pelo contato direto em atividades de recreação (Gkelis et al., 2006).

A presença de radioatividade diminui a qualidade hídrica e afeta diretamente

todas as populações expostas. Entre os radionuclídeos primordiais responsáveis

pela radiação destacam-se o isótopo 222 do gás radônio (Rn-222), que é emissor

partícula alfa e decai para Bi 214 e o Pb 214 que emissores partículas beta

(UNSCEAR, 2000).

O Rn-222 percola através do solo e da rocha, podendo se dissolver na água

e acumular no interior de residências, e por não se ionizar na água tem mais

mobilidade do que outros elementos da série de decaimento do U 238 (AMACS,



1987). A inalação desse gás radioativo pode gerar câncer de pulmão, e é

problema de saúde pública (Greenlee et al., 2001; FPTRPC 2000; NRC, 1998 e

NRPB, 1990).

Os metais são outra importante fonte de poluição aquática e ambiental,

muitos são potencialmente genotóxicos e cancerígenos e alguns são também

radioativos (Beyermann and Hartwig, 2008).

A função primária da mucosa oral, semelhante à pele, é a proteger as

estruturas subjacentes contra a agressão de agentes externos. Mas a

permeabilidade da mucosa oral é maior que a da pele, porém menos que a do

intestino (Nicolazzo et al., 2005).

Nas últimas décadas as células da mucosa oral têm sido utilizadas em

diversos trabalhos para biomonitorar populações humanas expostas a compostos

mutagênicos, pois essas células estão expostas ao contato direto com poluentes

ingeridos ou inalados (Salama et al., 1999; Smerhovsky et al., 2002; Joseph et al.,

2004; Maluf, 2004; Minozzo et al., 2004; Evseeva et al., 2005; Heepchantree et al.,

2005; Holland et al., 2008; Ceppi et al., 2010; Hintzsche e Stopper, 2010).


simples de avaliação de risco de câncer e biomonitoramento humano (Scott et al.,

1998; Fenech et al., 1999; Heepchantree et al., 2005). Esses biomarcadores tem

ampla aplicação na ecotoxicologia (Gauthier et al., 1999) e se manifestam

rapidamente após exposição aos agentes genotóxicos e antes de sinais clínicos

evidentes (Titenko-Holland et al., 1998; Salama et al., 1999; Fenech e Ferguson,

2001; Holland et al., 2001).

Diversos trabalhos tem o associado à presença de cianobactérias, metais e

radioatividade ao aumento da frequência de micronúcleos em células de mucosa



oral de populações humanas expostas (Majer et al., 2001; Oliveira and Cury, 2002;

Smerhovsky et al., 2002; Ishikawa et al., 2003; Masuk et al., 2008).

Ttrabalho recente do nosso grupo de pesquisa (Marcon et al., 2010) relatou

ocorrência de aumento genotoxicidade em peixes e poluentes nas águas do açude

de Lucrécia. Os pesquisadores do laboratório de radiologia natural (LARANA) do

Departamento de Geologia/UFRN têm divulgado a ocorrência de gás Rn-222 e de

radiação gama acima do LMP pela OMS em residências do município de Lucrécia

(Campos et al., 2010).

Logo, no intuito de avaliar a genotoxicidade humana nesse município do

semi-árido brasileiro e a presença de contaminantes na água de abastecimento foi

realizado este trabalho. Para tanto, foram medidas as concentrações: i)

cianobactérias, metais e partículas alfa e beta total na água de abastecimento e ii)

analisada a freqüência de micronúcleos (MN) e de alterações nucleares (NA) nas

células da mucosa oral da população urbana de Lucrécia e Natal.

2. Material e Métodos

2.1. Caracterização da área de estudo e locais de amostragem

O município de Lucrécia ((6o07’00’’ S; 37o39’00’’ W), está localizado junto a

sub-bacia do Rio Umari, no nordeste do Brasil, numa região semi-árida do médio

oeste do estado do Rio Grande do Norte e tem uma população de 3.423

habitantes, sendo que aproximadamente 35% são residentes da área urbana

(IBGE, 2008).

Na Figura 1 está representada a localização da área de estudo e as

características geológicas da região de Lucrécia.



Figura 1. Mapa Geológico simplificado da região de Lucrécia na micro-região

Umarizal (RN). Modificado de Araújo (1995): Mapeamento Geológico da região de

Lucrécia.

As amostras de água de abastecimento foram coletadas sazonalmente

(período seco e chuvoso) no município de Lucrécia (6o07’10’’ S; 37o39’30’’ W),

entre março de 2007 e novembro de 2009. Em março de 2009 foi realizada coleta

de água de abastecimento do Centro de Biociências no Campus da UFRN

(5o50’30’’ S; 35o12’30’’ W) em Natal, que é subterrânea.

Os métodos de coleta, preservação, acondicionamento, transporte e tempo

decorrido entre a coleta e a análise seguiram as recomendações da American

Public Health Association (APHA, 2005).

2.2. Análise hídrica

2.2.1. Análise de cianobactérias

Foram coletadas duas amostras de 500 mL de água de abastecimento de

Lucrécia para as análises de cianobactérias.



A quantificação e identificação das espécies de cianobactérias (céls mL-1)

nas amostras de água de consumo humano de Lucrécia foram realizadas pelo

método de Utermohl pelo Departamento de Microbiologia e Parasitologia/UFRN,

mediante a técnica de microscopia de luz (com microscópio marca Olympus) em

conformidade com a metodologia descrita pela American Public Health Association

(WHO, 2008).

2.2.2. Análise de metais

Foram coletadas 1000 mL de amostras de água de abastecimento em cada

município estudado para determinar os teores de metais.

As análises foram feitas por espectrometria de absorção atômica de chama -

EAAC (Varian model 50B) após digestão ácida da amostra, de acordo com as

recomendações da APHA (2005).

2.2.3. Análise de radiação alfa e beta total

Foram coletadas 2000 mL de água de abastecimento nos municípios de

Lucrécia e Natal para a análise da radiação alfa e beta total.

A quantificação da radiação alfa e beta total foi executada pelo

LAPOC/CNEN usando a técnica de contagem de cintilação com Eberline SAC-4

(alpha counter) e FHT-770T (beta counter).

2.3. Análise de radioatividade atmosférica

2.3.1. Análise de gás Radônio (Rn - 222)

A concentração de gás Radônio (Bq m-3) no interior das edificações da zona

urbana foram medidas por emanometria passiva do isótopo Rn-222 utilizando



detectores do tipo electret de curto e longo período (L E-PERM®) da RADELEC

System.

2.3.2. Análise de radiação Gama (γ)

No interior das construções da zona urbana também foram medidas as

emissões de radiação Gama total (cpm e µR h-1) por espectrometria com o

aparelho modelo RS-126 da marca TerraPlus®.

2.4. Material biológico

2.4.1. Células de mucosa oral humana

Para a análise das freqüências de micronúcleos (MN) e alterações nucleares

(NA) nas células de mucosa oral humana foram realizadas coletas em 28

voluntários (N=28) de ambos os sexos residentes a mais de dois anos na área

urbana de Lucrécia, com faixa etária entre 18 e 45 anos, sendo que todos eram

saudáveis, não fumantes, não utilizaram medicação (e.g., antibióticos), nem

estiveram expostos ocupacionalmente a compostos químicos durante os últimos

12 meses, e seus prógenitores até segundo grau não eram consaguíneos.

O grupo controle consistia também de 28 doadores de ambos os sexos

residentes da área urbana da capital do estado, Natal, que está localizada na

região costeira do país, distante 380 km do município de Lucrécia. Este grupo

controle possuía características de estrutura populacional e étnica semelhantes à

população de Lucrécia.

Todos os voluntários doadores de mucosa oral foram informados sobre os

objetivos e riscos da amostragem, e consentiram voluntariamente para coleta

celular. Após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE)

anteriormente submetido ao CEP/UFRN foi realizada a amostragem celular dos



doadores de ambos municípios estudados. A posterior manipulação e

armazenamento deste material biológico humano foram executados de acordo

com os padrões éticos estabelecidos pelo Comitê de Ética da Pesquisa Científica

da UFRN (CEP/UFRN).

2.4.2. Amostragem das células da mucosa oral, coloração e quantificação de

micronúcleo (MN) e alterações nucleares (NA)

As amostras de células de mucosa oral humana foram obtidas por

profissionais capacitados da área de saúde com espátulas de madeira estéreis e

individuais. Após a coleta, as amostras biológicas foram armazenadas a 4o C, em

tubos cônicos com 15 mL de soro fisiológico. Após, as amostras foram

transportadas para o laboratório, onde foram lavadas, centrifugadas três vezes a

1.500 rpm por 10 min e ressuspendidas em 500 µL de soro fisiológicos.

Depois 50 µL dessa suspensão celular foi aplicada numa lâmina seca e

limpa, fixadas em metanol 80 % gelado por 30 min e seca a temperatura ambiente

por 48 h. Posteriormente, as lâminas foram hidrolisadas em solução de 1 N de HCl

em estufas a 60o C, sendo a seguir coradas com reativo de Schiff (Holland et al.,

2008).

Os critérios para as avaliações de micronúcleos (MN) nas células da mucosa

oral humana seguiram as recomendações de Fenech et al. (1999). As alterações

nucleares (NA), tais quais, núcleo com brotamento (NB), células binucleadas (BN),

picnóticas (PY), cariólise (KL) e fragmentado (NF) foram classificados de acordo

com Holland et al. (2008).

Um total de 2.000 células de mucosa oral de cada voluntário do município de

Lucrécia e Natal foram analisadas usando aumento de 1.000 X em microscópio de

luz (Nikon 200 modelo eclipse).



A freqüência média de MN e NA e seus respectivos desvios padrões foram

avaliados obtidos com o teste ANOVA fator único e expressos por mil (‰). O teste

t Student’s (p≤0,05) foi utilizado para comparar estatisticamente as médias de MN

e NA nessas duas populações humanas do nordeste brasileiro, conforme

recomendações de Holland et al. (2008).

3. Resultados e Discussão

3.1. Análise hídrica

3.1.1. Análise de cianobactérias

Os resultados da densidade de cianobactéria (céls mL-1) nas amostras de

água de abastecimento estão demonstrados na Tabela 1.

Tabela 1. Densidade de cianobactéria (cels mL-1) das amostras de água de

abastecimento do município de Lucrécia.

Cianobactéria (céls mL-1) Estação Chuvosa - 15/03/2007 Chuvosa - 01/10/2008

Pseudanabaena sp. 21 Aphanocapsa sp. 27

Raphidiopsis sp. 42 Cylindrospermopsis sp. 27

Cylindrospermopsis sp. 2.520 Células esféricas (ni) 5.385

Geitlarinema unigranulatum 42 Planktothrix sp. 21 Pseudanabaena galeata 210 Aphanocapsa sp. 273 Synechocystes sp. 1.554 Total 4.683 5.439

Estação Chuvosa - 03/02/2009 Seca - 03/11/2009 Aphanocapsa sp. 903 Aphanocapsa sp. 45

Pseudanabaena sp. 903 Chroococcus minor 250

Células esféricas (ni) 27.568 Cylindrospermopsis sp. 18

Células esféricas (ni) 45

Total 29.374 358

Nota1: (nd) – amostra não determinada. Nota2: (ni) – microorganismo não identificado.



Nota3: Todos os valores obtidos estiveram acima dos valores máximos permitidos nas legislações da Portaria no. 518 (MS, 2004) e Orientações de Qualidade de Água Potável (WHO, 2008).

Na estação chuvosa (março de 2007), a amostra de água de abastecimento

de Lucrécia apresentou oito gêneros de cianobactérias, sendo que dois gêneros

com densidade celular elevada: o filamentosa produtor de cianotoxina,

Cylindrospermopsis sp. com densidade de 2.520 céls mL-1e Synechocystes sp.

com 1.554 céls mL-1, representando aproximadamente 54 e 33 % respectivamente

da densidade total de fitoplâncton observado nesse período úmido.

Na estação seca (outubro de 2008), a amostra de água de Lucrécia

apresentaram três populações de microorganismos, sendo que dois eram

cianobactérias: os gêneros Cylindrospermopsis sp. e Aphanocapsa sp., ambos

com densidade celular de 27 céls mL-1, representado cada gênero 0,5 % da

densidade total. O terceiro microorganismo observado tinha morfologia esférica e

unicelular, e não foi identificado (n.i), apresentou densidade celular elevada (5,385

céls mL-1), representando 99 % densidade total microorganismos observados

nesse período de estiagem.

Na estação chuvosa (fevereiro de 2009), a amostra de água apresentou dois

gêneros de cianobactérias tóxicas, Aphanocapsa sp e Pseudanabaena sp, ambas

com densidade celular de 902 céls mL-1, representando 0,5% da densidade total

de microorganismos observados. E também ocorreu em densidade elevada o

microorganismo unicelular não identificado (29.370 céls mL-1), representando 93,9

% densidade total observada nesse período úmido.

Na estação seca (novembro de 2009), a amostra de água apresentou três

cianobactérias tóxicas, os gêneros Aphanocapsa sp, Chroococcus minor e

Cylindrospermopsis sp. com densidade celular de 45, 250 e 18 céls mL-1,



representando 12, 70 e 5 % da densidade total de microorganismos observados,

respectivamente. Novamente ocorreu microorganismo unicelular não identificado

(45 céls mL-1), representando aproximadamente 13 % densidade total observada

nesse período de estiagem.

O gênero produtor de toxina (Cylindrospermopsis sp.) foi observado em três

períodos chuvosos nas amostras de água de abastecimento do município de

Lucrécia, sendo que esta espécie é produtora de citotoxinas e saxitoxinas. As

primeiras podem afetar células do fígado, estômago, coração, pulmão, rins e

órgãos linfáticos de animais e humanos. Além de causar danos genéticos in vivo e

in vitro (Humpage et al., 2000; Froscio et al., 2008).

Conforme a MS (2004) e WHO (2008), a presença de microorganismos nas

amostras de águas de abastecimento de Lucrécia nas três campanhas amostrais

não atende os critérios de potabilidade brasileira e internacional e o seu consumo

representa risco à saúde pública do município de Lucrécia.

3.1.2. Análise de metais

As concentrações dos sete metais avaliados nas águas de abastecimento

coletadas em Lucrécia, Natal e controle estão demonstrados na Tabela 2.



Tabela 2. Concentração (mg L-1) dos metais avaliados nas amostras de água de

abastecimento de Lucrécia e Natal/RN e de água destilada (controle negativo).

Estação Metal (mg L-1) Lucrécia Natal Controle negativo

Chuvosa 15/03/2007

Cd <0,02 <0,02 <0,02 Cr 0,13a,b <0,01 <0,06 Cu 0,04 <0,03 <0,03 Mn <0,02 <0,02 <0,02 Ni <0,1 <0,1 <0,1 Pb <0,1 <0,1 <0,1 Zn 0,01 <0,01 <0,01

Seca 23/08/2007

Cd <0,02 <0,02 <0,02 Cr 0,08a,b <0,01 <0,06 Cu <0,03 <0,03 <0,03 Mn 0,15a <0,02 <0,02 Ni <0,1 <0,1 <0,1 Pb <0,1 <0,1 <0,1 Zn <0,01 <0,01 <0,01

Chuvosa 05/04/2008

Cd <0,02 <0,02 <0,02 Cr 0,15a,b <0,01 <0,06 Cu <0,03 <0,03 <0,03 Mn 0,03 <0,02 <0,02 Ni <0,1 <0,1 <0,1 Pb <0,1 <0,1 <0,1 Zn 0,03 <0,01 <0,01

Seca 01/10//2008

Cd <0,02 <0,02 <0,02 Cr <0,06 <0,01 <0,06 Cu <0,03 <0,03 <0,03 Mn <0,02 <0,02 <0,02 Ni 0,1a,b <0,1 <0,1 Pb <0,1 <0,1 <0,1 Zn 0,02 <0,01 <0,01

Chuvosa 03/02/2009

Cd <0,02 <0,02 <0,02 Cr <0,06 0,01 <0,06 Cu <0,03 <0,03 <0,03 Mn <0,02 <0,02 <0,02 Ni <0,1 <0,1 <0,1 Pb <0,1 <0,1 <0,1 Zn 0,05 0,05 <0,01

Nota1: a Representa as concentrações de metais (mg L-1) acima do VMP para a água potável de acordo com a Portaria no. 518 (MS, 2004). Nota2: b Representa as concentrações de metais (mg L-1) acima da VMP para água de consumo humano de acordo com orientações das Normas de Qualidade de Água Potável nos países em desenvolvimento (WHO, 2008).



Nota3: < Representa as concentrações de metais (mg L-1) abaixo do limite de detecção da técnica analítica (FAAS).

O metal cromo apresentou teores acima do LMP estabelecido pelo Ministério

da Saúde do Brasil em (MS, 2004) e pela WHO (2008) para águas de consumo

humano em Lucrécia nas estações chuvosa (março de 2007), seca (agosto de

2007) e chuvosa (abril de 2008). Nestes três períodos amostrais as águas de

abastecimento de Lucrécia apresentaram concentrações desse metal tóxico (Cr)

até três vezes maiores que o VMP aceito pelas legislações de água potável.

O metal manganês apresentou na estação seca (agosto de 2007) em

Lucrécia concentração acima que o VMP para águas de consumo humano (MS,

2004), sendo que este metal em teores elevados é considerado neurotóxico para

humanos, conforme WHO (2008).

O metal níquel apresentou na estação seca (outubro de 2008) em Lucrécia

concentração acima que o VMP para águas de consumo humano (MS, 2004),

sendo que este metal é considerado cancerígeno, interfere no reparo e estrutura

cromossomal (Buschini et al., 2009; Zhou et al., 2009).

As amostras de água de Natal/RN durante todos os períodos de análises de

metais mostraram concentrações abaixo do limite de detecção da técnica analítica

(EAAC) ou do VMP das legislações brasileira e internacional (MS, 2004; WHO,

2008).

O cromo é um metal getóxico que está incluído na lista dos principais

poluentes ambientais (DeFlora et al., 1990) e sua presença na água de

abastecimento humano de Lucrécia pode estar ligada a elevada diversidade

litológica da região e representa um sério fator de risco à saúde pública do

município (MS, 2004; WHO, 2008).



O consumo de cromo está associado a distúrbios do sistema circulatório e

renal, danos no fígado e ulcerações intestinais (USEPA, 2007).

Dai et al., 2009 relataram em experimentos in vitro com a linhagem humana

Hela que ambos íons de cromo, trivalente e hexavalente, são capazes de interferir

no crescimento e na proliferação celular.

Fairbrother et al., 2007 classificam o cromo com um metal tóxico que

representa um elevado risco a saúde pública, e que a ocorrência de qualquer

forma desse elemento nos ecossistemas representa significativa perda de

qualidade ambiental. Apesar de que alguns dos complexos de Cr parecem

participar da potencialização da ação da insulina, sendo, por isso, denominado de

"fator de tolerância à glicose", sendo que a ausência de Cr pode provocar

intolerância à glicose e, como conseqüência, o aparecimento de diversos

distúrbios (Rana et al., 2008; USEPA, 2007).

3.1.3. Análise de radiação alfa e beta total

As concentrações obtidas de radiação alfa e beta total nas amostras de água

de abastecimento de Lucrécia e Natal, e na amostra de água destilada (controle

negativo) estão demonstradas na Tabela 3.




Tabela 3. Concentrações de radiação alfa e beta total (Bq L-1) nas amostras de

água de abastecimento dos municípios de Lucrécia e de Natal/RN, e do controle.

Estação Amostras Radiação (Bq L-1)

Total alpha Total beta

- Controle Negativo 0.14 ± 0.0 0.36 ± 0.07

Chuvosa - 15/03/2007

Lucrécia

0.98 ± 0.0a,b 2.10 ± 0.03a,b

Seca - 23/08/2007 0.27 ± 0.0a,b 0.31 ± 0.05

Chuvosa - 05/04/2008 0.25 ± 0.0a,b 0.30 ± 0.05

Seca - 03/10/2008 <0.09 ± 0.0 0.30 ± 0.05

Chuvosa - 03/02/2009 <0.09 ± 0.0 0.36 ± 0.05

Chuvosa - 24/07/2009 Natal <0.09 ± 0.0 0.22 ± 0.03

Média ± Desvio Padrão

Nota1: Os valores marcados com a letra a e b representam respectivamente diferença estatística em relação às amostras de água do controle negativo e de Natal, utilizando o teste t Student’s (p ≤ 0,01). Nota2: < Representa as concentrações de alfa (Bq L-1) abaixo do limite de detecção da técnica analítica (contagem de cintilação).

As concentrações observadas de radiação alfa e beta total na amostra de

água de abastecimento de Lucrécia na estação chuvosa (3/15/2007) foram nove e

duas vezes maiores que os VMP pelas legislações em água potável

respectivamente (MS, 2004 e WHO, 2008).

Nos períodos amostrais (seca/2007 e chuvosa/2008) os teores de radiação

alfa total nas amostras de água potável de Lucrécia foram mais de duas vezes

maiores que o VMP pelas legislações em água potável (MS, 2004 e WHO, 2008).

Os níveis médios de radiação alfa e beta total nas amostras de água de

abastecimento de Lucrécia, coletados na primeira estação chuvosa (2007),

também mostraram diferenças significativas (p≤0.01), quando comparadas aos



níveis de radiações obtidos nas demais amostragens sazonais entre agosto/2007

e março/2009 em Lucrécia.

Nos três períodos amostrais distintos, a radioatividade nas amostras de água

de abastecimento de Lucrécia esteve acima do VMP estabelecidos pela portaria

no. 518 do Ministério da Saúde do Brasil (2004) e das recomendações da WHO

(2008). Conforme as diretrizes do MS (2004) e da WHO (2008), quando a radiação

ionizante na água potável estiver acima do VMP estabelecido pela legislação,

deverão ser identificados os radionuclídeos responsáveis pela radioatividade.

A ocorrência dessas radiações ionizantes nas amostras de água de

abastecimento de Lucrécia pode levar ao acúmulo de outros subprodutos

radioativos nesses recursos hídricos (e.g., Rn). Trabalho realizado por Campos et

al. (2010) foi relatado à ocorrência de teores elevados de Rn-222 (>100 Bq m-3) e

radiação gama na atmosfera indoor de algumas residências rurais e urbanas do

município de Lucrécia.

A presença de radioatividade nas águas de abastecimento representa maior

risco, pois 95 % da exposição ao Rn é no interior das residências (indoor) e cerca

de um por cento (1 %) é a partir de fontes de água potável. E a maior parte desta

exposição à radioatividade devido ao consumo de água é durante a inalação de

Rn 222 que é liberado nas atividades humanas diárias, como tomar banho e

limpezas, sendo que 0,1 % da exposição é da ingestão de água contaminada com

radionuclídeos (WHO, 2008; NCR, 1999).

3.2. Análise de radioatividade atmosférica

3.2.1. Análise de gás Radônio (Rn - 222) in door



A maioria das habitações do município de Lucrécia não possui foro e são

cobertas por telha de cerâmica vermelha, e por sua vez o piso varia entre

cerâmica vitrificada e cimento. A presença de rachadura na estrutura das

habitações e deficiência de ventilação principalmente devido à proximidade entre

as moradias podem estar facilitando a percolação e acúmulo de Rn 222 in door.

Conforme Tabela 4, no primeiro período (chuvoso/2009), todas as habitações

da área urbana do município de excederam 100 Bq m-3 (intervalo: 170 – 6.538;

MED: 307; GM: 370; SD: 956 Bq m-3) que é o nível máximo permitido pela

Organização Mundial de Saúde (OMS, 2009). No segundo período (seco/2010), os

dados são mais dispersos (intervalo: 42 - 7.679; MED: 115; GM: 135; SD: 919 Bq

m-3), isso ocorreu possivelmente devido ao início precoce de uma anormal da

temporada de chuvas, mas a maioria das habitações continuou a apresentar

valores que ultrapassam o limite máximo de contaminante estabelecido pela OMS

(2009).

Tabela 4. Variação, média e desvio padrão da concentração do gás Rn-222 (Bq

m-3) nas habitações (in door) da área urbana do município de Lucrécia.

Estação Rn-222 (Bq m-3)

Variação Média ± Desvio Padrão

Seca - 03/11/2009 170 - 6538 370 ± 956

Chuvosa - 01/02/2010 42 - 7679 135 ± 919

Nos dois períodos analisados, o “radônio interior” variou entre 40 – 7.679 Bq

m-3, com Mediana (MED) de 237, Média Geométrica (GM) de 220 e Desvio Padrão

(SD) de 957 Bq m-3.

Normalmente o Rn 222 contribui com até 50% para a radiação de fundo e a

radiação gama de 20%. O Rn por ser um gás nobre é rapidamente expirado após



ser inalado, no entanto, as descendências do Rn (e.g., radiação alfa) combinam-

se com outras moléculas no ar e com partículas de poeira, aerossóis e fumaça, se

depositam nas vias aéreas do pulmão e podem danificar as várias células que

revestem as vias aéreas (Hellman et al., 1999). Acredita-se, por exemplo, que a

cada ano mais de 15.000 mortes por câncer de pulmão ocorrem devido à

exposição ao Rn 222 nos Estados Unidos e mais de 2.500 mortes no Reino Unido

(IARC, 1988; ATSDR, 1990; NCR, 1998).

A exposição ao Rn presente nessas casas da área urbana de Lucrécia pode

levar ao câncer de pulmão e pode estar contribuindo para a elevada

genotoxicidade em mucosa oral observada neste trabalho. Estima-se que para

níveis de 20 Bq m-3 de Rn 222 em residências, o risco de câncer de pulmão é

estimado em 0,3% (3 mortes para 1.000 pessoas). Sendo que para efeito de

comparação, o risco de morte acidental em casa é de 0,7% (7 em 1000) (OMS,

2009).

Mesmo que o risco seja muito baixo quando o Rn 222 é diluído em

ambientes abertos, em locais fechados normalmente o Rn 222 e seus

descendentes contribui com até 50 % para a radiação de fundo (USEPA,

1999a,b).

3.2.2. Análise de radiação Gama (γ) nas residências

Em ambos os períodos analisados (chuvoso/2009) o nível de radiação gama

verificado em cada habitação e variou entre 913 a 5.625 cintilações por minuto

(cpm); com MED: 3539; GM: 3505; SD: 567 cpm. Mesmo com valores médios

algumas das habitações continuaram a apresentar valores que ultrapassam o

limite máximo de contaminante estabelecido pela OMS (2009).



Na Figura 2 está representada a distribuição geográfica da concentração

média de radiação gama (background) detectada em ambos os períodos de

análises (chuvoso/2009 e seco/2010) nas residências do município de Lucrécia (A)

e em detalhe na área urbana (B).

Figura 2. Distribuição geográfica (isolinha) do background da concentração média

de radiação gama (cpm) detectada em ambos os períodos analisados

(chuvoso/2009 e seco/2010) no município de Lucrécia (A) e em detalhe (µR h-1) na

área urbana (B).

3.3. Material Biológico

As principais características dos grupos de pessoas doadores de mucosa

oral de Lucrécia e Natal estão apresentadas na Tabela 5.



Tabela 5. Características gerais dos doadores de mucosa oral humana (18 a 45

anos) dos municípios de Lucrécia e Natal/RN.

Local N Gênero Média etária

(média ± S.D.) Feminino Masculino

Natal (controle) 28 14 14 23,46 ± 4,39

Lucrécia (caso) 28 14 14 26,18 ± 6,76

3.3.1. Teste de micronúcleos (MN) e alterações nucleares (NA)

Os resultados das freqüências médias por mil células (‰) e desvios padrão

de micronúcleo, bem como de alterações nucleares observados em mucosa oral

humana de Lucrécia (grupo caso) e Natal (grupo controle) estão apresentados na

Tabela 6.

Tabela 6. Freqüência média de MN e NA (‰) obtidas em células de mucosa oral

de doadores de Lucrécia e Natal (grupo controle).

Local MN BN NB PY KL FN

Natal 1,23±1,19 0,62±0,93 0,07±0,22 0,43±0,76 0,87±0,89 0,00±0,00

Lucrécia 1,82±1,13a 4,23±2,48c 7,0±2,72c 3,94±3,49c 2,73±1,78c 0,59±1,00b

Média (‰) ± S.D.

Nota1: os valores marcados com as letras a, b e c representam respectivamente diferença estatística de p≤0.05, p≤0.005 e p≤0.00001 em relação ao grupo controle (Natal) com teste t Student’s. Nota2: Micronúcleos (MN) e Alterações nucleares (NA): núcleo com brotamento (NB), células binucleadas (BN), picnóticas (PY), cariólise (KL) e fragmentado (NF).

As células da mucosa oral da população humana de Lucrécia mostraram

aumento significativo (p ≤ 0.05) na freqüência de micronúcleos (MN) em relação

ao grupo controle de Natal (teste t Student’s). As células orais das pessoas dessa

cidade do semi-árido brasileiro também mostraram aumento significativo (p ≤

0.00001), em relação ao grupo controle, para a maioria das alterações nucleares



(NA) avaliadas (BN, NB, PY e KL), sendo que a frequência de fragmentos

nucleares demonstrou aumento significativo (p ≤ 0.005) com o teste t Student’s.

Estes resultados obtidos durante as análises de MN e NA com células de

mucosa oral humana em Lucrécia são bioindicadores de aumento significativo da

citotoxicidade, genotoxicidade e instabilidade genômica nesta população. O

aumento da frequência de brotamentos nucleares (NB) indica elevação de

bloqueios e interferências na amplificação gênica; as células binúcleadas (BN)

estão relacionadas às alterações na citocinese celular durante a mitose; a

degeneração ou condensamento do DNA pode gerar células com núcleos ínfimos

(PY), que são indicativos de células apoptóticas; perda total do material nuclear

(KL) indica necrose celular e a fragmentação nuclear (FN) está relacionada a

intensas quebras cromossômicas (Holland et al., 2008).

Através destes dados de MN e NA pode-se inferir que possa estar ocorrendo

aumento da morte celular programada nas amostras de mucosa oral da população

humana analisada em Lucrécia, pois a elevação desses tipos de danos genéticos

e alterações a estrutura nuclear pode, via processos apoptóticos, elevar à necrose

e à eliminação celular antes da mitose (Holland et al., 2008).

Logo, a significativa diferença na freqüência de MN e NA observada na

mucosa oral humana da população amostrada em Lucrécia em relação à da

capital do estado (Natal) indica que nessas amostras populacionais do Rio Grande

do Norte ocorreram indícios de aumento de alterações genéticas, desestruturação

nuclear e de apoptose celular. Provavelmente, essa elevação no potencial

genotóxico em humanos dessa região está sendo incrementada pela ocorrência

de poluentes hídricos e ambientais no município de Lucrécia.



A ocorrência do metal tóxico cromo em diversas estações sazonais de coleta

acima dos VMP estabelecidos pelas legislações do MS (2004) e WHO (2008) na

água de abastecimento do município de Lucrécia representa elevado risco

ambiental e a saúde pública, pois pode levar a bioacumulação desse elemento

químico na população humana e também biogmanificar para todos os biomas da

região através da cadeia ecológica (Peralta-Videa et al., 2009). O trabalho recente

de Lushchak et al. (2009) descreve o cromo como um metal tóxico para a biota

aquática. Além disso, a possível presença de pesticidas nessas águas também

pode ser outro poluidor responsável pelo aumento da genotoxicidade humana

(Bortoli et al., 2009; Pastor, et al., 2001).

Outro agravante para a poluição ambiental ressaltada neste estudo foi a

radioatividade na água de consumo humano do município de Lucrécia, que

possivelmente também contribui para o aumento de genotoxicidade humana na

micro-região de Umarizal. A ocorrência de radiação ionizante é reconhecidamente

indutora de câncer em humanos. Sendo assim, exposições a doses elevadas de

radiação alfa podem até mesmo queimar a epiderme de pessoas expostas (WHO,

2008, USEPA, 1999a; NCR, 1998).

A radioatividade nas residências (indoor) do município de Lucrécia pode

estar aumentando a genotoxicidade humana na região, uma vez que o trabalho de

Smerhovsky et al. (2002), desde a década de 70, relaciona positivamente o

aumento do risco ocupacional de câncer com a ocorrência de radiação ionizante e

com aumento de aberrações cromossômicas (Sráma et al. 2008). Heepchantree et

al. (2005) durante estudo de biomonitoramento de risco de câncer de pulmão na

China associaram a presença de radioativos e outros genotóxicos ambientais com



o aumento da indução de micronúcleos e alterações cromossômicas em linfócitos

humanos.

A presença de radiação alfa e beta na água de abastecimento do município

de Lucrécia é outro poluente cancerígeno perigoso para a saúde pública nesta

área estudada, pois diversas pesquisas relacionam a ocorrência de radioatividade

e outros poluentes hídricos com o aumento de casos de câncer de bexiga em

humanos, relatam também que o tratamento hídrico convencional e posterior

desinfecção com cloro pode aumentar a toxicidade da água poluída por

radioatividade (Villanueva et al. (2007).

A presança de cianbactérias nas águas de abastecimento, provavelmente,

expõe a população humana de Lucrécia a cianotoxinas. Pois, trabalhos recentes

têm relacionado à bioacumulação de cianotoxinas e peptídeos bioativos na fauna

aquática de rios e lagos com a biomagnificação desses poluentes hídricos na

cadeia trófica do manancial e na população humana abastecida (Magalães et al.,

2003; Gkelis et al., 2006). Mendiguchía et al. (2007) advertem que a presença de

concentrações de metais e cianobactérias acima dos níveis recomendados pelas

agências regulatórias na água tratada é um forte indicador de atividade antrópica e

degradação do ambiente aquático.

De acordo com Campos e Vasconcelos (2010), todos os poluentes hídricos

relatados neste trabalho (cianobactéria, metal e radioatividade) podem ser

responsáveis, sozinhos, em associação ou sinergia pela genotoxicidade

observada na população humana de Lucrécia.

Além disso, em algumas comunidades da micro-região de Umarizal e do

município de Lucrécia ocorrem nascimentos consangüíneos que podem estar

relacionado com predisposição ao câncer e polimorfismos genéticos. Neste



sentido, Musak et al. (2008) relacionam polimorfismos em genes de metabolização

de xenobióticos e de reparo do DNA com a exposição ocupacional e aumento nas

alterações cromossômicas e extensão de danos genéticos. Já Ames (1999) e

Iarmarcovai et al. (2008) relacionam a ocorrência de consangüinidade e

polimorfismos genéticos humano com aumento da genotoxicidade, sensibilidade e

predisposição ao câncer

Outros fatores do estilo de vida e cultural (e.g., dieta) também podem

contribuir e aumentar a susceptibilidade ao potencial genotóxico de contaminantes

em população humanas expostas (Fenech e Fergunson, 2001; Fenech, 2002;

Huang et al., 2009; Ceppi et al., 2010)

4. Conclusão

Todos esses impactos negativos ocasionados pela presença de poluentes

ambientais (cianobactérias, metais e radioatividade) no município de Lucrécia/RN

acarretam em deficiências na conservação hídrica, na perda de qualidade de vida

no município, comprometem a proteção, sustentabilidade e o manejo nesta parte

da sub-bacia hidrográfica do Rio Umari.

Logo, todos esses grupos de poluentes ambientais podem ser responsáveis,

em sinergia ou isolados pelo aumento do potencial genotóxico na população

humana de Lucrécia. O abastecimento e o consumo de águas com concentrações

elevadas desses xenobióticos são reconhecidamente indutores de danos

genéticos em diversos biomas.

Desta forma, recomenda-se no intuito de minimizar os efeitos danosos

desses contaminantes sobre os diversos organismos dos ecossistemas desse

município que os órgãos de proteção à saúde pública e ambiental executem ações



preventivas e mitigadoras para a remoção ou redução desses poluentes e

intensifiquem as investigações sobre as possíveis fontes dessa degradação

ambiental. Bem como, a determinação do grau de consaguinidade e de

polimorfismos genéticos relacionados ao aumento de sensibilidade e

susceptibilidade aos cânceres na população humana da região de Lucrécia.

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4. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES

Durante o monitoramento da genotoxicidade usando peixes (O. niloticus) do

açude Lucrécia, as freqüências de modificações nucleares nos eritrócitos

branquiais (MN e NA) foram significantemente maiores que no grupo de peixes do

controle negativo.

Já essas mesmas análises de genotoxicidade (teste de MN e NA) realizadas

com as células de mucosa oral da população humana que residiam na área

urbana do município de Lucrécia também apresentaram aumento significativo em

relação ao grupo humano comparativo da capital do estado do Rio Grande do

Norte (Natal/RN).

Contudo, foram observados nas águas de Lucrécia teores elevados de

alguns metais, elevada densidade de espécies de cianobactérias tóxicas e de

radioatividade. Além disso, os representantes da ictiofauna (O. niloticus) do açude

público de Lucrécia apresentaram bioacumulação aguda e crônica de metais

genotóxicos. Todos esses poluentes possivelmente elevam degradação ambiental

e a genotoxicidade nos biomas aquáticos, e estão impactando negativamente toda

a região de Umarizal. A ocorrência de radioatividade nas águas do açude de

Lucrécia, já detecta anteriormente por Malanca et al. (1998), é indicatio de

degradação ambiental. A presença de metais nas águas e nos peixes desse

manancial pode ser um agravante para a bioacumulação de metais já detectada

na população humana desse município (Serra et al., 2006).

Desta forma, a presença desses poluentes ambientais em associação,

sinergia ou mesmo isolados pode ser respponsável pelo aumento de

genotoxicidade animal e humana observada e pela elevada ocorrência de tumores

nessa região semi-árida do estado do rio Grande do Norte (INCA, 2007).



Sugerimos que os grupos de poluentes detectados nas águas do município

de Lucrécia estão cooperando para degradação ambiental e perda de qualidade

hídrica na região. A poluição ambiental observada nesta área de estudo,

provavelmente, está induzindo aumentos na freqüência de doenças degenerativas

e diminuindo a expectativa de vida das comunidades humanas abastecidas.

Logo, a recreação, consumo, uso dessas águas está comprometido, à

medida que representa riscos à saúde pública da região e, mesmo que atualmente

esses recursos hídricos não estejam mais sendo disponibilizados para o

abastecimento humano, os poluentes contidos no recurso hídrico dessa área da

sub-bacia do Rio Umari ainda representa risco ao ser humano e aos ecossistemas

de toda a região do médio oeste Potiguar.

Durante a execução deste trabalho científico inferimos que a degradação

ambiental nos mananciais dessa região possivelmente é incrementada pelo

inadequado uso e ordenamento das áreas de proteção permanente (APP) e das

terras de entorno do açude de Lucrécia. Pois, a ausência de conservação das

matas ciliares nativas nos afluentes e de atividades de agropecuária nas margens

do reservatório público de Lucrécia é de fácil e rápida constatação. Seguramente

este fato colabora para a lixiviação de poluentes para o interior do manancial.

Este trabalho propiciou intenso enriquecimento científico, cultural e social

para os seus autores. Esta pesquisa científica cumpriu e executou, com êxito, o

cronograma estabelecido no seu projeto. Durante todos os períodos de estudos na

os pesquisadores contaram com a ajuda e colaboração das Prefeituras de

Lucrécia e de Frutuoso Gomes, do Laboratório de Recursos Naturais do IFRN,

bem como, de diversos centros acadêmicos e departamentos de pesquisa

científica da UFRN, entre os quais se destacam: Departamento de Biologia



Celular e Genética, Departamento de Ciências da Saúde, Departamento de

Departamento de Geologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia e

Departamento de Química.

Recomenda-se que trabalhos futuros nessa região do nordeste brasileiro

abordem a determinação da localização das fontes desses poluentes ambientais,

no intuito de mitigar seus efeitos negativos para as populações humanas e

ecossistemas da região. Sugerimos que novos estudos na população humana da

região de Lucrécia determinem polimorfismos genéticos, sensibilidade e

predisposição ao desenvolvimento de cânceres, e também o grau de

consangüinidade dessa comunidade do semi-árido brasileiro. Conforme os

trabalhos de Ames (1999) e de Iarmarcovai et al. (2008), polimorfismos e outras

alterações gênicas podem aumentar genotoxicidade e a formação de tumores em

populações humanas expostas a poluentes ambientais.

Esperamos que este trabalho científico sirva de referência para futuras

pesquisas nessa região semi-árida do Rio Grande do Norte, que contribua de

forma relevante para a melhoria da qualidade ambiental na área, e auxilie na

redução e mitigação do potencial genotóxico das águas do município de Lucrécia.



5. APÊNDICE

5.1. Lista de Publicações em Eventos

Resumos Publicados em Anais de Congressos:

Eventos Internacionais:

Marcon, A. E.; Guedes, A. G.; Campos, T. F. C.; Ferreira, D. M.; Agnez-Lima, L. F.;

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Eventos Nacionais

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águas superficiais do açude de Lucrécia-RN através do teste de micronúcleo em

http://lattes.cnpq.br/1036476218421364

http://lattes.cnpq.br/1036476218421364



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Lucrécia/RN, através do teste Allium cepa, considerando a freqüência de

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micronúcleo em eritrócitos de Oreochromis niloticus. In: VIII Congresso Brasileiro

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Moreira, D. A.; Marcon, A. E.; Barbosa, J. S.; Cabral, T. M.; Oliveira, G. B.; Agnez-

Lima, L. F.; Batistuzzo de Medeiros, S. R. Análise do Potencial Genotóxico das

águas do açude de Lucrécia-RN, através do teste Allium cepa, considerando a

freqüência de micronúcleos na região F1. In: VIII Congresso Brasileiro de

Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental, 2007, Mangaratiba/RJ.



5.2. Apresentação: 10th International Conference on Environmental Mutagens.

COMET ASSAY IN GILL ERYTHROCYTES (OREOCHOMIUS NILOTICUS) FOR

EVALUATION OF GENOTOXICITY IN DAM OF LUCRÉCIA, RIO GRANDE DO

NORTE – BRAZIL.

AE Marcon (1), DA Moreira (2), DM Ferreira (3), TFC Campos (4), MFV Moura (5),

LF Agnez-Lima (1,2), SR Batistuzzo de Medeiros (1,2)

(1) Center of Sciences of the Health, University Federal of Rio Grande do Norte,

Natal, Brazil;

(2) Department of Cellular Biology and Genetic, University Federal of Rio Grande

do Norte, Natal, Brazil;

(3) Laboratory of Natural Resources, Institute Federal of Rio Grande do Norte,

Natal, Brazil;

(4) Department of Geosciences, University Federal of Rio Grande do Norte, Natal,

Brazil;

(5) Department of Chemical, University Federal of Rio Grande do Norte, Natal,

Brazil.

e-mail addresses: [email protected] (SR. Batistuzzo de Medeiros)




INTRODUCTION

The Dam of Lucrécia is one of the main superficial water reservoirs of

supplying in volume of this region of the State of the Rio Grande do Norte (Fig. 1),

that possess two distinct rain stations (dry and humid). The fishes (O. niloticus) are

sensible biomarker for genetic ecotoxicology studies in freshwater. Comet test

(SCGE) is a method for rapid screening of chemical contaminant dangerous and

presence of pollutants with genotoxicity potential in environmental aquatic. SCGE

is currently the most widely employed method to detect DNA lesions in eco-

genotoxicology. The impact of genotoxic chemicals on the integrity of cellular DNA

is one of the first events in aquatic organisms exposed to natural and

anthropogenic contaminants (Frenzilli et al., 2009).

Figure 1 - Map of the Dam of Lucrécia, Rio Grande do Norte - Brazil.



MATERIALS AND METHODS

Sample collection

Twenty five (N=25) fishes (O. niloticus) known popularly as tilapia do Nilo

(exotic) were seasonality collected in study reservoir between October of 2006 (dry

season) to April of 2008 (rainy season) and nine (N=9) in Negative control group

maintained by 120 days in aquarium with distilled water (Tab.1).

Table 1 – Means of weight (g) and lenght (cm) of the fish (O. niloticus) collected in

Dam of Lucrécia and Negative control group.

Season Local N Weight (g) Lenght (cm)- Negative Control 9 106.22 ± 25.77 18.22 ± 2.59

dry/2006 5 342.00 ± 142.10 25.20 ± 2.84rain/2007 10 675.60 ± 142.09 30.25 ± 2.82dry/2007 6 343.67 ± 43.01 28.17 ± 3.31rain/2008 4 650.00 ± 60.96 27.75 ± 1.26

Dam of Lucrecia

Mean ± Standard Deviation

0

10

20

30

40

50

60

70

80

% C

lass

l of D

NA

dam

age

NC dry/2006 rain/2007 dry/2007 rain/2008

Class 0

Class 1

Class 2

Class 3

*

*

**

*

*

**

**

*

*

Figure 2 – Percentual of class of DNA damage (Class 1 to 3) in gill erythrocyte

cells of the fish species O. niloticus of Dam of Lucrécia and Negative control group

by Comet test.



* represent significant statistical difference (p≤0.05) compared to control

(Dunnett's T test) and bars represent the more S.D. of each class of DNA damage.

RESULTS AND DISCUSSSION

This trench belongs to one of the most important hydrograph basin of this

region of Rio Grande do Norte – northeast of Brazil with seasonal disparate in rain

distribution. The results of Comet test demonstrated significance difference

(p≤0.05) and increased in frequencies breaks on strand of nuclear DNA

(Kobayashi et al., 1995) of gills blood erythrocytes cells of the fish averaged in

Dam of Lucrécia when related from to the negative control group (aquarium fishes)

by Dunnett’s T test (Fig.2). The obtained results showed that this reservoir

possess genotoxic compounds for aquatic vertebrate that can be elevating to

frequencies of damage of DNA erythrocytes of the exposed fish.

FINAL CONSIDERATIONS

These obtained data suggest increased of genotoxicity potencial on water of

Dam of Lucrécia, indicating a possible risk to the ictiofauna this aquatic

ecosystem.



5.3. Artigo da dissertação de mestrado de Anuska Conde Fagundes Soares Garcia

em submissão na Revista internacional Science of Total Environmental:

STUDY ON WATER QUALITY AND MUTAGENICITY OF A SURFACE WATER

FROM A SEMI-ARID REGION BY MICRONUCLEUS ASSAYS

A. C. F. S. Garcia a, A. E. Marcon b, Ferreira, D.M c, E. A. B. Santos d, V. S. Amaral

a, S. R. Batistuzzo de Medeiros a,b *

a Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências,

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brazil.

b Progama de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da

Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brazil.

c.Laboratório de Recursos Naturais, Instituto Federal de Tecnologia do Rio Grande

do Norte (IFRN), Natal, RN, Brazil

d Departamento de Estatística, Centro de Ciências Exatas e da Terra,

Universidade Federal de Sergipe (UFS), Sergipe, AL, Brazil.

* Corresponding author:

Dra. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros.

Departamento de Biologia Celular e Genética, CB – UFRN

Av. Salgado Filho, s/n - Campus Universitário

Lagoa Nova

Natal, 59072-970, RN, Brazil

Tel.: # 55.84.3211-9209; Fax # 55.84.3215-3346

E-mail address: [email protected]




Abstract

The present study evaluated the mutagenic potencial of the surface water from the

Lucrécia dam by analyzing micronuclei in Tradescantia pallida (Trad-MCN) and in

human peripheral blood lymphocytes (CBMN) assay, which correspond an in vivo

and in vitro system, respectively. In addition, heavy metals and physicochemical

properties were measured. Water samples were collected on 2009 November (dry

season) and 2010 May (rainy season), in three distinct points. The results of both

assays for the raw water showed positive responses for the points analyzed when

compared to the respectively negative control. Using the CBMN assay it was

possible to verify that the water diluted was still capable to induce a significant

increase in micronucleus frequency. The highest MN medium was observed in the

dry season for both assays. Chemical analyses detected an increase of heavy

metal levels in the sample points and different seasons. These results point out the

presence of genotoxins in this water, involving heavy metals, which may be

affecting all the ecosystem, including human population. It is recommended a

longer water quality monitoring to provide a better characterization of this public

supply.

Key words: CBMN, Tradescantia pallida, water pollution, genotoxicity, heavy

metals



1. Introduction

The water quality of many reservoirs in the world has been reduced due to

percolation of contaminants to water, which can have natural or anthropogenic

origin, increasing the level of genotoxic compounds in aquatic ecosystems. This

fact has contributed to the reduction of environmental quality, and commitment the

health of living beings that inhabit these ecosystems, including the human

population (Ohe et al., 2004; Lemos et al., 2007; Liu et al., 2009).

In this backdrop of reduced water quality, is the Lucrécia dam (Figure 1),

which is a major surface water reservoirs by volume of semi-arid region of Rio

Grande do Norte, Brazil, and that has shown contamination by heavy metals,

cyanobacteria toxic, presence of alpha and beta radiation and a potential of

genotoxicity using fishes from this dam (Marcon et al., 2010). The population that

use this source has been showing high rates of cancer, popularly associated with

the consumption of this water, with a prevalence about three times higher

compared to the whole state of Rio Grande do Norte (INCA-BRAZIL, 2007). It has

been proven by some studies that the pollution of water source has certain

relationship with endemic cancers of human beings (Zhang et al., 2003; Villanueva

et al., 2007).

In order to study environmental genotoxicity, it should be understood that the

environmental sample consists of a complex mixture of substances that requires

the choice of different methods for genetic evaluation (Vargas et al., 2001). Among

these methods, the micronucleus test is one of the most widely used and is gaining

increased attention among laboratories active in the field of environmental

mutagenesis. Different cells from different organisms are being used for this

analyses such as plants (Barbosa et al., 2010), molluscs (Danellakis et al., 2011),



fish (Egito et al., 2010), human oral mucosa (Bortoli et al., 2009), human cell line

(Hashizume et al., 2009) and human lymphocytes (Wnuk et al., 2009).

The Tradescantia micronucleus bioassay (Trad-MN) is very useful tool for

screening the mutagenic potential in the environment due the capability to detect

low-level genotoxicity in either short-term in situ exposures or in vivo tests with un-

concentrated water samples (Rodrigues et al., 1997; Knasmuller et al., 2002; Misik

et al., 2006). On the other hand, the micronucleus in peripheral blood lymphocytes

has been considered as a predictive of increased cancer risk in human population

(Bonassi et al., 2007; Murgia et al., 2008).

The aim of this study is to assist the evaluation of the genotoxicity from the

Lucrécia dam, by micronucleus test, using two systems an in vivo (TRAD-MCN)

and other in vitro (CBMN) in a dry and a rainy season. Also, the levels of

cadmium, copper, zinc, lead, chromium, manganese and nickel were measured.

2. Material and Methods

2.1. Collection sites and sampling

In order to assess the genotoxicity of the Lucrécia dam, three monitoring sites

were chosen (Figure 1): P1 (6o 33’ 7.62” S/ 93o 23’ 515” W) is located near

the water up-take for public distribution by CAERN and is the point more

accessible for the population; P2 (6o 31’ 4.48” S/ 93o 23’ 8.46” W) is in the

opposite side of P1 and is located at the confluence of tributaries rivers; P3

represents the tap water of the houses.



Figure 1. Location of the Lucrécia dam study area in semi-arid region of Rio

Grande do Norte – Brazil

Water samplings were carried out in November 2009 and May 2010,

corresponding dry and rainy season, respectively. About 3 L of surface water for

each point was collected in pre-cleaned amber flasks at a death of 50 cm, stored at

4o C for 4 days, and then divided into aliquots and kept in a freezer at -20o C as

described in Vargas et al. (2001).



2.2. Water chemical analysis

The levels of cadmium, chromium, copper, lead, manganese, nickel and zinc

were determined by flame atomic absorption spectrometry. Also, some

physicochemical characterization such as pH, turbidity, total floating solids,

ammonia nitrogen (NH3), nitrite (NO2-) and nitrate (NO3

-). All these characterization

was done following the APHA (2005) guidelines.

2.3. Tradescantia Micronucleus Assay

This assay was carried out using Tradescantia pallida according to the

protocol of Ma (1981). Young stems with inflorescences of T. pallida were collected

from plants cultivated in humus soil and fertilized with a formulation of N:P:K

(10:10:10). The plants were kept in full sun and watered daily with distilled water,

maintaining the ideal conditions. For the micronucleus tests, we used the raw water

(undiluted) of each point sampled. In this study, formaldehyde (0.2 %) was used as

a positive control and distilled water was utilized as a negative control.

In conducting the bioassay, about 15-30 cuttings of T. pallida for each point

were collected and maintained in the hydroponic system with Hoagland solution for

24 hours. After that, the cuttings were immersed in a 560 mL of the water to be

assayed. The duration of the exposure time was 12 h followed by a process of

recovery for 24 h with Hoagland solution. After that, the inflorescences were fixed

in 1:3 aceto-ethanol (Carnoy´s) solution for 24 hours and stored in 70 % alcohol.

Slides were prepared from the buds, and the micronucleus frequency in

meiotic pollen mother cells was evaluated (Ma et al., 1981). A total of 3000 tetrads

were scored for each sample. The data were expressed as MCN at 100 tetrads.



2.4. Lymphocyte culture and CBMN assay

A 5 mL peripheral blood was obtained once from three healthy young donor

males with normal karyotypes. For each donor, one series of cultures was

prepared with two parallel cultures for every sample tested. In this test, were used

not only the raw water but also the water diluted to 50 % and 25 %, to evaluate the

dose response.

Whole blood cultures were then set up according Huang et al. (2009). Briefly,

0.3 mL of whole blood was added to 4.7 mL of RPMI 1640 culture medium

containing 10 % fetal bovine serum, 1 % penicillin/streptomycin and 5 %

phytohaemaglutinin (PHA). Twenty-four hours after PHA stimulation, cultures were

supplemented with 200 μL of water samples, which were previously sterilized in a

Sartorius filter with a 0.22 µm pore membrane. The negative control was sterile

distilled water and the positive control was 0.1 μg mL-1 of Mitomycin-C. Forty-four

hours after PHA stimulation 4.5 μg mL-1 Cytochalasin B was added to the cultures

to accumulate cells that had completed one nuclear division at the binucleated

stage (Fenech, 2000). Blood cultures were incubated for a total of 72 h at 37o C.

The lymphocytes were collected by centrifuge (1000 rpm 5 min-1), and then treated

with 0.075 M KCl followed by fixing 3 times in 5 mL methanol/glacial acetic acid

(3:1). The cell suspension was dropped on a slide, stained with Giemsa (1:40

phosphate buffer pH= 6.8) and then the frequencies of micronuclei were measured

in 1000 binucleated cells, for each donnor, totalizing 3,000 cells per sample,

according to Fenech (2003).

As a parameter for cytostatic, the nuclear division index (NDI) was assessed

according to the formula: NDI=[M1 + 2(M2) + 3(M3) + 4(M4)]/N, where M1-M4



indicate the number of cells with 1-4 main nuclei and for which 1000 cells per

donor/sample (N) were scored, as recommended by Fenech (2007).

2.5 Statistical analysis

Statistical analyses were performed using the R software 2.12.0 (R

Development Core Team, 2010). The variables were assessed for normality using

the Kolmogorov-Smirnov test. For TRAD-MN the difference groups among sample

sites were determined by ANOVA one-way followed by Tukey test as a post hoc

test. For the comparisons of the means of MN in human lymphocytes was used

Kruskal-Wallis Test. Statistical differences were considered significant for p ≤ 0.05.

3. Results

3.1 Physicochemical and heavy metals characterization

The physicochemical characterization of the surface waters in the different

seasons is summarized in Table 1.



Table 1. Physicochemical characterization of water samples collected from

Lucrécia dam.

Season Parameter Sample Points

P1 P2 P3

Dry

pH 8.00 8.00 8.70

Turbidity, NTU 3.33 3.33 0.10

Total floating solids, mg L-1 273.60 261.00 230.00

NH3, mg L-1 0.24 0.04 0.03

NO2-, mg L-1 0.00 0.00 0.00

NO3-, mg L-1 0.00 0.00 0.00

Rainy

pH 7.07 7.46 7.77

Turbidity, NTU 6.72 9.50 0.57

Total floating solids, mg L-1 207.80 208.30 207.70

NH3, mg L-1 0.43 0.07 0.10

NO2-, mg L-1 0.00 0.00 0.00

NO3-, mg L-1 0.00 0.00 0.02

Note: NTU represent Nephelometric Turbity Unit.

All the properties analyzed like pH, turbidity, ammonium, nitrite and nitrate,

were within the limits allowed by the Brazilian law (Portaria no. 518/MS, 2004).

The concentrations of the seven metals analyzed are shown in Table 2.



Table 2. Concentrations (mg L-1) of the metals measured in the water samples from

different points at the Lucrécia dam and the maximum allowed values by CONAMA

and WHO.

Season Metal CONAMA (A) WHO (B) Sample Points (mg L-1)

P1 P2 P3

Dry

Cd 0.001 0.003 0.004a,b 0.004a,b 0.003a

Cu 0.009 1.000 0.349a 0.005 0.031a

Cr 0.005 0.050 0.004 0.004 0.005

Mn 0.100 0.100 0.079 0.067 0.007

Ni 0.025 0.020 0.003 0.005 0.003

Pb 0.010 0.010 0.007 0.005 0.003

Zn 0.180 3.000 0.006 0.020 0.008

Rainy

Cd 0.001 0.003 0.000 0.005a,b 0.000

Cu 0.009 1.000 0.000 0.000 0.000

Cr 0.005 0.050 0.000 0.000 0.000

Mn 0.100 0.100 0.195a,b 0.105a,b 0.000

Ni 0.025 0.020 0.000 0.050a,b 0.000

Pb 0.010 0.010 0.050a,b 0.000 0.000

Zn 0.180 3.000 0.015 0.000 0.010

(A) Maximum values allowed by Brazilian legislation – resolution no. 357/2005 of

the National Council of the Environment (CONAMA);

(B) Maximum values allowed according Chemical Hazards in Drinking Water of

World Health Organization (WHO, 2003); a Values above the allowed limit according to CONAMA (2005); b Values above the allowed limit according WHO (2003).



At the dry season the level of copper at the P1, were 38 times higher than the

Maximum Permitted Level (MPL) for class 2 and 3 waters, according to CONAMA

(2005) and above the criteria maximum concentration of chemical hazards in

drinking water (WHO, 2003). For cadmium, all three collected points (P1, P2, P3)

showed concentrations above the established for CONAMA (2005) and P1 and P2

above the criteria maximum concentration of chemical hazards in drinking water

(WHO, 2003). Also, in P3 it was found Copper above the Brazilian legislation. On

the other hand, in the rainy season, were found levels of cadmium (P2), lead (P1),

manganese (P1 and P2) and nickel (P2) above the allowed limits of both agencies.

3.2. Tradescantia Micronucleus Assay

The frequency of micronuclei in the Trad-MCN observed for each sample

site, for dry and rainy season are summarized in Table 3.

Table 3. Frequency of micronuclei (MN% ± S.D) obtained for T. pallida exposed to

different points of the raw water samples from the Lucrécia dam.

Season Negative

Control

Positive

Control

Sample Points

P1 P2 P3

Dry

1,46 ± 0,76 4,25 ± 0,86***

4,23 ± 1,11** 3,49 ± 0,59** 2,79 ± 0,75**

Rainy 2,43 ± 0,95 2,66 ± 0,80** 1,50 ± 0,36

Note: values marked for * (p ≤ 0.05); ** (p ≤ 0.01); *** (p ≤ 0.001) represent

statistical differences compare to negative control by Tukey test.



All the water samples collected in the dry season showed a significant

increase in MN frequency compared to the negative control. In the rainy season,

only the P2 lead an increase in the MN frequency.

Comparing the respective points in the different seasons, it was observed that

P1 in dry season showed a significant increase in the MN frequency when

compared to the rainy season (p ≤ 0.001).

3.3. Lymphocyte culture and CBMN assay

Table 4 shows the results obtained by the analysis of CBMN assay in human

lymphocytes induced by water samples from the Lucrécia dam. In this assay, water

was also diluted to 50 % and 25 % to observe the concentration-response in the

micronucleus frequency. This frequency was proportional to the water

concentration.

In the dry season, the P1 was statistically significant for the three water

concentrations compared to control, as well as the P2 was significant for the raw

water and water diluted to 50 %. The P3 didn´t show positive response for any

sample. In the rainy season, P1 and P2 were statistically significant only for the

raw water. Analyses were performed between the respective points for the raw

water comparing the dry and rainy seasons and it was not found statistical

difference between the seasons, although in the dry season the MN medium was

higher.

Besides the micronucleus frequencies, the values of Nuclear Division Index

are also shown in the Table 4.



Table 4. Frequency of micronuclei in human lymphocytes and NDI by different

dilutions of the water samples from different points at the Lucrécia dam.

Season Dilution

Sample Points

P1 P2 P3

MN‰ ± S.D. NDI MN‰ ± S.D. NDI MN‰ ± S.D. NDI

Dry

Raw water 15.00 ± 2.00** 1.96 11.0 ± 2.64** 2.00 6.67 ± 1.53 1.97

50% diluted 8.33 ± 1.53* 1.97 8.00 ± 1.53* 2.02 5.67 ± 1.53 1.97

25% diluted 7.33 ± 1.15* 1.92 5.67 ± 1.53 1.973 5.67 ± 0.58 2.00

Rainy

Raw water 12.67 ± 2.31** 1.99 8.67 ± 1.53** 1.93 7.00 ± 2.00 1.99

50% diluted 6.67 ± 2.08 2.00 6.33 ± 2.31 1.96 5.33 ± 1.15 2.01

25% diluted 6.33 ± 0.58 2.00 5.67 ± 1.15 1.96 6.00 ± 1.00 1.98

Negative

Control - 5.33 ± 0.57 2.06

Positive

Control - 41.33 ± 4.04*** 1.82*

Note: values marked for * (p ≤ 0.05); ** (p ≤ 0.01); *** (p ≤ 0.001) represent

statistical differences compare to negative control by Kruskal–Wallis test.

This nuclear division index (NDI) showed no significant difference in relation

to negative control, showing that the samples are not cytotoxic to human

lymphocytes.

4. Discussion

Contamination of water used for public supply is considered a major risk

factor for human health. The high concentrations of xenobiotics from urban,



agricultural and industrial wastes contributed to the increase of the genotoxic

activity of aquatic environments (Pereira et al., 2007; Caffeti et al., 2008). One of

the most concern contaminants is the heavy metals, due to persistence leading to

the instability of the ecosystems. They are highly toxic and, unlike the organic

compounds, are not biodegradable (Valko et al., 2005). The presence of them in

water samples above those allowed limits by environmental agencies is a strong

indicator of anthropogenic activities (Mendiguchia et al., 2007). In the present study

the levels of some metals, such as cadmium, copper, lead and manganese,

showed results above the maximum limits permitted by CONAMA (2005) and WHO

(2003) at different sampling points and seasons. Similar results were found by

Barbosa et al. (2010) in analysis of the water from Extremoz Lake, in the same

state of our study, and found some metals above the maximum values allowed by

Brazilian legislation. A study performed by Marcon et al. (2010) in the Lucrécia

dam from 2006 to 2009, showed the presence of heavy metals, demonstrating that

over the years there is not a decrease in these metals. This fact suggests that the

presence of heavy metals in this water is a serious problem due to their

persistence.

Since the economic and social importance of the Lucrécia dam for the

population, it is necessary to use different organisms and experimental models, to

obtain a larger panorama of the mutagenic activity of the surface water from this

dam, in order to clarify the real risks that this water can bring. In this present study,

it were used an in vivo and in vitro system. Our in vivo assay, using the Trad-MCN,

revealed a significantly increase in the average frequency of micronuclei for the

points analyzed at the different seasons. Similar results for the in vivo genotoxicity

assay carried out by Marcon et al. (2010) using the levels of micronucleus and



nuclear abnormalities of Oreocchromis niloticus collected in the Lucrécia dam also

showed significant increase. These findings in both in vivo studies suggest that all

organisms living in this ecosystem probably may be affected.

The Trad-MCN assay in this study showed to be effective and sensitive to

analyze the water genotoxin effects. In studies conducted in rivers of China (Duan

et al., 1999) and Austria (Steinkellner et al., 1999) using Trad-MCN, the results of

both showed that this assay was also sensitive to detect the genotoxicity of these

rivers. Although the Trad-MCN is nowadays being used worldwide to monitoring

the air (Meireles et al., 2009), urban sludge (Mielli et al., 2008) and soil (Cesniene

et al., 2010), there are no recent reports using the micronucleus test in

Tradescantia to analyze water pollution. Another relevant point is that the plant

most frequently used in the Trad-MCN is the clone #4430, but for hot climates, like

the Northeast of Brazil, this plant has not been adapted. In accordance with some

authors who showed similar sensitivity of both species plants (Suyama et al., 2002;

Mielli et al., 2008) and use the Tradescantia pallida as bioindicator (Carvalho-

Oliveira et al., 2005; Carreras et al, 2006; Alves et al., 2007), we reinforce the

suggestion that the T. pallida can replace the Clone #4430 in the Trad-MCN assay.

Furthermore, this study is pioneer in Brazil using the micronucleus test in

Tradescantia pallida to evaluate the water resources. Thus, due to versatility,

practicality and reliability, the T. pallida micronucleus test can provide a first

indication of warning about the situation of water quality under real conditions and

can be used along with other bioassays and physic-chemical analyses, for

monitoring threatened ecosystems.



Considering that Trad-MCN assay was first used for us to make a preliminary

screening of the mutagenic pollution in this area, the CBMN assay in human

lymphocytes was carried out to investigate the response in an in vitro system,

using human cells. It can be observed that the micronucleus frequencies decays

proportionally with the increase of dilution for all points analyzed, demonstrating a

high concentration of genotoxins in water undiluted.

Similar study carried out by Amaral et al. (2005) employed the SMART in

Drosophila melanogaster to evaluate the genotoxicity of Caí river and the

genotoxic analysis were tested at crude samples and at 50 % and 25 %

concentrations. El Asslouj et al. (2009) performed the CBMN assay to assess the

genotoxicity from Bounoumossa River adding to the lymphocytes culture

respectively 50, 100, 200 and 400 µL of wastewater from this river and found an

increase in micronucleus frequency in proportion to increasing doses. The

importance of use this assay is to the fact that micronucleus frequency in

peripheral blood lymphocytes is associated with early events in carcinogenesis,

being a predictive of cancer risk (Bonassi et al., 2007). Because of this, the CBMN

in human lymphocytes has been extensively used in molecular epidemiology and

cytogenetic for the biomonitoring of human populations exposed to genotoxic

agents or bearing a susceptible genetic profile (Jiang et al., 2010; Wang et al.,

2010).

Using the CBMN assay, it was also possible to detect the Point P1 was

genotoxic not only to the raw water as well as to the 50 % and 25 % diluted water

analyzed in the dry season, followed by Point P2, which showed positive

responses for raw water and 50 % diluted water. The importance of using the

dilution in water samples is the fact that it becomes clearly the toxicity impacts of



this water, involving citotoxity and/or genotoxity effects that the different

concentrations may present. In this study it was possible to demonstrate that in dry

period the concentration of genotoxins is so high that even when the water is

diluted still observed significant mutagenic responses.

In the Point P1 it was found Cu>Cd for dry season and Mn>Pb for rainy

season. In the Point P2 it was observed in dry season only the presence of Cd and

in the rainy season Mn>Ni>Cd. In the P3, it was observed the presence of Cu>Cd

in dry season. Metals form a particularly complex class of mutagen, since they can

interact in different ways with the cellular machinery (Mateuca et al., 2006). The

adverse effects of some heavy metals in DNA of plants, animals and humans are

well documented and known that they can lead to decreased fertility and cancer

induction (Majer et al., 2002; Goyer et al., 2004; Lu et al., 2005; Barbosa et al.,

2010). This action is due to two main mechanisms, oxidative damage and

interference with DNA replication and repair (Valko et al., 2006; Joseph, 2009).

Studies about copper (Cu) have shown that this metal is required in trace

amounts for metabolic pathways, but is toxic in excess amounts, causing genotoxic

endpoints such as sister chromatid exchanges and chromosomal aberrations

(Grillo et al., 2009). Prá et al. (2008) showed that the copper induced mutagenicity

as evaluated by the MN test in mice. The cadmium (Cd) toxicity is well documented

by several studies (Badisa et al., 2008; Casalino et al., 2006; Fatur et al., 2002;

Giaginis et al., 2006; Koyuturk et al., 2007). Cd can lead to a process of

carcinogenesis through various mechanisms of action as inhibition of DNA repair,

induction of oxidative stress, aberrant gene expression and apoptosis

resistance/inhibition (Joseph, 2009). Manganese (Mn) is reported to cause

neurological disorders in excessive doses (Crossgrove and Zheng, 2004) and this



can be explained by the fact that Mn can cause oxidative stress, mitochondrial

dysfunction and neuroinflammation (Milatovic et al., 2009). The toxicity of lead (Pb)

has been studied for many years throughout several end-points but data related to

the mutagenic, clastogenic and carcinogenic properties of lead and lead

compounds is still conflicting, moreover biochemical and molecular mechanisms of

action of lead remain still unclear (García-Léston et al., 2010). The nickel is

associated with some incidences of cancer and the carcinogenic actions of nickel

compounds are thought to involve oxidative stress, genomic DNA damage,

epigenetic effects, and the regulation of gene expression by activation of certain

transcription factors related to corresponding signal transduction pathways (Lu et

al., 2005).

Analyzing the date of raw water from Trad-MCN and CBMN assay, it can be

observed that the Point 1 showed a highest MN average for both assays. This may

be related to the fact that this point receives directly effluents from multiple

sources. Moreover the water from this point has no where to drain and possible

concentrates a large number of genotoxins. Results for the genotoxicity on the

water samples for both assays from dry season are relatively higher than that of

the rainy season. This can be explained by the fact that in the rainy season occur

decreases in the concentration of the contaminants due to the dilution factor (Brum

and Netto, 2009). On the other hand, Point P2 showed the strongest response for

both assays on the climates conditions. This may be due to the confluence area of

this point, where there is a meeting of the tributaries rivers bringing a large amount

of toxicants for the dam. The point P3 represented the water treated and

distributed to the population. All the mutagenicity results for this point showed

negative results, which was expected, except for Trad-MCN in dry season. This



can be correlated with the presence of cadmium and copper above the limits of

Brazilian legislation.

Comparing the mutagenic responses found in the Trad-MCN and CBMN

assay in the different seasons for the raw water (table 5), the two assays agree in

66 and 66 % of the responses.

Table 5. Mutagenic response obtained by both micronucleus assays at raw

water from Lucrécia dam.

Sample Points

Raw Water

Mutagenicity assays

Trad-MN CBMN

Dry Season

P1 + +

P2 + +

P3 + -

Rainy Season

P1 - +

P2 + +

P3 - -

Note: (+) and (-) represent positive and negative results, respectively.

This data shows that the CBMN assay, which is well validated in worldwide,

supports the majority responses found in the Trad-MCN, proving the importance

and sensibility of the Trad-MCN to monitor the aquatic ecosystems. Obviously,

differences between the in vitro and in vivo bioassays may occur because the in

vitro assays the cultures cells were directly exposed to damage, while in the in vivo

assays the toxic compounds could be metabolized. In addition, the differences

could also have been due to the difference in DNA damage responses



by different cells types used in each assay (Jha et al., 2004; Caffetti et al., 2008).

Furthermore, for the specific assay using a plant, it can be considered that the

phytotoxicity from the metal absorbed by it is complex and depend of some factors

such as the concentrations and speciation of the metal, the oxidation state of it, the

concentration and duration of its exposure and the complex mechanisms of the

hyperaccumulation (Patra et al., 2004; Yang et al., 2005).

The two kinds of micronuclei test used in this study, demonstrated the

capacity of these water samples from Lucrécia dam to induce chromosome

breakage and/or dysfunction of the mitotic apparatus. It is important to know that

the aquatic environment is often the ultimate recipient of the increasing range of

contaminants and because of this, the definition of the class of compounds

responsible for the genotoxic contamination is difficult to know. Among the aspects

to be considered are the effects of synergy and antagonisms that occur as a result

of the mixture formed by a lot of chemical compounds (Cesniene et al., 2010,

Vargas et al., 2001). In the Lucrécia dam, it is clear that the heavy metals are

persistent in this water and due to the mechanism of action they may be

compromising the entire ecosystem, but probably are not the only genotoxics

agents. There is a “cocktail” of environmental factors, such as radioactivity and

toxic cyanobacteria described by Marcon et al. (2010) and possible others organic

compounds in water, that taken together may be responsible for the mutagenic

effects found for this water and may be endangering the health of all organisms,

including human.



5. Conclusion

All the results obtained in this study show the presence of genotoxic

compounds, including heavy metals, in surface water in the Lucrécia dam which

can induce chromosomal mutations and probably may be correlated with the high

rate of cancer found in the population. These findings demonstrate the importance

of using different organisms in genotoxicity assays in conjunction with analytical

methods for the characterization of complex environmental mixtures. Further, a

longer water quality monitoring is recommended to provide a better

characterization of this public supply.

Aknowledgements

The authors wish to thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico (CNPq), the Fundação de Apoio a Pesquisa do Rio Grande do Norte

(FAPERN) and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES) for the financial support.

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5.4. Capítulo de Livro do Prodema sobre Meio Ambiente e Saúde Humana

AÇUDE DE LUCRÉCIA COMO MODELO DA PROBLEMÁTICA DA ÁGUA NO

SEMIÁRIDO BRASILEIRO: ESTUDOS GENOTÓXICOS E A RELAÇÃO ENTRE

SAÚDE AMBIENTAL E HUMANA

Anuska Conde Fagundes Soares Garcia1; Alexandre Endres Marcon2; Viviane

Souza do Amaral1,3; Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros1,2,3

1. Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Meio

Ambiente/PRODEMA, Centro de Biociências, UFRN, Natal, RN.

[email protected]

2. Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da

Saúde, UFRN, Natal, RN. [email protected]

3. Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, UFRN,

Natal, RN. [email protected], [email protected]

INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, o homem vem aumentando expressivamente o descarte

de seus dejetos seja no solo, na água ou na atmosfera. Estas ações possibilitam

que diferentes grupos de produtos químicos sejam liberados no ambiente, gerando

estresse ambiental podendo afetar a atual e as próximas gerações de todos os

seres vivos, incluindo o próprio homem.

Dentre os ambientes afetados pela poluição, um dos mais preocupantes é o

aquático, devido à água ser um bem mineral essencial às funções vitais dos

organismos e, conseqüentemente, a manutenção da vida no planeta (Leme,

2007). O planeta Terra é o único do sistema solar, o qual se tem conhecimento,







que possui água nos três estados (sólido, líquido e gasoso), e as mudanças de

estado físico da água no ciclo hidrológico são fundamentais e influem nos

processos biogeoquímicos dos ecossistemas terrestres e aquáticos. Somente 3%

das águas do planeta estão disponíveis como águas doces. Destes 3%, cerca de

75% estão congelados em calotas polares, em estado sólido; 10% estão

confinados nos aqüíferos e, portanto, a disponibilidade dos recursos hídricos no

estado líquido é de aproximadamente 15% destes 3%. A água, portanto, é um

recurso extremamente reduzido (Tundisi, 2003).

Além dessa questão da disponibilidade, outro ponto de fundamental

importância, é que as águas superficiais, tais como rios, lagos e mares, recebem

grandes quantidades de efluentes, com ou sem tratamento, provenientes de

atividades industriais, agrícolas e de fontes domésticas. Essas águas, que contêm

muitos compostos desconhecidos, são usadas como fonte de água potável, bem

como para fins agrícolas e atividades recreativas de todo o mundo (Ohe et al.,

2004). Conseqüentemente, a poluição da água é uma séria preocupação para

saúde pública e para os ecossistemas aquáticos, sobretudo em região semiárida.

O Nordeste brasileiro apresenta condições hídricas desfavoráveis, que

combinam: evapotranspiração alta durante todo ano, baixa precipitação, subsolo

desfavorável em muitas regiões (água salobra ou formação cristalino) e

desenvolvimento econômico socialmente mal distribuído. Além disto, nas grandes

concentrações urbanas, os sistemas hídricos apresentam condições críticas de

sustentabilidade devido a uma forte demanda local por água associada ao

excesso de cargas de poluição doméstica e industrial, que contaminam os

mananciais.



Além da contaminação de recursos hídricos a região do semi-árido sofre com

a possibilidade de desertificação que é a degradação de terras. Ambos os efeitos

podem ser resultado da ação antrópica sobre o seu ambiente e/ou de processos

naturais como as mudanças climáticas. Esta destruição por sua vez, contribui

tanto para a perda de diversidade genética, quanto da capacidade de

sobrevivência de comunidades afetando assim a estrutura e função do

ecossistema como um todo.

Em relação à qualidade da água há dois aspectos a considerar: os danos

causados ao manancial e a potabilidade da água. As modificações causadas nas

características do manancial afetam diretamente sua biota, mas não ao homem.

No entanto, a presença de agentes patogênicos como vírus, bactérias, fungos,

protozoários, entre outros, ou elementos químicos tóxicos ou radioativos

constituem-se em contaminação da água (Mendiguchia et al., 2007). Como

conseqüência desta deteriorização observa-se perdas de vidas humanas,

prejuízos econômicos, forte degradação da qualidade de vida, com retorno de

doenças de veiculação hídrica, perdas de moradias e bens e interrupção da

atividade comercial (inclusive danos ao turismo) e industrial em algumas áreas.

Além das doenças de veiculação hídrica é de suma importância que se

registre os prejuízos causados à saúde humana pela ocorrência de metais

pesados e compostos nitrogenados (Van Leeuwen et al., 2005). Os metais

pesados são causadores de inúmeros males se em contato com o organismo

humano, causando inúmeras anomalias. A ingestão de sais de cobre provoca

vômitos, náuseas e taquicardia; o zinco, quando absorvido na forma de sais, é

muito tóxico provocando cansaço e náuseas; o chumbo pode ser absorvido ainda

em fase sólida e os seus sais são altamente tóxicos causando uma doença



denominada saturismo, tendo ainda a propriedade de acumulação nos tecidos e

ossos. Os sintomas mais gerais de intoxicação por metais pesados são tremores,

convulsões e insuficiência renal. Já a presença de nitrato em elevadas

concentrações é altamente prejudicial à saúde humana. Já, os efeitos patológicos

atribuídos ao nitrato incluem hipertensão, metahemoglonemia, outros tipos de

câncer e linfoma, incluindo câncer de estômago. Além dos citados, outros danos

poderiam ser arrolados, todos geradores de morbidade por doenças de vários

grupos, elevados prejuízos para o desenvolvimento sadio de crianças,

adolescentes e da população em geral, contribuindo sensivelmente para a

redução dos níveis de produção ao afetar a capacidade da mão-de-obra local

(Amr e Yassin, 2008).

Preocupados com estes dois aspectos e aos danos que podem ser

causados principalmente na área da saúde, inúmeros trabalhos são realizados no

sentido de detectar a presença de poluentes, principalmente no que se refere às

análises físico-químicas como, por exemplo, a caracterização da cor e turbidez,

tensão superficial, osmose, pH, presença de agentes redutores, eutrofizantes ou

mesmo análise biológica no que se refere à presença de patógenos ou ainda às

alterações na estrutura da biota aquática, como por exemplo, a redução da

diversidade das espécies ou redução da produtividade primária (Gastado et al.,

2008). Entretanto, pouca atenção é dada à presença de agentes genotóxicos e

mutagênicos no Brasil, sobretudo na região nordeste.

Agentes genotóxicos são aqueles capazes de provocar lesões no material

genético, especificamente na molécula de DNA. Lesões de DNA são modificações

na estrutura química da molécula, as quais podem interferir em processos

celulares como replicação e transcrição levando a morte celular e/ou induzindo a



ocorrência de mutações, que são modificações, permanentes e herdáveis na

seqüência nucleotídica do DNA. Esta molécula é responsável por carregar a

informação genética de um organismo, contendo as informações necessárias

para a síntese de todas as proteínas. Estas desempenham funções estruturais,

regulatórias e catalíticas dentro das células. Mutações, além de ser a principal

fonte para a diversidade, podem alterar a informação genética acarretando em

perda de funções, o que, no homem pode estar relacionado a muitos processos

degenerativos como o envelhecimento, doenças hereditárias e o câncer (Holland

et al., 2008).

As lesões de DNA podem se caracterizar em quebras na cadeia fosfodiéster

do DNA, na formação de aductos, de sítios abásicos, ou ainda na formação de

dímeros de pirimidinas, por exemplo. Já as mutações podem ocorrer tanto ao

nível de genes quanto a nível cromossômico. A mutação gênica é o processo pelo

qual os genes são alterados, podendo levar a uma perda ou ganho de função,

seja pela substituição, inserção ou deleção de um único par de bases (mutação

de ponto) ou de um segmento de pares de base. A mutação cromossômica pode

ser classificada como alteração numérica e/ou estrutural dos cromossomos

(Rana, 2008).

Algumas mutações são oriundas de processos espontâneos e outras são

induzidas, ou seja, produzidas por agentes mutagênicos. Esses agentes

potencializam as taxas de mutações que normalmente ocorrem na natureza em

níveis baixíssimos. Esses agentes podem ser classificados como químicos, físicos

e biológicos, podendo ser incluídos também os ditos "produtos naturais"

(Beyersmann e Hartwig, 2008).



Além de afetar a saúde humana, a poluição ambiental pode levar a efeitos

deletérios também à saúde ambiental. Neste âmbito podem ser destacados os

danos ao DNA promovidos em animais aquáticos, os quais podem ser associados

à redução no crescimento, desenvolvimento anormal e redução da sobrevivência

de embriões e de adultos (Nakayama et al., 2010;Lee e Steinert, 2003). Além

disso, poluentes genotóxicos podem alterar a freqüência alélica em populações

de diversos organismos expostos a diferentes classes de contaminantes

ambientais. Estas alterações podem levar a uma perda de diversidade genética,

redução no tamanho da população, alteração do equilíbrio populacional, podendo

em última instância, levar extinção de espécies, ocasionando sérios problemas

aos ecossistemas (Bickham et al., 2000; De Wolf et al., 2004; Theodorakis, 2001).

Caracterização da área de estudo: Semiárido Nordestino

O semiárido brasileiro se estende por uma área que abrange a maior parte

dos estados da região Nordeste (86, 48%), a região setentrional do estado de

Minas Gerais (11,01%) e o norte do Espírito Santo (2,51%), ocupando uma área

974.572km2 (ASA, 2009). Apresenta clima seco e quente, com chuvas que se

concentram no verão e outono. Essas características favorecem a ocorrência de

períodos de seca que atingem a região com todas suas repercussões sociais,

naturais e econômicas.

Na região Nordeste, onde vivem 29% da população e origina-se em torno de

21% da produção agrícola do país (Araújo, 2000), o semiárido ocupa uma área de

aproximadamente 900.000km2, abrigando um contingente populacional

expressivo. No estado do Rio Grande do Norte, segundo dados do Ministério da

Integração Nacional (Brasil, 2005), cerca de 1,6 milhões de pessoas vivem na



região que compreende o semiárido potiguar sujeitas aos problemas ocasionados

ou acentuados pela seca. Visando minimizar os problemas acarretados pela seca,

a construção de grandes açudes pelo poder público se tornou uma das mais

importantes iniciativas para garantir água para a população, além de ser uma

oportunidade de promover o desenvolvimento da região, em virtude de sua

múltipla funcionalidade (Petrovich e Araújo, 2009). Porém, mesmo com o múltiplo

uso ao qual são destinados esses açudes vêm, constantemente, sendo afetados

por efluentes domésticos não tratados e por agrotóxicos, acentuando assim a

perda de qualidade da água com o aumento do potencial genotóxico que esses

poluentes podem provocar e consequentemente, afetando a saúde não só do

ecossistema, como também do próprio homem que se utiliza desse recurso.

Caracterização da área de estudo: Açude de Lucrécia

O açude de Lucrécia é um dos principais reservatórios hídricos superficiais

da região médio oeste do Estado do Rio Grande do Norte. Este reservatório

público foi construído em 1934 e tem capacidade máxima de armazenamento de

água de aproximadamente 27 milhões de metros cúbicos, e está localizado

próximo à fronteira estadual com a Paraíba, entre os municípios de Lucrécia e

Frutuoso Gomes/RN (Figura 1).



Figura 1 – Mapa de localização do açude de Lucrécia na região do médio oeste

do Rio Grande do Norte.

Os afluentes que originam este reservatório público são tributários da sub-

bacia do Umari que integra a bacia hidrográfica Apodi-Mossoró, que é a segunda

maior do estado do RN e tem uma área de drenagem de 14.276km2. No que

tange a geologia da área, o açude de Lucrécia está inserido na Província

Borborema e na micro-região de Umarizal, onde afloram diversas litologias do

embasamento cristalino com ocorrência de vários minerais e metais, que podem

ser emissores de radiações ionizantes (Serviço Geológico do Brasil, 2006).

O clima na região é tropical continental sub-úmido, com inverno seco e verão

chuvoso, conforme classificação de Köppen (Serviço Geológico do Brasil, 2006),

e com precipitação pluviométrica média anual de 1000 mm e temperatura de 28o

C (EMPARN).

Durante a estação de seca o açude de Lucrécia pode perder mais de 70%

do volume de água armazenada, devido às elevadas taxas de evaporação e baixo

índice de precipitação pluviométrica. Essa redução drástica do volume hídrico do



reservatório tem se demonstrado cíclica ao longo dos anos e pode estar

colaborando para a concentração progressiva de diversos compostos nocivos ao

meio ambiente e a saúde humana (Serra et al., 2006).

Este açude está sob influência de descargas antropogênicas que recebe em

função do despejo de efluentes domésticos e agrícolas, além de fontes naturais,

como a radiação. Dentre os compostos provenientes da ação antrópica destacam-

se os metais pesados, os quais já possuem relatos na literatura sobre seus efeitos

tóxicos, entre eles cádmio, cobre, manganês e níquel. Além disso, a presença de

determinados elementos químicos nos corpos d’água favorecem a presença de

florações de cianobactérias tóxicas, como as Aphanocapsa sp., Microcystis

aeruginosa e Cylindrospermopsis raciborskii, as quais podem liberar cianotoxinas

que podem afetar não só o ecossistema, como causar dermatites e problemas

hepáticos crônicos em humanos. (Marcon et al., 2010; Serra, 2006). Agravando

ainda mais a situação, essa região tem apresentado incidência natural do radônio,

o qual é considerado a fonte mais importante de exposição humana a radiação

(Lutze et al., 1992, Malanca et al., 1998, Campos et al., 2010). O radônio é um gás

nobre radiativo, pesado, incolor, inodoro, insípido e solúvel na água, que se

origina durante o decaimento radioativo (série de decaimento do urânio e do tório)

e está presente naturalmente no meio ambiente em rochas, solos, águas e ar.

Porém, diferentemente dos outros gases nobres, ele não é completamente

inerte, pois podem formar alguns complexos químicos. A sua ocorrência na

natureza é controlada por variáveis físicas, tais como a pressão, temperatura,

emissividade pelas rochas, assim como pelo tempo e pela geoquímica dos seus

progenitores (Faure, 1991; Marques et al., 2006). O radônio produz partículas alfa,

que é uma radiação de alta transferência de energia linear que causam



permanentes lesões ao DNA, como as quebras cromossômicas, e devido a isso,

geram grande preocupação ao meio ambiente. Baseada em evidências de

exposição humana e animal, a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer

(IARC), classificou o radônio como do grupo 1 dos cancerígenos (Hamza e

Mohankumar, 2009; Villalobos-Pietrini et al., 1999).

Em um recente trabalho de medição de radônio em Lucrécia, foram

colocados 110 detectores passivos desse gás distribuídos em algumas

residências do município, em dois períodos da estação seca (Dezembro 2009/

Fevereiro 2010). Em ambos os períodos, o “radônio interior” variou entre 40-7.679

Bq.m-3, com mediana de 237 Bq.m-3. Isso demonstra que as habitações

apresentaram resultados que excederam o nível de ação da Organização Mundial

de Saúde – OMS (2008) que é de 100 Bq.m-3 (Campos et al., 2010). Além desses

resultados para o ar, no trabalho de Marcon et al. (2010), onde foi realizada a

medição de partículas alfa e beta na água, em dois pontos do açude, os

resultados também apresentaram níveis acima do valor permitido pela portaria no.

518 do Ministério da Saúde.

Entre os aspectos a serem analisados advindos dessa gama de poluentes

que comprometem a água do açude, tem que ser considerados os efeitos

sinergísticos ou mesmo antagônicos que esta interação possa vir a trazer,

podendo causar sérios riscos a todos os organismos que dependem desse

recurso. Nessa perspectiva, o dado mais preocupante e que merece destaque, é

que os municípios que se utilizam desse açude apresentam um histórico de

elevada incidência de câncer associados ao consumo da água do açude de

Lucrécia. Esta região apresenta prevalência de câncer cerca de três vezes maior,

quando comparada a todo o Estado do Rio Grande do Norte. Entre a maior



incidência, está o câncer na via digestiva (INCA, 2007; Serra, 2006). Segundo

dados do DATASUS (2008), uma das maiores causas de mortalidade

proporcional em todas as idades nesse município é de neoplasias, chegando a

25% do total da população.

Bioensaios para análise de genotoxicidade

Além da questão da água em si já ser um limitante para o desenvolvimento

sócio-econômico na região do semiárido brasileiro, a água precisa ter boa

qualidade para não trazer prejuízos à saúde humana e ao ecossistema. Assim, na

busca da identificação dos riscos genéticos impostos ao ambiente existem um

número razoável de bioensaios de curta duração que são utilizados para o

monitoramento do risco imposto pelos contaminantes, assim como da qualidade

dos corpos hídricos receptores.

Para avaliação dessa contaminação, freqüentemente, são feitas análises

físico-químicas, que detectam a presença de compostos químicos potencialmente

perigosos para os indivíduos que fazem uso dessa água ou que estão presentes

no ambiente (Pellacani et al., 2006). Contudo, muitas substâncias químicas

liberadas na natureza, bem como os seus metabólitos, ainda não apresentam

uma identidade química bem caracterizada, fazendo-se necessário a avaliação do

impacto, causado pela exposição a esses agentes químicos, sobre os organismos

aquáticos (van der Oost et al., 2003). Os ensaios biológicos, por outro lado, são

capazes de caracterizar os efeitos dos contaminantes ambientais causados por

exposições crônicas e/ou agudas a agentes químicos, sem obrigatoriamente

precisar do conhecimento prévio dos componentes químicos presentes na água

(Ohe et al., 2004). Em função disto, as agências de controle ambiental



recomendam o emprego de testes de natureza biológica, química e física, em

conjunto, para a identificação de agentes tóxicos presentes nos ecossistemas

aquáticos

Portanto, devido à preocupação com degradação ambiental e com a

vulnerabilidade do material genético às agressões impostas pela contaminação

ambiental, foi criada uma nova área de pesquisa, denominada de Genética

Toxicológica. Esta área tem como objetivo não apenas estimar os prováveis

danos às células pela detecção dos efeitos genotóxicos e/ou mutagênicos, mas

também identificar os mecanismos de ação de agentes químicos presentes no

ambiente, aos quais diversos organismos vivos, inclusive o homem, estão

expostos (Rabelo-Gay et al., 1991).

Dentre os diferentes ensaios de genotoxicidade e/ou mutagenicidade,

podemos citar o Teste de Ames (Maron e Ames, 1983), Teste de Allium cepa

(Grant, 1978), teste de Mutação e Recombinação Somática (SMART) (Graf et al.,

1994), teste de Micronúcleo por Bloqueio da Citocinese (CBMN) (Fenech, 2000),

teste Cometa (Singh et al., 1988), entre outros (Zegura et al., 2009.

Teste do Cometa

O teste Cometa ou eletroforese de células individualizadas vem sendo

proposto como um teste de screening e foi descrito por Singh et al. (1988) e

revisado por Tice et al. (2000). Este teste não é utilizado para detectar mutações,

mas sim lesões no material genético, que se não forem reparadas, podem resultar

em mutação. Para teste pode ser utilizado diferentes tipos celulares e/ou

linhagens celulares sendo os eritrócitos de peixes, bastante usados em análise

ambiental. Neste caso, eritrócitos de sangue periférico podem ser obtidos por



punção caudal ou branquial de espécies de peixes residentes no local de estudo.

As células coletadas são colocadas em gel de agarose e lisadas para liberação do

DNA, que é aplicado em corrente elétrica para separação da molécula de DNA.

Quanto maior for o número de quebras, mais fragmentado estará o DNA e assim

maior será o rastro gerado durante a corrida eletroforética (Figura 2).

Figura 2 - Classificação dos níveis de fragmentação do DNA nuclear (danos)

através do teste Cometa. Classe 0 (núcleo íntegro ou sem dano), Classe 1 (dano

mínimo), Classe 2 (dano médio), Classe 3 (dano elevado) e Classe 4 (núcleo com

fragmentação total do DNA = indicativo de células em apoptose).

Este rastro forma uma imagem se assemelha a um cometa, razão pelo qual

foi dado o nome de teste do cometa. O DNA pode ser visualizado por coração

com brometo de etídeo em microscópio de fluorescência e a qualificação da

extensão dos danos é feita pelo tamanho do rastro observado.

No teste cometa não é necessário que a célula esteja em divisão, além de

que requer uma baixa quantidade de células para sua execução. De acordo com

Kim e Hyun (2006), o ensaio cometa é um teste marcador de genotoxicidade

sensível e confiável para análises de monitoramento aquático. Portanto ele tem

sido amplamente utilizado em estudos de monitoramento em indivíduos expostos

a substâncias genotóxicas próprias do seu estilo de vida ou a genotoxinas

liberadas no meio ambiente (Frenzilli et al., 2009).



Teste do Micronúcleo

Dentre os testes mais empregados para a avaliação da toxicidade genética

associada a misturas complexas, destaca-se o teste do Micronúcleo.

Os micronúcleos são estruturas resultantes de cromossomos inteiros ou de

fragmentos cromossômicos que se perdem na divisão celular e, por isso, não são

incluídos no núcleo das células filhas, permanecendo no citoplasma das células

interfásicas (para revisão ver: Iarmarcovai et al., 2008) (Figura 3).

Figura 3 - Formação do Micronúcleo em células em divisão. A origem do

micronúcleo tanto pode ser por perda de um cromossomo inteiro ou de um

fragmento cromossômico na anáfase. Micronúcleos são facilmente identificáveis

devido a sua morfologia menor, porém igual a do núcleo principal (adaptado de

Fenech et al., 1993).

Desta forma, a detecção de micronúcleos representa perda da cromatina em

conseqüência de dano cromossômico estrutural ou no aparelho mitótico, sendo

consideradas como mutações que são transmitidas as células, pois o dano

genético pode se manifestar nas células filhas (Bonassi et al., 2003; Fenech,

2000). A sua formação tanto pode ser induzida por substâncias que causam



quebras cromossômicas (substâncias clastogênicas), bem como por agentes que

afetam o aparato do fuso mitótico (substâncias aneugênicas) (Majer et al., 2001).

Assim, um aumento na freqüência de células com micronúcleos é usado

como um biomarcador de efeitos mutagênicos em células animais, vegetais ou

humanas, visto que se manifestam em curto prazo após exposição e sua

freqüência se encontra elevada em tecidos expostos antes que qualquer sinal

clínico seja evidente e, além disso, eles podem ser considerados como um

marcador precoce para a carcinogênese (Albertini et al., 2000; Bonassi et al.,

2007; Montero et al., 2006).

Para a realização desse teste, podem ser empregados diferentes

organismos como peixes, plantas e humanos e tipos celulares como linfócitos e

células da mucosa oral.

O grupo de pesquisa do Laboratório de Mutagênese Ambiental da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (LAMA/UFRN) tem realizado

diversos trabalhos sobre a qualidade das águas neste importante ambiente

aquático.

No trabalho recente de Marcon et al. (2010) as análises de águas do açude

de Lucrécia mostraram a ocorrência cianobactérias, metais e radioatividade em

dois pontos distintos desse manancial, acima dos níveis aceitáveis estabelecidos

pelas legislações ambientais nacional (CONAMA, 2005) e internacional (USEPA,

2007) de corpos de água.

O açude de Lucrécia mostrou uma elevada densidade, superior ao LMP

(limite máximo permitido) pelas legislações do CONAMA (2005) e USEPA (2007),

de espécies tóxicas de cianobactérias, como as Microcystis aeruginosa e

Cylindrospermopsis raciborskii e espécies do gênero Aphanocapsa sp., em vários



períodos amostrais entre 2006 e 2008. Logo, o consumo dessas águas com

cianofíceas podem representar um sério risco à saúde humana e dos biomas da

região de Lucrécia, pela possibilidade de liberarem cianotoxinas no meio.

As análises hídricas desse reservatório público também mostraram a

presença de metais tóxicos acima dos LMP estabelecidos para padrões de água

(CONAMA, 2005 e USEPA, 2007), entre os quais, se ressalta a presença dos

metais que representam risco à saúde humana: cádmio (cd), cobre (Cu), cromo

(Cr), níquel (Ni), manganês (Mn) e zinco (Zn). A presença de metais nessas

águas indica uma possível degradação ambiental em todos os biomas da região

que consumem esses recursos hídricos, pois esses elementos químicos são

persistentes nos ecossistemas e se bioacumulam na flora e fauna e se

biomagnificam na cadeia ecológica.

O teor de metais também foi determinado em material biológico de peixes

desse manancial, e os resultados obtidos mostraram bioacumulação aguda e

crônica de metais na ictiofauna do açude de Lucrécia, representando um risco à

saúde pública.

A radioatividade na forma de radiação alfa e beta também foram medidas e

mostraram estar acima dos LMP estabelecidos pelas legislações ambientais. A

ocorrência de radiação alfa e beta indica a presença de radionuclídeos nos solos,

rochas, atmosfera e/ou nas águas superficiais ou subterrâneas do município.

Dentre os elementos químicos metálicos emissores desse tipo de radiação que

podem estar ocorrendo nessa região se destacam os metais radioativos urânio

(U), rádio (Ra), tório (Th) e potássio (K), e seus subprodutos de decaimento

radioativo, entre os quais se ressalta o gás radioativo radônio (Rn) que é

considerado o principal radionuclídeo causador de câncer de pulmão em



populações humanas expostas a radioatividade natural ou ocupacional. O isótopo

Rn-222 do gás radônio vem sendo determinado nas residências do município de

Lucrécia e tem mostrado, até o presente momento, estar acima dos 100Bq m-3

que é o valor máximo permitido (VMP) para interior de residência pela USEPA

(1999). Estes estudos vêm sendo feito pelo grupo de pesquisa do Laboratório de

Radiologia Natural do Departamento de Geologia (LARANA) da UFRN.

Para a análise de genotoxicidade das águas do açude de Lucrécia, foi

realizado o teste de micronúcleo (MN), em diferentes sistemas e o sumário dos

resultados estão demonstrados na Tabela 1.

Tabela 1 – Resultados dos Testes de Micronúcleo (MN) com diferentes

bioindicadores expostos às águas do açude de Lucrécia.

Bio

indi

cado

r Animal

Tradescantia sp. Peixe

(Tilápia do Nilo) Humano

Mat

eria

l

Cel

ular

Flores Sangue Epitélio

Hemácias Linfócitos Mucosa oral

Gen

otox

icid

ade

Positiva Positiva Positiva Positiva

Em eritrócitos branquiais dos peixes coletados no açude foi visto um

aumento da freqüência de danos genéticos (MN e outras alterações nucleares)

em relação a um grupo peixes nascidos e criados em viveiros. Em Tradescantia



pallida, um modelo vegetal para análise ambiental, também houve um aumento

significativo de micronúcleos para ambas as estações do ano, seca e chuvosa. O

mesmo resultado foi encontrado para o ensaio de micronúcleo in vitro, utilizando

linfócitos humanos. Já a análise de micronúcleos em células da mucosa oral de

moradores do município também indicou aumento de mutagenicidade.

Em conjunto, esses dados de genotoxicidade indicam que as águas desse

reservatório público possuem poluentes que estão sendo capazes de gerar

quebras na molécula de DNA. Estas genotoxinas podem ser os metais, a radiação

ou mesmo cianotoxinas, de ação isolada ou sinérgica levando a alterações

nucleares nos peixes ali residentes e provavelmente também para as outras

espécies aquáticas que habitam esse manancial e/ou consumem essas águas,

constituindo assim um risco para a saúde pública.

As concentrações de cianobactérias, metais e radiação alfa e beta, foram

maiores no período de seca, período no qual o reservatório estava com menor

volume hídrico.

Desta forma, a ocorrência elevada desses poluentes está provavelmente

associada às atividades antrópicas na região, tais como, agropecuária intensiva e

lançamento de efluentes domésticos nos afluentes do manancial. Em adição, a

degradação ambiental existente nessa região, como por exemplo, a ausência de

matas ciliares nativas nos afluentes e nas margens desse reservatório público

pode cooperar para a maior lixiviação e percolação dos poluentes ambientais para

dentro do açude de Lucrécia.

Em função do exposto, torna-se fundamental unir esforços científicos aos do

governo, na sua esfera educacional, ambiental e de saúde pública, de forma a



realizar ações integradas em prol do melhor desenvolvimento e qualidade de vida

no município de Lucrécia.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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