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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

ANA CELLY BEZERRA CRUZ

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DA ATIVIDADE

BIOINSETICIDA, DE UM INIBIDOR DE TRIPSINA EM SEMENTES

DE CATANDUVA (Piptadenia moniliformis)

NATAL/RN 2008


PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DA ATIVIDADE

BIOINSETICIDA, DE UM INIBIDOR DE TRIPSINA EM SEMENTES

DE CATANDUVA (Piptadenia moniliformis).

Dissertação apresentada ao Departamento de

Bioquímica da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte como requisito parcial para

obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales.

NATAL 2008

Divisão de Serviços Técnicos Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial Leopoldo Nelson.

Cruz, Ana Celly Bezerra. Purificação, caracterização e análise da atividade bioinseticida, de um inibidor de tripsina em sementes de catanduva (Piptadenia moniliformis) / Ana Celly Bezerra Cruz. - Natal(RN), 2008. 97 f.

Orientador: Mauricio Pereira de Sales.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Departamento de Bioquímica. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.

1. Bioquímica - Dissertação. 2. Inibidor de tripsina - Dissertação. 3. Piptadenia moniliformis - Dissertação. 4. Insetos praga - Dissertação. 5. Inibidor Kunitz – Dissertação. I. Sales, Mauricio Pereira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BC CDU 577.1(043.3)


PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DA ATIVIDADE BIOSINSETICIDA DE UM INIBIDOR DE TRIPSINA EM SEMENTES DE

CATANDUVA (Piptadenia moniliformis)

Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Aprovado em: 20/10/2008

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos

Departamento de Bioquímica - UFRN Coordenador

____________________________________________________ Profª. Drª. Antônia Elenir Amâncio Oliveira

Centro de Biociências- UENF 1º Examinador

____________________________________________________ Profª. Drª. Luciana Duarte Martins da Matta

Departamento de Bioquímica – UFRN 2º Examinador

Dedico

Aos meus pais, Edilson e Gorett que de diferentes formas me ajudaram a finalizar mais uma etapa da minha vida.

À Marcos, presente de Deus, pela paciência e dedicação ao nosso amor.

A Adeliana, mulher maravilhosa, que nunca mediu esforços para me ajudar na hora ou no dia que fosse necessário. Esse trabalho também é seu!

Ao meu orientador, professor Maurício, obrigada pela oportunidade de fazer parte do LQFPB, pela paciência e ensinamentos.

AGRADECIMENTOS

A DEUS por me dar tanta força quando achei que não conseguiria concluir

essa etapa da minha vida e não deixou que o desespero tomasse conta do meu

coração e colocou as pessoas certas nas horas certas para que eu conseguisse

chegar até aqui.

À minha família (alicerce), meus pais e meu marido, por tudo que eles

representam em minha vida. O meu amor é de vocês.

A Marcos, que me ajudou e esteve sempre comigo em todos os momentos

difíceis. Não tenho palavras para agradecer. Amo você.

À Pureza e Macau (in memorian), meus sogros, que de diferentes formas

me ajudaram a alcançar mais uma meta em minha vida. Obrigada pelas orações. E

valeu Tio Macau pelo exemplo de força...!

A Tia Fátima pelas palavras de apoio e força, a atenção nos momentos

difíceis.

Ao professor Maurício pela força nos momentos mais difíceis que enfrentei

durante o mestrado sem sua amizade e carinho não teria conseguido chegar até

aqui. MUITO OBRIGADA!

Ao professor Elizeu pela serenidade e sabedoria. Suas palavras são muito

acalentadoras. Obrigada!

Aos professores que fazem o Departamento de Bioquímica: Edda Lisboa,

Hugo, Luiz, Roberto, Fernanda, Suely, Jacira, Selma e, em especial, à professora

Dilma Ferreira Lima (uma mãe), pelo apoio e confiança transmitidos nos anos de

iniciação cientifica.

À Creusa, que me ensinou muito quando precisei. Nunca esquecerei de

você!

A grande amiga Virginia, que passou a ser a irmã que não tive neste período de

convivência, compartilhando os momentos difíceis e principalmente as vitórias.

Nossos momentos de alegria foram muito importantes. Obrigada por tudo!

Aos amigos da turma do mestrado, Vi, Mi, Vide, Dani, Lí, Adri, Pablito,

Ludo, Rho e Sérgio. Valeu a todos!

Aos companheiros de laboratório, Sheyla (Negona, a amiga que Deus

mandou para mim), Adeliana (Mãezona), Hugo (Gaguinho), Norba (Norbinha),

Jannison (Jan), Dayse (Daysoca, caladinha, mas muito especial para mim), Ludovico

(Ludinho, amigo do coração mesmo que às vezes meio maluquinho), Rodrigo (Rho)

e Fabinho (Binho, pelo inicio desse trabalho!) e a todos aqueles que foram

importantes e não estão no laboratório, mas estarão sempre no meu coração, Ibson,

Léo Caicó (meu braço direito por muitos meses), Danielle (companheira e ouvinte

para muitos desabafos), Ticiana (pela ajuda incondicional), Gioconda (pelas palavras

de amizade), Léo Pepino, Kátya e Joelma (pela alegria e carinho).

Às professoras da Pré-qualificação, Adriana Uchôa e Kátia pelas

sugestões. Obrigada!

A Adriana Uchoa e Adeliana pelas sugestões dadas e pelo tempo a mim

concedido para as correções... Muito obrigada!

A todos os funcionários e amigos do Departamento de Bioquímica, em especial

a Ana Katarina e Eliene que de alguma forma contribuíram para a realização

deste trabalho.

“Que eu continue a acreditar no outro mesmo sabendo de alguns valores tão

esquisitos que permeiam o mundo; Que eu continue otimista, mesmo sabendo que o futuro que nos espera nem

sempre é tão alegre; Que eu continue com a vontade de viver, mesmo sabendo que a vida é, em muitos

momentos, uma lição difícil de ser aprendida; Que eu permaneça com a vontade de ter grandes amigos (as), mesmo sabendo que

com as voltas do mundo, eles (as) vão indo embora de nossas vidas; Que eu realimente sempre a vontade de ajudar as pessoas, mesmo sabendo que

muitas delas são incapazes de ver, sentir, entender ou utilizar esta ajuda.... E, acima de tudo...

Que eu lembre sempre que todos nós fazemos parte desta maravilhosa teia chamada vida, criada por alguém bem superior a todos nós!

E que as grandes mudanças não ocorrem por grandes feitos de alguns e, sim, nas pequenas parcelas cotidianas de todos nós!“

CHICO XAVIER

RESUMO

Um inibidor de tripsina da família Kunitz (PmTI) foi purificado de sementes de Piptadenia moniliformis, uma árvore da sub-família Mimosoideae, através da precipitação com ácido tricloroacético (TCA), cromatografia de afinidade com tripsina acoplada em sepharose, coluna DEAE- celulose(troca iônica) e Superose 12 (exclusão molecular) em sistema FPLC/AKTA. O inibidor possui massa molecular de 25 kDa como confirmado através de SDS-PAGE e cromatografia de exclusão molecular. A seqüência do N-terminal deste inibidor mostrou alta homologia com outros inibidores da família Kunitz. Este também é estável as variações de temperatura e pH, e apresentou um pequeno decréscimo na sua atividade quando incubado com DTT na concentração de 100 mM por 120 minutos. A inibição da tripsina foi do tipo competitiva com Ki de 1,57x10-11 mM. A atividade da tripsina foi inibida efetivamente com percentual de inibição de 100%, entre as outras enzimas testadas não foi detectada inibição para a bromelaína, foi fracamente inibidor da elastase pancreática (3,17% de inibição), inibiu em 76,42% elastase de neutrófilos, inibiu de forma moderada quimotripsina e papaína com percentual de inibição de 42,96% e 23,10%, respectivamente. Ensaios in vitro foram realizados com as proteinases digestivas de Lepidóptera, Coleóptera e Díptera. Vários graus de inibição foram encontrados. Para Anthonomus grandis e Ceratitis capitata a inibição foi de 89,93% e 70,52%, respectivamente, e as enzimas de Zabrotes subfasciatus e Callosobruchus maculatus foram inibidas com percentuais de 5,96% e 9,41% respectivamente, e as enzimas de Plodia interpunctella e Castnia licus foram inibidas com percentuais de 59,94% e 23,67%, respectivamente. No ensaio in vivo, foi observada redução no desenvolvimento de larvas em 4º ínstar de C. capitata, quando PmTI foi adicionado à dieta artificial, obtendo WD50 de 0,30% e LD50 0,33% . Estes resultados sugerem que este inibidor possa ser um forte candidato para programas de melhoramentos de plantas via transgenia.

Palavras-chave: Inibidor de tripsina, Piptadenia moniliformis, Insetos praga, Bioinseticida, Inibidor Kunitz.

ABSTRACT

One Kunitz-type trypsin inhibitors (PmTI) was purified from Piptadenia moniliformisseeds, a tree of the sub-family Mimosoideae, by TCA precipitation, affinity chromatography on immobilized trypsin-Sepharose, DEAE – cellulose (ion exchange) and Superose 12 (molecular exclusion) column FPLC/AKTA. The inhibitor has Mr of 25 kDa by SDS-PAGE and chromatography molecular exclusion. The N-terminal sequence of this inhibitor showed high homology with other family Kunitz inhibitors. This also stable variations in temperature and pH and showed a small decrease in its activity when incubated with DDT in the concentration of 100mM for 120 minutes. The inhibition of trypsin by PmTI was competitive, with Ki of 1.57 x10-11 M. The activity of trypsin was effectively inhibited by percentage of inhibition of 100%, among enzymes tested, was not detected inhibition for the bromelain, was weak inhibitor of pancreatic elastase (3.17% of inhibition) and inhibited by 76.42% elastase of neutrophils, and inhibited in a moderate, chymotrypsin and papain with percentage of inhibition of 42.96% and 23.10% respectively. In vitro assays against digestive proteinases from Lepidoptera, Diptera and Coleoptera pests were carried out. Several degrees of inhibition were found. For Anthonomus grandis and Ceratitis capitata the inhibition was 89.93% and 70.52%, respectively, and the enzymes of Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus maculatus were inhibited by 5.96% and 9.41%, respectively, and the enzymes of Plodia. interpunctella and Castnia licuswere inhibited by 59.94% and 23.67, respectively. In vivo assays, was observed reduction in the development of larvae in 4rd instar of C. capitata, when PmTI was added to the artificial diet, getting WD50 and LD50 of 0.30% and 0.33%, respectively. These results suggest that this inhibitor could be a strong candidate to plant management programs cross transgenic.

Keywords: Trypsin inhibitor, Piptadenia moniliformis, Insect pests, Bioinsecticide, Kunitz inhibitor.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura primária de inibidor de soja da família Bowman-Birk.

23

FIGURA 2 Adulto de Callosobruchus maculatus 27

FIGURA 3 Efeito de incorporação de PDTI em dieta artificial 29

FIGURA 4 Árvore de Catanduva (Piptadenia moniliformis) 31

FIGURA 5 Larvas e insetos adultos 32

FIGURA 6 Esquema de hidrólise do BApNA 37

FIGURA 7 Esquema da tripsina acoplada a Sepharose 39

FIGURA 8 Esquema da metodologia empregada no trabalho 51

FIGURA 9 Atividade anti-tríptica de frações protéicas de sementes de Catanduva

52

FIGURA 10 Análise cromatográfica de CT1% em Tripsina-Sepharose 53

FIGURA 11 Perfil cromatográfico de PmTI em coluna DEAE- celulose FPLC/AKTA

54

FIGURA 12 Perfil da PmTI purificada em FPLC – AKTA, coluna Superose 12

55

FIGURA 13 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE 20%) 56

FIGURA 14 Determinação da massa molecular de PmTI por cromatografia Superose-12 em sistema FPLC-AKTA

58

FIGURA 15 Seqüência parcial e alinhamento comparativo de PmTI 59

FIGURA 16 Estabilidade a diferentes pHs 60

FIGURA 17 Estabilidade térmica de PmTI 61

FIGURA 18 Efeito do desnaturante do DTT na atividade de PmTI 62

FIGURA 20 Mecanismo de inibição de PmTI sobre a atividade catalítica

64

FIGURA 21 Determinação do valor de Ki de PmTI contra tripsina 65

FIGURA 22 Peso médio das larvas de 4º ínstar de C. capitatata 69

FIGURA 23 Sobrevivência das larvas de 4º ínstar de C. capitatata 70

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Família de inibidores de proteinase de plantas 21

TABELA 2 Tabela de purificação 56

TABELA 3 Especificidade de PmTI para proteinases serínicas e cisteínicas

66

TABELA 4 Especificidade de inibição de PmTI para enzimas de diferentes insetos

67

LISTA DE ABREVIATURAS

AcTKI- Inibidor de Acacia confusa

ApTKI- Inibidor de Adenanthera pavonina

[S] - Concentração de substrato

μg - Micrograma

μL - Microlitro

BApNA - α- benzoil-DL-arginina-ρ-nitroanilida

BBI – Bowman- Birk

CT1% - Fração de Catanduva obtida com 1% de TCA




DMSO - Dimetilsulfóxido

DTT- Dithiothreitol

EB- Extrato Bruto de Piptadenia moniliformis

EcTKI- Inibidor de Enterelobium contortisiliquum

EDTA- Ácido etilenodiamino-tetra-acético

kDa- Quilodaltons

Ki - Constante de inibição

LD50 – Dose letal

LiTKI- Inibidor de Leucena leucocephala

M - Molar

mg - Miligrama

Min - Minuto

mL- Mililitro

mM - Milimolar

NaCl – Cloreto de sódio

NCBI- National Center for Biotechnology Information

ND - Não detectado

nm - Nanômetro

ºC - Graus Celcius

PBS - Tampão fosfato

PjTKI- Inibidor de Prosopis juliflora

PmTI - Inibidor de tripsina de Piptadenia moniliformis

SDS - Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE-Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

TCA - Ácido tricloroacético

TEMED – N, N,N’,N’- tetrametiletilenodiamino

Tris - Tris hidroximetil aminometano

UA/mg prot - Unidades de atividade por proteína

UI - Unidade de inibição

UR - Umidade relativa

Vmax - Velocidade máxima

v/v – Relação volume / volume

WD50 – Quantidade de inibidor que reduz em 50% o peso das larvas

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 16

1.1 Considerações gerais 16

1.2 INIBIDORES: distribuição, ocorrência e características. 18

1.3 Inibidores da família Bowman Birk 22

1.4 Inibidores da família Kunitz. 23

1.5 Ação de inibidores sobre insetos 25

2 OBJETIVOS 30

3 MATERIAIS 31

3.1 Sementes 31

3.2 Insetos 32

3.3 Enzimas adquiridas comercialmente 33

3.4 Substratos 33

3.5 Reagentes 34

3.6 Equipamentos 34

4 MÉTODOS 35

4.1 Preparação do extrato protéico de sementes de Catanduva 35

4.2 Fracionamento protéico com ácido tricloroacético (TCA) 35

4.3 Determinação de proteínas 36

4.4 Preparo das soluções usadas como substrato 36

4.5 Determinação da atividade anti-tríptica 36

4.6 Isolamento e Purificação 38

4.6.1 Cromatografia de afinidade em Tripsina-Sepharose 38

4.6.2 Cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-celulose em

sistema FPLC/AKTA

38

4.6.3 Determinação da Massa Molecular por Cromatografia de

Exclusão Molecular em Superose 12 10 300 GL em Sistema

FPLC-AKTA.

39

4.7 Determinação da seqüência de aminoácidos N- terminal da

proteína purificada

40

4.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 41

4.8.1 Em condições desnaturantes e não redutoras 41

4.8.2 Em condições desnaturantes e redutoras 42

4.8.3 Coloramento com Comassie Blue. 42

4.8.4 Revelação com Nitrato de Prata 42

4.9 Caracterização do inibidor 43

4.9.1 Estabilidade do inibidor em diferentes pHs 43

4.9.2 Estabilidade térmica do inibidor 44

4.8.3 Efeito do DTT na atividade do inibidor 44

4.8.4 Especificidade do inibidor para proteinases serínicas e

cisteínicas

45

4.8.4.1 Inibição da elastase pancreática 45

4.8.4.2 Inibição da elastase de neutrófilos 45

4.8.4.3 Inibição da quimotripsina 46

4.8.4.4 Inibição da bromelaína 46

4.8.4.5 Inibição da papaína 47

4.9 Determinação do mecanismo e da constante de inibição do

inibidor

47

4.10 Preparo das enzimas digestórias de insetos 48

4.10.1 Ensaios in vitro sobre extrato intestinal de larvas de insetos 49

4.10.1.1 Ensaio in vitro para C. maculatus, A grandis e Z. subfaciatus 49

4.10.1.2 Ensaio in vitro para C. capitata, C.licus, e P. interpunctela 49

4.11 Bioensaio para C. capitata 50

5 RESULTADOS 52

5.1 Isolamento e purificação 52

5.1.1 Detecção da atividade inibitória para tripsina em extratos

protéicos de Catanduva

52

5.1.2 Análise cromatográfica de CT1% em Tripsina-Sepharose 53

5.1.3 Isolamento do inibidor de tripsina em cromatografia DEAE-

celulose/AKTA

54

5.1.4 Análise cromatográfica em Superose - 12 AKTA 55

5.1.5 Análise das etapas de purificação 56

5.1.5.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS

(SDS-PAGE) da fração protéica de Catanduva

57

5.2 Caracterização bioquímica dos inibidores de sementes de

Catanduva

58

5.2.1 Determinação da massa molecular relativa 58

5.3 Alinhamento e análise da seqüência N-terminal 59

5.4 Estabilidade em diferentes pHs 60

5.5 Estabilidade térmica 61

5.6 Efeito do DTT na atividade do inibidor 62

5.7 Mecanismo de inibição e valor de Ki 63

5.7.1 Mecanismo de inibição sobre a tripsina 63

5.8 Especificidade para proteinases serínicas e cisteínicas 66

5.9 Especificidade dos inibidores para enzimas digestórias de

insetos

67

5. 10 Bioensaio para C. capitata 68

6 DISCUSSÃO 71

7 CONCLUSÕES 80

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 81

16 Introdução

1 INTRODUÇÃO

1.1 Considerações gerais.

O aumento da população mundial demanda concomitante incremento da

produção de alimentos em escala global. A expansão da área disponível para o

cultivo poderá causar um impacto negativo ao meio ambiente e aos recursos

naturais, desta forma faz-se necessário o desenvolvimento de novas tecnologias que

promovam aumento da produção, sem aumento da área plantada, além de

proporcionar alimentos de melhor qualidade nutricional, resistentes a estresses

abióticos (ex., salinidade, seca, etc) (KRATTIGER, 1997) e bióticos (pragas e

patógenos) (KOGAN, 1986).

As perdas na produção mundial de grãos sem o uso de pesticidas e de outras

estratégias de controles não-químicas são calculadas em cerca de 70%, chegando a

um prejuízo de 400 bilhões de dólares. As perdas da pré-colheita devido à ação de

insetos, apesar da utilização de inseticidas, são estimadas em 15% da produção

total, representando um valor de 100 bilhões de dólares (Ferry et al., 2004). O custo

anual do controle de insetos equivale a 8 bilhões de dólares, justificando assim o

emprego de medidas mais econômicas e urgentes para o controle (LAWRENCE;

KOUNDAL, 2002). As pragas e os patógenos (fungos, bactérias, vírus e nematóides)

são responsáveis por grandes prejuízos na agricultura mundial por se alimentarem

dos tecidos das plantas. As perdas chegam a 37%, sendo 13% destas causadas por

insetos e doenças (GATEHOUSE; BOULTER; HILDER, 1992).

Segundo LAURENCE; KOUNDAL, (2002), a busca e o desenvolvimento de

técnicas ambientalmente favoráveis tornam-se a solução para diminuir, a utilização

de produtos químicos, gastos em energia e, portanto a produção de materiais

17 Introdução

prejudiciais, como resíduos de pesticidas. O uso exclusivo de pesticidas químicos,

além de resultar num rápido desenvolvimento de resistência nos insetos, é

responsável por alterar o balanço entre as pragas e seus predadores naturais,

geralmente em favor das primeiras. Sendo assim, um programa de manejo integrado

proporcionaria a melhor opção, pois ele seria baseado na combinação de práticas

onde ocorra o uso criterioso de pesticidas, rotação de culturas e acima de tudo a

exploração de variedades de plantas resistentes.

As sementes de leguminosas são fontes ricas de proteínas, dentre as

diversas classes de proteínas de sementes, algumas são consideradas fatores anti-

nutricionais, como os inibidores de proteinases, quitinases, as lectinas, proteínas

alergênicas e outras toxinas protéicas (XAVIER-FILHO; VENTURA, 1988; PUZSTAI,

1989; CARLINI; Sales et al., 1996; GROSSI-DE-SÁ, 2002). Estas substâncias tem a

função de proteger ou defender a semente e a planta do ataque de patógenos e de

pragas, e dentre estas os inibidores de leguminosas vêm sendo intensamente

estudados (NEURATH, 1984; Macedo et al., 2000; Pando et al., 2001; Cursino-

Santos et al., 2003; Santos et al., 2004).

A primeira transferência de gene bem sucedida para outra espécie vegetal foi

realizada por Hilder et al., (1987), onde genes de feijão de corda (Vigna unguiculata),

que codifica um inibidor de tripsina, foram transferidos para plantas de tabaco

(Nicotiana tabacum). Nesse contexto, a busca de genes e produtos gênicos de

proteínas de defesa, tais como lectinas, inibidores de enzimas entre outras

moléculas que possam ser utilizados em biotecnologias têm sido amplamente

estimuladas, como, por exemplo, na formulação de bioinseticidas e para modificação

genética de plantas cultivadas.

18 Introdução

1.2 - INIBIDORES: distribuição, ocorrência e características.

No final do século XIX, as substâncias inibidoras de proteinases foram

encontradas em nematóides e no soro humano (RICHARDSON, 1991). Entretanto,

especulações sobre inibidores de plantas iniciaram-se a partir da década de 40

quando KNEEN; SANDSTEDT (1943) encontraram um inibidor de α-amilase em

grãos de vários cereais, e posteriormente, KUNITZ (1945) purificou uma proteína

termoestável da soja com capacidade de inibir a tripsina.

Os inibidores de proteinases são proteínas ou peptídeos, amplamente

encontrados em vegetais, animais e microorganismos, com propriedades de inibir a

ação catalítica das enzimas, ao interagir em diversos graus de afinidade com os

sítios reativos das enzimas, formando complexos estequiométricos inativos (RYAN,

1973; RICHARDSON, 1977; WEDER, 1981; RICHARDSON, 1991). Nas plantas os

inibidores vão se concentrar principalmente nos órgãos reprodutivos e de reserva,

tais como, sementes e tubérculos (RYAN, 1981; BRZIN; KIDRIC, 1995). No entanto,

já foram encontrados em polpa de frutas (Araújo et al., 2004), folhas, frutos, raízes e

vagens (XAVIER-FILHO, 1992; CUNNINGHAM; VOLENEC, 1996; XU et al., 2001;

SIN; CHYE, 2004) e, podem apresentar diversas funções como: proteínas de

reserva, agentes reguladores de proteases endógenas, importantes para proteger

fluidos e tecidos da degradação pela atividade proteolítica (NEURATH, 1984; RYAN,

1990; RICHARDSON, 1991; Walker et al.,1997) além de serem parte do sistema

natural de defesa das plantas mostrando especificidade para a maioria das

proteases digestivas dos insetos herbívoros (BODE; HUBER, 2000) e patógenos

(BRODWAY; DUFFEY, 1986; Johnson et al.,1989; BRODWAY, 1995; TORNERO et

al., 1997; Schuler et al., 1998; TIFFIN; GAUT, 2001).

19 Introdução

A expressão dos inibidores pode ser constitutiva ou induzida (Tornero et al.,

1997; VAN DER HOORN; JONES, 2004). O mecanismo de defesa das plantas são

constitutivas, se sua ação faz-se dentro do programa de desenvolvimento normal da

planta nos diferentes tecidos vegetais; ou induzidas quando estão envolvidas

diretamente na resposta a infecção ou estímulos ambientais (CHESIN; ZIPF, 1990).

Essa resposta induzida pode resultar em efetivos mecanismos de resistência a

doenças quando ela é expressa pela planta, sistemicamente. Nesse caso, os

agentes envolvidos induzem uma resposta do hospedeiro, não apenas em torno das

partes atingidas, como também em partes da planta distante da área onde ocorreu à

injúria, sendo este processo (DEAN; KUC, 1986; GOTTSTEIN; KUC, 1989). As

defesas induzidas são mais importantes para as defesas de partes vegetativas das

plantas, enquanto que as defesas constitutivas são mais importantes para as

defesas das sementes (XAVIER-FILHO, 1993, Uchôa et al., 2002).

Em relação à distribuição dos inibidores em plantas, sabe-se que as

angiospermas dicotiledôneas englobam o maior número de espécies contendo

essas proteínas, merecendo destaque as famílias Leguminosae (ou Fabaceae)

sendo representada pelos feijões, soja e ervilha (XAVIER-FILHO, 1992; Macedo et

al., 2000), e a família Solanaceae representada pela batata, tomate e tabaco.

Enquanto que entre as monocotiledôneas os inibidores estão mais amplamente

distribuídos na família Gramineae (atualmente denominada Poaceae) tendo como

representantes, arroz, milho, trigo e centeio (OLIVEIRA, 2007). No entanto, a

quantidade de inibidores é extremamente variável, dependendo de vários fatores

como o estágio de maturação da planta, sua localização nos tecidos, tempo de

colheita e de armazenamento (SHEWRY; LUCAS, 1997).

20 Introdução

A especificidade é uma característica marcante no estudo das interações

entre enzima-inibidor, sendo determinada pela dinâmica das interações envolvidas e

pela estrutura nativa do inibidor e da enzima (MACEDO; XAVIER - FILHO, 1993). A

inibição exibida por estas proteínas é altamente variável e muitos dos inibidores de

tripsina também inibem quimotripsina. Em alguns casos, o sítio reativo é o mesmo

para ambas as enzimas ou a inibição ocorre através de sítios reativos

independentes (BIRK, 1994).

Os inibidores de proteinases são caracterizados de acordo com sua

especificidade e seu mecanismo de ação. Baseado nessa observação quatro

classes de inibidores foram estabelecidas: inibidores de proteinases serínicas; de

proteinases cisteínicas; aspárticas e de metalo-proteinases (RYAN, 1990;

RICHARDSON, 1991) (Tabela 1). Os mais estudados e caracterizados são os

inibidores de proteinases serínicas, (Koiwa et al., 1997). Entretanto, alguns

inibidores de proteinases cisteínicas foram caracterizados e seus efeitos observados

contra insetos pragas (BODE; HUBER, 1992; 2000; Oliveira et al., 2003; Macedo et

al., 2004).

Os inibidores de proteinases serínicas presentes em plantas são classificados

em sete famílias (Tabela 1) através de características da homologia da estrutura

primária, massa molecular, conteúdo de cisteína e de pontes dissulfetos

(RICHARDSON, 1991; Koiwa et al., 1997). Os demais inibidores compreendem

apenas uma família (BODE; HUBER, 1992; 2000; Koiwa et al., 1997; MARGIS;

REIS; VILLERET, 1998). Os inibidores de plantas são tipicamente pobres nos

aminoácidos metionina, histidina e triptofano; porém, são ricos em ácido aspártico,

ácido glutâmico, serina, lisina e cisteína (BOWLES, 1990). Dentre estes, os

inibidores de proteinases serínicas da família Kunitz e Bowman-Birk têm sido

21 Introdução

bastante estudados e diferem principalmente em massa molecular, conteúdo de

cisteína e números de sítios reativos (RICHARDSON, 1977).

Tabela 1 - Família de inibidores de proteinases de plantas

Classes de inibidores Famílias de inibidores

Inibidores de proteinases serínicas Kunitz

Bowman-Birk

Batata I

Batata II

Superfamilia de cereais

Taumatina

Ragi I-2/milho

Inibidores de proteinases cisteínicas Cistatinas de planta (Fitocistatinas)

Inibidores de proteinases aspárticas Inibidor de proteinase aspártica

Inibidores de metalo-proteinases Inibidores de carboxipeptidases A e B

Existem relatos sobre inibidores de proteinases serínicas que também são ativos

contra enzimas de outras classes, como por exemplo, inibidores de tripsina que

também inibem papaína (uma proteinase cisteínica) (Macedo et al., 2004; Oliveira

et al., 2007), e também aqueles que apresentam uma atividade inibitória sobre α-

amilase (Koiwa et al., 1997, BELITZ; GROSCH, 1997).

22 Introdução

Os inibidores de proteinases mais abundantes e estudados são aqueles capazes

de inibir as proteinases serínicas, grupo da tripsina e quimotripsina, enzimas

digestivas encontradas em insetos das ordens Lepidoptera, como em Spodoptera

frugiperda (TERRA; FERREIRA, 1994) e Diptera, como em Ceratitis capitata

(Gomes et al., 2005; Silva et al., 2006). Inibidores de proteinases cisteínicas e

aspárticas, enzimas que são predominantes nas ordens Coleoptera e Hemiptera,

como no Calosobruchus maculatus, Zabrotes subfasciatus e Dysdercus

peruvianus (SILVA; XAVIER-FILHO, 1991; Campos et al., 1989; Haq et al., 2004;

StanisçuaskI et al., 2005) são menos conhecidos.

1.3 - Inibidores da família Bowman-Birk

Os inibidores da família Bowman-Birk (BBI) são proteínas globulares solúveis,

caracterizadas por suas pequenas massas moleculares que variam de 8 a 10

kDa, com alto conteúdo de cisteína podendo apresentar 7 pontes dissulfeto, que

conferem grande estabilidade à sua estrutura, distribuídas em cerca de 70 a 90

aminoácidos (LASKOWSKI; KATO, 1980; RICHARDSON, 1991; BIRK, 1994).

O primeiro inibidor pertencente à família Bowman-Birk (Figura 1), que deu

origem a esta família, foi purificado de sementes de soja (Glycine max), constituído

de uma cadeia polipeptídica com dois sítios reativos, um para a tripsina e o outro

para quimotripsina, e formado de 71 resíduos de aminoácidos (ODANI; IKENAKA,

1973a, b).

23 Introdução

1.4 - Inibidores da família Kunitz

Os inibidores da família Kunitz são proteínas que apresentam uma ou duas

cadeias polipeptídicas, em geral, com apenas um sítio reativo, e massa molecular

entre 18 e 24 kDa, correspondendo a aproximadamente 180 resíduos de

aminoácidos, geralmente com quatro resíduos de cisteína que formam duas

pontes dissulfeto, que proporcionam estabilidade a estrutura protéica (Svendnsen

et al., 1984; KIM; LAMBOOY, 1985; RICHARDSON, 1991; Batista et al., 1996).

Os inibidores que apresentam um sítio reativo são conhecidos como inibidores de

Figura 1: Estrutura primária de inibidor de soja da família Bowman-

Birk. A estrutura primária do inibidor de soja da família Bowman-Birk

mostra a organização das sete pontes dissulfetos. Os dois sítios

reativos localizados nos loops e a posição do resíduo P1 estão

indicados: O sítio reativo para tripsina (Lisina16-Serina-17), e

quimotripsina (Leucina44-Serina45) (ODANI; IKENAKA, 1973 a, b).

24 Introdução

uma cabeça “single headed”. Entretanto, alguns representantes dessa família

foram caracterizados como inibidores que possuem dois sítios reativos “double

headed” (RICHARDSON, 1991). A interação direta do resíduo do sítio reativo P1

do inibidor no sítio ativo da enzima caracteriza um mecanismo de inibição

competitivo, comum para muitos inibidores de tripsina da família Kunitz (BODE;

HUBER, 1992, 2000; Franco et al., 2002; Mandal et al., 2002, Bhattacharyya et

al., 2006).

Os inibidores de proteinases serínicas da família Kunitz foram purificados de

vários tecidos e órgãos de plantas incluindo látex do mamão (OdanI et al., 1996;

Azarkan et al., 2006), folhas de azolla (MAITY; PATRA, 2003), rizomas tuberosos

de várias aráceas (OLIVEIRA, 2001; SUMATHI; PATTABIRAMAN, 1979),

tubérculos de solanáceas (Valueva et al., 1998; VALUEVA; REVINA; MOSOLOV,

1997, 1999), sementes de jaca (BHAT; PATTABIRAMN, 1989), sementes de

mustarda (Mandal et al., 2002), e particularmente de sementes de leguminosas

(RICHARDSON, 1991).

Esses inibidores podem ser encontrados em quantidades relativamente grandes

em sementes das três subfamílias de leguminosas: Mimosoideae,

Caesalpinoideae e Papilionoideae (Faboideae). Sendo as Mimosoideae as mais

primitivas, as Papilionoideae as mais evoluídas e as Caesalpinoideae

pertencentes a um estágio intermediário de evolução (CRONQUIST, 1988).

Os pertencentes à subfamília Mimosoideae são formados por duas cadeias

polipeptídicas após redução das pontes dissulfeto, como é o caso do inibidor de

tripsina isolado da Leucaena leucocephala (Oliva et al., 1999), do inibidor de

tripsina da batata, denominado PSPI-21 (Valueva, et al., 1998), do inibidor de

tripsina de Prosopis juliflora (Negreiros et al., 1991), do inibidor de tripsina de

25 Introdução

Archidendron ellipticum (Bhattacharyya et al., 2006), do inibidor de tripsina de

Dimorphandra mollis (Macedo et al., 2000).

2- Ação de inibidores sobre insetos

A planta, durante todo o seu ciclo de vida, está exposta ao ataque de uma

grande variedade de insetos, microorganismos e outros agentes que afetam sua

integridade. A presença de um mecanismo de defesa no sistema vegetal torna-se

então, fundamental para alcançar o sucesso na manutenção do seu crescimento e

desenvolvimento (Mello et al., 2001). Este mecanismo abrange os mais variados

tipos de sistemas de defesa, desde a ocorrência de barreiras físicas ou de

modificações estruturais na morfologia vegetal, até a presença de compostos

químicos tais como alcalóides, toxinas, inibidores enzimáticos e outras substâncias

biologicamente ativas contra os agentes predadores (BROADWAY, 1996; SHEWRY;

LUCAS, 1997; HARBORNE, 1997; Tamhane et al., 2005; Dunaevsky et al., 2005).

As plantas desenvolveram características extraordinárias contra as proteinases

dos insetos tais como o aumento da atividade do inibidor em seus tecidos (Rakwal

et al., 2001), produção de um conjunto heterogêneo de inibidores ativos contra

amilases e proteinases (ROY; GUPTA, 2000), além de inibidores de enzimas de

insetos altamente específicos (Falco et al., 2001), resistentes à proteólise e ativos

sob condições diversas de pH (Christeller et al., 1990, CHRISTELLER, 2005).

26 Introdução

Para a obtenção de aminoácidos essenciais utilizados nos processos

fisiológicos, os insetos utilizam uma combinação de proteases em seus processos

digestivos (MCFARLANE, 1985; Terra et al., 1990). Essas proteases digestivas

catalisam a liberação de peptídeos e aminoácidos das proteínas da dieta e são

encontradas abundantemente na região do intestino médio do trato digestivo de

insetos (JONGSMA; BOLTER, 1977). Por um longo tempo pensava-se que,

semelhante aos vertebrados, os insetos continham apenas proteinases serínicas do

tipo tripsina e quimotripsina, e aspárticas do tipo pepsina, pois a maioria das

pesquisas foi realizada com insetos da ordem Lepidoptera e Diptera, que geralmente

usam proteinases serínicas para a digestão das proteínas, possuindo em seus

intestinos médio um pH alcalino variando entre 8 a 11,5, ideal para atividade dessa

classe de enzimas (APLEBAUM, 1964). Entretanto, estudos mostraram que outras

classes de insetos utilizam proteinases cisteínicas e aspárticas para degradar as

proteínas da dieta. Dentre esses estão os insetos da ordem Coleoptera, com pH

ótimo do intestino entre 5 e 7 para proteinases cisteínicas e 4,5 para proteinases

aspárticas (BARRET, 1986; TURK; BODE, 1991; BODE; HUBER, 1992). Diante

disso, existe a hipótese de que o uso de proteinases cisteínicas pode ter sido uma

adaptação evolucionária dos insetos que se alimentam de sementes de leguminosas

e outros tecidos de plantas que possuem, naturalmente, altas concentrações de

inibidores de proteinases serínicas (JONGSMA; BOLTER, 1997). Como exemplo

temos o bruquídeo Callosobruchus maculatus, pertencente à classe Coleóptera que

infesta variedades de Vigna unguiculata (feijão-de-corda) que apresentam elevados

níveis de inibidores de tripsina em suas sementes (Gatehouse et al., 1979

GATEHOUSE; BOULTER, 1983) (Figura 2).

27 Introdução

A presença de inibidores em sementes ou em tubérculos também facilita o

acúmulo e armazenamento de proteínas pela diminuição da atividade das

proteinases endógenas (Koiwa et al., 1997). O estudo dessas proteínas de defesa

tem mostrado que a introdução de genes de inibidores de proteinases em plantas

transgênicas pode conferir resistência a insetos, comprovando seu envolvimento nas

defesas de vegetais (Hilder et al., 1987; Johnson et al., 1989; Boulter et al., 1990;

Mcmanaus et al., 1994). Foi observado que a indução de inibidores de proteinases

em folhas de tomate reduz o crescimento de larvas do cartucho da beterraba

(Spodoptera exigua), quando comparada com as larvas controle alimentadas com

Figura 2: Adulto de Callosobruchus maculatus em grãos

apresentando ovos e orifício para saída dos insetos

(Fonte: EMBRAPA MEIO-AMBIENTE, 2003).

28 Introdução

folhas sem inibidor (Brodway et al., 1986). Vários outros trabalhos têm demonstrado

que inibidores de proteinases podem inibir a atividade de enzimas digestivas in vitro.

Como exemplos, temos o inibidor de tripsina de soja que é efetivo contra enzimas do

besouro da farinha, Tenebrio molitor (Applebaum et al., 1985), a tripsina de Manduca

sexta (MILLER, KRAMER, LAW, 1974) e a elastase de Teleogryllus commodus

(Christeller et al., 1990). A presença de inibidores também tem sido relatada por

retardar o desenvolvimento larval quando esses são incorporados em ensaios in vivo

utilizando dietas artificiais (Macedo et al., 2000).

Inúmeros trabalhos demonstraram que os inibidores de proteinases,

principalmente, serínicas e cisteínicas presentes em dietas artificiais ou em plantas

transgênicas, são capazes de interferir no crescimento e desenvolvimento de

algumas espécies de insetos principalmente aquelas pertencentes às ordens

Lepidóptera e Coleóptera (Jouanin et al., 1998). Ensaios biológicos, nos quais

inibidores são incorporados em dietas artificiais de insetos (Macedo et al., 2003)

(Figura 03), fornecem uma valiosa informação sobre os tipos de inibidores com

potencial para serem usados como fatores de resistência na manipulação genética e

programas de melhoramento de plantas economicamente importantes (McManus et

al., 1995; BROADWAY, 1997).

29 Introdução

Diante do exposto, a purificação e caracterização de inibidores de proteinases

presentes em sementes e a determinação da especificidade de inibição é um passo

importante para a indicação desse inibidor para os programas de melhoramento de

plantas cultivadas e também no seu uso como bioinseticida. Dentro desse contexto,

nenhum estudo foi desenvolvido sobre proteínas de defesa de sementes de

Catanduva (Piptadenia moniliformis) e sua ação bioinseticida sobre os insetos

pragas.

Figura 03: Efeito de incorporação de PDTI em dieta artificial

para Anagasta kuenhiella (Lepidoptera: Pyralidae).

Variações no tamanho de larvas de quarto instar de A.

kuenhiella alimentada sobre dieta controle (A), e dieta

contendo 0,4%(B); 0,8%(C) e 16% de PDTI (D) (Macedo et

al., 2003).

A B C D

30 Objetivos

2 OBJETIVOS

Esse trabalho teve como objetivos:

• Identificar a presença de inibidores de enzimas do tipo serínicas em sementes

de catanduva;

• Purificar um inibidor de tripsina presente em sementes de Catanduva

(Piptadenia moniliformis);

• Caracterizar o inibidor de tripsina purificado e determinar sua especificidade

para diferentes enzimas;

• Determinar a atividade inibitória in vitro sobre enzimas digestórias de

Lepidópteras (Plodia interpuncttela, Castnia licus), Coleópteras

(Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus, Anthonomus grandis) e

Díptera (Ceratitis capitata);

• Avaliar a ação do inibidor purificado in vivo para o díptera C. capitata (mosca-

das-frutas), através da determinação da sua WD50 e LD50.

_________________________________________________________________ Materiais e Métodos

31

3 MATERIAIS

3.1 Sementes

As sementes de Catanduva (Piptadenia moniliformis) (Benth.) (Figura 4) foram

gentilmente fornecidas pela Divisão Técnica do Setor de Sementeiras do Instituto

Brasileiro do Meio ambiente (IBAMA), Natal-RN.

P. moniliformis (Benth.), pertence à familia Mimosaceae (leguminosae), é uma

árvore que pode atingir até 20 metros de altura, encontrada em áreas de caatinga e

clima semi-árido em quase todo Brasil, sendo amplamente distribuída nos Estados

da Bahia, Ceará, Pernambuco, Piauí e Rio Grande do Norte. A planta P. moniliformis

é conhecida popularmente como Angico, Angico-de-bezerro, Carrasco, Catanduba,

Jurema-preta, Marmeleiro, Quipembe, Rama-de-bezerro, além de Catanduva

(LEWIS, 2003).

Figura 4: Árvore e sementes de Catanduva (P. moniliformis)

Fonte: http://www.cnip.org.br/bdpn/fotosdb/32.jpg (acesso em 05 de maio de 2008).


32

3.2 Insetos

Espécimes de Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruquideo; gorgulho do feijão-

de-corda), Zabrotes subfasciatus (Coleoptera: Bruquideo; gorgulho do feijão-de-

corda e feijão comum) e Plodia interpunctela (Lepidoptera: Pyralidae; praga

generalista) foram coletados da criação mantida no Laboratório de Química e

Função de Proteínas Bioativas (LQFPB), do Departamento de Bioquímica da UFRN.

Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae; mosca-das-frutas,) foram gentilmente cedidos

pelo Prof. Dr. Francisco Pepino de Macedo do Laboratório de Mosca-das-frutas, no

Departamento de Biologia Celular e Genética da UFRN. As larvas de Anthonomus

grandis (Coleoptera: Curculionidae; bicudo do algodoeiro) foram gentilmente cedidas

pela Dra. Márcia Vidal, do Centro Nacional de Pesquisa do Algodão, de Campina

Grande, Paraíba. E as larvas de Castnia licus (Lepidoptera: Castniidae; broca

gigante) foram gentilmente cedidas pela Dra. Fátima Grossi de Sá, do CENARGEN,

de Brasília.

Figura 5: Larvas e insetos adultos utilizados nos ensaios com enzimas digestórias. Larvas de: A - C.

licus; e B - A. grandis. Insetos adultos de: C- C. maculatus; D- C. capitata; E- P. interpunctella; e F- Z.

subfasciatus.

A B C

D E F


33

3.3 Enzimas adquiridas comercialmente

Proteinase serínica: Tripsina – pâncreas bovino (Sigma)

Proteinase serínica: Quimotripsina - pâncreas bovino (Sigma)

Proteinase serínica: Elastase - pâncreas bovino (Sigma)

Proteinase serínica: Elastase – neutrófilo humano (Sigma)

Proteinase cisteínica: Papaína – látex de mamão (Sigma)

Proteinase cisteínica: Bromelaína do talo de abacaxi (Sigma)

3.4 Substratos

Azocaseína- (Sigma)

BApNA- (Sigma): α- benzoil-DL-arginina-p- nitroanilida

SAAvNA (Bachem Feinchemikalien AG): N-succinil-L-alanil-L-valina-p-nitroanilida

3.5 Reagentes

BSA (albumina sérica bovina) – Sigma

Comassie blue G-250 e R- 250 – Sigma

Dimetilformamida (N’N’ – Dimetilformamida) - Sigma

DMSO (dimetilsulfóxido) - VTEC Química Fina LTDA

DTT (ditiotreitol) - Sigma

EDTA (ácido etileno dianimotetracético) – Sigma

Mercaptoetanol – VETEC Química Fina LTDA

Padrão de massa molecular -Fermentas life sciences:


34

Beta-amilase (200 kDa)

Álcool desidrogenase (150 kDa)

β-galactosidase (116 kDa);

Albumina sérica bovina (66,2 kDa);

Ovalbumina (45 kDa);

Lactato desidrogenase (35 kDa);

Endonuclease de restrição (25 kDa);

β-lactoglobulina (18,4 kDa);

Lisozima (14,4 kDa).

SDS (dodecil sulfato de sódio) – Sigma

Sepharose-4B – Sigma

TCA (ácido tricloroacético) - VETEC Química Fina LTDA

TEMED (N, N, N-tetrametiletilinodiamino) – Sigma

3.6 Equipamentos

Agitador Magnético Tecnal TE-081

Balança analítica eletrônica Tecnal classe II

Banho-Maria -Tecnal Te 056

Centrífuga HITACHI CR 21

Espectrofotômetro Femto 700 plus

FPLC AKTA Purifier – GE Healthcare Bio-Sciences Corp.

Microcentrífuga Eppendorf 5410


35

4 MÉTODOS

4.1 Preparação do extrato protéico de sementes de Catanduva

As sementes de Catanduva (P. moniliformis) foram moídas em um processador até a

formação de um pó de granulação fina, em torno de 40 mesh. As proteínas totais

desta farinha foram extraídas em tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5, na

proporção de 1:10 (p/v). O extrato protéico foi submetido à agitação constante, por 3

horas em temperatura ambiente. Decorrido esse tempo, o extrato protéico foi

centrifugada a 12.000 xg por 30 minutos a 4 0C e o sobrenadante obtido foi

denominado extrato bruto (EB).

4.2 Fracionamento protéico com ácido tricloroacético (TCA)

O extrato bruto obtido foi submetido à precipitação com solução aquosa de TCA

20% para remoção de proteínas de alta massa molecular. Alíquotas de 2 ml de

extrato bruto foram precipitadas com solução aquosa de TCA 20%, em banho de

gelo, para obter frações protéicas com concentrações finais de 1, 2, 3 e 4% de TCA.

Decorridos 30 minutos da adição lenta de TCA em agitação constante, as frações

protéicas foram centrifugadas a 12.000 xg por 30 minutos a 4 0C e os sobrenadantes

obtidos foram dialisados contra tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5 por 16

horas, e em seguida foram submetidos a ensaio de atividade inibitória para tripsina.

Após essa primeira análise, a fração protéica que apresentou maior atividade

inibitória foi utilizada nos passos subseqüentes. O restante do extrato bruto foi


36

submetido ao mesmo tratamento e a fração protéica foi utilizada nas etapas

subseqüentes de isolamento e purificação protéica.

4.3 Determinação de proteínas

As proteínas foram quantificadas pelo método de BRADFORD (1976), utilizando-se

albumina sérica bovina (BSA) como padrão. Medidas de densidade óptica de 280

nm foram utilizadas para acompanhamento das corridas cromatográficas.

4.4 Preparo das soluções usadas como substrato

BApNA (1,25 mM) foi dissolvido em DMSO 1% (v/v) e o volume completado com

tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. Para os ensaios cinéticos também foram

preparados BApNA a 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 2,0; e 2,5 mM, utilizando o mesmo

procedimento descrito anteriormente.

Azocaseína a 1% foi preparada em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 e fervida por

cerca de 15 minutos, após resfriamento o volume foi completado com água

destilada. A solução foi reservada em congelador até sua utilização.

SAAvNA (300 mM ) foi dissolvido em N’N’ – Dimetilformamida 100%.

4.5 Determinação da atividade anti-tríptica

A atividade anti-tríptica das frações foi determinada utilizando a seguinte

metodologia (ERLANGER; KOLOWSKY; COHEN, 1961): alíquota de 30 μL da

solução de tripsina bovina (0,3 mg/ mL tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) foi pré-


37

incubada com 390 μL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 e 50 μL do inibidor por 10

minutos a 37 0C. Após esse período a reação foi iniciada adicionando-se 500 μL de

solução de substrato (BApNA 1,25 mM). A reação processou-se por mais 15 minutos

nas mesmas condições de incubação, e em seguida foi paralisada adicionando-se

120 μL de solução de ácido acético 30%. Todos os ensaios foram feitos em

triplicatas e provas em branco foram realizadas. O p-nitroanilida hidrolisado foi

monitorado em espectrofotômetro a 410 nm, como mostrado na Figura 6.

Figura 6: Esquema de hidrólise do BApNA (Adaptado de OLIVEIRA, 2007).

p-nitroanilida Positivo= amarelo

Tripsina H2O


38

4.6 Isolamento e Purificação

4.6.1 Cromatografia de afinidade em Tripsina-Sepharose 4B

Para a cromatografia de afinidade foi feito a acoplagem de tripsina bovina a uma

resina de Sepharose 4B ativada com brometo de cianogênio, seguindo instruções do

fabricante. Para seu preparo, pesou-se 1g da Sepharose para cada 3,5 mL final de

gel. O pó foi ressuspendido em 50 mL de HCl 1 mM e lavado por 15 min sendo

filtrado várias vezes com auxílio de bomba a vácuo. O gel foi retirado do filtro,

adicionou-se 15 mL de HCl 1 mM e deixou-se em repouso por 15 min.

A tripsina para o acoplamento a resina Sepharose 4B ativada (Figura 7) foi

preparada dissolvendo-se 10 mg de enzima, por mL de gel, em tampão bicarbonato

de sódio 100 mM, pH 8,3 contendo NaCl 500 mM. A solução de tripsina foi então

adicionada ao gel e incubou-se por 16h a 4°C. Decorrido o tempo, lavou-se o

excesso de ligante (tripsina) com 5 volumes de tampão bicarbonato de sódio 100

mM contendo NaCl 500 mM. Em seguida o gel foi transferido para um recipiente

contendo tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 por duas horas para bloquear quaisquer

grupos ativos remanescentes na resina. Decorrido esse tempo, o gel foi lavado com

5 volumes de tampão acetato de sódio 100 mM contendo NaCl 500 mM, pH 4,0

seguido por 5 volumes de Tris-HCl 100 mM contendo NaCl 500 mM, pH 8,0. Após

esse procedimento o gel foi transferido para uma coluna (10 cm x 1,5 cm) e

equilibrada com tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5.


39

Figura 7: Esquema da tripsina acoplada a Sepharose (Adaptado de OLIVEIRA, 2007).

A fração mais enriquecida com atividade inibitória foi dialisada contra tampão

tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5, proveniente da precipitação com solução

aquosa de TCA 20%, denominada CT1%, foi submetida a cromatografia de

afinidade em Tripsina-Sepharose (10 cm X 1,5 cm) equilibrada com tampão

tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5. As proteínas adsorvidas na matriz foram eluídas

com solução de HCl 5 mM. Frações de 2 mL foram coletadas em fluxo constante de

2 mL/min e o perfil protéico foi acompanhado por espectrofotometria a 280 nm. O

pico retido da matriz de afinidade, denominado CT1Af foi dialisado em tampão

tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5 e submetido a ensaio de atividade inibitória para

tripsina.

4.6.2 - Cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-celulose em sistema

FPLC/AKTA

O pico com atividade antitríptica (CT1Af), detectado na coluna de afinidade Tripsina

–Sepharose, foi dialisado e aplicado em uma coluna de troca iônica DEAE- celulose

equilibrada previamente com tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5. Foi

OH

NH2

O C NH Tripsina Sepharose


40

utilizado um gradiente salino de NaCl de 0-1,0 M, para eluição das proteínas

absorvidas, sendo coletadas frações de 0,5 mL por tubo sob um fluxo de 0,5 mL/min

e absorbância medida a 280 nm .

4.6.3-Determinação da Massa Molecular por Cromatografia de Exclusão Molecular

em Superose 12 10 300 GL em Sistema FPLC-AKTA.

Para confirmação da purificação e determinação da massa molecular de

PmTI, cerca de 0,034 mg de proteína foi submetido a cromatografia de exclusão

molecular Superose 12 10 300 GL, em sistema FPLC/AKTA em tampão Tris-HCl 50

mM, pH 7,5. Esta coluna foi previamente calibrada com os seguintes padrões de

proteínas: Beta-amilase (200 kDa); álcool desidrogenase (150 kDa); anidrase

carbônica (29 kDa) e tripsina (24 kDa). Frações de 0,5 mL foram coletadas sob um

fluxo de 0,5 mL/min e absorbância medida a 280 nm. A massa molecular aparente

do inibidor foi estimada a partir da interpolação logarítmica entre massas

moleculares dos diferentes marcadores protéicos utilizados e os seus respectivos

volumes de eluição.

4.7 Determinação da seqüência de aminoácidos N- terminal da proteína

purificada

O método de degradação automática de Edman foi utilizado para determinar

a seqüência da porção N-terminal do inibidor de PmTI, que foi realizada no

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, ICB, na Universidade Federal do


41

Ceará. O peptídeo de interesse foi submetido à degradação de Edman em

seqüenciador automático da Shimadzu PPSQ23.

4.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

4.8.1 Em condições desnaturante e não redutoras

A eletroforese das amostras foi feita segundo o método desenvolvido por Laemmli

(1970). Foram utilizadas placas de vidro de dimensões 10 x 14 cm, espaçadores de

0,75 mm e solução estoque de acrilamida/bisacrilamida (30%/ 0,8%, p/v) dissolvidas

em água destilada em volume para 100 mL. Esta solução foi filtrada em papel de

filtro Whatman n01 e estocada em frascos escuros a 50C. O gel de separação foi

preparado numa concentração de 20% contendo: 1,2 mL de água destilada, 1,3 mL

de tampão Tris-HCl 1500 mM, pH 8,8, 50 μL de SDS 10 %, 2,5 mL de solução

estoque de acrilamida/bisacrilamida, 25 μL de persulfato de amônio e 2,5 μL de

Temed. O gel de concentração foi preparado com 1,5 mL de água destilada, 0,625

mL de tampão Tris-HCl 1500 mM, pH 6,8, 25 μL de SDS 10%, 0,330 mL de solução

estoque de acrilamida/bisacrilamida, 12,5 μL de persulfato de amônio e 2,5 μL

Temed. A fração protéica contendo 15 μg de proteína, foi adicionada tampão de

amostra constituído de Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8, SDS 2 %, glicerol 10 % v/v, e 0,01

% de azul de bromofenol. O tampão de corrida continha trizma base 25 mM, glicina

192 mM e SDS 10 %. A eletroforese foi realizada sob corrente constante de 30 mA

por aproximadamente 2 horas e após o marcador de corrida (azul de bromofenol)

atingir o final do gel, a corrida foi parada.


42

4.7.2 Em condições desnaturantes e redutoras

Essa eletroforese foi realizada com amostras tratadas com β-mercaptoetanol 100

mM a 100 °C por 10 min. Após esse procedimento as amostras foram submetidas à

migração eletroforética como descrito no item anterior.

4.7.3 Coramento com Comassie Blue

Após a eletroforese o gel foi corado segundo procedimento descrito por Weber e

Osborne (1969). A solução corante foi preparada usando-se Comassie Blue R-250 a

1%, metanol 40%, ácido acético 10% em água destilada. O descoloramento foi feito

com uma solução contendo ácido acético 10 % e etanol 30 %.

4.7.4 Revelação com Nitrato de Prata

Para melhor visualização das bandas protéicas o gel foi submetido a revelação com

nitrato de prata, o qual foi desidratado com uma solução de etanol 50%,

submetendo-se a três lavagens de 20 minutos cada. Em seguida, foi adicionada uma

solução de tiossulfato de sódio (20 mg/100 mL H20) e mantida por 1 minuto sob leve

agitação. Decorrido esse tempo, foram feitas três lavagens rápidas em água

destilada, sendo então adicionada a solução de nitrato de prata (200 mg + 74 μL de

formaldeído em 100 mL de H20) mantendo-se por 20 minutos sob leve agitação.

Após esse tempo, o gel foi submetido a três lavagens rápidas em água destilada e


43

adicionou-se a solução reveladora (carbonato de cálcio 6 g + 50 μL de formaldeído +

2 mL de tiossulfato de sódio em 100 mL de H20). Para cessar a revelação adicionou-

se uma solução de ácido acético 13 % (BLUM; BEIER; GROSS, 1987).

4.8 Caracterização do inibidor purificado

4.8 1 Estabilidade do inibidor em diferentes pHs

Para avaliar a estabilidade do inibidor à variação de pHs, seguiu-se a metodologia

como descrita em Gomes et al., (2005), com pequenas modificações, na qual

alíquotas de 1 mL do inibidor foram dialisadas contra o tampão com o pH desejado

por 16 horas. Estes tampões foram, glicina-HCl pH 2-3; fosfato de sódio pH 6 e 8; e

glicina-NaOH pH 11-12, nos quais a concentração de soluto foi de 100 mM. Após

esse período as alíquotas foram incubadas por 30 min a 37 0C nos referidos

tampões, em seguida as amostras foram dialisadas por cerca de 4 horas em Tris-

HCl 50 mM, pH 7,5, com a finalidade de ajustar ao pH do ensaio. Os ensaios de

atividade inibitória para tripsina foram feitos em triplicata utilizando-se 30μL do

inibidor (6,9 μg). Os ensaios foram realizados em triplicata e provas em branco

foram realizadas conforme descrito no item 4.5.

4.8.2 Estabilidade térmica do inibidor


44

Para determinar a estabilidade térmica dos inibidores seguiu-se a metodologia como

descrita por Gomes et al., (2005), na qual alíquotas de 1 mL do inibidor foram

incubadas por 30 minutos a 37, 40, 60, 70, 90 e 100 0C. Decorrido o tempo de

incubação, as amostras foram resfriadas a 40C e após esse procedimento alíquotas

de 30μL (6,9 μg) dos inibidores foram utilizadas no ensaio de atividade inibitória

sobre a tripsina. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram feitos em

triplicata.

4.8.3 Efeito do DTT na atividade do inibidor

Para avaliar a atividade do PmTI, na presença de agente redutor, seguiu-se a

metodologia descrita por Mello (2005), onde amostras foram incubadas com

soluções de DTT em concentrações finais de 1,10 e 100 mM. A reação foi encerrada

pela adição de iodoacetamida, na quantidade de duas vezes a concentração final de

DTT. Durante a incubação a 37°C, alíquotas foram coletadas em intervalos de tempo

de 15, 30, 60 e 120 minutos. Para todos esses intervalos, um controle da amostra

sem DTT foi feito. Após o período de incubação, essas alíquotas foram submetidas a

ensaios antitrípticos para verificar a atividade do inibidor. Os resultados mostrados

foram obtidos a partir da média de triplicatas.

4.8.4 Especificidade do inibidor para proteinases serínicas e cisteínicas


45

4.8.4.1 Inibição da elastase pancreática

A inibição da atividade da elastase pancreática, foi avaliada usando 30 μL da enzima

(0,1mg/mL em Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) foram incubados com 310 μL de tampão

Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 e 50 μL (11,5 μg ) do inibidor PmTI por 15 min a 37 °C, após

esse tempo foram acrescentados 500μL de azocaseína a 1%. Após 30 min a reação

foi parada pela adição de 150 μL de TCA a 20%. A mistura de reação foi

centrifugada por 10 min a 12000 xg. Alíquotas de 700 μL dos sobrenadantes foram

adicionados a 700 μL de NaOH 2 N, e a absorbância foi medida a 440 nm. Provas

em branco foram realizadas e os ensaios foram feitos em triplicata.

4.8.4.2 Inibição da elastase de neutrófilos

Para determinar a atividade inibitória sobre a elastase de neutrófilos, 50 μL da

enzima (PBS 0,1 M, pH 7,4) foi pré-incubada com 450 μL de tampão PBS 0,1 M pH

7,4 e 50 μL do inibidor PmTI (11,5 μg) por 15 min. A reação foi iniciada após adição

de 2,5 μL de SAAvNA 300 mM. O tempo de reação do ensaio foi de 1 hora, a

temperatura de 37 ºC. A reação foi interrompida com a adição de 250 μL de solução

de ácido cítrico 2,0%. Os produtos da reação foram lidos a 405 nm. Os ensaios

foram feitos em triplicata e provas em branco foram realizadas.

4.8.4.3 Inibição da quimotripsina


46

Para verificar a atividade inibitória sobre a atividade da quimotripsina, 30 μL da

enzima (0,1mg/mL de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) foram incubados com 320 μL de

tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 e 50 μL do inibidor PmTI (11,5 μg) por 15 min a 37

°C, após esse tempo foram acrescentados 500 μl de azocaseína a 1%. Decorridos

30 min de incubação a 37 °C a reação foi parada pela adição de 150 μL de TCA a 20

%. A mistura de reação foi centrifugada por 10 min a 12000 x g. Alíquotas de 700 μL

dos sobrenadantes foram adicionados a 700 μL de NaOH 2N, e a absorbância foi

medida a 440 nm. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram feitos em

triplicata.

4.8.4.3 Inibição da bromelaína

Para determinação da atividade inibitória para a bromelaína, 10 μL de solução de

bromaleína (1mg/mL de tampão acetato de sódio 300 mM, pH 5,5) foi pré-incubada

com 330 μL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, e 50 μL do inibidor PmTI (11,5 μg)

por um período de 20 min a 45 0C. Após esse tempo foram acrescentados 500 μL de

azocaseína a 1%. Decorridos 30 min de incubação a reação foi parada pela adição

de 150 μL de TCA a 20%. A mistura de reação foi centrifugada por 10 min a 12000 x

g. Alíquotas de 700 μL dos sobrenadantes foram adicionados a 700 μL de NaOH 2

N, e a absorbância foi medida a 440 nm. Provas em branco foram realizadas e os

ensaios foram feitos em triplicata.

4.8.4.4 Inibição da papaína


47

Para determinação da atividade anti-papainásica, 10 μL de solução de papaína

(1mg/mL Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) foi pré-incubada com 40 μl de solução ativadora

contendo L-cisteína 50 mM e EDTA 20 mM pH 8,0, 400 μL tampão Tris-HCl 50 mM,

pH 7,5 e 50 μL do inibidor (11,5 μg) por um período de 15 minutos a 37 0C. Após

este período foi acrescentado 200 μL de solução de azocaseína 1%. Passados mais

30 minutos a reação foi paralisada com 300 μL de TCA 20%. A mistura de reação foi

centrifugada por 10 min a 12000 x g. Alíquotas de 700 μL dos sobrenadantes foram

adicionados a 700 μL de NaOH 2 N, e a absorbância foi medida a 440 nm. Provas

em branco foram realizadas e os ensaios foram feitos em triplicata.

4.9 Determinação do mecanismo e da constante de inibição

Para a determinação do mecanismo de inibição os ensaios foram realizados como

descrito em 4.5. Para o controle positivo, alíquotas de 10 μL de solução de tripsina

(0,3 mg/mL tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 foram incubadas por 15 minutos a 370 C

com concentrações crescentes de BApNA (0,5; 0,66; 0,8; 1; 1,25; 1,5 e 2,0 mM) em

volumes de 250 μL livres de inibidor. Para análise da cinética de PmTI, alíquotas de

20, 40, 60 e 80 μL de PmTI, foram incubadas com 10 μL de solução de tripsina e

250 μL das referidas solução de BApNA com leitura de absorbância a 410 nm.

O valor de Ki foi determinado de acordo com Dixon et al., 1979. O ensaio enzimático

com tripsina para a determinação da constante de inibição (Ki) foi realizado na

presença de concentrações crescentes de PmTI (0,209; 0,418 e 0,836 ug) e duas

diferentes concentrações de BApNA (0,5 mM e 1 mM) e o valor de Ki foi obtido da

intercessão de duas linhas correspondentes as concentrações do substrato.


48

4.10 Preparo das enzimas digestórias de insetos

Larvas de C. maculatus, Z. subfaciatus e A. grandis foram coletadas entre 17 e 20

dias de vida pós-postura (3° ínstar), larvas de P. interpunctella do 5o ínstar, e larvas

de C. capitata de 5 dias de idade foram mergulhadas em solução de NaCl a 150 mM

e dissecadas com auxílio de pinças anti-magnéticas número 4 e lupa estereoscópica

para retirada de todos os tecidos estranhos as paredes intestinais. Cerca de 25

intestinos médios de P. interpunctella assim obtidos foram imediatamente colocados

em tubos para microcentrífuga contendo 100 μL de tampão Tris-HCl, 50 mM, pH 9,5.

Cerca de 90 intestinos de C. maculatus, e 50 de Z. subfasciatus e A. grandis,

respectivamente, foram colocados em tampão Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5 e 5 intestinos

de C. licus foram colocados em tampão Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5, e 80 intestinos de

C. capitata foram colocados em tampão Tris-HCl, 50 mM, pH 8,5, e estocados a -20

°C. Os homogenatos intestinais das larvas foram preparados seguindo a

metodologia estabelecida por Terra, Ferreira e Bianchi (1977). Os intestinos das

larvas dos insetos foram homogeneizados com auxílio de um “potter” em banho de

gelo por aproximadamente 10 minutos, usando-se como extrator 1 mL dos tampões

descritos a cima. Em seguida, os homogenatos foram centrifugados a 12.000 x g por

10 min a 4 °C e os sobrenadantes obtidos foram imediatamente utilizados para

ensaios de atividade enzimática e inibitória como descrito a seguir.

4.10.1 Ensaio de inibição contra enzimas dos extratos intestinais de larvas de

insetos (in vitro).

4.10.1.1 Ensaio para enzimas digestórias de C. maculatus, A. grandis e Z.

subfaciatus


49

Nos ensaios in vitro, alíquotas de 100 μL de extrato intestinal de Z. subfaciatus, 50

μL de A. grandis e 20 μL de C. maculatus foram incubados com 150, 200 e 230 μL

de tampão Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5, respectivamente, e 10 μL (0,418 μg) do inibidor

PmTI por 10 min a 37 °C. Após este período de incubação, foram adicionados 250

μL de BapNA e a incubação procedeu-se por mais 15 minutos na mesma

temperatura. Decorrido este tempo, a reação foi parada pela adição de 60 μL de

ácido acético 30 %, e a absorbância foi medida a 410 nm. Todos os ensaios foram

realizados em triplicata e com provas em branco.

4.10.1.2 Ensaio para enzimas digestórias de C. capitata, C.licus, e P. interpunctela

(in vitro).

Para determinar a atividade inibitória in vitro para o extrato intestinal de C. capitata,

C. licus e P. interpunctela, alíquotas de 50, 10 e 5 μL dos extratos intestinais,

respectivamente, foram pré-incubados com 320, 370 e 375 μL de tampão Tris-HCl,

50 mM, pH 8,5, 7,5 e 9,5, respectivamente, e 10 μL (0,418 μg) do inibidor isolado por

10 min a 37 °C. Após este período de incubação, foram adicionados 250 μL de

BapNA e a incubação procedeu-se por mais 15 minutos na mesma temperatura.

Decorrido esse tempo, a reação foi parada pela adição de 60 μL de ácido acético 30

%, e a absorbância foi medida a 410 nm. Todos os ensaios foram realizados em

triplicata e com provas em branco.

4.11 Bioensaio para C. capitata


50

As larvas de C. capitata foram submetidas a ensaio in vivo para avaliação do

efeito da ingestão de PmTI no crescimento e desenvolvimento do inseto (MACEDO

et al., 2008). Para tal, dietas artificiais foram preparadas contendo concentrações

crescentes de PmTI: 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 e 1,0 %, e dieta controle sem inibidor. Foram

usadas larvas de 1° dia de vida pós-eclosão acondicionadas em tubos de ensaio

contendo 500 mg de dieta, 8 larvas/tubo, sendo 3 tubos por tratamento. Os tubos

foram então fechados com filme plástico e incubados por 5 dias sobre condições

controladas (28°C e 90% U.R). No 5° dia, as larvas foram retiradas das dietas,

lavadas e pesadas individualmente em balança de precisão. Foram calculadas as

médias das massas e da sobrevivência e os desvios padrões para cada tratamento.

• Dieta artificial para C. capitata:

Para o preparo de 500 g da dieta, segundo Walder, (2002), foi adicionando gérmen

de trigo (15 g), farinha de trigo (32,5 g), açúcar cristal (60 g), extrato de levedura

(49,5 g), benzoato de sódio (1,5 g), HCl (4,5 g), H2O (285 g) e farinha de bagaço da

cana-de-açúcar (52 g). O material foi misturado até a formação de uma pasta

homogênea. Para os bioensaios com larvas de C. capitata diferentes quantidades do

inibidor liofilizado foram adicionadas e os valores subtraídos da massa de água.

Materiais e Métodos 51

Figura 8: Esquema da metodologia empregada no trabalho

EXTRATO BRUTO

Precipitação com TCA (1%, 2%, 3%, e 4%).

CT1% CT2% CT3% CT4%

Cromatografia Tripsina-Sepharose

Cromatografia DEAE-celulose

Cromatografia Superose 12

Tampão Bórax 50 mM, pH 7, 5, 1:10, agitação 3h Centrifugação: 12.000 x g por 30 min a 4°C

Farinha de sementes de Piptadenia moniliformis

Especificidade

Enzimas serínicas e cisteínicas

Atividade in vitro paraenzimas digestorias de

insetos

Bioensaio

Larvas

SDS – PAGE

Determinação da massa molecular

Caracterização bioquimica

Determinação do mecanismo e da

constante de inibição

pH, temperatura e DTT

WD50

LD50

Resultados 52

5 RESULTADOS

5.1 - Isolamento e purificação

5.1.1 - Detecção da atividade inibitória para tripsina em extratos protéicos de

Catanduva

A figura 9 apresenta as atividades inibitórias sobre a tripsina presente no extrato

bruto (EB) e nas frações protéicas de sementes de Catanduva obtidas após

tratamento do EB com ácido tricloroacético (TCA 20 %) em concentrações finais de

1, 2, 3 e 4%, denominadas de CT1%, CT2%, CT3% e CT4%. O EB inibiu em torno

de 70% a atividade tríptica enquanto que as frações inibiram em 71,0, 42,5, 10,7 e

13,6%, respectivamente. A fração CT1% apresentando maior atividade anti-tríptica

foi usada nos passos subseqüentes de purificação.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 4 5

% In

ibiç

ão

Figura 9: Atividade anti-tríptica de frações protéicas de sementes de Catanduva: No ensaio para

determinar a atividade inibitória das frações protéicas sobre a atividade da tripsina foi utilizado 50

μL de cada fração, tendo BApNA 1,25 mM como substrato.

CT1% CT2%EB CT4%

Resultados 53

5.1.2 - Análise de CT1% em cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose

A fração protéica de sementes de Catanduva denominada de CT1% proveniente do

fracionamento do extrato bruto de sementes com TCA, apresentando cerca de 71%

de inibição para a tripsina, foi submetida à cromatografia de afinidade em Tripsina-

Sepharose. As frações não adsorvidas na matriz foram eluídas com tampão

tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5, e as frações protéicas adsorvidas foram eluídas

com HCl 5 mM em fluxo constante de 2 mL/min, e a densidade óptica foi monitorada

a 280 nm. As frações protéicas foram dialisadas contra tampão tetraborato de sódio

50 mM, pH 7,5 e submetidas a ensaio para determinação da atividade inibitória

sobre a atividade catalítica da tripsina, no qual foi detectado aproximadamente 100

% de inibição nas frações adsorvidas que foram reunidas e denominadas CT1Af

(Figura 10).

Figura 10: Perfil de eluição de CT1% (0,52 μg/mL de proteína) em Tripsina-Sepharose: A coluna

foi previamente equilibrada com tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5. As frações

protéicas foram eluídas em fluxo constante de 2 mL/min., a densidade óptica medida a (�) 280

nm e (ο) atividade anti-tríptica foi avaliada usando 50 μL de cada fração, tendo BApNA 1,25 mM

como substrato.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

1 11 21 31 41 51

Frações

D.O

280

nm

0

20

40

60

80

100

120%

In

ibiç

ão

HCl 5 mM

(mL)

Resultados 54

5.1.3 - Isolamento do inibidor em cromatografia DEAE-celulose/AKTA

A fração (CT1Af) com atividade inibitória foi dialisada contra tampão tetraborato de

sódio 50 mM, pH 7,5 e submetida a cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-

celulose em sistema de purificação FPLC/AKTA. A Figura 11 ilustra o perfil

cromatográfico de CT1Af em DEAE-celulose que apresentou um pico protéico

predominante com atividade inibitória sobre a atividade catalítica da tripsina o qual

foi eluído com gradiente salino, em torno de 0,7 M de NaCl, o qual foi dialisado para

dar seqüência aos passos de purificação.

Figura 11: Perfil cromatográfico de PmTI em coluna DEAE-celulose em sistema FPLC/AKTA. A

coluna foi previamente equilibrada com tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5. As frações

protéicas foram eluídas em fluxo constante de 0,5 mL/min e a densidade óptica medida a 280 nm. A

atividade anti-tríptica foi avaliada usando 50 μL de cada fração, tendo como substrato BApNA 1,25

mM. ( ) frações com atividade inibitória.

Frações

M

Resultados 55

5.1.4 - Análise cromatográfica de Catanduva em SUPEROSE-12 AKTA

Para confirmar o grau de purificação e determinar a massa molecular do

inibidor de tripsina de sementes de Catanduva, a fração protéica obtida em coluna

DEAE-Celulose em sistema FPLC/AKTA, apresentando atividade inibitória sobre a

atividade catalítica da tripsina foi submetida à cromatografia de exclusão molecular

Superose 12 10 300 GL em sistema FPLC/AKTA. O perfil cromatográfico (Figura 12)

confirmou a purificação do inibidor de tripsina de sementes de Catanduva, P.

moniliformis que foi denominado de PmTI.

Figura 12: Perfil cromatográfico de PmTI purificada na coluna Superose 12 FPLC – AKTA. A

coluna foi previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. As frações protéicas

foram eluídas em fluxo constante de 0,5 mL/min, a densidade óptica medida a 280 nm e atividade

anti-tríptica foi avaliada usando 50 μL de cada fração, tendo como substrato BApNA 1,25 mM. ( )

as frações com atividade inibitória.

Frações (mL)

Resultados 56

5.1.5 - Análise das etapas de purificação

As etapas utilizadas no processo de purificação do inibidor de sementes de

Catanduva estão sumarizadas na Tabela 2. O extrato bruto (EB), obtido na primeira

etapa do processo de purificação foi utilizado como parâmetro para as demais

frações protéicas. O valor de purificação 1 e um rendimento de 100% foram

atribuídos a essa fração. O grau de purificação das demais frações foi calculado

como sendo a razão entre sua atividade específica e a do extrato bruto. A

percentagem de rendimento das demais frações foi calculada com base na razão

entre a sua atividade inibitória e a atividade inibitória do extrato bruto multiplicado

por 100. A atividade especifica (UI) foi calculada com base na razão entre a

atividade inibitória da fração obtida e proteína total da mesma fração. A tabela de

purificação mostra que PmTI foi purificado 21,3 vezes em Superose-12/AKTA com

recuperação de 0,02%.

Tabela 2 - Tabela de purificação

Uma unidade de inibidor foi definida como a quantidade de inibidor que diminui a atividade da enzima

em 0,01 da absorbância a 410 nm.

Etapas Proteína Total (mg)

UI Total

Atividade Específica (UI/mgP)

Purificação (X)

Rendimento(%)

EB 207,0 16284 78,7 1,0 100 CT1% 146,9 21775 148,2 1,9 71 CT1Af 2,24 473,2 211,3 2,7 1,1

DEAE-Celulose

0,6 169,0 281,7 3,6 0,3

PmTI 0,034 57,0 1676,5 21,3 0,02

Resultados 57

5.1.5.1 - Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE)

A análise por eletroforese da fração protéica obtida da Superose 12/AKTA em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) na ausência de agente redutor revelou a presença de

uma única banda protéica com massa molecular aparente de 25 kDa (Figura 13). A

análise de PmTI em SDS-PAGE tratado com agente redutor (β - mercaptoetanol)

revelou a presença de uma única banda protéica sugerindo que o inibidor é

composto por uma única cadeia polipeptídica de 25 kDa.

Figura 13: Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE 20%)

M – Padrão de massa molecular: Álcool desidrogenase (150 kDa), galactosidase (116

kDa), albumina sérica bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), lactato desidrogenase (35

kDa), endonuclease de restrição (25 kDa), lactoalbumina (18,4 kDa); PmTI, fração

protéica com atividade inibitória (15 μg); PmTI, tratada com β- mercaptoetanol. A seta

indica a banda de PmTI com massa molecular de aproximadamente 25 kDa.

PmTI PmTI + β

kDa

Resultados 58

5.2 - Caracterização bioquímica dos inibidores de sementes de Catanduva

5.2.1 - Determinação da massa molecular relativa em cromatografia de exclusão

molecular Superose 12 10 300GL em sistema FPLC-AKTA

Através da curva de calibração com proteínas de massas moleculares

conhecidas, foi possível determinar a massa molecular relativa de PmTI. Apos

determinação dos volumes de eluição das proteínas marcadoras e do inibidor PmTI

foi construída uma curva em escala semi-log (Figura 14), e calculada a massa

molecular de PMTI. A determinação da massa relativa foi realizada através do

gráfico de log Mr x Ve/Vo. Assim encontramos uma massa molecular para PmTI de

25 kDa confirmando o observado em SDS-PAGE.

3

4

5

6

1 1,5 2

Ve/Vo

Lo

g (P

eso

Mo

lecu

lar)

Figura 14: Determinação da massa molecular de PmTI por cromatografia Superose-12 em

sistema FPLC-AKTA. Curva de calibração dos pesos moleculares: 1, Beta-amilase (200 kDa);

2, Álcool desidrogenase (150 kDa); 3, Anidrase carbônica (29 kDa); 4, PmTI (25 kDa) e 5,

Tripsina (24 kDa). Ve/Vo - relação entre o volume de eluição da proteína e o volume total da

coluna.

12

3 4 5

Resultados 59

5.3 – Alinhamento e análise da seqüência N-terminal

A Figura 15 mostra o alinhamento comparativo de PmTI com outros inibidores de

tripsina da família Kunitz de sementes de leguminosas da subfamília Mimosoideae.

A seqüência N-terminal de PmTI mostrou forte identidade com inibidor de tripsina de

sementes de Acacia confusa (AcTKI), Enterelobium contortisiliquum (EcTKI),

Prosopis juliflora (PjTKI), Adenanthera pavonina (ApTKI) e Leucena leucocephala

(LlTKI). De acordo com a Figura 15, foi observada a presença de resíduos de

aminoácidos fortemente conservados em todas as seqüências analisadas, como:

glicina (G8, G14, G27, G28, e G29), asparagina (N13), tirosina (Y17 e Y18), leucina

(L3 ,L11 e L30), Isoleucina (I19) e ácido aspártico (D5 e D7).

Os resultados obtidos a partir do alinhamento de PmTI com inibidores de

tripsina de sementes de leguminosas da família Kunitz confirmam que o inibidor de

tripsina purificado de sementes de Catanduva é um novo membro de inibidor de

tripsina da família Kunitz.

10 20 30 % identidade

AcTKI_m KELLDADGDILRNGGAYYILPALRGKGGGL 86,67%EcTKI_m KELLDSDGDILRNGGTYYILPALRGKGGGL 86,67%PmTKI_m KELLDADGDLLRNGGTYYILPVFRGKGGGLPjTKI_m QELLDVDGEILRNGGSYYILPAFRGKGGGL 80% ApTKI_m RELLDVDGNFLRNGGSYYIVPAFRGKGGGL 76,67%LlTKI_m QVLVDLDGDPLYNGMSYYILPVARGKGGGL 70% : *:* **: * ** :***:*. *******

Figura 15: Seqüência parcial e alinhamento comparativo de PmTI com outros inibidores de tripsina da

família Kunitz de sementes de leguminosas: A. confusa (AcTKI, gi: 166234,NCBI), E. contortisiliquum

(EcTKI, Batista el al., 1996), P. juliflora (PjTKI, gi: 243386, NCBI), A. pavonina (ApTKI, gi: 225058,

NCBI), L. leucocephala (LiTKI, gi, 18202442,NCBI). Os resíduos de aminoácidos em vermelho são

idênticos e conservados, em verde, forte similaridade, e em azul, indicam fraca similaridade.

Resultados 60

5.4 - Estabilidade em diferentes pHs

A estabilidade de PmTI em diferentes pHs foi testada incubando-se o inibidor em

tampões com pHs variando de 2 a 12. Após ensaio verificou-se que a atividade de

PmTI (Figura 16) permaneceu inalterada quando testado na faixa de pH entre 2-12

por 30 minutos a 37 0C.

Figura 16: Estabilidade de PmTI em diferentes pHs. O inibidor purificado foi pré-incubado por

30 min a 37°C em diferentes intervalos de pH. A atividade inibitória de PmTI sobre a tripsina foi

determinada usando BApNA como substrato (11,5 μg de proteína).

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

pH

% I

nib

ição

Resultados 61

5.5 - Estabilidade térmica

O inibidor purificado de sementes de Catanduva também foi avaliado quanto a sua

resistência em diferentes temperaturas (37 a 100 °C). Na Figura 17 observa-se que

PmTI manteve sua atividade máxima de inibição sobre a atividade catalítica da

tripsina quando testado em temperaturas de 37, 40 e 60 °C, 10% dessa atividade foi

perdida em temperatura 70 °C. A pré-incubação desse inibidor em temperaturas de

90 e 100 °C por 30 minutos reduziu sua capacidade inibitória em 20%.

0

20

40

60

80

100

120

30 40 50 60 70 80 90 100 110

Temperatura (°C)

% I

nib

ição

Figura 17: Estabilidade térmica de PmTI. O inibidor purificado foi pré-incubado por 30 min

em diferentes temperaturas. A atividade inibitória de PmTI sobre a tripsina foi determinada

usando BApNA como substrato (11,5 μg de proteína).

Resultados 62

5.6 - Efeito do DTT na atividade do inibidor

PmTI foi incubadas com DTT, nas concentrações finais de 1, 10 e 100 mM,

em intervalos de tempo de 15, 30, 60 e 120 minutos para determinar sua

estabilidade funcional. A Figura 18 mostra os resultados obtidos após ensaio

enzimático. PmTI mostrou-se estável nas concentrações de 1 e 10 mM. Observou-se

pouca redução quando o mesmo se encontrava na concentração de 100 mM, após

duas horas de incubação com o agente desnaturante foi observada perda de 20 %

de sua atividade inibitória.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

1 2 3 4

Tempo (minutos)

% d

e A

tivi

dad

e R

esid

ual

Controle 1 mM 10 mM 100 mM

Figura 18: Efeito de desnaturante DTT na atividade de PmTI (11,5 μg de proteína). A atividade

foi determinada como descrito 4.5 em diferentes concentrações finais de DTT e por intervalo de

tempos específicos.

1 3 6 120

Resultados 63

5.7– Mecanismo de inibição e valor de Ki

PmTI purificado de sementes de Catanduva foi avaliado quanto ao seu mecanismo

de inibição sobre a atividade catalítica da tripsina e o valor de Ki foi determinado.

5.7.1– Mecanismo de inibição sobre a tripsina

Após a realização de ensaios utilizando concentrações variáveis de inibidor e

substrato (BApNA) foi construído um gráfico duplo recíproco de Lineweaver-Burk,

para determinação do tipo de mecanismo de inibição de PmTI para Tripsina. A

Figura 19 mostra que PmTI suprimiu a atividade catalítica da tripsina de modo

competitivo, caracterizado pela variação do valor de Km (constante de Michaelis-

Menten) e inalteração da velocidade máxima de reação.

A Figura 20, mostra a inibição da tripsina em pH 7,5 por PmTI (concentrações

crescentes) sobre a hidrolise de BApNA como substrato nas concentrações de 0,5 e 1

mM. A análise do gráfico de Dixon et al., 1979 confirmou que PmTI inibiu a tripsina de

modo competitivo similar ao observado no gráfico duplo recíproco de Lineweaver-Burk

e a constante de inibição (Ki) calculada foi de 1,5 x 10-11 mM ou 0,416 μg para PmTI.

Resultados 64

Figura 19: Mecanismo de inibição de PmTI sobre a atividade catalítica da tripsina. A atividade

inibitória de PmTI foi determinada usando várias concentrações de BApNA (0,5; 0,66; 0,8; 1;

1,25; 1,5 e 2,0 mM), e ilustrados através do gráfico do duplo recíproco de LIneweaver-Burk. �,

controle positivo, �, 0,209 ug; �, 0,418 ug; �, 0,836 ug de PmTI.

Resultados 65

0

2

4

6

8

10

12

14

-10 -5 0 5 10 15

PmTI (ug)

1/v

(DO

410/

h/m

L) -1

BApNA [1 mM] BApNA [0,5 mM]

Figura 20: Determinação do valor de Ki de PmTI contra tripsina. A constante de inibição

(Ki) de PmTI sobre a tripsina foi obtido pelo método de Dixon et al., 1979. O valor de Ki foi

obtido dos interceptos de duas retas das duas concentrações de substrato utilizada.

Resultados 66

5.8 - Especificidade para proteinases serínicas e cisteínicas

Para determinar a especificidade de inibição do PmTI foram realizados ensaios

utilizando-se proteinases serínicas e cisteínicas. Como se pode observar na Tabela

3, com relação a proteinases serínicas, PmTI foi potente na inibição da atividade

catalítica da tripsina suprimindo esta atividade em torno de 99,76 % também foi

observada inibições para elastase de neutrófilos, quimotripsina e elastase

pancreática em 76,42, 42,96 e 20,77 %, respectivamente. E com relação às

proteinases cisteínicas foi observada uma inibição de 23,10 % para papaína e de

5,28 % para bromelaína.

Tabela – 3: Especificidade de inibição de PmTI para enzimas do tipo serínicas e cisteínicas.

Enzimas Atividade

enzimática Atividade residual

da enzima Percentual de

inibição

Tripsinaa 28,13 ± 1,75 0,06 ± 0,12 99,76 %

Elastase dec

neutrófilos 31,96 ± 6,31 7,20 ± 2,12 76,42 %

Elastase pancreática b

17,0 ± 1,76 13,4 ± 0.65 3,17%

Quimotripsinab 17,33 ± 0,77 9,86 ± 0,57 42,96 %

Papaínab 36,90 ± 5,2 28,13 ± 2,28 23,10 %

Bromelaínab 27,33 ± 1,95 25,53 ± 0,51 NDd

a Atividade inibitória usando BApNA como substrato. b Atividade inibitória usando azocaseína

como substrato. c Atividade inibitória usando SAAvNA como substrato. d não detectado

Resultados 67

5.9 - Especificidade do inibidor para enzimas digestórias de insetos

A atividade in vitro de PmTI (inibidor purificado de sementes de Catanduva) para

enzimas digestórias de diversos insetos-praga foi testada (Tabela 4). PmTI inibiu de

forma seletiva a atividade das enzimas digestórias de Coleópteras como

Anthonomus grandis em 89,93 %, Zabrotes subfasciatus em 5,96 % e

Callosobruchus maculatus em 9,41 % de inibição, quando testadas as enzimas dos

Lepidópteras como Plodia interpunctella houve inibição de 59,94 % e para Castnia

licus de 23,67 % e para Ceratitis capitata (Diptera) houve 70,52 % de inibição.

A partir deste resultado larvas de C. capitata foram escolhidas para serem

submetidas a ensaio in vivo com dieta preparada com PmTI.

Tabela 4 - Especificidade de inibição de PmTI para enzimas de diferentes insetos.

Os ensaios inibitórios sobre a atividade catalítica das enzimas digestórias de insetos praga foram

realizadas em triplicata usando azocaseína como substrato e os valores na tabela correspondem à

media do percentual de inibição e seus respectivos desvios padrões.

Insetos Atividade

enzimática Atividade residual

da enzima Percentual de

inibição

A. grandis 15,90 ± 1,01 1,60 ± 0,81 89,93%

Z.subfasciatus 12,33 ± 0,98 11,56 ± 0,40 5,96%

C. maculatus 22,96 ± 0,28 20,83 ± 0,64 9,41%

P. interpunctela 32,73 ± 1,86 13,1 ± 0,86 59,94%

C. licus 29,86 ± 1,25 22,7 ± 0,57 23,67%

C. capitata 38,96 ± 0,28 11,50 ± 0,17 70,52%

Resultados 68

5.10- Bioensaio para C. capitata

Para o bioensaio concentrações crescentes de PmTI (liofilizado) foram utilizados e

dois parâmetros foram avaliados, a quantidade de PmTI que reduzia a massa das

larvas em 50% (WD50) e a quantidade que reduzia a população das larvas em 50%

(LD50).

Em relação à massa das larvas de quarto ínstar foram observadas alterações

significativas, quando as larvas foram alimentadas com PmTI na concentração de

1% não foi observado ganho de massa. Enquanto que a massa média das larvas

alimentadas em dieta controle foi de 10 mg as larvas alimentadas em dietas

contendo PmTI em diferentes concentrações variou de 8,0 mg a 3 mg,

aproximadamente (Figura 21).

A sobrevivência das larvas de quarto ínstar de C. capitata alimentadas com dietas

artificiais contendo concentrações crescentes de PmTI (0,05 a 1%) apresentou um

decréscimo linear na taxa de sobrevivência quando comparada com as larvas do

grupo controle, quando submetidas a dieta contendo 1 % de PmTI foi observada

aproximadamente 90% de mortalidade larval (Figura 22).

A massa das larvas foi afetada com uma WD50 de 0,30% e sua sobrevivência com

uma LD50 de 0,33%.

Resultados 69

Figura 21: Peso médio das larvas de 4º ínstar de C. capitata alimentadas com dieta controle sem inibidor e dietas artificiais contendo PmTI em concentrações crescentes de 0,05 % a 1 %. Cada valor representa à média ± SD.

y = -2.5218x + 12.925R2 = 0.9979

0

2

4

6

8

10

12

Controle 0, 05% 0, 20% 0, 50% 1%

Concentração

Mas

sa L

arva

l (m

g)

Resultados 70

Figura 22: Sobrevivência das larvas de 4º ínstar de C. capitata alimentadas com dieta controle

sem inibidor e dietas artificiais contendo PmTI em concentrações crescentes de 0,05 % a 1 %.

Cada valor representa à média ± SD.

y = 18.889x - 12.222

R2 = 0.9633

0

20

40

60

80

100

Contole (mg) 0, 05% 0, 20% 0, 50% 1%Concentração

Controle

% M

ort

alid

ade

_________________________________________________________________ Discussão

71

6 DISCUSSÃO

Em plantas, os inibidores de proteinases atuam como proteínas de reserva

(MOSOLOV, 1995; VALUEVA; MOSOLOV, 1999) ou podem estar envolvidos no

mecanismo de defesa vegetal contra pragas e doenças causadas por patógenos

(RYAN, 1990; Macêdo et al., 2003; Haq et al., 2004; Tamhane et al., 2005;

Dunaevsky et al., 2005). Os inibidores podem ser também utilizados como

ferramentas alternativas no tratamento de patologias humanas tais como

hemorragias, inflamação e câncer (Oliva et al., 2000, CHEN; SHAW, 2003; Fook et

al., 2005; Mello et al., 2006).

Considerando o conhecimento de que as plantas utilizam substâncias

químicas como proteínas para se defender da agressão por herbívoros e

fitopatógenos, muitas pesquisas estão sendo realizadas com o intuito de verificar a

eficácia de proteínas de defesa de plantas e trazer assim contribuições futuras para

a agricultura (Jouanin et al., 1998).

A ação bioinseticida de um inibidor de Piptadenia moniliformis foi avaliada

para viabilizar um potencial emprego na aplicação desta molécula como ferramenta

biotecnológica.

Muitos inibidores presentes nas sementes das mais variadas espécies de

plantas são purificados e isolados com a utilização de técnicas cromatográficas.

Assim cromatografias em colunas de troca iônica e de exclusão molecular são

amplamente utilizados como passos obrigatórios durante o processo de purificação

de inibidores (RICHARDSON, 1991). A fração CT1% da Catanduva foi fracionada

numa coluna de afinidade Tripsina-Sepharose, cujo perfil cromatográfico está

ilustrado na Figura 10. O "pool" obtido, detectado através de ensaio anti-tríptico, foi

denominado de CT1Af e apresentou um rendimento de 1,1% (Tabela 2), os passos

_________________________________________________________________ Discussão

72

seguintes foram a cromatografia DEAE - celulose e após submetido a Superose 12

mostrando um rendimento final de 0,02%, resultado esse inferior aos encontrados

por outros autores (Mello et al., 2001; Gomes et al., 2005; Bhattacharyya et al.,

2006; Macedo et al., 2007; BHATTACHARYYA, LEIGHTON, BABU; 2007).

A eletroforese em gel de poliacrilamida (20%), na presença de SDS, permitiu

verificar que o PmTI, (Figuras 13 e 14), apresentou uma massa molecular de

aproximadamente, 25 kDa, uma única cadeia polipeptídica e exibiu potente

capacidade inibitória sobre a atividade catalítica da tripsina, sugerindo ser um

inibidor da família Kunitz como relatado na literatura por Richardson, 1991; e

Oliveira, 2001. Um inibidor de tripsina da família Kunitz encontrado em

Dimorphandra mollis apresentou massa molecular similar com 23 kDa (Macedo et

al., 2002), que semelhante ao PmTI é composto de apenas uma cadeia

polipeptídica, em contrapartida, um inibidor encontrado em Crotalaria pallida

(GOMES, 2004) apresentou massa molecular de 32,5 kDa, sendo este composto por

duas subunidades,uma de 27,7 kDa e uma menor de 5,6 kDa. No entanto, nenhum

inibidor da família Kunitz, até o momento, foi relatado ter uma massa molecular de

25 kDa.

O sequenciamento da estrutura N-terminal de PmTI indicou um alto grau de

homologia com inibidores da família Kunitz, conforme é mostrado na figura 15. Na

seqüência de PmTI foi observado a presença do resíduo de asparagina (N13), que é

conservado em vários inibidores de tripsina da família Kunitz relatados na literatura

(Batista et al., 1996, Macêdo et al., 2003, Iwanaga et al., 2005, Bhattacharyya et al.,

2006), resíduo este que está envolvido na interação entre tripsina- inibidor (Iwanaga

et al., 2005).

_________________________________________________________________ Discussão

73

Estudos para avaliar a estabilidade do inibidor foram realizados com o

objetivo de verificar os efeitos causados por diferentes condições de pH,

temperatura e concentrações do agente desnaturante (DTT).

As variações de pH alteram o estado iônico das cadeias laterais de

aminoácidos, alterando, portanto, a distribuição de cargas e a necessidade da

existência de pontes de hidrogênio, que contribuem para a estabilidade das

proteínas. A atividade inibitória de PmTI não sofreu variação considerável quando

submetida à diferentes condições de pH (2- 12); revelando que o inibidor é

notavelmente estável a uma ampla faixa de pH, inclusive nas condições extremas

(Figura 16). A estabilidade dos inibidores da família Kunitz a diferentes condições de

pH já é fato registrado na literatura (RICHARDSON, 1991). Nossos resultados foram

similares ao observado para outros inibidores da família Kunitz (GRUEN; TAO;

KORTT, 1984; Mello et al., 2002; HAQ; KLAN, 2003; Bhattacharyya et al., 2006), no

entanto, outros inibidores mostraram maior estabilidade à variação de pH, como

observado para o inibidor de tripsina purificado de tubérculo de C. esculenta que

manteve sua atividade inibitória máxima sobre a atividade catalítica da tripsina em

pH ácido (1-4) e básico (12-13) após pré-incubação por aproximadamente 17 horas

(OLIVEIRA, 2001).

Resultados de termoestabilidade de PmTI (Figura 17) mostraram que este

inibidor não apresentou diminuição considerável de sua atividade inibitória até 60°C,

por 30 minutos. Assim, PmTI é uma proteína relativamente termoestável apesar de

ser da família de Kunitz e possivelmente apresentar poucas pontes dissulfeto. Este

resultado é compatível com alguns inibidores da família Kunitz, como foi relatado por

Souza et al., 1995, Osman, et al., 2002 e Oliveira et al., 2007, no entanto, Garcia et

al., 2004, caracterizaram um inibidor presente em sementes de Poecilanthe

_________________________________________________________________ Discussão

74

parviflora, o PPTI, com uma estabilidade térmica superior quando submetido à pré-

incubação do inibidor a temperatura de 100 ºC por 30 minutos.

A ação de um agente redutor, como o DTT, sobre as pontes dissulfeto

presentes nos inibidores de proteinases pode causar danos a sua integridade, e

provavelmente, afetar a atividade antitríptica dos mesmos, dependendo da

localização destas pontes em relação aos seus sítios reativos (Macedo, et al., 2007).

Assim, foi realizado um estudo para verificar a ação do DTT sobre a atividade

inibitória de PmTI. Observamos que o DTT a 100 mM provocou uma redução de 20

% da capacidade inibitória de PmTI (Figura 18). Lehle et al., 1996, também

relataram que ETI, um inibidor de tripsina da família Kunitz presente em sementes

de Erythrina caffra, conservou sua atividade inibitória após redução com DTT.

Macedo et al., 2003, observaram que quando o inibidor PDTI foi incubado, por 120

minutos, com 10 mM de DTT, a atividade inibitória sofreu um decréscimo de 60% e

quando incubado com 100 mM do agente redutor, o mesmo perdeu 90% de sua

atividade. Fato semelhante foi demonstrado por Garcia et al., 2004, cujo inibidor

PPTI perdeu 85% de sua atividade quando incubado com a mesma concentração de

DTT por 120 minutos. Aparentemente, a estabilidade do inibidor de P. moniliformis

não está relacionada à presença de pontes dissulfeto. Os resultados mostrados na

Figura 18 sugere que a estabilidade da atividade inibitória de PmTI pode estar

relacionada com a presença de pontes dissulfetos intra-cadeias ou que as pontes

afetadas pela redução estariam relativamente distantes do sítio reativo e que

somente uma redução e alquilação das mesmas ocasionaria a perda total da

atividade inibitória.

A cinética de PmTI é do tipo competitiva (Figura 19) corroborando com outros

inibidores de tripsina da família Kunitz (LAKOWSKI; KATO,1980; FUSHIKI; KAZUO,

_________________________________________________________________ Discussão

75

1989). Nossos resultados, no entanto, contrastam com os resultados relatados para

inibidores que interagiram com a tripsina de modo não competitivo como observado

para um inibidor de tripsina purificado de tubérculo de C. esculenta (OLIVEIRA,

2001) e C. antiquorum (SUMATHI; PATTABIRAMAN, 1979), e de sementes de

leguminosas como, CapTI (Gomes et al., 2005a), ApTI de sementes de A. pavonina

(Macedo et al., 2004), TTI de sementes de Tamarindus indica (Araújo et al., 2005a),

e uma fitocistatina purificada de Castanea sativa, denominada CsC, que inibiu não

competitivamente a tripsina com valor de Ki de 3,49 x 10-6 M (Pernas et al., 1998).

Em adição, também foi descrito que a atividade da tripsina foi inibida de modo

incompetitivo pelo inibidor purificado de sementes de Caesalpinia pulcherima

(HASE; KOYAMA; DAIYASU, 1986) e Artocarpus integrifolia (BHAT;

PATTABIRAMAN, 1989).

O valor de Ki (constante de inibição) de 1,57 x 10-11 mM, calculado utilizando o

modelo proposto por Dixon (1979),(Figura 20) demonstra que PmTI tem uma alta

afinidade pela tripsina, semelhante ao encontrado para outros inibidores de tripsina

vegetais, purificados e já caracterizados (BIRK, 1994). Comparando-se os valores

de Ki de PmTI com outros inibidores da família Kunitz foi observado que esse

inibidor é mais potente inibidor de tripsina do que os encontrados em C. esculenta

(OLIVEIRA, 2001), ETIa de sementes de Erythrina variegata (Kouzuma et al., 1992;

Iwanaga et al., 2005) que apresentaram valor de Ki na ordem de 10-6 M, CapTI

(Gomes et al., 2005), PPTI (Garcia et al., 2004), PPI de sementes de Carica papaya

(Odani et al., 1996), e COTI de sementes de Cassia obtusifolia (Liao et al., 2007)

cujos valores de Ki foram determinados na ordem de 10-7 M. No entanto, o inibidor

de Catanduva apresentou valores de Ki similares em ordem de grandeza àqueles

determinados para os inibidores de TTI (Araujo et al., 2005a), BrTI de sementes de

_________________________________________________________________ Discussão

76

Bauhinia rufa (Nakahata et al., 2006), SWTI de sementes de Swartizia pickelli

(Cavalcanti et al., 2002), ECTI (Batista et al., 1996), DMTI-II de sementes de

Dimorphandra mollis (Mello et al., 2002), DMTI (Macedo et al., 2000), AeTI de

sementes de Archidrendon ellipticum (Bhattacharyya et al., 2006), BbKI de sementes

de Bauhinia bauhinoides (Oliva et al., 2001), PDTI de sementes de Peltophorum

dubium (Macedo et al., 2003), ILTI de sementes de Inga laurina (Macedo et al.,

2007), CbTI-2 de sementes de Caesalpinia bonduc (BHATTACHARYYA, RAI; BABU,

2007), e de sementes de Murraya koenigii (SHEE; SHARMA, 2007) que

apresentaram valores de Ki na ordem de 10-9 e 10-10 M. confirmando que o valor de

Ki determinado para o inibidor de Catanduva encontra-se dentro do padrão do valor

de Ki determinado para outros inibidores da família Kunitz.

Diante das características e propriedades apresentadas por ele no decorrer

do estudo, concluímos que o inibidor presente em sementes de P. moniliformis

pertence à família Kunitz.

Análises da inibição in vitro, de enzimas obtidas comercialmente ou das

enzimas presentes no trato digestório dos insetos alvos, foram feitos para determinar

a especificidade do inibidor sobre estas proteases (BROADWAY, 1997). Através

destas análises, o potencial de proteínas em inibir o desenvolvimento de insetos

quando ingeridas pode ser avaliado.

Na ordem Lepidóptera e Díptera são encontradas proteinases serínicas, como

tripsina, quimotripsina e elastase (TERRA; FERREIRA, 1994, HAQ; ATIF; KHAN,

2004, Gatehouse et al., 1999, Silva et al., 2006), e sabe-se que C. capitata, expressa

proteinases serínicas em seus intestinos médios (Applebaum et al., 1985, SILVA,

2003; Gatehouse et al., 1999; Zeng et al., 2001). Enquanto da ordem coleóptera

_________________________________________________________________ Discussão

77

apresentam proteinases do tipo cisteínicas (Lemos et al., 1990, Lecardonnet et al.,

1999),

Os inibidores de proteinases serínicas são considerados como agentes

naturais de controle contra insetos herbívoros, devido à capacidade de suprimir a

atividade dessas enzimas proteolíticas in vitro (Harsulkar et al., 1999; REED;

CHANDLER; SANDEMAN, 1999; De Leo et al., 2001; Macedo et al., 2003; Telang et

al., 2003, 2005; Tamhane et al., 2005; Garcia et al., 2004; Gomes et al., 2005b;

Srinivansan et al., 2005; Liao et al., 2007), retardar o crescimento e desenvolvimento

larval (Gatehouse et al., 1999), diminuir a fertilidade e fecundidade de fêmeas (DE

LEO; GALLERANI, 2002; Telang et al., 2003; TAMHANE et al., 2005), causar

deformidades (Franco et al., 2004; Gomes et al., 2005b) e aumentar a taxa de

mortalidade de insetos pragas (Macedo et al., 2002; Gomes et al., 2005a; Araujo et

al., 2005; Moura et al., 2006).

A atividade de PmTI foi testada, in vitro, contra extratos enzimáticos de

intestinos de 6 espécies de insetos-praga, pertencentes a diferentes ordens,

Lepidópteras (P. interpunctella e C. licus), Coleópteras (C. maculatus , Z.

subfasciatus e A. grandis) e Díptera (C. capitata) (Tabela 4). PmTI foi capaz de inibir

em 89,93% as enzimas de A. grandis, apresentando uma inibição de 59,94% para

as enzimas de P. interpunctella, este resultado foi similar ao observado para o

inibidor de tripsina de sementes de T. indica, denominado TTI, este inibidor suprimiu

a atividade de proteinases serínicas de Alabama argillacea (Lepidóptera) em

aproximadamente 54% (Araujo et al., 2005a). As enzimas de C. capitata, foram

inibidas em 70,52% resultado este que corrobora com o encontrado por Oliveira,

(2007), quando utilizou o inibidor de Pithecellobium dumosum, denominado JB2, que

_________________________________________________________________ Discussão

78

apresentou uma inibição de 70%. PmTI apresentou inibição de 5,96% para Z.

subfasciatus, de 9,41% para C. maculatus e de 23,67% para C. licus.

Os resultados obtidos nos experimentos in vitro conduziram a uma segunda

etapa do estudo da atividade inseticida do inibidor PmTI, o ensaio in vivo, no qual ele

foi oferecido como fonte de alimento em várias concentrações em dieta artificial com

a finalidade de analisarmos os parâmetros de crescimento e sobrevivência (WD50 %

e LD50 %) de C. capitata que é uma importante praga para o agronegócio potiguar.

Para verificar a aplicabilidade da ação inseticida dos inibidores e ou de

qualquer outra proteína, são utilizados métodos que envolvem ensaios de inibição in

vitro das proteases presentes no trato digestivo do inseto pelos inibidores alvo de

estudo, testes de alimentação de insetos contendo a proteína de estudo e numa fase

mais avançada a produção de plantas transgênicas, onde o aumento de sua

resistência seria decorrente da transferência de genes codificantes de inibidores de

proteinases (Macedo et al., 2001).

A presença de PmTI na dieta artificial reduziu significativamente a

sobrevivência (WD50 de 0,33) e o peso médio (LD50 de 0,30) das larvas de C.

capitata quando comparado ao controle (Figura 21 e 22), sugerindo um efeito

subseqüente no desenvolvimento do inseto, Macedo et al., (2000), demonstraram

que um inibidor de Dimorphandra mollis apresentou um WD50 de 0,53%, para larvas

de C. maculatus, resultado esse superior ao encontrado para PmTI. No entanto, o

nosso resultado é bem superior ao inibidor de tripsina presente nas sementes de

Peltophorum dubium que reduziu em 50% o ganho de peso de Anagasta kuehniella

(Lepidoptera) quando presente a 1% em dieta artificial, (Macedo et al., 2003). Mello

et al., (2004) quando alimentaram larvas de A. kuehniella com DMTI-II em

concentrações crescentes de 0,5 a 2,0% não observou efeitos significativos sobre a

_________________________________________________________________ Discussão

79

sobrevivência das larvas, resultado esse inferior ao encontrado para PmTI quando

testado contra as larvas de C. capitata, que na concentração de 1% não foi

observado crescimento e em relação a sobrevivência observou-se uma taxa de

mortalidade crescente nas diferentes concentrações testadas. Franco et al., (2004)

demonstraram que a presença de 500 μM de SKTI na dieta oferecida a A. grandis

causou uma diminuição no peso médio larval de 75%. O resultado obtido com PmTI

foi superior ao encontrado por GOMES, (2004) que alimentou C. capitata com o

inibidor de C. pallida e não observou mudança significativa em relação a nenhum

dos parâmetros analisados, o que explicaria neste caso uma adaptação do inseto ao

inibidor fato este já relatado na literatura (DE LEO; GALLERANI, 2002; Franco et al.,

2004).

Conclusões 80

7 CONCLUSÕES

A massa molecular, a potente atividade inibitória sobre a atividade catalítica

da tripsina, bem como, a similaridade da seqüência de aminoácidos do inibidor de

tripsina purificado de sementes de Catanduva (P.moniliformis), denominado PmTI,

com outros inibidores de sementes de leguminosas da família Kunitz são indicativos

de que este é o mais novo membro de inibidor de tripsina da família Kunitz;

A estabilidade do inibidor purificado de sementes de Catanduva às variações

de temperaturas, pHs e agente redutor (DTT) pode sugerir a presença de pontes

dissulfeto intramoleculares ou a presença de inúmeras pontes de hidrogênio;

PmTI mostrou especificidade de inibição, in vitro, para enzimas proteolíticas

pertencentes às classes mecanísticas das proteinases serínicas e cisteínicas;

PmTI purificado de sementes de Catanduva exibiu capacidade de inibir

diferencialmente, in vitro, as enzimas digestórias de insetos pragas pertencentes a

diferentes ordens e apresentou uma atividade tóxica para larvas de mosca-das-

frutas (C. capitata);

A perspectiva que se abre em relação aos resultados dos ensaios in vitro e in

vivo obtidos com PmTI é que este inibidor possa ser um forte candidato aos

programas de melhoramento via transgenia.

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universidade federal do rio grande do norte … · “que eu continue a acreditar no outro mesmo...

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