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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Jarmilla Bow-ltaif Garcia
Investigação do papel dos receptores 5-HT3 da substância cinzenta
periaquedutal dorsal na modulação dos comportamentos relativos à ansiedade
no labirinto em cruz elevado e no campo aberto em ratos
Natal
Junho/2015
Jarmilla Bow-ltaif Garcia
Investigação do papel dos receptores 5-HT3 da substância cinzenta
periaquedutal dorsal na modulação dos comportamentos relativos à ansiedade
no labirinto em cruz elevado e no campo aberto em ratos
Natal
Junho/2015
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte-UFRN, como pré-requisito para a obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientadora: Profa. Dra. Vanessa de Paula
Soares Rachetti.
Jarmilla Bow-Ltaif Garcia
Investigação do papel dos receptores 5-HT3 da substância cinzenta periaquedutal
dorsal na modulação dos comportamentos relativos à ansiedade no labirinto em cruz
elevado e no campo aberto em ratos.
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte-UFRN, como pré-requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Dissertação aprovada em: 25/06/15
Banca examinadora:
Profa. Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti - Orientadora
Departamento de Biofísica e Farmacologia - UFRN
Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli
Departamento de Biofísica e Farmacologia – UFRN
Prof. Dr. José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti
Departamento de Ciências Biomédicas - UERN
AGRADECIMENTOS
Agradeço:
A Deus pelo dom da vida, por me iluminar nos momentos difíceis, pela força e
determinação para a realização desse trabalho.
Aos meus pais pelo amor e afeto incondicionais, por me acompanharem e me darem
apoio em todos os momentos importantes da minha vida, por me ensinarem que
devemos fazer tudo com alegria e entusiasmo e que devemos ter perseverança
frente aos desafios, por oferecerem suporte educacional, que além de outras coisas,
foi importante para a execução desse trabalho.
Ao meu irmão Khalil pelos momentos de alegria e companheirismo, apesar da
distância física que estamos.
Ao meu namorado Ícaro pelo seu amor, carinho, companheirismo, paciência e
tranquilidade nos meus ―momentos de estresse‖, por me apoiar e incentivar durante
toda essa jornada, e fora dela. Somos parceiros para toda a vida, te amo!
Aos meus amigos do Farmacolab: a Raliny, ao Aldo, a Rebecca (a menina mais
chique do CB!), a Marana (Ops! Manara) e a Bárbara, pelo apoio em diversas
atividades do laboratório, pela convivência sempre afetuosa de vocês, pelas
conversas bastante animadas e enriquecedoras sobre temas científicos, pelos
momentos de descontração também, enfim a minha experiência no laboratório não
teria sido a mesma sem vocês!
Aos amigos com que a vida me presenteou: a Marília Oliveira, a Raíza Guerra, a
Sarah Sakamoto, a Juliana Oliveira, a Luênia Tavares e a Daniele Almeida que
sempre me apoiaram e torceram pelo meu sucesso.
À professora Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti por todo o suporte durante o
mestrado, pelos ensinamentos que muitas vezes extrapolaram os assuntos de
trabalho, pela paciência, por me ajudar a desenvolver um pensamento crítico acerca
dos assuntos científicos, o que me fez ser uma pessoa ainda mais empolgada com a
psicofarmacologia, além de ser uma incentivadora e entusiasta da vida! Jamais vou
esquecer esses momentos de aprendizado e alegria! Muito obrigada por tudo!
Ao Dr. Bruno Lobão Soares e à Dra. Alianda Maíra Cornélio da Silva pela
disponibilidade e importantes considerações.
À Dra. Elaine Cristina Gavioli e ao Dr. José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti por
aceitarem o convite para participar da banca de defesa e pelas sugestões que irão
contribuir com o desenvolvimento desse trabalho.
.
Aos técnicos do Laboratório de Farmacologia Experimental, à Carla, ao César e ao
Flávio, que, em diversas vezes, me deram apoio durante as atividades realizadas no
laboratório.
Ao LEME (Laboratório de Estudos da Memória) pela disponibilização do criostato
para o preparo das lâminas histológicas.
Aos ratinhos que foram importantes para a realização desse trabalho.
A Capes pelo auxílio financeiro.
A todos que de alguma forma contribuíram direta ou indiretamente para a realização
desse trabalho.
Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em
descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras,
enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos
(Isaac Newton)
RESUMO
A ansiedade é um estado emocional caracterizado por alterações fisiológicas e
psicológicas que oferecem uma sensação desagradável ao indivíduo. No entanto,
esse comportamento tem grande valor adaptativo, uma vez que alerta o indivíduo
sobre os possíveis perigos que determinada situação possa oferecer. Já foram
identificadas várias regiões encefálicas relacionadas ao substrato neural da
ansiedade e dentre elas pode-se citar a substância cinzenta periaquedutal (SCP).
Além disso, diversos estudos demonstraram o envolvimento do sistema
serotonérgico da porção dorsal da SCP (SCPD) na modulação de comportamentos
relativos à ansiedade. Tendo em vista isso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o
papel dos receptores 5-HT3 da SCPD na modulação de comportamentos
relacionados à ansiedade e locomoção em ratos testados no labirinto em cruz
elevado (LCE) e no campo aberto (CA). Ratos Wistar receberam a microinjeção do
antagonista do receptor 5-HT3 dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) (experimento
1), do agonista do receptor 5-HT3 m-Chlorophenylbiguanide (mCPBG) (2,5 µg, 5 µg
e 10 µg) (experimento 2) ou de salina na SCPD. Após as administrações os ratos
foram colocados no LCE e seus comportamentos foram avaliados durante 5
minutos. Vinte e quatro horas depois, os animais receberam as mesmas doses com
que foram microinjetados no dia anterior na SCPD e seus comportamentos foram
avaliados no CA durante 15 minutos. No experimento 1, a microinjeção do
dolasetron não alterou os parâmetros de ansiedade e locomoção no LCE e CA. Já
no experimento 2, o mCPBG nas doses de 5 µg e de 10 µg produziu efeito
ansiolítico no LCE sem promover alteração locomotora no animal. Esses resultados
sugerem que a ativação dos receptores 5-HT3 da SCPD favorece um efeito
ansiolítico em ratos avaliados no LCE.
Palavras-chave: Ansiedade. Substância cinzenta periaquedutal dorsal. Serotonina.
Receptor 5-HT3. Dolasetron. m-Chlorophenylbiguanide (mCPBG). Labirinto em cruz
elevado. Campo aberto.
ABSTRACT
Anxiety is an emotional state characterized by physiological and psychological
changes that provide an unpleasant feeling to the individual. However this behavior
has great adaptive value, since it alerts the individual about possible dangers that
particular situation can offer. It has been identified various brain regions related to
neural substrate of anxiety and, among them, it is the periaqueductal gray matter
(PAG). Several studies have demonstrated the involvement of serotonergic system of
the dorsal portion of PAG (DPAG) in the modulation of behaviors related to anxiety.
In view of this, the objective of this study was to evaluate the role of 5-HT3 receptors
of the DPAG in the modulation of behaviors related to anxiety and locomotion in rats
tested in the elevated plus maze (EPM) and open field (OF). Wistar rats received
microinjection of 5-HT3 receptor antagonist dolasetron (100ng, 500ng and 1000ng)
(experiment 1), 5-HT3 receptor agonist m-Chlorophenylbiguanide (mCPBG) (2,5μg,
5μg and 10mg) (Experiment 2) or saline 0.9% in the DPAG. After 10 minutes
(experiment 1) or 5 minutes (Experiment 2), the rats were placed in the EPM and
their performances were evaluated during 5 minutes. Twenty-four hours later the
animals received the same doses that were microinjected on the previous day in the
DPAG and after 10 minutes (experiment 1) or 5 minutes (experiment 2) were placed
in OF and their behaviors were assessed for 15 minutes. In experiment 1
microinjection of dolasetron did not change the parameters of anxiety and locomotion
in EPM and OF. In the experiment 2, the mCPBG at doses of 5μg and 10mg
produced anxiolytic effect in EPM without changes in locomotor behavior. These
results suggest that activation of 5-HT3 receptors in the SCPD eliciate an anxiolytic
effect in rats evaluated in EPM.
Key words: Anxiety. Dorsal periaqueductal gray matter. Serotonin. 5-HT3 receptor.
Dolasetron, m-Chlorophenylbiguanide (mCPBG). Elevated plus maze. Open field.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Modelo da SCP 18
Figura 2 – Arquitetura do receptor 5-HT3 26
Figura 3 – Dolasetron 34
Figura 4 – mCPBG 34
Figura 5 – Labirinto em cruz elevado 37
Figura 6 – Campo Aberto 38
Figura 7 – Fluxograma geral das etapas metodológicas empregadas
no trabalho 38
Figura 8 – Fluxograma do experimento 1 39
Figura 9 – Fluxograma do experimento 2 40
Figura 10 – Representação esquemática dos sítios de microinjeção
na SCPD de ratos 42
Figura 11 – Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado
na SCPD de ratos sobre a porcentagem de entradas e
tempo nos braços abertos do LCE 43
Figura 12 – Efeito do mCPBG (10µg, 5µg e 2,5µg) microinjetado na
SCPD de ratos sobre a porcentagem de entradas e tempo
nos braços abertos do LCE 46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado 44
na SCPD de ratos sobre o número de entradas e tempo nos
braços abertos, número de entradas nos braços fechados e
número total de entradas do LCE
Tabela 2 Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado 44
na SCPD de ratos sobre os índices etológicos do LCE.
Tabela 3 Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado 45
na SCPD de ratos sobre o índice de locomoção do CA.
Tabela 4 Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado 45
na SCPD de ratos sobre os parâmetros de ansiedade
avaliados no CA.
Tabela 5 Efeito do mCPBG (2,5µg, 5µg e 10µg) microinjetado na SCPD 47
de ratos sobre o número de entradas e tempo nos braços abertos
(valores absolutos), número de entradas nos braços fechados
e número total de entradas do LCE.
Tabela 6 Efeito do mCPBG (2,5µg, 5µg e 10µg) microinjetado na SCPD 47
de ratos sobre os índices etológicos do LCE
Tabela 7 Efeito do mCPBG (10µg, 5µg e 2,5µg) microinjetado na SCPD 48
de ratos sobre o índice de locomoção do CA.
Tabela 8 Efeito do mCPBG (10µg, 5µg e 2,5µg) microinjetado na SCPD 48
de ratos sobre os parâmetros de ansiedade avaliados no CA.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BDZ Benzodiazepínico
DALY Disability-Adjusted Life Year
DEC Domínio extracelular
DMT Domínio transmembrana
DIC Domínio intracelular
DSM Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais
LCE Labirinto em cruz elevado
LTE Labirinto em T elevado
NMR Núcleo mediano da fafe
NDR Núcleo dorsal da rafe
PCPA Paraclorofenilalanina
PEC Postura de esticar o corpo protegido
RBF Retorno aos braços fechados
SCP Substância cinzenta periaquedutal
SCPD Substância cinzenta periaquedutal dorsal
TIS Teste de interação social
TP Transtorno do pânico
TAG Transtorno de ansiedade generalizada
WHO World Health Organization
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................13
1.1 ANSIEDADE.......................................................................................................13
1.2 A SUBSTÂNCIA CINZENTA PERIAQUEDUTAL NO SUBSTRATO NEURAL
DA ANSIEDADE.......................................................................................................17
1.3 O SISTEMA SEROTONÉRGICO NA ANSIEDADE...........................................19
1.4 O RECEPTOR 5-HT3: ESTRUTURA E FUNÇÃO..............................................25
1.5 O RECEPTOR 5-HT3 NA ANSIEDADE: ESTUDOS CLÍNICOS E
PRÉ-CLÍNICOS........................................................................................................27
2. OBJETIVOS.........................................................................................................32
2.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................32
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................32
3. MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................33
3.1 ANIMAIS.............................................................................................................33
3.2 DROGAS............................................................................................................33
3.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS..............................................................34
3.3.1 CIRURGIA ESTEREOTÁXICA PARA O IMPLANTE DA CÂNULA GUIA......34
3.3.2 HABITUAÇÃO.................................................................................................35
3.3.3 MICROINJEÇÃO INTRA-SCPD......................................................................35
3.4 APARATOS EXPERIMENTAIS..........................................................................36
3.4.1 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE)........................................................36
3.4.2 CAMPO ABERTO............................................................................................37
3.5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL...................................................................38
3.5.1 EXPERIMENTO 1............................................................................................39
3.5.2 EXPERIMENTO 2............................................................................................39
3.6 PERFUSÃO........................................................................................................40
3.7 HISTOLOGIA......................................................................................................40
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA.....................................................................................41
4. RESULTADOS.....................................................................................................42
4.1HISTOLOGIA......................................................................................................42
4.2 EXPERIMENTO 01: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO DOLASETRON NA
SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO LCE..............................................................43
4.3 EXPERIMENTO 01: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO DOLASETRON NA
SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO CA ...............................................................44
4.4 EXPERIMENTO 02: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO MCPBG NA SCPD
DE RATOS SUBMETIDOS AO LCE.........................................................................45
4.5 EXPERIMENTO 02: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO mCPBG NA SCPD
DE RATOS SUBMETIDOS AO CA..........................................................................47
5. DISCUSSÃO........................................................................................................49
6. CONCLUSÃO......................................................................................................59
REFERÊNCIAS........................................................................................................60
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 ANSIEDADE
Não é de hoje a curiosidade e o temor dos seres humanos com relação ao
universo que abrange os transtornos mentais. Era tendência dos médicos dos
séculos XVI e XVII, por exemplo, inferir que entidades sobrenaturais seriam, em
parte, responsáveis por alterações comportamentais visualizadas em pacientes
portadores de epilepsia, cuja causa racional ainda não havia sido completamente
elucidada (RIEMENSCHNEIDER, 2004).
Atualmente, centenas de transtornos mentais são classificados e catalogados,
podendo ser encontrados em um guia denominado Manual Diagnóstico e Estatístico
de Transtornos Mentais (DSM), o qual ao longo dos anos se tornou ferramenta
indispensável aos profissionais da saúde para o diagnóstico dessas enfermidades
(AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2013).
A fim de criar as bases para o entendimento desses transtornos, é
imprescindível primeiramente compreender como funcionam os sistemas de
neurotransmissão e áreas encefálicas correlacionadas, em indivíduos normais, e
com isso produzir o conhecimento científico que futuramente pode contribuir para
resolução dessas afecções. Tendo em vista isso, tornar-se-ia interessante ampliar os
conhecimentos a respeito do substrato neural da ansiedade, já que alterações nos
mecanismos neurais relativos a essa emoção poderiam ser a causa dos transtornos
de ansiedade (ROTH, 1994; BELZUNG; GRIEBEL, 2001).
A ansiedade é um estado emocional caracterizado por alterações psicológicas
e fisiológicas que causam uma sensação desagradável ao indivíduo. O componente
psicológico caracteriza-se pela percepção negativa de determinada situação e da
necessidade de desvencilhar-se da mesma, a fim de eliminar o desconforto gerado
por esse estado de desprazer. Além disso, indivíduos ansiosos podem ser
acometidos por pensamentos negativos, gerando preocupação e antecipação de
possíveis sofrimentos. Por fim, a dificuldade de dormir também pode se configurar
em estados ansiosos. É interessante observar que o conceito atual de ansiedade,
em sua essência, não se desligou da sua origem grega, proveniente do radical
14
Anshein, o qual significa estrangular, sufocar e oprimir (GRAEFF; GUIMARÃES,
2005; BRANDÃO, 2004).
Já com relação ao componente fisiológico, destaca-se a ativação do sistema
nervoso autônomo, o qual é dividido em sistema nervoso simpático e
parassimpático. A estimulação do primeiro pode promover a elevação da frequência
cardíaca e da pressão arterial, sudorese, tremores ou sensação de falta de ar.
Quando o segundo sistema é excitado, pode-se observar aumento da secreção
gástrica e aumento da motilidade intestinal (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005).
É interessante salientar que estas alterações, tanto psicológicas quanto
fisiológicas, são normais e fazem parte da vida cotidiana de qualquer indivíduo
durante uma situação que gere ansiedade (DURANT; CHRISTMAS; NUTT, 2010).
Mas, apesar de a ansiedade ser responsável por essas sensações incômodas, ela
possui grande valor adaptativo para o ser humano, uma vez que alerta o indivíduo
sobre os possíveis perigos que determinada situação possa oferecer (GRAEFF;
GUIMARÃES, 2005).
Essa emoção também é fundamental para promover o bom desempenho em
atividades cognitivas. De fato, adaptando-se a curva de Yerkes-Dodson para o
contexto da ansiedade, a elevação da mesma causa um aumento no desempenho
das tarefas, até determinado ponto, em que a eficiência seria máxima. No entanto, a
partir desse limite, o aumento da ansiedade passa a ser prejudicial e promove uma
redução na performance do indivíduo (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005). Nesse
contexto, quando a ansiedade afeta o desempenho, apresentando uma resposta
com intensidade ou frequência desproporcional a situação que a originou, ou ainda
quando a sua causa não é bem determinada, pode-se afirmar que esse estado
ansioso abandonou o seu caráter benéfico/protetor e tornou-se nocivo (BRANDÃO,
2004; BRAGA ET AL, 2010).
Assim, quando esses mecanismos de autopreservação encontram-se
desbalanceados, estabelece-se o estado de ansiedade patológica (GRAEFF;
GUIMARÃES, 2005). Esta pode ter origem secundária quando ela é uma
consequência de outras enfermidades (psiquiátricas ou não) ou primária quando se
trata da única ou principal manifestação clínica da doença. É nesse último quesito
em que se enquadram os transtornos de ansiedade (PITTA, 2010). Segundo o DSM-
15
V, os transtornos de ansiedade podem ser classificados em vários subtipos, tais
como: o transtorno do pânico (com ou sem agorafobia) (TP), a agorafobia sem
história de transtorno do pânico, o transtorno de ansiedade generalizada (TAG), a
fobia específica, a fobia social, o transtorno devido a uma condição médica geral, o
transtorno de ansiedade induzido por substância e o transtorno de ansiedade sem
outra especificação (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2013).
A fim de ilustrar como esses transtornos são extremamente debilitantes e
interferem no estilo de vida das pessoas (MENEZES ET AL, 2007), o TAG, o TP e a
fobia social são descritos a seguir. O primeiro caracteriza-se por um estado de
ansiedade e preocupação excessivo durante um período de seis meses (ocorrendo
na maioria dos dias) no qual o indivíduo sente dificuldades em controlar essa
emoção. Além disso, a ansiedade sentida é desproporcional ao evento que a gerou.
Já o transtorno do pânico caracteriza-se pelo surgimento de ataques de pânico
recorrentes e inesperados. Estes se caracterizam por configurar um estado de medo
intenso ou desconforto ao indivíduo e é frequentemente acompanhado da sensação
de morte eminente e do desejo de fugir. Além disso, os ataques aparecem
associados a alguns sintomas, tais como: sensação de sufocamento, sudorese,
sensação de tontura, medo de morrer, medo de enlouquecer e tremores. Esse
conjunto de sintomas surge de maneira súbita e alcança um pico dentro de dez
minutos. Por outro lado, a fobia social se caracteriza por uma ansiedade exagerada
devido à exposição a situações sociais ou de desempenho na qual o indivíduo tem
receio de que vá agir de forma humilhante ou vergonhosa. Além disso, o indivíduo,
apesar de reconhecer que esse comportamento é exagerado e irracional, tende a
esquivar-se das situações embaraçosas ou executá-las com intenso desconforto.
Por fim, para configurar-se como patologia também é necessário que esse
comportamento interfira significativamente na rotina diária, no trabalho e nas
relações sociais (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2013).
Com relação aos estudos epidemiológicos, em uma pesquisa realizada pela
World Health Organization (WHO), em 2012, foram avaliados os anos de vida
saudável perdidos por incapacitação (Disability-Adjusted Life Year –DALY) num
panorama global e demonstrou-se que os transtornos psiquiátricos estão entre as
seis maiores causas de anos de vida perdido por incapacitação e dentro desse
grupo os transtornos de ansiedade situam-se na terceira posição (WORLD HEALTH
16
ORGANIZATION, 2014). Em um estudo realizado em São Paulo, no Brasil,
demonstrou-se que 12,5 % dos entrevistados já tiveram o diagnóstico de transtorno
de ansiedade em algum momento de sua vida (ANDRADE, 2002).
É importante salientar que o tratamento para os transtornos de ansiedade são
realizados através de intervenções psicológicas e farmacológicas e quanto a estas
últimas, os inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS) e os inibidores
da recaptação da serotonina e noradrenalina (IRSN) são os fármacos mais indicados
pela ANVISA para o tratamento desses transtornos (ANVISA, 2013). Contudo, na
situação atual, os benzodiazepínicos (BZDs), drogas que foram largamente
utilizados na década de 70 pensando ser uma opção totalmente segura
(ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE PSIQUIATRIA, 2008), são ainda os medicamentos
mais empregados no tratamento desses transtornos, sendo a terceira classe de
drogas mais prescritas no Brasil (NORDON; HÜBNER, 2009). Apesar de ter efeito
rápido e ser bem aceita, essa classe de fármacos apresenta muitos efeitos nocivos
para o indivíduo, tais como: piora da memória e da coordenação motora fina,
sedação e risco de dependência (ANVISA, 2013; ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE
PSIQUIATRIA, 2008). Além disso, apesar dos ISRS serem os medicamentos de
escolha, eles apresentam alguns efeitos colaterais como a piora dos sintomas no
início do tratamento e a espera de cerca de quatro a doze semanas para o início do
efeito (ANVISA, 2013).
Outro ponto crucial é que os transtornos de ansiedade estão atrelados a um
maior risco de suicídio, a comorbidades médicas e psiquiátricas e, além disso, as
intervenções farmacológicas ou psicossociais são efetivas apenas em uma parte dos
pacientes (ETKIN, 2012).
Tendo em vista o impacto negativo dos transtornos de ansiedade na vida das
pessoas e a carência de medicamentos que sejam eficazes e ao mesmo tempo
possuam efeitos colaterais menos deletérios, é imprescindível que haja o
desenvolvimento de estudos nesse contexto, a fim de expandir os conhecimentos
referentes à fisiologia e patologia da ansiedade e, assim, futuramente contribuir com
a melhoria da qualidade de vida dos pacientes. Dessa forma, diversos estudos pré-
clínicos vem sendo realizados com o intuito de esclarecer o substrato neural da
17
ansiedade, bem como apontar novos alvos terapêuticos para o tratamento desses
transtornos.
1.2 A SUBSTÂNCIA CINZENTA PERIAQUEDUTAL NO SUBSTRATO NEURAL DA
ANSIEDADE
Com o avanço nas pesquisas, várias áreas encefálicas vêm sendo vinculadas
ao substrato neural da ansiedade e, dentre elas, pode-se citar: a substância cinzenta
periaquedutal (SCP), a amígdala, o hipotálamo medial, o septo, o hipocampo, o
locus coeruleus e córtex pré-frontal (BRANDÃO ET AL, 2003).
Com relação à SCP, sabe-se que ela é um conjunto de células densas que
circundam parcialmente o aqueduto mesencefálico (aqueduto de Sylvius) o qual é
um ducto que conecta o terceiro e quarto ventrículos, localizado no mesencéfalo de
mamíferos (KEAY; BANDLER, 2004). Essa estrutura possui o mesmo tamanho
relativo entre humanos, ratos e gatos correspondendo à aproximadamente 10% do
tamanho do mesencéfalo numa secção transversal (CARRIVE, 1993). Além disso, o
mesencéfalo demonstra ser uma das regiões do encéfalo que sofreu poucas
modificações evolutivas de modo que a SCP é uma estrutura bastante conservada
entre os mamíferos (CARRIVE, 1993; LINNMAN ET AL., 2012). Outro ponto
interessante é que a SCP não é uma estrutura funcionalmente homogênea, uma vez
que sub-regiões diferentes podem conduzir a reações emocionais distintas. Levando
em consideração esse raciocínio e aspectos anatômicos, ela foi dividida em quatro
colunas longitudinais que são paralelas ao aqueduto mesencefálico, denominadas:
dorsomedial e dorsolateral, que compõem a porção dorsal, lateral e ventrolateral
(DEPAULIS; BANDLER, 1991; KEAY; BANDLER, 2004; CARRIVE, 1993; LINNMAN
ET AL., 2012) (figura 1). Quanto a sua função, diversos estudos in vivo têm
demonstrado que a SCP está implicada na modulação da dor, no controle da
ansiedade e do medo, na vocalização, na regulação cardiovascular, no
comportamento sexual, no controle da micção, na termorregulação, na respiração e
nos mecanismos de regulação do sono (CARRIVE; MORGAN, 2012; LINNMAN ET
AL., 2012; BEHBEHANI, 1995; KEAY; BANDLER, 2004; BENARROCH, 2012;
HOLSTEGE, 2014). Essa diversidade de funções pode estar relacionada com a
variedade de neurotransmissores (glutamato, o GABA, a acetilcolina e a serotonina)
18
e de neuropeptídeos (somatostatina, substância P, neuropeptídeo Y) que atuam na
SCP (CARRIVE; MORGAN, 2012).
As primeiras conexões entre a SCP e a ansiedade se deram através de
estudos que empregaram a estimulação elétrica da substância cinzenta
periaquedutal dorsal (SCPD) em animais de laboratório. Nesses trabalhos foi visto
que o estímulo incitou reações de defesa do tipo luta e fuga (BRANDÃO; AGUIAR;
GRAEFF, 1982; VIANNA; LANDEIRA-FERNANDEZ; BRANDÃO, 2001;
SCHENBERG; AGUIAR; GRAEFF, 1983; BRANDÃO ET AL, 2003; GRAEFF, 2002;
HESS; BRUGGER, 1943 citado por CARVALHO-NETTO, 2009) que foram
acompanhadas por alterações neurovegetativas (aumento da pressão sanguínea,
taquicardia, e exoftalmia), indicando que o animal estava diante de uma situação
desconfortante (SCHENBERG ET AL, 2001). Esses comportamentos são usuais de
animais que se encontram sob uma ameaça proximal, como por exemplo, quando
estão diante de um predador em ambiente natural (GRAEFF, 2004), e, além disso,
são sensíveis a fármacos utilizados na clínica para o tratamento de transtornos de
ansiedade (BLANCHARD; GRIEBEL; BLANCHARD, 2003). Da mesma forma, em
humanos, já foi visto que a estimulação elétrica da SCPD durante procedimentos
neurocirúrgicos para o alívio da dor crônica desencadeou sensações de medo e
morte eminente, vontade de fugir, hiperventilação, parada respiratória, ruborização
da face, piloereção e sudorese (NASHOLD; WILSON; SLAUGHTER, 1974 citado por
GRAEFF, 2002). Tais reações são semelhantes aos sintomas de transtorno do
Figura 1 - Modelo da SCP. Ao longo do eixo rostrocaudal estão representadas as colunas dorsomedial (dm), dorsolateral (dl),
lateral (l) e ventrolateral (vl).
Fonte: LINNMAN ET AL, 2012
19
pânico, um tipo de transtorno de ansiedade (LOVICK, 2000; JENCK; MOREAU;
MARTIN, 1995).
Além disso, sabe-se que a SCP recebe aferências de regiões prosencefálicas e
do próprio tronco encefálico. Com relação às regiões prosencefálicas, as principais
projeções se originam na amígdala, no córtex insular, no córtex pré-frontal, no córtex
temporal e no hipotálamo. Já no tronco encefálico, as projeções partem dos
colículos superior e inferior, da formação reticular do mesencéfalo, da substância
negra, do núcleo cuneiforme do tegumento mesencefálico, do locus coeruleus, dos
núcleos parabraquial, vestibular, grácil e solitário, do dorsal da ponte, da medula
ventromedial e ventrolateral e do núcleo dorsal da rafe (NDR) (CARRIVE; MORGAN,
2012).
Com relação ao NDR, sabe-se que ele é um dos núcleos formados
predominantemente por corpos celulares serotonérgicos situados ao longo da linha
média do tronco encefálico em humanos e em animais (HORNUNG, 2003; TABER;
BRODAL; WALBERG, 1960) e que projetam fibras serotonérgicas para SCPD
(STEZHKA; LOVICK, 1994; LOVICK, 1994). Portanto, a SCPD através das
aferências oriundas do NDR recebe projeções de um dos sistemas de
neurotransmissão implicados na modulação da ansiedade, o sistema serotonérgico
(DURANT; CHRISTMAS; NUTT, 2010).
1.3 O SISTEMA SEROTONÉRGICO NA ANSIEDADE
A serotonina, também conhecida como 5-hidroxitriptamina (5-HT), foi
descoberta há mais de sessenta anos atrás através do trabalho de caracterização
realizado por Maurice Rapport e Irvine Page (NICHOLS; NICHOLS, 2008;
RAPPORT; GREEN; PAGE, 1948). Essa amina biogênica possui importantes
funções no sistema cardiovascular, genitourinário, endócrino e gastrointestinal, no
controle da respiração, na modulação da dor, e, em especial, no sistema nervoso
central (BERGER; GRAY; ROTH, 2009; DUTTON; BARNES, 2008). Com relação a
esse último, é de conhecimento que esse neurotransmissor está implicado em
processos neurofisiológicos importantes para a manutenção de funções relevantes
para o organismo, como por exemplo, o humor, a recompensa, a raiva, a agressão,
o apetite, a memória, a sexualidade, a atenção, a regulação da temperatura, os
20
ciclos do sono, a êmese, a dor, a cognição e a ansiedade (BERGER; GRAY; ROTH,
2009; MOHAMMAD-ZADEH; MOSES; GWALTNEY-BRANT, 2008; DUTTON;
BARNES, 2008). Também foi constatado que a desregulação do sistema
serotonérgico está relacionada à patogênese de alguns transtornos neurológicos,
dentre eles o de ansiedade (ROTH, 1994; DUTTON; BARNES, 2008).
Sabe-se que os receptores serotonérgicos atualmente são classificados em
sete famílias (5-HT1 – 5-HT7), compostas por quatorze subtipos distintos de
receptores. Com exceção dos receptores 5-HT3, os quais são canais iônicos
operados por ligante, as demais famílias são receptores metabotrópicos acoplados a
proteína G (HOYER; HANNON; MARTIN, 2002; BARNES; SHARP, 1999).
Os primeiros trabalhos envolvendo o sistema serotonérgico e a ansiedade
utilizaram um modelo experimental de ansiedade denominado teste de conflito (teste
de punição). Nesse modelo um animal privado de alimento é treinado a pressionar
uma barra (rato) ou bicar um disco (pombo) com o intuito de obter uma recompensa
(líquido ou alimento). Após essa fase de treino, o animal é colocado novamente no
sistema, de modo que quando o disco era bicado ou a barra pressionada o animal
recebia um choque elétrico leve, caracterizando uma situação de conflito (GELLER;
SEIFTER, 1960; WUTTKE; KELLEHER, 1970; CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ,
2012). Assim, foi demonstrado que fármacos ansiolíticos (BZDs) liberavam a
resposta punida (aumento da taxa de pressionamento da barra ou bicadas no disco)
e que fármacos não ansiolíticos, como antipsicóticos, analgésicos, antidepressivos e
psicoestimulantes não alteravam essa resposta (LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012;
BRANDÃO ET AL, 2003).
Dessa forma, em um estudo em que foi administrado um inibidor da síntese de
serotonina, denominado paraclorofenilalanina (PCPA), perifericamente em ratos,
observou-se um aumento na taxa de pressão da barra (liberação do comportamento
punido) (ROBICHAUD; SLEDGE, 1969). Em outro trabalho semelhante, utilizando-se
pombos, notou-se que a administração periférica do metisergida (antagonista não
seletivo de receptor serotonérgico) também promoveu a liberação do
comportamento punido (GRAEFF; SCHOENFELD, 1970 citado por GRAEFF, 2002).
Além disso, esses efeitos foram semelhantes aos encontrados com a administração
de BDZs (WUTTKE; KELLEHER, 1970; GRAEFF, 2002).
21
Posteriormente, em 1972, surgiram indícios que solidificaram a inserção da
serotonina na modulação da ansiedade, ainda que com mecanismos não totalmente
esclarecidos. De fato, foi visto que a injeção intraventricular da serotonina promoveu
a supressão do comportamento punido e antagonizou a redução da ansiedade
promovida pelos BDZs (WISE; BERGER; STEIN, 1972). Além disso, a partir de
evidências neuroquímicas, acreditou-se, na época, que os BDZs induziam a
diminuição da taxa de renovação da serotonina no mesencéfalo do rato, numa dose
igual a que promoviam efeito ansiolítico no teste de conflito (WISE; BERGER;
STEIN, 1972). Como o NDR envia projeções serotonérgicas para áreas
prosencefálicas e o tronco encefálico (CARRIVE; MORGAN, 2012; GRAEFF, 2002),
sugeriu-se que a serotonina inibiu o comportamento punido por atuar nessas duas
regiões e que os BDZs realizaram seu efeito ansiolítico diminuindo a liberação de
serotonina nessas áreas (WISE; BERGER; STEIN, 1972). Contudo, atualmente,
sabe-se que os BDZs geram seu efeito ansiolítico por mecanismos de ação distintos
(FERRERO; GUIDOTTI; COSTA, 1984). Considerando que a SCP recebe projeções
do NDR (CARRIVE; MORGAN, 2012) e possui um papel no controle da aversão
(GRAEFF, 2002), inferiu-se na época que a serotonina poderia aumentar a
ansiedade promovida nos testes de conflito através de sua ação sobre a SCP, além
de outras estruturas prosencefálicas (WISE; BERGER; STEIN, 1972; GRAEFF,
2002).
Contudo, a partir de trabalhos que envolveram a administração de ligantes
serotonérgicos e a estimulação elétrica da SCPD, obtiveram-se resultados que
sugeriram que a serotonina teria um papel antiaversivo na SCPD.
Assim, alguns estudos utilizaram um teste no qual a SCPD do animal é
estimulada eletricamente e o mesmo é treinado a evadir-se desse estímulo aversivo
através do pressionamento de uma barra. Neste teste, era esperado que a
serotonina facilitasse o comportamento de fuga, uma vez que ela aumentaria a
ansiedade de acordo com a hipótese sugerida anteriormente (GRAEFF, 2002).
Contudo, foi observado que a administração do PCPA perifericamente aumentou a
taxa de pressão na barra para reduzir a estimulação (KISER; LEBOWITZ, 1975). De
maneira recíproca, a administração intraperitoneal de um precursor da serotonina (5-
HTP) ou de um inibidor da recaptação da serotonina (clomipramina) mostrou um
22
decaimento na taxa de pressionamento da barra (KISER; GERMAN; LEBOWITZ,
1978).
Também foi registrado que a estimulação elétrica do NDR diminuiu a fuga
motivada pela estimulação elétrica na SCPD (KISER ET AL., 1980). Ou seja, o
aumento da atividade serotonérgica reduziu os efeitos aversivos promovidos pela
estimulação elétrica na SCPD (atenuação da taxa de pressionamento da barra), ao
passo que a sua diminuição favoreceu os efeitos aversivos dessa estimulação
(facilitação do comportamento de fuga).
Por sua vez, trabalhos combinando administração de substâncias intracérebro
e a estimulação elétrica na SCPD também corroboraram a ideia de que a serotonina
inibe a aversão na SCPD. No modelo utilizado nesses trabalhos, ratos com
quimitrodos, instrumentos que permitem a estimulação elétrica e a microinjeção de
substâncias ao mesmo tempo na SCPD, são colocados dentro de uma caixa com
dois compartimentos. A intensidade da corrente é aumentada gradualmente até que
o animal corra para o compartimento oposto, o que desliga a corrente. Assim, depois
de três repetições do procedimento, o limiar elétrico aversivo basal (corrente mínima
necessária para provocar o deslocamento do animal) é determinado. Após um
tempo, o animal é microinjetado com a droga e um novo limiar é determinado.
Quanto maior o limiar pós-droga comparado ao limiar basal, maior será o efeito
antiaversivo daquela droga (SCHÜTZ; AGUIAR; GRAEFF, 1985). Assim, foi visto
que a administração da serotonina e do 5-MeODMT (agonista não seletivo de
receptor 5-HT2 e 5-HT1) aumentou o limiar elétrico necessário para induzir o
comportamento de fuga. Ainda nesse mesmo experimento, a microinjeção da
ketanserina (antagonista seletivo do receptor 5-HT2) ou da metergolina (antagonista
de receptor serotonérgico) trinta minutos antes da administração da serotonina
bloqueou o efeito antiaversivo dessa monoamina e o pré-tratamento com um inibidor
da recaptação de serotonina fortaleceu o efeito antiaversivo da mesma (SCHÜTZ;
AGUIAR; GRAEFF, 1985).
Tendo em vista esses resultados, é bastante sugestivo que os efeitos
antiaversivos da serotonina sobre a estimulação elétrica na SCPD sejam mediados
por receptores 5-HT2 uma vez que o antagonista desse receptor conseguiu reverter
os efeitos da serotonina na SCPD (SCHÜTZ; AGUIAR; GRAEFF, 1985).
23
Pesquisas utilizando subtipos dos receptores 5-HT2 e 5-HT1 também foram
bem sucedidas em mostrar que esses subtipos estão implicados nos efeitos
antiaversivos da serotonina. Utilizando o modelo experimental supracitado,
observou-se que a microinjeção de agonistas do receptor 5-HT1A (8-OH-DPAT e
BAY-R-1531) ou do agonista do receptor 5-HT2A/2C (DOI) aumentou o limiar elétrico
aversivo (inibição da fuga) de forma dose dependente; no entanto o tratamento com
o agonista do receptor 5-HT2B/2C (mCPP) foi ineficaz. Já a microinjeção prévia do
antagonista do receptor 5-HT1A (NAN-190) reverteu o efeito antiaversivo do 8-OH-
DPAT. De maneira similar, o antagonista do receptor 5-HT2A (espiperona) também
neutralizou o efeito do DOI. Portanto, a ativação dos receptores 5-HT1A e 5-HT2A
provavelmente é a responsável pela inibição da aversão gerada pela estimulação
elétrica da SCPD (NOGUEIRA; GRAEFF, 1995).
Tendo em vista isso, através dos dados obtidos com a estimulação elétrica da
SPCD, foi possível inferir que a serotonina inibiu a aversão na SCPD, por meio de
sua atuação em receptores 5-HT1A e 5-HT2A e, consequentemente, esses resultados
não concordam com hipótese criada na década de 70, de que a serotonina
aumentaria a ansiedade ao atuar na SCP (GRAEFF, 2002).
Já em modelos que se baseiam no repertório natural de defesa do rato, como o
labirinto em cruz elevado (LCE), foram observadas respostas distintas de acordo
com o subtipo de receptor envolvido. Esse modelo é um aparato constituído por dois
braços abertos (destituídos de paredes) perpendiculares a dois braços fechados
(protegidos por paredes). O centro, ou seja, o ponto de encontro entre os braços
abertos e fechados é destituído de paredes e todo o aparato é elevado do solo.
Assim, o animal é colocado no centro do labirinto e seu comportamento é avaliado
(HANDLEY; MITHANI, 1984). O LCE se baseia no medo inato dos roedores por
espaços abertos o qual é confrontado pelo o ímpeto de explorar ambientes
desconhecidos, de modo que esse aparato confere ao animal um conflito de
aproximação e esquiva, no qual os braços abertos do LCE representam um estímulo
aversivo (MONTGOMERY, 1955; HANDLEY; MITHANI, 1984). Já foi visto que ratos
colocados no LCE demonstraram preferência pelos braços fechados (HANDLEY;
MITHANI, 1984). Além disso, drogas ansiolíticas empregadas na clínica como o
diazepam promoveram o aumento no número de entradas e tempo nos braços
abertos, ao passo que drogas que induzem ansiedade em humanos como o
24
pentilenotetrazol diminuíram esses valores. Logo, esses parâmetros são usados
como índices de ansiedade no LCE (PELLOW ET AL, 1985).
Assim, a microinjeção de um agonista de receptor 5-HT2B/2C (mCPP) na SCP
de camundongos produziu efeito ansiolítico no LCE, o qual foi bloqueado pelo pré-
tratamento com um antagonista de receptores 5-HT2A/2C (ketanserina) (NUNES-DE-
SOUZA ET AL,2008). Por outro lado, a microinjeção isolada de um antagonista e de
agonista do receptor 5-HT1A, o WAY-100135 e o 8-OH-DPAT, respectivamente, na
SCPD de ratos não alterou os índices de ansiedade do LCE (MORAES;
BERTOGLIO; CAROBREZ, 2008).
Já em outro modelo etológico derivado do LCE, o labirinto em T elevado (LTE;
GRAEFF; NETTO; ZANGROSSI, 1998; TEIXEIRA; ZANGROSSI; GRAEFF, 2000;
POLTRONIERI; ZANGROSSI; VIANA, 2003), resultados interessantes tem sido
obtidos. Nesse sentido, alguns estudos demonstraram que a microinjeção da
serotonina ou de agonistas de receptores serotonérgicos, tais como: o mCPP
(agonista do receptor 5-HT2B/2C), o 8-OH-DPAT (agonista de receptor 5-HT1A) e o
DOI (agonista preferencial do 5-HT2A) na SCPD produziram efeito antiaversivo no
LTE (ZANOVELI; NOGUEIRA; ZANGROSSI, 2003; SOARES; ZANGROSSI, 2004).
Além disso, o efeito antiaversivo do 8-OH-DPAT e do DOI foram bloqueados pela
microinjeção prévia dos antagonistas do receptor 5-HT1A (WAY 100635) e do
antagonista preferencial do receptor 5-HT2A (ketanserina), respectivamente
(SOARES; ZANGROSSI, 2004). De maneira semelhante, o efeito antiaversivo da
serotonina também foi bloqueado pela microinjeção prévia desses mesmos
antagonistas e do antagonista preferencial do receptor 5-HT2C (SDZ SER 082)
(SOARES; ZANGROSSI, 2004). É interessante notar que esses resultados estão de
acordo com os efeitos antiaversivos observados com a microinjeção de agonistas
dos receptores 5-HT1A e 5-HT2A ou da própria serotonina no modelo de estimulação
elétrica da SCPD (SCHÜTZ; AGUIAR; GRAEFF, 1985; NOGUEIRA; GRAEFF,
1995). Tendo em vista esses dados, sugeriu-se que os receptores 5-HT1A, 5-HT2A e
5-HT2C poderiam mediar o efeito antiaversivo da serotonina na SCPD (SOARES;
ZANGROSSI, 2004) Ainda em estudos posteriores, foi visto que, nesse mesmo
teste, a microinjeção de um agonista seletivo do receptor 5-HT2C, o MK-212, na
SCPD promoveu efeito ansiogênico no LTE, o qual foi revertido pela microinjeção
25
prévia do antagonista seletivo do receptor 5-HT2C, o SB 242084 (YAMASHITA;
BORTOLI; ZANGROSSI, 2011).
Portanto, com essas informações, é possível inferir que a SCPD é uma
estrutura diversificada quanto aos mecanismos que envolvem a ansiedade, uma vez
que a serotonina pode ativar diferentes receptores e gerar efeitos comportamentais
distintos. Então, com o intuito de compreender melhor a participação da SCPD em
mecanismos de ansiedade é de suma importância investigar os efeitos decorrentes
da ativação e bloqueio de outros receptores serotonérgicos nessa região.
1.4 O RECEPTOR 5-HT3: ESTRUTURA E FUNÇÃO
O receptor 5-HT3 é um dos receptores serotonérgicos presentes na SCP
(LAPORTE ET AL, 1992; GE ET AL, 1997) e faz parte da família de canais iônicos
operados por ligante Cys-loop. Os membros dessa família têm em comum o fato de
serem proteínas transmembranas ativadas por neurotransmissores e de
desencadear neurotransmissões rápidas de caráter excitatório ou inibitório. A
principal característica dos componentes desse grupo é a presença de uma alça de
13 aminoácidos, na porção extracelular dos receptores, delimitada por uma ponte
dissulfeto entre dois resíduos de cisteína (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010).
Esse receptor serotonérgico é formado por cinco subunidades que estão
dispostas pseudosimetricamente ao redor de um poro central, permeável à
passagem de cátions, quando ativado. Cada subunidade pode ser dividida em três
domínios: o domínio extracelular (DEC), o domínio transmembrana (DTM) e o
domínio intracelular (DIC) (figura 2) (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010;
LUMMIS, 2012). O DEC contém o local de ligação do ligante e é um importante sítio
para a ação de agonistas e antagonistas competitivos. Já o DTM é formado por
quatro α-hélices (M1-M4) que permitem a passagem de íons positivos através da
membrana (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010; LUMMIS, 2012). No entanto, na
região central dessa estrutura, na linha do poro, situa-se uma constrição hidrofóbica
em M2 que funciona como o portão do canal impedindo a passagem dos íons
quando o neurotransmissor não está associado ao receptor (THOMPSON; LESTER;
LUMMIS, 2010). Quando essa ligação ocorre, ele se move permitindo o fluxo dos
26
íons através da membrana. Assim, a ligação de ao menos duas moléculas de
serotonina na porção DEC do canal provocaria uma rotação que se propagaria ao
longo do eixo do canal até à α-hélice M2. Nessa região, a alteração conformacional
gerada promoveria a ruptura das interações hidrofóbicas no centro de M2,
permitindo a passagem dos íons (LUMMIS, 2004; PANICKER ET AL., 2002). Esse
domínio também é o sítio de ligação para alguns compostos como o álcool,
anestésicos e esteroides (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010). Por sua vez, o
DIC é constituído por um grande laço (loop) intracelular que é responsável pela
condutância iônica do canal e é susceptível à modulação por compostos
intracelulares (fosforilação). Além disso, forma uma abertura que permite a
passagem dos íons através do poro (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010;
LUMMIS, 2012). Ademais, as cinco subunidades que podem estar presentes no
receptor são denominadas: 5-HT3A, 5-HT3B, 5-HT3C, 5-HT3D e 5HT3E
(WALSTAB; RAPPOLD; NIESLER, 2010). A subunidade 5-HT3A pode formar
homopentâmeros ou heteropentâmeros com outras subunidades, de modo que a
presença dessa subunidade é fundamental para a constituição funcional do receptor
5-HT3 (LUMMIS, 2012; NIESLER ET AL., 2007). Por fim, todas estão presentes em
humanos, porém em roedores (ratos e camundongos) apenas as subunidades 5-
HT3A e 5-HT3B foram identificadas (LUMMIS, 2012; HOLBROOK, 2009; HANNA ET
AL., 2000).
A localização desse canal iônico é bastante diversificada no organismo,
podendo ser encontrado em células enterocromafins intestinais, em linfócitos e em
neurônios dos sistemas nervoso periférico e central. No sistema nervoso periférico
Figura 2 - Arquitetura do receptor 5-HT3. É possível observar os domínios de cada subunidade do receptor num corte longitudinal
(fig.2A) e transversal (fig.2B) do receptor.
Fig.2A Fig.2B
Fonte: HASSAINE ET AL., 2014.
27
estão envolvidos em atividades autonômicas, como na transferência de informações
relacionadas ao vômito no trato gastrointestinal e no controle da motilidade intestinal
e peristaltismo (THOMPSON; LUMMIS, 2006). Já no sistema nervoso central, ele
está principalmente implicado na cognição, na ansiedade, nos processos relativos
ao reflexo do vômito, à dor e ao sistema de recompensa (THOMPSON; LUMMIS,
2006; FAERBER ET AL, 2007). Com relação à localização no SNC, esse receptor
além de estar presente na SCP, ele pode ser encontrado, por exemplo, no córtex
frontal e etorrinal, no hipocampo, na amígdala, no nucleus accumbens, na
substância negra, na área tegumental ventral, nas camadas superficiais do corno
dorsal da medula espinhal, na área postrema, no núcleo do trato solitário e no
núcleo dorsal da rafe (THOMPSON; LUMMIS, 2006; LAPORTE ET AL, 1992; GE ET
AL, 1997).
Quanto aos mecanismos de ativação, esse receptor promove a despolarização
da membrana por meio da corrente de íons positivos que atravessam o canal. Nesse
fluxo de íons, ocorre a entrada de Na+ e Ca+2 na célula e a saída de K+. Já foi visto
que os receptores 5-HT3 estão localizados predominantemente em regiões pré-
sinápticas, tais como as terminações nervosas e axônios, onde apresentam alta
permeabilidade ao Ca+2 (MIQUEL ET AL., 2002; RONDÉ; NICHOLS, 1998; NAYAK
ET AL., 1999). Esse fato é interessante uma vez que a entrada de Ca+2 no terminal
pré-sináptico da célula promove a exocitose das vesículas contendo
neurotransmissores. De fato alguns estudos confirmaram que a ativação desse
receptor promove a liberação de muitos neurotransmissores, como o GABA e a
dopamina (TURNER; MOKLER; LUEBKE, 2004; CHEN; PRAAG; GARDNER, 1991;
FAERBER ET AL, 2007). Já nos terminais pós-sinápticos, os receptores 5-HT3
destacam-se pela despolarização causada pela passagem de Na+ e K+ pelo poro do
canal, uma vez que ele apresenta alta permeabilidade a esses cátions e a baixa
permeabilidade ao Ca+2 (NAYAK ET AL., 1999; RONDÉ; NICHOLS, 1998).
1.5 O RECEPTOR 5-HT3 NA ANSIEDADE: ESTUDOS CLÍNICOS E PRÉ-CLÍNICOS
É de conhecimento que uma das principais áreas terapêuticas nas quais os
antagonistas do receptor 5-HT3 atuam são o controle do vômito induzido pela
28
quimioterapia. No entanto, em ensaios clínicos demonstrou-se que esses fármacos
possuem também funções diferentes da convencional, em especial na ansiedade.
Em um desses ensaios, o tropisetron gerou efeito ansiolítico num estudo duplo cego,
no qual 91 indivíduos com o TAG receberam cápsulas de tropisetron ou cápsulas de
placebo durante 21 dias de tratamento (LECRUBIER ET AL., 1993). Além disso, em
outros estudos clínicos, o ondansetron demonstra ser uma alternativa interessante
na redução do abuso de substâncias. De fato, viu-se que esse fármaco conseguiu
reduzir o consumo de álcool e aumentou o período de abstinência, conforme
demonstrado em um estudo duplo cego com 271 indivíduos diagnosticados com
alcoolismo precoce (JOHNSON ET AL., 2000; THOMPSON; LUMMIS, 2006).
Com relação aos estudos pré-clínicos, a maioria das pesquisas fez uso de
testes comportamentais que se baseiam na apresentação de estímulos
incondicionados, tais como: o LCE, a transição claro/escuro e o teste de interação
social (TIS), para avaliar a participação do receptor 5-HT3 no desenvolvimento dos
comportamentos relacionados à ansiedade.
Observou-se que a administração periférica de diversos antagonistas do
receptor 5-HT3 gerou respostas discordantes num mesmo ou em modelos animais
de ansiedade distintos, nos quais efeito ansiolítico ou ausência de efeito foram
encontrados. Uma hipótese provável para a origem dessas discrepâncias poderia
ser a seletividade dos antagonistas por uma subunidade específica do receptor 5-
HT3. Outra possibilidade seria as diferenças sutis empregadas pelos pesquisadores
num mesmo modelo comportamental, o que poderia interferir nos resultados
encontrados (EGUCHI; INOMATA; SAITO, 2001; GRIEBEL, 1995).
Então, já foi demonstrado que a administração periférica de antagonistas do
receptor 5-HT3 tais como: o zacopride, o BRL 46470, o tropisetron, o MDL 72222, o
ondansetron, o granisetron e o WAY100289 em ratos (SETEM ET AL, 1999; FILE;
JOHNSTON, 1989; WRIGHT, 1992; GRIEBEL ET AL., 1997; FILE; JOHNSTON,
1989) e em camundongos (TANYERI ET AL., 2013; RODGERS; COLE;
TREDWELL, 1995) não alterou os comportamentos relativos à ansiedade no LCE e
no TIS. Além disso, os camundongos submetidos a um regime crônico de 21 dias de
ondansetron também não diferiram dos animais controle no LCE (RODGERS;
CUTLER; JACKSON, 1997).
29
Considerando os estudos que demonstraram alteração nos parâmetros de
ansiedade, já foi visto que a administração periférica de todos os antagonistas do
receptor 5-HT3 citados no parágrafo anterior, além do Y-25130, do RS-42358, do
VA21B7 e do 6K, produziu efeito ansiolítico em ratos (DUNN; CARLEZON;
CORBETT, 1991; ANDREWS; FILE, 1993; BLACKBURN ET AL, 1993; FILIP ET AL,
1992; COSTALL ET AL, 1993; ARTAIZ ET AL, 1995; JONES, 1988; BELL ET AL,
2014; GARGIULO ET AL, 1996) e em camundongos (SÁNCHEZ, 1995; JONES ET
AL., 1988; COSTALL ET AL., 1989a; ARTAIZ ET AL., 1995; COSTALL ET AL.,
1993; KURHE ET AL. 2014) em diversos modelos comportamentais (LCE, TIS,
labirinto em zero elevado, LTE, teste de conflito de Vogel e o modelo de transição
claro/escuro). Somado a isso, um estudo que empregou o regime crônico de
ondansetron durante 14 dias em ratos gerou aumento do número de entradas e
tempo de permanência nos braços abertos do LCE (efeito ansiolítico) (WRIGHT,
1992). Com relação às medidas etológicas, pesquisadores mostraram que o
zacopride e o ondansetron foram aptos em diminuir a avaliação de risco no LCE, o
que é indicativo de um perfil ansiolítico (GRIEBEL ET AL., 1997).
Por outro lado, observou-se que a administração periférica do agonista 1-(m-
Chlorophenyl)-biguanide (mCPBG) diminuiu o tempo de permanência nos braços
abertos do LCE e a interação social no TIS, gerando efeito ansiogênico em ambos
os testes. (EGUCHI; INOMATA; SAITO, 2001; ANDREWS; FILE, 1992). Além disso,
administração combinada de antagonistas com agonistas de receptor 5-HT3 revelou
resultados interessantes. De fato, foi visto que a administração isolada do
ondansetron em ratos, por via oral, aumentou a interação social no TIS. No entanto,
quando o mCPBG foi administrado subsequente à aplicação do ondansetron, o
efeito ansiolítico gerado pelo antagonista foi anulado. Portanto, o efeito ansiolítico
promovido pelo ondansetron possivelmente se deve à ativação de receptores 5-HT3
(EGUCHI; INOMATA; SAITO, 2001).
Com relação às administrações intracérebro de antagonista e agonistas de
receptor 5-HT3, diversas respostas comportamentais são observadas de acordo com
teste comportamental empregado ou com a região onde essa substância é
administrada.
30
Por exemplo, foi visto que a microinjeção na amígdala de antagonistas de
receptores 5-HT3 (ondansetron, do tropisetron e do MDL 72222) em ratos aumentou
a interação social no TIS (efeito ansiolítico), ao passo que, a microinjeção do 2-Me-
5-HT (agonista de receptor 5-HT3) ou da própria serotonina promoveu efeito
ansiogênico nesse modelo. A microinjeção de antagonistas de 5-HT3 na amígdala de
ratos também promoveu efeitos ansiolíticos no LCE (HIGGINS ET AL., 1991;
TOMKINS; COSTALL; KELLY, 1990; MENARD; TREIT, 1999). É interessante notar
que esses dados corroboram os resultados ansiolíticos encontrados através da
administração periférica de antagonistas. Assim, a amígdala provavelmente seria um
das regiões neuroanatômicas pela qual os antagonistas de receptor 5-HT3
exerceriam seus efeitos ansiolíticos. Por outro lado, a administração dos mesmos
antagonistas em ratos no NDR não foi capaz de alterar os parâmetros de ansiedade
no TIS (HIGGINS ET AL., 1991).
Já no teste de conflito, a microinjeção do ondansetron e do tropisetron na
amígdala não foi capaz de gerar alterações comportamentais em ratos (HIGGINS ET
AL., 1991). No entanto, quando esses antagonistas foram administrados no
hipocampo e núcleo accumbens facilitaram os comportamentos suprimidos pela
punição (efeito ansiolítico) em testes de conflito nesses mesmos animais.
(STEFANSKI ET AL., 1993). Isso denota que os receptores 5-HT3 do núcleo
accumbens e do hipocampo possivelmente contribuem para o efeito ansiolítico no
teste de conflito (STEFANSKI ET AL., 1993).
Em estudos realizados em camundongos, resultados semelhantes foram
encontrados. De fato a microinjeção de ondansetron ou tropisetron na amígdala ou
no NDR aumentou o tempo gasto e o número de linhas cruzadas na área clara no
teste de transição claro e escuro (efeito ansiolítico). Já a administração do 2-Me-5-
HT (agonista do receptor 5-HT3) na amígdala ou no NDR causou efeito oposto
(COSTALL ET AL., 1989b). Portanto, a amígdala ou NDR possivelmente são um
dos locais de ação de antagonistas administrados perifericamente que tiveram seus
efeitos ansiolíticos demonstrados em testes comportamentais em camundongos
(COSTALL ET AL., 1989b). Contudo quando esses mesmos antagonistas são
microinjetados no núcleo mediano da rafe (NMR), núcleo accumbens, núcleo
caudado e putâmen não alteram as medidas espaço temporais no teste de transição
claro e escuro (COSTALL ET AL., 1989b).
31
Além das regiões já citadas, os antagonistas de receptor 5-HT3 também
promoveram resultados interessantes quando microinjetados na SCP de
camundongos. Assim, foi visto que a administração do ondansetron promoveu a
redução do número de entradas e do tempo decorrido nos braços abertos do LCE,
um efeito ansiogênico (SILVA, 2009). Contudo, esses resultados não concordam
com o efeito ansiolítico observado com a administração periférica de antagonistas do
receptor 5-HT3 (DUNN; CARLEZON; CORBETT, 1991; ANDREWS; FILE, 1993;
BLACKBURN ET AL, 1993; FILIP ET AL, 1992; COSTALL ET AL, 1993; ARTAIZ ET
AL, 1995; WRIGHT, 1992; JONES, 1988) e, além disso, esse estudo não diferenciou
as sub-regiões da SCP, as quais podem processar informações distintas
(BANDLER, ET AL, 2000; VIANNA; LANDEIRA-FERNANDEZ; BRANDÃO, 2001).
Assim, sabendo-se que os resultados obtidos com a administração periférica e
central de ligantes do receptor 5-HT3 não ofereceram resultados conclusivos em
relação a comportamentos relacionados à ansiedade, torna-se interessante
investigar se a SCPD estaria envolvida nesse processo em ratos.
32
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o envolvimento dos receptores 5-HT3 da SCPD na modulação de
comportamentos associados à ansiedade em ratos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Investigar o efeito da injeção intra-SCPD do antagonista do receptor 5-HT3
dolasetron sobre os parâmetros de ansiedade e locomoção avaliados no LCE e
no teste do campo aberto;
Investigar o efeito da administração intra-SCPD do agonista do receptor 5-HT3 m-
Chlorophenylbiguanide (mCPBG) sobre os parâmetros de ansiedade e locomoção
avaliados no LCE e no teste do campo aberto.
33
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados ratos machos Wistar com o peso entre 220 g - 270 g
provenientes do biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (DBF-UFRN). Durante toda a fase de
desenvolvimento do animal e no período de experimentos os ratos foram dispostos
em grupos de 5 animais e alojados em caixas com dimensões de 41 cm x 34 cm x
16 cm, em que receberam água e comida ad libitum e viveram num ciclo de claro e
escuro de 12 hrs (luzes acesas: 06:00-18:00) num ambiente climatizado a 23 ºC ±
1ºC. Além disso, todos os procedimentos experimentais realizados nesse trabalho
foram efetuados de acordo com a lei nº 11.794 de 08/10/2008 (Lei Arouca) e
aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFRN sob o número
049/2013.
3.2 DROGAS
As drogas empregadas durante realização dos experimentos comportamentais
foram o antagonista do receptor 5-HT3 dolasetron (Sigma-Aldrich®, EUA) nas doses
de 100 ng, 500 ng e 1000 ng (figura 3) (HIGGINS ET AL, 1990) e o agonista m-
Chlorophenylbiguanide (mCPBG) (Tocris Bioscience®, Reino Unido) nas doses de
2,5 µg, 5 µg e 10 µg (figura 4) (HIGGINS ET AL., 1990), ambos solubilizados em
salina estéril. Já durante a cirurgia foram empregadas as seguintes drogas: o
cloridrato de cetamina (BioChimico®) (80 mg/kg/ml), a xilazina (Sigma-Aldrich®, EUA)
(10 mg/kg/ml), o cloridrato de lidocaína 2% (Xylestesin®, Cristália) (0,2 ml/ por
animal), a flunixina meglumina 5% (Banamine®, MSD) (0,2 ml/ por animal) e uma
combinação de antibióticos (benzilpenicilina benzatina, benzilpenicilina procaína,
benzilpenicilina potássica, diidroestreptomicina base e espreptomicina base)
(Pentabiótico®, Zoetis - Fort Dodge) de uso veterinário para animais de pequeno
porte (0,2 ml/ por animal). Por fim, durante a perfusão foi empregado tiopental sódico
(Thiopentax®, Cristália) (100 mg/kg) para indução da anestesia.
34
3.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
3.3.1 CIRURGIA ESTEREOTÁXICA PARA O IMPLANTE DA CÂNULA GUIA
Os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina (80 mg/kg/ml) e
xilazina (10 mg/kg/ml) e em seguida foi realizada a tricotomia da região posterior da
cabeça para facilitar a execução dos procedimentos posteriores. O próximo passo
consistiu em fixar o animal no estereotáxico com a barra de incisivos a 2,5 mm
abaixo da linha interaural. Com o animal já fixado no aparelho, foi feita a
higienização da porção posterior da cabeça, da região da coxa e da região dorsal do
tronco do animal com solução de iodopovidona a 10 % (PVP-I) para a administração
subcutânea de 0,2 ml de cloridrato de lidocaína a 2% (anestésico local), para a
injeção intramuscular de 0,2 ml do Pentabiótico® e a administração subcutânea de
0,2 ml de Banamine® 5% (analgésico, anti-inflamatório e antipirético),
respectivamente. Em seguida, foram realizadas uma incisão na pele da porção
posterior da cabeça e a limpeza da superfície do crânio com H2O2 a 3%, a fim de
evitar infecções, melhorar a visualização das suturas e, assim, permitir a perfuração
de dois orifícios na calota craniana. O primeiro orifício destinou-se à fixação do
parafuso de aço inoxidável cuja função consiste em auxiliar na sustentação do
capacete de acrílico a ser produzido no final do processo. O segundo orifício foi
produzido com a intenção de permitir a implantação da cânula guia constituída de
aço inoxidável com 12 mm de comprimento e 0,7 mm de diâmetro no mesencéfalo
do rato, numa região 2 mm acima da substância cinzenta periaquedutal dorsal
(SCPD). O procedimento para a determinação do local onde deveria ser introduzida
a cânula foi realizado antes da confecção do segundo orifício. Esse procedimento
consistiu em posicionar a cânula fixada na haste do estereotáxico sobre o ponto de
encontro das suturas sagital e lambdóide e deslocá-la 1,9 mm lateralmente para a
Fonte: http://goo.gl/l0IAit .Fonte: CHONG;CHOO, 2010
Figura 3 - Dolasetron. Figura 4 - mCPBG.
35
esquerda, sob um ângulo de 22°. Em seguida, o orifício foi perfurado nesse ponto e
a cânula foi introduzida 3,2 mm abaixo da superfície do crânio. Após a colocação da
cânula no posicionamento desejado, foi confeccionado o capacete de acrílico
autopolimerizante, com a função de fixar a cânula na coordenada almejada. Por fim,
foi introduzido na cânula um mandril de aço inoxidável de mesmo tamanho para
evitar a entrada de detritos, sendo retirado apenas no dia do teste (PAXINOS;
WATSON, 2005).
3.3.2 HABITUAÇÃO
Esse procedimento consistiu na manipulação do animal durante 5 minutos e
após esse período, o animal foi colocado numa caixa de 30 cm x 19 cm x 13 cm por
mais 5 minutos, sendo essa mesma caixa utilizada no procedimento de microinjeção
de substâncias e, ao terminar essa etapa, o animal foi devolvido para a caixa de
origem (41 cm x 34 cm x 16 cm). A finalidade dessa tarefa consistiu em habituar o
animal às condições de experimentação que serão empregadas no dia do teste. Por
fim, essa atividade foi realizada nos dois dias que antecederam o teste do labirinto
em cruz elevado (LCE) e no mesmo período do dia em que os experimentos foram
realizados (08:00-13:00).
3.3.3 MICROINJEÇÃO INTRA-SCPD
Para a microinjeção de drogas na SCPD foi necessário a preparação de um
sistema de infusão composto por uma seringa de Hamilton de 54,10 mm de
comprimento e 10 µl de volume, uma bomba de infusão (Insight®), tubos de
polietileno e agulhas gengivais de 14 mm de comprimento. Assim, para criar o
ambiente necessário para a administração de substâncias, a seringa de Hamilton foi
acomodada na bomba de infusão e a sua extremidade foi conectada a um tubo de
polietileno, o qual também foi conectado a uma agulha gengival na outra
extremidade. Em seguida, o êmbolo da seringa foi deslocado para a formação de
uma bolha dentro do tubo de polietileno, a fim de impedir o contato da droga com a
água destilada previamente utilizada para a limpeza do sistema, evitando assim
alterações na concentração do fármaco. Após a formação da bolha, a agulha
36
gengival foi colocada num tubo de microcentrífuga (eppendorf) contendo a droga e a
mesma foi aspirada com o auxílio da seringa de Hamilton. O próximo passo consistiu
em proceder com a infusão da droga, através da inserção da agulha gengival na
cânula do animal, o qual foi alojado na mesma caixa utilizada no dia da habituação
(30 cm x 19 cm x 13 cm). Durante todo o procedimento de infusão o animal pôde
percorrer livremente a caixa enquanto o fármaco estava sendo infundido. Além
disso, o tempo (2 minutos) e o volume de injeção (0,2 µl) foram controlados pela
bomba de infusão. Após o tempo necessário para realizar a microinjeção, a agulha
permaneceu por mais um minuto no local de injeção a fim de evitar o refluxo da
droga.
3.4 APARATOS EXPERIMENTAIS
3.4.1 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE)
O LCE é um aparato de madeira elevado a 50 cm do solo constituído por dois
braços fechados (com barreiras de 40 cm de altura) que se cruzam
perpendicularmente com dois braços abertos (sem paredes), de mesmas dimensões
(50cm x 10cm) (figura 5). Além disso, as laterais dos braços abertos são constituídas
de pequenos batentes feitos de material acrílico transparente de 0,5cm cuja função é
evitar a queda do animal durante o experimento. A iluminação empregada no teste
foi de baixa intensidade (luz vermelha fluorescente de 15W) e o experimento foi
realizado durante a fase clara do ciclo claro e escuro (08:00-13:00). Durante a
realização do teste o animal foi colocado no centro do aparato, que é desprovido de
paredes, com a cabeça voltada para um dos braços fechados e os seus
comportamentos foram avaliados durante 5 minutos. Para proceder com a avaliação
desses comportamentos, o período em que o animal ficou no labirinto foi gravado
por uma câmera de segurança para posterior análise dos parâmetros
comportamentais relativos à ansiedade, tais como: a porcentagem de entrada nos
braços abertos [(número de entradas nos braços abertos/ entradas no centro +
entradas no aberto + entradas fechado) x 100], a porcentagem de tempo nos braços
abertos [(tempo nos braços abertos/300 x 100)] e o número absoluto de entradas e
tempo nos braços abertos (HANDLEY; MITHANI, 1984, PELLOW ET AL, 1985).
Além desses parâmetros convencionais, foram investigados parâmetros etológicos
37
como a postura de esticar o corpo (PEC) protegido e o retorno aos braços fechados
(RBF). O primeiro consiste num comportamento exploratório no qual o animal estica-
se para frente e depois retorna a posição original sem se locomover. Esse
comportamento foi avaliado quando o animal estava dentro dos braços fechados ou
na plataforma central do labirinto. Já o RBF é um comportamento no qual o animal
sai do braço fechado com as duas patas dianteiras e, em seguida, retorna ao
mesmo braço (RODGERS; JOHNSON, 1995). Por fim, com relação aos parâmetros
de locomoção foram analisados o número absoluto de entradas nos braços fechados
e o total de entradas (entradas no centro + entradas no aberto + entradas fechado).
Após o teste de cada animal, o aparato foi limpo cuidadosamente com uma solução
de álcool 5% (HANDLEY; MITHANI, 1984, PELLOW ET AL, 1985).
3.4.2 CAMPO ABERTO
O campo aberto (CA) é uma caixa cúbica (60 cm x 60 cm x 60 cm) com
paredes internas brancas e base preta (figura 6). A iluminação empregada no teste
foi a luz branca indireta e o experimento foi realizado durante a fase clara do ciclo
claro e escuro (08:00-13:00). Durante a realização do teste o animal foi colocado no
centro do CA e os seus comportamentos foram avaliado durante 15 minutos. Para
Figura 5 - Labirinto em cruz elevado.
Fonte: Laboratório de Farmacologia Comportamental (DBF-UFRN)
38
proceder com a avaliação desses comportamentos, o período em que o animal ficou
no CA foi registrado por uma câmera de segurança para posterior análise dos
parâmetros comportamentais relativos à ansiedade e à locomoção pelo programa
ANY-maze (Stoelting, USA). Com relação à ansiedade foram avaliados o número de
entradas, o tempo e a distância percorrida na região central do CA durante os
primeiros 5 minutos e com relação à locomoção foi avaliado a distância percorrida
pelo animal em todo o aparato durante 15 minutos. Após o teste de cada animal, o
aparato foi limpo cuidadosamente com uma solução de álcool 5% (HALL, 1934).
3.5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Decorridos de 6 a 7 dias do término da cirurgia, os ratos foram submetidos aos
testes comportamentais (figura 7).
Fonte: adaptado de http://goo.gl/w5Jm8N
Figura 6 - Campo aberto.
Figura 7 – Fluxograma geral das etapas metodológicas empregadas no trabalho
Fonte: Autor
39
3.5.1 EXPERIMENTO 1
No experimento 1 os ratos foram microinjetados na SCPD com o antagonista
do receptor 5-HT3 dolasetron nas doses de 100 ng/0,2µl/2 minutos, 500 ng/0,2µl/2
minutos e 1000 ng/0,2µ/2 minutos ou com salina (0,2 µl/2 minutos). Após 10
minutos, os animais foram colocados no centro do LCE e seus comportamentos
foram avaliados durante 5 minutos. Vinte e quatro horas depois, os animais
receberam as mesmas doses com que foram microinjetados no dia anterior na
SCPD e após 10 minutos foram colocados no CA e seus comportamentos foram
avaliados durante 15 minutos (figura 8).
3.5.2 EXPERIMENTO 2
No experimento 2 os ratos foram microinjetados na SCPD com o agonista do
receptor 5-HT3 mCPBG nas doses de 2,5 µg/ 0,2µl/2 minutos, 5 µg/0,2µl/2 minutos e
10 µg/0,2µl/ 2 minutos ou com salina (0,2 µl/2 minutos). Após 5 minutos, os animais
foram colocados no centro do LCE e seus comportamentos foram avaliados durante
5 minutos. Vinte e quatro horas depois, os animais receberam as mesmas doses
com que foram microinjetados no dia anterior na SCPD e após 5 minutos foram
Figura 8 – Fluxograma do experimento 1
Fonte: Autor
40
colocados no CA e seus comportamentos foram avaliados durante 15 minutos
(figura 9).
3.6 PERFUSÃO
Com a finalização dos testes comportamentais, os animais foram anestesiados
com tiopental sódico (100 mg/kg) e submetidos à perfusão intracardíaca com salina.
Em seguida, foi realizada a infusão do corante azul de metileno (0,2 µl/2 minutos) via
cânula para a marcação do sítio de injeção. Após essa etapa, os encéfalos foram
removidos e armazenados numa solução de formol 10% para posterior análise
histológica.
3.7 HISTOLOGIA
Nessa última etapa do experimento, os encéfalos obtidos durante a perfusão
foram cortados em secções coronais de 50 µm por meio de um criostato (Leica
CM1510S) e dispostos numa lâmina. O objetivo dessa etapa consistiu em verificar a
localização do sítio de injeção e determinar se a microinjeção foi realizada na SCPD
através da comparação com as figuras do atlas de George Paxinos e Charles
Watson, as quais compreenderam o intervalo entre a figura 92 (interaural: 1,92 mm e
Figura 9 – Fluxograma do experimento 2
Fonte: Autor
41
bregma: -7,08 mm) e a figura 100 (interaural: 0,96 mm e bregma: -8,04 mm)
(PAXINOS; WATSON, 2005). Apenas os animais que tiveram sítio de injeção
localizado na SCPD foram considerados para a análise estatística.
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos no LCE e CA foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) de uma via e, quando houve diferenças significativas entres os grupos, o
teste de Duncan foi empregado.
42
4 RESULTADOS
4.1 HISTOLOGIA
Os sítios de microinjeção na substância cinzenta periaquedutal dorsal (SCPD)
estão representados na figura 10. Durante a realização de todos os experimentos
foram utilizados 191 animais dos quais 79 obtiveram canulação positiva para SCPD.
Desses, 44 animais correspondiam ao experimento 1 e 35 animais correspondiam
ao experimento 2.
Figura 10 - Representação esquemática dos sítios de microinjeção na SCPD de ratos. O número de pontos observados é menor que o número total de animais com
canulação positiva devido às sobreposições.
Fonte: adaptado de PAXINOS; WATSON, 2005.
43
4.2 EXPERIMENTO 01: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO DOLASETRON NA
SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO LCE.
A análise de variância ANOVA mostrou que os tratamentos com dolasetron nas
doses de 100 ng, 500 ng e 1000 ng não geraram diferenças significativas na
porcentagem de entrada [F (3,43) = 0,06; p = 0,979] e de tempo [F(3,43) = 0,12; p =
0,944] nos braços abertos do LCE (figura 11). Com relação ao número absoluto de
entradas [F(3,43) = 0,28; p = 0,839] e tempo [F(3,43) = 0,12; p = 0,944] nos braços
abertos também não foram observadas diferenças significativas entre os grupos
(tabela 1).
Além disso, nenhuma das doses alterou a atividade locomotora dos animais, o
que foi percebido pela análise do número de entradas nos braços fechados [F(3,43)
= 0,80; p = 0,498] e do número total de entradas [F(3,43) = 0,85; p = 0,470] (tabela
1).
Já com relação aos índices etológicos, a análise de variância ANOVA mostrou
que não houve diferença significativa entre os grupos para os parâmetros: postura
de esticar o corpo protegido (PEC) [F(3,43) = 0,37; p = 0,770] e retorno aos braços
fechados (RBF) [F(3,43) = 0,13; p = 0,938] (tabela 2).
Sal
ina
100n
g
500n
g
1000
ng
0
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20
30
Dolasetron
% t
em
po
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raço
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Fig.8A
Sal
ina
100n
g
500n
g
1000
ng
0
5
10
15
20
25
Dolasetron
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a
no
s b
raço
s a
bert
os
Fig.8B
Figura 11 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre a porcentagem de entradas (fig. 8A) e tempo (fig. 8B) nos braços abertos do LCE. Os
dados representam a média ±EPM. N = 8-13. Análise estatística: ANOVA.
44
Comportamentos Dolasetron
Salina 100 ng 500 ng 1000 ng
Nº entradas braços abertos 4,55 ±1,12 4,00 ±1,10 4,17 ±0,84 3,13 ±0,85
Tempo braços abertos (s) 65,73 ±16,47 62,31 ±18,15 64,67 ±12,48 51,63 ±16,34
Nº entradas braços fechados 8,18 ±0,88 7,85 ±0,88 8,33 ±0,84 6,38 ±0,96
Total de entradas 24,36 ±2,88 21,85 ±2,66 23,67 ±2,45 18,00 ±3,29
S = segundos. Os dados representam a média ±EPM. N = 8-13. Análise estatística: ANOVA.
Comportamentos
etológicos
Dolasetron
Salina 100 ng 500 ng 1000 ng
PEC 1,00 ±0,50 0,69 ±0,29 0,50 ±0,23 0,63 ±0,32
RBF 1,64 ±0,86 1,23 ±0,61 1,08 ±0,48 1,13 ±0,79
PEC = postura de esticar o corpo protegido e RBF = retorno aos braços fechados. Os dados representam a média ±EPM. N = 8-13. Análise estatística: ANOVA.
4.3 EXPERIMENTO 01: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO DOLASETRON NA
SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO CA.
Segundo a análise de variância ANOVA, a microinjeção de dolasetron intra-
SCPD, nas doses 100 ng, 500 ng e 1000 ng, não alterou a atividade locomotora dos
ratos, o que pode ser constatado pela ausência de diferença significativa entre as
doses no parâmetro distância percorrida [F(3,36) = 1,91; p =0,146] (tabela 3).
Já com relação aos índices de ansiedade avaliados no CA, a ANOVA
demonstrou que não houve diferença significativa entre os grupos para as variáveis:
número de entradas no centro [F(3,36) = 1,73; p = 0,178], tempo no centro [F(3,36) =
0,40; p = 0,747] e distância percorrida no centro [F(3,36) = 1,21; p = 0,321] (tabela
4).
Tabela 1 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre o número de entradas e tempo nos braços abertos, número de entradas nos braços
fechados e número total de entradas do LCE
Tabela 2 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre os índices etológicos do LCE.
45
Comportamentos Dolasetron
Salina 100 ng 500 ng 1000 ng
Distância percorrida (m) 17,53 ±2,44 17,15 ±2,43 23,93 ±4,82 12,39 ±2,23
M = metros. Os dados representam a média ±EPM. N = 6-13. Análise estatística: ANOVA.
Comportamentos Dolasetron
Salina 100 ng 500 ng 1000 ng
Nº entradas no centro 1,73 ±0,38 3,23 ±0,69 2,83 ±1,11 1,43 ±0,48
Tempo no centro (s) 2,80 ±0,63 4,40 ±1,49 4,65 ±1,52 4,73 ±2,11
Distância percorrida no centro
(m)
0,26 ±0,08 0,55 ±0,17 0,60 ±0,23 0,30 ±0,14
S = segundos e M = metros. Os dados representam a média +EPM. N = 6-13. Análise estatística: ANOVA.
4.4 EXPERIMENTO 02: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO mCPBG NA SCPD
DE RATOS SUBMETIDOS AO LCE.
Os efeitos da microinjeção de mCPBG sobre os parâmetros convencionais de
ansiedade podem ser visualizados na figura 12. Através da análise de variância
ANOVA notou-se que houve diferenças significativas entre os grupos para
porcentagens de entradas [F(3,34) = 3,85; p = 0,019] e tempo [F(3,34) = 3,15; p=
0,039] nos braços abertos. Em seguida, o teste de post hoc de Duncan especificou
essas distinções demonstrando que os tratamentos com as doses de 10 µg e de 5
µg promoveram o aumento das porcentagens de entrada e tempo nos braços
abertos, comparando-se os valores correspondentes ao grupo controle. Assim, para
essas doses, o mCPBG promoveu efeito ansiolítico em ratos. Já a dose de 2,5 µg
não diferiu de forma significativa do controle.
Já com relação à outras medidas espaço-temporais, como a frequência
[F(3,34) = 4,86; p = 0,007] e tempo [F(3,34) = 3,15; p = 0,039] nos braços abertos, a
Tabela 3 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre o índice de locomoção do CA.
Tabela 4 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre os parâmetros de ansiedade avaliados no CA.
46
análise demonstrou que há diferenças significativas entre os grupos. De forma
semelhante às variáveis anteriores, o teste de Duncan revelou que as doses de 10
µg e de 5 µg promoveram aumento da frequência e tempo nos braços abertos, ao
passo que a dose de 2,5 µg não alterou esses comportamentos (tabela 5).
Para as medidas etológicas, a análise estatística ANOVA não demonstrou
diferenças significativas entre os grupos para todos os parâmetros avaliados:
postura de esticar o corpo protegido (PEC) [F(3,34) = 1,28; p = 0,295] e retorno aos
braços fechados (RBF) [F(3,34) = 0,38; p = 0,763] (tabela 6).
Por fim com relação à atividade locomotora, a análise de variância ANOVA
indicou que nenhum dos grupos diferiu significativamente no parâmetro número de
entradas nos braços fechados [F(3,34) = 1,72; p = 0,182] e que houve diferença
significativa entre os grupos para o numero total de entradas [F(3,34) = 3,19; p =
0,037]. Contudo, o teste de post hoc de Duncan demonstrou que os grupos tratados
não se distinguiam estatisticamente do grupo salina, de modo que a diferença
observada na ANOVA se referia apenas a uma distinção entre os grupos que
receberam as doses de mCPBG. Portanto, a microinjeção do mCPBG não promoveu
alteração locomotora nos animais tanto para o número total de entradas quanto para
o número de entradas nos braços fechados, quando comparado ao controle (tabela
5).
Sal
ina
2,5µ
g5µ
g
10µg
0
10
20
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mCPBG
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Sal
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mCPBG
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os
Fig.9A
*
Fig.9B
* * *
Figura 12. Efeito do mCPBG (2,5 µg, 5 µg e 10 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre a porcentagem de entradas (fig. 9A) e tempo (fig. 9B) nos braços abertos do LCE. Os dados
representam a média ±EPM. N = 08-09. Análise estatística: ANOVA seguida de teste de Duncan. * P < 0,05 comparado ao grupo salina.
47
Comportamentos mCPBG
Salina 2,5 µg 5 µg 10 µg
Nº entradas braços abertos 3,88 ±0,69 3,89 ±1,11 7,56 ±0,88* 7,22 ±0,89*
Tempo braços abertos (s) 54,00 ±11,33 60,56 ±17,47 103,44 ±15,58* 109,56 ±17,99*
Nº entradas braços fechados 8,50 ±0,82 6,22 ±0,68 7,00 ±0,62 7,33 ±0,71
Nº total de entradas 24,50 ±2,63 20,89 ±2,35 29,22 ±1,53 29,11 ±2,49
S = segundos. Os dados representam a média ±EPM. N = 08-09. Análise estatística: ANOVA seguida de teste de Duncan. * P < 0,05 comparado ao grupo salina.
Comportamentos etológicos mCPBG
Salina 2,5 µg 5 µg 10 µg
PEC 1,00 ±0,50 0,67 ±0,33 0,22 ±0,22 0,22 ±0,22
RBF 0,75 ±0,31 0,33 ±0,33 0,33 ±0,24 0,44 ±0,34
PEC = postura de esticar o corpo protegido e RBF = retorno aos braços fechados. Os dados
representam a média +EPM. N = 08-09. Análise estatística: ANOVA.
4.5 EXPERIMENTO 02: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO mCPBG NA SCPD
DE RATOS SUBMETIDOS AO CA.
Após a análise de variância ANOVA, nenhuma diferença significativa foi
observada entre os grupos para a variável distância percorrida, a qual avalia a
atividade locomotora dos animais no CA [F(3,20) = 1,74; p = 0,195] (tabela 7).
Com relação aos índices de ansiedade avaliados no CA, a ANOVA seguida
do teste de Duncan também demostrou não haver diferenças significativas entre os
grupos para todas as variáveis testadas: número de entradas no centro [F(3,20) =
0,92; p = 0,449], distância percorrida no centro [f(3,20) = 0,12; p = 0,944] e tempo no
centro [f(3,20) = 1,72; p = 0,199] (tabela 8).
Tabela 5 - Efeito do mCPBG (2,5 µg, 5 µg e 10 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre o número de entradas e tempo nos braços abertos (valores absolutos), número de entradas nos
braços fechados e número total de entradas do LCE.
Tabela 6 - Efeito do mCPBG (2,5 µg, 5 µg e 10 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre os índices etológicos do LCE.
48
Comportamentos mCPBG
Salina 2,5 µg 5 µg 10 µg
Distância percorrida (m) 16,64 ±2,88 19,50 ±6,17 15,12 ±2,00 25,11±1,26
Os dados representam a média +EPM. N = 05-06. Análise estatística: ANOVA.
Comportamentos mCPBG
Salina 2,5 µg 5 µg 10 µg
Nº entradas no centro 2,20 ±0,73 2,20 ±0,37 3,60 ±0,68 3,67 ±1,20
Tempo no centro (s) 1,18 ±0,39 5,96 ±2,19 4,26 ±1,01 4,02 ±1,57
Distância percorrida no centro
(m)
0,44 ±0,16 0,46 ±0,15 0,48 ±0,08 0,73 ±0,27
Os dados representam a média +EPM. N = 05-06. Análise estatística: ANOVA.
Tabela 7 - Efeito do mCPBG (10 µg, 5 µg e 2,5 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre o índice de locomoção do CA.
Tabela 8 - Efeito do mCPBG (10 µg, 5 µg e 2,5 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre os parâmetros de ansiedade avaliados no CA
49
5 DISCUSSÃO
O objetivo desse trabalho foi investigar a função dos receptores 5-HT3
presentes na SCPD na modulação de comportamentos relativos à ansiedade
experimental produzidos pela exposição de ratos ao LCE.
No experimento 1 foi possível constatar que o dolasetron, um antagonista
seletivo de receptores 5-HT3 (Ki: 20,03 ±6,58 nM) (MILLER ET AL.,1993;
BOEIJINGA ET AL., 1992), para todas as doses testadas, não modificou os
comportamentos relativos à ansiedade no LCE e no CA, e que essa ausência de
efeitos não está relacionada às alterações na locomoção do animal. Com relação à
avaliação etológica do comportamento no LCE, como o retorno aos braços fechados
(RBF) e a postura de esticar o corpo (PEC), a mesma tem se mostrado uma
ferramenta auxiliar na interpretação dos resultados relativos à ansiedade no LCE
(RODGERS; JOHNSON, 1995; GRIEBEL, 1997). Assim, a microinjeção do
dolasetron na SCPD, para todas as doses testadas, não alterou de forma
significativa os valores do PEC protegido e do RBF, ratificando os resultados obtidos
com as análises convencionais do LCE. Com isso, é possível inferir que, nas
condições experimentais aqui descritas, a ativação do receptor 5-HT3 parece não
estar sendo requerida para a execução dos comportamentos relativos à ansiedade
gerados pela exposição ao LCE.
Em outro estudo demonstrou-se que a microinjeção isolada de um antagonista
(ondansetron) e de um agonista (mCPBG) do receptor 5-HT3 na SCP de
camundongos produziu efeito ansiogênico e ausência de efeito, respectivamente, no
LCE (SILVA, 2009). Tendo em vista a ausência de efeito para o agonista, investigou-
se se haveria alguma interação entre os receptores 5-HT3 e 5-HT2 da SCP com
relação à ansiedade avaliada no LCE. Com isso, demonstrou-se que a microinjeção
prévia do ondansetron na SCP bloqueou o efeito ansiolítico do agonista do receptor
5-HT2B/2C mCPP, observado quando o mesmo foi microinjetado isoladamente na
SCP de camundongos (SILVA, 2009). Assim, os autores sugeriram que poderia
existir uma interação entre os receptores 5-HT3 e 5-HT2B/2C da SCP na modulação
da ansiedade de camundongos avaliada no LCE (SILVA, 2009).
50
Os resultados obtidos por Silva e colaboradores (2009) diferenciaram-se do
obtido nesse trabalho e a razão para essa distinção pode estar assentada no
emprego de espécies de animais diferentes e condições metodológicas distintas, os
quais podem influenciar as respostas comportamentais e os efeitos farmacológicos
observados no LCE (CAROBREZ; BERTOGLIO, 2005). Como exemplo, no presente
trabalho utilizou-se um LCE de madeira e luz vermelha de baixa intensidade para a
iluminação da sala experimental, enquanto que no estudo supracitado foi utilizado
um LCE feito de vidro transparente e luz branca de baixa intensidade (77 lux). Nesse
sentido, foi observado que o diazepam produziu efeito ansiolítico mais contundente,
quando administrado perifericamente em ratos submetidos a condições
experimentais de baixa luminosidade (luz vermelha) e testados no LCE com braços
fechados de madeira do que quando submetido a outras condições experimentais
(braços fechados de material transparente com luz de alta ou baixa intensidade e
braços fechados de material opaco com luz de alta intensidade) (VIOLLE, 2009).
Assim, as condições experimentais empregadas no presente estudo estão de acordo
com as escolhas metodológicas citadas acima, as quais favoreceram o efeito
ansiolítico do Diazepam. Além disso, Silva e colaboradores (2009) realizaram a
microinjeção dos ligantes do receptor 5-HT3 em uma região não especificada da
SCP o que poderia gerar resultados variados, uma vez que a SCP é dividida em
quatro colunas paralelas ao aqueduto de Sylvius, que podem apresentar funções
distintas (CARRIVE, 1993; LINNMAN ET AL., 2012; BRANDÃO ET AL, 2003;
VIANNA; LANDEIRA-FERNANDEZ; BRANDÃO, 2001).
Curiosamente, de forma semelhante aos resultados obtidos com o dolasetron,
a microinjeção isolada de outros antagonistas serotonérgicos na SCPD, como os
antagonistas dos receptores 5-HT2A/2C (espiperona e ketanserina) e 5-HT1A (NAN-
190), também não alterou o comportamento de ratos avaliados no teste da
estimulação elétrica da SPCD (NOGUEIRA; GRAEFF, 1995; SCHÜTZ; AGUIAR;
GRAEFF, 1985). Contudo, quando os antagonistas dos receptores 5-HT2A/2C e do 5-
HT1A foram microinjetados antes dos agonistas do receptor 5-HT2 (DOI) e do 5-HT1A
(8-OH-DPAT), respectivamente, ou da própria serotonina, conseguiam reverter o
efeito antiaversivo dos agonistas (NOGUEIRA; GRAEFF, 1995; SCHÜTZ; AGUIAR;
GRAEFF, 1985). Além disso, o mesmo foi observado em modelos etológicos quando
a microinjeção isolada dos antagonistas dos receptores 5-HT1A, 5-HT2A e 5-HT2C
51
também não produziu efeitos no LTE; contudo a microinjeção prévia desses
antagonistas conseguiu bloquear o efeito antiaversivo da serotonina sobre a fuga no
LTE (SOARES; ZANGROSSI, 2004). É importante salientar que a fuga observada
no modelo de estimulação elétrica da SCPD e no LTE vem sendo relacionada ao TP
e configura-se como um modelo para o estudo representativo desse transtorno
(SCHENBERG ET AL., 2001; GRAEFF; NETTO; ZANGROSSI, 1998). Em outro
trabalho, a microinjeção de um antagonista do receptor 5-HT1A (WAY-100135) na
SCPD de ratos também não alterou os índices de ansiedade do LCE (MORAES;
BERTOGLIO; CAROBREZ, 2008). O mesmo ocorreu com a microinjeção da
ketanserina (antagonista de receptor 5-HT2A/2C) na SCP de camundongos avaliados
no LCE (NUNES-DE-SOUZA ET AL., 2008). Portanto, os resultados obtidos por
esses autores, juntamente com os encontrados nesse trabalho, reforçam a ideia de
que a serotonina realiza um controle regulatório fásico sobre os neurônios da SCPD.
Ou seja, a ativação dos receptores serotonérgicos da SCPD, inclusive o receptor 5-
HT3, parece não se realizar de forma contínua na modulação de respostas de
ansiedade (GRAEFF, 2004; GRAEFF, 2002).
Com relação aos estudos que empregaram a administração periférica de
antagonistas do receptor 5-HT3 observaram-se alguns resultados contraditórios. De
fato, a administração periférica do zacopride, do BRL 46470, do tropisetron, do MDL
72222, do granisetron ou do ondansetron (antagonistas de receptor 5-HT3) não
promoveu efeitos relacionados à ansiedade em ratos testados no LCE (SETEM ET
AL, 1999; FILE; JOHNSTON, 1989; WRIGHT, 1992; GRIEBEL ET AL., 1997) e no
TIS (FILE; JOHNSTON, 1989), ao passo que administração intraperitoneal ou oral
desses antagonistas gerou efeitos ansiolíticos em outros estudos empregando tanto
o LCE (DUNN; CARLEZON; CORBETT, 1991; ANDREWS; FILE, 1993;
BLACKBURN ET AL, 1993; FILIP ET AL, 1992) quanto o TIS (DUNN; CARLEZON;
CORBETT, 1991; BLACKBURN ET AL, 1993; JONES, 1988). Além disso, ratos
administrados perifericamente com o BRL46470 e o Y-25130 (antagonistas do
receptor 5-HT3) também exibiram efeito ansiolítico quando testados no LTE
(GARGIULO ET AL, 1996) e no labirinto em zero elevado (BELL ET AL, 2014).
Assim, os dados obtidos no presente estudo sugerem que os receptores 5-HT3 da
SCPD provavelmente não estão envolvidos com os efeitos ansiolíticos observados
com a administração periférica de antagonistas do receptor 5-HT3 em ratos.
52
Uma questão interessante é o fato de que o LCE é tido como um modelo misto,
pois o animal pode emitir diferentes reações de defesa, como a esquiva e a fuga dos
braços abertos, ao percorrer livremente o labirinto. Assim, sabendo-se que as vias
serotonérgicas estão relacionadas à modulação dessas reações de defesa, o efeito
dos fármacos sobre os receptores serotonérgicos poderia variar de acordo com a
predominância ou não de uma determinada reação de defesa durante o teste
(GRAEFF, 2002; HANDLEY, 1993). Do ponto de vista desse trabalho, a ausência de
efeito do dolasetron também poderia ser explicada pelos múltiplos comportamentos
de defesa que poderiam ocorrer no LCE. Sendo assim, sob essa ótica, seria
pertinente verificar os efeitos do dolasetron no LTE, um modelo que permite avaliar
dois comportamentos de defesa separadamente num mesmo animal (esquiva
inibitória e a fuga), a fim de confirmar os resultados obtidos no LCE.
Em relação especificamente aos ligantes do receptor 5-HT3, somando-se ao
fato sugerido acima, é possível que a ausência de efeito do dolasetron no presente
estudo também possa estar relacionada a uma maior afinidade do dolasetron por
uma determinada subunidade do receptor 5-HT3. De fato sabe-se que o receptor 5-
HT3 é um canal iônico constituído por cinco subunidades dispostas ao redor de um
poro central, cujo arranjo pode variar de acordo com a presença ou não de alguma
das diferentes subunidades já identificadas (5-HT3A, 5-HT3B, 5-HT3C, 5-HT3D e 5-
HT3E) (WALSTAB; RAPPOLD; NIESLER, 2010). Além disso, já foi demonstrado que
para estabelecer uma configuração funcional é necessário que ao menos a
subunidade 5-HT3A esteja presente no receptor. Assim, é possível formar
receptores homoméricos constituídos apenas da subunidade 5-HT3A e receptores
heteroméricos constituídos pela combinação de uma subunidade 5-HT3A com outra
de tipo diferente (LUMMIS, 2012; NIESLER ET AL., 2007).
É interessante notar que, através da técnica de ensaio de ligação do ligante
(ligand binding assay), a afinidade do mCPBG, um agonista do receptor 5HT3, ou da
própria serotonina é diferente entre os receptores homoméricos contendo
subunidade 5-HT3A (mCPBG: 0,15 µM e serotonina: 0,42 µM) e receptores
heteroméricos formados pelas subunidades 5-HT3A e 5-HT3B (mCPBG: 0,43 µM e
serotonina: 2,69 µM), sendo essa afinidade maior entre os integrantes do primeiro
tipo de receptor (THOMPSON; LUMMINS, 2013). O mesmo foi observado para um
antagonista do receptor 5-HT3, o VUF10166, que também apresentou afinidades
53
distintas entre os receptores homopentâmeros formados pelas subunidades 5-HT3A
(Ki: 0,04 nM) e heteropentâmeros que continham as subunidades 5-HT3A e 5-HT3B
(Ki: 22 nM), sendo essa afinidade muito superior em receptores homoméricos
(THOMPSON ET AL., 2012). Assim, tendo em vista a variedade de subunidades
existentes e os diferentes resultados obtidos entre receptores homoméricos e
heteroméricos, seria interessante investigar quais subtipos de receptor 5-HT3 estão
presentes na SCPD de ratos e promover ensaios de ligação do ligante envolvendo o
dolasetron e esses subtipos identificados, a fim de assegurar que a ausência de
efeito do dolasetron não esteja relacionada a uma maior afinidade desse antagonista
por um subtipo de receptor que não esteja presente na SCPD.
Já com relação às administrações intracérebro de antagonistas do receptor
5HT3 tem-se observado resultados variados de acordo com a região em que eles
foram administrados. Dessa forma, com relação à amígdala, os antagonistas
ondansetron, MDL 72222 e tropisetron causaram efeito ansiolítico em ratos testados
no TIS, ao passo que a microinjeção da serotonina ou do agonista do receptor 5-
HT3, o 2-Me 5-HT, causou efeito ansiogênico nesse mesmo teste (HIGGINS ET AL.,
1991). Em camundongos, foi possível constatar que o ondansetron e o mCPBG
(agonista de receptor 5-HT3) microinjetados na amígdala causaram efeitos ansiolítico
e ansiogênico, respectivamente, no LCE. Além disso, a microinjeção prévia do
ondansetron seguida da injeção local do mCPBG foi capaz de reverter o efeito
ansiogênico gerado por esse agonista quando microinjetado isoladamente na
amígdala de camundongo (LAINE, 2010). Com esses resultados, foi possível inferir
que a serotonina através da ativação de receptores 5-HT3 parece contribuir com o
seu efeito ansiogênico na amígdala. Além disso, esses resultados corroboram
alguns estudos com administração periférica que atribuíram efeito ansiolítico aos
antagonistas de receptores 5-HT3 (LAINE, 2010; HIGGINS ET AL., 1991). Por outro
lado, quando antagonistas do receptor 5-HT3 foram microinjetados no NDR de ratos
não alteraram os parâmetros de ansiedade no TIS (HIGGINS ET AL., 1991). O
mesmo foi observado após a microinjeção do ondansetron e tropisetron no NMR,
núcleo accumbens, caudado e putâmen de camundongos avaliados teste de
transição claro e escuro (COSTAL ET AL., 1989b) o que leva a sugestão de que o
efeito ansiolítico observado pela administração periférica de antagonistas do
receptor 5-HT3 se deva à sua atuação sobre receptores 5-HT3 da amígdala.
54
Com relação ao experimento 2, a microinjeção do mCPBG, um agonista
seletivo dos receptores 5-HT3 (KILPATRICK ET AL, 1990), nas doses de 5 µg e de
10 µg, na SCPD produziu efeito ansiolítico por meio do aumento da porcentagem de
entrada e de tempo nos braços abertos do LCE, assim como nos seus respectivos
valores absolutos. Além disso, os animais testados com essas doses não
demonstraram alterações nos parâmetros de locomoção no LCE e no CA, de
maneira que os efeitos ansiolíticos observados não estão relacionados às alterações
locomotoras do animal. Com relação às medidas etológicas avaliadas no LCE,
houve diminuição, porém não significativa, da quantidade de PEC protegido e RBF
realizados pelos animais, sendo essa diminuição mais acentuada para o PEC nas
doses de 5 µg e de 10 µg. Essa diminuição é sugestiva de um perfil ansiolítico, que
concorda com os efeitos ansiolíticos das medidas clássicas obtidas para essas
doses.
Em relação aos parâmetros de ansiedade avaliados no CA, não houve
diferenças significativas para todas as doses de mCPBG testadas quando
comparadas ao grupo salina. A diferença de resultados entre o LCE (efeito
ansiolítico) e o CA (ausência de efeito), para as doses de 5µg e de 10µg pode ter
ocorrido em virtude da possibilidade desses modelos produzirem tipos de ansiedade
diferentes (CAROLA, 2002; GRAEFF; GUIMARÃES, 2005). Um fato interessante é
que o CA também é afetado por alterações nas condições experimentais como, por
exemplo, a idade do animal e a iluminação da sala experimental (PENG ET AL,
1994; BOUWKNECHT ET AL, 2007). Com relação à iluminação, assim como no
LCE, níveis baixos de luz são menos aversivos ao animal do que a luz de alta
intensidade (HALL ET AL, 2000; BOUWKNECHT ET AL, 2007) e, nesse trabalho, foi
utilizada a luz branca (de intensidade maior do que a luz vermelha usada no LCE)
durante a execução do CA. Portanto, sabendo-se que a luz de alta intensidade não
seria um interferente para detecção de drogas ansiolíticas (HOOG, 1996) e que
mCPBG produziu efeito ansiolítico no LCE, é possível que essa variação na
quantidade de iluminação não tenha alterado o resultado. Além disso, foi possível
notar que o mCPBG, para todas as doses testadas, aumentou o tempo em que o
animal passou na região central do CA. Assim, esse resultado reforça o efeito
ansiolítico das doses de 5µg e de 10µg observado no LCE, apesar do aumento do
valor dessa variável não ter sido significativo.
55
Nesse contexto, as administrações intracérebro foram uma ferramenta
imprescindível para o aprofundamento dos conhecimentos acerca do papel do
sistema serotonérgico na fisiopatologia da ansiedade. Assim, alguns autores
demonstraram que a serotonina na SCPD tem uma função antiaversiva na
modulação da fuga causada pela estimulação elétrica da SCPD (NOGUEIRA;
GRAEFF, 1995) e pela exposição ao LTE (ZANOVELI; NOGUEIRA; ZANGROSSI,
2003) e que, além disso, anormalidades nesse sistema poderiam estar relacionadas
ao TP (GRAEFF; NETTO; ZANGROSSI, 1998). Por outro lado, foi visto que a
serotonina na SCPD também produziu efeito ansiogênico na tarefa de esquiva
inibitória do LTE (ZANOVELI; NOGUEIRA; ZANGROSSI, 2003) e que desequilíbrios
nesse sistema poderiam estar relacionados ao TAG (GRAEFF; NETTO;
ZANGROSSI, 1998). Assim, a partir dos resultados obtidos pelos autores
supracitados, foi possível depreender que a SCPD não é uma estrutura
exclusivamente relacionada ao pânico (reações de fuga), como a princípio se
pensou, mas também com a ansiedade.
Esse elo entre a ansiedade e o sistema serotonérgico da SCPD também foi
revelado nesse trabalho, através do efeito ansiolítico produzido pelo mCPBG
microinjetado na SCPD de ratos testados no LCE.
De maneira similar aos resultados obtidos nesse estudo com o agonista do
receptor 5-HT3 (mCPBG), a microinjeção do agonista do receptor 5-HT1A (8-OH-
DPAT) na SCPD de ratos produziu efeito ansiolítico no parâmetro de esquiva
inibitória do LTE, o qual foi revertido pela microinjeção prévia do antagonista do
receptor 5-HT1A (WAY 100135) (SOARES; ZANGROSSI, 2004). Por outro lado, a
microinjeção de um agonista seletivo do receptor 5-HT2C, o MK-212, na SCPD de
ratos gerou efeito ansiogênico no LTE o qual foi bloqueado pela microinjeção prévia
de um antagonista seletivo do receptor 5-HT2C (YAMASHITA; BORTOLI;
ZANGROSSI, 2011). Assim, os receptores 5-HT3 e 5-HT1A parecem modular
respostas similares relativas à ansiedade na SCPD (efeito ansiolítico), as quais são
opostas a dos receptores 5-HT2C (efeito ansiogênico) (ZANOVELI; NOGUEIRA;
ZANGROSSI, 2003).
É interessante ressaltar que a afinidade do mCPBG é consideravelmente maior
por receptores 5-HT3 do que por outros subtipos de receptores serotonérgicos,
56
sendo necessário uma concentração 1000 vezes maior de mCPBG para que o
mesmo se ligue a receptores 5-HT1A e 5-HT2 (IC50 do mCPBG para os receptores 5-
HT3: 1,47 ±0,07nM, 5-HT1A: 10µM e 5-HT2: 10µM) (KILPATRICK ET AL., 1990).
Contudo, ainda que o mCPBG apresente elevada afinidade por receptores 5-HT3,
seria pertinente avaliar o efeito da microinjeção combinada do antagonista
(dolasetron) com o agonista (mCPBG) do receptor 5-HT3 na SCPD de ratos testados
no LCE, a fim de ratificar o envolvimento do receptor 5-HT3 na ação ansiolítica do
mCPBG.
Tendo em vista o exposto acima, uma possível explicação para efeito
ansiolítico do mCPBG microinjetado na SCPD poderia residir na relação entre
receptores 5-HT3 e os interneurônios GABAérgicos.
Sabe-se que a utilização de benzodiazepínicos (BDZs) no tratamento de
enfermidades relativas à ansiedade (principalmente o TAG, mas também o TP), pôs
em destaque o mais ubíquo sistema de neurotransmissão inibitório, o sistema
GABAérgico. Os BDZs, ao atuarem nos receptores GABAA (um dos receptores
desse sistema), potencializam a ação do neurotransmissor GABA, cujo um dos
efeitos consiste em ligar-se a esse receptor e causar a hiperpolarização da célula,
através de um influxo de cloro para o interior da mesma, gerando a inibição da
excitabilidade celular (DAVIDSON, 2004; SUSMAN; KLEE, 2005; RICKELS; RYNN,
2002; ATACK, 2005).
Dentro desse contexto, já foi demonstrado que interneurônios GABAérgicos
estão presentes em estruturas consagradamente relevantes para a fisiologia da
ansiedade, tais como: a SCPD, o hipocampo e a amígdala (MILLAN, 2003;
SPAMPANATO; POLEPALLI; SAH, 2011; KULLMANN, 2011; DEPAULIS;
BANDLER, 1991; REICHLING, 1991). Além disso, estudos pré-clínicos vêm
mostrando a relevância desse sistema para a ansiedade. De fato, já foi constatado
que a microinjeção de um agonista BZD (midazolam) na SCPD gerou efeito
ansiolítico em ratos testados no LCE (MOTTA; BRANDÃO, 1993; RUSSO, 1993) e
que a microinjeção prévia de um antagonista BZD (flumazenil) foi apta em reverter
esse efeito ansiolítico, sugerindo que os receptores GABAérgicos da SCPD podem
estar participando de mecanismos relacionados à ansiedade nessa região (RUSSO,
1993).
57
Alguns trabalhos utilizando técnicas de imuno-histoquímica e hibridização têm
demonstrado a presença de receptores 5-HT3 em internêuronios GABAérgicos da
amígdala, do hipocampo, da região septal, do córtex e do córtex olfatório.
(MORALES; BLOOM, 1997; JAKAB; GOLDMAN-RAKIC, 2000). Somado à disso, em
outros trabalhos utilizando técnicas eletrofisiológicas in vitro, demonstrou-se que a
serotonina facilita a transmissão sináptica inibitória por aumentar a liberação de
GABA através da ativação de receptores 5-HT3 presentes em interneurônios
GABAérgicos do hipocampo, amígdala e giro dentado (ROPERT; GUY, 1991;
McMAHON; KAUER, 1997; PIGUET; GALVAN 1994; KOYAMA ET AL, 2000;
KOYAMA, 2002; KATSURABAYASHI, 2003). Em estudos empregando técnicas
eletrofisiológicas bastante conceituadas, como o patch clamp, foi possível
demonstrar que esse aumento da liberação de GABA no terminal era consequência
da atuação da serotonina em receptores 5-HT3 pré-sinápticos dos interneurônios
GABAérgicos do hipocampo e da amígdala, e que o influxo de cálcio gerado pela
ativação do receptor facilitava a exocitose das vesículas contendo GABA
(KATSURABAYASHI, 2003; TURNER; MOKLER; LUEBKE, 2004; KOYAMA, 2002;
KOYAMA, 2000). De fato sabe-se que o Ca+2 é um cátion imprescindível para a
exocitose de vesículas contendo neurotransmissores (SÜDHOF, 1995). Tendo em
vista esses resultados, pode-se inferir que a serotonina, ao ligar-se aos receptor 5-
HT3 de interneurônios GABAérgicos, facilitaria a liberação do GABA, favorecendo as
sinapses inibitórias das quais participe, atribuindo-se à serotonina, dessa forma, o
papel de moduladora da circuitaria inibitória dessas regiões.
Assim, em suma ao que foi descrito até agora, viu-se que a potencialização do
sistema GABAérgico gera efeito ansiolítico quando BZDs são microinjetados na
SCPD e que a terapia com BZD é efetiva no tratamento dos transtornos de
ansiedade. Além disso, já foi visto que os BZDs de alta potência, como o
alprazolam, são eficazes no tratamento do TP, afecção correlacionada à SCPD
(GRAEFF; GUIMARÃES, 2005; MELLO, 2006). Além disso, viu-se que a SCP
contém receptores 5-HT3 e interneurônios GABAérgicos (na sua porção dorsal), e
tendo em vista que há sobreposição dos receptores 5-HT3 nos interneurônios
GABAérgicos em diversas estruturas límbicas já citadas, é plausível sugerir que os
receptores 5-HT3 da SCP também possam estar localizados em interneurônios
GABAérgicos da SCPD. Portanto, transferindo tal raciocínio para o universo desse
58
trabalho, o efeito ansiolítico observado após a microinjeção do mCPBG nas doses
de 5µg e de 10µg poderia ser fruto do efeito do agonista em receptores 5-HT3
presentes em interneurônios GABAérgicos da SCPD. Isso favoreceria as sinapses
inibitórias, tal como os BZDs, que por um caminho diferente, também facilitam essas
sinapses ao potencializar o efeito do GABA em receptores GABAA.
De maneira interessante, já foi demonstrado, por meio de técnicas de imuno-
histoquímica, que outro subtipo de receptor serotonérgico, o 5-HT2A, está presente
em neurônios GABAérgicos da SCPD. Além disso, essa colocalização foi observada
ao longo de todo o eixo rostrocaudal da SCP, sendo superior a 70%. Dessa forma,
foi possível constatar que uma grande quantidade de neurônios GABAérgicos da
SCP expressam receptores 5-HT2A (GRIFFITHS; LOVICK, 2002).
Sendo assim, com o intuito de aprofundar os estudos realizados nesse trabalho
seria interessante comprovar a presença dos receptores 5-HT3 nos interneurônios
GABAérgicos da SCPD, através de técnicas de imuno-histoquímica. Além disso,
também seria interessante realizar a microinjeção combinada de um antagonista do
receptor GABAA e de um agonista do receptor 5-HT3 (mCPBG) na SCPD, a fim de
verificar se o bloqueio dos receptores GABAA dessa região interfere no efeito
ansiolítico observado com a microinjeção do mCPBG na porção dorsal da SCP de
ratos testados no LCE.
59
6 CONCLUSÃO
Tendo em vista os resultados obtidos nesse trabalho, foi possível constatar que
a microinjeção dos dois ligantes serotonérgicos empregados geraram resultados
diferentes no LCE. O dolasetron, antagonista do receptor 5-HT3, quando
microinjetado na SCPD, nas doses de 100ng, 500ng e 1000ng, não alterou os
comportamentos relativos à ansiedade de ratos avaliados no LCE e CA e esta ação
não foi influenciada por alterações na locomoção do animal. Já a microinjeção do
mCPBG (agonista do receptor 5-HT3) na SCPD, nas doses de 5µg e de 10µg,
reduziu os comportamentos relacionados à ansiedade no LCE sem promover
alteração na atividade locomotora. Portanto, os resultados obtidos nesse estudo
sugerem que a ativação dos receptores 5-HT3, presentes na SCPD, modulam um
efeito ansiolítico no LCE.
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