universidade federal do rio grande do norte centro … · fma - dissertação. i. theodoro, raquel...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTECENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO
FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES (GLOMEROMYCOTA)EM UM CONTÍNUO DE RESTINGA E CAATINGA, NA RESERVA
DE DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL ESTADUALPONTA DO TUBARÃO, RN
________________________________________________Dissertação de MestradoNatal/RN, março de 2017
KÁSSIA JÉSSICA GALDINO DA SILVA
KÁSSIA JÉSSICA GALDINO DA SILVA
FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES (GLOMEROMYCOTA) EM UM
CONTÍNUO DE RESTINGA E CAATINGA, NA RESERVA DE
DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL ESTADUAL PONTA DO TUBARÃO, RN
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Sistemática e Evolução da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como
parte das exigências para obtenção do grau de
Mestre.
Linha de Pesquisa: Taxonomia, Sistemática e Ecologia.
Orientadora: Profa. Dra. Raquel Cordeiro Theodoro.
Coorientador: Prof. Dr. Bruno Tomio Goto
Natal – RN
2017
Silva, Kássia Jéssica Galdino da. Fungos micorrízicos arbusculares (Glomeromycota) em umcontínuo de restinga e Caatinga, na reserva de desenvolvimentosustentável Estadual Ponta do Tubarão - RN / Kássia JéssicaGaldino da Silva. - Natal, 2017. 77 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grandedo Norte. Centro de Biociências. Programa de pós-graduação emSistemática e Evolução. Orientadora: Profa. Dra. Raquel Cordeiro Theodoro.
1. Sazonalidade - Dissertação. 2. Diversidade - Dissertação.3. Ecótono - Dissertação. 4. Salinidade - Dissertação. 5. FMA -Dissertação. I. Theodoro, Raquel Cordeiro. II. UniversidadeFederal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 502.15
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB
KÁSSIA JÉSSICA GALDINO DA SILVA
FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES (GLOMEROMYCOTA) EM UM
CONTÍNUO DE RESTINGA E CAATINGA, NA RESERVA DE
DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL ESTADUAL PONTA DO TUBARÃO, RN
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Sistemática e Evolução da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como
parte das exigências para obtenção do grau de
Mestre.
Aprovada em: 06 de Março de 2017.
Comissão Examinadora:
Dra. Danielle Karla Alves da Silva (UNIVASF)
Dr. Iuri Goulart Baseia (UFRN)
Dra. Raquel Cordeiro Theodoro (UFRN - Orientadora)
DEDICATÓRIA
Ao meu pai, Raimundo Galdino (in
memoram) dedico.
“Aquele que vive esteticamente espera tudo de fora. Daí a angústia enfermiça com que muita gente fala do que há de terrível no fato de não ter encontrado seu lugar no mundo. A angústia demonstra sempre que o indivíduo espera tudo desse lugar, nada de si mesmo”.
Soren Kierkegaard
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos órgãos financiadores desse projeto, seja com a concessão da
bolsa ou de auxílios financeiros: CAPES, PPg (Pró-Reitoria de Pós-Graduação
UFRN), PPGSE (Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução).
Á minha orientadora, profª Dra. Raquel Cordeiro Theodoro por toda orientação
e mais que isso, apoio (financeiro e moral), amizade e comprometimento a esse
trabalho. Não poderia ter orientadora melhor.
Ao meu Coorientador profº Dr. Bruno Tomio Goto, por todos esses anos de
contribuição.
A banca de qualificação profª Dra. Maria Tereza Barreto e profº Dr. Alexandre
Fadigas, com seus conselhos e críticas bem utilizadas nesse trabalho final.
A banca de defesa profª Dra. Danielle Karla Alves da Silva e profº Dr. Iuri
Goulart Baseia, por terem aceitado tão prontamente o convite e por todos os pontos
levantados que serão de grande ajuda.
A minha família, em especial minha mãe Iracema Francisca da Silva Galdino,
pelo apoio e auxilio na falta de bolsa e pelo cuidado comigo.
Aos meus colegas e ex-colegas de laboratório (LBM, LAVIMI e LBF) que
ajudaram em todos os momentos: José Alex, Conceição Castro, Matheus Zatti,
Felipe Gomes, Ingrid Góes, Thales Domingos, Adler Santana, Xocthil Margarito,
Aretha Melo, Ana Clarissa, Nathalia Mendonça, Julimar Freitas Neto, Rafaela
Gomes, Cintia de Maria, Miguel Dorcino, Rhudson Cruz, enfim, todos da micologia
ambiental e médica da UFRN.
Em especial agradeço aos meus amigos Marcus Issler e Danilo Miguel, que
foram a campo e deram uma mão no trabalho pesado, sem vocês seriam uns kilos a
mais pra carregar.
Ao Ruy Lima, por toda correção no texto, pelas dúvidas tiradas e por todo
apoio. Assim como a sua esposa Gabriela Araújo.
Ao José Luiz por ajuda na estatística e em tudo que já precisei na graduação
e mestrado.
À todos os amigos, que mesmo não ajudando na produção cientifica, foram
uteis para manter a sanidade da mente em momentos difíceis.
Ao Victor Schinaider, que sem ele este último ano de mestrado não teria sido
tão suportável. Por todo amor e incentivo quando preciso.
À Deus por ter me sustentado e por me dar mais do que preciso e espero.
Não teria conseguindo chegar até aqui, se o Senhor não tivesse me sustentado.
RESUMO
A zona costeira é caracterizada por uma transição entre biomas ou fitofisionomias,
apresentando condições ambientais estressantes. No Rio Grande do Norte tal
transição se dá pela sobreposição (ecótono) entre restinga e caatinga,
fitofisionomias distintas, caracterizadas por formações mosaicas. Além das próprias
adaptações das espécies vegetais a essa zona de interface, outro fator importante
para a sobrevivência das espécies vegetais são os fungos micorrízicos arbusculares
(FMA), simbiontes obrigatórios importantes para a estabilização do sistema solo-
planta. Diante dessa importância ecológica, este trabalho objetivou identificar a
diversidade da comunidade de FMA em um contínuo de restinga e caatinga ao longo
do litoral do RN, na Reserva de Desenvolvimento Sustentável Estadual Ponta do
Tubarão, Macau/Guamaré, RN. Foram realizadas duas coletas de solo, uma no fim
do período após chuva e outra no período seco, bem como avaliação de fatores
abióticos do solo e sua influência sobre a comunidade de FMA, cuja diversidade foi
aferida pela morfologia dos esporos. Foram identificadas 24 espécies, destas 12 são
exclusivas da restinga, uma (1) exclusiva de caatinga e 11 ocorrem em ambas as
áreas. Quanto à dinâmica sazonal, o período seco demonstrou uma maior
abundância dos esporos, e no período chuvoso espécies esporocárpicas, com
formação em aglomerado de cachos de esporos, foram frequentemente
encontradas. Os fatores ambientais que mais influenciaram a distribuição das
espécies foram a salinidade e o pH. A salinidade, assim como os demais aspectos
químicos do solo averiguados, se mostrou homogênea, sendo encontrados alguns
sítios específicos mais salinos, os quais apresentaram uma baixa riqueza de
espécies. Tal resultado sugere um significativo impacto de uma das principais
atividades econômicas do RN, as salinas, na biodiversidade de FMA no solo.
PALAVRAS-CHAVE: FMA, Diversidade, Ecótono, Salinidade, Sazonalidade.
ABSTRACT
The coastal zone is characterized by a transition between biomes or
phytophysiognomies and may present stressful environmental conditions. In Rio
Grande do Norte State (Brazil), this transition occurs due to the overlap (ecotone)
between restinga and caatinga, distinct phytophysiognomies, characterized by
mosaic formations. In addition to the flora adaptations to this interface, another
important factor for the survival of plant species is the arbuscular mycorrhizal fungi
(AMF), which are important symbionts that are relevant for the stabilization of the
soil-plant system. In view of its ecological importance, this work aimed to identify the
diversity of the AMF community in a restinga and caatinga continuum along the
Northeastern coast, in the Ponta do Tubarão Sustainable Development Reserve, in
Macau / Guamaré Counties, RN, Brazil. Two soil collection were carried out, one at
the end of the period after rainfall and another in the dry period for AMF species
identification by spore morphology. The soil abiotic factors and their influence on the
AMF community were assessed. Twenty - four species were identified, 12 of which
are exclusive to restinga, one (1) to caatinga and 11 occurred in both areas. As for
the seasonal dynamics, the dry period showed a greater abundance of spores, and in
the rainy season sporocarpic species, with agglomerates forming bunches of spores,
were frequently found. The environmental factors that most influenced the distribution
of the species were salinity and pH. The salinity, as well as the other chemical
aspects of the soil verified, was homogeneous, being found some specific sites more
saline, which presented a low species richness. This result suggests a significant
impact of one of the main economic activities of the RN, the salines, on the
biodiversity of AMF in the soil.
Key-words: AMF, Diversity, Ecotone, Salinity, Seasonality.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Estruturas intra e extra radiculares para colonização da raiz, reprodução do esporo e distribuição dos nutrientes para a planta .............................................. 15
Figura 02. Esquema da formação da micorriza arbuscular e simbiose com cianobactérias, estabelecimento da interface simbiótica ......................................... 21 Figura 03. Inserção dos primers: SSUmAr e SSUmCf (na porção 18S), LSUmAr e LSUmBr (na porção 28S); atingindo assim, uma região amplificada de cerca de 1800 pb, cuja cobertura vai do SSU, ITS1e2, 5.8S e LSU ................................................ 29
Figura 04. Árvore proposta em 2001 por Schuessler et al., mostrando o monofiletismo do grupo e desmembrando dois filos (Chytridiomycota e Zygomycota) ...................................................................... ............................................................. 31 Figura 05. Mapa dos biomas brasileiros .................................................................. 32
Figura 06. Área da RDSE Ponta do Tubarão e seus limites ................................... 37
Figura 07. Caracterização da vegetação da RDSE Ponta do Tubarão ................... 38
Figura 08. Transectos de coleta na RSDE Ponta do Tubarão. R1 e R2: restinga; E1 e E2: restinga com região de Ecótono; C1 e C2: caatinga ...................................... 39
Figura 09. Fotos dos locais de coleta, na RSDE Ponta do Tubarão. A-B: restinga, sendo A estação pós chuvosa e B estação seca; C-D: caatinga, sendo C estação pós chuvosa e D estação seca; E-F: restinga com região de Ecótono, sendo E estação pós chuvosa e F estação seca ................................................................... 40
Figura 10. A – Coleta de solo rizosférico (RDSE Ponta do Tubarão); B – montagem de cultura armadilha na casa de vegetação da UFRN; C – peneiramento úmido e centrifugação em sacarose; D – separação dos esporos em ácido lático; E – Montagem de lâminas em PVLG e PVLG + Melzer; F – identificação das espécies de acordo com as chaves de identificação; G – Paradentiscutata maritima (espécie encontrada nesse estudo) ........................................................................................ 41
Figura 11. Presença das espécies em cada área, com sua representação em número de esporos encontrados .............................................................................. 44 Figura 12. Proporção da representação das famílias encontradas na caatinga e na restinga .................................................................................................................... . 44
Figura 13. Número de esporos por espécie em cada estação de coleta representando a abundância das espécies na restinga e na caatinga .................... 45 Figura 14. Análise de RDA de correlação entre a matriz ambiental e a riqueza e abundância das espécies ......................................................................................... 47 Figura 15: A-F Acaulospora sp.2, A-C: esporos montados em PVLG. D-F: esporos montados em PVLG + reagente Melzer. Siglas: (orn) ornamentação em forma de sulcos com espinhos no seu interior, primeira camada da parede externa, (ex) parede externa, (ex1) primeira camada da parede externa, (ex2) segunda camada da parede externa, (in) parede interna, (med) parede média, (med1) primeira camada da parede média, (med2) segunda camada da parede média, (sac) sáculo esporífero .................................................................................... ............................. 49 Figura 16: A-F Dentiscutata hawaiiensis, A-C: esporos montados em PVLG. D-F: esporos montados em PVLG + reagente Melzer. Siglas: (ex) parede externa, (ex1) primeira camada da parede externa, (ex2) segunda camada da parede externa, (in) parede interna, (med) parede média, (med1) primeira camada da parede média, (med2) segunda camada da parede média, (bs) bulbo suspensor, (hif) hifa do bulbo suspensor .................................................................................... ............................. 51
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Espécies de FMA encontradas ao longo de todo estudo e suas respectivas famílias ..................................................................... ............................. 43
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ºC Graus Celsius
μl Microlitro
Al Alumínio
ARISA Automated Ribossomal Intergenic Spacer Analysis
DNA Deoxyribonucleic Acid
DGGE Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis
EMPARN Empresa de Pesquisa Agropecuária do RN
FMA Fungo Micorrízico Arbuscular
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IDEMA Instituto de Desenvolvimento Sustentável e Meio
Ambiente
ITS Internal Transcribed Spacer
Kg Kilograma
LSU large subunit
m Metro
MA Micorriza Arbuscular
Mg Magnésio
mm Milímetro
MMA Ministério do Meio Ambiente
N Nitrogénio
Na Sódio
NaCl Cloreto de Sódio
OTU operational taxonomic unit
P Fósforo
PCA Principal Component Analysis
PCR Polymerase Chain Reaction
pH Potencial hidrogeniônico
PPBIO Programa de Pesquisa em Biodiversidade
PVLG Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
RDA Redundancy Analysis
RDSE Reserva de Desenvolvimento Sustentável Estadual
RISA Ribossomal Intergenic Spacer Analysis
RFLP Restricion Fragment Length Polymorphism
RN Rio Grande do Norte
rRNA RNA ribossomal
SSR Single Sequence Repeats
SSU Small Subunit
T-RFLP Terminal Restricion Fragment Length Polymorphism
UC Unidade de Conservação
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................... ............. 14
1.1 FUNGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES: CONCEITO,
IMPORTÂNCIA E TAXONOMIA ........................................................ 14
1.2 CONTÍNUO RESTINGA-CAATINGA ........................................... 31
2. OBJETIVOS ....................................................................................... 36
2.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................... 36
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................ 36
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................. 37
3.1 ÁREA DE ESTUDO E COLETA DE SOLO .................................. 37
3.2 ANÁLISES TAXONÔMICAS ........................................................ 41
3.3 ANÁLISES ECOLÓGICAS ........................................................... 42
4. RESULTADOS ................................................................................... 43
4.1 TAXONOMIA ................................................................................ 43
4.2 ÍNDICES DE BIODIVERSIDADE ................................................. 46
4.3 DESCRIÇÃO DE ESPÉCIES ....................................................... 47
5. DISCUSSÃO ...................................................................................... 52
6. CONCLUSÃO .................................................................................... 57
7. REFERÊNCIAS .................................................................................. 58
8. ANEXO ............................................................................................... 70
14
1. INTRODUÇÃO
1.1 FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES: CONCEITO, IMPORTÂNCIA E
TAXONOMIA
Os Fungos Micorrízicos Arbusculares (FMA), pertencentes ao filo
Glomeromycota (SCHUESSLER et al., 2001), são simbiontes obrigatórios da maioria
das raízes de plantas, colonizando desde Briófitas e Pteridófitas à Angiospermas e
Gimnospermas (SMITH; READ, 2008), estima-se que essa associação micorrízica
seja encontrada em aproximadamente dois terços de todas as espécies de plantas,
incluindo plantas lenhosas e árvores tropicais (TOWNSEND et al., 2010). Há
registros desses fungos em diversos habitats do planeta, (EMBRAPA, 2006;
SIQUEIRA et al., 2002), tais como: áreas árticas (CABELLO et al., 1994), desérticas
(YANG et al., 2008), floresta boreal (ÖPIK et al., 2008), tropical (GOTO et al., 2011)
e ecossistemas de lagos (SUDOVÁ et al., 2015), o que demonstra que se trata de
uma relação altamente difundida e bem sucedida (SMITH; READ, 2008).
Evidências fósseis e moleculares apontam que a relação simbiótica entre
espécies vegetais e fungos micorrízicos é antiga, datada de 450 a 600 milhões de
anos. Esporos com formação scutellosporóides semelhantes aos de Gigasporales
foram encontrados e datados em cerca de 400 milhões de anos (DOTZLER et al.,
2009); o que indica que tal simbiose provavelmente foi um fator crucial para a
colonização e estabelecimento das plantas vasculares no ambiente terrestre,
(HELGASON; FITTER 2005; DOTZLER et al., 2009; SOUZA et al., 2007;
REDECKER et al., 2000; SCHUESSLER et al., 2001; MAIA et al., 2010), uma vez
que esta associação é essencial para o desenvolvimento e nutrição da planta, à
medida que esta obtém nutrientes por meio da extensão do micélio fúngico no solo,
proporcionando um maior alcance das raízes e, portanto uma maior área de contato
com o seu substrato.
O termo Micorriza “Arbuscular” (MA) faz referência à estrutura característica
do grupo, os arbúsculos, responsáveis por transportar os nutrientes obtidos no solo
para o simbionte vegetal. O arbúsculo é formado através da diferenciação de hifas
intra radiculares que se instalam no córtex das raízes do simbionte vegetal,
invaginando o tecido vegetal, disponibilizando os nutrientes obtidos pelas hifas
15
extras radiculares (figura 01), as quais formam a extensão radicular que a planta
tanto precisa; em troca a planta cede cerca de 20% dos seus carboidratos e lipídios
(o produto assimilado) para o fungo (SIQUEIRA et al., 2002; BAGO et al., 2003;
MARX, 2004; SMITH; READ, 2008; PARNISKE, 2008; CAVALCANTE et al., 2009).
Figura 01. Estruturas intra e extra radiculares para colonização da raiz, reprodução
do esporo e distribuição dos nutrientes para a planta. (Fonte: Parniske,
2008)
A emissão de moléculas sinalizadoras por parte da planta promove a
colonização do simbionte vegetal pelos FMA. Um dos sinalizadores é a
estrigolactona, que estimula o metabolismo do fungo aumentando o crescimento da
hifa extra radicular, a qual entra em contato com a raiz e estabelece assim a MA
(figura 01). Os mecanismos que irão promover a colonização e a comunicação entre
os simbiontes são pouco conhecidos (COSTA et al., 2000), mas sabe-se que
moléculas de origem vegetal, chamadas de fatores de ramificação induzem a
intensa ramificação de hifas, tal indução se dá em situações limitantes de fósforo no
substrato (BUÉE et al., 2000; LAMBAIS; RAMOS 2010). O crescimento das hifas é
em direção à raiz, embora algumas, por algum motivo ainda não conhecido,
destoem desse comportamento (SBRANA; GIOVANNETI, 2005;, LAMBAIS; RAMOS
2010).
16
É importante salientar que essa sinalização poderá ser recebida por qualquer
microrganismo que estiver ao seu alcance na rizosfera, sendo estes patógenos ou
não. A associação é, portanto, tão benéfica para a planta a ponto que mesmo com o
risco de um “hospedeiro indesejado” também receber o estímulo hormonal, esta
estratégia de simbiose vem ocorrendo por pelo menos 400 milhões de anos
(DOTZLER et al., 2009).
A formação da micorriza arbuscular em regiões de clima semiárido, como em
áreas de dunas, restinga (JANOS, 1980; CORDAZZO; STÜRMER, 2007) e caatinga
(SOUZA et al., 2003; HELGASON; FITTER, 2005; GOTO, 2009), é de extrema
importância para a estabilidade destes biomas, por aumentarem a tolerância das
plantas a estresses ambientais bióticos e abióticos, como salinidade e estresse
hídrico, bastante intensos nesses ambientes (SMITH; READ, 2008; MAIA;
CAVALCANTE, 2005), protegendo também contra patógenos e herbívoros, assim
como aumentando a resistência a metais tóxicos (NEWSHAM et al., 1995).
Um exemplo dessa ajuda contra patógenos foi descrito por Newsham e seus
colaboradores (1995), com plantas de Vulpia sp., para as quais foi analisado seu
crescimento com e sem esporos de Glomus sp., sendo estas plantas também
submetidas ao fungo patógeno Fusarium oxysporum. A espécie de fungo micorrízico
em si não foi vista como incrementadora do crescimento da espécie de planta que
era herbácea, mas na ausência do FMA e presença do patógeno, o crescimento era
reduzido, na presença dos dois fungos, o crescimento ocorria em níveis normais,
protegendo assim as plantas dos efeitos do patógeno.
Os FMA viabilizam a absorção de macronutrientes, como o Nitrogênio (N) e o
Fósforo (P), e também micronutrientes. Como elemento de baixa mobilidade no solo,
o P geralmente se encontra em depósitos de águas nos solos, lagos, rios e oceanos,
muitas vezes é visto como o responsável por inibir a formação de ectomicorrizas, e
com isso torna-se um dos principais nutrientes de interesse nos estudos de endo e
ectomicorriza. Esse interesse é principalmente dado pela mobilidade baixa do
elemento no solo, sendo o solo, em especial o brasileiro, de baixo pH e baixa
disponibilidade de fósforo (Kasuya et al., 2010). Também se pode falar do N e P
como nutrientes alvos nos estudos, pois os mesmos são os elementos que mais
limitam o crescimento vegetal (TOWNSEND et al., 2010).
17
A importância deste macronutriente (fósforo) foi muito bem elucidada por
Yano-Melo e colaboradores (2003), os quais observaram o aumento da absorção de
P pela planta como um dos principais efeitos dos FMA levando a maior tolerância
das plantas ao estresse salino. Assim, os autores evidenciaram que, na presença de
FMA, os índices de P aumentam enquanto os de Na e NaCl diminuem no simbionte
vegetal.
Plantas associadas ao fungo micorrízico também possuem resistência ao
estresse hídrico, apresentando taxas diferenciadas de abscisão durante a seca,
transpiração, resistência estomática e crescimento (Maia; Cavalcante, 2005).
A identificação e definição das espécies de FMA são, tradicionalmente, feitas
por meio da morfologia dos esporos. Estudos moleculares apontam que o filo
possua reprodução sexuada (GASPAROTTO et al., 2010), porém, a forma
assexuada é a única que se conhece morfologicamente, inviabilizando o uso do
conceito biológico de espécie. A reprodução assexuada se dá por meio da divisão
dos esporos quando associados às raízes, motivo pelo qual são organismos
simbiontes obrigatórios, já que sua multiplicação e propagação ocorrem
exclusivamente quando em simbiose.
A identificação “clássica” de FMA é feita com base na morfologia dos esporos
assexuados ou glomerosporos, diferenciando as espécies por suas paredes,
camadas, ornamentações, entre outros caracteres A partir da estrutura reprodutiva
assexuada, os esporos, chamados de glomerosporos (GOTO; MAIA, 2006; GOTO,
2009). Os esporos, além de estrutura de reprodução, são unidades de sobrevivência
multinucleados, alvos também para taxonomia molecular (KUHN et al., 2001). A
presença de vários núcleos (vários genomas) no mesmo esporo resulta em um DNA
ribossomal, principal alvo dos estudos moleculares, altamente polimórfico
(GASPAROTTO et al., 2010). Tal característica poderia ser uma evidência de
reprodução sexuada, assim como também a capacidade de fusão de hifas e troca de
material genético (REDECKER, 2000).
Os critérios usados para identificação morfológica são: forma, dimensão dos
esporos; forma de inserção da hifa no esporo, número, espessura e coloração das
camadas da parede do esporo, presença ou ausência de bulbo, assim como da
placa germinativa (ou escudo germinativo) (GERDEMANN; TRAPPE, 1974; GOTO;
18
MAIA, 2006; GOTO, 2009). Dependendo do estágio de desenvolvimento do esporo,
chegar ao nível de espécie fica inviável, por não termos o amadurecimento do
esporo na fase de crescimento vegetativo (GASPAROTTO et al., 2010), faltando
assim caracteres informativos.
As formas de glomerosporos descritos são: glomóide, radial glomóide,
gigasporóide, acaulosporóide, entrofosporóide e scutellosporóides (GOTO, 2009),
sendo resumido atualmente em três: acaulosporoides, glomoides sensu lato e
gigasporoides sensu lato. Esses tipos variam de acordo com a formação dos
esporos, sendo na parte terminal, apical, lateral, ou dentro de uma hifa (MAIA et al.,
2010). Já os tipos de camadas das paredes são: evanescente, laminada, unitária,
flexível, amorfa, expansiva, germinativa, coriácea, chanfrada e membranosa (GOTO,
2009; MAIA et al., 2010), podendo-se encontrar em um esporo, uma mesma camada
sendo mais de um tipo, como por exemplo: expansiva e laminada.
Os primeiros representantes de Glomeromycota a serem publicados foram
duas espécies do gênero Glomus (Glomerales), Glomus microcarpum e Glomus
macrocarpum (Tul. & C. Tul.), em 1844. Desde então muitos outros fungos que
formavam micorriza, foram sendo classificados dentro do Filo Zygomycota. Em 1851
essas duas espécies foram transferidas para outro gênero de Zygomycota,
Endogone, por seus autores, e entre os anos de 1844 a 1962, o gênero Glomus foi
sinonimizado com Endogone. O segundo gênero de FMA publicado para
Zygomycota, foi Sclerocystis (Berk. & Broome) em 1873, e atualmente é um gênero
da ordem Glomerales, em Glomeromycota.
Entre os anos de 1963 e 1990 houve uma grande revisão da família
Endogonaceae (Gerdemann & Trappe, 1974), e como resultados foram
determinados sete gêneros, além da criação de mais dois gêneros de FMA
(Gigaspora, Acaulospora) e a classificação dos representantes de Glomus como
gênero à parte de Endogone. Sendo os táxons então definidos por: Glomus,
Sclerocystis, Gigaspora, Acaulospora, Endogone e Modicella. Dos setes, quatro são
gêneros atuais de FMA (Glomus, Sclerocystis, Gigaspora, Acaulospora). Em 1974
Gerdemann & Trappe desenvolveram critérios para chave de identificação de
espécies de FMA, que até hoje são utilizados para identificação das espécies desse
grupo.
19
O gênero Entrophospora (Ames & Schneider) foi proposto em 1979, pela
transferência da espécie Glomus infrequens para o novo gênero. Já Scutellospora
surge em 1986, a partir de observações em determinadas espécies de Gigaspora,
cuja parede interna possuía a característica germinativa. Gigaspora ficando,
portanto, com espécies que não possuem parede interna ou parede típica para
germinação (GOTO, 2009).
Em 1989 foi criada à família Glomeraceae (Pirozynski & Dalpé) que agrupava
Glomus e Sclerocystis, devido o modo de formação dos esporos. Também nessa
época, de grande revisão do filo Zygomycota, foi descrita a ordem Glomales (Morton
& Benny), em 1990, agrupando todos os gêneros que formavam Micorriza
Arbuscular em um grupo monofilético.
De 1990 a 2001 tivemos um período de descrição de novas espécies e dois
novos gêneros (Archaeospora e Paraglomus). A ordem Glomales do filo Zygomycota
era então composta por cinco famílias e sete gêneros: Glomeraceae (Glomus),
Acaulosporaceae (Entrophospora e Acaulospora), Archaeosporaceae
(Archaeospora), Paraglomeraceae (Paraglomus) e Gigasporaceae (Gigaspora e
Scutellospora).
Passaram-se 157 anos entre a primeira descrição de uma espécie que
formava micorriza arbuscular até que esses fungos simbiontes fossem elevados ao
nível de filo (Glomeromycota) em 2001 por Schuessler et al., por meio de evidências
moleculares da subunidade (SSU) de RNA ribossomal (rRNA) comprovando o
monofiletismo do grupo. A principal característica biológica do filo para sua descrição
é a simbiose obrigatória, seja com raízes de plantas (FMA) ou com cianobactérias,
caso do único representante do filo que não forma Micorriza Arbuscular, a espécie
Geosiphon pyriformis (Kütz) F. Wettst., ordem Archaeosporales (figura 02).
Em 2004 foi proposta a criação do gênero Pacispora (Oehl & Sieverding),
incluso na família Glomeraceae, com base morfológica e no modo de germinação
dos esporos (glomóide). Walker e colaboradores, também em 2004, propõem a
criação do gênero Gerdemannia na também proposta família Gerdemanniaceae,
com base em análises SSU rDNA, e características morfológicas. Em 2006 temos a
proposta de Spain et al., do gênero Appendicispora, dentro da família
Archaeosporaceae, com bases morfológica.
20
Walker et al., desfaz sua proposta da família Ambisporaceae (WALKER et al.,
2007), para propô-la como Appendicisporaceae, gênero Appendicispora, devido ao
principio de prioridade do Código Internacional de Nomenclatura Botânica, pois a
denominação de gênero dada por Spain et al. (2006) na proposta anterior do gênero
Appendicispora. O gênero Otospora é proposto dentro da família Diversisporaceae,
em 2008 por Palenzuela et al., no mesmo ano Oehl et al., concluíram que
Scutellospora é um gênero polifilético, baseados em dados morfológicos e
sequências de genes de rRNA 18S e 25S, reorganizando as espécies de
Scutellospora em três novas famílias e cinco novos gêneros: Scutellosporaceae
(Scutellospora), Racocetraceae (Racocetra, Cetraspora) e Dentiscutataceae
(Dentiscutata, Fuscutata, Quatunica). Mais tarde Morton e Msiska (2010), colocam
apenas o gênero Racocetra como um clado bem sustentado, com base em análises
moleculares de genes 25S rRNA e β-tubulina.
Oehl et al., (2011a) propõem um revisão das ordens Glomerales e
Diversisporales, criando como resultado da revisão os gêneros: Simiglomus,
Septoglomus e Viscospora. No mesmo ano Oehl et al., (2011b), também propõem o
gênero Orbispora, na família Scutellosporaceae e da ordem Gigasporales, classe
Archaeosporomycetes, Paraglomeromycetes, com bases moleculares utilizados
sequências parciais de β-tubulina e rRNA (SSU e LSU) (Oehl et al., 2011c), em
dados não agrupados diferente de Morton & Msiska (2010), afirmando a validade de
sua publicação em 2008.
Oehl et al. (2011f) demonstraram que Entrophospora não é monofilético e sua
espécie tipo, E. infrequens está mais relacionada com as espécies do gênero
Claroideoglomus, colocando a família Entrophosporaceae para a ordem Glomerales,
e espécies ancestrais de Claroideoglomus para o gênero criado Albahypha
(Diversisporaceae), propondo a criação dos gêneros Tricispora (Entrophosporaceae)
e Sacculospora, dentro da família, Sacculosporaceae.
21
Figura 02. Esquema da formação da micorriza arbuscular e simbiose com
cianobactérias, estabelecimento da interface simbiótica. (Fonte:
Parniske, 2008)
Até 2010 tínhamos descritas 217 espécies no mundo, sendo 119 registradas
no Brasil (SOUZA et al., 2010). Destas, 75 espécies foram registradas na caatinga
no inventário de Maia et al. (2010). Já no mesmo ano, Goto et al. (2010) registraram
adicionalmente 4 novas espécies para a caatinga. Com relação a outro tipo de
vegetação brasileira, a mata atlântica, foram encontradas 37 espécies em áreas de
dunas marítimas (STRÜMER et al., 2010), no entanto, esses dados se limitavam
apenas às regiões sul e sudeste, apresentando os gêneros Gigaspora e
Scutellospora com maior frequência, seguidos por Glomus e Acaulospora, o registro
de uma espécie de cada um dos gêneros Paraglomus e Archeospora.
Até o ano de 2012, não havia nenhum registro de espécie de FMA no estado
do Rio Grande do Norte. O primeiro registro aconteceu nos trabalhos de Goto e Oehl
(2012) com a publicação da espécie Glomus trufemii (B.T. Goto, G.A. Silva & F.
Oehl), coletada em dunas do RN. Em 2014, uma nova espécie foi descrita em
amostras de solo coletadas na reserva Parque Estadual Dunas do Natal,
considerado o maior parque urbano sobre dunas do Brasil (IDEMA, 2015). Esta nova
espécie recebeu o epiteto específico fazendo menção a cidade do Natal:
22
Rhizophagus natalensis ≡ Rhizoglomus natalense (Błaszk., Chwat & B.T. Goto)
Sieverd., G.A. Silva & Oehl.
Goto et al. (2015) também descreveram uma nova família para
Glomeromycota, a Intraornatosporaceae, possuindo dois gêneros, Intraornatospora
e Paradentiscutata, movendo Racocetra intraornata, para Intraornatospora
intraornata. Dentro de Paradentiscutata, duas espécies novas foram descritas,
Paradentiscutata bahiana, coletada na Serra da Jibóia/BA e Paradentiscutata
maritima, coletada em dunas dos estados da Paraíba e do Rio Grande do Norte.
Em 2016, um inventário feito para área de dunas marítima (vegetação de
restinga), na reserva Parque Ecológica Dunas de Genipabu, Rio Grande do Norte
registrou 46 espécies de FMA, distribuídas em 10 famílias: Glomeraceae (12),
Acaulosporaceae (7) Dentiscutataceae (7), Diversisporaceae (2), Gigasporaceae (5),
Scutellosporaceae (4), Ambisporaceae (3), Racocetraceae (3), Intraornatosporaceae
(2) e Sacculosporaceae (1) (JOBIM; GOTO 2016).
Atualmente o filo Glomeromycota é composto por aproximadamente 280
espécies e destas, 153 são encontradas no Brasil e classificadas em: cinco (5)
classes, cinco (5) ordens, 15 famílias e 38 gêneros (www.mycobank.org;
http://glomeromycota.wix.com/lbmicorrizas) (OEHL et al., 2011b; GOTO et al., 2012;
BLASZKOWSKI et.al., 2015).
Técnicas moleculares têm sido cada vez mais usadas nos estudos de
diversidade genética de FMA e nas descrições de espécies. Tais metodologias são
vantajosas devido à rapidez, sensibilidade e especificidade, além de serem mais
informativas, em termos filogenéticos, que a avaliação morfológica dos esporos.
Segundo Gasparotto et al. (2010) estas técnicas também são vantajosas pois não
estão sujeitas a variações fenotípicas, à ação do ambiente, ao estágio de
desenvolvimento e a outros fatores que possam afetar a morfologia do organismo e
levar á uma descrição equivocada.
A PCR (Polymerase Chain Reaction – reação em cadeia da polimerase)
começou a ser empregada nas últimas décadas para avaliar a biodiversidade de
FMA (GASPAROTTO et al., 2010), sendo as sequências de rDNA e os espaçadores
intergênicos os principais alvos de tais estudos. Contudo, ainda existem dados
limitados em relação á Glomeromycota, já que muitas espécies não possuem ainda
23
suas sequências depositadas em bancos de dados de acesso livre para comparação
e análises filogenéticas. A espécie Rhizoglomus intraradices (N.C. Schenck & G.S.
Sm.) Sieverd., G.A. Silva & Oehl, por exemplo, é a única espécie cujo genoma foi
totalmente sequenciado (MARTIN et al., 2008).
A extração de DNA é o início para os estudos moleculares, sendo essencial a
obtenção de um DNA de qualidade (íntegro) e de quantidade suficiente para que
haja amplificação das regiões desejadas. Para os FMA os métodos de extração
podem ser a partir de um único esporo (COLOZZI-FILHO; CARDOSO, 2000), ou
extração de raízes colonizadas com lise celular direta por meios físicos e químicos
(KOIDE, 2005).
A extração direta de um único esporo foi proposta por Colozzi-Filho &
Cardoso (2000), e consiste em uma técnica simples e necessária para descrição de
espécies por se ter certeza de estar amplificando uma única espécie para
sequenciamento, já que o mesmo fragmento de raiz pode conter diversas espécies
de FMA além de outros microrganismos. A técnica consiste na limpeza e perfuração
do esporo (por simples ruptura celular com auxilio de uma agulha estéril), para
liberação do seu conteúdo citoplasmático, e consequentemente do DNA, em água
estéril. Ao quebrar o esporo, deve-se armazena-lo a -20º C até seu uso na PCR.
Apesar de a lise celular direta ser utilizada amplamente, alguns compostos
que comprometem a qualidade do DNA podem permanecer na reação de PCR, pois
não há passagem de precipitação e lavagem deste DNA. Assim, diversas
substâncias orgânicas inibidoras da PCR, como ácidos húmicos, DNases e taninos
podem ser extraídas junto do extrato do esporo. Por isso, deve-se ter muito cuidado
na limpeza dos esporos antes da sua quebra para a extração do DNA, dando-se
preferência para o uso de água ultrapura e agulhas estéreis. O PCR realizado a
partir de um único esporo, apesar de específico, é extremamente pouco sensível,
sendo necessária a amplificação de vários esporos para se ter um resultado positivo.
Com a obtenção de DNA, seja do solo ou dos esporos diretamente, técnicas
baseadas na amplificação de regiões específicas, são necessárias para analisar as
informações genéticas. PCR, DGGE (Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis –
eletroforese em gel com gradiente desnaturante), clonagem e sequenciamento, são
exemplos das metodologias utilizadas nos estudos de diversidade genética. O
24
pirosequenciamento, uma metodologia mais moderna, pode ser utilizado em estudos
desse tipo, no entanto, seu alto custo é um fator limitante.
A PCR reside na amplificação de uma região de interesse do DNA, e as
técnicas de identificação molecular utilizam-se dessa metodologia como um fator
indispensável. São utilizados, geralmente, iniciadores da PCR, primers para
amplificar genes que transcrevem RNA ribossomais (rDNA) e seus espaçadores
(ITS). A grande vantagem de se usar estas regiões como marcadores moleculares
reside no fato de elas possuírem sequências altamente conservadas (LSU – Large
Subunit ou 28S e SSU – Small Subunit ou 18S) (figura 03), possibilitando o desenho
de primers que reconheçam um grande número de espécies de FMA. Além disso,
por ser uma região multicópia no genoma, a sensibilidade da técnica é favorecida
(DÉBAUD et al., 1999).
A região conservada (18S, 5.8S e 28S) está intercalada por espaçadores de
sequências divergentes, com alta variabilidade, sendo polimórficas em tamanho e
sequências, e portanto muito informativas (GASPAROTTO et al., 2010), permitindo
assim a análise de diversos níveis taxonômicos distintos e discriminação de
espécies. A respeito dessa escolha, segundo Gasparotto et al. (2010), por ser
altamente conservado, o 18S é mais indicado para comparação entre organismos
filogeneticamente mais distantes, quando comparado ao 28S, relativamente mais
variável. Contudo, em muitas comparações entre gêneros distintos o 28S pode
apresentar poucos caracteres informativos, sendo mais indicado nestes casos o uso
dos espaçadores internos transcritos ou ITS.
Esta região conservada (18S e 28S), no entanto, pode ser mal usada, pois
sua conservação é tão alta que pode não ser suficiente para fazer a distinção entre
espécies e outros taxa filogeneticamente próximos. Os estudos filogenéticos são
prejudicados nesse ponto, assim como pelo número cada vez maior de sequências
depositadas no banco de dados sem a devida identificação.
Outros genes e regiões são estudados, como o gene codificador da β-
tubulina, genes ribossômicos mitocondriais, genes envolvidos na reprodução e o
gene codificador do fator de alongamento 1-alfa. Porém, ainda são poucos os
marcadores moleculares, que não o rDNA, que são usados em estudos
filogenéticos, sendo que a maioria das sequências depositadas são de LSU e SSU,
25
regiões conservadas que muitas vezes não diferenciam espécies crípticas. Assim,
deve-se ter mais investimento em projetos genomas de espécies de diferentes
famílias de FMA a fim de se criar um banco de dados mais completo, para a
realização de filogenias, com um maior número de sequencias possível.
Variações da técnica de PCR, como o double PCR (repetição do primeiro
PCR usando o seu produto como molde) e o Nested PCR (produto do primeiro PCR
serve de molde para um segundo PCR com primers mais internos) vem sendo
aplicadas com o intuito de aumentar a sensibilidade da amplificação do material
genético proveniente de um único esporo. No Nested PCR temos geralmente o uso
de primers universais para fungos para a primeira reação e na segunda utilizamos
primers específicos para FMA. Essa estratégia também é vantajosa para quando se
tem pouca quantidade DNA para amplificar ou quando há o risco de se ter
contaminante nas amostras, já que os primers internos são específicos.
Outras técnicas devem ser utilizadas com o produto amplificado da PCR,
entre elas temos a clonagem e sequenciamento, principalmente quando se quer
determinar quais espécies estão associadas à planta. A clonagem é feita a partir dos
fragmentos amplificados de diversas espécies distintas para se obter a diversidade
de sequências de uma amostra. Os produtos de PCR são individualizados por meio
de sua ligação a vetores, como plasmídeos seguido de transformação de células
competentes de bactérias (geralmente se usa a Escherichia coli). Constrói-se então
uma pequena biblioteca de sequências amplificadas a partir do material ambiental
(solo). Estes clones são então sequenciados e comparados aos bancos de dados,
para se aferir a riqueza de espécies do local. Essa variedade de técnicas tem se
tornado ferramentas mais constantes nos estudos de diversidade genética tanto de
fungos endomicorrízicos (MA, por exemplo), como em fungos ectomicorrízicos.
As sequências geradas são usadas como unidades taxonômicas operacionais
(OTU - operational taxonomic unit), ou táxons virtuais, cujas sequências são
depositadas mesmo sem termos o material biológico. Tal abordagem demonstra a
grande potencialidade da biologia molecular para o estudo da diversidade genética e
descoberta de novas espécies. Neste cenário, a limitação da descrição e
identificação morfológica é vencida pela identificação molecular, o que vem trazendo
importantes avanços na taxonomia dos fungos em geral, revelando a existência de
26
muitas espécies crípticas, que morfologicamente são consideradas uma única
espécie. O contrário, também pode acontecer em alguns casos, nos quais mais de
duas espécies morfológicas distintas podem representam, na verdade, uma grande
plasticidade fenotípica de uma única espécie.
Os resultados de diversos estudos levaram à conclusão de que as técnicas
existentes de cultivo eram ineficientes para isolar estas espécies e que a diversidade
genética de microrganismos na natureza é muito maior do que se esperava
(GASPAROTTO et al., 2010). Todavia, não tão caro como o sequenciamento de
última geração, o sequenciamento convencional requer recursos financeiros para
sua execução; dependendo do tamanho amostral e do objetivo do estudo (se de
cunho ecológico, requer um tamanho amostral grande), fica inviável usar a clonagem
e sequenciamento.
Assim sendo, as técnicas que estão sendo utilizadas para estudos de
diversidade genética em relação à distribuição espacial de microrganismos são entre
outras: o DGGE, RFLP (Restricion Fragment Length Polymorphism), RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA), RISA (Ribossomal Intergenic Spacer
Analysis), etc. (GASPAROTTO et al., 2010).
A análise genética com a finalidade de gerar um padrão da representação da
diversidade é chamada de fingerprint. A diferenciação do tamanho e até mesmo da
sequência dos amplicons gerados pode ser feita por técnicas de eletroforese com ou
sem componentes desnaturante. Estas técnicas permitem a detecção de pequenas
mudanças na composição das comunidades, além de fácil execução, análise e
viabilidade econômica (GASPAROTTO et al., 2010).
O DGGE é uma técnica capaz de separar sequências de ácidos nucléicos de
mesmo tamanho, ou tamanho diferentes, porém diferindo na composição das bases
(SOUZA et al., 2010) pois ocorre em um gradiente de desnaturação. Pode ser usada
no estudo de diversidade genética de Fungos Micorrízicos usando primers
específicos para determinado grupo de FMA. Por exemplo, o DGGE foi utilizado
para diferenciar isolados geográficos do gênero Gigaspora, como Gigaspora albida,
Gigaspora gigantea, e Gigaspora margarita (SOUZA et al., 2004)
RISA é a técnica que usa a variação existente nos espaçadores intergênicos
das regiões 18S-5.8S -28S, o ITS1 e o ITS2. Os amplicons obtidos formam um
27
padrão de fragmentos, de tamanhos diferentes, visualizados em gel de
poliacrilamida, e podem ser purificados e sequenciados para se ter a informação
mais precisa das diferenças nas sequências. Esta técnica possui uma versão
automatizada, a ARISA (Automated RISA) cuja resolução e tempo de análise foram
maximizados, pois são usados primers fluorescentes e a eletroforese se dá em
capilar (sequenciador de DNA). No RISA ou ARISA, a variação detectada é apenas
quanto ao tamanho do produto de PCR, já o DGGE é mais sensível, pois também
detecta a variação nas bases que constituem uma sequência.
A técnica de RFLP (Restricion Fragment Length Polymorphism) usa a
detecção de fragmentos comuns para indivíduos da mesma espécie ou espécies
próximas, sendo de interesse taxonômico. Sua grande vantagem consiste no fato de
ser reprodutível, porém apresenta baixa resolução para se diferenciar espécies de
FMA filogeneticamente próximas (REDECKER et al., 2000). Além do RFLP, temos
uma técnica que é sua variante, o T-RFLP (Terminal Restricion Fragment Length
Polymorphism), que pode ser utilizado para amostras ambientais (espécies que se
encontram no solo ou colonizando raízes), pois os primers são marcados com um
fluoróforo, de forma que somente fragmentos terminais, produzidos pela digestão
com enzimas de restrição, são detectados. Com o sequenciador automático de DNA
os fragmentos podem ser visualizados em forma de picos e sua abundância indicada
pela altura e área do pico. As enzimas de restrição utilizadas são de fundamental
importância ao serem escolhidas, como no RFLP, sendo utilizadas de duas a quatro
enzimas diferentes no mesmo estudo. A marcação do fluoróforo é feita tanto no
primeiro primer como no segundo (sense e antisense), para se gerar dois
fragmentos terminais (REDECKER et al., 2000).
O uso de um sequenciador com eletroforese capilar proporciona a avaliação
de muitas amostras e ainda permite a recuperação dos fragmentos para obtenção
das sequências e geração de OTU. No entanto, para se identificar as sequências,
deve-se combinar a técnica com a clonagem e posterior sequenciamento,
aumentando o seu custo. Estudos que utilizaram essa técnica conseguiram detectar
que plantas em um mesmo ambiente são colonizadas por comunidades distintas de
FMA (VANDENKOORNHUYSE et al., 2003), ou seja, diferente grupos de espécies
colonizando espécies vegetais distintos.
28
Já o RAPD, usa iniciadores randômicos para amplificação, compostos por de
8 a 12 nucleotídeos, amplificando diferentes porções do DNA e gerando amplicons
de tamanhos distintos, mas como esses primers não são específicos, podemos
também amplificar o DNA do simbionte vegetal ou de outro fungo que não seja
micorrízico por exemplo. Por isso, seu uso é restrito para avaliar culturas puras. Com
o sequenciamento das bandas geradas podemos construir primers específicos para
FMA.
Temos também a SSR (Single Sequence Repeats), cujos primers são
homólogos a região que flanqueia os chamados microssatélites, pequenas
sequências repetitivas (1-6 nucleotídeos) in tandem (uma ao lado da outra) ao longo
do genoma dos eucariotos. Nessa técnica podemos usar um único primer homólogo
a uma região de microssatélite (Ex.: (ATT) 5). A amplificação com esses primers
gera padrões de bandas que pode discriminar espécies e mesmo isolados
geográficos (GASPAROTTO et al. 2010).
Como no RAPD, por serem inespecíficos, tais primers devem apenas ser
usados em culturas puras para posterior construção de primers específicos que
permitirão estudos de diversidade genética populacional, uma vez que o número de
repetições de microssatélites é altamente polimórfico. Um exemplo do uso de
microssatélites no estudo de diversidade fúngica foi a busca por tais elementos no
genoma de Rhizoglomus intraradices. Mathimaran e colaboradores (2008)
detectaram 842 microssatélites, do quais 100 foram selecionados para desenho de
primers, e 18 alelos testados em 8 culturas puras monospóricas de R. intraradices.
Sete dos isolados puderam ser discriminados por pelo menos 5 alelos distintos e um
os isolados do fungo pode ser descriminado pelos 18 alelos.
Muitos primers universais para fungos (panfúngicos), de anelamento nas
regiões 28S e 18S foram desenvolvidos, ex.: ITS4 e ITS5, (WHITE et al., 1990). No
entanto, uma das principais exigências para os estudos usando a molecular em FMA
é o uso de primers específicos, ou seja, iniciadores que amplifiquem apenas
membros de Glomeromycota e não outros membros do reino Fungi. O desenho e o
uso desses primers específicos, excluindo o DNA de outros fungos, bactérias e
vegetais, é o foco de muitos trabalhos (REDECKER et al., 2000; LEE et al., 2008;
KRÜGER et al., 2009, GASPAROTTO et al., 2010; SILVA et al., 2011). Temos
29
atualmente aproximadamente 44 primers desenhados especificamente para FMA
(REDECKER, 2000; KRÜGER et al., 2009; GASPAROTTO et al., 2010; SILVA et al.,
2011).
Krüger et al. (2009) desenharam conjuntos de primers específicos para
caracterização de amostras potencialmente contaminadas com DNA de outros
organismos (fungos, bactérias, planta, etc). A região amplificada por tais primers é
uma região de cerca de 1.800 pb. Os autores se basearam em cerca de 1.000
sequências disponíveis de Glomeromycota, e desenharam dois conjuntos de pares
de primers, os SSUmAf + LSUmAr e os SSUmCf + LSUmBr (figura 03). Cada
conjunto possui variações, que podem ser utilizadas de acordo com as famílias de
fungos micorrízicos trabalhados, tanto em reações de PCR como de Nested PCR.
Apesar do grande esforço para o desenho de primers específicos, muitos
deles apresentam problemas com a especificidade, podendo amplificar outros filos
de fungos, ou não amplificando todos os táxons contidos no grupo de FMA em
questão, como no caso dos conjuntos de primers desenhados por Krüger et al.,
(2009) que dependendo do par de primer usado só iremos amplicar espécies da
família Glomeraceae ou como por exemplo os primers AML1 e AML2 de Lee et al.,
(2008) que amplificam todos os membros do filo Glomeromycota com a exceção de
Archeospora trappei (GASPAROTTO et al., 2010).
Figura 03. Inserção dos primers: SSUmAr e SSUmCf (na porção 18S), LSUmAr e
LSUmBr (na porção 28S); atingindo assim, uma região amplificada de
cerca de 1800 pb, cuja cobertura vai do SSU, ITS1e2, 5.8S e LSU.
(Fonte: Krüger et al, 2009 modificado).
30
Um ponto muito importante para as análises taxonômicas em FMA é a
concordância entre as identificações morfológica e molecular. Silva et al. (2011),
utilizaram os primers ALB1 e GiITS1 (Lanfranco et al. 1999), para 18 isolados que
morfologicamente compreendiam sete (7) espécies e observaram que dos 11
isolados ditos pertencentes ao gênero Gigaspora, 2 foram identificados de forma
errônea, ou seja, a morfologia não coincidia com as análises moleculares e
filogenéticas.
O principal exemplo do impacto da biologia molecular em análises
filogenéticas foi a própria descrição do filo Glomeromycota como um filo único,
completamente separado de Zygomycota (figura 04) (SCHUESSLER et al., 2001). O
trabalho usou a biologia molecular para propor o monofiletismo dos fungos
micorrízicos que estavam restritos à ordem Glomales, e por meio de evidências
moleculares acabaram por incluir no novo filo a espécie Geosiphon pyriformis, o
único representante de Glomeromycota que não faz simbiose com raízes de plantas.
Quando descrito, o filo contava com os seguintes táxons: quatro ordens e sete
famílias: Archaeosporales (Archaeosporaceae e Geosiphonaceae), Diversisporales
(Diversisporaceae, Acaulosporaceae e Gigasporaceae), Glomerales (Glomeraceae)
e Paraglomerales (Paraglomeraceae). A árvore proposta no trabalho de descrição
do filo, também coloca os filos Chytridiomycota e Zygomycota como grupos
polifiléticos (figura 04)
31
Figura 04. Árvore proposta em 2001 por Schuessler et al., mostrando o
monofiletismo do grupo e desmembrando dois filos (Chytridiomycota e
Zygomycota). (Fonte: Parniske, 2008)
1.2. CONTÍNUO RESTINGA-CAATINGA
O nome caatinga tem origem no Tupi-Guarani e significa “mata branca” ou
“floresta branca” (LEAL et al., 2003), característica marcante da vegetação na
estação seca, quando as folhas caem e restam apenas os troncos brancos
retorcidos.
A vegetação da caatinga é um mosaico de arbustos espinhosos e floresta
sazonalmente seca, composta por distintas fisionomias vegetais, também
denominadas de “caatingas” no plural (LEAL et al., 2003; 2005); ricas em recursos
genéticos, com altos níveis de biodiversidade e endemismo. Mostra-se como uma
formação florestal entre as matas secas, representada pelo modelo arbóreo,
estacional, caducifólio, xerófilo, garranchento, espinhoso, próprio da região semi-
32
árida do nordeste (FERNANDES, 2007), cujo clima é caracterizado pelo longo
período de seca e sazonalidade anual, solo raso e pedregoso (MMA, 2005;
FERNANDES, 2007; OLIVEIRA-FILHO, 2009).
A caatinga é um bioma exclusivo do território brasileiro, ocupando a região
Nordeste (figura 05), englobando os estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão,
Pernambuco, Paraíba, Rio Grande do Norte, Piauí, Sergipe e a região norte do
estado de Minas Gerais (LEAL et al., 2003; MMA, 2007). Trata-se da única
ecorregião de floresta tropical seca do mundo, possuindo sobreposição com
florestas úmidas, semiúmidas e restinga (LEAL et al., 2003). Sua conservação é um
dos maiores desafios da ciência brasileira uma vez que as unidades de conservação
cobrem menos de 2% do seu território, o qual sofre um extenso processo de
alteração e deterioração ambiental provocado pelo uso insustentável dos seus
recursos naturais (LEAL et al., 2003).
Figura 05. Mapa dos biomas brasileiros. (Fonte: IBGE modificado)
Assim, a caatinga tem sofrido um crescente investimento e incentivo à
pesquisa e a proporção de estudos no bioma tem aumentado exponencialmente. O
Programa de Pesquisa em Biodiversidade (PPBio no Semiárido) é o grande
33
responsável por esse quadro, já que através do seu incentivo e financiamento, foram
publicados cerca de 363 artigos entre os anos de 2005 a 2016, aos quais
encontramos inventários de diversidade de fauna, flora e microbiota. Destes artigos,
cerca de 1/3 são sobre diversidade, taxonomia e ecologia de fungos no semiárido,
demonstrando a alta biodiversidade da região.
O bioma Mata Atlântica é caracterizado por ser um hot spot de biodiversidade
(RIZZINI, 1997), sendo formado por dois tipos vegetações principal, a Floresta
Atlântica (termo geral para formações de florestas sempre verdes até florestas
semidecíduas) e a vegetação costeira (dunas, mangues e restinga) (ZANGARO;
MOREIRA, 2010), cuja área é distribuída ao longo da costa leste do Brasil e de
forma menos frequente no interior da região sul e sudeste alcançando 18 estados
brasileiros, assim como parte da Argentina e Paraguai, ocupando 15% do território
brasileiro (OLIVEIRA-FILHO; FONTES, 2000). Ao longo dos anos a mata atlântica
tem sido degradada, restando apenas 8% de sua formação original, resultando em
perda de diversidade, fragmentação de habitat e consequentemente perda das
áreas caracterizadas como restinga (MMA, 2007).
A restinga é uma formação vegetal mosaica, podendo se dispor em um
gradiente de estabilização de solo arenoso, ocorrendo geralmente em solos rasos ou
depósitos de areia profundos, com regimes de água variados. Trata-se de um
complexo florístico com predominância arbustiva com valor regional principalmente
para a região do nordeste brasileiro (FERNANDES, 2007). Por isto, ela não se
caracteriza como uma unidade, nem circunscreve apenas um bioma específico,
formando inúmeros complexos de ecossistemas (MMA, 2007). Segundo a
classificação de OLIVEIRA-FILHO (2009) a restinga ocorre sobre depósitos de areia
estabilizados do Domínio Atlântico e com regimes de água variados. Já no regime
das fitofisionomias campestres, temos as restingas sobre dunas instáveis e costões
e marismas nos estuários subtropicais (OLIVEIRA-FILHO, 2009).
Ocupando a zona costeira do Brasil, a restinga possui sobreposição territorial
com os biomas amazônico e mata atlântica, mantendo também interface com outros
importantes biomas como a caatinga, o cerrado e o Pampa. Essa sobreposição
ocorre, pois, as zonas marginais entre duas áreas distintas acabam por sobrepor
suas formações vegetações e influências geológicas, formando zonas de transição.
34
Se estendendo ao longo de 95% do território do RN, a caatinga, representa a
principal formação vegetal do interior e parte do litoral estado (IDEMA, 2015),
ocorrendo geralmente após mangues. A restinga, junto com outros tipos vegetais da
mata atlântica, como mangue, brejos de altitudes, cobre os outros 5%, atingindo
originalmente 16 municípios do litoral (RIZZINI, 1997) e hoje restrita a
remanescentes preservados em áreas de UC (unidades de conservação), como a
maior reserva de mata atlântica em parque urbano do país, o Parque Estadual
Dunas de Natal.
A mobilidade dos nutrientes no solo em regiões do semiárido é baixa, já que
esta região possui longo período de seca (FERNANDES, 2007). A restinga, por
exemplo, que possui sedimentos arenosos, acaba proporcionando um ambiente
muito seco para a vegetação, já que sua granulometria permite o escoamento da
água da chuva com facilidade. A baixa retenção da água no solo influencia
diretamente na morfologia interna e externa da vegetação, selecionando inúmeras
adaptações ao longo da história evolutiva dessas plantas possibilitando a
colonização deste ambiente.
Os mecanismos adaptativos para obtenção de água, nutrientes e estabilidade
em ambientes estressantes são os que garantem a manutenção em diversos tipos
de ecossistemas (alagados, salinos, dunas, altitudes, estuários, etc). Um destes
mecanismos é o mutualismo entre planta e outros organismos. As plantas que
possuem simbiose com fungos e bactérias, na rizosfera conseguem obter nutrientes
ou mesmo fixar macronutrientes. Dentre estes microrganismos se destacam as
bactérias dos gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium e Azorhizobium, fixadores de
Nitrogênio, conseguindo não somente absorver o nutriente e realizar a
desnitrificação como fixa-lo para os vegetais (TOWNSEND et al., 2010),
O estudo dos FMA é importante para conservação e preservação dos
simbiontes vegetais em suas condições ambientais. Os aspectos que influenciam
essa relação, os benefícios e qual comunidade estão colonizando as diferentes
espécies vegetais são os tópicos encontrados nos estudos de diversidade.
Os aspectos físico-químicos do solo, como a disponibilidade de nutrientes,
formação do substrato, entre outros, são de grande influência na diversidade que se
encontra no ambiente. O papel ecológico dos fungos micorrízicos é altamente
35
importante para o equilíbrio de ecossistemas, fixação das raízes do simbionte
vegetal no substrato e estabilização dos sedimentos (SIQUEIRA et al., 2002; SMITH
& READ, 2008).
A zona de transição de um bioma para outro ou a área de interface
(marginais) entre dois ou mais biomas são conhecidas como Ecótono. O termo
Agreste, muito empregado no Rio Grande do Norte, Paraíba e Pernambuco,
representa esse tipo de transição entre as vegetações. Esta zona entre restinga e
caatinga é formada por vegetação arbórea subúmida pelo alto grau de umidade que
caracteriza as proximidades litorâneas, intermediárias entre as matas costeiras
(mata atlântica/restingas) e a caatinga interiorana. Ecótonos são áreas dinâmicas
que, com o tempo, podem mudar de largura e até de posição, em razão de
influências geomorfológicas e mudanças ambientais, como o fenômeno da sucessão
ecológica. Formando uma comunidade mista, sua diversidade pode ser considerada
própria, tendo em vista espécies e características próprias (FERNANDES, 2007).
Dentre os domínios fitogeográficos com maior ocorrência de FMA no mundo,
a Mata Atlântica e a Caatinga brasileira se encontram na liderança, contendo 30% e
24%, respectivamente, de todas as espécies de FMA já descritas. Contudo, as áreas
de estudo destes fungos no RN são exclusivas de vegetação de mata atlântica
(floresta, restinga e tabuleiro costeiro), sendo inexistentes os estudos de
levantamento de FMA na caatinga bem como no ecótono restinga-caatinga no RN.
Apesar de a Mata Atlântica e a Caatinga serem importantes fonte de
biodiversidade, o ecótono entre elas vem sendo negligenciado, não sendo citado
dentre os principais ecótonos brasileiros pelo MMA (2005), que considera apenas as
transições cerrado-amazônia, caatinga-amazônia e cerrado-caatinga.
Tendo em vista que a escassez de informações a respeito da diversidade de
FMA em zonas de contínuo entre restinga e caatinga na costa setentrional do Rio
Grande do Norte, o presente estudo inventariou a diversidade de fungos micorrízicos
arbusculares e avaliou a relação entre a diversidade e os dados ambientais abióticos
ao longo desta área de transição, como fatores de maior influência na distribuição
das espécies.
36
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
● Estudar a diversidade de FMA em uma zona de contínuo de restinga e caatinga
levando em consideração a influência dos aspectos físico-químicos do solo.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
● Identificar morfologicamente as espécies da comunidade de FMA das áreas em
estudo;
● Avaliar índices ecológicos de riqueza (Simpson), diversidade (Shannon-Wiener),
equitabilidade (Pielou) e similaridade (Jaccard) de espécies ao longo do contínuo;
● Identificar as propriedades físicas e químicas do solo que influenciam a distribuição
das espécies de FMA ao longo do contínuo
● Acrescentar dados para preservação da área de coleta, já que esta se trata de uma
unidade de conservação.
37
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ÁREA DE ESTUDO E COLETA DE SOLO
A coleta ocorreu na Reserva de Desenvolvimento Sustentável Estadual Ponta
do Tubarão (RDSE Ponta do Tubarão) (figura 06), compreendendo as comunidades
de Diogo Lopes, Barreiras, Sertãozinho e Mangue Seco; (coordenadas 5º2'S e
5º16'S de latitude e 36º23'W. 36º32' de longitude), que abrange os municípios de
Macau e Guamaré.
Figura 06. Área da RDSE Ponta do Tubarão e seus limites. (Fonte: IDEMA)
Criada no ano de 2003 com quase 13 mil hectares de extensão, numa área
costeira do extremo norte do estado do RN, a reserva possui remanescente de
restinga e sua transição para caatinga (figura 07), formando um ecótono entre
esses dois ambientes e suas fitofisionomias. O reconhecimento de restinga foi feito
com base na classificação geológica e florística proposta por Mazzochini, 2014.
38
Figura 07. Caracterização da vegetação da RDSE Ponta do Tubarão. (Fonte:
Mazzochini, 2014 modificado)
Foram coletadas amostras de solo rizosférico em sete pontos aleatórios
(plantas) com 0-20 cm de profundidade, acondicionados em sacos plásticos (média
de 2Kg de solo por amostra), em seis transectos (150m) nas área de coleta:
caatinga e restinga (figura 07, 08), totalizando 42 amostras em cada coleta, feitas
no final do período chuvoso (03/Julho) e no período de seca (24/Novembro) no ano
de 2015 (figura 09).
As amostras foram levadas ao Laboratório de Biologia de Micorriza (LBM)
para secagem em temperatura ambiente e 100g de cada foram encaminhadas para
caracterização química e física (pH e os macros nutrientes P, N, Mg, Al, K) na
Emparn e outras 50g foram destinadas à montagem de culturas armadilhas, para se
obter a esporulação de esporos que no momento da coleta não estavam
esporulando.
39
Figura 08. Transectos de coleta na RSDE Ponta do Tubarão. R1 e R2: restinga; E1
e E2: restinga com região de Ecótono; C1 e C2: caatinga. (Fonte:
Google Earth)
40
Figura 09. Fotos dos locais de coleta, na RSDE Ponta do Tubarão. A-B: restinga,
sendo A estação pós chuvosa e B estação seca; C-D: caatinga, sendo C
estação pós chuvosa e D estação seca; E-F: restinga com região de
Ecótono, sendo E estação pós chuvosa e F estação seca. (Fonte:
autoria própria)
41
3.2. ANÁLISES TAXONÔMICAS
Foram separados 100g de cada amostra para extração dos glomerosporos,
por meio do método de peneiramento úmido (GERDMANN; NICOLSON, 1963)
usando duas peneiras com abertura na malha de 150 mm/um e 63 mm/um,
centrifugação em água e sacarose 50% (JENKIS, 1964). Os esporos separados em
lupa óptica montados em lâminas com PVLG (ácido polivinílico lacto glicerol) e
PVLG + reagente de Melzer, secos em estufa a 70ºC por aproximadamente 24h e
encaminhados para subsequente visualização em microscópio óptico e identificação
morfológica (figura 10), seguindo as chaves de Goto (2009), Schenck & Pérez
(1990) e demais literaturas de descrições de espécies.
Figura 10. A – coleta de solo rizosférico (RDSE Ponta do Tubarão); B – montagem
de cultura armadilha na casa de vegetação da UFRN; C – peneiramento
úmido e centrifugação em sacarose; D – separação dos esporos em
ácido lático; E – Montagem de lâminas em PVLG e PVLG + Melzer; F –
42
identificação das espécies de acordo com as chaves de identificação; G
– Paradentiscutata maritima (espécie encontrada nas amostras da
restinga). (Fonte: autoria própria)
3.3 ANÁLISES ECOLÓGICAS
As análises ecológicas de riqueza, diversidade, equitabilidade e similaridade,
foram feitas pelo cálculo dos índices de Simpson (D= 1/ Σpi2), Shannon-Wiener (H’ =
-Σ pi ln pi), Pielou (J=H'/Hmax) e Jaccard (J=Scom/S), respectivamente, usando o
software Past (versão 3). Os dados físico-químicos do solo, avaliados na EMPARN
(Empresa de Pesquisa Agropecuária do RN), usados, para a matriz ambiental, são:
pH (1:25 em água), salinidade (1:5 dS.m-¹), P (mg.dm-³), N (g.dm-³), Mg (cmolc.dm-
³), Al(cmolc.dm-³), K (mg.dm-³). Tais dados foram obtidos para comparação da
riqueza e abundância das espécies, relacionando os resultados da diversidade e da
comunidade identificada com os fatores de influência presentes no solo.
Os dados da matriz de espécie foram transformados por meio da função
“hellinger” no software R (versão 3.2.1) e os dados ambientais foram transformados
pela função “standardize” pelo R. Antes disso usou-se o programa Past (versão 3)
para normalizar a matriz ambiental, o Nitrogênio foi normalizado por box copy, e os
outlier foram retirados para três variáveis: pH, Mg e K, sendo substituído pela média
do transecto ao qual os outlier pertenciam. Por fim foi feito uma RDA (Redundancy
Analysis - Análise de Redundância) para correlacionar á matriz ambiental e de
espécies (figura 14).
43
4. RESULTADOS
4.1 TAXONOMIA
Um total de 24 espécies foi encontrado ao longo do contínuo (tabela 01).
Todas estas espécies ocorrem na restinga e apenas 11 delas ocorrem na caatinga
(figura 11).
Tabela 01: Espécies de FMA encontradas ao longo de todo estudo e suas respectivas famílias.
ESPÉCIE FAMÍLIA Acaulospora sp.1¹
Acaulosporaceae
Acaulospora sp. 2¹ Acaulospora sp. 3 Acaulospora sp. 4 Acaulospora cf. herrerae Furrazola, B.T.Goto, G.A.Silva, Sieverd. & Oehl¹ Acaulospora reducta Oehl, B.T. Goto & C.M.R. Pereira Acaulospora cf. spinosissima Oehl, Palenz., Sánchez-Castro, Tchabi, Hount. & G. A. Silva Ambispora sp.1¹ Ambisporaceae Cetraspora sp.1¹
Racocetraceae Cetraspora gilmorei (Trappe & Gerd.) Oehl, F.A. de Souza &
Sieverd. Fuscutata rubra (Stürmer & J.B. Morton) Oehl, F.A. Souza & Sieverding ² Dentiscutataceae Dentiscutata hawaiiensis Koske & Gemma Gigaspora cf. albida N.C. Schenck & G.S. Sm.¹
Gigasporaceae Gigaspora margarita W.N. Becker & I.R. Hall¹ Scutellospora sp.1¹
Scutellosporaceae Scutellopora sp. 2¹ Rhizoglomus sp.11
Glomeraceae
Sclerocystis sp.1¹ Septoglomus furcatum Błaszk., Chwat & Kovács, Ryszka¹ Septoglomus sp.1 Septoglomus sp. 2 Glomus sp.1 Glomus sp.2 Paradentiscutata maritima B.T. Goto, D.K. Silva, Oehl & G.A. Silva
Intraornatosporaceae
1 Espécies encontradas exclusivamente na restinga. ² Espécie exclusiva da caatinga.
44
Figura 11. Presença das espécies em cada área, com sua representação em
número de esporos encontrados.
Oito (8) famílias foram registradas nesse estudo (figura 12), das 15 famílias
existentes no filo Glomeromycota. Para as famílias Acaulosporaceae,
Ambisporaceae, Gigasporaceae, Glomeraceae e Scutellosporaceae a restinga
apresentou maior número de espécies que a caatinga, sendo as famílias
Ambisporaceae e Gigasporaceae exclusivas da restinga (figura 12).
45
Figura 12. Número de espécies por família para cada ambiente coletado (restinga e
caatinga).
Quanto à sazonalidade das coletas para as ambas as áreas (período pós-
chuva e período seco), o número de esporos encontrados durante o período seco foi
maior para a maioria das espécies na catinga, assim como na restinga (figura 13).
Figura 13. Número de esporos por espécie em cada estação de coleta
representando a abundância das espécies na restinga e na caatinga.
46
4.2 ÍNDICES DE BIODIVERSIDADE
A similaridade aferida pelo índice de Jaccard para as duas áreas foi de 0,48; o
que demonstra que as áreas possuem cerca de 50% de similaridade, já que todas
as espécies encontradas na caatinga também ocorrem na restinga, mas o inverso
não é verdadeiro.
Expressando riqueza e uniformidade, a área mais diversa, segundo o índice
de Shannon-Wiener, foi a restinga, com valor de H’= 2,78, enquanto a caatinga
possui H’= 1,17. O índice de Pielou, o qual utiliza dos valores de h’ do Shannon-
Wiener, mostrou uma equitabilidade de 0,91 para a restinga e de 0,49 para a
caatinga, indicando que a restinga possui a riqueza de espécies e abundância delas
mais equilibradas entre si do que as espécies da caatinga. A riqueza de Simpson foi
de 0,92 na restinga e 0,48 na caatinga, mostrando que a restinga possui maior
riqueza do que a caatinga.
Os dados ambientais aferidos no solo, com seus parâmetros físico-químicos
analisados, demonstram que sua influência na distribuição de espécies no contínuo
não é significativa (figura 14). Essa influência dos dados ambientais sobre a
distribuição das espécies foi de 20% analisada pela Análise de Redundância, onde
os eixos mais significativos foram o RDA1 (eixo X) e RDA2 (eixo Y) os quais tiveram
como maior representatividade a salinidade e o pH, respectivamente, esses eixos
pela baixa influência demonstram um intervalo baixo para a distribuição das
espécies.
47
Figura 14. Análise de RDA de correlação entre a matriz ambiental e a riqueza e
abundância das espécies.
4.3 DESCRIÇÃO DE ESPÉCIES
Duas espécies encontradas são aqui descritas, uma por ser uma espécie
nova, a Acaulospora sp.2, e a Dentiscutata hawaiiensis por ser seu primeiro achado
no Brasil, além de que sua descrição histórica foi apenas morfológica e como
continuação deste trabalho tem-se a pretensão de sequenciar a região
LSU/ITS/SSU.
Acaulospora sp.2
48
Seus Glomerosporos são globosos (entre 45-104 μm) a subglobosos com
média de 49x43 μm de diâmetro. Coloração marrom escuro, castanho avermelhado
e castanho alaranjado. Com três (3) paredes externa, média e interna (ex, med e in),
cada uma contendo duas (2) camadas. Presença do sáculo esporífero em alguns
esporos. Figura 15.
Primeira camada da parede externa (ex1) com coloração alaranjada, com
ornamentações nesta camada, em forma de sulcos irregulares, com espinhos seu no
interior, em quantidades ≥ 7. Entre as depressões a camada permanece, formando
dessa forma o que parece vales e picos ao longo de todo o esporo. A segunda
camada (ex2) é expansiva de coloração vermelho mais intenso a laranja, o que torna
a segunda camada, quando nessa coloração mais laranja, difícil de ser distinguida
da primeira camada que já possui essa cor.
A parede média (med) é de difícil visualização e possui duas camadas, e
ambas são hialinas e semi-fléxiveis, altamente aderidas a parede interna. A parede
interna possui duas camadas também, ambas são hialinas, semi-flexiveis, a primeira
(in1) laminada, (in2) é “beaded”.
Outra espécie do mesmo gênero foi encontrada ao longo deste estudo, a
Acaulospora reducta, que comparando suas características com a espécie nova,
vemos esporos formados a partir do sáculo esporífero (típico do gênero), globosos a
subglobosos, com coloração marrom a castanho amarelado. Diâmetro dos
glomerosporos variando de 137,44 - 149 μm, ornamentações em depressões ao
longo da primeira parede (ex). Presença de três paredes nos esporos, sendo a
parede média e interna de dificil vizualização por ser aderidas, e com coloração
hialinas.
49
Figura 15: A-F Acaulospora sp.2, A-C: esporos montados em PVLG. D-F: esporos
montados em PVLG + reagente Melzer. Siglas: (orn) ornamentação em forma de
sulcos com espinhos no seu interior, primeira camada da parede externa, (ex)
parede externa, (ex1) primeira camada da parede externa, (ex2) segunda camada
da parede externa, (in) parede interna, (med) parede média, (med1) primeira
50
camada da parede média, (med2) segunda camada da parede média, (sac) sáculo
esporífero. (fonte: autoria própria)
Dentiscutata hawaiiensis (Koske & Gemma)
Glomerosporos isolados, formado na base do bulbo suspensor, com
coloração marrom escuro, alaranjado ou laranja escura. Globosos a subglobosos,
em média de 245,8 μm, com três (3) paredes: externa, média e interna.
A primeira parede (ex) formada por duas (2) camadas, a camada mais
externa (ex1) é de coloração marrom alaranjado a marrom avermelhado, unitária, a
segunda camada (ex2) é laminada, hialina a amarelo claro. A segunda parede (med)
constitui-se de duas (2) camadas: (med1) é coriácea e hialina, já a segunda camada
(med2) é chanfrada, ou seja, que se quebra em forma de V (típica dessa espécie) e
hialina. A última parede (in) também é formada de duas camadas (2): hialina e
coriácea (in1), hialina e amorfa (in2).
51
Figura 16: A-F Dentiscutata hawaiiensis, A-C: esporos montados em PVLG. D-F:
esporos montados em PVLG + reagente Melzer. Siglas: (ex) parede externa, (ex1)
primeira camada da parede externa, (ex2) segunda camada da parede externa, (in)
parede interna, (med) parede média, (med1) primeira camada da parede média,
(med2) segunda camada da parede média, (bs) bulbo suspensor, (hif) hifa do bulbo
suspensor. (fonte: autoria própria)
52
5. DISCUSSÃO
Este estudo registrou 24 espécies na restinga, destas, apenas 11 estão
presentes na caatinga, e uma delas exclusiva para o bioma Caatinga. Segundo o
site de inventário de plantas e fungos no Brasil, Flora do Brasil (2017), não há até o
momento nenhum registro de Fungos Micorrízicos Arbusculares na caatinga do
estado, para os demais estados do nordeste, já foi inventariado o número de: 86
espécies na caatinga e 36 na restinga. O que nos confirma que o bioma caatinga
tem sido estudado amplamente pelo nordeste (semiárido) do país, enquanto o RN
concentra e restringi suas coletas e estudos às áreas costeiras e vegetação de
restinga (mata atlântica).
Os espécimes vegetais, cujo solo rizosférico foi coletado, variam de
vegetação herbácea na restinga à vegetação arbustiva com presença de cactos e
bromélias na caatinga. Nosso trabalho apontou maior riqueza e abundância das
espécies nas áreas de coleta da restinga, cuja vegetação era predominantemente
herbácea. Segundo Silva (2013), o tipo de formação de esporo seguiu uma linha de
predominância no tipo de vegetação da restinga, onde: restinga arbórea apresentou
70% de espécies glomóides, e predominância de espécies gigasporóide na restinga
arbustiva. No entanto, somente o tipo de vegetação não pareceu influenciar as
populações de FMA, neste trabalho, assim essa influência não esta bem
estabelecida.
O estudo de FMA em restinga e dunas costeiras já foi realizado no sul e
sudeste do Brasil, variando de 12 a 47 espécies descritas (TRUFEM; VIRIATO,
1990; CÓRDOBA et al., 2001, TRUFEM, 1995). No nordeste brasileiro 46 espécies
foram descritas por Jobim & Goto (2016), distribuídas em 10 famílias distintas, em
estudo de áreas de dunas marítimas costeiras. O presente trabalho identificou
espécies de 8 destas 10 famílias anteriormente identificadas (figura 12):
Glomeraceae, Acaulosporaceae, Gigasporaceae, Scutellosporaceae,
Ambisporaceae, Racocetraceae, Dentiscutataceae e Intraornatosporaceae, todas
encontradas na restinga e cinco delas na caatinga (as famílias Ambisporaceae e
Gigasporaceae não foram encontradas na caatinga). Ambas as áreas
(restinga/caatinga) apresentam as famílias Glomeraceae e Acaulosporaceae como
53
mais representativas com número de espécies (figura 11). Este dado corrobora
outros achados em dunas do nordeste, por exemplo, Silva (2013) registrou em seu
trabalho a presença de espécies de Glomus e Acaulospora, em 60% das espécies
inventariadas, que totalizaram o número de 50 espécies encontradas em áreas de
dunas do litoral da Paraíba, município de Mataraca.
De fato, o gênero Acaulospora parece ser muito bem representado em
ambientes costeiros, sendo representados por espécies já descritas e bem
conhecidas, assim como espécies novas. Neste trabalho detectamos uma espécie
nova para o gênero Acaulospora, e sua descrição e publicação estão em
andamento. Esta nova espécie apresenta algumas peculiaridades em relação a
outras espécies do gênero, como a A. reducta; o tipo de ornamentação é a principal
diferença morfológica entre elas, já que a Acaulospora sp.2 possui ornamentação
em forma de depressões preenchidas por espinhos. Apesar de morfologicamente
distintas, o sequenciamento da região ITS, com primers descritos por Kruger et al
(2009), será de grande relevância para a confirmação desta nova entidade
taxonômica.
Neste trabalho contamos também com o primeiro registro para o Brasil da
espécie: Dentiscutata hawaiiensis, espécie usualmente identificadas no Havaí.
Como a descrição original da espécie D. hawaiiensis se deu em 1995, sem o uso de
ferramentas moleculares (KOSKE & GEMMA 1995), faz-se também necessária a
sua nova descrição, incluindo caracteres moleculares.
A sazonalidade não parece interferir na riqueza das espécies, mas sim na
abundância de esporos, uma vez que em ambas as áreas observou-se maior
abundância de esporos na seca. Porém, vale ressaltar que algumas espécies podem
se encontrar no ambiente e não estar esporulando na época da coleta ou seus
esporos estarem em condições de difícil identificação (ZANGARO; MOREIRA,
2010).
Apesar de a restinga ter, no geral, um maior número de esporos para a
maioria das espécies identificadas, a espécie Glomus sp.2 apresentou-se
significativamente mais numerosa na caatinga do que na restinga (figura 13). As
espécies mais abundantes, como o Glomus sp.2 são aquelas de formação
esporocárpica, ou seja, formam aglomerados de esporos com densa massa de hifas
54
protegendo os cachos de esporos. Estas espécies puderam ser encontradas em
forma de cachos na estação chuvosa, quando normalmente quando são formados,
tanto na restinga como na Caatinga. Já na seca estes esporos podem ser dispersos
no solo, e foram encontrados em grande número ao longo do contínuo.
O índice de equitabilidade demonstra em seu resultado que valores próximos
de 1 indicam que a área possui espécies igualmente abundantes, e valores próximos
a zero (0) indicam um desiquilíbrio na abundância das diferentes espécies. Assim,
em nosso estudo, a restinga apresentou espécies mais igualmente abundantes ao
longo do espaço coletado. A restinga é mais rica em espécies, mais abundante,
mais diversa e mais “equitavél”.
Apesar dessa discrepância de riqueza de espécies, aparentemente não há
variação ambiental (condições físico-químicas do solo) influenciando a comunidade
de FMA ao longo da zona de transição entre restinga e caatinga. Contudo, deve-se
chamar atenção para alguns sítios de coleta, demonstrados na figura 14 (sit, 16, 17,
18, 19 e 36), que destoam dos outros. Isso se dá não por influência das variáveis
ambientais, pois são sítios igualmente salinos como os outros, mas que por
aleatoriedade são os que apresentaram as espécies mais abundantes. Por este
motivo, graficamente eles estão distantes dos demais pontos, pois a característica
abundância das espécies nestes pontos acaba influenciando sua posição no plot do
gráfico da análise.
O RDA é uma análise que, assim como a PCA (Análise de Componentes
Principais), procura criar eixos mais significativos de representação dos elementos
mais influentes. Nossa análise, cujo objetivo foi relacionar variáveis abióticas de solo
com distribuição de espécies, demonstrou que os elementos ambientais possuem
20% de representatividade nesta distribuição; destes elementos, a salinidade e o pH
são os mais importantes. Esse valor, de 20%, é considerado de pouca influência,
uma representação ≥ 60% dos dados seria a porcentagem ideal para inferir a
influência destes fatores na determinação da composição de espécies neste caso.
Uma importante diferença ambiental entre os dois biomas avaliados é que os
solos arenosos das dunas favorecem o escoamento rápido da água da chuva
(FERNANDES, 2007), enquanto o solo mais argiloso da caatinga retém um pouco
mais a umidade, com isso as vegetações herbáceas das dunas são mais
55
frequentemente associadas à FMA (JOBIM; GOTO, 2016), o que corrobora nosso
achado maior número de espécies encontradas na restinga.
Os pontos de coleta com pH mais alto foram os da restinga. Este fator
ambiental é conhecido por favorecer a abundância e riqueza de espécies glomóide
(ZANGARO; MOREIRA, 2010; SILVA, 2013). De fato, em nossos resultados a
caatinga apresenta maior número de espécies com esporos glomóides, enquanto na
restinga os Glomus sensu lato, estão igualmente ricos a espécies acaulosporóides.
A menor diversidade encontrada na caatinga pode ser também aferida pela
condição salina do solo, já que em média o solo é mais salino na caatinga com
0.091 dS.m-¹ enquanto na restinga encontramos a maior salinidade com 0.045
dS.m¹. A salinidade é inversamente proporcional à riqueza de espécies, à medida
que o gradiente salino diminui com a distância do mar, ao longo de nossos pontos
de coleta, o número de esporos aumentou. Indo de 02-48 esporos no trecho de
intervalo de salinidade de 0,067-0,024 na Restinga, concordando com o trabalho de
Córdoba e colaboradores (2001), segundo o qual a menor abundância de esporos
foi registrada nas proximidades do mar e aumento da salinidade. Na caatinga, no
entanto, mesmo com a sua distância da influência marítima, temos a ocorrência de
atividade salina próximo á alguns pontos de coleta, explicando a ocorrência de
pontos mais salinos na caatinga do que a restinga.
A disponibilidade de P é um fator importante na distribuição e colonização de
espécies de FMA, afetando diretamente estes organismos (ARAÚJO et al., 2003), de
acordo com Cavalcante et al. (2002) a alta fertilidade do solo geralmente inibe a
relação simbiótica (MOREIRA; SIQUERA, 2002). Bressan et al. (2001), também
constatou que a ausência de P, N e K, diminuem o crescimento simbiótico. Em
nosso trabalho, as concentrações de P se mostraram menores na caatinga, podendo
também ser um dos fatores de influência na menor riqueza de espécies de FMA
nesta área, enquanto os índices de N e K são equiparáveis.
Dentre as variáveis ambientais acima citadas que poderiam ter relação com a
diversidade de espécies ao longo do contínuo restinga-caatinga, a salinidade nos
chama atenção, pelo fato de o Rio Grande do Norte ser o maior produtor de sal do
Brasil, com sua produção concentrada principalmente nos municípios de Macau
(local de nossa coleta), Areia Branca e Mossoró, sendo responsável por 90% da
56
produção nacional (AZEVEDO, 2013). A atividade salina atualmente se concentra no
oeste e noroeste do estado, no entanto encontramos outras zonas onde já foram
áreas de salinas e que se encontram abandonadas.
A colonização vegetal destas áreas certamente é possível graças a simbiose
com micro-organismos. Dentre os simbiontes desse cenário temos os FMA sendo
grandes responsáveis pela obtenção de resistência das plantas ao alto teor salino.
Alguns estudos têm demonstrado que a inoculação com fungos micorrízicos
arbusculares, principalmente isolados dos gêneros Acaulospora e Rhizoglomus, no
caso da Acaulospora, gênero abundante ao longo de todas as áreas coletadas,
melhora o crescimento das plantas sob uma variedade de condições de estresse
salino (TIAN et al., 2004; YANO-MELO et al., 2003). Tais achados elevam a
importância da pesquisa de comunidades de FMA em ambientes estressantes, como
o de nosso estudo. Além de colaborar com o inventário da diversidade da micobiota
de um dos biomas brasileiros mais ameaçados, estes estudos contribuem com a
bioprospecção de espécies de FMA com potencial uso no melhoramento de
cultivares em ambientes inóspitos ou reflorestamento de áreas degradadas.
57
6. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho nos permitem ver a grande
potencialidade da área de transição entre restinga-caatinga no estudo de
diversidade de Fungos Micorrízicos, assim como do bioma Caatinga no RN.
O continuo restinga-caatinga se demonstrou homogêneo em composição nos
aspectos ambientais, tornando a distribuição das espécies aleatória.
A Restinga é mais diversa do que a Caatinga.
De maneira geral, as espécies de FMA apresentam maior abundância de
esporos no período seco, indicando a influência sazonal na esporulação das
mesmas.
Este trabalho apresenta o primeiro registro de Dentiscutata hawaiiensis no
Brasil. Sua descrição molecular está em andamento.
Dentre os fatores abióticos do solo, a salinidade pareceu influenciar a
diversidade de espécies encontradas entre os dois ambientes, indicando um possível impacto ambiental negativo de uma das principais atividades econômicas do RN, as salinas.
58
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMES, R.N.; SCHNEIDER, R.W. 1979. Entrophospora, a new genus in the
Endogonaceae. Mycotaxon. 8 (2):347-352.
ARAÚJO, C.V.M.; SANTOS, O.M.; ALVES, L.A.; MUNIZ, C.R.R. 2003. Fungos
micorrízicos arbusculares em espécies de Melastomaceae no Parque Metropolitano
de Pituaçu, Salvador-Bahia-Brasil. Sitientibus série Ciência Biólogicas, 3(1/2): 115 –
119.
AZEVEDO, F.F. 2013. REESTRUTURAÇÃO PRODUTIVA NO RIO GRANDE DO
NORTE. Mercator, Fortaleza, v. 12, número especial (2)., p. 113-132.
BAGO, B.; PFEFFER, P. E.; ABUBAKER, J.; JUN, J.; ALLEN, J. W.; BROUILLETTE
J.; DOUDS, D. D.; LAMMERS, P. J.; SHACHAR-HILL, Y. 2003. Carbon export from
arbuscular mycorrhizal roots involves the translocation of carbohydrate as well as
lipid. Plant Physiol. 131: 1496–1507.
BERKELEY, M.J.; BROOME, C.E. 1874. Enumeration of the fungi of Ceylon. Part II.
Botanical Journal of the Linnean Society. 14:29-141.
BŁASZKOWSKI, J., CHWAT, G., GÓRALSKA, A., GOTO, B.T. 2014. Rhizophagus
natalensis, a new species in the Glomeromycota. Mycotaxon. 129(1):97-108.
BŁASZKOWSKI, J; CHWAT, G.; SYMANCZIK, S.; GÓRALSKA, A. 2015. Dominikia
duoreactiva sp. nov. and Dominikia difficilevidera sp. nov., two new species in the
Glomeromycota. Botany Vol. 93.
BRESSAN, W.; SIQUEIRA, J.O.; VASCONSELHOS, C.A.; PURCINO, A.A.C. 2001.
Fungos micorrízicos e fósforo, no crescimento, nos teores de nutrientes e na
produção de sorgo e soja consociados.
59
BUÉE, M.; ROSSIGNAL, M.; JAUNEAU, A.; RANJEVA, R.; BÉCARD, G. 2000. The
pré-symbiotic growth of arbuscular mycorrhizal fungi is induced by a branching factor
partially purified from plant root exudates. Molecular Plant Microbe Interactions, 13:
693-698.
CABELLO, M.; GASPAR, L.; POLLERO, R. 1994. Glomus antarticum sp.nov., a
vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus from Antártica. Mycotaxon LI: 123-128.
CAVALCANTE, U.M.T.; GOTO, B.T.; MAIA, L.C. 2009. Aspectos da simbiose
micorrízica arbuscular. Anais da Academia Pernambucana de Ciência Agronômica,
Recife, 5 e 6: 180-208.
CAVALCANTE, U.M.T.; MAIA, L.C.; COSTA, C.M.C.; CAVALCANTE, A.T.;
SANTOS, V.F. 2002. Efeito de fungos micorrízicos arbusculares, da adubação
fosfatada e da esterilização do solo no crescimento de mudas de maracujazeiro
amarelo.
CORDAZZO, C.V.; STÜRMER, S.L. 2007. Ocorrência de fungos micorrízicos
arbusculares em Panicum racemosum (P. Beauv.) Spreng (Poaceae) em dunas
costeiras do extremo sul do Brasil. Atlântica Rio Grande, 29, n. 1, p. 65-68.
CÓRDOBA, A.S., MENDONÇA, M.M., STÜRMER, S.L. & RYGIEWICZ, P.T. 2001.
Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi along a sand dune stabilizatoin gradient: a
case study at Praia da Joaquina, Ilha de Santa Catarina, South Brasil. Mycoscience,
42, p. 379-387.
COSTA, H.S.; RUIZ, W.F.R.; LAMBAIS, M.R. 2000. Ácido salicílio inibe a formação
de micorrizas arbusculares e modifica a expressão de quitinases e 1,3- glucanases
em raízes de feijoeiro. Scientia Agricola, 57: 19-25.
DA SILVA, G.A.; LUMINI, E.; BIANCIOTTO, V.; BONFANTE, P.; MAIA, L.C. 2011.
Discrimination of Gigaspora species by PCR specific primers and phylogenetic
analysis. Mycotaxon Vol. 118, pp. 17–26.
60
DÉBAUD, J.C.; MARMEISSE, R.; GAY, F. 1999. Intraespecific genetic variation in
ectomycorrhizal fungi. In: VARMA, A. & HOCK, B. eds. Mycorrhizal: Structure,
Function, Molecular, Biology and Biotechnology. Berlin, Springer Verlag, p. 79-113.
DOTZLER, N.; WALKER, C.; KRINGS, M.; HASS, N.; KERP H.; TAYLOR, T.N.;
AGERER, R. 2009. Acaulosporoid glomeromycotan spores with a germination shield
from the 400-million- year-old Rhynie chert. Mycological Progress 8: 9–18.
EMBRAPA. 2006. Sistema brasileiro de classificação de solos. 2ª Edição, Rio de
Janeiro, Embrapa Solos.
FERNANDES, A. 2007. Fitogeográfica Brasileira – Fundamentos Fitogeográficos:
Fitopaleontologia, Fitoecologia, Fitossociologia, Fitocorologia. 3ª edição, Fortaleza
editora UFC.
FLORA DO BRASIL. 2017. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em:
<http://floradobrasil.jbrj.gov.br/reflora/floradobrasil/FB125775>. Acesso em: 29 Jan.
2017
GASPAROTTO, F.A.; NAVARRETE, A.A.; SOUZA, F.A.; TSAI, S.M. 2010. Técnicas
moleculares aplicadas ao estudo de micorrizas. In: Siqueira, J.O.; de Souza, F.A.;
Cardoso, E.J.B.N.; Tsai, S.M. (Org.). Micorrizas: 30 anos de pesquisas no Brasil. 1
ed. Lavras: Editora UFLA, p. 551-581.
GERDEMANN, J.W.; NICOLSON, T.H. 1963. Spores of Mycorrhizal Endogone
species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British
Mycological Society 46: 235-244.
GERDEMANN, J.W.; TRAPE, J.M. 1974 The Endogonaceae in the Pacific North
West. Mycologia Memoirs 5: 1-76.
61
GOTO, B.T.; MAIA, L.C. 2006. Glomerospores: a new denomination for the spores of
Glomeromycota, a group molecularly distinct from the Zygomycota. Mycotaxon 96:
129–132.
GOTO, B.T. 2009. Taxonomia de Glomeromycota: revisão morfológica, chaves
dicotômicas e descrição de novos táxons. Tese de doutorado. Universidade Federal
de Pernambuco, Brasil.
GOTO, B.T.; SILVA, G.A.; YANO-MELO, A.M.; MAIA, L.C. 2010. Checklist of
arbuscular Mycorrhizal fungi (Glomeromycota) in the Brazilian semiarid. Mycotaxon
113: 251-254.
GOTO, B.T.; SILVA, G.A.; MAIA, L.C.; SOUZA, R.G.; COYNE, D.; TCHABI, A.;
LAWOUIN, L.; HOUNTONDJI, F.; OEHL, F. 2011. Racocetra tropicana, a new
species in the Glomeromycetes from tropical areas. Nova Hedwigia 92 (1–2): 69–82.
GOTO, B.T.; JARDIM, J.G.; DA SILVA, G.A.; FURRAZOLA, E.; TORRES-ARIAS, Y.;
OEHL, F. 2012. Glomus trufemii (Glomeromycetes), a new sporocarpic species from
Brazilian sand dunes. Mycotaxon. 120:1-9
GOTO, B.T.; SILVA, G.A.; DE ASSIS, D.M.A. SILVA, D.K.A.; SOUZA, R.G.;
FERREIRA, A.C.A.; JOBIM, K.; MELLO, C.M.A.; VIEIRA, H.E.E.; MAIA, L.C.; OEHL,
F. 2012. Intraornatosporaceae (Gigasporales), a new Family with two new genera
and two new species. Mycotaxon 119: 117-132.
HELGASON, T.; FITTER, A. 2005. The ecology and evolution of the arbuscular
mycorrhizal fungi. Mycologist 19: 96–101.
IDEMA. Disponível em: http://www.idema.rn.gov.br/ Acessado em: 29/03/2015.
JANOS, D.P. 1980. Mycorrhizae influence tropical sucession. Biotropica, v. 12, p. 56-
96.
62
JENKINS, W.R. 1964. A rapid centrifugal flotation technique for separating
nematodes from soil. Plant Disease Reporter 48: 692.
JOBIM, K.; GOTO, B.T. 2016. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi
(Glomeromycota) in maritime sand dunes of Brazilian northeast. Studies in Fungi 1
(1): 43–55.
KASUYA, M.C.M.; COSTA, M.D.; ARAÚJO, E.F.; BORGES, A.C.; MENDONÇA,
M.M. 2010. Ectomicorrizas no Brasil: biologia e nutrição de plantas. In: Siqueira,
J.O.; de Souza, F.A.; Cardoso, E.J.B.N.; Tsai, S.M. (Org.). Micorrizas: 30 anos de
pesquisas no Brasil. 1 ed. Lavras: Editora UFLA, p 615-645.
KOIDE, R.T. 2005. Nucleic acid isolation from ecological samples – fungal
associations, mycorrhizae. Meth Enzym, 395:58-72.
KOSKE, R.E.; GEMMA, J.N. 1995. Scutellospora hawaiiensis (Gigasporaceae):a
new species of arbuscular mycorrhizal fungi from Hawaii. Mycologia. 87:678-683
KRÜGER, M.; STRORCKINGER, H.; KRÜGER, C.; SCHÜSSLER, 2009. A. DNA-
based species level detection of Glomeromycota: one PCR primer set for all
arbuscular Mycorrhizal fungi. New Phytol. 2009;183 (1):212-23.
LAMBAIS, M.R.; RUIZ, W.F.R.; ANDRADE R.M. 2003. Antioxidant responses in
bean (Phasseolus vulgaris) roots colonized by arbuscular mycorrhizal fungi. New
Phytol, 160:421-428.
LAMBAIS, M.R.; RAMOS, A.C. 2010. Micorrizas Arbusculares nos Biomas Floresta
Atlântica e Floresta de Araucária. In: Siqueira, J.O.; de Souza, F.A.; Cardoso,
E.J.B.N.; Tsai, S.M. (Org.). Micorrizas: 30 anos de pesquisas no Brasil. 1 ed. Lavras:
Editora UFLA, p. 119.
63
LEAL, I.R.; TABARELLI, M.; SILVA, J.M.C. 2003. Ecologia e Conservação da
Caatinga. Editora Universitária. UFPE, Recife, Brasil.
LEAL, I.R.; SILVA, J.M.C.; TABARELLI, M.; LACHER, JR.T.E. 2005. Mudando o
curso da conservação da biodiversidade na Caatinga do Nordeste do Brasil.
Megadiversidade 1: 139-146.
LEE, J.; LEE, S.; YOUNG, J.P.W. 2008 Improved PCR primers for the detection and
identification of arbuscular mycorrhizal fungi. FEMS Microbiol. Ecol., 65:339-349.
MAIA, L.C.; CAVALCANTE, U.M.T. 2005. Estresses ambientais: danos e benefícios
para as plantas. Respostas fisiológicas de plantas micorrizadas. Recife: UFRPE,
imprensa universitária, 500p. il., tabs.
MAIA, L.C.; SILVA, F.S.B.; GOTO, B.T. 2010. Estrutura, ultraestrutura e germinação
de glomerosporos. In: Siqueira, J.O.; de Souza, F.A.; Cardoso, E.J.B.N.; Tsai, S.M.
(Org.). Micorrizas: 30 anos de pesquisas no Brasil. 1 ed. Lavras: Editora UFLA 1:
77–120.
MAIA, L.C.; SILVA, G.A.; YANO-MELO, A.M.; GOTO, B.T. 2010. Fungos
micorrízicos arbusculares no bioma caatinga. In: Siqueira, J.O.; de Souza, F.A.;
Cardoso, E.J.B.N.; Tsai, S.M. (Org.). Micorrizas: 30 anos de pesquisas no Brasil. 1
ed. Lavras: Editora UFLA, p 311 – 339.
MATHIMARAN, N.; FALQUET, L.; INEICHEN, K.; PICARD, C.; REDECKER, D.;
BOLLER, T.; WIEMKEN, A. 2008. Microsatellites for disentangling underground
networks: Stain-specific identifation of Glomus intraradices, an arbuscular
mycorrhizal fungus. Fungal Gen. Biol., 45:812-817.
MARTIN, F.; GIANINAZZI-PEARSON, V.; HIJRI, M.; LAMMERS, P.; REQUENA, N.;
SANDERS, I.R.; SHACHAR-HILL, Y.; SHAPIRO, H.; TUSKAN, G.A.; YOUNG,
64
J.P.W. 2008. The long hard road to a completed Glomus intraradices genome. New
Phyton, 180(4):747-750.
MARX, J. 2004. The roots of plant–microbe collaborations. Science 304, 234–236.
MAZZOCHINI, G.G. 2014. Plant diversity influencing structure and functioning of
caatinga vegetation. Tese de doutorado, Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Brasil.
MMA. 2005. Conservação e uso sustentável em áreas protegidas e corredores: uma
contribuição para a superação da pobreza nos biomas caatinga e cerrado. Brasília,
DF: Ministério do Meio Ambiente. 07-12p.
MMA. 2007. Áreas prioritárias para conservação, uso sustentável e repartição de
benefícios da biodiversidade brasileira: atualização - portaria mma n° 9, de 23 de
janeiro de 2007. Ministério do Meio Ambiente, Secretaria de Biodiversidade e
Florestas. 301p.
MOREIRA, F.M.S.; SIQUEIRA, J.O. 2002. Microbiologia e Bioquímica do Solo.
MORTON, J.B.; BENNY, G.L. 1990. Revised classification of arbuscular mycorrhizal
fungi (Zygomycetes): a new order, Glomales, two new suborders, Glomineae and
Gigasporineae, and two new families, Acaulosporaceae and Gigasporaceae, with an
emendation of Glomaceae. Mycotaxon. 37:471-491.
MORTON, J.B.; MSISKA, Z. 2010. Phylogenies from genetic and morphological
characters do not support a revision of Gigasporaceae (Glomeromycota) into four
families and five genera. Mycorrhiza, v. 20,p. 483–496.
NEWSHAM, K.K.; FITTER, A.H.; WATTERSON, A.R. 1995. Arbuscular mycorrhiza
protect an annual grass from root pathogenic fungi in the field. Journal of Ecology
65
83,991–1000.
OEHL, F.; SIEVERDING, E. 2004. Pacispora,a new vesicular arbuscular mycorrhizal
fungal genus in the Glomeromycetes. Journal of Applied Botany, v. 78, p. 72 82.
OEHL, F.; SÝKROVÁ,Z.; BLASZKOWSKI, J; SÁNCHEZ-CASTRO, I; COYNE, D;
TCHABI, A.; LAWOUIN, L; HOUNTONDII, F.C.C.; SILVA, G.A. 2011a. Acaulospora
sieverdingii, an ecollogically diverse new fungus in the Glomeromycota, described
from lowland temperature Europe and tropical WestAfrica. Journal of Applied Botany
and Food Quality,v. 84, n. 1, p. 47-53.
OEHL, F.; SIEVERDING, E.; PALENZUELA, J.; INEICHEN, K.; DA SILVA, G.A.
2011b. Advances in Glomeromycota taxonomy and classification. IMA Fungus,2, p.
191-199.
OEHL F.; DA SILVA,G.A.; GOTO, B.T.; MAIA, L.C.; SIEVERDING, E. 2011c.
Glomeromycota: two new classes and a new order.
OEHL, F.; DA SILVA, G.A.; SÁNCHEZ-CASTRO, I.; GOTO, B.T.; MAIA, L.C.;
VIEIRA, H.E.E.; BAREA, J-M.; SIEVERDING, E.; PALENZUELA, J. 2011f. Revision
of Glomeromycetes with entrophosporoid and glomoid spore formation with
entrophosporoid and glomoid spore formation with three new genera. Mycotaxon, v.
117, p. 297-316.
OLIVEIRA-FILHO, A.T.; FONTES, M.A.L. 2000. Patterns of floristic differentiation
among Atlantic forests in southeastern Brazil and the influence climate. Biotropica 32
(4): 793 – 810.
OLIVEIRA-FILHO, A. T. 2009. Classificação das fitofisionomias da América do Sul
Cisandina tropical e subtropical: proposta de um novo sistema–prático e flexível–ou
uma injeção a mais de caos? Rodriguésia 60(2): 237-258.
66
ÖPIK, M.; MOORA, M.; ZOBEL, M.; SAKS, U.; WHEATLEY, R.; WRIGHT, F.;
DANIELL, T. 2008. High diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in a boreal herb-rich
coniferous Forest. New Phytologist 179 (3): 867–876.
PARNISKE, M. 2008. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root
endosymbioses. Nature Reviews Microbiology 6, 763-775.
PIROZYNSKI, K.A.; DALPÉ, Y. 1989. Geological history of the Glomaceae with
particular reference to mycorrhizal symbiosis. Symbiosis. 7:1-36.
REDECKER, D. 2000. Specific PCR primers to identify arbuscular mycorrhizal fungi
(Glomales) within colonized roots. Mycorrhiza, 10:73-80.
REDECKER, D., KODNER, R., GRAHAM, L. E. 2000. Glomalean Fungi from the
Ordovician. Science 289: 1920-1930.
RIZZINI, C.T. 1997. Tratato de fitogeografia do Brasil – aspectos ecológicos,
sociológicos e florísticos. Ed. Âmbito Cultural, Rio de Janeiro, 747p.
SBRANA, C.; GIOVANNETI, M. 2005. Chemotropism in the arbuscular mycorrhizal
fungus Glomus mosseae. Mycorrhizal, 15: 539-545.
SCHENCK, N.C.; PEREZ, Y. 1990. Manual for the identification of VA mycorrhizal
fungi. 3nd Ed. Synergistic Publications, Gainsville, Fla.
SCHÜSSLER, A.; SCHWARZOTT, D.; WALKER, C. 2001. A new fungal phylum, the
Glomeromycota: phylogeny and evolution. Mycological Research 105: 1413–1421.
SIEVERDING, E.; SILVA G.A.; BERNDT R.; OEHL, F. 2014. Rhizoglomus, a new
genus of the Glomeraceae. Mycotaxon. 129(2):373-386.
67
SILVA, D. K. A. da. 2013. Diversidade e ecologia de fungos micorrízicos
arbusculares em áreas de dunas e restingas naturais e revegetadas após atividade
de mineração no município de Mataraca, Paraíba. Tese de doutorado. Universidade
Federal de Pernambuco, Recife: O Autor, 2013.
SILVA, J. L. A.; SOUZA, A. F.; JARDIM, J. G.; GOTO, J. G. 2015. Community
assembly in harsh environments: the prevalence of ecological drift in the heath
vegetation of South America. Ecosphere. Volume 6(7), 111.
SIQUEIRA, J.O., LAMBAIS, M. R., STÜRMER. S. L. 2002. Fungos Micorrízicos
Arbusculares: Características, associação simbiótica e aplicação na agricultura.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 25: 12 – 21.
SMITH, S.E.; READ, D. 2008. Mycorrhizal Symbiosis. 3nd ed. Academic Press, San
Diego. 787p.
SOUZA, R.G.; MAIA, L.C.; SALES, M.F.; TRUFEM, S.F.B. 2003. Diversidade e
potencial de infectividade de fungos micorrízicos arbusculares em área de caatinga,
na Região de Xingó, Estado de Alagoas, Brasil. Revista Brasileira de Botânica 26(1):
49-60.
SOUZA, F.A. de; KOWALCHUK, G.A.; LEEFLANG. P; VAN VEEN, J.A.; SMIT, E.
2004. PCR-denaturing Gradient gel electrophoresis profiling of inter- and intraspecies
18S rRNA gene sequence heterogeneity is an accurate and sensitive method to
assess species diversity of arbuscular mycorrhizal fungi of the genus Gigaspora.
Appl. Environ. Microbiol. 70: 1413–1424.
SOUZA, F.A.; DA SILVA, I.C.L.; BERBARA, R.L.L. 2007. Fungos Micorrízicos
Arbusculares: muito mais diversos do que se imaginava. Biodiversidade, 14-15, p.
483-536.
68
SOUZA, F.A.; STÜRMER, S. L.; CARRENHO, R.; TRUFEM, S. F. B. 2010.
Classificação e taxonomia de fungos micorrízicos arbusculares e sua diversidade e
ocorrência no Brasil. In: Siqueira, J.O.; de Souza, F.A.; Cardoso, E.J.B.N.; Tsai, S.M.
(Org.). Micorrizas: 30 anos de pesquisas no Brasil. 1 ed. Lavras: Editora UFLA, p 15
– 73.
SUDOVÁ, R.; SÝKOROVÁ, Z.; RYDLOVÁ, J.; ČTVRTLÍKOVÁ M.; OEHL, F. 2015.
Rhizoglomus melanum, a new arbuscular mycorrhizal fungal species associated with
submerged plants in freshwater lake Avsjøen in Norway. Mycol Progress 14:9.
STÜRMER, S. L.; MELLONI, R.; CAPRONI, A.L. 2010. Micorrizas arbusculares em dunas marítimas e em áreas de mineração In: Siqueira, J.O.; de Souza, F.A.; Cardoso, E.J.B.N.; Tsai, S.M. (Org.). Micorrizas: 30 anos de pesquisas no Brasil. 1 ed. Lavras: Editora UFLA, p 341 – 360.
TIAN, C.Y.; FENG, G.; LI, X.L.; ZHANG, F.S. 2004. Different effects of arbuscular
mycorrhizal fungal isolates from saline or non-saline soil on salinity tolerance of
plants. Applied Soil Ecology 26: 143–148.
TOWNSEND, C. R.; BEGON, M.; HARPER, J. L. 2010. Fundamentos da Ecologia.
3ª edição, Porto Alegre, Artmed.
TRUFEM, S.F.B.; VIRIATO, A. 1990. Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares da
Reserva Biológica do Alto da Serra de Paranapiacaba, SP, Brasil, Revista Brasileira
de Botânica, 13: 49-54.
TRUFEM, S.F.B. 1995. Aspectos ecológicos de fungos micorrízicos arbusculares na
rizosfera de plantas de restinga da Ilha do Cardoso, SP, Brasil. Revista Brasileira de
Botânica 18(1):51-60.
69
TULASNE, L.R.; TULASNE, C. 1844. Fungi nonnulli hypogaei, novi v. minus cogniti.
Giornale Botanico Italiano. 2(7-8):55-63
VANDENKOORNHUYSE, P.; RIDGWAY, K.P.; WATSON, I.J.; FITTER, A.H.;
YOUNG, J.P.W. 2003. Co-existing grass species have distinctive arbuscular
mycorrhizal communities. Mol. Ecol., 12:3085-3095.
WALKER, C; VESTBERG, M.; DEMIRCIK, F.; STOCKINGER, H.; SAITO, M.;
SAWAKI, H.; NISHMURA, I.; SCHUESSLER, A. 2007. Molecular phylogeny and a
new taxa in the Achaeosporales (Glomeromycota): Ambispora fennicagen. sp. nov.,
Ambisporaceae fam. nov., and emendation of Archaeospora and Archeosporaceae.
Mycological Research, v.111, p. 253-256.
YANG, Y.; CHEN, Y.; LI, W. 2008. Arbuscular mycorrhizal fungi infection in desert
riparian forest and its environmental implications: A case study in the lower reach of
Tarim River. Progress in Natural Science 18: 983–991.
YANO-MELO, A.M.; SAGGIN, O.J.; MAIA, L.C. 2003. Tolerance of mycorrhized
banana (Musa sp. cv. Pacovan) plantlets to saline stress. Agriculture, Ecosystems
and Environment 95: 343–348.
ZANGARO, W.; MOREIRA, M. 2010. Micorrizas Arbuculares nos Biomas Floresta
Atlântica e Floresta de Araucária. In: Siqueira, J.O.; de Souza, F.A.; Cardoso,
E.J.B.N.; Tsai, S.M. (Org.). Micorrizas: 30 anos de pesquisas no Brasil. 1 ed. Lavras:
Editora UFLA, p. 280.
www.mycobank.org Acessado em: 19/03/2016.
http://glomeromycota.wix.com/lbmicorrizas Acessado em: 20/03/2016.
70
8. ANEXOS
SCRIPT DA RDA ESPÉCIES X DADOS AMBIENTAIS
71
72
73
74
75
76
77