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Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento

e Inovação Tecnológica em Medicamentos

DAYANNE LOPES PORTO

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA A AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA

STIGMURINA, UM PEPTÍDEO DO ESCORPIÃO Tityus stigmurus

NATAL – RN

2019

DAYANNE LOPES PORTO

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA A AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA

STIGMURINA, UM PEPTÍDEO DO ESCORPIÃO Tityus stigmurus

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação

Tecnológica em Medicamentos da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte (PPgDITM/UFRN),

como requisito para obtenção do título de Doutor em

Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em

Medicamentos

Orientador: Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão

Co-Orientador: Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa

NATAL – RN

2019

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263

CDU 615.281 RN/UF/BS-CCS

1. Stigmurina - Tese. 2. Peptídeo Sintético - Tese. 3.

Degradação Forçada - Tese. 4. Degradação Térmica - Tese. I.

Aragão, Cícero Flávio Soares de. II. Pedrosa, Matheus de Freitas

Fernandes. III. Título.

Porto, Dayanne Lopes.

Desenvolvimento de metodologia para a avaliação da qualidade

da stigmurina, um peptídeo do escorpião Tityus stigmurus /

Dayanne Lopes Porto. - 2019.

177f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em

Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos. Natal,

RN, 2019.

Orientador: Cícero Flávio Soares de Aragão.

Coorientador: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa.

Tinha uma pedra no meio do caminho,

No meio do caminho tinha uma pedra,

Tinha uma pedra,

Um muro,

Uma montanha,

Problemas de saúde

Pessoas,

Cansaço....

E lutei, e lutarei para sempre conjugar o verbo no passado.

Dedico esta tese aos meus filhos, João

Pedro e Luíze. Eles me ensinaram que um

filho carrega, mas que o pão debaixo do

braço, traz a tese, o artigo e tudo aquilo que

não sabemos que podemos ser.

AGRADECIMENTOS

A Deus pela benção da vida, por estar ao meu lado em todos os momentos, pela força

e coragem em mim depositada durante os dias mais difíceis, sem Ele eu nada seria.

A minha família, especialmente a minha mãe, Janilza Lopes de Brito, pela presença

constante, me apoiando e aconselhando, pelo exemplo de vida, dedicação e incentivo

aos estudos.

A minhas irmãs Deyse Cristine e Daíse Lopes Porto pela presença, carinho e

cumplicidade em tantos momentos. Somos diferentes, mas diferentemente nos

completamos.

Aos meus sobrinhos João Lucas, David e Clara Victoria, por me proporcionarem

momentos de alegria incondicionais e serem o alívio nos momentos de cansaço.

Ao meu esposo Cleber Vieira da Silva, pelo companheirismo, amadurecimento,

compreensão nas ausências, muitas vezes necessárias e pelo apoio nos momentos

difíceis.

Aos meus filhos João Pedro e Luíze por serem motivos de revolução em meu ser, por

me inspirarem a desejar ser, e fazer, o melhor sempre.

Ao professor, Cícero Flávio Soares Aragão por acreditar em mim, por todo apoio, pelos

seus ensinamentos, pela tranquilidade repassada em todos os momentos e inspiração

na pesquisa.

Ao professor, Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa pela confiança depositada, por

todo apoio, pelos ensinamentos e inspiração na pesquisa.

A professora, Ana Paula Gomes pelos ensinamentos em análise térmica, por todo

apoio, pela disponibilidade de sempre ouvir e inspiração na pesquisa.

Ao professor, Leandro de Santis Ferreira pelos ensinamentos em espetroscopia de

massas, por todo apoio e inspiração na pesquisa.

A professora, Renata Mendonça pela parceria, disponibilidade, ensinamentos em

espetroscopia de massas e análises infravermelho, por todo apoio e inspiração na

pesquisa.

A colega, Alessandra pela parceira, disponibilidade e apoio para realização dos

ensaios in vitro de atividade biológica, entusiasta no estudo da stigmurina.

As colegas de trabalho Regina, Thereza Mylene, Nilma e Nayanna Luíza pela ajuda

incondicional, pelos momentos de partilha e convivência fraterna.

A todos da família LCQMed, em especial aos alunos de iniciação científica Fernando,

Rodrigo, Edson, George, Tayenne e Breno por serem minhas mãos e pés nos

momentos de dificuldades e sempre dispostos a ajudar.

Às colegas de vida e profissão, Fátima Duarte, inspiração como doutoranda,

profissional e mãe, e Luciana Nobre, pelos aconselhamentos, pela parceria, pelo

exemplo de vida e disponibilidade em todos os momentos. Como foi bom ter, e fazer

amigos nessa trajetória.

Ao Departamento de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN) pela oportunidade de realizar este doutorado e todo auxílio e compreensão

na liberação para afastamento parcial das atividades desempenhadas no mesmo.

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) pela oportunidade de realizar

este doutorado.

Ao Instituto de Química da Universidade de São Carlos nas pessoas de Carla e prof.

Éder Cavalheiro pela total abertura, ensinamentos e disponibilidade para realização

de experimentos de ciclo aquecimento-resfriamento em DSC

Ao Laboratório de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos (LCQPF) da

Universidade Federal da Paraíba (UFPB) pelas análises do DSC-Fotovisual.

Ao Laboratório de Caracterização Estrutural dos Materiais da UFRN nas pessoas de

Carla Laíze dos Santos Cruz Costa e Ígor Zumba Damasceno pelas análises MEV,

DRX e FRX, bem como simpatia e ensinamentos repassados.

Ao Laboratório de Análise Térmica do Instituto de Química da UFRN na pessoa de

Joadir pelas análises TG-FTIR, bem como simpatia e ensinamentos repassados.

Ao NUPRAR na pessoa de professora Renata Araújo, pela abertura e disponibilidade

para realização das análises de pirólise.

Ao Laboratório de Controle de Qualidade do Núcleo de Pesquisa em Alimentos e

Medicamentos (NUPLAM) pela doação de alguns materiais de laboratório necessários

a execução deste trabalho.

À todos que contribuíram na minha formação profissional em especial a Farmacêutica

Jovita, ao Farmacêutico Severino Júnior Granjeiro e todos do LAFEPE, a Prof.(a)

Darízy Flávia Silva, a Prof.(a) Aldeídia, ao Prof. Isac Almeida de Medeiros, aos colegas

contemporâneos do LTF (Thiago, Maria do Carmo, Fabíola, Angélica, George,

Couras, Thaís) .

A grande amiga Narayanna Martins Dantas, companheira de faculdade, de vida e de

profissão. Iniciamos a jornada na Farmácia juntas, caminhamos juntas no início, e

depois, seguimos cada uma sua jornada na vida e profissão. Amiga você é inspiração

e certeza de que um amigo verdadeiro, mesmo longe, se faz sempre presente.

Aos familiares e amigos que me ajudaram e comemoram comigo a conclusão deste

trabalho.

Por fim, não poderia deixar de agradecer àqueles que não acreditaram em mim, pois

o desafio de superar os descrentes é, e foi, um incentivo enorme para a realização

deste trabalho.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUÇÃO............................................................................... 24

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA..................................................... 26

2.1 O ESCORPIÃO Tityus stigmurus................................................... 26

2.2 O PEPTÍDEO STIGMURINA.......................................................... 30

2.3 PERFIL DE IMPUREZAS EM PEPTÍDEOS................................... 32

2.4 ESTABILIDADE DE PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS......................... 35

2.5 ANÁLISE TÉRMICA E SUAS APLICAÇÕES NO ESTUDO DE

PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS......................................................... 36

2.6 CROMATOGRAFIA APLICADA A ANÁLISE DE

PEPTÍDEOS.................................................................................. 41

2.6.1 Cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE.......................... 42

2.6.2 Cromatografia líquida de ultra eficiência – CLUE......................... 46

2.7 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

PARA ANÁLISE DE PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS.......................... 47

2.7.1 Avaliações prévias a validação...................................................... 55

2.7.1.1 Estabilidade de soluções............................................................... 55

2.7.1.2 Teste de adequabilidade/verificação do sistema........................... 55

2.8 ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA............ ...................... 58

2.9 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS......................... 60

3 OBJETIVOS.................................................................................. 63

3.1 OBJETIVO GERAL........................................................................ 63

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................... 63

4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................. 65

4.1 MATERIAL..................................................................................... 65

4.1.1 Stigmurina...................................................................................... 65

4.1.2 Reagentes...................................................................................... 65

4.1.3 Material de laboratório.................................................................... 66

4.2 MÉTODOS..................................................................................... 67

4.2.1 Calorimetria exploratória diferencial (DSC).................................... 67

4.2.2 Calorimetria exploratória diferencial acoplada em sistema

fotovisual (DSC-FOTOVISUAL)..................................................... 67

4.2.3 Difratometria de raios-X (DRX)....................................................... 68

4.2.4 Fluorescência de raios-X (FRX)..................................................... 68

4.2.5 Análise termogravimétrica acoplada à análise por infravermelho

com transformada de fourier de produtos gasosos liberados (TG-

FTIR).............................................................................................. 68

4.2.6 Pirólise rápida acoplada a cromatografia gasosa com analisador

de espectrometria de massas – (PYR-GC/MS).............................. 69

4.2.7 Análise termogravimétrica (TG/DTG)............................................. 70

4.2.7.1 Obtenção dos resíduos sólidos após aquecimento térmico........... 70

4.2.8 Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo

(MEV-FEG).................................................................................... 70

4.2.9 Espectrofotômetro de infravermelho (FTIR-ATR)......................... 71

4.2.10 Cromatógrafo líquido acoplado a espectrômetro de massas com

analisador do tipo Time-Of-Flight (LC-MS)................................... 71

4.2.11 Determinação da atividade antiparasitária frente forma

epimastigota do Trypanosoma cruzi (cepa Y)............................... 72

4.2.11.1 Método da Rezarsurina.................................................................. 73

4.2.12 Desenvolvimento de método cromatográfico................................. 74

4.2.12.1 Preparo das fases móveis.............................................................. 74

4.2.12.2 Preparo da solução estoque e solução de trabalho...................... 74

4.2.12.3 Estratégia de desenvolvimento de método cromatográfico.......... 74

4.2.13 Estudo de degradação forçada....................................................... 77

4.2.13.1 Preparo das soluções degradantes.............................................. 77

4.2.13.2 Preparo da solução estoque (SES), soluções de degradação (SD)

e soluções de leitura (SL)............................................................... 77

4.2.13.3 Análises cromatográficas das amostras submetidas a

degradação forçada....................................................................... 79

4.2.14 Validação do método analítico........................................................ 80

4.2.14.1 Seletividade................................................................................... 80

4.2.14.2 Linearidade.................................................................................... 80

4.2.14.3 Limite de detecção (LD).................................................................. 81

4.2.14.4 Limite de quantificação (LQ)........................................................... 81

4.2.14.5 Exatidão......................................................................................... 81

4.2.14.6 Repetibilidade................................................................................ 82

4.2.14.7 Precisão intermediária.................................................................... 82

4.2.14.8 Robustez........................................................................................ 82

4.2.14.9 Adequabilidade do sistema............................................................ 83

4.2.14.10 Estabilidade das soluções............................................................. 83

5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................... 84

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA STIGMURINA......................................... 84

5.1.1 Caracterização dos grupos químicos e morfologia do pó da

Stigmurina...................................................................................... 84

5.1.2 Perfil de impurezas de síntese para Stigmurina............................. 86

5.1.3 Caracterização térmica................................................................. 88

5.2 CARACTERIZAÇÃO DOS VOLÁTEIS LIBERADOS PELA

STIGMURINA DURANTE DECOMPOSIÇÃO EM ATMOSFERA

DE NITROGÊNIO E AR SINTÉTICO.............................................. 92

5.2.1 Análises TG-FTIR........................................................................... 92

5.2.2 Pirólise catalítica rápida.................................................................. 100

5.3 CARACTERIZAÇÃO DOS RESÍDUOS SÓLIDOS DE

DECOMPOSIÇÃO TÉRMICA DA STIGMURINA.......................... 103

5.3.1 Quantificação das amostras........................................................... 104

5.3.2 Avaliação da morfologia e espectros FTIR entre Stigmurina e

amostras aquecidas....................................................................... 105

5.3.3 Identificação dos produtos sólidos de decomposição térmica para

Stigmurina...................................................................................... 109

5.3.4 Avaliação da atividade antitripanossoma frente forma

epimastigota do T. cruzi (Y) após aquecimento da stigmurina a

diferentes temperaturas................................................................ 119

5.4 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO DE DOSEAMENTO PARA

STIGMURINA POR CLAE-UV/DAD............................................... 121

5.5 ESTUDO DE DEGRADAÇÃO FORÇADA EM SOLUÇÃO PARA

STIGMURINA................................................................................ 132

5.6 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO........................................ 140

6.0 CONCLUSÃO....................................... ........................................ 155

REFERÊNCIAS............................................................................. 157

ANEXO A...................................................................................... 175

ANEXO B....................................................................................... 176

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Classificação taxonômica do escorpião Tityus stigmurus............... 26

Figura 2 - Escorpião Tityus stigmurus............................................................ 27

Figura 3 - Número de publicações disponíveis até 17.09.2019 para 4 tipos

de escorpião do gênero Tityus encontrados no Brasil.................... 28

Figura 4 - Estrutura química linear aberta da stigmurina (A), sequência de

aminoácidos, fórmula química e massa molecular (MM) (B)........... 31

Figura 5 - Diferentes formas de classificação das técnicas

cromatográficas............................................................................. 42

Figura 6 - Diferenças estruturais entre o desenvolvimento de métodos

analíticos utilizando abordagem tradicional e a abordagem

científica........................................................................................ 48

Figura 7 - Características intrínsecas e físico-químicas dos analitos

importantes para o desenvolvimento de métodos cromatográficos 50

Figura 8 - Espectro FTIR (A) e imagem MEV (B) para stigmurina em estado

sólido.............................................................................................. 84

Figura 9 - Cromatograma de íons Totais (TIC) para stigmurina evidenciando

impurezas (A) e espectro de massas para tR = 17,84 (B), tR =

17,66 (C) e tR = 17,351 (D).............................................................. 86

Figura 10 - Proposta de estrutura química para impurezas 2........................... 88

Figura 11 - Sobreposição de curvas DSC e TG para stigmurina em atmosfera

de N2 (A) e imagens DSC-fotovisual a 30°C, 100°C, 140°C,

160°C, 190°C, 230°C e 360°C (B).................................................. 89

Figura 12 - Curvas DSC para ciclo aquecimento-resfriamento em atmosfera

de nitrogênio (A) e curva DRX para stigmurina (B)......................... 90

Figura 13 - Curvas TG, DTG e Gram-Schmidt para stigmurina em atmosfera

de N2 (A) e ar sintético (B)............................................................... 93

Figura 14 - Gráfico de superfície 3D para espectro FTIR dos gases liberados

produzidos pela pirólise da stigmurina: em atmosfera de N2 (A) e

ar sintético (B), e os respectivos espectros extraídos em (C) e (D)

96

Figura 15 - Espectros de absorbância em função da temperatura dos voláteis

liberados durante decomposição térmica da stigmurina em N2, (A)

e ar sintético (B).............................................................................. 99

Figura 16 - Pirograma da Stigmurina................................................................ 101

Figura 17 - Sobreposição de cromatogramas para stigmurina e amostras

aquecidas (A), linearidade (B) e teor residual de stigmurina em

função da temperatura de aquecimento (C)................................... 105

Figura 18 - Sobreposição de espectros FTIR para stigmurina e amostras

aquecidas em diferentes temperaturas.......................................... 107

Figura 19 - Imagens MEV, em diferentes ampliações, para amostras de

stigmurina a temperatura ambiente e aquecidas a diferentes

temperaturas: 50°C, 94°C e105°C a 5,0KX, 140°C e 160°C a

1,5KX e, 190°C e 230°C a 1,0KX.................................................... 108

Figura 20 - Sobreposição de cromatogramas de íons totais (TIC) para

amostras de stigmurina aquecidas evidenciando tR........................ 109

Figura 21 - Cromatograma de íons totais (TIC) para amostra aquecida até

190°C evidenciando produtos identificados................................... 110

Figura 22 - Espectro MS a 14,53 min na faixa de 600 – 1600 m/z.................... 111

Figura 23 - Espectro MS a 15,63 min na faixa de 600 – 1600 m/z..................... 111


Figura 25 Espectro MS a 17,61 min na faixa de 840 – 1760 m/z..................... 112


Figura 27 - Espectro MS a 18,59 min na faixa de 700 – 1600 m/z.................. 113


Figura 29 - Espectro MS a 22,0 min na faixa de 900 – 2000 m/z.................... 114


Figura 31 - Cromatograma de íons totais (TIC) para amostra aquecida até

230°C evidenciando produtos identificados ................................... 116

Figura 32 - Espectro MS a 8,24 min na faixa de 200 – 650 m/z......................... 117

Figura 33 - Espectro MS a 8,91 min na faixa de 300 – 800 m/z......................... 117



Figura 36 - Atividade antiparasitária da Stigmurina submetida a diferentes

condições de aquecimento sobre a forma epimastigote do T. cruzi

Y..................................................................................................... 120

Figura 37 - Propriedades calculadas para stigmurina...................................... 122

Figura 38 - Sobreposição de cromatogramas evidenciando pico para

stigmurina e diferentes colunas avaliadas...................................... 125

Figura 39 - Sobreposição dos cromatogramas obtidos para as condições

estudadas durante avaliação da proporção de solvente orgânico

no gradiente de eluição................................................................. 127


estudadas durante avaliação da temperatura de eluição e

determinação da proporção de FMB.............................................. 128


estudadas durante avaliação da influência do fluxo de fase móvel

sobre o perfil de eluição no modo isocrático................................... 129


estudadas durante avaliação da influência do volume de injeção... 131

Figura 43 - Percentagem remanescente de stigmurina, utilizando método

desenvolvido, em 24h de degradação em HCl 0,1M, 1M e 5M (A),

NaOH 0,1M, 1M e 2M (B), H2O2 0,1%, 1% e 10% (C), térmica e

fotolítica (D).................................................................................... 132

Figura 44 - Mecanismo geral de hidrólise ácida para amidas........................... 133

Figura 45 - Mecanismo geral de hidrólise básica para amidas......................... 134

Figura 46 - Sobreposição de cromatogramas em 24h de degradação e

respectivos brancos em H2O2 0,1%, 1% e 10% (A), térmica e

fotolítica (B).................................................................................... 137

Figura 47 - Sobreposição de cromatogramas em 24h de degradação e

respectivos brancos em H 2O2 0,1%, 1% e 10% (A) térmica (B),

fotolítica (C).................................................................................... 138

Figura 48 - Sobreposição dos cromatogramas de stigmurina e amostras

aquecidas para verificação da seletividade do método................... 141

Figura 49 - Curva de calibração para verificação da linearidade do método..... 142

Figura 50 - Gráfico dos resíduos gerados pela regressão................................ 144

Figura 51 - Sobreposição de cromatogramas para amostras de LD e LQ

cujas concentrações foram estimadas a partir da linearidade........ 150

Figura 52 - Gráfico para avaliação da estabilidade da solução nos tempos

estudados (0h, 6h, 12h, 18h, 24h e 72h). Valores expressos como

média ± DPR%............................................................................... 153

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação quanto a origem das impurezas provenientes da

síntese química de peptídeos........................................................ 34

Tabela 2 - Processos envolvidos na instabilidade química e física de

peptídeos e proteínas......................................... .......................... 36

Tabela 3 - Algumas técnicas termoanalíticas utilizadas na caracterização de fármacos........................................................................................

37

Tabela 4 - Algumas técnicas não-térmicas utilizadas na caracterização de

fármacos........................................................................................ 39

Tabela 5 - Detectores comumente utilizados em análises por CLAE.............. 45

Tabela 6 - Parâmetros cromatográficos obtidos durante uma corrida

analítica.......................................................................................... 57

Tabela 7 - Figuras de mérito a serem considerados na validação analítica a

depender do objetivo do método.................................................... 62

Tabela 8 - Diferentes colunas cromatográficas avaliadas durante

desenvolvimento de método.......................................................... 75

Tabela 9 - Preparo das soluções de degradação (SD) e solução de

degradação para leitura nos diferentes tempos de

análise............................................................................................ 78

Tabela 10 - Condições cromatográfica para análise das soluções de leitura de

stigmurina submetida a diferentes condições de degradação........ 79

Tabela 11 - Produtos de decomposição identificados a 190°C.......................... 115

Tabela 12 - Produtos de decomposição identificados a 230°C.......................... 119

Tabela 13 - Valores de pKa e Cut off de alguns reagentes utilizados na

análise cromatográfica de peptídeos e proteínas........................... 123

Tabela 14 - Parâmetros cromatográficos obtidos para as diferentes colunas

avaliadas........................................................................................ 126

Tabela 15 - Parâmetros cromatográficos calculados para avaliação da

proporção de solvente orgânico no gradiente de eluição................ 127

Tabela 16 - Parâmetros cromatográficos calculados para durante avaliação

da temperatura de eluição e determinação da proporção de

FMB............................................................................................... 128


da influência do fluxo de fase móvel sobre o perfil de eluição no

modo isocrático.............................................................................. 130


da influência do volume de injeção sobre o perfil de eluição no

modo isocrático.............................................................................. 131

Tabela 19 - Valores de resolução (R), fator de cauda (Tf) e pureza de pico

para amostras analisadas durante avaliação da seletividade do

método cromatográfico desenvolvido............................................. 141

Tabela 20 - Análise estatística da regressão e ANOVA para verificação da

linearidade do método cromatográfico desenvolvido...................... 142

Tabela 21 - Avaliação de DPR% para verificação da repetibilidade.................. 144

Tabela 22 - Avaliação dos parâmetros de adequabilidade do sistema para

dados de repetibilidade................................................................. 145

Tabela 23 - Avaliação de DPR% das análises para verificação da precisão

intermediária.................................................................................. 146

Tabela 24 - Teste de t de Student para verificação da precisão intermediária 147

Tabela 25 - Verificação da Exatidão................................................................ 147

Tabela 26 - Avaliação de DPR% para verificação da robustez entre as

variações com base nos valores de área obtidos para

combinação da condição nominal com variação............................ 148

Tabela 27 - Avaliação de parâmetros médios de adequabilidade do sistema

para variações realizadas na robustez........................................... 149

Tabela 28 - Avaliação de DPR% das análises para determinação da

repetibilidade para o LQ estimado................................................. 151

Tabela 29 - Avaliação de DPR% das análises para determinação da precisão

intermediária do LQ estimado........................................................ 151

Tabela 30 - Teste de t de Student para verificação da precisão intermediária

para o LQ estimado........................................................................ 152

Tabela 31 - Avaliação da exatidão para LQ estimado....................................... 152

Tabela 32 - Resumo de testes para validação do método analítico de teor de

stigmurina em Matéria-prima.......................................................... 154

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

Ala – Alanina

AQbD – do inglês, Analytical Quality by Design

Asp (D) – Ácido Aspártico

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATP – do inglês, Analytical Target Profile

BPC – Boas Práticas Clínicas

BPF – Boas Práticas de Fabricação

CEATOX-PE – Centro de Assistência Toxicológica de Pernambuco

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLUE – Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência

CMD – Concentração Média determinada

CQA – do inglês, Control quality Analytical

CMA – do inglês, Critical Method Attribute

Cys (C) – Cisteína

DAD – do inglês, Diode Array Detector

DOE – do inglês, Design of Experiments

DP – Desvio Padrão

DPR – Desvio Padrão Relativo

DKP – do inglês, Diketopiperazine

DRX – do inglês, Diffraction ray-X

DTA – do inglês, Differential Thermo Analysis

DTG – do inglês, Differential Thermogravimetric

DSC – do inglês, Differential Scanning Calorimetry

E – Energia

EDQM – do inglês, European Directorate for the Quality of Medicines

EGA – do inglês, Evolved Gases Analytical

EGD – do inglês, Evolved Gases Detector

FE – Fase Estacionária

FM – Fase Móvel

FTIR – do inglês, Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Gly (G) – Glicina

Glu (E) – Ácido Glutâmico

HETP – do inglês, High Equivalent Theoretical Plates

ICH – do inglês, International Conference Harmonization

ICTAC – do inglês, International Confederation of Thermal Analysis and Calorimetry

Ile (I) – Isoleucina

INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia

IUPAC – do inglês, International Union of Pure and Applied Chemistry

K – Fator de retenção

LC – do inglês, Liquid Chromatography

Leu (L) - Leucina

DLS – do inglês, Detector Light Scattering

Lys (K) - Lisina

Met (M) - metionina

MRSA – do inglês, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

MS – do inglês, Mass Spectrometry

N – Número de Pratos Teóricos

OFAT – do inglês, On factor at Time

PAM – do inglês, Peptide Antimicrobial

Phe (F) - Fenilalanina

Pro (P) - Proline

QbD – do inglês, Quality by Design

RDC – Resolução de Diretoria Colegiada

Res – Resolução Cromatográfica

RMN – Ressonância Magnética Nuclear

SD – Solução de Degradação

SES – Solução Estoque

Ser (S) - Serina

SL – Solução de Leitura

t - Tempo

T - Temperatura

Tf – do inglês, Tailing Factor

TFA – do inglês, Trifluoracetic acid

TFE – 2,2,2-trifluoretanol

TGA – do inglês, Thermogravimetric Analysis

Trp - Triptofano

USP – do inglês, United States Pharmacopeia

UV – Ultravioleta

Val (V) - Valina

W – do inglês, Width

WHO – do inglês, World Health Organization

RESUMO

Stigmurina é um peptídeo contendo 17 aminoácidos (FFSLIPSLVGGLISAFK-NH2)

sendo identificado no transcriptoma do escorpião Tityus stigmurus e sintetizado com

extremidade N-terminal amidada. Apresenta ação antimicrobiana frente a batérias

Gram-positivas e Gram-negativas, algumas cepas de bactérias resistentes a

meticilina, e no controle da sepse, atividade antiparasitária frente forma epimastigota

do T. cruzi e baixa atividade anti-hemolítica. Esta tese de doutorado aborda o

desenvolvimento de metodologias analíticas para a avaliação da qualidade do

peptídeo sintético stigmurina, identificado na peçonha do escorpião Tityus stigmurus.

Das técnicas utilizadas destacam-se técnicas termoanalíticas (DSC, TG, TG-FTIR),

cromatográficas (CLAE, LC-MS e Pirólise-GC-MS) e técnicas complementares (MEV,

FTIR e DRX). Stigmurina sintética em estado sólido apresentou-se na forma amorfa,

temperatura de transição vítrea de 149°C (midpoint), e início de temperatura de

decomposição térmica diferindo entre atmosfera de nitrogênio (183°C) e ar sintético

(180°C). A decomposição térmica produz principalmente voláteis derivados de

resíduos de fenilalanina, prolina, serina e leucina, sugerindo decomposição iniciando

na extremidade N-terminal. Foram detectadas impurezas de sínteses decorrentes de

erros de acoplamento, deleção de serina e isoleucina/leucina, além de ausência de

amidação na extremidade N-terminal. Durante a decomposição térmica foram

detectados fragmentos da série y, tais como: y14 (m/z = 1.413,8776 Da), y15 (m/z =

1.500,9121 Da), fragmentos decorrentes de perdas neutras de amônio e água (m/z =

1.778,0184 Da e 1.760,0041 Da) e fragmentos da série b, possivelmente derivados

de fragmentos b6 e b2 (m/z = 566,4267, m/z = 679,5107, m/z = 274,2737 e m/z =

290,2686 Da). As amostras obtidas após aquecimento de stigmurina até temperaturas

de 190°C e 230°C, com teor residual de stigmurina de 60% e 0%, respectivamente,

apresentaram atividade antitripanossoma possivelmente relacionada aos produtos de

decomposição formados e/ou ao aprisionamento de gases tóxicos durante a

decomposição térmica. Esta tese fornece subsídios para elaboração de estratégias

tecnológicas visando manutenção da qualidade, segurança e eficácia durante o

desenvolvimento de futuros produtos farmacêuticos.

Palavras-chave: Stigmurina, peptídeo sintético, degradação térmica, degradação

forçada.

ABSTRACT

Stigmurin is a peptide containing 17 amino acids (FFSLIPSLVGGLISAFK-NH2)

identified in the transcriptome of the scorpion Tityus stigmurus, synthetized with

amidated C-terminal end. It has shown antimicrobial action against Gram-positive and

Gram negative bacterial, some methicillin resistant bacterial, efficient in controlling

sepsis, antiparasitic action for epimastigote forms T. cruzi Y strain and low

antihemolytic activity. This doctoral thesis deals the development of analytical

methodologies for the quality assessment of the synthetic peptide stigmurin, identified

in the Tityus stigmurus scorpion venom. The techniques used were analytical

techniques (DSC, TG, TG-FTIR), chromatography (HPLC, LC-MS, GC-MS pyrolysis)

and complementary techniques (SEM, FTIR and XRD). Synthetic solid-state Stigmurin

present amorphous form, with a glass transition temperature of 149 °C (midpoint) and

the initial temperature differing between nitrogen atmosphere (183 °C) and synthetic

air (180 °C). Thermal decomposition produces mainly volatiles derived from

phenylalanine, proline, serine and leucine residues, which seems to start in its N-

terminus. Synthesis impurities were detected due to coupling errors, serine and

isoleucine / leucine deletion, and lack of amidation at the N-terminal end. During

thermal decomposition were detected y fragments, such as: y14 (m/z = 1.413,8776 Da),

y15 (m/z = 1.500,9121 Da), fragments resulting from neutral losses of ammonium and

water (m/z = 1.778,0184 Da e 1.760,0041 Da) and series b fragments, possibly derived

from fragments b6 and b2 (m/z = 566,4267, m/z = 679,5107, m/z = 274,2737 and m/z

= 290.2686 Da). Samples obtained after heating stigmurine to temperatures of 190 °C

and 230 °C, with residual stigmurine content of 60% and 0%, respectively, showed

antiparasitic activity possibly related to the decomposition products formed and / or the

trapping of toxic gases during thermal decomposition. This thesis provides support for

the elaboration of technological strategies aimed at maintaining quality, safety and

efficacy during the development of future pharmaceutical products.

Key words: Stigmurin, synthetic peptide, thermal degradation, forced degradation.

24

1 INTRODUÇÃO

Na busca por alternativas terapêuticas o homem tem se apropriado da

natureza como fonte de substâncias úteis a cura dos males de saúde (OGA;

CAMARGO; BATISTUZZO, 2008). Fármacos podem ser descobertos de fontes

vegetais e animais, bem como servirem de arcabouço ao desenvolvimento de

fármacos semissintéticos.

No reino animal, espécies de diferentes filos (poríferos até cordatas),

produtores de peçonha ou veneno, tem se destacado como fonte de peptídeos

bioativos (GHOSH et al., 2018). Atualmente, é crescente o número de medicamentos

à base de peptídeos disponíveis para o tratamento de diversas doenças, tais como:

infecções virais, bacterianas, doenças imunes, doenças neurológicas, doenças

cardiovasculares e câncer (PENNINGTON; CZERWINSKI; NORTON, 2018; UHLIG et

al., 2014; VLIEGHE et al., 2010).

O desenvolvimento de medicamentos contendo fármacos peptídicos esteve

atrelado ao desenvolvimento das técnicas “omicas”: genômica, transcriptômica e

proteômica, desenvolvimento de técnicas de análise e técnicas de purificação. Trata-

se de um mercado bilionário, de projeção crescente, cujos avanços nos processos de

produção de peptídeos aumentam ainda mais o desenvolvimento da terapêutica (LAU;

DUNN, 2018)

Escorpiões do gênero Tityus são bem distribuídos no Brasil e, algumas

espécies vêm sendo estudadas por grupos de pesquisas na área de Toxicologia. No

nordeste brasileiro o grupo de pesquisa de Biotecnologia da UFRN, através de análise

transcriptômica das glândulas de veneno do escorpião Tityus stigmurus, identificou

um repertório distinto de peptídeos com potencial biotecnológico e/ou farmacológico.

Dentre esses, destaca-se a Stigmurina, classificado por homologia como peptídeo

antimicrobiano (PAM) (ALMEIDA et al., 2012).

Embora os peptídeos demonstrem uma alta atividade biológica em

combinação com baixa toxicidade e alta especificidade em comparação com

pequenas moléculas, eles por vezes possuem baixa estabilidade, baixa

biodisponibilidade oral e dificuldades de liberação (MASON, 2010; RAMANATHAN et

al., 2011; SATO et al., 2006). Durante os passos de obtenção de um peptídeo

impurezas podem ser adicionadas ao produto acabado, mediante utilização de

25

reagentes, aditivos para proteção ou acoplamento. Estas impurezas podem ser ativas

biologicamente ou ainda alterar a atividade do peptídeo (VAN DORPE et al., 2011).

Logo, é importante o desenvolvimento de metodologias para análise da pureza do

peptídeo por técnicas sensíveis para poder garantir conclusões científicas frente à

atividade biológica, bem como, determinar parâmetros de qualidade para um ativo

promissor. Embora, passos de purificação sejam geralmente incluídos após a síntese,

deve-se garantir o perfil de impurezas do produto, sendo, portanto, crucial investigar

e relatar as impurezas totais e o perfil de degradação de um fármaco peptídico.

Nesta tese foram utilizadas várias abordagens para caracterização da

matéria-prima sintética de stigmurina, caracterização da forma cristalina, perfil térmico

e cinética de decomposição, desenvolvimento de método cromatográfico de

quantificação e avaliação dos produtos de degradação.

26

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 O ESCORPIÃO Tityus stigmurus

Os escorpiões do gênero Tityus, pertencente à família Buthidae, são bem

distribuídos na América do Sul, destacando-se o Brasil. Entre seus representantes

temos as espécies Tityus obscurus, Tityus fasciolatus Tityus bahiensis, Tityus

serrulatus e Tityus stigmurus.

A taxonomia do escorpião Tityus stigmurus é apresentada na Figura 1. Este

animal pertence a ordem Scorpiones (escorpiões) e filo Arthropoda que apresenta

aproximadamente 1500 espécies distribuídas em 163 gêneros e 18 famílias

(BROWNELL; POLIS, 2001). Os escorpiões são animais quelicerados e estima-se que

surgiram há 450 milhões de anos, no período siluriano, inicialmente no ambiente

marinho (FET et al., 2000). São animais vivíparos e em algumas espécies a

reprodução se dá por partenogênese (PRENDINI; WHEELER, 2005).

Figura 1 - Classificação taxonômica do escorpião Tityus stigmurus

Fonte: Autoria Própria, 2019

A espécie Tityus stigmurus (Figura 2) é endêmica do Brasil, e a que mais

causa acidentes no Nordeste, podendo ser localizado nos estados de Pernambuco,

Bahia, Ceará, Piauí, Paraíba, Alagoas, Rio Grande do Norte e Sergipe (BRASIL,

2009).

27

Figura 2 - Escorpião Tityus stigmurus

Foto: Diego Dantas Almeida, 2015

O escorpionismo é um problema de saúde pública no Brasil devido à elevada

incidência em várias regiões do País. Em 2016 foram registrados 54.847 casos de

escorpionismo no Nordeste (BRASIL, 2016). No período de 1982 – 1995 o estado da

Bahia apresentou 237 casos de escorpionismo por Tityus stigmurus sendo que todos

evoluíram para cura, não havendo letalidade (LIRA-DA-SILVA; AMORIM; BRAZIL,

2000). No estado de Pernambuco, entre o período de 2006 a 2010, o escorpionismo

foi a principal causa de envenenamento, segundo dados do CEATOX-PE, havendo 3

casos de morte de crianças confirmados relacionados a picada por Tityus stigmurus

(DE ALBUQUERQUE et al., 2013). No Rio grande do Norte, entre o período de 2007

a 2011, foram registrados 10.251 acidentes, sendo 90% dos casos considerados de

grau leve (não há relatos ad espécie) e a maior incidência é encontrada nos municípios

da região metropolitana da capital do estado (BARBOSA, 2014).

Os venenos e peçonhas animais apresentam uma mistura complexa de

toxinas que foram desenvolvidas evolutivamente como estratégia de defesa e/ou

captura de presas, causando modificações fisiológicas nas presas (LEWIS; GARCIA,

2003). A peçonha de escorpião é formada de muco, mucopolissacarídeos,

oligopeptídeos, nucleotídeos, inibidores de protease, liberadores de histamina,

aminoácidos, enzimas (hialuronidades e metaloproteases) e lipídeos. Várias proteínas

básicas de baixa massa molecular (neurotoxinas) e aminas bioativas (serotonina e

histamina) também estão presentes em venenos de escorpião, incluindo o veneno de

Tityus, e atuam em canais iônicos em membranas biológicas (GWEE et al., 2002;

28

POSSANI et al., 1999; VASCONCELOS et al., 2005). A composição dos venenos

varia conforme a espécie e influencia os sintomas clínicos observados (SUNAGAR et

al., 2013)

Os aspectos clínicos das picadas de Tityus stigmurus podem variar de leve

(com edema local e dor como os principais sintomas clínicos), moderados (com

náuseas, vômitos, suor, salivação, agitação, taquicardia e taquipnéia) e em casos

graves (com vômitos profusos, sudação e salivação, prostração, convulsões, edema

pulmonar e choque) (BRASIL, 2001). Após uma picada, a peçonha de escorpião

Tityus stigmurus se distribui rapidamente para os órgãos, atingindo os rins

rapidamente, induzindo um aumento transiente da pressão de perfusão com lesão

tubular, ambos os quais conduzem a uma excreção elevada de eletrólitos (SILVA et

al., 2016).

A Figura 3 retrata as publicações disponíveis na plataforma Scopus, para os

escorpiões do gênero Tityus, peçonha e substâncias identificadas, quando utilizado o

nome científico das espécies, até janeiro de 2018. O escorpião Tityus serrulatus é o

mais estudado com 77% das publicações (441 documentos) e o escorpião Tityus

stigmurus, é o segundo menos estudado, (9% das publicações, 52 documentos).

Dentre as publicações (575 documentos) a totalidade dos estudos envolvem

caracterização bioquímica, avaliação da atividade farmacológica/toxicológica,

purificação e questões ambientais.

Figura 3 - Número de publicações disponíveis até 17.09.2019 para 4 tipos de escorpião do gênero Tityus encontrados no Brasil

Fonte: Autoria própria - Pesquisa no site Scopus em 17.09.2019

9%

77%

12%2%

Publicações até setembro/2019

Tityus stigmurus

Tityus serrulatus

Tityus bahienses

Tityus fasciolatus

29

O veneno do escorpião Tityus stigmurus já foi estudado através de análise de

proteômica (BATISTA et al., 2007) e a glândula do veneno através de análise de

transcriptômica (ALMEIDA et al., 2012) foi estudada. Em sua peçonha, através da

biblioteca de transcritos seis tipos conhecidos de proteínas são relatados: canais de

potássio (subfamílias α e β), canais de sódio (subfamílias α e β), hipotensinas e

peptídeos antimicrobianos, além de cinco tipos atípicos de peptídeos e proteínas em

veneno, tais como: lecitinas, peptídeos aniônicos, metaloproteínas, peptídeos

hipotéticos secretados e peptídeos ricos em cisteína. Peptídeos antimicrobianos e

aniônicos são as moléculas mais representativas no banco de transcritos, e

diferentemente dos demais escorpiões da família Buthidade seu transcriptoma

apresenta baixa expressão de toxinas de canais para sódio, especialmente para

subfamília α, relacionado com a gravidade do envenenamento (ALMEIDA et al., 2012).

Algumas moléculas promissoras para o Tityus stigmurus já foram sintetizadas

e suas atividades biológicas avaliadas: a hipotensina TistH, um peptídeo com ação

hipotensora (MACHADO et al., 2015) e antimicrobiana (MACHADO et al., 2016); que

foi incorporado a nanopartículas biodegradáveis de quitosana reticulada melhorando

sua atividade anti-Candida e anti-biofilme (TORRES-RÊGO et al., 2019) ; os peptídeos

antimicrobianos Stigmurina e TsAP-2, (DANIELE-SILVA et al., 2016a; DE MELO et

al., 2015a) e o peptídeo aniônico TanP que apresenta uma possível atividade

imunomoduladora (MELO et al., 2017).

2.2 O PEPTÍDEO STIGMURINA

Os peptídeos podem ser considerados como uma categoria de fármacos

distinta, situada entre as moléculas orgânicas pequenas clássicas e proteínas. Dado

o seu tamanho, isto é, geralmente definido como resíduos de até 50 aminoácidos (AA),

os peptídeos são capazes de penetrar mais profundamente no tecido alvo do que as

proteínas. Além disso, os peptídeos terapêuticos são geralmente menos

imunogênicos e são mais eficientes em termos de custo de fabricação, de acordo com

os parâmetros de qualidade exigidos, do que proteínas e anticorpos recombinantes

(LADNER et al., 2004; LAU; DUNN, 2018; MCGREGOR, 2008; VLIEGHE et al., 2010).

Pesquisas com peptídeos isolados de peçonhas de animais vêm se

destacando por constituírem modelos moleculares interessantes para as indústrias

farmacêuticas, no desenvolvimento de estratégias terapêuticas (KLINT et al., 2013) e

30

para a prospecção de novas alternativas de grande interesse biotecnológico

(DUFOURC et al., 2012). Por consistirem em sequências de aminoácidos individuais,

os peptídeos oferecem possibilidades para a descoberta de fármacos através de

bibliotecas combinatórias (BIONDA et al., 2016; FALCIANI et al., 2005).

Na atualidade os peptídeos podem ser obtidos de diversas maneiras: por

extração de fontes naturais, produção por DNA recombinante (KUMAR; DASU;

PAKSHIRAJAN, 2011), síntese em animais ou plantas transgênicas, síntese química

e síntese enzimática (MASON, 2010).

A síntese química é a forma de obtenção preferível para a produção de

peptídeos com até 50 resíduos de aminoácidos. Embora a síntese tenha sido

originalmente realizada em solução, com a introdução do modo de síntese em fase

sólida por Merrifield, este método ganhou mais interesse (GUZMÁN; BARBERIS;

ILLANES, 2007; MERRIFIELD, 1963a; RASMUSSEN, 2018). Os peptídeos sintéticos

são provas inequívocas das identidades químicas e dos papéis biológicos dos

peptídeos naturais, sendo utilizados na construção de curvas padrões (concentração

versus absorção ou emissão de luz ou desenvolvimento de coloração) que permitam

quantificar os peptídeos correspondentes contidos em extratos brutos ou em frações

obtidas durante os seus isolamentos.

A Stigmurina (Figura 4) é um peptídeo contendo 17 resíduos de aminoácidos

e extremidade C-terminal amidada, identificado como transcrito mais abundante na

peçonha do escorpião Tityus stigmurus (ALMEIDA et al., 2012; DE MELO et al.,

2015b), sendo classificado por homologia como um peptídeo antimicrobiano.

A stigmurina, apresenta efetividade frente a bactérias Gram-positivas,

incluindo microorganismos resistentes a meticilina (MRSA) e fungos (Candida

albicans). Revela-se uma molécula promissora para propostas terapêuticas tendo em

vista que apresenta atividade antimicrobiana in vitro, baixa atividade hemolítica e

atividade citotóxica, indicando uma possível toxicidade frente células cancerígenas

(DE MELO et. al., 2015), além de apresentar-se efetivo na redução de carga

microbiana e inflamação em sepsis (DANIELE-SILVA et al., 2016b).

31

Figura 4 - Estrutura química linear aberta da stigmurina (A), sequência de aminoácidos, fórmula química e massa molecular média (MM) (B)

A)

B)

F-F-S-L-I-P-S-L-V-G-G-L-I-S-A-F-K-NH2

(Phe-Phe-Ser-Leu-Ile-Pro-Ser-Leu-Val-Gly-Gly-Leu-Ile-Ser-Ala-Phe-Lys- NH2)

Fórmula química: C89H139N19O20 MM = 1795,18 Da

Fonte: Autoria própria através do site http://pepdraw.com/ em 08.06.2018

Recentemente a stigmurina foi utilizada como protótipo para o

desenvolvimento de peptídeos otimizados (análogos ou mutantes) apresentando

atividade antiparasitária frente formas epimastigota e tripomastigota do T. Cruzi Y para

stigmurina e 4 peptídeos análogos demonstrando seu potencial como fármaco para o

tratamento da doença de Chagas (AMORIM-CARMO et al., 2019; PARENTE et al.,

2018).

Quanto a sua caracterização estrutural a Stigmurina apresenta diferentes

conformações em água, 2,2,2-trifluoretanol (TFE) 70% e dodecil sulfato de sódio

(SDS), sugerindo uma conformação dependente do ambiente, com uma

predominância de α-hélices, carga líquida positiva (+2) (DE MELO et al., 2015b),

estável em diferentes pH e com variação de temperatura em ambiente de SDS,

característica comum a vários PAM (DANIELE-SILVA et al., 2016b).

Apesar das atividades biológicas relatadas e potencial farmacêutico para

stigmurina são escassos os estudos de caracterização estrutural, metodologias de

análise e quantificação para este peptídeo.

2.3 PERFIL DE IMPUREZAS EM PEPTÍDEOS

Peptídeos devido ao seu sistema de construção em blocos, massa molecular

elevada e características físico-químicas, exigem formas específicas de síntese e

http://pepdraw.com/

32

cuidados na formulação. Essa complexidade pode resultar em subprodutos

relacionados, que provavelmente são biologicamente ativos. Uma vez que a

segurança de um medicamento depende não apenas das propriedades toxicológicas

do fármaco, mas também das propriedades toxicológicas de suas impurezas, há uma

preocupação crescente com as impurezas presentes nos insumos farmacêuticos

ativos (IFA) e produtos farmacêutico terminados (SPIEGELEER et al., 2008;

VERGOTE et al., 2009).

As impurezas podem ser relacionadas ao processo ou ao produto, originadas

durante a síntese, fabricação e armazenamento, devendo ser, portanto,

caracterizadas na medida necessária. Durante etapas de avaliação biológica a

presença de impurezas pode levar a obtenção de resultados falsos positivos ou

negativos relacionado a sua presença, uma vez que as impurezas podem ser mais

ativas em comparação ao fármaco/substância ou até alterar sua atividade.

(ANTONIOLI et al., 2007; BEUKELAAR et al., 2007; CURRIER et al., 2008; DORPE

et al., 2012; VERBEKEN et al., 2012).

Durante o controle de qualidade dos peptídeos, a identidade é verificada e a

presença de impurezas é avaliada a fim de quantificar e qualificar a pureza do

peptídeo. Para ensaios de ligação ao ligante, estudos in vitro e bioensaios in vitro,

recomenda-se que a quantidade total de impurezas peptídicas seja inferior a 5%

(D’HONDT et al., 2014a; SPIEGELEER et al., 2008).

O perfil de impurezas (isto é, a identidade, bem como a quantidade de

impurezas no fármaco) tem ganhado atenção das autoridades reguladoras, a fim de

assegurar e controlar a qualidade. É possível encontrar monografias específicas para

medicamentos peptídicos em diferentes Farmacopeias, como por exemplo, a

Farmacopeia Europeia, Farmacopeia dos Estados Unidos da América (USP),

Farmacopeia Internacional e Farmacopeia Indiana.

As diretrizes práticas sobre impurezas relacionadas a peptídeos sintéticos

foram publicadas na Farmacopeia Europeia deste sua 6° edição como um

complemento à diretriz Q3A da ICH (ICH, 2006), com base nas conclusões do

simpósio EDQM "Novo controle de impurezas: definindo especificações para

antibióticos e peptídeos sintéticos" (EMA, 2012).

As regulamentações internacionais consideram peptídeos obtidos através de

síntese química como medicamentos sintéticos, não sendo considerados produtos

biológicos/biotecnológicos (PLAN, 1946). No Brasil medicamentos peptídicos podem

33

ser considerados produtos biotecnológicos e seguir legislação específica conforme o

método de obtenção (BRASIL, 2010a).

Como as reações de síntese química são comumente incompletas, não

produzindo 100% de produtos, durante a síntese, diferentes grupos de proteção de

cadeia lateral, grupos ativadores funcionais ou sequestrantes podem ser adicionados

para evitar reações indesejadas da cadeia lateral, ou parte deles podem permanecer

presentes ou ligados ao peptídeo, levando a presença de impurezas peptídicas

relacionadas (VAN DORPE et al., 2011). Estas impurezas decorrentes do processo

de síntese são, portanto, classificadas conforme Tabela 1. As impurezas decorrentes

de degradação durante armazenamento, são denominados produtos de degradação

e abordadas no item Estabilidade de proteínas e peptídeos.

Além da presença de impurezas de síntese, fármacos peptídicos ou

medicamentos podem ser quimicamente instáveis. Produtos de degradação são

produzidos já durante a síntese, purificação ou fabricação, mas principalmente

durante o armazenamento (VAN DORPE et al., 2011).

34

Tabela 1 - Classificação quanto a origem das impurezas provenientes da síntese química de peptídeos

Impureza Definição

Deleção de aminoácido • Em virtude da remoção incompleta de grupos

protetores levando a formação de cadeia

peptídicas que não possuem um ou mais resíduos

de aminoácidos desejados.

Inserção de aminoácido • Decorrente do excesso de aminoácidos

protegidos por Fmoc que pode resultar na

inserção de um aminoácido adicional a sequência

peptídica desejada.

Remoção incompleta de

grupos protetores

• A remoção incompleta de grupos protetores

permanentes durante a síntese leva a impurezas

peptídicas com aumento de massa relativo de

+56Da para àquelas sequências que

permaneceram ligadas a tBu.

Oxidação/Redução • Oxidação/redução de aminoácidos durante o

processo de síntese, tais como metionina e

cisteína.

Diastereisomerização • Racemização de resíduos de aminoácidos

Dímeros • Decorrentes de mecanismos de auto-associação

ou agregação levando a formação de impurezas

peptídicas de alto peso molecular. Os dímeros

podem ser decorrentes de interações covalentes

(químicos) ou não-covalentes (físicos).

Impurezas de cadeia

lateral e final

• Decorrentes da reatividade das cadeias laterais e

finais, tais como aminações na cadeia lateral da

arginina, reações na cadeia lateral da histidina e

acetilação de resíduos de serina.

Contaminação

estruturalmente

indesejada

• Contaminação por sequencias totalmente

diferentes durante síntese, contaminação

cruzada.

Fonte: Adaptado de (D’HONDT et al., 2014a).

35

2.4 ESTABILIDADE DE PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS

Nos últimos anos, ampliou-se o uso de peptídeos como agentes terapêuticos

e espera-se que esta tendência continue. O desenvolvimento de fármacos peptídicos

para uso na terapêutica é um processo desafiador (KALIYAPERUMAL et al., 2014),

principalmente no que tange a manutenção da estabilidade (MANNING et al., 2010;

MANNING; PATEL; BORCHARDT, 1989; STALMANS et al., 2014).

A estabilidade em solução, durante o armazenamento a longo prazo, muitas

vezes é limitante e, portanto, formas farmacêuticas em estado sólido são preferidas.

Comumente o sólido é obtido por uma técnica de secagem tal como liofilização ou

secagem por pulverização (CHANG; PIKAL, 2009). Formulações em estado sólido são

uma alternativa para prolongar a vida útil de peptídeos e proteínas (CARPENTER et

al., 1997; PIKAL et al., 1991), no entanto reações de degradação química ainda podem

ocorrer (CARPENTER et al., 1997; CHANDRASEKHAR; TOPP, 2015; PIKAL et al.,

1991). Em alguns casos, a estabilidade da proteína no estado sólido é menor ou

comparável àquela em solução (STRICKLEY et al., 1989).

A instabilidade de proteínas no estado sólido pode ser química e física. A

instabilidade química envolve modificação covalente de uma proteína ou resíduo de

aminoácido para produzir uma nova molécula através de quebra de ligação, formação

de ligação, rearranjo ou substituição. A instabilidade física refere-se a mudanças na

integridade conformacional tridimensional da proteína e não envolve alteração na

composição química, mas na sua conformação estrutural. Esses processos físicos

incluem desnaturação, agregação, precipitação e adsorção a superfícies (MANNING

et al., 2010; MANNING; PATEL; BORCHARDT, 1989).

As reações químicas que contribuem para instabilidade de proteínas e

peptídeos no estado sólido são: desaminação, quebra de ligação peptídica, oxidação,

reações de Maillard, β-eliminação e dimerização (HOUCHIN; TOPP, 2008; LAI; TOPP,

1999). A Tabela 2 apresenta uma descrição dos processos envolvidos na instabilidade

física e química de peptídeos e proteínas.

36

Tabela 2 - Processos envolvidos na instabilidade química e física de peptídeos e proteínas

INSTABILIDADE QUÍMICA INSTABILIDADE FÍSICA

Desaminação Desnaturação

Isomerização de Asp • Térmica

Hidrólise de Asp • Fria

Hidrólise da região de dobra • Química

Hidrólise de Trp • Induzida por pressão

Racemização de β-eliminação • Em estado sólido

Formação de DKP Proteínas desnaturadas intrinsicamente

Formação de pGlu Agregação

Glicação de proteínas Formação de partículas/Precipitação

Fotoxidação Adsorção a superfície

Oxidação (Met/Trp/Cys) • Interface água-ar

Oxidação catalisada por metal • Efeito de sal e agitação

Troca de dissulfeto • Interface gelo-água

Fonte: Adaptado de (MANNING et al., 2010).

Vários fatores influenciam a estabilidade de peptídeos e proteínas no estado

sólido, promovendo a ocorrência das reações químicas descritas na Tabela 1, tais

como: temperatura, umidade, atividade de hidrogênio, estado físico do sólido

(cristalino ou amorfo) e presença de excipientes (BELL, 1997; HANCOCK;

SHAMBLIN; ZOGRAFI, 1995; HANCOCK; SAHL, 2006; PIKAL; RIGSBEE, 1997;

SPERLING, 2006; ZAPADKA et al., 2017). Avaliar o comportamento do peptídeo

frente a estes fatores é fundamental para o desenvolvimento do medicamento.

2.5 ANÁLISE TÉRMICA E SUAS APLICAÇÕES NO ESTUDO DE PEPTÍDEOS

A União Internacional de Química Aplicada (IUPAC) e a Confederação

Internacional para Análise Térmica e Calorimetria (ICTAC) publicaram, no ano de

2014, a mais recente definição sobre Análise Térmica:

“Análise térmica é o estudo da relação entre uma propriedade da

amostra e sua temperatura quando a amostra é aquecida ou resfriada

de uma maneira controlada (LEVER et al., 2014).”

37

Para cada propriedade ou quantidade física que é medida frente a

temperatura existe uma técnica. A Tabela 3 apresenta algumas técnicas

termoanalíticas, suas definições e propriedades medidas.

Tabela 3 - Algumas técnicas termoanalíticas utilizadas na caracterização de fármacos

TÉCNICA PROPRIEDADE

MEDIDA

DEFINIÇÃO

Calorimetria

Exploratória

Diferencial (DSC)

Diferença na taxa de

fluxo de calor

DSC por fluxo de calor: Técnica em

que a diferença entre as taxas de

fluxo de calor em uma amostra e um

material de referência é medida.

DSC por compensação de

potência: Técnica em que a

diferença entre o sinal elétrico em

uma amostra e um material de

referência é medida.

Análise Térmica

Diferencial (DTA)

Diferença de

temperatura

Técnica em que a diferença de

temperatura em uma amostra e um

material de referência é medida.

Análise

termogravimétrica

(TGA)

Massa

Técnica em que a massa da amostra

é medida, também conhecida como

termogravimetria.

Análise de gases

liberados (EGA) Fluxo de gás

Família de técnicas onde a natureza

e/ou a quantidade de gás ou vapor

liberado é determinada. O termo

detecção de gás liberado (EGD)

também é usado quando a natureza

do gás não é determinada.

Fonte: Adaptado de (LEVER et al., 2014)

38

Recentemente Armstrong e Kailas (2017) definiram o uso dos termos

complementar, híbrido e hifenado em análises térmicas:

“Análise complementar é a aplicação de duas ou mais técnicas analíticas

a mesma amostra separadamente. Os dados obtidos de cada técnica

são combinados e interpretados em conjunto para explicar os resultados

obtidos em cada um deles.

Análise hifenada refere-se a duas ou mais técnicas analíticas

combinadas em um único experimento, onde cada técnica pode ser

aplicada à amostra analisada sequencialmente ou simultaneamente.

Técnica híbrida refere-se ao projeto de um único instrumento, como

SEM-EDX, no qual duas ou mais técnicas analíticas foram integradas.”

As técnicas térmicas podem ser utilizadas isoladamente ou, mais

recentemente em conjunto/acopladas com outras técnicas térmicas e não térmicas,

sejam elas off-line (complementar) ou on-line (hifenada), na elucidação dos eventos

térmicos apresentados pelas substâncias. A Tabela 4 apresenta algumas técnicas

não-térmicas utilizadas em estudos de caracterização térmica.

As técnicas termoanalíticas têm sido amplamente aplicadas no campo

farmacêutico para muitas propostas incluindo determinação de pureza de fármacos,

análise de composição de medicamentos e matérias-primas, determinação de ponto

de fusão, mudanças de estados e formação de cristal, estabilidade térmica de

medicamentos, avaliação de validade cinética de decomposição térmica, identificação

de fármacos e processos de otimização de fármacos (FULIAS et al., 2013; GIRON,

2002; GOMES; FREIRE; ARAGÃO, 2012; MENDONÇA et al., 2014; MOURA et al.,

2017; PEREIRA et al., 2016).

39

Tabela 4 - Algumas técnicas não-térmicas utilizadas na caracterização de fármacos

TÉCNICA APLICAÇÃO

IR – FTIR

On-line Análise de gases liberados (FULIAS et al., 2013)

Análise de resíduos sólidos (LIN; WANG, 2012)

Off-line Análise de resíduos sólidos

GC-MS On-line Análise de gases liberados (ZHU et al., 2016)

Off-line Análise de resíduos sólidos (PINTO; FERREIRA; CAVALHEIRO,

2017; SMITH; ALI; SOLDATOV, 2014)

LC-MS Off-line Análise de resíduos sólidos

DRX Off-line Análise de resíduos sólidos (BERBENNI et al., 2001)


Estas aplicações podem ser resumidas e inseridas em duas categorias

principais: a) medição de alterações físicas relacionadas com transições de fase,

pontos de fusão, mudanças nos estados cristalinos líquidos, diagramas de fases,

estudo de polímeros, transições vítreas e capacidade calorífica; b) medição de

variações químicas em reações como oxidações e decomposições (GIRON, 2002).

No campo biotecnológico as técnicas térmicas são aliadas na avaliação da

estabilidade térmica de peptídeos e proteínas, interações e dobramentos proteicos

(MAZURENKO et al., 2017), estudos de compatibilidade proteína-excipiente (LU et al.,

2007), degradação térmica (CUCOS; BUDRUGEAC, 2014a), interação fármaco-

proteína através de calorimetria isotérmica (TIC) (INDURTHI; LECLERC; VETTER,

2014) e interações entre peptídeos e modelos de membrana utilizando DSC

(ANDRUSHCHENKO; VOGEL; PRENNER, 2007), estudos cinéticos de

decomposição ou desnaturação térmica (VYAZOVKIN; VINCENT; SBIRRAZZUOLI,

2007). A aplicabilidade das análises térmicas é decorrente da suscetibilidade de

peptídeos e proteínas a variações de temperatura, seja aquecimento ou resfriamento.

Dentre as técnicas térmicas utilizadas o DSC foi inicialmente o método

calorimétrico desenvolvido para amostras biológicas. Adicionalmente outras técnicas

foram desenvolvidas, tais como a calorimetria de titulação isotérmica que mede

40

interações pela mistura de componentes a uma temperatura fixada. Em contraste,

estudos de DSC de transições ou processos que são induzidos por variações na

temperatura, no qual o aumento da temperatura pode promover a fusão térmica.

Muitas moléculas biológicas de interesse sofrem tais transições de fase e logo podem

ser estudadas usando DSC (JOHNSON, 2013).

Análises de DSC para avaliação da estabilidade de proteínas, foram

realizadas para proteínas de diferentes famílias estruturais onde conclui-se que a

técnica é capaz de detectar pelo menos 10% de proteína desnaturada, sendo apta na

análise de caracterização proteica na avaliação da estabilidade conformacional (WEN

et al., 2012).

A cinética de desnaturação térmica do colágeno também foi estudada através

de técnicas DSC utilizando método isoconvercional (VYAZOVKIN; VINCENT;

SBIRRAZZUOLI, 2007)

Os estudos envolvendo análises termogravimétricas envolvem normalmente

determinações de conteúdo de água, compatibilidade fármaco-excipiente,

estabilidade e cinética de decomposição. As análises termogravimétricas podem ser

realizadas isoladamente, como no estudo de avaliação da estabilidade e formação de

nano tubos peptídicos (ADLER-ABRAMOVICH et al., 2006), avaliação da estabilidade

de um peptídeo dendrimérico após intercalação entre as lamelas da argila

montmorilonita (KEDZIERSKI; JANISZEWSKA; MOSZUMANSKA, 2016), bem como

acoplada a técnicas não térmicas, tais como FTIR ou MS, como no estudo da

degradação térmica da proteína ovalbumina em atmosfera inerte (ORSINI; DUCE;

BONADUCE, 2018).

Espectroscopia FTIR combinada com análise termogravimétrica provê

informações sobre mudanças de perda de massa na amostra e permite identificação

qualitativa de gases liberados durante a degradação térmica. Características dos

produtos liberados no processo de pirólise são determinadas pela composição da

matéria-prima (reações primárias) e pelas reações sofridas pelos voláteis primários

(reações secundárias). A extensão destas reações secundárias depende do

equipamento experimental bem como das condições de operação. No caso de

equipamentos como a termobalança (TGA), no qual a taxa de aquecimento é

relativamente baixa e o craqueamento de produtos primários não é monitorado,

apenas a perda de massa da amostra é registrada. Portanto, nenhuma informação

pode ser obtida nem sobre os produtos liberados, nem obviamente, sobre as possíveis

41

reações secundárias. Por outro lado, a análise de TGA acoplada a outras técnicas,

como FTIR, GC ou MS, permite o monitoramento direto dos perfis de evolução de

produtos primários como função da temperatura. Neste caso, as condições de

operação (isto é, quantidade de amostra, taxa de aquecimento, atmosfera, etc..)

devem ser cuidadosamente selecionadas para assegurar a operação adequada do

equipamento conectado on-line (TUDORACHI; CHIRIAC, 2011).

Comumente os estudos térmicos realizados mediante aplicação de técnicas

térmicas envolvendo análise de peptídeos e proteínas são mais frequentes para

aqueles em solução (DANDURAND et al., 2014) e poucos estudos envolvem amostras

em estado sólido (OLIVA et al., 2010) Esta condição deve-se ao fato do

armazenamento de produtos biofarmacêuticos como uma formulação aquosa líquida

ser preferido pelos clínicos, uma vez que a formulação está pronta a ser usada e não

requer rehidratação, em contraste com os produtos liofilizados (BYE; PLATTS;

FALCONER, 2014). Quando uma formulação aquosa não é viável devido a problemas

de estabilidade, as formulações sólidas liofilizadas são frequentemente desenvolvidas

(LI et al., 2005). Logo para um adequado estudo do fármaco em questão e posterior

desenvolvimento de formulação terapêutica é imprescindível a caracterização térmica

em ambos os estados, sólido e líquido.

2.6 CROMATOGRAFIA APLICADA A ANÁLISE DE PEPTÍDEOS

Concomitante à análise térmica, a cromatografia é uma das técnicas analíticas

mais utilizadas na análise de fármacos. Consiste em um método físico de separação

no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma

das quais é estacionária (fase estacionária - FE) enquanto outra move-se em uma

direção definida (fase móvel- FM) (IUPAC, 1993).

Desta forma pode-se identificar três componentes que compõem as técnicas

cromatográficas: a fase móvel, a fase estacionária e os componentes/moléculas a

serem separados. A fase estacionária é sempre composta por uma fase “sólida” ou

“uma camada de um líquido adsorvido à superfície por um suporte sólido”, por

conseguinte a fase móvel é sempre composta por “líquido” ou “componente gasoso”

e, por fim, as moléculas a serem separadas tratam-se das mais variadas substâncias

químicas presentes em uma mistura separadas conforme propriedades físicas ou

físico-químicas (COSKUM, 2016).

42

As técnicas cromatográficas admitem várias classificações (LANÇAS, 2008),

tais como quanto ao mecanismo de separação (Adsorção, Partição, Exclusão por

tamanho, Troca iônica); quanto à técnica empregada (Planar, Coluna), em relação ao

tipo de fase móvel utilizada (Gasosa, Líquida, Fluido supercrítico) dentre outras

(BRAITHWAITE; SMITH, 1999; PALLAVI; PATIL, 2017). A Figura 5 apresenta um

resumo da classificação das técnicas cromatográficas.

Figura 5 - Diferentes formas de classificação das técnicas cromatográficas

Fonte: Adaptado de (BRAITHWAITE; SMITH, 1999; PALLAVI; PATIL, 2017).

As técnicas cromatográficas podem ser utilizadas separadamente ou

acoplada com outras técnicas dependendo dos componentes a serem separados ou

identificados. A cromatografia líquida (LC) é reconhecida como uma ferramenta

indispensável na pesquisa de proteínas e peptídeos, devido à sua alta velocidade, alta

resolução, alta sensibilidade e reprodutibilidade e sua compatibilidade com outras

técnicas. Outra característica atraente da LC é a ampla seleção de fases estacionárias

e móveis. Durante os últimos anos, várias técnicas de LC surgiram na literatura, nas

43

quais vários modos foram usados isoladamente e em combinação (OLIVA; FARINA;

LLABRES, 2007; SIDDIQUI; ALOTHMAN; RAHMAN, 2017). Dentre as quais, a

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) que tem sido largamente utilizada no

desenvolvimento de métodos para análise de fármacos, medicamentos, matérias-

primas (GUMUSTAS et al., 2013) e nas mais diversas áreas.

2.6.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE

Desde as fases de desenvolvimento do fármaco até o marketing e pós-

comercialização, as técnicas analíticas desempenham um grande papel, seja na

compreensão da estabilidade física e química sobre o impacto na seleção e

delineamento da forma farmacêutica para o fármaco, avaliação da estabilidade,

quantificação e identificação das impurezas que estão acima do limiar estabelecido,

essencial para avaliar os perfis de toxicidade dessas impurezas para distingui-las

daquelas do IFA, quando aplicável, e avaliar o conteúdo de fármaco nos produtos

comercializados. A análise do fármaco e do seu metabólito, que pode ser quantitativa

ou qualitativa, é amplamente aplicada nos estudos farmacocinéticos (SIDDIQUI;

ALOTHMAN; RAHMAN, 2017).

A determinação da pureza é considerada de grande importância no controle

de qualidade de produtos, mesmo durante etapas de desenvolvimento. Neste contexto

é necessário uma técnica sensível e reprodutível pode ser utilizada para determinar a

pureza de um peptídeo (DE SPIEGELEER et. al., 2008; VERBEKEN et. al., 2011).

Atualmente, há grande interesse no desenvolvimento de métodos analíticos

rápidos e que forneçam parâmetros apropriados para análises quantitativas de

fármacos. Dentre as técnicas utilizadas temos a cromatografia a líquido de alta

eficiência (CLAE) que é uma técnica de separação fundamentada na distribuição dos

componentes de uma mistura entre duas fases imiscíveis, a fase móvel, líquida, e a

fase estacionária sólida, contida em uma coluna cilíndrica (BRASIL, 2010b).

A CLAE é uma técnica avançada de cromatografia líquida em coluna, onde o

solvente flui sob pressão através de uma coluna para que a amostra possa ser

separada em diferentes constituintes de acordo com a diferença de suas afinidades

relativas. Os equipamentos são constituídos de reservatório de fase móvel,

degaseificador, bombas de pressão, injetor, forno, detector e interface (THAMMANA,

2016).

44

• Reservatório de Fase Móvel: Recipiente de vidro que contém a fase móvel, que

é uma mistura de componentes líquidos polares e não polares. Dependendo

da composição da amostra, os solventes polares e não polares serão variados.

• Bomba: Aspira a fase móvel do reservatório de solvente e força-a para a coluna

e depois passa para o detector. 42000 KPa é a pressão de operação da bomba.

Esta pressão de operação depende das dimensões da coluna, tamanho da

partícula, vazão e composição da fase móvel.

• Injetor de Amostra: O injetor pode ser manual ou automático e deve fornecer

infusão da amostra dentro da faixa de 0,1 a 100 mL de volume com alta

reprodutibilidade e sob alta pressão (até 4000 psi).

• Colunas: São tipicamente feitas de aço inoxidável limpo, em torno de 50 mm e

300 mm de comprimento e têm uma distância interna de cerca de 2 e 5 mm.

Geralmente são carregados com uma fase estacionária com um tamanho de

molécula de 3 μm a 10 μm. Colunas com diâmetros internos <2 mm são

regularmente mencionadas como segmentos microbore. De preferência, a

temperatura da fase móvel e da coluna deve ser mantida constante.

• Detector: Estão situados na extremidade da coluna, distingue os analitos à

medida que eles são eluídos da coluna cromatográfica. Detectores utilizados

regularmente são espectroscopia de UV, fluorescência, espectrometria de

massa e identificadores eletroquímicos, cujas características estão

apresentadas na Tabela 5.

• Dispositivos de Coleta de Dados ou Integrador: Os sinais do detector podem

ser reunidos em gravadores gráficos ou integradores eletrônicos que flutuam

em qualidade multifacetada e em sua capacidade de processar, armazenar e

reprocessar informações cromatográficas.

45

Tabela 5 - Detectores comumente utilizados em análises por CLAE

DETECTORES QUANTIDADE

MÍNIMA DETECTÁVEL

PROPRIEDADE MEDIDA APLICAÇÕES

Detector de

Fluorescência pg

Emissão de luz óptica após

excitação em comprimento

de onda de maior energia

Substâncias

fluorescentes, ou

fluorescentes por

derivatização

Detector

UV/Vis/PDA ng

Absorção da Luz UV em

determinado comprimento

de onda

Substâncias que

apresentam cromóforos

Detector de

Espalhamento

de Luz – DLS

Maior que ng

Nebulização da fase móvel e

medição da luz espalhada

pelas partículas resultantes

Substância com restrita

ou nenhuma absorção

UV

Detector de

Índice de

Refração

µg

Diferença no índice de

refração ótica entre a fase

móvel e a amostra

Substância com restrita

ou nenhuma absorção

UV (Álcoois, açúcares

carboidratos, ácidos

graxos e polímeros)

Detector

eletroquímico fg – pg

Variações na corrente

elétrica

Substâncias oxidáveis

ou redutíveis

Fonte: Adaptado de (SWARTZ, 2010).

A CLAE tornou-se uma ferramenta amplamente utilizada e bem estabelecida

para a análise e purificação de biomoléculas. A justificativa para o papel central que

tem desempenhado atualmente na análise e purificação de proteínas/peptídeos é a

resolução, pois é capaz de separar polipeptídios de sequências quase idênticas, não

apenas para pequenos peptídeos como aqueles obtidos através de digestão com

tripsina, mas também para proteínas muito maiores (KALIYAPERUMAL et al., 2014).

Outra vantagem especial da CLAE, quando comparado a outras técnicas é a sua

especificidade química (RAMANATHAN et al., 2011).

46

Diversas são as aplicações da CLAE na análise de proteínas e peptídeos. A

cromatografia líquida de fase reversa com detector ultravioleta (RP-CLAE-UV) tem

sido aplicada na avaliação de pureza de peptídeos devida sua seletividade, baixo

limite de detecção e quantificação, robustez e alta sensibilidade (BICHSEL et al.,

1996), no desenvolvimento de métodos capaz de quantificar anticorpos, tais como o

anticorpo monoclonal intacto, rituximab (NAVAS et al., 2013) e peptídeos anticâncer

(KALIYAPERUMAL et al., 2014), na avaliação das propriedades antioxidantes de

proteínas hidrolisadas do Salmão (Salmon solar) e frações isoladas de peptídeos

(GIRGIH et al., 2013), na determinação de distribuição de partículas de um potencial

carcinogênico humano, a 3-nitrobenzatrona, transportadas pelo ar (HASEI et al.,

2012), bem como na caracterização da insulina e seus produtos de degradação,

através da cromatografia líquida por exclusão de tamanho e por fase reversa,

acopladas a um detector de espalhamento de luz (OLIVA; FARIÑA; LLABRÉS, 2000).

2.6.2 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência - CLUE

A necessidade de rapidez e eficiência analítica exigida atualmente contribui

para que outra técnica cromatográfica venha se firmando como uma técnica bastante

aplicável quando se deseja obter análises rápidas, reprodutibilidade melhorada e

detecção de amostras complexas, tornando-se um instrumento valioso para o controle

de qualidade de medicamentos (LIANG et al., 2010). A cromatografia líquida de ultra

eficiência (CLUE) é uma técnica que vem ganhando espaço e está sendo utilizada em

análises de rotina em diversas áreas. Os princípios de CLUE são os mesmos da

CLAE, a diferença básica está no tamanho de partícula do material da coluna. A rápida

difusão que está relacionada principalmente à disponibilidade da instrumentação

totalmente desenvolvida e adequada para as necessidades do emprego de partículas

< 2 μm, a altas pressões (KAWANO et al., 2008).

O uso destas partículas juntamente com a alta velocidade linear da fase móvel

aumenta a resolução, a detecção e diminuem o tempo das análises (WU et al., 2008).

Os ajustes nos sistemas envolvem uma bomba binária de alta fluidez, a qual é capaz

de trabalhar com pressões acima de 100 MPa (15.000 psi ou 400 kgf) (NOVÁKOVÁ;

MATYSOVÁ; SOLICH, 2006; PIETERS; DEJAEGHER; HEYDEN, 2010). As

vantagens do CLUE incluem melhorias significativas em velocidade, sensibilidade

(melhoramento da razão sinal/ruído) e resolução, em comparação com a

47

cromatografia líquida de alta eficiência convencional (HPLC)(EL MUBARAK et al.,

2016).

O CLUE é decorrente da teoria da eficiência do processo de separação, que

reflete o desempenho da coluna, e baseia-se no conceito de altura equivalente de um

prato teórico (HETP) e na expressão (equação de Van Deemter – Equação 17) que

foi derivada da adsorção em fase gasosa envolvendo uma isotérma linear e cinética

de transferência de massa rápida (UNGER; LIAPIS, 2012). O entendimento desta

teoria é fundamental para determinação dos parâmetros a serem otimizados durante

o desenvolvimento de método cromatográfico.

𝐻 = 𝐴 + 𝐵

𝑢+ 𝐶𝑢 (17)

Onde H é a altura dos pratos teóricos, o termo A corresponde a difusão de

Eddy, o termo B, a difusão longitudinal, o termo C a resistência a transferência de

massa e u é a velocidade linear da fase móvel.

De acordo com este modelo que descreve a relação entre HETP e a

velocidade linear, um dos termos, o termo C, é dependente do diâmetro da partícula

do material de empacotamento da coluna. Logo redução no tamanho das partículas

levam a significativa redução de HETP que resulta em aumento da eficiência

(NOVÁKOVÁ; MATYSOVÁ; SOLICH, 2006).

O CLUE tem sido amplamente utilizado para análise de pequenas moléculas.

Em se tratando de peptídeos e proteínas ele tem sido aplicado a métodos de

determinação e métodos de quantificação direcionados, que normalmente usam

gradientes lentos e rápidos, respectivamente (HOWARD et al., 2012).

Em virtude de suas vantagens as aplicações da CLUE na análise de peptídeos

e proteínas são diversas: envolvem o desenvolvimento de métodos de detecção e

quantificação de peptídeos em matrizes complexas (EL MUBARAK et al., 2016),

métodos para avaliação de estabilidade e degradação forçada de peptídeos utilizando

CLUE/DAD e CLUE/MS-MS (D’HONDT et al., 2014b) para avaliação de

farmacocinética (LEE et al., 2017), farmacodinâmica bem como identificação de

moléculas utilizando matrizes complexas e por muitas vezes acoplados a outras

técnicas como espectroscopia de massas (KLAPOETKE; ZHANG; BECHT, 2011; LI

et al., 2018).

48

2.7 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS PARA

ANÁLISE DE PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS

A literatura é diversa em publicações acerca de desenvolvimento de métodos

cromatográficos, no entanto a grande maioria não deixa claro os passos e etapas

seguidos para determinação das condições do método cromatográfico em questão.

Podemos distinguir duas abordagens para o desenvolvimento de métodos

cromatográficos: àquela chamada abordagem tradicional ou clássica e, a abordagem

científica, que remete ao conceito de Analytical Quality by Design (AQbD). De forma

geral podemos elencar as etapas e diferenças nas abordagens tradicional e científica

conforme apresentado na Figura 6.

Figura 6 - Diferenças estruturais entre o desenvolvimento de métodos analíticos utilizando abordagem tradicional e a abordagem científica

Fonte: Adaptado de (RAMAN; MALLU; BAPATU, 2015)

Os métodos analíticos implementados utilizando abordagens tradicionais

foram baseados em um desenvolvimento de método denominado um fator por vez

(one factor at time - OFAT), no qual um único parâmetro é otimizado para a resposta

49

esperada, enquanto outros permanecem constantes. Essa prática sempre conduziu a

um comportamento robusto e restrito do método para variáveis instrumentais

utilizadas na fase de desenvolvimento do método. Portanto, a presente estratégia tem

alto risco de falha do método e sempre requer um protocolo de revalidação ou

transferência de método ou desenvolvimento de método alternativo, aumentando o

custo do método (PERAMAN; BHADRAYA; REDDY, 2015).

Além disso a abordagem tradicional é não sistemática e, portanto, as decisões

são tomadas com base em resultados de eventos sequenciais de experimentos. A

desvantagem dessa abordagem é que, se alguma etapa não for adequadamente

projetada, o esforço de desenvolvimento do método frequentemente se desvia,

levando a métodos não otimizados. Quando os resultados experimentais não são

significativos, investigações adicionais serão realizadas, resultando na multiplicação

do trabalho de laboratório e no longo tempo de desenvolvimento. Pelo contrário, o

tempo inicial e o esforço que é colocado no design de desenvolvimento do método

AQbD é muito mais do que a maneira tradicional. É preciso ter uma quantidade

significativa de conhecimento sobre o medicamento e a tecnologia analítica para

projetar o processo de desenvolvimento do método corretamente.

Abordagem AQbD deriva da aplicação dos princípios de Quality by Design

(QbD) no desenvolvimento de métodos analíticos. QbD é uma abordagem sistemática

do desenvolvimento que começa com objetivos pré-definidos e enfatiza a

compreensão do produto e do processo e o controle do processo, com base em sólida

ciência e gerenciamento de risco de qualidade (ICH, 2009). O conceito QbD foi

resumido por um especialista em qualidade bem conhecido, Joseph Moses Juran.

Este acreditava que a qualidade poderia ser planejada e que a maioria dos problemas

associados à qualidade tem sua origem na forma como a qualidade foi a princípio

planejada. Os princípios do QbD (desenvolvimento baseado em ciência e risco,

avaliação de risco, avaliação de ciclo de vida e projeto de método) foram usados para

promover a qualidade do produto e do processo em vários setores e áreas industriais

(SANGSHETTI et al., 2017). Na atualidade estes princípios foram incorporados a

indústria farmacêutica, que busca o desenvolvimento de produtos de qualidade e com

consistência no processo de fabricação para alcançar o desempenho pretendido, e

sua aplicação vem sendo estimulada pela Conferência Internacional de Harmonização

(ICH) através dos documentos: ICHQ8 Pharmaceutical Development, ICHQ9 Quality

Risk Management, e ICH Q10 Pharmaceutical Quality System.

50

A abordagem tradicional não usa DOE e avaliação de risco, enquanto a

abordagem AQbD utiliza ferramentas científicas tais como ATP, CQA, DOE, avaliação

de risco, estratégias de controle e avaliação de risco, validação de método e

monitoramento contínuo de métodos (RAMAN; MALLU; BAPATU, 2015).

Em ambas as abordagens o conhecimento sobre rota de síntese e

características físico-químicas do fármaco (Figura 7) são imprescindíveis ao início do

desenvolvimento do método (PALLAVI; PATIL, 2017). Para o desenvolvimento do

método, é necessário estudar as propriedades físicas tais como massa molar,

solubilidade, polaridade, pKa e pH da molécula, ponto isoelétrico (PI), índice de

GRAVY, absortividade, dentre outros. São aos propriedades físico-químicas da

molécula que irão ditar a técnica cromatográfica bem como detector mais apropriado

a sua análise.

Figura 7 - Características intrínsecas e físico-químicas dos analitos importantes para o desenvolvimento de métodos cromatográficos


As características fundamentais de peptídeos e proteínas são sua massa

molecular e sequência primária (ARNOTT; SHABANOWITZ; HUNT, 1993). A massa

molecular é parâmetro de escolha na avaliação do tamanho de poro de colunas

cromatográficas em LC. A polaridade e solubilidade do analito irá influenciar a escolha

do solvente diluente e composição da fase móvel. O analito deve ser solúvel nos

diluentes e não deve se degradar com nenhum dos componentes do diluente.

51

O índice de GRAVY mede o grau de hidrofopatia médio de peptídeos e

proteínas ao longo da sua sequência de aminoácidos e cadeias laterais

correspondentes, levando-se em conta sua hidrofilicidade e hidrofobicidade (KYTE;

DOOLITTLE, 1982). Em análise de proteínas e peptídeos a determinação do índice

de GRAVY é importante como um dos parâmetros de escolha de colunas

cromatográficas, visto que substitui o coeficiente de partição (Log P). A

hidrofobicidade é também importante para escolha da coluna em cromatografia

líquida. Em geral colunas C18 são usadas para proteínas hidrofílicas e pequenos

peptídeos, e C4 ou C5 é usada para proteínas hidrofóbicas e grandes peptídeos.

O pH e o pKa desempenham um papel importante no desenvolvimento de

métodos cromatográficos. O valor do pH é definido como o logaritmo negativo na base

10 da concentração do íon hidrogênio. A acidez ou basicidade de uma substância é

definida mais tipicamente pelo valor do pH. A seleção de um pH adequado para

analitos ionizáveis geralmente leva a picos simétricos e nítidos em cromatografia.

Picos agudos e simétricos são necessários na análise quantitativa para atingir baixos

limites de detecção. Se o analito alvo for ionizável, o pKa do analito deve ser

determinado ou obtido. Pacotes de software como o ACD (Advanced Chemistry

Development) podem ser usados para obter um valor estimado de pKa para as

funcionalidades ionizáveis na molécula. Se o analito alvo for neutro, o pH da fase

móvel não afetará sua retenção. O pH ótimo para iniciar o desenvolvimento de um

método é o pH, na mistura hidro orgânica empregada, que seja 1-2 unidades do pKa

do analito (KAUSHAL K.; SRIVASTAVA, 2010).

Em se tratando de peptídeos e proteínas o ponto isoelétrico (pI) é uma

propriedade intrínseca definido como o valor de pH na qual uma proteína/peptídeo

apresenta uma carga líquida nula. Assim, determina o sinal da carga líquida para

diferentes faixas de pH (PIHLASALO et al., 2012). A um pH acima do pI, uma proteína

terá uma carga líquida negativa, enquanto um pH abaixo do pI levará a uma carga

positiva líquida. Assim, o pH do solvente pode ser ajustado para facilitar ou para

promover a eluição de uma proteína ligada.

No que diz respeito a absortividade no ultravioleta, proteínas e peptídeos

possuem grupos cromóforos sejam das ligações peptídicas que unem os resíduos de

aminoácidos, seja da presença de aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina e

triptofano) ou ligações dissulfeto (ANTHIS; CLORE, 2013). Com isso, sequências de

peptídeos contendo aminoácidos aromáticos podem ser detectados a 280 nm,

52

possuindo uma sensibilidade 8 vezes maior que a 190 nm, característica de ligações

peptídicas (UCHIHO et al., 2015). A ligação peptídica exibe uma absorção ampla e

banda moderadamente intensa com absorção máxima em cerca de 185 nm. Na região

facilmente acessível de cerca de 200 a 240 nm, a absorção é consideravelmente maior

que a dos aminoácidos constituintes. Logo, a absortividade em 205 nm também pode

ser utilizada na quantificação de aminoácidos. Na atualidade o comprimento de onda

de 215 nm vem sendo utilizado para detecção de peptídeos e proteínas em técnicas

LC-DAD (EBERLEIN, 1995).

Uma vez determinada as características do analito é necessário a

determinação do perfil do método analítico alvo (ATP), ou seja definir qual técnica

analítica que será utilizada com base no objetivo desejado, seja quantificar fármaco,

impurezas, determinar uniformidade ou dissolução, dentre outros, bem como os

atributos críticos do método (preparo de amostra, especificidade, adequabilidade do

sistema, precisão etc..) que devem ser seguidos para que o método seja considerado

apto. Esta etapa é por vezes desconsiderada no método tradicional o que leva a

relatório de validação inconsistentes bem como escolha de técnicas não ideais ao

objetivo pretendido. A determinação dos atributos críticos do método (CMA) ou

atributos críticos da qualidade (CQA) e parâmetros é acompanhada de uma avaliação

de risco de cada etapa que envolve a utilização de ferramentas estatísticas tais como

diagrama de espinha de peixe, onde com base na criticidade, impacto e

detectabilidade o risco pode ser determinado fornecendo ao analista uma boa

compreensão do significado de cada etapa e esforço necessário para as investigações

laboratoriais subsequentes (KOCHLING et al., 2016).

A avaliação de risco é procedimento inexistente durante o desenvolvimento

de métodos tradicionais e sua grande riqueza é a possibilidade de detectar

dificuldades e situações a serem evitadas nas etapas seguintes. Esta oferece ao

analista um olhar esmiuçado acerca do método a ser desenvolvido e um porque

científico as ferramentas analíticas utilizadas.

Uma vez definida a técnica cromatográfica com base em suas peculiaridades

as condições de análise devem ser elencadas. Cada técnica apresenta uma série de

cuidados que devem ser seguidos com base em sua finalidade e característica do

analito. Em se tratando de análise por cromatografia líquida de peptídeos e proteínas

a escolha da fase móvel (componente aquoso e orgânico), da coluna, temperatura e

detectores são críticos ao sucesso do método (FIELD et al., 2019).

53

Alguns pareadores iônicos são utilizados para otimizar resolução e retenção,

como por exemplo, o pareador aniônico PFA ou ácido pentafluorpropriônico que se

complexa com resíduos carregados positivamente, e o pareador catiônico acetato de

trietilamina que interage com grupos carregados negativamente (KAZAKEVICH,

LOBRUTTO, 2007).

Quando se deseja realizar análise com sistemas de detecção MS o ácido

fórmico é preferido como modificador ácido. Entretanto, para peptídeos catiônicos,

sabe-se que ocorrem interações prejudiciais com os silanóis superficiais de colunas

de fase reversa, resultando em pico caudado e baixa eficiência. A carga peptídica

positiva, presente na fase móvel acidificada, causa também uma baixa retenção e

baixa resolução. Portanto, o ácido trifluoroacético (TFA), um agente de

emparelhamento de íons forte e altamente ácido, é preferido para ajustar a retenção

e a eficiência da análise de peptídeo catiônico (STALMANS et al., 2016).

A concentração de tampões e pareadores devem ser adequadamente

estabelecidas, pois a concentração inadequada destes pode ocasionar sobreposição

de bandas e perfis de peptídeos (GRITTI, GUIOCHON, 2009).

O tamanho de poro apropriado é uma das primeiras considerações a ser

levantadas sobre a coluna a ser selecionada, e dependerá da massa molar do

peptídeo ou proteína a ser analisado. Além da maior massa molecular de proteínas e

peptídeos, seu maior volume também afeta sua cromatografia. Um tamanho de poro

muito pequeno restringe a difusão da molécula para dentro e para fora dos poros,

enquanto um tamanho muito grande reduz a área de superfície total e a eficiência de

baixa intensidade.

Outro parâmetro a ser considerado na escolha da coluna é o princípio de

separação a ser utilizado no método podendo ser hidrofóbico, partição, afinidade ou

exclusão por tamanho. Para cada método de separação diferentes empacotamentos

de colunas podem ser utilizados.

Por fim, um aumento no fluxo e diminuição da taxa de gradiente aumenta a

resolução, embora diminua a sensibilidade. Altas temperaturas aumentam a

eficiência, forma do pico e resolução, contudo, diminuem a atividade biológica da

molécula nos casos em que se deseja a recuperação do analito (KAZAKEVICH,

LOBRUTTO, 2007).

Ao contrário de pequenas moléculas orgânicas cujo comportamento

cromatográfico é descrito por um equilíbrio finito de partição entre a fase estacionária

54

e a fase móvel, os peptídeos tipicamente não exibem tal efeito. Em vez disso, eles

exibem um fenômeno de adsorção no qual o polipeptídio é adsorvido na fase

estacionária e elui apenas quando a força do solvente da fase móvel é suficiente para

competir com as forças hidrofóbicas que o mantêm nela. A sensibilidade da retenção

do peptídeo a mudanças sutis na concentração da fase orgânica dificulta a eluição

isocrática porque a concentração da fase orgânica deve ser mantida com muita

precisão (AGUILAR, 2004; SHYAMALA; PRIYA P; ANJALI, 2013). Além disso,

pequenos peptídeos parecem eluir por um híbrido de mecanismos de partição e

adsorção e tornam o processo cromatográfico mais complexo. Por estas razões, a

eluição no modo gradiente de pequenos peptídeos, é preferida, uma vez que resulta

em picos muito mais nítidos quando comparado ao modo isocrático de eluição. A

eluição isocrática é raramente utilizada para separações de peptídeos (VERGOTE et

al., 2009).

Definido as condições do método de análise cuidado especial deve ser dado

ao tratamento da amostra com base em suas propriedades físico-químicas e nas

características do método de análise elencado, visando manutenção da estabilidade

do fármaco durante a análise e recuperação da amostra na etapa de preparo de

amostra (PALLAVI; PATIL, 2017).

Uma vez desenvolvido o método, uma estratégia de controle deve ser

planejada para assegurar a relação entre a finalidade do método e seu desempenho.

Esta estratégia é derivada de dados obtidos durante a fase de desenvolvimento e

verificação do método e incluem monitoramento de parâmetros que influenciam sua

variabilidade.

Em geral a validação de um método analítico é sempre feita de acordo com

as diretrizes nacionais e internacionais sob condições operacionais normais ou a

chamada condição otimizada compreendendo um conjunto de variáveis em um ponto.

No entanto além desta validação, conforme orientação regulamentadora a verificação

do método pode também ser realizada por meio de uma avaliação conjunta da

exatidão e precisão em diferentes pontos dos fatores do método dentro do espaço de

separação cromatográfica (MODR). Esta verificação em múltiplos pontos

provavelmente representa a maior probabilidade da capacidade do método de atender

ao requisito do ATP e deve ser feita além dos limites robustos de testes regulares em

mais dois pontos com ambos os desvios (PERAMAN; BHADRAYA; REDDY, 2015).

55

Desta forma não apenas uma condição operacional será validada, e sim, uma faixa

operacional de trabalho.

Com o estabelecimento do método analítico, testes de desempenho do

método devem ser estabelecidos através do monitoramento do desempenho do

método ao longo do tempo para monitorar sua conformidade com os critérios

previamente definidos. Na indústria isto pode ser realizado pelo uso de gráficos de

controle e ferramentas de rastreio de dados de adequação do sistema e investigações

relacionadas ao método. Este monitoramento contínuo permite que um analista

detecte, identifique e resolva qualquer desempenho anormal ou fora de tendência do

método analítico (PERAMAN; BHADRAYA; REDDY, 2015).

2.7.1 Avaliações Prévias a Validação

2.7.1.1 Estabilidade de Soluções

Apesar de não se enquadrar em nenhuma das resoluções e regulamentações

nacionais e internacionais como um parâmetro de validação, a estabilidade de

soluções é muitas vezes tratada como um tópico dentro da validação em virtude de

alguns analitos em solução poderem se decompor previamente às análises

cromatográficas, por exemplo, durante a preparação das soluções da amostra,

extração, limpeza ou armazenamento nos frascos (em refrigeradores ou em um

amostrador automático).

No entanto, a estabilidade de soluções e da fase móvel devem ser entendidas

como uma etapa prévia a validação, visando a geração de resultados reprodutíveis e

confiáveis, a estabilidade do (s) analito (s).

Em muitos casos, as amostras são analisadas durante a noite (overnight)

usando sistemas cromatográficos equipado com o amostrador automático. Para o

método de teor de fármaco a granel ou o método de traços de impureza (impurezas e

contaminantes), o (s) analito (s) nas soluções amostra e solução padrão devem

permanecer estáveis por 48 horas sob condições de armazenamento definidas. As

fases móveis devem ser estáveis por pelo menos 48 horas. O critério de estabilidade

aceitável para o método de teor não é mais do que 2,0% de variação nas áreas de

pico obtidas a partir das soluções armazenadas, em relação às das soluções

recentemente preparadas. Quanto ao método de impureza, o critério de estabilidade

56

aceitável não é mais do que 10% de variação determinada da mesma maneira para o

método de teor. Se o (s) analito (s) nas soluções não forem estáveis à temperatura

ambiente, a diminuição da temperatura de armazenamento para 2−8° C pode

melhorar a estabilidade das soluções. A fase móvel é considerada estável se a fase

móvel armazenada produzir o cromatograma equivalente ao obtido com a fase móvel

preparada recentemente. A avaliação deve ser realizada com base no fator de

capacidade, resolução e fator de cauda (KAZUSAKI et al., 2012).

2.7.1.2 Teste de Adequabilidade/Verificação do sistema

A verificação do sistema é o procedimento a ser realizado previamente a uma

corrida analítica para demonstrar que o sistema está apto para o uso pretendido,

sendo que os parâmetros desse procedimento devem ser definidos durante o

desenvolvimento e validação do método (BRASIL, 2017).

Logo os testes de adequabilidade do sistema são parte integrante do método

cromatográfico desenvolvido. Estes são aplicados com a finalidade de verificar se a

resolução e reprodutibilidade do sistema cromatográfico estão adequadas para as

análises a serem realizadas.

Durante uma corrida cromatográfica vários parâmetros podem ser obtidos e

são úteis para o desenvolvimento do método cromatográfico e definição dos testes de

adequabilidade do sistema. A Tabela 6 apresenta os parâmetros que podem ser

obtidos a partir de uma corrida cromatográfica, suas definições e equações.

57

Tabela 6 - Parâmetros cromatográficos obtidos durante uma corrida analítica

PARÂMETRO CROMATOGRÁFICO

DEFINIÇÃO EQUAÇÃO

Tempo de retenção (t) É característico da substância analisada,

entretanto não é exclusivo Não se aplica

Tempo de retenção

relativo (tr)

Trata-se do tempo de relação de uma

substância com base em uma substância

principal cujo trr é considerado 1.

𝑡𝑟 = 𝑡1

𝑡2

Fator de retenção /Fator

de capacidade (K)

É a razão entre a quantidade da

substância com afinidade pela fase

estacionária e a quantidade com

afinidade pela fase móvel.

𝑘 = 𝑡 − 𝑡0

𝑡0

Número de pratos

teóricos (N) É indicativo da eficiência da coluna 𝑁 = 16 (

𝑡

𝑊)

2

Resolução (Res) Medida quantitativa do grau de separação

de dois picos adjacentes 𝑅 =

2(𝑡2 − 𝑡1)

𝑊1 + 𝑊2

Fator de cauda (Tf)

Indica a simetria do pico, apresenta valor

igual a 1 quando o pico é perfeitamente

simétrico

𝑇𝑓 = 𝑊0,05

2𝑓

Fonte: Adaptado de (BRASIL, 2010b)

Onde, t0 é o tempo morto; t é o tempo de retenção da substância analisada;

W é a largura do pico; t2 e t1 são tempo de retenção de dois picos adjacentes; W1 e

W2 são a largura dos respectivos picos na linha de base pelo método de triangulação

e W0,05 é largura do pico a 5% da altura e f é o valor da porção anterior do pico, em

relação a largura a 5% da altura.

Não há critérios definidos para todos os parâmetros de adequabilidade, exceto

para o DPR%, fator de cauda e pureza de pico. Os critérios devem ser definidos

conforme desenvolvimento do método visando a garantia da confiabilidade dos

resultados

58

2.8 ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA

A maioria dos fármacos sofre degradação físico-química no armazenamento,

logo é essencial caracterizar os produtos de degradação no processo de descoberta

e desenvolvimento de fármacos (RAJU et al., 2011).

Estudos de degradação forçada são também conhecidos como testes de

estresse, estudos de estresse, estudos de decomposição de estresse, estudos de

decomposição forçada etc. O conhecimento da estabilidade da molécula ajuda a

selecionar a formulação e embalagens adequadas, além de proporcionar condições

adequadas de armazenamento e prazo de validade. A degradação forçada é um

processo que envolve a degradação de medicamentos e substâncias em condições

mais severas do que as aceleradas e, portanto, gera produtos de degradação que

podem ser estudados para determinar a estabilidade da molécula (BLESSY et al.,

2014), fornecem dados para apoiar a identificação de possíveis degradantes; vias de

degradação e estabilidade intrínseca da molécula do fármaco e validação de

procedimentos analíticos indicadores de estabilidade (JAIN; BASNIWAL, 2013).

Embora os estudos de degradação forçada sejam um requisito regulatório e uma

necessidade científica durante o desenvolvimento de medicamentos, ele não é

considerado um requisito para o programa de estabilidade formal.

Um processo sistemático de fabricação de medicamentos de qualidade que

atendam às metas pré-definidas para os atributos críticos de qualidade (CQA) requer

o uso do conhecimento obtido em estudos de degradação forçada.

Um estudo de degradação forçada bem projetado é indispensável para o

desenvolvimento de métodos analíticos em um paradigma de QbD. Ele ajuda a

estabelecer a especificidade de um método indicativo de estabilidade e a predizer os

potenciais produtos de degradação que poderiam se formar durante os estudos

formais de estabilidade. Incorporar todas as impurezas potenciais no método analítico

e estabelecer pureza dos picos de interesse ajuda a evitar a necessidade de novo

desenvolvimento e revalidação desnecessários do método.

O conhecimento do comportamento químico das substâncias sob diversas

condições de stress também pode proporcionar informação sobre a seleção dos

excipientes para o desenvolvimento da formulação. A compatibilidade de excipientes

é parte integrante do entendimento de possíveis interações de formulação durante o

desenvolvimento do produto e é uma parte fundamental do entendimento do produto.

59

Produtos de degradação devido à interação fármaco-excipiente ou interação fármaco-

fármaco em produtos combinados podem ser examinados estressando amostras de

fármaco, medicamento e placebo separadamente e comparando os perfis de

impureza. As informações obtidas sobre os picos relacionados ao medicamento e os

picos não relacionados ao medicamento podem ser utilizadas na seleção e no

desenvolvimento de formulações mais estáveis. Por exemplo, se uma substância

medicamentosa é instável à oxidação, a adição de um antioxidante pode ser

considerada na formulação contendo substâncias medicamentosas que são instáveis

em ácido ou sofrem conversão estéreo-química em meio ácido. O teste de hidrólise

ácida/básico também pode fornecer informações úteis na formulação de

medicamentos que são líquidos ou suspensões (RAWAT; PANDEY, 2015).

O conhecimento adquirido em estudos de degradação forçada pode facilitar

melhorias no processo de fabricação. Se um estudo de fotoestabilidade mostrar que

uma substância é foto instável, deve-se tomar cuidado durante o processo de

fabricação do medicamento. Informações relativas ao desenvolvimento do processo

(por exemplo, processamento úmido versus seco, seleção da temperatura) podem ser

obtidas a partir do teste de stress térmico da substância e produto farmacêutico

(MAHESWARAN, 2012).

Após a identidade e a quantidade de um produto de degradação serem

confirmadas positivamente, o perfil de segurança deste composto de degradação

pode ser totalmente avaliado. Químicos sintéticos podem até desenvolver um novo

composto com uma estrutura semelhante, mas com uma estabilidade química

intrínseca melhorada (PAN; LIU; MOTTO, 2011).

Em se tratando de peptídeos e proteínas a fotodegradação representa uma

importante via de degradação, que pode ocorrer em vários pontos durante a

fermentação, purificação, formulação e armazenamento (KERWIN; JR., 2007) e cujas

consequências potenciais envolvem aumento da heterogeneidade, descoloração,

perda de potência (QI et al., 2009; WEI et al., 2007), mudanças conformacionais (KIM

et al., 2007), e a formação de agregados (LORENZ et al., 2009; QI et al., 2009). De

todos os aminoácidos, o triptofano é aquele que apresenta a maior absorbância da luz

ultravioleta e é, portanto, um ator fundamental nos processos de fotodegradação

(STEINMANN et al., 2013).

No Brasil a RDC N° 53/2015 apresenta as diretrizes para realização dos

estudos de degradação forçada, indicando condições de degradação: calor, umidade,

60

degradação ácida e básica e exposição fotolítica, bem como a percentagem de

degradação, que deve ser superior a 10% (BRASIL, 2015a). Posteriormente a

publicação da RDC supracitada a ANVISA publicou um guia para obtenção do perfil

de degradação e identificação de produtos de degradação em medicamentos que

ampliou a visão acerca de quais reagentes e condições utilizar uma degradação ácida

(HCl), degradação básica (NaOH), oxidativa (H2O2) (BRASIL, 2015b), no entanto

detalhes sobre como essas degradações devem ser realizadas não são ofertados e,

muitas condições diferentes podem ser encontradas na literatura .

2.9 VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS ANALÍTICAS

A qualidade analítica é um fator importante na indústria farmacêutica,

nomeadamente nos processos de desenvolvimento, produção e controle de qualidade

de medicamentos. Os métodos analíticos são o instrumento pelo qual avalia-se a

conformidade dos resultados de identificação e quantificação dos analitos com as

especificações definidas para um determinado processo ou produto. Para tanto é

imprescindível o desenvolvimento e validação de métodos analíticos cujo êxito

depende da colaboração entre os departamentos de pesquisa, desenvolvimento

controle e garantia da qualidade (BHARTI MITTU; CHAUHAN, 2015).

A demonstração da qualidade de medições químicas, através de sua

comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez mais

reconhecida e exigida. Dados analíticos não confiáveis podem comprometer

conclusões de estudos e conduzir a decisões desastrosas e a prejuízos financeiros

irreparáveis. Para garantir que um novo método analítico gere informações confiáveis

e interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominada validação

(MARY ÂNGELA FÁVARO PEREZ, 2010).

O termo validação é amplo, foi implementando ainda neste século, podendo

ser definido como: ação de provar e documentar que qualquer processo,

procedimento ou método leva a resultados esperados e consistentes (WHO, 2016),

bem como confirmação por experimentos e fornecimento de evidência objetiva de que

os requisitos específicos para um uso específico pretendido podem ser

consistentemente cumpridos (FDA, 2017).

A validação é uma parte essencial das boas práticas, incluindo boas práticas

de fabricação (BPF) e boas práticas clínicas (BPC). É, portanto, um elemento do

61

sistema de qualidade farmacêutica. A validação, como conceito, incorpora a

qualificação e deve ser aplicada ao longo do ciclo de vida do produto, processo,

sistema, equipamento ou utilidade aplicável (WHO, 2016).

Por se tratar de um termo amplo, e visando alcançar a harmonização para

aplicações farmacêuticas, foi organizada a Conferência Internacional sobre

Harmonização (ICH), e representantes da indústria farmacêutica e agências

reguladoras dos Estados Unidos, Europa e Japão definiram características de

validação, requisitos e metodologia para métodos de validação analítica. Para

análises farmacêuticas, uma diretriz ICH (Q2 (R1): Texto sobre validação de

procedimentos analíticos e metodologia (ICH, 2005), foi publicada para realização de

estudos de validação. No Brasil, a ANVISA e INMETRO são agências que apresentam

documentos acerca da validação de métodos analíticos.

Segundo RDC N° 166/2017, validação de métodos analíticos é uma avaliação

sistemática de um método por meio de ensaios experimentais de modo a confirmar e

fornecer evidências objetivas de que os requisitos específicos para seu uso pretendido

são atendidos (BRASIL, 2017). Desta forma a validação de métodos analíticos deve

demonstrar que o método analítico produz resultados confiáveis e é adequado à

finalidade a que se destina, de forma documentada e mediante critérios objetivos.

Na Tabela 7 encontram-se enumerados todos os parâmetros de validação que

um método analítico, a depender de sua finalidade, deve apresentar.

Ao observar a Tabela 7, é possível perceber que o parâmetro analítico

Robustez não é contemplado, para RDC 166/2017, àquele é considerado um

parâmetro típico da etapa de desenvolvimento de método e, caso seja considerado

relevante para o resultado do método analítico deve ser avaliado adicionalmente.

Na indústria farmacêutica, o processo de validação torna-se complexo, pois

todos os procedimentos analíticos de um medicamento, desde o seu desenvolvimento

até ao seu controle de qualidade, devem ser validados. A validação de todos os

processos de um produto farmacêutico tem que satisfazer determinados requisitos

impostos legalmente pelas autoridades reguladoras e diretivas vigentes.

62

Tabela 7 - Figuras de mérito a serem consideradas na validação analítica a depender do objetivo do método

PARÂMETRO

AVALIADO

OBJETIVO DO MÉTODO

IDENTIFICAÇÃO

TESTE DE IMPUREZAS DOSEAMENTO

- DISSOLUÇÃO

(QUANTIFICAÇÃO)

- UNIFORMIDADE

DE CONTEÚDO

- POTÊNCIA

QUANTITATIVO QUALITATIVO

Exatidão NÃO SIM NÃO SIM

Precisão

repetibilidade NÃO SIM NÃO SIM

Precisão

Intermediária NÃO SIM NÃO SIM

Seletividade SIM SIM SIM SIM

Limite de

detecção (LD) NÃO NÃO SIM NÃO

Limite de

quantificação

(LQ)

NÃO SIM NÃO NÃO

Linearidade NÃO SIM NÃO SIM

Intervalo NÃO SIM NÃO SIM

Fonte: Adaptado de (BRASIL, 2017)

63

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

A presente tese tem como objetivo geral o desenvolvimento de metodologias

analíticas para avaliação da qualidade, produtos de degradação e identificação de

impurezas, em estado sólido, do peptídeo sintético stigmurina identificado na peçonha

do escorpião Tityus stigmurus.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Caracterizar o peptídeo, em estado sólido

• Avaliar os voláteis produzidos durante decomposição térmica

• Avaliar os produtos de decomposição térmica

• Desenvolver um método de doseamento de Stigmurina por CLAE-UV/DAD

• Avaliar o perfil de degradação forçada em solução para stigmurina

• Validar o método analítico de quantificação desenvolvido

64

FLUXOGRAMA EVIDENCIANDO OBJETIVOS ESPECÍFICOS E METODOLOGIAS

UTILIZADAS

65

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL

4.1.1 Stigmurina

O peptídeo maduro (sem ambos, o peptídeo sinal e pro-peptídeo), aqui

chamado Stigmurina, foi sintetizado quimicamente, na sua forma amidada pela

Aminotech®, Brasil, utilizando a tecnologia em fase sólida FMOC (CARPINO; HAN,

1970; MERRIFIELD, 1963b). Amidação C-terminal foi selecionada com base na

presença, na sequência traduzida completa, de um sinal altamente conservado pós-

translacional de processamento (Gly-Arg-Arg-Lys), de que a clivagem proteolítica

tipicamente precede a amidação do resíduo adjacente o peptídeo maduro, como

descrito anteriormente para vários peptídeos escorpiões similares (DAI et al., 2008;

GUO et al., 2013; ZENG; CORZO; HAHIN, 2005; ZHAO et al., 2009). O peptídeo

sintético foi purificado por HPLC de fase reversa (> 98% de pureza) e sua massa

molecular foi confirmada por espectrometria de massa realizada pelo fornecedor

(ANEXO A).

Autorização Sisgen (Sistema Nacional de gestão do Patrimônio Genético),

número do Cadastro: AAF17D9 de 24/04/2018.

4.1.2 Reagentes

Os regentes utilizados que apresentaram grau LC-MS foram: ácido

trifluoroacético (TFA), fabricante Merck Millipore®, lote S5761162641 e acetonitrila,

fabricante J. T. Baker®, lote P14C58. Os reagentes utilizados que apresentaram grau

reagente foram: Hidróxido de Sódio (NaOH), lote: 08/0468, fabricante: Proquímios®,

ácido clorídrico (HCl), lote:1000832, fabricante: Vetec® e peróxido de hidrogênio

(H2O2), lote: 112275, fabricante: Synth®

A água purificada foi obtida por sistema de purificação por osmose reversa

Milli-Q Advantage, Merck®. Para realização das análises LC-MS foram utilizadas

adicionalmente solução de calibração de massas e solução de Tunning, ambas do

fabricante Agilent®.

66

4.1.3 Material de laboratório

• Balança Analítica, modelo: AUY 220, n° de série: D610020115, fabricante:

Shimadzu®

• Ultra-som, modelo: 1400, fabricante: Unique

• Câmara de Fotoestabilidade, modelo: Farma 424CF, fabricante: Ethik

technology®

• Pipeta volumétrica automática para dispensação de volumes entre 100 -

1000µL, n° de série: Neo_P1000N, fabricante: GILSON

• Pipeta volumétrica automática para dispensação de volumes entre 20 - 200µL,

n° de série: Neo_P200N, fabricante: GILSON

• Pipeta calibrada de vidro de 2 mL, fabricante: Pyrex®

• Pipeta calibrada de vidro de 5 mL, fabricante: Pyrex®

• Ponteira volumétrica para dispensação de volumes entre 50 - 1000µL,

fabricante: Eppendorf

• Ponteira volumétrica para dispensação de volumes entre 2 - 200µL,

fabricante: Eppendorf

• Proveta de 500 mL, fabricante: Pyrex®



• Balão volumétrico de 50 mL, fabricante: Pyrex®

• Balão volumétrico de 100 mL, fabricante: Pyrex®

• Béquer de plástico de 150 mL, fabricante: Brand®

• Membrana de filtração em Nylon, 47 mm de diâmetro e 0,22 µm de tamanho

de poro, lote: 120323004, fabricante: Allcrom.

• Membrana de filtração em Nylon, 47 mm de diâmetro e 0,45 µm de tamanho

de poro, lote: 522013, fabricante: FilterPro

• Vial rosqueável transparente, capacidade de 1,5 mL, com tampa e septo,

fabricante: Shimadzu®

• Coluna Zorbax Extend300 C18, dimensões: 100 x 2,1 mm; 3,5µm - 300Å, carga

de carbono: 4%, área de superfície: 45m2/g, faixa de pH de 2,0 – 11,5, duplo

endcapped, n° de série: USZT001182, fabricante Agilent®

67

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)

As curvas DSC foram obtidas em um Módulo Calorimétrico Diferencial Q10,

controlado pelo software Thermal Advantage Series® (v. 2.5.0.256), TA Instruments,

usando massas de amostra de 2,0 mg (± 0,1 mg) em cadinho de amostra de alumínio

selado com tampa contendo um orifício no centro de 0,7 mm, usando razão de

aquecimento de 10 °C.min-1. Todas as medidas foram realizadas sob atmosfera

dinâmica de nitrogênio a 50 mL.min-1, com ciclo de aquecimento-resfriamento-

aquecimento entre -50 °C e 180 °C. O DSC foi calibrado para temperatura e entalpia

utilizando metal índio (Tfusão = 156,6 °C; ∆Hfus = 28,7 J.g-1) com 99,999% de pureza,

de acordo com as instruções do fabricante. As temperaturas máximas (Tpico), o início

da temperatura (Tonset), temperatura de transição vítrea (Tg) e o calor envolvido no

evento (ΔH) para cada amostra foram medidos a partir das curvas DSC.

Estas análises foram realizadas no Laboratório do Análise Térmica, do

Instituto de Química na Universidade de Federal do Rio Grande do Norte – USP/São

Carlos.

4.2.2 Calorimetria Exploratória Diferencial acoplada em Sistema Fotovisual (DSC-

fotovisual)

Os dados de DSC acoplados ao sistema fotovisual foram obtidos no

calorímetro exploratório diferencial Shimadzu®, modelo DSC-50, constituído por

microscópio Olympus® conectado a câmera de alta resolução, modelo VCC-D520,

Sanyo® e software de captura de imagens. Utilizaram-se as mesmas condições que a

análise DSC, exceto para o intervalo de temperatura que ocorreu entre a temperatura

ambiente a 400 °C.

Estas análises foram realizadas no Laboratório Unificado de Desenvolvimento

e Ensaios de Medicamentos (UDEM) na Universidade Federal da Paraíba - UFPB.

68

4.2.3 Difratometria de raios-X (DRX)

A difratometria de raios-X das amostras foi obtida em um Difratômetro de

Raios-X Shimadzu, modelo Maxima_X XRD-7000, com tubo de raios X selado com

radiação Cu kα. A varredura angular (2θ) variou de 5 ° a 80 °, e o passo de 0,02° em

uma velocidade de varredura de 5°/min. O equipamento foi operado em 40,0 kV, 30,0

mA. A presença de características cristalinas foi identificada através de comparação

dos picos obtidos com os dados fornecidos pelas fichas de referência JCPDS (Joint

Commitee on Powder Diffraction Standards) contidas na base de dados do ICDD

(International Center for Diffaction Data) através do Software XRD700 versão 5.21. Os

dados foram plotados por meio do software Origin® (v.8.0). As análises foram

realizadas no DRX à temperatura ambiente.

Estas análises foram realizadas no Laboratório de Caracterização Estrutural

de Materiais do Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Materiais na

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN.

4.2.4 Fluorescência de raios X (FRX)

A fluorescência de raios X por dispersão de energia da amostra foi realizada

para investigar a presença de átomo de Sílicio (Si) em um equipamento Shimadzu,

modelo EDX-720/800HS, Software EDX, em atmosfera de vácuo e utilizando energia

dispersiva.


de Materiais do Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Materiais na


4.2.5 Análise termogravimétrica acoplada à análise por Infravermelho com

transformada de Fourier de produtos gasosos liberados (TG-FTIR)

As curvas TG/DTG foram obtidas em equipamento TG-FTIR, com analisador

térmico Netzsch® TG 209 F1, acoplado a um espectrômetro FTIR, Bruker®, ALPHA,

equipado com uma célula de gás TGIR, utilizando massas de amostra de 5,0 mg (±

0,1 mg) em um porta amostra de alumina, razão de aquecimento de 10 °C.min-1,

atmosfera de nitrogênio ou ar sintético em um fluxo de 20 mL.min-1, pureza de 98,0%

69

para ambos, no modo aquecimento entre temperatura ambiente a 900 °C. A entrada

do adaptador, a linha de transferência e a célula TG-IR foram mantidas a 200 °C para

evitar a condensação dos gases envolvidos. Os espectros de FTIR foram coletados

continuamente durante medições no intervalo de 4.000 - 650 cm-1 com uma resolução

de 4 cm-1. A caracterização dos produtos gasosos desenvolvidos durante a

decomposição foi realizada utilizando o software Opus® (V. 7.2).

Estas análises foram realizadas no Laboratório de Análise Térmica do Instituto

de Química na Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN.

4.2.6 Pirólise rápida acoplada a cromatografia gasosa com analisador de

espectrometria de massas – (Pyr-GC/MS)

A catálise rápida foi realizada utilizando um pirolisador Pyroprobe Py-5200

HP-R (CDS Analytical) acoplado a cromatógrafo gasoso (GC) VARIAN 3800 e

espectrômetro de massas (MS) VARIAN 3900. Os experimentos de pirólise foram

realizados a 400°C com uma razão de aquecimento de 10°C.ms-1, utilizando

aproximadamente 1 mg de amostra colocada entre a lã de quartzo superior e inferior

entre um tubo de quartzo (25,38 mm x 1,75 mm). Os vapores da pirólise foram

conduzidos por N2 (50 mL.min-1) a armadilha Tenax para dessorção a 300°C,

transferidos através da linha de transferência aquecida a 300°C e injetada no GC no

modo split (1:30). Para análise cromatográfica utilizou-se uma coluna VF-5ms (30m x

0,25mm x 0,1µm), He (99,9999%) a 1 mL.min-1 como gás carreador, com a seguinte

programação de aquecimento: em temperatura constante de 40°C por 2 min, 40 –

280°C a taxa de aquecimento de 10°C.min-1, 280°C constante por 14,5 min. A

detecção no MS foi avaliada sob impacto de elétrons (EI) em condições de ionização

de varredura total de m/z 40-500. Os voláteis foram identificados através de banco de

dados da biblioteca de espectro de massas NIST (National Institute of Standards of

Technology) do software acoplado ao sistema de análise GC/MS, considerado

identificado quando em um nível de similaridade acima de 95%.

Estas análises foram realizadas na Central Analítica do Núcleo de

Processamento Primário e Reuso de Água Produzida e Resíduo (NUPRRAR) na


70

4.2.7 Análise Termogravimétrica (TG/DTG)

As curvas TG/DTA dinâmicas foram obtidas em uma termobalança da marca

Shimadzu®, modelo DTG-60AH, com fluxo de nitrogênio 50 mL.min-1, variando as

razões de aquecimento de acordo com a metodologia utilizada. Antes do início dos

experimentos, foi realizada a limpeza do equipamento, a obtenção do branco e a

verificação da normalidade da balança procedendo à corrida prévia do padrão de

oxalato de cálcio monohidratado. Apresentando-se a termobalança em condições de

operação, deu-se início às corridas com as amostras. Para cada corrida utilizou-se

cadinho de α-alumina, contendo 5,0 mg ± 0,01 de amostra.

Estas análises foram realizadas no Laboratório de Desenvolvimento

Farmacêutico na Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN.

4.2.7.1 Obtenção dos resíduos sólidos após aquecimento térmico

Para os estudos de caracterização dos resíduos sólidos foram realizadas três

corridas dinâmicas na razão de aquecimento de 10°C.min-1, de temperatura ambiente

até para cada uma das seguintes temperaturas finais (50°C – 94°C – 105°C – 140°C

– 160°C – 190°C e 230°C). As amostras obtidas foram submetidas às análises FTIR,

MEV, CLAE, LC-MS e avaliação da atividade antiparasitária.

4.2.8 Microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (MEV-FEG)

Uma vez mantidas em dessecador por 48h as amostras foram submetidas a

metalização com ouro e depois montadas em stubs de alumínio usando fita de dupla

face. Posteriormente foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura de alta

resolução (MEV-FEG), modelo Auriga, ZEISS®. As imagens eletrônicas secundárias

foram realizadas com uma tensão de aceleração de 3 kV.


de Materiais do Programa de Pós-Graduação em Engenharia de materiais na


71

4.2.9 Espectrofotômetro de Infravermelho (FTIR-ATR)

Os espectros na região da absorção do infravermelho para os resíduos nas

diferentes temperaturas de aquecimento foram obtidos a partir de um

espectrofotômetro de absorção na região do infravermelho com transformada de

Fourier (FTIR) modelo IRPrestige-21 (Shimadzu®, Tóquio, Japão) através da técnica

de reflectância total atenuada (ATR). Os espectros foram obtidos no comprimento de

onda de 4.000 a 700 cm-1, com resolução de 4 cm-1 e baseados em 20 varreduras.

Uma análise IR correlacional foi realizada para evidenciar diferenças entre a

stigmurina não aquecida e as amostras que foram submetidas a aquecimento. A

região espectral de 1.500 a 600 cm-1 (região de impressão digital) foi considerada

nesta abordagem. Foi calculada a correlação de Pearson (r) entre os espectros de IR.

Valores de correlação de Pearson próximo a unidade (r = 1) indicam que as variáveis

comparadas são semelhantes, sendo interpretado como indicação de degradação da

stigmurina. Quando o valor de r estiver entre 0,80 e 1,00, indicando alta correlação,

enquanto entre 0,5 e 0,80 mostra correlação moderada e menos que 0,50 indica uma

baixa correlação entre as variáveis comparadas (LAVOR et al., 2014; LIMA et al.,

2015).

Estas análises foram realizadas no Laboratório Escola de Farmácia Industrial

(LEFI) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN.

4.2.10 Cromatógrafo líquido acoplado a espectrômetro de massas com analisador do

tipo Time-of-flight (LC-MS)

Para a caracterização dos resíduos sólidos nas diferentes temperaturas de

aquecimento, bem como para stigmurina padrão e caracterização dos produtos de

degradação gerados apenas na condição de degradação e tempo que tenha

apresentado degradação superior a 10% e inferior a completa decomposição da

stigmurina, as amostras foram diluídas em TFA 0,1% em água a concentração de 1

mg.mL-1 e analisados em UHPLC (Agilent® 1260 Infinity) acoplado a analisador de

massas e fonte de ionização do tipo eletrospray e tempo de voo, respectivamente,

(ESI-TOF) (Agilent® 6230). Coluna Zorbax 300Extend C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,5 μm)

foi utilizada. O volume de injeção de 1 μL e fluxo 0,3 mL.min-1. A fase móvel usada foi

TFA 0,1% em água (A) e TFA 0,1% em ACN (B) em um gradiente de eluição: iniciando

72

em 5% de A, seguido por 5 min, então alcançando 100% de B em 30 min. Nitrogênio

foi utilizado como gás nebulizante a pressão de 40 psig e o fluxo foi ajustado para 10

L.min-1. A temperatura do capilar e voltagem foram mantidas a 325 °C e 3.5 kV. A

varredura total das massas cobriu a faixa de m/z 100 a m/z 3000Da. As análises foram

conduzidas em modo positivo de ionização. Os dados foram processados pelo

software MassHunter Workstation versão B.06.11.

O padrão de fragmentação para stigmurina foi definido com base em sua

sequência primária para fragmentos das séries b e y (Apêndice C).

Estas análises foram realizadas no Laboratório de Controle de Qualidade de

Medicamentos (LCQMed) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN.

4.2.11 Determinação da atividade antiparasitária frente a forma epimastigota do

Trypanosoma cruzi (cepa Y)

A atividade antiparasitária da Stigmurina submetida a diferentes condições de

temperatura foi avaliada sobre as formas epimastigotas da cepa Y do Trypanossoma

cruzi cultivada em meio LIT (Liver Infusion Triptose). Os parasitas foram incubados a

27 ± 2 °C em meio LIT por 11 dias até a fase estacionária para o teste de viabilidade

celular.

Os peptídeos foram solubilizados em água destilada, sendo observada

partículas em suspensão de coloração amarelada na amostra aquecida a 230 ºC. O

ensaio foi realizado com a Stigmurina armazenada em geladeira e amostras

aquecidas nas temperaturas de estudo (50°C – 94°C – 105°C – 140°C – 160°C –

190°C e 230°C) na concentração de 17,95 µg.mL-1. A concentração selecionada teve

como base o estudo de Parente e colaboradores (2018), no qual observou a inibição

de 75% da viabilidade das formas epimastigota (crescimento de 25%) nesta

concentração, utilizando a metodologia do MTT (MUELAS-SERRANO; NOGAL-RUIZ;

GÓMEZ-BARRIO, 2000).

4.2.11.1 Método da resazurina

A atividade antiparasitária da Stigmurina submetida a diferentes condições de

temperatura foi avaliada sobre a forma epimastigota do Trypanosoma cruzi (cepa Y)

pelo método da resazurina, seguindo a metodologia descrita por Rolón e

73

colaboradores (2006) com modificações (ROLÓN et al., 2006). Em uma placa de 96

poços, as formas epimastigota (1x107 parasitas/mL) em meio LIT foram incubadas a

27 °C ± 2 com Stimgurina (10 µM) nas diferentes condições de aquecimento por 24h.

Sequencialmente, 20 µL da solução de resazurina (3 mM) foi adicionado a mistura e

incubado a 27 °C ± 2 por 24h. A absorbância foi mensurada a 570 nm e 600 nm em

um leitor de microplacas (Epoch Biotek, Winooski, EUA). Os poços contendo as

formas epimastigotas em meio LIT na ausência do peptídeo foram utilizados como

controle positivo de viabilidade (100% de viabilidade). A capacidade de redução da

resazurina (RR) possui relação diretamente proporcional a viabilidade do parasita,

sendo calculada a partir da seguinte equação:

𝑅𝑅 = [𝐴570t – (𝐴600𝑝𝑡 𝑥 𝑅0)]/ [𝐴570c – (𝐴600𝑐 𝑥 𝑅0)] (19)

Onde, A570 e A600 correspondem à absorbância da resazurina em 570 nm e

600 nm respectivamente, dos poços tratados (pt) com a Stigmurina e absorbância no

mesmo comprimento de onda, dos poços controle positivo de crescimento (c). O R0

corresponde ao fator de correção do ensaio obtido a partir da seguinte equação:

𝑅0 = 𝐶𝑚𝑒𝑖𝑜570𝑛𝑚 / 𝐶𝑚𝑒𝑖𝑜600𝑛𝑚 (20)

Onde, Cmeio570nm e Cmeio600nm correspondem a absorbância da resazurina a

570nm e 600nm no meio de cultura LIT na ausência de parasitas. A análise estatística

foi realizada utilizado o ANOVA one way, seguido do teste de Tukey para

comparações múltiplas, utilizando o software GraphPad Prism versão 7.0 (San Diego,

EUA). Os valores foram considerados significativos quando p <0,05.

Estas análises foram realizadas no Laboratório de Imunoparasitologia na


4.2.12 Desenvolvimento de método cromatográfico

4.2.12.1 Preparo de fases móveis

A fase móvel A consistiu em uma solução aquosa de ácido trifluoroacético,

utilizando água purificada e concentração final de 0,1% de TFA.

74

A fase móvel B consistiu em uma solução orgânica de ácido trifluoroacético,

em acetonitrila, na concentração de 0,1% de TFA.

Todo conteúdo foi filtrado em membrana de nylon com 0,22 µm de diâmetro

de poro e degaseificada previamente por sonicação (10min) antes de circular no

sistema cromatográfico. Preparo diário.

4.2.12.2 Preparo da solução estoque e solução de trabalho

Pesou-se a stigmurina em balança analítica previamente calibrada e em

seguida o volume foi completado com diluente para concentração final de 5,0 mg.mL-

1. A solução diluente consistiu na fase móvel A.

A solução de trabalho foi obtida de diluições da solução estoque até a

concentração final de 1,0 mg.mL-1.

4.2.12.3 Estratégia de desenvolvimento de método cromatográfico

Para avaliação da coluna cromatográfica escolhida durante o

desenvolvimento do método foram avaliadas diferentes colunas, conforme Tabela 8.

Os parâmetros N, HETP, tR, k e Tf foram determinados para comparação da eficiência

de separação das diferentes colunas. Foram realizadas corridas no modo gradiente

iniciando em 30% de FMB e alcançando 100% de FMB em 30 min. A cada análise a

coluna foi equilibrada em 30% de FMB por aproximadamente 15 min. A temperatura

de análise padronizada foi de 25°C (temperatura ambiente), utilizou-se solução padrão

nominal a 1,0 mg.mL-1 (100%) de stigmurina.

75

Tabela 8 - Diferentes colunas cromatográficas avaliadas durante o desenvolvimento de método

COLUNA C

(mm) D

(mm) PARTÍCULA

(µM) PORO

(Å) Vc

(mL)

V. inj

(µL)

Fluxo (mL.min-1)

ZORBAX

EXTEND300 100 2,1 3,5 300 ≈ 0,35 1 0,3

ADVANCEDBIO

PEPTIDE MAP 100 2,1 2,7 120 ≈ 0,35 1 0,3

SHIMPACK XR-

ODS C18 50 3,0 2,2 120 ≈ 0,35 1 0,3

POROSHELL

120 EC-C18 50 4,6 2,7 120 ≈ 0,83 ≈ 2 0,72

KINETEX 50 2,1 1,3 95 ≈ 0,17 0,50 0,15


O volume de injeção e fluxo da coluna foram ajustados a partir das equações

de escalonamento geométrico com base no volume da coluna (Equação 21 – volume

da coluna, Equação 22 - ajuste de fluxo e Equação 23 - ajuste de volume de injeção)

utilizando a condição para coluna ZORBAX EXTEND 300 como condição padrão

(Volume 1 µL e Fluxo de 0,3 mL.min-1). O preparo da amostra foi equivalente a solução

padrão de linearidade a 100%.

Vc = πr2L (21)

Fluxo 2 = Fluxo1x dc2

2

dc12 (22)

Vinj 2 = Vinj 1x Vc2

Vc1 (23)

Para avaliação do comportamento inicial de eluição os parâmetros N, HETP,

tR, k, W, pureza de pico, número de picos detectados e Tf foram calculados. Realizou-

se corridas em dois modos gradiente, sendo que o primeiro iniciava em 30% de FMB

76

e alcançando 100% de FMB em 30 min, sendo a coluna inicialmente equilibrada em

30% de FMB por aproximadamente 15 min, enquanto que o segundo iniciava em 40%

de FMB e alcançando 100% de FMB em 30 min, sendo a coluna inicialmente

equilibrada em 40% de FMB. A temperatura de análise padronizada foi de 25°C

(temperatura ambiente), utilizou-se solução padrão nominal a 1,0 mg.mL-1 (100%) de

stigmurina injetada num volume de 1 µL. O preparo da amostra foi equivalente a

solução padrão de linearidade a 100%.

Para avaliação da proporção de eluição de solvente orgânico em uma

temperatura ótima de análise realizou-se análise no modo gradiente variando-se de

40% de FMB a 50% de FMB em 15 min, mantendo-se fixo o volume de injeção em 1

µL e alterando a temperatura da coluna em três situações distintas a 30°C, 40°C e

50°C. Nesta etapa o parâmetro Tf e Res foi determinante para escolha da temperatura

de análise. Além disso com base numa variação de fase móvel mais estreita (∆% =

10%) foi determinado a concentração de solvente orgânico para eluição de stigmurina

(proporção FMB), conforme equação (25) em cada temperatura, com base na taxa de

mudança de gradiente (Txg), calculada equação (24):

Taxa de mudança = Concentração final de FMB(%)− Concentração inicial de FMB(%)

tempo de gradiente (min) (24)

Proporção FMB = Cinicial FMB (%) + t inicial de saída de pico × Taxa de mudança (25)

Para avaliação do fluxo de fase móvel realizou-se análise no modo isocrático

com 42% de FMA e 58% de FMB, a temperatura de 40°C, volume de injeção de 1 µL,

e alterando-se o fluxo em análises distintas para 0,1 mL.min-1, 0,2 mL.min-1 e 0,3

mL.min-1. Nesta etapa o parâmetro Tf, R e tR foram determinantes para escolha do

fluxo de análise, bem como o DPR% da replicata das leituras.

Por fim, avaliou-se a influência do volume de injeção sobre o método analítico

e análises foram realizadas no modo isocrático com 42% de FMA e 58% de FMB, a

temperatura de 40°C, fluxo de 0,3 mL.min-1, alterando-se o volume de injeção de 0,1

µL, 0,5 µL e 1,0 µL em análises distintas. Nesta etapa todos os parâmetros foram

avaliados para determinação do comportamento de eluição com diferentes volumes

de injeção.

77



4.2.13 Estudo de Degradação Forçada

4.2.13.1 Preparação das soluções degradantes

Solução de ácido clorídrico 1M (HCl M) foi preparado a partir de uma solução

de ácido clorídrico 5N diluída em água purificada e armazenada em frasco de vidro.

Solução de Hidróxido de sódio 1M (NaOH 1M) foi preparado a partir de uma

solução de hidróxido de sódio 2M diluída em água purificada e armazenada em frasco

plástico.

Solução de peróxido de hidrogênio 20,0% foi preparada a partir de uma

solução de peróxido de hidrogênio 29% diluída em água purificada e armazenada em

frasco de vidro.

4.2.13.2 Preparo da solução estoque (SES), soluções de degradação (SD) e soluções

de leitura (SL)

Pesou-se a stigmurina em balança analítica previamente calibrada e em

seguida o volume foi completado com diluente para concentração final de 5,0 mg.mL-

1. A solução diluente consistiu na fase móvel A. Esta solução foi denominada solução

estoque (SES).

As soluções de degradação de stigmurina (SD), em cada tempo de análise

(T0, 12h, 24h e 36h) e para as condições de degradação ácida, básica e oxidativa,

foram preparadas por diluição da solução estoque para obtenção de solução final

leitura (SL) na concentração de 1,0 mg.mL-1, conforme Tabela 9.

78

Tabela 9 - Preparo das soluções de degradação e solução de degradação para leitura nos diferentes tempos de análise

SOLUÇÕES SOLUÇÃO DE

DEGRADAÇÃO (SD)

SOLUÇÃO DE LEITURA

(SL)

Preparo da solução

1mL de SES

+

1mL de uma das Soluções

degradantes: HCl 1N,

NaOH 1N, H2O2 20,0%

250 mL de SD

+

375 µL de FMA

Concentração final 2,5 mg.mL-1 1,0 mg.mL-1


Em se tratando da solução submetida à fotodegradação, adicionou-se 1 mL

da solução estoque (SES) em balão volumétrico de 5 mL completando o volume com

diluente (FMA) – concentração final: 1 mg.mL-1. Esta solução foi submetida a

exposição em câmara de fotoestabilidade, com controle de temperatura, (radiação UV,

lâmpada fluorescente e, iluminação > 1,2 milhões de lux.hora, em concordância com

diretrizes ICH Q1B) e, nos tempos de leitura 0, 12, 24 e 36h uma alíquota de 625 µL

foi retirada para análise. Uma solução contendo apenas diluente (FMA) foi mantida

conjuntamente por todo período de exposição com a amostra durante foto degradação

e analisada no tempo T0 e T36h.

Para a hidrólise térmica, em 1 mL da solução estoque (SES) adicionou-se 1

mL de água, esta solução foi mantida em banho maria sob aquecimento a 70°C. Nos

tempos de análise a amostra foi coletada e diluída conforme preparo da solução de

leitura na Tabela 9.

Foram preparadas soluções brancas para cada uma das condições de

degradação, excluindo-se a solução degradante e adicionando igual volume de

solução diluente (FMA) em seu lugar, que foram posteriormente analisadas no tempo

T0.

4.2.13.3 Análises Cromatográficas de amostras submetidas a degradação forçada

As análises cromatográficas foram realizadas em cromatógrafo líquido de ultra

eficiência, modelo Proeminence UFLC-XR, fabricante Shimadzu®, composto de

79

bomba binária (modelo: LC-20AD), degaseificador de fase móvel on-line (modelo:

DGU-20A3), auto-injetor (modelo: SIL-20AHT), detector de arranjo de fotodiodos

(modelo: SPD-20A), forno para coluna (modelo:CTO-20A), módulo de comunicação

(modelo: CBM-20A) e sistema de aquisição de dados software LC-Solution. A Tabela

10 apresenta as condições analíticas do método utilizado para avaliação da

degradação de stigmurina nas soluções de leitura.

Tabela 10 - Condições cromatográfica para análise das soluções de leitura de stigmurina submetida a diferentes condições de degradação

PARÂMETRO ESPECIFICAÇÃO

Coluna

Zorbax extend 300 Å

(100 mm x 2,1 mm; 3,5µm)

Fluxo de fase móvel 0,3 mL.min-1

Temperatura do forno 40°C

Comprimento de onda 215 nm e 280 nm

Volume de injeção 1µL

Modo de eluição Isocrático

FMA TFA 0,1% em água purificada

FMB TFA 0,1% em acetonitrila

PROPORÇÃO FMA: FMB 58%:42%

TEMPO DE ANÁLISE 10 min


A taxa de degradação foi determinada considerando-se 100% a solução de

leitura no tempo zero e fazendo sua correlação linear para os demais tempos de

análise. Para verificação de conformidade de preparo as áreas obtidas no tempo zero

para cada uma das soluções de degradação no tempo zero foi comparada a uma

solução padrão na concentração nominal de 1,0 mg.mL-1.



80

4.2.14 Validação do método

O método proposto foi validado de acordo com a Conferência Internacional

sobre Harmonização dos Requisitos Técnicos para o Registro de produtos

Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) orientações Q2 (R1) (ICH, 2005) e Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) conforme resolução de diretoria colegiada

RDC n° 166/2017 (BRASIL, 2017).

4.2.14.1 Seletividade

A seletividade do método foi checada na solução diluente, na amostra

contendo stigmurina, nas soluções de stigmurina que passaram por degradação

térmica, fotólise, hidrólise ácida (HCl) e hidrólise básica (NaOH), no tempo de

degradação e concentração de degradação otimizadas, durante o estudo de

degradação forçada. O espectro UV para identificação de stigmurina e o grau de

pureza do pico cromatográfico foram determinados. Varreduras espectrais foram

obtidas de 200 a 400 nm pelo detector de arranjo de fotodiodos, operando no modo

de varredura total e, em seguida, selecionou-se o comprimento de onda de 215 nm

para o estudo.

4.2.14.2 Linearidade

A curva de calibração foi realizada em triplicata pela preparação de solução

padrão de stigmurina em diferentes concentrações, preparadas de maneira

independente, a fim de se obter as concentrações finais de 0,8, 0,9, 1,0 1,1 e 1,2

mg.mL-1. A curva de calibração foi obtida pela obtenção do gráfico da razão da área

do pico de stigmurina versus a concentração.

Para avaliação da linearidade, foi obtida uma curva de calibração através da

representação gráfica das respostas (ÁREA DO PICO DA STIGMURINA) em função

da concentração do analito, o gráfico de dispersão dos resíduos, acompanhado de

sua avaliação estatística, e a equação da reta de regressão de y em x, estimada pelo

método dos mínimos quadrados, uma avaliação da associação linear entre as

variáveis por meio do coeficientes de correlação (r) e de determinação (r²) e uma

avaliação da significância do coeficiente angular.

81

A homocedasticidade dos dados foi ser investigada para a utilização do

modelo adequado, em um nível de significância de 5% (cinco por cento), o coeficiente

de correlação > 0,99, e o coeficiente angular deve ser significativamente diferente de

zero.

4.2.14.3 Limite de detecção (LD)

A determinação do limite de detecção foi realizada por estimativa a partir dos

dados da curva analítica de calibração (desvio padrão residual da linha de regressão)

e confirmada pela preparação e leitura de uma solução a 0,04 mg.mL-1, a partir da

diluição da solução padrão nominal a 1,0 mg.mL-1 (100%).

4.2.14.4 Limite de quantificação (LQ)

A determinação do limite de quantificação foi realizada por estimativa a partir

dos dados da curva analítica de calibração (desvio padrão residual da linha de

regressão) e confirmada pela preparação e leitura de uma solução a 0,14 mg.mL-1, a

partir da diluição da solução padrão nominal a 1,0 mg.mL-1 (100%), cuja precisão e

exatidão foram determinadas, devendo o limite de recuperação encontrar-se na faixa

de 80% - 110% e o DPR% das análises variar no máximo 5%.

4.2.14.5 Exatidão

A Exatidão é determinada por meio do grau de concordância entre os

resultados individuais do método em estudo em relação a um valor aceito como

verdadeiro.

Para determinação da exatidão foram utilizadas triplicatas de soluções

amostra, preparadas de maneira independente, nas concentrações baixa (0,8 mg.mL-

1 – 80%), média (1,0 mg.mL-1 – 100%) e alta (1,2 mg.mL-1 – 120%) e os resultados

foram expressos em recuperação média.

A exatidão foi expressa pela relação percentual de recuperação do analito de

concentração conhecida adicionado à amostra ou pela relação entre a concentração

82

média, determinada experimentalmente, e a concentração teórica correspondente,

dada pela equação seguinte:

Recuperação = Concentração média experimental

Concentração teórica × 100

4.2.14.6 Repetibilidade

Para determinação da repetibilidade a solução de trabalho foi preparada, 6

réplicas, na concentração nominal de 1,0 mg.mL-1 (100%), individualmente

preparadas, sob as mesmas condições de operação, mesmo analista e mesma

instrumentação, em uma única corrida analítica. Os resultados foram expressos em

DPR%.

4.2.14.7 Precisão Intermediária

Para determinação da precisão Intermediária a solução de trabalho foi

preparada em sextuplicata, na concentração nominal de 1,0 mg.mL-1 (100%), em dois

dias diferentes, por dois analistas distintos, denominados analista A e B. Os valores

foram expressos em DPR% e análise estatística de teste T de Student em par para

médias foi realizada.

4.2.14.8 Robustez

Para determinação da robustez do método foram preparadas soluções de

trabalho na concentração nominal de 1,0 mg.mL-1 (100%) e realizadas pequenas

mudanças deliberadas em três fatores da condição cromatográfica padronizada, a

saber: temperatura do forno (39°C e 41°C), proporção de fase móvel (41%:59% –

FMA:FMB e 43%:57% – FMA:FMB) e fluxo de fase móvel (0,29 mL.min-1 e 0,31

mL.min-1). Os resultados foram expressos em DPR%.

83

4.2.14.9 Adequabilidade do sistema

Para determinação da adequabilidade do sistema avaliou-se as condições de

operação do equipamento, método e coluna cromatográfica com base no pico

cromatográfico para stigmurina. Os dados de adequabilidade do sistema foram

obtidos para as análises de repetibilidade e expressos em DPR%. Os valores de área,

N, HETP, K, Tf, Res, Pureza de pico e tR foram calculados através do software LC

Solution, Shimadzu®.

4.2.14.10 Estabilidade das soluções

Para avaliação da estabilidade preparou-se uma solução de trabalho na

concentração nominal de 100% (1,0 mg.mL-1) e procedeu-se sua injeção, três vezes

nos tempos 0, 12, 18 e 24h. A presença de picos adicionais àqueles presente no

tempo zero, bem como a diminuição das áreas dos picos foram avaliadas.



84

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA STIGMURINA

5.1.1 Caracterização dos grupos químicos e morfologia do pó de stigmurina

O espectro FTIR da stigmurina no estado sólido é apresentado na Figura 8(A).

O espectro. de peptídeos e proteínas, apresenta algumas regiões de vibração bem

características, são elas: Amida A, Amida I, Amida II e Amida III. Sendo a região da

Amida I a mais sensível às alterações conformacionais estando sua frequência

correlacionada com a estrutura secundária e sendo, portanto, bastante utilizada na

caracterização de estrutura secundária de peptídeos e proteínas (BAL RAM, 1999;

SPEED; KING; WANG, 1997).

Figura 8 - Espectro FTIR (A) e imagem MEV (B) para stigmurina em estado sólido

Fonte: Autoria própria, 2019.

Duas características são proeminentes no espectro da stigmurina: uma banda

larga de absorção em 3290 cm-1, conhecida como Amida A, e uma banda de absorção

em 1649 cm-1. A atribuição deste último é bem conhecida: a faixa a 1620-1700 cm-1

refere-se à amida I (principalmente modo de estiramento do grupo C=O de carbonila);

a banda a 1539 cm-1 (amida II) também está bem estabelecida: refere-se ao modo de

deformação no plano do grupo NH. As bandas de modo deformacional dos grupos

amina de cadeia lateral carregada NH3+ também estão no intervalo em 1500 cm−1,

85

como por exemplo, para zwitterion de alanina no estado sólido (ROZENBERG et al.,

2003).

Evidências qualitativas extensivas correlacionam frequências de absorção de

amida características com a presença de α-hélices (1650 cm-1), folhas-β (1620 cm-1 e

1680 cm-1) e estruturas randômicas (1640-1650 cm-1) (SUSI; TIMASHEFF; STEVENS,

1967). No estado sólido os dados FTIR sugerem que stigmurina se estabilize entre α-

hélices e/ou estruturas randômicas visto não serem observadas vibrações

características para folhas-β.

A banda em 3068 cm-1 é atribuída a vibração dos grupos NH3+ da cadeia lateral.

A atribuição desta banda ao modo NH3+ também é suportada pela presença de uma

banda a 3000 - 3100 cm-1 em espectros de cristal de peptídeos simples e aminoácidos

(ROZENBERG et al., 2005), que formam zwitterions com o grupo NH3+ no estado

sólido. As bandas estreitas em 2964 cm-1, 2927 cm-1 e 2870 cm-1 são atribuídos aos

modos de estiramento CH2.

Adicionalmente a imagem MEV, Figura 8(B), de stigmurina pó apresenta

morfologia pouco definida e bastante heterogênea, com presença de estruturas

esféricas e bastões, organizados em forma de teia, e partículas desagregadas de

superfície lisa.

5.1.2 Perfil de impurezas de síntese para stigmurina

Inicialmente foram caracterizadas as impurezas na amostra de stigmurina

estudada, uma vez que esta foi sintetizada com 98% de pureza. Em virtude de

proteínas e peptídeos normalmente sofrerem protonação as análises LC-TOF/MS

foram realizadas no modo positivo.

A Figura 9 apresenta o cromatograma de íons totais (TIC) e os espectros de

massas para cada uma das substâncias observadas na análise do padrão de

stigmurina. Foram detectados três picos com tempos de retenção (tR) de 17,35 min;

17,66 min e 17,84 min (Figura 9A).

86

Figura 9 - Cromatograma de íons totais (TIC) para stigmurina evidenciando impurezas (A) e

espectro de massas para tR = 17,84 (B), tR = 17,66 (C) e tR = 17,35 (D)

(A)

(B)

(C)

(D)


[M+H]+

[M+2H]2+

[M+3H]3+

[M+H]+[M+3H]+

[M+3H]3+

[M+2H]2+

[M+H]+

[M+H]+

[M+Na]+

[M+K]+

[M+Na]+ [M+2H]2+

[M+Na]+

[M+H]+

[M+2H]2+ [M+3H]3+

87

Em 17,84 min (Figura 9B) encontra-se os íons com m/z de 599,3566, 898,5328

e 1.796,0556 que correspondem à stigmurina triplamente protonada, duplamente

protonada e protonada, respectivamente. Também encontramos uma m/z de

2.394,4007 correspondente a ligação entre a forma protonada e triplamente protonada

da stigmurina. Este peptídeo apresenta massa molecular monoisotópica de

1.795,1713 Da, erro 0,62 ppm (C89H139N19O20).

Em 17,66 min (Figura 9C) encontra-se os íons com m/z de 855,0142;

1.709,0192; 1.731,0005 e 1.745,9704, que correspondem à impureza 1 duplamente

protonada, protonada, formando aduto com íon sódio e com íon potássio,

respectivamente, o que indicaria que a massa molecular média da impureza 1 seria

1.708,011375 Da (C84H129N17O19), erro 0,49 ppm. A diferença entre os valores de m/z

para as formas protonada da stigmurina e impureza 1 de aproximadamente 87 Da

sugere deleção de um resíduo de serina. Na estrutura linear da stigmurina o resíduo

de serina está em 3 diferentes posições e, portanto, a impureza 1 pode ser uma das

seguintes sequências: FFLIPSLVGGLISAFK-NH2; FFSLIPLVGGLISAFK-NH2 ou

FFSLIPSLVGGLIAFK-NH2.

Ainda em 17,66 min também se encontra íons com m/z de 599,6836;

899,0228; 1.797,0339 e 1.819,0131, que correspondem à impureza 2 triplamente

protonada, duplamente protonada, protonada e formando aduto com sódio,

respectivamente, o que indicaria que a massa molecular da impureza 2 seria

1.796,0260 (C89H138N18O21), erro 0,31 ppm. A proximidade de massa molecular com

a stigmurina divergindo em 0,98402 sugere que a impureza 2 trata-se da forma não-

amidada da stigmurina (Figura 10), também presente na amostra e co-eluindo com a

impureza 1.

88

Figura 10 - Proposta de estrutura química para impurezas 2

Impureza de síntese 2: FFSLIPSLVGGLISAFK - m/z: 1797,0339 +H

OHNH NH NH NH N NH NH NH NH NH NH NH NH NH NHNH2

O O O

OH

O

CH3

CH3

O

CH3

CH3

O O

OH

O

CH3

CH3

O

CH3CH3

O O O

CH3

CH3

O

CH3

CH3

O

OH

O

CH3

O

NH

O

NH2


Em 17,35 min (Figura 9D) encontra-se íons com m/z de 561,6624; 841,9868;

1.682,9652 e1.703,9438, que correspondem à impureza 3 triplamente protonada,

duplamente protonada, protonada e formando aduto com íon sódio, respectivamente,

o que indicaria que a massa molecular média da impureza 3 seria 1.682,0136 Da

(C85H129N17O20), erro 4 ppm. A diferença entre os valores de m/z para as formas

protonada da stigmurina e impureza 3 de aproximadamente 113 Da sugere deleção

de um resíduo de isoleucina ou leucina, que são isômeros. Na estrutura linear da

stigmurina os resíduos de leucina se encontram em 3 diferentes posições enquanto

os de isoleucina se encontram em 2 diferentes posições.

5.1.3 Caracterização térmica

O entendimento das alterações pós aquecimento que a stigmurina sofre e que

podem levar a alterações de suas propriedades é crucial para o desenvolvimento de

suas aplicações. Inicialmente foram obtidas curvas DSC e TG em atmosfera de N2

para stigmurina, conforme apresentado na Figura 11.

89

Figura 11 – Sobreposição de curvas DSC e TG para stigmurina em atmosfera de N2 (A) e imagens DSC-fotovisual a 30°C, 100°C, 140°C, 160°C, 190°C, 230°C e 360°C (B). (A)

(B)


A stigmurina apresentou quatro etapas de perda de massa, na curva TG, na

faixa de 30°C – 900°C e apenas eventos endotérmicos, totalizando quatro eventos,

na faixa de 30°C – 450°C, relacionados as etapas de perda de massa. As duas perdas

de massa que se iniciam à temperatura ambiente e finalizam a 170°C estão

possivelmente relacionadas com perda de água e solventes ainda presentes na

amostra. Estas etapas de perda de massa envolvem a presença de dois eventos

endotérmicos. O primeiro evento (Tonset = 25°C e ∆Hevap = 40,5 J.g-1) e o segundo

evento (Tonset = 135°C) pouco definido envolvendo possível desvio da linha de base.

As etapas de perda de massa superiores a 180°C trata-se de decomposição

propriamente dita da stigmurina (Ti = 184°C; 1° etapa e, Ti = 257°C; 2° etapa) e

envolve processos endotérmicos (Figura 11A).

90

As imagens DSC-Fotovisual (Figura 11B) não evidenciam alteração visual da

amostra até 160°C, no entanto na imagem a 190°C pode-se observar presença de

amostra em estado líquido possivelmente devido a formação de produtos de

decomposição. A 232°C observa-se que a coloração da amostra se encontra

levemente amarelada e, a 360°C evidencia-se escurecimento da amostra e formação

de material com contornos alaranjado.

Uma vez evidenciado alteração da linha de base durante a curva DSC,

sabendo-se que a presença de solventes de síntese poderiam estar interferindo na

visualização deste evento e, sendo determinada a temperatura de início da

decomposição procedeu-se obtenção de curvas DSC em ciclos no modo de

aquecimento-resfriamento-aquecimento entre temperatura ambiente e 180°C

(primeiro e segundo ciclo) e -50 a 180°C (resfriamento), como apresentado na Figura

12.

Figura 12 – Curvas DSC para ciclo aquecimento-resfriamento em atmosfera de nitrogênio (A) e curva DRX para stigmurina (B)

Fonte: Autoria própria, 2019

Na Figura 12(A), o primeiro aquecimento da stigmurina (iniciando em

temperatura ambiente revelou um evento endotérmico relacionado a perda de água a

Tonset = 34,08 °C e ∆Hevap = 55,93 J.g-1 e um segundo evento endotérmico não bem

definido a Tonset = 137 °C. Após resfriamento da amostra um segundo aquecimento foi

realizado onde se observou um desvio da linha de base com Tg = 149°C (ponto médio)

típico de material amorfo confirmando que a amostra não cristaliza na etapa de

91

resfriamento. De fato, nenhum pico de recristalização foi encontrado durante o

resfriamento, conforme Figura 12(A).

Finalmente padrão de dados DRX foram usados para confirmar que a amostra

sendo analisada seria amorfa. Materiais amorfos não apresentam uma estrutura

ordenada como materiais cristalinos e, portanto, o padrão de difração resultante não

possui série típica de picos associados a materiais cristalinos. O padrão de difração

de materiais amorfos associados com materiais apresenta um amplo "halo" com

poucos ou um único máximo, conforme visualizado na Figura 12(B) para stigmurina

obtida por síntese química na faixa de 2 θ – 40 θ. Embora este halo padrão não

identifique unicamente o material em estudo ele confirma que o material é amorfo,

sendo fundamental a sua caracterização. Três sinais fortes característicos de fase

silício-carbono estão presentes, após 40θ (44θ, 64θ e 77θ). Estes picos coincidem

com a fase carbeto de silício (SiC), conforme identificado por comparação com a carta

padrão #JPCDS 49-1623. Adicionalmente, uma análise FRX foi realizada e verificado

presença de átomo de Silício na amostra.

Após a etapa final de síntese química dos peptídeos, seja em solução ou em

fase sólida, o peptídeo bruto deve ser purificado por técnicas cromatográficas, como:

troca iônica, exclusão, afinidade e / ou reversa (MACHADO et al., 2004; MANT et al.,

2018; XU et al., 2018). A cromatografia líquida de fase reversa é baseada na adsorção

dos peptídeos sintéticos a uma matriz estacionária hidrofóbica (derivada de sílica pela

introdução de cadeias alquílicas tais como n-butil (C4), n-octil (C8), n-octadecil (C18),

fenil, ciclo-hexil e outros) (FIELD et al., 2019). Portanto, é possível detectar o carbeto

de silício (SiC), oriundo de etapa de síntese ou purificação, juntamente com o padrão

de Stigmurina em análises de DRX acima de 40θ.

A presença de uma transição vítrea evidencia o fato do peptídeo stigmurina

apresentar região amorfa, com uma falta de ordem, semelhante ao da proteína

elastina (SAMOUILLAN et al., 2002). A determinação da temperatura de transição

vítrea é importante para o desenvolvimento da formulação de stigmurina no futuro,

pois, em geral, a estabilidade de longo prazo de uma formulação contendo

proteínas/peptídeos requer que a temperatura de armazenamento esteja bem abaixo

da temperatura de transição vítrea, além da possibilidade do uso da temperatura de

transição vítrea na realização de estudos de compatibilidade fármaco-excipiente (LU

et al., 2007). Stigmurina pode ser, portanto, considerado um peptídeo com alto valor

de temperatura de transição vítrea (Tg > 100) (FABIO et al., 2015).

92

5.2 CARACTERIZAÇÃO DOS VOLÁTEIS LIBERADOS PELA STIGMURINA

DURANTE DECOMPOSIÇÃO EM ATMOSFERA DE NITROGÊNIO E AR SINTÉTICO

5.2.1 Análises TG-FTIR

A Figura 13 (A) apresenta a perda de massa (TG), associada a curva derivada

DTG e perfil de absorbância total no infravermelho (Curva Gram-Schmidt) da

stigmurina como uma função da temperatura para atmosfera de N2.

Em atmosfera de nitrogênio, Figura 13(A), a curva TG apresenta 4 etapas

distintas de perda de massa. A primeira etapa ocorre da temperatura ambiente a cerca

de 93°C com pico de baixa intensidade e pequena perda de massa de 2,8%. A

segunda etapa ocorre entre 93°C – 184°C com perda de massa de 4,1%. A terceira

etapa ocorre entre 184°C – 254°C com perda de massa de 12%. A quarta etapa ocorre

entre 254°C – 497°C com perda de massa de 70,3%. Depois desta stigmurina

mantém-se perdendo massa lentamente de maneira constante, com eliminação de

material carbonáceo, ao final de 900°C a perda de massa é de 99,1%, com 0,9% de

resíduo.

A perda de massa de vários α-aminoácidos alifáticos (metionina, treonina, e

alanina) ocorre praticamente em uma única etapa com quase 100% de perda de

massa (RODANTE; MARROSU, 1990; RODANTE; MARROSU; CATALANI, 1992),

para leucina a perda de massa está relacionada a sublimação do aminoácido que

posteriormente decompõem-se no estado gasoso (LI et al., 2006), a glicina é um α-

aminoácido que apresenta múltiplos passos de decomposição (LI et al., 2007), para

aminoácidos aromáticos tais como tirosina e fenilalanina essa perda de massa ocorre

em duas etapas (JIE; YUWEN; JINGYAN, 2008). Devido à complexidade da estrutura

de peptídeos e a presença de aminoácidos aromáticos (no caso a fenilalanina) a

decomposição em múltiplos passos foi observada para stigmurina.

93

Figura 13 – Curvas TG, DTG e Gram-Schmidt para stigmurina em atmosfera de N2 (A) e ar sintético (B)

(A)

(B)


94

A comparação da curva Gram-Schmidt com a curva DTG indica que a

temperatura dos picos de absorbância no IR corroboram com aquelas dos picos de

DTG apenas para a terceira etapa de perda de massa. A curva Gram-Schmidt

apresenta 5 picos a 212 °C, 229 °C, 241 °C, 250 °C e 357°C, e a curva DTG apresenta

3 picos a 132,7 °C, 230,2 °C e 310,1 °C. A terceira etapa de perda de massa na curva

DTG envolve três picos máximos da curva Gram-Schmidt. Provavelmente indicando

três perfis de voláteis liberados durante esta etapa.

Em atmosfera de ar sintético, Figura 13(B), a curva DTG mostra 5 etapas de

perda de massa. A primeira etapa ocorre entre a temperatura ambiente a 83°C com

pico amplo de baixa intensidade e pequena perda de massa de 1,8%. A segunda

etapa ocorre entre 83°C – 180°C com perda de massa de 4,2%. A terceira etapa

ocorre entre 180°C – 254°C com perda de massa de 11,2%. A quarta etapa ocorre na

faixa de 254°C - 467°C com perda de massa de 60,8%. Em temperaturas elevadas,

acima de 467°C, a quinta etapa de perda de massa ocorre (467°C – 900°C) com perda

de massa contínua de 20,3% e, na curva Gram-Schmidt, um pico adicional é

observado, sugerindo que produtos gasosos continuam a ser liberados devido a

decomposição e oxidação de resíduos. Ao final temos uma massa residual de 1,6%.

Apenas os valores de temperatura de pico para a terceira etapa de perda de

massa entre a curva Gram-Schmidt (225°C) e curva DTG (229,6°C) apresentaram

similaridade quando comparamos a decomposição da stigmurina em N2 e ar sintético.

Em ar sintético, a curva Gram-Schmidt apresenta picos as temperaturas de

215°C, 225°C, 247°C, 340°C e 597°C, enquanto a curva DTG apresenta apenas três

picos referentes a perda de massa as temperaturas de 45°C, 162°C, 227°C, 311°C e

585°C. Provavelmente, independente da atmosfera, devido à pequena quantidade de

voláteis liberados nos estágios iniciais de perda de massa, o sinal DTG não foi

observado na curva Gram-Schmidt. Sugerimos que a perda de massa observada na

primeira e segunda etapa, em ambas atmosferas, se deva à umidade e solventes

decorrentes do processo de síntese em quantidade pouco significativa para curva

Gram-Schmidt. Além disso, na terceira etapa de perda de massa, a temperatura de

pico na Gram-Schimdt envolve um pico principal e picos secundários que sugerem

diferentes perfis de voláteis liberados na mesma etapa de decomposição.

O comportamento térmico de aminoácidos tem sido estudado e suposições

acerca dos gases liberados durante a decomposição foram feitas (RODANTE;

MARROSU; CATALANI, 1990; RODANTE; MARROSU, 1992; RODANTE; 1992). Em

95

se tratando de estudos TG-FTIR, existem dados para glicina, fenilalanina e tirosina

para os quais o mecanismo de degradação foi elucidado, bem como para alguns

dipeptídeos da glicina (JIE; YUWEN; JINGYAN, 2008; LI et al., 2007). Existem muitos

aminoácidos cujos mecanismos de decomposição ainda não foram estudados e isto

dificulta a compreensão do mecanismo de decomposição para os peptídeos e

proteínas que os apresentam. Logo, como o número de resíduos de aminoácidos em

peptídeos e proteínas variam, a complexidade das reações que estão ocorrendo

durante o processo de decomposição aumenta, tornando a determinação exata do

mecanismo de decomposição pouco provável. Apesar disso é possível encontrar

estudos sobre decomposição térmica de peptídeos e proteínas (CUCOS;

BUDRUGEAC, 2014b; FONTANARI et al., 2012; TUDORACHI; CHIRIAC, 2011), mas

a rota de degradação não é determinada.

O peptídeo deve adquirir instabilidade para que qualquer reação de

decomposição ocorra. Quando a estabilidade de homopeptídeos de glicina contendo

até 5 resíduos deste aminoácido foi avaliada, constatou-se que o aumento da cadeia

peptídica estava relacionado com o aumento da estabilidade térmica (SMITH; ALI;

SOLDATOV, 2014), sendo, portanto, peptídeos do aminoácido em questão menos

estáveis que seus di-, tri- ou tetra- peptídeos correspondentes.

A Figura 14 apresenta o gráfico de superfície 3D para os gases liberados em

ambas as atmosferas produzidos a diferentes temperaturas. Os três eixos

representam o número de onda, unidade de absorbância e temperatura do processo,

respectivamente. A partir destes foram coletados espectros FTIR com base nas

temperaturas das curvas Gram-Schmidt e DTG nas temperaturas de 45 °C, 132 °C,

230 °C, 318 °C e 632°C, para atmosfera de N2, como apresentado na Figura 14(C) e

ar sintético 14(D).

96

Figura 14 – Gráfico de superfície 3D para espectro FTIR dos gases liberados produzidos pela pirólise da stigmurina: em atmosfera de N2 (A) e ar sintético (B), e os respectivos espectros extraídos em (C) e (D)


Para ambas as atmosferas, de 50°C a 135°C algumas bandas de absorção

entre 1396 - 1799 cm-1 e 3566 – 3925 cm-1 são registradas em decorrência de

frequências de vibração-rotação da água na fase de vapor que estava adsorvida. A

presença de água em temperaturas superiores pode ser produzida por um caso

especial de dimerização por ciclização externa na reação de formação de

dicetopiperazinas, que rende 1 mol H2O/mol AA e envolve a junção de N- e C-terminal

em uma reação de desidratação, bem como também pode ser considerada a

existência de ciclização interna, entre a extremidade final da cadeia lateral que se

97

conecta à extremidade C-terminal do peptídeo. Explicando assim, portanto a formação

contínua de água para estas condições (SHARMA et al., 2004; WEISS et al., 2018).

O gás carbônico está presente durante todo processo de perda de massa

apresentando uma banda de reduzida intensidade a 669 cm-1 e duas bandas agudas

de alta intensidade a 2353 - 2359 cm-1 e 2373 cm-1. É descrito que o dióxido de

carbono pode estar presente na linha de transferência e, portanto, sua detecção

(CAVALHEIRO; PINTO; FERREIRA, 2017). Entretanto sua alta detecção também

indica liberação durante o processo de pirólise, como observado desde 212°C e

215°C, para ambas as atmosferas, desde a terceira etapa de perda de massa (Figura

14C e Figura 14D). A razão do alto valor de absorbância, nestas regiões sugere que

reações conhecidas como descarboxilação (formação de CO2) estão envolvidas na

etapa principal de decomposição. A intensa formação de gás carbônico a 597°C

evidencia a oxidação de resíduo carbonáceo em atmosfera de ar sintético.

Uma forte banda a 1151cm-1, está presente desde o início do terceiro evento,

a 212°C (atmosfera de nitrogênio) e 215°C (ar sintético), sendo atribuídas a vibrações

de deformação axial simétricas para grupo álcool (C-OH) indicando formação de

substâncias contendo estes grupos.

Uma vibração fraca atribuída a grupos metileno (C-H) foi detectada a 1376

cm-1. Metano também foi formado no terceiro estágio pela presença de banda a

3034cm-1, provavelmente ele pode ser formado a partir de reações de condensação

envolvendo grupos –CH3 e –CH2–.

Amônia também é detectada na terceira etapa de perda de massa em ambas

as atmosferas, apresentando bandas a 3334 cm-1, 965 cm-1 e 930 cm-1. A formação

de amônia pode ser explicada por reações de desaminação envolvendo grupos –NH2

livres de resíduo de lisina N-terminal ou grupos –NH–.

Vibrações decorrentes de espécies aromáticas derivadas de benzeno

monosubstituídos foram detectadas a 755 cm-1 e 702 cm-1 e as vibrações

características de seu esqueleto aromático na faixa de 1603 a 1408 cm-1 (Car=Car),

provavelmente formados a partir da perda de cadeias laterais dos resíduos de

fenilalanina ou decorrentes de processos de ciclização molecular.

Os principais produtos de decomposição detectados em ambas as atmosferas

foram gás carbônico, água, metano, amônia, substâncias contendo grupos éter,

substâncias aromáticas, e substâncias contendo grupos carbonila, em ambas as

atmosferas. Em ambas as atmosferas o perfil de voláteis liberados durante a

98

decomposição é semelhante até quarta etapa de perda de massa quando monóxido

de carbono é liberado na atmosfera de ar sintético.

Estudos de termodinâmica e cinética dos processos de decomposição para α-

aminoácidos e alguns de seus dipeptídeos no estado sólido, mostram que para o

dipeptídeo serina-alanina e serina-glicina, o primeiro estágio de decomposição implica

na perda da cadeia lateral CH2-OH. Adicionalmente, a mesma situação ocorreu para

o dipeptídeo valina-serina, indicando desestabilização da serina pela valina e

tendência para perda da cadeia lateral da serina (RODANTE, 1992). Também é

relatado que a presença da cadeia lateral contendo grupo fenil para fenilalanina a

torna menos estável que a leucina, sendo desfavorável a desaminação, a

descarboxilação e a decomposição deste aminoácido, cuja degradação inicia-se com

a perda da cadeia lateral (RODANTE; MARROSU, 1990).

Stigmurina apresenta em sua estrutura resíduos de aminoácido fenilalanina,

leucina, serina, entre outros. Baseados nos resultados do perfil de gases liberados

durante a decomposição térmica deste peptídeo, propomos que o passo inicial de

decomposição envolve a perda das cadeias laterais de resíduos de fenilalanina e

serina. A presença de dois resíduos de fenilalanina na extremidade N-terminal do

peptídeo e uma serina vizinha aos dois, durante o aquecimento, leva a ruptura das

cadeias laterais ligadas aos resíduos de aminoácidos com formação de compostos

aromáticos, tais como tolueno e etilbenzeno, metano, e espécies contendo grupos

éter. Durante este processo rearranjo molecular e condensação intramolecular levam

a formação de dicetopiperazinas e liberação de água além de descarboxilação com

liberação de CO2.

Para as próximas etapas de decomposição a identificação dos voláteis foi

dificultada devido a sobreposição e deformação das bandas de vibração e, em virtude

da existência de reações rápidas de degradação onde espécies produzidas são

rapidamente convertidas em produtos gasosos de baixo peso molecular.

Na quarta etapa de perda de massa um grande volume de gases é liberado a

357°C, em atmosfera de N2. O perfil muda completamente da etapa anterior e várias

substâncias gasosas são formadas. Sugere-se que uma das principais reações de

pirólise para oligopeptídeos, polipeptídeos e proteínas é a formação de DKP. DKPs

são dipeptídeos cíclicos formados a partir de resíduos de aminoácidos de matéria

orgânica contendo aminoácidos, peptídeos ou proteínas durante a pirólise. Eles são

voláteis e permanecem no cadinho aquecido até que seja alcançado 400°C. A pirólise

99

de DKP tem sugerido produzir iminas seguidas da decomposição a cianeto e gás

hidrogênio, mas também podem reagir com aminas primárias formando amônia e,

amidas podem produzir iminas pela perda de monóxido de carbono (FABBRI et al.,

2012; HANSSON et al., 2003).

Estas premissas podem explicar o pico agudo a 1716 cm-1 e 1683 cm-1, com

uma banda de absorção de alta intensidade para substâncias contendo grupos

carbonílicos (C=O, de cetonas) e significantes bandas para amidas (C=O, de amidas),

respectivamente. Vibrações de alongamento de grupos CH2- para substâncias

alifáticas (2951 - 2935 cm-1) e CH- (2869 cm-1) foram identificadas além de e vibrações

de ligações CH do anel benzeno a 3058 – 3029 cm-1.

O espectro para atmosfera de nitrogênio a 357°C assemelha-se com aquela

em ar sintético a 340°C. Contudo em ar sintético foi detectado vibrações

características de gás carbônico indicando oxidação.

Em ar sintético no último estágio, a 597°C, a oxidação foi predominante do

resíduo carbonáceo com formação de CO (2104 cm-1 e 2182 cm-1) e CO2 (2356 cm-1

e 2323 cm-1; 669 cm-1). Espécies contendo grupos carbonílicos (C=O) foram

detectados a (1720 cm-1),bem como amônia (970 – 923 cm-1), espécies aromáticas a

1561 - 146 0cm-1 (Car=Car) e, 718 cm-1 e 689 cm-1.

A Figura 15 apresenta a evolução dos gases identificados (CH4, CO2, NHCO,

CO, C=O de amida, C-O-C, NH3, C=O de cetona) com o aumento da temperatura

durante perda de massa para stigmurina em atmosfera de nitrogênio e ar sintético.

Figura 15 – Espectros de absorbância FTIR em função temperatura dos voláteis liberados durante decomposição térmica da stigmurina em N2, (A) e ar sintético (B)


100

Ácido ciânico (HCN), NH3 e ácido isociânico (HNCO) foram liberados em

ambas as atmosferas a partir da segunda etapa de decomposição (Figura 12). Estes

são os principais gases de pirólise relacionados a proteínas em altas temperaturas,

formados principalmente pelo craqueamento de amidas cíclicas, e seus rendimentos

dependem da temperatura e da composição de aminoácidos da proteína (HANSSON

et al., 2003), mas em nosso caso não foram os principais gases de pirólise.

Na terceira etapa de perda de massa, relacionada à decomposição, gás

carbônico e substâncias contendo grupos éter foram os principais liberados. A taxa

máxima de liberação destes gases é alcançada a 229°C e 225°C para atmosfera de

ar sintético e nitrogênio, respectivamente, e contribuem para aparência do primeiro

pico da curva Gram-Schmidt. A formação de substâncias contendo grupos amidas e

cetonas estão presentes na quarta etapa de perda de massa, relacionada a segunda

etapa de decomposição com temperatura de pico a 357°C e 340°C, para atmosfera

de nitrogênio e ar sintético, respectivamente, e contribuem para aparência do segundo

pico da curva Gram-Schmidt.

5.2.2 Pirólise rápida catalítica

A Figura 16 apresenta o pirograma da Stigmurina indicando as principais

substâncias identificadas. Claramente apenas uma pequena fração do espectro de

massas associado com os picos cromatográficos pode ser determinada: o pirograma

obtido é extremamente complexo, com grande número de picos parcialmente

resolvidos e de baixa intensidade.

O pirograma é dominado por substâncias aromáticas, algumas das quais

contendo nitrogênio (N) e oxigênio (O): etil benzeno, 2-metilpropilbenzeno, tolueno,

estireno, piperazina, Bibenzil, benzeno propanonitrila, propil benzeno, 2,3-

dihidrofurano, 4-metil pentanitrila, além de álcoois e éteres, tais como butanol e 1-

propeno-3-(1,1-dimetiletoxi) e outras substâncias aromáticas contendo N, cuja

estrutura molecular não pode ser identificada, mas que apresenta uma porção do

espectro de massas em comum com DKP.

101

Figura 16 – Pirograma da Stigmurina


A presença de grande número de substâncias aromáticas sugere que a

degradação ocorre a partir de resíduos de fenilalanina cujos radicais contém anéis

benzeno, possivelmente a partir da extremidade N-terminal, em virtude da existência

de dois resíduos de fenilalanina consecutivos. A degradação térmica da fenilalanina e

tirosina foram estudadas por TG-FTIR, sendo identificados como produtos da

decomposição da fenilalanina o tolueno e a benzeno etamina. Esta última está

relacionada com a primeira etapa de decomposição da fenilalanina envolvendo a

descarboxilação direta do aminoácido, enquanto que a formação do tolueno estaria

relacionada a uma segunda etapa de decomposição envolvendo a ruptura da cadeia

carbônica lateral (JIE; YUWEN; JINGYAN, 2008). Assim sendo na pirólise da

stigmurina a presença de tolueno e seus derivados indica que a ruptura da cadeia

lateral é predominante frente a descarboxilação.

A presença de nitrilas tais como a 4-metil pentanitrila, benzeno propanonitrila

e 3-fenil,2-propanonitrila foram possivelmente formadas como um resultado da

decomposição das correspondentes aminas sofrendo reações de desidrogenação

102

sendo já demonstrado para os resíduos de aminoácidos de leucina, isoleucina e em

menor quantidade para fenilalamina (CHIAVARI; GALLETTI, 1992). Benzeno,

estireno, tolueno, bifenil, 2-propanonitrila e derivado do furano já foram identificados

na pirólise de diferentes tecidos de mamíferos (WEBER; SPLEISS, 1997).

A pirólise da serina tem sido já investigada, sendo os derivados da pirazina,

pirrol e aminas os principais produtos de decomposição identificados: pirazina, metil

pirazina, etil pirazina, 2-metil-6-etil-pirazina, 2,6-dietil-pirazina, 2,6-dietil-3-metil-

pirazina, pirrol, 2-metil-pirrol e 3-metil-4-etil-pirrol, etilamina, amônia e etanolamina

(KATO et al., 1970). Para glicina seus produtos de decomposição térmica revelados

foram 1,3-diazetina-2,4-diona, 1,2-diazetina-3,4-diona e 2-aziridinona (WEISS et al.,

2018). A Alanina foi estudada para seus produtos menos voláteis sendo identificados

o ácido propiônico, DKP da alanina e 3-etil-5metilhidantoina (BASIUK; NAVARRO-

GONZALEZ; BASIUK, 1998).

Além disso, a detecção de butanol e 1-propeno, 3-(1,1-dimetiletoxi), que nos

dados de MS apresentaram baixo sinal, mas nos resultados de TG-FTIR

apresentaram absorbância proeminente, possivelmente foram formados a partir das

reações entre cadeias laterais dos resíduos de serina e lisina, que são adjacentes aos

resíduos consecutivos de fenilalanina na extremidade N-terminal da stigmurina.

Quando foi estudada a formação de heterocíclicos de baixo peso molecular e

compostos aromáticos policíclicos (PACs) na pirólise de prolina a 300°C, a mesma foi

completamente convertida em produtos voláteis e foi detectada formação após

descarboxilação de pirrolidina, desidrogenação com formação em pirrolina e

finalmente pirrol (SHARMA et al., 2003). A estrutura N-cíclica da prolina produziu

consideravelmente mais resíduos sólidos contendo nitrogênio do que a leucina,

enquanto a estrutura amino simples da leucina produziu mais amônia do que a prolina

(LIU et al., 2016). No pirograma da stigmurina, identificamos três produtos voláteis

possivelmente originados da decomposição do resíduo de prolina e não mencionados

em estudos anteriores: 1-pirrolidinilacetonitrila (C6H10N2, ácido 5-isoxazolcarboxílico

(C7H11NO3) e L-prolina, 1-metil, 5-oxo, éster metílico (C7H11NO3).

A pirólise de leucina e valina foi investigada para produtos menos voláteis e

seus produtos de decomposição foram: ácido isobutírico, ácido 3-metilbutírico, 3,5-

diisopropilpiridina, várias amidas e DKP leucina para o aminoácido leucina e, ácido

isobutírico, N-isobutilformamida, 2-metilpentano-3-ona e amidinas bicíclicas para

valina (BASIUK, 1998). No entanto, apesar da existência destes resíduos de

103

aminoácidos na molécula de stigmurina, nenhum dos seus produtos de pirólise

descritos foi detectado. Possivelmente, a presença de substâncias alifáticas (isômeros

de metil noneno) identificadas foi originada da presença de resíduos não polares,

como valina, leucina e isoleucina. Entretanto, quando avaliada a pirólise da poli-L-

valina, esta apresentou um perfil volátil diferente do resíduo de aminoácido, com

detecção de isocianato de etila, benzenonitrila, pentanonitrila, 4-metil piridina,

isômeros de dimetil-benzeno, ácido 3,5-heptanóico, isômeros de dimetil piridina,

pentanamida, DKP valina, N-etil-3-metilbenzenamina e 3-isobutil-5-isopropil-

hidantoína (BASIUK; DOUDA, 2001), alguns dos quais foram detectados para a

pirólise de stigmurina.

Como a pirólise foi realizada a 400°C e, como as dicetopiperazinas são

conhecidas por serem produtos menos voláteis formados a partir de 400°C, elas foram

detectadas no pirograma em pequenas quantidades e seu aminoácido derivado não

foi identificado. Portanto, conclui-se que, a partir do conhecimento sobre os voláteis

produzidos para os aminoácidos que compõem um peptídeo e proteína, bem como

para alguns dipeptídeos, a natureza dos voláteis depende não apenas da temperatura

em que a pirólise é realizada, mas também do conjunto de aminoácidos vizinhos da

estrutura peptídica que torna único o perfil e mecanismo de decomposição para cada

peptídeo ou proteína.

5.3 CARACTERIZAÇÃO DOS RESÍDUOS SÓLIDOS DE DECOMPOSIÇÃO

TÉRMICA DA STIGMURINA

Durante caracterização térmica do peptídeo stigmurina observou-se a

existência de eventos relacionados a perda de água e solventes orgânicos, transição

vítrea e decomposição da stigmurina.

Em etapas anteriores deste trabalho de tese caracterizamos a stigmurina e os

voláteis liberados no processo de decomposição através das técnicas termoanalíticas,

nesta etapa os esforços são voltados para a identificação dos produtos de

decomposição (resíduo sólido) da stigmurina visando determinar os pontos de

instabilidade térmica do peptídeo, bem como avaliar se alguma alteração física

poderia promover alteração da atividade biológica do peptídeo.

104

Para tanto amostras aquecidas de stigmurina da temperatura ambiente até

diferentes temperaturas selecionadas (50°C, 94°C, 105°C, 140°C, 160°C, 190°C e

230°C) foram quantificadas por HPLC para o teor residual de stigmurina, bem como

comparada com stigmurina não aquecida utilizando diferentes técnicas: FTIR-ATR,

MEV, LC-MS/TOF, e atividade antitripanossoma frente a forma epimastigota do

Tripanossoma cruzi Y.

5.3.1 Quantificação das amostras

As amostras aquecidas até a temperatura de eventos envolvendo perda de

água (50, 94, 105 °C), antes e depois do evento de transição vítrea (140 e 160 °C), no

início de degradação térmica (190 °C) e no final do primeiro evento de degradação

térmica (230 °C) foram quantificadas quanto ao teor residual de stigmurina (Figura 17)

utilizando método desenvolvido em tópico posterior desta tese com extensão da faixa

de trabalho para 0,1 mg - 1,0 mg.mL-1.

O cromatograma, obtido para amostras de degradação por calor seco, padrão

stigmurina, é apresentado na Figura 17(A), indicando a seletividade do método CLAE.

O método para quantificação apresentou R2 de 0,9998, com dispersão aleatória dos

dados e uma relação linear Figura 17(B). A injeção de uma amostra de 1,0 mg.mL-1

de stigmurina não resultou em picos na solução em branco injetada posteriormente,

indicando que não havia transferência. A quantificação do conteúdo residual de

stigmurina é mostrada na Figura 17(C). Após o aquecimento, as amostras mostram

conteúdo semelhante de stigmurina até 160 °C. Em 190 °C, a temperatura relacionada

ao início da decomposição apresentou aproximadamente 60% de stigmurina e, a 230

°C o peptídeo não foi detectado. Stigmurina é estável em aquecimento dinâmico de

até 160 °C, e os eventos de perda de água e transição vítrea não parecem alterar seu

conteúdo.

105

Figura 17 – Sobreposição de cromatogramas para stigmurina e amostras aquecidas (A), linearidade (B) e teor residual de stigmurina em função da temperatura de aquecimento (C)

(A) (B)

(C)


5.3.2 Avaliação da Morfologia e espectros FTIR entre Stigmurina e amostras

aquecidas

É relatado que as estruturas secundárias da hélice α, da folha β ou da

estrutura randômica podem alterar-se conforme o pH da solução aquosa (SUSI;

TIMASHEFF; STEVENS, 1967). Alternativamente, essas transições podem ser

alcançadas por aquecimento (DAVIDSON; FASMAN, 1967; JACKSON; HARIS;

CHAPMAN, 1989), manipulando o nível de hidratação (WOLKERS; VAN KILSDONK;

106

HOEKSTRA, 1998) ou através do processo de liofilização (PRESTRELSKI et al.,

1993).

No intuito de verificar alterações vibracionais para stigmurina que pudessem

refletir em alterações de sua estrutura secundária, bem como estrutura primária, as

amostras que sofreram aquecimento foram analisadas inicialmente por FTIR, cuja

sobreposição dos espectros encontram-se na Figura 18. Estes espectros também

foram comparados com àquele para stigmurina não aquecida através do método

quantitativo de correlação de Pearson.

O método de correlação de Pearson vem sendo utilizado em estudos de

compatibilidade Fármaco-Excipiente e Fármaco-Fármaco para verificação de

alterações em espectros FTIR para misturas binárias, cujos valores são indicativos de

compatibilidade ou incompatibilidade entre os constituintes das misturas (PEREIRA et

al., 2016).

Entre as diferentes temperaturas de aquecimentos puderam ser identificadas

as regiões características das ligações peptídicas: amida A, amida I, amida II e amida

III. As vibrações em 3290 cm-1, 1649 cm-1 e 1539 cm-1 foram mantidas com a mesma

forma até 190°C. A partir de 190°C nota-se deslocamento na vibração para Amida I

que em temperaturas inferiores encontrou-se entre1649 ± 10 cm-1, alcançando 1631

cm-1 e 1633 cm-1, para amostras aquecidas até 190°C e 230°C respectivamente. A

amostra aquecida até 230°C não apresentou vibrações em 833 cm-1, 798 cm-1 e 719

cm-1, característicos de vibrações para anéis aromáticos, sugerindo perda de cadeias

laterais contendo estes grupos, possivelmente dos resíduos de fenilalanina da

estrutura da stigmurina, tendo em vista ser o aminoácido aromático presente no

peptídeo. Vibrações em 1178 cm-1, 1128 cm-1 e 1041 cm-1, relacionada com a

presença de grupos C-O em aminoácidos contendo grupos OH de álcoois também se

fizeram ausentes, evidenciando a perda das cadeias laterais dos aminoácidos e

decomposição da stigmurina.

107

Figura 18 - Sobreposição de espectros FTIR para stigmurina e amostras aquecidas a diferentes temperaturas


Para o aquecimento da amostra a 50 ° C (r = 0,96), 94 ° C (r = 0,98), 105 ° C

(r = 0,95), 140 ° C (r = 0,96) e 160 ° C (r = 0,96) o valor de correlação de Pearson foi

acima de 0,95, indicando alta correlação. A partir do aquecimento da amostra a 190 °

C (r = 0,92), o valor de r começa a se afastar de 1 e a 230 ° C (r = 0,66) a correlação

é fraca, indicando alterações no padrão vibracional de grupos químicos presentes

amostra.

Quando quantificadas as amostras a 190°C e 230°C apresentaram teor

residual de stigmurina de 60% e 0%, respectivamente, indicando degradação da

stigmurina, mesmo que a 190°C não tenha sido identificado alterações no perfil

vibracional e, o valor de correlação de Pearson seja de 0,92 indicando degradação da

molécula e necessidade de alteração dos limites de correlação de Pearson quando se

deseja avaliar estabilidade química. Sugere-se que alta correlação seja considerada

108

numa faixa mais restrita de 1 a 0,95. Valores fora desta faixa já são considerados

indicativos de degradação da amostra conforme visualizado para stigmurina.

Em se tratando de imagens MEV, a Figura 19 apresenta imagens de

stigmurina não aquecida em três ampliações 1,0KX, 1,5KX e 5,0KX com as diferentes

amostras de stigmurina sob aquecimento. Stigmurina não apresenta morfologia bem

definida, apresentando estruturas arredondadas variando entre bastões e esferas

organizadas em teias, apresentando-se no estado amorfo. Quando comparada

stigmurina a temperatura ambiente com as amostras aquecidas a 50°C, 94°C e 105°C

observa-se que estas presentam morfologias equivalentes, indicando que a perda de

umidade não altera a estrutura morfológica da partícula. Com o aumento da

temperatura verifica-se agregação de partículas a 140°C, mas ainda há manutenção

da estrutura morfológica. Aglutinação é evidenciada a 160°C,com posterior formação

de canais, decomposição com formação de material sinterizado e partículas de

superfície rugosa entre 190°C a 230°C.

Figura 19 - Imagens MEV, em diferentes ampliações, para amostras de stigmurina a temperatura ambiente e aquecidas a diferentes temperaturas: 50°C, 94°C e105°C a 5,0KX, 140°C e 160°C a 1,5KX e, 190°C e 230°C a 1,0KX


109

5.3.3 Identificação dos produtos sólidos de decomposição térmica para stigmurina

Uma vez caracterizadas as impurezas de síntese presentes na stigmurina,

procedeu-se ao estudo das amostras pós condições de aquecimento. A Figura 20

apresenta o TIC para stigmurina e amostras pós aquecimento nas temperaturas

estudadas.

Até a temperatura de 160°C não foram verificadas diferenças entre os

cromatogramas de íons totais entre stigmurina não aquecida e amostras aquecidas.

Qualquer sinal adicional encontrado também foi detectado na amostra branco.

Ao analisar o tempo de retenção da stigmurina na sobreposição dos TIC,

Figura 20, evidencia-se que após o aquecimento na temperatura de 230°C não há

mais o sinal cromatográfico referente ao peptídeo. Tendo em vista durante a etapa de

quantificação as amostras aquecidas as temperaturas de 190°C e 230°C

apresentarem redução do teor de stigmurina os espectros de massas nessas

temperaturas foram avaliados com o objetivo de investigar a presença de produtos de

decomposição.

Figura 20 – Sobreposição de cromatogramas de íons totais TIC para amostras de stigmurina aquecidas evidenciando tR


110

A Figura 21 contém o cromatograma e espectro de massas para as

substâncias detectadas nas amostras que foram aquecidas a 190°C.

Figura 21 - Cromatograma de íons Totais (TIC) para amostra aquecida até 190°C evidenciando produtos identificados


Foram detectados no TIC para amostra aquecida de stigmurina até 190°C

nove picos diferentes daquele para stigmurina (tR = 17,84 min) com tempos de

retenção (tR) de 14,53 min, 15,63 min, 17,29 min, 17,65, 18,03 min, 18,59 min, 18,82

min, 22,00 min e 22,98 min (Figura 21).

Em 14,53 min (Figura 22) encontra-se íons com m/z de 707,4447, 1413,8776,

1435,8602, 1451,8323 e 1571,8365, que correspondem a forma duplamente

protonada, protonada, formando aduto com sódio, aduto com potássio e aduto com

NaCF3CO2, respectivamente. Sua massa molecular monoisotópica obtida foi de

1412,8755 Da (C68H116N16O16), 3,07 ppm (erro), denominado produto de

decomposição 1 e, caracterizado como fragmento y14.

111

Figura 22 – Espectro MS a 14,53min na faixa de 600 – 1600 m/z


Em 15,63 min (Figura 23) encontram-se íons com m/z de 750,9587,

1.500,9121 e 1.523,8970 que foram identificados como forma duplamente protonada,

protonada e formando aduto com sódio, respectivamente. Sua massa molecular

monoisotópica obtida foi de 1.499,9043 Da, erro de 2,2 ppm (C71H121N17O18),

denominado produto de decomposição 2 e, caracterizado como fragmento y15.

Figura 23 – Espectro MS a 15,63 min na faixa de 600 – 1600 m/z


Em 17,29 min (Figura 24) encontram-se íons com m/z de 841,4859 e

1.682,9718, que correspondem as formas duplamente protonada e protonada,

respectivamente. Estes sinais foram previamente caracterizados na stigmurina como

impureza 3 e, que ainda está presente na amostra a 190°C.

112




1.709,0192; 1.731,0005 e 1.745,9704, que correspondem à impureza 1 duplamente

protonada, protonada, formando aduto com íon sódio e com íon potássio,

respectivamente. Estes sinais foram previamente caracterizados na stigmurina como

impureza 1 e, que ainda está presente na amostra a 190°C.





respectivamente. Sua massa molecular monoisotópica obtida foi de 1.777,0178 Da,

erro de 3,74 ppm (C89H136N18O20), denominado produto de decomposição 3 e,

caracterizado como fragmento y-H2O. Também evidenciamos perfil de ionização

característico para impureza 2 ainda presente a 190°C.

113



Em 18,59 min (Figura 27) encontram-se íons com m/z de 742,4472,

1.483,8867, 1.505,8641 e 1.521,9562, que correspondem as formas duplamente

protonada, protonada, formando aduto com sódio e potássio, respectivamente. Sua

massa molecular monoisotópica obtida foi de 1.482,8810 Da, erro de 1,08 ppm

(C71H118N16O18), denominado produto de decomposição 4 e, caracterizado como

fragmento y15-NH3.






erro 2,48 ppm (C73H120F3N17O19),denominado produto de decomposição 6 e,

caracterizado como y15+F3CCO.

114



Em 22,00 min (Figura 29) encontra-se íons com m/z de 946,1126, 1.892,0326,

1.914,0147 e 1.929,9887, que correspondem as formas duplamente protonada,

protonada, formando aduto com sódio e potássio respectivamente. Sua massa

molecular monoisotópica obtida foi de 1.890,0266 Da, erro 2,78 ppm

(C91H138F3N19O21), denominado produto de decomposição 7 e, caracterizado como

y+F3CCO.






erro de 5,93 ppm (C71H118N16O18), denominado produto de decomposição 5 e,

caracterizado como fragmento y-NH3-H2O.

115



A Tabela 11 sumariza todos os produtos identificados a 190°C, com valores

encontrados de massa, erro, fórmula molecular e atribuições.

Tabela 11 – Produtos de decomposição identificados a 190°C

Pico Tr

(min)

Fórmula

molecular

Massa

Monoisotópica

(Da)

[M+H]+ - erro

(m/Z / ppm) Atribuição

1 14,5 C68H116N16O16 1.412,8755 1.413,8776/ 3,07 y14

2 15,6 C71H121N17O18 1.499,9043 1.500,9121/ 2,2 y15

3 17,3 C85H129N17O20 1.682,9652 1.682,0136/ 4,0 Impureza 3

4 17,6 C84H129N17O19 1.708,0113 1.709,0192/ 0,49 Impureza 1

5 17,8 C89H139N19O20 1.795,1713 1.796,0556 / 0,62 Stigmurina

6 18,0 C89H136N18O20 1.777,0178 1.778,0184/ 3,74 y-H2O

7 18,6 C71H118N16O18 1.482,8810 1.483,8867/ 1,08 y15-NH3

8 18,8 C73H120F3N17O19 1.595,8898 1.596,9011/ 2,48 y15+F3CCO

9 22,0 C91H138F3N19O21 1.890,0266 1.892,0326/2,78 y+F3CCO

10 22,9 C89H134N18O19 1.759,0073 1.760,0041/ 5,93 y-NH3-H2O


Desta forma as estruturas detectadas para temperatura de 190°C sugerem

que o aquecimento de stigmurina promove fragmentação do peptídeo com formação

de íons das séries b e y. Foram detectados fragmentos y (y14 e y15), bem como

fragmentos decorrentes de perdas neutras para amônia e/ou água (y15-NH3 / y-H2O / y-

NH3-H2O). A formação de fragmentos y14 e y15 sugerem instabilidade da vizinhança para

116

resíduo de serina na extremidade N-terminal, vizinho a resíduos de aminoácidos da

fenilalanina. Estes achados corroboram com dados TG-FTIR e pirólise anteriormente

realizados.

Foram detectados no TIC para amostra aquecida de stigmurina até 230°C

quatro picos diferentes daquele para stigmurina com tempos de retenção (tR) de 8,24

min, 8,91 min, 16,55 min e 16,85 (Figura 31), cujas fórmulas moleculares foram

identificadas. Stigmurina não foi detectada a 230°C.

Figura 31 - Cromatograma de íons Totais (TIC) para amostra aquecida até 230°C evidenciando o tR dos produtos identificados


Em 8,24 min (Figura 32) encontram-se íons com m/z de 283,7171, 566,42679

e 588,40865, que correspondem as formas duplamente protonada, protonada e

formando aduto com sódio, respectivamente. Sua massa molecular monoisotópica

obtida foi de 565,4203 Da, erro de 1,56 ppm (C30H55N5O8).

117



Em 8,91 min (Figura 33) encontram-se íons com m/z de 340,25915, 679,5107

e 701,4925, que corresponde a forma duplamente protonada, protonada e formando

aduto com sódio, respectivamente. Sua massa molecular monoisotópica obtida foi de

678,50438 Da, erro de 0,94 ppm (C36H66N6O6).



Em 16,55 min (Figura 34) encontra-se íons com m/z de 274,27377, que

corresponde a forma protonada. Sua massa molecular monoisotópica obtida foi de

273,26678 Da, erro de 1,25 ppm (C16H35NO2).

118



Em 16,85 min (Figura 35) encontra-se íons com m/z de 290,26869, que

corresponde a forma protonada. Sua massa molecular monoisotópica obtida foi de

289,26169 Da, erro de 1,16 ppm (C16H35NO3).



A Tabela 12 sumariza todos os produtos identificados a 230°C, com valores

encontrados de massa, erro, fórmula molecular e atribuições.

O processo de degradação térmica envolve o fornecimento de energia ao

peptídeo podendo levar a fragmentação da cadeia peptídica. A fragmentação de

peptídeos pode ocorrer por quebra ao longo da cadeia peptídica bem como por quebra

da cadeia lateral dos aminoácidos que o compõe, através de perdas neutras de

moléculas de baixo peso molecular, como já identificado durante armazenamento de

formulações neutras de insulina humana (HJORTH et al., 2015). A 230°C stigmurina

não foi detectada. Os produtos de decomposição identificados não correspondem a

fragmentos propriamente ditos, porém correspondem principalmente a compostos

119

derivados de fragmentos b6 e b2 provenientes de etapas de quebra de suas cadeias

laterais.

Tabela 12 – Produtos de decomposição identificados a 230°C

Pico Tr

(min)

Fórmula

molecular

Massa

Monoisotópica

(Da)

[M+H]+ - erro

(m/Z / ppm) Atribuição

1 8,2 C30H55N5O5 565,4203 566,42679/1,56 Derivado do

resíduo b6

2 8,9 C36H66N6O6 678,5043 679,5107/ 0,94 Derivado do

resíduo b6

3 16,5 C16H35NO2 273,2667 274,27377/ 1,25 Derivado do

resíduo b2

4 16,9 C16H35NO3 289,2616 290,26869/ 1,16 Derivado do

resíduo b2


Os fragmentos b2 e b6 correspondem respectivamente as sequências: FF (MM

= 295,1441Da) e FFSLIP (MM = 705,3970Da). Os derivados de cada fragmento são

formados a partir de redução das ligações nos anéis aromáticos ou abertura dos anéis

das cadeias laterais para os resíduos de fenilalanina, redução de carbonilas, perda de

cadeia lateral para resíduo de serina, desaminação na extremidade N-terminal e/ou

descarboxilação da extremidade C-terminal.

5.3.4 Avaliação da atividade antitripanossoma frente forma epimastigota do T. cruzi Y

após aquecimento da stigmurina a diferentes temperaturas

Com o intuito de verificar se durante os aquecimentos os eventos térmicos

decorrentes, tais como perda de água e transição vítrea, afetavam a atividade

antitripanossoma da stigmurina não aquecida e amostras aquecidas, foram avaliadas

frente forma epimastigota do T. Cruzi Y.

A Figura 36 apresenta o efeito anti-T. cruzi (cepa Y) sobre as formas

epimastigota do parasita avaliada após 24 h de incubação. Parasitas incubados com

120

meio LIT na ausência do peptídeo foi utilizado como controle positivo de viabilidade

(Controle). A análise estatística foi obtida pelo ANOVA seguido do teste de Tukey.

Stigmurina submetida as diferentes condições de aquecimento demonstrou

elevada atividade antiparasitária sobre a forma epimastigota do T. cruzi Y. Amostras

de Stigmurina não aquecida (25 oC) e aquecidas a 50°C, 94°C, 105°C, 140°C e 160

oC foram capaz de inibir acima de 80% a viabilidade do parasita após 24 h de

incubação. Nessa faixa de temperatura eventos térmicos relacionados a perda de

água, bem como a transição vítrea parecem, portanto, não afetar a atividade biológica

da stigmurina.

Figura 36 - Atividade antiparasitária da Stigmurina submetida a diferentes condições de aquecimento sobre a forma epimastigote do T. cruzi Y. Média ± DP (n = 4)

a - p ≤ 0,001 comparado com o grupo controle;

b - p ≤ 0,05 comparado com Stigmurina 190 ºC;

c - p ≤ 0,01 comparado com Stigmurina 190 ºC;

d - p ≤ 0,001 comparado com Stigmurina 190 ºC

e - p ≤ 0,001 comparado com Stigmurina 230 ºC;


Contudo, as amostras de stigmurina aquecidas a 190oC e 230oC

apresentaram menor efeito antitripanossoma sobre a forma epimastigota, quando

comparado com o peptídeo a 25oC - 160oC, inibindo a redução da resazurina em

66,3% + 12,2 e 53,6% + 6,7 quando comparado com o grupo controle. Estes

aquecimentos correspondem a etapas de decomposição térmica do peptídeo e,

portanto, em virtude de apresentarem teor reduzido de stigmurina esperava-se não

apresentarem atividade biológica. Duas hipóteses são levantadas para a existência

de atividade biológica ainda apresentada nas amostras aquecidas a 190°C e 230°C.

A primeira diz respeito a existência de atividade decorrente da presença de resíduos

+

121

de decomposição e, a segunda diz respeito a existência de atividade decorrente do

aprisionamento de gases pelo material sólido, produzidos durante decomposição

térmica, que em sua maioria se tratava de gases tóxicos.

5.4 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO DE DOSEAMENTO DA STIGMURINA

POR CLAE-UV/DAD

Para o pleno desenvolvimento de um método cromatográfico é imprescindível

o conhecimento das propriedades físico-químicas das substâncias a serem

analisadas, tendo em vista que são essas propriedades que nortearão a escolha das

fases móvel e do método de separação, em decorrência das interações entre

substâncias, fase móvel e fase estacionária. Em se tratando de peptídeos e proteínas

o conhecimento da sequência de aminoácidos, bem como modificações terminais são

cruciais na determinação das propriedades físico-químicas bem como atividade

biológica. Para peptídeos contendo até 20 resíduos de aminoácidos a retenção é

primariamente devido aos processos de partição que envolvem todos os resíduos

(MEEK, 1980). Para determinações in silico das propriedades físico químicas de

peptídeos e proteínas vários softwares são disponíveis (Pepdraw®, Expasy

Protoparam toll®, PepCalc®, Peptide Property Calculator®). Com base nessas

premissas o primeiro passo ao desenvolvimento do método foi o cálculo de MM, pI e

análise de hidrofilicidade para stigmurina, com base em sua sequência de

aminoácidos, utilizando o software livre Peptide Property Calculator®, cujos dados

estão apresentados na Figura 37.

122

Figura 37 - Propriedades calculadas para Stigmurina

Análise hidrofílica

MM = 1795,18 g.moL-1 pI = 8,86 Coeficiente de Extinção = 0 M-1.cm-1

Fonte: https://www.genscript.com/tools/peptide-property-calculator, acesso em 29-07-2015.

A partir da Figura 37 observa-se que por se tratar de substância zwiteriônica,

a carga líquida da stigmurina varia conforme seu pH, essa propriedade está

relacionada diretamente com sua solubilidade. A redução do pH da stigmurina pode

levar a um aumento na solubilidade em soluções aquosas, tendo em vista ser

classificado como um peptídeo básico. Em se tratando de absorção UV, apesar de

apresentar resíduos aromáticos como a fenilalanina seu coeficiente de extinção molar

a 280 nm é zero e, portanto, determinações utilizando 215 nm, relacionadas a

absorção das ligações peptídicas, são preferidas em análises espectroscópicas, a 280

nm, relacionada a absorção de resíduos aromáticos.

Em virtude da baixa solubilidade em água de peptídeos básicos o uso de

diluentes ácidos ou a redução do pH da água é uma estratégia utilizada para

solubilização das amostras. Ácido fórmico (AF), ácido acético (AC) e ácido

trifluoroacético (TFA) são bastante utilizados no preparo de fases móveis para análise

de peptídeos e proteínas, cada um dos quais apresenta suas vantagens e

desvantagens (WANG; CARR, 2007), a Tabela 13 lista as características úteis destes

reagentes no desenvolvimento de análises cromatográficas.

https://www.genscript.com/tools/peptide-property-calculator

123

Tabela 13 – Valores de pKa e Cut off de alguns reagentes utilizados na análise cromatográfica de peptídeos e proteínas

ÁCIDO ACÉTICO ÁCIDO FÓRMICO ÁCIDO

TRIFLUOROACÉTICO

pKa 4,75 3,77 0,23

Cut off (nm) 230 210 210

Fonte: Adaptado de www.kromasil.com, acesso em 29.07.2018

Os diferentes valores de pKa dos reagentes proporcionam a utilização dos

mesmos em diferentes proporções e, a redução do pH da água está diretamente

relacionado a estes valores. Ácido acético é bastante utilizado em proporções que

variam de 0,5 a 5%, ácido fórmico é comum na proporção de 0,1 a 3% e, ácido

trifluoroacético na proporção de 0,01 a 2,5% (HEYRMAN; HENRY, 1999). No entanto

o alto valor de Cut off para o ácido acético exclui sua utilização, em virtude da

necessidade de análise da stigmurina em detector DAD ser a 215 nm. Métodos

cromatográficos utilizando ácido fórmico e trifluoroacético são compatíveis em

análises LC-MS e LC-DAD. Entretanto, para peptídeos catiônicos, sabe-se que ácido

fórmico promove a ocorrência de interações prejudiciais com os silanóis superficiais

de colunas de fase reversa, resultando em pico caudados e baixa eficiência de

separação. A carga peptídica positiva, presente na fase móvel acidificada, causa

também uma baixa retenção e baixa resolução (HOUBART et al., 2013). O TFA

apresenta a propriedade adicional de funcionar como pareador iônico forte altamente

ácido, além de ser altamente volátil, apresenta baixo Cutt off e é preferido para ajuste

de retenção e eficiência de análise para peptídeos catiônicos. Vale ressaltar que para

análises LC-MS o TFA pode funcionar como agente de supressão iônica e dificultar a

detecção de peptídeos e proteínas, porém existem vários estudos onde mesmo

apresentando esta propriedade a detecção de peptídeos foi satisfatória (GILAR; XIE;

JAWORSKI, 2010).

Quando solubilizado em TFA 0,1%, cujo pH é aproximadamente 2,0

stigmurina apresentou boa solubilidade, sem necessidade de adição de solvente

orgânico. Desta forma preteriu-se a utilização de TFA 0,1% em água purificada como

fase móvel de escolha para desenvolvimento do método analítico. Ressalta-se que,

conforme a análise de hidrofilicidade na Figura 37, a carga líquida da stigmurina altera-

http://www.kromasil.com/

124

se com o pH e, portanto, em pH 2.0 sua carga líquida é +2, sendo um peptídeo

catiônico.

Em se tratando de solventes orgânicos a escolha de solventes que

apresentem altos coeficiente eluotrópicos (ɛ°) é comum para reduzir as interações

com a coluna. Fases móveis para caracterização de proteínas e peptídeos contêm

acetonitrila, que possui um valor eluotrópico de C18 relativamente baixo de 3,1

(KARCH et al., 1976). Em contraste, os álcoois n-propílico e isopropílico têm valores

eluotrópicos de C18 muito elevados de 10,1 e 8,3, respectivamente. No entanto

álcoois apresentam alta viscosidade levando ao aumento da pressão do sistema, bem

como valores elevados de cut off e sua utilização é muitas vezes combinada com

acetonitrila para melhorar a resolução da separação cromatográfica (DILLON et al.,

2006).

Em virtude das propriedades físico-químicas da acetonitrila, esta foi escolhida

como solvente orgânico para composição da fase móvel B. A acetonitrila apresenta

baixo cut off, baixa viscosidade e, adequado poder de eluição. Desta forma, para

desenvolvimento de métodos que utilizem valores de comprimento de onda, para

obtenção dos cromatogramas, entre 210 – 230 nm suas propriedades são adequadas

a obtenção de um método robusto.

Findado a escolha do diluente, da fase móvel orgânica e aquosa e

determinação do comprimento de onda para monitoramento de stigmurina, passamos

a avaliação das colunas cromatográficas.

A seleção das colunas cromatográficas baseou-se na literatura que relata a

utilização de colunas de fase reversa, C18, C8 e C4 para análise de peptídeos e

proteínas. As colunas avaliadas tratavam-se todas de colunas C18, apresentando

diferentes dimensões, tamanhos de partícula, tamanhos de poro e fabricantes,

conforme Tabela 8. Para um mesmo fabricante, tamanho de partícula e poro também

houve avaliação do comportamento de eluição em função das dimensões.

Para todas as colunas estudadas o pico cromatográfico para stigmurina foi

detectado, conforme Figura 38. As colunas apresentavam diferentes dimensões e

tamanhos de poro de 300 Å, 120 Å e 95 Å, conforme Tabela 8 na seção metodologia.

125

Figura 38 - Sobreposição de cromatogramas evidenciando pico para stigmurina e diferentes colunas avaliadas


Recomenda-se que proteínas maiores que 10 kDa sejam analisadas em

colunas com tamanho de poro acima de 300 Å, com intuito de reduzir restrição de

proteínas na fase estacionária, pobre recuperação e diminuição na eficiência,

enquanto que polipeptídeos menores que 10kDa podem ser efetivamente separados

utilizando coluna de poros pequenos (< 150Å) (AGUILAR, 2004). O baixo peso

molecular da stigmurina (≈ 1,7KDa) permitiu que o mesmo fosse capaz de ser

analisado em todas as faixas de tamanho de poro avaliadas, não sendo, portanto,

uma restrição ao desenvolvimento do método, conforme valores de área apresentados

na Tabela 14.

Em virtude das diferentes características dimensionais entre as diferentes

colunas estudadas a comparação de suas eficiências de eluição através apenas de

avaliação dos valores de N e HETP é pouco significativo. Podemos inferir que todas

as colunas apresentaram valores de N > 2000, para o pico de stigmurina e, portanto,

são capazes de realizar sua detecção cromatográfica. Em relação ao HETP todas as

colunas apresentaram baixos valores variando de 0,9 a 3,0, demostrando eficiência

de separação equivalentes. Os picos para stigmurina apresentaram-se finos, com

largura por volta de 0,2 min, porém ainda assim foram visualizadas co-eluições,

apesar dos valores de resolução terem sido superiores a 1,5. Os valores de fator de

126

cauda foi o parâmetro que melhor refletiu a baixa separação cromatográfica, sendo

que todas as colunas apresentaram cauda a direita (Tf < 0,99).

Tabela 14 - Parâmetros cromatográficos obtidos para as diferentes colunas avaliadas

COLUNA Vc

(mL) tR

(min) W N HETP R Tf K'

ZORBAX

EXTEND300 ≈ 0,35 9,196 0,20 33665248 2,97 3,118 0,833 10,286

ADVANCEDBIO

PEPTIDE MAP ≈ 0,35 10,333 0,19 47211945 2,118 1,887 0,816 7,266

SHIMPACK XR-

ODS C18 ≈ 0,35 10,359 0,24 30308711 1,650 2,93 0,855 7,287

POROSHELL

120 EC-C18 ≈ 0,83 10,084 0,22 34143523 1,464 1,871 1,008 7,067

KINETEX ≈ 0,17 9,432 0,17 50997931 0,980 2,07 0,770 6,546


Em termos de tempo de análise a coluna Zorbax Extend300 apesar de possuir

uma das maiores dimensões entre as colunas analisadas apresentou o menor tempo

de retenção para stigmurina. Logo podemos concluir que stigmurina é versátil na

análise em diferentes colunas, no entanto em virtude do menor tempo de retenção

para o método de seleção de colunas utilizados, elegemos a coluna Zorbax Extend300

para desenvolvimento de método cromatográfico de stigmurina matéria-prima.

Uma vez definido a coluna, é necessário a otimização do método, visando

redução do fator de capacidade (k), separação dos picos co-eluídos com obtenção de

valores de R > 1,5 e Tf entre 0,99 e 2,0. Além de determinação da melhor composição

de fase móvel para obtenção de um método de quantificação isocrático.

O procedimento de otimização do método envolveu a realização de

experimentos em 4 etapas: avaliação da proporção do solvente orgânico para o

gradiente, avaliação de diferentes temperaturas de eluição, avaliação do fluxo de fase

móvel e avaliação do comportamento cromatográfico frente variações no volume de

injeção. Sabe-se que uma diminuição da taxa de gradiente aumenta a resolução,

embora diminua a sensibilidade e altas temperaturas aumentam a eficiência, forma do

127

pico e resolução, contudo, diminuem a atividade biológica da molécula

(KAZAKEVICH, LOBRUTTO, 2007), no entanto em métodos analíticos não há

preocupações com atividade biológica visto que não há preocupações com

recuperação da amostra.

Inicialmente foi verificado o comportamento de eluição do peptídeo em duas

proporções de gradiente de fase móvel: 30% a 100% e 40% a 100%, conforme Figura

39 e Tabela 15.

Figura 39 – Sobreposição dos cromatogramas obtidos para as condições estudadas durante avaliação da proporção de solvente orgânico no gradiente de eluição


Tabela 15 – Parâmetros cromatográficos calculados para avaliação da proporção de solvente orgânico no gradiente de eluição

ANÁLISE tr ÁREA W N HETP Res Tf Pureza de

pico K

Varredura 1

(30 - 100%) 9,38 2484591 0,26 21602 4,62 2,62 0,88 0,999 6,51

Varredura 2

(40 - 100%) 5,44 2504510 0,28 6209 16,100 2,67 0,87 0,999 3,35


128

A partir da avaliação de resultados da Figura 39 e Tabela 15, podemos inferir

que não havia substâncias eluídas em concentrações superiores a 50% de FMB

possibilitando a realização de novas análises com proporção de gradiente reduzido

para de 40 – 50%. Nesta nova condição variou-se os valores de temperatura (30°C,

40°C ou 50°C) utilizados no intuito de determinar a temperatura que proporcionasse

valores otimizados de fator de cauda.

A Figura 40 apresenta a sobreposição dos cromatogramas obtidos durante

avaliação da influência da temperatura e, a Tabela 16 os parâmetros cromatográficos

calculados com base no pico da stigmurina.

Figura 40 - Sobreposição dos cromatogramas obtidos para as condições estudadas durante avaliação da temperatura de eluição e determinação da proporção de FMB


Tabela 16 – Parâmetros cromatográficos calculados durante avaliação da temperatura de eluição e determinação da proporção de FMB

ANÁLISE tr W N HETP Res Tf Pureza de pico

30°C 10,05 0,646 3872 25 1,88 1,13 0,999

40°C 9,349 0,556 4521 22 1,65 1,56 0,999

50°C 8,17 0,481 4608 21 1,10 1,94 0,999


129

Podemos observar, conforme Tabela 16, que o aumento da temperatura leva

a redução do tempo de retenção e fator de capacidade, indicando a possibilidade de

obtenção de corridas analíticas mais curtas e picos mais finos. Aumento na eficiência

de separação também é evidenciado com o aumento progressivo do número de pratos

teóricos e redução de HETP, indicando um maior número de equilíbrios químicos entre

fase móvel, fase estacionária e analito que proporcionem a separação da stigmurina.

No entanto o aumento da temperatura leva a redução da resolução, bem como

aumento do fator de cauda. Estes resultados nos sugerem que os extremos 30°C e

50°C devem ser evitados e, portanto, a temperatura de 40°C foi escolhida como

adequada visto que é intermediária e apresenta moderadas alterações de vantagens

e desvantagens na separação da stigmurina como supracitado.

Além do mais, com a redução da taxa de mudança de gradiente ao longo

desta corrida analítica, uma determinação mais exata da proporção de fase móvel foi

calculada e chegamos ao valor de 42% de FMB e 58% de FMA para eluição isocrática

de stigmurina.

Neste momento uma avaliação do tempo de retenção para obtenção de um

método isocrático curto a temperatura de 40°C foi realizada a partir da variação do

fluxo em 0,1 mL.min-1, 0,2 mL.min-1 ou mL.min-1, conforme dados apresentados na

Figura 41.

Figura 41 - Sobreposição dos cromatogramas obtidos para as condições estudadas durante avaliação da influência do fluxo de fase móvel sobre o perfil de eluição no modo isocrático


130

Tabela 17 – Parâmetros cromatográficos calculados durante avaliação da influência do fluxo de fase móvel sobre o perfil de eluição no modo isocrático

ANÁLISE tr W N HETP Res Tf Pureza de pico K

Fl 0,1mL.min-1 20,65 1,58 2741 36 1,76 2,03 1,000 15,52

Fl 0,2mL.min-1 10,57 0,86 2394 42 1,63 1,73 1,000 7,46

Fl 0,3mL.min-1 7,29 0,62 2191 45 1,55 1,56 1,000 4,83


Conforme valores de tempo de retenção apresentados na Tabela 17

verificamos que a redução no fluxo de 0,3 mL.min-1 para 0,1 mL.min-1 levou ao

aumento do tempo de retenção da stigmurina em aproximadamente três vezes. Fluxo

reduzido também proporcionaram maiores valores de área que foram acompanhados

de alargamento do pico apesar do leve aumento na eficiência de separação

evidenciado pelo aumento de N e redução de HETP. Em termos de resolução e fator

de cauda os valores para fluxo de 0,2 mL.min-1 e 0,3 mL.min-1 foram satisfatórios,

sabe-se que um método está otimizado quando o fator de retenção dos analitos está

compreendido na faixa de 2 - 8, o que ocorre para ambos os fluxos, apresentando-se

muito próximo do limite superior a corrida para fluxo de 0,2 mL.min-1, além disso o

fluxo de 0,3 mL.min-1 leva a tempo de corrida analítica reduzido e, portanto, foi

escolhido como adequado.

Por fim, foi realizado a avaliação final dos parâmetros cromatográficos do

método frente a redução do volume de injeção, conforme Figura 42 e Tabela 18.

131

Figura 42 - Sobreposição dos cromatogramas obtidos para as condições estudadas durante avaliação da influência do volume de injeção


Tabela 18 – Parâmetros cromatográficos calculados durante avaliação da influência do volume de injeção sobre o perfil de eluição no modo isocrático

ANÁLISE tr W N HETP Res Tf Pureza de pico K

Volume de

injeção 0,1 µL 7,53 0,56 2875 34 2,12 1,07 0,995 5,02

Volume de

injeção 0,5 µL 7,38 0,58 2571 38 1,75 1,29 0,999 4,91

Volume de

injeção 1,0 µL 7,26 0,63 2108 47 1,54 1,56 1,000 4,81


Existe uma relação linear entre a redução do fluxo e as alturas e

consequentemente áreas dos picos eluídos. A redução do fluxo pode melhorar os

valores de resolução e fator de cauda. E, por fim, o método otimizado apresenta

pureza de pico adequada e valores de K dentro dos limites de otimização, podendo

então passarmos a validação do método analítico.

132

5.5 ESTUDO DE DEGRADAÇÃO FORÇADA EM SOLUÇÃO PARA STIGMURINA

Em virtude da inexistência de estudos de degradação para stigmurina, uma

vez avaliado seu comportamento térmico, em estado sólido, buscou-se investigar seu

comportamento em diferentes condições de degradação em solução.

A heterogeneidade das moléculas inviabiliza uma condição única para

realização de estudos de degradação forçada. A susceptibilidade a degradação para

uma mesma condição pode variar em termos de concentração do agente degradante,

bem como tempo de exposição. Desta forma para as degradações em meio ácido,

alcalino e oxidativo a estabilidade da stigmurina foi avaliada em 3 diferentes

concentrações de degradantes e, para todas as condições, avaliadas no tempo 0, 12

e 24h. A Figura 43 apresenta os gráficos de percentagem remanescente de

stigmurina nas diferentes condições de degradação estudadas.

Figura 43 – Percentagem remanescente de stigmurina, utilizando método desenvolvido, em 24h de degradação para HCl 0,1M, 1M e 5M (A), NaOH 0,1M, 1M e 2M (B), H2O2 0,1%, 1% e 10% (C), térmica e fotolítica (D)


133

Stigmurina não apresentou degradação significativa em 24h para HCl 0,1M e

HCl 1M quando comparado com o controle, Figura 43(A). Para os degradantes com

HCl 1M e 5M foi verificado a formação de um precipitado durante as análises o que

explica os grandes desvios observados. A amostra degradada com HCl 5M em 12h

apresentou degradação média de 50% (superior a 10%), sendo significativamente

diferente do controle (**p<0,05) mostrando-se uma condição bastante drástica para

este tipo de estudo. Enquanto HCl 1M não ultrapassou 10% de degradação.

A degradação de um peptídeo está intimamente relacionada à quebra de

ligações peptídicas, formação de novas ligações e reatividade dos radicais dos

aminoácidos presentes no peptídeo. Durante os estudos de degradação forçada em

meio ácido, a hidrólise de ligações peptídicas é dependente da reatividade dos grupos

carbonilas destas ligações (GRANT; HAY, 1965). Esta reatividade é quase ausente

em peptídeos, devido à ressonância, entre o par de elétrons da carbonila e átomo de

nitrogênio, pois ocorre apenas a deslocalização do par de elétrons não-ligantes do

átomo de nitrogênio. No caso de peptídeos que apresentem extremidade C-terminal

amidada, esta hidrólise pode ser possível através do ataque do ácido sobre a carbonila

protonada levando a formação de um íon amônio e um peptídeo com extremidade

carboxílica (Figura 44) (CAREY; SUNDBERG, 2007; SOLOMONS; FRYHLE, 2009).

Figura 44 – Mecanismo geral de hidrólise ácida para amidas

Fonte: Adaptado de Solomons; Fryle, 2009.

A reação apresentada na Figura 44 é reversível, sendo que da mesma

maneira que se forma um peptídeo com extremidade carboxílica, a reação inverte

formando novamente a amida na extremidade C-terminal. O produto gerado na

134

hidrólise ácida é mais polar, sendo assim, interage menos com a coluna, saindo com

um tempo de retenção menor que a Stigmurina.

Em condições alcalinas, a hidrólise ocorre mais facilmente pelo ataque do íon

hidróxido, um agente fortemente nucleofílico, sobre a própria amida, resultando na

formação de um grupo carboxila e amônia (Figura 45) (CAREY; SUNDBERG, 2007;

SOLOMONS; FRYHLE, 2009).

Figura 45 - Mecanismo de hidrólise básica de amidas

Fonte: Adaptado de Solomons; Fryle, 2009.

A hidrólise em meio alcalino diferentemente da ácida é uma reação

irreversível, o que pode justificar as degradações observadas para Stigmurina em

meio básico (NaOH) com degradação superior a 30% para NaOH 1M e superior a

70% para NaOH 2M, Figura 43(B). Apenas a condição NaOH 2M apresentou-se

diferente do controle (***p<0,05). Semelhante a condição ácida (HCl 1M e 5M) foi

observado formação de precipitado para degradação alcalina (NaOH 1M e NaOH 2M).

Esse precipitado era facilmente solubilizado por agitação da amostra.

A hidrólise de peptídeos e proteínas envolve quebra de grupos amida que

podem ou não fazerem parte de ligações peptídicas pela adição de uma molécula de

água, resultando em desamidação, formação de fragmentos de peptídeos ou

ciclização de resíduos de aminoácidos adjacentes levando a produção de

dicetopiperazinas (MOZZICONACCI; SCHÖNEICH, 2015). Resíduos de prolina,

glicina e aminoácidos N-metil são mais susceptíveis a aminólise intramolecular,

resultando na formação de dicetopiperazina (DKP) (PEDROSO et al., 1986) devido ao

ataque nucleofílico do nitrogênio N-terminal no meio da carbonila entre o segundo e

terceiro aminoácido, em condição ácida, básica e térmica combinada a temperaturas

elevadas. Além disso resíduos de serina são susceptíveis à desidratação e formação

de intermediários de imidas cíclicas que podem resultar na clivagem hidrolítica de

ligações peptídicas. A hidrólise destes intermediários pode ser catalisada sob

condições ácidas ou básicas (OLIYAI et al., 1993; TAMIZI; JOUYBAN, 2016).

135

Possivelmente a hidrólise de resíduos de serina, presente na stigmurina, ou formação

de DKP pode estar levando a formação de produtos de degradação menos solúveis

em HCL 1M ou NaOH 1M que explicaria a formação de precipitado nestas condições.

Para degradação oxidativa - H2O2 (Figura 43 C), nenhuma das concentrações

utilizadas apresentou-se significativamente diferente do controle, no entanto as

concentrações a 1% e 10% promoveram degradação de Stigmurina superior a 10%

em 24h. A presença de resíduos de metionina e cisteína na estrutura primária de

peptídeos e proteínas está intimamente relacionada a susceptibilidade à oxidação, em

decorrência da presença de átomos de enxofre reativos em sua estrutura (CHU et al.,

2004), bem como a presença de anéis aromáticos para os aminoácidos de histidina,

tirosina e triptofano (TAMIZI; JOUYBAN, 2016), somando-se a estas condições a

flexibilidade da cadeia peptídica torna-lhe mais susceptível a oxidação (MANNING et

al., 2010). A ausência destes resíduos para Stigmurina explicaria sua relativa

estabilidade frente a oxidação por H2O2, no entanto em virtude da presença do

aminoácido fenilalanina na estrutura linear da Stigmurina que apresenta anel

aromático, é importante verificar prolongando-se o tempo de degradação e os valores

de decomposição para degradação na condição extrema, H2O2 a 10%, sejam

significantes e a oxidação seja induzida ou não.

Stigmurina apresentou-se pouco susceptível a degradação térmica (Figura 43

D), não se apresentando significativamente diferente do controle. Reações de

hidrólise já mencionadas podem ocorrer em meio ácido e básico. A hidrólise de

ligações peptídicas é pouco favorecida à temperatura ambiente (KAHNE; STILL,

1988). A água purificada apresenta pH neutro ou levemente ácida (5 – 7) não sendo

o ideal para o favorecimento de reações de hidrólise, porém o aumento de temperatura

pode favorecer este tipo de reação (CAREY; SUNDBERG, 2007; SOLOMONS;

FRYHLE, 2009). Apesar de apresentar-se estável na hidrólise térmica é necessário

ampliar o tempo de exposição para confirmar sua estabilidade.

A degradação fotolítica (Figura 43D) foi superior a 20% em 24h. A exposição

de proteínas à luz e a consequente degradação química e física foram estudadas

extensivamente por muitos anos (KERWIN; JR., 2007). A presença de resíduos de

triptofano, tirosina, fenilalanina e cisteína, estão relacionadas a foto oxidação primária

em proteínas e peptídeos (MOZZICONACCI et al., 2012). Embora a foto oxidação

tenha sido reconhecida como um dos principais contribuintes para a degradação

proteica, os efeitos da foto induzida pelo dano não têm sido amplamente estudados

136

para produtos biofarmacêuticos. Isso é particularmente importante, já que a

fotodegradação pode levar a alterações nas estruturas primárias, secundárias e

terciárias de proteínas, e essas mudanças, embora não estabelecidas definitivamente,

podem levar a diferenças na estabilidade, bioatividade ou imunogenicidade em longo

prazo (KERWIN; JR., 2007).

Uma vez analisadas as amostras frente a percentagem remanescente de

stigmurina também foram avaliados os cromatogramas frente a presença de co-

eluições e detecção de picos. A Figura 46 e 47 apresentam a sobreposição de

cromatogramas para as diferentes condições de degradação.

137

Figura 46 – Sobreposição de cromatogramas em 24h de degradação e respectivos brancos em HCl 0,1M, 1M e 5M (A) e NaOH 0,1M, 1M e 2M (B)

(A)

(B)


138

Figura 47 – Sobreposição de cromatogramas em 24h de degradação e respectivos brancos em H2O2 0,1%, 1% e 10% (A), térmica e fotolítica (B)

(A)

(B)


Não foram detectados picos interferentes nos brancos para nenhuma das

condições avaliadas (Figuras 46 e 47). A corrida padrão trata-se da análise de um

padrão da Stigmurina, não degradada, utilizada nos estudos de degradação forçada

(Figura 46). Stigmurina foi detectada em aproximadamente 7,15 min, e, suas

impurezas de síntese em aproximadamente 6,20 min e 4,86 min, nos cromatogramas

de todas as degradações.

Para hidrólise ácida não (Figura 46 A) foi observado surgimento de picos

cromatográficos para as condições HCl 0,1M e HCl 1M, no entanto para a condição

HCl 5M observou-se um significativo aumento da impureza em 6 min, indicando que

a mesma além de ser impureza de síntese pode ser um produto de decomposição

decorrente de hidrólise ácida.

139

Para corridas de degradações alcalinas (Figura 46 B), não foram encontrados

interferentes em nenhum dos brancos de degradação. Apesar da condição NaOH 2M

ter sido a única a apresentar teor de Stigmurina significativamente diferente do

controle, observamos o surgimento de picos em 2,86 min e 3,73 min, além de um

aumento significativo dos picos para a impureza de síntese em 6,15 min em todas as

condições de degradação. Sendo que a condição NaOH 2M em 24h apresentou um

pico em 6,15 min relacionado a impureza de síntese superior ao pico da Stigmurina.

A forte degradação em NaOH 2M por 24h inviabiliza seu uso nos estudos de

degradação por se tratar de uma condição muito drástica. Entretanto o NaOH 1M

apresentou uma degradação mais branda em relação ao 2N, assim como também a

presença de produtos de degradação que justifica sua utilização em estudos

posteriores de degradação forçada para Stigmurina.

Para as corridas cromatográficas em meio oxidativo (Figura 47A) não foi

observado nenhum pico adicional em nenhuma das condições oxidantes de

degradação em 24h. Sugere-se prolongar o tempo de exposição para a condição de

H2O2 10% e observar se Stigmurina continua estável.

A Figura 47(B) apresenta a sobreposição das corridas de degradação térmica

(Água 70°C) e fotolítica de 24h. Observa-se a presença de picos co-eluidos no volume

morto para degradação térmica (0,94 min e 1,30 min) e fotodegradação (0,94 min),

além de aumento de intensidade de sinal para o pico em 6,15 min em ambas as

degradações, esses picos não foram observados nos cromatogramas dos respectivos

brancos de degradação. A fotólise da fenilalanina resulta em clivagem fotolítica para

formar os radicais benzil e glicil ou formação do cátion radical fenil e produção de um

elétron. A fotólise é fortemente dependente da temperatura, resultando em uma

dependência de temperatura para os subprodutos de radical e elétron (BENT;

HAYON, 1975; DAVIES; TRUSCOTT, 2001; KERWIN; JR., 2007). Portanto, a

suscetibilidade a fotodegradação da Stigmurina pode ser explicada pela presença de

resíduos de fenilalanina na Stigmurina.

Stigmurina apresentou-se estável nas condições oxidativas, HCl 0,1 e 1 M.

Susceptível a hidrólise ácida, básica, fotodegradação. O surgimento de picos para as

condições de fotodegradação, degradação térmica, NaOH 1M, NaOH 2M sugere

degradação nessas condições. Em virtude do não surgimento de picos e baixo

percentual de degradação para condição oxidativa e ácido (HCl 1M) sugere-se que

para essas condições o tempo de exposição seja prolongado por pelo menos mais

140

12h. Define-se que as condições a serem usadas para identificação de produtos de

degradação e desenvolvimento de método indicativo de estabilidade para Stigmurina

sejam: HCL 1M, H2O2 10% e hidrólise térmica a 70°C com prorrogação do tempo de

exposição superior a 24h e, para NaOH 1M e fotodegradação por 24h. A estabilidade

química do peptídeo influencia diretamente a escolha de aditivos durante o

desenvolvimento de uma formulação.

5.6 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

O método analítico desenvolvido para quantificação de Stigmurina matéria-

prima foi validado com base na norma regulamentadora RDC n° 166/2017 da ANVISA,

bem como diretrizes do ICH Q2 (R1). Por se tratar de método de doseamento a

validação envolveu avaliação da seletividade, linearidade, precisão, exatidão e

robustez. Adicionalmente os limites de detecção e quantificação também foram

determinados.

A seletividade foi estudada levando em conta os produtos de degradação

formados após diferentes condições de degradação (ácida, básica neutra, oxidação e

fotólise), bem como possível interferência do diluente. Para garantia da seletividade

avaliou-se a presença de co-eluições a partir da verificação do fator de cauda, bem

como resolução, além da verificação da pureza de pico cromatográfica. A Figura 48

apresenta curvas cromatográficas para as diferentes condições avaliadas bem como

Tabela 19, contendo valores de R, Tf e Pureza de pico para cada condição.

141

Figura 48 – Sobreposição de cromatogramas de stigmurina e amostras degradadas para avaliação da seletividade.


Tabela 19 – Valores de Resolução (R), fator de cauda (Tf) e pureza de pico para amostras analisadas durante avaliação da seletividade do método cromatográfico desenvolvido

AMOSTRAS R Tf PUREZA DE PICO

Padrão Stigmurina Não degradado 1,52 1,53 0,999

Degradação Básica - NaOH 1M 1,81 1,49 0,999

Degradação Ácida - HCl 1M 1,81 1,28 0,999

Degradação Oxidativa - H2O2 10% 1,69 1,08 0,997

Degradação Térmica 70°C 1,80 1,10 0,999

Fotodegradação 1,89 1,14 0,998


Na Tabela 19 observa-se que os valores de fator de cauda, resolução e pureza

de pico encontraram-se dentro dos valores especificados (Tf < 2,0; R ≥ 1,5 e pureza

de pico ≥ 0,99). O método é seletivo para os produtos de degradação forçada

formados nas condições estudadas.

142

A linearidade foi estudada, tendo em conta a subsequente aplicação do

método, isto é, doseamento da matéria-prima. Cinco níveis de concentração com três

réplicas independentes para cada um foram usados para determinar a curva de

calibração, conforme descrito acima na seção “Materiais e métodos”. A Figura 49

apresenta a curva de calibração obtida, com representação dos pontos, equação da

reta e coeficiente de determinação (R2), para determinação da linearidade.

Figura 49 - Curva de calibração para avaliação da linearidade


Tabela 20 - Análise estatística da regressão e ANOVA para avaliação da linearidade


143

Observa-se que a reta obtida a partir dos 5 níveis de concentração estudado

é visualmente linear. A análise de correlação linear é uma das formas de verificar a

linearidade da curva de calibração. O coeficiente de correlação (R) estabelece a

interdependência entre sequências de dados entre o sinal medido e a concentração

do padrão correspondente, enquanto o coeficiente de determinação (R2) traduz a

adequabilidade do modelo linear aos valores experimentais, ou seja, a variabilidade

explicada pelo modelo. Com intuito de verificar linearidade da curva e o ajuste da reta

foi realizado regressão linear e estudo ANOVA, cujos resultados estão apresentados

na Tabela 20.

O valor do coeficiente de correlação pode tomar valores entre (-1; +1), ou seja,

-1 ≤ R ≤ 1. Quando R = -1, trata-se de uma correlação negativa (reta de declive

negativo). Quando R = 1, trata-se de uma correlação positiva (reta de declive positivo).

Ambas as situações refletem correlações perfeitas. Contudo, se for obtido um bom

valor do coeficiente de correlação (≅ 1), não significa que a correlação linear seja a

que melhor se ajusta. É por isso que este parâmetro deve implicar a visualização da

curva de calibração, recorrendo à elaboração de um gráfico do sinal obtido em função

da concentração dos padrões, para que sejam detectadas tendências não lineares

dos resultados. A análise de regressão da linearidade/curva de calibração para

stigmurina mostrou resultados bastante satisfatórios, uma vez que apresentou

coeficiente de correlação (R) de 0,9955 e coeficiente de determinação (R²) de 0,9911,

demostrando capacidade do método de gerar resultados linearmente proporcionais a

concentração do analito, além disso foi realizado o teste ANOVA para verificar a

necessidade de ajuste da reta e, o mesmo demonstrou que não será necessário

realizar ajustes, uma vez que o F obtido (1449) é maior que o F-crítico (4,65).

A qualidade do ajuste da curva de calibração e a sua linearidade também foi

demonstrada a partir da inspeção visual do gráfico de resíduos gerados pela

regressão, conforme apresentado na Figura 50.

144

Figura 50 - Gráfico dos resíduos gerados pela regressão


Verifica-se que os pontos no gráfico de resíduos estão aleatoriamente

distribuídos ao redor do eixo x, não apresentando nenhum comportamento ou

tendência funcional.

Garantida a linearidade do método na faixa de trabalho estudada (0,8 mg.mL-

1 – 1,2 mg.mL-1), passamos a avaliação da precisão nos níveis de repetibilidade e

reprodutibilidade. A tabela 21 apresentada os dados brutos para avaliação da

repetibilidade.

Tabela 21 - Avaliação de DPR% das análises para determinação da repetibilidade

Amostras Concentração

(mg.mL-1) Área Fator de Correlação

1 1,0 2500944 2500944

2 1,0 2502592 2502592

3 1,0 2509892 2509892

4 1,0 2495365 2495365

5 1,0 2516026 2516026

6 1,0 2482091 2482091

Critério de Aceitação Resultado Obtido

Média das Área - 2501152 DPR% < 2,0% 0,47


145

No nível de repetibilidade considerou-se satisfatório o resultado desde que o

desvio padrão relativo de sextuplicata das amostras fosse inferior a 2,0%. Para a

concentração de 1,0 mg.mL-1, o coeficiente de variação (DPR%) foi 0,472,

demonstrando, portanto, repetibilidade aceitável para o método.

Adicionalmente avaliou-se a variação dos parâmetros cromatográficos

durante a análise dos dados de repetibilidade, conforme apresentado para Tabela 22.

Tabela 22 - Avaliação dos parâmetros de adequabilidade do sistema para dados de repetibilidade

Amostras tr W N Res Tf Pureza de

Pico K

1 7,25 0,64 2073 1,58 1,55 0,999 4,80

2 7,23 0,63 2117 1,52 1,55 0,999 4,79

3 7,30 0,62 2206 1,55 1,54 0,999 4,84

4 7,29 0,62 2206 1,55 1,56 0,999 4,83

5 7,29 0,62 2186 1,55 1,57 0,999 4,83

6 7,28 0,62 2181 1,53 1,54 0,999 4,82

MÉDIA 7,27 0,63 2162 1,546 1,55 0,999961 4,82

DESVPAD 0,0261 0,0061 54,5980 0,0204 0,0115 8,066E-06 0,0212

DPR% 0,36 0,97 2,53 1,32 0,74 0,0008 0,44


Os parâmetros largura de pico (W), número de pratos teóricos (N), resolução

(Res), fator de cauda (Tf), pureza de pico e k (coeficiente de capacidade)

apresentaram baixa variação com DPR% < 3,0%. Além disso, o DPR% para tempo

de retenção (tr) foi inferior a 1%, os valores de Tf < 2,0%, N > 2000, a pureza de pico

≥ 0,99 e R ≥ 1,5, todos os valores encontravam-se conforme dados de

desenvolvimento de método (Tabela 22).

A precisão intermediária foi avaliada a partir do DPR% das análises inter-dia

e intra-dias, conforme Tabela 23, bem como análises estatística t de Student,

conforme Tabela 24.

146

Tabela 23 - Avaliação de DPR% das análises para determinação da precisão intermediária

ANALISTAS/DIAS Analista A Analista B

Dia 01 Dia 02

Amostras Concentração (%) Concentração (%)

1 100,26 100,77

2 100,06 103,54

3 99,23 100,12

4 98,18 100,30

5 100,64 100,30

6 101,18 99,62

Média 99,93 100,78

Desvpad 1,07 1,41

DPR% 1,07 1,39

Variância 1,15 1,98

MÉDIA ENTRE ANALISTAS 100,35

DESVPAD ENTRE ANALISTAS 1,27

DPR% ENTRE ANALISTAS 1,26


Tabela 24 - Teste de t de Student para verificação da precisão intermediária

100,2647411 100,7702371

Média 99,85717733 100,7771893

Variância 1,407117726 2,469542925

Observações 5 5

Correlação de Pearson -0,020049817

Hipótese da diferença de média 0

Gl 4

Stat t ou T cal -1,034909453

P(T<=t) uni-caudal 0,179586903

t crítico uni-caudal 2,131846786

P(T<=t) bi-caudal 0,359173805

t crítico bi-caudal 2,776445105

Critério de Aceitação T cal T crítico

T cal < T crítico -1,034909453 2,776445105


147

Os valores de DPR% para variação inter-dia (1,07 – Analista A e 1,39 –

Analista B), bem como para variação intra-dias (1,26) demonstra precisão

intermediária aceitável, tendo em vista que para nenhum dos resultados o DPR% foi

superior a 2,0% (Tabela 23).

Adicionalmente, a precisão intermediária também foi satisfatória quando os

dados foram avaliados a partir do teste t de Student em par para médias tendo em

vista que os valores da estatística T calculados (Tcal) foram inferiores ao T crítico,

indicando não haver diferenças entre os valores encontrados para as variações inter-

dia e entre-analistas (Tabela 24).

A exatidão foi avaliada em nível de % de recuperação, para as concentrações

de 0,8mg.mL-1 (80%), 1,0 mg.mL-1 (100%) e 1,2 mg.mL-1 (120%) cujos dados estão

dispostos na Tabela 25.

Tabela 25 - Avaliação da Exatidão

Conc.

Conc.

Recup.

(%)

Conc.

Recup.

(mg.mL-1)

DP

entre

leituras

DPR

entre

leituras

Exatidão

Recuperação

(%)

Intervalo

de

Confiança

( ± )

80%

80,06 0,80

1,38 1,73 99,88 1,10

79,77 0,79 80,03 0,80 80,31 0,80 77,03 0,77 77,85 0,78

100%

99,11 0,99

0,26 0,26 99,53 0,21

99,52 0,99 99,14 0,99 99,76 0,99 99,61 0,99 99,54 0,99

120%

118,61 1,19

0,73 0,61 99,78 0,59

120,29 1,20 119,91 1,19 118,56 1,19 119,96 1,19 119,57 1,19


148

Tendo em vista a concentração do analito na amostra, considera-se aceitável

a exatidão desde que a recuperação para os níveis de concentração analisados se

encontre entre 98% - 102%, sendo assim, o método satisfez aos critérios de exatidão

(Tabela 25).

A robustez foi avaliada com relação a pequenas variações nas condições

cromatográficas de fluxo, temperatura e proporção de fase móvel, cujos dados estão

apresentados na Tabela 26, comparando-se o DPR% de cada variação individual com

a condição nominal, sendo aquela padronizada para o método (fluxo de 0,3 mL.min-1,

temperatura de 40°C e proporção de fase móvel FMA:FMB – 58%:42%).

Tabela 26 - Avaliação de DPR% para determinação da robustez entre as variações com base nos valores de área obtidos para combinação da condição nominal com variação

CONDIÇÕES MÉDIA DESVPAD DPR %

Nominal +39°C 2468225 43106,97 1,75

Nominal +41°C 2478401 33398,53 1,35

Nominal + 0,29mL.min-1 2512812 24082,81 0,96

Nominal + 0,31mL.min-1 2430013 30385,31 1,25

Nominal + 41%:59% 2471080 46390,29 1,88

Nominal + 43%:57% 2451739 31478,42 1,28

Critério de Aceitação DPR% < 2,0%


Quanto à robustez, após variação dos parâmetros em estudo observou-se que

o método não apresentava alterações significativas quanto aos valores de área entre

a condição nominal e cada variação individualmente. No entanto quando avaliado os

parâmetros de adequabilidade do sistema, variações foram encontradas conforme

apresentado na Tabela 27.

Quando avaliado as variações em se tratando de parâmetros de

adequabilidade verifica-se que para nenhuma das variações de proporção de fase

móvel (± 1% de FMB), foram alcançados os critérios de aceitação, os valores estão

evidenciados em cinza. Além da alteração de fluxo para valores superiores

(0,31mL.min-1), não ter alcançado coeficiente de variação aceitável ( DPR% ≤ 1,0%).

149

Tabela 27 - Avaliação de parâmetros médios de adequabilidade do sistema para variações realizadas na robustez

PARÂMETRO K R tR Tf N

CONDIÇÃO MÉDIA MÉDIA DPR (%) MÉDIA MÉDIA

Normal 4,84 1,55 0,51 1,54 2117

39°C 4,76 1,56 0,25 1,55 2051

41°C 4,55 1,50 0,48 1,65 2182

0,29mL.min-1 5,04 1,55 0,16 1,62 2157

0,31mL.min-1 4,74 1,55 3,19 1,60 2106

59%: 41% 6,78 1,74 0,14 1,71 2330

57%: 43% 3,54 1,41 1,93 1,49 2003


As variações observadas, em termos de proporção de fase móvel, podem ser

explicadas em virtude da força modificadora orgânica. Para separações de pequenas

moléculas, a retenção muda lentamente com a força modificadora orgânica, enquanto

para separações de proteína e peptídeos os analitos permanecem ligados à superfície

até que uma concentração específica de solvente orgânico seja alcançada e então

abruptamente eluam com apenas pequenas interações resultando em picos nítidos.

É devido a essa eluição abrupta, para separações de proteínas ou de peptídeos, que

pequenas diferenças na preparação da fase móvel levam a tempos de retenção

irreproduzíveis, devendo, portanto, em modos de separação isocrático manterem-se

constantes e sob controle a proporção da fase móvel utilizada.

Adicionalmente as figuras de mérito preconizadas para validação de método

de doseamento, a partir da curva de calibração para linearidade, estimou-se os limites

de detecção e quantificação de 0,04 mg.mL-1 e 0,14 mg.mL-1, respectivamente, cujos

gráficos são apresentados na Figura 51.

150

Figura 51 – Sobreposição de cromatogramas para amostras de LD e LQ cujas concentrações foram estimadas a partir da linearidade


Foi avaliada os valores de precisão em nível de repetibilidade (Tabela 28) e

precisão intermediária (Tabela 29 e Tabela 30) ambos a 0,14 mg.mL-1, para o LQ, bem

como a exatidão em 3 níveis (0,112 mg.mL-1, 0,14 mg.mL-1 e 0,168 mg.mL-1; 80%,

100% e 120%, respectivamente) conforme apresentado na Tabela 28.

A repetibilidade foi satisfatória e o DPR < 2,0% (Tabela 28) e a precisão

intermediária para o LQ estimado foi aceitável em termos de DPR%, bem como para

o teste t de Student (Tabela 29 e 30). A exatidão para o LQ estimado também foi

encontrada ficando entre 80% - 120% e DPR% < 2% (Tabela 31).

0 2 4 6 8 10

-20000

-15000

-10000

-5000

0

5000

10000

15000

20000

LD = 0,04 mg.mL-1

LQ = 0,14 mg.mL-1

Inte

nsid

ad

e (

mA

U)

Tempo (min)

151

Tabela 28 - Avaliação de DPR% das análises para determinação da repetibilidade para o LQ estimado

Amostras Concentração

(mg.mL-1) Área

Fator de

Correlação

1 0,14 322480 2303429

2 0,14 323025 2307321

3 0,14 330052 2357514

4 0,14 325655 2326107

5 0,14 329767 2212621

6 0,14 335435 2355479

Critério de Aceitação Resultado Obtido

Média das Área - 322736 DPR% < 2,0% 1,51


Tabela 29 - Avaliação de DPR% para determinação da precisão intermediária do LQ estimado

ANALISTAS/DIAS Analista A Analista B

Dia 01 Dia 02

Amostras Concentração (%) Concentração (%)

1 13,37 13,68

2 13,19 13,55

3 13,59 13,88

4 13,14 13,79

5 13,22 13,83

6 13,79 13,34

Média 13,38 13,68 Desvpad 0,26 0,20

DPR% 1,92 1,49

Variância 0,066 0,061

MÉDIA ENTRE ANALISTAS 13,95 DESVPAD ENTRE ANALISTAS 0,637

DPR% ENTRE ANALISTAS 4,569 Fonte: Autoria própria, 2019

152

Tabela 30 - Teste de t de Student para verificação da precisão intermediária para o LQ estimado

Analista 1 Dia 1 Analista 2 Dia 2

Média 13,38345262 13,6760374

Variância 0,066169271 0,041387502

Observações 6 6

Correlação de Pearson -0,469323428

Hipótese da diferença de

média

0

gl 5

Stat t -1,810606168

P(T<=t) uni-caudal 0,064985477

t crítico uni-caudal 2,015048373

P(T<=t) bi-caudal 0,129970954

t crítico bi-caudal 2,570581836

Critério de Aceitação T cal T crítico

T cal < T crítico -1,810606168 2,570581836


Tabela 31 - Avaliação da Exatidão para o LQ estimado

Conc. Conc. Recup.

(%)

Conc. Recup.

(mg.mL-1)

DPR

entre

leituras

Exatidão

Recuperação

(%)

Intervalo

de

Confiança

( ± )

80% 98,59 0,11042

1,080

98,59

0,85

97,98 0,10974 100,05 0,11206

100% 80,73 0,11302

1,203

80,29

0,77

78,88 0,11043 80,29 0,11240

120% 103,35 0,17363

1,096 103,35 0,91 105,18 0,17670 103,11 0,17322


153

Adicionalmente a validação a estabilidade da amostra em 72h (Figura 52), foi

avaliada. O gráfico para avaliação da estabilidade da solução expressa a percentagem

encontrada de stigmurina em função do tempo para uma mesma amostra (% ± DP / n

= 3). Os resultados alcançados para 72h de análise apresentaram DPR < 2%, sendo,

portanto, a solução de stigmurina em TFA 0,1% em água estável durante período de

72h.e não apresentou amostra retida pela unidade filtrante utilizada durante o estudo.

Figura 52 - Gráfico para avaliação da estabilidade da amostra


A Tabela 32 sumariza as figuras de mérito avaliadas durante a validação do

método de quantificação de stigmurina matéria-prima indicativo de estabilidade

química, a partir do qual podemos concluir que o método se encontra validado e apto

a utilização para avaliação da síntese do peptídeo.

154

Tabela 32 - Resumo de testes para validação do método analítico de teor de stigmurina em Matéria-prima

FIGURAS DE MÉRITO CRITÉRIO DE ACEITAÇÃO RESULTADOS

SELETIVIDADE Completa separação das

impurezas e nenhum pico

interferente – DPR% tR < 1% e

Res ≥ 1,5

Atendeu aos critérios

LINEARIDADE Resíduos com distribuição

randômica

Coeficiente angular ≠ 0

r e r² ≤ 0,99

Atendeu aos critérios

Coeficiente angular =

2509231

r = 0,9911 e r² = 0,9904

LD= 0,4mg.mL-1

LQ=0,14 mg.mL-1

EXATIDÃO Média da recuperação entre

98% a 102%

99,53 – 99,88 %

REPETIBILIDADE DPR% ≤ 2,0% DPR% = 0,472

PRECISÃO

INTERMEDIÁRIA

Desvio padrão relativo inferior a

2% inter-analista e intra-analista

e Tcal < Tcrit

Analista 1 = 1,07%

Analista 2 = 1,39%

inter-analista = 1,26%

T cal(-1,035) < Tcrit(2,778)

ROBUSTEZ DPR% inter-variação e entre-

variações ≤ 2%

K = 2-6 / Res ≥ 1,5 / tR DPR% <

1% / N > 2000/ Tf < 2,00

DPR% ≤ 2% para todas as

variações, no entanto os

parâmetros de

adequabilidade (K, Res e tR)

são susceptíveis as variações

de proporção de fase móvel e

fluxo


155

6 CONCLUSÃO

• Neste estudo, pela primeira vez, um peptídeo, do escorpião Tityus Stigmurus,

obtido por síntese química foi caracterizado em estado sólido;

• Stigmurina apresentou-se no estado amorfo;

• O uso da correlação de Pearson para avaliação de estabilidade a partir de

espectros infravermelho deve considerar baixa correlação quando r < 0,95

• Foram detectadas 3 impurezas de síntese, sendo que uma delas tratar-se da sua

forma não-amidada, e as demais decorrentes de deleção dos aminoácidos serina

e leucina/isoleucina durante etapas de acoplamento dos resíduos de aminoácidos;

• O peptídeo apresenta evento de transição vítrea durante aquecimento, com

temperatura de 149°C (midpoint);

• A decomposição da stigmurina é um processo endotérmico onde o produto de

decomposição é originado no estado líquido, de acordo com as imagens de DSC-

fotovisual. Acima de 500°C é observado evento exotérmico decorrente de material

carbonáceo.

• É estável em atmosfera de nitrogênio até 183°C e ar sintético a 180°C.

• Sugere-se que os voláteis de decomposição térmica sejam produzidos em

decorrência de quebra homolítica das cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos

iniciando-se pela extremidade N-terminal, com formação de compostos aromáticos,

aminas, nitrilas, álcoois, éteres, entre outros, seguidos por reações de

desfragmentação (principalmente descarboxilação e desaminação) e reações de

condensação intramoleculares gerando compostos similares à 2,5-dicetopiperazina

ou DKP com liberação de água e produtos de baixo peso molecular (CO2, NH3, CO,

HCNO);

156

• A degradação térmica de stigmurina leva principalmente a formação de fragmentos

y14 e y15, bem como fragmentos decorrentes de perdas neutras.

• Após aquecimento a atividade antitripanossoma da stigmurina é mantida até

160°C. Em 190°C e 230°C a atividade biológica resultante é decorrente dos

produtos de decomposição ou de gazes tóxicos aprisionados nos sólidos e

formados durante a decomposição térmica.

• O estudo de degradação forçada para stigmurina mostrou que este peptídeo é

estável por 36h em degradação oxidativa (H2O2 a 10%), susceptível a

fotodegradação, degradação alcalina (NaOH 1M), degradação ácida (HCl 1M) e

térmica.

• Parâmetros físico-químicos para stigmurina foram determinados in silico para

nortear o desenvolvimento do método cromatográfico.

• O screening analítico para detecção stigmurina e avaliação de colunas

cromatográficas revelou que o sistema de fase móvel constituinte de ácido

trifluoroacético e acetonitrila foram capazes de identificar e quantificar o peptídeo,

bem como todas as colunas capazes de detectar o peptídeo stigmurina.

• Após a obtenção do sistema de fase móvel (fase móvel A: TFA 0,1% v/v em água

e fase móvel B: TFA 0,1% em ACN), o método analítico foi otimizado e

desenvolvido com base no método clássico one-factor-at-time, para resolução,

fator de cauda e fator de capacidade sendo posteriormente validado.

• A validação foi realizada com a determinação da especificidade/seletividade,

linearidade, precisão (repetibilidade e precisão intermediária), exatidão e robustez.

Adicionalmente foram estimados os limites de detecção e quantificação. O método

apresentou-se adequado para determinação da stigmurina frente seus produtos

de degradação em solução, onde nenhum mostrou interferência nos demais. O

método encontra-se apto para utilização na quantificação de stigmurina obtida por

síntese química, bem como avaliação da presença de produtos de degradação.

157

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ANEXO A

LAUDO DE STIGMURINA SINTÉTICA

176

ANEXO B

Padrão de Fragmentação para stigmurina no modo positive, series b e y.

S Res. Mass # (N) b b - 17 b - 18 y y - 17 y - 18 # (C)

F 147,068414008 1 148,075690468091 131,049141340091 130,065125748091 1795,05165597209 1778,02510684409 1777,04109125209 17

F 147,068414008 2 295,144104476091 278,117555348091 277,133539756091 1647,98324196409 1630,95669283609 1629,97267724409 16

S 87,032028488 3 382,176132964091 365,149583836091 364,165568244091 1500,91482795609 1483,88827882809 1482,90426323609 15

L 113,084064088 4 495,260197052091 478,233647924091 477,249632332091 1413,88279946809 1396,85625034009 1395,87223474809 14

I 113,084064088 5 608,344261140091 591,317712012091 590,333696420091 1300,79873538009 1283,77218625209 1282,78817066009 13

P 97,052763928 6 705,397025068091 688,370475940091 687,386460348091 1187,71467129209 1170,68812216409 1169,70410657209 12

S 87,032028488 7 792,429053556091 775,402504428091 774,418488836091 1090,66190736409 1073,63535823609 1072,65134264409 11

L 113,084064088 8 905,513117644091 888,486568516091 887,502552924091 1003,62987887609 986,603329748091 985,619314156091 10

V 99,068414008 9 1004,58153165209 987,554982524091 986,570966932091 890,545814788091 873,519265660091 872,535250068091 9

G 57,021463768 10 1061,60299542009 1044,57644629209 1043,59243070009 791,477400780091 774,450851652091 773,466836060091 8

G 57,021463768 11 1118,62445918809 1101,59791006009 1100,61389446809 734,455937012091 717,429387884091 716,445372292091 7

L 113,084064088 12 1231,70852327609 1214,68197414809 1213,69795855609 677,434473244091 660,407924116091 659,423908524091 6

I 113,084064088 13 1344,79258736409 1327,76603823609 1326,78202264409 564,350409156091 547,323860028091 546,339844436091 5

S 87,032028488 14 1431,82461585209 1414,79806672409 1413,81405113209 451,266345068091 434,239795940091 433,255780348091 4

A 71,037113848 15 1502,86172970009 1485,83518057209 1484,85116498009 364,234316580091 347,207767452091 346,223751860091 3

F 147,068414008 16 1649,93014370809 1632,90359458009 1631,91957898809 293,197202732091 276,170653604091 275,186638012091 2

K 128,094963136 17 1777,04109125209 1760,01454212409 1759,03052653209 146,128788724091 129,102239596091 128,118224004091 1

universidade federal do rio grande do norte centro de ... · momentos de dificuldades e sempre...

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