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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Efeitos de um extrato aquoso de porangaba (Cordia salicifolia) na marcação de
constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia de hemácias
JACQUES NATAN GRINAPEL FRYDMAN
Natal / RN
2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Efeitos de um extrato aquoso de porangaba (Cordia salicifolia) na marcação de
constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia de hemácias
JACQUES NATAN GRINAPEL FRYDMAN
Dissertação a ser apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para a obtenção
do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Mario Bernardo Filho
Co-orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
Natal / RN
2009
ii
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte UFRN
Frydman, Jacques Natan Grinapel
Efeitos de um extrato aquoso de porangaba (Cordia salicifolia) na marcação de constituintes
sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia de hemácias / Jacques Natan Grinapel Frydman. –
Natal, RN, 2009. xii, 54p.
Orientador: Mário Bernardo-Filho
Co-orientador: Aldo da Cunha Medeiros
Tese (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da
Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
1. Plantas Medicinais – Tese. 2. Tecnécio-99m – Tese. 3. Cordia salicifolia – Tese. 4.
Eritrócitos – Tese. 5. Plasma sanguíneo – Tese. 6. Proteínas – Tese. 7. Morfologia – Tese. I. Bernardo-
Filho, Mario. II. Medeiros, Aldo da Cunha. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV.
Título
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Professora Doutora Técia Maria de Oliveira Maranhão
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
Natal / RN
2009
iii
JACQUES NATAN GRINAPEL FRYDMAN
Efeitos de um extrato aquoso de porangaba (Cordia salicifolia) na marcação de
constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia de hemácias
BANCA EXAMINADORA
MEMBROS TITULARES
PRESIDENTE DA BANCA:
Prof. Dr. Mario Bernardo Filho – Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Prof. Dr.
Prof. Dr.
Natal / RN
2009
iv
DEDICATÓRIA
À minha esposa Vanessa, por seu apoio e incentivo incondicionais e por estar
sempre ao meu lado superando todas as adversidades.
“A adversidade desperta em nós capacidades que, em circunstâncias favoráveis,
teriam ficado adormecidas” (Horácio)
Ao meu filho João Gabriel, meu mais precioso projeto. Fonte de toda a minha
inspiração e energia.
“A criança é alegria como o raio de sol e estímulo como a esperança” (Coelho
Neto)
Aos meus pais, pelo apoio e orientação no caminho a ser trilhado.
“Somos o resultado de muitos esforços que não são nossos” (Georges Chevrot)
“É na educação dos filhos que se revelam a virtude dos pais” (Coelho Neto)
A Deus, fonte fecunda de luz, felicidades e virtudes. Que Ele continue sempre a
nos prodigalizar os seus benefícios.
A eles dedico tudo o que fiz, faço e farei.
v
AGRADECIMENTOS
Obrigado Senhor por ter me permitido aprender e ter me concedido a
oportunidade de colaborar com mais um conhecimento para a humanidade.
“Quem é o sábio? Aquele que aprende de cada pessoa” (Pirkei Avot)
À minha esposa e filho por todo amor, carinho, vibração em cada conquista e
compreensão da necessidade de minha ausência em determinados momentos.
“Apenas em torno de uma mulher que ama se pode formar uma família” (Friedrich
Schlegel)
Ao Professor Mario Bernardo Filho por todo seu esforço em conduzir seus
alunos no caminho da busca do conhecimento e da excelência, forjando o caráter do
cientista. Como orientador soube indicar caminhos e sugerir soluções para que esta
caminhada pudesse ter êxito, meu respeito e admiração. Um exemplo a ser seguido.
“A coisa principal da vida não é o conhecimento, mas o que dele se faz” (Talmude)
Ao Professor Adenilson de Souza da Fonseca pela orientação, e grande
incentivo durante a iniciação científica e todo o processo de seleção, execução e
conclusão do mestrado.
“Não se pode ensinar tudo a alguém, pode-se apenas ajudá-lo a encontrar por si mesmo.”
(Galilleu Galilei)
vi
Aos amigos e companheiros de pesquisa: Gabrielle Rocha, Márcia Pereira,
Camila Godinho, Rosane Neves, Bernardo Rebello, Angélica Garcia-Pinto, Mônica
Benarroz, Maria Regina Macedo e Sebastião Santos Filho, nos momentos difíceis e
alegres.
“O prazer dos banquetes não está nos pratos, mas sim nas pessoas que acompanham a
mesa.” (Talmude)
Ao Serviço de Medicina Nuclear e ao Laboratório de Endocrinologia do
Hospital Universitário Pedro Ernesto pelo suporte aos resultados obtidos.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde. Ao auxílio dado pelo
CAPES, FAPERJ e CNPq.
A todos que direta ou indiretamente possibilitaram a realização deste
trabalho.
vii
LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS
Células Vermelhas do Sangue CVS
Cloreto estanoso SnCl2
Cordia salicifolia C. salicifolia
Extrato Aquoso da Porangaba ExPo
Pertecnetato de sódio Na99mTcO4
Tecnécio-99m (meta estável) 99mTc
Molibdênio-99 99Mo
99-Molibdênio / Tecnécio-99m 99Mo / 99mTc
Nanômetro nm
Micrograma g
Microlitro L
Quiloeletronvolt kev
Porcentagem de radioatividade incorporada %ATI
Cloreto de sódio NaCl
Milímetro cúbico mm3
Íon estanoso Sn+2
Universidade do Estado do Rio de Janeiro UERJ
Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES
Fundo de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro FAPERJ
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq
viii
SUMÁRIO
Dedicatória............................................................................................................................v
Agradecimentos...................................................................................................................vi
Lista de abreviações siglas e símbolos…………………….....………………..........…......…viii
Sumário...…………………………………………………………...........……………….............ix
Abstract.................................................................................................................................x
Resumo…………………………………….........……….............…………………....................xi
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................1
2 REVISÃO DA LITERATURA..............................................................................................3
3 REFERÊNCIAS ................................................................................................................7
4 INDEXAÇÃO DE ARTIGOS ............................................................................................12
4.1 Artigos publicados.........................................................................................................12
5 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES..............................................................18
6 APÊNDICES ...................................................................................................................22
ix
ABSTRACT
Effects of a Cordia salicifolia (porangaba) extract on the labeling of blood cells
(BCs) with technetium-99m ((99m)Tc) and on the morphology of red BCs were evaluated.
Labeling of cellular and molecular structures with (99m)Tc depends on a reducing agent.
Some physical characteristics, as visible absorbance spectrum, electric conductivity, and
refractive index of this porangaba extract, were also determined. Blood samples from
Wistar rats were incubated with porangaba extract or with 0.9% NaCl (control). Labeling of
blood constituents with (99m)Tc was performed. Plasma (P) and BCs, both soluble (SF-P
and SF-BC) and insoluble (IF-P and IF-BC) fractions, were separated. The radioactivity in
each fraction was counted, and the percentage of radioactivity incorporated (%ATI) was
calculated. Blood smears were prepared, fixed, and stained, and the morphology of the
red BCs was evaluated. Data showed an absorbance peak at 480 nm and electric
conductibility and refractive index concentration-dependent. Porangaba extract decreased
significantly (P < .05) the BC, IF-P, and IF-BC %ATI, and no modifications were verified on
the shape of red BCs. Analysis of the results reveals that some physical parameters could
be useful to aid in characterizing the extract studied. Moreover, it is possible that chemical
compounds of this extract could have chelating/redox actions or be capable of binding to
plasma and/or cellular proteins.
x
RESUMO
Extratos aquosos de Cordia salicifolia (porangaba) têm sido utilizados
popularmente para tratamento de diversas doenças. O uso de radionuclídeos com
finalidades diagnósticas e terapêuticas tem contribuído para avanços em Ciências da
Saúde. Radiofármacos marcados com tecnécio-99m (99m
Tc) tem possibilitado a obtenção
de imagens diagnósticas em Medicina Nuclear. Tem sido descrito que fármacos sintéticos
e extratos de plantas medicinais podem interferir na marcação de constituintes
sanguíneos com 99m
Tc. Este estudo teve como objetivos a obtenção de um extrato aquoso
de porangaba (ExPo) com a realização de controles de reprodutibilidade de preparo do
mesmo e avaliação de seu efeito in vitro na marcação de constituintes sanguíneos com
99m
Tc e na morfologia de hemácias de ratos Wistar. Foram determinadas algumas
características físicas, como o espectro de absorbância, condutividade elétrica e índice de
refração do ExPo. Amostras de sangue de ratos Wistar foram incubadas com ExPo ou
NaCl 0,9% (grupo controle) e a marcação de constituintes sanguíneos com 99m
Tc foi
realizada. Frações solúvel (FS) e insolúvel (FI) de plasma (P) e células sanguíneas (CS)
foram separadas. A radioatividade em cada fração foi contada e a porcentagem de
radioatividade incorporada (%ATI) foi calculada. Distensões sanguíneas foram
preparadas, fixadas, coradas e a morfologia de células sanguíneas foi avaliada. Dados
mostraram um máximo de absorbância em 480nm e uma condutividade elétrica e índice
de refração dependente da concentração do extrato. O ExPo diminuiu significativamente
(p<0,05) a %ATI em CS, FI-P e FI-CS e nenhuma modificação foi verificada na forma das
células vermelhas do sangue. A análise dos resultados sugere que alguns parâmetros
físicos podem ser úteis na caracterização do extrato estudado. Além disso, compostos
químicos presentes no extrato poderiam ter ações quelante, redox ou serem capazes de
se ligar a proteínas plasmáticas ou celulares.
xi
Esse estudo é uma pesquisa experimental com caráter multidisciplinar. Foi
desenvolvido em colaboração com diferentes Departamentos da Universidade do Estado
do Rio de Janeiro e Serviços da área Biomédica do Hospital Universitário Pedro Ernesto,
UERJ, atestando o caráter multidisciplinar da pesquisa .
xii
1
1. INTRODUÇÃO
Células vermelhas do sangue (CVS) são marcadas com tecnécio-99m (99m
Tc) e
usadas em diferentes aplicações em medicina nuclear1-4
. O processo de marcação de
estruturas celulares e moleculares com 99m
Tc depende de um agente redutor e o cloreto
estanoso (SnCl2) tem sido o agente redutor mais utilizado5
. Tem sido sugerido, para CVS,
que o transporte do íon pertecnetato para o meio intracelular ocorra através do sistema de
transporte transmembrana do tipo banda-36
, enquanto o transporte do íon estanoso
ocorreria através de canais de cálcio7
. A ligação do 99m
Tc, agora com número de oxidação
reduzido, ocorreria, principalmente, na cadeia da beta hemoglobina6
.
Estudos têm mostrado que drogas naturais e sintéticas podem alterar a marcação
de constituintes sanguíneos com 99m
Tc. Os dados obtidos nestes trabalhos científicos têm
estimulado a utilização de procedimentos que envolvam esta marcação de com 99m
Tc
como em ensaio in vitro para análise de propriedades químicas de fármacos sintéticos e
produtos naturais8-10
.
A análise morfológica qualitativa e quantitativa tem sido utilizada como um método
para avaliar se os efeitos dos fármacos no processo de radiomarcação poderiam estar
relacionados com alterações na forma das CVS9
.
Cordia salicifolia (C. salicifolia), conhecida popularmente como porangaba, Chá de
Bugre, café do mato ou bugrinho, é um arbusto (8 a 12m de altura), com caule de
diâmetro entre 30 e 40cm, pertencente à família das Boraginacea. É nativa do Brasil, mas
também é encontrada em florestas tropicais da Argentina e Paraguai. No Brasil, a árvore é
botanicamente classificada como C. salicifolia e no Paraguai a mesma árvore é
classificada como C. ecalyculata Vell. Extratos de porangaba são usados na medicina
popular como supressor de apetite e tosse, diurético, febrífugo e estimulante. Poucos
2
dados experimentais ou clínicos estão disponíveis sobre suas propriedades
farmacológicas no PubMed (www.pubmed.com), mas alguns de seus efeitos sobre o
sistema cardiovascular11
, ações antiviral12
, cicatrizante13
, além de efeito citotóxico14
foram
descritos. Dados sobre a análise fitoquímica do extrato de porangaba também são
escassos e, atualmente, sabe-se que frutos vermelhos ou bagas de porangaba contêm
cafeína, potássio, alantoína e ácido alantóico13
.
Propriedades físicas do extrato de porangaba não foram encontradas na literatura
(PubMed). Uma propriedade física útil e que pode ajudar a caracterizar e estimar o grau
de pureza ou a determinar a concentração de uma substância ou solução é o índice de
refração15
. Condutibilidade elétrica e o perfil do espectro de absorbância são outros
parâmetros físicos que podem ser utilizados para caracterizar uma solução de
composição desconhecida, como um extrato de plantas medicinais9
.
Poucos são os dados experimentais disponíveis sobre as características físicas,
bem como os efeitos biológicos do extrato de porangaba, apesar de sua popularidade no
Brasil. A utilização de diferentes ensaios e testes pode permitir a avaliação e obtenção de
mais informações sobre as características físicas e possíveis mecanismos de ação das
substâncias presentes neste produto natural. Esses fatos têm estimulado o estudo de
efeitos biológicos de um extrato aquoso de porangaba (ExPo) na marcação de
constituintes sanguíneos com 99m
Tc e na morfologia de CVS isoladas de ratos Wistar.
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Radiofarmácia Experimental,
Departamento de Biofísica e Biometria, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes,
UERJ em colaboração com o Serviço de Medicina Nuclear do Hospital Universitário Pedro
Ernesto, UERJ. Os experimentos foram possíveis através de convênio firmado entre a
UERJ e a UFRN, sob a orientação do Professor Doutor Mario Bernardo Filho, e na
vigência dos auxílios concedidos pela CAPES, FAPERJ e CNPq.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Aplicações do tecnécio-99m em Saúde
As aplicações das radiações ionizantes e de elementos radioativos são de grande
interesse em Ciências da Saúde como um meio de auxiliar o diagnóstico e o tratamento
das doenças. Os avanços no conhecimento para a manipulação e controle dos elementos
radioativos têm permitido que os processos envolvidos na sua produção, no seu
armazenamento e no seu uso se tornassem cada vez mais seguros5.
Em medicina nuclear, os radionuclídeos podem ser utilizados como fontes de
radiação, onde o meio biológico recebe apenas as radiações emitidas pelo radionuclídeo
usado, e como traçadores (radiofármacos), o próprio radioisótopo é incorporado no meio
biológico que se deseja estudar5, 16.
O tecnécio-99m (99mTc) é o radionuclídeo mais utilizado para obtenção de imagens
cintilográficas em medicina nuclear17. Isto se deve por este radionuclídeo apresentar
propriedades que favorecem a sua utilização, tais como: (i) um metal de transição do
grupo 7; (ii) decaimento com uma meia vida de 6 horas; (iii) emissão de radiação gama
com energia de 140 keV, (iv) é facilmente eluído de gerador Molibdênio-99/Tecnécio-99m
(99
Mo/99m
Tc); (v) rejeitos radioativos praticamente desprezíveis. Além disso, os números
de oxidação mais estáveis são +7 e +4, mas outras formas com número de oxidação
entre -1 a +7 também são encontradas, o que possibilita a marcação de inúmeras
estruturas de interesse biomédico de variadas formas químicas5, 18.
O 99m
Tc é obtido em gerador 99
Mo/99m
Tc na forma de pertecnetato de sódio
(Na99m
TcO4), sendo que nesta forma química, o 99mTc é pouco reativo devido ao número
de oxidação (+7)17. Assim, para a marcação de moléculas e células, o 99mTc necessita da
redução de sua valência. Entre os agentes redutores empregados, o cloreto estanoso tem
sido o mais usado5.
4
2.2. Marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc: aplicações em Saúde e
modelo experimental
Hemácias marcadas in vitro com 99mTc são utilizadas para obtenção de imagens
diagnósticas de hemorragias gastrintestinais19, fluxo sanguíneo arterial periférico20,
hemangiomas hepáticos21, carcinoma renal22, retículo endotelial esplênico23, tromboses
veínicas24. Além disso, a marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc tem sido
utilizada como modelo experimental, conveniente e útil para o estudo de propriedades
químicas de fármacos sintéticos e extratos de plantas medicinais12, 14, 25.
Na ligação 99mTc-hemácias tem sido sugerido que: (i) o íon estanoso (Sn+2) é
transportado através de canais de cálcio para o interior das células, ligando-se ao
componente celular; (ii) o íon pertecnetato vai para o meio intracelular através do sistema
de transporte transmembrana do tipo banda-3; (iii) ao mesmo tempo, o íon pertecnetato,
dentro da célula na presença do Sn+2 é reduzido e se liga principalmente à cadeia-beta da
hemoglobina26, 27.
Na técnica da marcação de hemácias com 99m
Tc, na forma de pertecnetato, esse
radionuclídeo também pode estar ligado às proteínas plasmáticas dependendo, da
concentração do agente redutor e do tempo de incubação considerado28, 29.
2.3. Hemácias: morfologia e modelo experimental
As células do sangue são geralmente estudadas em distensões preparadas pelo
espalhamento de uma gota de sangue sobre lâminas de vidro para microscopia de luz30.
Os eritrócitos ou hemácias dos mamíferos são anucleados e, em humanos, tem a
forma de disco bicôncavo, com 7,5µm de diâmetro, 2,6µm de espessura próximo à sua
borda e 0,8µm no centro. As hemácias são flexíveis, passando facilmente pelas
bifurcações dos capilares mais finos, sem se romperem. A concentração normal de
hemácias no sangue é de aproximadamente 5 x 109 por mm3 no homem30, 31, 32.
5
A composição interna das hemácias é mantida à custa de mecanismos que
requerem energia. A membrana que reveste a hemácia é semipermeável, permitindo a
passagem de água e eletrólitos32, 33.
As hemácias apresentam alterações em sua morfologia as quais podem refletir
estados de anormalidade do organismo. O conhecimento de tais alterações pode ser
utilizado no diagnóstico de doenças34.
2.4. Plantas medicinais: utilização na medicina popular e efeitos biológicos
Está amplamente evidenciado na literatura que as plantas medicinais possuem
uma variedade de substâncias, os fitoquímicos, que podem apresentar propriedades
antioxidantes, anticarcinogênicas35, ação antiplaquetária36, bem como antimicrobianas e
antifúngicas37, podendo agir na estabilização da membrana mitocondrial e aumento de
sua função, como quelante de metais, na estimulação do sistema de defesa antioxidante
da célula e na indução de apoptose em células pré-neoplásicas e neoplásicas36.
A marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc pode ser alterada por uma
variedade de fármacos sintéticos e plantas medicinais14, 29, 38.
2.5. Cordia salicifolia: utilização na medicina popular, efeitos biológicos e
caracterização de extrato aquoso
A C. salicifolia, pertencente à família das Boraginacea, popularmente conhecida
como porangaba, é uma planta originária do Brasil, Argentina e Paraguai. Apesar do
pouco conhecimento sobre suas propriedades terapêuticas, o chá de porangaba tem sido
utilizado popularmente como um produto que auxilia a perda de peso como supressor do
apetite, redutor da celulite ou depósitos de gorduras, diurético, regulador da função renal,
cardiotônico e estimulante da circulação, além de propriedades antiviral e de inibição do
crescimento de células tumorais39. Os componentes químicos do chá de porangaba já
6
identificados incluem a cafeína, a alantoína e o ácido alantóico40.
Propriedades físicas do ExPo não foram determinadas até o presente momento
(www.pubmed.com). Uma propriedade física útil para caracterizar e estimar a pureza ou
para determinar a concentração de uma substância ou de uma solução é o índice de
refração41. A condutibilidade elétrica e o perfil do espectro da absorbância são outros
parâmetros físicos que poderiam ser determinados e usados para caracterizar uma
solução de composição desconhecida, tal como um extrato de uma planta medicinal29.
Poucos dados experimentais estão disponíveis sobre os efeitos biológicos de
extratos de porangaba, apesar de seu uso no Brasil40. A utilização de diferentes ensaios
poderia permitir a obtenção de mais informações sobre as características físicas e o
possível mecanismo de ação das substâncias presentes neste produto natural.
2.6. Efeitos de produtos naturais na marcação de constituintes sanguíneos com
99mTc e na morfologia de hemácias
Pelo fato dos produtos naturais estarem presentes na dieta ou como
medicamentos, eles podem alterar a marcação de constituintes sanguíneos com 99m
Tc7, 29,
42. Entretanto, esta interação ainda não está completamente compreendida, o que poderia
acarretar alterações nos resultados obtidos em exames de medicina nuclear, levando a
um diagnóstico incorreto e à necessidade da repetição do procedimento43.
Tem-se descrito que doenças44 e drogas7, 11 poderiam alterar a forma das hemácias.
Assim, a análise da forma e de alguns parâmetros morfométricos, tais como o perímetro e
a área das hemácias, vem sendo utilizada para avaliar propriedades relacionadas com a
membrana eritrocitária29, 45. Além disso, a análise morfológica qualitativa e quantitativa
tem sido usada como um método para avaliar se os efeitos de produtos naturais neste
processo de radiomarcação poderiam estar relacionados às mudanças na forma de
glóbulos vermelhos11, 29.
7
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12
4. INDEXAÇÃO DE ARTIGOS
4.1. Artigo publicado
13
14
15
16
17
18
5. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES
Todo profissional que busca a excelência no desempenho e vislumbra a
possibilidade de ser um formador de opinião e um multiplicador de conhecimentos,
precisa hoje cumprir uma etapa marcante e fundamental na carreira acadêmica: o
mestrado.
A educação continuada, através de um curso de pós-graduação strictu sensu,
possibilita ao aluno participar das mudanças no contexto social decorrentes dos avanços
tecnológicos, a partir do aperfeiçoamento, capacitação e qualificação técnica, bem como
agregar valores inerentes ao cientista: investigação, crítica e criatividade.
Ingressar no Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte foi uma experiência ímpar. Ainda que cumprindo créditos
e exercendo as atividades acadêmicas e científicas em outra Universidade (UERJ).
Cursar as disciplinas em diferentes departamentos e compartilhar experiências e o
conhecimento com profissionais das áreas mais diversas foi muito enriquecedor.
A convivência com mestres e doutores, alunos de iniciação científica, mestrandos e
doutorandos foi um grande desafio. Um ambiente restrito, cujo crivo não é apenas o
saber, mas o aprimoramento do saber, o compromisso com a ciência e a dedicação no
estudo em desenvolvimento. Entretanto, o mais desafiador foi desenvolver um projeto em
modelos experimentais, avaliando efeitos biológicos e interações entre drogas naturais e
sintéticas com material radioativo, linha de pesquisa do Laboratório de Radiofarmácia
Experimental do Departamento de Biofísica e Biometria (UERJ), local onde desenvolvi
minha pesquisa.
Estar vinculado a uma Instituição Pública de Ensino Superior me proporcionou
inúmeras vantagens. Docentes altamente capacitados; bibliotecas com acervo moderno;
autonomia proporcionada aos alunos, os quais são estimulados a publicar; parceria entre
os departamentos de pesquisa e entre Instituições são alguns exemplos.
19
Entretanto, como todo serviço público, as restrições orçamentárias estão presentes
e prejudicam muitos projetos. A restrição do número de “bolsas de estudo” impede a
dedicação integral do discente, visto que o trabalho remunerado é uma necessidade real
para muitos. A carência de recursos humanos (secretário ou auxiliar administrativo) e
recursos materiais (por exemplo computadores), podem ser citados como pontos críticos
nas condições gerais do desenvolvimento de uma pesquisa científica. Contudo, as
dificuldades foram superadas com o trabalho em equipe e a boa vontade de todos os
integrantes do grupo de pesquisa.
Como biólogo, investigar os efeitos biológicos de produtos naturais era pertinente.
A escolha de um produto natural que tivesse efeitos biológicos diversos e com boa
aceitação popular no mercado foi meu primeiro passo investigatório. A porangaba (Cordia
salicifolia), uma planta largamente empregada na medicina popular, tem despertado
interesse de alguns pesquisadores, especialmente na América do Sul, onde tem sido
investigada por inúmeras propriedades e daí a curiosidade de estudá-la.
O desenvolvimento dos experimentos descritos nesta dissertação baseou-se nos
modelos experimentais de marcação de hemácias com material radioativo (99mTc) e na
morfologia de sangue de animais. No tratamento in vitro amostras de sangue isoladas de
animais foram incubadas com extrato de porangaba. Esse modelo é bem estabelecido,
com diversas publicações em revistas indexadas.
Este estudo, apesar de ser uma pesquisa experimental, tem caráter multidisciplinar.
Foi realizado em colaboração com o Setor de Medicina Nuclear e o Laboratório de
Endocrinologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto – UERJ e através do convênio
entre duas universidades públicas, a UERJ e a UFRN. Essas parcerias possibilitaram
novas idéias e perspectivas, além de agregar conhecimentos de diferentes áreas.
Os resultados deste estudo viabilizaram a publicação de um artigo original
intitulado: “Assessment of effects of a Cordia salicifolia extract on the radiolabeling of
20
blood constituents and on the morphology of red blood cells” em revista internacional de
impacto relevante, Journal of medicinal food, com índice de impacto 1,3 (referente ao ano
de 2006) e Qualis A internacional.
Em outros estudos em paralelo, um artigo que está no prelo, intitulado:
“Acetylsalicylic acid and morphology of red blood cells” em revista internacional de
impacto relevante, Brazilian Archives of Biology and Technology, com índice de impacto
0,353 (referente ao ano de 2008) e Qualis B Internacional, bem como a co-autoria de
outros três artigos, “Cinnamomum zeylanicum extract on the radiolabelling of blood
constituents and the morphometry of red blood cells: In vitro assay” (Applied Radiation and
Isotopes - 2008), “Effects of a Chronic Sucralose Sweetener on the Labeling of Blood
Constituents with Technetium-99m, Morphology of Red Blood Cells and the Biodistribution
of Sodium Pertechnetate in Rats” (Brazilian Archives of Biology and Technology - 2008) e
“Acetylsalicylic acid decreases the labeling of blood constituents with technetium-99m”
(Acta Biologica Hungarica – 2007).
Verificou-se, através de pesquisa bibliográfica e experimental, que as substâncias
presentes nos extratos vegetais podem produzir efeitos que possibilitem uma alteração no
processo de marcação de hemácias com 99mTc, assim como na morfologia das células
vermelhas.
Neste estudo, o objeto de pesquisa foi a Cordia salicifolia, uma planta
popularmente conhecida como porangaba, chá de bugre, café do mato ou ainda bugrinho.
O produto foi adquirido na forma de apresentação em folhas e pequenos galhos, mas foi
utilizado na forma de extrato aquoso para a metodologia aplicada.
Observou-se que no tratamento in vitro o extrato de porangaba foi capaz de
diminuir significativamente (p<0,05) a porcentagem de radioatividade nos compartimentos
celulares e na fixação das proteínas celulares e plasmáticas. Os resultados obtidos para a
morfologia de hemácias sugerem que o tratamento in vitro não altera a forma nem a razão
21
perímetro/área.
Os dados obtidos neste trabalho são de relevante importância por descreverem
algumas das interações entre a porangaba, como planta medicinal e os constituintes
sanguíneos marcados com 99mTc, como radiobiocomplexos. Além disso, até o momento
não foram encontrados relatos dos efeitos de extratos de porangaba sobre radiofármacos.
Embora, os resultados apresentados sejam experimentais, podem ser úteis para
compreensão de problemas associados à interpretação inadequada de exames de
medicina nuclear e/ou à necessidade de repetição deste tipo de procedimento clínico em
pacientes que estejam fazendo uso da porangaba como planta medicinal.
A porangaba vem sendo largamente estudada em diferentes áreas, seja nas
ciências biomédicas ou na química ou ainda na indústria farmacêutica. Portanto colaborar
com o meio científico com informações da pesquisa básica pode em algum aspecto trazer
esclarecimentos sobre o tema.
Assim, fica o sentimento de contribuição para o progresso da ciência e, por
conseguinte, para o desenvolvimento da sociedade.
22
6. APÊNDICES
6.1. Carta de aceite de artigo no prelo
23
6.2. Artigo no prelo
ACETYLSALICYLIC ACID AND MORPHOLOGY OF RED
BLOOD CELLS
Jacques Natan Grinapel Frydman1,2
, Adenilson de Souza da Fonseca2,*
, Vanessa Câmara da Rocha2,
Monica Oliveira Benarroz1,2
, Gabrielle de Souza Rocha1,2
, Marcia de Oliveira Pereira1,2
, Mario José
Pereira3 and Mario Bernardo-Filho
2
1Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Rio Grande do
Norte, Brasil.
1Departamento de Biofísica e Biometria;
3Departamento de Fisiologia, Instituto de Biologia
Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Avenida 28 de Setembro 87,
fundos, 20551-030, Rio de Janeiro, Brasil.
ABSTRACT
Acetylsalicylic acid (ASA) is a classical antipyretic, analgesic, anti-inflammatory and for
secondary prevention of thrombotic phenomenon in the heart, brain and peripheral circulation. Undesirable gastric effects can occur at therapeutic doses. This work has evaluated the effect of in vitro
and in vivo treatment with ASA on the morphology of the red blood cells. Blood samples or Wistar rats
were treated with ASA during 1 hour. Blood samples or animals treated with saline were used as control group. Blood smears were prepared, fixed, stained and the qualitative and quantitative morphology of red
blood cells were evaluated under optical microscopy. Data showed that the in vitro treatment during 1
hour with ASA at higher dose used significantly (p<0.05) modified the perimeter/area ratio of the red
blood cells. No morphological alterations were obtained with the in vivo treatment. ASA acid use at highest doses may interfere on shape of red blood cells.
Keywords: Acetylsalicylic Acid; Blood Cells; Morphology
Corresponding author.
INTRODUCTION Acetylsalicylic acid is a classical
nonsteroidal antipyretic, analgesic and anti-
inflammatory drug and in the United States alone, 35,000 kg are consumed daily (Jack, 1997). Its
actions are based on irreversible inhibition of
cyclooxygenases 1 and 2 that are responsible for
the prostaglandin synthesis and some autacoids (Catella-Lawson, 2001; Amann & Peskar, 2002;
Aude & Mehta, 2002). The anti-thrombotic action
of acetylsalicylic acid is due mainly to its antiplatelet action (Grotta et al., 1985; Catella-
Lawson, 2001; Insel, 2001) but it has been
postulated that the inhibition of oxidative stress could be related to ability of this drug to prevent
cerebrovascular accidents (Sagone & Husney,
1987; Guerrero et al., 2004).
On the other hand, acetylsalicylic acid at
therapeutic doses could induce gastrointestinal adverse effects as gastric ulceration, erosive
gastritis, gastrointestinal hemorrhage and
exacerbation of peptic ulcer symptoms (Bollini et al., 1992), as well as ions imbalance associated to
respiratory alkalosis with increased Na+, K
+ and
bicarbonate excretion (Lauwerys & Bernard,
1989; Nuyts et al., 1989). Morphometric analysis has been used to
evaluate morphological changes induced in
different cellular systems: (i) chronic ocular hypertensive effects on thickness of retinal nerve
fiber layer and optic disc structure (Shimazawa et
al., 2006), (ii) relationship between infarct-related artery stenosis and capillary density (Prech et al.,
2006) and (iii) effects of sexual hormones on
mamma gland (Pompei et al., 2005). Red blood
cells have been proposed as a prototypical cellular system
regarding drug mediated plasma membrane effects
(Li et al., 1999). Different techniques have
demonstrated that therapeutic drugs can modify
24
the structure and morphology of these cells
(Nwafor & Coakley, 1986; Scheiman & Elta,
1990; Li et al., 1999; Shacter & Weitzman, 2002; Suwalsky et al., 2003; Hubner et al., 2005; Santos
et al., 2005; Zhang et al., 2005). The
morphometric analysis (area, shape and volume measurements) has been used to evaluate the
alterations induced by natural products and
synthetic drugs on membrane of red blood cells
(Oliveira et al., 2002; Moreno et al., 2004). The aim of this work was to evaluate the
effect of in vitro and in vivo treatment with
acetylsalicylic acid on the morphology of the red blood cells.
MATERIAL AND METHODS
Animals Adult male Wistar naive rats (3-4 month
of age, body weight 250-350g) were housed, five
per cage, in an environmental controlled room. Animals had free access to water and food and
ambient temperature was kept at 25 2oC.
Experiments were conducted in accordance with
the Department Committee of Animal Care.
Drugs
Commercial acetylsalicylic acid used in
this study was purchased from Bayer (Aspirin , Brazil).
In vitro treatment with acetylsalicylic acid
Samples of heparinized whole blood were
treated during 1 hour with acetylsalicylic acid at different doses (0.01, 0.10 and 1.00 mg/mL).
Blood samples treated with 0.9% NaCl were used
as control group. These concentrations were
chosen to be similar the plasma levels found in
human beings under antiinflammatory therapy
with this drug (Insel, 2001).
In vivo treatment with acetylsalicylic acid
Wistar rats (n=9) were treated during 1
hour with acetylsalicylic acid at different doses (1.5, 3.0 and 6.0 mg/kg, intragastric
adminstration) and after heparinized whole
blood were withdrawn. Animals (n=10) treated
with saline solution (0.9% NaCl, intragastric
adminstration) were used as control group.
These doses are similar to used in
antiinflammatory therapy with this drug (Insel,
2001) and experimental investigations
(Guerrero et al., 2004).
Morphological evaluation of red blood cells
Histological preparations were carried out with blood samples in vitro or in vivo treated with
acetylsalicylic acid during 1 hour at room
temperature, or with NaCl 0.9% as control group. Blood smears were prepared, dried, fixed and
staining by May-Grünwald-Giensa method
(Junqueira & Carneiro, 2002). After that, the images of red blood cells were acquired
(Optronics, Japan) from blood smears to
qualitative morphology analysis under optical
microscopy (x1000). To morphometric analysis of red blood cells the perimeter/area ratio was
obtained from images by specific program (Image
ProPlus Software). Morphological analysis were
carried out by blind way by a specialist in
histological analises.
Statistical analysis Data are reported as means ± SD of
perimeter/area ratio and they were compared
between the treated and control group by One way analysis of variance - ANOVA, followed by
Bonferroni post test with a p<0.05 as significant
level. InStat Graphpad software was used to perform statistical analysis (GraphPad InStat
version 3.00 for Windows 95, GraphPad Software,
San Diego California, USA).
RESULTS
The figures 1 and 2 show the
photomicrographs of the blood smears from blood in vitro treated with 0.9% NaCl solution (control)
and with acetylsalicylic acid at the highest
concentration used (1.0 mg/mL), respectively. The qualitative morphological analysis by the
comparison between these figures suggests that
the acetylsalicylic acid induces important changes
on the shape of the red blood cells. The figure 3 shows the perimeter/area
ratio for red blood cells from blood samples in
vitro treated with acetylsalicylic acid at different concentrations. The analysis of these data
indicates that acetylsalicylic acid significantly
(p=0.014)
modifies the perimeter/area ratio of red blood
cells at the higher concentration used.
25
FIGURE 1: Photomicrography of blood smears
from blood samples in vitro treated with 0.9%
NaCl solution (control group). Samples of whole blood from Wistar rats were treated with 0.9%
NaCl solution during 60 minutes. Blood smears
were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red
blood cells was evaluated under optical
microscopy (x1000) after image capture.
FIGURE 2: Photomicrography of blood smears
from blood samples in vitro treated with
acetylsalicylic acid. Samples of whole blood from
Wistar rats were treated with acetylsalicylic acid (1.0 mg/mL) during 60 minutes. Blood smears
were prepared, dried, fixed and staining by May-
Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was evaluated under optical
microscopy (x1000) after image capture.
FIGURE 3: Effects of acetylsalicylic acid on the perimeter/area ratio of red blood cells from blood
in vitro treated. Samples of whole blood from
Wistar rats were treated with acetylsalicylic acid
at different concentrations during 60 minutes. Blood smears were prepared, dried, fixed and
staining by May-Grünwald-Giensa method. The
morphology of red blood cells was evaluated under optical microscopy (x1000) after image
captures of five fields for each smear and five
smears for each acetylsalicylic acid concentration. After that, morphometric measurements
(perimeter and area) were carried out and
perimeter/area calculated.
The figures 4 and 5 show the
photomicrographs of the blood smears from blood
in vivo treated with 0.9% NaCl solution (control) and with acetylsalicylic acid at the highest dose
used (6 mg/kg), respectively. The qualitative
morphological analysis by the comparison between these figures suggests that the in vivo
acetylsalicylic acid not induce important
modifications in the shape of the red blood cells.
The figure 6 shows the perimeter/area ratio for red blood cells from blood samples in
vivo treated with acetylsalicylic acid at different
doses. The analysis of these data indicates that in vivo acetylsalicylic acid not alter significantly
(p=0.749) the perimeter/area ratio of red blood
cells.
DISCUSSION
The data obtained in this work have
showed that in vitro or in vivo acetylsalicylic acid has not effect on morphology of red blood cells at
doses similar to used in anti-thrombotic,
antipyretic or anti-inflammatory therapy (figures 3, 5 and 6). However, in vitro acetylsalicylic acid
at the higher dose studied (1.0 mg/mL) could alter
the morphology of red blood cells as observed by
*
26
qualitative analysis and confirmed by
morphometric measurement of perimeter/area
ratio (figures 2 and 3).
FIGURE 4: Photomicrography of blood smears
from blood samples in vivo treated with 0.9% NaCl solution (control group). Wistar rats were
treated with NaCl 0.9% solution during 60
minutes. After that, blood samples were withdraw,
blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The
morphology of red blood cells was evaluated
under optical microscopy (x1000) after image capture.
FIGURE 5: Photomicrography of blood smears from blood samples in vivo treated with
acetylsalicylic acid. Wistar rats were treated with
acetylsalicylic acid (6.0 mg/kg) during 60 minutes. After that, blood samples were withdraw,
blood smears were prepared, dried, fixed and
staining by May-Grünwald-Giensa method. The
morphology of red blood cells was evaluated under optical microscopy (x1000) after image
capture.
FIGURE 6: Effects of acetylsalicylic acid on the
perimeter/area ratio of red blood cells from blood
in vivo treated. Wistar rats were treated with acetylsalicylic acid at different concentrations
during 60 minutes. After that, blood samples were
withdraw, blood smears were prepared, dried,
fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was
evaluated under optical microscopy (x1000) after
image captures of five fields for each smear and five smears for each acetylsalicylic acid
concentration. After that, morphometric
measurements (perimeter and area) were carried out and perimeter/area calculated.
Different techniques have been used to
evaluate the effects of the interaction between drugs and plasma membrane. Using a photometric
method it was demonstrated that derivates but not
acetylsalicylic acid are capable of induce changes in red blood cell shape (Li et al., 1999). However,
in an in vitro study was verified that
acetylsalicylic acid at highest doses could increase the deformability and osmotic fragility of the
membrane of red blood cells (Bilto, 1999). By
electron spin resonance spectroscopy it was
demonstrated that human beings submitted to highest doses of acetylsalicylic acid presented
structural changes of the membrane of red blood
cells (Mazorow et al., 1985).
It was demonstrated that 30 minutes after
a single dose of 0.65g, only 27% of acetylsalicylic
is in acetylated form due its metabolism in
plasma, liver and erythrocytes (Amann & Peskar, 2002). About 50% of acetylsalicylic acid are de-
acetylated to salicylate already during and
immediately after its absorption (Amann & Peskar, 2002). In this condition acetylsalicylic
acid reaches detectable plasma level at 30 minutes
but the higher plasma concentration occurs only after 1 hour (Insel, 2001). However, our data
suggest that the acetylsalicylic
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 1.5 3.0 6.0
Acetylsalicylic Acid (mg/kg)
Pe
rim
ete
r/A
rea
Ra
tio
27
acid concentration reached 1 hour after in vivo
treatment could be low and no alterations on
membrane shape could be observed. This hypothesis was confirmed by in vitro treatment at
high dose (1.0 mg/mL) where modifications on
membrane shape were observed (figures 2 and 3).
Acetylsalicylic acid at normal dose
(10mg/kg/day) can cause peroxidation in human
erythrocytes increasing glutathione peroxidase
and catalase activities but without to change the susceptibility to oxidation (Durak et al., 2001).
Other authors reported decreasing of
glutathione levels in Wistar rats after
acetylsalicylic acid treatment at 10mg/kg with
plasma levels about 10 g/mL (Guerrero et al., 2004). In fact, it was hypothesized that gastric
damage induced by acetylsalicylic acid may be
connected with the degradation of the lipid components of the cellular membranes (Javor et
al., 1986). Salicylates may cause direct cellular
toxicity via inhibition of membrane transport properties (Scheiman & Elta, 1990). Other data
have demonstrated that acetylsalicylic acid can
alter the inward calcium currents by voltage-gated
Ca+2
channels (Greffrath et al., 2002; kim et al., 2001). Indeed, salicylates uncouple oxidative
phosphorylation leading diminished cellular ATP
concentrations at pharmacologic relevant doses (Cronstein et al., 1994). This effect may alter ions
balance ATP-dependent and induce alterations on
membrane. These mechanisms could be involved
in effects of in vitro acetylsalicylic acid on membrane of red blood cells for us observed.
In conclusion, acetylsalicylic acid at doses
similar to anti-thrombotic, antipyretic, analgesic or anti-inflammatory therapy could be not capable
but at toxic doses alterations on membrane of red
blood cells could be induced.
RESUMO
O ácido acetilsalicílico (AAS) é uma
droga com ação antipirética, analgésica, anti-inflamatóra e para prevenção de eventos
trombóticos no coração, cérebro e circulação
periférica. Efeitos gástricos indesejados podem ocorrer em doses terapêuticas. Este trabalho
avaliou o efeito do tratamento in vitro e in vivo
com AAS na morfologia dos eritrócitos. Amostras de sangue ou ratos Wistar foram tratadas com
AAS durante 1 hora. Amostras sangüíneas ou
animais tratados com salina foram utilizados
como grupos controle. Distensões de sangue foram preparadas, fixadas, coradas e a análise
morfológica qualitativa e quantitativa dos
eritrócitos foi realizada em microscópio óptico.
Os dados mostraram que o tratamento in vitro
durante 1 hora com AAS na maior dose utilizada
modificou significativamente (p<0.05) a relação perímetro/área dos eritrócitos. Não foram obtidas
alterações morfológicas com o tratamento in vivo.
O uso do AAS em doses altas poderia interferir na forma dos eritrócitos.
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