universidade federal do rio grande do norte … · À minha querida família, pois, sem ela, ......

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA

LABORATÓRIO DE CRONOBIOLOGIA CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

APRENDIZADO ESPACIAL-TEMPORAL EM UM AMBIENTE COMPLEXO SEM RESTRIÇÃO ALIMENTAR EM RATOS

ALEXSANDRO LAMARCK DUARTE OLIVEIRA

Natal 2007

ALEXSANDRO LAMARCK DUARTE OLIVEIRA

APRENDIZADO ESPACIAL-TEMPORAL EM UM AMBIENTE COMPLEXO SEM RESTRIÇÃO ALIMENTAR EM RATOS

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Psicobiologia da UFRN, como condição necessária para obtenção do Grau de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. John Fontenele Araújo Co-orientador(a): Dra. Verônica S. Valentinuzzi

Natal 2007

À minha querida família, pois, sem ela, não teria tido forças para prosseguir nessa jornada de formação profissional e pessoal. Em especial à minha mãe, minha fortaleza nas horas difíceis, a mais fiel torcedora do meu sucesso e a mais sincera crítica dos meus erros e acertos.

“Think of me long enough To make a memory Come bless the child one more time” Nightwish – Bless the Child “Nós nos tornamos, por meio da força de um acidente evolutivo glorioso chamado inteligência, os guardiões da continuidade da vida na Terra. Não pedimos para exercer esse papel, mas não podemos recusá-lo. Podemos não estar preparados para ele, mas estamos aqui.” Stephen Jay Gould

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS 07

INTRODUÇÃO 10

OBJETIVOS 19

HIPÓTESES 20

ARTIGO 21

ABSTRACT/RESUMO 22

INTRODUCTION 23

METHODS 27

SUBJECTS 27

ACTIVITY RHYTHM RECORDING 28

APPARATUS 28

PROCEDURE 29

DATA ANALYSIS 31

RESULTS 32

LEARNING BEHAVIOR 32

CIRCADIAN ACTIVITY RHYTHM 34

DISCUSSION 36

REFERENCES 40

DISCUSSÃO 42

CONCLUSÃO 46

REFERÊNCIAS 47

Alexsandro Lamarck Duarte Oliveira 7

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha família, que sofreram pela minha ausência e se felicitaram

com minha volta. Ao meu pai, que me inspirou com suas três faculdades. Em

especial gostaria de agradecer à minha linda avozinha Stela, matriarca da família.

Sem ela não estaríamos aqui. Meus tios Regina e Gonzaga, pessoas extremamente

sensatas que sempre estiveram presentes na minha vida, tanto nos momentos bons

quanto nos ruins. À minha irmãzinha “preferida” Adriana, que depois de tantas

“briguinhas de irmãos” e de tanta “arenga”, descobri a imensa saudade que tenho

dela. Por ironia a distância nos aproximou ainda mais. Meu cunhadão Rafael, que

torna a vida da minha irmã mais alegre e plena, além de ser uma pessoa incrível e

de estar se mostrando um verdadeiro amigo. À Imeuda, esposa do meu tio Gonzaga

e à Isabel, esposa do meu pai, pessoas que entraram recentemente na minha vida e

já desempenham um papel importante. Ao meu irmãozinho, que ainda não tem

idade pra compreender o que esta etapa significa, mas que um dia lerá estas

palavras e saberá que, mesmo que não tenhamos muito contato, eu gosto muito

dele.

Ao meu orientador John, que pacientemente agüentou meus erros e

sabiamente elogiou meus acertos. Deu-me orientação quando eu estava perdido e

foi meu modelo de cientista, com o qual pretendo seguir espelhando. À minha co-

orientadora Verônica que foi a idealizadora deste projeto. Apesar de ter-mos tido

momentos difíceis, tornamo-nos bons colegas e espero conseguir manter contato

mesmo depois de terminada essa jornada. Ao seu marido José, que desenhou e

construiu o labirinto utilizado neste experimento.


Aos meus queridos colegas de Mestrado Flávio, Fabiana, Seba, Márcio,

Crhis, Bruno e Karla, só pra citar alguns, pois fica a sensação de que teria que

copiar a lista de matriculados no curso para não esquecer ninguém.

Aos professores que sempre me ajudaram nas disciplinas do curso Arrílton,

Fabíola, Fátima Arruda, Fátima Campos, Fívia, Jéferson, Mirian, Carolina,

Alexandre. Grandes mestres que com grande habilidade tentaram me passar uma

pequena parcela do seu vasto conhecimento.

Aos meus queridos colegas da graduação Breno, Kathiane e Cinthya, que me

ajudaram nos experimentos. Sem vocês não teria conseguido conciliar todas as

tarefas do Mestrado. Mesmo durante a copa do mundo e nos finais de semana,

estávamos lá, fazendo experimento, cuidando dos ratinhos ou limpando a sala de

experimentos. Aos meus queridos animais experimentais, sempre esquecidos nos

agradecimentos, obrigado. Sem eles não teria como ser feito nenhum experimento.

Ao meu amigo Del, companheiro de quarto que de tanta ajuda foi durante

todo o tempo que passei em Natal. Vivemos como uma família durante dois anos:

brigamos e comemoramos como irmãos. Fomos confidentes nos momentos difíceis

dos nossos relacionamentos e amigos nos momentos de necessidade. Nas

qualificações, nas festas e no momento de vir embora estivemos sempre juntos.

Sem ele a saudade de casa e as dificuldades de morar sozinho pela primeira vez

teriam me feito desistir. Também sei que fui de grande ajuda quando foi sua vez de

querer desistir. Obrigado amigo!

Um parágrafo especial é dedicado à minha mãe. Seria lugar-comum

agradecê-la por ter me colocado no mundo, me dado de comer e me medicado,

pago minha educação e meu lazer. Por tudo isso eu sou grato. Mas ela fez mais que

isso. Ela nunca ria quando aos 5 anos eu dizia que seria cientista. Ela nunca fez


nenhum tipo de pressão para eu ser médico ou advogado, mas sim para que eu

escolhesse uma profissão que me agradasse e me deixasse realizado. Só o que ela

pedia era para que eu fosse bom naquilo que eu escolhesse. Ela chorou quando eu

passei no vestibular, chorou quando eu colei grau, vibrou quando eu passei na

seleção do mestrado. Deu-me carões quando eu tirei notas baixas, me deu

parabéns quando eu tirava notas altas. Levava-me ao colégio para aulas das

olimpíadas de ciência na sexta série. Ia comigo comprar material para as feiras de

ciência e ainda me ajudava a fazer, mesmo sem saber direito o que estava fazendo.

Ouvia minhas indagações filosóficas com paciência e ainda as discutia comigo.

Suportou minha fase dos “porquês” durante muito, muito tempo. Enfim, foi a pessoa

com quem eu sempre pude contar quando eu arranjava uma namorada nova e

quando eu terminava com ela. Suporta meus momentos de raiva, de estresse e de

depressão e sempre tenta me colocar pra cima. Está sempre por perto quando eu

preciso e o melhor de tudo, não pede nada em troca. Por isso e por tantas outras

coisas eu só tenho a dizer: Mainha, nós conseguimos!

Agradecimento final ao CNPq, CAPES e FAPERN pelo apoio financeiro deste

trabalho.


1. INTRODUÇÃO

Animais e plantas mudam conforme o clima, a hora do dia, as estações do

ano, enfim, a vida manifesta-se como movimento permanente. Essa dinâmica pode

ser então considerada como um dos aspectos essenciais da organização dos seres

vivos (Menna-Barreto, 2003). Esses processos biológicos que variam

periodicamente são conhecidos como ritmos biológicos.

Podemos classificar os ritmos biológicos em dois tipos: (1) reativo, quando

apenas reagem a estímulos ambientais; e (2) preditivo, quando antecipam

fenômenos naturais. Essa antecipação é possível quando está relacionada a

eventos ambientais que se repetem regularmente ou à manutenção da dinâmica do

meio interno (Menna-Barreto et al, 2003).

Outra classificação é em relação ao tamanho do período dos ritmos (Marques

et al, 2003). Os ritmos biológicos com períodos que vão de 20 a 28 horas são

chamados circadianos e sua freqüência é de um evento por dia (p.ex. o ciclo

sono/vigília). Ritmos com períodos menores que 20 são chamados de ultradianos e

acontecem várias vezes ao dia (p.ex. os batimentos cardíacos). Já os ritmos com

períodos maiores que 28 são chamados infradianos. Estes últimos somente se

repetem depois de muitos dias, como o ciclo menstrual (Marques et al, 2003).

Os ritmos biológicos se caracterizam por persistirem em ambientes com

condições constantes (p.ex. luminosidade constante). Quando os ritmos se

expressam nestas condições dizemos então que estão em livre-curso, isso denota

seu caráter endógeno. É essa endogenicidade dos ritmos que proporciona a

capacidade antecipatória aos eventos cíclicos do ambiente e do meio interno das


espécies. Outra característica dos ritmos biológicos é a capacidade de sincronizar a

um ciclo do ambiente ou do meio interno.

A eficiência funcional de um organismo depende dessa sincronização. Esta

consiste na harmonização das fases dos ritmos endógenos com aquelas dos ciclos

ambientais (Marques et al, 2003). Aos ciclos geofísicos do ambiente que promovem

essa sincronização chamamos de Zeitgeber, um neologismo alemão que quer dizer

“doador de tempo” (Menna-Barreto et al, 2003). Entretanto, não só os ciclos

geofísicos constituem-se em zeitgebers, mas também outros eventos periódicos do

ambiente, tais como os ciclos de disponibilidade de alimento, dentre outros.

Os organismos necessitam então de sistemas de temporização capazes de

gerar e de sincronizar esses ritmos endógenos. Todos os sistemas de temporização

são formados por pelo menos três elementos. São eles: 1) uma via de entrada da

informação ambiental; 2) um oscilador para a geração e regulação dos ritmos; e 3)

vias de saída (Marques et al, 2003). Um exemplo que ilustra bem essa organização

é o sistema de temporização circadiana em mamíferos. A via de entrada são os

olhos, o oscilador principal é o núcleo supraquiasmático e uma das vias de saída é a

glândula pineal, que produz a melatonina. Este hormônio é liberado durante a fase

escura do dia (Arendt, 2005).

Quando nos referimos aos ritmos endógenos estamos nos referindo a uma

capacidade inata destes ritmos de antecipar acontecimentos que se repetem em

intervalos relativamente regulares de tempo. Para tanto, o sistema circadiano

necessita, de algum modo, lembrar dos fatos que aconteceram anteriormente para

poder prevê-los no futuro, seja de modo consciente, seja de modo inconsciente.

Portanto, necessitamos compreender melhor como funcionam os mecanismos de

aprendizado e memória.


Segundo Kandel, o aprendizado e a memória definem a base biológica da

individualidade (Kandel et al, 2000). Podemos definir memória como sendo o

armazenamento e recordação de experiência passada (Goldman et al., 2002). A

memória parece ser o produto de sistemas múltiplos, sendo a distinção mais básica

feita entre os sistemas de memória implícita, ou não-declarativa, e memória explícita,

ou declarativa (Kandel et al, 2000).

Figura 1: Classificação dos tipos de sistemas de memória. A memória declarativa é

dependente da consciência, enquanto a memória não-declarativa independe da consciência.

A memória explícita codifica a informação sobre eventos autobiográficos ou o

conhecimento de fatos, enquanto a memória implícita tem uma qualidade automática

e reflexiva e sua formação e recordação não são dependentes de processos

conscientes (Kandel et al, 2000). As memórias explícitas podem ser recuperadas por

ato consciente de recordação, enquanto a implícita se acumula lentamente pelas

repetições de várias sessões de treino e são expressas pela melhora do

desempenho (Squire & Kandel, 2003).

O aprendizado na memória implícita pode ser avaliado pelo treinamento

repetitivo do sujeito em uma tarefa, observando-se a melhora do desempenho deste.

A partir desta avaliação progressiva, produz-se uma curva de aprendizado (Kandel


et al, 2000), que é uma avaliação de como o desempenho melhora com o

andamento das sessões de treino.

Evidências apontam uma modulação do funcionamento do sistema de

temporização pela aprendizagem e vice-versa. Uma dessas evidências é a de

Golombek et al (1994) onde eles demonstraram que a glândula pineal ou as vias que

a inervam, podem “aprender” a responder, ou seja, a liberar melatonina, quando um

estímulo não-específico (disponibilidade de água), que havia sido pareado com o

estímulo ambiental sincronizador normal (o início da fase escura), era apresentado

sozinho. Também foi demonstrado que distúrbios no ciclo claro/escuro produzem

prejuízo na memória em tarefas de esquivas passiva (Holloway & Wansley, 1973;

Davies et al, 1974). Em particular, memórias dependentes de hipocampo, como

memória espacial, são afetadas por distúrbios da organização circadiana em ratos,

como demonstrado por Devan e colaboradores (2001) utilizando o Labirinto Aquático

de Morris. Nesse experimento, animais submetidos a alterações do ciclo

claro/escuro tiveram dificuldades em aprender a localização de uma plataforma

submersa. Percebe-se então uma interação entre os sistemas de memória e o

sistema circadiano.

Precisamos ter em mente que os organismos em forrageamento precisam

saber explorar os eventos regulares, tanto espaciais quanto temporais, da

disponibilidade de alimento no ambiente (Mistlberger, 1994). Muitos alimentos

apresentam uma variação temporal e espacial na sua disponibilidade e a habilidade

de aprender a prever essa variação confere uma vantagem adaptativa ao animal.

Essa habilidade de aprender a variabilidade de eventos biologicamente significantes

que ocorrem em determinado momento do dia é chamada de Aprendizado Espacial-

Temporal (Thorpe & Wilkie, 2005). Neste caso, o organismo estabelece uma


associação entre um evento temporalmente distribuído (disponibilidade temporal do

alimento) e a sua localização espacial. Experimentos anteriores (ver Aragona et al,

2002; Lukoyanov et al, 2002) demonstraram que várias espécies de animais são

capazes de organizar suas atividades diárias, particularmente aquelas relacionadas

à disponibilidade de alimento, usando a hora do dia como uma pista discriminativa.

Quando essa disponibilidade de alimento se restringe a eventos bem

definidos ao longo do dia, seja um ou mais, muitos animais apresentam o fenômeno

da Atividade Antecipatória Alimentar (FAA em inglês, Food Anticipatory Activity), que

consiste em um considerável aumento da atividade do animal antes da liberação da

comida em um ou mais momentos do dia. Quando mantidos em restrição temporal

de alimento (ou seja, se o alimento estiver disponível apenas uma vez por dia, na

mesma hora), os ratos apresentam um aumento da atividade (FAA) cerca de uma

hora antes do momento da disponibilidade de alimento (Mendoza et al, 2005;

Ángeles-Castellano et al, 2006). Este fenômeno está associado não apenas ao ritmo

de atividade, mas também a vários outros ritmos, incluindo ritmos de temperatura

corporal e de cortisol plasmático (Mistlberger, 1994; Stephan, 2001). Mistlberger

após uma revisão crítica, indicou que modelos teóricos, tipo relógio de ampulheta ou

processos de aprendizado associativo isolados eram inadequados para explicar

várias propriedades da FAA. Dentre essas propriedades podemos citar a

persistência da atividade antecipatória durante privação alimentar (Davidson &

Stephan, 1998). Adicionalmente, foi demonstrado que os animais continuam a

apresentar FAA mesmo quando seu núcleo supraquiasmático (NSQ) for lesionado

(Mistlberger, 1994), sugerindo um mecanismo oscilatório independente do NSQ para

geração da FAA. Mistlberger chamou esse mecanismo de Oscilador Sincronizável

pelo Alimento (FEO em inglês, Food Entrainable Oscillator).


Há evidências de que FAA e Aprendizado espacial-temporal estão sob o

controle deste FEO. Além de ambos os processos revelarem uma capacidade de

desenvolver um comportamento antecipatório (Valentinuzzi, 2002), ambos são

independentes do NSQ, uma vez que mesmo quando os animais têm este núcleo

cerebral lesionados cirurgicamente, eles continuam a apresentar um bom

desempenho na tarefa espacial-temporal (Mistlberger et al, 1996). Adicionalmente,

quando submetidos a uma tarefa de aprendizado espacial-temporal, onde deveriam

discriminar dois eventos temporais e espaciais de disponibilidade de alimento

distintos, associada a uma dieta hipocalórica ou de restrição alimentar, os animais

apresentam FAA (Aragona et al, 2002).

Entretanto, o FEO ainda não foi localizado com precisão e evidências

sugerem que este seja um sistema difuso (Pereira de Vasconcelos et al, 2006).

Tentativas de se achar um núcleo cerebral responsável pelo comportamento

antecipatório, o que evidenciaria o FEO, foram realizadas utilizando-se lesões em

regiões discretas relacionadas com a regulação da ingestão alimentar e do

metabolismo energético, especialmente no hipotálamo e no tronco cerebral. Tais

lesões não obtiveram sucesso em abolir por completo o FAA (Mistlberger, 1994;

Stephan, 2001), à exceção de lesões na região parabraquial e no núcleo accumbens

leva a uma redução significante na FAA (Davidson et al, 2000; Mendoza et al, 2005).

Durante esta atividade antecipatória, diferentes áreas do cérebro de ratos são mais

requisitadas do que outras. Em animais onde foi injetado a 2-desoxiglucose (2-DG),

e posteriormente submetidos a uma sincronização por um pulso diário de

alimentação, verificou-se que algumas áreas apresentavam maior consumo da 2-

DG. Estas áreas foram: o núcleo arqueado, o núcleo paraventricular, o folheto


intergeniculado, o córtex cerebelar e o núcleo pré-óptico medial (Pereira de

Vasconcelos et al, 2006).

Quando vemos as áreas que parecem estar envolvidas no processo de

formação da memória espacial-temporal, observamos uma semelhança com as

envolvidas no FAA supracitadas. Aragona et al. (2002) ao investigarem o papel de

diversos neurotransmissores em distintas regiões cerebrais em animais submetidos

a uma tarefa espacial-temporal, encontraram uma correlação significativa entre a

formação da memória espaço-temporal e o aumento nos níveis de dopamina no

núcleo accumbens e no núcleo paraventricular do hipotálamo.

Um dos conceitos que parece ser um consenso entre os pesquisadores é que

os animais só seriam capazes de formar esse tipo de aprendizado em situações

onde sua sobrevivência estivesse ameaçada. Lukoyanov et al. (2002) sugerem que

a restrição alimentar é um forte fator de influência para a formação da memória

espacial-temporal. Em seus experimentos utilizando o labirinto aquático de Morris,

Lukoyanov dividiu os seus animais em dois grupos, um recebeu alimentação ad

libitum e o outro foi submetido a restrição alimentar. Posteriormente, foram treinados

a uma tarefa espacial-temporal, onde deveriam aprender a disponibilidade temporal

de uma fonte de alimento. Somente o grupo submetido à restrição foi capaz de

formar memória espaço-temporal.

Outro trabalho importante que tentou elucidar a capacidade de formação de

memória espacial-temporal em ratos foi o de Widman et al. (2004). Eles afirmaram

que o aumento no custo de resposta à tarefa pode ser um fator ainda mais forte do

que a restrição alimentar na formação dessa memória. Enquanto os trabalhos

anteriores somente obtiveram sucesso em observar a formação de memória

espacial-temporal em animais sob restrição alimentar, o grupo de Widman


conseguiu que os animais formassem tal memória apenas aumentando o custo de

resposta dos animais ao treino espacial-temporal. Eles treinaram os animais no

labirinto aquático de Morris, divididos em dois grupos. O protocolo utilizado foi o

mesmo de Lukoyanov et al (2002) sendo que um dos grupos de animais recebeu um

peso adicional às costas, de cerca de 10% de seu peso corporal, aumentando assim

o esforço físico necessário para completar a tarefa. O grupo que recebeu o peso

adicional conseguiu um bom desempenho na tarefa espacial-temporal, enquanto o

grupo que não recebeu o peso falhou na tarefa.

Apesar de aparentemente diferentes, podemos enquadrar o acréscimo no

custo de resposta por parte dos animais e a restrição alimentar dentro das situações

de ameaça à integridade física do animal. Widman et al (2004) argumentam que,

embora não tenha utilizado um protocolo de restrição alimentar, seus animais ainda

sim podem ter consultado o FEO para obtenção de um bom desempenho na tarefa a

que foram submetidos. Seu argumento é que o aumento no esforço pra completar a

tarefa tenha aumentado a demanda energética dos animais, não tendo sido suprida

pela alimentação ad libitum. Entretanto, ainda não foi verificada esta hipótese em

experimentos posteriores.

Manipulações apropriadas das condições experimentais também podem

facilitar ou dificultar a aquisição da memória espaço-temporal. Um bom exemplo

dessa influência das condições experimentais são os experimentos de Aragona et al

(2002). Eles utilizaram uma caixa experimental de 40cmX40cmX30cm onde haviam

dois comedouros com as entradas posicionadas uma ao lado da outra, cada qual

disponibilizava alimento uma vez por dia em horários alternados. No primeiro grupo,

ele verificou que a presença de uma fonte de água próxima a um dos comedouros

estava causando uma preferência por parte dos animais para esse comedouro tanto


durante a sessão em que este disponibilizava alimento quanto na sessão seguinte

(onde não disponibilizava alimento). Quando foi modificada a localização da fonte de

água, ficando esta localizada no meio das duas entradas para os comedouros, os

animais formaram uma preferência para os comedouros corretos em cada sessão.

Apesar disso, como essa preferência não foi estatisticamente significativa, não é

possível afirmar que os animais formaram de fato uma memória espacial-temporal.

Um outro fator que pode interferir no aprendizado é que em muitos

experimentos as manipulações experimentais são feitas apenas durante a fase de

claro dos animais. O registro de atividade locomotora que poderia informar possíveis

alterações no ciclo sono/vigília desses animais foi de certo modo negligenciado em

todos os experimentos anteriores. Não sabemos, portanto quais os efeitos que uma

tarefa espacial-temporal exerce sobre o ritmo circadiano de atividade locomotora dos

animais, bem como se a fase circadiana em que são realizados os treinos interfere

na resposta comportamental.

Para avaliar a integração entre os sistemas funcionais que controlam a

memória e os ritmos circadianos estudamos a capacidade de ratos aprenderem a

emitir uma resposta comportamental associando tanto informações espaciais quanto

temporais. Tendo em vista que manipulações do ambiente experimental podem

interferir no processo de aprendizado espacial-temporal, nossos experimentos foram

conduzidos num aparato modificado, com o intuito de aumentar a complexidade da

tarefa, causando assim um aumento cognitivo no custo de resposta por parte dos

animais; uma pequena modificação da proposta feita por Widman et al (2004).


2. OBJETIVO GERAL

O presente trabalho teve por objetivo investigar a capacidade dos animais de

aprenderem uma tarefa espacial-temporal em um ambiente complexo sem restrição

alimentar, bem como se esta tarefa afeta o ritmo circadiano de atividade locomotora.

2.1 Objetivos Específicos

1- Investigar se o enriquecimento do ambiente contribui com a formação de

memória espacial-temporal sem restrição alimentar.

2- Investigar como a tarefa espaço-temporal afeta o ritmo circadiano de

atividade locomotora.


3. HIPÓTESES

Hipótese 1: Os animais aprendem a descriminar o local (espaço) e o

momento (tempo) em que o alimento está disponível em cada sessão de treino.

Predição 1: O tempo gasto para entrar nos comedouros reforçados

são menores que o tempo gasto para entrar nos comedouros não-reforçados

em cada sessão de treino e nas sessões de teste;

Predição 2: A freqüência de entrada nos comedouros reforçados são

maiores que a freqüência de entrada nos comedouros não-reforçados em

cada sessão de treino e nas sessões de teste;

Hipótese 2: O ritmo de atividade locomotora sofre influência do treino

espacial-temporal.

Predição 1: O ritmo de atividade locomotora apresenta um pico de

atividade antecipatória às sessões de treino.


Time-place learning in a complex environment, in rats without food restriction

Alexsandro Lamarck Duarte-Oliveira, Verônica S Valentinuzzi, John F. Araújo Department of Physiology, Laboratory of Chronobiology, Bioscience Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Brasil. Running title: Time-place learning in a complex environment Grant sponsor: Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Ensino Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Rio Grande do Norte (FAPERN). Correspondence to: John Fontenele Araújo Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Departamento de Fisiologia, Centro de Biociências, Campus Universitário, Lagoa Nova Caixa Postal, 1511. CEP: 59078-970; Natal-RN, BRASIL. Phone: 55 (84) 3215 3409 (Ramal 218); Fax: 55 (84) 3211 9206; E-mail: [email protected]


Abstract. Time-place learning is the capacity of organisms to associate both space and time with a biological relevant stimulus such as food. Experiments are usually done with food restricted animals due to the belief that food system activation is necessary for time-place learning. Another line of thought suggest that, in addition to food system activation, response cost should be increased to effectively allow time-place discrimination. The purpose of this experiment was to test whether a complex environment, which presumably implied in a heightened response cost, would facilitate time-place association in satiated rats using a highly palatable food as reward. Nine rats were trained in a time-place task for 30 non-consecutive days. A large experimental box (1x1m) divided in four compartments was used. To access each compartment the animal had to overcome a series of obstacles such as ramps, staircases and mazes. Two feeders localized in opposite compartments were rewarded with sunflower seeds in two daily sessions. One feeder offered the reward during the morning sessions while the second feeder in afternoon sessions. After the 15th day of training, the animals began to show a preference for the correct feeder during the correct time of day expressed by increased frequency of visits as well as lower latency to access the feeders. These results suggest that satiated animals are also capable of learning a time-space task as far as the experimental context is complex enough to result in a higher response cost. Resumo: O aprendizado espacial-temporal é a capacidade dos organismos em associar espaço e tempo com um estímulo biologicamente relevante, tal como a comida. Experimentos geralmente são feitos com animais em restrição alimentar, devido acreditar-se que a ativação do sistema alimentar é necessária para a memória espacial-temporal. Outra linha de pensamento sugere que, em conjunto com a ativação do sistema alimentar, o custo de resposta deve ser aumentado para efetivamente permitir-se a discriminação espaço-tempo. O propósito desta experiência foi testar se um ambiente complexo, presumivelmente implicando num aumento do custo de resposta, poderia facilitar a associação espaço-tempo em animais saciados, utilizando um alimento altamente palatável como recompensa. Nove ratos foram treinados em uma tarefa espacial-temporal por 30 dias não-consecutivos. Uma caixa experimental grande (1m x 1m x 0,5m) dividida em quatro compartimentos foi utilizada. Para acessar cada compartimento o animal tinha que vencer uma série de obstáculos, tais como rampas, escadas e labirintos. Dois comedouros localizados em compartimentos opostos forneciam sementes de girassol como recompensa em duas sessões diárias. Um comedouro ofereceu recompensa durante as sessões matutinas enquanto o segundo comedouro ofereceu recompensa durante as sessões vespertinas. Depois do 15º dia de treino, os animais começaram a demonstrar uma preferência pelo comedouro correto na hora correta do dia, expressa tanto pelo aumento na freqüência de visitas quanto na diminuição da latência para acessar o comedouro correto. Estes resultados sugerem que animais saciados também são capazes de aprender uma tarefa espacial-temporal, desde que o contexto experimental seja complexo o bastante para resultar num custo de resposta mais alto.


Introduction

Due to the earth's rotation almost all organisms are exposed to a change in

environmental illumination conditions. To anticipate chances and challenges of the

resulting daily variations in their habitat the animals developed an internal timing

system. Light acts as the primary stimulus to synchronize this system with the outside

world.

We need to keep always in mind that a primary task of the foraging organisms

is to explore space and time regularities of the food availability in the environment

(Mistlberger, 1994). Many food sources present temporal and spatial variations in its

readiness and the ability of foreseen that variations confers an adaptive advantage to

the animals. The ability of learning the variability of biologically significant events that

happens in certain moment of the day is called Time-Place Learning (Thorpe &

Wilkie, 2005). In this case, the organism establishes an association among a

temporally distributed event and its space location. Previous experiments (see

Aragona et al, 2002) have demonstrated that several species of animals are capable

to organize their daily activities, particularly those related to the food readiness, using

the hour of the day as a discriminative cue (Lukoyanov et al, 2002).

Experimenters that tried to evaluate the capacity of the rats in form time-place

memory still find quite controversial experimental results about the underlying

mechanisms involved. Previous reports have demonstrated that the rats are only

capable to learn a time-place task when submitted to food or caloric restriction

(Lukoyanov et al., 2002; Mistlberger et al., 1996; Thorpe et al., 2003). However, in

these experiments, they have used only food as a reward for the completion of a

temporal-spatial task.


Recently, Widman et al (2004) have shown that rats are capable of forming

the time-place discrimination when submitted to an increased cost of behavioral

answer without food restriction. They have submitted rats to a time-place task in

Morris' Water Maze with additional weights attached to their bodies. The rats have

learned the correct location of two submerged platforms in two daily sessions, each

one at a specific time of the day. This have show that the animals can discriminate

time and place cues without been in food restriction.

In resume, the animals have different motivations in these experiments. When

the task involves food, the restriction was required to the time-place learning. When

the task involves physical effort, an increase in the weight was sufficient to facilitate

the learning. By the way, in both cases the animals had to be placed into a risk-of-

death condition.

However, appropriate manipulations of the experimental conditions also

facilitates or difficult the formation of the time-place memory. Aragona et al (2002), for

example, even with food restriction could not observe the formation of a time-place

association. They have used an experimental box where the animal had access to

two feeders and a water source. However, they observed that the water source was

nearest to one of the feeders that the other, so they argued that it could have

functioned as a discriminative cue for the animals, which have formed a preference

for the feeder closest to the water. When they changed the location of that water

source, placing it halfway from the two feeder’s entrance, the animals still do not

learned the availability for the correct feeder at the correct time, but they formed a

discrete preference for it.

Another discussion is concerning the behavioral strategy used by the animals

to discriminate the time and place cues. There are three mechanisms of solving a


time-place task: ordinal, interval and circadian. The ordinal mechanisms occurs when

the animals learns the order of events, such as first A after B, independent of the

time of the day. If rats are using this strategy, omissions of the B session will affect

the A session in the next day. The interval mechanisms occurs when the animals

learns the sequence of the sessions A and B along the day. If an A session is omitted

at a day it will affect the B session at the same day, but not in the next consecutive

days. The animals associate the sequence with the beginning of the day, as in a

sand clock that is activated each day. Already in the circadian strategy, the animals

use an endogenous clock to discriminate both the time of the day that a session

occurs and the spatial localization of the biological event (like food readiness).

Omitting the A session, for example, will not disturb the next B session, not even in

the consecutive days (Carr & Wilkie, 1999).

Pizzo & Crystal (2002) have investigated all the three mechanisms. In their

experiments, rats were submitted to a two morning sessions and one afternoon

session (AB-C) or one morning session and two evening sessions (A-BC). Their

results are consistent with interval and circadian representations of time by the

animals.

However, more recently, Pizzo & Crystal (2004) have founded evidences for

an alternation strategy in time-place learning by rats. This time, only two sessions

were given for the animals, separately by approximately 7h. After the rats learned to

visit the correct location at the appropriate time, tests were omitted to evaluate the

three possible mechanisms. Their results suggest that rats were using an alternation

strategy to learn the time-place learning.

Mistlberger (1994) also investigated the strategy that were been used by rats

to track the daily spatiotemporal pattern of food availability. He has found results


consistent with a circadian strategy. Even when submitted to a phase changes in the

photoperiod, the animals continued to visit the correct feeder at the correct session.

Mistlberger have also found that rats with lesions in the Suprachiasmatic Nucleus

(SCN) continued to show good results in the time-place task. So he argued that an

oscillator should exist that is not Entrainable by light cues, but for food availability

cues, a Food Entrainable Oscillator (FEO). This oscillator would be also responsible

for the Food Anticipatory Activity (FAA), an increasing of the animal’s activity just

before the liberation of the daily meal, when this one is given at the same time of the

day, day-by-day. So, even when not presented to the food, the animals can access

the FEO, anticipating the meal. A possible mechanism that might allow for this

activation of the FEO without the specific presentation of food would be to suggest

that food restriction allows a general activation of a system of feeding similar to that

propose by Timberlake (Timberlake, 2001; Timberlake and Lucas, 1989) which

includes access to and activation of the FEO.

So, it seems that the FAA and the Time-place learning are both controlled by

the same oscillator; however, there is only little evidence of where are the neural

correlates of this oscillator. Aragona et al (2002) have investigated also endogenous

factors that may affect this behavior in rats. They have found significant correlations

between the level of FAA and the amount of dopamine turnover in the nucleus

accumbens and paraventricular nucleus of the hypothalamus, indicating possible

involvement or regional dopaminergic activity in time-place learning. Additionally,

they haven’t found correlations between FAA and dopamine turnover when rats were

entrained to only one meal per day.

An aspect that has been neglected in previous experiments is the possible

interference of the time-place training in the circadian activity rhythm of the animals.


Many of those prior experiments have trained the animals during the light phase of

the day, so in the rest phase of the animals (Lukoyanov et al, 2002, Pizzo & Crystal,

2002, Pizzo & Crystal, 2004). So, without that accompaniment, it is not possible to us

know which consequences for the circadian activity rhythm these manipulations

brings, even if it interferes with their sleep-wake cycle, once they are nocturnal

animals and they are sleeping on the light phase of the day.

In this report we have evaluated the capacity of rats to learn to emit a

behavioral answer associating the both space information and the time of the day in

a complex environment, that requests a cognitive increase answer cost, without food

deprivation. We also wanted to know what influences the time-place tasks have on

the circadian motor activity rhythm.

2. Methods

2.1 Subjects

Nine male Wistar rats, varying from 26 to 28 days old, born in our laboratory

were used. Animals were weaned around the 27th day of birth and group-housed (3

per cage) in standard rodent cages (32 cm x 17 cm x 40 cm). Food and water were

available ad libitum and temperature was maintained constant at 22 ± 3°C. Weaning

was considered day 1 of the experimental procedure since this is when the animals

were placed in a new light-dark cycle and activity recording as well as human

handling began, as will be explained later.

An additional, similar group of nine animals maintained in the same conditions

were kept undisturbed in their cages inside another light-tight cabinet as controls of

the motor activity rhythms.


2.2 Activity rhythm recording

Cages were placed in a light-tight, ventilated wooden cabinets (160 cm X 49

cm X 57 cm) under a 12:12h light/dark (LD) cycle. The motor activity rhythm of the

animals was monitored continuously by an automatic system based on infrared

sensors. In these cabinets the LD cycle was controlled, where lights went on at

00:00h. Light (350 lux) in each cabinet was provided by one 30-W fluorescent bulb

localized in the lower back wall. Localized on top of each cage (15 cm above the

cage lid) was an infrared sensor. Any movement within the cages was continuously

detected every 5 minutes and saved using a home-made computer program. The

activity data were displayed in actograms using the El Temps® software (Diez-

Noguera, 1999) and were used to monitor entrainment to the LD cycle, confirm if

behavioral testing occurred at the desired circadian phase, and if the testing

procedure affected rhythmicity. Animals were placed in these conditions 11 days

before behavioral tests began.

2.3 Apparatus

We used a wooden square labyrinth (100x100x50cm) divided in four

interconnected compartments of the same size named A, B, C and D (50x50x50cm)

(Figure 1). To access each compartment the animals had to overcome a series of

obstacles such as ramps, staircases and mazes. Two feeders were located in

opposite compartments (compartment A and C). These feeders consisted simply in

two wooden boxes (20x30x10cm) open in the front and top. The labyrinth was placed

in the center room that contained several distal cues. These cues included a table

with a computer, the recording equipment and the synchronization cabinets. All the


cues were kept in the same place during the entire experiment. A video camera was

placed directly above the center of the labyrinth (128 cm from the middle top point) to

allow behavioral recording. Light intensity at the level of the labyrinth floor was

maintained constant in 3 lux during all sessions. With this manipulation we intended

to eliminate possible influences of the light as a discriminative cue and to avoid total

darkness, which would not allow behavioral recording.

Figure 1: Schematic draw of the experimental apparatus

2.4 Procedure

The experiment protocol was divided in five stages: habituation 1, habituation

2, pre-training, training and testing. The first day of weaning, in which the animals

were placed in the synchronization cabinets, was considered day 1. Manipulations

occurred in non consecutive days (most of them were consecutive) and, except the

Habituation 1 stage, all manipulations occurred in two daily sessions. The first

session occurred 3 hours before lights offset (ZT9) while the second 3 hours

following lights offset (ZT15).


a) Habituation 1. Starting at weaning, all animals were handled, at random times

each day, during 11 days. With this procedure we intended to habituate the animals

to human contact and in this way reduce the stress associated with manipulation.

b) Habituation 2. This stage had the purpose of habituating the animals to the

experimental chamber as well as to the handling involved in the experiment. The

three animals of each cage were placed together in the labyrinth and allowed to

explore the apparatus during two daily 10-min sessions. This occurred during two

days

c) Pre-training. During 15 non-consecutive days animals were placed individually in

the labyrinth in two daily 5-min sessions. Each day the animal sequence as well as

the starting compartment (B or C) was randomly assigned.

d) Training. This stage followed the same protocol of the pre-training sessions,

except that a food reward was placed in one or another feeder according to the

session. Compartment “A” always offered food during the first sessions (ZT9) while

compartment “D” during the second sessions (ZT15). The food reward consisted in

sunflower seeds and two sugar pellets (NOYES® Precision Pellets, 45mg). This

stage lasted 30 non-consecutive days.

e) Testing. One day after the last training session the animals were submitted to a

test session which was similar to training except that no food reward was provided.

The purpose was to determine if the animals were using cues other than time of day,

such as odor, to find the reward.

All the sessions were video recorded. Two independent observers analyzed

the tapes, one being blind to the identification of animals and sessions. Two

behavioral measures were registered from the videotaped sessions. These were


latency to reach each feeder and frequency of visits. Entrance in the feeders was

defined as head and forepaws in.

Back in their homecages in the light-tight cabinets animals were submitted to

constant dark for three weeks while their activity rhythm continued to be registered in

order to determine the phase of the free-running period. We intended with this to see

the behavior of some aspects, found in the activity rhythm’s graphs (if they persist in

free-running).

Experiments were in compliance with the institutional guidelines of the

Universidade Federal do Rio Grande do Norte and Sociedade Brasileira de

Neurociência e Comportamento.

2.5 Data analysis

Data was analyzed using the mean latency values of the total days of each

stage. Student´s t-test was used to compare the latency between rewarded and non-

rewarded feeder for each stage. In order to visualize behavior evolution over the

training days, the mean latency values of 5-day blocks was calculated.

Frequency analysis was done using a relative frequency formula RF/RF+NRF,

where RF is the frequency of visits to the rewarded feeder while NRF is the

frequency of visits to the Non-rewarded feeder. Since some animals where very

active in the maze while others where not, this was the way we found to normalize

the data. A one-way ANOVA was used in this data where number of blocks was the

factor. Significance levels for latency and relative frequency were set in 0.05.

Graphical output (actograms) and rhythm analysis were undertaken using El

Temps® computer program (Diez-Noguera, Barcelona, Spain). Periodograms were


used to determine significance of the activity peaks and the free-running period under

constant dark. Significance levels were set above 2.85.

3. Results

3.1 Learning behavior

Figure 2 shows the mean latency to reach each feeder during both daily

sessions of each pre-training, training and testing stages. As expected during the

pre-training stage there were no preference for neither of the feeders (ZT9: t=0,50,

p=0,635 and ZT15: t=-1,73, p=0,134). On the other hand, during training animals

showed a significant preference for the rewarded feeder since latency to reach it was

lower compared to the non-rewarded feeder (ZT9: t=-3,186, p=0,019 and ZT15:

t=3,750, p=0,010). This pattern is also maintained during the testing session where

there wasn’t food reward. That is, latency to reach the feeder that had been rewarded

during training was always lower during testing. However, this was only significant at

ZT15 (ZT09: t=-1,399 p=0,106 and ZT15: t=2,198 p=0,035)

Figure 2: Mean latency to reach each feeder, rewarded (RF) and non-rewarded (NRF). The latency was significantly lower for the RF at Training (ZT9: t=-3,186, p=0,019 and ZT15: t=3,750,

p=0,010) and Test (ZT09: t=-1,399 p=0,106 and ZT15: t=2,198 p=0,035)


Figure 3 shows how the animal’s behavior changed over the course of the

experiment, from the pre-training session to the testing session, for both time points

(upper and lower panels). During the pre-training days latency values were high for

both feeders. As training progresses latency values decrease for the both feeders.

However, the values for the non-rewarded feeder begin to increase around the

blocks 2 and 3. This tendency is observed at both time points.

Figure 3: Behavioral evolution of the latency for the both feeders in both sessions. Each block consists of 5 days, except the pre-training, that were grouped all the 15 days. With the training, the curves begin to dissociate: the RF continues to decrease and the NRF begins to increase

around the blocks 2 and 3 (around the 10th and the 15th day of training).


This data is further confirmed when analyzing the relative frequencies showed

in Figure 4. At both time points the frequency of visits to the correct feeder are lower

during the pre-training sessions and gradually increase in the course of training.

Figure 4: Behavioral evolution of the frequency for the rewarded feeder in both sessions. The curves for RF at ZT9 and ZT15 begin to increase right at the first block of 5 days of training. All

the points at the curves are above the chance line (50%).

3.2 Circadian activity rhythm

Figure 5 shows two representative actograms of the activity of cage of the

control group (left panel) and of another cage of animals submitted to the

experimental stages (right panel) as well as wave form graphs of four different

intervals. In the control group, data from days 1 to 45 was lost due to technical

problems however, we believe that since these animals were maintained undisturbed

during those days, the data after day 45 is representative of the normal activity of this

group.

The wave form graph shows us the mean amount of motor activity during a

determined time interval. Four wave form graphs were obtained, one during the pre-

training stage (days 15 to 29), two during the training stage (days 30 through 54 and


days 55 through 75) and another graph during the constant dark stage (days 76

through 90).

Figure 5: Behavioral (Actograms and Wave form) graphs. A: Control group. B: Experimental group. The arrows labeled in the right panel are the four peaks found in the wave form graphs. The “d” arrow can’t be seen in the beginning of the experiments, while the “a” arrow disappear

in the free-running stage.

Synchronization to a 24h event is revealed when peak activity occurs at

1440min. Clearly animals from both groups showed this peak. However, the animals

submitted to the behavioral manipulations revealed four more additional peaks.

Peaks 2 and 3 represent an increase in activity with periods of 720min and 1080min,

respectively, while peak 4 has a period of 960min (Peak 1 y=39.40; Peak 2 y=8.65;

Peak 3 y=5.71; and Peak 4 y=4.59).

The vertical arrows in Figure 5, labeled “a”, “b”, “c” and “d”, show four activity

peaks observed only in the experimental group. Note that the control group only

shows one activity peak, starting in the beginning of the dark phase and finishing at


the end of the dark phase (T=1440min). This is the expected in well synchronized

animal. During the pre-training stage in the experimental group, the “d” peak is not

very clear. As manipulations progress, the four activity peaks become more evident.

Once in DD the “a” peak disappears completely, while the “b” and the “c” peaks begin

to merge into one. The “d” peak continues, now in free-running. However, again due

to technical problems, and as can e seen in the actograms, part of the data was lost

during the free-running condition.

4. Discussion

Based on the present findings we can suggest that the animals have indeed

learned how to associate the location of the food reward and its temporal availability

without food restriction, unlike what was suggested by prior works (Lukoyanov et al.,

2002; Mistlberger et al., 1996; Thorpe et al., 2003). Besides, these data corroborates

with the suggestion of Widman et al, (2004) that the increased response cost (in this

case, a cognitive increased response cost) is an important consideration when

examining time-place discrimination by rats. Additionally, there are evidences that the

time-place training using food reward promotes changes in the entrainment of the

animals.

There are three factors that could have worked to facilitate the formation of the

time-place discrimination by the rats. First, the decrease of stressful factors. Second,

the use of an enriched environment as a way of increasing the response cost. Third,

the use of very young animals. We will examine each one of these factors separately.

Stress is a known agent that can facilitate the acquisition, retention and/or the

evocation of memories (Squire and Kandel, 2003). However, there are evidences


that chronic stress might induce cognitive impairments that are dependent on the

task and on the stress intensity (Gamaro et al, 1998; Cui et al, 2006). Gamaro et al

(1998) submitted female rats to three kind of behavioral tasks: two-way shuttle

avoidance, inhibitory avoidance and habituation to an open field. They have found

low memory scores or absence of memory in the habituation to an open field and in

two-way shuttle avoidance for the chronic stressed group. In our protocol, we have

included several tactics with the objective of reducing the stress levels. The first was

the constant handling of the animals by all the experimenters, since before the

beginning of the experiment. The second was to use a palatable reward. There are

evidences showing that palatable meals it self promotes entrainment in non-food

restricted rats (Mendoza et al, 2005). Besides, animals in food restriction are

exposed to an alternation of long fasting–short meal intervals, which leads them to a

chronic catabolic state. This can easily activate the feeding system, or FEO (Widman

et al, 2004; Stephan, 2002). Despite the use of a food reward on this time-place task,

we can say the ad libitum feeding schedule could have hindered the access to the

FEO. The third and last tactic used to reduce the stress levels was the group

housing. Placing three related animals into the same home cage allow the

socialization of the animals. We have observed that the animals showed several

social behaviors that might reduce stress, like grooming and pursuit before and after

the experiments. Some evidences, like absence of defecation episodes inside of the

experimental apparatus and of attacks to the experimenters suggest us that the

animals were with stress levels reduced, what can facilitates (or do not difficult)

learning.

Another discussion is about the apparatus used in this experiment. Sharp et al

(1985) demonstrated that exposure to a spatially complex environment can enhance


the synaptic input/output relations between hippocampus perforant path afferents

and dentate granule cells. Additionally, Pham et al (1999) demonstrated that adult

(two months) rats housed into an enriched environment for 12 months had

significantly higher levels of nerve growth factor in the hippocampus, visual and

entorhinal cortices when compared to animals housed into standard cages. Enriched

rats also performed better than isolated rats in acquisition of spatial learning. So the

complex apparatus used in this experiment can be considered as a facilitator

stimulus for the formation of the time-place memory.

The last factor that might have influenced the results is the age of the animals

and the duration of the training. In several prior studies, the animals begins the

experiments when adults (3 or more month year old; Lukoyanov et al., 2002;

Mistlberger et al., 1996; Thorpe et al., 2003; Widman et al, 2004). Sharp et al (1987)

have suggested that the increase in the age of the animals (one group with 14 month

and other with 32 month) decrease the modulation of the hippocampal evoked

responses. They have exposed the both groups to an enriched environment for 11

days and than have returned than to their home cages. The decay of the enhanced

population spike during this period differed markedly between the groups (time

constants of 30 days for the young and 11 days for the old groups).

So, one important issue rises from this discussion. These factors have to be

considered when making a protocol for time-place memory. The size and shape of

the experimental apparatus proposed here may have facilitates the formation of a

time-place discrimination. Also, this was the first experiment that has merged the

prior two points of view. The traditional one that used food reward tasks and the

enhance response cost, proposed by Widman. Increasing the cognitive response


cost, using a complex environment and using palatable meal as a reward, we have

promoted the formation of the time place discrimination.

One last consideration is about the time of the training sessions. Many others

(Aragona et al, 2002; Mistlberger et al, 1996; Widman et al, 2004, Thorpe et al, 2003)

have conducted their experiments in the light phase of the Light-Dark Cycle. That

means that they have had to wake up the animals twice a day to submit them to the

training sessions. This may interfere in the animal’s sleep/wake cycle. There are

evidences that the sleep phase may play an important role in the memory

consolidation (Dave & Margoliash, 2000). As observed in our data, the animals

showed interference in their circadian activity rhythm evidenced by the actograms.

Part of the activity was transferred to the final of the rest phase. We can see that

after the ZT15 session, the animals reduced their activity, like they were in the rest

phase. However, this has yet to be well investigated by further works.

In resume, these and previous data (Mistlberger et al, 1996; Pizzo & Crystal,

2004; Widman et al, 2000; Widman et al, 2004) are consistent with the idea that the

activation of the feeding system is not crucial to the formation of the time-place

discrimination. More, they leave a possible role for an interaction of the FEO and

SCN as a timing mechanism for such discrimination. They do, indeed, suggest that

access to these mechanisms may be facilitated by a cognitive enhanced response

cost. These data also shows that the access to this mechanism interfere with the

circadian activity rhythm. However, additional experiments are required to confirm

and to refine this inference.


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4. DISCUSSÃO

Há três fatores que podem ter agido para facilitar a formação da discriminação

espacial-temporal em nosso experimento. Primeiro, a redução nos fatores

estressores. Segundo, o uso de um ambiente enriquecido como uma maneira de

aumentar o custo de resposta. Terceiro, o uso de animais bastante jovens.

Examinaremos cada um destes fatores separadamente.

O estresse é um conhecido agente que pode interferir a aquisição, a retenção

e/ou a evocação das memórias (Squire & Kandel, 2003). Há evidências de que o

estresse crônico pode induzir prejuízos cognitivos dependendo da tarefa e da

intensidade do estresse (Gamaro et al, 1998; Cui et al, 2006). Gamaro et al (1998)

submeteram ratas a três tipos de tarefas comportamentais: esquiva de mão-dupla,

esquiva inibitória e habituação ao campo aberto. Eles encontraram baixos escores

de memória ou ausência dela na habituação ao campo aberto e na esquiva de mão-

dupla para grupos de animais submetidos a estresse crônico.

Em nosso protocolo, utilizamos diversas estratégias com o objetivo de reduzir

os níveis de estresse. A primeira foi manipulação constante dos animais por parte de

todos os experimentadores, antes dos testes comportamentais. A segunda foi a

utilização de uma recompensa alimentar palatável. No nosso protocolo, os animais

não foram submetidos a qualquer forma de restrição alimentar ou calórica. Com isso

acreditamos ter eliminado um possível estresse causado pela restrição. Animais em

restrição alimentar são expostos a longos períodos de fome e curtos períodos de

alimentação, o que pode levar a um estado catabólico crônico. Isto pode facilmente

ativar o FEO (Widman et al, 2004; Stephan, 2002). Além disso, há evidências de que

alimentos palatáveis são capazes de promover sincronização em ratos não

submetidos à restrição alimentar (Mendoza et al, 2005).


A terceira e última estratégia utilizada para reduzir os níveis de estresse foi o

alojamento dos animais em grupos aparentados. Colocar os animais aparentados

dentro da mesma caixa possibilita a socialização dos mesmos. Nós observamos que

os animais demonstraram diversos comportamentos sociais que podem ter ajudado

a reduzir o estresse, como o grooming e a perseguição, antes e depois das sessões.

Algumas evidências, como ausência de episódios defecação dentro do aparato

experimental e de mordidas nos leva a sugerir que os animais estiveram com níveis

de estresse reduzidos o que pode facilitar (ou ao menos não dificultar) o

aprendizado.

Outro fator que pode ter atuado a favor dos nossos resultados foi a utilização

de um aparato espacialmente complexo como forma de se aumentar o custo de

resposta por parte dos animais. Sharp et al (1985) demonstrou que a exposição a

um ambiente espacialmente complexo pode aumentar a relação Entrada/Saída

sináptica entre as vias aferentes do hipocampo e as células granulares do giro

denteado. Adicionalmente, Phan et al (1999) demonstraram que ratos adultos (dois

meses) alojados por 12 meses dentro de um ambiente enriquecido tiveram níveis

significativamente mais altos de fatores de crescimento neural no hipocampo e

córtices visual e entorrinal, quando comparados a animais alojados em caixas

padrão. Os ratos “enriquecidos” também se saíram melhor do que ratos “isolados” na

aquisição de memória espacial. Portanto, o aparato complexo utilizado neste

experimento pode ser considerado o um fator estimulante para a formação da

memória espacial-temporal.

Dois últimos fatores que podem ter influenciado positivamente nossos

resultados foram a idade dos animais e a duração do treino. Em diversos estudos

anteriores, os animais começaram os experimentos já quando adultos com cerca de


3 ou mais meses de idade (Lukoyanov et al, 2002; Mistlberger et al, 1996; Thorpe et

al, 2003; Widman et al, 2004), enquanto no nosso experimento os animais iniciaram

os procedimentos experimentais por ocasião do desmame, com cerca de 27 dias de

idade. Sharp et al (1987) sugeriram que o aumento na idade dos animais (um grupo

“jovem” de 14 meses e outro “idoso” com 32 meses) diminui a modulação das

respostas evocadas pelo hipocampo. Estas respostas são marcadas por aumentos

nos picos de disparo dos neurônios da região do hipocampo quando o animal é

exposto a uma situação nova, como um ambiente novo, inexplorado. Os animais

foram expostos a um ambiente enriquecido por 11 dias e depois os retornaram para

suas caixas. Foi observado um aumento nos picos do registro eletrofisiológico dos

neurônios hipocampais para ambos os grupos. Entretanto, o tempo de decaimento

desses picos (ou seja, o tempo para que voltassem aos níveis de disparo

anteriormente registrados) foi marcadamente diferente entre os grupos (30 dias para

o grupo “jovem” e 11 dias para o grupo “idoso”). Disso conclui-se que as alterações

promovidas pela exposição ao ambiente complexo demoram mais para desaparecer

em animais mais jovens.

Um ponto importante surge desta discussão. Estes fatores anteriormente

expostos devem ser considerados quando da elaboração de um protocolo para

aprendizado espacial-temporal. O tamanho, a forma e a complexidade do aparato

experimental utilizado no presente experimento podem ter facilitado a formação da

memória espacial-temporal. Além do mais, este foi o primeiro experimento que

conseguiu fundir dois pontos anteriores de vista acerca deste tipo de aprendizado: o

tradicional, que utilizava restrição alimentar como os trabalhos tradicionais de

Lukoyanov; e o mais recente, que utilizou aumento do custo de resposta, proposto

por Widman e colaboradores. Aumentando-se cognitivamente o custo de resposta,


utilizando-se um ambiente complexo e um alimento palatável como recompensa, foi

possível promover a formação da discriminação espacial-temporal.

Uma última consideração é sobre a hora em que são executadas as sessões

de treino. Muitos outros experimentos (Aragona et al, 2002; Mistlberger et al, 1996;

Thorpe et al, 2003) foram conduzidos durante a fase clara do ciclo Claro - Escuro,

talvez por conveniência experimental. Isso significa que eles tiveram que acordar os

animais duas vezes durante sua fase de sono para submetê-los às sessões de

treino. Isto pode ter interferido no ciclo sono/vigília. Existem evidências de que a fase

de sono exerce um papel importante na consolidação da memória (Dave &

Margoliash, 2000). Como observado nos nossos dados, os animais mostraram

interferências em seu ritmo circadiano de atividade, evidenciado pelos actogramas.

Parte da atividade foi “transferida” para o final da fase de repouso. Podemos

observar que depois da sessão ZT15, os animais reduziram sua atividade, como se

estivessem na fase de repouso. Entretanto, esta afirmação necessita ser mais bem

investigada por trabalhos futuros.

Em resumo, dados recentes e anteriores (Mistlberger et al, 1996; Pizzo &

Crystal, 2004; Widman et al, 2000; Widman et al, 2004) são consistentes com a idéia

de que a ativação do oscilador por alimento (FEO) não é crucial para a formação da

discriminação espacial-temporal. Entretanto, estes dados deixam um possível papel

para uma interação entre o FEO e o NSQ como um mecanismo de temporização

para tal discriminação. Nossos dados, de fato, sugerem que o acesso a este

mecanismo pode ser facilitado por um aumento cognitivo do custo de resposta.

Estes dados também mostram que este acesso ou as manipulações experimentais

podem interferir com o ritmo de atividade circadiana. Entretanto, experimentos

adicionais são requeridos para refinar e confirmar esta interferência.


5. CONCLUSÃO

Baseado nos resultados encontrados, podemos sugerir que os animais

realmente aprenderam a associar a localização de uma recompensa alimentar bem

como sua disponibilidade temporal, sem estarem submetidos a restrição alimentar, o

que vai de encontro a alguns trabalhos anteriores. Porém, nossos dados corroboram

com a sugestão de que o aumento no custo de resposta (neste caso um custo de

resposta cognitivo) é um ponto importante a ser considerado quando estudamos a

discriminação espacial-temporal em ratos. Adicionalmente, há evidências de que o

treino espacial-temporal utilizando recompensa alimentar palatável promove

mudanças na sincronização do ritmo circadiano de atividade motora dos animais.


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universidade federal do rio grande do norte … · À minha querida família, pois, sem ela, ......

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