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NATÁLIA RODRIGUES SILVA

IMUNOEXPRESSÃO DA PROTEÍNA BAX EM GRANULOMAS

PERIAPICAIS E CISTOS RADICULARES

NATAL/RN

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIA DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

ODONTOLOGIA

NATÁLIA RODRIGUES SILVA

2

NATÁLIA RODRIGUES SILVA

IMUNOEXPRESSÃO DA PROTEÍNA BAX EM GRANULOMAS PERIAPICAIS E

CISTOS RADICULARES

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao

Departamento de Odontologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte como parte

integrante dos requisitos para obtenção do título

de Cirurgião-Dentista.

Orientadora: Márcia Cristina da Costa Miguel

NATAL/RN

2016

3

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

Silva, Natalia Rodrigues.

Imunoexpressão da proteína Bax em granulamas periapicais e cistos radiculares

/ Natalia Rodrigues Silva. – Natal, RN, 2016.

37 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Márcia Cristina da Costa Miguel.

Monografia (Graduação em Odontologia) – Universidade Federal do Rio Gran-

de do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia.

1. Proteína Bax– Monografia. 2. Imuno-histoquímica – Monografia. 3.

Granuloma periapical – Monografia. 4. Cisto radicular - Monografia. I. Miguel,

Márcia Cristina da Costa. II. Título.

RN/UF/BSO Black D 6

4

NATÁLIA RODRIGUES SILVA

IMUNOEXPRESSÃO DA PROTEÍNA BAX EM GRANULOMAS PERIAPICAIS E

CISTOS RADICULARES

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Departamento

de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de

Cirurgião-Dentista.

Aprovada em: 07/06/2016

_______________________________________

Prof. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Orientadora

_______________________________________

Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Banca Examinadora

_______________________________________

Prof. Dra. Ericka Janine Dantas da Silveira

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Banca Examinadora

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DEDICATÓRIA

Dedico esse TCC a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para que eu

chegasse até aqui, em especial meus pais.

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AGRADECIMENTOS

Há tanto o que agradecer que não sei por onde começar. Irei começar pelo criador de

tudo, pai todo poderoso, Deus - o pai de todos - pois foi quem disse o caminho que deveria

seguir, o curso que deveria fazer, e assim fiz, de acordo com Sua vontade. Obrigada, meu pai,

por toda força, por transformar todo obstáculo parecer uma simples pedra no meu caminho,

obrigada por me fazer forte e sempre me ajudar levantar a cabeça quando as dificuldades

apareciam, que não foram poucas, a Ti devo essa conquista.

Agradeço a Deus por ter me dado duas mães maravilhosas - Maria Rodrigues (avó) e

Graça Maria (mãe). Minha avó que, infelizmente, não está mais entre nós em corpo, mas

que sinto sua presença onde quer que eu vá. A ela, que até seus últimos dias dizia que ia

esperar eu me formar pra que eu fosse cuidar dela, mas ainda continua cuidando, vibrando por

mim lá do céu, devo meu muito obrigado. Minha mãe, meu forte, meu tudo, sem ela também

não teria chegado aqui. Cada noite sem dormir, cada desespero, estresse até mesmo nos dias

de provas, serão sempre lembrados. Obrigada por estar comigo cada minuto, agora é minha

vez de retribuir por tudo isso.

Agradeço pelos dois pais que tenho - Raimundo (avó) e José Rilmar (pai). Meu avô

com seu jeitinho bruto de ser, sempre preocupado se eu estou precisando de alguma, se estou

bem, meu muito obrigado. Meu pai que me deu a oportunidade de sair muito nova de casa

para que eu pudesse ter bons estudos e com muito trabalho permitiu que eu chegasse até aqui.

Eu tinha 14 e hoje, com 25, estou me formando. Demorou um pouco, mas consegui.

Agradeço pelas irmãs que tenho, Gracielle e Gilmara. Irmãs que eu brigo e ao mesmo tempo

estamos rindo, brincando e, agora, comemoram essa vitória. Obrigada, minhas irmãs, por todo

apoio.

Agradeço pela família que me deu, pois todos contribuíram grandemente para minha

formação, estando comigo durante todo período em que estava estudando tanto pra o

vestibular como na graduação. Obrigada por me acolherem em suas casas quando precisei,

por me tirarem dos apertos, enfim, por tudo, vocês foram essenciais para minha formação.

Agradeço a Deus também pelos anjos que colocou em minha vida durante todos esses

anos de estudo. Minhas amigas/irmãs Mellyna e Myllena que estiveram comigo em todos os

momentos, vocês foram mais que amigas, foram minha família quando estava sozinha,

cansada, doente, em todas as vezes que precisei de uma mãozinha. Meus amigos, que sempre

estiveram torcendo, me fazendo rir nos momentos de tristeza, de desespero, de ansiedade, me

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dando todo apoio pra chegar até aqui. Os cursinhos que foram minha segunda casa durante

três anos, Lógico Cursos Aliados e Call, em especial os professores Carlão, Rogerio, João

Maria, Lazaro e Rosemberg, pelo excelente trabalho que fizeram, por serem tão atenciosos,

por me ajudarem muito quando mais precisei. Meus anjos da faculdade Rani, Bianca, Ana

Margarida e Thaís com quem compartilho diariamente meus estresses, risos e medos,

momentos que sentirei muita falta quando tudo isso acabar. Luiz Artur, meu anjo do TCC,

sem você estaria perdida nesse trabalho. Obrigada por ter tanta paciência comigo, por sempre

me socorrer quando não sabia para onde ir, por me fazer rir nos momentos de desespero, por

tornar esse trabalho mais leve. Todos os professores que fizeram parte da graduação, obrigada

pelos ensinamentos e pela paciência de mostrar, explicar quando não tinha habilidade em

algum procedimento.

Agradeço a minha orientadora Márcia Cristina Da Costa Miguel pela oportunidade

que me deu. O projeto trata de um assunto nada fácil, pelo menos a meu ver, mas com as

orientações essenciais que tive consegui concluir. Obrigada pela paciência, pelos

ensinamentos, pelo perfeccionismo que me fez aprender muito, enfim, obrigada por tudo.

Agradeço, por fim, a todas as pessoas que contribuíram na minha formação, foram

tantas que não dá pra colocar todas, mas que lembrarei o que cada um fez e ainda faz por

mim. Agradeço novamente e sempre agradecerei a Deus, pois foi Ele que proporcionou que

todas essas pessoas entrassem em minha vida.

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RESUMO

Objetivo: Avaliar a presença da proteína Bax em linfócitos presentes no infiltrado

inflamatório de GPs e CRs.

Metodologia: Vinte e cinco casos de GPs e 25 de CRs foram submetidos à análise imuno-

histoquímica usando o anticorpo primário anti-bax. A imunoexpressão da proteína Bax foi

quantitativamente avaliada nos linfócitos marcados em 5 campos consecutivos de cada caso

de GP e CR. Então, foi contado o número total de linfócitos imunopositivos em cada campo.

Os dados foram avaliados pelo teste não paramétrico de Mann-Whitney. Foi considerado um

nível de significância de 5% (p < 0,05).

Resultados: Verificou-se a imunoexpressão da proteína Bax em linfócitos de todos os casos

de GPs e CRs, mas não houve diferença estatisticamente significativa entre as duas lesões em

relação à quantificação da imunopositividade à proteína Bax (p=0,236). Assim como também

não foi verificado diferença estatisticamente significativa do infiltrado inflamatório entre as

lesões (p=0,347) e (p=0,476) respectivamente, nem entre a espessura do revestimento epitelial

(p=0,186).

Conclusões: Sugere-se que a imunoexpressão da proteína Bax identificada em linfócitos dos

GPS e dos CRs está implicada no processo de apoptose de linfócitos ativados em resposta à

estimulação antigênica frequente nestas lesões periapicais e que este mecanismo acontece

tanto para limitar o dano aos tecidos saudáveis causados por estes linfócitos ativados e suas

citocinas liberadas, quanto para restaurar a homeostase do sistema imunológico local.

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ABSTRACT

Aim: To evaluate the presence of Bax protein in lymphocytes presented in inflammatory

infiltrate of radicular cysts (RC) and periapical granuloma (PG).

Material and Methods: Twenty-five cases of PG and twenty-five cases of RC were

submitted to immunohistochemistry analysis using a primary antibody anti-bax. The

immunoexpression of Bax protein was quantitatively evaluated on these lymphocytes marking

five fields consecutively in each case of PG and RC. Then, the total number of lymphocytes

immunopositives was counted on each field. All data was evaluated through the non-

parametric Mann-Whitney test. It was observed a significance of 5% (p<0,05).

Results: There were immunoexpression of Bax protein in lymphocytes from all cases of PG

and RC, but it was not observed a statistical significant difference between these lesions and

the number of immunopositivity to Bax protein (p=0,236). There was no statistical significant

in the inflammatory infiltrate from PG (p= 0,347) and PC (p= 0,476), nor between the

thickness of epithelial covering (p= 0,186).

Conclusion: It is suggested that the immunoexpression of Bax protein identified in PG and

PC lymphocytes is related to apoptosis process activated in response to antigens stimulation

on these periapical lesions. This mechanism happens to limit the damage to normal tissue

caused by this activated lymphocytes and its cytokines in order to return the homeostasis to

local immunologic system.

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LISTA DE TABELA E ILUSTRAÇÕES

TABELA 1 Avaliação das diferenças do numero de células Bax+ em granulomas

periapicais e cistos radiculares e suas diferenças em relação ao tipo de

lesão, grau do infiltrado inflamatório e espessura epitelial dos cistos

radiculares..................................................................................................27

FIGURA 1: Imunoexpressão de Bax em lesões periapicais...........................................28

FIGURA 2a: Box plot do número de linfócitos imunopositivos para a proteína Bax no

CR...............................................................................................................29

FIGURA 2b: Box plot da associação do número de linfócitos imunopositivos para

proteína Bax em relação à espessura do epitélio nos CRs.....................30

11

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 13

2 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................... 15

2.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA...................................................................................... 15

2.2 MÉTODO IMUNO-HISTOQUÍMICO........................................................................ 15

2.3 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA........................................................................ 16

2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA...........................................................................................16

3 RESULTADOS .......................................................................................................... 17

3.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA...................................................................................... 17

3.2 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA........................................................................ 17

4 DISCUSSÃO............................................................................................................... 18

5 CONCLUSÃO............................................................................................................ 22

6 REFERÊNCIAS......................................................................................................... 23

7 ANEXOS..................................................................................................................... 31

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Imunoexpressão da proteína Bax em granulomas periapicais e cistos radiculares

NR Silva1, LAB Silva

2, SIM Lourenço

2, ALL Costa

2, EJD Silveira

2, MCC Miguel

2

1 Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN, Brasil.

2 Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Departamento de Odontologia, Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, RN, Brasil.

Palavras-chave: Cisto radicular, Granuloma periapical, Imuno-histoquímica, Linfócitos

Proteína Bax.

Correspondência: Márcia Cristina da Costa Miguel, Programa de Pós-Graduação em

Patologia Oral, Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Av. Senador Salgado Filho, 1787, Lagoa Nova, Natal, RN, Brasil, CEP 59056-000. Tel.: +55

84 3215 4138; fax: +55 84 3215 4138. E-mail: mccmiguel@hotmail.com.

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INTRODUÇÃO

A exposição da polpa dental aos microrganismos e seus subprodutos, como

consequência da cárie dentária, fraturas ou procedimentos operatórios, desencadeia uma

resposta inflamatória local que irá resultar em necrose e consequente envolvimento dos

tecidos periapicais (Queiroz-Júnior et al. 2010, Shiromany et al. 2015). Os produtos

microbianos e a resposta imunológica que atuam no periápice acabam levando à destruição

do tecido periapical, resultando na formação de lesões, como granulomas periapicais e cistos

radiculares (Graunaite et al. 2011).

Os granulomas periapicais (GPs) são compostos por um tecido de granulação

contendo fibroblastos e vasos recém-formados, com um infiltrado inflamatório variável

(Andrade et al. 2013, Faustino et al. 2016). Os cistos radiculares (CRs) são cistos

odontogênicos inflamatórios cuja origem está associada aos restos epiteliais de Malassez que

são estimulados a proliferar como consequência da resposta imunoinflamatória (Martins et al.

2011, Moosvi & Rekha 2013, Bernardi et al. 2015).

O infiltrado inflamatório presente nessas lesões periapicais consiste em uma mistura

de linfócitos T CD4+/ CD8+ e B, neutrófilos polimorfonucleares (PMN), macrófagos, células

dendríticas (DC), células NK, eosinófilos, mastócitos, bem como diferentes citocinas (IL-1,

IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17), interferon-γ (IFN- γ), fator de necrose tumoral (TNF-α)

presentes em diferentes proporções de acordo com o estágio de evolução da lesão (Marçal et

al. 2010, Martín-gonzález et al. 2015). À medida que a infecção se estabelece, uma resposta

imune específica é formada, podendo ser encontrados linfócitos CD4+ e CD8+ difusos no

infiltrado dessas lesões (Philippi et al. 2003). Os linfócitos CD4+ modulam a resposta

inflamatória no periápice através da liberação de citocinas pelos seus subgrupos, como a IL-2

liberada pelas células Th1, que são associadas à destruição do tecido ósseo e a progressão da

lesão, enquanto seus antagonistas IL-4, IL-10 e IL-33 liberadas pelas células Th2 limitam os

danos aos tecidos. Além da Th1/ Th2, as células Th17 também produzem outras citocinas

efetoras com propriedades osteoclastogênicas, tais como IL-6 e IL-23, reforçando o potencial

papel destrutivo nas lesões periapicais (Araujo-Pires et al. 2014). Os linfócitos CD8+, além de

induzirem a morte por apoptose de células infectadas, podem produzir citocinas pró-

inflamatórias como IFN- γ, (TNF-α), fator de necrose tumoral- β (TNF-β) e fator estimulador

de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) (Morishima et al. 2010, Myoung et al.

2012).

14

Um dos mecanismos da morte celular desencadeada pelos linfócitos é a apoptose,

também conhecido como morte celular programada, que desempenha um papel importante no

desenvolvimento e na manutenção da homeostase dentro de todos os organismos

multicelulares (Tekkeşin et al. 2012). Este é um mecanismo geneticamente programado e

tem um importante papel na homeostase da população de células, podendo ser desencadeado

pela via intrínseca ou pela via extrínseca (Loreto et al. 2013).

Dentre as proteínas envolvidas na apoptose, tem-se as proteínas intracelulares que

regulam diretamente o processo de ativação das caspases que constituem a denominada

família Bcl-2. Os membros dessa família podem ser divididos em moléculas pró-apoptóticas

(BAX, BAK, BCL-xs, BAD, BID, BIKHRK, BIM e BOK) e antiapoptóticas (BCL-2, BCL-x,

BCL-w, BFL-1, BRSAG-1, MCL-1, A1, E1B19K, LMW5-HL e EBV BHRF1) (Faria et al.

2006). As proteínas Bcl-2 e Bax são geralmente consideradas como as mais importantes

reguladoras de apoptose e os seus níveis relativos determinam o destino das células. A

proteína Bax é o membro de promoção da morte mais característico da família Bcl-2 (Amaral

et al. 2011). Essa proteína pode produzir heterodímeros com a Bcl-2 (Bax/Bcl-2) ou

homodímeros (Bax/Bax) e desta forma, Bcl-2 suprime a morte celular quando

heterodimerizada com Bax, por outro lado, o homodímero Bax/Bax promove apoptose

(Tekkeşin et al. 2012). O mecanismo de controle da apoptose pelos genes da família Bcl-2

envolve a formação de poros na membrana mitocondrial, permitindo a interação de várias

proteínas envolvidas na regulação da morte celular (Anazzeti & Melo 2007).

Algumas pesquisas analisaram os mecanismos de apoptose associados ao

revestimento epitelial de CRs (Suzuki et al. 2005, Martins et al. 2011, Loreto et al 2013).

Tekkeşin et al (2012), verificaram a forte presença da proteína Bax no revestimento epitelial

de cistos radiculares, sugerindo o aumento da atividade apoptótica no epitélio cístico.

Na revisão de literatura, não foram encontrados estudos que analisem a apoptose

associada aos componentes do infiltrado inflamatório das lesões periapicais. Diante do

exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar a presença da proteína Bax em linfócitos

presentes no infiltrado inflamatório de GPs e CRs.

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MATERIAIS E MÉTODOS

Cinquenta espécimes, incluindo 25 GPs e 25 CRs, obtidos do laboratório de Patologia

Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

foram selecionados de maneira randomizada para o estudo. O diagnóstico patológico das

lesões foi confirmado através da associação entre aspectos clínicos, radiográficos e

histopatológicos. Todos os casos de GPs e CRs foram obtidos a partir de pacientes que não

realizaram tratamento endodôntico prévio nos dentes associados às lesões. O estudo foi

aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Número do

parecer: 398.669).

Análise morfológica

Para o estudo histomorfológico, foram utilizadas lâminas com cortes de 5μm de

espessura do material incluído em blocos de parafina, corados pela técnica da

Hematoxilina/Eosina que posteriormente foram escaneadas com auxílio do equipamento

Scanner Panoramic MIDI (3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest,

Hungary, H-1121). As imagens foram analisadas através do programa de visualização

Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest,

Hungary, H-1121) em diferentes amplitudes. Foi avaliada a intensidade do infiltrado

inflamatório em todos os espécimes. A partir da porção mais central dos GPs e da região

subepitelial dos CRs, em direção à periferia, foi avaliado 1 campo microscópico, sob aumento

total de 33,33x, o qual foi dividido em três terços. As lesões foram então classificadas da

seguinte forma: grau I (leve), infiltrado inflamatório restrito ao primeiro terço; grau II

(moderado), infiltrado inflamatório até o segundo terço; grau III (intenso), infiltrado

inflamatório até o terceiro terço, adaptado do estudo de Tsai et al. (2004). O revestimento

epitelial dos CRs foi avaliado adaptando-se o critério sugerido por Moreira et al. (2000), onde

CRs que apresentaram em sua maior extensão 2 a 10 camadas de células foram classificados

como atróficos e os que revelaram mais de 10 camadas de células foram classificados como

hiperplásicos.

Método imuno-histoquímico

As amostras selecionadas, fixadas em formol a 10% e incluídas em parafina foram

submetida a cortes de 3μm de espessura, os quais foram estendidos em lâminas de vidro

devidamente preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropiltrietoxisilano,

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Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Posteriormente, o material foi submetido ao

anticorpo primário anti-Bax (A3533, Dako Carpinteria, CA, USA) com uma diluição de

1:1000-overnight. Posteriormente, as amostras foram incubadas no sistema HI DEF (HRP,

Polymer System) de detecção. A diaminobenzidina (3,3-Diaminobenzidina, Sigma Chemical

Co, St. Louis, MO, USA) foi usada como cromógeno para revelação da reação e a contra-

coloração foi feita com hematoxilina de Mayer. Como controle positivo para os anticorpos

primário foram utilizados cortes de linfonodo. O controle negativo consistiu na substituição

do anticorpo primário por albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução tampão.

Análise imuno-histoquímica

Para o estudo imuno-histoquímico, as lâminas preparadas foram escaneadas com

auxílio do equipamento Scanner Panoramic MIDI (3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege

M. str. Budapest, Hungary, H-1121). As imagens foram analisadas através do programa de

visualização Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str.

Budapest, Hungary, H-1121) num aumento de 80x. Foram selecionados 5 campos

consecutivos de cada caso (região subepietelial dos CRs e região central dos GPs). Após esta

etapa, foi contado o número total de linfócitos imunopositivos em cada campo, sendo gerada

uma mediana para cada caso, a qual foi usada para análise estatística. A contagem desses

linfócitos positivos foi realizada por um único examinador. Consideraram-se como os

linfócitos as células pequenas, com citoplasma escasso, agranular, com o núcleo esférico e

intensamente corado (Ross & PAWLINA, 2011). Após esta etapa, foi contado o número total

de linfócitos imunopositivos em cada campo com o auxílio do programa imageJ.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada no programa Statistical Package for the Social

Sciences (versão 20.0; SPSS Inc., Chicago, USA). Ao constatar-se a ausência de normalidade

na distribuição da amostra, foi feita a comparação entre o número de células positivas para a

proteína Bax de acordo com o tipo de lesão (GPs ou CRs), intensidade do infiltrado

inflamatório (grau I/II ou grau III) e tipo de revestimento cístico (atrófico ou hiperplásico)

através do teste não paramétrico de Mann-Whitney. Na busca por associação significativa

entre intensidade do infiltrado inflamatório e a espessura do revestimento cístico utilizou-se

também o teste não paramétrico de Mann-Whitney. Para todos os testes, foi considerado um

nível de significância de 5% (p < 0,05).

17

RESULTADOS

Análise morfológica

A análise da intensidade do infiltrado inflamatório mostrou que dos 25 casos de GPs

72% (n=18) possuíam infiltrado grau III, enquanto que o grau II foi visto em 20% (n=5) e o

grau I em 8% (n=2) dos casos. Nos CRs, o infiltrado grau III foi visto em 56% (n=14) dos

casos, enquanto o grau II ocorreu em 20% (n=5) e o grau I em 24% (n=6). Em relação à

espessura do revestimento epitelial dos CRs, 52% (n=13) foram do tipo atrófico e 48% (n=12)

do tipo hiperplásico.

A análise da associação entre a intensidade do infiltrado inflamatório (I/II e III) e a

espessura do revestimento epitelial dos CRs (atrófico ou hiperplásico), mostrou ausência de

associação estatisticamente significativa entre essas duas variáveis (p=0,828).

Análise imuno-histoquímica

A análise da expressão imuno-histoquímica do anticorpo anti-Bax mostrou a presença

da proteína Bax em linfócitos de todos os casos de GPs (Fig. 1a) e CRs (Fig. 1b) analisados.

O numero médio de linfócitos Bax positivos foi de 30,06 (±17,4) com mínimo de 6 e máximo

de 97 células. Enquanto que a mediana da marcação para proteína Bax destas células foi 31,0

em GPs e 25,0 em CRs. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as duas

lesões em relação à quantificação da imunopositividade para a proteína Bax (p=0,236)

(Tabela 1) (Fig. 1c-d) (Fig. 2a).

A comparação entre o número de linfócitos Bax positivos em relação ao grau de

infiltrado inflamatório também mostrou ausência de diferença estatisticamente significativa

(p=0,169) (Tabela 1). A espessura do revestimento epitelial dos CRs também foi relacionada

ao número de linfócitos Bax positivos

(Fig. 1e-f). A mediana para lesões com epitélio atrófico

foi de 22,0 e para lesões com epitélio hiperplásico foi de 32,5, não sendo observada diferença

estatisticamente significativa para os linfócitos Bax

positivos

entre esses dois grupos

(p=0,186) (Tabela 1) (Fig. 2b).

Avaliando o número de linfócitos Bax

positivos e a intensidade do infiltrado

inflamatório dentro do grupo dos CRs não foi observada diferença estatisticamente

significativa (p=0,476) assim como no grupo dos granulomas (p=0,347).

18

DISCUSSÃO

As lesões periapicais se desenvolvem em resposta à infecção microbiana nos canais

radiculares. Após a necrose pulpar, micro-organismos estimulam a migração de células do

sistema imune para a região periapical, onde estas dão inicio a uma série de reações que

envolvem o recrutamento de outras células inflamatórias, liberação de citocinas pró-

inflamatórias e imunorreguladoras, além de quimiocinas (Brito et al. 2012, Aranha et al.

2013).

Tanto os linfócitos T quanto B são programados para responder a antígenos

específicos, mas nas lesões periapicais os linfócitos T se encontram em maior proporção

(Zizzi et al. 2012). Essas células são as principais responsáveis pela regulação da liberação de

citocinas na resposta imunológica. O subgrupo Th1dos linfócitos T CD4+ são os responsáveis

pela produção da IL-2, IFN- γ e indução de macrófagos, podendo participar de todas as etapas

da progressão da lesão periapical. Em contrapartida o subgrupo Th2 secreta IL-4, IL-5 e IL-

13, além de serem excelentes auxiliares para os linfócitos B na produção de anticorpos e

modulação da resposta sintomatológica e são encontrados principalmente em lesões crônicas

(Fraga et al. 2013). Além das células Th1 e Th2, as células Th17 desempenham papéis

críticos no desenvolvimento das lesões periapicais através da liberação de IL-6 e IL-23 que

atuam estimulando o desenvolvimento de osteoclastos participando consequentemente no

processo de reabsorção óssea, enquanto as células Treg suprem a formação dos osteoclastos

através da liberação de citocinas como TGF-β e IL-10 (Andrade et al. 2013, Araujo-Pires et

al. 2014, Yang et al. 2014). A função primária dos linfócitos T CD8+ é a detecção e

eliminação de células transformadas ou infectadas por vírus, esses linfócitos atuam na

atividade lítica por meio de dois mecanismos: através da liberação de grânulos e morte

dependente de um receptor, que é ativado pela interação entre CD95 (Fas), TNF-α ou TRAIL

e os ligantes presentes na superfície dos linfócitos CD8+ (Harari et al. 2009). A razão positiva

CD4/CD8 indica a natureza complexa da interação imunológica em cistos radiculares. Vários

fatores, como o tempo de duração da lesão podem influenciar na interação, o que permite uma

inversão desta razão (Zizzi et al. 2013).

Para limitar o dano aos tecidos saudáveis, vários mecanismos têm evoluído para

controlar a resposta imunológica, incluindo inativação celular e morte celular (Häcker et al.

2006), por exemplo após eliminação do antígeno em uma infecção, a maioria dos linfócitos T

morre por apoptose, enquanto alguns sobrevivem e se tornam células de memória (Suzuki et

19

al. 2005). Nas infecções periapicais, como as aqui estudadas, grande quantidade de células

inflamatórias são geradas em resposta aos antígenos microbianos, dentre estas células,

destacam-se os linfócitos T, então é de se esperar que o sistema imune utilize a apoptose

destas células imunes ativadas como forma de restaurar a homeostase de células T, prevenir

autoimunidade e imunopatologias, desempenhando um mecanismo importante no controle

numérico de linfócitos T específicos que são ativados massivamente em resposta a infecções

microbianas (Häcker et al. 2006, Tripath et al. 2013). Em relação a isto, estudos têm

demonstrado que a morte de linfócitos T ativados por antígenos durante o término da resposta

imune é iniciado pela proteína Bim, membro da família BCL-2 e também necessitam das

proteínas Bax e Bak, onde estas têm um papel essencial na execução da morte celular

(Strasser & Pellegrini 2004).

A progressão das lesões periapicais depende principalmente do equilíbrio entre a

morte e a sobrevivência das células que compõe o infiltrado inflamatório. Na apoptose ocorre

o encolhimento celular, condensação da cromatina nuclear e posteriormente a fragmentação

do DNA cromossômico, tendo assim, uma função importante na homeostase do tecido e na

patogênese das doenças inflamatórias (Suzuki et al. 2005, Lin et al. 2007, Martins et al. 2011,

Zhu et al. 2013). As duas principais vias para a apoptose são a via extrínseca e intrínseca. Na

via extrínseca, a apoptose celular é induzida através da ligação de alguns ligantes, tais como

Fas -FasL e TNF-α aos seus receptores (TNFR1 / 2). Na via intrínseca, a indução da apoptose

ocorre nas mitocôndrias, em conjunto com o grupo de proteínas da família Bcl-2. Esta família

consiste de um grupo de proteínas pro-apoptóticas, como a Bax, Bak entre outras e por

proteínas anti-apoptóticas, como Bcl-2, Bcl-xL e outras. Como resultado da indução da morte

celular programada, tanto na via extrínseca e intrínseca, a fase de execução do presente

processo é iniciada, com uma cascata de enzimas denominadas caspases. Isto leva à

fragmentação da membrana da célula e a formação de corpos apoptóticos, que são,

posteriormente, eliminadas por células fagocíticas (Eder et al. 2013).

Alguns trabalhos tem mostrado um papel dominante da via mitocondrial na apoptose,

mediada por membros da família Bcl-2, na regulação da morte dos linfócitos T ativados

(Suzuki et al 2005, Martins et al 2011, Tripathi et al. 2013, Precone et al. 2013).

Este estudo investigou a presença da proteína Bax em linfócitos na patogênese de GPs

e CRs, uma vez que essas são importantes células envolvidas na defesa contra micro-

organismos e que são encontradas em grande quantidade nestas lesões. Na análise da

expressão imuno-histoquímica do anticorpo anti-Bax verificou-se a presença da proteína Bax

em linfócitos de todos os casos de GPs e CRs analisados no infiltrado inflamatório. Segundo

20

Brito et al, (2012), a presença de bactérias no canal radicular induz a apoptose dos linfócitos

T através do receptor p55, isto pode explicar a imunomarcação para proteína Bax nos

linfócitos detectada nos casos de GP e CR analisados neste estudo, o que também pode ser

corroborado pelos achados de Precone et al. (2013), os quais afirmaram que a apoptose regula

a resposta dos leucócitos durante as infecções bacterianas e estes autores demonstraram que

existe a ativação de vias pró-apoptóticas em linfócitos, mas não em granulócitos de pacientes

cirróticos com infecção bacteriana.

Nos GPs foi encontrado um maior número de linfócitos positivos quando comparado

ao CRs, porém sem diferença estatisticamente significativa (p=0,236). Este fato, talvez possa

ser explicado pela maior quantidade de infiltrado inflamatório verificado nos GP, uma vez

que a análise da intensidade do infiltrado inflamatório mostrou que 92% (n=23) possuíam

infiltrado grau II/III e nos CRs, o infiltrado grau II/III foi visto em apenas 76% (n=19) dos

casos e, além disto, 24% (6 casos) exibiram infiltrado Grau I.

Tekkeşin et al. (2012) avaliando o papel da proteína Bcl-2, Bax e Ki-67 no

revestimento epitelial e nas células do tecido conjuntivo de ceratocistos, cistos radiculares e

amesloblastomas, verificaram baixa expressão da Bcl-2 tanto no revestimento epitelial como

em células do tecido conjuntivo dos CRs, enquanto que no ceratocisto e ameloblastoma

visualizou-se uma alta expressão dessa proteína. Quando avaliaram a Bax viram que das três

lesões essa proteína estava em maior quantidade no revestimento epitelial dos cistos

radiculares o que implica no aumento da atividade apoptótica no epitélio em comparação às

outas lesões. Em contrapartida, nas células do tecido conjuntivo, a imunoexpressão da

proteína Bax foi muito baixa nos três grupos.

Na análise da espessura do revestimento epitelial dos CRs verificou-se que nas lesões

com epitélio hiperplásico houve uma maior quantidade de linfócitos Bax positivos quando

comparado ao atrófico, porém não houve diferença estatisticamente significativa entre esses

dois grupos (p=0,186). Como também não houve diferença estatística na intensidade do

infiltrado inflamatório entre lesões hiperplásicas e atróficas, pode-se sugerir que em epitélios

císticos hiperplásicos, encontra-se uma maior quantidade de linfócitos em apoptose, o que

pode denotar um ambiente de maior atividade de citocinas pró-inflamatórias como relatado na

literatura (Andrade et al. 2013), as quais levariam a uma maior proliferação do epitélio cístico

e também maior número de linfócitos ativados e, consequentemente, um maior disparo dos

processos de apoptose destes linfócitos. Em relação a isto, Martins et al. (2011), verificaram

em seu estudo que a apoptose foi mais evidente no epitélio de cisto radicular hiperplásico,

provavelmente como um mecanismo para regular a proliferação das células epiteliais basais

21

estimuladas pela concentração aumentada de infiltrado inflamatório na capsula de tecido

conjuntivo adjacente, sugerindo que o aumento da inflamação reflete no aumento da apoptose

de células epiteliais em periodontites periapicais.

Além desses resultados, viu-se também nesse estudo que a presença da proteína Bax

foi maior no infiltrado inflamatório grau III, mas que não foi observada diferença

estatisticamente significativa (p=0,476) entre os grupos grau I/II e III. Suzuki et al. (2005)

avaliando o processo de apoptose em cistos radiculares e cistos residuais viram a presença da

proteína Bax e Bcl-2 em células basais do epitélio de ambas as lesões. Estes autores

verificaram que nos CRs com infiltrado inflamatório intenso houve uma maior presença da

proteína Bax e menor de Bcl-2 do que CRs com infiltrado inflamatório leve, sugerindo dessa

forma, que essas proteínas regulam a apoptose e assim contribuem para proliferação e morte

celular de células do revestimento epitelial de lesões periapicais inflamatórias, além disso, os

autores também afirmam que a ação dos membros da família Bcl-2 é afetada pelo processo

inflamatório destas lesões.

22

CONCLUSÃO

Diante dos resultados encontrados e dos dados encontrados na literatura acredita-se

que a imunoexpressão da proteína Bax em linfócitos tanto nos GPs quanto nos CRs está

implicada no processo de apoptose de linfócitos ativados em resposta à estimulação

antigênica frequente nestas lesões periapicais e que este mecanismo é de suma importância,

tanto para limitar o dano aos tecidos saudáveis causados por estes linfócitos ativados e suas

citocinas liberadas, quanto para restaurar a homeostase do sistema imunológico no local das

lesões.

23

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27

Tabela 1- Avaliação das diferenças do numero de células Bax+ em granulomas periapicais e

cistos radiculares e suas diferenças em relação ao tipo de lesão, grau do infiltrado inflamatório

e espessura epitelial dos cistos radiculares.

Variável n Media Mediana Q25-Q75 Ranks p

Lesão

Granuloma periapical 25 34,1 31,0 18,0-38,0 27,9 0,236

Cisto radicular 25 25,6 25,0 15,5-36,5 23,1

Infiltrado inflamatório

Grau I/II 18 24,6 24,5 9,7-36,5 21,7 0,169

Grau III 32 33,1 31,5 18,5-37,7 27,6

Revestimento Epitelial

Atrófico 13 22,4 22,0 15,5-26,5 11,1 0,186

Hiperplásico 12 29,7 32,5 16,0-39,2 15,1

28

Figura 1 Imunoexpressão de Bax em lesões periapicais: a. Fotomicrografia exibindo visão

geral de GP; b. Fotomicrografia exibindo visão geral de CR; c. Fotomicrografia exibindo

imunoexpressão de Bax no infiltrado inflamatório intenso; d. Fotomicrografia exibindo

imunoexpressão de Bax moderado; e. Associação do infiltrado inflamatório com o epitélio

atrófico de CR; f. Associação do infiltrado inflamatório com o epitélio hiperplásico em CR.

(Pannoramic Viewer 1.15.2).

29

Figura 2a: Box plot do número de linfócitos imunopositivos para a proteína Bax no CR

e GP.

30

Figura 2b: Box plot da associação do número de linfócitos imunopositivos para proteína

Bax em relação à espessura do epitélio nos CRs.

31

ANEXO 1

32

33

34

ANEXO 2

REVISTA

INTERNATIONAL ENDODONTIC JOURNAL

Edited By: PMH Dummer

Impact Factor: 2.971

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Presentation: Authors should pay special attention to the presentation of their research

findings or clinical reports so that they may be communicated clearly. Technical jargon

should be avoided as much as possible and clearly explained where its use is unavoidable.

Abbreviations should also be kept to a minimum, particularly those that are not standard. The

background and hypotheses underlying the study, as well as its main conclusions, should be

clearly explained. Titles and abstracts especially should be written in language that will be

readily intelligible to any scientist.

Abbreviations: International Endodontic Journal adheres to the conventions outlined in

Units, Symbols and Abbreviations: A Guide for Medical and Scientific Editors and Authors.

When non-standard terms appearing 3 or more times in the manuscript are to be abbreviated,

they should be written out completely in the text when first used with the abbreviation in

parenthesis.

35

Structure

All manuscripts submitted to International Endodontic Journal should include Title Page,

Abstract, Main Text, References and Acknowledgements, Tables, Figures and Figure Legends

as appropriate

Title Page: The title page should bear: (i) Title, which should be concise as well as

descriptive; (ii) Initial(s) and last (family) name of each author; (iii) Name and address of

department, hospital or institution to which work should be attributed; (iv) Running title (no

more than 30 letters and spaces); (v) No more than six keywords (in alphabetical order); (vi)

Name, full postal address, telephone, fax number and e-mail address of author responsible for

correspondence.

Abstract for Original Scientific Articles should be no more than 250 words giving details of

what was done using the following structure:

• Aim: Give a clear statement of the main aim of the study and the main hypothesis tested, if

any.

• Methodology: Describe the methods adopted including, as appropriate, the design of the

study, the setting, entry requirements for subjects, use of materials, outcome measures and

statistical tests.

• Results: Give the main results of the study, including the outcome of any statistical analysis.

• Conclusions: State the primary conclusions of the study and their implications. Suggest

areas for further research, if appropriate.

Main Text of Original Scientific Article should include Introduction, Materials and

Methods, Results, Discussion and Conclusion

Introduction: should be focused, outlining the historical or logical origins of the study and

gaps in knowledge. Exhaustive literature reviews are not appropriate. It should close with the

explicit statement of the specific aims of the investigation, or hypothesis to be tested.

Material and Methods: must contain sufficient detail such that, in combination with the

references cited, all clinical trials and experiments reported can be fully reproduced.

Clinical Trials should be reported using the CONSORT guidelines available

at www.consort-statement.org. A CONSORT checklist and flow diagram (as a Figure)

should also be included in the submission material.

Experimental Subjects: experimentation involving human subjects will only be published

if such research has been conducted in full accordance with ethical principles, including

the World Medical Association Declaration of Helsinki (version 2008) and the additional

requirements, if any, of the country where the research has been carried out. Manuscripts

36

must be accompanied by a statement that the experiments were undertaken with the

understanding and written consent of each subject and according to the above mentioned

principles. A statement regarding the fact that the study has been independently reviewed

and approved by an ethical board should also be included. Editors reserve the right to reject

papers if there are doubts as to whether appropriate procedures have been used.

When experimental animals are used the methods section must clearly indicate that

adequate measures were taken to minimize pain or discomfort. Experiments should be

carried out in accordance with the Guidelines laid down by the National Institute of Health

(NIH) in the USA regarding the care and use of animals for experimental procedures or

with the European Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC)

and in accordance with local laws and regulations.

All studies using human or animal subjects should include an explicit statement in the

Material and Methods section identifying the review and ethics committee approval for each

study, if applicable. Editors reserve the right to reject papers if there is doubt as to whether

appropriate procedures have been used.

Suppliers: Suppliers of materials should be named and their location (Company, town/city,

state, country) included.

Results: should present the observations with minimal reference to earlier literature or to

possible interpretations. Data should not be duplicated in Tables and Figures.

Discussion: may usefully start with a brief summary of the major findings, but repetition of

parts of the abstract or of the results section should be avoided. The Discussion section should

progress with a review of the methodology before discussing the results in light of previous

work in the field. The Discussion should end with a brief conclusion and a comment on the

potential clinical relevance of the findings. Statements and interpretation of the data should be

appropriately supported by original references.

Conclusion: should contain a summary of the findings.

References

It is the policy of the Journal to encourage reference to the original papers rather than to

literature reviews. Authors should therefore keep citations of reviews to the absolute

minimum.

We recommend the use of a tool such as EndNote or Reference Manager for reference

management and formatting. The EndNote reference style can be obtained upon request to the

editorial office (iejeditor@cardiff.ac.uk). Reference Manager reference styles can be searched

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37

In the text: single or double authors should be acknowledged together with the year of

publication, e.g. (Pitt Ford & Roberts 1990). If more than two authors the first author

followed by et al. is sufficient, e.g. (Tobias et al. 1991). If more than 1 paper is cited the

references should be in year order and separated by "," e.g. (Pitt Ford & Roberts 1990,

Tobias et al. 1991).

Reference list: All references should be brought together at the end of the paper in

alphabetical order and should be in the following form.

(i) Names and initials of up to six authors. When there are seven or more, list the first three

and add et al.

(ii)Year of publication in parentheses

(iii) Full title of paper followed by a full stop (.)

(iv) Title of journal in full (in italics)

(v) Volume number (bold) followed by a comma (,)

(vi) First and last pages

Examples of correct forms of reference follow:

Standard journal article

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Corporate author

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document/report and URL. If this information is not available, the reference should be

removed and only the web address cited in the text.

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document]. URL http://www.dhss.gov.uk/reports/report015285.html

[accessed on 7 November 2003]

Tables, Figures and Figure Legends

Tables: Tables should be double-spaced with no vertical rulings, with a single bold ruling

beneath the column titles. Units of measurements must be included in the column title.

Figures: All figures should be planned to fit within either 1 column width (8.0 cm), 1.5

column widths (13.0 cm) or 2 column widths (17.0 cm), and must be suitable for photocopy

reproduction from the printed version of the manuscript. Lettering on figures should be in a

clear, sans serif typeface (e.g. Helvetica); if possible, the same typeface should be used for all

figures in a paper. After reduction for publication, upper-case text and numbers should be at

least 1.5-2.0 mm high (10 point Helvetica). After reduction, symbols should be at least 2.0-3.0

mm high (10 point). All half-tone photographs should be submitted at final reproduction size.

In general, multi-part figures should be arranged as they would appear in the final version.

Reduction to the scale that will be used on the page is not necessary, but any special

requirements (such as the separation distance of stereo pairs) should be clearly specified.

Unnecessary figures and parts (panels) of figures should be avoided: data presented in small

tables or histograms, for instance, can generally be stated briefly in the text instead. Figures

should not contain more than one panel unless the parts are logically connected; each panel of

39

a multipart figure should be sized so that the whole figure can be reduced by the same amount

and reproduced on the printed page at the smallest size at which essential details are visible.

Figures should be on a white background, and should avoid excessive boxing, unnecessary

colour, shading and/or decorative effects (e.g. 3-dimensional skyscraper histograms) and

highly pixelated computer drawings. The vertical axis of histograms should not be truncated

to exaggerate small differences. The line spacing should be wide enough to remain clear on

reduction to the minimum acceptable printed size.

Figures divided into parts should be labelled with a lower-case, boldface, roman letter, a, b,

and so on, in the same typesize as used elsewhere in the figure. Lettering in figures should be

in lower-case type, with the first letter capitalized. Units should have a single space between

the number and the unit, and follow SI nomenclature or the nomenclature common to a

particular field. Thousands should be separated by a thin space (1 000). Unusual units or

abbreviations should be spelled out in full or defined in the legend. Scale bars should be used

rather than magnification factors, with the length of the bar defined in the legend rather than

on the bar itself. In general, visual cues (on the figures themselves) are preferred to verbal

explanations in the legend (e.g. broken line, open red triangles etc.)

Figure legends: Figure legends should begin with a brief title for the whole figure and

continue with a short description of each panel and the symbols used; they should not contain

any details of methods.

Permissions: If all or part of previously published illustrations are to be used, permission

must be obtained from the copyright holder concerned. This is the responsibilty of the authors

before submission.