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Rosélia Sousa Leal
ESTUDO ETNOFARMACOLÓGICO E FITOQUÍMICO DAS ESPÉCIES MEDICINAIS Cleome spinosa Jacq, Pavonia varians Moric e Croton cajucara
Benth
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Doutor em Química. Orientação: Profa. Dra. Maria Aparecida Medeiros Maciel Co-orientação: Profa. Dra. Tereza Neuma de Castro Dantas
Natal/RN
2008
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial de Química
Leal, Rosélia Sousa.
Estudos etnofarmacológico e fitoquímico espécies medicinais Cleome spinosa Jacq, Pavonia varians Moric e Croton cajucara Benth / Rosélia Sousa Leal. Natal, RN, 2008. 190 f. Orientadora: Maria Aparecida Medeiros Marciel. Co-orientadora: Tereza Neuma de Castro Dantas. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de
Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química. 1. Fitoquímico – Tese. 2. Etnofarmacológico - Tese. 3. Cleome Spinosa –
Tese. 4. Pavonia varians – Tese. 5. Croton cajucara - Tese. I. Maciel, Maria Aparecida Medeiros. II. Dantas, Tereza Neuma de Castro. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UFRN/BSE- Química CDU 547
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus amados filhos
Stella Rosa, Wandick, Maristela e Sarah Carolina e
agradeço pelo companheirismo, amor, incentivo e
compreensão, durante a elaboração desse trabalho.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Maria Aparecida de Medeiros Maciel pelo incentivo, apoio e orientação
durante a realização deste trabalho.
À Profa. Tereza Neuma de Castro Dantas pela amizade e confiança que motivaram a
realização deste trabalho.
À Profa. Dra. Maria das Dores Melo pela colaboração com o estudo etnobotânico.
À Prof. Dr. Frederico Argolo Vanderlinde pela colaboração com o estudo
farmacológico (ação antiinflamatória).
À Profa. Dra. Aurea Echevarria pela colaboração com o estudo farmacológico (ação
antioxidante).
À Profa. Dra. Sonia Regina Souza pela colaboração com o estudo farmacológico (ação
fungicida).
À Prof. Dr. Valdir Florêncio da Veiga Júnior pela colaboração com os estudos de
cromatografia via CG-EM.
À Prof. Dr. Carlos Roland Kaiser pela colaboração na aquisição de espectros de RMN.
À Universidade Potiguar, em especial a Profa. Sandra Amaral de Araújo, diretora da
área de saúde, pela disponibilização de equipamentos essenciais para o desenvolvimento deste
trabalho.
Aos amigos por compartilharem as alegrias e pelos incentivos nos momentos mais
difíceis.
À Elaine Cristina Martins de Moura pela amizade e colaboração na elaboração deste
trabalho.
À Elizabeth Dantas Martes a amizade e dedicação demonstrada durante a realização da
coleta de dados.
À todos que compõem o Laboratório de Tecnologia de Tensoativos pelo acolhimento e
agradável convivência.
Quem nos separará do amor de Cristo?
Tribulação? Angústia? Perseguição? Fome?
Nudez? Perigo? Espada? Em tudo isso, somos mais que
vencedores, graças aqueles que nos amou! Tenho a
certeza de que nem a morte, nem a vida, nem os anjos,
nem os poderes celestiais, nem o presente, nem o futuro,
nem as forças cósmicas, nem a altura, nem a profundeza,
nem outra criatura qualquer será capaz de nos separar do
amor de Deus por nós, manifestado em Cristo Jesus,
nosso Senhor.
Rm 8,35,37-39
RESUMO
Neste trabalho realizou-se uma pesquisa etnográfica envolvendo oitenta e quatro espécimes vegetais nativas do Litoral Norte Riograndense. Duas destas espécies Cleome spinosa Jacq e Pavonia varians Moric foram alvo de estudos etnobotânico, fitoquímico e farmacológico. Em adição, ampliou-se os estudos fitofarmacológicos de Croton cajucara Benth, uma espécie medicinal nativa da região Amazônica. Os resultados fitoquímicos de Cleome spinosa e Pavonia varians indicaram dentre outros metabólitos especiais, a presença de flavonóides. Os flavonóides (2S)-5-hidroxi-7,4’-dimetoxi-flavanona e 5,4’-diidroxi-3,7,3’-trimetoxi-flavona foram isolados de Cleome spinosa. A atividade antioxidante dos extratos hidroalcoólicos de P. varians e C. spinosa solubilizados em sistemas microemulsionados (SME), foi avaliada frente ao radical livre DPPH. Os sistemas SME-1 e SME-4 [contendo Tween 80: Span 20 (3:1) e miristato de isopropila (IPM)] mostraram-se eficazes na solubilização dos extratos avaliados, tendo sido observado melhor eficácia para o sistema SME-1 [EC50 = 113,84 µg/mL (SME-1) and 246,00 µg/mL (SME-4) para P. varians e EC50: 223,97 µg/mL (SME-1) e 248,37 µg/mL (SME-4) para C. spinosa (sistema SME-1contendo etanol como cotensoativo e SME-4, isento de cotensoativo]. A ação antinociceptiva de Pavonia varians foi confirmada através do teste das contorções abdominais, tendo sido observado relação dose/efeito inibitório dependente do extrato hidroalcoólico desta espécie. Os testes do tipo tail flick e da formalina afastaram a possibilidade da participação de mecanismos antinociceptivos no sistema nervoso central. No entanto, no teste da formalina evidenciou-se a participação de mecanismos antiinflamatórios na produção do efeito antinociceptivo deste extrato. O estudo fitoquímico das cascas do caule de Croton cajucara Benth conduziu ao isolamento de diterpenos do tipo 19-nor-clerodano, bem como à obtenção do óleo fixo OF-CC, rico em sesquiterpenos e 19-nor-clerodano bioativos. O efeito de OF-CC foi avaliado no desenvolvimento in vitro dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii propagados em meio de cultura Batata-dextrose-agar. A resposta fisiológica, variou de acordo com o tipo de fungo testado, tendo sido observado que o OF-CC apresentou efeito fungistático significativo, com efeito inibitório mais estável para o gênero de fungo Fusarium oxysporum. Realizou-se ainda, um estudo de espectrometria de massas objetivando-se a identificação de fragmentos característicos de diterpenos do tipo clerodano (com dados obtidos na literatura) e 19-nor-clerodano (isolados das cascas do caule de C. cajucara), tendo sido evidenciado que a junção trans de clerodanos está correlacionada com a presença dos íons característico de m/z 95, 121 e 205. Os sistemas de junção cis de clerodanos apresentaram íons característicos de m/z 122 e 124. A junção trans de 19-nor-clerodanos foi correlacionada com a presença dos íons característico de m/z 161, 134 e 121. Este estudo pode ser utilizado na identificação de diterpenos do tipo clerodano e 19-nor-clerodano, contendo carbonila α,β-insaturada no anel A do sistema decalínico, evitando desta forma, a obrigatoriedade de isolamento e caracterização via RMN. Palavras-chaves: etnofarmacológico, fitoquímico, Cleome spinosa, Pavonia varian, Croton cajucara.
ABSTRACT
In this present work an ethnographic research was performed with 84 native medicinal specimens from the Litoral Norte Riograndense, from which two plants Cleome spinosa Jacq e Pavonia varians Moric were submitted to ethnobotanic, phytochemistry and pharmacologic investigations. Additionally, a phytopharmacological research of the medicinal specimen Croton cajucara Benth ( native plant of the Amazon region of Brazil) was improved. The obtained phytochemical results of the C. spinosa and P. varians showed the presence of flavonoids constituents, among other components. The two flavonoids (2S)-5-hydroxy-7,4’-dimethoxy-flavanone and 5,4’-dihydroxy-3,7,3’-trimethoxy-flavone were isolated from C. spinosa. The antioxidant activity of the hydroalcoholic extracts of C. spinosa and P. varians solubilized in the microemulsion systems SME-1 and SME-4, was evaluated in the DPPH-method. The used SME systems [obtained with Tween 80: Span 20 (3:1) and isopropyl myristate (IPM)] improved the dissolution of those tested polar extracts, with higher efficacy to the SME-1 system (in which ethanol was included as cosurfactant). The CE50 values evidenced for P. varians were 114 µg/mL (SME-1) and 246 µg/mL (SME-4); for C. spinosa it was 224 µg/mL (SME-1) and 248 µg/mL (SME-4), being the system SME-1 more effective for both tested extracts. The hydroalcoholic extracts of P. varians (HAE-PV) was also submitted to pharmacological screening for antinociceptive activity in animal models. The oral administration of this extract (100, 300 and 1000 mg/kg) inhibited the acetic acid-induced writhing in mice. The higher inhibition (74%) was evidenced to the 1000 mg/kg administered dose. Its effect on the central nervous system (CNS) was investigated by tail flick and formalin-method and reveled that it has negligible antinociceptive action on the CNS. After taking consideration of HAE-PV interaction, Pavonia varians Moric could be used as a potent analgesic agent in case of peripheral algesia, without affecting the CNS. The phytochemical study of the stem bark of Croton cajucara Benth lead to the isolation of 19-nor-clerodane-type diterpenes, as well as to the separation of its fixed oil FO-CC. This non polar oil material reveled to be rich in sesquiterpenes and 19-nor-clerodanes components. The biologic effect of OF-CC was evaluated in the development in vitro of the fungis phytopatogens such as Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. Significant inhibitory effect of the tested fungis (at 0,2 mg.mL-1 dosage) were comproved. A Mass Spectrometry study of clerodane-type diterpenes was developed in order to identify characteristic fragments on mass spectrometra of both clerodane and 19-nor-clerodane presenting an α,β-insaturated carbonyl moiety at ring A of the decalin-system. For that study, mass spectroscopy data were analysed for 19-nor-clerodanes [trans-dehydrocrotonin (DCTN), trans-crotonin (CTN), cis-cajucarin B (c-CJC-B), and cajucarinolide (CJCR)] and for clerodanes [isosacacarin (ISCR) and trans-cajucarin A (t-CJC-A)] obtained from the stem bark of C. cajucara, and also clerodane-type from other species. The trans-junction of the enone-system clerodanes was clear correlated with the presence of the characteristic ions at m/z 95, 121 e 205. Meanwhile, the characteristics ions at m/z 122 e 124 were correlated to cis-junction. The trans-junction of the enone-system 19-nor-clerodanes showed characteristics ions at m/z 161, 134 e 121. This study could be successful employed for identification of clerodane constituents from other specimens without any additional spectroscopic analyses, as well as a previously phytochemical analyzes in clerodane project search. Keyword: ethnopharmacologic, phytochemistry, Cleome spinosa, Pavonia varian, Croton cajucara.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Triterpenos do tipo lupano isolados da espécie Maerua oblogifolia
Forssk..................................................................................................................................
32
Figura 2 - Triterpenos do tipo damarano isolados da espécie Cleome ambliocarpa
Barratte & Murb. Var..........................................................................................................
33
Figura 3 - Triterpenos do tipo damarano isolados da espécie Cleome africana
Botsch..................................................................................................................................
34
Figura 4 - Triterpeno isolado da espécie Cleome droserifolia
Forssk..................................................................................................................................
34
Figura 5 - Diterpenos do tipo cembranos isolados da espécie Cleome viscosa L............. 35
Figura 6 - Diterpenos cembranos isolados da especie Cleome spinosa Jack..................... 35
Figura 7 – Flavonóides na forma de agliconas isolados de espécies do gênero
Capparis..............................................................................................................................
36
Figura 8 - Flavonóides glicosilados isolados de espécies do gêneros Capparis e
Cleome.................................................................................................................................
38
Figura 9 - Flavonóides na forma de aglicona isolados do gênero Cleome......................... 41
Figura 10 - Alcalóides isolados da espécie Sida acuta Burn............................................. 48
Figura 11 - Alcalóides isolados da espécie Sida cordifolia L............................................ 49
Figura 12 - Compostos nitrogenados isolados de espécies da família Malvaceae............. 49
Figura 13 - Compostos fenólicos isolados da espécie Sida acuta Burn............................. 50
Figura 14 - Compostos fenólicos isolados da espécie Sidastrum paniculatum L.............. 51
Figura 15 – Flavonóides na forma de aglicona e glicosilados isolados de Sida
galheirensis Ulbr.................................................................................................................
51
Figura 16 - Flavonóides glicosilados isolados da espécie Sida cordifolia L...................... 52
Figura 17 - Flavonóides do tipo aglicona e antocianidinas isolados do gênero
Hibiscus...............................................................................................................................
53
Figura 18 - Flavonoide glicosídico de Pavonia distinguenda A. St.-Hil........................... 55
Figura 19 - Esteróides isolados da espécie Sida acuta Burn.............................................. 56
Figura 20 - Esteróides glicosilados isolados da espécie Sida galheirensis Ulbr................ 56
Figura 21 – Fitoecdisteróides isolados da Sida spinosa L.................................................. 57
Figura 22 – Triterpenos isolados da espécie Pavonia distinguenda A. St.-Hill &
Naud....................................................................................................................................
58
Figura 23 – Outros constituintes químicos isolados do gênero Sidastrum......................... 58
Figura 24 – Fitoalexina malvonea isolada da espécie Malva sylvestris L.......................... 59
Figura 25 - Outros Metabólitos Isolados de Sida spinosa L.............................................. 59
Figura 26 - Estrutura de (-)-clerodina……………………………………......................... 62
Figura 27 - Esqueleto básico de clerodanos……………………………………..………. 63
Figura 28 - Estruturas isoladas da casca do caule de Croton cajucara Benth................... 66
Figura 29 – Fotografia da excicata de Cleome Spinosa Jacq............................................ 90
Figura 30 – Fotografia da excicata de Pavonia varians Moric.......................................... 91
Figura 31 – Estrutura química de CS-EM-3b [(2S)-5-hidroxi-7,4’-dimetoxi-
flavanona]............................................................................................................................
94
Figura 32 – Esqueleto básico de flavonóides..................................................................... 95
Figura 33 – Estrutura química de 5,4’-diidroxi-3,7,3’-trimetoxi-flavona.......................... 97
Figura 34 - Eficácia antioxidativa de Cleome Spinosa Jacq expressa em valores de
EC50.....................................................................................................................................
104
Figura 35 - Eficácia antioxidativa de Pavonia varians expressa em valores de
EC50.....................................................................................................................................
104
Figura 36 - Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2% em salina, 100
µL/10g, i.p.) em camundongos previamente tratados (60 min.) pela via oral (p.o.) com o
veículo (controle), com o controle positivo indometacina (INDO) ou com o extrato
hidroalcoólico de Pavonia varians (EHA). As colunas e barras verticais representam as médias
± erro padrão de 6 a 8 animais por grupo experimental. Estatisticamente diferente do grupo
controle (**p < 0,01 e ***p < 0,001)..............................................................................................
107
Figura 37 - Porcentagem de inibição das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
(1,2% em salina, 100 µL/10g, i.p.) em camundongos previamente tratados (60 min.) pela via
oral com o extrato hidroalcoólico de Pavonia varians (EHA). Os símbolos e barras verticais
representam as médias ± erro padrão de 6 a 8 animais por grupo
experimental....................................................................................................................................
107
Figura 38 - Reatividade ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do tail−flick em
camundongos previamente tratados pela via oral (p.o. - 60 min.) ou pela via subcutânea (s.c. -
30 min.) com o veículo (água, 100 µL/10 g, p.o.), com o fentanil (100 µg/kg, s.c.) ou com o
extrato hidroalcoólico de Pavonia varians (EHA). Nas ordenadas estão representados os
tempos de reação dos camundongos ao estímulo térmico nociceptivo em segundos. Os
símbolos e barras verticais representam as médias ± erro padrão de 8 animais por grupo
experimental. Estatisticamente diferente do grupo controle (*p < 0,05 e ***p <
0,001)...............................................................................................................................................
108
Figura 39 - Reatividade em segundos, após a aplicação intraplantar de formaldeído
(20µL, 1,2% em salina) na pata posterior de camundongos previamente tratados (60min) pela
via oral (p.o.) com o veículo (10 µL/g), com a indometacina (10 mg/kg) ou com o extrato
hidroalcoólico da Pavonia varians (EHA – 1 g/kg). As colunas e barras verticais indicam as
médias da fase I (A - 0 a 5 min - dor neurogênica) e fase II (B - 15 a 30 min - dor inflamatória)
± erro padrão de 8 animais por grupo experimental. Estatisticamente diferente do grupo
controle (**p < 0,01 e ***p < 0,001)..............................................................................................
109
Figura 40 - Expansão do cromatograma da fração F3, evidenciando a presença de
clerodanos [trans-crotonina (CTN), cis-cajucarina B (c-CJC-B) e trans-cajucarina B (t-
CJC-B)] e esteróis................................................................................................................
115
Figura 41 - Espectro de massas do clerodano trans-crotonina, obtido no cromatograma
da fração F3.........................................................................................................................
115
Figura 42 - Espectro de massas do clerodano isomérico trans-cajucarina B (t-CJC-B),
obtido no cromatograma da fração F3.................................................................................
117
Figura 43 - Espectro de massas do clerodano isomérico cis-cajucarina B (c-CJC-B),
obtido no cromatograma da fração F3.................................................................................
117
Figura 44 - Representação estrutural de diterpenos do tipo clerodano (129) e do tipo
19-nor-clerodano (131a)......................................................................................................
119
Figura 45 - Diâmetro de crescimento das colônias em meio de cultura BDA, durante
cinco dias. Controle positivo: meio de cultura BDA; Controle testemunha padrão: meio
de cultura BDA + 1% DMSO; óleo fixo de Croton cajucara: meio de cultura BDA com
concentração 0,2 mg.mL-1 de óleo fixo e 1% de DMSO; A) Fusarium oxysporum.; B)
Rhizoctonia solani.; C) Sclerotium
rolfsii....................................................................................................................................
126
Figura 46 - Colônias dos fungos crescidos em meio de cultura BDA. Imagens
capturadas no quinto dia após o início do ensaio, onde nas colunas: 1) meio de cultura
BDA; 2) meio de cultura BDA + 1% DMSO e 3) meio de cultura BDA com
concentração de 0,2 mg.mL-1 do óleo fixo de Croton cajucara e 1% de DMSO; nas
linhas: A) Fusarium oxysporum.; B) Rhizoctonia solani e C) Sclerotium
rolfsii....................................................................................................................................
127
Figura 47 – Percentual de inibição do crescimento das colônias de Fusarium
oxysporum,. Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii em meio de cultura BDA, contendo
0,2 mg.mL-1 do óleo fixo de Croton cajucara, durante cinco dias.....................................
127
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição de flavonóides na forma de agliconas de espécies do gênero
Capparis..............................................................................................................................
37
Tabela 2 - Distribuição de flavonóides glicosilados de espécies do gênero
Capparis..............................................................................................................................
39
Tabela 3 - Distribuição de flavonóides na forma aglicona de espécies do gênero
Cleome.................................................................................................................................
40
Tabela 4 - Distribuição de flavonóides glicosilados em espécies do gênero
Cleome.................................................................................................................................
41
Tabela 5 - Outros metabólitos que ocorrem emespécies vegetais do gênero
Cleome.................................................................................................................................
42
Tabela 6 - Outros metabólitos que ocorrem em espécies vegetais da família
Brassicasceae.......................................................................................................................
42
Tabela 7 - Distribuição de flavonóides na forma de aglicona em espécies do gênero
Hibiscus...............................................................................................................................
54
Tabela 8 - Atividades biológicas da trans-desidrocrotonina realizados “in vivo” (130)............... 68
Tabela 9 - Atividades biológicas de trans-crotonina (131)................................................ 68
Tabela 10 - Atividades biológicas do óleo essencial de Croton cajucara Benth
realizadas “in vivo”..............................................................................................................
69
Tabela 11 - Procedimento Cromatográfico do Extrato metanólico de Cleome
spinosa.................................................................................................................................
73
Tabela 12 - Reunião de grupos de frações obtidas do procedimento cromatográfico do
extrato metanólico das partes aéreas de Cleome Spinosa....................................................
73
Tabela 13 - Refracionamentos do grupo de fração CS-EM-1............................................ 74
Tabela 14 - Refracionamentos do grupo de fração CS-EM-3............................................ 74
Tabela 15 - Refracionamentos do grupo de fração CS-EM-4............................................ 75
Tabela 16 - Grupos de frações resultantes do procedimento cromatográfico do extrato
hidroalcoólico (PV-HA) de Pavonia varians......................................................................
76
Tabela 17 - Plantas utilizadas pela comunidade da cidade de Rio do Fogo/RN................ 85
Tabela 18 - Metabólitos secundários detectados em extratos de Cleome spinosa............. 92
Tabela 19 - Dados de RMN de 1H (300 MHz; CDCl3) e de RMN de 13C (75 MHz;
CDCl3) para a substância CS-EM-3b (140).........................................................................
95
Tabela 20 - Dados de RMN de 1H (300 MHz; CDCl3) e de RMN de 13C (75 MHz;
CDCl3) para a substância CS-EM-4a (141)......................................................................... 97
Tabela 21 - Metabólitos secundários detectados em extratos de Pavonia varians
Moric...................................................................................................................................
98
Tabela 22 - Substâncias voláteis da fração F1 detectadas por CG-EM e confirmadas por
seus dados de IR por CG-FID.............................................................................................
114
Tabela 23 - Substâncias voláteis da fração F2 detectadas via CG-EM............................... 115
LISTAS DE ABREVIATURAS
%AA - percentual antioxidante
DEPT – Distortionless Enhancement by Polarization
COSY – correlation spectroscopy
HMBC – Heteronuclear Multiple Quantun Coference
AAA - ácido acetilaleuritólico
Abs. - absorbância
AcOEt – acetato de etila
ANOVA - análise de variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BDA - Batata-dextrose-ágar
CC - via cromatografia em coluna
CCF - cromatografias em camada fina
c-CJC-B - cis-cajucarina B
CG/MS – cromatografo gasoso acoplado a espectrômetro de massa
CGEM-AR - cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massa equipada com
detecto de ionização de chama
CJC-A - cajucarina A
CJCR- cajucarinolida
CS - Cleome spinosa
CS-EM - fração do extrato metanólico de Cleome spinosa
CTN - trans-crotonina
DCTN - trans-desidrocrotonina
DMSO - dimetilsulfóxido
DNA – ácido desoxiribonucleico
DPPH - 2,2-difenil-picril-hidrazila
EHA – extrato hidroalcóolico
EM - espectros de massas
EtOH - etanol
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
ICJCR - iso-cajucarinolida
ID50 - dose inibitória 50%
IPM - miristato de isopropila
ISCR - isosacacarina
IV - infravermelho
MeOH -metanol
OF - óleo fixo
OMS - Organização Mundial de Saúde
P.F. - ponto de fusão
p.o. – por via oral
PA - Pará
PV - Pavonia varians
RMN de 13C - espectros de ressonância magnética nuclear de carbono-13
RMN de 1H - espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênios
RN - Rio Grande do Norte
SME - sistema microemulsionado
t-CJC-B - trans-cajucarina B
UFRRJ – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
UnP - Universidade Potiguar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO……………………………………………………………………….. 19
2 ABORDAGEM GERAL SOBRE PLANTAS MEDICINAIS.................................... 22
2.1 ASPECTOS SOBRE ETNOBOTÂNICA……………………………………............. 25
3 ABORDAGEM GERAL SOBRE AS FAMÍLIA BRASSICACEAE,
MALVACEAE E EUPHORBIACEAE...........................................................................
29
3.1 FAMÍLIA BRASSICACEAE....................................................................................... 29
3.1.1 Aspectos etnofarmacológicos da família Brassicaceae.......................................... 29
3.1.2 Constituintes químicos da família Brassicaceae.................................................... 31
3.1.2.1 Triterpenos.............................................................................................................. 31
3.1.2.2 Diterpenos............................................................................................................... 35
3.1.2.3 Flavonóides............................................................................................................. 36
3.2 FAMÍLIA MALVACEAE............................................................................................ 43
3.2.1 Aspectos etnofarmacológicos da família Malvaceae............................................. 43
3.2.1.1 Contribuição do gênero Hibiscus............................................................................ 43
3.2.1.2 Contribuição gênero Sida…………………………………………………............ 44
3.2.1.3 Contribuição gênero Pavonia…………………………………………………….. 46
3.2.2 Constituintes químicos da família Malvaceae....................................................... 48
3.2.2.1 Compostos fenólicos e flavonóides……………………………….………............ 50
3.2.2.2 Esteróides e saponinas esteroidais………………………………………………... 55
3.2.2.3 Triterpenos e saponinas triterpênicas.…................................................................. 57
3.2.2.4 Outros metabólitos isolados de Sida spinosa L....................................................... 59
3.3 FAMÍLIA EUPHORBIACEAE.................................................................................... 60
3.3.1 O gênero Cróton........................................................................................................ 61
3.3.1.1 Croton cajucara Benth: aspectos gerais.................................................................. 64
3.3.1.2 Croton cajucara Benth: abordagem farmacológica................................................ 67
3.3.1.2.1 Atividades biológicas da trans-desidrocrotonina................................................. 67
3.3.1.2.2 Atividades biológicas da trans-crotonina............................................................. 67
3.3.1.2.3 Atividades biológicas do óleo essencial............................................................... 68
4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL....................................................................... 71
4.1 MATERIAL VEGETAL............................................................................................... 71
4.1.1 Cleome spinosa Jacq e Pavonia varians Moric....................................................... 71
4.1.2 Croton cajucara Benth.............................................................................................. 71
4.2 MATERIAL E MÉTODOS QUÍMICOS...................................................................... 71
4.3 ESTUDOS FITOQUÍMICO........................................................................................ 72
4.3.1 Cleome spinosa Jacq................................................................................................. 72
4.3.1.1 Separação dos constituintes químicos..................................................................... 72
4.3.2 Pavonia varians Moric…………………………………………….………………. 75
4.3.2.1 Separação dos constituintes químicos…………..……………………….……….. 75
4.3.3 Croton cajucara Benth………………………………………………………….…. 76
4.3.3.1 Extração do óleo fixo de Croton cajucara.............................................................. 76
4.3.3.2 Isolamento de clerodanos das cascas do caule........................................................ 77
4.3.3.3 Obtenção de sistemas microemulsionados….……………………………………. 78
4.4 MATERIAL E MÉTODOS FARMACOLÓGICOS………………………...………. 78
4.4.1 Avaliação da atividade antioxidante……….…………………………………….. 79
4.4.2 Avaliação da atividade antiinflamatória………..……………………………….. 80
4.4.3 Análise estatística………………………………………………………………….. 81
4.4.4 Desenvolvimento in vitro de fungos fitopatogénicos.............................................. 81
4.5 LEVANTAMENTO ETNOBOTÂNICO DE PLANTAS DO LITORAL NORTE
RIOGRANDENSE..............................................................................................................
82
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO……………………………………………………... 84
5.1 ESTUDO ETNOBOTÂNICO DE PLANTAS MEDICINAIS DO LITORAL
NORTE RIOGRANDENSE...............................................................................................
84
5.1.1 Considerações etnobotânicas de Cleome spinosa Jacq.............................................. 89
5.1.2 Considerações etnobotânicas de Pavonia varians Moric........................................... 89
5.2 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DE Cleome spinosa Jacq (BRASSICACEA).......... 92
5.3 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DE Pavonia varians Moric (MALVACEAE)........ 98
5.4 ABORDAGEM FARMACOLÓGICA DE Cleome spinosa Jacq E Pavonia varians
Moric...................................................................................................................................
102
5.4.1 Atividade antioxidante de Cleome spinosa Jacq e Pavonia varians Moric.......... 102
5.4.2 Avaliação da atividade antiinflamatória de Pavonia varians Moric.................... 105
5.5 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DE Croton cajucara Benth
(EUPHORBIACEAE).........................................................................................................
110
5.5.1 Óleo fixo das cascas do caule................................................................................... 110
5.5.2 Estudo Fitoquímico das cascas do caule de Croton cajucara Benth.................... 119
5.5.2.1 Espectrometria de massas de diterpenos do tipo clerodano.................................... 119
5.6 ABORDAGEM FARMACOLÓGICA DE Croton cajucara BENTH......................... 124
5.6.1 Propriedade antifúngica do óleo fixo de Croton cajucara..................................... 124
6 CONCLUSÕES............................................................................................................. 129
REFERÊNCIAS............................................................................................................... 133
ANEXOS........................................................................................................................... 159
A – ESPECTROS DE (2S)-hidroxi-7,4’-dimetoxi-flavanona (CS-EM-3b)....................... 159
B – ESPECTROS DE 5,4’-diidroxi-3,7,3’-trimetoxi-flavanona (CS-EM-4a)................... 172
1 INTRODUÇÃO
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
19
1 INTRODUÇÃO
A utilização de vegetais pela humanidade é conhecida desde épocas mais remotas,
auxiliando as comunidades nas mais diversificadas finalidades: abrigo, vestimentas,
alimentação, condimentos e fragrâncias e, principalmente, para fins medicinais.
Milenarmente, plantas formam a base de sistemas de medicina tradicional amplamente
utilizada por vários grupos étnicos (GURIB – FAKIM, 2006). Até a década de cinqüenta os
remédios vegetais representavam o único recurso terapêutico disponível. A partir de então,
foram substituídos por medicamentos contendo substâncias bioativas extraídas de vegetais,
bem como seus derivados sintéticos e/ou semi-sintéticos (LAPA et al., 2003). A partir da
década de oitenta, ocorreu o aumento significante do uso de plantas medicinais que pode estar
correlacionado com alguns fatores específicos, tais como: a facilidade de obtenção, o baixo
custo e a eficácia demonstrada no combate às doenças. Apesar das plantas nativas serem
amplamente utilizadas por séculos, são raros os exemplos de produtos registrados do Brasil
contendo vegetais. Apesar da vasta flora medicinal disponível a maior parte das plantas
medicinais nativas permanece sendo usada da mesma forma tradicional, com embasamento
empírico (só com informações populares) (BRANDÃO et al., 2006; ALMEIDA, 2003;
MACIEL et al., 2002a; 200b).
Como conseqüência do crescente interesse da sociedade mundial pelo uso de plantas
medicinais, pesquisadores de várias áreas a optaram por projetos multidisciplinares
envolvendo, no mínimo, a Etnobotânica, Etnofarmacologia e a Fitoquímica. A Etnobotânica
abrange dois aspectos fundamentais: a coleta e a utilização da planta. Enquanto que a
Etnofarmacologia é o ramo da Etnobiologia/Etnobotânica que trata das práticas médicas,
especialmente remédios, usados em sistemas tradicionais de medicina. (MACIEL et al.,
2002a; 2002b). A pesquisa fitoquímica objetiva conhecer os constituintes químicos de
espécies vegetais ou avaliar a sua presença (SIMÕES et al, 2007).
As espécies Cleome spinosa e Pavonia varians, deferente da amplitude de estudos que
foram desenvolvidas para o Croton cajucara, são alvos recentes de interesse cientifico, como
demonstrado nos itens a seguir.
Neste trabalho, objetivando-se contribuir com a validação científica da espécie
medicinal Croton cajucara Benth (nativa da região Amazônica do Brasil) e avançar na busca
de novas plantas terapêuticas, as espécies Cleome spinosa Jacq e Pavonia varians Moric
(nativas do litoral Norte-Riograndense), que são alvos recentes de interesse científico, foram
avaliadas em estudos etnobotânico, fitoquímico e farmacológico. No Capítulo 2 encontra-se
uma abordagem geral sobre plantas medicinais e etnobotânica. No Capítulo 3 encontram-se
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
20
dados etnofarmacológicos previamente divulgados para as espécies C. spinosa
(Brassicaceae), P. varians (Malvaceae) e C. cajucara (Euphorbiaceae). Diferente das duas
primeiras, Croton cajucara se enquandra perfeitamente no quesito de planta protótipo para
fins fitoterapêuticos comerciais com possibilidades significativas para legalização pela
ANVISA. A justificativa é dada pela amplitude de estudos científicos que foram realizados
com este Croton. Uma pesquisa etnobotânica contemplando 84 espécies medicinais nativas
do Litoral encontra-se descrita no Capítulo 5 (Resultados e Discussão). Duas destas espécies
(C. spinosa e P. varians) foram alvo de investigações fitofarmacológicas (Capítulo 4). A
parte Experimental deste trabalho está descrita no Capítulo 4. No Capítulo5, encontra-se
além dos Resultados e Discussão, além das considerações e referências bibliográficas.
2 ABORDAGEM GERAL SOBRE PLANTAS MEDICINAIS
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
22
2 ABORDAGEM GERAL SOBRE PLANTAS MEDICINAIS
Plantas medicinais são aquelas que possuem tradição de uso em uma população ou
comunidade e, que são capazes de prevenir, aliviar ou curar enfermidades. Ao serem
processadas para a obtenção de um medicamento, têm-se como resultado o medicamneto
fitoterápico (CARVALHO et al., 2007).
O uso de produtos medicinais a base de plantas é uma prática comum na terapêutica
desde os tempos mais remotos. O mercado de fitoterápicos de caiu com o desenvolvimento
dos medicamentos sintéticos no Pós-Guerra, porém, vem apresentando um crescimento
significativo nas últimas décadas, como tratamento alternativo aos medicamentos da
medicina convencional (CARVALHO et al., 2007; BRANDÃO et al., 2006; ALMEIDA et
al., 2003).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) a medicina tradicional consiste no
conjunto de todos os conhecimentos teóricos e práticos, utilizados para explicar, prevenir e
suprimir transtornos físicos, mentais e sociais, baseados exclusivamente na experiência e na
observação; transmitida oralmente ou por escrito de uma geração a outra (SANTOS e
COELHO-FERREIRA, 2005).
No Brasil, apesar da vasta flora medicinal disponível, a maior parte das plantas
medicinais nativas permanece sendo utilizada da mesma forma tradicional, sendo raros os
exemplos de produtos registrados contendo vegetais (BRANDÃO et al., 2006; ALMEIDA,
2003).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 65 - 80 % dos países em
desenvolvimento dependem de plantas medicinais como única forma de acesso aos cuidados
básicos de saúde e definiu como planta medicinal “todo e qualquer vegetal que possui
substâncias que podem ser utilizadas para fins terapêuticos, em um ou mais órgãos, bem como
que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos” (VEIGA JR., 2005). No Brasil, o órgão
responsável pela comercialização de produtos naturais é a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA) (VEIGA JR., 2005). A partir de 1995, as autoridades da área de saúde
publicaram uma sequência de normas sobre o registro de fitoterápicos alternando-se em
intervalos de 5 anos em média. A portaria nº.6 de 31 de janeiro de 1995 introduziu conceitos e
determinou requisitos tecnológicos e terapêuticos, que se caracterizaram em grande avanço na
normatização de medicamentos fitoterápicos. Com base nesta portaria, tornou-se possível a
diferenciação entre os termos: produto fitoterápico e produto fitoterápico intermediário
(SIMÕES et al., 2007; TAPPIN e LUCHETTI, 2007).
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
23
Segundo a portaria nº.6 de 31 de janeiro de 1995 defini-se como produto fitoterápico
“todo o medicamento tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se exclusivamente
matérias-primas vegetais com finalidade profilática, curativa ou para fins de diagnósticos,
com benefício para o usuário”. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos do
seu uso, assim como da reprodutibilidade e constância de sua qualidade. É o produto final
acabado embalado e rotulado. Na sua preparação podem ser utilizados adjuvantes
farmacêuticos permitidos na legislação vigente. Não podem estar incluídas substâncias
bioativas de outras origens, não sendo considerado produto fitoterápico quaisquer substâncias
ativas, ainda que de origem vegetal isolada ou mesmo suas misturas. Neste último caso
encontra-se o fitofármaco, que por definição “é a substância bioativa, isolada de matérias-
primas vegetais ou mesmo, misturas de substâncias ativas de origem vegetal”. O produto fito
intermediário pode se apresentar sob a forma extrato, tintura, óleo fixo, ou volátil, cera, sumo
e outras formas obtidos de plantas frescas ou secas. Finalmente a matéria prima vegetal é “a
planta fresca ou preparado fitoterápico”. Outra definição importante para a garantia e o
controle de qualidade da produção de fitoterápicos (também faz parte da Portaria nº.6 da
Secretaria de Vigilância Sanitária) refere-se ao termo principio ativo. Segundo a norma,
principio ativo é a “substância ou grupo delas, quimicamente caracterizadas, cuja ação
farmacológica é responsável, total ou parcialmente, pelos efeitos terapêuticos do produto
fitoterápico” (TAPPIN e LUCHETTI, 2007).
Resumidamente, pode-se dizer que a liberação do uso de fitoterápicos depende do
cumprimento de vários requisitos que são divididos em tecnológico e terapêutico. O requisito
tecnológico (relacionados à produção e ao controle de qualidade) aborda o produto a cada
etapa de produção desde a coleta e nomenclatura científica (e popular) até o controle de
qualidade (caracterização farmacognótica e análise fitoquímica qualitativa dos constituintes
da espécie). O requisito terapêutico está correlacionado com a segurança e a eficácia do
medicamento (VEIGA JR et al., 2005).
Mesmo com a globalização da indústria química e a utilização de derivados de plantas
medicinais ainda detém uma pequena parcela do mercado mundial, US$ 14 milhões de um
total estimado de US$ 280 bilhões (cerca de 5% do mercado mundial de produtos
farmacêuticos). No Brasil, o valor gasto em fitoterápicos é da ordem de US$ 300 milhões,
relativamente pequeno, representando cerca de 4% do total do mercado farmacêutico, da
ordem de US$ 7,4 bilhões (CARVALHO et al., 2007). O mercado mundial de produtos
naturais apresenta uma média anual de crescimento industrial estimada em 22%, cujos
indicadores de potencialidade são estimados pela evolução de empresas do ramo (LEMOS et
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
24
al., 2006). Neste contexto, o crescente interesse da sociedade mundial pelo uso de plantas
medicinais vem incentivando os pesquisadores de várias áreas a optarem por projetos
multidisciplinares envolvendo, no mínimo, a Etnobotânica, Etnofarmacologia e a Fitoquímica.
Considerações gerais sobre a etnobotânica são abordadas a seguir. Estratégias para o
desenvolvimento de estudos fitoquímicos encontram-se amplamente documentadas na
literatura (QUEIROZ e HOSTETTMANN, 2006; VIEGAS JR. et al., 2006; ZACCHI et al.,
2006; BARRETO et al., 2005; COSTA NETO, 2004; VEIGA JR. 2004; NETO e NUNES,
2003; SMITH, 2003; MACIEL et al., 2002b; QUEIROZ et al., 2002a; 2002b; KATO, 2001;
WILLIAMS e MANDER, 2001; MATOS, 1997; PINTO et al., 2000; 1997; VEIGA JR. et al.,
1997; CASTIONI et al., 1995; PATITUCCI et al., 1995; POOLE et al., 1990).
Com relação à etnofarmacologia, pode-se dizer que não se trata de uma versão
moderna da farmacologia, já que está relacionada às práticas médicas, especialmente
remédios usados em sistemas tradicionais na medicina. A investigação de plantas medicinais
sob abordagem etnofarmacológica consiste em combinar informações adquiridas junto às
comunidades que fazem uso da flora medicinal, com estudos químicos e farmacológicos
realizados em laboratórios especializados (SIMÕES et al., 2007; MACIEL et al., 2002a). A
Etnofarmacologia é o ramo da Etnobiologia/Etnobotânica que trata das práticas médicas,
especialmente remédios utilizados em sistemas tradicionais de medicina (SIMÕES et al.,
2007; MACIEL et al., 2002b).
De acordo com a abordagem etnofarmacológica, a seleção da espécie vegetal de
interesse é feita pelo uso terapêutico evidenciado por um determinado grupo étnico. A
informação sobre uma planta que tem sido usada por um determinado grupo por um longo
período de tempo, pode sugerir a existência de uma substância potencialmente válida.
Portanto, plantas que apresentam histórico medicinal oferecem uma maior possibilidade de
fonte de novas substâncias bioativas. Neste contexto, a seleção correta de testes biológicos
específicos permitirá uma avaliação precisa do uso terapêutico da espécie vegetal (MACIEL
et al., 2002a).
A avaliação das propriedades farmacológicas de uma determinada planta deve seguir
as indicações terapêuticas empíricas divulgadas por estudos etnobotânicos, contribuindo com
a validação da espécie em estudo (MACIEL et al., 2002a). Como exemplos destacam-se
alguns estudos que foram desenvolvidos em programas multidisciplinares que demonstraram
superioridade na qualidade de seus resultados (COSTA et al., 2007; MACIEL et al., 2007a,b;
2002a,b; 2000; SIMÕES et al., 2007; ALBUQUERQUE e HANAZAZI, 2006; CALIXTO,
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
25
2005; GILBERT e FERREIRA, 2005; PINTO et al., 2002; CECHINEL FILHO e YUNES,
1998; SOUZA-BRITO e SOUZA-BRITO, 1993).
2.1 ASPECTOS SOBRE ETNOBOTÂNICA
A Etnobotânica pode ser conceituada de várias maneiras, dentre as quais destacam-se:
“Disciplina que se ocupa do estudo e conceituações desenvolvidas por qualquer sociedade a
respeito do mundo vegetal”, “Verdadeira botânica científica voltada para o habitat e uso por
uma etnia” e como “Ciência botânica que possui uma etnia especifica”. De maneira geral, a
Etnobotânica abrange dois aspectos fundamentais: a coleta e a utilização da planta (SIMÕES
et al., 2007; MACIEL et al., 2002b). O estudo etnobotânico junto às comunidades
tradicionais consiste: na avaliação da interação humana com todas as espécies do meio
ambiente; em levantamentos sobre a utilização de plantas na farmacopéia caseira e na
economia doméstica; na investigação preliminar da eficácia dos produtos que atingem o
mercado na produção de chás, xaropes, cremes dentre outros (SOUZA e FELFILI, 2006).
A Etnobotânica é citada na literatura como sendo um dos caminhos alternativos que
mais contribuíram nos últimos anos para a descoberta de produtos naturais bioativos
(MACIEL et al., 2002a). Caracteriza-se por ser uma ciência multidisciplinar que
compreende o estudo e a interpretação do conhecimento popular, significado cultural na
relação entre o homem e os elementos da natureza os quais estão presentes no contexto
diário das comunidades. É importante enfatizar que a exploração de recursos naturais
iniciou-se com a evolução da espécie humana, porém no decorrer da sua história, o homem
aprimorou seus instrumentos de trabalho, construindo novas tecnologias, transformando os
espaços rurais em urbanos e adaptando-se a ambientes diversificados (AMOROSO e GELY,
1988). A despeito de tais circunstâncias, resgatar o profundo conhecimento do arsenal
químico da natureza que os povos primitivos e os indígenas detêm, pode ser considerado
fator fundamental para o descobrimento de substâncias tóxicas e medicamentos ao longo do
tempo. Esta convivência e aprendizado tem trazido valiosas contribuições para o
desenvolvimento da pesquisa de produtos naturais. (VIEGAS JR et al., 2006). Segundo,
AMOROSO e GELY (1988), o conhecimento sobre os recursos naturais destas
comunidades, além de indicar o uso de espécies em potencial, podem vir a ensinar novos
modelos para seu uso e manejo.
A partir da década de1990 as pesquisas envolvendo os saberes e as práticas
“tradicionais” ganharam novo sentido indo além da simples compilação de plantas e animais.
Sob a suposição tática de que o sucesso da descoberta de novos fármacos seria maior a partir
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
26
de pesquisas etnodirigidas, houve um incremento significativo em tais pesquisas. A principal
característica da pesquisa etnobotânica, compreende a coleta de informações populares por
meio do método de entrevista direta, com o objetivo de sondagem preliminar a respeito do
uso de espécimes vegetais, posteriormente é feita a coleta “in locu”, seguido de registro
fotográfico. O material vegetal é catalogado em laboratório (ALBUQUERQUE e
HANAZAZI, 2006). A planta ao ser coletada permite além da identificação e caracterização
do seu nome científico, inúmeras informações sobre seu habitat, adaptações ecológicas,
influência interculturais ligadas á utilização prática assim como podemos recuperar
informações de outras regiões, que utilizam a mesma espécie vegetal.
O maior número de espécies vegetais, atualmente, encontra-se na região equatorial da
América do Sul, da África e Ásia. O local onde ocorre o máximo de diversidade quanto á
flora situa-se na América do Sul (Colômbia, Equador e Peru), onde estão concentrados
40.000 espécies vegetais em um território que equivale a 2% da superfície da terra, sendo
assim um local altamente biodiverso e riquíssimo em informações, comparando com outros
locais onde não podemos achar tamanha diversidade. A flora planetária atual encontra-se
ameaçada, o ritmo atual de extinção já está entre 50 a 100 vezes maior do que taxas médias
observadas nos passados. Na América do Sul encontramos 52% de florestas e apenas na
década de 1980 o Brasil respondeu por 28% de perdas florestais tropicais e 14% de outros
tipos de florestas (SIMÕES et al., 2007).
As formas de uso e de preparo dos produtos a base de plantas são muito
diversificadas, assim como também suas utilidades e forma de aplicação. Em conseqüência
do custo reduzido (por serem naturais e de fácil acesso) quando comparado às medicamentos
sintetizados em laboratórios, os produtos a base de plantas medicinais representam o único
recurso terapêutico para a maioria das comunidades tradicionais. O modo como estes
produtos são utilizados é muito variado tanto através de aplicações internas quanto externas.
As internas se restringem a chás, sucos, xaropes, tinturas (extração de ervas com solução
alcoólica ou hidroalcoólica) ou em forma também de extrato (preparação concentrada). Os
produtos que são preparados em soluções para uso externo podem ser usados na forma de
cataplasma (erva pulverizada ou macerada), ungüento (similar a cataplasma, mas utiliza
solventes com consistência mais pastosa), óleos medicinais (dissolução simples da tintura em
um óleo fixo ou azeite como o de girassol ou algodão), pomadas, pastas, cremes, loções,
sabões e géis (ALBUQUERQUE e HANAZAZI, 2006; MACIEL et al., 2002b).
Estudos etnobotânicos no semi-árido brasileiro são ainda muito escassos, o que
reflete a grande falta de interesse de pesquisadores pelas florestas secas. As atuais formas de
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
27
uso e aproveitamento da terra são extremamente precárias e não respeitam a complexidade
desses delicados ecossistemas. Uma das alternativas para solucionar o problema seria o
estudo sobre o conhecimento e uso que as populações locais fazem dos recursos naturais e a
análise detalhada de suas práticas sobre a biodiversidade (ALBUQUERQUE e HANAZAZI,
2006; AMOROSO e GELY, 1988).
Finalmente, pode-se dizer que a etnobotânica colabora com a valorização dos
conhecimentos e as medidas tradicionais da comunidade; com a preservação da flora
utilizando o conhecimento adquirido pela sua investigação científica; subsídios para estudos
farmacológicos, fitoquímicos, étnicos, antropológicos, botânicos e ecológicos; bem como
subsídios ao poder público referente ao desenvolvimento de projetos sócio- econômicos
(SIMÕES et al., 2007).
3 ABORDAGEM GERAL SOBRE AS FAMÍLIAS BRASSICACEAE,
MALVACEAE E EUPHORBIACEAE
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
29
3 ABORDAGEM GERAL SOBRE AS FAMÍLIAS BRASSICACEAE, MALVACEAE E
EUPHORBIACEAE
3.1 FAMÍLIA BRASSICACEAE
3.1.1 Aspectos etnofarmacológicos da família Brassicaceae
As famílias Brassicaceae e Capparaceae, até recentemente eram consideradas famílias
correlacionadas. No entanto, havia questionamentos significativos quanto à monofilia de
Cappareceae, que foi submetida a um detalhado estudo utilizando-se informações sobre
sequência de DNA em cloroplastos. Estes estudos envolveram a realização de análises
filogenéticas usando, preliminarmente, critérios de monofilia (habitat, folhas, flores, estames e
frutos) e na sequência, obtenção e análise dos dados de DNA desenvolvidos em cloroplastos
que permitiram comprovar a filogenia de Brassicaceae e Capparaceae. Os resultados obtidos
possibilitaram que alguns gêneros de Capparaceae integrassem a família Brassicaceae (HALL
et al., 2002). Esta família possui uma distribuição cosmopolita (ampla distribuição mundial)
incluindo cerca de quatrocentos gêneros e mais de quatro mil espécies. Do ponto de vista
econômico, a família Brassicaceae destaca-se em função da grande diversidade de espécie
hortículas, como por exemplo: alcaparras, brócoles, couve de Bruxelas, repolhos, couve-flor
(SARDI e TORDA, 2005; MATTHAUS e OZCAN, 2002).
No Brasil, encontram-se aproximadamente cinquenta espécies que integram a família
Brassicaceae que encontram-se distribuídas nos seguintes gêneros: Capparis, Cleome,
Comonopus, Crateva, Dactylaena, Lepidium e Morisonia (SOUSA, 2005).
A seguir destacam-se aspectos gerais para os gêneros Capparis e Cleome.
Para o gênero Capparis as espécies de maior destaque são: C. spinosa Jack, C.
atamisquea Kuntze, C. cynophallophora L., C. humilis Hass, C. retusa Griseb, C. salicifolia
Griseb, C. speciosa Griseb, C. tweediana Eichler, C. artilogenia L., C. deidua Forssk, C.
flexuosa L., C. ferruginea L., C. ovata L., C. moonii Wight e C. tomentosa L. Como exemplo,
Capparis spinosa (uma planta bastante difundida na flora da Turquia) é utilizada na medicina
folclórica como tonificante, anti-helmítico, depurativa, espectorante, diurética, vasoconstritor,
antiipertensiva, analgésica e antiinflamatória, combate ainda, hidropisia, anemia, aritimia e
gota (ÇALIS et al., 2002).
O gênero Cleome consta de cento e cinquenta espécies formada por plantas herbáceas,
arbustivas e arbóreas; sendo vinte e oito destas nativas e amplamente distribuídas,
preferencialmente em áreas abertas. São usadas como medicinais e ornamentais (PEREIRA et
al., 2007).
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
30
De acordo com o uso tradicional, espécies do gênero Cleome são utilizadas como
estimulantes, antiescorbútico, anti-helmítico, rubefaciente e vesicante, dentre outros (BOSE et
al., 2007). Como exemplos de espécies que são usadas na medicina tradicional destacam-se:
Cleome spinosa Jack, Cleome rutidosperma DC, Cleome droserifolia Forssk, Cleome viscosa
L., Cleome amblycarpa Hassk, Cleome africana Botsch, Cleome brachycarpa Vahl ex DC, e
Cleome chrysantha Decne.
As folhas e raízes de Cleome spinosa Jacq são utilizadas na medicina tradicional; as
folhas após maceração são aplicadas sobre a pele e agem como rubefacientes; em infusão, são
estomáquicas e estimulantes do aparelho digestivo, e são eficazes no combate a leucorréia.
Externamente, utiliza-se o suco das folhas para a redução de otites supuradas e as raízes são
eficazes no tratamento de bronquites asmáticas (COLLINS et al., 2004). O levantamento
bibliográfico de C. spinosa (1950 até 2008) revelou apenas um estudo fitoquímico com
isolamento de diterpenos cembranos e flavonóides (COLLINS et al., 2004).
Cleome rutidosperma D.C. é um arbusto nativo da região oeste da África, encontra-se
também em várias partes tropicais da América e no sudeste da Ásia. O extrato aquoso desta
espécie mostrou atividades antibacteriana e diurética. Estudos fitoquímicos preliminares
realizados com este extrato mostrou a presença de taninos e saponinas, que são amplamente
associados à atividade antibacteriana observada em plantas (BOSE et al., 2007; 2006). Em
outros extratos brutos (metanol, clorofórmio e éter de petróleo) foi possível comprovar as
atividades analgésica e motora (diminuição da atividade locomotora), bem como as atividades
laxativa e diurética no extrato etanólico (BOSE et al., 2007; 2006).
Cleome droserifolia Forssk é um arbusto com aproximadamente 60 cm de altura,
originaria de desertos, especialmente do Egito e da Líbia, tendo sido erradicada em vastas
áreas do Deserto do Sinai. Esta espécie vem sendo utilizada na medicina folclórica no
controle do diabetes. Os extratos clorofórmico, etanólico e aquoso de C. droserifolia
mostraram-se eficazes na redução de índices glicêmicos. O extrato aquoso apresentou
também, atividade antimicrobiana contra Staphylococus aureus, Streptococus faecalis,
Pseudomonus aeruginosa, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumaniae, Escheichia coli e
Candida albicans. Para o extrato etanólico comprovou-se ainda, os efeitos hepatoprotetor,
antiistamínico e diurético. Este extrato exerce ainda, diminuição da pressão arterial (EL-
NAGAR et al., 2005; MOTHANA et al., 2008).
Cleome viscosa L. é uma erva frequentemente encontrada na Índia, utilizada na
medicina tradicional no combate a febre, inflamações, doenças do fígado, bronquite, diarréias
e convulsões infantis. As folhas são benéficas na cicatrização de ferimentos e as sementes
TESE DE DOUTORADO
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31
desta espécie, são utilizadas como antielmítico. O extrato aquoso de C. viscosa apresentou
atividade analgésica, não tendo sido comprovado para este extrato, efeito citotóxico (SING e
WEST, 1991).
3.1.2 Constituintes químicos da família Brassicaceae
Apesar da junção de alguns gêneros da família Capparaceae com a família
Brassicaceae, bem como da volumosa distribuição de gêneros destas famílias, evidencia-se na
literatura, um baixo percentual de trabalhos fitoquímicos reportados. Os principais gêneros
desta família que tiveram sua constituição química investigada são: Maerua, Capparis e
Cleome (ABEL-MOGIG, 1999). Dentre as classes de substâncias predominantes destacam-se
a ocorrência de terpenóides e flavonóides, que serão abordados a seguir. No entanto, as
seguintes classes de metabólitos especiais foram encontradas na família Brassicaceae:
flavonóides (PELOTTO et al., 1998; SHARAF et al. 2000); alcalóides (DELAVEAU et al.,
1973; AHMAD et al., 1992); glicosinolatos (MATTHÄUS e LUFTMANN, 2000;
MATTHÄUS e OZCAN, 2002); glicosídeos indólicos (ÇALIS et al., 1999; 2002); sais de
amônio quartenários (inclusive betaínas) (Mc LEAN et al., 1996; SARRAGIOTTO et al.,
2004); oxindóis (DEKKER et al., 1987) e triterpenos do tipo lupano (ABDEL-MOGIB,
1999).
No gênero Cleome destacam-se as seguintes classes de metabólitos especiais:
alcalóides (DELAVEAU et al. 1973); flavonóides (SHARAF et al., 1997; NASSAR et al.,
2003); fenoxicumarina (RAMACHANDRAN, 1979); diterpenos cembranos (COLLINS et al.,
2004); cumarinas lignóides (ANIL et al. 1985); esteróides glicosilados; triterpenos damaranos
e sais de amônio quaternário (McLEAN et al., 1996; AHMED et al., 2001).
3.1.2.1 Triterpenos
Na família Brassicaceae as classes predominantes de triterpenos são do tipo lupanos e
damaranos. A investigação fitoquímica da espécie Maerua oblogifolia Forssk resultou no
isolamento de três triterpenóides do tipo lupano (Figura 1), denominados de betulina (1),
betulinaldeído (2) e lup-20-en-3β, 30-diol (3) (ABEL-MOGIG, 1999). A betulina é uma
substância com poderes curativos encontrada nas cascas de algumas plantas. É utilizada para
combater inflamações e também na manipulação de cosméticos. O seu derivado ácido
betulínico (4) detém um amplo histórico de atividades farmacológicas, dentre elas destacam-
se as ações antiinflamatória, antitumoral, anti-HIV, antimálaria e citotóxica. Os derivados 2 e 3
também demonstraram ação antitumoral, anti-HIV e citotóxica (PATOCKA, 2003).
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
32
OH
H
H
H
R'
R''
1
2
34
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25 26
27
28
29
30
1. R' = CH2OH, R''=CH3
2. R' = CHOH, R''=CH3
3. R' = CH3, R''=CH2OH
4. R' = CH3, R''=COOH
Figura 1 - Triterpenos do tipo lupano isolados da espécie Maerua oblogifolia Forssk
O estudo realizado na década de 1990 com a espécie Cleome amblyocarpa Barratte &
Murb. Var. resultou no isolamento de diversos triterpenos damaranos (Figura 2): cleocarpanol
(5), hidroxi-cabralealactona (6), cleoginol (7), ambriona (8), cleombinol A (9) e
isocleombinol A (10), cleombinol B (11) (HARRAZ et al., 1995). Estudos posteriores
conduziram ao isolamento de dois outros triterpenos damaranos [15α-acetoxi-braxicarpona-
22(23)eno (12), 11α-15α-diacetoxi-braxicarpona-22(23)eno (13) (Figura 2)] (AHMED, et al.,
2001).
Os constituintes químicos 5 e 7 também foram isolados da espécie Cleome africana
Botsch (coletada no Egito) (TSICHRITZIS et al., 1993). Estes constituintes químicos
[cleocarpanol (5) e cleoginol (7)] também foram isolado de C. africana, proveniente da região
caribenha. Desta espécie, foram obtidos ainda, dezesseis triterpenos damarano [17α-hidroxi-
cabralealactona (14), cabralealactona (15), 3-O-acetil-12β-acetoxi-17α-hidroxi-cabralea-
lactona (16), 3α,17α-dihidroxi-cabralealactona (17), 12β-acetoxi-cleocarpona (18), 12-β-
acetoxi-cleocarpanol (19), 3-O-acetil-12β-hidroxi-cleocarpanol (20), cleocarpone (21), 3-O-
acetil-12β-acetoxi-25-O-etil-cleocarpanol (22), ∆1,2-desidro-cabralealactona (23), 12β-
acetoxi-∆1,2-desidro-cabralealactona (24), ∆1,2, ∆22,23-tetradesidro-cabralealactona (25), 12β-
acetoxi-∆1,2-∆22,23-tetradesidrocabralealactona (26), hemiacetal-cleoginol (27) e 17-hidroxi-
cleoginol (28) (Figura 3) (NAGAYA et al., 1997).
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
33
O
O
OH
OH
O
OH
OH
H
O
O
OH
O O
OH
O
O
O
OAc
OAc
R
OOH
12
34
56
7
89
10
11
1213
14
15
1617
1819
20
2122 23
24
25
26
27
2829
30
5
6
7
8
O
O
O
O
R
AcOAcO
123
45
67
8910
11
1213
141516
17
1819
20
21
22
23
24
28 29
3012. R = OAc13. R = H
Figura 2 - Triterpenos do tipo damarano isolados da espécie Cleome ambliocarpa Barratte & Murb. Var.
9. R = βOAc, R”= H 10. R = αOAc, R”= H 11. R = βOAc, R”= βOAc
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
34
O OO O
12
34
5
6
7
8910
11
12
13
14
15
16
17
1819
2122
23
24
25 26
27
2829
30
20
R1
R2
R3
R4
17
24
R1
R2
R3
O
O
OO
O
O
O
OH
O
OHR1
R1
R1R2
Figura 3 - Triterpenos do tipo damarano isolados da espécie Cleome africana Botsch
O triterpeno cleoginol (7) também foi isolado da espécie Cleome gynandra L. e o
triterpeno damarano bucharial (29) da espécie Cleome droserifolia Forssk (Figura 4) (EL-
ASKARY, 2005; DAS et al., 1999).
O OAc
CH2OH
O
OAc
12
3
4
56
7
89
1112
13
30
141516
171819
20
21
22
23
24
25
26
27
2829
29
Figura 4 - Triterpeno isolado da espécie Cleome droserifolia Forssk
14. R1 = O, R2 = H, R3 = OH, R4 = O 15. R1 = O, R2 = H, R3 = H, R4 = O 16. R1 = α-OAc, β-H, R2 = OAc, R3 = OH, R4 = O 17. R1 = α-OH, β-H, R2 = H, R3 = OH, R4 = O
18. R1 = O, R2 = OAc, R3= H 19. R1 = α-OH, β-H, R2 = OAc, R3 = H 20. R1 = α-OAc, β-H, R2 = OH, R3 = H 21. R1 = O, R2 = H, R3 = H 22. R1 = α-OAc, β-H, R2 = OAc, R3 = CH2CH3 5. R1 = α-OH, β-H, R2 = H, R3 = H
23. R1 = H 24. R1 = OAc
25. R1 = H 26. R1 = OAc
7. R1 = R2 = H 27. R1 = -O- R2
28. R1 = OH, R2 = H
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35
3.1.2.2 Diterpenos
Diterpenos do tipo cembranos ocorrem no gênero Cleome, com citação original para a
lactona diterpênica cleomeloide (30) (Figura 4), obtida na espécie Cleome viscosa L.
(BURKE et al., 1980; MAHATO et al., 1979). O ácido diterpénico cleomaldeído
[(3E,7E,11E)-20-oxo-cembra-3,7,11,15-tetraen-19-oico] (31) (Figura 5), também foi isolado
desta espécie (JENTE et al., 1990).
O
O
OH
H
1
2 3
4 5
6
78910
1112
13
14
15
16
17
18 19
20
30
CH3
HO2CCH3
CH2
CHO31
1
37
19
17
16
2011
14
18
Figura 5 - Diterpenos do tipo cembranos isolados da espécie Cleome viscosa L.
Os diterpenos do tipo cembrano 30 e 31 também foram isolados de Cleome spinosa
(COLLINS et al., 2004). Adicionalmente, outros cembranos foram isolados desta espécie
[cleospinol A (32), B (33), C (34) e D (35) e o derivado esterificado de cleospinol A (36)]
(Figura 6). Os diterpenos cleospinois são derivados de 10R,13S-dihidroxi-4,12-dimetil-1-(1-
metiletenil)-11(E)-ciclotetradeceno (COLLINS et al., 2004).
Figura 6 - Diterpenos cembranos isolados da especie Cleome spinosa Jack
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36
3.1.2.3 Flavonóides
A família Brassicaceae possui uma ampla variedade de flavonóides na forma de
aglicona e glicosilados (Figuras 7 e 8). As estruturas químicas dos flavonóides 43 até 49
(Figura 7) possuem o esqueleto básico de uma aglicona do tipo canferol (3,5,7,4’-
tetrahidroxiflavona). A aglicona correspondente aos flavonóides glicosilados 50 até 54
(Figura 8) apresenta o esqueleto básico da quercetina (3,5,7,3’,4’-pentaxidroxiflavona). A
aglicona correspondente aos flavonóides glicosilados 55 e 56 é do tipo isoramnetina (3,5,7,4’-
tetrahidroxi-3-metoxi-flavona) e o flavonóide glicosilados 57 é do tipo apigenina (5,7,4’-
trihidroxiflavona). Os gêneros Cleome e Capparis são os mais representativos pela ampla
ocorrência desta classe de produtos naturais. A Tabela 1 correlaciona os flavonóides na forma
de agliconas isolados de espécies do gênero Capparis e na Tabela 2 encontram-se exemplos
de flavonóides glicosídicos isolados deste gênero.
O
O
35
7
3'
4'
R1
R3
R2
R4
R5
Figura 7 – Flavonóides na forma de agliconas isolados de espécies do gênero Capparis
O estudo de quatro espécies do gênero Cleome (C. amblycarpa Hassk, C. brachycarpa
Vahl ex DC, C. chrysantha Decne e C. droserifolia Forssk) levou ao isolamento de onze
flavonóides na forma de agliconas (Figura 9) e quatorze flavonóides glicosilados (Figura 8)
(SHARAF et al., 1997). A distribuição dos flavonóides entre espécies do gênero Cleome
encontra-se nas Tabelas 3 e 4. Além de terpenóides e flavonóides, o gênero Cleome ou a
família Brassicaceae apresentam outros tipos de constituintes químicos, alguns deles estão
citados nas Tabelas 5 e 6.
R1 R2 R3 R4 R5 37 OH OH OH H OH 38 OH OH H OH OH 39 OH OH OH OCH3 OH 40 OCH3 OH OH H OH 41 OCH3 OH OH OH OH 42 OCH3 OH OH OCH3 OH
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37
Tabela 1 - Distribuição de flavonóides na forma de agliconas de espécies do gênero Capparis
NOME ESTRUTURA ESPÉCIE*
C. atamisquea
C. cynophallophora
C. humilis
C. retusa
C. salicifolia
C. speciosa
C. tweediana
C. artilogenia
C. decidua
C. spinosa
3,5,7,4’-
Tetrahidroxiflavona
37 + + + + - + + - - -
5,7,3’,4’-
Tetrahidroxiflavona
38 + + - + - + + - - -
3,5,7,4’-Tetrahidroxi-
3-metoxiflavona
39 + - - + + + + - - -
3,5,4’-trihidroxi-7-
metoxiflavona
40 - - - - - - + - - -
3,5,3’,4’-Tetrahidroxi-
7-metoxiflavona
41 - - - - - - + - - -
3,5,4’-Trihidroxi-7,3’-
dimetoxiflavona
42 - - - - - - + - - -
*Capparis atamisquea Kuntze; Capparis cynophallophora L.; Capparis humilis Hass; Capparis retusa Griseb; Capparis salicifolia Griseb; Capparis speciosa Griseb; Capparis tweediana Eichler; Capparis antilogenia L.; Capparis decidua Forssk; Capparis spinosa Jack.
Fonte: SHARAF et al., 1997; PELLOTO et al., 1998
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38
O
O
R1O
OH
OH
OR2
O
O
R1O
OH
OH
OR2
OH
O
O
R1O
OH
OH
OR2
OMe
O
O
OH
OH
OH
R
R
1
2
Figura 8 - Flavonóides glicosilados isolados de espécies do gêneros Capparis e Cleome
R1 R2 43 Ramnose H 44 H Ramnose 45 Ramnose Ramnose 46 Ramnose Glicose 47 Glicose Ramnose 48 H 6”α-L-Ramnosil-6”-β-D-
glucose-β-D-glucosídeo 49 H Ramnoglucosil
R1 R2 50 Ramnose H 51 H Rutina 52 Rutina H 53 Ramnose Ramnose 54 Ramnose Glicose
R1 R2 55 H Rutina 56 Ramnose Ramnose
R1 R2 57 Glicose Glicose
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39
Tabela 2 - Distribuição de flavonóides glicosilados de espécies do gênero Capparis NOME ESTRUTURA ESPÉCIE*
C. artilogenia
C. decidua
C. spinosa
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona -7-ramnose 43 - - -
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona -3-rutinose 44 - - -
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona -3,7-diramnose 45 + + +
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona -3-glucose-7-ramnose 46 - - -
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona -3-ramnose-7-glicose 47 - - -
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-7-[6”α-L-Ramnosil-
6”-β-D-glucoseclucosil]-β-D-glucosídeo
glicoseramnose
48 - - -
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona -3-ramnoglicosídeo 49 - - -
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona -7-ramnose 50 - - -
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona -3-rutina 51 + + +
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona -7-rutina 52 + + +
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona -3,7-diramnose 53 - - -
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona-3-glucose-7-
ramnose
54 + + +
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-3’-metoxiflavona-3-
rutina
55 - - -
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-3’-metoxiflavona-3,7-
diramnose
56 - - -
5,7,4’-trihidroxiflavona-6,8-di-C-glicose 57 - - -
*Capparis antilogenia L.; Capparis decidua Forssk; Capparis spinosa Jack. Fonte: SHARAF et al., 1997; PELLOTO et al., 1998
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40
Tabela 3 - Distribuição de flavonóides na forma aglicona de espécies do gênero Cleome NOME ESTRUTURA ESPÉCIE*
Cleome
amblyocarpa
Cleome
brachycarpa
Cleome
chrysantha
Cleome
droselifolia
5,7,4’-trihidroxi-3-
metoxiflavona
58 + + + +
5,7,4’-trihidroxi-3,3’-
dimetoxiflavona
59 + - - -
5,7,4’-trihidroxi-6,3’-
dimetoxiflavona
60 + + + +
5,4’-dihidroxi-3,6,7-
trimetoxiflavona
61 + + + +
5,7,3’,4’-tetrahidroxi-
3,6-dimetoxiflavona
62 + - - -
5,7,4’-trihidroxi-
6,3’,5’-
trimetoxiflavona
63 + - - +
5,4’-dihidroxi-
3,6,7,3’-
tetrametoxiflavona
64 + + + +
5,3’-dihidroxi-
3,6,7,4’,5’-
pentametoxiflavona
65 + - - +
5,4’-dihidroxi-
3,6,7,8,3’-
pentametoxiflavona
66 - + - +
5-hidroxi-
3,6,7,3’,4’,5’-
hexametoxiflavona
67 + - + +
5,3’-dihidroxi-
3,6,4’,5’-
tetrametoxiflavona
68 - - - +
*Cleome amblycarpa Hassk, Cleome brachycarpa Vahl ex DC, Cleome chrysantha Decne, Cleome droserifolia Forssk. Fonte: SHARAF et al., 1997; PELLOTO et al., 1998
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41
O
O
R2
OH
R6
R3
R1
R4
R5
R7
Figura 9 - Flavonóides na forma de aglicona isolados do gênero Cleome
Tabela 4 - Distribuição de flavonóides glicosilados em espécies do gênero Cleome NOME ESTRUTURA ESPÉCIE*
C. amblyocarpa
C. brachycarpa
C. chrysantha
C. droselifolia
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-7-ramnose 43 + + + +
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-3,7-diramnose 45 + - - -
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-3-glucose-7-ramnose 46 + + + +
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-3-ramnose-7-glicose 47 + + + +
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-7-[6”α-L-Ramnosil-6”-β-D-
glucoseclucosil]-β-D-glucosídeo glicoseramnose
48 + - - -
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-3-ramnoglicosídeo 49 + - - +
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona-7-ramnose 50 + + + +
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona-3-rutina 51 + - - +
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona-7-rutina 52 - + - +
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona-3,7-diramnose 53 + - + +
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona-3-glucose-7-ramnose 54 - - - +
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-3’-metoxiflavona-3-rutina 55 + + + +
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona-3’-metoxiflavona-3,7-
diramnose
56 + + + +
5,7,4’-trihidroxiflavona-6,8-di-C-glicose 57 + - - -
*Cleome amblycarpa Hassk, Cleome brachycarpa Vahl ex DC, Cleome chrysantha Decne, Cleome droserifolia Forssk. Fonte: SHARAF et al., 1997; PELLOTO et al., 1998
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 58 H OH H OCH3 H OH H 59 H OH H OCH3 OCH3 OH H 60 H OH OCH3 H OCH3 OH H 61 H OCH3 OCH3 H H OH H 62 H OH OCH3 OCH3 OH OH H 63 H OH OCH3 OCH3 OCH3 OH OCH3 64 H OCH3 OCH3 H OCH3 OH H 65 H OCH3 OCH3 OCH3 OH OCH3 OCH3 66 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OH H 67 H OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 68 H H OCH3 OCH3 OH OCH3 OCH3
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42
Tabela 5 – Outros metabólitos que ocorrem emespécies vegetais do gênero Cleome CLASSE ESPÉCIE REFERÊNCIA Esteróides glicosídeos C. viscosa L. SRIVASTAVA, 1982 Fenoxi coumarina C. icosandra L. NAIR, 1979 Coumarina liganóide C. viscosa L. RAY et al., 1985 Sais de amônio quaternários C. burmannii
Wight & Arn C. spinosa Jack
MC LEAN et al., 1996
Glicosinolatos C. chelidonii L.f. C. viscosa L.
SONGSAK e LOCKWOOD, 2002
Alcalóides glucosinolatos C. chelidonii L.f. Polifenois C. spinosa Jack SUGA e SHISHIBORI, 1980
Tabela 6 - Outros metabólitos que ocorrem em espécies vegetais da família Brassicasceae CLASSE ESPÉCIE REFERÊNCIA Alcalóides Capparis deidua
Forssk AHMAD et al., 1992
Glicosinolatos Cardaria draba L. Capparis flexuosa L. Capparis ferruginea L. Capparis spinosa Jack e Capparis ovata L.
FRÉCHARD et al., 2002 BROWN e STNART, 1968 MATTHAUS e OZCAN, 2002 AHMED et al., 1972
Glicosilotatos tipo indol Arabidopsis thaliana e Brassica napus L. Isatis tinctoria L.
AGERBICK et al., 2001 FRÉCHARD et al., 2001
Glicosinolatos ésteres do ácido benzóico
Arabidopsis thaliana
(L.) Heynh REICHELT et al., 2002
6(S)-hidroxi-3-oxo-α-ionol glicosídeo
Capparis spinosa Jack ÇALIS et al., 2002
Sais de amônio quaternários Morisonia subcordata e Morisonia americana L. Capparis humilis Hass Capparis spinosa Jack Capparis moonii Wight Capparis deidua Forssk Capparis tormentosa L. Maerua virgata Gilg Maerua glauea Chiov
SARRAGIOTTO et al., 2004 MC LEAN et al., 1996
1-H-indol-3-acetonitrila glicosídeo Capparis spinosa Jack ÇALIS et al., 1999 3-hidroxi-3-metil-4-metoxiindol Capparis tomentosa L. DEKKER et al., 1987 Indol glicosídeos Capparis spinosa Jack ÇALIS et al., 2002
TESE DE DOUTORADO
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43
3.2 FAMÍLIA MALVACEAE
3.2.1 Aspectos etnofarmacológicos da família Malvaceae
A família Malvaceae é composta por 243 gêneros e 4.225 espécies, distribuídas em
todas as partes do mundo, com exceção de regiões muito frias, sendo mais abundantes nas
regiões tropicais da América do Sul (COSTA et al., 2007). Espécies desta família são
amplamente utilizadas como fonte de madeira e de fibras na indústria têxtil, cordoaria e
aniagem, bem como para fins ornamentais, alimentícios e medicinais. Com relação ao uso
terapêutico, vários estudos farmacológicos foram realizados com base no uso etnobotânico,
objetivando a validação do uso tradicional, bem como elucidação de mecanismos de ação de
algumas espécies desta família (SILVA et al., 2006a).
Dentre os gêneros mais numerosos encontram-se Hibiscus (300), Sida (200), Pavonia
(270), Abutilon (100), Nototriche (100), Cristaria (75) e Gossypium (40) (COSTA et al.,
2007; SILVA et al., 2006a; ESTEVES et al., 2006; 2000; HALL et al., 2002). Em função
da ocorrência mais abundante dos gêneros Hibiscus, Sida e Pavonia, nos ítens a seguir
encontram-se um enfoque etnofarmacológico para algumas espécies destes gêneros.
3.2.1.1 Contribuição do gênero Hibiscus
O gênero Hibiscus, até recentemente, era conhecido como rico em plantas
ornamentais, de ocorrência abundante nos Estados Unidos da América (com
representatividade de dezessete espécies de Hibiscus). Entretanto, nos últimos anos seu
potencial alimentício [flores comestíveis, corante alimentício natural, utilização nutracêutica
das sementes (farinha rica em proteínas)] vem sendo difundido (PUCKNABER et al., 2002).
Como exemplos de espécies alimentícias, destacam-se H. mutabilis L., H. syriacus L., H.
hamabo Sieb. et Zucc., H. tileaceous Rubra. Neste contexto, o uso de fibras, mucilagens e
monossacarídeos complexos obtidos a partir do caule, galhos, hastes e ramos, também são
expressivos. Adicionalmente, o óleo é utilizado como lubrificante (PUCKNABER et al.,
2002).
O gênero Hibiscus caracteriza-se por apresentar como principal classe de metabólitos
secundários os flavonóides agliconas ou glucosídeos. Além disso, análises preliminares de
amostras das flores de várias espécies de Hibiscus mostraram conter vitamina A e E, bem
como precursores de carotenos e tocoferois (PUCKHABER et al., 2002). Algumas espécies
deste gênero apresentam atividades farmacológicas como mostrado a seguir.
A espécie Hibiscus syriacus L. é utilizada na medicina tradicional no combate a
diarréia, dores abdominais e leucorreia (KASTURE et al., 2000; LEE et al., 1999; YUN et al.,
TESE DE DOUTORADO
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44
1999). Avaliações farmacológicas realizadas para H. syriacus comprovaram sua ação
inibitória para peroxidação de lipídios e citotoxidade significativa contra células cancerígenas
de humano (YUN et al., 1999). Flavonóides isolados das cascas do caule desta espécie
exibiram atividade antioxidante (LEE et al., 1999).
Hibiscus sabdariffa L. vem sendo utilizado na medicina tradicional como diurético,
estomáquico, afrodisíaco, antisséptico, adstringente, colagogo (estimulação do fluxo biliar),
digestivo, sedativo, laxativo e como remédio para febre e abcesso (MALHOTRA e SIGH,
2007; REANMONGKOL e ITHARAT, 2007; MÜELLER e FRANZ, 1992). O extrato
alcoólico de H. sabdariffa apresentou ação antinociceptiva e a atividade antipirética. Não foi
observada toxicidade aguda em ratos após a administração do extrato aquoso ou etanólico
(REANMONGKOT e ITHARAT, 2007). O efeito imunomodulador desta espécie foi
correlacionado com polissacarídeos (MÜELLER e FRANZ, 1992).
Hibiscus vitifolius L. apresenta atividade antinociceptiva similar aos alcalóides do ópio
envolvendo os sistemas neurotransmissores, sendo também um agente analgésico
(MALHOTRA e SIGH, 2007) e o extrato etanólico de Hibiscus sinensis Mill. apresentou
atividade anticonvulsivante (KASTURE et al., 2000).
3.2.1.2 Contribuição gênero Sida
O gênero Sida encontra-se bem representado nas Américas (México e América
Central), ocorrendo também na África e Índia. No Brasil ocorre mais abundantemente nas
regiões nordeste e sul e, em menor proporção, nas regiões norte, centro-oeste e sudeste
(KAROU et al., 2007; LANS, 2007). Investigações fitoquímicas em espécies deste gênero (S.
galheirensis Ulbr., S. acuta Burn., S. humilis var., S. rhombifolia L., S. spinosa L., S. spp.)
mostraram a presença das várias classes de metabólitos secundários (ácidos graxos,
esteróides, terpenóides, flavonóides, alcalóides e compostos nitrogenados) (SILVA et al.,
2006b; DINAH et al., 2001; PRAKASH et al., 1981). Adicionalmente, espécies do gênero
Sida apresentam uma característica em comum que é a ocorrência de fitoecdisteróides,
detectados em aproximadamente 200 espécies. Tipicamente, são compostos semelhantes ao
matabólito 113 (isolado de Sida spinosa, Figura 21) (DINAH et al., 2001). Este tipo de
produto natural é responsável por atividades biológicas que apresentam os seguintes efeitos:
tonificante, diurético, anabolizante e regulador de índices glicêmicos (DARWISH e
REINECKE, 2003).
No Brasil, a espécie Sida cordifolia L. é conhecida popularmente como malva branca
ou malva branca sedosa, utilizada na medicina folclórica no tratamento de estomatites,
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
45
blenorréia, bronquite asmática e congestão nasal (SILVA, et al., 2006). Na Índia, onde é
conhecida como bala, é utilizada no tratamento de leucorreia, gonorréia, reumatismo, no
combate a dor ciática e debilidade em geral (imunomodulador) (SINGH, 2006). No Irã, Sida
cordifolia é utilizada para combater desinteira crônica (SUTRADHAR et al., 2007).
O extrato aquoso das folhas de S. cordifolia L. foi submetido a testes farmacológicos,
tendo sido comprovado os efeitos antiglicemico, hepatoprotetor, antiinflamatório, analgésico,
com baixa toxicidade. Estes efeitos poderão estar correlacionados com a presença de
alcalóides [efedrina, pseudoefedrina (um vaso constritor potente), vasicinona e vasicina
(componente majoritário)] que foram detectados nas folhas desta espécie (FRANZOTTI,
2000; SILVA, et al., 2006; KANTH e DIWAN, 1998).
A espécie Sida acuta Burm é conhecida por representar uma rica fonte etnobotânica,
no tratamento de malária, asma, inflamação renal, resfriado, febre, cefaléia, úlcera, vermes e
diarréia (KAROU et al., 2005; BANZOUZI et al., 2004). É utilizada também, para neutralizar
o veneno da serpente Bothrops atrox (SILVA et al., 2006). Estudos realizados com S. acuta
(extrato bruto ou substâncias isoladas) têm sido realizados com base nos conhecimentos
tradicionais, para confirmar sua ação terapêutica. As propriedades farmacológicas
comprovadas para esta planta são: antiespasmódica, antimicrobiana, antimalária,
antiplasmódico, antioxidante e citotóxica (KAROU et al., 2007; KAROU et al., 2003).
Os testes realizados para avaliar a atividade antibacteriana de Sida acuta revelaram
que muitos compostos são responsáveis por esta atividade. Polifenois e alcalóides da planta
foram testados separadamente em várias bactérias patogênicas. Os testes revelaram que os
compostos fenólicos apresentam uma boa atividade antimicrobiana in vitro e que esta
atividade foi muito influenciada pelo tempo de estocagem do extrato provavelmente devido à
oxidação dos compostos fenólicos (KAROU et al., 2007). Os primeiros testes antimicrobianos
com o extrato metanólico mostraram significativa atividade para Staphylococus aureus,
Escherichia coli, Bacilus subtilis e Mycobacterium phlei. No entanto, este extrato não
mostrou ação bactericida para Streptococus faecalis, Klebsiella pnsumoniae, Salamonella
tryphimurim, Pseudonomas aeruginosa e Cândida albicans (KAROU et al., 2007).
Estudos fitoquímico sugeriam que a atividade antimalária de Sida acuta estava
relacionada à presença de alcalóides (BANZOUZI et al., 2004; KAROU et al., 2003). Estes
alcalóides mostraram as seguintes propriedades farmacológicas: a propriedade antiplasmodial
foi evidenciada para o alcalóide criptoleína (5-metil indol [2,3b]quinolina) (BANZOUZI et
al., 2004). Adicionalmente, apresentou atividade antiparasitária contra P. falciparum (a
principal espécie parasita responsável pela malária) e efeitos hipotensivo, antipirético,
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
46
antibacteriano e antiinflamatório (KAROU et al., 2007); a ação antiiflamatória foi
comprovada para o alcalóide escopoletina (6-metoxi-7-hidroxicumarina) (Figura 13; estrutura
84). Adicionalmente, apresentou ação inibidora da função da tireóide e não apresentou efeito
hepatóxico (KAROU et al, 2007).
A espécie Sida spinosa L. é utilizada como tonificante e no tratamento contra asma e
outras doenças toráxicas. As folhas são indicadas no tratamento de picadas de cobras. As
raízes e as folhas desta espécie são utilizadas no tratamento de diarréia. As raízes e as partes
aéreas levaram ao isolamento de fictoecesteróides (DARWISH e REINECKE, 2003).
A espécie Sida rhomboidea Roxb. ex Fleming é uma erva encontrada nos pântanos da
Índia onde é utilizada como afrodisíaco, tônico, combate febre, doenças cardíacas e
inflamações em geral (KANTH e DIWAM, 1998). Testes farmacológicos realizados com
extratos de S. rhomboidea revelaram sua ação genotóxica sobre linfócitos tendo sido
comprovado que o extrato etanólico das raízes e o extrato aquoso das folhas foram os que
apresentaram maior efeito genotóxico. Estes dados são significativos já que as folhas são a
parte da planta tradicionalmente utilizada na medicina tradicional (BRUGÉS e REZA, 2007).
Avaliou-se ainda seu efeito antimicrobiano contra Staphylococus aureus e Pseudonomas
aeruginosa. O extrato etanólico apresentou atividade antimicrobiana que foi associada aos
metabólitos terpenoídicos e flavonóides presentes nesta espécie (BRUGÉS e REZA, 2007).
Sida galheirensis Ulbr ocorre em todos os estados do Nordeste do Brasil,
especificamente em meio à caatinga (SILVA et al., 2006). Na medicina popular, as partes
aéreas de S. galheirensis são utilizadas em forma de decocto ou xarope, no combate à tosse e
coqueluches (AGRA et al., 2007)). Atividade antioxidante de S. galheirensis foi justificada
pela presença flavonóides (SILVA et al., 2006).
3.2.1.3 Contribuição gênero Pavonia
O gênero Pavonia ocorre abundantemente nas Américas, com concentração
significativa no sul dos Estados Unidos (ocorrência de mais de 200 espécies), América
Central, Oeste da Índia e América do Sul. Ocorre também, no velho mundo, especificamente
na África. No Brasil existem 134 espécies distribuídas nas regiões nordeste e sudoeste
(ESTEVES, 2006; 1998). Muitas espécies deste gênero são consideradas como plantas
ornamentais, sendo de uso restrito em função da grande dificuldade de cultivo (SELVAN et
al., 2007). Para várias espécies do gênero Pavonia, encontram-se na literatura muitos estudos
botânicos e agronômicos. No entanto, com relação ao enfoque fitoquímico e farmacológico,
incluindo atividade toxicológica, poucos são os estudos reportados até o presente momento.
TESE DE DOUTORADO
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47
As seguintes classes de metabólitos foram encontradas na família Malvaceae: alcalóides
(CORDÓBA et al., 1995); betaínas (McNEIL et al.,1999); diterpenos (BHATT et al.,1983);
esteróides (GOYAL et al., 1989); flavonóides (SILVA et al., 2006b) e saponinas
(CORDÓBA et al., 1995).
Diferentes espécies de Pavonia são utilizadas e indicadas na medicina popular do
Brasil e em países de clima tropical e subtropical para combater tumores de próstata,
adicionalmente, agem como agentes bactericida, vermífugo e purgativo (MARASCIULO et
al., 2006). Como exemplos, destacam-se as espécies Pavonia varians Moric, Pavonia odorata
Willd. e Pavonia distinguenda A. St.-Hil.
No Brasil, as folhas de Pavonia varians (vulgarmente conhecida como cabeça de boi)
são utilizadas para combater infecções do aparelho digestivo, bem como inflamações de boca
e garganta. O levantamento bibliográfico (1950 até 2008) realizado para esta espécie não
revelou nenhum estudo fitoquímico ou farmacológico.
A espécie Pavonia zeylanica apresentou atividade larvicida. Esta propriedade é
bastante importante em termos de saúde pública uma vez que os mosquitos são transmissores
de doenças como malária e dengue. Contribuindo desta forma, com outros produtos de plantas
que têm sido usados em comunidades de muitas partes do mundo contra vetores de espécies
de insetos (VAHITAHA et al., 2002).
Pavonia odorata (trata-se de uma erva com odor aromático) é utilizada na medicina
tradicional da Índia no combate a inflamações, hemorragia de órgãos internos, bem como
antidiarréica, antipirética, estomáquica, asdistringente, tonificante, emoliente, carminativa e
diurética (SELVAN et al., 2007). Cientificamente comprovou-se que esta espécie exerce ação
citotóxica e antitumoral contra células de carcinoma de Erlich (SELVAN et al., 2007). A
analise fotoquímica desta espécie mostrou a presença predominante de terpenos e saponinas, e
resultado positivo para flavonóides, glicosídeos e carboidratos (SELVAN et al., 2007).
Pavonia distinguenda (trata-se de uma planta de pequeno porte) é encontrada na
região sul do Brasil, bem como em países de clima tropical e subtropical com flores róseas,
conhecida popularmente como erva de ovelha (GARCIA, 2007). Esta espécie é conhecida
tradicionalmente por combater tumores de próstata (MARASCIULO et al., 2006).
Cientificamente comprovou-se que esta espécie exerce efeito bactericida (MARASCIULO et
al., 2006).
TESE DE DOUTORADO
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48
3.2.2 Constituintes químicos da família Malvaceae
Investigações com espécies pertencentes à família Malvaceae revelaram a ocorrência
de esteróides, triterpenos, compostos fenólicos, flavonóides (agliconas e glicosídeos),
alcalóides (e outros compostos nitrogenados, com ocorrência abundante de glicinabetaína),
saponinas (esteroidais e triterpênicas) (GORHAM, 1996). Especificamente, o metabólito
glicinabetaína foi isolada dos seguintes gêneros: Hibiscus (isolado de 13 espécies), Sida (6
espécies), Abutilon (6 espécies), Malva (6 espécies), Gossypium, Lavatera e Althaea
(BLUNDEN et al., 2001; GORHAM, 1996).
Os alcalóides encontrados na família Malvaceae são do tipo quinolínicos (vasicinona,
vascinol e vascina), indoquinolínicos, β-fenilaminas (efedrina e pseudoefedrina) e triptaminas
carboxiladas. No gênero Sida por exemplo, as espécies Sida acuta Burn. e Sida cordifolia L.
se destacam pela ocorrência abundante de alcalóides. A Figura 10 mostra alcalóides do tipo
indoquinolínicos [criptolepina (69), quindolinona (70), criptolepinona (71), quindolina (72),
metoxiquindolinas (73)] que foram isolados de Sida acuta e a Figura 11 mostra outros tipos
de alcalóides [efedrina (74), N-metil-triptofano (75), vascina (76), vasicinol (77) e vasicinona
(78)] que foram isolados da espécie Sida cordifolia (KAROU et al., 2005; PRAKASH et al.,
1981).
N
N
CH3
H
N
N
H
N
N
HOMe
N
N
R1O
R
R169
70.R=R1=H 71.R=CH3, R1=H
72 73
Figura 10 - Alcalóides isolados da espécie Sida acuta Burn.
TESE DE DOUTORADO
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49
N
OHH
CH3CH3
NNH(CH3)
H
COOH NCH3CH3
H
H
OH
N
NHOH
R
N
NHOH
OHO
7475 76
7778
Figura 11 - Alcalóides isolados da espécie Sida cordifolia L.
Diferente do produto natural nitrogenado glicinabetaína (79) de ampla ocorrência na
família Malvaceae, o metabólito 17’’’etoxifaeoforbideo (80) isolado das espécies Sida spinosa
L. e Sida galheirensis Ulbr. é de rara ocorrência (Figura 12) (SILVA et al., 2006b).
NN
NN
CH3HHa
HbHc
CH3
CH3
HH
CH3
O
HH
CH3
H
OCH
2
CH3
O OMe
I II
IV IIIV
N CH2
COO
CH3
CH3
CH3
1
23
4 5 67
8
9
10
11
1213
1415
16
17
18
19
20
3'3"
17'17"
17"'
13"13'
13"'
12'
2'
7'
8' 8"
13""
18'
17''''
17'''''
80
+ -
79
Figura 12 - Compostos nitrogenados isolados de espécies da família Malvaceae
TESE DE DOUTORADO
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50
3.2.2.1 Compostos fenólicos e flavonóides
Da espécie Sida acuta foram isolados os seguintes compostos fenólicos: evofolin-“A”
(81) e “B” (82), escopoletina (83), voifoliol (84), loliolida (85) e 4-cetopinorisinol (86)
(Figura 13) (KAROU et al., 2007). Da espécie Sidastrum paniculatum L., foram isolados os
metabólitos fenólicos ácido 3-metoxi-4-hidroxibenzóico (87) e 3-metoxi-4-
hidroxibenzaldeído (88) (Figura 14) (NOGUEIRA et al., 2006).
Da espécie Sida galheirensis Ulbr. foram isolados flavonóides [5,4’-dihidroxi-3,7,3’-
trimetoxiflavona (89), 5,7,4’-trihidroxiflavona (90), 5,7,3’,4’-tetrahidroxiflavona (91) e o
raro produto natural 6,7-dimetoxicumarina (92)] e flavonóides glicosilados [canferol-3-O-β-
D-(6’’-E-p-cumaroil) glicopiranosídeo (93), luteolina 7-O-β-D-glicopiranosídeo (94)] (Figura
15) (SILVA et al., 2006b). Flavonóides glicosilados também foram isolados da espécie Sida
cordifolia L. (Figura 16) (SUTRADHAR et al., 2007).
OH
O
OH
OMe
OHO
OH OH
MeOOMe
O O
MeO
OHOH
O
OH
OO
OH
O
O
OH
H
H
O
OH
MeO
OMe
8182
848385
86
Figura 13 - Compostos fenólicos isolados da espécie Sida acuta Burn.
TESE DE DOUTORADO
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51
HO
OH
OMe
OHO
OH
OMe
87 88
Figura 14 - Compostos fenólicos isolados da espécie Sidastrum paniculatum L.
O
O
R1
R2
R5
R3
R4
O OMeO
MeO
3
5
7
4'
3'
6
78
4a
8a
3
92
O
O
O
OH
OH
OH
O
OHOH
CH2
OH
O
O
OH
93
O O
OOH
OH
OH
O
OHOHOH
CH2
OH 3'4'
594
Figura 15 – Flavonóides na forma de aglicona e glicosilados isolados
de Sida galheirensis Ulbr.
R1 R2 R3 R4 R5 89 OCH3 OH OCH3 OCH3 OH 90 OH OH H H OH 91 OH OH H OH OH
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52
O
O
OH
OH
OH
O
R3
R1
R2
O
OH
OH
OHOH
-CH2
CH3 CH3
-CH2
CH3
CH3
C10H17 =
C5H9 =
Figura 16 - Flavonóides glicosilados isolados da espécie Sida cordifolia L.
Um estudo realizado com flores de vinte e nove espécies de Hibiscus mostrou que este
gênero é rico em flavonóides e antocianinas. O flavonóide aglicona mais comumente
encontrado neste gênero foi a flavona 37 (3,5,7,3’,4’-pentahidroxiflavona), tendo sido
isolados também, outras duas agliconas 103 e 104, um flavonóide glicosídeo (105) e
antocianidinas (98 a 102), apresentados na Figura 17. Na Tabela 7 encontram-se descritos
flavonóides do tipo aglicona que foram isolados de diferentes espécies de Hibiscus (SHUI e
PENG, 2004; PUCKHABER et al., 2002).
Da espécie Pavonia distinguenda A. St.-Hill & Naud., foram isolados os flavonóides
glicosilados canferol-3-O-β-D-(6’’-E-p-coumaroil) glicosídeo (93) e canferol-3-O-β-D-
glicopiranosídeo (106) (Figura 18) (GARCIA, 2007).
R1 R2 R3 95 Glucose H C10H17
96 Glucosil[1→4]glucose H C10H17
97 Glucosil[1→4]glucose C5H9 C10H17
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53
OR1
R3
R2
R4
R5
+
O
O
R1
R2R3
R4
R5
R6
O
O
O
OH OHOH
OH
OOH
OH
OH
CH2OH
105
Figura 17 - Flavonóides do tipo aglicona e antocianidinas isolados do gênero Hibiscus
R1 R2 R3 R4 R5 98 OH OH OH OH H 99 OH OH OH OH OH
100 OH OH OCH3 OH OCH3 101 OH OH OCH3 OH H 102 OH OH OCH3 OH OH
R1 R2 R3 R4 R5 R6 103 OH OH OH OH OH H 37 OH OH OH H OH H
104 OH OH H OH OH OH
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54
Tabela 7 - Distribuição de flavonóides na forma de aglicona em espécies do gênero Hibiscus NOME ESTRUTURA ESPÉCIE*
H. aculeatus
H. calyphyllus
H. coccineus
H. esculentus
H. grandiflorus
H. laeuis
H. martianus
H. moscheutos
H. mutabilis
H. paramutabilis
H. rosa-sinensis
H. striatus lambertianus
H. syriacus “Purble Red”
H. syriacus “The Blues”
H. syriacus
3,5-Dimetoxi-3,3,7,4’-tetra hidroxianto cianidina
98 - - + - - - - - - - - - - + -
3,7,4’-Trihidroxiantocianidina
99 - + - - + - - - - - - - + + +
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiantocianidi na
100 + + + - + + + + + + + + + + -
3,7,4’,5’-Te trahidroxi-3’-metoxian tocianidina
101 - - - - - - - - - - - - + + -
3,7,4’-Trihi droxiantocianidina
102 - - - - - - - - - - - - + + -
3,5,7,3’,4’-Pentahidroxiflavona
103 + + + - + + + + + + + + - - +
3,5,7,4’-Tetrahidroxiflavona
37 - - - - - - - - + + - - + + -
3-Ramnosi na-5,7,3’,4’, 5’-flavona
104 + - - - - - - - - - - - - - -
3,5,7,4’-Te trahidroxiflavona-3-O-glucosídeo
105 - - - + - - - - - - - - - - -
Fonte: SHUI e PENG, 2004; PUCKNABER et al., 2002.
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55
O
O
O
OH OHOH
CH2OH
OH
OOH
OH
106
Figura 18 - Flavonoide glicosídico de Pavonia distinguenda A. St.-Hil.
3.2.2.2 Esteróides e saponinas esteroidais
Da espécie Sida acuta Burm. foram isolados os esteróides mais comumente
encontrados em plantas, tais como: ecdisterona (107), β-sitosterol (108), estigmasterol (109) e
campesterol (110) (Figura 19) (KAROU et al., 2007). Na Figura 20, encontram-se os
esteróides glicosilados [sistosterol-3-O-β-D-glucopiranosídeo (111) e estigmasterol-3-O-β-D-
glucopiranosídeo (112)] que foram isolados de Sida galheirensis Ulbr.. O metabólito 108
também foi isolado de Pavonia distinguenda (SILVA et al., 2006b). É importante destacar a
ocorrência fitoecdisteróis nas espécies Sida spinosa L., S. filicaulis Torr. & Gray e S.
rhombifolia L. (DINAH et al., 2001). Dentre estas espécies, Sida spinosa é a mais rica em
fitoecdisteróides [constituem tipos de esteróides está correlacionados aos hormônios
esteroidais dos invertebrados: 20 hidroxiecdisona, com 27, 28 ou 29 carbonos além do
cromóforo 14-hidroxi-7-en-6-ona e fusão cis A/B(5β-H)], tendo sido identificados os
seguintes metabólitos: 20-hidroxi,24-hidroximetil ecdisona (113), 20-hidroxiecdisona (114),
turquesterona (115), maquisterona “C” (116), 20-hidroxiecdisona-20,22-monoacetonida
(117) (Figura 21) (DARWISH e REINECKE, 2003).
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CH3
OH
OH
CH3
CH3
OHOH
OH
OH
CH3
O
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
CH3
107108
109 110
Figura 19 - Esteróides isolados da espécie Sida acuta Burn.
O O
OH
CH2
OH
OHOH
O O
OH
CH2
OH
OHOH
1
35
6
89
11
12
14
16
18 20
21 22
2425
26
27
2829
111
1
35
6
89
11
12
14
16
18 20
21 22
2425
26
27
2829
112
Figura 20 - Esteróides glicosilados isolados da espécie Sida galheirensis Ulbr.
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OH
OHOH
OH
OH
O
R2
R1
OH
H
OH
OH
OH
O
OH
OO
H 117
Figura 21 – Fitoecdisteróides isolados da Sida spinosa L.
3.2.2.3 Triterpenos e saponinas triterpênicas
Da espécie Pavonia distinguenda A foram identificados os triterpenos lupeol (118),
germanicol (119) e taraxerol (120) (Figura 22) (TIWARY e MINOCHA, 1980).
Do gênero Sidastrum (encontrado na região nordeste do Brasil, conhecido
popularmente como malva-roxa ou malvarisco) destaca-se a espécie Sidastrum paniculatum
L. (NOGUEIRA et al., 2006). O estudo fitoquimico desta espécie levou ao isolamento dos
seguintes metabólitos especiais: compostos fenólicos [m-metoxi-p-hidroxibensóico (87) e m-
metoxi-p-hidroxibenzaldeído (88) (Figura 14)]; flavonóide glicosilado [canferol-3-O-β-D(6”-
E-p-coumaroil) glicosídeo (93) (Figura 15)]; esteróides de ampla ocorrência [sitosterol (108) e
estigmasterol (109) (Figura 19)] e do composto nitrogenado ácido e N-trans-feruloiltiramina
(121) (Figura 23) (GARCIA, 2007; NOGUEIRA et al., 2006). Os metabólitos 93, 108 e 109
também foram isolados da espécie Sidastrum sp, em adição ao flavonóide 5,7-dihidroxi-8,4-
dimetoxiflavona (122) (Figura 23) (SILVA et al., 2006a; 2006b).
R1 R2 113 H CH2OH 114 H H
115 OH H
116 H C2H5
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58
OH
1
35
6
89
11
12
14
18
21
23 24
25
2
4 7
10
13
15
16
17
19
20
22
118
OHH
H H
119
OH
1
35
6
89
11
12
14
18
23 24
25
2
4 7
10
13
15
16
17
120
1920 21
22
26
27
28
2930
Figura 22 – Triterpenos isolados da espécie Pavonia distinguenda A. St.-Hill & Naud.
N
OOH
OMeOH
H
H
O
OMe
OOH
OHOMe
121
122
Figura 23 – Outros constituintes químicos isolados do gênero Sidastrum
O estudo fitoquimico da espécie Malva sylvestris L. levou ao isolamento de
antocianinas, leucocianidinas, carotenóides e uma fitoalexina malvonea (2-metil-3-metoxi-
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59
5,6-dihidroxi-1,4-naftoquinona) (123; Figura 24) (VESHKUROVA et al., 2006; ESIYOK et
al 2004).
O
OH
OOMe
OH
CH3
123
Figura 24 – Fitoalexina malvonea isolada da espécie Malva sylvestris L.
3.2.2.4 Outros metabólitos isolados de Sida spinosa L.
Constituintes pertencentes a outras classes de metabólitos secundários também foram
isolados do Sida spinosa L., tais como: hidrocarbonetos triacontano (124) e 1-eicoseno (125),
ésteres gliceril-1-eicosanoato (126) e p-hidroxipenetil-trans-felurico (127) e do glicosídeo 1-
O-β-D-glucopiranosil-(2S,3S,4R,8Z)-2-[(2’R)-2’-hidroxixipalmito-ilamino]-8-octadecene-
1,3,4’-triol (128) (Figura 25) (DARWISH e REINECKE, 2003).
[CH3(CH2)28CH3] [CH2=CH-(CH2)7CH3]
CH2
O CH2(CH2)17CH3
OCH
CH2
OH
OH
1
2
3
2' 20
126
O
OHO
OMeOH
12
3
45
6
78
1'
2'
3'
4'
1''
2''
127
OCH2OH
H
OHOH
OH
O
NH (CH2)12CH3
O
OH
CH
OH
CH
(CH2)17CH3
128
Figura 25 - Outros Metabólitos Isolados de Sida spinosa L.
3.3 FAMÍLIA EUPHORBIACEAE
124 125
TESE DE DOUTORADO
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60
A família Euphorbiaceae encontra-se amplamente distribuída no reino vegetal e
compreende aproximadamente 300 gêneros e 8000 espécies que ocorrem em todo o mundo,
com concentração significativa nas Américas e África. As euforbiaceas são encontradas em
habitats variados e têm representantes que variam de acordo com o tamanho das árvores. As
flores são sempre monogâmicas e as frutas possuem normalmente, cápsulas com três partes,
onde cada parte contém uma semente oleosa. A família Euphorbiaceae possui gêneros que se
destacam por serem mais abundantes, dentre eles encontram-se: Euphorbia (1600 espécies),
Croton (1000), Phyllantus (480), Acalypha (430), Manihot (160), Jatropha (150), Tragia
(140), Vigia (101), Alchornea (60) (SILVEIRA, 1985; WILSON et al., 1976; WEBSTER,
1967; PAX e HOFFMAN, 1931).
De acordo com SILVEIRA (1985) aproximadamente 1000 espécies do gênero Croton
encontram-se distribuídas em todo o mundo. No entanto, em 1994 reportou-se à existência de
700 espécies (WEBSTER, 1994); constatando-se, portanto, uma incompatibilidade de dados.
Este assunto merece um levantamento bibliográfico mais rigoroso, envolvendo
principalmente, trabalhos divulgados por botânicos.
Recentemente dois trabalhos de revisão com abordagem etnobotânica, fitoquímica e
farmacológica foram divulgados por MACIEL et al., 2006a (O Gênero Croton e Aspectos
Relevantes de Diterpenos Clerodanos) e SALATINO et al., 2007 [Traditional uses, Chemistry
and Pharmacology of Croton species (Euphorbiaceae)]. Dentre as espécies de Croton,
destaca-se pelo maior número de estudos publicados, o Croton cajucara Benth (COSTA et al.
2007; MACIEL et al., 2007a; 2007b; 2006a; 2006b; 2005; 2002a; 2002b; 2000;1998a;
PERAZZO et al., 2007; POERSCH et al., 2007; SANTOS et al., 2006; CAMPOS et al.,
2002; HIRUMA-LIMA et al., 2002a; 2002b; LOPES et al., 2000; GROSSMAN e RASNE,
2001; dentre outras). Em função do volume de trabalhos publicados com a espécie C.
cajucara, a seguir encontram-se considerações específicas sobre esta planta, bem como sobre
o gênero Croton.
TESE DE DOUTORADO
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61
3.3.1 O gênero Croton
De maneira geral, o gênero de qualquer espécie vegetal, se divide em tribo e subtribo.
Dentre as tribos (dos gêneros) que pertencem à família Euphorbiaceae, destacam-se: Cleroda,
Cyclostigma, Klotzschiphytum, Eutropia, Luntia e Eluteria (WEBSTER, 1994). O gênero
Croton, por exemplo, pertence à família Euphorbiaceae, subfamília Crotonoideae e tribo
Crotoneae (MACIEL, 1997). O Quadro 1 mostra alguns exemplos de várias espécies deste
gênero, que encontram-se distribuídas no Brasil (Maciel et al., 2006a).
Quadro 1 - Espécies do gênero Croton que ocorrem no Brasil C. abeggii Urb. & Ekman C. antisyphiliticus Mart. C. argyrophylloides Muell
Arg.
C. inaequilobus Steyerm C. piptocalyx Müll. Arg. C. priscus Croizat C. pullei Lanjouw
C. cajucara Benth C. caperoniifolius Müll. Arg. C. campestris A. St C. celtidifolius Baillon C. cordifolius Baillon C. crustulifer Croizat C. cuneatus Klotz
C. jacobinensis Baillon C. junceus Baillon
C. rhamnifolius Kunth
C. echioides Baillon C. essequiboensis Klotzsch
C. maracayuensis Chodat & Hassler C. matourensis Aubl. C. micans Baillon C. microgyne Croizat C. mucronifolius Müll. Arg.
C. sacaquinha Benth C. salutaris Casar C. sampatik Müll. Arg. C. sepotubensisv Hoehne C. sincorensis Mart. ex Muell Arg. C. sonderianus Müll. Arg. C. sphaerogynus Baillon
C. glechomifolius Müll. Arg. C. goyazensis Müll. Arg. C. gracilescens Müll. Arg.
C. nepetifolius Baillon C. nummularius Baillon
C. tessmannii Mansf C. tetradenius Baillon
C. hemiargyreus Muell Arg. C. heterocalyx Baillon
C. ocalia Klotzsch C. organensis Baillon
C. urucurana Baill C. zehntneri Pax e Hoffm
O progresso científico de pesquisas realizadas com produtos naturais está focado em
investigações multidisciplinares que conduzam a validação do uso medicinal de espécies
vegetais. Neste contexto, é importante destacar que o gênero Croton está representado
internacionalmente pelas espécies Croton zambesicus Muell Arg. (África), Croton lechleri
Muell. Arg. (EUA) e Croton tiglium Klotzsch (Ásia), que atualmente lideram as pesquisas
científicas deste gênero, totalizando 58 artigos publicados em periódicos indexados (MACIEL
et al.; 2006a). Dentre as espécies nativas do Brasil, o Croton cajucara Benth, Croton
zehntneri Pax e Hoffm. e Croton sonderianus Müll Arg. são os destaques por serem os mais
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62
representativos, perfazendo em 2006, um total de 90 artigos publicados. A espécie C.
cajucara é a mais estudada do gênero em todo o mundo, perfazendo até 2006, 64 publicações
inseridas em um contexto científico multidisciplinar (MACIEL et al., 2006a). Outras espécies
do gênero Croton também são alvo de estudos multidisciplinares, tais como: Croton
sonderianus Muell Arg., Croton zehntneri Pax e K. Hoffm, Croton schiedeanus Schltdl,
Croton megalocarpus Hutch, Croton urucurana Baill, Croton eluteria (L.) Sw. e Croton
linearis Jacq (MACIEL et al., 2006a).
O gênero Croton é uma fonte rica em diterpenóides do tipo clerodano. Esta classe de
diterpenos bicíclicos tem seu nome derivado da (-)-clerodina (129; Figura 26), primeiro
diterpeno da série dos clerodanos. Esta substância foi isolada da espécie Clerodendron
infortunatum L. (Verbenaceae) e a partir da determinação de sua estereoqumica postulou-se
que os clerodanos com a quiralidade correspondente à da clerodina seriam designados neo-
clerodanos, e os seus enantiômeros de ent-neo-clerodano (MACIEL et al., 2006a).
129
Figura 26 - Estrutura de (-)-clerodina
O emprego de prefixos indicando modificações na estrutura básica é bastante comum,
como exemplo: ent, seco, nor. O prefixo ent é usado para indicar inversão de todos os centros
quirais, o seco evidencia quebra de alguma ligação do esqueleto anelar e o nor indica que o
produto natural possui um carbono a menos em sua estrutura. Um nor-diterpeno possuirá 19
átomos de carbono e não 20; bisnor, trinor e tetranor, indicam a perda de dois, três ou quatro
átomos de carbono, respectivamente.
A grande maioria dos diterpenos do tipo clerodanos apresentam junção A/B trans (5α,
10β), com configuração relativa cis para os substituintes das posições C-5, C-8 e C-9. Os
diterpenos com junção A/B cis (5α, 10α) exibem, na sua grande maioria, os substituintes das
O
O
O
HH
HH
OAcOAc
12
34
56
7
89
10
1112
TESE DE DOUTORADO
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63
posições C-8 e C-9 com orientação β. As estruturas apresentadas na Figura 27 representam
esqueletos básicos de clerodanos de junção cis e trans (MACIEL et al., 2006a).
Figura 27 - Esqueleto básico de clerodanos
Os diterpenos do tipo clerodano incluem mais de 800 compostos isolados (MACIEL et
al., 2003) dentre os quais um número significativo apresenta atividades biológicas, tais como:
antibacteriana (URZÚA et al., 2006), antimicrobiana (BOUAMAMA et al., 2006),
antifúngica (MUNRO, 2006), fagorrepelente e/ou inseticida (COLL e TANDRON, 2005;
KUBO et al., 1991;), antiviral (COLL e TANDRON, 2005), citotóxica (SHEN et al., 2004),
efeito vasodilatador (GUERRERO et al., 2004), antitumoral (BLOCK et al., 2002).
A diversificação farmacológica dos clerodanos estimula o crescente interesse de
químicos sintéticos que buscaram desenvolver trabalhos de sínteses parciais e/ou totais de
clerodanos bioativos, evidenciando-se, porém, uma forte tendência para clerodanos que
possuem propriedade fagorrepelente (KUBO et al., 1991; JONES et al., 1986). Existe um
número considerável de sínteses totais de clerodanos ópticos e biologicamente ativos: (ARNS
e BARRIAULT, 2006; HAGIWARA et al., 2005; LY et al., 2004; NAKATANI et al., 2003;
GROSSMAN e RASNE, 2001; LIU e SHIA, 1998; ALSMTEAD et al., 1998; LIU et al.,
1997; PIERS et al., 1995; HAGIWARA, et al., 1995; GOLDSMITH e DESHPANDE, 1995;
IIO et al., 1987; JONES et al., 1986; ASADA et al., 1986; SARMA e CHATTOPADHYAY,
1982).
De forma geral, um número significativo de diterpenos do tipo clerodano apresenta
atividades biológicas, tais como: inseticida, antimicrobiana, antiviral, pisicotrópica,
antiulcerogênica e antitumoral. Dentre clerodanos biologicamente ativos destacam-se: 6-β-
acetóxi-2-oxokolavenol na sua forma racêmica com propriedades inseticidas e medicinais, tais
H
Me
Me
Me
A B5
109
8
H
junção cis
H Me
H
Me
Me
A B5
109
8
junção trans
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64
como: antitumoral, antifúngica, antibiótica, antiulcerogênica e psicotrópica (LIU et al., 2003;
MERRITT e LEY, 1992); (16-hidroxicleroda-3,13(14)Z-dieno-15,16-olídeo com ação
antibacteriana (HAGIWARA et al., 1995); linaridial (ASADA et al., 1986); (-)-metil
kolavenato um clerodano obtido na sua forma opticamente ativo (IIO et al., 1987); cis e trans-
cajucarinas B com propriedade inseticida (GOLDSMITH e DESHPANDE, 1995; JONES et
al., 1986); trans-desidrocrotonina e trans-crotonina com propriedades antiulcerogênica e
antiinflamatória, dentre outras (COSTA et al., 2007; MACIEL et al., 2006a; 2002a,b; 2000).
Os estudos multidisciplinares realizados no Brasil com o Croton cajucara, crescem
sistematicamente e ao longo dos últimos dez anos, projetaram internacionalmente o princípio
bioativo trans-desidrocrotonina (DCTN). Atualmente, a DCTN é o diterpeno do tipo 19-nor-
clerodano que detém o maior número de publicações em todo o mundo, somando, até o ano
de 2006, cerca de 32 registros (MACIEL et al., 2006a). Em função do constante avanço
científico das pesquisas deste Croton, estes índices crescem sistematicamente, tendo sido
divulgadas duas revisões intituladas “O Gênero Croton e Aspectos Relevantes de Diterpenos
Clerodanos” (MACIEL et al., 2006a) e “Uma Revisão das Atividades Biológicas da trans-
desidrocrotonina, um produto natural obtido de Croton cajucara (COSTA et al., 2007), onde
se encontram citados 60 artigos pertinentes aos estudos com o Croton cajucara.
Adicionalmente, a importância da DCTN como um agente antitumoral e antimutagênico,
encontra-se divulgado em um artigo que foi intitulado “Aspectos sobre produtos naturais na
descoberta de novos agentes antitumorais e antimutagênicos” (MACIEL et al., 2007b).
A seguir encontram-se discutidos alguns aspectos etnobotânico, fitoquímico e
farmacológico da espécie medicinal Croton cajucara Benth, que mostrou ser rica em
diterpenos bioativos do tipo 19-nor-clerodano.
3.3.1.1 Croton cajucara Benth: aspectos gerais
A espécie vegetal Croton cajucara Benth ocorre amplamente na Amazônia, Região
Norte do Brasil onde é popularmente conhecida como “sacaca” e tem um histórico de uso na
medicina popular. Esta espécie é ingerida na forma de chá ou cápsulas, no combate a diversas
enfermidades (MACIEL et al., 2002a,b). No Estado do Pará, as folhas e cascas de caule do C.
cajucara são usadas no combate a diabetes, diarréia, malária, febre, problemas estomacais,
inflamação do fígado, rins, vesícula e no controle de índices elevados de colesterol. A sacaca
também é comercializada em farmácias de manipulação e, neste caso, o pó das cascas do
caule é vendido em cápsulas (contendo 250 mg). As folhas são comercializadas em feiras
TESE DE DOUTORADO
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65
livres da cidade de Belém-PA, para distúrbios do fígado e auxilia na digestão, principalmente
após ingestão de alimentação rica em gorduras. O pó das folhas é vendido com indicação
hepatoprotetora, para tratamento do diabetes e em dietas de emagrecimento (MACIEL et al.,
2007a; 2007b; 2006a; 2002a,b; 1998a; VEIGA JR. et al., 2005; SOARES, 2004).
Os resultados de testes farmacológicos realizados com princípios bioativos, bem como
com extratos das cascas do caule mostraram as seguintes propriedades farmacológicas: ação
antiinflamatória e antinociceptiva (correlacionados com as indicações da planta para a cura de
inflamações em geral); efeito hipoglicemiante (tratamento de diabetes); atividade
antiespasmódica (cura de diarréia); atividade antiulcerogênica (tratamento de problemas
estomacais como azia, gastrite, úlcera gástrica). Evidenciaram-se ainda, nesta espécie
propriedades biológicas não mencionadas pelos usuários da planta, tais como; atividade
antitumoral, antiestrogênica e citotóxica (COSTA et al., 2007; MACIEL et al., 2007a; 2007b;
2006a; 2002b; 2000; 1998a; VEIGA JR et al., 2005; GRYNBERG et al., 1999; LUNA-
COSTA et al., 1999; CARVALHO et al., 2007). Estudos fitoquímicos realizados com grandes quantidades de folhas e cascas do caule
de Croton cajucara, objetivando o isolamento de substâncias majoritárias que pudessem vir a
ter representatividade em testes biológicos, mostraram que as cascas do caule desta planta são
ricas em diterpenos do tipo clerodano, tendo sido isolados (Figura 28): trans-desidrocrotonina
(DCTN), trans-crotonina (CTN), cis-cajucarina B (c-CJC-B), trans-cajucarina B (t-CJC-B),
cajucarina A (CJC-A), cajucarinolida (CJCR), iso-cajucarinolida (ICJCR), isosacacarina
(ISCR) e o triterpeno ácido acetilaleuritólico (AAA) (MACIEL et al., 2007a; 2006a; 2006b;
2003; 2002b; 2000; 1998a; 1998b; BARRETO et al., 2005; ICHIHARA et al., 1992; KUBO
et al., 1991; ITOKAWA et al., 1990; 1989; SIMÕES 1979).
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66
Figura 28 - Estruturas isoladas da casca do caule de Croton cajucara Benth
O
COOCH3O
H
H
c-CJC-B
O
COOCH3O
H
H
t-CJC-B t-CJC-A
O
COOCH3O
H
COH
O
OH
O
O
ISCR
O H
H
O
O
O OHO
ICJCR
O H
H
O
O
OHO O
CJCR
O
O
H
COOH
H
AAA
O
O
H O
O
H
DCTN
O
O
H O
O
H
CTN
1 3 0 1 3 1 1 3 2
1 3 3 1 3 4 1 3 5
1 3 6 1 3 7 1 3 8
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67
3.3.1.2 Croton cajucara Benth: abordagem farmacológica
3.3.1.2.1 Atividades biológicas da trans-desidrocrotonina
Os diterpenos são uma classe de compostos que apresentam grande variedade de
atividade biológica, muitas das quais podendo ser essenciais para a sobrevivência e o bem
estar de animais (GONZALES et al., 1990). As várias substâncias diterpenoídicas
encontradas na natureza possuem esqueletos diversificados incluindo desde acíclicos,
monocíclicos, bicíclicos e tricíclicos, até policíclicos. Numa abordagem geral, podem ser
citados vários tipos de propriedades que variam de fagorrepelente (KUBO et al., 1991) e
reguladora do crescimento de plantas (HANSON, 1985), até atividades bioativas, como por
exemplo: ação antitumoral, antiinflamatória, antibiótica, antiulcerogênica, analgésica, dentre
outros (MACIEL et al., 2007a; 2007b; 2006a; 2006b). Dentre os terpenóides isolados de
Croton cajucara a trans-desidrocrotonina (DCTN) foi o componente majoritário isolado
(MACIEL et al., 1998a; 1998b) com um rendimento incomum (em se tratando de produto
natural) de 1,4% (MACIEL et al., 2003; 1998a; 1998b). COSTA et al. (2007) publicaram
uma revisão das atividades biológicas da trans-desidrocrotonina, com detalhamento para
todos os tipos de ensaios realizados para cada experimento avaliado. Na Tabela 8 encontra-se
resumido o potencial farmacológico da DCTN.
3.3.1.2.2 Atividades biológicas da trans-crotonina
A trans-crotonina, outro constituinte bioativo da classe dos clerodanos, foi isolado
(0,002%) de Croton cajucara (MACIEL et al., 1998b). As suas atividades biológicas têm sido
descritas na literatura (MACIEL et al., 2000; 2002a; (GRYNBERG et al., 1999). Em função
do baixo teor de isolamento da trans-crotonina (CTN), é comum obter-se CTN-derivado
como produto semissintético, partindo-se da hidrogenação catalítica de DCTN (MACIEL et
al., 2000). Teste para comprovação de atividades antiinflamatória, antinociceptiva e
antiulcerogênica, por exemplo, foram realizados utilizando CTN semissintética (PERAZZO et
al., 2007; MACIEL et al., 2006a). A sua ação biológica em prevenir a formação de ulcerações
da mucosa gástrica em diferentes experimentos com ratos, também foi avaliada. Os resultados
obtido com a CTN são comparáveis com aqueles obtidos com o clerodano DCTN. De maneira
semelhante, também foi possível comprovar para a CTN atividades antisecretora e/ou
propriedade gastoprotetora, anteriormente atribuídas a DCTN (HIMURA-LIMA et al.,
2002a). Um resumo das atividades biológicas da CTN (Figura 28, estrutura química 131)
encontra-se na Tabela 9.
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68
Tabela 8 - Atividades biológicas da trans-desidrocrotonina realizados “in vivo” (130)
ATIVIDADE REFERÊNCIAS
Hiperglicêmica SILVA et al., 2001a; FARIAS et al., 1997
Antigenotóxica e Antimutagênica
POERSCH et al., 2007; AGNER et al., 2001; 1999
Antiulcerogênica RODRÍGUEZ et al., 2004; MACIEL et al., 2000; HIRUMA-LIMA et al., 1999a; SOUZA-BRITO et al., 1998
Antiinflamatória e antinociceptiva
PERAZZO et al., 2007; CARVALHO et al., 1996
Antiestrogênica LUNA COSTA et al., 1999
Cardiovascular SILVA et al., 2005
Citotoxidade e Atividade Antitumoral
MACIEL et al., 2007a; FREIRE et al., 2003; MELO et al., 2001; 2002; 2003; 2004
Hipolipidêmica SILVA et al., 2001b; 2001c
Tabela 9 - Atividades biológicas de trans-crotonina (131)
ATIVIDADE TIPO DE EXPERIMENTO REFERÊNCIAS
Antiinflamatoria e Antinociceptiva
in vivo PERAZZO et al., 2007 MACIEL et al., 2000
Efeitos Antiulcerogênico e citotóxico
in vivo e in vitro HIMURA-LIMA et al., 2002a ALMEIDA et al., 2003
Efeito citotóxico in vivo MACIEL et al., 2007a ANAZETTI et al., 2004, 2003
Antitumor in vitro GRYNBERG et al., 1999
3.3.1.2.3 Atividades biológicas do óleo essencial
O interesse pelo óleo essencial de Croton cajucara Benth se deve ao fato da busca por
um substituto para o Pau-Rosa (Aniba Ducker Kostern), que é abundante em linalol, um
componente de elevado valor comercial. ARAUJO et al. (1971), divulgaram que o óleo
essencial obtido das cascas do caule de C. cajucara é uma fonte rica em linalol, Revelando
um elevado percentual (64,4% ) de linalol. LOPES et al. (2000) e LEMOS et al., (1999)
confirmaram a presença deste metabólito em menores rendimentos, nas folhas deste Croton.
LOPES et al. (2000) avaliaram por CG-EM a composição química do óleo essencial obtido
das folhas de C. cajucara, tendo sido possível identificar a presença de 49 constituintes
(perfazendo um total de 89,6% do volume total de óleo analisado). Dentre eles, destaca-se o
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69
linalol (41.2%), (E)-nerolidol (12.6%) e β-cariofileno (6.9%). A concentração de linalol foi
avaliada em diferentes coletas de C. cajucara, tendo variado entre 30 to 45%. Dentre os
constituintes minoritários (1.1 a 2.0 %) encontram-se: germacreno D, germacreno B,
biciclogermacreno, spatulenol, óxido de cariofileno, β-bourboneno, β-gurjuneno, α-
humuleno, α-muroleno, γ-cadineno e epi-α-murolol. A composição química do oleo fixo
obtido das cascas do caule de C. cajucara foi avaliada por CG-EM, tendo sido divulgada em
publicação recente (SOUZA et al., 2006). Este estudo faz parte deste trabalho e encontra-se
nos Capítulos 4 e 5 (Experimental e Resultados e Discussão, respectivamente).
As atividades biológicas do óleo essencial obtido das cascas do caule de Croton
cajucara vêm sendo divulgadas. Na Tabela 10, destacam-se as atividades que foram
comprovadas para este óleo. Adicionalmente, o efeito fungicida foi evidenciado para o óleo
fixo obtido das cascas do caule deste Croton (SOUZA et al., 2006). Este resultado integra a
parte de Resultados e Discussão do presente trabalho.
Tabela 10 - Atividades biológicas do óleo essencial de Croton cajucara Benth realizadas “in vivo”
ATIVIDADE REFERÊNCIAS
Antiinflamatória e antinociceptiva BIGHETTI et al., 1999
Antiulcerogênica HIMURA-LIMA et al., 1999b, 2000; 2002b
Antileishmanial ROSA, et al., 2003
Antimicrobiana ALVIANO, et al., 2005
4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
TESE DE DOUTORADO
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71
4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.1 MATERIAL VEGETAL
4.1.1 Cleome spinosa Jacq e Pavonia varians Moric
As partes aéreas de Cleome spinosa e Pavonia varians foram coletadas em Pitangui
(RN) e a identificação botânica destas espécies foi realizada pela botânica Maria das Dores
Melo. As exsicatas de Cleome spinosa (No. 00276) e de Pavonia varians (No. 00325) foram
preparadas e depositadas no Herbário da Universidade Potiguar (Rio Grande do Norte) (UnP).
4.1.2 Croton cajucara Benth
O material vegetal utilizado de Croton cajucara foi obtido no mercado Ver-o-peso de
Belém/PA. Uma prévia identificação botânica da planta foi feita por Nelson A. Rosa do
Museu Paraense Emílio Goeldi, tendo sido depositada uma exsicata (No. 247) no herbário
deste Museu. A autenticidade do material vegetal foi confirmada com análises comparativas
do extrato metanólico, via cromatografia em camada fina com padrões autênticos previamente
isolados (MACIEL et al., 1998a,b; 2003).
4.2 MATERIAL E MÉTODOS QUÍMICOS
Os solventes utilizados (hexano, clorofórmio, acetato de etila, etanol e metanol) foram
os da marca Vetec e Nuclear.
Nas separações cromatográficas em coluna, utilizou-se como adsorvente gel de sílica
(35-70 ou 70-230 Mesh) da Merck. As Cromatografias em Camada Fina (CCF) foram
preparadas utilizando-se respectivamente, gel de sílica 60H da marca Vetec e Merck. Para
revelação das placas em CCF foram utilizados ácido sulfúrico/metanol (1:1) e reagente de
Dragendorff, vanilina-ácido sulfúrico. O critério de pureza adotado para as substâncias foi a
obtenção de uma única mancha uniforme em CCF, variando-se o sistema de solvente
empregado,
A evaporação dos solventes contidos nas soluções orgânicas foi efetuada sob pressão
reduzida, em evaporador rotativo do tipo MIFF 35/s. Como fonte de aquecimento foi utilizado
banho térmico com temperatura controlada.
Os espectros na região do infravermelho (IV) foram registrados em espectrofotômetro
Biorad EXCALIBUR Series, modelo FTS 3000MX com transformada de Fourrier. Foram
utilizadas pastilhas de KBr para as substâncias sólidas contendo aproximadamente 1% de
amostra. As frequências de absorção foram medidas em unidades de número de ondas (cm-1).
TESE DE DOUTORADO
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72
Os pontos de fusão foram determinados em um aparelho de ponto de fusão (MQAPF -
301), com um termômetro aferido em 3ºC.
Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênios (RMN de 1H) e de
carbono-13 (RMN de 13C) foram registrados em espectrômetro Varian, modelo Gemini,
operando a 300 e 75 MHz, respectivamente e em espectrômetro Varian, modelo Mercury 200,
operando a 200 MHz (RMN de 1H) e 50 MHz (RMN de 13C). O padrão utilizado como
referência interna foi o sinal do próprio solvente empregado para solubilizar as amostras. Os
solventes deuterados usados em espectroscopia de RMN foram os da marca Sigma e Merck.
Os espectros de massas (EM) foram registrados em espectrômetro CG/MS Finnigan -
4000 e VG Auto Spec Q - 70eV (ambos com baixa resolução).
As análises em CGEM-AR foram executadas utilizando um cromatográfo gasoso HP
modelo 5890 equipado com um FID (detector de ionização de chama, fornecido com o
hidrogênio e ar de elevada pureza) com o injetor, modelo split (1:20), na temperatura 270°C e
detector em 300°C. Como também em um cromatográfo HP modelo 5880 (analisador
quadrupolo), operado no modo de impacto do elétron (70eV) acoplado a um espectrômetro de
massa HP modelo 5897A. No espectrômetro de massa a escala de varredura foi de 40 a 600
a.m.u.. Foi utilizado hidrogênio altamente puro como gás de arraste em uma velocidade linear
de 2mL min-1. A temperatura do forno foi programada de 110°C a 160°C em 2°C min-1 e
(nenhuma pressão) e de 290°C a 5°C min-1 (pressão de 5 minutos).
4.3 ESTUDOS FITOQUÍMICO
4.3.1 Cleome spinosa Jacq
O material vegetal (parte aérea) de Cleome spinosa (600 g), previamente triturada e foi
submetido a duas extrações via percolação (24 h para cada uma delas), com clorofórmio, e na
sequência, utilizou-se MeOH/H20 (7:3). As porções solúveis em metanol/água (hidrofílico) e
clorofórmico (lipofílico) obtidos foram submetidas a um procedimento analítico (metodologia
desenvolvida por MATOS, 1997) para avaliação do perfil químico (prospecção analítica). Os
metabólitos secundários detectados nestes extratos encontram-se descritos no Capítulo 5.
4.3.1.1 Separação dos constituintes Químicos O material vegetal (parte aérea) de Cleome spinosa (2,7 kg), previamente moído, foi
submetido à extração via percolação, com MeOH/H20 (7:3). O extrato hidroalcoólico (126 g)
obtido foi cromatografado em coluna filtrante de sílica gel (35-70 Mesh), tendo sido utilizado
TESE DE DOUTORADO
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73
como eluentes de hexano:acetato de etila:metanol:água considerando suas diferentes
polaridades. Foram obtidas 41 frações (250 mL cada) (Tabela 11). Após análise por
cromatografia em camada fina (CCF) foram reunidas fornecendo 10 grupos de frações
designados de CS-EM-1 até CS-EM-10 (Cleome spinosa-Extrato Metanólico-grupo de fração
correspondente) (Tabela 12).
Tabela 11 - Procedimento Cromatográfico do Extrato metanólico de Cleome spinosa FRAÇÕES OBTIDAS SOLVENTE MASSA OBTIDA (g) F1 Hexano 3,30 F2 - F3 Hexano- acetato de etila (95:5) 0,80 F4 - F5 Hexano-acetato de etila (95:5) 0,75 F6 - F8 Hexano-acetato de etila (90:10) 2,80 F9 - F10 Hexano-acetato de etila (90:10) 1,20 F11 - F13 Hexano-acetato de etila (85:15) 1,10 F14 - F16 Hexano-acetato de etila (85:15) 1,60 F17 - F23 Hexano-acetato de etila (80:20) 1,20 F24 -F28 Hexano-acetato de etila (75:25) 1,10 F29 Hexano-acetato de etila (70:30) 0,80 F30 - F31 Hexano-acetato de etila (1:1) 4,75 F32 - F35 Hexano-Acetato de etila (20:80) 10,5 F36 - F37 Acetato de etila 24,75 F38 Acetato de etila – metanol (50:50) 27,01 F39 Metanol 11,01 F40 Metanol-água (90:10) 6,30 F41 Metanol-água (80:20) 10,39
Tabela 12 - Reunião de grupos de frações obtidas do procedimento cromatográfico do extrato metanólico das partes aéreas de Cleome Spinosa FRAÇÕES FRAÇÕES REUNIDAS MASSA OBTIDA (g) F1 CS-EM-1 3,30 F2 - F5 CS-EM-2 1,55 F6 - F29 CS-EM-3 9,80 F30 - F31 CS-EM-4 4,75 F32 - F35 CS-EM-5 10,35 F36 - F37 CS-EM-6 24,75 F38 CS-EM-7 27,01 F39 CS-EM-8 11,01 F40 CS-EM-9 6,30 F41 CS-EM-10 10,39
O grupo de fração CS-EM-1 (3,30 g) foi submetido a um novo procedimento
cromatográfico em coluna de sílica gel (70-230 Mesh), utilizando como eluentes
hexano:acetato de etila com diferentes polaridades. Neste procedimento foram obtidas 23
TESE DE DOUTORADO
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74
frações (50 mL cada fração) que após análise de CCF permitiu reunir os seguintes grupos: F1,
F2-4, F5, F6, F7-8, F9-10, F11-15 e F16-23, como mostrado na Tabela 13.
Tabela 13 - Refracionamentos do grupo de fração CS-EM-1 FRAÇÕES REUNIDAS SOLVENTE MASSA
OBTIDA (g) F1 Hexano 0,10 F2-4 Hexano-acetato de etila (95:5) 1,30 F5 Hexano-acetato de etila (95:5) 0,05 F6 Hexano-acetato de etila (90:10) 1,40 F7-8 Hexano-acetato de etila (90:10) 0,05 F9-10 Hexano-acetato de etila (85:15) 0,10 F11-15 Hexano-acetato de etila (85:15) 0,08 F16-13 Hexano-acetato de etila (80:20) 0,10
O grupo de frações CS-EM-3 (9,80 g) foi submetido a um novo fracionamento
cromatográfico de acordo com o mostrado na Tabela 14. As frações F5, F6, F7 e F8 foram
reunidas após análise por CCF fornecendo o grupo F5-8, conduzindo ao isolamento da
substância CS-EM-3a. Similarmente, reuniu-se os seguintes grupos de frações F9-11, F12-13,
F14-23 levaram ao isolamento das substâncias CS-EM-3b, CS-EM-3c e CS-EM-3d,
respectivamente.
Tabela 14 - Refracionamentos do grupo de fração CS-EM-3 FRAÇÕES REUNIDAS SOLVENTE MASSA
OBTIDA (g) F1-4 Hexano 0,5 F5-8 Hexano-acetato de etila (98:2) 1,5 F9-11 Hexano-acetato de etila (97:3) 1,2 F12-13 Hexano-acetato de etila (95:5) 1,4 F14-23 Hexano-acetato de etila (90:10) 1,8 F24-34 Hexano-acetato de etila (85:15) 2,5 F35-48 Hexano-acetato de etila (80:20) 0,8
O grupo de fração CS-EM-4 (4,75 g), foi submetido a um novo fracionamento
cromatográfico de acordo com o mostrado na Tabela 15. Após análises por CCF reuniu-se
novos grupos de frações. Os grupos F10-12, F13-14 e F15-16 continham um sólido amarelo
que foi submetido a sucessivas lavagens com mistura de hexano-acetato de etila, que após
purificação por recristalização [hexano-acetato de etila (1:1)] levou ao isolamento da
substância CS-EM-4a.
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75
Os grupos de frações CS-EM-2, CS-EM-5 até CS-EM-10 encontram-se em fase de avaliação.
Tabela 15 - Refracionamentos do grupo de fração CS-EM-4 FRAÇÕES REUNIDAS SOLVENTE MASSA
OBTIDA (g) F1-4 Hexano 0,15 F5 Hexano-acetato de etila (98:2) 0,15 F6 Hexano-acetato de etila (95:5) 0,30 F7-9 Hexano-acetato de etila (95:5) 0,25 F10-12 Hexano-acetato de etila (90:10) 0,20 F13-14 Hexano-acetato de etila (85:15) 0,80 F15-16 Hexano-acetato de etila (70:30) 0,25 F17-20 Hexano-acetato de etila (50:50) 0,95 F21-23 Hexano-acetato de etila (50:50) 1,15
4.3.2 Pavonia varians Moric No estudo de prospecção analítica realizado para P. varians utilizou-se 620,0 g de
material vegetal (raízes e partes aéreas, utilizados após moagem) foram utilizados. Este
material sofreu duas extrações via percolação (24 h), tendo sido obtido inicialmente um
extrato lipofílico (extração com éter etílico) e na sequência, obteve-se o extrato hidroalcoólico
[hidrofílico; MeOH/H20 (7:3)]. Estes extratos (lipofílico e hidrofílico) foram submetidos
(separadamente) a testes químicos preliminares (prospecção analítica, metodologia
desenvolvida por MATOS, 1997).
Parte do extrato lipofílico foi submetido às reações de caracterização descritas no
Esquema 1. O material remanescente foi submetido à hidrólise alcalina (NaOH, 70%) como
mostrado no Esquema 2.
O extrato hidroalcoólico foi submetido a testes qualitativos que levaram a detecção de
algumas classes de metabólitos secundários Esquema 3.
4.3.2.1 Separação dos Constituintes Químicos O material vegetal de Pavonia varians Moric (3,4 kg) foi moído e submetido à
extração (via percolação) com uma mistura de solventes polares [MeOH/H20 (7:3)], tendo
sido obtidos 184,7 g de extrato hidroalcoólico [PV-HA; (183 g)]. Este extrato foi submetido a
fracionamento cromatográfico (sílica gel 230-80 Mesh), com eluição dos seguintes solventes:
cloreto de metileno, metanol, água (utilizados em gradiente de polaridade), resultando na
obtenção de 42 frações (125 mL/fração). Após análises via cromatografia em camada delgada
(CCF) foram reunidos vários grupos de frações, como mostrado na Tabela 16. Os grupos de
frações F1a-1f até F11a-11b se encontram em fase de avaliação.
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Tabela 16 - Grupos de frações resultantes do procedimento cromatográfico do extrato hidroalcoólico (PV-HA) de Pavonia varians
FRAÇÕES REUNIDAS SOLVENTE MASSA OBTIDA (g)
F1a-1f Cloreto de metileno 2,0 F2a-2f Cloreto de metileno 2,5 F3a-3c Cloreto de metileno 8,8 F4a-4h Acetato de etila 12,5 F5a-5b Acetato de etila 25,3 F6a Metanol 28,0 F7a-7b Metanol 7,6 F8a-8b Metanol-água 30% 13,6 F9a-9e Matanol-agua 1:1 5,0 F10a-10d Metanol-água 1:1 4,0 F11a-11b Água 2,0
4.3.3 Croton cajucara Benth
4.3.3.1 Extração do Óleo Fixo de Croton cajucara
A partir das cascas do caule de Croton cajucara, adquirido comercialmente em épocas
diferentes, foi seco em estufa a temperatura de 40oC, e moído em moinho de facas do tipo
Willey. Foi obtido um pó submetido a dois procedimentos diferentes: extração via percolação
e extração via fluido supercrítico (com altas pressões e temperatura moderada).
A extração do óleo fixo via fluido supercrítico foi realizada utilizando-se 109g de
material vegetal (cascas do caule de C. cajucara Benth), triturado e peneirado com
granulometria entre 28 a 45 Mesh (necessária para o uso no processo de extração de fluido
supercrítico). O pó obtido foi empacotado e submetido por aproximadamente 4 horas, a um
fluxo de gás CO2, com pressão variando entre 66-70 bar e temperatura de 55ºC.
A extração do óleo fixo via percolação foi realizada utilizando-se 423 g de material
vegetal (cascas do caule de C. cajucara Benth). O extrato metanólico (EM) obtido após
redução do solvente, foi submetido a fracionamento cromatográfico convencional (MACIEL
et al., 2002a), utilizando-se como adsorvente sílica gel (70-230 Mesh) da Merck, tendo sido
obtido 6 frações [FA,B,C,D,E,F eluídas com hexano/AcOEt (100:0 – 85:15%)], como mostrado
no Esquema 4. As frações FA e FB [eluídas com hexano/AcOEt (100:0 e 98:2,
respectivamente)] foram reunidas e forneceram 13g (3,14%) de óleo fixo (OF-CC-FAB). A
fração resultante (OF-CC-FAB) sofreu um novo procedimento cromatográfico gerando quatro
novas frações (OF-CC-F1,2,3,4). A fração F1 foi eluída em hexano/AcOEt (100:0 - 98:2), F2
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77
em hexano/AcOEt (95:5), F3 em hexano/AcOEt (90:10) e F4 em hexano/AcOEt (85:15).
Apenas a fração F1 sofreu esterificação com diazometano.
A fração F1 (esterificada) e as frações F2-4 (não-esterificadas) provenientes da
extração via percolação foram analisadas por CG-FID e CG-EM, tendo sido utilizado um
cromatográfo de fase gasosa HP modelo 5890 equipado com um detector de ionização de
chama a 300ºC e injetor em modo split (1:20) na temperatura de 270°C. As análises por CG-
EM foram realizadas em um cromatográfo HP modelo 5880 acoplado a um espectrômetro de
massas HP modelo 5897A, operado no modo de impacto de elétrons (70eV) com analisador
quadrupolo. No espectrômetro de massas a escala de varredura foi de 40 a 600 a.m.u.. Foi
utilizado hidrogênio altamente puro como gás carreador em uma velocidade linear de 2mL
min-1. A temperatura do forno foi programada de 110°C a 160°C com razão de aqueciemnto
de 2°C min-1 e, em seguida, de 290°C a razão de 5°C min-1, seguida de isoterma de 5 minutos.
Em todas as análises foi utilizada coluna capilar de sílica de 25 m de comprimento, 0,25 mm
de i.d. e película de 0,25 mm de SE-54 da fase estacionária (5% de fenil e 1% de vinil em
metil silicone). As identificações foram realizadas por comparação dos dados de
cromatografia (índices de retenção) e espectrometria de massas obtidos de padrões, da
literatura e de espectrotecas (Wiley 275).
4.3.3.2 Isolamento de Clerodanos das Cascas do Caule
As cascas do caule de Croton cajucara Benth foram coletadas em Jacundá-PA. O
material vegetal foi seco em estufa a temperatura de 40oC, e moído em moinho de facas do
tipo Willey. Utilizou-se 3 Kg de pó da casca do caule para obtenção do extrato metanólico via
percolação. As soluções foram concentradas em evaporador sob pressão reduzida dando
origem ao extrato metanólico. Este extrato sofreu fracionamento cromatográfico, utilizando-se
como adsorvente gel de sílica (70-230 Mesh) de acordo com metodologia previamente
reportada (MACIEL et al., 1998b).
O extrato metanólico (150,8 g) forneceu, após filtração em coluna aberta de gel de
sílica (35-70 Mesh), as frações A (eluída em hexano), B (eluída em diclorometano) e C
(eluída em metanol). A fração B sofreu nova eluição em coluna aberta de gel de sílica (35-70
Mesh), utilizando hexano-CH2Cl2-MeOH em gradiente de polaridade. Foram coletadas 53
frações, que sofreram monitoramento por cromatografia de camada fina (CCF) e produziram
6 grupos de frações (F7-21, F22-25, F26-29, F30-33, F34-41 e F42-53), tendo sido possível
isolar 9 g do clerodano DCTN (130), 0,048 g de CTN (131), 0,04 de c-CJC-B (133), 0,08 g de
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78
t-CJC-B (134), 0,02 de ISCR (136) e 0,01 g de CJCR (137) (Figura 28; Capítulo 2). Estes
clerodanos [trans-desidrocrotonina (DCTN), trans-crotonina (CTN), cis e trans-cajucarinas
B, isosacacarina (ISCR) e cajucarinolida (CJCR)] foram identificados via análises de CCF por
comparação com padrões autênticos [previamente isolados, purificados e caracterizados
(Maciel et al., 2007a; 2006b; 2003; 1998a,b; 1997)], tendo sido utilizados para estudo de
espectrometria de massas.
4.3.3.3 Obtenção de Sistemas Microemulsionados
As microemulsões (SME-1 e SME-4) foram preparadas de acordo com GOMES et al.,
2006, utilizando-se a mistura Tween 80 e Span 20 (3:1) como tensoativo, miristato de
isopropila (IPM) como fase óleo e água bidestilada. Em apenas um dos sistemas testados
(SME-1) foi utilizado etanol como cotensoativo na razão C/T = 1. Os diagramas de fases
foram obtidos a partir da titulação com água bidestilada e fase oleosa (quando necessário) de
misturas pré-determinadas contendo tensoativo/cotensoativo. O sistema microemulsionado 1
(SME-1) foi constituído de 35% etanol/tween 80/Span 20; 60% de água bidestilada; 5% de
miristato de isopropila e o sistema microemulsionado 4 (SME-4) de 30% tween 80/Span 20;
5% de água bidestilada; 65% de miristato de isopropila (GOMES et al., 2006).
4.4 MATERIAL E MÉTODOS FARMACOLÓGICOS
O material utilizado nas formulações biológicas do tipo microemulsão (tensoativos,
co-tensoativo e fase óleo) foram da marca Aldrich. Os solventes utilizados [etanol (EtOH),
metanol (MeOH) e dimetilsulfóxido (DMSO)] foram os da marca Vetec, CRQ e Nuclear; 2,2-
difenil-picril-hidrazila (Aldrich); Fentanil (Janssen Farmacêutica), indometacina (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, USA), acido acético glacial, cloreto de sódio, bicarbonato de
sódio (Merck-Alemanha), éter sulfúrico (Unilab-Brasil).
Todas as drogas testadas na avaliação da atividade antiinflamatória (injetadas por via
parenteral), antes do seu uso, foram solubilizadas em solução salina (NaCl 0,9%). A diluição
das drogas administradas pela via oral foi realizada com água. Na dissolução da indometacina
usou−se solução de bicarbonato de sódio a 5%.
Os Camundongos machos do tipo albinos (Mus musculus) [adultos (20−30 g)],
utilizados nos experimentos que avaliaram a ação antiinflamatória de Pavonia varians Moric,
foram fornecidos pelo Biotério do Departamento de Ciências Fisiológicas/IB/ UFRRJ. Os pré-
tratamentos dos animais com o veículo (animais controle), com o extrato ou diferentes
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79
substâncias foram sempre realizados em concentrações adequadas para a administração de um
volume constante de 10 mL/kg. As administrações antecediam 30 min. (via subcutânea) e 60
min. (via oral) aos testes de atividade farmacológica.
Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura e iluminação
(ciclo claro/escuro de 12 h), com água e ração ad libitum, permanecendo no laboratório por
um período de adaptação de pelo menos uma hora antes dos experimentos, normalmente
iniciados às 09:00 horas. Quando da administração pela via oral (p.o.), os animais
permaneciam em jejum por 8 h.
Após os testes de atividades farmacológicas os animais eram sacrificados por anestesia
etérea e todos os experimentos foram desenvolvidos seguindo normas que envolvem cuidados
com animais de laboratório e normas éticas para o seu uso em experimentos com dor
(ZIMMERMANN, 1986; CIOMS, 1985, PORTER, 1992).
Os fungos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii utilizados
para avaliação da ação fungicida de Croton cajucara Benth, foram obtidos junto a micoteca
do setor de fitopatologia da UFRRJ e propagados em meio de cultura Batata-dextrose-ágar
(BDA).
4.4.1 Avaliação da Atividade Antioxidante
Os extratos hidroalcoólicos de Cleome spinosa (CS) e de Pavonia varians (PV) foram
solubilizados nos sistemas microemulsionados SME-1 (CS-SME-1) e SME-4 (CS-SME-4). A
avaliação da atividade antioxidante foi realizada via captura do radical 2,2-difenil-picril-
hidrazila (DPPH) (MENSOR et al., 2001). Foram preparadas soluções estoque de cada extrato
na concentração de 1 mg/mL (extrato/SME). O ensaio foi realizado em microplacas de 96
poços, nas quais foram feitas 6 diluições sucessivas das amostras a partir da concentração de
710 µg/mL, sendo adicionado posteriormente, uma solução de 0,3mM de DPPH. Após 30
minutos no escuro, a leitura da absorbância (Abs.) foi realizada, em leitora Elisa, a 490nm.
Foram realizados quatro ensaios independentes, todos em triplicata. O percentual antioxidante
(%AA) foi calculado a partir da Equação 1:
( )
−−= 100100% x
A
AAAA
c
ba (1)
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onde: Aa = abs. da amostra com DPPH; Ab = abs. do branco e Ac = abs. do controle. Os
valores de EC50 foram determinados por regressão linear.
4.4.2 Avaliação da Atividade Antiinflamatória
No teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético que permite avaliar a
atividade antinociceptiva de uma determinada droga, utilizou-se a metodologia descrita por
KOSTER et al. (1959), na qual grupos experimentais de pelo menos 6 camundongos foram
pré−tratados (60xmin.) pela via oral (p.o.) com o veículo (água), com o extrato hidroalcoólico
da Pavonia varians Moric (EHA; 0,1, 0,3 e 1 g/kg) ou com indometacina (10 mg/kg),
utilizada como controle positivo do teste. Após 60 min. todos os animais foram injetados com
ácido acético diluído em salina (1,2%,x100µL/10 g, i.p.). As contorções abdominais,
consideradas como contrações da parede abdominal seguidas por extensão de pelo menos uma
das patas posteriores (VACHER et al., 1964), foram contadas acumulativamente por 30
minutos. Para isso, os camundongos foram colocados individualmente sob funis de vidro, com
um período de adaptação prévia de 15 minutos. Os resultados foram expressos como as
médias dos números de contorções abdominais acumuladas durante os 30 minutos de
avaliação experimental ou como porcentagem de inibição das contorções, comparativamente
ao grupo controle, obtendo-se através da interpolação da relação dose x efeito inibitória, a
ID50 (dose inibitória 50%).
No teste do tail flick utilizou-se a metodologia descrita por D’AMOUR e SMITH
(1941), este ensaio permite o estudo de drogas com atividade opióide, mediante a avaliação
do tempo, em segundos, que o animal leva para retirar a cauda do local de incidência de um
estímulo térmico doloroso. Este estímulo nociceptivo foi produzido por um foco de luz
convergente na cauda, obtido de um analgesímetro (modelo tail flick DS−20, Ugo Basile).
Neste experimento, grupos experimentais de 8 animais foram previamente selecionados
quanto a sua reatividade ao estímulo nociceptivo, não sendo utilizados animais cujo tempo de
resposta foi superior a 8 segundos. A reatividade foi medida a cada 30 minutos, iniciando-se
uma hora antes e prolongando-se por 2 horas depois da administração p.o. do veículo ou do
EHA da Pavonia varians (1 g/kg). O Fentanil (300 µg/kg), administrado pela via subcutânea,
foi utilizado como controle positivo do ensaio.
No teste da formalina que permite (após a injeção intraplantar de formalina) avaliar
dois tipos de dor: a de origem neurogênica que ocorre pela estimulação direta de terminações
nociceptivas e a de origem inflamatória produzida pela liberação de mediadores inflamatórios,
TESE DE DOUTORADO
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81
foram utilizados grupos experimentais de até 8 camundongos tratados pela via oral (p.o.) com
EHA de P. varians Moric (1 g/kg), com o veículo ou com a indometacina (10 mg/kg) controle
positivo da 2a fase de nocicepção (dor inflamatória). Após 60 minutos dos tratamentos, os
animais foram submetidos à injeção na região intraplantar da pata posterior direita com 20 µL
de formalina 3% (formaldeído 1,2% em salina), sendo então observados individualmente
durante 30 min, em caixas de acrílico com fundo especular, para auxiliar a visualização da
medida da reatividade do animal considerada como o tempo, em segundos, que o animal
permaneceu lambendo, mordendo ou sacudindo a pata injetada. O efeito antinociceptivo foi
avaliado nas duas fases de dor: durante os primeiros 5 minutos (dor neurogênica) e no período
de 15 a 30 minutos (dor de origem inflamatória), sendo os resultados expressos como as
médias dos tempos de reatividade ou como a porcentagem de inibição da reatividade nas
distintas fases, comparativamente ao grupo experimental controle.
4.4.3 Análise Estatística
Os resultados foram expressos como as médias ± erro padrão das médias. As
diferenças estatísticas entre os grupos experimentais foram detectadas pela análise de
variância (ANOVA) seguida pelo teste de Scheffé. A comparação entre dois grupos foi feita
com o teste t de Student não pareado, considerando−se como significantes valores de p <
0,05.
4.4.4 Desenvolvimento in vitro de Fungos Fitopatogénicos
Os fungos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii foram
propagados em meio de cultura Batata-dextrose-agar (BDA). Para a solubilização do óleo fixo
testado (OF-CC proveniente da reunião de frações FAB) utilizou-se dimetilsulfóxido (DMSO),
tendo sido efetuado um ensaio prévio para determinar a concentração de DMSO menos tóxica
aos fungos. Para o preparo da solução teste, foram diluídos 20 mg.mL-1 do OF-CC em
DMSO. Em seguida, três frascos contendo o meio de cultura BDA foram fundidos e os
tratamentos preparados continham: a) controle positivo (constituído do meio de cultura BDA),
b) controle negativo [meio de cultura mais 1% (v.v-1) de DMSO] e c) tratamento teste [meio
de cultura mais 1% (v.v-1) da solução teste (previamente preparada), de modo que a
concentração do óleo fixo no meio de cultura foi de 0,2 mg.mL-1]. Os meios de cultura
utilizados foram preparados com antibiótico de largo espectro (Gentamicina®), tendo sido
vertidos nas placas de Petri (4 mm ± 1 mm de diâmetro) e logo após a solidificação, foram
repicados fragmentos de BDA no centro destas placas que continham estruturas reprodutivas
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
82
dos fungos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. As placas de Petri
foram lacradas com filme plástico, identificadas e armazenadas em uma câmara de
crescimento, com luz do dia e temperatura de 28oC ± 1oC, durante cinco dias, após o inicio do
ensaio. Os dados foram coletados pela média do diâmetro da colônia nos dois sentidos
ortogonais, os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas
pelo teste de Fisher LSD com 5% de significância (SOUZA et al., 2003).
4.5 LEVANTAMENTO ETNOBOTÂNICO DE PLANTAS DO LITORAL NORTE
RIOGRANDENSE
No procedimento metodológico da pesquisa etnográfica, realizou-se entrevistas com
nativos da comunidade Rio do Fogo (Município do Estado do Rio Grande do Norte).
Inicialmente aplicou-se um questionário contemplando 30 moradores, com idade variando
entre 30 e 84 anos, totalizando 10 homens e 20 mulheres.
O Município de Rio do Fogo fica 83 Km de distância da capital (Natal), com
extensão de 151,52 Km2, delimitado pelos Municípios de Touros, Maxaranguape, Pureza e
banhado pelo Oceano Atlântico. O acesso ao Município é feito pela BR 101, a área de estudo
encontra-se em torno dos pontos de coordenadas geográficas, Latitude – 235351,38 Sul e
Longitude – 9417201,60 Oeste, (Datum-SAD 69 - Zona: 25 sul). A região é de clima tropical
chuvoso, com chuvas de março a agosto, temperatura média anual de 25,8ºC. Com uma
população de aproximadamente 10.000 habitantes (senso de 2000), tem como base
econômica a pesca. Observa-se o predomínio de vegetação da mata Atlântica, com formação
de dunas e nascente de rio que leva o mesmo nome da referida cidade.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
84
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ESTUDO ETNOBOTÂNICO DE PLANTAS MEDICINAIS DO LITORAL NORTE
RIOGRANDENSE
Em um contexto geral, a medicina popular no Rio Grande do Norte foi legada pelos
indígenas. No litoral, os Janduis e no interior os Cariris. Conhecedores da flora medicinal
sabiam o segredo das plantas, raízes e folhas sob a forma de chás, infusões, defumadores,
aplicadas em um ritual que segundo eles, favoreciam a cura (CÂMARA, 2006). Com o
objetivo de resgatar e catalogar a importância do uso de plantas medicinais em suas
aplicabilidades na medicina popular do Litoral Norte Riograndense, realizou-se uma
pesquisa etnográfica que resultou no registro etnobotânico de 84 espécies.
No procedimento metodológico da pesquisa etnográfica, sob supervisão da Dra.
Maria das Dores Melo, realizou-se entrevistas com os cidadãos daquela região com o intuito
de observar o nível dos conhecimentos referentes às plantas nativas e suas utilizações, bem
como preservação. Desta forma, a pesquisa que foi realizada com a comunidade Rio do Fogo
(RN), tendo como etapa inicial a aplicação de um questionário contemplando 30 moradores,
com idade variando entre 30 e 84 anos, totalizando 10 homens e 20 mulheres. Os
entrevistados, na sua grande maioria, apresentaram baixo grau de escolaridade e renda
familiar (fonte de renda é a pesca e/ou aposentadoria). O Município de Rio do Fogo fica 83
Km de distância da capital (Natal), com população que representa um povo simples, bastante
acolhedor e comunicativo, que de alguma forma, facilitou o desenvolvimento desta pesquisa.
A população desta cidade trabalha com pesca, extração de mariscos e algas (trabalho que
está sendo realizado de forma sustentável).
As plantas cultivadas pela comunidade pesquisada são ornamentais, alimentícias e
medicinais, tendo sido destacado o amplo cultivo de plantas medicinais. Todos os
entrevistados informaram que adquiriram as plantas através de mudas, e que utilizam
diariamente estes vegetais para fins alimentícios ou medicamentosos para cura de
enfermidades. Cerca de vinte e cinco entrevistados afirmaram que não comercializam as
plantas cultivadas em seus quintais, geralmente doam ou trocam pela vizinhança. No
entanto, apenas cinco dos entrevistados afirmaram que vendiam a produção, para ajudar na
renda da família.
O conhecimento da população alvo sobre o poder de cura das plantas foi justificado
pela grande maioria, pelo conhecimento empírico de informações que foram repassadas
pelos familiares e eles, por sua vez, estariam repassando para as novas gerações. Dentre as
partes das plantas mais utilizadas, destacam-se as folhas, seguidas de raiz, casca e frutos. A
TESE DE DOUTORADO
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85
forma de utilização do material vegetal é bastante variada, havendo uma maior incidência de
utilização em forma de pó e misturas de ervas.
Quando abordados sobre o tipo de enfermidades que eram curadas pelo uso das
plantas cultivadas, revelaram as seguintes informações: a maioria dos entrevistados (26
pessoas) informaram que as espécimes cultivadas tinham como principal uso a cura de
inflamações. E na sequencia de uso, apontaram o uso para tratamento de problemas
respiratórios, dermatites, diabetes, osteoporose e distúrbios renais.
Com os dados fornecidos, 84 espécimes vegetais foram registradas e representaram
44 tipos diferentes de famílias (Tabela 17), confirmando a grande diversidade do uso
tradicional de plantas para fins curativos. Nesta pesquisa, destacaram-se as famílias
Myrtaceae, Araceae e Euphorbiaceae, pela incidência de utilização. Duas destas espécies
Cleome spinosa Jacq (Brassicaceae) e Pavonia varians Moric (Malvaceae) foram alvo de
investigações botânicas e fitofarmacológicas (abordadas a seguir).
Tabela 17 - Plantas utilizadas pela comunidade da cidade de Rio do Fogo/RN NOME CIENTIFICO NOME VULGAR PORTE UTILIZAÇÃO Família: Acanthaceae Espécie: Justicia pectoralis Jacq
Trevo-do-pará Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Acanthaceae Espécie: Hypoestes phyllostachya Baker
Confete face-sardenta
Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Alliaceae Espécie: Allium pisfulosum L.
Cebolinha Herbáceo Alimentícia e Medicinal
Família: Anacardiaceae Espécie: Anacardium ocidentale L.
Cajueiro Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Anacardiaceae Espécie: Mangifera indica L.
Mangueira Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Anacardiaceae Espécie: Spondias pupurea L.
Siriguela Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Anacardiaceae Espécie: Shinus tirebinthifolius Raddi
Aroeira Arbóreo Medicinal
Família: Apiaceae Espécie: Coriandrum sativum L.
Coentro Herbáceo Alimentícia e Medicinal
Família: Apocynaceae Espécie: Aspidosperma pryfolium Mart
Pereiro Arbóreo Medicinal
Família: Apocynaceae Espécie: Catharanthus roseus (L) G. Don
Boa noite Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Apocynaceae Espécie: Hancornia speciosa Gomes
Mangaba Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Araceae Espécie: Aglaonema commmutatum Sehot
Café-de-salão-dourado
Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Araceae Espécie: Dieffenbachia picta Schott.
Comigo-ninguém-pode
Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Araceae Espécie: Epipremnum pinnatum (L.) Engl
Jiboia Verde Herbáceo Ornamental e Medicinal
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Família: Araceae Espécie: Monstera deliciosa Liebm
Costela de Adão Semi-Herbáceo
Ornamental e Medicinal
Família: Araceae Espécie: Philodendron bipinnatifidum Schott
Imbê Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Araceae Espécie: Zantedeschia aethiopia (L.) Spreng.
Copo-de-leite Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Arecaceae Espécie: Cocos nucifera L.
Coqueiro Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Arecaceae Espécie: Copernicia cerifera Mart.
Carnaúba Arbóreo Medicinal
Família: Arecaceae Espécie: Roystonea oleraceae Cook
Palmeira Imperial Arbóreo Ornamental e Medicinal
Família: Araliaceae Espécie: Shefflera arboricola (Hayata) Merr
Cheflera-Pequena Arbustivo Ornamental e Medicinal
Família: Asteraceae Espécie: Lactuca sativa L.
Alface Herbáceo Alimenticia e Medicinal
Família: Asteraceae Espécie: Matricaria chamomilla L.
Camomila Herbáceo Medicinal
Família: Asteraceae Espécie: Zynnia elegans Jacq.
Benedita Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Brassicaceae Espécie: Cleome spinosa Jacq.
Mussambé Arbóreo Ornamental e Medicinal
Família: Brassicaceae Espécie: Nasturtium officinale R. Br.
Amescla Arbustivo Medicinal
Família: Burseraceae Espécie: Protium heptaphyllum (Hubl) Marchi
Agrião Herbáceo Alimentícia e Medicinal
Família: Caesalpiniaceae Espécie: Caesalpinia echinata Lam
Pau-Brasil Arbóreo Ornamental e Medicinal
Família: Caesalpiniaceae Espécie: Senna occidentalis (Linn.) Link
Manjirioba Arbustivo Medicinal
Família: Cactaceae Espécie: Melocactus zehntneri (Britton & Rose) Luetzelb.
Coroa de frade Herbáceo Medicinal
Família: Caricaceae Espécie: Carica papaya L.
Mamão Arbustivo Alimentícia e Medicinal
Família: Convolvulaceae Espécie: Ipomoea asarifolia (Desr.) Roem & Schult
Salsa da praia Herbáceo Medicinal
Família: Cucurbitaceae Espécie: Citrullus lanatus (Thunb.) Matsumura & Nakai
Melância Herbáceo Alimentícia e Medicinal
Família: Cucurbitaceae Espécie: Cucurbita pepo L.
Jerimum Herbáceo Alimentícia e Medicinal
Família: Cucurbitaceae Espécie: Momordica charantia L.
Melão São Caetano
Herbáceo Alimentícia e Medicinal
Família: Chenopodiaceae Espécie: Chenopodium ambrosioides L.
Mastruz Herbáceo Medicinal
Família: Chysobalanaceae Espécie: Chrisobalanus icaco L.
Guagiru Arbustivo Alimentícia e Medicinal
Família: Crassulaceae Espécie: Bryophyllum calycinum Salisb.
Corama Herbáceo Medicinal
Família: Cyatheaceae Espécie: Cyathea leucosticta Fee
Samambaia Herbáceo Ornamental e Medicinal
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Família: Euphorbiaceae Espécie: Croton campestris A. St
Velame Herbáceo Medicinal
Família: Euphorbiaceae Espécie: Manihot esculenta Craantz.
Mandioca Herbáceo Alimentícia e Medicinal
Família: Euphorbiaceae Espécie: Ricinus communis L.
Mamona Arbustivo Medicinal
Família: Euphorbiaceae Espécie: Euphorbia tirucalli L.
Dedinho Arbustivo Medicinal
Família: Euphorbiaceae Espécie: Cnidosculus urens (L.) Arthur
Urtiga Branca Herbáceo Medicinal
Família: Euphorbiaceae Espécie: Phyllanthus niruri Müll. Arg.
Quebra-pedra Herbáceo Medicinal
Família: Euphorbiaceae Espécie: Phyllanthus amarus Schum & Thom
Quebra-pedra Herbáceo Medicinal
Família: Fabaceae Espécie: Abrus Precatorius L.
Olho-de-pombo Arbustivo Ornamental e Medicinal
Família: Fabaceae Espécie: Cassia occidentalis L.
Fedegoso Herbáceo Medicinal
Família: Fabaceae Espécie: Erytrina verna Vell
Mulungu Arbóreo Medicinal
Família: Krameriaceae Espécie: Krameria tomentosa A. St. Hill
Carrapicho de Ovelha
Herbáceo Medicinal
Família: Lamiaceae Espécie: Mentha sativa L.
Hortelã Herbáceo Medicinal
Família: Lamiaceae Espécie: Ocimum basilicum L.
Manjericão Herbáceo Alimentícia e Medicinal
Família: Laureaceae Espécie: Laurus nobilis L.
Louro Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Laureaceae Espécie: Persea americana Mill.
Abacate Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Liliaceae Espécie: Aloe Vera (L.) Burm. F
Babosa Herbáceo Medicinal
Família: Malpighiaceae Espécie: Byrsonima crassifolia (L.) Rich
Murici Arbustivo Alimentícia e Medicinal
Família: Malpighiaceae Espécie: Malpighia glabra L.
Acerola Arbustivo Alimentícia e Medicinal
Família: Malvaceae Espécie: Pavonia varians Moric
Cabeça de Boi Malva-Grossa Malva-folha-de-figo
Arbóreo Ornamental e Medicinal
Família: Marcgraviaceae Espécie: Marcgravia coriacea Vaht
Mão de onça Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Moraceae Espécie: Artocarpus communis Forst
Fruta Pão Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Monimiáceae Espécie: Peamus boldus Molina
Boldo Herbáceo Medicinal
Família: Musaceae Espécie: Musa sp.
Banana Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Myrtaceae Espécie: Campomanesia dichotoma (O. Berg) Mattos det. L. R. Landrum
Murta Arbóreo Medicinal
Família: Myrtaceae Espécie: Eugenia aff. uniflora L.
Ubaía Arbóreo Alimentícia e Medicinal
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Família: Myrtaceae Espécie: Eugenia rastrifolia Legrand
Batinga Arbustivo Alimentícia e Medicinal
Família: Myrtaceae Espécie: Eugenia malaccensis L.
Jambo Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Myrtaceae Espécie: Eugenia tinctoria
Mapironga Arbustivo Alimentícia e Medicinal
Família: Myrtaceae Espécie: Myrciaria tenella Berg
Cambuí Arbustivo Alimentícia e Medicinal
Família: Myrtaceae Espécie: Psidium cattleianum Sabini
Araçá Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Myrtaceae Espécie: Psidium guajava L.
Goiaba Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Olacaceae Espécie: Ximenia americana L.
Ameixa do mato Arbóreo Medicinal
Família: Oleaceae Espécie: Olea europaea L.
Azeitona Preta Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Onograceaes Espécie: Fuchsia sp.
Brinco de Princesa
Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Oxalidaceae Espécie: Averrhoa caranbola L.
Carambola Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Poaceae Espécie: Bambusa gracilis Hort. Ex Rivière & Rivière
Bambu de jardim Arbustivo Ornamental e Medicinal
Família: Poaceae Espécie: Cymbopogon citratus (DC) Stapf.
Capim Santo Herbáceo Medicinal
Família: Polypodiaceae Espécie: Phymatodes scolopendria (Burm. F.) Ching
Samambaia Jamaica
Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Rubiaceae Espécie: Genipa americana L.
Jenipapo Arbóreo Alimentícia e Medicinal
Família: Rutaceae Espécie: Citrus Limon (L.) Burm. F.
Limão Arbustivo Alimentícia e Medicinal
Família: Rutaceae Espécie: Galipea jasminiflora (A. St. Hil) Engler
Canela-de-viado Herbáceo Ornamental e Medicinal
Família: Rhamnaceae Espécie: Ziziphus joazeiro Mart.
Juá Arbóreo Medicinal
Família: Solanaceae Espécie: Solanum tuberosum L.
Batata Herbáceo Alimentícia e Medicinal
Família: Verbenaceae Espécie: Lippia alba (Mill.) N. E. Br.
Erva Cidreira Herbáceo Medicinal
Família: Zingiberaceae Espécie: Alpinia zerumbet (Pers.) B. L. Burtt. & R. M. Sm.
Colônia Herbáceo Medicinal e Ornamental
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5.1.1 Considerações Etnobotânicas de Cleome spinosa Jacq
O Quadro 2 mostra considerações gerais sobre C. spinosa e na Figura 29 encontra-se
uma fotografia adquirida na ocasião da aquisição da excicata desta espécie. Informações
etnofarmacológicas de C. spinosa encontram-se no Capítulo 3.
5.1.2 Considerações Etnobotânicas de Pavonia varians Moric
O Quadro 3 mostra considerações gerais sobre P. varians e na Figura 30 encontra-se
uma fotografia adquirida na ocasião da aquisição da excicata desta espécie. Informações
etnofarmacológicas de P. varians espécie encontram-se no Capítulo 3.
Quadro 2 - Considerações gerais sobre Cleome spinosa Jacq (Brassicaceae)
Descrição Botânica
Arbusto de 1 a 3 metros de altura. Caule pubescente. Folhas alternas, 5 a 7 folículos ablongo-lanceolados. Pubescente, com dois aguilhões na base do pecíolo. Flores róseo-purúreas, variando para o branco, com base de estames de lilacina. Cápsula comprida.
Origem Espécie originária da América tropical (encontrada nos lugares úmidos).
Propriedades Terapêuticas As folhas machucadas e aplicadas sobre a pele agem como rubefascientes. As folhas em infusão são estomáquicas e estimulantes do aparelho digestivo, úteis contra a blenorragia, eficazes na leucorréia. Externamente, empregam-se para a tratamento de otites. O suco das folhas contra otites supuradas. Raízes, em cozimento, são utilizadas no tratamento da bronquite e asma.
Quadro 3 - Considerações gerais sobre Pavonia varians Moric (Malvaceae)
Descrição Botânica
Subarbusto ramificado, geralmente com até um metro de altura. Caule cilíndrico, ramificado, muito resistente. Raiz principal pivotante, aprofundando-se bastante. Folhas alternas, pecioladas, de limbo subarredondado com base cordada, com cinco grandes lobos que se curvam um pouco, tendo margens denteadas, comprimento até 6 cm por largura equivalente. Flores amareladas isoladas, axilares com pedúnculo articulado perto do ápice, de comprimento maior que o do pecíolo da folha correspondente. Fruto esquizocarpo (fruto composto).
Origem Espécie originária da América tropical (encontrada nos lugares úmidos).
Propriedades Terapêuticas As folhas são utilizadas para combater infecções do aparelho digestivo, bem como inflamações de boca e garganta.
TESE DE DOUTORADO
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Figura 29 – Fotografia da excicata de Cleome Spinosa Jacq
TESE DE DOUTORADO
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Figura 30 – Fotografia da excicata de Pavonia varians Moric
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92
5.2 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DE Cleome spinosa Jacq (BRASSICACEA)
Uma análise fitoquímica preliminar foi efetuada para os extratos lipofílico e hidrofílico
de Cleome spinosa. Os metabólitos secundários detectados encontram-se descritos na Tabela
18. Metabólitos especiais como catequinas, chalconas e flavonóides polares foram detectados
no extrato hidroalcoólico (hidrofílico). Alcalóides e flavonoides, dentre outros metabólitos de
polaridade mediana, foram detectados no extrato clorofórmio (lipofílico).
Tabela 18 - Metabólitos secundários detectados em extratos de Cleome spinosa CLASSE DE METABÓLITOS SECUNDARIOS EXTRATO
LIPOFÍLICO HIDROFÍLICO Alcalóides Positivo Bases quaternárias Positivo Catequinas Positivo Flavonas, flavonois, flavanonas e flavanonois Positivo Positivo Leucocianidinas Positivo Chalconas Positivo Positivo Saponinas Positivo
O estudo fitoquímico do extrato metanólico de Cleome spinosa (Tabelas 11 e 12)
conduziu a obtenção de 10 grupos de frações que foram designados de CS-EM-1 até CS-EM-
10 (Cleome spinosa - Extrato Metanólico - grupo de fração correspondente) (Tabela 12).
Os grupos de frações CS-EM-1 (eluição em Hexano 100%) e CS-EM-2 [eluição
Hexano:AcOEt (95:5)] foram submetidos a novos procedimentos cromatográficos e análises
espectroscópicos (infravermelho, RMN1H), que revelaram a ocorrência de misturas de
substâncias apolares.
O grupo de fração CS-EM-3 foi submetido a um novo fracionamento cromatográfico
de acordo com o mostrado na Tabela 14. As frações F5, F6, F7 e F8 foram reunidas após
análise por CCF fornecendo o grupo F5-8, denominado CS-EM-3a. Na análise CS-EM-3a por
CCF observou-se a ocorrência de uma mistura complexa de difícil separação. Similarmente,
foram reunidos os seguintes grupos de frações F9-11, F12-13, F14-23 correspondendo a CS-
EM-3b (F9-11), CS-EM-3c, (F12-13) e CS-EM-3d (F14-23). As frações F12-13 quando
comparadas por CCF com os grupos de frações CS-EM-3b e CS-EM-3d revelaram apresentar
alguns constituintes em comum. A substância encontrada nas frações F14-23 (CS-EM-3d)
mostrou absorções compatíveis (RMN) com triterpeno que poderá ser do tipo lupano ou
damarano (em função das impureza contidas na amostra a elucidação estrutural encontra-se
incompleta, com várias possibilidades estruturais).
TESE DE DOUTORADO
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93
O grupo de frações F6-29 [eluição com Hexano:ACoEt (90:10 – 70:30) (vide Tabela
11) oi submetido a um novo fracionamento cromatográfico conduzindo a reunião do novo
grupo de frações F9-11 (eluição 97:3) que possibilitou o isolamento de uma substância
amorfa (P.F. 118-119 oC) denominada de CS-EM-3b.
A estrutura química de CS-EM-3b (140) foi estabelecida com base nos espectros de
RMN de 1H e RMN de 13C (1D e 2D). Os dados do espectro de RMN de 1H mostraram-se
compatíveis com a estrutura de uma flavanona, tendo sido observadas absorções
características de anel heterociclo (δ 5,37; 3,11; 2,79). Estas absorções foram atribuídas ao H-
2 (δ 5,37; 1H; dd; J=13,0 e 2,9 Hz,) e aos hidrogênios H-3 do anel heterociclo [δ 3,11 (1H;
dd; J=17,1 e 13,0 Hz, H-3axial) e δ 2,79 (1H; dd; J=2,9 e 17,1 Hz, H-3equatorial)].
No anel aromático-A comprovou-se a presença de uma hidroxila na posição-5 (OH em
C-5) em função do singleto em campo baixo (δ 12,04), característico de hidroxila
quelatogênica [OH quelada com a carbonila do anel heterociclo. Evidenciou-se ainda, a
presença de dois grupos metoxílicos (δ 3,81 e 3,84) posicionados em anel aromático. A
análise das constantes de acoplamento dos hidrogênios aromáticos H-6 (δ 6,05; 1H; d; J=2,2
Hz) e H-8 (δ 6,08; 1H; d; J= 2,2 Hz) possibilitou o posicionamento de uma metoxila na
posição-7 do anel-A, pela ocorrência do acoplamento em W do H-6 com H-8 e H-8 com H-6.
A metoxila remanescente foi posicionada na posição-4’ (anel-B) em função das constantes de
acoplamento dos hidrogênios H-2’,6’ (δ 6,96; 2H; d; J=8,6 Hz) e H-3’,5’ (δ 7,39; 2H; d;
J=8,6 Hz), características de acoplamento “orto”. Desta forma, foi possível propor para a
substância CS-EM-3b de fórmula molecular C17H16O5, nomeada da seguinte forma: (2S)-1-
benzopiran-4-ona,2,3-diidro-5-hidroxi-7-metoxi-2-(4-metoxifenil) ou (2S)-5-hidroxi-7,4’-
dimetoxi-flavanona; 2,3-diidro-5-hidroxi-4’,7-dimetoxi-flavone; 7,4’-dimetoxi-naringenina;
7,4’-dimetil éter-naringenina; 4’-metil éter-sakuranetina (Fonte: CA Index Name).
A quiralidade 2S proposta para esta flavanona representada na Figura 31 enquanto que
na Tabela 19 encontram-se os assinalamentos propostos com base nos RMN de 1H e de 13C
que se apresentam compatíveis com dados da literatura (LAGO et al., 2007; OYAMA e
KONDO, 2004). Os dados de IV desta flavanona reforçam sua identidade pelos máximos de
absorção característicos de região aromática (vide anexo-A para espectros de IV e RMN desta
substância).
TESE DE DOUTORADO
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94
140
Figura 31 – Estrutura química de CS-EM-3b [(2S)-5-hidroxi-7,4’-dimetoxi-flavanona]
O espectro de RMN de 13C (Tabela 19) de CS-EM-3b confirma a proposta estrutural
para esta flavanona. Os sinais em 79,16 e 43,33 ppm foram atribuídos aos carbonos (C-2 e C-
3, respectivamente) do anel heterociclo. O espectro RMN 1D-DEPT confirma a
multiplicidade do carbono C-3 (grupo metilênico). As duas metoxilas absorvem em δ 55,84 e
55,53. O espectro de RMN 2D- HOMOCOSY estabeleceu as correlações entre os hidrogênios
do anel heterociclo (H-3eq com H-3ax; H-3eq com H-2; H-3ax com H-3eq; H-3ax com H-2; H-2
com H-3ax; H-2 com H-3eq). As correlações entre os Hidrogênios do anel-B (H-2’,6’ com H-
3’,5’ e H-3’,5’ com H-2’,6’) também foram observadas. Após assinalamento dos carbonos
característicos C-2, C-3 e C-4 (79,16; 43,33 e 196.20 ppm, respectivamente), as atribuições
dos átomos de carbono remanescentes foram inicialmente efetuadas com base nas densidades
eletrônicas dos carbonos C-6, C-8 e C- 3’,5’(que sofrem blidagem mesomérica). Portanto, as
absorções em δ 94,37 e 95,23 foram atribuídas aos carbonos C-6 e C-8, respectivamente e o
sinal em δ 114,37 aos carbonos C-3’,5’. O deslocamento químico observado em 127,9 ppm
foi correlacionado aos carbonos C-2’,6’ pela correlação observadas no espectro de RMN 2D-
HMQC. Este experimento confirmou os assinalamentos dos carbonos hidrogenados (C-2, C-3,
C-6, C-8 e C-3’,5’). O experimento RMN 2D-HMBC mostrou as seguintes correlações:
OH/C-6 (J3); OH/C-10 (J3); OH/C-5 (J2); H-6/C-9 (J4); H-8/C-5 (J4); H-8/C-7 (J4); OMe (δ
55,53)/C-7 (J3); OMe (δ 55,83)/C-4’ (J3); H-2/C-1’ (J2); H-3eq/C-4 (J2); H-3ax/C-4 (J
2); H-
3ax/C-2 (J2); H-3ax/C-1’ (J
3), possibilitando as atribuições inequívocas dos carbonos
quaternários, bem como dos grupos metoxilas.
TESE DE DOUTORADO
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95
Tabela 19 - Dados de RMN de 1H (300 MHz; CDCl3) e de RMN de 13C (75 MHz; CDCl3) para a substância CS-EM-3b (140)
H δ (ppm) C δ (ppm) 2 5,37 [1H; dd (J=13,0 e 2,9 Hz)] 1 - 3ax 3,11 [1H; dd (J=17,1 e 13,0 Hz)] 2 79,16 3eq 2,79 [1H; dd (J=17,1 e 2,9 Hz)] 3 46,30 4 - 4 196,21 5 - 5 164,28 6 6,05 [1H; d (J=2,2 Hz)] 6 94,37 7 - 7 168,10 8 6,08 [1H; d (J=2,2 Hz)] 8 95,23 9 - 9 163,05 10 - 10 103,28 1’ - 1’ 130,52 2’ 6,96 [1H; d (J=8,6 Hz)] 2’ 114,37 3’ 7,39 [1H; d (J=8,6 Hz)] 3’ 127,90 4’ - 4’ 160,19 5’ 7,39 [1H; d (J=8,6 Hz)] 5’ 127,90 6’ OH
6,96 [1H; d (J=8,6 Hz)] 12,04 s
6’ -
114,37 -
O-CH3 3,81 s (3H) C-4’-O-CH3 55,83 O-CH3 3,84 s (3H) C-7-O-CH3 55,53
A flavanona (2S)-5-hidroxi-7,4’-dimetoxi-flavanona apresentou registradas na
literatura as seguintes atividades biológicas: antiespasmódica (WEIMANN et al., 2002),
antimutagênica (MIYAZAWA et al., 2003); antifúngica e bactericida (LAGO et al., 2007).
Figura 32 – Esqueleto básico de flavonóides
Dentre as classes de flavonóides mais amplamente distribuídos na natureza encontram-
se as flavanonas, flavonas e flavonóis (Figura 32) que apresentam em sua grande maioria, o
padrão de hidroxilação característico de flavonóides. Numerosos derivados destes metabólitos
especiais são conhecidos pelo número distinto de hidroxilas, metoxilas e pela presença ou não
de ligações glicosídicas (MACIEL, 1997).
TESE DE DOUTORADO
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96
Um flavonóide do tipo flavona foi identificado no grupo de fração CS-EM-4. Este
grupo foi submetido a um novo fracionamento cromatográfico de acordo com o mostrado na
Tabela 15 (parte experimental). As frações F10 - 16 [eluição com hexano-AcOEt (9:1 - 7:3)]
foram reunidas após análise por CCF, conduzindo ao isolamento da substância CS-EM-4a
[substância de coloração amarela (P.F. 171 - 173 oC)]. A substância encontrada neste grupo de
frações mostrou absorções compatíveis (RMN) com flavona [δ 60,1 (C-3) e 3,80 (H-3)
correspondente ao grupo metoxila posicionado na posição-3] e teve sua estrutura estabelecida
com base nos espectros de RMN de 1H e RMN de 13C (RMN 1D e 2D). Nos aneis aromáticos-
A e B comprovou-se a presença de grupos hidroxila (OH-7 e OH-4’) e metoxila (MeO-5 e
MeO-3’). Os grupos metoxílicos (MeO-5, MeO-3’ e MeO-3) foram atribuídos através das
análises de RMN 2D (HMQC e HMBC), tendo sido observado as seguintes correlações: δ
60,1 com sinal em 3,75 ppm (HMQC) correspondente ao carbono e hidrogênios do grupo
metoxílico ligado ao carbono-3 (MeO-3); δ 165,54 com sinal em 3,80 ppm (HMBC)
correspondente ao carbono-7 e hidrogênios do grupo metoxílico ligado ao carbono-5 (J4); δ
161,42 com sinal em 3,80 ppm (HMBC) correspondente ao carbono-5 e hidrogênios do grupo
metoxílico ligado ao carbono-5 (J2). Com estas correlações atribuiu-se os carbonos C-7
(165,54 ppm), C-5 (161.42 ppm), MeO-3 (60,1 ppm), C-3’-MeO e C-5-MeO (55,85 e 55,79
ppm). A análise dos sinais em δ 6,29 e 6,40 possibilitou a atribuição dos H-6 e H-8 [ H-6 em
6,29 ppm (1H; d; J=2,0 Hz acoplamento em W com o H-8) e H-8 (δ 6,40; 1H; d; J= 3,3 Hz
acoplamento de H-8 com H-6 do tipo W, bem como acoplamento H-8 com o H do grupo
hidroxila posicionado em C-7)].
O hidrogênio H-5’ em δ 7,06 (1H; d; J=9,1 Hz acoplamento de H-5’ com H-6’) e os
hidrogênios H-2’ e H-6’ absorvem em δ 7,61 - 7,59 [2H; multipleto, contendo os
acoplamentos de H-2’ com H-6’(W), H-6’ com H-2’ (W) e H-6’ com H-5’ (“orto”)]. As
análises dos espectros de RMN 1D (HOMOCOSY) e 2D (HMQC e HMBC) confirmaram as
atribuições de RMN de 1H e de 13C para esta flavona [Tabela 20, compatíveis com dados da
literatura (SILVA et al., 2006; AGRAWAL, 1989)]. Desta forma, foi possível propor a
estrutura 141 para a substância CS-EM-4a (Figura 33) de fórmula molecular C18H16O7,
nomeada como 1-benzopiran-4-one,7-hidroxi-2-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-3,5-dimetoxi
(Fonte: CA Index Name) ou 5,4’-diidroxi-3,7,3’-trimetoxi-flavona. Os dados de IV desta
flavona reforçam sua identidade pelos máximos de absorção característicos de região
aromática, bem como de grupo hidroxila (vide anexo-B para espectros de IV e RMN desta
substância).
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97
Esta flavona, segundo a literatura, apresentou reduzida atividade antioxidante. No
entanto, para análogos mais hidroxilados tem sido relatada atividade antioxidante mais eficaz,
bem como atividade antimicrobiana (WANG et al., 1992).
Tabela 20 - Dados de RMN de 1H (300 MHz; CDCl3) e de RMN de 13C (75 MHz; CDCl3) para a substância CS-EM-4a (141)
H δ (ppm) C δ (ppm) 2 - 2 156,30 3 - 3 138,94 4 - 4 178,83 5 - 5 161,42 6 6,29 [1H; d (J=2,0 Hz)] 6 97,91 7 - 7 165,54 8 6,40 [1H; d (J=3,3 Hz)] 8 92,26 9 - 9 156,80 10 - 10 105,86 1’ - 1’ 121,21 2’ 7,61 – 7,59 (1H; m) 2’ 110,84 3’ - 3’ 145,91 4’ - 4’ 149,83 5’ 6,91 [1H; d (J=9,1 Hz)] 5’ 114,90 6’ C-3’-O-CH3
7,61 – 7,59 (1H; m) 3,90 (3H; s)
6’ C-3’-O-CH3
122,99 55,85ƒƒƒƒ
C-5-O-CH3 3,80 (3H; s) C-4’-O-CH3 55,79ƒƒƒƒ C-3-O-CH3 3,75 (3H; s) C-3-O-CH3 60,10
ƒƒƒƒValores Permutáveis
Figura 33 – Estrutura química de 7,4’-diidroxi-3,5,3’-trimetoxi-flavona
141
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98
5.3 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DE Pavonia varians Moric (MALVACEAE)
O material vegetal de Pavonia varians Moric (raízes e partes aéreas, utilizados após
moagem) foi submetido à extração (via percolação) para avaliação preliminar do seu perfil
químico. Neste estudo obteve-se inicialmente um extrato lipofílico (extração com éter etílico)
e na sequência, obteve-se o extrato hidroalcoólico [hidrofílico; MeOH/H20 (7:3)]. O Esquema
1 mostra o procedimento que foi adotado para detecção no extrato lipofílico os seguintes
metabólitos: bases quaternárias, alcalóides, ácidos fixos fortes, esteróides, triterpenoides e
taninos e o Esquema 2 mostra o procedimento adotado para avaliação do extrato lipofílico
hidrolisado.
Os testes qualitativos realizados para o extrato hidroalcoólico levaram a detecção de
algumas classes de metabólitos secundários (leucocianidinas, catequinas, flavonóis, flavanonas,
chalconas e saponinas (Esquema 3). A Tabela 21 mostra os resultados obtidos nestas análises.
Tabela 21 - Metabólitos secundários detectados em extratos de Pavonia varians Moric CLASSE DE METABÓLITOS SECUNDARIOS EXTRATO
LIPOFÍLICO EXTRATO HIDROFÍLICO
Bases quaternárias Positivo Alcalóides Positivo Ácidos fixos fortes Positivo Esteróides e triterpenoídes Positivo Taninos Positivo Leucocianidinas, antocianidinas Catequinas
Positivo Positivo Positivo
Flavonóis, flavanonas, chalconas Positivo Saponinas Positivo
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99
Esquema 1 – Prospecção analítica para o extrato lipofílico de Pavonia varians Moric
SOLÚVEL EM ÁGUA REJEITAR
SOLÚVEL EM ÁGUA
HIDRÓLISE ALCALINA
ESQUEMA 2
• ALÍQUOTA CONCENTRADA A SECURA • DILUÍDO EM ÁCIDO
REJEITAR
• NH4OH
• CHCl3 • HNaCO3 diluído
• HCl (pH1) • Éter • CHCl3
• NaOH 70%
ÁCID
OS FORTE
ÁCID
OS FIX
OS
FRACOS E FENÓIS
CONSTITUÍN
TES
FENÓLIC
OS
CONSTITUÍN
TES
NEUTROS
• HCl diluído
EXTRATO LIPOFÍLICO
SOLÚVEIS EM ÉTER
SOLÚVEIS EM CLOROFÓRMIO
SOLÚVEIS EM ÁGUA
SOLÚVEIS EM ÉTER SOLÚVEIS
EM MEIO BÁSICO
NEUTRALIZA, TESTE PARA BASES
QUATERNÁRIAS
SOLÚVEIS EM ÁGUA
TESTE ALCALÓIDES
SOLÚVEL EM ÉTER
FENÓIS E
TANIN
OS
ANTOCIA
NID
INAS E
FLAVONÓID
ES
LEUCOANTOCIA
NID
INAS
FLAVONAS E
FLAVONÓIS
• H2O
SOLÚVEIS EM CLOROFÓRMIO
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100
Esquema 2 – Prospecção analítica para o extrato lipofílico hidrolisado de P. varians Moric
• HCl (pH 2-3)
EXTRATO LIPOFÍLICO
EXTRATO SAPONIFICADO
FASE ORGÂNICA FASE AQUOSA
REJEITA FILTRADO
SOLÚVEIS EM ÉTER – INSAPON.
SOLÚVEIS EM ÁGUA
TESTE PARA ESTERÓIDES E TRITERNÓIDES FASE
ORGÂNICA SOLÚVEIS EM ÁGUA
TESTE PARA ÁCIDOS FIXOS TESTE PARA
GLICERINA
• NaOH 70% • REFLUXO (2 HORAS)
• ÁGUA • EXTRAÇÃO COM ÉTER
• Na2SO4 (ANIDRO) • FILTRAÇÃO
• HNaCO3, DILUÍDO
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101
Esquema 3 - Prospecção analítica para o extrato hidroalcoólico de P. varians Moric
pH11 pH1
ÁCIDOS FIXOS FORTES
CATEQUINAS
EXTRATO
EXTRATO HIDROALCOÓLICO
TESTE FÉNOIS E TANINOS
TESTE LEUCOANTOCIANIDINAS, CATEQUINAS E FLAVONAS
TESTE FLAVONAS
SOLÚVEL
TESTE ANTOCIANIDINAS,
FLAVONAS E CHALCONAS
INSOLÚVEL
SOLÚVEL INSOLÚVEL
TESTE SAPONINAS
TESTE ESTEROIDES
TRITERPENÓIDES
RESINA BASES QUATERNÁRIAS
ALCALÓIDES
pH3 pH1-3 pH11
NH4OH CLOROFÓRMIO
CALOR
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102
5.4 ABORDAGEM FARMACOLÓGICA DE Cleome spinosa Jacq E Pavonia varians Moric
5.4.1 Atividade Antioxidante de Cleome spinosa Jacq e Pavonia varians Moric
Em função do estudo etnofarmacológico das espécies medicinais C. spinosa e P.
varians ter revelado importância significativa destas espécies na medicina tradicional,
avaliou-se o potencial antioxidante destas plantas que apesar de serem de famílias diferentes,
apresentam perfil químico semelhante, dentre eles destacam-se a classe dos flavonóides. O
estresse oxidativo induzido por radicais livres é um dos fatores primários no desenvolvimento
de doenças degenerativas. A capacidade dos flavonóides e polifenóis de sequestrarem radicais
livres, por exemplo, intensifica o interesse em espécies vegetais com propriedades
antioxidantes.
Neste trabalho a atividade antioxidante dos extratos hidroalcoólicos de Pavonia
varians (PV) e Cleome spinosa (CS) solubilizados em MeOH, bem como em sistemas
microemulsionados (SME), foi avaliada via estabilização do radical 2,2-difenil-picril-
hidrazila (DPPH), de acordo com metodologia previamente reportada (MENSOR et al.,
2001).
Microemulsões são sistemas coloidais termodinamicamente estáveis e opticamente
isotrópicos contendo água, óleo, tensoativo e, frequentemente, um cotensoativo (GOMES et
al., 2006; OLIVEIRA et al., 2004). Estes sistemas foram considerados como sendo
nanosistemas encapsuladores eficazes (FLORENCE, 2005; REDDY et al.; 2006) e vêm sendo
amplamente utilizados como sistemas de liberação de fármacos pelo aumento da capacidade
de solubilização de substâncias hidrofílicas e lipofílicas, bem como pela redução de efeitos
adversos (REDDY et al.; 2006; FORMARIZ et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2004;
KAWAKAMI et al., 2002; LAWRENCE e REES, 2000). O aumento da biodisponibilidade
de fármacos está correlacionado com a solubilização de substâncias pouco solúveis, bem
como com a diminuição da dose administrada, garantindo além de vantagens econômicas, a
diminuição de efeitos adversos (KAWAKAMI et al., 2002). Adicionalmente, as
microemulsões podem atuar ainda, como um sistema reservatório para o fármaco, garantindo
a sua liberação lenta e a prolongação do seu efeito farmacológico, com redução de efeitos
adversos (AZEVEDO et al., 2005; DALMORA et al., 2001; LYONS et al., 2000).
Neste trabalho, os extratos hidroalcoólicos de Pavonia varians (PV) e de Cleome
spinosa (CS) foram solubilizados nos sistemas microemulsionados SME-1 (35% etanol/tween
80/Span 20; 60% de água bidestilada; 5% de miristato de isopropila) e SME-4 (30% tween
80/Span 20; 5% de água bidestilada; 65% miristato de isopropila), previamente reportados
(GOMES et al., 2006; 2007; MACIEL et al., 2006a).
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103
Para a avaliação da atividade antioxidante, foram preparadas soluções estoque de cada
extrato [extrato de P. varians (PV) e de C. spinosa (CS)] na concentração de 1 mg/mL
(extrato/SME), tendo sido obtido as formulações CS-SME-1, CS-SME-4, PV-SME1 e PV-
SME-4). O ensaio foi realizado em microplacas, sendo adicionada posteriormente, uma
solução de DPPH. Após 30 minutos no escuro, a leitura da absorbância (Abs.) foi realizada,
em leitora Elisa, tendo sido realizados 4 ensaios independentes, todos em triplicata. O
percentual antioxidante (%AA) foi calculado a partir da Equação 1 e os valores de EC50 foram
determinados por regressão linear. O resultado de EC50= 370 µg/mL (r=0,98) obtido para o
extrato CS solubilizado em MeOH foi superior aos valores de EC50 obtidos para este extrato
solubilizado nos sistemas SME-1 (CS-SME-1) e SME-4 (CS-SME-4) (Figura 34).
Evidenciou-se (via estabilização do radical livre) que o encapsulamento (solubilização de CS
nos sistemas microemulsionados) eleva a eficácia antioxidativa de Cleome spinosa, tendo sido
obtidos os seguintes valores de EC50: 224 µg/mL (r=0,97) para CS-SME-1 e 248 µg/mL
(r=0,98) para CS-SME-4.
O extrato hidroalcoólico de Pavonia varians (PV solubilizado em MeOH) apresentou
valor de EC50 acima de 710 µg/mL, com inibição máxima de 37%. No entanto, a
solubilização deste extrato nos sistemas SME-1 e SME-4, resultaram em uma maior
estabilização do radical DPPH (EC50 = 114 µg/mL para PV-SME-1 e 246 µg/mL para PV-
SME-4) (Figura 35).
De modo geral, os sistemas microemulsionados permitem a incorporação de
compostos na fase interna oleosa (baixa constante dielétrica), na região interfacial (constante
dielétrica intermediária entre o óleo e a água) ou na fase externa aquosa (alta constante
dielétrica) (OLIVEIRA et al., 2004). Estes compostos podem ser responsáveis pelo aumento
significativo da atividade antioxidante dos extratos microemulsionados de Cleome spinosa e
Pavonia varians. Metabólitos ricos em grupos fenólicos, presentes nestes extratos, assim
como os flavonóides já isolados de Cleome spinosa uma vez encapsulados nos sistemas SME-
1 e SME-4, podem estar melhores disponibilizados para interações e estabilização do radical
DPPH, já que se comprovou que os SME-1 e SME-4 potencializou a atividade antioxidante
dos extratos testados.
TESE DE DOUTORADO
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104
710 355 177,5 88,75 44,37 22,18
Extrato-CS
CS-SME-1
CS-SME-4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
% AA (DPPH)
µµµµg/mL
Figura 34 - Eficácia antioxidativa de Cleome Spinosa Jacq expressa em valores de EC50
355 177,5 88,75 44,3722,18
PV-SME-1
PV-SME-40
10
20
30
40
50
60
70
% AA (DPPH)
µµµµg/mL
Figura 35 - Eficácia antioxidativa de Pavonia varians expressa em valores de EC50
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105
O levantamento bibliográfico realizado com as espécies Cleome spinosa Jacq Pavonia
varians Moric revelou a importância etnobotânica destas espécies que se encontram pouco
exploradas em estudos fitofarmacológicos. Através de um estudo analítico (metodologia de
MATOS, 1997) foi possível detectar nos extratos hidroalcoólicos de C. spinosa e P. varians
(coletadas em Pitangui/RN). A presença dos seguintes metabólitos especiais: flavonóides;
xantonas; saponinas e leucoantocianidinas. Foi observado o seguinte diferencial: alcalóides
detectados para C. spinosa e taninos, para a espécie P. varians. A solubilização dos extratos
polares de C. spinosa e P. varians nos sistemas microemulsionados SME-1 e SME-4
possibilitaram a biodisponibilização destas espécies, tendo resultado na comprovação da ação
antioxidante destas espécies, com significante diminuição da dose usada, garantindo além de
vantagens econômicas, a diminuição de possíveis efeitos adversos (a serem avaliados em
futuros ensaios in vivo). Comparativamente, evidenciou-se para ambas as espécie P. varians e
C. spinosa, melhor eficácia antioxidativa para o sistema SME-1. O percentual antioxidativo
do extrato de P. varians foi significativo em ambos SME, sendo duas vezes melhor para o
sistema SME-1 (EC50 = 114 µg/mL). Portanto, a espécie P. varians foi mais eficaz na
estabilização do radical livre DPPH, podendo estar correlacionado com a presença adicional
de taninos (evidenciada por testes analíticos) nesta espécie.
5.4.2 Avaliação da Atividade Antiinflamatória de Pavonia varians Moric
No teste das contorções abdominais (ácido acético 1,2%), a administração oral do
extrato hidroalcoólico (EHA) de P. varians nas doses de 100, 300 ou 1000 mg/kg, produziu
uma inibição dose-dependente do número de contorções acumuladas durante 30 minutos de
36% (35,7 ± 4,9 contorções), 62% (21,2 ± 4,3 contorções) e 74,2% (14,4 ± 2,5 contorções),
respectivamente, quando comparado com o grupo tratado com o veículo água, que somaram
55,8 ± 5,2 contorções (Figura 36), com dose inibitória 50% (ID50) de 201,8 mg/kg (Figura
37). Da mesma forma, o controle positivo indometacina (10 mg/kg, p.o.) reduziu em 47,1%
as contorções abdominais (29,5 ± 3,5) (Figura 36).
Teste do tail-flick permite investigar a participação de mecanismos centrais na
antinocicepção, mediante a avaliação do tempo, em segundos, que o animal leva para retirar a
cauda após a incidência de um estímulo térmico produzido por um feixe de luz; a
administração oral do extrato hidroalcoólico de Pavonia varians, na dose que produziu
inibição das contorções abdominais com maior intensidade (1000 mg/kg), não modificou de
forma significativa a reatividade dos animais ao estímulo térmico nociceptivo (Figura 38).
De forma diferente, o tratamento com fentanil (300 µg/kg, s.c.), controle positivo, elevou
TESE DE DOUTORADO
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106
significativamente o tempo de reação nos instantes trinta (22,8 ± 0,01 segundos - 3,3 vezes),
sessenta (17,9 ± 2,3 segundos – 3,4 vezes) e noventa minutos (8,3 ± 1,4 segundos - 1,5
vezes), quando comparados à reatividade dos animais do grupo experimental controle (7,0 ±
0,6; 5,2 ± 0,2 e 5,7 ± 0,5 segundos respectivamente) (Figura 38).
No teste da formalina, o pré-tratamento com 1 g/kg de EHA (pela via oral) ou com o
controle positivo indometacina (10 mg/kg), não reduziu a reatividade dos animais durante a
primeira fase de nocicepção (0 a 5 min.) que corresponde à dor de origem neurogênica (123,4
± 14,1 e 135,3 ± 19,7 segundos) respectivamente, quando comparada ao grupo experimental
veículo (131,2±7,5 segundos) (Figura 39A). Entretanto, na segunda fase (15 a 30 minutos,
dor inflamatória), a reatividade foi reduzida em 43,1% (144,8 ± 18,3 segundos) para o EHA e
61,7% (97,6 ± 23,4 segundos) para a indometacina, comparativamente aos resultados do
grupo veículo, que foi de 254,6 ± 11,2 segundos (Figura 39B). Estes resultados indicam a
presença de princípios bioativos (com forte atividade antinociceptiva) no extrato
hidroalcoólico da Pavonia varians (EHA). O teste das contorções abdominais, cuja relação
dose/efeito inibitório dependente confirmou a especificidade do efeito. No teste do tail flick e
na primeira fase de nocicepção (dor neurogênica) do teste da formalina, a ausência de
efetividade do EHA, afastou a possibilidade da participação de mecanismos antinociceptivos
no sistema nervoso central. Entretanto, a inibição da segunda fase (dor inflamatória) no teste
da formalina criou o forte indicativo da participação de mecanismos antiinflamatórios na
produção do efeito antinociceptivos deste extrato. Ensaios farmacológicos adicionais serão
necessários para a determinação destes mecanismos de ação.
TESE DE DOUTORADO
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107
Figura 36 - Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2% em salina, 100 µL/10g, i.p.) em camundongos previamente tratados (60 min.) pela via oral (p.o.) com o veículo (controle), com o controle positivo indometacina (INDO) ou com o extrato hidroalcoólico de Pavonia varians (EHA). As colunas e barras verticais representam as médias ± erro padrão de 6 a 8 animais por grupo experimental. Estatisticamente diferente do grupo controle (**p < 0,01 e ***p < 0,001)
2.0 2.5 3.0
0
50
100EHA Pavonia varians
Log dose ( g/kg, p.o. )
% de Inibição das
Contorções Abdominais
Figura 37 - Porcentagem de inibição das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético (1,2% em salina, 100 µL/10g, i.p.) em camundongos previamente tratados (60 min.) pela via oral com o extrato hidroalcoólico de Pavonia varians (EHA). Os símbolos e barras verticais representam as médias ± erro padrão de 6 a 8 animais por grupo experimental
TESE DE DOUTORADO
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108
-60 -30 0 30 60 90 120
0
5
10
15
20
25VeículoEHA P. varians
1 g/kg, p.o.Fentanil300 µµµµg/kg, s.c.
******
*
Tempo ( minutos )
R E A T I V I D A D E
(segundos)
Figura 38 - Reatividade ao estímulo térmico nociceptivo medido no teste do tail−flick em
camundongos previamente tratados pela via oral (p.o. - 60 min.) ou pela via subcutânea (s.c. - 30 min.) com o veículo (água, 100 µL/10 g, p.o.), com o fentanil (100 µg/kg, s.c.) ou com o extrato hidroalcoólico de Pavonia varians (EHA). Nas ordenadas estão representados os tempos de reação dos camundongos ao estímulo térmico nociceptivo em segundos. Os símbolos e barras verticais representam as médias ± erro padrão de 8 animais por grupo experimental. Estatisticamente diferente do grupo controle (*p < 0,05 e ***p < 0,001)
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109
0
50
100
150
Fase I ( 0 - 5 minutos )
V e í c u l o
Dor Neurogênica
I n d o
E H A
0
100
200
300Fase II ( 15 - 30 minutos )
1 0,01 g/kg, p.o.
E H A Indo
**
***
Dor Inflamatória
V e í c u l o
R E A T I V I D A D E (segundos )
A
B
Figura 39 - Reatividade em segundos, após a aplicação intraplantar de formaldeído
(20µL, 1,2% em salina) na pata posterior de camundongos previamente tratados (60min) pela via oral (p.o.) com o veículo (10 µL/g), com a indometacina (10 mg/kg) ou com o extrato hidroalcoólico da Pavonia varians (EHA – 1 g/kg). As colunas e barras verticais indicam as médias da fase I (A - 0 a 5 min - dor neurogênica) e fase II (B - 15 a 30 min - dor inflamatória) ± erro padrão de 8 animais por grupo experimental. Estatisticamente diferente do grupo controle (**p < 0,01 e ***p < 0,001)
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110
5.5 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DE Croton cajucara Benth (EUPHORBIACEAE)
5.5.1 Óleo Fixo das Cascas do Caule
Os óleos fixos obtidos via cromatografia em coluna (OF-CC) na extração com fluido
supercrítico (gás CO2) apresentaram rendimentos significativamente diferentes. A
comparação feita entre as duas extrações [via percolação (seguido de CC) e fluido
supercrítico] revelou que houve um maior rendimento de óleo fixo obtido através de coluna
cromatográfica (OF-CC), tendo sido obtido 13 g (3,14%) de óleo fixo (partindo-se de 413 g
de cascas), versus 1,2% de óleo fixo extraído no processo via fluido supercrítico (1,34 g;
partindo-se de 109 g de cascas). Estes dados poderiam estar correlacionados com questões
sazonais (MACIEL et al., 1998b, 2002a), já que a fonte vegetal utilizada em cada
experimento é comercializada no mercado Ver-o-peso (Belém/PA) e foi adquirida em épocas
diferentes. A extração com fluido supercrítico minimiza gastos e tempo de trabalho, desta
forma, mesmo que forneça rendimentos menores, torna-se uma alternativa viável na extração
de óleos em geral.
Não há relatos de estudos que tenham efetuado caracterização química de óleo
essencial ou fixo obtidos das cascas do caule do Croton cajucara, apenas cita-se que o óleo
essencial das cascas não apresenta traços de desidrocrotonina (DCTN) (Figura 28) e
constituído de sesquiterpenos (sem divulgação da identificação química) considerados como
responsáveis pelas atividades antiulcerogênica (HIRUMA-LIMA, et al., 1999b 2000),
antiinflamatória e antinociceptiva (BIGHETTI et al., 1999). Com relação ao óleo essencial de
folhas do Croton cajucara, sabe-se que é rico em linalol (ARAÚJO et al., 1971; LOPES et
al., 2000) e possui atividades antimicrobiana (ALVIANO et al., 2005) e antileishmania
(ROSA et al., 2003). O óleo essencial das partes aéreas deste Croton, também mostrou-se rico
em linalol (LEMOS et al., 1999).
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111
Figura 28 - Estruturas isoladas da casca do caule de Croton cajucara
O
COOCH3O
H
H
c-CJC-B
O
COOCH3O
H
H
t-CJC-B t-CJC-A
O
COOCH3O
H
COH
O
OH
O
O
ISCR
O H
H
O
O
O OHO
ICJCR
O H
H
O
O
OHO O
CJCR
O
O
H
COOH
H
AAA
O
O
H O
O
H
DCTN
O
O
H O
O
H
CTN
1 3 0 1 3 1 1 3 2
1 3 3 1 3 4 1 3 5
1 3 6 1 3 7 1 3 8
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112
Os constituintes químicos das frações F1 (esterificada) e F2, F3 e F4 (não-
esterificadas), após procedimento cromatográfico (Esquema 4) foram identificados por CG-
FID e CG-EM. Para tanto, efetuou-se estudo comparativo dos espectros de massas obtidos
destas frações, com os dados da espectroteca Wiley e dos índices de retenção, calculados a
partir da injeção de uma série de alcanos lineares (C13 - C18). Os resultados obtidos
revelaram para a fração F1 a presença de sesquiterpenos (Tabela 22), onde o α-copaeno
(20,1%) e cipereno (21,8%) foram os componentes majoritários. Uma vez que esta fração foi
previamente esterificada, foram observados ésteres metílicos e etílicos.
Os sesquiterpenos corresponderam a aproximadamente 70% da constituição química
de F1. A normalização observada na Tabela 22 permite a visualização do percentual relativo
entre os sesquiterpenos identificados.
A fração F2 mostrou sesquiterpenos mais oxigenados (Tabela 23), onde se inclui o
linalol e outros monoterpenos em pequenas quantidades. A identificação de frações de
álcoois, cetonas e substâncias oxigenadas em geral, utilizando dados de comparação com
espectroteca e índices de retenção, é de baixa confiabilidade. Desta forma, foram citadas
apenas as substâncias que apresentaram altos índices de similaridade entre espectros na
comparação com a espectroteca.
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113
Esquema 4 - Procedimentos de extração e fracionamento em coluna cromatografia para
obtenção do óleo fixo das cascas do caule de Croton cajucara
F1 esterificada
Esterificaçãocom diazometano
Fração F4
hexano/AcOEt (85:15)
Fração F3
hexano/AcOEt (90:10)
Fração F2
hexano/AcOEt (95:5)
Fração F1
hexano/AcOEt(100:0 - 98:2)
CC (sílica gel 70-230 Mesh)
FAB (13g; 3,14%)
reunidas após análises de CCDReservadas paraIsolamento dePadrões
Frações FC-FF
hexano/AcOEt(90:10 - 85:15)
Fração FB
hexano/AcOEt (98:2)
Fração FA
hexano/AcOEt (100 : 0)
Frações Obtidas: FA, FB, FC, FD, FE, FF
cromatografia de columa (CC)sílica gel (70-230 Mesh - 94g)
extração com MeOH
extrato metanólico (EM)
(cascas do caule)
Croton cajucara 413g
Avaliação dasPropriedadesFungicidas
Análises por CG-FID e CG-EM
Denominadade OF-CC(óleo fixo obtidovia CC)
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114
A fração F3 contém ácidos graxos, misturas de esteróis e os diterpenos do tipo
clerodano trans-crotonina (CTN), cis-cajucarina B (c-CJC-B;) e trans-cajucarina B (t-CJC-B)
(Figura 28: estruturas químicas 131, 133 e 134, respectivamente) constituintes químicos das
cascas do caule de Croton cajucara (Maciel et al., 1998a,b, 2003). A Figura 40 mostra a
expansão do cromatograma da fração F3, evidenciando a presença dos clerodanos e esteróis
detectados. O somatório de esteróis e diterpenos neste cromatograma constituiu cerca de 40%
do total de F3. A fração F4 contém majoritariamente os clerodanos isoméricos cis e trans-
cajucarina B. Os clerodanos CTN, c-CJC-B e t-CJC-B foram identificados nas frações F3 e
F4, via co-injeção com padrões autênticos. A Figura 41 apresenta o espectro de massas da
CTN e as Figuras 42 e 43 apresentam respectivamente, os espectros de massas dos isômeros
c-CJC-B e t-CJC-B detectados no cromatograma da fração F3. Os Esquemas 5 e 6 mostram
fragmentos característicos que foram atribuídos aos clerodanos trans-crotonina (CTN) e
cajucarinas B (c-CJC-B e t-CJC-B), respectivamente.
Tabela 22 - Substâncias voláteis da fração F1 detectadas por CG-EM e confirmadas por seus dados de IR por CG-FID
Substâncias detectadas %* % ** IR obtido IR lit. Cicloisosativeno 2,3 3,3 1370 -
α-copaeno 13,9 20,1 1376 1369
Cipereno 15,1 21,8 1398 1398
α-bergamoteno 1,6 2,3 1408 1436
2,6-dimetil-6-(4-metil-pent-3-enil) biciclo[3.1.1] hep-2-eno 8,3 12,0 1415 -
cis-cariofileno 5,6 8,1 1438 1426
allo-aromadendreno 2 2,9 1455 1463
α-longipineno 3,6 5,2 1467 1357
δ-guaieno 1,4 2,0 1486 1502
α-muuroleno 2,2 3,2 1488 1503
δ-cadineno 6,7 9,7 1509 1524
Nerolidol 2,2 3,2 1545 1562
Junipeno 1,4 2,0 1572 -
Cadaleno 3 4,3 1636 1637 Total 69,3 100,0 * Porcentagem observada pela integração. ** Porcentagem normalizada para a constituição dos sesquiterpenos. IR obtido = Índice de Retenção obtido nas análises realizadas. IR lit. = Índice de Retenção observado na literatura, obtido nas mesmas condições de análises
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115
Tabela 23 - Substâncias voláteis da fração F2 detectadas via CG-EM Substâncias detectadas % Linalool 0,6 Borneol 0,5 p-cimeno-α-ol t propanoato de linalila t Elemicina 2,3
Nerolidol 1,0 Espatulenol 23,8 Viridiflorol 8,6
Total 36,8
Figura 40 - Expansão do cromatograma da fração F3, evidenciando a presença de clerodanos
[trans-crotonina (CTN), cis-cajucarina B (c-CJC-B) e trans-cajucarina B (t-CJC-B)] e esteróis
Figura 41 - Espectro de massas do clerodano trans-crotonina, obtido no
cromatograma da fração F3
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116
Esquema 5 - Fragmentos propostos para a CTN
O
O
O
+O
[M ]+ 316
(39 %)
m/z 222
OCO2H
(22 %)m/z 94
(100 %)
O
O
C
m/z 95
(76 %)
O+
(48 %)
m/z 82
O
O
O
m/z 204 (51 %)
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117
Figura 42 - Espectro de massas do clerodano isomérico trans-cajucarina B (t-CJC-B), obtido
no cromatograma da fração F3
Figura 43 - Espectro de massas do clerodano isomérico cis-cajucarina B (c-CJC-B), obtido no cromatograma da fração F3
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118
Esquema 6 - Proposta de fragmentação para os 19-nor-clerodanos cis e trans-cajucarinas B
CO
m/z 189
O
O
O
+
m/z 271
+O
CO
m/z 82
O +O
CO
O
C+
m/z 217
O
CO2Me
330 [M]+
OCO2Me
O+
m/z 81
+
H
m/z 161
+O
OCO2Me
m/z 248
MeO
OCO2Me
O
HO
CO
m/z 189
OC+
m/z 236
+
HO
CH2
OMeO
OCO2Me
HO
HO
m/z 121
m/z 95
HOHO
m/z 134
O
H2C2
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119
5.5.2 Estudo Fitoquímico das Cascas do Caule de Croton Cajucara Benth
5.5.2.1 Espectrometria de Massas de Diterpenos do Tipo Clerodano
Objetivando a realização de um estudo de espectros de massas de terpenóides do tipo
clerodano, obteve-se das cascas do caule de Croton cajucara, os diterpenos 19-nor-clerodano
trans-desidrocrotonina (130), trans-crotonina (131), cis-cajucarina B (133), trans-cajucarina
B (134) e cajucarinolida (CJCR) (Figura 28). Estes clerodanos foram reisolados das cascas do
caule de C. cajucara de acordo com metodologia previamente reportada (MACIEL et al.,
1998a,b; 2003; 2006b). É importante ressaltar que dentre estes diterpenos, a trans-
desidrocrotonina mostrou correlação significativa com as indicações medicinais desta espécie
medicinal (vide Capítulo 2) (MACIEL et al., 2000, 2002a,b; 2006a,b; COSTA et al., 2007).
Como dito anteriormente (Capítulo 2) a maioria dos diterpenos do tipo clerodano apresenta
junção A/B trans (5α, 10β) com configuração relativa cis para os substituintes das posições
C-5, C-8 e C-9 (Figura 44). Os diterpenos com junção A/B cis (5α, 10α) na sua grande
maioria, apresentam os substituintes das posições C-8 e C-9 β-orientados (MACIEL et al.,
2006b).
Clerodina Esqueleto Junção A/B Junção A/B cis-crotonina
129 Básico do tipo trans do tipo cis 131a
Figura 44 - Representação estrutural de diterpenos do tipo clerodano (129)
e do tipo 19-nor-clerodano (131a)
O
H O
H
O
O
H
R
H
R
HO
O
HH
OAc
H
OAc
O5
8
9
10A B
20
19
18
17
15
16
12
9
75
3
1
TESE DE DOUTORADO
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120
Neste estudo, foram avaliados inicialmente, dados de íons provenientes de espectros
de clerodanos reportados na literatura (ATHONSEN et al., 1973; HASAN, et al., 1982;
MISRA et al.,1985; LOPES et al., 1987; YU et al., 1988; ETSE et al., 1989; EL-BABILI et
al., 1998; URONES et al., 1989; KHAN et al., 1990; AVILA et al., 1991; FAZIO et al.,
1992; LEITÃO et al., 1992; AQUINO et al., 1992; PINTO et al., 1994). Para tanto, tomou-
se a subunidade decalínica de sistema enona padrão (142) representada no Esquema 7, onde o
substituinte 19 (ligado a posição C-5) é obrigatoriamente, diferente de hidrogênio
(caracterizando desta forma, um clerodano ao invés de um 19-nor-clerodano. As análises dos
dados de espectros de massas divulgados na literatura (referências citadas acima),
possibilitou o reconhecimento de padrões de fragmentações para clerodanos de sistema enona
padrão deste tipo (142). Os fragmentos de íons m/z 95, 109, 121, 135 e 205 foram os mais
encontrados. O fragmento de íon m/z 205, resultante da quebra da cadeia linear, foi observado
em todos os isômeros. Na ausência de substituintes nas posições 6 e 7, os fragmentos de íons
m/z 109 e 121 foram os mais abundantes. Os fragmentos de íons m/z 122 e 124 provenientes
de rearranjo, foram observados mais frequentemente nos cis-clerodanos e apresentam
abundância relativa mais alta do que os trans-clerodanos. Para os trans-clerodanos, os
fragmentos de íon m/z 95, 109, 121 e 205 se destacam em todos os espectros analisados. O
Esquema 7 mostra uma proposta de fragmentações para os íons de m/z 205, 134, 124, 122,
121 e 95.
Esquema 7- Padrões de fragmentações para clerodanos com sistema enona do tipo 142
A subunidade decalínica padrão 142a (Esquema 8) foi utilizada para o estudo dos 19-
nor-clerodanos DCTN (130), c-CJC-B (133), t-CJC-B (134) e CJCR (137)] Para estas
substâncias destacam-se os padrões de fragmentação 161, 134 e 121 (Esquemas 6 e 8). O
isômero trans-cajucarina B (134) apresentou abundância relativa mais alta [m/z 161 (18%),
+O
m/z 205
10
10
5
HO
m/z 124
O
m/z 134
HO
m/z 122
HO OH
m/z 121
HO
m/z 95
CH31 4 0
m/z 142
TESE DE DOUTORADO
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121
134 (95%) e 121 (100%)] do que o cis-cajucarina B (133) [m/z 161 (27%), 134 (61%) e 121
(81%)]. Os fragmentos padrões de íons m/z 161, 134 e 121 também foram observados para o
clerodano isosacacarina (ISCR, 136), previamente isolado de Croton cajucara (MACIEL et
al., 1998a,b; 2003; 2006b). Para este clerodano, que apresenta grupo CH2 na posição C-19, os
fragmentos de íons m/z 162 (25%), 122 (57%), 94 (94%) e 82 (100%) foram os mais
abundantes (Esquema 9).
Esquema 8 - Padrões de fragmentação para 19-nor-clerodanos do tipo 142a
O 19-nor-clerodano trans-crotonina (CTN; 131) apesar de não possuir insaturação ∆3,4
no anel A do sistema decalínico, apresentou os fragmentos padrões de íons de m/z 161 (38%),
134 (24%) e 121 (51%), no entanto, os fragmentos m/z 94 (100%) e 95 (78%) foram os mais
abundantes. O isômero cis-crotonina (131a, Figura 41) isolado de Croton lucidus L., também
apresentou o fragmento m/z 94 como pico base (CHAN et al., 1968). O clerodano trans-
cajucarina A (135) que possui um grupo formila na posição C-5, apresentou abundância
relativa mais alta nos seguintes fragmentos m/z 330 (47%), 299 (33%), 269 (47%) e 248
(100%).
OH
m/z 121m/z 134
OH
m/z 161
+O
m/z 189
+H
H
O
5
10
10a1 4 0m/z 142
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122
Esquema 9 - Proposta de fragmentação do clerodano isosacacarina (136)
m/z 245
O
CO2Me
(11 %)
O
O
m/z 284 (10 %)
O
+
[M ]+ 328
(13 %)
O
O
O
m/z 122(57 %)
O
m/z 162(25 %)
HO
(100 %)
m/z 82
O
(18 %)m/z 134
HO
m/z 94(94 %)
O
+
(47 %)
m/z 81
O
19
20
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
123
Com base nos espectros foram caracterizados fragmentos padrões para a identificação
de diterpenos do tipo clerodano e 19-nor-clerodano isolados de Croton cajucara, bem como
de outras fontes vegetais que apresentem carbonila α,β-insaturada na posição ∆3,4 do anel A
do sistema decalínico, tendo sido possível através de íons característicos, definir a junção dos
anéis A e B do sistema decalínico destes tipos de diterpenos.
Os fragmentos de rearranjo com íons m/z 122 e 124 são mais abundantes em cis-
clerodanos e, desta forma, permitem correlacioná-los com a estereoquímica dos centros
quirais C-5 e C-10. A observação de fragmentos padrões nos espectros de massas dos
clerodanos investigados, poderá facilitar a identificação de subunidades decalínicas do tipo
140 (Esquema 7; com fragmentos abundantes para os íons m/z 95, 121 e 205) e 142a
(Esquema 9; onde os fragmentos m/z 161, 134 e 121 são os mais característicos para os
diterpenos 19-nor-clerodano), em estudos realizados com o uso de Cromatografia Gasosa de
Alta Resolução acoplada à Espectrometria de Massas (CGAR-EM).
Através deste estudo pode-se concluir ainda, que o fragmento de íon m/z 161 é
também, característico par diterpenos do tipo 19-nor-clerodano e que o uso da metodologia
CGAR-EM torna-se uma ferramenta importante na análise de misturas complexas de extratos
provenientes de fontes naturais (vegetais ou marinhas) ricas em diterpenos do tipo clerodano.
Desta forma, o trabalho exaustivo de isolamento, purificação, identificação, caracterização e
definição da configuração relativa dos centros quirais C-5 e C-10 de substâncias clerodânicas
com decalina contendo um sistema enona do tipo 142 e 142a, pode ser evitado.
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
124
5.6 ABORDAGEM FARMACOLÓGICA DE Croton cajucara Benth
5.6.1 Propriedade antifúngica do óleo fixo de Croton cajucara
O controle positivo representa em experimentos in vitro uma condição básica para o
crescimento de fungos. Neste tratamento o fungo é submetido ao meio de cultura BDA
acrescido de antibiótico, para evitar o crescimento de bactérias. O controle negativo, também
conhecido como testemunha padrão ou branco, é preparado da mesma forma, entretanto, com
uma diferença: a adição de 1% (v.v-1) de DMSO. A utilização do DMSO foi necessária para
solubilizar o óleo fixo de Croton cajucara no meio de cultura, constituído principalmente por
água, permitindo, desta maneira, que o óleo seja difundido igualmente no meio de cultura. A
utilização do controle negativo permite que os efeitos dos tratamentos sejam subtraídos de um
possível efeito do DMSO, sobre o crescimento dos fungos. A comparação feita entre o
controle testemunha padrão (BDA + DMSO) e o controle positivo (BDA) nas placas de Petri,
com o fungo Fusarium oxysporum, observou-se que não houve diferenças significativas
durante os cinco dias de ensaio. No entanto, os fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii,
apresentaram sensibilidade à presença do DMSO no meio de cultura. Por esta razão, os
percentuais de inibição foram trabalhados a partir dos resultados obtidos com a testemunha
padrão. Desta forma, o efeito do DMSO sobre o crescimento dos fungos foi subtraído. Uma
vez subtraído os efeitos inibitórios do DMSO sobre os fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium
rolfsii, os tratamentos com o óleo fixo de Croton cajucara obtido via procedimento
cromatográfico (OF-CC proveniente da reunião de frações FAB) apresentaram efeito inibitório
suplementar ao observado na testemunha padrão (Figuras 45 e 46). Resultados semelhantes
foram encontrados por SOUZA et al. (2003) ao verificarem a atividade biológica do óleo de
capim limão sobre o desenvolvimento dos mesmos tipos de fungos utilizados neste trabalho.
Após cinco dias de observação, as placas de Petri contendo o fungo Sclerotium rolfsii,
apresentaram uma possível alteração fisiológica, já que as estruturas de resistência,
denominadas de esclerócios, apresentaram-se rugosas, com manchas variando do marrom-
escuro ao marrom-claro e diâmetro quatro vezes superior ao encontrado nas placas do
controle positivo. Ao se avaliar os efeitos do OF-CC sobre o crescimento do fungo, verificou-
se efeito fungistático em decorrência de redução no crescimento da colônia, tendo sido
comprovado inibição do crescimento dos três fungos testados (Figuras 45 e 46). Em
contrapartida, a resposta fisiológica dos fungos testados (na presença do OF-CC no meio de
cultura) foi diferente, tendo variado de acordo com o tipo de fungo testado. Observou-se que
os fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii foram resistentes ao óleo testado, de modo
que o percentual de inibição diminuiu com o transcorrer dos dias, principalmente para
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
125
Sclerotium rolfsii. Como pode ser observado na Figura 45, o fungo Fusarium oxysporum foi o
que sofreu efeito inibitório mais estável ao longo dos 5 dias de crescimento.
Comparativamente, o fungo Sclerotium rolfsii sofreu a maior queda do efeito inibitório,
enquanto o fungo Rhizoctonia solani sofreu maior inibição ao crescimento da colônia (Figura
47).
A presença de sesquiterpenos foi comprovada no óleo fixo obtido das cascas do caule
de Croton cajucara Benth, tendo sido evidenciado que o α-copaeno (20,1%) e cipereno
(21,8%) são os componentes majoritários (70% de percentual sesquiterpénico total) deste
óleo. Dentre os sesquiterpenos minoritários mais oxigenados, destaca-se o linalol.
Adicionalmente, foram confirmadas as presenças de ácidos graxos, misturas de esteróis e os
diterpenos bioativos trans-crotonina (CTN), cis-cajucarina B (c-CJC-B) e trans-cajucarina B
(t-CJC-B) (Figura 28). Com relação aos ensaios in vitro pode-se dizer que o DMSO serviu
apenas como veículo nos ensaios in vitro com fungos, como observado previamente por
SOUZA et al. (2003), FERREIRA et al. (2004) e JACQUES et al. (2005), tendo sido
necessário um estudo prévio das concentrações ideais para a sua utilização. O óleo fixo
testado na concentração de 0,2 mg.mL-1, apresentou atividade biológica de grande valor
agronômico, já que possui sesquiterpenos e clerodanos que podem ser utilizados isoladamente
em testes posteriores, bem como disponibilizados em mistura (óleo fixo) para uso comercial
na agricultura.
Equívocos com relação ao uso tradicional de Croton cajucara, onde folhas são
comercializadas com indicações terapêuticas de cascas, encontram-se documentados (VEIGA
JR. et al., 2005). Desta forma, trabalhos que enfoquem a constituição química de óleos
provenientes de folhas ou cascas deste Croton, bem como investigações biológicas, devem ser
divulgados objetivando esclarecimentos que contribuam com o uso tradicional desta espécie
medicinal, bem como com seus estudos etnobotânico, etnofarmacológico, fitoquímico e
fitoterápico.
TESE DE DOUTORADO
Rosélia Sousa Leal
126
Figura 45 - Diâmetro de crescimento das colônias em meio de cultura BDA, durante cinco dias. Controle positivo: meio de cultura BDA; Controle testemunha padrão: meio de cultura BDA + 1% DMSO; óleo fixo de Croton cajucara: meio de cultura BDA com concentração 0,2 mg.mL-1 de óleo fixo e 1% de DMSO; A) Fusarium oxysporum.; B) Rhizoctonia solani.; C) Sclerotium rolfsii
A
a
a
a
aa
a
a
aa
a
a
b
b
b
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 2 3 4 5
Controle (+)Controle (-)Óleo de Sacaca
Ba
a
a
a a
a
b
b
ba
b
c
c
c
b0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Diâmetro da colônia (cm
)
C
aa
a
b
b
a
b
ba
a
c
c
c
c
b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 2 3 4 5
Tempo após o início do ensaio (dias)
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Figura 46 - Colônias dos fungos crescidos em meio de cultura BDA. Imagens capturadas no quinto dia após o início do ensaio, onde nas colunas: 1) meio de cultura BDA; 2) meio de cultura BDA + 1% DMSO e 3) meio de cultura BDA com concentração de 0,2 mg.mL-1 do óleo fixo de Croton cajucara e 1% de DMSO; nas linhas: A) Fusarium oxysporum.; B) Rhizoctonia solani e C) Sclerotium rolfsii
Figura 47 - Percentual de inibição do crescimento das colônias de Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii em meio de cultura BDA, contendo 0,2 mg.mL-1 do óleo fixo de Croton cajucara, durante cinco dias
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5
Tempo após início dos ensaios (dias)
% de inibição
F. oxysporum
R. solaniS.rolfssi
A
B
1 2 3
C
6 CONCLUSÕES
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129
6 CONCLUSÕES
O estudo etnobotânico realizado com 84 espécimes vegetais, confirmou a grande
diversidade do uso tradicional de plantas para fins curativos. Neste estudo 44 tipos diferentes
de famílias foram correlacionadas com as espécimes, tendo sido destacadas as famílias
Myrtaceae, Araceae e Euphorbiaceae, pela incidência de utilização. Duas destas espécies
Cleome spinosa Jacq (Brassicaceae) e Pavonia varians Moric (Malvaceae) foram neste
trabalho, alvo de investigações etnobotânicas e fitofarmacológicas.
O levantamento bibliográfico realizado com as espécies Cleome spinosa e Pavonia
varians revelou a importância etnobotânica destas espécies que se encontram pouco
exploradas em estudos fitofarmacológicos.
Através de um estudo de prospecção analítica, realizado com extratos lipofílico e
hidrofílico de Cleome spinosa Jacq, foram detectados os seguintes metabólitos especiais:
catequinas, chalconas, flavonóides e alcalóides. O estudo fitoquímico comprovou a presença
dos flavonóides (2S)-5-hidroxi-7,4’-dimetoxi-flavanona e 5,4’-diidroxi-3,7,3’-trimetoxi-
flavona.
Similarmente foram realizados testes qualitativos para a espécie Pavonia varians
Moric, tendo sido detectados os seguintes metabólitos especiais: leucocianidinas, catequinas,
flavonois, flavanonas, chalconas e saponinas.
A biodisponibilização dos extratos polares de C. spinosa e P. varians se deu pelo uso
de sistemas microemulsionados farmacologicamente aceitáveis, que se mostraram eficazes na
solubilização destes extratos. Os sistemas microemulsionados SME-1 e SME-4
possibilitaram evidenciar a ação antioxidante dos extratos hidroalcoólicos de C. spinosa e P.
varians, tendo sido utilizadas baixas doses em experimentos in vitro que avaliam a
estabilização do radical livre DPPH.
O percentual antioxidativo do extrato de P. varians foi significativo em ambos os
sistemas microemulsionados SME-1 e SME-2, sendo duas vezes melhor para o sistema SME-
1 (EC50 = 113,8472 µg/mL). A eficácia antioxidativa do extrato de C. spinosa foi mais
significativa no sistema SME-1 (CE50: 224 µg/mL). Comparativamente, a espécie P. varians
foi mais eficaz, podendo estar correlacionado com a presença de taninos (evidenciada por
testes analíticos).
No teste das contorções abdominais a administração oral (p.o.) do extrato
hidroalcoólico de P. varians (EHA-PV) produziu inibição dose-dependente do número de
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contorções acumuladas, com dose inibitória 50% (ID50) de 201,8 mg/kg [controle positivo
indometacina 47,1% (10 mg/kg, p.o.)].
No teste do tail-flick que permite investigar a participação de mecanismos centrais na
antinocicepção, a administração oral do extrato EHA-PV em dose elevada [1000 mg/kg (dose
que produz inibição das contorções abdominais com maior intensidade)], não modificou de
forma significativa a reatividade dos animais ao estímulo térmico. De forma diferente, o
tratamento com fentanil [controle positivo (300 µg/kg, s.c.)] elevou significativamente o
tempo de reação.
No teste da formalina, o pré-tratamento com 1 g/kg de EHA-PV (pela via oral) ou
com o controle positivo indometacina (10 mg/kg), não reduziu a reatividade dos animais
durante a primeira fase de nocicepção. No entanto, na segunda fase (15 a 30 min.), a
reatividade foi reduzida em 43,1% (144,8 ± 18,3 segundos) para o EHA e 61,7% (97,6 ± 23,4
segundos) para a indometacina, comparativamente aos resultados do grupo veículo, que foi
de 254,6 ± 11,2 segundos.
Os estudos realizados com a espécie medicinal Croton cajucara Benth foram
centralizados em avaliações do óleo fixo das cascas do caule deste Croton, bem como de
constituintes do tipo clerodano presentes nesta parte da planta, que melhor representa o uso
tradicional de C. cajucara. Neste estudo, utilizou-se a espectrometria de massas objetivando-
se a identificação de fragmentos característicos de diterpenos do tipo clerodano e 19-nor-
clerodano contendo carbonila α,β-insaturada no anel A do sistema decalínico. Para tanto,
dados de espectrometria de massas foram analisados para os seguintes metabólitos especiais:
trans-desidrocrotonina (DCTN), trans-crotonina (CTN), cis-cajucarina B (c-CJC-B), trans-
cajucarina B (t-CJC-B), isosacacarina (ISCR) e cajucarinolida (CJCR). A junção trans de
clerodanos de sistemas enona foi claramente correlacionada com a presença dos íons
característico de m/z 95, 121 e 205 e os sistemas de junção cis apresentaram íons
característicos de m/z 122 e 124. A junção trans dos diterpenos do tipo 19-nor-clerodano de
sistemas enona foi correlacionada com a presença dos íons característico de m/z 161, 134 e
121. Este estudo pode ser utilizado na identificação de diterpenos do tipo clerodano e 19-nor-
clerodano, contendo carbonila α,β-insaturada no anel A do sistema decalínico, evitando desta
forma, a obrigatoriedade de isolamento e caracterização via espectroscopia de RMN.
As análises (via CG-FID e CG-EM) realizada para o óleo fixo obtido das cascas do
caule de Croton cajucara revelou a presença de sesquiterpenos com percentual majoritário
para o α-copaeno (20,1%) e cipereno (21,8%), perfazendo 70% de percentual sesquiterpénico
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total. Sesquiterpenos minoritários mais oxigenados também foram detectados, além de
linalol. Adicionalmente, ácidos graxos, misturas de esteróis e dos diterpenos bioativos trans-
crotonina (CTN), cis-cajucarina B (c-CJC-B) e trans-cajucarina B (t-CJC-B) também foram
detectados.
O efeito biológico do óleo fixo obtido das cascas do caule do Croton cajucara no
desenvolvimento in vitro dos fungos fitopatogénicos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia
solani e Sclerotium rolfsii propagados em meio de cultura Batata-dextrose-agar (BDA).
Mostrou a resposta fisiológica, tendo sido observado que este óleo possui efeito fungistático
no controle micelial dos fungos testados, onde o fungo F. oxysporum foi o que sofreu efeito
inibitório mais estável.
Finalmente pode-se dizer que, este trabalho pode contribuir com os estudos científicos
da espécie medicinal Croton cajucara Benth (nativa da região Amazônica do Brasil) e
avançar na busca de novas plantas terapêuticas nativas do Litoral Norte Riograndense, aqui
representadas pelas espécies Cleome spinosa Jacq e Pavonia varians Moric.
REFERÊNCIAS
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ANEXOS
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ANEXO A- ESPECTROS DE (2S)-hidroxi-7,4’-dimetoxi-flavanona (CS-EM-3b)
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ANEXO B - ESPECTROS DE 7,4’-diidroxi-3,5,3’-trimetoxi-flavanona (CS-EM-4a)
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