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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Programa de Pós-Graduação em Produtos Bioativos e Biociências

Arielly Rodrigues Ribeiro Barreto

ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DA CHALCONA ANTILEISHMANIAL CH8 APÓS BIOTRANSFORMAÇÃO IN VITRO POR MICROSSOMAS HEPÁTICOS DE RATOS

Macaé 2017





Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências da

Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Macaé,

como parte dos requisitos necessários para a obtenção do

título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Produtos Bioativos e Biociências

Orientador: Prof. Dr. Thiago Barth

Coorientadora: Profa. Dra. Michelle Frazão Muzitano

Macaé 2017





Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Produtos

Bioativos e Biociências da Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Macaé

como parte dos requisitos à obtenção do grau de Mestre em Ciências.

Macaé, 22 de setembro de 2017.

Aprovada por

Dr. Fernando Armani Aguiar – Universidade Federal do Rio de Janeiro- Campus Macaé

Dr. Maximiliano da Silva Sangoi – Universidade Federal do Rio de Janeiro- Campus Macaé

Dr. Shaft Corrêa Pinto – Universidade Federal do Rio de Janeiro- Campus Macaé

Dr. Thiago Barth – Universidade Federal do Rio de Janeiro- Campus Macaé

(Orientador)

Dra. Michelle Frazão Muzitano – Universidade Federal do Rio de Janeiro- Campus Macaé

(Coorientadora)

Dedico este trabalho ao Senhor Jesus, a

minha família, aos meus orientadores e amigos

por todo apoio e incentivo.

Agradecimentos

Primeiramente ao meu Senhor Jesus por me permitir concretizar mais um

sonho, pela oportunidade de honrar os meus pais, pelos ensinamentos adquiridos

durante o mestrado, por colocar pessoas maravilhosas em meus caminhos para me

abençoar, por me dar força, saúde, capacidade para concluir esse trabalho e me

ensinar que todas as coisas cooperam para o bem daqueles que amam a Deus.

Aos meus pais, Edir e Marta, por todo amor, carinho, orações, incentivo, apoio,

paciência, compreensão, pelas renúncias e investimentos na minha educação, por

não medirem esforços para tornarem os meus sonhos realidade e por me incentivar

em meus projetos. Aos meus irmãos, Ruan e Heivyn, por sempre me apoiar e torcer

pelo meu sucesso profissional. Muitíssimo obrigada família por tudo!!!

Aos Profs. Dr. Thiago Barth e Dra. Michelle Muzitano por terem sido mais do

que orientadores. Amigos que Deus colocou na minha vida para me mentorear.

Muitíssimo obrigada por todo apoio, preocupação, carinho, conselhos, palavras

encorajadoras, pela confiança, paciência, compreensão, descontrações, por me

conceder a oportunidade de desenvolver esse trabalho e torcer pelo meu sucesso.

Obrigada Profa. Michelle pelos sacrifícios para estar comigo no Fundão para

apresentar a proposta de doutorado em inglês aos meus orientadores do doutorado

e Prof. Thiago obrigada por não medir esforços para me ajudar e me acompanhar

com sua esposa Vanessa e seu filho Davi para que eu pudesse realizar os

experimentos na USP-RP e concluir esse trabalho. Sempre me lembrarei de tudo o

que vocês fizeram por mim!!!

A Profa. Dra. Bartira Bergmann pelo privilégio, oportunidade e confiança para

que nós, do LPBio (UFRJ-Macaé) pudéssemos contribuir cientificamente no estudo

da chalcona CH8, que é fruto de muito trabalho iniciado a mais de 10 anos atrás.

Obrigada pela atenção, disponibilidade e pela oportunidade de doutorado. As alunas

de pós-doutorado Ariane e Izabella, a aluna Maria Paula, doutorandos Douglas e

Felipe pela receptividade, atenção e por compartilhar conhecimento.

Ao Prof. Dr. Fernando Armani pela compreensão, por compartilhar

conhecimento, pelas contribuições nas bancas de acompanhamento, por se dispor

juntamente com o Prof. Thiago a ir para USP-RP para preparar os microssomas para

que eu pudesse realizar esse trabalho.

Ao Prof. Dr. Vitor Todeschini pela disponibilidade em ajudar, compreensão,

pelas palavras encorajadoras, paciência e agregadoras contribuições nas bancas de

acompanhamento.

Ao Prof. Dr. Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira do Departamento de

Química, da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP-

USP) e seus alunos de pós-graduação Maysa e Ícaro por me receber e por todo o

suporte para realização dos experimentos de metabolismo.

Ao Prof. Dr. Norberto Peporine Lopes do Núcleo de Pesquisa em Produtos

Naturais e Sintéticos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

(FCFRP-USP) pela oportunidade de realizar análises em seu laboratório e, em

especial, ao pós-doutorando Lucas Maciel e o técnico em espectrometria de massas

José Carlos Thomaz pela atenção, paciência, suporte e ajuda na obtenção dos

dados no LC-MS.

A Profa. Ivana Correa, as doutorandas Maria Sandra e Maíra e pós-

doutorando Daniel por me receber no laboratório, pela atenção e suporte prestados

para que eu pudesse fazer algumas análises no LC-MS.

Ao grupo do Laboratório de Produtos Bioativos (LPBio), em especial, os

amigos Marlon Heggdorne, Marcos, Jobert, Isabela, Jessyca, Juliana, Cristiane,

Natielly por tornarem nossos dias no laboratório mais alegres; obrigada pelas

risadas, momentos de confraternização, pelas palavras positivas, pela torcida, por

todas as ajudas. Aos graduandos de farmácia Marlon Roca e Bianca pelas

contribuições nesse trabalho.

As amigas Mariana, Renata e Nívia pela torcida, conselhos e amizade.

A Universidade Federal do Rio de Janeiro do Campus Macaé pelo apoio

institucional durante a graduação em Farmácia e no mestrado pelo Programa de

Pós-Graduação de Produtos Bioativos e Biociências (PPGProdBio).

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e

a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo

financiamento concedido.

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para o desenvolvimento

desse projeto. Muitíssimo obrigada e que DEUS abençoe a cada um de forma

especial!!!

“Como é feliz o homem que acha

sabedoria, o homem que adquire

conhecimento; porque melhor é o lucro que

ela dá do que o da prata, e melhor a sua

renda do que o ouro mais fino” (Provérbios

3:13-14).

i

RESUMO

BARRETO, A.R.R. M.Sc., Universidade Federal do Rio de Janeiro- Campus Macaé,

2017. Análise cromatográfica da chalcona antileishmanial CH8 após

biotransformação in vitro por microssomas hepáticos de ratos. Orientador: Thiago

Barth e Coorientadora: Michelle Frazão Muzitano.

A chalcona CH8, quimicamente 3-nitro-2’-hidroxi-4’,6’-dimetoxichalcona, é um

derivado sintético de chalcona. Apresenta comprovada atividade antileishmanial in

vivo, 60 vezes maior frente a Leishmania amazonensis, quando comparada aos

derivados antimoniais, candidatando-a a um potencial fármaco. O estudo do

metabolismo no estágio inicial de descoberta do fármaco é indispensável para a

avaliação da sua segurança e eficácia. Dessa forma, o presente trabalho teve por

objetivo estudar a biotransformação in vitro da chalcona CH8 utilizando microssomas

hepáticos de ratos. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da

chalcona CH8 em fração microssomal de fígado de ratos empregando CLAE-DAD. O

método empregou uma coluna C18, fase móvel acetonitrila: solução de ácido acético

0,1% (65:35, v/v) e vazão de 1 mL/min. Para extração da chalcona CH8 foi

empregada a extração líquido-líquido utilizando 4 mL de éter metil terc-butílico como

solvente extrator. Após otimização, o método foi validado, mostrando-se linear na

faixa de 0,15-15,91 µM, obtendo-se uma equação de reta y= 13808,02x-820,25

(r= 0,99) e limite de quantificação de 0,15 µM. A precisão e exatidão apresentaram

resultados dentro do preconizado. A chalcona CH8 manteve-se estável até 90

minutos em condições de incubação, até 6 h sob a bancada e 7 h no auto-injetor.

Além disso, apresentou efeito matriz e efeito residual dentro do preconizado pela

legislação. Através da técnica de CLAE-TOF-EM foi possível identificar a formação

de prováveis metabólitos desmetilado e mono-hidroxilado. Deste modo, os

microssomas hepáticos mostraram-se um modelo simples e viável para condução

dos estudos de biotransformação in vitro.

Palavras-chave: Antileishmanial; Chalcona CH8; CLAE-DAD; CLAE-TOF-EM;

Biotransformação in vitro; Microssomas hepáticos de rato.

ii

ABSTRACT

Chalcone CH8, chemically 3-nitro-2’-hydroxy-4’,6’-dimethoxychalcone, is a synthetic

derivative of chalcone. It has proven in vivo antileishmanial activity, 60 times greater,

against Leishmania. amazonensis, when compared to the antimonial derivatives,

applying it to a potential drug. The study of metabolism, at the drug discovery stage,

is indispensable for the evaluation of its safety and efficacy. Thus, the present work

aimed to study the in vitro biotransformation of chalcone CH8 using rat hepatic

microsomes. For this, a method of quantification of chalcone CH8 in rat microsomes,

using CLAE-DAD, was developed. The method employed a C18 column, mobile

phase acetonitrile: 0.1% acetic acid solution (65:35, v/v) and flow rate of 1 mL/min.

Extraction of chalcone CH8 was performed using liquid-liquid extraction using 4 mL

of terct-butyl methyl ether as solvent. After optimization, the method was validated,

showing linearity in the range of 0.15-15.91 µM, obtaining a line equation y=

1308.02x – 820.25 (r= 0.99) and limit of quantification of 0.15 µM. The precision and

accuracy presented results within the recommended by the ANVISA guide. Chalcone

CH8 remained stable for up to 90 minutes under incubation conditions, up to 6 h on

the bench and 7 h in the sampler. In addition, it showed matrix effects and carryover

within the recommended. Through the CLAE-TOF-EM technique it was possible to

identify the formation of one demethylated and another monohydroxylated putative

metabolites. Thus, hepatic microsomes have been shown to be a simple and viable

model for conducting in vitro biotransformation studies.

Key words: Antileishmanial; Chalcone CH8; CLAE-DAD; CLAE-TOF-EM; In vitro

biotransformation; Rat hepatic microsomes.

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1– Ciclo de vida do parasito de Leishmania sp. no vetor flebotomíneos e

no homem.............................................................................................2

Figura 2– Manifestações clínicas das leishmanioses em humanos. (a)

Leishmaniose visceral (LV); (b) Leishmaniose cutânea (LC); (c)

Leishmaniose mucocutânea (LC) e (d) Leishmaniose cutânea difusa

(LCD)....................................................................................................2

Figura 3– Núcleo básico de chalcona...................................................................8

Figura 4– Esquema da estrutura do citocromo P450..........................................19

Figura 5– Estrutura química da chalcona CH8 (A) e do PI (B)............................28

Figura 6– Cromatograma representativo da condição cromatográfica otimizada e

os espectros de ultravioleta da chalcona CH8 e do PI........................42

Figura 7– Porcentagem de solubilidade da chalcona CH8 de 50 µg/mL e 100

µg/mL, em solução de tampão fosfato de potássio 0,1 M e soluções de

Cremophor®........................................................................................45

Figura 8– Cromatograma representativo das amostras extraídas com solventes

extratores na presença e ausência da chalcona CH8.........................46

Figura 9– Cromatograma representativo das análises de seletividade na

presença e ausência de Cremophor® (n= 3).......................................49

Figura 10– Cromatograma representativo das análises de efeito residual...........54

Figura 11– Cromatograma representativo das amostras preparadas com

Cremophor® submetidas à biotransformação in vitro..........................56

Figura 12– Espectro de absorção no UV de prováveis metabólitos (A: TR 1,3 min;

B: TR 1,7 min; C: 1,9 min) e da chalcona CH8 (D: TR 4,0 min)............57

Figura 13– Estrutura básica de chalconas e suas porções que geram as bandas

de absorção características no UV......................................................57

Figura 14– Cromatograma representativo das amostras preparadas na ausência

de Cremophor® submetidas à biotransformação in vitro.....................58

Figura 15– Cromatograma representativo das amostras preparadas na presença

e ausência de Cremophor® submetidas à biotransformação in vitro..60

Figura 16– Espectro de massas da chalcona CH8 com tR 22,8 min e m/z

330,0973, obtido no modo positivo após análise por CLAE-TOF-

iv

EM.......................................................................................................61

Figura 17– Espectro de massas da chalcona CH8 obtido no modo positivo após

análise por CLAE-Q-TOF-EM, sendo íon molecular da CH8 de m/z

330,0951 e íons fragmentos de m/z 181, 176 e 166...........................62

Figura 18– Proposta de fragmentação da chalcona CH8 protonada, após

obtenção do espectro de massa obtido por CLAE-Q-TOF-

EM.......................................................................................................63

Figura 19– Espectro de massas do metabólito M1 com tR 12,8 min e m/z


EM.......................................................................................................64

Figura 20– Espectro de massas do metabólito M2 com tR 18,4 min e m/z


EM.......................................................................................................64

Figura 21– Estruturas químicas propostas a partir das análises por CLAE-TOF-

EM dos metabólitos da chalcona CH8 após a biotransformação por

microssomas hepáticos de rato...........................................................65

Figura 22– Estrutura química de provável chalcona para-desmetilado.................66

v

LISTA DE TABELAS

Tabela 1– Derivados de chalconas como potenciais agentes

antileishmaniais....................................................................................9

Tabela 2– Alterações mais comuns na massa molecular da substância por meio

das reações de fase I.........................................................................23

Tabela 3– Parâmetros de desempenho cromatográficos nas diferentes

proporções da FM testadas................................................................41

Tabela 4– Condições cromatográficas de análise por CLAE..............................42

Tabela 5– Condições otimizadas para o procedimento de extração líquido-

líquido.................................................................................................47

Tabela 6– Linearidade do método na ausência (n= 5) e presença de

Cremophor® (n= 6)..............................................................................50

Tabela 7– Limite de quantificação na ausência (n= 5) e presença de

Cremophor® (n= 6)..............................................................................51

Tabela 8– Precisão e exatidão intracorrida na ausência (n= 5) e com

Cremophor® (n= 6)............................................................................52

Tabela 9– Precisão e exatidão intercorrida na ausência (n= 3) e presença de

Cremophor® (n= 3)............................................................................52

Tabela 10– Estabilidade de bancada, condições de incubação e auto-injetor na

ausência de Cremophor® (n= 5).........................................................53

Tabela 11– Efeito matriz (n= 3).............................................................................54

Tabela 12– Análise preliminar dos possíveis metabólitos.....................................58

Tabela 13– Porcentagem de formação dos metabólitos M1 e M2........................61

Tabela 14– Dados da massa exata da chalcona CH8 e seus metabólitos

empregando o CLAE- TOF-EM..........................................................65

vi

LISTA DE QUADROS Quadro 1– Medicamentos antileishmaniais e suas principais limitações.............5

Quadro 2– Exemplos de reações de fase I..........................................................15

Quadro 3– Exemplos de reações de fase II.........................................................16

vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACN Acetonitrila

AcOEt Acetato de etila

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization (Ionização química à

pressão atmosférica)

APPI Atmospheric Pressure Photoionization (Ionização por fótons à pressão

atmosférica)

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

CYP Citocromo P450

DAD Detector de arranjo de diodos

ELL Extração líquido-líquido

EM Espectrometria de massas

ESI Eletrospray

h hora

min minuto

MTBE Éter metil terc-butílico

NADP Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina

NADPH Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzido

PI Padrão interno

Q-TOF Quadrupole-Time-of-flight (Quadrupolo- Tempo de Voo)

RMN Ressonância Magnética Nuclear

TOF Time-of-flight (Tempo de Voo)

tR Tempo de retenção

UV Ultravioleta

viii

Sumário

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1

1.1.1. Quimioterapia das leishmanioses .............................................................. 3

1.2. Importância das chalconas como agentes antileishmaniais ............................. 7

1.3. Descoberta e desenvolvimento de fármacos.................................................. 12

1.4. Metabolismo de moléculas em mamíferos ..................................................... 14

1.4.1. Citocromo P450 ....................................................................................... 18

1.5. Estudo de biotransformação in vitro ............................................................... 19

1.6. Técnicas analíticas aplicadas em estudos de biotransformação in vitro ......... 21

1.6.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ....................................... 21

1.6.2. Espectrometria de massas (EM) .............................................................. 22

1.6.3. Ressonância Magnética Nuclear (RMN) .................................................. 24

2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 25

3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 26

3.1. Objetivo geral ................................................................................................. 26

3.2. Objetivos específicos ..................................................................................... 26

4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 27

4.1. Materiais ........................................................................................................ 27

4.1.1. Solventes e reagentes ............................................................................. 27

4.1.2. Equipamentos em geral ........................................................................... 27

4.1.3. Soluções de referência e reagentes......................................................... 27

4.2. Métodos ......................................................................................................... 28

4.2.1. Análise por CLAE-DAD ............................................................................ 28

4.2.2. Avaliação da solubilidade da chalcona CH8 no meio de incubação

microssomal ...................................................................................................... 29

4.2.3. Otimização do método de preparo de amostras por extração líquido-

líquido (ELL) ...................................................................................................... 30

ix

4.2.4. Validação do método por CLAE-DAD ...................................................... 30

4.2.4.1. Seletividade ....................................................................................... 31

4.2.4.2. Linearidade ........................................................................................ 31

4.2.4.3. Limite inferior de quantificação (LIQ) ................................................. 32

4.2.4.4. Exatidão intracorrida e intercorrida .................................................... 32

4.2.4.5. Precisão intracorrida e intercorrida .................................................... 33

4.2.4.6. Estabilidade ....................................................................................... 33

4.2.4.7. Efeito matriz ...................................................................................... 34

4.2.4.8. Efeito residual .................................................................................... 34

4.2.5. Procedimento geral de incubação para o estudo de biotransformação in

vitro e preparo de amostras ............................................................................... 35

4.2.6. Obtenção de microssomas hepáticos de ratos ........................................ 36

4.2.7. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a

espectrômetro de massas por tempo de voo (CLAE-TOF-EM) .......................... 37

4.2.8. Análises em espectrômetro de massas híbrido do tipo quadrupolo-tempo

de vôo (Q-TOF) ................................................................................................. 37

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 39

5.1. Desenvolvimento e otimização do método por CLAE-DAD ............................ 39

5.2. Avaliação da solubilidade da chalcona CH8 nas condições de incubação ..... 43

5.3. Otimização do método de preparo de amostras por ELL ............................... 45

5.4. Validação do método bioanalítico para determinação da chalcona CH8 em

meio de incubação microssomal ........................................................................... 48

5.4.1. Seletividade ............................................................................................. 48

5.4.2. Linearidade .............................................................................................. 49

5.4.3. Limite inferior de quantificação (LIQ) ....................................................... 50

5.4.4. Precisão e exatidão intracorrida e intercorrida ......................................... 51

5.4.5. Estabilidade ............................................................................................. 53

5.4.6. Efeito matriz ............................................................................................. 54

x

5.4.7. Efeito residual .......................................................................................... 54

5.5. Identificação estrutural da chalcona CH8 e seus metabólitos ........................ 55

5.5.1. Análise por CLAE-DAD ............................................................................ 55

5.5.2. Análise por CLAE-TOF-EM ...................................................................... 57

5.5.3. Análise estrutural da chalcona CH8 por CLAE-TOF-EM e CLAE-Q-TOF-

EM ..................................................................................................................... 61

5.5.4. Análise estrutural dos metabólitos M1 e M2 por CLAE-TOF-EM .............. 63

6. CONCLUSÃO ...................................................................................................... 67

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 68

8. ANEXO I .............................................................................................................. 76

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Leishmanioses: um problema de saúde pública mundial

As leishmanioses compõem um grupo de doenças tropicais negligenciadas

não contagiosas e que se encontram dentro do programa de prioridades da

Organização Mundial da Saúde (WHO, 2017). A transmissão dessa enfermidade

ocorre através da picada do mosquito fêmea do gênero Phlebotomus (Velho mundo)

e Lutzomyia (Novo mundo) infectado com protozoário do gênero Leishmania sp.

(ORYAN; AKBARI, 2016).

As manifestações clínicas das leishmanioses em humanos ocorrem após a

inoculação da forma promastigota (flagelar) do parasito Leishmania sp. (1). Uma vez

no tecido do hospedeiro, essa forma flagelar pode ser fagocitada por macrófagos ou

por outras células fagocíticas mononucleares (2). Após a internalização do parasito

na célula fagocítica do hospedeiro, o parasito diferencia-se na forma amastigota

(parasito intracelular) que se multiplica por divisão binária no interior da célula até

levar a lise celular (3). Após a lise da célula fagocítica, as formas amastigotas são

liberadas e prontas para infectar outras células do hospedeiro (4). Quando o

flebótomo (vetor) pica um indivíduo infectado ou hospedeiro reservatório, o mesmo

ingere macrófagos infectados com a forma amastigota ou amastigotas livres no

sangue deste indivíduo (5 e 6). Ao atingir o intestino do inseto, as amastigotas

transformam-se em promastigotas (7), que se multiplicam por divisão binária e

migram para o probóscide (prolongamento do aparelho bucal do inseto) (8). Por sua

vez, ao fazer outro repasto sanguíneo o flebótomo introduz na pele do hospedeiro a

forma promastigota (1). As oito etapas explicitadas acima estão esquematizadas na

Figura 1 (MISHRA; SAXENA; SINGH, 2007).

As mais de vinte espécies de Leishmania sp. conhecidas por infectar

humanos podem levar ao desenvolvimento de quatro tipos de leishmaniose como a

visceral ou “kala-azar” (LV) (Figura 2a), que é uma infecção visceral generalizada e

a forma mais severa da doença; a leishmaniose cutânea (LC) (Figura 2b), uma

infecção que acomete a pele causando lesões com ulcerações, sendo a forma mais

comum; a leishmaniose mucosa (LM) (Figura 2c) em que se observa ulcerações

oronasais e por fim, a leishmaniose cutânea difusa (LCD) (Figura 2d) considerada a

2

forma mais rara da doença, com lesões cutâneas não ulceradas (DESJEUX, 2004;

ZULFIQAR; SHELPER; AVERY, 2017).

Figura 1- Ciclo de vida do parasito de Leishmania sp. no vetor flebotomíneos e no homem. (Adaptado da fonte: https://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/biology.html)

Figura 2- Manifestações clínicas das leishmanioses em humanos. (a) Leishmaniose visceral

(LV); (b) Leishmaniose cutânea (LC); (c) Leishmaniose mucosa (LC) e (d) Leishmaniose cutânea difusa (LCD) (Fonte: WHO, 2017).

A manifestação clínica da doença varia de acordo com a espécie do

protozoário e a resposta imune do paciente (JAIN; JAIN, 2015). Por exemplo, as

https://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/biology.html

3

espécies de L. amazonensis, L. braziliensis, L. major, L. panamensis, L. shawi são

referenciadas por causar a LC, enquanto as espécies L. amazonensis e L.

braziliensis podem causar a LCD e LM em 3 e 6% dos casos de pacientes com LC,

respectivamente (MONGE-MAILLO; LÓPEZ-VÉLEZ, 2013). Já, as espécies L.

donovani e L. infantum são agentes causadores da LV (NAGLE et al., 2014). Além

dos seres humanos, animais silvestres e domésticos são considerados reservatórios

das leishmanioses, sendo o cão, principal reservatório da LV na América Latina e

países mediterrâneos, e importante reservatório da LC no mundo (WHO, 2017).

Globalmente, esse grupo de doenças negligenciadas considerado um

problema de saúde pública é prevalente em 98 países e afeta populações da

América Latina, África, Europa e Ásia (WHO, 2017). A disseminação das

leishmanioses está associada à má-nutrição, deslocamento de populações,

habitações em condições precárias, falta de recursos e sistema imune baixo

(MACKEY et al., 2014). De acordo com a Organização Mundial da Saúde estima-se

que aproximadamente 50 a 90 mil novos casos de LV ocorram por ano em todo o

mundo e mais de 90% dos casos ocorrem em sete países como Brasil, Etiópia,

Índia, Quênia, Somália, Sudão do Sul e Sudão. Enquanto que para forma de LC,

estima-se que 0,6 a 1 milhão de novos casos ocorram por ano em todo o mundo e

cerca de 95% dos casos ocorrem nas Américas, países Mediterrâneos, Oriente

Médio e Ásia, sendo o Afeganistão, Argélia, Brasil, Colômbia, Irã e Síria, os países

onde são mais reportados os novos casos. Cerca de 90% dos casos de LM ocorrem

no Brasil, Etiópia, Peru e Bolívia (WHO, 2017).

1.1.1. Quimioterapia das leishmanioses

Os fármacos empregados como primeira escolha no tratamento das

leishmanioses são, os antimoniais pentavalentes, que foram desenvolvidos na

década 1940, entre os quais, podemos destacar o antimoniato de meglumina.

Apesar da ampla utilização, exigem terapia prolongada, são de uso parenteral,

alguns pacientes não respondem ao tratamento ou desenvolvem resistência,

somado a isso, apresentam efeitos adversos severos a nível cardíaco, pancreático e

renal (RATH et al., 2003).

Além dos antimoniais pentavalentes, são também utilizados na terapia

antileishmanial, a pentamidina, anfotericina B, anfotericina B lipossomal,

4

paromomicina e miltefosina como fármacos de segunda escolha. Os mecanismos de

ação desses fármacos variam, por exemplo, sugere-se que os antimoniais interferem

no processo de glicólise e beta oxidação de ácidos graxos, levando a depleção dos

níveis de ATP intracelular; a pentamidina interfere na biossíntese de poliamidas,

impedindo, assim a síntese de proteínas importantes para a manutenção da vida do

parasito; a anfotericina B se liga ao ergosterol (componente da membra celular) do

parasito, promovendo o aumento da permeabilidade celular e ruptura da célula; a

paromomicina inibe a síntese proteica através da ligação às proteínas ribossômicas;

e em relação a miltefosina, o seu mecanismo ainda é bem controverso, porém

sugere-se que este fármaco seja responsável por interferir na biossíntese de

fosfolípideos (MISHRA; SAXENA; SINGH, 2007).

Embora apresente essas opções terapêuticas, o tratamento das

leishmanioses possui limitações pois, com exceção da miltefosina (via oral), os

demais fármacos são administrados via intravenosa ou intramuscular e apresentam

efeitos adversos severos (NAGLE et al., 2014; ZULFIQAR; SHELPER; AVERY,

2017). Além disso, não há nenhuma vacina disponível na clínica para uso em

humanos (GILLESPIE, 2016). O Quadro 1 apresenta a relação entre a período de

tratamento, vias de administração, efeitos adversos e eficácia dos antileishmaniais

disponíveis na clínica.

5

Quadro 1- Medicamentos antileishmaniais e suas principais limitações (Fonte adaptado de: ZULFIQAR; SHELPER; AVERY, 2017).

Medicamentos Estrutura Química Período de tratamento

(dias)

Vias de administração

Efeitos adversos

Tipos de

leishmaniose (Eficácia)

Anfotericina B

30 Intravenosa Severa

nefrotoxidade, hipocalemia

Cutânea e visceral (>90%)

Anfotericina B lipossomal

20 Intravenosa Baixa

nefrotoxidade Visceral (>96%)

Miltefosina

28 Oral Hepatotoxidade, nefrotoxidade e teratogenicidade

Visceral (>94%)

Paromomicina

21 Tópica e

intramuscular

Hepatotoxidade, nefrotoxidade e

ototoxidade

Cutânea e mucocutânea

(>94% na Ásia e 46-85% na

África)

6

Quadro 1- Medicamentos antileishmaniais e suas principais limitações (Fonte adaptado de: ZULFIQAR; SHELPER; AVERY, 2017). (Continuação)

Medicamentos Estrutura Química Período de tratamento

(dias)

Vias de administração

Efeitos adversos

Tipos de

Leishmaniose (Eficácia)

Pentamidina

4 Intramuscular Severa

hiperglicemia, hipotensão

Cutânea e visceral (36-

96%)

Estibogluconato de sódio

30 Intravenosa,

intramuscular ou intralinfática

Severa hepatotoxidade, carditoxidade, pancreatite e nefrotoxidade


95%)

Antimoniato de meglumina

30 Intravenosa,

intramuscular ou intralinfática

Severa hepatotoxidade, carditoxidade, pancreatite e nefrotoxidade


95%)

7

Diante dos preocupantes dados epidemiológicos, tratamentos prolongados

por via parenteral e efeitos tóxicos da quimioterapia, que somados dificultam a

adesão dos pacientes ao tratamento, vários pesquisadores vêm buscando novos

fármacos mais efetivos, menos tóxicos e que permitam a administração por via oral,

para substituir ou complementar a quimioterapia disponível para o tratamento das

leishmanioses.

1.2. Importância das chalconas como agentes antileishmaniais

Cada vez mais, estudos têm demonstrado que os produtos naturais têm

desempenhado um papel primordial no desenvolvimento de fármacos. Afinal,

estima-se que dos 1562 novos fármacos aprovados entre 1981 e 2014, 21% são

derivados de produtos naturais (NEWMAN; CRAGG, 2016). Dessa forma, muitos

pesquisadores buscam nos produtos naturais a fonte de substâncias para o

tratamento de enfermidades. Em especial, para o tratamento das leishmanioses

verificaram que as chalconas representam uma classe bastante promissora

(TAJUDDEEN et al., 2017). Na literatura, a licochalcona A, codificada como LICO,

(Tabela 1) isolada a partir das raízes da espécie Glycyrrhiza glabra é descrita como

a primeira chalcona oxigenada de origem natural com promissora atividade

antileishmanial (CHEN et al., 1993). A partir desse estudo seguiram-se outros

utilizando chalconas de origem natural e sintética, delas derivadas, visando avaliar o

potencial destas como agentes antileishmanais (TORRES-SANTOS et al., 1999;

HERMOSO et al., 2003; NARANDER et al., 2005; De MELLO et al., 2015). Durante o

período de 1990 e 2016 foram descritas 34 chalconas de origem natural e 278

chalconas sintéticas ou semissintéticas com atividade antileishmanial (TAJUDDEEN

et al., 2017).

As chalconas são naturalmente produtos do metabolismo secundário das

plantas. Quimicamente, esse grupo de substâncias é definido como 1,3-diaril-2-

propen-1-onas (Figura 3) que apresentam em seu núcleo base dois anéis

aromáticos ligados por um sistema carbonil α,β-insaturado composto por três

carbonos (DEWICK, 2002). Do ponto de vista biológico, estudos têm demostrado

que essa classe química possui um amplo espectro de propriedades biológicas entre

elas, pode-se destacar as atividades antibacteriana (NIELSEN et al., 2005),

8

antitumoral (ANTO et al., 1995), antimalarial (LI et al., 1995), antiviral (WU et al.,

2003) e antileishmanial (CHEN et al., 1993). Essa versatilidade biológica pode ser

explicada pela introdução de diferentes grupos substituintes nos anéis aromáticos

das chalconas (A e B), o que resulta em substâncias com propriedades

farmacológicas distintas (YAZDAN; SAGAR; SHAIK, 2015).

Figura 3- Núcleo básico de chalcona.

Embora as chalconas sejam de origem natural, as mesmas podem ser

facilmente obtidas pela síntese orgânica em um processo conhecido como reação

de Claisen-Schmidt (PAREEK et al., 2013). Por consequência dessa variedade

biológica e facilidade sintética, vários pesquisadores vêm testando diferentes

chalconas de origem natural e sintética quanto ao seu potencial frente às espécies

de Leishmania sp. em ensaios in vitro e in vivo (TORRES-SANTOS et al.,1999; LIU

et al., 2003; NARENDER et al., 2005; BOECK et al., 2006; APONTE et al., 2010;

MONGA et al., 2014; De MELLO et al., 2015).

A Tabela 1 reúne alguns derivados de chalcona de origem natural (código:

LICO; DMC; F10; F11; F12) e sintética (Código: CH8; F4; F5; F6; F7; F8; F9) que se

mostraram mais ativos após serem testados nos ensaios in vitro frente as formas

promastigotas e/ou amastigotas de Leishmania sp. nos respectivos estudos. Vale

ressaltar que cada estudo realizou os ensaios empregando um controle positivo

(anfotericina B, pentaminidina ou antimonial pentavalente) a fim de avaliar o

potencial antileishmanial de forma comparativa.

9

Tabela 1- Derivados de chalconas como potenciais agentes antileishmaniais.

Código Estrutura química Forma parasitária

(espécie) IC50

*

(µM) Referências

LICO

Promastigota (L. major)

7,09

CHEN et al., 1993.

Promastigota (L. donovani)

7,09

DMC

Promastigota (L. amazonensis)

25

TORRES-SANTOS et al., 1999. Amastigota

(L. amazonensis)

4

CH8


0,7

BOECK et al., 2006. Amastigota

(L. amazonensis)

15

F4

Promastigota (L. braziliensis)

3,5 ANDRIGHETTI-

FRÖHNER et al., 2009.

*IC50: concentração capaz de inibir 50%

10

Tabela 1- Derivados de chalconas como potenciais agentes antileishmaniais. (Continuação)


(espécie) IC50

*

(µM) Referências

F5

Amastigota (L. amazonensis)

11,7 APONTE et al., 2010.

F6


6,2 APONTE et al., 2010.

F7

Promastigota (L. braziliensis) 2,7 BELLO et al., 2011.

F8


11

Tabela 1- Derivados de chalconas como potenciais agentes antileishmaniais. (Continuação)


(espécie) IC50

*

(µM) Referências

F9


F10


0,8 RUIZ et al., 2011.

F11

Amastigota (L. amazonensis) 8 RUIZ et al., 2011.

F12


11,03

PICOLO et al., 2014. Promastigota

(L. shawi) 11,26

12

Dentre os derivados de chalcona apresentados, pode-se destacar o estudo

realizado por Torres-Santos e colaboradores (1999) os quais isolaram a substância

2’,6’-dihidroxi-4’-metóxichalcona (codificada como DMC) (Tabela 1) a partir das

inflorescências da espécie vegetal Piper aduncum. Neste trabalho verificaram

significativa atividade in vitro frente as formas amastigotas e promastigota de L.

amazonensis, com concentração capaz de inibir 50% (IC50) das formas parasitárias

testadas de 4 e 25 µM, respectivamente. A partir desses resultados Boeck e

colaboradores (2006) sintetizaram a DMC e 17 análogos da chalcona visando

potencializar a atividade antileishmanial da DMC. Com isso, os análogos foram

testados nos ensaios in vitro frente às formas amastigota e promastigota de L.

amazonensis. Destacando-se a chalcona sintética nitrosilada, codificada como

chalcona CH8, (Tabela 1, F3) que se mostrou mais ativa frente as formas

amastigotas (IC50 14 µM) e promastigota (IC50 0,7 µM). Posteriormente, a mesma foi

testada, in vivo, intralesionalmente na dose de 0,2 µg/dose em ratos infectados com

L. amazonensis e mostrou-se 60 vezes mais efetiva que o medicamento de

referência Pentostan® (200 µg/dose) na dose 100 vezes menor, indicando a

potencial atividade antileishmanial dessa substância (BOECK et al., 2006). A

chalcona CH8, ou 3-nitro-2’-hidróxi-4’,6’-dimetóxichalcona, idealizada a partir da

DMC foi previamente patenteada quanto a sua atividade antileishmanial (ROSSI-

BERGMANN et al., 2004 – patente PI 0204079-4).

A partir da comprovação da atividade antileishmanial in vivo da chalcona CH8,

essa substância pode ser considerada um candidato a fármaco. Entretanto, é

necessário, durante a etapa pré-clínica do desenvolvimento do fármaco avaliar os

parâmetros farmacocinéticos do qual os estudos de metabolismo in vitro fazem

parte.

1.3. Descoberta e desenvolvimento de fármacos

O processo de descoberta e desenvolvimento de um fármaco é dividido em

duas relevantes fases denominadas, pré-clínica (descoberta e otimização) e clínica

(desenvolvimento) (GUIDO et al., 2010).

A força motriz que impulsiona a busca por novos fármacos inicia-se com a

identificação da necessidade de se implementar uma nova terapia ou aprimorar uma

já existente. A partir disso, segue-se na fase pré-clínica estudos para se obter

13

moléculas (origem natural, sintética ou biotecnológica) com potencial de

desenvolvimento clínico, considerando aspectos de segurança e eficácia. Para isso,

é necessário realizar a identificação e validação do alvo terapêutico (receptor,

enzima, célula, DNA, entre outros) e a triagem de substâncias ativas capazes de

modular a atividade do alvo selecionado. Com auxílio da química orgânica,

estruturas análogas são sintetizadas visando maximizar a atividade biológica e

selecionar uma ou mais substâncias candidatas ao desenvolvimento do fármaco.

Ainda na etapa pré-clínica, essas substâncias são submetidas aos ensaios in vitro e

in vivo para avaliação da segurança e eficácia através de estudos toxicológicos e

farmacocinéticos (Administração, Distribuição, Metabolismo e Excreção – ADME) e

caso sejam aprovados, as substâncias são sintetizadas em larga escala e

encaminhadas para os estudos clínicos (BERGSDORF; OTTL, 2010; HUGHES et

al., 2011; PATIL, 2012).

Na fase clínica as substâncias selecionadas precisam passar pelos testes de

fase I, II e III antes de serem aprovadas. Geralmente, os testes de fase I são

conduzidos em pequenos grupos de voluntários sadios, os quais são submetidos a

exames médicos exaustivos e monitorados com a finalidade de avaliar a segurança

e eficácia, bem como o comportamento do novo fármaco no organismo humano. Já,

os testes de fase II são realizados em pequenos grupos de pacientes que têm a

condição (patologia) para qual o fármaco foi desenvolvido como opção de

tratamento. O sucesso dessa fase conduz aos testes de fase III, onde o novo

produto é testado num grande número de pacientes, fornecendo dados sobre a

segurança e a eficácia, a fim de satisfazer os requisitos preconizados pelas agências

regulatórias. Após a aprovação pelas agências fiscalizadoras, o fármaco pode ser

prescrito pelos médicos aos pacientes para tratar a doença para a qual foi

designado. Na fase IV os novos fármacos aprovados são mantidos sobre

monitoramento pós-comercialização (LOMBARDINO; LOWE III, 2004).

Diante disso, nota-se que o processo de descoberta do fármaco até sua

comercialização é bastante complexo, longo e envolve uma grande soma de capital.

Estima-se que o tempo para aprovação de um novo fármaco é de 10 a 15 anos e

exige investimento de mais de US$ 1 bilhão de dólares (CHUNG, 2014). Esse valor

engloba o custo de milhares de falhas durante o desenvolvimento, a cada 30.000

moléculas protótipos que entram no processo de pesquisa e desenvolvimento (P&D)

apenas 0,027% recebem aprovação de órgão regulatórios e 0,003% são mantidas

14

para comercialização (CALIXTO; SIQUEIRA-JÚNIOR, 2008). Vários fatores

contribuem para isso, por exemplo, cerca de 60% de insucesso estão atrelados à

perda da eficácia e a constatação de efeitos adversos durantes os estudos clínicos e

com o conhecimento insuficiente das propriedades metabólicas e farmacocinética

(KOLA; LANDIS, 2004). Nesse sentido, a realização dos estudos farmacocinéticos

(ADME) do qual o estudo de metabolismo é parte integrante deve ser feita já nas

fases iniciais da descoberta de um candidato a fármaco. Afinal, o conhecimento do

metabolismo do fármaco é fator importante na avaliação da eficácia e segurança do

mesmo (MONTANARI; BOLZANI, 2001). Em especial, esses estudos são

primordiais para fornecer informações quanto às rotas metabólicas no que se refere

à identificação e elucidação dos prováveis metabólitos, bem como, da(s) enzima(s)

responsáveis pela biotransformação do fármaco, além de questões relacionadas a

possíveis interações medicamentosas (HARIPARSAD et al., 2006).

1.4. Metabolismo de moléculas em mamíferos

Ao longo de muitos anos, os seres humanos, expostos a inúmeras

substâncias químicas estranhas ao organismo (xenobióticos), seja através de

componentes da dieta ou contaminantes ambientais, desenvolveram mecanismos

para metabolizar e eliminar essas substâncias de modo que estas não causem

danos. (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2010).

O metabolismo de substâncias endógenas (hormônios, vitaminas, etc.) e

exógenas (fármacos, alimentos, etc.) em mamíferos é um processo natural que

envolve vias enzimáticas (MARTIGNONI et al., 2006). O metabolismo foi

conceitualmente dividido em duas fases, I e II (WILLIANS, 1959). Ambas as fases

atuam de modo a tornar a substância mais hidrofílica para que seja eliminada do

organismo pela via renal ou biliar. Sendo, a fase I classificada como fase de

funcionalização, onde substâncias são metabolizadas por meio de reações de

oxidação, redução e hidrólise (Quadro 2). As famílias de enzimas envolvidas nessas

reações são CYP (ou citocromo P450), FMO (monooxigenases contendo flavina) e

hidrolases de epóxido (mEH e sEH) (BOLLEDDULA et al., 2014).

Enquanto que na fase II, fármacos ou metabólitos (ativos ou tóxicos)

produzidos nas reações de fase I sofrem reações de conjugação que incluem

glicuronidação, sulfatação ou sulfonação, acetilação, metilação, conjugação com

15

glutationa (Quadro 3). As enzimas conhecidas por realizarem reações de fase II

encontram-se, em sua maioria no citoplasma da célula, entre elas estão, a

glutationa-S-transferase (GST), N-acetil transferase (NAT), metiltransferase (MT) e

sulfotransferase (SULT), com exceção da UDP-glicuronosiltransferase (UGT) que é

expressa no retículo endoplasmático. De modo geral, essas reações formam

produtos farmacologicamente inativos devido a transferência de grupos polares (por

exemplo, ácido glicurônico) que confere maior hidrofilicidade e peso molecular à

substância, consequentemente, o fármaco metabolizado terá dificuldade de se ligar

no alvo para promover o efeito terapêutico (JANCOVA; ANZENBACHER;

ANZENBACHEROVA, 2010).

Quadro 2- Exemplos de reações de fase I (Fonte adaptado de: BRUNTON; LAZO; PARKER, 2010).

Reações (Fase I)

Fármaco → metabólito

Exemplos

N-desalquilação

Cafeína

O-desalquilação

Codeína

Hidroxilação

alifática

Ibuprofeno

Hidroxilação

aromática

Fenitoína

16

Quadro 2- Exemplos de reações de fase I (Fonte adaptado de: BRUNTON; LAZO; PARKER, 2010). (Continuação)

Reações (Fase I)


Exemplos

N-oxidação

Dapsona

S-oxidação

Tioridazina

Desaminação

Anfetamina

Hidrólise

Ácido

acetilsalicílico

Quadro 3- Exemplos de reações de fase II (Fonte adaptado de: BRUNTON; LAZO; PARKER, 2010).

Reações (Fase 2)


Exemplos

Glicuronidação

Morfina

17

Quadro 3- Exemplos de reações de fase II (Fonte adaptado de: BRUNTON; LAZO; PARKER, 2010). (Continuação)

Reações (Fase 2)


Exemplos

Sulfatação

Paracetamol

Acetilação

Clonazepam

Metilação

Mercaptopurina

Conjugação

com glutationa

Paracetamol

O processo de metabolização das substâncias ocorre em vários tecidos como

rins, intestino, pulmões, epitélio nasal, pele e cérebro, sendo que no fígado esse

processo ocorre em maior extensão (ASHA; VIDYAVATHI, 2010). Isso porque o

fígado é uma fonte abundante de hemeproteínas oxidativas, que compõem o

citocromo P450 (CYP), e são responsáveis por mediar aproximadamente 75% das

reações de fase I que ocorrem no metabolismo de fármacos (GUENGERICH;

WATERMAN; EGLI, 2016).

18

1.4.1. Citocromo P450

A superfamília de enzimas metabolizadoras, CYP, é uma das mais

importantes entre as espécies, sendo proteínas de membrana expressas no retículo

endoplasmático liso das células de animais e vegetais, assim como em células de

fungos e bactérias (WILLIAMS et al., 2000). Pois, acredita-se que essa superfamília

seja derivada de um único gene (MARTIGNONI et al., 2006). Embora apresente

regiões altamente conservadas, há diferenças relativamente pequenas nas

sequências primárias de aminoácidos do citocromo P450 entre as espécies, o que

confere profundas diferenças na especificidade do substrato e na atividade catalítica

(SEZUTSU et al., 2017). Com o advento de novas tecnologias no que tange a

genômica estrutural foi possível identificar nos seres humanos 57 isoformas das

enzimas do CYP, das quais 7 estão envolvidas na metabolização de 90% de

fármacos e xenobióticos (CYP3A4; CYP2D6; CYP2E1; CYP2C19; CYP2C9;

CYP2C18; CYP1A2) (ASHA; VIDYAVATHI, 2009).

As reações oxidativas mediadas pelas isoformas do CYP são possíveis

devido as suas estruturas apresentarem uma molécula de heme ligada não

covalentemente à cadeia polipeptídica que é capaz de ligar o oxigênio (O2) aos

locais ativos do CYP como parte do ciclo catalítico (Figura 4). Com isso, as enzimas

CYP usam o O2 e o H+ derivado do cofator fosfato dinucleotídio de adenosina e

nicotinamida reduzido (NADPH) para realizar a oxidação dos substratos (por

exemplo, fármacos). O H+ é fornecido pela enzima NADPH-citocromo P450

oxidorredutase e metabolismo de um substrato pelo CYP consome uma molécula de

O2 e produz um substrato oxidado e uma molécula de água como subprodutos,

conforme a equação geral, NADPH + H+ + RH + O2 → NADP+ + H2O + ROH

(BRUNTON; LAZO; PARKER, 2010).

19

Figura 4- Esquema da estrutura do citocromo P450.

Sabe-se que o citocromo P450 está envolvido no metabolismo da maioria dos

fármacos e que as reações mediadas por essa superfamília podem levar a formação

de metabólitos ativos ou tóxicos. Nesse sentido, o presente trabalho visou identificar

e caracterizar os possíveis metabólitos formados da chalcona CH8, através dos

estudos de biotransformação in vitro, com enfoque nas reações de fase I.

1.5. Estudo de biotransformação in vitro

Os estudos de metabolismo podem ser realizados através de modelos in vivo

(pessoas sadias, pacientes e animais), mas também, por meio de modelos in silico e

in vitro que mimetizam as condições biológicas e permitem fazer uma predição do

perfil metabólico de um fármaco. Todavia, a preferência pela utilização de modelos

in vitro nos estudos de biotransformação de um candidato a fármaco se sustenta em

aspectos éticos, científicos e econômicos. Afinal, são mais acessíveis, simples e

úteis para comparação de perfis metabólicos interespécies e seleção racional de

modelos adequados de animais para posterior realização dos estudos toxicológicos

(EKINS et al., 2000; MARTIGNONI et al., 2006). Os principais modelos de estudos in

vitro envolvem o uso de hepatócitos, fração S9, superssomas e microssomas

hepáticos (JIA; LIU, 2007).

Os hepatócitos são considerados células epiteliais que compõem a estrutura

base do fígado e importantíssimos no processo de metabolismo de xenobióticos

(fármacos) e substâncias endógenas. Esse modelo é uma ferramenta adequada que

mais se aproxima do comportamento in vivo, pois, a partir desse sistema celular é

20

possível estudar sequencialmente o metabolismo de fármacos mediado pelas

reações de fase I e II, bem como, variações interindividuais. Em contrapartida, há

perda gradual da expressão enzimática ao longo do tempo o que compromete a

exatidão do modelo (ASHA; VIDYAVATHI, 2010; SERVIOR; PELKONEN; AHOKAS,

2012).

A fração S9 é composta pelas frações microssomal e citosólica, as quais

contém as enzimas envolvidas nas reações de fase I e II, respectivamente. A fração

S9 é obtida pela centrifugação diferencial, necessita do enriquecimento com

cofatores e é frequentemente empregada em associação ao teste de mutação

reversa bacteriana (teste de Ames), uma ferramenta utilizada para avaliar possíveis

efeitos mutagênicos de substâncias químicas. Adicionalmente, é útil nos estudos de

interação de fármacos e não é extensivamente utilizada como os microssomas, pois

apresenta baixa atividade enzimática (PLANT, 2004).

O superssoma representa a isoforma desejada da CYP, que é obtida a partir

de células infectadas por baculovírus com auxílio da engenharia genética. Esse

modelo é bastante empregado em associação ao modelo de microssomas

hepáticos, com a finalidade de determinar qual a isoforma da CYP é responsável

pelo biotransformação do fármaco, bem como, avaliação da interação entre

fármacos (PLANT, 2004; ASHA; VIDYAVATHI, 2010).

Os microssomas hepáticos, por sua vez, consistem de vesículas do retículo

endoplasmático liso obtidos por centrifugação diferencial e são amplamente

utilizados nos estudos de biotransformação de fármacos, visto que são úteis para

identificação do metabólito, comparação do perfil metabólico de diferentes espécies

e para auxiliar nos ensaios in vivo. Como vantagens pode-se destacar o baixo custo,

simplicidade, protocolos bem estabelecidos, facilidade no armazenamento (a

atividade enzimática é mantida por um longo período a -80 °C) e possibilidade de

avaliação interindividual. Como desvantagens, este modelo requer a adição de

cofatores (NADP, enzima glicose-6-fosfato desidrogenase e glicose-6-fosfato) para

reações mediadas por CYP (fase I) e UGT (fase II), não representam a fisiologia real

e as condições de incubação devem ser cuidadosamente controladas (força iônica,

pH do meio, tipo e a concentração do solvente orgânico, temperatura, tempo de

incubação) (SINGH, 2006; JIA; LIU, 2007).

Vale enfatizar que os resultados obtidos nos estudos in vitro devem ser

empregados com cautela ao extrapolar para os estudos in vivo, visto que os

21

modelos in vitro não representam fielmente as condições fisiológicas observadas in

vivo.

1.6. Técnicas analíticas aplicadas em estudos de biotransformação in vitro

A condução de estudos de biotransformação in vitro exige o emprego de

ferramentas analíticas confiáveis e adequadas para separação, identificação,

quantificação e caracterização estrutural dos metabólitos presentes em uma matriz

biológica. Para esses fins, são geralmente empregadas a cromatografia líquida de

alta eficiência e espectrometria de massas (CASTRO-PEREZ, 2007; TOLONEN;

TURPEINEN; PELKONEN, 2009).

1.6.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A aplicação da técnica de CLAE nos estudos metabólicos de um fármaco

baseia-se na capacidade desta técnica separar e determinar de modo qualitativo e

quantitativo uma ampla faixa de analitos presentes em uma mistura. Para tanto,

utiliza-se colunas cromatográficas preenchidas de sílica, denominadas de fase

estacionária (FE) e um sistema de solventes, denominados de fase móvel (FM) que

elui o analito sob altas pressões (SILVA; COLLINS, 2011).

As fases estacionárias podem ser de diferentes tipos, sendo fase reversa a

mais utilizada na cromatografia líquida para separação de substâncias e consiste em

uma FE de menor polaridade e FM de maior polaridade, enquanto que a fase normal

é o inverso. A maior aplicabilidade desses sistemas de fase reversa deve-se ao uso

de fases móveis menos tóxicas e de menor custo, como metanol e água ou

acetonitrila e água; fases estacionárias estáveis e de diferentes tipos; rápido

equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel; rapidez das análises; facilidade

em empregar eluição por gradiente e possibilidade de separação de analitos de

diferentes polaridades (TONHI et al., 2002). Todavia, a escolha das FE e FM

dependerão das características físico-químicas do analito (pKa e log P). Quando

técnica de CLAE é acoplada a detectores de arranjo de diodos (DAD) é possível

analisar a absorbância em todos os comprimentos de onda da região do ultravioleta

(UV) e visível simultaneamente e identificar algumas classes químicas com grupos

cromóforos (MARIA; MOREIRA, 2007; SILVA; COLLINS, 2011).

22

Para a caracterização estrutural de substâncias, a técnica de CLAE-DAD não

é capaz de atender a essa exigência, sendo, portanto, a cromatografia líquida

associada a espectrômetros de massas com a finalidade de ampliar a eficiência

analítica (MARIA; MOREIRA, 2007).

1.6.2. Espectrometria de massas (EM)

A EM é uma técnica rápida e de alta sensibilidade que permite a identificação

de compostos em misturas complexas com baixíssima concentração, através da

determinação de suas massas moleculares na forma iônica (carregadas positiva ou

negativamente), conhecida como razão massa/carga (m/z). Um espectrômetro de

massas é composto por 3 módulos principais: fonte de ionização, analisador de

massas e detector (ARDREY, 2003; MARIA; MOREIRA, 2007).

A ionização é um processo físico/químico de conversão de um átomo ou

molécula em um íon (positivo ou negativo). Dependendo da fonte ionizadora

empregada os produtos podem ser formados através de um dos três processos

químicos principais como, remoção/ adição de um elétron resultando em íons

radicais (M.+ ou M.-); protonação/desprotonação gerando moléculas protonadas

([M+H]+) / desprotonadas ([M+H]-), e cationização/ anionização, que resultam em

moléculas cationizadas ([M+Na]+)/ anionizadas ([M+Cl]-) (ARDREY, 2003;

VESSECHI et al., 2008).

As fontes de ionização empregadas em sistemas de CLAE-EM são ESI, APCI

e APPI. Dentre estas formas de ionização branda, o modo de ionização por ESI é a

mais amplamente utilizada na análise de uma variedade de moléculas bastante

polares ou iônicas, termolábeis, ou com massa molecular elevada (>1000 Da),

funciona muito bem somente em fase reversa e apresentam bom desempenho em

vazões mais baixas de fase móvel. A segunda fonte mais empregada, a APCI gera

bons resultados nas análises de substâncias de pouca a intermediária polaridade

com massa inferior a 1500 Da, utiliza alta faixa de temperatura (300-400 °C) para

dessorção térmica dos analitos, apresenta melhor desempenho em fase normal e

razoavelmente bem em fase reversa e a capacidade de ionização é diretamente

proporcional a vazão da fase móvel. Por último, a APPI é a fonte de ionização mais

recente, empregada em CLAE-EM e diferente das demais, esta é aplicada nas

análises de substâncias não polares ou de polaridade muito baixa. Semelhante a

23

APCI, a APPI funciona melhor em fase normal e razoavelmente bem em fase

reversa e não é recomendada para substâncias termolábeis. Além disso, a APPI

funciona muito bem em vazões baixas de fase móvel, assim como, a ESI (LANÇAS,

2009; Da SILVA; COLLINS, 2011).

Outro componente importantíssimo da espectrometria é o analisador de

massas que consiste em um ambiente sob um campo elétrico com função de

separar os íons e direcioná-los ao detector de acordo com os seus valores de m/z.

Dentre os analisadores mais comumente empregados e que podem ser utilizados

nos estudos de biotransformação in vitro estão o Q (“quadrupole”), armadilhas de

íons (“ion trap”) e o TOF (“time-of-flight”). Os dados obtidos a partir de cada um deles

apresentam diferentes aplicabilidades, por exemplo, os analisadores Q e armadilhas

de íons são de baixa resolução, ou seja, os íons detectados são diferenciados por

uma única unidade de massa atômica. Enquanto que o TOF é de alta resolução,

sendo assim, é possível distinguir os íons com precisão de quatro unidades de

massa atômica, o que permite a determinação da fórmula molecular exata do

analito. Consequentemente, torna-se possível a identificação de alterações ocorridas

na massa molecular por meio das reações de biotransformação (CASTRO-PEREZ,

2007; TOLONEN; TURPEINEN; PELKONEN, 2009; LANÇAS, 2009), conforme

demonstrado na Tabela 2.

Tabela 2- Alterações mais comuns na massa molecular da substância por meio das reações de fase I (Fonte adaptado: TOLONEN; TURPEINEN; PELKONEN, 2009). Biotransformação

Fase I

Mudança na fórmula molecular Mudança de massa

(Da)

Descarboxilação -CO2 -43,9898

Desidratação -H2O -18,0106

Desmetilação -CH2 -14,0157

Desidrogenação -H2 -2,0157

Hidroxilação +O +15,9949

N/S-oxidação +O +15,9949

Epoxidação +O +15,9949

Hidratação +H2O -18,0106

24

1.6.3. Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

A técnica consagrada para elucidação estrutural de moléculas orgânicas é a

espectroscopia de RMN. Pois, essa técnica oferece informações sobre número de

átomos magneticamente distintos do isótopo estudado em uma molécula. Quando o

RMN é acoplado a CLAE se torna uma ferramenta poderosa para a identificação

estrutural de metabólitos presentes em uma matriz biológica. Afinal, os metabólitos

podem ser separados ou isolados de outros metabólitos ou de interferentes

presentes na matriz biológica, e assim elucidados estruturalmente, porém necessita

de quantidades superiores de massa dos metabólitos quando comparada a EM

(SIDELMANN et al., 2001).

25

2. JUSTIFICATIVA

A leishmaniose é considerada uma das doenças negligenciadas mais

importantes no Brasil. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, no Brasil

existem mais de dois mil novos casos de pessoas acometidas por essa doença

anualmente (BRASIL, 2015). Os tratamentos farmacológicos disponíveis empregam

anfotericina B, isotionato de pentamidina, antimoniais pentavalentes, paromomicina

e miltefosina. Esses fármacos apresentam efeitos adversos, e na sua grande

maioria, empregam vias de administração parenteral, o que de maneira combinada

restringe a adesão dos pacientes ao tratamento. Apesar da miltefosina ser destinada

a administração oral, a mesma é restrita ao tratamento da leishmaniose visceral

(SUNADAR et al., 2002; BRASIL, 2005; DAVID; CRAFT, 2009).

Logo, fica evidente a necessidade da busca de um fármaco que apresente

reduzidos ou nenhum efeito colateral e que permita sua administração por via oral

para o tratamento da leishmaniose cutânea. Neste cenário, a chalcona CH8

desenvolvida pelo grupo de pesquisa da Profa. Bartira Rossi Bergmann, parceira

neste trabalho, apresenta atividade antileishmanial, a qual é 60 vezes superior ao

dos antimoniais (BOECK et al., 2006). Em etapa seguinte a comprovação da

atividade biológica é importante, durante a etapa pré-clínica, avaliar os parâmetros

farmacocinéticos, dentre os quais destaca-se o metabolismo. Visando à economia

de tempo e recursos financeiros (MONTANARI; BOLZANI, 2001).

Dessa forma, devido à ausência de método na literatura, é de grande

contribuição para o avanço dos ensaios pré-clínicos desenvolver um método

bioanalítico combinado a técnica de CLAE e a extração líquido-líquido (ELL) para

determinação da chalcona CH8 em fração microssomal. Assim como, identificar os

metabólitos formados, uma vez, que o conhecimento dos metabólitos permite a

avaliação de sua atividade biológica e toxidez.

26

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Estudar a biotransformação in vitro da chalcona CH8 utilizando microssomas

hepáticos de ratos.

3.2. Objetivos específicos

Desenvolver um método analítico por CLAE-DAD para determinação da

chalcona CH8 em meio de incubação microssomal;

Otimizar um método de extração da chalcona CH8 a partir do meio de

incubação microssomal;

Validar o método bioanalítico (separação e extração) para determinação da

chalcona CH8 em meio de incubação microssomal;

Identificar e caracterizar os possíveis metabólitos formados empregando a

CLAE acoplada a EM.

27

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Materiais

4.1.1. Solventes e reagentes

A água ultrapura utilizada para o preparo das fases móveis e soluções

reagentes foi obtida a partir do sistema purificador Elga Veolia, modelo Labwater

Purelab® Classic (Paris, França). A acetonitrila, ácido acético glacial, usados no

preparo das fases móveis, enquanto o éter metil terc-butílico e o acetato de etila,

usados na otimização da extração líquido-líquido foram adquiridos, todos, em grau

HPLC da Tedia® (Fairfield, OH, EUA). Os demais reagentes, fosfato de potássio

monobásico, ácido clorídrico, hidróxido de potássio, tris (hidroximetil) aminometano,

cloreto de potássio foram adquiridos da VETEC (Duque de Caxias, RJ, Brasil). O

tensoativo macrogol glicerol ricinoleato (Cremophor®) e os componentes do sistema

de regeneração de NADPH, enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, fosfato de

dinucleotídeo de β-nicotinamida e adenina (NADP) e glicose-6-fosfato foram

comercialmente obtidos da empresa Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EUA).

4.1.2. Equipamentos em geral

Para pesagem das substâncias foi empregada balança analítica, modelo

CP225D da marca Sartorius (Goettingen, Alemanha). Para incubação das amostras

foi empregado um banho metabólico do tipo Dubnoff, modelo NT232, da marca Nova

técnica (Piracicaba, SP, Brasil). Na etapa de preparação das amostras foram usados

um agitador de tubos tipo Vórtex e uma centrífuga de bancada modelo 80-2B ambos

da marca Edutec (São Paulo, SP, Brasil). Para a aferição do pH das soluções

tampão foi empregado um potenciômetro modelo PHS3BW, da marca BEL

Engineering (Monza, Itália).

4.1.3. Soluções de referência e reagentes

A chalcona CH8, 3-nitro-2’-hidroxi-4’,6’-dimetoxichalcona (Figura 5A), peso

molecular de 329,3 g/mol, foi sintetizada e gentilmente cedida pelo grupo de

28

pesquisa da Profa. Bartira Rossi Bergmann enquanto que o padrão interno (1,3-

diaril-2-propen-1-onas) foi adquirido da Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EUA). A

solução estoque de chalcona CH8 foi preparada em acetonitrila (ACN) na

concentração de 200 µg/mL e a partir dessa solução estoque foram preparadas por

diluição em balão volumétrico mais 11 soluções nas concentrações de 2; 5; 10; 15;

30; 50; 70; 100; 130; 160 e 180 µg/mL, usando como solvente a ACN. No entanto,

apenas seis das doze soluções foram empregadas na validação do método

bioanalítico entre elas estão as de 2; 5; 30; 100; 160 e 200 µg/mL que equivalem,

respectivamente, as concentrações de 0,15; 0,38; 2,28; 7,59; 12,15 e 15,18 µM no

meio microssomal. O padrão interno (PI) (Figura 5B) testado foi a chalcona não

substituída e a solução estoque foi preparada por diluição em balão volumétrico

apenas na concentração de 200 µg/mL.

Figura 5- Estrutura química da chalcona CH8 (A) e do PI (B).

4.2. Métodos

4.2.1. Análise por CLAE-DAD

Para a realização das análises cromatográficas foi empregado o equipamento

de CLAE, modelo Prominence, da marca Shimadzu® (Kioto, Japão), composto de

uma bomba de gradiente quaternário LC-20AT, forno CTO-20A, degaseificador

DGU-20A5, sistema controlador CBM-20A, injetor automático SIL-20A e DAD SPD-

M20A. No desenvolvimento do método utilizou-se a coluna cromatográfica Ascentis®

Express C18 (100 x 4,6 mm; 2,7 µm), da Sigma-Aldrich® (Bellefonte, EUA). A eluição

foi conduzida no modo isocrático, sendo utilizado o sistema de solventes acetonitrila:

solução de ácido acético 0,1%, na proporção de 65:35 (v/v) A vazão empregada foi

de 1 mL/min, temperatura de análise de 35 °C e o volume de injeção das amostras

foi de 4 µL. A chalcona CH8 e os seus metabólitos foram monitorados para detecção

29

no comprimento de onda de 338 nm. Os dados foram analisados utilizando o

software LC solution® versão 1.25 SP1.

4.2.2. Avaliação da solubilidade da chalcona CH8 no meio de incubação

microssomal

A solubilidade da chalcona CH8 foi avaliada no meio de incubação

microssomal que é composto basicamente por soluções aquosas como tampão

fosfato de potássio, tampão TRIS (empregado para preparar as soluções dos

cofatores) e água ultrapura. Esse procedimento foi aplicado com a finalidade de

garantir que a concentração da CH8 adicionada no meio microssomal fosse solúvel

no mesmo e, portanto, disponível para a biotransformação enzimática para CYP450,

utilizando o modelo de microssomas hepáticos.

Nesse sentido, o experimento foi realizado em replicatas (n= 3), utilizando

tubos cônicos e a solubilidade da chalcona CH8 foi avaliada nas concentrações de

50 e 100 µg/mL (3,79 e 7,59 µM, no meio de incubação, respectivamente). Dessa

forma, foram adicionados nos tubos cônicos 25 µL da solução estoque da chalcona

CH8 preparada em ACN (50 e 100 µg/mL) e 975 µL da solução tampão fosfato de

potássio (pH 7,4; 0,1 M). Além disso, a solubilidade do analito foi testada no meio

contendo 25 µL do analito, 200 µL da solução tampão fosfato de potássio 0,5 M pH

7,4 (resultando em uma concentração final de 0,1 M), um volume (µL) do tensoativo

cremophor® que resultasse nas concentrações de 0,1; 0,2 e 0,25% (m/v) no meio e

(µL) água ultrapura para completar o volume final de 1 mL. Após a adição das

soluções em tubos, as amostras foram centrifugadas, durante 5 minutos a 3000 rpm,

e os sobrenadantes transferidos para os vials para serem analisados por CLAE-

DAD. Além disso, outras amostras foram processadas contendo 25 µL da chalcona

CH8 nas mesmas concentrações (50 e 100 µg/mL) e 975 µL de ACN onde a CH8 é

100% solúvel. O percentual de solubilidade da chalcona CH8 foi obtido a partir dos

resultados da área relativa dos picos da chalcona CH8.

30

4.2.3. Otimização do método de preparo de amostras por extração líquido-

líquido (ELL)

A chalcona CH8 foi extraída, por ELL, a partir do meio de incubação

microssomal composto pela seguinte mistura: 200 µL de solução tampão fosfato de

potássio 0,5 M (pH 7,4); 250 µL de tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4) com 0,15 M de

KCl (em substituição aos cofatores preparados neste tampão) e um volume (µL) de

fração microssomal que resulte em uma concentração final no meio microssomal de

1 mg/mL e um volume (µL) de água ultrapura a fim de se obter uma concentração

final de tampão fosfato de potássio equivalente a 0,1 M.

Após a adição de 25 µL da chalcona CH8 (100 µg/mL), resultando na

concentração de 7,59 µM no meio de incubação, e do meio de incubação

microssomal em tubos de fundo redondo com tampa esmerilhada totalizando um

volume final de meio de incubação de 1 mL, as amostras foram homogeneizadas em

vórtex durante 10 s. Posteriormente, foram adicionados 4 mL dos solventes

extratores testados (éter metil terc-butílico e acetato de etila).

As amostras foram agitadas por 1 minuto em vórtex e então centrifugadas

durante 5 min a 3000 rpm. Logo em seguida, 3 mL de fase orgânica foram

transferidos para tubos cônicos de vidro de 10 mL. A partir disso, o solvente foi

evaporado sobre fluxo de ar comprimido e os resíduos foram redissolvidos em 300

µL de fase móvel e agitados em vórtex durante 10 s. Por fim, as alíquotas foram

transferidas para os vials e submetidas à análise cromatográfica. Controles foram

realizados sem a adição da chalcona.

4.2.4. Validação do método por CLAE-DAD

O método bioanalítico foi validado usando a RDC nº 27, de 17 de maio de

2012 da ANVISA. Com isso, para a validação da metodologia foram avaliados os

parâmetros de seletividade, linearidade, limite inferior de quantificação (LIQ),

precisão/exatidão intracorrida e intercorrida, estabilidade, bem como, o efeito matriz

e efeito residual.

Para construção da curva de calibração e validação do método bioanalítico

foram selecionadas as concentrações 2; 5; 30; 100; 160 e 200 µg/mL da chalcona

CH8, que equivalem, respectivamente, a 0,15; 0,38; 2,28; 7,59; 12,15 e 15,18 µM

31

no meio de incubação microssomal. Para avaliação dos parâmetros descritos é

necessário utilizar a menor concentração capaz de ser quantificada com precisão e

exatidão, denominado como LIQ; a concentração baixa (CB), que é até três vezes o

LIQ; a concentração média (CM) que é a média do LSQ (limite superior de

quantificação); e a concentração alta (CA), que se encontra entre 75 e 85% da maior

concentração da curva. Com base nessas especificações e nas concentrações da

chalcona CH8 preparadas determinou-se que o LIQ equivale a 0,15 µM; CB: 0,38

µM; CM: 7,59 µM; CA: 12,15 µM; LSQ: 15,18 µM.

As amostras foram compostas por 25 µL da solução da chalcona CH8 e do

meio de incubação microssomal descrito na seção 4.2.3. A partir dessa alíquota de 1

mL as amostras foram extraídas (exceto as amostras de estabilidade avaliadas em

condições de incubação que foram incubadas e depois extraídas) e posteriormente,

analisadas por CLAE-DAD, conforme descrito na seção 4.2.5.

4.2.4.1. Seletividade

A seletividade refere-se à habilidade de um método em determinar um analito

específico em uma mistura, sem a interferência de outros componentes presentes.

Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos nas amostras

processadas do limite de quantificação (LIQ), equivalente a 0,15 µM no meio de

incubação microssomal, e as respostas de picos interferentes próximo ao tempo de

retenção do analito devem ser inferiores a respectivamente 20% e 5% da resposta

do analito nas amostras do LIQ. Com a finalidade de avaliar a capacidade do

procedimento de preparo de amostra em eliminar interferentes, foram analisados

alíquotas de 1 mL do meio de incubação microsssomal na presença e ausência de

Cremophor® e brancos na presença e ausência do tensoativo livres do analito (n= 3).

4.2.4.2. Linearidade

A linearidade refere-se à capacidade de um método fornece resultados

diretamente proporcionais, dentro de uma faixa de concentração do analito na

amostra (INMETRO, 2003). A linearidade do método foi avaliada através da

construção de curvas analíticas na ausência de Cremophor® (n= 5) e presença de

Cremophor® (n= 6), as quais foram obtidas pela preparação de 1 mL do meio de

32

incubação microssomal. As concentrações da solução estoque da chalcona CH8

foram de 2; 5; 30; 100; 160 e 200 µg/mL, que equivalem em concentrações no meio

de incubação microssomal de 0,15; 0,38; 2,28; 7,59; 12,15 e 15,18 µM,

respectivamente. A análise estatística dos dados foi realizada usando a análise de

variância (ANOVA) Lack of fit pelo programa estatístico MINITAB Realease versão

14.1 (State College, PA, EUA). Valores de p maiores que o nível de significância (α=

0,05) indicam que não houve desvio de linearidade.

4.2.4.3. Limite inferior de quantificação (LIQ)

A detectabilidade do método foi avaliada pela determinação do LIQ, definido

como a menor concentração do analito que pode ser quantificada com exatidão,

expresso pelo erro padrão relativo (EPR, %) e precisão, expresso pelo desvio

padrão relativo (DPR, %), os quais não se admitem valores maiores ou iguais a 20%

para DPR (%) e fora da faixa de ± 20% para o EPR (%). Para esta determinação

alíquotas de 1 mL do meio de incubação microssomal foram preparadas na

concentração de 0,15 µM do analito na presença (n= 6) e ausência de Cremophor®

(n= 5), e posteriormente, analisadas com base em uma curva analítica preparada

simultaneamente.

4.2.4.4. Exatidão intracorrida e intercorrida

A exatidão se refere ao grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência (INMETRO, 2003).

Dessa forma, a exatidão foi determinada em uma mesma corrida analítica (exatidão

intracorrida) e em três corridas diferentes (exatidão intercorrida). Os ensaios de

exatidão intercorrida e intracorrida foram realizados na presença de Cremophor® (n=

6) e ausência de Cremophor® (n= 5) utilizando 1 mL do meio de incubação

microssomal contendo concentrações do analito no meio de incubação microssomal

de 0,15 µM (LIQ); 0,38 µM (CB); 7,59 µM (CM); 12,15 µM (CA). A exatidão foi

expressa pelo EPR (%), não se admitindo valores fora da faixa de ± 15% do valor

nominal, exceto para o LIQ, para o qual não se admitem valores fora da faixa de ±

20% do valor nominal. Os cálculos para avaliar a exatidão intracorrida e intercorrida

33

foram baseados em curvas analíticas, processadas diariamente da mesma forma

que as amostras e os resultados foram obtidos a partir da Equação 1.

(Equação 1)

4.2.4.5. Precisão intracorrida e intercorrida

A precisão representa a dispersão de resultados obtidos a partir de ensaios

independentes repetidos de uma mesma amostra (INMETRO, 2003). Dessa forma, a

precisão foi determinada em uma mesma corrida (precisão intracorrida) e em três

corridas diferentes (precisão intercorrida). Os ensaios de precisão intercorrida e

intracorrida foram realizados na presença de Cremophor® (n= 6) e ausência de

Cremophor® (n= 5) utilizando 1 mL do meio de incubação microssomal contendo

concentrações do analito no meio de incubação microssomal de 0,15 µM (LIQ); 0,38

µM (CB); 7,59 µM (CM); 12,15 µM (CA). A precisão foi expressa pelo DPR (%) e

para o cálculo foi empregado a Equação 2. Para este parâmetro não são admitidos

valores superiores 15% do valor nominal, exceto para o LIQ, para o qual não se

admite valores superiores a 20%.

(Equação 2)

Em que, S representa o desvio padrão absoluto e M refere-se a média

aritmética dos valores obtidos das replicatas para cada concentração.

4.2.4.6. Estabilidade

Este parâmetro visa avaliar a estabilidade das amostras quanto às condições

de armazenamento, preparo e análise das amostras. Com isso, as mesmas foram

avaliadas nas condições de bancada, de incubação e de auto-injetor nas

concentrações do analito no meio de incubação microssomal de 0,38 µM (CB) e

12,15 µM (CA). Essas amostras foram quantificadas empregando uma curva

analítica preparada no dia de análise e os resultados obtidos foram expressos como

34

EPR (%) e DPR (%). Todos os experimentos foram realizados em quintuplicata para

cada concentração avaliada.

Para avaliar a estabilidade de bancada, as amostras contendo o meio de

incubação microssomal foram mantidas a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C)

durante 6 horas, para posteriormente dar prosseguimento a extração líquido-líquido

e análise via CLAE-DAD. A estabilidade do analito submetidas as condições de

incubação foi avaliada utilizando amostras incubadas a 37 °C, sob agitação (200

rpm), durante 90 minutos em meio de incubação microssomal e ao fim procedendo-

se com a extração e análise. Para estabilidade de auto-injetor, as amostras foram

preparadas concomitantemente à curva analítica, mantidas dentro do amostrador e

injetadas após 7 h.

4.2.4.7. Efeito matriz

É o efeito na resposta do analito proveniente pela eluição de componentes da

matriz biológica no mesmo tempo de retenção do analito de interesse. Para avaliar o

efeito matriz foram preparadas em triplicatas alíquotas de 1 mL do meio de

incubação contendo a concentração de 0,38 µM (CB) e 12,15 µM. Posteriormente,

as amostras foram extraídas e injetadas em cromotográfo.

Os cálculos para avaliar o efeito matriz foi feito por meio do Fator de Matriz

Normalizado, segundo a fórmula a seguir:

FMN= área do analito em matriz / média das áreas do analito em solução

O critério de avaliação é que o coeficiente de variação (CV) dos FMNs

relativos as amostras avaliadas devem ser inferiores a 15%.

4.2.4.8. Efeito residual

O efeito residual refere-se ao efeito gerado pelo aparecimento ou aumento do

sinal do analito causado pela contaminação proveniente de amostras analisadas

anteriormente. Para a avaliação do efeito residual foi utilizado uma alíquota de 1 mL

do meio de incubação sem a adição do analito (branco) e esta foi injetada no

cromatógrafo. Por conseguinte, foram processadas três alíquotas de 1 mL do meio

35

de incubação contendo a concentração 15,2 µM (LSQ) do analito que em seguida

foram extraídas e injetadas após amostra branco, seguida de mais duas injeções da

amostra branco. As respostas de picos interferentes eluindo no tempo de retenção

do analito devem ser inferiores a 20% das respostas dos mesmos na concentração

do LIQ.

4.2.5. Procedimento geral de incubação para o estudo de biotransformação in

vitro e preparo de amostras

Os procedimentos e concentrações dos reagentes empregados nos ensaios

de biotransformação foram baseados no guia da BD Biosciences e no trabalho de

Messiano e colaboradores (2013). O meio de incubação microssomal foi preparado

para um volume final de 1 mL. Para os experimentos de biotransformação foram

transferidos 25 µL da solução estoque da chalcona CH8 na concentração de 100

µg/mL (que equivalem a 7,59 µM, no meio de incubação microssomal) para um tubo

de vidro de fundo redondo com tampa. Posteriormente, foram adicionados na

sequência 200 µL da solução tampão fosfato de potássio 0,5 M (pH 7,4); o sistema

de cofatores responsáveis pela regeneração de NADPH: 100 µL de NADP+ (0,25

mM), 100 µL solução de glicose-6-fosfato (5 mM) e 50 µL de glicose-6-fosfato

desidrogenase (0,5 unidades/mL); e um volume de água ultrapura (µL) a fim de se

obter um volume final de 1 mL.

Após adição das soluções, as amostras foram levadas para o banho-maria

metabólico, do tipo Dubnoff, as quais foram pré-incubadas por 5 minutos à 37 °C.

Passados os minutos, adicionou-se um volume (µL) da fração microssomal do fígado

de rato, a fim de se obter uma concentração proteica de 1 mg/mL no meio de

incubação. Logo após a adição da fração microssomal, as amostras foram

novamente incubadas a 37 °C, na rotação de 200 rpm, durante 90 minutos, em

banho-maria.

Decorrido o tempo de incubação, a reação foi encerrada ao adicionar-se 4 mL

de solvente orgânico extrator, em seguida, agitou-se utilizando o vórtex, durante 1

minuto. Após essa etapa, as amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 3000

rpm. Logo após a centrifugação, foram retirados 3 mL da fase orgânica e

transferidos para tubos cônicos, os quais foram colocados sob fluxo de ar

comprimido para completa secura do solvente orgânico. Por fim, os resíduos secos

36

contidos nos tubos foram redissolvidos em 300 µL de fase móvel, acetonitrila:

solução de ácido acético 0,1% (65:35, v/v), e levados para análise em HPLC-DAD.

Inicialmente, para monitorar a formação de metabólitos foram preparadas amostras

contendo a fração microssomal em replicatas (n= 10) e controles (n= 5) sem a

adição da fração microssomal e para ambos os grupos, as amostras foram

concentradas em uma única amostra. Posteriormente, para identificação e

caracterização estrutural dos metabólitos foram preparadas novas amostras

contendo a fração microssomal (n= 50) e controle (n= 6) sem a fração microssomal.

Para os experimentos de validação do método bioanalítico as amostras não

foram submetidas a etapa incubação, exceto as amostras de estabilidade

submetidas as condições de incubação.

4.2.6. Obtenção de microssomas hepáticos de ratos

Os microssomas hepáticos foram obtidos pelo método descrito por Lake

(1987). Para obtenção da fração microssomal dos fígados de ratos foram utilizados

seis ratos machos da linhagem Wistar, pesando entre 180-220 g, fornecidos pelo

Biotério Geral do Campus da USP de Ribeirão Preto. Os animais foram ambientados

a 25 °C e sacrificados pelo método de decapitação (Protocolo CEUA nº MAC041-

ANEXO I). A partir disso, o fígado fresco foi removido e colocado em um béquer

imerso em gelo com solução tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4), contendo 0,15 M de

KCl. Os fígados foram triturados e lavados três vezes com tampão Tris-HCl.

Posteriormente, estes pedaços foram homogeneizados em um homogeneizador tipo

“Potter” modelo MA 181 da marca Marconi (Piracicaba, SP, Brasil).

Após homogeneizar, o fígado foi centrifugado por 15 minutos a 4 °C na

rotação de 15.000 rpm em centrífuga modelo Himac CF16RXII da marca Hitachi,

(Tóquio, Japão). O sobrenadante foi coletado e centrifugado em ultracentrífuga a 4

°C por 60 minutos a uma velocidade de 38.000 rpm. O pellet contendo os

microssomas foi ressuspendido em solução tampão Hepes-HCl 0,05 M (pH 7,4),

contendo 0,001 M de EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) e 20% de glicerol. O

conteúdo proteico presente na fração microssomal foi dosado pelo método de

biureto empregando o kit para dosagem de proteínas totais da marca Labtest (Lagoa

Santa, MG, Brasil). Os microssomas hepáticos foram armazenados em tubos

criogênicos e armazenados em nitrogênio líquido até o momento do uso.

37

4.2.7. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a

espectrômetro de massas por tempo de voo (CLAE-TOF-EM)

As análises para identificação dos metabólitos também foram realizadas em

equipamento de CLAE da marca Shimadzu (Kioto, Japão), composto por duas

bombas isocráticas de alta pressão modelo LC-20AD operando a uma vazão de 1

mL/min, desgaseificador DGU-20A5, injetor modelo SIL-20AHT, detector

espectrofotométrico de arranjo diodo (DAD) SPD-M20A, módulo de comunicação

CBM-20A e forno para coluna modelo CTO-20A. As injeções foram realizadas

automaticamente (10 µL). Utilizou-se a coluna cromatográfica Ascentis® Express C18

(100 x 4,6 mm; 2,7 µm), da Sigma-Aldrich® (Bellefonte, EUA). A eluição da fase

móvel foi conduzida no modo gradiente, sendo utilizado o sistema de solventes

acetonitrila: solução de ácido fórmico 0,1% (v/v), que iniciava com 5% ACN (5 min) e

após esse tempo o gradiente atingia linearmente 100% em 30 minutos.

O equipamento de CLAE foi acoplado a um espectrômetro de massas

micrOTOF II da marca Bruker Daltonics (Billerica, MA, EUA). O aparelho utilizado é

de alta resolução necessitando de calibração interna antes e durante a realização

das análises. Para tanto, foi utilizado a solução de ácido trifluroacético sodiado (TFA-

Na+) na concentração de 10 mg/mL, como padrão de calibração de massas do

equipamento. Os espectros foram obtidos empregando ionização por eletrospray

operando em modo positivo, sendo utilizadas as seguintes condições de análise:

voltagem do capilar 3500 volts, e o skimmer 1 e 2 foram ajustados em 40 e 22 V,

respectivamente. Além disso, foi utilizado o gás nitrogênio, tanto para nebulização

como para secagem. A pressão do nebulizador foi de 5,5 Bar, a temperatura do gás

de secagem de 220 °C a uma vazão de 10 L/min. O programa empregado na

aquisição dos dados foi o software Bruker Compass Data Analysis versão 4.3

(Bremen, Alemanha).

4.2.8. Análises em espectrômetro de massas híbrido do tipo quadrupolo-tempo

de vôo (Q-TOF)

Para identificação caracterização dos metabólitos foi empregado também o

espectrômetro de massa microOTOF-Q II da Bruker Daltonics (Billerica, MA, EUA),

38

equipado com analisador de massas do tipo quadrupolo – tempo de voo (Q-TOF)

com o auxílio de uma bomba de infusão, modelo KDS 100L, da marca (Holliston,

MA, EUA) com vazão de 300 µL/h. A voltagem do capilar e do end plate foram 3500

Volts e 500 Volts, respectivamente, no modo positivo e negativo de ionização,

temperatura do gás de secagem (nitrogênio) de 220 °C, vazão de 10 L/min e pressão

de 5,5 Bar. Para calibração do equipamento utilizou-se a solução de ácido

trifluroacético sodiado (TFA-Na+) como padrão de calibração de massas, com

concentração de 10 mg/mL. O programa empregado na aquisição dos dados foi o

software Bruker Compass Data Analysis versão 4.3 (Bremen, Alemanha).

39

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Desenvolvimento e otimização do método por CLAE-DAD

Nas análises cromatográficas optou-se por utilizar a coluna Ascentis® Express

C18 (fase reversa), que possui fase ligada apolar, pelo fato do analito chalcona CH8

apresentar uma polaridade baixa (log P 3,79) (SciFinder®), permitindo um melhor

controle de sua retenção na fase estacionária (FE). Além disso, o material de

recheio com partículas superficialmente porosas e de menor diâmetro (2,7 µm) foi

empregado visando obter maior eficiência cromatográfica em menor tempo de

análise através do favorecimento da transferência de massa. Isso pode ser

justificado pela equação de van Deemter (Equação 3).

(Equação 3)

A Equação 3 relaciona a altura equivalente a um prato (H), a velocidade

linear (u) e fatores que podem levar o alargamento do pico, consequentemente,

comprometer a eficiência cromatográfica. Em que, o termo A está relacionado aos

diferentes caminhos seguidos pelas moléculas da amostra (caminhos múltiplos); B

refere-se a difusão do soluto pela fase móvel (difusão longitudinal) e C está

relacionado com a facilidade de transferência de massa da fase estacionária para a

fase móvel (LANÇAS, 2010).

Os solventes empregados na fase móvel foram acetonitrila e solução de ácido

acético 0,1%, pois a viscosidade da acetonitrila em água é inferior ao do metanol.

Considerando que a coluna cromatográfica escolhida possui tamanho de partícula

reduzido, o uso de metanol elevaria a pressão do sistema cromatográfico podendo

extrapolar o limite de pressão tolerado pelo modelo do injetor automático, SIL-20A,

usado (máximo de 200 kgf/cm2). Adicionalmente, a acetonitrila contribui

favoravelmente para separação eficiente da chalcona CH8 visto que tanto o analito

quanto a acetonitrila apresentam em sua estrutura química grupos com momentos

dipolos, o que favorece as interações eletrostáticas, consequentemente, torna a

acetonitrila mais seletiva a chalcona CH8 quando comparado ao metanol (SNYDER;

KIRKLAND; DOLAN, 2010).

40

A solução de ácido acético 0,1% foi empregada com a finalidade de garantir

que a molécula de chalcona CH8 esteja na forma não ionizada buscando a melhor

simetria do pico durante as análises cromatográficas (SANTOS-NETO, 2010), visto

que, essa molécula possui um caráter levemente ácido (pKa 6,74). O valor de pKa

foi obtido através da base de dados SciFinder.

Após estabelecer o tipo de coluna, tamanho de partículas da FE e os

solventes da FM seguiu-se a etapa de otimização da proporção entre os

componentes da fase móvel selecionados, acetonitrila e solução de ácido acético

0,1%, que fornecessem a maior eficiência possível (número de pratos), separação

entre a chalcona CH8 e o padrão interno (resolução), com o menor tempo de

retenção possível. As proporções testadas de acetonitrila e ácido acético foram,

60:40; 65:35 e 70:30, respectivamente.

Ao comparar os resultados obtidos nas análises cromatográficas (Tabela 3)

nota-se que conforme foi aumentada a proporção da fase orgânica o tempo de

retenção da chalcona CH8, número de pratos e resolução foram reduzindo devido

ao aumento da força cromatográfica. Apesar das três condições testadas terem

apresentado uma boa resolução (Rs > 1,5) e adequado número de pratos (>2000)

(SNYDER; KIRKLAND; DOLAN, 2010). Cabe aqui ressaltar que esse método

cromatográfico foi aplicado após a biotransformação in vitro da chalcona CH8.

Portanto, deve ser capaz de separar a chalcona CH8 e seus metabólitos, tendo em

vista que os metabólitos formados tendem a ser mais polares que os seus

precursores, logo são eluídos primeiro (GUTTERIDGE et al., 2010). Nesse sentido, a

condição com proporção 70:30 (v/v) não foi escolhida por apresentar uma faixa de

tempo muito estreita para eluição dos metabólitos. Enquanto que na proporção de

60:40 (v/v), apesar de apresentar a melhor resolução e maior número de pratos que

contribui para melhor eficiência do método apresentou um tempo de retenção mais

tardio, sendo assim, levaria a um maior tempo de análise e um gasto maior de

solventes, sendo, portanto, escolhida a condição intermediária na proporção de

65:35 (v/v) da fase móvel.

41

Tabela 3- Parâmetros de desempenho cromatográficos nas diferentes proporções da FM testadas.

Proporção FM (A:B)

Tempo de retenção (min)

Número de pratos

Resolução

60:40 5,72 14850,08 11,30 65:35 4,07 11948,44 7,74 70:30 3,07 8923,45 5,10

A: acetonitrila; B: Solução de ácido acético 0,1%.

Vale ressaltar que os valores referentes ao número de pratos (N) e a

resolução (Rs) foram calculados pelo próprio software cromatográfico.

A equação empregada no cálculo da resolução é dada por:

Rs= 1,18 (tR2-tR1) / WH2 + WH1 (Equação 4)

Em que, tR2 refere-se ao tempo de retenção do pico mais retido e tR1 ao pico

com menor tempo de retenção. Enquanto que WH2 e WH1, referem-se as larguras

dos picos, mais e menos retidos, medidas à meia altura.

Por sua vez, para o cálculo do número de pratos (N) o software emprega a

seguinte equação:

N= 5,54 (tR/WH)2 (Equação 5)

Em que, tR é o tempo de retenção do pico e WH é a largura a meia altura.

A Figura 6 representa o cromatograma da condição cromatográfica otimizada

onde o padrão interno e a chalcona CH8 apresentaram, respectivamente, tempos de

retenção (tR) em 2,9 min e 4,0 min e bandas máximas de absorção no ultravioleta

em 308 e 338 nm. Vale destacar que o pico com tR de 6 min refere-se a uma

impureza proveniente da síntese orgânica da chalcona CH8.

42

Figura 1- Cromatograma representativo da condição cromatográfica otimizada e os espectros de ultravioleta da chalcona CH8 e do padrão interno.

Contudo, na Tabela 4 apresenta a condição cromatográfica otimizada para

posterior aplicação nos estudos de biotransformação in vitro com microssomas

hepáticos de ratos.

Tabela 4- Condições cromatográficas de análise por HPLC.

Parâmetro Condições de análise

Coluna Ascentis® C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 µm)

Fase móvel (FM) Acetonitrila/Sol. de ácido acético 0,1% (65:35, v/v)

Vazão 1 mL/min

Volume de injeção 4 µL

Temperatura de análise 35 °C

Detecção UV 338 nm

43

5.2. Avaliação da solubilidade da chalcona CH8 nas condições de incubação

Os ensaios de biotransformação in vitro são realizados em meio aquoso

contendo solução tampão fosfato, fração microssomal e cofatores preparados em

tampão Tris. Desta forma, com a finalidade de avaliar o solvente que seria

empregado no preparo da solução estoque da chalcona CH8 foi testada sua

solubilidade em água. Com isso, foi verificado que a CH8 apresenta baixíssima

hidrossolubilidade. Consequentemente, a chalcona CH8 não poderia ser adicionada

no meio de incubação microssomal sem antes de estabelecer um solvente para

dissolvê-la e garantir a sua solubilização no meio de incubação microssomal. Entre

os solventes que podem ser empregados na solubilização de substâncias lipofílicas

no meio de incubação microssomal estão o metanol, acetona, etanol,

dimetilsulfóxido e acetonitrila (VENKATAKRISHNAN; Von MOLTKE; GREENBLATT,

2001). Neste sentido, Li e colaboradores (2010) avaliaram o efeito inibitório destes

solventes sobre CYP1A, CYP2C, CYP2D, CYP2E e CYP3A empregando

microssomas hepáticos de ratos. Observaram que dentre os solventes testados a

acetonitrila consiste da melhor escolha. Pois, a acetonitrila não apresenta inibição

em concentrações < 1% (LI et al., 2010).

Por sua vez, neste experimento foi empregado um volume de 25 µL de

solução estoque da chalcona CH8, preparada em acetonitrila. Este volume (25 µL)

foi adicionado ao meio de incubação microssomal (volume final de 1 mL), resultando

em uma concentração de 2,5% de acetonitrila. Volumes inferiores de solução

estoque não foram usados a fim de limitar erros analíticos no meio de incubação

microssomal. Esta concentração de acetonitrila (2,5%) mantém respectivamente 75,

75, 60, 90 e 100% de atividade catalítica das enzimas CYP1A, CYP2C, CYP2D,

CYP2E e CYP3A, respectivamente. Mesmo conhecendo que algumas CYP

poderiam estar parcialmente inibidas, avaliou-se o custo-benefício, e deu-se

continuidade aos experimentos nesta concentração de ACN, já que as reações

somente se processam em solução aquosa. Sendo assim, soluções estoque da

chalcona CH8 foram preparadas em acetonitrila.

Previamente aos ensaios, avaliou-se também a solubilidade dessa solução

estoque de chalcona CH8 na presença de tampão fosfato (pH 7,4) já que as reações

enzimáticas de biotransformação in vitro ocorrem em meio aquoso contendo solução

de tampão fosfato. Com isso, verificou-se que em ambas as concentrações testadas

44

da chalcona CH8, 50 e 100 µg/mL, apresentaram baixo percentual de solubilidade (<

20%) (Figura 7).

Todavia, com a finalidade de aumentar ainda mais a solubilidade da chalcona

CH8 no meio de incubação foram preparadas soluções do tensoativo Cremophor®

nas concentrações de 0,1; 0,2 e 0,25% (p/v), as quais foram testadas e conforme

observa-se no gráfico (Figura 7), a solubilidade da chalcona CH8, em ambas as

concentrações, aumentou em função do aumento da concentração de Cremophor® e

que na maior concentração do Cremophor® (0,25%) as concentrações de chalcona

CH8 testadas apresentaram um percentual de solubilidade de quase 48% (50

µg/mL: 47,8% 100 µg/mL: 47,0%). O tensoativo Cremophor® não foi testado em

concentrações superiores a 0,25%, porque há relatos na literatura que em

concentrações superiores observa-se uma inibição considerável da atividade

catalítica da CYP3A4 (RAO et al., 2010; CHRISTIANSEN et al., 2011).

Diante dos dados apresentados, foi escolhida a concentração de 0,25% de

Cremophor® para a realização dos ensaios posteriores tendo em vista que nesta

concentração apresentou maior solubilidade da chalcona CH8 quando comparadas

as demais testadas. Enquanto que a concentração da chalcona CH8 de 100 µg/mL

foi escolhida para ser empregada nos ensaios de biotransformação porque esta

concentração encontra-se dentro da faixa de concentração a ser empregada nos

ensaios de validação do método bioanalítico.

45

0

20

40

60

80

100

Chalcona CH8

g\mL

Chalcona CH8

g\mL

Tampão 0,1 M

Cremophor 0,1%

Cremophor 0,2%

Cremophor 0,25%

% s

olu

bil

idad

e

Figura 7- Porcentagem de solubilidade da chalcona CH8 de 50 µg/mL e 100 µg/mL, em solução de tampão fosfato de potássio 0,1 M e soluções de Cremophor®.

5.3. Otimização do método de preparo de amostras por ELL

Após otimização do método cromatográfico para análise da chalcona CH8,

deu-se prosseguimento a otimização do método para extração do analito do meio de

incubação contendo a fração microssomal. Para obter-se uma recuperação eficiente

do analito pela técnica clássica de ELL é importante considerar alguns parâmetros,

por exemplo, tempo de extração, volume da amostra e do solvente extrator,

procedimentos utilizados para evaporação do solvente e a escolha do solvente

extrator (BARTH et al., 2014). Nesse sentido, a técnica de ELL empregada foi

avaliada considerando a quantidade recuperada do analito e seletividade dos

solventes extratores após a extração do analito do meio microssomal utilizando

acetato de etila (AcOEt) e éter metil terc-butílico (MTBE).

A partir dos resultados obtidos verificou-se que ambos os solventes foram

seletivos, pois não foi observada a presença de interferentes, nos tempos de

retenção dos analitos, nos cromatogramas das amostras controle e amostras

contendo os analitos (Figura 8).

46

Figura 8- Cromatograma representativo das amostras extraídas com solventes extratores na presença e ausência da chalcona CH8. (A) amostras contendo o analito extraídas com MTBE; (B) amostras contendo o analito extraídas com AcOEt; (C) amostras controle sem o analito extraídas com MTBE; e (D) amostras controle sem o analito extraídas com AcOEt.

Todavia, o éter metil terc-butílico apresentou maior recuperação quando

comparado ao acetato de etila, 90 e 83%, respectivamente. Outro fator adicional que

contribuiu para escolha do MTBE, além da seletividade e maior recuperação foi o

menor ponto de ebulição (MTBE: 55,2 °C; AcOEt: 77,1 °C, obtidos na base de dados

do SciFinder®), o que contribui para redução do tempo evaporação dos solventes e

de preparo das amostras. Outros fatores que devem ser considerados são a razão

de volumes entre o solvente orgânico, tempo de extração e velocidade de extração,

para tanto esses parâmetros foram determinados com base no trabalho realizado

por Clemente (2016) que avaliou vários parâmetros inerentes a técnica de ELL para

extração eficiente da chalcona CH8 da fase aquosa contendo plasma murino. Com

isso, as condições para a extração da chalcona CH8 foram adaptadas para extração

do mesmo analito, porém, a partir do meio de incubação contendo microssomas

hepáticos de ratos. As condições otimizadas para a extração líquido-líquido estão

apresentadas na Tabela 5.

47

Tabela 5- Condições otimizadas para o procedimento de extração líquido-líquido.

Parâmetro Condição otimizada

Solvente (volume) MTBE (4 mL)

Tempo de agitação 60 s

Rotação e tempo de centrifugação 3000 rpm/5 min

Procedimento de evaporação Fluxo de ar comprimido

Volume recuperado 3 mL

Dissolução dos resíduos (Volume) 300 µL de fase móvel – ACN:

Solução de ácido acético 0,1%

(65:35, v/v)

48

5.4. Validação do método bioanalítico para determinação da chalcona CH8 em

meio de incubação microssomal

Após otimização dos parâmetros de extração líquido-líquido, o método

analítico foi validado, a fim de garantir a confiabilidade dos resultados obtidos no

estudo de biotransformação in vitro da chalcona CH8. O procedimento de validação

foi conduzido com base na RDC nº 27, de 17 de maio de 2012, da ANVISA que

dispõem requisitos mínimos para a validação de métodos bionalíticos aplicados em

estudos de biodisponibilidade e bioequivalência, em virtude da ausência de método

específico para a condução de estudos de metabolismo. Vale destacar que o

método foi validado sem o emprego do padrão interno visto que, os parâmetros de

validação avaliados foram atendidos sem o uso de PI, e porque o mesmo não

promoveu nenhuma melhoria nos resultados. Além disso, devido à possibilidade de

inibição do metabolismo o método foi validado na presença e ausência do tensoativo

Cremophor® (RAO et al., 2010).

5.4.1. Seletividade

Esse parâmetro é o primeiro passo no desenvolvimento e validação de um

método analítico, pois, esse parâmetro visa avaliar se há presença de algum

interferente eluindo no mesmo tempo de retenção do analito. A partir dos resultados

obtidos nota-se no cromatograma que tanto as amostras preparadas na presença

quanto na ausência de Cremophor® não houve a presença de picos interferentes

eluindo no mesmo tempo de retenção da chalcona CH8 (Figura 9). Portanto,

evidencia-se que o método bioanalítico foi seletivo.

49

Figura 9- Cromatograma representativo das análises de seletividade na presença e ausência de Cremophor® (n=3). (A) amostras contendo 0,15 µM da chalcona CH8 e 0,25%

de Cremophor® no meio de incubação microssomal; (B) 0,15 µM da chalcona CH8 no meio de incubação microssomal; (C) branco, amostras preparadas na ausência de Cremophor® e CH8; e (D) branco, amostras preparadas na presença de Cremophor® e ausência da chalcona CH8.

5.4.2. Linearidade

Para avaliação da linearidade do método foram construídas três curvas de

calibração com no mínimo seis concentrações diferentes do analito e mínimo de

cinco replicatas. De acordo com as especificações, os padrões de calibração devem

apresentar DPR menor ou igual 20% em relação à concentração nominal para os

padrões do LIQ, e DPR menor ou igual a 15% em relação a concentração nominal

para os demais padrões de calibração.

Após obter os resultados, os mesmos foram submetidos a um cálculo de

ponderação (peso=1/x2) a fim de minimizar o valor do EPR (%) obtido pela relação

entre os valores nominais dos padrões estabelecidos na curva de calibração e os

valores obtidos pela equação da curva. Pois, os dados da curva de calibração

apresentaram um comportamento heteroscedástico, ou seja, é quando se observa

variâncias discrepantes no valor resultante da soma dos erros relativos, em pontos

da curva de calibração (CRIBARI-NETO; SOARES, 2003).

50

O método avaliado atendeu as especificações preconizadas pelo guia

utilizado, mostrando ser linear em toda faixa da curva, com coeficiente de correlação

maior que 0,99. As equações da reta obtidas para as amostras na ausência e

presença de Cremophor® estão expressas na Tabela 6, onde y representa a área do

pico da chalcona CH8, e x refere-se a concentração da chalcona CH8. As análises

das seis concentrações da curva na ausência de Cremophor® (n=5) e na presença

de Cremophor® (n=6) apresentaram DPR inferior a 20% em relação a concentração

do LIQ (0,15 µM) e EPR situado entre ± 20%. Para as demais concentrações da

curva analítica, o DPR foi inferior a 15% e o EPR situado em ±15%. Além disso, o

teste para falta de ajuste (Lack of it) apresentou valores de F inferiores ao tabelado,

indicando que não há falta de ajuste e os valores de p superiores ao nível

significância (α= 0,05) indicam que não houve desvio de linearidade (Tabela 6).

Tabela 6- Linearidade do método na ausência (n=5) e presença de cremophor® (n=6).

Analito Faixa (µM)

Equação linear ra Lack of fitb

F p

Chalcona CH8 0,15 - 15,18

Ausência de Cremophor®

y=13808,02x - 820,25 0,998 1,780 0,193

Presença de Cremophor®

y=12007,03x - 390,12 0,996 3,74 0,062 aCoeficiente de correlação linear.

5.4.3. Limite inferior de quantificação (LIQ)

O limite inferior de quantificação representa a menor quantidade de analito

que pode ser quantificada com precisão e exatidão. Os resultados das análises com

0,15 µM de chalcona CH8 nas amostras (n=5) na ausência de Cremophor® e na

presença de Cremophor® (n=6), apresentaram valores dentro do especificado pelo

guia utilizado, sendo possível quantificar o analito nessa concentração com DPR

inferior a 20% e EPR situado entre ± 20% (Tabela 7).

51

Tabela 7- Limite de quantificação na ausência (n=5) e presença de Cremophor® (n=6).

Analito Concentração

(µM) Concentração

obtida (µM) EPR, %a DPR, %b

Chalcona CH8 0,15


0,15 2,60 4,30


0,16 6,08 3,38 aEPR, erro padrão relativo;

bDPR, desvio padrão relativo.

5.4.4. Precisão e exatidão intracorrida e intercorrida

A precisão representa a dispersão de resultados obtidos a partir de ensaios

independentes repetidos de uma mesma amostra. Enquanto que a exatidão se

refere ao grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um

determinado ensaio e um valor de referência (INMETRO, 2003). Os ensaios de

precisão e exatidão foram realizados empregando a menor concentração capaz de

ser quantificada com precisão e exatidão (LIQ), a concentração baixa (CB),

concentração média (CM) e a concentração alta (CA) da curva de calibração. Como

podem ser observados nas Tabelas 8 e 9, todos os valores para precisão (DPR)

foram inferiores a 15%, enquanto que a exatidão situou-se entre ± 15%, de acordo

com o guia empregado.

52

Tabela 8- Precisão e exatidão intracorrida na ausência (n= 5) e presença de Cremophor®

(n= 6).


(µM) Concentração

obtida (µM) EPR, %a DPR, %b

Chalcona CH8

0,15


0,15 2,60 4,30


0,16 6,08 3,38

0,38


0,35 -7,32 11,39


0,32 -15,00 5,42

7,59


7,98 5,11 0,68


7,51 -1,08 2,92

12,15


12,27 0,97 3,76




Tabela 9- Precisão e exatidão intercorrida na ausência (n= 3) e presença de Cremophor®

(n= 3).

Analito Concentração (µM)

Concentração obtida (µM)

EPR, %a DPR, %b

Chalcona

CH8

0,15


0,15 0,77 1,72


0,17 11,74 10,95

0,38


0,38 0,28 6,66


0,32 -13,69 8,60

7,59


7,93 4,42 7,44


8,09 6,17 6,18

12,15


11,96 -1,57 6,36




53

5.4.5. Estabilidade

As amostras foram avaliadas quanto as condições de armazenamento,

preparo e análise das amostras. Com isso, foram avaliadas as estabilidades de

bancada, de incubação e de auto-injetor para as concentrações baixa (0,38 µM) e

alta (12,15 µM) na ausência de Cremophor®. Essas amostras foram quantificadas

empregando uma curva analítica preparada no dia da análise e os resultados foram

expressos como EPR e DPR. Todos os experimentos foram realizados em

quintuplicata para cada concentração avaliada. Conforme pode ser observado na

Tabela 10, os resultados obtidos encontram-se dentro do especificado pelo guia

utilizado.

Tabela 10- Estabilidade de bancada, condições de incubação e auto-injetor na ausência de Cremophor® (n= 5).

Analito Concentração (µM)

Concentração obtida (µM)

EPR, %a DPR, %b

Chalcona

CH8

0,38

Bancada (6 h)

0,33 -10,80 9,87

Condições de incubação (37 °C, 200 rpm, 90 min)

0,32 -13,51 12,45

Auto-injetor (7 h)

0,35 -5,87 7,04

12,15

Bancada (6 h)

11,69 -3,79 5,46

Condições de incubação (37 °C, 200 rpm, 90 min)

12,86 5,91 5,76

Auto-injetor (7 h)



Além destas, também foi avaliada a estabilidade das soluções estoque, as

quais se mostraram estáveis durante o período de trinta dias de armazenamento a -

20 °C, apresentando EPR dentro da faixa de ± 15%, quando comparadas a solução

fresca, recentemente preparada e a solução analisada no último dia da validação.

Para este monitoramento foram empregadas as CB (0,38 µM) e CA (12,15 µM) em

triplicata.

54

5.4.6. Efeito matriz

Conforme pode ser observado na Tabela 11, os valores do coeficiente de

variação dos FMN calculados foram inferiores a 15% tanto para as amostras de

concentração baixa (0,38 µM) quanto alta (12,15 µM).

Tabela 11- Efeito matriz (n= 3).


(µM) CV, %a

Chalcona CH8 0,38 5,73

12,15 3,63 aCV, coeficiente de variação

5.4.7. Efeito residual

Para avaliar se o efeito residual ocorria no método, foi testada a injeção de

amostras fortificadas na maior concentração da curva analítica 15,18 µM e posterior

a injeção de amostras brancas livre do analito. Com isso, não foi observada a

presença do analito nas amostras branco injetadas posteriormente ao LSQ (Figura

10). Porém, a fim de eliminar a possibilidade de ocorrência deste efeito nas análises

posteriores a lavagem do auto-injetor foi realizada com acetonitrila no volume de

lavagem da seringa máximo permitido pelo injetor que é de 2000 µL.

Figura 10- Cromatograma representativo das análises de efeito residual. (A) refere-se as amostras processadas na concentração de 15,18 µM (LSQ); (B) amostras branco anterior a injeção do LSQ; (C) primeira amostra branco anterior a injeção do LSQ; (D) segunda

amostra branco analisada após a injeção do LSQ.

55

5.5. Identificação estrutural da chalcona CH8 e seus metabólitos

5.5.1. Análise por CLAE-DAD

Após etapas de otimização e validação do método bioanalítico, as amostras

provenientes do estudo de metabolismo e controle foram submetidas a análise

cromatográfica empregando a técnica de CLAE-DAD a fim de monitorar a formação

de metabólitos provenientes da biotransformação in vitro da chalcona CH8

empregando microssomas hepáticos de ratos.

As condições empregadas nesse estudo para promover a biotransformação

da chalcona CH8 foram tempo de incubação de 90 minutos e concentração de

proteínas microssomais de 1 mg/mL, visto que em ensaios preliminares não foi

possível observar por CLAE-DAD picos indicativos de metabólitos em concentração

e tempo inferiores a estes. Para esse experimento, foram preparadas replicatas da

amostra controle (n= 5) e amostra biotransformada (n= 10), sendo que ambos os

grupos foram, respectivamente, reunidas e concentradas em um único recipiente e

extraídas com MTBE, conforme o protocolo descrito na seção 4.2.5 e injetadas no

equipamento de CLAE-DAD.

O metabolismo da chalcona CH8 foi monitorado através da comparação entre

o perfil cromatográfico da amostra controle (amostra sem microssomas hepáticos,

portanto, não sofreram biotransformação) e biotransformada, adicionadas de

microssomas hepáticos, através da análise dos espectros de absorção no

ultravioleta (UV), bem como, pela diminuição da área da chalcona CH8

biotransformada quando comparada a da amostra controle.

Ao comparar o perfil cromatográfico notou-se a presença de picos no

cromatograma da amostra metabolizada que não foram observados na amostra

controle com tempos de retenção (tR) de 1,31; 1,76 e 1,96 minutos (Figura 11).

Dentre esses, apenas o pico com tR 1,76 min apresentou espectro de absorção no

UV (Figura 12B) semelhante ao da chalcona CH8 (Figura 12D) com observação de

duas bandas de absorção características conhecidas como, banda I (300-380 nm),

que está associada à absorção do sistema cinamoil do anel B, e a banda II (240-280

nm), ocasionada pela absorção do sistema benzoil do anel A (Figura 13) (CHAGAS

et al., 2014).

56

Apesar dos outros dois picos com tR 1,31 e 1,96 min não terem apresentado

esse espectro de absorção no UV característico não significa que essas sustâncias

não sejam produtos do metabolismo da chalcona CH8. Afinal, a baixa concentração

do produto formado e o efeito da matriz podem interferir na detecção por UV

(CASSIANO et al, 2009).

Figura 11- Cromatograma representativo das amostras preparadas com Cremophor®

submetidas à biotransformação in vitro. (A) representa a amostra controle preparadas na ausência de microssoma hepático (n= 5) e (B) amostra biotransformada preparadas na presença de microssomas hepáticos (n= 10), as quais foram analisadas por CLAE-DAD.

Condições de incubação: concentração de proteínas microssomais de 1 mg/mL e tempo de 90 minutos. Condições de análise: Coluna Ascentis C18 (100 x 4,6 mm; 2,7 µm) e fase móvel composta por acetonitrila e solução de ácido acético 0,1% (65:35, v/v); vazão de 1 mL/min; volume de injeção de 4 µL e detecção no UV em 338 nm. Solvente extrator: MTBE.

57

Figura 12- Espectro de absorção no UV de prováveis metabólitos (A: TR 1,3 min; B: TR 1,7 min; C: 1,9 min) e da chalcona CH8 (D: TR 4,0 min).

Figura 13- Estrutura básica de chalconas e suas porções que geram as bandas de

absorção características no UV.

As análises das amostras por CLAE-DAD indicaram a formação de possíveis

metabólitos da chalcona CH8 provenientes do estudo de biotransformação in vitro

com microssomas hepáticos de ratos. Desta forma, seguiu-se o estudo de

identificação dos prováveis metabólitos formados empregando CLAE-EM. Nesse

sentido, foram preparadas novas amostras controle (n= 6) e biotransformadas (n=

50) na presença e ausência de Cremophor®, e as amostras dos respectivos grupos

(quatro grupos) foram concentradas em um uma única amostra e analisadas por

CLAE-TOF-EM.

5.5.2. Análise por CLAE-TOF-EM

Ao comparar, qualitativamente, os cromatogramas obtidos após análise das

amostras, controle e biotransformada na ausência de Cremophor®, foi observada a

58

presença de cinco picos não encontrados no controle. Ao verificar a relação m/z dos

picos não encontrados no controle foi possível observar 5 picos (Figura 14) com

perda ou ganho de massas característico de reações mediadas pelo CYP (Tabela

12).

Figura 14- Cromatograma representativo das amostras preparadas na ausência de Cremophor® submetidas à biotransformação in vitro. (A) representa a amostra biotransformada (n= 50) e (B) amostra controle preparada na ausência de microssomas hepáticos (n= 6), as quais foram analisadas por CLAE-UV-TOF-EM. Condições de incubação: concentração de proteínas microssomais de 1 mg/mL e tempo de 90 minutos. Condições de análise: Coluna Ascentis C18 (100 x 4,6 mm; 2,7 µm) e fase móvel composta por acetonitrila e solução de fórmico 0,1% (gradiente 5% ACN (5 min); 5→100% (30 min)); vazão de 10 L/min; volume de injeção de 10 µL e detecção no UV em 338 nm. Solvente extrator: MTBE.

Tabela 12- Análise preliminar dos possíveis metabólitos.

Analito tR

(min) m/z Variação de

massa Possível

modificação estrutural

1 12,8 316 -14 -CH2

2 14,5 362 +32 +2O

3 16,6 346 +16 +O

4 16,8 302 -28 -2CH2

5 18,4 346 +16 +O

CH8 22,8 330 - -

tR, tempo de retenção; m/z, relação massa/carga; Variação de massa em função da chalcona CH8.

59

Após realizar a análise preliminar dos metabólitos (Tabela 12) foram

realizados cálculos do erro da massa acurada e foi observado que somente os picos

com tempo de retenção de 12,8 e 18,4 min, apresentaram massa acurada

compatível com as possíveis alterações estruturais encontradas nos metabólitos.

Devido a isso, o pico com tR 12,8 min foi codificado como M1 e o pico com tempo de

retenção em 18,4 min, codificado como M2. O cálculo do erro de massa será

abordado na sequência.

Porém, ao realizar a sobreposição dos cromatogramas das amostras

metabolizadas na ausência e presença de Cremophor® não foi observada a

presença do pico no tR de 12,8 min (M1) na amostra metabolizada contendo

Cremophor®, além disso, os picos foram menos intensos (Figura 15). Vale ressaltar

que apesar do método ter sido validado no modo isocrático, as análises foram

realizadas por CLAE-TOF-EM em modo gradiente com o objetivo de ampliar a faixa

de polaridade da fase móvel e garantir a identificação de um maior número de

metabólitos. Além disso, foi empregado o ácido fórmico para acidificar a fase aquosa

da fase móvel devido à disponibilidade deste solvente no laboratório onde foi

realizado as análises.

60

Figura 15- Cromatograma representativo das amostras preparadas na presença e ausência de Cremophor® submetidas à biotransformação in vitro. (A) amostras preparadas na ausência de Cremophor® (n= 50) e (B) amostras preparadas na presença de Cremophor® (n= 50), as quais foram analisadas por CLAE-UV-TOF-EM. Condições de incubação:

concentração de proteínas microssomais de 1 mg/mL e tempo de 90 minutos Condições de análise: Coluna Ascentis C18 (100 x 4,6 mm; 2,7 µm) e fase móvel composta por acetonitrila e solução de ácido fórmico 0,1% (gradiente 5% ACN (5 min); 5→100% (30 min)); vazão de 10 L/min; volume de injeção de 10 µL e detecção no UV em 338 nm. Solvente extrator MTBE.

Diante disso, a caracterização estrutural dos metabólitos provenientes da

biotransformação in vitro da chalcona CH8 empregando microssomas hepáticos de

ratos foi conduzida utilizando a amostra na ausência de Cremophor®.

Adicionalmente, a influência negativa do Cremophor® nas análises das amostras

contribuiu para que a validação do método bioanalítico fosse completamente

realizada na ausência de Cremophor®. Embora os resultados da validação parcial na

presença de Cremophor® tenham atendido aos requisitos mínimos dos guias

utilizados para essa finalidade, visto que a intenção preliminar era de realizar o

estudo de biotransformação na presença de Cremophor®, para assegurar que uma

parcela mais substancial da chalcona CH8 estivesse solúvel.

Portanto, conforme apresentado na Figura 14 a incubação da chalcona CH8

com microssomas hepáticos de ratos levou a formação de dois possíveis

metabólitos, codificados como M1 (tR=12,8 min) e M2 (tR=18,4 min), os quais não

foram observados na amostra controle incubada sem a adição da fração

61

microssomal. Conforme podem ser observados os dados apresentados na Tabela

13, verificou-se a transformação de 0,33 e 2,11%, para os metabólitos M1 e M2,

respectivamente, a partir da substância precursora, chalcona CH8. Após essas

observações, prosseguiu-se para análise do espectro de massas da chalcona CH8 e

seus metabólitos com o objetivo de propor a estrutura química dos produtos M1 e

M2 formados.

Tabela 13- Porcentagem de formação dos metabólitos M1 e M2.

Analito tR (min) Área % Relativa

CH8 22,8 2515,12 97,38 M1 12,8 8,63 0,33 M2 18,4 54,62 2,11

5.5.3. Análise estrutural da chalcona CH8 por CLAE-TOF-EM e CLAE-Q-TOF-EM

Os espectros de massas da chalcona CH8 foram previamente analisados com

a finalidade de auxiliar na proposta estrutural dos metabólitos formados. A partir da

ionização da chalcona CH8 empregando-se fonte ESI verificou-se a formação do íon

molecular m/z 330 (Figura 16) e íons fragmentos m/z 181, 176 e 166 no modo

positivo, conforme demonstrado na Figura 17.

Figura 16- Espectro de massas da chalcona CH8 com tR 22,8 min e m/z 330,0973, obtido no modo positivo após análise por CLAE-TOF-EM.

62

Figura 17- Espectro de massas da chalcona CH8 obtido no modo positivo após análise por

CLAE-Q-TOF-EM, sendo íon molecular da CH8 de m/z 330,0951 e íons fragmentos de m/z 181, 176 e 166.

Os íons m/z 181, 176 e 166 obtidos nos espectros de massas da chalcona

CH8 podem ter sido formados conforme a proposta de fragmentação apresentada

na Figura 18. Todavia, ao analisar os espectros de massas dos metabólitos M1 e

M2 obtidos por CLAE-Q-TOF-EM com o objetivo de fazer a caracterização estrutural

dos mesmos a partir da proposta de fragmentação da chalcona CH8, não foi

possível obter resultados conclusivos. Sendo assim, as amostras metabolizadas na

ausência de Cremophor® também foram analisadas por CLAE-TOF-EM a fim de se

obter informações estruturais dos metabólitos através da sua massa exata.

63

Figura 18- Proposta de fragmentação da chalcona CH8 protonada, após obtenção do espectro de massa obtido por CLAE-Q-TOF-EM.

5.5.4. Análise estrutural dos metabólitos M1 e M2 por CLAE-TOF-EM

Os espectros de massa adquiridos após a ionização no modo positivo por

eletrospray dos metabólitos M1 e M2 estão demostrados nas Figuras 19 e 20. Ao

analisar os dados obtidos por CLAE-TOF-EM, notou-se que o íon molecular do

metabólito M1 (m/z 316,0814) apresentou uma perda de 14 unidades de massa,

enquanto que o metabólito M2 (m/z 346,0920) teve um acréscimo de 15 unidades de

massa quando comparados ao íon molecular da chalcona CH8 protonada com m/z

330,0972.

64

Figura 19- Espectro de massas do metabólito M1 com tR 12,8 min e m/z 316,0814, obtido no modo positivo após análise por CLAE-TOF-EM.

Figura 20- Espectro de massas do metabólito M2 com tR 18,4 min e m/z 346,0920, obtido no modo positivo após análise por CLAE-TOF-EM.

Conforme demostrado anteriormente, os cromatogramas e espectros de

massas da chalcona CH8 e seus metabólitos foram obtidos por CLAE-TOF-EM, um

instrumento que apresenta o analisador de alta resolução, o qual é capaz de

conceder a massa exata das substâncias em análise. Na Tabela 14 reúne a massa

exata observada para a chalcona CH8 e metabólitos (M1e M2).

65

Tabela 14- Dados da massa exata da chalcona CH8 e seus metabólitos empregando o CLAE-TOF-EM.

Analito Massa exata Massa acurada Erro (ppm)

Fórmula molecular

CH8 330,0973 330,0972 -0,1 C17H16NO6 +

M1 316,0814 316,0816 0,5 C16H14NO6 +

M2 346,0920 346,0921 0,3 C17H16NO7 +

A exatidão das massas medidas foi avaliada através do cálculo do erro de

acordo com a equação: [106 x (m/z acurada – m/z exata) / m/z exata], onde m/z

acurada corresponde a massa medida e a m/z exata corresponde a massa teórica.

A partir dessas informações é possível inferir que os metabólitos M1 e M2 são

provenientes de uma possível desmetilação e mono-hidroxilação da chalcona CH8,

respectivamente. Todavia, a técnica empregada não permite elucidar a estrutura

química da molécula em estudo, indicando com exatidão em quais posições houve a

desmetilação nos grupos metoxilas do anel A e a inserção da hidroxila na porção

cinamoil. Dessa forma, é possível apenas propor a estrutura química dos

metabólitos (Figura 21) e fazer algumas observações quanto as posições mais

prováveis de terem ocorrido a reação de funcionalização.

Figura 21- Estruturas químicas propostas a partir das análises por CLAE-TOF-EM dos metabólitos da chalcona CH8 após a biotransformação por microssomas hepáticos de rato. O pontilhado envolvendo a parte da molécula corresponde aos possíveis locais onde podem ter ocorrido a reação química de desmetilação e mono-hidroxilação.

66

A regiosseletividade do processo de hidroxilação aromática mediada pela

CYP depende da natureza do(s) substituintes ligado(s) ao anel aromático e da

interação substrato-enzima (BARREIRO; FRAGA, 2015). A mono-hidroxilação

aromática da chalcona CH8 mais provável de ocorrer é na posição meta ao grupo

nitro (anel B). Pois, ao investigar o mecanismo de hidroxilação aromática mediada

pela CYP e os efeitos dos substituintes na reatividade, empregando cálculos teóricos

de modelo in silico, Bathelt e colaboradores (2004) verificaram que a reação de

hidroxilação em meta é mais favorável devido a influência eletrônica do nitro, um

grupo retirador de elétrons (BATHELT et al., 2004). Outra possibilidade de mono-

hidroxilação é no carbono-3 da insaturação do sistema carbonila, pois é um grupo

bastante eletrofílico e pouco impedido estericamente para reação enzimática. A

desmetilação provável seria na metoxila ligada ao carbono na posição 4’ do anel A,

tendo em vista que nessa posição está a metoxila menos impedida estericamente

para atuação da enzima (CAREY; SUNDBERG, 2007; SOLOMONS; FRYHLE,

2012).

Ao fazer uma busca na base de dados do SciFinder® a fim de verificar

registros de chalcona mono-hidroxilada em uma das quatro posições de carbonos

(C-2;4.5;6) disponíveis no anel B e no carbono-3 insaturado do sistema carbonila,

não foi encontrado nenhuma chalcona com tais estruturas químicas propostas. E o

mesmo foi feito para avaliar as chalconas desmetiladas em um dos grupos metoxilas

(C-4’ e 6’) do anel A, sendo encontrado apenas a chalcona desmetilada na posição

para (Figura 22). De acordo com dados da literatura esse derivado sintético de

chalcona é descrito como um agente anticâncer (ZHANG et al., 2015).

Figura 22- Estrutura química de provável chalcona para-desmetilado.

67

6. CONCLUSÃO

O presente trabalho apresentou o desenvolvimento e validação de um método

analítico empregando o CLAE-DAD. A separação cromatográfica empregou uma

coluna analítica empacotada com partículas superficialmente porosas que forneceu

elevada eficiência de separação (> 11000 pratos teóricos) e tempo de análise (7

min).

Por sua vez, a extração líquido-líquido empregada no preparo das amostras,

usando como solvente extrator éter metil terc-butílico, forneceu recuperação da

chalcona CH8 de 90% livre de interferentes. Além disso, este método é o primeiro

método desenvolvido e validado para determinação da chalcona CH8 em meio

contendo matriz biológica.

O método bioanalítico foi validado e atendeu as exigências do guia de

validação bioanalítica adotado. Após a validação o método foi aplicado na

determinação da chalcona CH8 e dos seus metabólitos em meio de incubação

microssomal.

As condições de incubação empregadas no estudo de metabolismo in vitro

com microssomas hepáticos de rato da chalcona CH8, 1mg/mL de proteínas

microssomais e tempo de incubação de 90 minutos, possibilitaram a formação e

identificação de dois prováveis metabólitos. Estes metabólitos, denominados de M1

e M2, indicam tratar-se de um derivado desmetilado e mono-hidroxilado,

respectivamente. A identificação preliminar foi realizada com o auxílio da técnica

CLAE acoplada a um espectrômetro de massas com fonte de ionização eletrospray

e analisador de tempo de voo. No entanto, a técnica não permitiu a elucidação

estrutural dos metabólitos. Para esta finalidade deverão ser realizadas análises com

outros analisadores ou mesmo pela cromatografia líquida acoplada a RMN.

A identificação dos metabólitos de um candidato a fármaco constitui-se em

etapa importante do estudo da farmacocinética de uma nova substância. Permitindo

a avaliação da atividade biológica e toxidez dos metabólitos contribuindo com a

avaliação da segurança da substância candidata a fármaco.

68

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8. ANEXO I

universidade federal do rio de janeiro programa de pós ......durante o mestrado, por colocar...

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