universidade federal do rio de janeiro aline ...epqb.eq.ufrj.br/download/microencapsulados...escola...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ALINE DAMICO DE AZEVEDO

SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO DE COPOLÍMEROS

ANFIFÍLICOS E DE MICROENCAPSULADOS

BIODEGRADÁVEIS DE L,L-LACTÍDEO E GLICOL

ETILÊNICO

RIO DE JANEIRO

2010

Aline Damico de Azevedo




ETILÊNICO

Orientadores: Profa. Dra. Cheila Gonçalves Mothé (EQ/UFRJ)

Profa. Dra. Shu Hui Wang (USP)

Rio de Janeiro

2010

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Tecnologia de

Processos Químicos e Bioquímicos,

Escola de Química, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como

requisitos necessários à obtenção do

título de Doutor em Ciências.

FICHA CATALOGRÁFICA

A994s Azevedo, Aline Damico de.

Síntese, Caracterização de Copolímeros Anfifílicos e de Microencapsulados

Biodegradáveis de L,L-Lactídeo e Etileno Glicol/ Aline Damico de Azevedo. –

2010. xxii, 143 f.: il.

Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Universidade Federal

do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, 2010.

Orientadoras: Cheila Gonçalves Mothé e Shu Hui Wang

1. Copolímeros. 2. Triblocos de PLLA-PEG-PLLA. 3. Poli(l,l-lactídeo). 4. Poli(glicol

etilênico). 5.Microencapsulamento. 6. Anfifílicos. 7. Caracterização. 8. Biodegradabilidade –

Teses. I. Mothé, Cheila Gonçalves (Orient.). II. Wang, Shu Hui (Orient.). III. Universidade Federal

do Rio de Janeiro, Programa em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de

Química. IV. Título.

CDD: 547.7

Aline Damico de Azevedo




ETILÊNICO

Aprovada em 22 de julho de 2010.

______________________________________________________________________

Profª Drª. Cheila Gonçalves Mothé - EQ/ UFRJ (Presidente da Banca)

______________________________________________________________________

Profª. Drª. Glaucia Barbosa Candido Alves Slana - FIOCRUZ

______________________________________________________________________

Prof. Dr. Jo Dweck - EQ/UFRJ

______________________________________________________________________

Profª. Drª. Maria José de Oliveira C. Guimarães - EQ/UFRJ

______________________________________________________________________

Profª. Drª. Rosangela Sabbatini Capela Lopes - IQ/UFRJ

______________________________________________________________________

Prof. Dr. Walker Soares Drumond - POLI/USP

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Tecnologia de Processos

Químicos e Bioquímicos, Escola de Química,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como

requisitos necessários à obtenção do título de

Doutor em Ciências.

O caminho de Deus é perfeito; a palavra do

Senhor é provada: é um escudo para todos os

que nele confiam.

Porque, quem é Deus senão o Senhor? E quem

é rochedo senão nosso Deus?

Deus é o que me cinge de força e aperfeiçoa o

meu caminho.

Salmo 18:30-32

Esta Tese foi realizada na Escola de Química

da Universidade Federal do Rio de Janeiro

(EQ-UFRJ) com auxílio financeiro da

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal

de Nível Superior (CAPES).

Dedico esta tese aos meus amados sobrinhos:

KARINE & LUCAS.

Amo vocês!

As minhas orientadoras Profa. Dra. Cheila

Gonçalves Mothé e Profa. Dra. Shu Hui Wang

pela amizade, companheirismo, orientação,

compreensão, dedicação e incentivo em todos os

momentos deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

Ao meu Senhor e Salvador Jesus Cristo por ter me dado, entre muitas outras

coisas, a vida e a oportunidade de estudar e concluir esta tese.

A minha amiga e mãe Sandra Rettori Damico pelo incentivo para eu retornar a

estudar e concluir esta tese, pois se não fosse ela, nem teria começado.

Ao Engenheiro Químico Dr. Walker S. Drumond que disponibilizou seu tempo em

ajudar-me na síntese dos copolímeros PLLA-PEG-PLLA na USP.

Ao Profº Drº Rubén Sinisterra por ter disponibilizado seu laboratório para a

confecção dos microencapsulados na UFMG.

Ao Químico (M.Sc.) Frederico B. de Souza que disponibilizou seu tempo em

ajudar-me na síntese do microencapsulamento da tetraciclina nos copolímeros

PLLA-PEG-PLLA na UFMG.

A Profª Drª Karen S. Pereira por disponibilizar seu laboratório para a Análise

Microbiológica dos copolímeros desenvolvidos no DEB/EQ/UFRJ.

A Química Industrial (M.Sc.) Cristiane Vieira e a Profª Drª Carla R. Araújo pela

realização das análises TG/DTG, DTA e DSC no DPO/EQ/UFRJ.

As minhas colegas de Doutorado Iara M., Kátia F. e Michelle G. pelo

companheirismo e incentivo durante toda trajetória de conclusão desta tese.

A todos que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste trabalho.

Resumo da tese apresentada à Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos

requisitos para obtenção do grau de Doutor em Ciências (D. Sc).

SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO DE COPOLÍMEROS ANFIFÍLICOS E DE

MICROENCAPSULADOS BIODEGRADÁVEIS DE L,L-LACTÍDEO E GLICOL

ETILÊNICO


Orientadoras: Profª Dra. Cheila Gonçalves Mothé

Profª Dra. Shu Hui Wang

Copolímeros anfifílicos, à base de segmentos hidrofóbicos de poli(l,l-lactídeo) (PLLA)

e de segmentos hidrofílicos de poli(glicol etilênico) (PEG), foram sintetizados por

polimerização em massa usando o catalisador 2-etil hexanoato de estanho. Estes copolímeros

foram utilizados como matriz para a preparação de microesferas de tetraciclina encapsuladas

pelo método de dupla emulsão com evaporação do solvente. A morfologia dos materiais foi

caracterizada por Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) e Microscopia Óptica (OM).

Suas composições e propriedades térmicas foram avaliadas por Infravermelho com

Transformada de Fourier método de Refletância Total Atenuada (FTIR-ATR), Ressonância

Magnética Nuclear (NMR) e Análise Térmica (TG / DTG, DTA e DSC). SEM e OM mostrou

o predomínio da forma esférica, no entanto, foi possível distinguir três padrões: superfície

rugosa ou lisa ou com colapsos (rupturas). A presença das absorções características de cada

homopolímero nos espectros de NMR e FTIR indicou a presença dos segmentos PEG e

PLLA, sugere a ligação covalente entre eles e apresentaram estabilidade térmica e a

integridade estrutural do copolímero PLLA-PEG-PLLA nas microesferas com a tetraciclina

encapsulada. Por Análise Térmica foi possível ver a influência da tetraciclina nas

temperaturas de transição vítrea (Tg), de cristalização (Tc) e de fusão (Tm) dos copolímeros de

PLLA-PEG-PLLA (DSC), enquanto os resultados por TG indicaram que as microesferas

mantiveram o perfil de decomposição térmica similar aos seus copolímeros de origem.

Abstract of thesis presented to Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro as partial

fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Science.

SYNTHESIS, CHARACTERIZATION OF AMPHIPHILIC COPOLYMERS AND

BIODEGRADABLE MICROENCAPSULATED OF L,L-LACTIDE AND ETHYLENE

GLYCOL


ADVISERS: Profª. Drª. Cheila Gonçalves Mothé

Profª Drª. Shu Hui Wang

Amphiphilic copolymers, based on hydrophobic poly(l,l-lactide) (PLLA) blocks and

hydrophilic poly(ethylene glycol) (PEG) blocks, were synthesized by mass polymerization

using stannous 2-ethylhexanoate. These copolymers were used as the matrix material for the

preparation of tetracycline-loaded microspheres by double-emulsion-solvent evaporation

technique. The morphology of these materials was characterized by using Scanning electron

microscopy (SEM) and Optical microscopy (OM). Their compositions and thermal properties

were evaluated by Fourier Transform Infrared-Attenuated Total Reflectance (FTIR-ATR),

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Thermal Analysis (TG/DTG, DTA and DSC). SEM

and OM showed the predominance of the spherical shape, however it was possible to

distinguish three patterns: rough or smooth surface or unbalanced collapsed volume. The

presence of the characteristic absorptions of each homopolymer in NMR and FTIR spectra

indicates the presence of the PEG and PLLA blocks, suggests the covalent bond between

them and showed thermal stability and structural integrity of the PLLA-PEG-PLLA

copolymer‟ microspheres enclosing tetracycline. By Thermal analysis it was possible to see

the marginal influence of tetracycline in the glass transition (Tg), crystallization (Tc) and

melting (Tg) temperatures of the PLLA-PEG-PLLA copolymers (DSC), while the results of

TG showed that the microspheres maintained the thermal decomposition profile similar to

their origin‟s copolymers.

Parte desta tese foi apresentada nos seguintes congressos / revistas científicas:

Azevedo, A. D., Mothé, C. G., Wang, S. H. e Drummond, W. S. “Thermal

Analysis of Biodegradable Triblock Copolymer Poly(l-lactide)-b-Poly(ethylene

glycol)-b-Poly(l-lactide) (PLLA-PEG-PLLA)”. Apresentado no 14th

International

Congress on Thermal Analysis and Calorimetry / VI Brazilian Congress on

Thermal Analysis and Calorimetry, E23, São Pedro, São Paulo, Set/2008.

Mothé, C. G., Azevedo, A. D., Drummond, W. S. e Wang, S. H. “Thermal

Properties of Amphiphilic Biodegradable Triblock Copolymer of L,L-Lactide and

Ethylene Glycol”. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, v. 101, n. 1, p.

229-233, 2010.

Aline D. de Azevedo, Cheila G. Mothé, Walker S. Drumond, Shu H. Wang,

Frederico B. de Souza, Rubén D. Sinisterra. “Microencapsulamento de

Tetraciclina em Copolímero de L,L-Lactídeo e Etileno glicol: Síntese e

Caracterização por Análise Térmica e SEM”. VII Congresso Brasileiro de Análise

Térmica e Calorimetria, São Paulo, 25-28/Abril/2010

SUMÁRIO

Capítulo 1 Introdução..................................................................................................

Capítulo 2 Objetivos.....................................................................................................

Capítulo 3 Justificativa................................................................................................

Capítulo 4 Fundamentos Teóricos..............................................................................

4.1 PLA – Poli (ácido láctico)………....................................................................

4.2 PEG – Poli(glicol etilênico)………………………………………………….

4.3 Síntese do Tribloco PLLA-PEG-PLLA……………………………………...

4.4 Tetraciclina.…………………………………………………………………..

4.5 Microencapsulamento………………………………………………………..

4.6 Métodos de Caracterização…………………………………………………..

4.6.1 Análise Microbiológica......................................................................

4.6.2 Análise Térmica.................................................................................

4.6.2.1 Termogravimetria (TG)/ Termogravimetria Derivada

(DTG).......................................................................................

4.6.2.2 Análise Térmica Diferencial (DTA).........................................

4.6.2.3 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)..........................

4.6.3 Difração de Raios X (XRD)...............................................................

4.6.4 Espalhamento de Luz Laser de Baixo Ângulo para Análise de

Tamanho de Partícula (LALLS).........................................................

4.6.5 Espectrometria de Absorção na região do Infravermelho com

Transformada de Fourier pelo método Refletância Total Atenuada

(FTIR-ATR).......................................................................................

4.6.6 Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (NMR)..............

4.6.7 Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM)....................................

4.6.8 Microscopia Óptica (OM)..................................................................

Capítulo 5 Materiais e Métodos..................................................................................

Página

01

07

09

11

14

18

20

22

23

30

30

31

31

34

35

36

38

41

44

47

49

51

5.1 Reagentes.........................................................................................................

5.2 Solventes..........................................................................................................

5.3 Equipamentos...................................................................................................

5.4 Métodos de Preparo..........................................................................................

5.4.1 Preparação dos Copolímeros de PLLA-PEG-PLA............................

5.4.2 Preparação do Microencapsulamento pelo método de dupla

emulsão por evaporação do solvente.................................................

5.5 Métodos de Caracterização..............................................................................

5.5.1 Análise Microbiológica......................................................................

5.5.2 Análise Térmica.................................................................................

5.5.2.1 Termogravimetria (TG) / Termogravimetria Derivada (DTG)

e Análise Térmica Diferencial (DTA)......................................

5.5.2.2 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)..........................

5.5.3 Difração de Raios X (XRD)...............................................................

5.5.4 Espalhamento de Luz Laser de Baixo Ângulo para Análise de

Tamanho de Partícula (LALLS).........................................................


Transformada de Fourier pelo método de Refletância Total

Atenuada (FTIR-ATR).......................................................................

5.5.6 Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (NMR)..............

5.5.7 Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM)....................................

5.5.8 Microscopia Óptica (OM)..................................................................

Capítulo 6 Resultados e Discussão..............................................................................

6.1 Caracterização dos Copolímeros....................................................................

6.1.1 Análise Microbiológica....................................................................

6.1.2 Análise Térmica...............................................................................

6.1.2.1 Termogravimetria (TG) / Termogravimetria Derivada

(DTG)....................................................................................

6.1.2.2 Análise Térmica Diferencial (DTA)......................................

6.1.2.3 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).......................

6.1.3 Difração de Raios X (XRD).............................................................


52

52

52

54

54

57

60

60

60

60

60

60

61

61

61

61

61

62

63

63

64

64

66

67

70


Atenuada (FTIR-ATR).....................................................................

6.1.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM)..................................

6.1.6 Microscopia Óptica (OM)................................................................

6.2 Caracterização dos Microencapsulados..........................................................

6.2.1 Análise de Tamanho de Partícula (método LALLS)........................

6.2.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM)..................................

6.2.3 Microscopia Óptica (OM)................................................................

6.2.4 Análise Térmica...............................................................................

6.2.4.1 Termogravimetria (TG) / Termogravimetria Derivada

(DTG) e Análise Térmica Diferencial (DTA).......................

6.2.4.2 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).......................

6.2.5 Difração de Raios X (XRD).............................................................



Atenuada (FTIR-ATR).....................................................................

6.2.7 Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (NMR)............

6.2.7.1 Núcleo de Hidrogênio (1H-NMR).........................................

6.2.7.2 Núcleo de Carbono 13 (13C-NMR).......................................

Capítulo 7 Conclusões..................................................................................................

Capítulo 8 Sugestões.....................................................................................................

Referências Bibliográficas...............................................................................................

72

74

78

80

80

83

90

95

95

105

110

111

117

117

120

123

127

129

LISTA DE FIGURAS

Figura 4.1: Ilustração da autoassociação de copolímero anfifílico (micela) e sua

relevância a liberação de droga..........................................................................................

Figura 4.2: Copolímeros: hidrogéis inteligentes, estímulo-resposta, liberação modulada

da droga (círculos)..............................................................................................................

Figura 4.3: Ilustração do ciclo de vida do PLA..................................................................

Figura 4.4: Formas isoméricas do ácido láctico.................................................................

Figura 4.5: Síntese de PLLA por polimerização de abertura de anel (ROP).....................

Figura 4.6: Diferentes isômeros de lactídeo.......................................................................

Figura 4.7: Esquema de reação de síntese do poli(glicol etilênico)...................................

Figura 4.8: Representação esquemática da aplicação do PEG em copolímero dibloco

PLA/PEG............................................................................................................................

Figura 4.9: Formação do alco-óxido a partir do catalisador...............................................

Figura 4.10: Etapa da abertura do anel l,l-lactídeo e propagação da cadeia......................

Figura 4.11: Coiniciador como possível agente de transferência.......................................

Figura 4.12: Copolímero Tribloco PLLA-PEG-PLLA......................................................

Figura 4.13: Estrutura química da tetraciclina...................................................................

Figura 4.14: Estruturas biológicas formadas a partir da autoassociação............................

Figura 4.15: Ilustração da conseqüência da autoassociação: a origem da vida..................

Figura 4.16: Ilustração da formação da corona e núcleo na autoassociação dos

copolímeros triblocos de formato A-B-A...........................................................................

Figura 4.17: Estratégia de encapsulação: liberação do fármaco na célula-alvo.................

Figura 4.18: Ilustração esquemática da ilustração de liberação de droga..........................

Figura 4.19: Passos básicos do microencapsulamento por evaporação do solvente..........

Figura 4.20: Curva termogravimétrica característica de uma reação em um único

estágio.................................................................................................................................

Figura 4.21: Comparação de curvas de TG e DTG para reações sobrepostas...................

Figura 4.22: Curva típica obtida pela técnica DTA............................................................

Figura 4.23: Curva típica obtida no DSC...........................................................................

Figura 4.24: Ilustração da Lei de Bragg.............................................................................

Figura 4.25: Esquema de um difratômetro de raios X.......................................................

Página

12

13

14

16

16

17

18

18

20

21

21

21

22

23

24

25

25

26

28

32

33

34

35

36

37

Figura 4.26: Cristal de NaCl (a) e seu difratograma (b).....................................................

Figura 4.27: Diâmetros médios equivalentes.....................................................................

Figura 4.28: Processo de difração a laser...........................................................................

Figura 4.29: Ilustração da técnica espalhamento de luz no instrumento Mastersize

2000....................................................................................................................................

Figura 4.30: Diagrama esquemático do caminho da radiação infravermelha no

acessório ATR....................................................................................................................

Figura 4.31: Origem do Deslocamento Químico: o movimento dos elétrons gera um

campo ‟ que se opõe ao campo externo 0....................................................................

Figura 4.32: Representação esquemática da interação spin-spin através das ligações

químicas.............................................................................................................................

Figura 4.33: Diagrama esquemático dos componentes relevantes de um microscópio

eletrônico de varredura.......................................................................................................

Figura 4.34: Constituintes principais do microscópio óptico.............................................

Figura 5.1: Câmara “Glove-box” utilizada para a preparação dos copolímeros................

Figura 5.2: Diagrama de blocos do procedimento de copolimerização.............................

Figura 5.3: Fotografia dos três copolímeros obtidos..........................................................

Figura 5.4: Diagrama de blocos do procedimento de microencapsulamento.....................

Figura 6.1: Sobreposição das curvas de TG dos três copolímeros.....................................

Figura 6.2: Sobreposição das curvas de DTG dos três copolímeros..................................

Figura 6.3: Sobreposição das curvas de DTA dos três copolímeros..................................

Figura 6.4: Curva de DSC para o copolímero 1.................................................................



Figura 6.7: Difratograma do copolímero 1.........................................................................

Figura 6.8: Difratograma do copolímero 3.........................................................................

Figura 6.9: Espectro de FTIR-ATR do copolímero 1........................................................

Figura 6.10: Espectro de FTIR-ATR do copolímero 2......................................................

Figura 6.11: Espectro de FTIR-ATR do copolímero 3......................................................

Figura 6.12: Micrografia do copolímero 1 (ampliação de 500 vezes)...............................

Figura 6.13: Micrografia do copolímero 1 (ampliação de 1000 vezes).............................



37

38

39

40

43

45

46

48

50

55

56

57

59

64

65

66

67

68

69

70

70

72

72

73

74

74

75

75



Figura 6.18: Fotografia óptica do copolímero 1.................................................................



Figura 6.21: Perfil de distribuição do tamanho de partícula para o microencapsulado 1..







Figura 6.28: Micrografia do microencapsulado 1 (ampliação de 500 vezes)....................

Figura 6.29: Micrografia do microencapsulado 1 (ampliação de 1500 vezes)..................

Figura 6.30: Micrografia do microencapsulado 4 (ampliação de 500 vezes)....................

Figura 6.31: Micrografia do microencapsulado 4 (ampliação de 1500 vezes)..................

Figura 6.32: Micrografia do microencapsulado 7 (ampliação 500 vezes).........................


Figura 6.34: Micrografia do microencapsulado 2 (ampliação 1500 vezes).......................







Figura 6.41: Fotografia óptica da tetraciclina....................................................................

Figura 6.42: Fotografia óptica do microencapsulado 1......................................................







76

76

78

78

79

80

80

80

81

81

81

82

83

83

84

84

85

86

86

87

87

88

88

89

89

90

91

91

92

93

93

94

94

Figura 6.49: Curvas de TG/DTG e DTA da tetraciclina....................................................

Figura 6.50: Curva de TG da tetraciclina...........................................................................

Figura 6.51: Curva de DTA da tetraciclina........................................................................

Figura 6.52: Curvas de TG/DTG e DTA do microencapsulado 1......................................







Figura 6.59: Curva de DSC da tetraciclina.........................................................................

Figura 6.60: Sobreposição das curvas de DSC dos microencapsulados 1, 4 e 7 (a partir

do copolímero 1)................................................................................................................

Figura 6.61: Sobreposição das curvas de DSC dos microencapsulados 2 e 5 (a partir do

copolímero 2).....................................................................................................................

Figura 6.62: Sobreposição das curvas de DSC dos microencapsulados 3 e 6 (a partir do

copolímero 3).....................................................................................................................

Figura 6.63: Difratograma do microencapsulado 3............................................................

Figura 6.64: Espectro de FTIR-ATR da tetraciclina..........................................................

Figura 6.65: Espectro de FTIR-ATR do microencapsulado 1............................................







Figura 6.72: Espectro de FTIR-ATR da fase solúvel e do clorofórmio.............................

Figura 6.73: Espectro de FTIR-ATR da fase insolúvel......................................................

Figura 6.74: Espectro de 1H-NMR da tetraciclina em água deuterada..............................

Figura 6.75: Espectro de 1H-NMR do microencapsulado 4 em clorofórmio deuterado...

Figura 6.76: Espectro de 1H-NMR do microencapsulado 6 em clorofórmio deuterado...

Figura 6.77: Espectro de 13

C-NMR da tetraciclina em água deuterada.............................


C-NMR do microencapsulado 4 em clorofórmio deuterado...

95

96

96

97

98

99

100

101

102

103

105

106

107

108

110

111

112

112

113

114

114

115

115

116

116

117

118

119

120

121


C-NMR do microencapsulado 6 em clorofórmio deuterado...

122

LISTA DE TABELAS

Tabela 4.1: Posição das bandas características dos grupos funcionais na técnica IR........

Tabela 5.1: Composição de copolímeros baseados em PLLA e PEG................................

Tabela 6.1: Valores de diâmetro médio e desvio padrão dos microencapsulados.............

Tabela 6.2: Dados termogravimétricos obtidos nas curvas TG/DTG referentes à

tetraciclina, copolímeros e microencapsulados..................................................................

Tabela 6.3: Dados térmicos obtidos na curva DTA referentes à tetraciclina,

copolímeros e microencapsulados......................................................................................

Tabela 6.4: Temperaturas de transição vítrea, de cristalização e de fusão observadas nas

curvas de DSC dos materiais sintetizados..........................................................................

Página

42

54

82

104

104

109

LISTA DE SIGLAS

APHA American Public Health Association (Associação Americana de Saúde Pública)

DEB Departamento de Engenharia Bioquímica

DDS Drug Delivery Systems (Sistemas de Liberação de Droga)

DPO Departamento de Processos Orgânicos

DSC Calorimetria Exploratória Diferencial

DTA Análise Térmica Diferencial

DTG Termogravimetria Derivada

EQ Escola de Química

FTIR-ATR Espectrometria de Absorção na região do Infravermelho com Transformada de

Fourier pelo método de Reflexão Total Atenuada

LALLS Low Angle Laser Light Scattering (Espalhamento de Luz Laser de Baixo

Ângulo)

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Ressonância Magnética Nuclear)

OM Optical Microscopy (Microscopia Óptica)

PCL poli( -caprolactona)

PDLA poli(d,l-lactídeo)

PEG poli(glicol etilênico)

PLA poli(ácido láctico)

PLGA poli(ácido láctico-co-glicólico)

PLLA poli(l,l-lactídeo)

ROP Ring Opening Polimerization (Polimerização por Abertura do Anel)

SEM Scanning Eletronic Microscopy (Microscopia Eletrônica de Varredura)

TG Termogravimetria

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

USP Universidade de São Paulo

XRD X Rays Diffraction (Difração de Raios X)

Capítulo 1

INTRODUÇÃO

Copolímeros com natureza anfifílica têm despertado o interesse por apresentarem a

propriedade de auto-organização (formação de micelas coloidais) em meio aquoso

(GRIFFITH, 2000; HOFFMAN, 2002) alterando as propriedades de dissociação e erosão, e,

por sua vez, melhorando a biodistribuição e biocompatibilidade dos polímeros citados

anteriormente no controle de liberação da droga como nanopartículas (YANG &

ALEXANDRIDIS, 2000; KAWASHIMA, 2001).

A tecnologia de liberação controlada de fármacos envolve campos multidisciplinares

da ciência (química, física, biologia, ciências de matérias, polímeros entre outros) e apresenta

grandes desafios. Avanços nesta tecnologia podem contribuir de forma a assegurar uma

concentração adequada do fármaco no plasma sanguíneo (PILLAI & PANCHAGNULA,

2001; FREIBERG & ZHU, 2004; KIM et al., 2009) e o micro e o nanoencapsulamento tem

sido um método alternativo para otimizar tal efeito terapêutico (GRIFFITH, 2000).

Nanodispositivos preparados a partir de poli(hidroxi ácidos) tendo como grupo radical

diferentes estruturas, cuja importância é devido a biodegradabilidade apresentada, podem ser

exemplificados por poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA),

poli(trimetilenocarbonato) (PTMC), poli( -caprolactona) (PCL) e entre outros. A facilidade

de copolimerização por reação de abertura do anel dos monômeros constituintes amplia e

flexibiliza as propriedades destes sistemas biodegradáveis (ALLENDER et al., 2000;

BREINTENBACH, LI & KISSEL, 2000; BAJPAI et al., 2008).

Copolímeros biodegradáveis na forma de diblocos (formato AB) ou triblocos

(formatos ABA ou BAB) de segmentos originários do PLA, tais como poli(l,l-lactídeo)

(PLLA), poli(d,l-lactídeo) (PDLA), copolímero poli(ácido lático-co-ácido glicólico) PLGA

(segmento A) e de poli(glicol etilênico) (PEG) (segmento B) têm sido enfatizados os estudos

de síntese e caracterização na última década por apresentarem biodegradabilidade e potencial

para aplicação como nanossistemas portadores de fármaco (JEONG, BAE & KIM, 2000;

KUMAR, RAVIKUMAR & DOMB, 2001; HASIRCI et al., 2001; JEONG, KIM & BAE,

2002). Entretanto, somente nos últimos anos que os copolímeros de formato de triblocos estão

sendo estudados com maior ênfase.

Huang, Chung & Tzeng (1997) concluíram que o copolímero dibloco PLA-PEG

possui maior hidrofilicidade e menor temperatura de transição vítrea em relação ao

homopolímero PLA. As microesferas obtidas desse dibloco, com encapsulamento de droga

hidrofílica – lidocaína – pelo método de emulsão óleo/água, eram mais porosas e possuíam

uma permeabilidade mais adequada à liberação do fármaco citado.

Em outro trabalho, Huang, Chung & Tzeng (1999) identificaram que a introdução de

poli(glicol etilênico) nos homopolímeros de ácido láctico diminuiu a acidez dos produtos

degradados, aumentou a taxa de degradação do sistema e a taxa de liberação de drogas pelo

sistema copolimérico.

Nakada e colaboradores (1998) confirmaram em pesquisas in vivo que nanopartículas

de tribloco PLA-PEG-PLA possuíam a habilidade de evadir-se da captura pelo sistema

retículo endotelial prolongando, assim, a permanência no sistema circulatório. Esse tempo de

permanência era em função dos seguintes fatores: concentração, tamanho e distribuição de

massa molar do segmento PEG no copolímero.

Matsumoto e colaboradores (1999) pesquisaram a liberação in vitro de progesterona a

partir de microesferas de PLA e PLA-PEG-PLA. A velocidade de liberação da droga era

afetada por fatores relacionados à composição do copolímero, principalmente a porosidade. A

velocidade de liberação aumentava com o acréscimo do conteúdo do segmento de PEG no

copolímero. A adição de surfatante também alterou a porosidade das microesferas. Este

resultado foi atribuído em parte a uma maior molhabilidade das mesmas, propiciada pelo PEG

e surfatante. A distribuição da massa molar do copolímero também foi considerada um

importante parâmetro no controle da velocidade de liberação do fármaco.

Tobio e colaboradores (2000) estudaram a comparação entre os sistemas de liberação

de droga (Drug Delivery Systems - DDS) convencionais e os DDS a partir do copolímero

PLA-PEG e concluíram que o recobrimento das nanopartículas com PEG tem um papel

fundamental na estabilidade dos DDS no fluido intestinal e no acesso destas a corrente

sanguínea e a circulação linfática; as nanoesferas PEG-PLA apresentaram maior tendência em

transportar o principio ativo na corrente sanguínea que no sistema linfático. A camada de PEG

facilitou a adsorção e transporte de fármacos através das mucosas até a circulação que

flexibilizará a administração do DDS por rotas alternativas como a tópica, a nasal, a vaginal e

inclusive a oral.

Govender e colaboradores (2000) publicaram a incorporação da droga hidrofílica,

procaína, em diblocos de PLA-PEG com segmento fixo de PEG (5 kDa) e variando os

segmentos de PLA (3-110 kDa). Concluíram que os diâmetros dos nanoparticulados (forma

esférica) aumentaram proporcionalmente ao peso molecular de PLA nos mesmos, porém a

eficiência de liberação da droga não dependia dessa variação no segmento PLA.

Molina e colaboradores (2001) prepararam hidrogéis portadoras de albumina de soro

bovino (ASB) e de fibrinogênio a partir de tais copolímeros utilizando o método de separação

de fase. A divisão das moléculas de ASB a partir da matriz apresentou comportamento

parabólico, típico de sistemas monolíticos de entrega de droga enquanto que a difusão do

fibrinogênio apresentou um comportamento linear sugerindo que a matriz funciona com um

reservatório para a droga.

Lui e colaboradores (2001) avaliaram a aplicabilidade do copolímero PLA-PEG-PLA

como sistema parenteral portador da droga anticâncer adrimicina. Micelas com estreita

distribuição de tamanho foram preparadas pelo método de difusão do solvente. A eficiência

de incorporação do fármaco aumentou com o acréscimo do tamanho do segmento de PLA no

copolímero e tais características tornaram as micelas PLA-PEG-PLA promissoras como

portadoras de drogas.

Liggins & Burt (2002) desenvolveram diblocos de metoxipoli(glicol etilênico)

(MePEG) e poli (d,l-lactídeo) (PDLA) por polimerização em massa via abertura de anel do

meso lactídeo na presença do catalisador octanoato de estanho. Observaram que o sistema

poliéter-poliéster desenvolvido como micela carregadora de droga hidrofóbica como o

paclitaxel foi satisfatória, pois o comportamento térmico do copolímero possuiu propriedades

numerosas em relação aos seus homopolímeros, além do perfil de miscibilidade do paclitaxel

no copolímero foi mais eficiente que nos homopolímeros.

Kissel, Li & Unger (2002) prepararam microesferas a partir de poli(d,l-ácido láctico)

(PDLLA) PDLLA-PEG-PDLLA e PLA portando os fármacos, lidocaína e hidrocloreto de

propanolol, e pesquisadas as taxas de liberação in vitro. A velocidade de liberação de ambos

os fármacos foi geralmente maior nas microesferas do copolímero devido a maior porosidade

das mesmas. Também observaram que a velocidade de liberação da droga hidrofílica

(propanolol) foi geralmente maior que a droga hidrofóbica (lidocaína).

Lin, Juang & Lin (2003) pesquisaram a liberação de droga anticâncer indomethacin

em micelas obtidas a partir de diversos copolímeros triblocos poli(lactona)-PEG-poli(lactona),

sendo os blocos de lactonas formados por PLA, poli(valerolactona) (PVL) ou PCL. A taxa de

liberação da droga nas micelas tornou-se independente da composição dos copolímeros nos

primeiros cinco dias, entretanto, apos este período uma dependência como tamanho do bloco

de poli(lactona), ou seja, as micelas com maiores blocos de poli(lactona) apresentaram uma

menor taxa de liberação do fármaco. O efeito da natureza hidrofóbica da lactona foi também

pesquisado, uma reduzida taxa de liberação foi observada em micelas PVL-PEG-PVL e PCL-

PEG-PCL, quando a composição molar foi maior que 40/1/40, a partir desta composição, a

liberação de droga foi inferior a 40% em um intervalo de 14 dias. A liberação do fármaco em

micelas PLA-PEG-PLA foi mais rápida que as anteriores, este comportamento foi atribuído à

fraca interação entre o copolímero PLA e a droga encapsulada no sistema polimérico.

Ruan & Feng (2003) pesquisaram a taxa de liberação do paclitaxel (uma das mais

poderosas drogas anticâncer) em microesferas de tribloco de PLA-PEG-PLA e em

microesferas do copolímero PLGA. Em estudo prévio, a liberação do fármaco em

microesferas de PLGA mostrou-se extremamente vagarosa com uma liberação de apenas 50%

em 3 meses, quando para um tratamento efetivo de câncer, normalmente é necessário uma

liberação contínua de droga em um período entre 1 semana a 1 mês. Esperava-se que a junção

dos blocos PEG hidrofílicos a cadeia do PLA hidrofóbico facilitasse a liberação da droga a

partir das microesferas. De fato, a liberação do fármaco a partir dos microencapsulados de

PLA-PEG-PLA mostrou-se muito mais rápida que as mesmas de PLGA, 50% versus 18% em

1 mês. Este resultado foi parcialmente atribuído à morfologia porosa dos mesmos, pois foram

preparados adicionando-se acetona ao solvente orgânico, apresentando, assim, uma

morfologia bastante porosa e, consequentemente, uma taxa de liberação do fármaco maior.

Hiemstra e colaboradores (2006) observaram reologicamente que triblocos de PLLA-

PEG-PLLA e PDLA-PEG-PDLA formaram hidrogéis em concentrações mais baixas que os

respectivos diblocos, forneceram uma gelificação mais rápida e maior módulo de

armazenamento devido ao aumento da densidade de ligações reticuladas, promovendo assim

um uso melhor dos triblocos como hidrogéis injetáveis para liberação de proteínas

terapêuticas in vivo, pois os mesmos são biodegradáveis.

Em trabalho posterior, Hiemstra e colaboradores (2007) estudaram a introdução de

diferentes proteínas, como lisozina, IgG e rhIL-2 nos hidrogéis estereocomplexos sintetizados

de PDLA-PEG e/ou PLLA-PEG. Concluíram na liberação in vitro, que a lisozina possuiu

cinética de primeira ordem com 90% de liberação em 10 dias, a IgG seguiu a cinética de

ordem zero com 50% de liberação em 16 dias e a proteína terapêutica rhIL-2 seguiu uma

cinética de ordem zero com liberação de 75% em apenas 7 dias. Estudos de liberação in vivo

perceberam que os sistemas contendo os hidrogéis estereocomplexos de PEG-PLA e a

proteína rhIL-2 promoveram uma taxa de liberação menor entre 1 a 2 semanas, em relação

aos sistemas contendo somente a proteína rhIL-2.

Copolímeros anfifílicos nos formatos de ABA e BAB de PLA (A) e PEG (B) também

foram estudados por He e colaboradores (2007) e foram capazes de formar nanomicelas (40-

200 nm) em meio aquoso e de serem utilizados como liberadores de fármacos hidrofóbicos

como paclitaxel, com eficiência de incorporação de 30 a 40%. Concluíram que a liberação

controlada-difusão é menor nos copolímeros de formato BAB e tal liberação é influenciada

pelo tamanho dos segmentos de PLLA, enquanto que o segmento PEG possuiu maior

influencia nas características físico-químicas das nanomicelas.

Lee e colaboradores (2008) observaram as propriedades de separação de fases na

superfície dos triblocos e diblocos constituídos por PLLA. Concluíram que os triblocos são

mais capazes de aumentar a estabilidade tridimensional e a atividade biológica de fármacos

macromoleculares hidrofílicos tais como proteínas e enzimas.

Fernanéz-Carbadilho e colaboradores (2008) observaram que a incorporação do PEG

em matrizes de PLA e de PLGA reduziu a temperatura de transição vítrea (Tg) do sistema

final polimérico, originando microesferas de superfície mais porosa que os homopolímeros.

Tais sistemas poderiam ser utilizados como liberadores de droga destinados à administração

parenteral.

Xu e colaboradores (2009) estudaram a possibilidade de encapsulamento de fármacos

como o paclitaxel (droga hidrofóbica) e doxorrubicina (droga hidrofílica) em nanofibras de

PEG-PLA. As propriedades de solubilidade delas nas nanofibras foram responsáveis por seus

comportamentos de liberação. A taxa de liberação da doxorrubicina foi mais rápida do que a

do paclitaxel. Embora o comportamento da liberação da doxorrubicina não fosse afetado pelo

paclitaxel, a taxa de liberação do paclitaxel foi acelerada pela presença da doxorrubicina. Os

resultados anticancerosos prometedores sugeriram que um único portador para a entrega da

multidroga possa ser útil no desenvolvimento do dispositivo copolimérico para a terapia.

Os trabalhos anteriormente citados evidenciam a utilização de monômeros originários

do ácido láctico e glicol etilênico para síntese de copolímeros no formato di e triblocos com

alto potencial de estudo científico e tecnológico, interesse da presente tese.

O Capítulo 2 apresentará o objetivo geral e os específicos da tese.

O Capítulo 3 mostrará a justificativa pertinente da presente tese.

O Capítulo 4 mostrará os fundamentos teóricos dos materiais envolvidos na síntese

dos copolímeros e do fármaco, do microencapsulamento e das técnicas de caracterização

utilizadas na presente tese.

O Capítulo 5 apresentará os materiais e os equipamentos envolvidos na síntese e na

caracterização dos copolímeros e microencapsulados, além de apresentar os métodos de

preparo dos mesmos.

O capítulo 6 mostrará os resultados das técnicas de caracterização dos materiais

desenvolvidos na presente tese, além de confrontar com resultados obtidos de outros

pesquisadores na área de Ciência de Materiais e Microencapsulamento.

O Capítulo 7 apresentará as conclusões da presente tese e o Capítulo 8, as sugestões

para trabalhos futuros.

Capítulo 2

objetivos

Objetivo Geral

Avaliar a utilização de copolímeros biodegradáveis de poli(l,l-lactídeo)-b-poli(glicol

etilênico)-b-poli(l,l-lactídeo) (PLLA-PEG-PLLA) como um sistema de proteção de fármacos

(no caso particular, a tetraciclina), possibilitando, no futuro, o uso de tais copolímeros como

sistemas de liberação de droga (Drug Delivery Systems - DDS).

Objetivos Específicos

Sintetizar os copolímeros triblocos de poli(l,l-lactídeo)-b-poli(glicol etilênico)-b-

poli(l,l-lactídeo) (PLLA-PEG-PLLA);

Realizar o microencapsulamento da tetraciclina nos copolímeros sintetizados pela

técnica de dupla emulsão com evaporação do solvente;

Caracterizar os copolímeros e os microencapsulados por Análise Térmica, tais como:

Termogravimetria (TG), Termogravimetria Derivada (DTG), Análise Térmica Diferencial

(DTA) e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).

Caracterizar os copolímeros e os microencapsulados por Difração de Raios X (XRD),

Espectrometria de Absorção na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier pelo

método Reflexão Total Atenuada (FTIR-ATR), Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) e

Microscopia Óptica (OM);

Avaliar a presença de micro-organismos (mesófilos aeróbios) nos copolímeros

sintetizados com metodologia proposta pela American Public Health Association (APHA);

Determinar o tamanho de partícula dos microencapsulados pela técnica de

Espalhamento de Luz Laser de Baixo Ângulo (LALLS);

Caracterizar os microencapsulados obtidos por Espectrometria de Ressonância

Magnética Nuclear (1H-NMR e

13C-NMR).

Capítulo 3

JUSTIFICATIVA

A indústria farmacêutica sintetiza novos fármacos e, em muitas vezes, devido a sua

estreita faixa terapêutica (ou devido ao seu caráter tóxico ou lábel), necessitam de dispositivos

para sua proteção e transporte através do organismo, ou seja, necessitam serem recobertos

para atravessar as diversas membranas do organismo sem serem degradados (FRISBEE,

COLLIN & McGINITY, 2000; BAJPAI et al., 2008).

Alguns sistemas de liberação de fármacos destinam-se a liberar o fármaco no

organismo de modo que seja absorvido com rapidez e completamente, enquanto outros devem

liberar o princípio ativo lentamente para que a ação do fármaco seja prolongada. Sendo assim,

um sistema de liberação prolongada objetiva eliminar as mudanças cíclicas na concentração

de fármaco no plasma, observada após a administração de um sistema de liberação

convencional, permitindo uma redução da freqüência de doses, justificando assim estudo

científico e tecnológico nessa área com intuito de melhorar a qualidade de vida humana.

Entre as diferentes estratégias disponíveis para alcançar um controle na liberação de

fármacos estão os sistemas copoliméricos, pois sua diversidade e versatilidade (caráter

anfifílico, biodegradabilidade, velocidade de degradação e características físicas e mecânicas)

atende as necessidades para um efeito terapêutico mais contínuo da droga, sendo capazes de

conduzir os fármacos a mucosa gastrintestinal e liberá-los aos sítios específicos de forma a

aumentar a eficiência e minimizar os efeitos tóxicos (BAE et al., 2000; LUCKE et al., 2000;

VILA et al., 2002).

Copolímeros anfifílicos constituídos por poli(l,l-lactídeo) (PLLA) e por poli(glicol

etilênico) (PEG) são exemplos interessantes para estudo cientifico e tecnológico pois o

poli(l,l-lactídeo) apresenta disponibilidade comercial, biocompatibilidade, facilidade de

síntese e biodegradabilidade e o poli(glicol etilênico) possui baixa toxicidade, solubilidade

em água, alta flexibilidade da cadeia, propriedade mucoadesiva e, principalmente, a

capacidade de promover estabilização estérea na superfície da nanopartícula quando em

solução aquosa.

Assim, a presente tese visa o desenvolvimento de copolímeros a base de PLLA e PEG

e de microencapsulamento de um fármaco (por exemplo, um antibiótico, a tetraciclina) neste

sistema copolimérico para liberação controlada bem como a caracterização físico-química

desses sistemas.

Capítulo 4

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

A síntese de copolímeros biodegradáveis e anfifílicos (polímero hidrofóbico +

polímero hidrofílico) contribui para o ramo da nanociência/nanotecnologia, pois os mesmos

podem se autoassociarem em microestruturas como micelas e podendo, assim, transportar

com segurança a droga até o alvo, ilustrado na Figura 4.1 (THORCHILIN, 2001; HARADA

& NAGASAKI, 2001).

Figura 4.1: Ilustração da autoassociação de copolímero anfifílico (micela) e sua relevância a liberação de droga.

(Fonte: KATAOKA, HARADA & NAGASAKI, 2001)

A síntese de copolímeros é mais favorável do que as misturas mecânicas conhecidas

como blendas, pois além de combinar as propriedades dos homopolímeros, propicia a

propriedades adicionais ao material por efeito sinergético. A copolimerização gera

macromoléculas capazes de se auto-organizar e a ligação covalente entre os blocos pode

promover a miscibilidade entre as partes não similares (JARRET et al., 2000; KUMAR et al.,

2007).

A copolimerização representa uma valiosa estratégia para preparar materiais

poliméricos (hidrogéis) com propriedades físico-químicas e biodegradabilidades ajustadas

com a composição química e cristalinidades dos segmentos que compõe o copolímero, Figura

4.2. As características de um copolímero dependem não só da concentração relativa e

propriedades das unidades repetitivas, mas também da microestrutura.

O conhecimento e o entendimento da ligação dessas variáveis (alterações de pH,

temperatura, solvente e força iônica) tornarão possível o planejamento de novos materiais

com combinações de propriedades (BAJPAI et al., 2001; KISSEL, LI & UNGER, 2002;

RIESS, 2003; HAN, NA & BAE, 2003; AAEMER et al., 2004).

Figura 4.2: Copolímeros: hidrogéis inteligentes, estímulo-resposta, liberação modulada da droga (círculos).

(Fonte: BAJPAI et al., 2001)

As variadas estruturas que podem formar copolímeros (bloco, alternado e estatístico),

poliésteres baseados em poli(ácido láctico) (PLA) suas formas emantioméricas (PDLA e

PLLA), poli(ácido glicólico) (PGA) e copolímero de poli(ácido láctico-co-ácido glicólico)

(PLGA), são os melhores biomateriais para projetos na área biomédica, especialmente em

ortopedia e liberação controlada de drogas em função das características de

biocompatibilidade, degradação e reabsorção em meio aquoso (REZENDE & DUEK, 2003;

MALLARDÉ et al., 2003; KIM & PARK, 2004; MATSUMOTO et al., 2005; MOTTA &

DUEK, 2006; KIM, CHUNG & PARK, 2006; HONG, REIS & MANO, 2008).

As próximas seções deste capítulo apresentarão uma revisão bibliográfica dos

homopolímeros (PLLA e PEG) que formam o copolímero proposto, objeto de estudo desta

tese, além de apresentar a rota de síntese da copolimerização e a aplicação como sistemas de

liberação de droga (DDS).

4.1 PLA - Poli(ácido láctico)

Ácido láctico (ácido 2-hidroxipropanóico) é um ácido orgânico encontrado em vários

produtos de origem animal. Desde a década de 60 do século passado, as vantagens desse

material na área médica foram pesquisadas e reveladas e, em seguida, a fabricação desses

polímeros foi realizada em escala industrial.

A Figura 4.3 apresenta o ciclo de vida do polímero de ácido láctico, tal monômero

pode ser reproduzido tanto por processos de fermentação quanto pelas rotas químicas;

entretanto, a primeira opção ainda é mais adotada por sua simplicidade e baixo custo. A

fermentação ocorre normalmente em processos por bateladas ou contínuos e os parâmetros

importantes na fermentação são valores de pH, temperatura, atmosfera e em alguns casos,

agitação. Após o processo de fermentação, em muitos casos, o ácido lático obtido é purificado

para uma polimerização seguinte, gerando o poli(ácido láctico) (PLA) por policondensação

(PC) (JACOBSEN et al., 2000; GUPTA & KUMAR, 2007).

Figura 4.3: Ilustração do ciclo de vida do PLA. (Fonte: GUPTA & KUMAR, 2007)

O processo de biodegradação e bioadsorção dos poli( -hidroxi ácidos) é descrito na

literatura como uma sucessão de eventos (restante do ciclo apresentado na Figura 4.3).

Inicialmente, exposto ao meio aquoso, o material sofre hidratação. Com a presença das

moléculas de água, o processo de degradação dá-se através da hidrólise das ligações ésteres,

originando produtos na forma de oligômeros (ou monômeros) solúveis e não tóxicos. A

degradação prossegue por um processo biologicamente ativo (por enzimas) ou pela clivagem

hidrolítica passiva, sendo caracterizada pela perda de massa, diminuição de massa ponderal

média e pela perda de suas propriedades mecânicas (METTERS, ANSETH & BOWMAN,

2000; EDLUND & ALBERTSSON, 2003; DENG et al., 2007; GUPTA & KUMAR, 2007).

A taxa de degradação é influenciada por fatores de configuração estrutural, como grau de

copolimerização, cristalinidade, massa molar, morfologia, quantidade de monômero residual e

porosidade.

A bioadsorção pelo organismo ocorre quando a biodegradação gera produtos e

subprodutos com características dos metabólitos orgânicos, especialmente os ácidos do ciclo

de Krebs. Para os PLAs, ao terminar a hidrólise do material, a degradação segue o processo de

oxidação do ácido láctico, que por sua vez são convertidos em ácido pirúvico. Na presença da

acetil coenzima A, ocorre liberação de CO2 e, consequentemente, a decomposição em citrato,

que ao ser incorporado no ciclo de Krebs, resultará na formação de CO2 e H2O, podendo sua

eliminação ser feita através da urina, fezes e da respiração. Nenhuma quantidade significativa

de acumulo de resíduos da degradação é encontrada em órgãos vitais. O material foi então

absorvido e eliminado (EDLUND & ALBERTSSON, 2003; DENG et al., 2007; GUPTA &

KUMAR, 2007).

Tais polímeros são derivados de monômeros produzidos pelo metabolismo do corpo

humano, a degradação desses materiais é segura para usos „in vivo‟. Muito embora o PLGA

seja utilizado e considerado como o mais importante dos polímeros biodegradáveis, o

aumento da acidez local devido a sua degradação pode levar a uma irritação durante sua

utilização. Em implantes de PLGA, tem-se estudado o uso de sais básicos para controlar o pH

no meio local (MURAKAMI et al., 2000; KRICHELDORF, 2001).

O ácido láctico contém um carbono assimétrico, o qual é descrito tipicamente na

forma D ou L, em termo de isomeria clássica, apresentados na Figura 4.4. Esses

homopolímeros, PDLA e PLLA, apresentam propriedades físico-químicas semelhantes, são

opticamente ativos em relação ao feixe de luz polarizada, enquanto que o PLA racêmico tem

características bastante diferentes. Por exemplo, as temperaturas de transição vítrea (Tg) de

ambos são em torno de 60ºC, mas PLLA apresenta uma cristalinidade elevada com seu ponto

de fusão, Tm de 170ºC; enquanto o PLA racêmico é completamente amorfo (SÖDERGÅRD &

STOLT, 2002).

Figura 4.4: Formas isoméricas do ácido láctico. (Fonte: GUPTA & KUMAR, 2007)

As propriedades de polímeros baseados em ácido láctico variam dependendo dos

estereoisómeros. Tais polímeros podem ser fabricados por diversas rotas e a nomenclatura dos

mesmos se difere por tais rotas de síntese. Polímeros derivados do ácido láctico pela

policondensação (PC) são geralmente definidos como poli(ácido láctico) (PLA), enquanto os

que são preparados por polimerização via abertura de anel (ring opening polimerization-

ROP) são chamados polilactídeos (Figura 4.5).

Figura 4.5: Síntese de PLLA por polimerização de abertura de anel (ROP). (Fonte: GUPTA & KUMAR, 2007)

Devido aos dois estereoisômeros do ácido láctico, o lactídeo opticamente ativo

correspondente pode ser encontrado em duas formas diferentes, isto é, D,D-lactídeo e L,L-

lactídeo (Figura 4.6). Além disso, o lactídeo pode ser formado por uma molécula de D- e

outra de L- ácido láctico, formando o D,L-lactídeo (meso-lactídeo), Figura 4.6. O aumento da

cristalinidade pode ser manipulado também pela adição de uma tensão de orientação,

induzindo a aproximadamente 10ºC acima de sua temperatura de transição vítrea (Tg)

reorientando as cadeias durante o processamento do material (LIM, AURAS & RUBINO,

2008).

Figura 4.6: Diferentes isômeros de lactídeo. (Fonte: GUPTA & KUMAR, 2007)

A preparação dos polímeros baseados em ácido láctico pela ROP pode ser realizada

em polimerização em solução, em massa ou em suspensão. O mecanismo envolvido em ROP

pode ser reação iônica ou inserção por coordenação dependendo do sistema do catalisador

usado. Diversos tipos de catalisadores foram testados ao longo do tempo: compostos

metálicos de estanho (II), alumínio, zinco, potássio e outros (BHAW-LUXIMON et al., 2001;

D‟ANGELO et al., 2001; HELWIG et al., 2001; PRICE, LENZ & ANSELL, 2002).

Entre eles, 2-etil-hexanoato de estanho, Sn(Oct)2, é o mais utilizado, pois ele é aceito

pelo FDA (Food and Drug Administration) para fins alimentícios e médicos em inúmeros

países. Assim, o Sn(Oct)2 é facilmente encontrado comercialmente para síntese do poli (ácido

láctico) para usos em área médica. Além disso, esse catalisador apresenta solubilidade em

solventes orgânicos e em monômeros de ésteres cíclicos, facilitando a reação. O sistema

reativo do l,l-lactídeo com o Sn(Oct)2 gera produtos de alta massa molar com baixa taxa de

racemização, consequentemente, melhorando as propriedades mecânicas dos polilactídeos

(KRICHELDORF, KREISER-SAUNDERS & BOETTCHER, 1995; DONG et al., 2001;

BHATTARAI et al., 2003; KANG & LEROUX, 2004; REN et al., 2005; AGRAWAL et al.,

2006; WANG et al., 2007; McINNES et al., 2009).

4.2 PEG - Poli(glicol etilênico)

O polímero poli(glicol etilênico), mais popularmente conhecido como poli(etileno

glicol), PEG, é um poliéter neutro de estrutura linear ou ramificada, solúvel em água e na

maioria dos solventes orgânicos (Figura 4.7).

Figura 4.7: Esquema de reação de síntese do poli(glicol etilênico). (Fonte: CHENG et al., 2006)

PEG possui uma variedade de propriedades aplicáveis na área biomédica e biotécnica

(TOBIO et al., 2000; HUH, CHO & PARK, 2003; DENG et al., 2005). Isso porque o PEG é

raramente efetivo para excluir outros polímeros quando estão presentes num ambiente aquoso.

Essa propriedade mostra-se na sua conjugação com proteínas e na formação de sistemas

bifásicos com outros polímeros. A Figura 4.8 apresenta a aplicação desta conjugação em

copolímero dibloco PEG/PLA desenvolvido por OTSUKA e colaboradores (2000) ilustrando

a importância do PEG que forma um sítio de imobilização para moléculas funcionais.

Figura 4.8: Representação esquemática da aplicação do PEG em copolímero dibloco PLA/PEG. (Fonte:

OTSUKA et al., 2000)

Além disso, o polímero é atóxico e não é prejudicial às atividades protéicas e

celulares, embora interaja com membranas celulares. O PEG também está sujeito às

modificações químicas e associações com outras moléculas, esse último afeta muito pouco

sua propriedade química original, porem controla sua solubilidade e aumenta o seu tamanho

de cadeia, dependendo da quantidade da cadeia adicional.

PEG também é chamado de poli(óxido de etileno), de um modo geral, o poli(glicol

etilênico) se refere aos de massa molar abaixo de 20.000, poli(óxido de etileno) se refere a

polímeros de massa molar mais elevada. O PEG é geralmente por uma iniciação aniônica com

pouca transferência de cadeia e terminação. Com o aumento da massa molar da cadeia,

aumenta a cristalinidade da estrutura e, consequentemente, a viscosidade torna-se mais

elevada, por isso, os PEGs que apresentam massa molar abaixo de 1000 g.mol-1

são líquidos

viscosos e incolores, os que apresentam massa molar acima desse valor são brancos e

quebradiços. O ponto de fusão do sólido é proporcional a sua massa molar e varia na faixa de

30ºC a 60ºC. Os PEGs utilizados em aplicações médicas e biotécnicas são os de massa molar

desde 200 até 20.000 g.mol-1

. Geralmente, quanto menor for a massa molar do PEG, maior é

sua solubilidade. A solubilidade do PEG em solventes orgânicos polares é boa, mas é pouco

solúvel em hidrocarbonetos e outros solventes com pouca polaridade (GREF et al., 2000).

PEGs são largamente utilizados em sistemas para liberação controlada de drogas (LI et

al., 2001) e em produtos cosméticos de cuidados pessoais, e aqueles com massa molar abaixo

de 4000 u.m.a. podem ser eliminados do organismo, sendo que 98% do seu total ingerido

pode ser excretado do corpo humano através da urina. Por último, a solução de PEG forma

um ambiente hospedável para a sobrevivência de células, demonstrando sua

biocompatibilidade e por isso, PEG é amplamente utilizado em cobertura de tecidos e também

na preservação de órgãos, sendo, por isso, considerado um biomaterial na área de médicina

hospitalar. Em resumo, as razões para a escolha do PEG como co-iniciador em copolímeros

incluem sua baixa toxicidade, solubilidade em água, alta flexibilidade da cadeia, propriedade

mucoadesiva e principalmente, a capacidade de promover estabilização estérea na superfície

do copolímero quando em solução aquosa (KIM et al., 2004; DENG et al., 2005; CHEN et

al., 2006; JACKSON et al., 2007; ZHU et al., 2007; PARK et al., 2007).

4.3 Síntese do tribloco PLLA-PEG-PLLA

A rota de inserção por coordenação, utilizando como catalisador o Sn(Oct)2, é a rota

mais importante para a obtenção de copolímeros derivados do l,l-lactídeo pois gera o menor

número de produto racêmico, logo é a mais utilizada industrialmente.

No mecanismo de inserção por coordenação acredita-se que duas etapas são

envolvidas. Em uma primeira etapa, Figura 4.9, o catalisador Sn(Oct)2 (acido forte de Lewis)

reage com compostos doadores de hidrogênio, coiniciador, gerando o alco-óxido de estanho,

considerado o verdadeiro iniciador da reação (KOWALSKI, DUDA & PENCZEK, 2000).

Figura 4.9: Formação do alco-óxido a partir do catalisador. (Fonte: KOWALSKI, DUDA & PENCZEK, 2000)

A copolimerização ocorre em uma câmara purgada em atmosfera inerte a fim de que

catalisador, monômero, co-iniciador e o meio reacional serem mantidos secos evitando

qualquer umidade no meio, pois traços de água poderão provocar reações laterais como:

1) competição com o coiniciador impedindo a formação do copolímero desejado (traços

de água levam a formação do homopolímero com baixa massa molar);

2) decomposição do catalisador a ácido, inativando-o. Durante a reação, em altas

temperaturas, o ácido formado, em presença de umidade, pode catalisar a hidrolise

do bloco poli(l,l-lactídeo) em formação.

Em uma segunda etapa, Figura 4.10, o monômero cíclico se insere entre a ligação –Sn-

OPEG, promovendo o crescimento da cadeia (etapa de propagação). Onde ocorre o

rompimento da ligação alquil-oxigênio não há o alto risco de racemização, pois a etapa

subseqüente (propagação), Figura 4.11, será a substituição em um carbono quiral nesta rota, a

associação do monômero e catalisador é seguido pelo rompimento da ligação acil-oxigênio

com baixo risco de racemização (KOWALSKI, DUDA & PENCZEK, 2000; RYNER et al.,

2001; STOREY & SHERMAN, 2002; JÉROME & LECOMTE, 2008).

Figura 4.10: Etapa da abertura do anel l,l-lactídeo e propagação da cadeia. (Fonte: KOWALSKI, DUDA &

PENCZEK, 2000)

O aumento da concentração do coiniciador resulta em polímeros com massas molares

reduzidas. KOWALSKI, DUDA & PENCZEK (2000) atribuíram este comportamento ao

duplo papel desempenhado pelo coiniciador (PEG), Figura 4.11, na formação do verdadeiro

iniciador e como agente de transferência. Na ausência de reação de transferência o Mn do

polímero cresce linearmente com a conversão do monômero. Transferências reduzem a massa

molar e aumentam a polidispersidade do copolímero final apresentado na Figura 4.12,

copolímero tribloco anfifílico de PLLA e PEG.

Figura 4.11: Coiniciador como possível agente de transferência. (Fonte: KOWALSKI, DUDA & PENCZEK,

2000)

Figura 4.12: Copolímero Tribloco PLLA-PEG-PLLA. (Fonte: KOWALSKI, DUDA & PENCZEK, 2000)

4.4 Tetraciclina

A tetraciclina, Figura 4.13, pertence ao grupo de antibióticos usados no tratamento

das infecções bacterianas e é caracterizada pelo esqueleto do octaidronaftaceno, sistema

formado de quatro anéis cíclicos condensados. A tetraciclina é transportada de forma ativa

para dentro da célula bacteriana, onde se concentram cerca de 50 vezes e é específica às

bactérias porque as células de mamífero são incapazes de transportar a tetraciclina para o seu

interior.

Figura 4.13: Estrutura química da tetraciclina. (Fonte: BROOKS, BUTEL & MORSE, 2009)

A tetraciclina inibe a síntese protéica nas bactérias por bloquearem a ligação do

aminoacil-RNAt ao site A da subunidade 30S ribossomal, além disso, a tetraciclina é

bacteriostática porque a ligação da mesma aos ribossomas é fraca e reversível. Tal antibiótico

é eficaz no tratamento de infecções por Mycoplasma pneumoniae, cólera, Rickettsias,

Brucelose, uretrite por Chlamydias, gonorréias, infecção do trato urinário e acne, além se ser

utilizada no tratamento da doença de Lyme, causada pela Borrelia burgdorferi e não deve ser

usada em combinação com antibióticos que atuem sob células em crescimento ativo (ex.

penicilinas). Os mecanismos de resistência à tetraciclina são: o aumento do fluxo do

antibiótico da célula bacteriana, a proteção ribossomal e a modificação química da tetraciclina

(BROOKS, BUTEL & MORSE, 2009).

http://pt.wikipedia.org/wiki/Antibi%C3%B3tico

4.5 Microencapsulamento

A técnica de microencapsulamento teve sua origem no modelo celular. Neste modelo,

a membrana celular externa atua como um microrreservatório que envolve e protege o

citoplasma e demais componentes celulares de agressividades do meio. Além disso, a

membrana celular seleciona os nutrientes para interior das células, controla a condução

nervosa, o transporte de energia e outras funções de sobrevivência da célula. (KAWASHINA,

2001; YUAN et al., 2003).

Estruturas biológicas, como micelas, vesículas e bicamadas (Figura 4.14), são

formadas a partir da autoassociação de estruturas primárias anfifílicas, particularmente a partir

de lipídeos. A autoassociação (Self-Assembly) é a organização autônoma dos componentes do

sistema em estruturas ou padrões sem a intervenção humana. Este fenômeno ocorre em

qualquer escala: desde a escala molecular à escala planetária. O processo é reversível e

espontâneo (DEAMER, 1998).

Figura 4.14: Estruturas biológicas formadas a partir da autoassociação. (Fonte: DEAMER, 1998)

A autoassociação molecular pode ser de duas possibilidades: a intramolecular

(exemplo: estruturas secundária e terciária de uma proteína) e intermolecular (exemplo:

estrutura quaternária da proteína, micelas). As estruturas organizadas já formadas por

associação podem ainda formar novas estruturas ou padrões, dando origem à autoassociação

micro e macroscópica. A vida só é possível graças à autoassociação molecular, ilustrada na

Figura 4.15.

Figura 4.15: Ilustração da conseqüência da autoassociação: a origem da vida. (Fonte: DEAMER, 1998)

Os motivos que fazem com que as moléculas se autoassociem de forma espontânea

são: a atração promovida por forças intermoleculares, a minimização da energia interfacial, as

características anfifílicas da estrutura molecular e o efeito hidrofóbico. (DEAMER, 1998).

A estrutura resultante da agregação das moléculas anfifílicas (micelas, vesículas,

bicamadas) dependerá de fatores relacionados à geometria da molécula surfatante (balanço

entre os grupos hidrofílico e lipofílico), ao meio onde essas moléculas se encontram, pH,

temperatura, concentração da solução biológica e concentração de eletrólitos em solução,

variações nestas condições podem levar a transformações interestruturais (DEAMER, 1998;

SOLARO, 2002; NGYUEN et al., 2008).

Copolímeros anfifílicos tribloco do tipo A-B-A, com um bloco central hidrofílico (B)

e duplamente ligado a cadeias hidrocarbônicas (A), em meio aquoso biológico, se

autoassociam em estruturas diferenciadas „biocamadas‟, formando assim as áreas de corona e

núcleo do sistema final (Figura 4.16), em que a liberação do fármaco somente ocorre na

célula-alvo, as estratégias de encapsulação: funcionalização da corona e reconhecimento

molecular (Figura 4.17) (DEAMER, 1998; KAWAGUCHI, 2000).

Figura 4.16: Ilustração da formação da corona e núcleo na autoassociação dos copolímeros triblocos de formato

A-B-A. (Fonte: DEAMER, 1998)

Figura 4.17: Estratégia de encapsulação: liberação do fármaco na célula-alvo. (Fonte: DEAMER, 1998)

Tipicamente, a terapia com droga requer dosagens periódicas do agente terapêutico

modelado de maneira a assegurar uma concentração adequada no plasma sanguíneo.

Entretanto, alguns fármacos possuem uma faixa terapêutica muito estreita, requerendo assim,

que sejam entregues diretamente em alvo especifico do organismo ou, em pequenas dosagens

periódicas por longos tempos de administração. Em tais casos, um método contínuo de

liberação é necessário para manutenção do nível terapêutico ótimo da droga no plasma

sanguíneo e para otimização do seu efeito terapêutico.

O efeito terapêutico compreende em: administração fácil e segura (sem reações

inflamatórias locais), necessidade de menor numero de dosagens periódicas, direcionamento

da droga a alvos específicos e a liberação controlada de droga mantendo-se a concentração

dentro do limite terapêutico ótimo por longo período (SOPPIMATH et al., 2001; REIS et al.,

2006; YIN & YATES, 2009).

A Figura 4.18 compara a forma tradicional de dosagem: a droga dispersa em

expediente solúvel, e a dosagem por sistemas de liberação controlada e as drogas

encapsuladas em microrreservatórios poliméricos. Nos dispositivos tradicionais de dosagem a

concentração de drogas, no sistema sanguíneo alterna entre baixas e altas concentrações,

sendo o nível terapêutico ótimo brevemente alcançado. Dispositivos de última geração

controlam a concentração da droga no nível terapêutico ótimo de forma quase continua. Vale

ressaltar que a Figura 4.18 apresenta uma polêmica, pois a curva pontilhada referente a „dose

única‟ ultrapassa, em um determinado tempo, a concentração limite do fármaco no organismo,

atingindo, assim, o nível tóxico (nível indesejável) da droga no organismo humano (HENCH

& POLAK, 2002; BAJPAI et al., 2008).

Figura 4.18: Ilustração esquemática da ilustração de liberação de droga. (Fonte: BAJPAI et al., 2008)

Existem algumas características comuns, que são requeridas pela maioria das rotas,

como a possibilidade de formar dispositivos (micro ou nano), a biocompatibilidade, a

biodegradabilidade e a facilidade de eliminação após a entrega do fármaco. O tamanho

reduzido é uma característica fundamental para o dispositivo e entrega. O dispositivo deve ser

biocompatível, isto é, deve despertar resposta adversa (inflamatória, alérgica e imunológica)

mínima dos tecidos biológicos (KIM, CHO & YUK, 2001; PALMIERI et al., 2002).

A via oral é a rota de administração mais fácil, barata e segura e conveniente. Os

principais obstáculos à obtenção do ótimo nível terapêutico da droga, quando da

administração oral são a instabilidade dos DDS, no fluido gastrintestinal o baixo transporte

através da mucosa intestinal e a rápida eliminação destes após alcançar o sistema circulatório.

Porém a incorporação dos fármacos em dispositivos poliméricos com propriedade

mucoadesiva, cadeias de PEG, penetram através da interface partícula/mucosa devido ao

efeito mucoadesivo. O caráter hidrofílico da superfície do DDS é uma ferramenta utilizada

para redução da velocidade de eliminação total e consequentemente aumentar o tempo de

permanência dos DDS‟s no sistema sanguíneo (SCHAFFAZICK et al., 2003; LIU, BURGER

& CHU, 2003; SUDHAKAR et al., 2006; TANG & SINGH, 2008).

A técnica de microencapsulamento pela evaporação solvente é aplicada extensamente

em indústrias farmacêuticas para obter a liberação controlada do fármaco. As microesferas

obtidas do copolímero com droga encapsulada podem degradar e liberar a mesma lentamente

com um perfil específico da liberação.

Esta liberação controlada da droga tem benefícios clínicos proeminentes: diminuição

da frequencia de dose, mais conveniência e aceitação para pacientes, e droga mais direcionada

às posições específicas com resultado uma eficiência mais elevada. A escolha do método que

causará uma encapsulagem eficiente da droga depende da hidrofilicidade ou da

hidrofobicidade da droga (FREITAS, MERKLE & GANDER, 2005; LI, ROUAUD &

PONCELET, 2008).

Para drogas insolúveis ou pouco solúveis em água, o método óleo-em-água (oil-in-

water, o/w) é usado freqüentemente. Este método é o mais simples e os outros métodos

derivam-se deste. Consiste em quatro etapas principais (Figura 4.19):

(1) dissolução da droga hidrofóbica em um orgânico solvente que contem o polímero;

(2) emulsificação desta fase orgânica, chamada fase dispersada, em uma fase aquosa

chamada fase contínua;

(3) extração do solvente da fase dispersa por evaporação do solvente, as gotas de

transformação da fase dispersada em partículas sólidas contínuas;

(4) recuperação e secagem das microesfera para eliminar o solvente residual.

Figura 4.19: Passos básicos do microencapsulamento por evaporação do solvente. (Fonte: LI, ROUAUD &

PONCELET, 2008).

O método acima mencionado não é apropriado para a encapsulagem de drogas

hidrofílicas. Há duas razões principais: (1) a droga hidrofílica não pode ser dissolvida no

solvente orgânico; (2) a droga difundirá na fase contínua durante a emulsão, conduzindo a

uma grande perda dessa. Outros quatro métodos alternativos propõem e tornam

consequentemente possível o encapsulamento de drogas hidrofílicas, são eles:

1. O método de dupla emulsão (water-in-oil-in-water, w/o/w) (utilizado na presente

qualificação): a solução aquosa da droga hidrofílica é emulsificada em uma fase orgânica

(copolímero + solvente orgânico), esta emulsão é dispersa então em uma segunda solução

aquosa (solução de um surfatante) que dá forma a uma segunda emulsão (dupla emulsão,

w/o/w);

2. O método do cosolvente óleo/água (oil-water, o/w): quando a droga não é solúvel

no solvente orgânico principal, um cosolvente chamado de segundo solvente é necessário para

dissolver a droga;

3. O método de dispersão óleo/água (o/w): a droga é dispersa na forma de pó na

solução de polímero e de solvente orgânico;

4. O método de evaporação de solvente não aquoso (oil-oil, o/o): a fase aquosa é

substituída pelo óleo (tal como óleo mineral).

Na fase dispersa existem os polímeros/copolímeros e o solvente. Na fase contínua

existe o surfatante. Os copolímeros de ácidos lácticos e glicólicos são os mais utilizados de

um modo geral para desenvolver os sistemas de liberação da droga, pois são os mais seguros e

aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration). São degradáveis pela hidrólise de seus

componentes, que são produtos metabólicos usuais.

Para a técnica do microencapsulamento por evaporação do solvente, um solvente

apropriado deve encontrar os seguintes critérios: (1) dissolver o polímero escolhido; (2) ser

insolúvel na fase contínua; (3) ter uma volatilidade elevada e um baixo ponto de ebulição; (4)

ter baixa toxicidade (FREITAS, MERKLE & GANDER, 2005; LI, ROUAUD &

PONCELET, 2008). O diclorometano é o solvente mais comum para encapsulamento pela

técnica de evaporação devido a elevada volatilidade, baixo ponto de ebulição e alta

insolubilidade em água e foi utilizado no presente estudo.

Na fase contínua, o surfatante (tensoativo) apropriado deve fornecer a microesfera um

tamanho regular e uma distribuição de tamanho pequena, garantindo uma liberação estável da

droga. Antes de escolher o tipo de surfatante e de sua concentração, é importante conhecer a

polaridade das duas fases imiscíveis, do tamanho desejado dos microencapsulados e a

demanda da esfericidade dos mesmos (FREITAS, MERKLE & GANDER, 2005; LI,

ROUAUD & PONCELET, 2008).

Os surfatantes para as emulsões são anfifílicos. Isso significa que uma porção da

molécula tem mais afinidade aos solutos polares tais como a água (parte hidrofílica) e a outra

parte têm mais afinidade aos solutos apolares tais como os hidrocarbonetos (parte

hidrofóbica). Há quatro tipos diferentes de surfatantes na natureza: aniônico, catiônico,

anfótero e não-iônico (FREITAS, MERKLE & GANDER, 2005; LI, ROUAUD &

PONCELET, 2008). O surfatante não-iônico poli(ácido vinílico) (PVA) é o mais usado pois

fornece microesferas menores e o mesmo foi utilizado no presente estudo.

4.6 Métodos de Caracterização

Nenhuma técni

universidade federal do rio de janeiro aline ...epqb.eq.ufrj.br/download/microencapsulados...escola...

Documents