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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
CAMPUS UNIVERSITÁRIO MINISTRO PETRÔNIO PORTELA
PRO-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Sistemas de vetorização/liberação de extratos vegetais em modelos experimentais
de enfisema pulmonar
RAFAEL LEITE DANTAS
Teresina - Piauí
2014
2
RAFAEL LEITE DANTAS
Sistemas de vetorização/liberação de extratos vegetais em modelos experimentais
de enfisema pulmonar
Dissertação submetida à Coordenação do Curso
de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal do Piauí, como
requisito para a obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Lívio César Cunha Nunes
Coorientadora: Profa. Dra. Maria das Graças
Freire de Medeiros
Teresina – Piauí
2014
ii
3
RAFAEL LEITE DANTAS
SISTEMAS DE VETORIZAÇÃO/LIBERAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS
EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE ENFISEMA PULMONAR
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação
em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Piauí,
como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Aprovada em: ____/____/____
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Prof. Dr. Lívio César Cunha Nunes
Curso de Farmácia- Universidade Federal do Piauí (Orientador)
________________________________________________
Prof. Dr. Davyson de Lima Moreira
Departamento de Produtos Naturais de Farmanguinhos - Fundação Oswaldo Cruz
(Examinador Externo)
________________________________________________
Prof. Dr. Edson Cavalcanti da Silva Filho
Curso de Ciências dos Materiais - Universidade Federal do Piauí
(Examinador Interno)
Teresina – Piauí
2014
iii
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
REITOR
Prof. Dr. José Arimatéia Dantas Lopes
VICE-REITORA
Profa. Dra. Nadir do Nascimento Nogueira
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Pedro Vilarinho Castelo Branco
DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Profa. Dra. Regina Ferraz Mendes
VICE-DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Profa. Dra. Lina Gomes Santos
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Paulo Michel Pinheiro Ferreira
VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Rivelilson Mendes de Freitas
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“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém
viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou
sobre aquilo que todo mundo vê.”
Arthur Schopenhauer
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6
Dedicatória
Dedico esta dissertação, bem como todas as minhas
demais conquistas, a Deus, aos meus avós (José, Rita,
Nilton e Josete), aos meus pais (Manuel e Josinete),
aos meus irmãos (Daniel e Clívia – amo muito
vocês!), aos meus sobrinhos (Gabriel, Mariana e
Manuela), aos meus tios (Cláudia, Darlene, Roberto,
Rita, Alberto, Alice, Sara e Vicente) e aos meus
primos (André, Henrique, Diogo, Bruna, Daniela,
Lucas, Samuel e Júlia – nunca esquecerei as nossas
brincadeiras e os nossos momentos de alegria!).
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Agradecimentos
Ao meu orientador Prof. Dr. Lívio César Cunha Nunes que, muito mais do que
ensinar como trabalhar em laboratório, acompanhar alunos de graduação, ministrar
aulas, desenvolver projetos e redigir artigos e patentes, me ensinou sobre a vida;
Ao Prof. Wellington dos Santos Alves, que desde a graduação me orienta nas
pesquisas do sistema respiratório (que esta parceria e amizade se perpetuem!);
Aos professores Dr. Rivelilson Mendes de Freitas e Dra. Ana Amélia de
Carvalho Melo Cavalcante que, sempre que solicitados, disponibilizaram reagentes e
equipamentos imprescindíveis para a realização deste trabalho;
Aos professores Dr. Stanley Juan Chavez Gutierrez, Dr. Giovanny Rebouças
Pinto, Dra. Lécia Maria da Silva Freire e, em especial, a Dra. Maria das Graças
Freire de Medeiros, pela amizade e colaborações;
Aos mestrandos Érik Reis, Sean Telles, Rusbene Bruno, George Oliveira,
Antônio Luis, Paula Batista, Antonia Amanda, Giselle Zayra, Laisa Lis e Vânia
Lima, pela amizade e colaborações;
Aos graduandos Laynne Leal, Neylon Campelo, José Júnior, Khetyma
Fonseca, Mariana Soares, Amanda Goudinho e Laís Iasmin, foi um prazer ter vocês
ao meu lado!;
Aos integrantes do GEUM, do LAPNEX e do NTF. Em especial, a equipe de
limpeza e manutenção Maria Francisca Silva, Orlando Cardoso, Ary dos Santos,
Francisco Sena e Maria Ivelta Campos, pela ajuda em todos os momentos;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq,
a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES e a
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Piauí - FAPEPI, pelo auxilio a minha
formação científica com concessão de bolsas e financiamento de projetos;
vii
8
À Coordenação do Mestrado em Ciências Farmacêuticas, nas pessoas do
coordenador Dr. Paulo Michel Pinheiro Ferreira e dos secretários Rusniel Fonseca e
Suyanne Kassia, pela presteza que sempre fui recebido e pela atenção a mim dada;
Aos animais que fizeram parte desta pesquisa e que, inconscientemente, doaram
o material para que essa pesquisa tenha sido realizada.
Muito obrigado.
viii
9
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS xi
LISTA DE ILUSTRAÇÕES xiii
LISTA DE TABELAS xv
RESUMO xvi
ABSTRACT xvii
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 18
2. OBJETIVOS....................................................................................................... 19
2.1 Objetivo Geral.................................................................................................... 19
2.2 Objetivos Específicos......................................................................................... 19
3. REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 20
3.1 A DPOC e o enfisema pulmonar........................................................................ 20
3.2 Mecanismos patogênicos associados ao enfisema.............................................. 21
3.2.1 A ceramida e a apoptose celular...................................................................... 21
3.2.2 Fator de crescimento placentário..................................................................... 22
3.2.3 Prothymosin α.................................................................................................. 23
3.2.4 Receptor toll like 4 e a IL-17........................................................................... 24
3.2.5 Fibrilina-1........................................................................................................ 25
3.2.6 Proteína D do surfactante................................................................................ 26
3.3 Alternativas terapêuticas relevantes para o enfisema pulmonar........................ 26
3.4 Fitoterapia no enfisema: o guaco....................................................................... 28
3.5 Mikania glomerata Spreng................................................................................. 29
3.5.1 Família, gênero e morfologia.......................................................................... 29
3.5.2 Atividade farmacológica................................................................................. 30
3.5.3 Segurança do extrato da M. glomerata........................................................... 32
3.6 Entrega de formulações por via pulmonar......................................................... 32
3.7 Planejamento e otimização de experimentos..................................................... 33
3.7.1 Planejamento fatorial...................................................................................... 33
3.8 Perspectivas para o enfisema pulmonar: biomarcadores e células-tronco....... 34
REFERÊNCIAS...................................................................................................... 36
ix
10
4. CAPÍTULO I: Modelo animal de enfisema pulmonar: papaína pulverizada ou
fumaça de cigarro?...................................................................................................
47
Resumo..................................................................................................................... 48
Abstract.................................................................................................................... 49
Introdução................................................................................................................ 50
Materiais e métodos................................................................................................. 51
Resultados e discussões............................................................................................ 55
Conclusão................................................................................................................. 63
Referências............................................................................................................... 65
5. CAPÍTULO II: Mikania glomerata Spreng.: Desenvolvimento de uma
formulação para entrega pulmonar..........................................................................
70
Resumo..................................................................................................................... 71
Abstract.................................................................................................................... 72
Introdução................................................................................................................ 73
Materiais e métodos................................................................................................. 75
Resultados e discussões............................................................................................ 80
Conclusão................................................................................................................. 89
Referências............................................................................................................... 91
6. CAPÍTULO III: Avaliação do efeito da Mikania glomerata Spreng. ao ser
pulverizada no pulmão de animais com enfisema induzido por papaína................
97
Resumo..................................................................................................................... 98
Abstract.................................................................................................................... 99
Introdução................................................................................................................ 99
Materiais e métodos................................................................................................. 101
Resultados e discussões............................................................................................ 104
Conclusão................................................................................................................. 111
Referências............................................................................................................... 112
CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................. 115
PRODUÇÃO CIENTÍFICA E TECNOLÓGICA............................................... 116
ANEXOS
x
11
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
®
Marca registrada
ANOVA Análise de variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AHE Ágar enteric hecktoen
AP-1 Fator de transcrição AP-1
APT Água peptonada
CD Células dendríticas
CEP Células epiteliais do pulmão
CG Cromatografia gasosa
CONCEA Conselho nacional de controle de experimentação animal
CRD Carboidratos C-terminal
DNA Ácido desoxirribonucléico
DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica
DPPH• Radical livre estável 1,1-difenil-2-picrilhidrazil
eONS Isoformas III da óxido nítrico sintetase
EPM Erro-padrão da média
EPP Elastase pancreática de porco
ERO Espécies reativas de oxigênio
FECGH Fator estimulador de colônias de granulócitos humanos
FCEV Fator de crescimento do endotélio vascular
FCH Fator de crescimento de hepatócitos
FCP Fator de crescimento placentário
FN-kβ Fator nuclear kappa β
FNT Fator de necrose tumoral
FPF Fração de partícula fina
HATs Histonas acetiltransferases
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
IL Interleucina
iONS Isoformas II da óxido nítrico sintetase
JNK Via c-Jun N-terminal quinase
xi
12
LBA Lavado broncoalveolar
LIA Ágar lisina ferro
LST Caldo Lauril Sulfato Triptose
LTB4 Leucotrieno B4
MMP Matriz metaloproteinase
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
Nox Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidase
ON Óxido nítrico
ONS Óxido nítrico sintetase
PBS Solução Salina Fosfatada Tamponada
PEG Polietilenoglicol
PCA Ágar padrão para contagem
PCB Proteína CREB-binding
PLGA Poli (L- ácido láctico-co-ácido glicólico)
PNS Polimorfismo de nucleotídeo simples
PQAM Proteína quinase ativada por mitógeno
PQM Proteína quimiotática de monócitos
ProT Prothymosin α
PT2 Pneumócitos tipo II
REDOX Redução/oxidação
RNA Ácido ribonucleico
ROIs Intermediários reativos de oxigênio
RRPC Receptor de resposta precoce ao crescimento
RTL Receptor toll like
RTL4-
Nocaute gênico do RTL4
SP Proteína do surfactante
SS Ágar salmonella-shigela
Th Células T helper
TGF Fator de transformação de crescimento
TSI Ágar três açúcares ferro
UFC Unidade de formação de colônias
VEF1 Volume expiratório forçado em um segundo
xii
13
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Revisão
Ilustração 1
Figura - Características do enfisema pulmonar........................ 20
Ilustração 2 Figura – Mikania glomerta Spreng........................................... 29
Ilustração 3
Figura - Estrutura química da cumarina, 2H-1benzopiran-2-
ona............................................................................................
31
Ilustração 4
Estrutura química do ácido caurenóico..............................................
31
Capítulo I
Ilustração 1 Figura - Ooforectomia das ratas................................................ 52
Ilustração 2
Figura - Modelos de enfisema com cigarro e papaína..............
53
Ilustração 3
Figura - Lavado broncoalveolar................................................
54
Ilustração 4
Figura - Contagem total de células do LBA.............................
56
Ilustração 5
Figura - Contagem de neutrófilos do LBA...............................
57
Ilustração 6
Figura - Contagem de macrófagos do LBA.............................. 58
Ilustração 7
Figura - Contagem de linfócitos do LBA.................................. 59
Ilustração 8 Figura - Análise histopatológica dos experimentos realizados. 60
Ilustração 9
Figura - RX dos grupos avaliados.............................................
62
Capítulo II
Ilustração 1 Figura - Forma radicalar e não radicalar do DPPH................... 78
Ilustração 2
Figura - Rendimento das secagens por aspersão.......................
81
Ilustração 3 Figura - Teor de umidade das secagens por aspersão............... 83
Ilustração 4
Figura - Análise macroscópica dos extratos após seis meses
da secagem................................................................................
84
Ilustração 5
Figura - Análise da eliminação do radical DPPH.....................
86
Ilustração 6 Figura - Análise do teor de cumarina........................................ 87
xiii
14
Capítulo III
Ilustração 1 Figura - Laringoscópio artesanal, microspray e esquema de
pulverização..............................................................................
102
Ilustração 2
Figura - Lavado broncoalveolar................................................
103
Ilustração 3
Figura - Contagem total de células do LBA.............................
105
Ilustração 4
Figura - Sequência cronológica do recrutamento celular..........
106
Ilustração 5
Figura - Contagem de neutrófilos do LBA............................... 107
Ilustração 6
Figura - Contagem de macrófagos do LBA.............................. 108
Ilustração 7
Figura - Contagem de linfócitos do LBA.................................. 109
Ilustração 8 Figura - Análise histopatológica dos experimentos realizados. 110
xiv
15
LISTA DE TABELAS
Capítulo II
Tabela 1
Planejamento fatorial dos experimentos realizados 76
Tabela 2
Temperaturas de saída dos experimentos 85
xv
16
Sistemas de vetorização/liberação de extratos vegetais em modelos experimentais
de enfisema pulmonar. RAFAEL LEITE DANTAS. Orientador: Dr. Lívio César
Cunha Nunes. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Curso de Farmácia, UFPI, 2013.
RESUMO
O enfisema pulmonar é uma patologia com carência de estratégias de tratamento
eficazes. Como forma de tentar reverter esse cenário, o presente trabalho teve como
objetivo desenvolver uma formulação a partir da Mikania glomerata Spreng para o
tratamento dessa doença. Essa planta é amplamente utilizada no tratamento de alergias e
inflamações, particularmente do sistema respiratório. O efeito do tratamento com a M.
glomerata foi avaliado em um modelo animal de enfisema. Devido a algumas
desvantagens apresentadas nos modelos de enfisema em animais, fez-se uma adaptação
no modelo de enfisema com papaína e, então, o comparou com o modelo de enfisema
com inalação de fumaça de cigarro. Os resultados dos estudos com animais
evidenciaram que o modelo de enfisema com pulverização de papaína mostrou-se mais
adequado para o estudo isolado do enfisema do que o com cigarro. No modelo com
pulverização de papaína foi observado um maior recrutamento neutrofílico e destruição
parenquimatosa e uma menor quantidade de metaplasia de células caliciformes,
deposição de colágeno e muco. Na análise do efeito da castração sobre o
desenvolvimento do enfisema, não foram encontradas diferenças significativas. Dessa
forma, o modelo de enfisema com pulverização de papaína se mostra uma ferramenta
útil, particularmente, para o estudo de lesão proteolítica e inflamatória. A formulação
para o tratamento dos animais foi desenvolvida em um Spray dryer, pois esse fornece
pós com as características necessárias para a entrega pulmonar. No entanto, como esse
aparelho opera em altas temperaturas, uma formulação por liofilização foi desenvolvida
para servir de parâmetro. Para isso, foi realizado um planejamento fatorial para avaliar a
influência da temperatura de entrada e da percentagem de adjuvante de secagem. Na
análise de UV, utilizou-se a cumarina como marcador. Também foi avaliado a atividade
antioxidante, pelo método de eliminação do radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil
(DPPH•), e a analise microbiológica dos produtos acabados. Os resultados evidenciaram
uma perda de atividade antioxidante quando a secagem foi realizada com temperatura
de entrada de 170°C e a preservação das características físicas, a longo prazo, nos
extratos secos com 30% de Aerosil®
200 como adjuvante de secagem. Diante disso,
podemos concluir que o melhor método de secagem por aspersão utiliza 30% de
Aerosil®200 e uma temperatura de entrada de 140°C. Ficou evidente, ainda, que a
preservação do teor de cumarina no extrato seco por aspersão, se deve, provavelmente, a
microencapsulação promovida pelo Aerosil®200. Pôde-se constatar que a secagem por
aspersão e liofilização, mantiveram, estatisticamente, a mesma população
microbiológica. A utilização do extrato seco da M. glomerata no tratamento do
enfisema pulmonar mostrou-se muito eficiente, uma vez que houve uma diminuição
significativa no recrutamento neutrofílico e na contagem total de células. Outros
resultados evidenciaram um incremento, proporcional, no recrutamento de macrófagos
no grupo tratado com a planta, o que pode ocorrer devido a um acúmulo de extrato seco
de M. glomerata no pulmão. Dessa forma, existe a necessidade de otimizar algumas
características do extrato seco (como a biodegradabilidade) e a dose entregue sem,
contudo, afetar a eficácia de seu efeito terapêutico.
Palavras-chave: Enfisema pulmonar; Mikania glomerata; Modelos Animais;
Ovariectomia; Papaína.
xvi
17
Systems of vectorization/drug delivery of plant extract in experimental models of
pulmnary emphysema. RAFAEL LEITE DANTAS. Advisor: Dr. Lívio César Cunha
Nunes. Master’s dissertation. Post-Graduate Program in Pharmaceutical Sciences.
Center for Health Sciences. Pharmacy course, 2013.
ABSTRACT
Pulmonary emphysema is a disease with a lack of effective treatment strategies. In an
attempt to reverse this scenario, the present study aimed to develop a formulation from
Mikania glomerata Spreng for the treatment of this disease. This plant is widely used to
treat allergies and inflammation, particularly of the respiratory system. The effect of
treatment with M. glomerata was evaluated in an animal model of emphysema. Due to
some disadvantages of animal models of emphysema, was performed an adaptation in
the papain-induced experimental emphysema model and then compared it to the
cigarette smoke-induced emphysema model. The results of animal studies have shown
that the animal emphysema model with spraying papain was more suitable for the
isolated study of emphysema than the cigarette smoke-induced emphysema model. In
the spraying papain model was observed increased neutrophil recruitment and
parenchymal destruction and fewer goblet cell metaplasia, deposition of collagen and
mucus. Analyzing the effects of castration on the development of emphysema, no
significant differences were found. Thereby, the spraying papain model proves to be
useful, particularly for the study of proteolytic and inflammatory injury. Formulation for
the treatment of animals was performed in a spray dryer, as this equipment provides
powders with the necessary characteristics for the pulmonary delivery. However, since
this equipment operates at high temperatures, a formulation was developed by
lyophilization as parameter. For this, a factorial design was conducted to evaluate the
influence of the inlet temperature and the percentage of glidant. In the analysis of UV
was used as a marker coumarin. We also assessed the antioxidant activity by the method
of elimination of free radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH •), and
microbiological analysis of finished products. The results showed a loss of antioxidant
activity when drying was performed with inlet temperature of 170°C and long-term
preservation of the physical characteristics in dry extracts with 30% Aerosil®200 as a
glidant. Therefore, we conclude that the best method of spray drying uses 30% of
Aerosil®200 and an inlet temperature of 140°C. Besides, the preservation of the
coumarin content of the spray dried extract is probably promoted by Aerosil®200
microencapsulation. It could be observed that the spray drying and freeze drying,
remained statistically the same microbial population. The use of dry extract of M.
glomerata in the treatment of pulmonary emphysema proved to be very effective, since
was found a significant reduction in neutrophil recruitment and total cell count. Other
results showed an increase, proportionally, in the recruitment of macrophages in the
group treated with the plant, which can occur due to an accumulation of dry extract of
M. glomerata in the lung. Thus, there is a need to optimize certain characteristics of dry
extract (such as biodegradability) and the dose delivered without, however, affecting the
efficacy of therapeutic effect.
KEYWORDS: Pulmonary Emphysema; Mikania glomerata; Animal Models;
Ovariectomy; Papain.
xvii
18
1. INTRODUÇÃO
O entendimento dos mecanismos patogênicos de uma doença e o consequente
desenvolvimento de uma nova opção terapêutica, muitas vezes, alteram as estimativas
de crescimento de uma patologia. As estimativas de crescimento da doença pulmonar
obstrutiva crônica (DPOC), entretanto, continuam dentro do esperado. Se assim
continuar, a DPOC será a terceira principal causa de morte no mundo em 2020
(YOSHIDA; TUDER, 2007).
Dentre os esforços para reverter esse quadro, podemos destacar os estudos que
desenvolveram e/ou aprimoraram modelos pulmonares de enfisema em animais. Esses
modelos são ferramentas que possibilitam a análise de forma isolada de determinadas
vias moleculares, o que permite o melhor entendimento do complexo mecanismo
multifatorial da doença e, principalmente, possibilitam a compreensão dos eventos
primários (ROBBESOM et al., 2007).
Hoje, já são conhecidos muitos dos mecanismos moleculares envolvidos com a
evolução das alterações patológicas inicias da DPOC. Diante disso, esses mecanismos
serviram de base para o desenvolvimento desta pesquisa. Nesta dissertação, intitulada:
Sistemas de vetorização/liberação de extratos vegetais em modelos experimentais de
enfisema pulmonar, foram descritos experimentos que visam, de alguma forma,
acrescentar novos dados aos mecanismos patogênicos do enfisema e,
concomitantemente, despertar a atenção e mostrar as possibilidades do desenvolvimento
de novas formulações para entrega pulmonar a partir de plantas medicinais.
Dentre as varias plantas medicinais conhecidas, a Mikania glomerata Spreng foi
escolhida em virtude de sua ampla utilização em situações alérgicas e inflamatórias,
particularmente do sistema respiratório. Existem evidências pré-clínicas de sua ação
broncodilatadora, anti-inflamatória, antiespasmódica e na inibição da inflamação
imunológica (FALCÃO et al., 2005; GASPARETTO et al., 2010; CZELUSNIAK et al.,
2012). Além disso, é uma planta que integra a lista dos 12 fitoterápicos de interesse do
Sistema Único de Saúde (SUS) (RODRIGUES, SANTOS; AMARAL, 2006).
19
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver sistemas de vetorização/liberação de extratos vegetais em modelos
experimentais de enfisema.
2.2 Objetivos Específicos
Desenvolver e otimizar uma formulação para entrega pulmonar;
Realizar a caracterização das formulações desenvolvidas, comparando as
características das partículas obtidas por liofilização com as obtidas por spray
dryer;
Desenvolver/otimizar modelos de enfisema em ratos;
Avaliar a influência da ausência dos hormônios sexuais femininos na proteção
pulmonar;
Avaliar o tratamento com as formulações obtidas nos modelos
desenvolvidos/otimizados.
20
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 A DPOC e o enfisema pulmonar
A DPOC é uma doença heterogênea caracterizada pela obstrução crônica e não
totalmente reversível do fluxo aéreo (MANNINO; BUIST, 2007). Cada um dos
componentes da DPOC, o que inclui o enfisema pulmonar, a doença das pequenas vias
aéreas e a bronquite crônica, contam com características específicas que contribuem
para a redução do volume expiratório forçado em um segundo (VEF1) (YOSHIDA;
TUDER, 2007).
Dos componentes da DPOC, o principal é o enfisema pulmonar (ISHII et al.,
2011). O enfisema é caracterizado pela destruição das paredes alveolares, pelo
alargamento permanente dos espaços aéreos distais aos bronquíolos terminais e pela
perda de elasticidade do parênquima pulmonar, ilustração 1 (ROSENBLOOM;
ABRAMS; MECHAM, 1993; KIELTY; SHERRATT; SHUTTLEWORTH, 2002;
BARR et al., 2010).
Ilustração 1: Características do enfisema pulmonar. Adaptada de West (2011).
Além da DPOC ser uma doença com mecanismos patogênicos heterogêneos,
esses mecanismos não são totalmente compreendidos. Isso acaba se refletindo na
ausência de tratamentos eficazes, o que favorece a alta mortalidade e morbidade que são
encontradas. Em 2012, a DPOC foi a quarta principal causa de morte no mundo
(AGUSTI; SOBRADILLO; CELLI, 2011; DECRAMER, 2012).
21
3.2 Mecanismos patogênicos associados ao enfisema
Vários insultos, como a fumaça do cigarro, induzem a produção de quimiocinas
e outros quimioatrativos, tais como a interleucina-8 (IL-8), a proteína quimiotática de
monócitos-1 (PQM-1) e o leucotrieno B4 (LTB4). Esses quimioatrativos promovem o
acumulo de células inflamatórias no pulmão. Essas células, principalmente os
neutrófilos e os macrófagos, produzem citocinas inflamatórias, como o fator de necrose
tumoral (FNT)-α, IL-1β, IL-6 e espécies reativas de oxigênio (ERO); em particular, o
ânion superóxido (RUBIO et al., 2004; FORONJY et al., 2006; KINOSHITA et al.,
2007). Além disso, liberam proteinases, incluindo as elastases e a matriz
metaloproteinase-9. Essas citocinas e proteinases, por fim, contribuem para a
degradação dos componentes da matriz extracelular e, eventualmente, para o
desenvolvimento do enfisema (CALVERLEY; RENNARD, 2007).
Embora níveis aumentados de óxido nítrico (ON) (BRINDICCI et al., 2005) e da
nitração de proteínas (RICCIARDOLO et al., 2005) tenham sido encontrados em
pacientes com DPOC, as isoformas II (iNOS) e III (eNOS) da óxido nítrico sintetase
(ONS) não se mostraram necessárias para a indução do enfisema em um modelo
pulmonar de enfisema induzido por elastase (BOYER et al., 2010).
Todos esses achados, que compõem a hipótese protease/ antiprotease e a
hipótese oxidante/anti-oxidante, têm sido o conceito dominante na patogênese do
enfisema (ELIAS; LEE, 2005). Contudo, os agentes anti-inflamatórios ou anti-oxidantes
somente reduzem os sintomas, eles não afetam o declínio da VEF1 (CALVERLEY;
RENNARD, 2007). Dessa forma, outros mecanismos patogênicos devem estar
envolvidos com o desenvolvimento do enfisema. Além disso, embora o ato de fumar
seja considerado o mais importante fator de risco para o enfisema, apenas 15-20% dos
fumantes realmente desenvolvem a doença (FLETCHER; PETO, 1977; PAUWELS et
al., 2012). Isso sugere que a susceptibilidade para a DPOC para cada indivíduo é, pelo
menos em parte, determinada geneticamente (PATEL et al., 2008).
Como forma de descobrir novos alvos potenciais para o desenvolvimento de
estratégias terapêuticas contra o enfisema, nos últimos anos, várias pesquisas têm sido
realizadas. Essas pesquisas geram hipóteses que podem elucidar o desenvolvimento da
patologia.
3.2.1 A ceramida e a apoptose celular
22
Uma dessas hipóteses demonstra que a apoptose de células estruturais do pulmão
é um evento primário e significativo na patogênese do enfisema. A apoptose contribui
para o acúmulo de proteases locais que podem, em seguida, gerar um feedback de
degradação nas proteínas da matriz do septo alveolar exposto. Esses eventos, podem ser
confirmados através do bloqueio do fator de crescimento do endotélio vascular (FCEV)
e pela administração intrapulmonar de caspase 3 ativada. Nesse contexto, destacamos o
papel da ceramida. A ceramida é um segundo mensageiro regulador de esfingolipídios
que coordena as respostas ao stress, modula as respostas proliferativas e oxidativas e é
um potente indutor de apoptose. A molécula é produzida por uma variedade de tecidos
em resposta a uma série de estímulos, incluindo endotoxinas, stress oxidativo e
citocinas. Foi encontrado que as ceramidas pulmonares se mostram aumentadas e
qualitativamente alteradas nos tecidos pulmonares de indivíduos com enfisema induzido
por fumaça de cigarro. Corroborando com esses dados, foi observado que a instilação
pulmonar de ceramida é indutora de enfisema em camundongos. Além disso, a inibição
das enzimas que controlam a síntese da ceramida previne a apoptose de células do
alvéolo, o estresse oxidativo e o enfisema em camundongos com bloqueio do FCEV.
Outro ponto importante é que a estimulação do 1-fosfato de esfingosina, lisofosfolipídio
que inibe a ceramida, previne a apoptose no pulmão (ELIAS; LEE, 2005).
3.2.2 Fator de crescimento placentário
Ainda em relação à apoptose celular, foi descoberto que o fator de crescimento
placentário (FCP) induz a apoptose de células epiteliais do pulmão (CEP) e inibe a
proliferação celular (TSAO et al., 2004). O FCP pertence a uma família do FCEV e sua
principal função biológica é promover a angiogênese através do FCEV-1 (DE FALCO,
2012; DEWERCHIN; CARMELIET, 2012). O FCP é expresso na placenta, coração,
pulmão, tireóide, cérebro e músculo esquelético (DIPALMA et al., 1996).
Foi descoberto que, em ratos, a fumaça de cigarro aumenta a expressão do FCP
no pulmão (TSAI; CHIEN, 2012). Além disso, camundongos transgênicos com
superexpressão do FCP desenvolvem o fenótipo do enfisema (TSAO et al., 2004). Já os
camundongos com bloqueio gênico do FCP, ao serem estimulados com elastase
pancreática de porco (EPP), não desenvolvem esse fenótipo (SHIH et al., 2009).
Corroborando com os resultados em animais, foi encontrado que pacientes com
DPOC apresentam níveis maiores de FCP no soro e no lavado broncoalveolar (LBA).
23
Essa variação no nível do FCP, também é inversamente relacionada com a função
pulmonar (CHENG et al., 2008).
Essa participação do FCP na patogênese do enfisema induzido por EPP,
provavelmente, ocorre através do estímulo ao receptor de resposta precoce ao
crescimento-1 (RRPC-1). Além disso, o FCP ativada as vias c-Jun N-terminal quinase
(JNK) e proteína quinase ativada por mitógeno (PQAM) p38, que também estão
diretamente envolvidas com o desenvolvimento da doença (HOU et al., 2013).
Como nota, os estudos de apoptose induzidas pelo FCP associados aos estudos
de apoptose induzidas pela ceramida mostram um provável mecanismo de interação
entre essas duas vias. Nelas, ocorre a participação crucial do FCEV no desenvolvimento
do enfisema. Entretanto, ainda não existem estudos que mostrem essa relação. Além
desses estudos com o FCP e a ceramida, outras pesquisas também ajudam a elucidar a
patogênese do enfisema.
3.2.3 Prothymosin α
A Prothymosin α (ProT) é uma proteína nuclear ácida que possui diversas
funções intracelulares e extracelulares que estão envolvidas na proliferação, apoptose,
stress oxidativo, imunomodulação e acetilação (WU; SHIAU; LIN, 1997;
EVSTAFIEVA et al., 2003; LETSAS; FRANGOU-LAZARIDIS, 2006; MOSOIAN,
2011; IOANNOU et al., 2012; UEDA; MATSUNAGA; HALDER, 2012). Essa proteína
nuclear pode acetilar a histona H1do linker (KARETSOU et al., 1998; ZAKHAROVA
et al., 2011) e histonas do núcleo (COVELO et al., 2006), o que modula a estrutura da
cromatina. Além disso, pode interagir com duas diferentes histonas acetiltransferases
(HATs): proteína CREB-binding (PCB) e p300 (COTTER; ROBERTSON, 2000;
SUBRAMANIAN et al., 2002). Através da interação com a PCB, a ProT estimula a
transcrição dependente de AP-1 e do fator nuclear kappa β (FN-kβ) (KARETSOU et
al., 2002).
Particularmente sob exposição à fumaça de cigarro, a ProT aumenta a acetilação
de histonas e do FN-kβ, o que ocasiona o aumento da matriz metaloproteinase 2
(MMP2) e 9 (MMP9). Além disso, a superexpressão da ProT no pulmão está
correlacionada com a gravidade do enfisema em pacientes. Em modelos animais,
camundongos transgênicos homozigotos para ProT desenvolvem alargamento
espontâneo do espaço aéreo e destruição da parede alveolar característicos do enfisema.
Os camundongos heterozigotos desenvolvem, apenas, leves ampliações do espaço
24
aéreo. No entanto, ao serem estimulados com fumaça de cigarro, ocorre aumento
significativo da incidência e gravidade do enfisema com aumentos concomitantes na
expressão da ProT (SU et al., 2013).
3.2.4 Receptor toll like 4 e a IL-17
Muitos estudos indicam que os receptores toll like (RTLs) desempenham papéis
críticos no desenvolvimento e na resolução do enfisema. Os RTLs podem iniciar e
orquestrar a resposta imunitária inata e adaptativa. Além disso, funcionam como
sensores de danos e estão envolvidos com várias doenças inflamatórias não-infecciosas,
tais como a síndrome do desconforto respiratório agudo, a asma e a DPOC (ZHANG et
al., 2006; LEE et al., 2007).
Dentre os RTLs, o RTL4 e o RTL2 são os que desempenham um papel
proeminente nas interações gene-ambiente, as quais são relevantes para os fenótipos da
DPOC. Isso ocorre porque a interação entre a carga microbiana e o sistema imunológico
é um fator determinante para a função imune e para a susceptibilidade a asma/enfisema
(VERCELLI, 2010).
Foi encontrado que uma mutação no TLR4 resulta em enfisema através da
regulação positiva da NADPH oxidase (Nox) 3 nos pulmões e nas células endoteliais, o
que provoca um aumento nas atividades oxidante e elastolítica (ZHANG et al., 2006).
Tem sido demonstrado que a redução/oxidação (redox) regula a polarização da célula T
(GILL; TSUNG; BILLIAR, 2010) e que o acúmulo de ERO é crítico para a
diferenciação de células Th naive em Th1 ou Th17. As células Th17 desempenham um
papel importante na inflamação e em doenças como o enfisema (INOUE et al., 2006;
WON et al., 2010).
A IL-17, além de desempenhar um papel vital em doenças autoimunes como um
importante mediador pró-inflamatório que promove a produção de muitas citocinas,
quimiocinas e fatores de crescimento (HONG; LEE, 2010), promove o crescimento de
células epiteliais das vias aéreas (INOUE et al., 2006). Isso é relevante devido o
desenvolvimento do enfisema possuir um forte caráter autoimune (LEE et al., 2007), o
que é fundamentado pela descoberta de que folículos linfáticos contendo células
dendríticas (CD) e células Th1 estão presentes no parênquima do pulmão enfisematoso
(CALVERLEY; RENNARD, 2007).
Foi observado que o TGF-β1 e a IL-6 demonstram ser necessários para a
diferenciação de células T naive em células Th17 em camundongos (KORN et al.,
25
2009). Além disso, foi verificado que a IL-23 estabiliza e aumenta a população de
células Th17 (MCKENZIE; KASTELEIN; CUA, 2006) e que a IL-17 é um indutor
importante da expressão de IL-6. Em outras palavras, existe um ciclo de
retroalimentação que mantém o nível da IL-17, o que mantém a infiltração de células
Th17 no pulmão (KISHIMOTO, 2005).
Grande parte dessas observações foi fundamentada após estudos em
camundongos com nocaute gênico do RTL4 (RTL4-). Nesses, os níveis de expressão de
IL-17, IL-6 e IL-23 são todos deprimidos, o que resulta em atenuação na infiltração de
células Th17 no pulmão. Além disso, o tratamento de camundongos RTL4- com IL-17
exógena aumenta a fosforilação da MAP quinase p38 e a expressão do AP-1, o que
diminui os níveis de apoptose e reverte o enfisema pulmonar em camundongos RTL4-
(WANG et al., 2011).
3.2.5 Fibrilina-1
A rede de fibras elásticas é um elemento estrutural importante no parênquima
pulmonar e é, em grande parte, responsável pelas propriedades de recolhimento elástico
do pulmão (ROSENBLOOM; ABRAMS et al., 1993; KIELTY; SHERRATT et al.,
2002). As fibras elásticas são compostas de microfibrilas, que variam de 10-12nm e
estão localizadas em torno da elastina amorfa (ROBINSON; GODFREY, 2000;
KIELTY et al., 2002). Dentre os componentes das fibras elásticas, o principal é a
elastina. Ela tem atraído muita atenção nos estudos sobre enfisema, pois a substituição
de aminoácido no seu gene tem sido associada à DPOC (KELLEHER et al., 2005).
Nesse contexto, podemos destacar o papel da fibrilina-1, uma vez que essa é o
principal componente da parte microfibrilar das fibras elásticas, embora outros
componentes estejam presentes, dentre os quais podemos citar outras fibrilinas,
(ZHANG et al., 1994; ROARK et al., 1995; YANAGISAWA et al., 2002)
glicoproteínas associadas a microfibrilas, (GIBSON et al., 1986; GIBSON;
KUMARATILAKE; CLEARY, 1989; GIBSON et al., 1996) e emilins (BRESSAN et
al., 1993; DOLIANA et al., 1999; COLOMBATTI et al., 2000).
Outro dado importante que destaca a participação da fibrilina-1 é o fato de o
desenvolvimento do enfisema ter sido observado em pacientes com síndrome de
Marfan. Essa síndrome é caracterizada por ser uma doença autossômica causada por
mutações no gene que codifica a fibrilina-1 (COLLOD-BÉROUD; BOILEAU, 2002;
JACOBS et al., 2002; PYERITZ; DIETZ, 2003). Em camundongos, a mutação do gene
26
da fibrilina-1 resulta no desenvolvimento de enfisema que é, em muitos aspectos,
semelhante ao observado em humanos (PEREIRALRZ et al., 1997; KIELTY et al.,
1998; GAYRAUD et al., 2000).
Entretanto, a parte mais relevante dos estudos com a fibrilina-1 foi realizada no
parênquima pulmonar de pacientes que, embora sem manifestações clínicas,
apresentavam alterações microscópicas do enfisema. Nesses pacientes, foi possível
estabelecer uma associação significativa entre a fibrilina-1 e os três parâmetros
morfométricos mais importantes para o enfisema, a citar: a destruição alveolar, o
alargamento do espaço aéreo e as alterações morfológicas associadas à doença. Em
adição, foi verificado que, no estágio inicial do enfisema, as outras moléculas da matriz
extracelular (laminina e colágeno tipo I e IV) não estavam alteradas (ROBBESOM et
al., 2007).
3.2.6 Proteína D do surfactante
O surfactante é formado por proteínas (SP) hidrofóbicas (SP-B e SP-C) e
hidrofílicas (SP-A e SP-D). Enquanto as proteínas hidrofóbicas baixam a tensão
superficial do alvéolo, as proteínas hidrofílicas medeiam à função de defesa. Dessa
forma, no que se refere ao estudo do enfisema, são as proteínas hidrofílias que
interessam. Essas proteínas são colectinas (colágeno-lectinas) que consistem em quatro
domínios estruturais, incluindo um domínio de colágeno e um domínio de
reconhecimento de carboidratos C-terminal (CRD). O CRD medeia interações com o
patógeno, mediando, assim, à fagocitose celular. As colectinas também se ligam aos
receptores de superfície dos macrófagos alveolares e, principalmente, aos pneumócitos
tipo II. Além disso, foi descoberto que camundongos com nocaute gênico da SP-D
desenvolvem enfisema pulmonar (HARTL; GRIESE, 2006).
Ratificando esses resultados, foi encontrado que a concentração de SP-D no
líquido broncoalveolar de humanos está correlacionada com a limitação do fluxo aéreo
(SIN et al., 2008). Esse resultado, observado em duas populações distintas, ocorre
devido a um polimorfismo de nucleotídeo simples (PNS) da SP-D. A presença do alelo
C em rs721917 resulta na substituição da Met por Thr na posição 11 da SP-D, o que
está relacionado com a suscetibilidade ao enfisema. Outrossim, a concentração sérica de
SP-D prediz o genótipo da SP-D e indica a suscetibilidade à doença (ISHII et al., 2011).
3.3 Alternativas terapêuticas relevantes para o enfisema pulmonar
27
Dentre as opções terapêuticas que estão sendo desenvolvidas contra o enfisema,
a mais promissora é a que utiliza o fator de crescimento de hepatócitos (FCH). Nos
pulmões de animais de laboratório, o FCH age como mitogênico, morfogênico e
protetor pulmonar. Esse efeito é desempenhado através da fosforilação do c-Met, um
receptor tirosina quinase, e ocorre após lesão (OHMICHI; MATSUMOTO;
NAKAMURA, 1996; YAMADA et al., 2000; SAKAMAKI et al., 2002) ou durante o
desenvolvimento pulmonar (OHMICHI et al., 1998).
O FCH é o mais promissor tratamento porque a sua administração em ratos com
enfisema induzido por elastase, sobretudo por meio das vias aéreas, induz a migração de
células-tronco derivadas da medula óssea (CD34 (+) e de c-kit (+)) e a proliferação de
células-tronco endógenas do pulmão (Sca-1 (+) e CD34 (+)), que também são ativadas
em resposta à lesão e participam na regeneração do pulmão. Esse processo, orquestrado
pelo FCH, reverte as lesões enfisematosas do pulmão. Vale salientar que, após
administração exógena de FCH por via aérea, sua presença não é detectada no soro dos
animais, indicando que não ocorre a difusão do FCH a partir do pulmão para a
circulação. Outrossim, após a observação dos camundongos por várias semanas, não foi
observada a retomada da destruição do pulmão. A complacência pulmonar estática
também voltou aos níveis normais dentro de 2 semanas de tratamento com o FCH
(HEGAB et al., 2008).
Esse processo de cura do FCH não se deve apenas ao seu potente efeito
mitogênico sobre os pneumócitos tipo II (PT2), que ocorre in vivo (PANOS; PATEL;
BAK, 1996; SAKAMAKI et al., 2002) e in vitro (MASON et al., 1994). Embora se
saiba que os PT2 podem reparar danos do epitélio alveolar (ASO; YONEDA;
KIKKAWA, 1976), foi observado, após injúria pulmonar de camundongos adultos, que
é uma população de células-tronco do tecido pulmonar que se diferencia em células da
Clara e em PT2. São esses novos PT2 que regeneram os alvéolos através da
diferenciação em pneumócitos tipo I (KIM et al., 2005). Dessa forma, o FCH promove a
migração e a transdiferenciação de células tronco. Esse processo, que acontece
fisiologicamente, se mostra insuficiente quando o quadro de enfisema está estabelecido
(IWASAKI et al., 2005; APTE et al., 2006; FORTE et al., 2006; LI et al., 2006;
HEGAB; KUBO et al., 2008).
Entretanto, embora que no tratamento intranasal de camundongos saudáveis com
HGF por 4 semanas, e com posterior observação por várias outras, não tenha sido
detectada nenhuma alteração morfológica ou funcional no pulmão (HEGAB et al.,
28
2008), a participação da expressão descontrolada do FCH e seu receptor c-Met são
conhecidas por estarem associadas com uma variedade de tumores humanos,
particularmente os tipos mais agressivos (HADDAD; LIPSON; WEBB, 2001; DULAK
et al., 2011).
As células-tronco, no entanto, também contam com a opção de serem
administradas exogenamente ou induzidas, de outras formas, a se mobilizarem da
medula óssea para o pulmão lesionado (GRIFFITHS; BONNET; JANES, 2005), nesse
caso, o mais adequado seria a utilização do ácido all-trans-retinóico e do fator
estimulador de colônias de granulócitos humanos (FECGH) (ISHIZAWA et al., 2004).
Por sua vez, os tratamentos cirúrgicos disponíveis, tais como a cirurgia de
redução de volume e o transplante de pulmão, são adequados somente para um
subgrupo limitado de pacientes (HEGAB et al., 2008).
Além dessas opções terapêuticas, as quais precisam ter um desenvolvimento
tecnológico que as tornem viáveis, existe a opção de se utilizar a tecnologia
farmacêutica como ferramenta para otimizar os resultados clínicos de medicamentos
que já foram aprovados para uso e que têm o potencial de se tornarem mais eficazes.
Dentre esses medicamentos, podemos destacar os fitoterápicos.
3.4 Fitoterapia no enfisema: o guaco
Segundo a resolução – RDC nº 10, de 9 de março de 2010, os fitoterápicos, ou
drogas vegetais, são medicamentos oriundos de “plantas medicinais ou suas partes, que
contenham as substâncias, ou classes de substâncias, responsáveis pela ação terapêutica,
após processos de coleta ou colheita, estabilização e secagem, íntegras, rasuradas,
trituradas ou pulverizadas” (BRASIL, 2010). Em outras palavras, são medicamentos
que contêm princípios ativos de origem vegetal, diferentemente de um medicamento
comum, o qual pode ter componentes sintéticos e biológicos. Uma vez que são
medicamentos, os fitoterápicos precisam apresentar estudos científicos que comprovem
a sua segurança e a eficácia de sua utilização para que possam ser comercializados
(CARVALHO et al., 2008).
Essa necessidade de comprovação, aliada a outras exigências atuais, fez com
que muitos remédios antigos não conseguissem se adaptar. Isso acarretou a diminuição
do número de fitoterápicos registrados: de 512 em 2008 para 384 em 2011, ou seja, uma
redução de 25,0%. Além disso, nesse mesmo período, ocorreu a redução de 34,45% no
numero de empresas produtoras de fitoterápicos no país. Em contrapartida a essa
29
diminuição, a Vigilância Sanitária discute a criação da categoria “Produto Tradicional
Fitoterápico”. Essa categoria englobaria substâncias cuja segurança seja comprovada
pelo uso tradicional, desde que cumpram as condições adequadas de higiene em sua
fabricação (BRASIL, 2013).
Mesmo com esse novo panorama, que já é uma realidade na Europa (FAN et al.,
2012), existe a necessidade da fundamentação científica do uso das plantas brasileiras.
Dentre essas plantas, uma com ação potencial contra o enfisema e que pode ser
otimizada através da tecnologia farmacêutica é a Mikania glomerata spreng.
3.5 Mikania glomerata Spreng.
A Mikania glomerata Spreng., ilustração 2, é uma planta cujo uso já foi validado
pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), por isso possui aplicação
promissora na tecnologia farmacêutica. Além disso, ela é um dos 12 fitoterápicos
ofertados pelo SUS na atenção básica, o que constitui em uma das estratégias do
Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, lançado em 2008 com o
objetivo de ampliar as opções terapêuticas e fortalecer o complexo produtivo e o uso
sustentável da biodiversidade brasileira (BRASIL, 2008).
Ilustração 2: Mikania glomerata Spreng. Legenda: (a) folha; (b) flor; (c) exsicata.
Adaptada de Santos (2005).
3.5.1 Família, gênero e morfologia
A M. glomerata pertence à família Asteraceae. Essa família é o grupo mais
numeroso dentro das Angiospermas e compreende cerca de 1.100 gêneros e 25.000
espécies. É constituído por plantas com características variadas, inclui geralmente
pequenas ervas ou arbustos e raramente árvores. Aproximadamente 98% dos gêneros
b c a
30
são compostos por plantas de pequeno porte que são encontradas em todos os tipos de
habitats, principalmente na região tropical montanhosa da América do Sul
(CZELUSNIAK et al., 2012). O gênero Mikania conta com aproximadamente 430
espécies distribuídas na região tropical e subtropical da América, sendo que 171
espécies são encontradas no Brasil (KING; ROBINSON, 1987).
A planta, conhecida vulgarmente como coração-de-jesus, guaco-cheiroso, cipó-
caatinga e erva-de-cobra (GASPARETTO et al., 2010), é um subarbusto silvestre,
escandente, de folhagem densa e perene, com caule cilíndrico, ramificado e glabro.
Quando seco, o caule apresenta fratura fibrosa e aspecto estriado no sentido
longitudinal, enquanto que, estando jovem, apresenta coloração verde-claro passando a
arroxeada e a cinzento-escura nas partes suberificadas. As folhas são pecioladas,
cordiforme-deltoides, oval-lanceoladas, tri ou pentanervadas e agudas no ápice. As
flores são esbranquiçadas e carnosas, dispostas em inflorescência panícula tirsoide, com
até 30 cm de comprimento, onde os capítulos se encontram reunidos em glomérulos. As
bractéolas são lineares e apresentam medidas próximas a 2 mm de comprimento. O
aquênio é pentangular com aproximadamente 3 mm (CZELUSNIAK et al., 2012).
3.5.2 Atividade farmacológica
A M. glomerata foi oficializada desde 1929 na 1a edição da Farmacopéia
Brasileira (BRASIL, 1959) e encontra-se comercializada principalmente nas formas
farmacêuticas de extrato fluido, tintura e xarope. Com fins medicinais, a planta é
empregada no tratamento de afecções do aparelho respiratório (gripe, tosse, bronquite e
asma), além disso, também é empregada no tratamento de reumatismos, úlceras
gástricas, nevralgias, e como sudorífera, febrífuga, depurativa e cicatrizante (RADÜNZ
et al., 2012).
Essa ampla utilização é sustentada por evidências pré-clínicas de ação
broncodilatadora, expectorante, anti-inflamatória, antiespasmódica e analgésica
(FALCÃO et al., 2005; GASPARETTO et al., 2010; CZELUSNIAK et al., 2012). Há,
ainda, pesquisas que relatam que uma fração obtida do extrato etanólico da M.
glomerata é efetiva na inibição da inflamação imunológica, mas não afeta a resposta
inflamatória aguda no pulmão de ratos (RUPPELT et al., 1991)
Fitoquimicamente, os compostos de maior interesse presentes na M. glomerata
são a cumarina, os terpenos e os diterpenos. A cumarina, 2H-1benzopiran-2-ona, é um
dos constituintes majoritários da M. glomerata (Ilustração 3) e está envolvido com o
31
caráter broncodilatador da planta, o qual ocorre através do relaxamento da musculatura
lisa pulmonar (LEITE, 1992). Ela é responsável por cerca de 50% a 60% da atividade
broncodilatadora do extrato cru total (CELEGHINI; VILEGAS; LANÇAS, 2001).
Ilustração 3: Estrutura química da cumarina, 2H-1benzopiran-2-ona. Acervo pessoal.
Dentre os diterpenos, podemos destacar os que constituem a classe dos cauranos,
como por exemplo o ácido caurenóico, ilustração 4, (isolado de M. glomerata e M.
laevigata), que apresenta atividade bactericida, anti-parasitária e fúngicida
(BARBOSA; FERREIRA; VALENTE, 1994; GHISALBERTI, 1997; SILVA et al.,
2004; LEYVA et al., 2008).
Ilustração 4: Estrutura química do ácido caurenóico. Acervo pessoal.
Em virtude das propriedades terapêuticas atribuídas a essa espécie, o xarope e a
solução oral da M. glomerata foram incluídos no elenco de referência de medicamentos
e insumos complementares para a assistência farmacêutica na atenção básica em saúde,
conforme anexo II da Portaria No. 3.237 de 24 de dezembro de 2007 (CANABARRO;
HAHN, 2009).
32
3.5.3 Segurança do extrato da M. glomerata
Os fitoterápicos e os compostos isolados de espécies do guaco não apresentaram
efeitos tóxicos nem genotóxicos em seres humanos. Entretanto, como ocorre
discrepância dos constituintes devido às origens geográficas, aspectos agronômicos,
solvente extrator e técnica de extração, os efeitos e/ou toxicidade do guaco podem ser
alterados ou mascarados. Isso revela a necessidade de estudos prévios com os extratos
(DALLA NORA et al., 2010).
Dentre as opções de inovação tecnológica que poderiam beneficiar a resposta
farmacológica do fitoterápico da M. glomerata, podemos citar o desenvolvimento de
uma formulação para a entrega pulmonar do medicamento.
3.6 Entrega de formulações por via pulmonar
Durante as últimas décadas, tem se investido em vias de administração
alternativas que proporcionem elevada biodisponibilidade e baixos efeitos colaterais.
Dentre essas vias, uma das mais promissoras é a pulmonar. Essa via possui uma
superfície extensa (~75m2), fina (0,1-0,5: μm) e altamente vascularizada (MANCA et
al., 2012). Essas características trazem potencialidades, sobretudo, quando o objetivo
terapêutico é o próprio pulmão. Entretanto, a utilização dessa via pode gerar limitações,
como a flutuação da concentração e a perda da droga, que pode ocorrer devido à
deposição no trato orofaríngeo, à elevada depuração por macrófagos ou à atividade
mucociliar. Além disso, quantidades elevadas de drogas, como os antibióticos, podem
ter efeitos irritantes ou de toxicidade aguda no epitélio pulmonar (DOAN; COUET;
OLIVIER, 2011).
Para superar tais problemas foram criadas várias abordagens de formulações
com a utilização de diferentes carreadores e a incorporação de excipientes, adjuvantes
ou agentes porogênicos que otimizassem as muitas propriedades físico-químicas que
têm impacto significativo sobre a entrega pulmonar, a libertação sustentada e a
estabilidade de armazenamento (OGAIN et al., 2011). Essas abordagens são oriundas,
geralmente, das várias tecnologias que estão sob investigação, incluindo grandes
micropartículas porosas, partículas de polímero microencapsulado, drogas PEGylated e
conjugadas, nanopartículas e micropartículas intumescíveis (SELVAM; EL-
SHERBINY; SMYTH, 2011).
33
Entretanto, independente da inovação tecnológica utilizada, algumas
características das partículas são mantidas, uma vez que já possuem consenso. Dentre
essas características, o diâmetro é uma das de maior consenso. Esse diâmetro deve estar
entre 1-5μm para que ocorra uma maior probabilidade de se atingir a porção inferior do
sistema respiratório (HASSAN; LAU, 2011). Esse tamanho de partícula, entretanto, é o
que apresenta máxima absorção pelos macrófagos, o que é o desejado apenas em raros
casos, como no tratamento da tuberculose. Na maioria das vezes, então, são utilizados
agentes intumescíveis que incham quando no pulmão profundo e, portanto, podem iludir
a captação dos macrófagos alveolares através das suas maiores dimensões geométricas
(KHANDWEKAR et al., 2011).
Uma vez que as características das formulações se mostram tão importantes para
a entrega pulmonar, é preciso se trabalhar com equipamentos que possibilitem a
alteração dessas características para que se obtenha uma melhor otimização da entrega.
Um aparelho que possibilita tais alterações é o Spray Dryer. Entretanto, por ser um
aparelho que trabalha com muitas variáveis, é preciso estabelecer metodologias para se
obter as formulações com as melhores características. Para tanto, existe o planejamento
de experimentos.
3.7 Planejamento e otimização de experimentos
A atividade estatística mais importante não é a análise de dados, e sim o
planejamento dos experimentos em que esses dados devem ser obtidos. Quando isso não
é feito da forma apropriada, muitas vezes, não é possível obter uma conclusão plausível
a partir dos resultados. Um bom planejamento é o que fornece exatamente o tipo de
informação procurada. Para isso é preciso organizar a evolução do estudo empírico.
Essa organização consiste, inicialmente, em uma triagem das variáveis de maior
influencia, descartando dessa forma as variáveis não significativas. Em seguida é feita
uma avaliação da influência das variáveis, nesse caso é utilizado o planejamento
fatorial. Por fim, são construídos os modelos empíricos e mecanísticos, que possibilitam
a otimização do estudo. Entretanto, construir modelos empíricos não basta. É preciso
também avaliar se eles são realmente adequados ao sistema que se quer descrever
(BARROS, 2003). Então, uma vez que se objetive avaliar a influência de variáveis, o
mais adequado é o planejamento fatorial.
3.7.1 Planejamento fatorial
34
O planejamento fatorial é uma ferramenta extremamente eficiente e econômica
que pode ser utilizada para avaliar, quantitativamente, a influência de dezenas de
fatores, simultaneamente, sobre a resposta de interesse, bem como as possíveis
interações entre os fatores (BARROS, 2003).
3.8 Perspectivas para o enfisema pulmonar: biomarcadores e células-tronco
Entretanto, embora a tecnologia farmacêutica, aliada ao planejamento de
experimentos, possa trazer grandes avanços com a otimização de medicamentos já
existentes para o tratamento do enfisema, a longo prazo, a cura da patologia será,
possivelmente, conseguida através do diagnostico precoce por biomarcadores e/ou
tratamento com células tronco.
Os biomarcadores são entidades que podem ser medidas como um indicador de
processos biológicos normais ou patológicos, ou ainda como indicador de resposta à
terapia (ATKINSON et al., 2001). Eles podem ser usados na prática clínica para o
diagnóstico ou para identificar riscos de ocorrência de uma doença. Podem, ainda, ser
utilizados para estratificar doentes e identificar a gravidade ou progressão de uma
determinada doença, prever um prognóstico ou monitorizar um determinado tratamento
para que seja menos provável que alguns efeitos secundários ocorram. Ademais, o uso
de biomarcadores pode reduzir os custos no desenvolvimento de medicamentos, uma
vez que, através da triagem dos pacientes, minimiza o número de participantes
necessários (ROBINSON et al., 2013).
Embora os biomarcadores, geralmente, sejam utilizados para descrever uma
variável bioquímica, como a concentração de uma proteína ou outra biomolécula na
circulação, também podem ser empregados para se analisar características anatômicas e
estruturais, que são visualizadas por radiografia convencional, ultra-sonografia,
tomografia computadorizada (por exemplo, a tomografia por emissão de pósitrons) ou
ressonância magnética. As respostas celulares imunes, traços genéticos, características
histológicas do tecido doente e as proteínas ou RNAs expressos em tecidos também
podem ser utilizadas como biomarcadores (LOGOTHETIS, 2008).
Para muitas doenças, um único biomarcador pode ser informativo em um nível
populacional, mas não em um nível individual. Dessa forma, estão sendo desenvolvidos
biomarcadores múltiplos e, em paralelo, tecnologias que permitam a análise dessas
múltiplas variáveis (FU et al., 2010).
35
O enfisema pulmonar é uma das patologias onde o uso de biomarcadores
múltiplos se faz necessária. Esses biomarcadores, baseados nos mecanismos
patogênicos descritos na seção 3.2, permitiriam que uma proporção significativa de
pacientes fosse tratada antes que alterações irreversíveis do enfisema se instalassem.
Como forma de identificar esses biomarcadores, poderia ser utilizado, por exemplo, a
tomografia computadorizada (GALBÁN et al., 2012).
Uma vez que as alterações irreversíveis do enfisema já estejam estabelecidas, a
terapia mais promissora envolve, sem dúvidas, o uso ou recrutamento de células-tronco
endógenas e exógenas ao pulmão, conforme descrito na seção 3.3.
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47
CAPÍTULO I: Modelo animal de enfisema pulmonar:
papaína pulverizada ou fumaça de cigarro?
Artigo submetido à revista Brazilian Journal of Medical and
Biological Research
48
Modelos animais de enfisema pulmonar: papaína pulverizada ou fumaça de cigarro?
DANTAS, R. L.1; CAMPELO, N. B.
2; FONSECA, K. M.
3; LEAL, L. H. C.
2; LIMA, V.
B. S.4; PEREIRA JUNIOR, J. L.
5; REIS, E. V. S.
6; ALVES W. S.
7; NUNES, L.C.C.
1
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do
Piauí, UFPI, Teresina, Piauí, Brasil.
2Curso de Farmácia da Universidade Federal do Piauí, UFPI, Teresina, Brasil.
3Curso de Fisioterapia da Universidade Estadual do Piauí, UESPI, Teresina, Brasil.
4Programa de Pós-Graduação em Ciências Animal da Universidade Federal do Piauí,
UFPI, Teresina, Piauí, Brasil.
5Curso de Farmácia da Faculdade Santo Agostinho, FSA, Teresina, Brasil.
6Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Piauí,
UFPI, Parnaíba, Brasil.
7Mestre em Bioengenharia, Professor Assistente da Faculdade de Ciências Médicas-
Universidade Estadual do Piauí, UESPI, Teresina, Brasil.
RESUMO
O enfisema pulmonar é uma patologia com um expressivo impacto econômico e social.
Apesar disso, estamos totalmente desprovidos de agentes farmacológicos que alterem a
história natural da doença e diminuam a taxa de perda da função pulmonar. Essa falta é
devido, em grande parte, ao nosso conhecimento limitado da patogênese da doença.
Uma forma de reverter esse cenário é o desenvolvimento e a adaptação de modelos de
enfisema. Nesse sentido, esta pesquisa objetivou a adaptação do modelo de enfisema
com papaína, pois o seu modelo atual usa a instilação de uma solução contendo a
enzima, o que tende a gerar alterações que não são compatíveis com a doença. Nós
propomos um modelo que se assemelha mais ao que acontece no desenvolvimento do
enfisema com cigarro em humanos. Por esse motivo, como comparativo, foi utilizado o
modelo com inalação de fumaça de cigarro. Investigou-se, também, a influência da
castração no desenvolvimento da doença em ratas. Para tanto, foi realizado o estudo do
lavado broncoalveolar (LBA) e do tecido pulmonar, através de análise histológica e por
Raio-X. No LBA foi encontrado um maior recrutamento neutrofílico e,
proporcionalmente, um menor recrutamento de macrófagos e linfócitos, enquanto que
nos achados do histopatológico foi observada uma grande destruição parenquimatosa,
pouca metaplasia de células caliciformes e uma menor deposição de colágeno. Diante
49
disso, o modelo de enfisema com papaína revelou-se mais adequado para o estudo
isolado do enfisema que o modelo utilizando o cigarro. Na análise radiológica e do
efeito da castração, não foram encontradas diferenças significativas.
PALAVRAS-CHAVE: Enfisema pulmonar; Lesão por Inalação de Fumaça; Modelos
Animais; Papaína; Histopatologia.
Abstract: Animal models of pulmonary emphysema: spraying papain or cigarette
smoke?
Pulmonary emphysema is a disease with a significant economic and social impact. In
contrast to this, we are totally lacking in pharmacologic agents that alter the natural
history of the disease and decrease the rate of loss of lung function. This lack is due, in
great extent, to our limited knowledge of disease pathogenesis. One way to reverse this
scenario is the development and adaptation of animal models of emphysema. Seen in
these terms, this study aimed to adapt the papain-induced experimental pulmonary
emphysema model in rats, as its current model uses instillation of a solution containing
the enzyme, which tends to generate changes that are not compatible with the disease.
We have proposed a model that is closer to what happens in the development of
cigarette smoke-induced emphysema in humans. Therefore, as a comparison, was used
the cigarette smoke-induced experimental pulmonary emphysema model in rats. We
also investigated the influence on the castration on the development of emphysema in
rats. Thus, the study of bronchoalveolar lavage and lung tissue was performed by
histological, cell count and X-ray analysis. In the animal model by spraying papain was
found a higher neutrophil recruitment and destruction of the pulmonary parenchyma and
a lower goblet cell metaplasia, collagen and mucus deposition than in the animal model
by cigarette smoke. Thus, the animal model by spraying papain has proved to be more
suitable for the isolated study of emphysema that the model using cigarette smoke. In
the radiological and castration effect analysis, no significant differences were found.
KEYWORDS: Pulmonary Emphysema; Smoke Inhalation Injury; Animal Models;
Papain; Histopathology.
50
1 INTRODUÇÃO
O enfisema pulmonar, principal consequência da DPOC, é caracterizado pela
restrição permanente do fluxo de ar resultante do alargamento do espaço aéreo alveolar
e da perda de elasticidade do pulmão (BARNES, 2003). Seu diagnóstico baseia-se em
dados funcionais respiratórios, manifestações clínicas características, achados
radiológicos sugestivos e, por fim, alterações anatomopatológicas definitivas. O
principal fator de risco para o desenvolvimento, a gravidade e a progressão do enfisema
é o ato de fumar (FLETCHER; PETO, 1977; BARNES, 2009; PAUWELS et al., 2012).
As estimativas sobre a prevalência da DPOC, e consequentemente do enfisema,
têm sido baseadas primariamente nas estatísticas de mortalidade, o que configura um
subdiagnóstico. Ainda assim, essas estimativas mostram que a morbimortalidade está se
elevando em muitas regiões. A DPOC afeta 210 milhões de pessoas, é a quarta causa de
mortalidade e representa 4,8% dos óbitos em todo o mundo. No Brasil, estima-se que
existam 7,5 milhões de pessoas acometidas. Cada um desses pacientes tem um custo
estimado por ano de US$ 1.522,00, quase três vezes o custo per capita da asma
(BRASIL, 2014).
Em contraste com esse impacto econômico e social, estamos totalmente
desprovidos de agentes farmacológicos que alterem a história natural da doença e
diminuam a taxa de perda da função pulmonar. Essa falta é devido, em grande parte, ao
nosso conhecimento limitado da patogênese da doença (ELIAS; LEE, 2005). Uma
forma de reverter esse cenário é o desenvolvimento e a adaptação de modelos animais
de enfisema. Esses modelos aumentam, de forma progressiva, o nosso conhecimento
sobre os fatores envolvidos com essa doença (ROBBESOM et al., 2007).
Em laboratório, o enfisema pode ser desencadeado através da indução de
apoptose, que pode ocorrer por bloqueio do fator de crescimento do endotélio vascular,
pela administração intrapulmonar de caspase 3 e ceramida (ELIAS; LEE, 2005) e pela
superexpressão do fator de crescimento placentário (HOU et al., 2013) e da
Prothymosin α (SU; TSENG et al., 2013). Outros métodos de desencadear um enfisema
é por nocaute gênico do receptor toll like 4 (WANG et al., 2011) e da fibrilina-1
(ROBBESOM; KOENDERS et al., 2007), pelo desequilíbrio nas atividades
protease/antiprotease e oxidante/anti-oxidante, que pode ser induzido por fumaça de
cigarro (WRIGHT; CHURG, 2002), pela administração de papaína (GROSS et al.,
51
1965), por elastase pancreática de porco e de neutrófilos humanos (SNIDER; LUCEY;
STONE, 1986) e, por fim, pelo bloqueio da alfa-1-antitripsina (ERIKSSON, 1965).
Nesses modelos de enfisema nos deparamos com as complexas relações
envolvidas com a doença, incluindo a participação das interações gene-ambiente
(WANG et al., 2011), do sistema autoimune (TARASEVICIENE-STEWART et al.,
2005; CALVERLEY; RENNARD, 2007; LEE et al., 2007) e dos fatores genéticos
(MAHADEVA; SHAPIRO, 2002; WRIGHT; CHURG, 2002; PATEL et al., 2008;
ISHII et al., 2011). A participação dos fatores genéticos pode ser verificada, por
exemplo, quando se observa que o ato de fumar só causa enfisema em cerca de 15-20%
dos fumantes (FLETCHER; PETO, 1977; PAUWELS et al., 2012).
Nesse contexto, faz-se necessário a utilização de modelos pulmonares que
possibilitem o conhecimento exato do inicio da doença, para que tenhamos um melhor
entendimento dessa patologia. Dessa forma, este estudo teve como objetivo adaptar o
modelo de enfisema com papaína, enzima proteolítica extraída da fruta e seiva da papaia
(Carica papaya). Essa enzima foi escolhida devido ao seu baixo custo, facilidade de
obtenção e por possuir ação semelhante a elastase neutrofílica no desenvolvimento do
enfisema pulmonar (FUSCO et al., 2002; WEST, 2010).
Grande parte dos modelos experimentais de enfisema a base de papaína usam a
instilação de uma solução contendo a enzima. A presença de líquido no pulmão, embora
em pequenas quantidades, tende a gerar atelectasias (JOHNSTON; CARVALHO, 2008)
e outras alterações que não são compatíveis com o enfisema (IRION; MARCHIORI;
HOCHHEGGER, 2009). Por ser mais fisiológico, nós propomos um modelo com a
pulverização do pó da papaína. Além disso, nós fracionamos a dose com o objetivo de
parcelar o recrutamento celular, o que acontece no desenvolvimento do enfisema com
cigarro em humanos. Por esse motivo, como comparativo, foi utilizado o modelo com
inalação da fumaça do cigarro. Investigou-se, também, o efeito da castração, como
forma de avaliar se as mulheres pós-menopausa correm riscos adicionais de desenvolver
a doença. Além disso, como a radiografia convencional de tórax, exame de simples
execução, geralmente é um dos primeiros a serem solicitados na avaliação de paciente
com queixas e história de exposição compatíveis com o enfisema (BRUNO et al.,
2009), realizou-se a análise radiológica dos animais.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
52
2.1 Metodologia com Animais
Os experimentos com animais foram realizados após aprovação pelo Comitê de
Ética e Pesquisa da UESPI (CEP-UESPI 001/2012) e foram desenvolvidos em
conformidade com as diretrizes do conselho nacional de controle de experimentação
animal - CONCEA. Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus, albinus, Wistar), com
três meses de vida e peso médio de 300 g ± 20 g provenientes do Biotério da UFPI. Os
animais foram mantidos sob condições livres de organismos patogênicos. Os
procedimentos de anestesia foram realizados com administração subcutânea de 0,2 ml
de midazolam e 0,3 ml de ketamina. Para a eutanásia foi realizada tração cervical.
2.1.1 Grupos experimentais
Foram formados 5 grupos (n=10): grupo controle; grupo enfisema/papaína 22d,
grupo enfisema/papaína 31d; grupo enfisema cigarro e grupo enfisema/papaína
22d/castração.
2.1.2 Ooforectomia das ratas
O procedimento de ooforectomia pode ser visualizado na ilustração 1.
Ilustração 1: Ooforectomia das ratas.
Após a indução anestésica, os animais foram imobilizados em decúbito ventral e,
em seguida, foi realizado a tricotomia do dorso entre as últimas costelas e a região
pélvica, ilustração 1.a. A sepsia foi feita com álcool iodado a 2%. Em seguida, foi feito
uma incisão de 1 cm na pele e na musculatura, ilustração 1.b, possibilitando o acesso a
cavidade abdominal. Com uma pinça, foi puxada delicadamente a gordura que envolve
o ovário para fora da incisão, expondo o órgão e a porção superior do corno uterino,
a c
g f e
d b
h
53
ilustração 1.c. Com uma pinça hemostática, foi pinçado o tecido entre o ovário e o
oviduto, ilustração 1.d, procedendo a uma ligadura (com o fio) e excisão do ovário,
ilustração 1.e. Então, pela mesma incisão foi puxado o segundo corno uterino para que a
operação fosse realizada no outro ovário, ilustração 1.f. Por fim, foram recolocados os
cornos uterinos na cavidade abdominal e realizada a suturada na camada muscular e na
pele, ilustração 1.h.
2.1.3 Indução do enfisema
Os modelos utilizados neste estudo são apresentados na ilustração 2.
Ilustração 2: Modelos de enfisema. Legenda: (a) grupo cigarro; (b) grupos papaína.
Para induzir o enfisema com cigarro, os animais ficaram em uma câmara acrílica
medindo 40x30x25 cm por 30 minutos duas vezes ao dia, totalizando 8 cigarros (marca
US Mild) com filtro por dia, durante 45 dias. A câmara de inalação continha quatro
aberturas superiores, para permitir a ventilação, e duas aberturas laterais para a
introdução dos cigarros, destaques na ilustração 2.a. A indução do enfisema pulmonar
por papaína foi realizada por meio de três pulverizações, com intervalos de 7 dias entre
elas, de 3 mg de papaína, ilustração 2.b. A pulverização foi realizada utilizando um
microspray (Penn-Century®
). A dosagem estabelecida foi adaptada do modelo
experimental de Fusco (FUSCO et al., 2002).
2.1.4 RX dos animais
a b
54
Para a análise dos achados radiológicos, os animais foram anestesiados e
dispostos em decúbito ventral e perfil para a realização do RX em um RAEX RC/300
D®. Foram utilizados, como parâmetros, 225mA e 49KV.
2.2 Metodologia com células e tecidos
No 22° e 31° dia da primeira pulverização de papaína e no 45°dia de inalação de
cigarro, os animais foram eutanasiados para a realização do LBA, que permite a
contagem total e diferencial de células, e do histopatológico.
2.2.1 Lavado broncoalveolar
A canulação da traqueia para a realização do lavado é apresentada na ilustração 3.
Ilustração 3: Lavado broncoalveolar
Após a anestesia, foram retirados 10 ml de sangue pela artéria abdominal. Em
seguida, foi realizado a traqueostomia e o acoplamento da cânula, ilustração 3.a-c, a
qual foi fixada à traqueia para evitar o extravasamento da Solução Salina Fosfatada
Tamponada (PBS), indicada pela seta na ilustração 3.c. Através da cânula, foram
introduzidos 20 ml de PBS, ilustração 3.d. Durante a introdução, foi realizada uma
massagem na região torácica e em seguida, foram aspirados de 17 a 20 ml do lavado, o
qual foi centrifugado por 10 min a 1500 rpm. Então, foram coletados 0,5 ml para
contagem diferenciada (câmera de suta). Ao botão celular, foram adicionados 0,5 ml de
PBS e 0,8 ml de cristal violeta. Em seguida foi coletado 0,1 ml da amostra para
contagem em câmera de Neubauer. A contagem diferenciada foi realizada após coração
com panótico rápido, de acordo com as instruções do fabricante, Laborclin®.
2.2.2Histopatológico
Para retirada do pulmão foi realizada uma perfusão cardíaca para a retirada do
sangue pulmonar. Em seguida, os animais foram novamente acoplados à cânula.
a d c b
55
Através dessa, foi introduzido formaldeído a 10% tamponado. Os pulmões foram
conservados por um período de 24 horas e então, transferidos para recipientes contendo
álcool etílico a 70%, onde permaneceram por cerca de 72 horas. Em seguida, procedeu-
se à desidratação das peças em série alcoólica de concentração crescente (80% por 1
hora, 90% por uma hora, 95% por uma hora e 100% em dois banhos de uma hora cada).
Então foram diafanizadas em xilol (duas passagens de duas horas), impregnadas em
parafina histológica (duas passagens de duas horas em estufa a 60oC) e colocadas em
blocos de parafina. Os blocos foram seccionados em micrótomo Olympus, modelo CUT
4055 II, em seções com 5,0 µm de espessura. As amostras seccionadas foram, em
seguida, desparafinizadas em xilol (2/ 3 minutos) e hidratadas em série alcoólica de
concentração decrescente até água pura (100%/2 minutos, 95%/2 minutos, 70%/2
minutos e água destilada), conforme descrito anteriormente (SILVA et al., 2004).
As lâminas contendo os cortes histológicos foram, então, coradas com
Hematoxilina-Eosina (HE), PAS-Alcian Blue, Tricrômicos de Masson e Picrosírius, de
acordo com as instruções do fabricante, Easypath®
.
2.3 Análise estatística
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e, em
seguida, ao teste Newman-Keuls. As análises estatísticas foram conduzidas utilizando o
GraphPad Prism 5. Os resultados foram expressos como a média ± erro-padrão da
média (EPM). Valores de p<0,001 foram considerados significativos.
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
O enfisema induzido por fumaça de cigarro em modelos animais, assim como os
modelos de enfisema com papaína, contam com o inconveniente da falta de
padronização, pois diferem no tempo de exposição, no protocolo utilizado para induzir
as lesões e, consequentemente, nos graus de alterações produzidas (WRIGHT; CHURG,
2002). O primeiro modelo animal de enfisema com inalação de fumaça de cigarro foi
relatado em 1990. Nesse modelo, a exposição de porquinho-da-índia a 10 cigarros por
dia, 5 dias por semana, durante 1, 3, 6 e 12 meses resultou em enfisema e perda
progressiva da função pulmonar semelhantes ao observado em humanos (WRIGHT;
CHURG, 1990). Entretanto, a exposição de cigarro por 45 dias já é o suficiente para se
obter recrutamentos neutrofílicos e alterações histopatológicas compatíveis com o
56
enfisema, como já havia sido relatado (OLIVEIRA et al., 2010; ALVES et al., 2010).
Por esse motivo, os animais do grupo cigarro foram expostos a 45 dias de inalação.
O primeiro modelo com papaína foi desenvolvido em ratos há quase 50 anos
(GROSS et al., 1965). Depois dele, outros modelos surgiram, como o desenvolvido com
instilação (TAKARO; WHITE, 1973) e nebulização (HADDAD et al., 1979) de solução
de papaína em cães. Dentre os modelos de papaína em ratos, podemos destacar o que
causou enfisema com a instilação de cerca de 6mg de papaína por animal e avaliou o
enfisema após 50 dias. Esse modelo de enfisema, em muitos aspectos, se assemelha ao
encontrado em humanos (FUSCO et al., 2002). Entretanto, a curto prazo, esse modelo
não se mostrou tão compatível, uma vez que foram encontradas grande áreas de
congestão e de colabamento alveolar (DANTAS et al., 2012). Uma forma de se
contornar esse problema é através do modelo proposto por este estudo, onde o
fracionamento e a pulverização do pó de papaína permitiram, em pouco tempo, que os
achados característicos do enfisema fossem encontrados. Os dados que fundamentam
isso podem ser encontrados nas ilustração 4-8.
Na ilustração 4, são apresentados os dados da contagem total de células do LBA.
Ilustração 4: Contagem total de células do LBA. Os valores apresentados representam
a média ± E.P.M. dos experimentos realizados (n = 10).***, estatisticamente
significativo, p<0,001. ANOVA seguida de Newman-Keuls.
Os dados apresentados na ilustração 4 mostram que os grupos papaína e o grupo
cigarro apresentaram, em relação ao controle, um aumento significativo na contagem
57
total de células inflamatórias, os dois modelos são potentes indutores inflamatórios. Isso
é relevante porque existe uma associação positiva entre o número de células
inflamatórias e a gravidade do enfisema (CHUNG; ADCOCK, 2008).
Ainda na ilustração 4, ao compararmos os dois grupos papaína, é possível
constatar uma rápida progressão do recrutamento celular, no grupo papaína 31d em
relação ao grupo 22d, uma vez que o grupo 31d apresentou um aumento significativo na
contagem celular do LBA. Esse acréscimo pode ser atribuído a existência de um
feedback de degradação (ELIAS; LEE, 2005). Esse feedback pode ser causado, por
exemplo, pelas proteinases do hospedeiro (KUHN; STARCHER, 1980). Em outras
palavras, esses dados mostram que existe uma progressão da inflamação no modelo de
enfisema induzido por papaína.
Na ilustração 5, são apresentados os dados da contagem de neutrófilos do LBA.
Ilustração 5: Contagem de neutrófilos do LBA. Os valores apresentados representam a
média ± E.P.M. dos experimentos realizados (n = 10).***, estatisticamente
significativo, p<0,001. ANOVA seguida de Newman-Keuls.
É possível observar na ilustração 5 que o grupo controle apresentou uma
contagem de neutrófilos estatisticamente próximo a zero. Isso mostra que os animais do
grupo controle estão saudáveis, os neutrófilos são abundantes no sangue, mas
praticamente ausentes nos tecidos pulmonares saudáveis (WAGNER; ROTH 2000).
Também é possível observar que os grupos papaína apresentaram uma proporção maior
58
de neutrófilos que o grupo cigarro. Vale salientar que os neutrófilos são as células
inflamatórias encontradas em maior quantidade em pacientes com enfisema, eles são
observados no escarro induzido e no LBA desses pacientes. Os neutrófilos secretam
proteinases como a elastase neutrofílica, a catepsina neutrofílica e a proteinase
neutrofílica-3, que irão contribuir para o desequilíbrio entre proteases e antiproteases e
irão provocar a destruição do tecido pulmonar. Além disso, no período da exacerbação
da DPOC, há maior aumento do número de neutrófilos nas vias aéreas e no LBA
(TARANTINO, 2008).
Na ilustração 6, são apresentados os dados da contagem de macrófagos do LBA.
Ilustração 6: Contagem de macrófagos do LBA. Os valores apresentados representam a
média ± E.P.M. dos experimentos realizados (n = 10).***, estatisticamente
significativo, p<0,001. ANOVA seguida de Newman-Keuls.
Os macrófagos alveolares são representantes da primeira linha de defesa
pulmonar e atuam na depuração pulmonar através da captação, transporte e eliminação
de partículas, microorganismos e líquido por processos de fagocitose, pinocitose e
digestão (VALENÇA et al.; 2004, VALENÇA; PORTO 2008). Em condições normais,
representam 90% das células aspiradas na contagem celular do LBA, o que explica a
grande proporção de macrófagos no grupo controle, ilustração 6 (RUFINO; SILVA,
2006).
Na ilustração 7, são apresentados os dados da contagem de linfócitos do LBA.
59
Ilustração 7: Contagem de linfócitos do LBA. Os valores apresentados representam a
média ± E.P.M. dos experimentos realizados (n = 10).***, estatisticamente
significativo, p<0,001 . ANOVA seguida de Newman-Keuls.
Os macrófagos também desempenham um papel importante na inflamação da
DPOC por meio da liberação de mediadores, tais como o TNF-alfa, IL-8 e LTB4, que
promovem a inflamação neutrofílica (MENEZES et al., 2005). Entretanto, no LBA de
pacientes com DPOC ocorre uma diminuição percentual de macrófagos e uma
manutenção na contagem total de linfócitos (TARANTINO, 2008; RUFINO; SILVA,
2006; RUFINO et al., 2007). Dessa forma, o modelo de enfisema com papaína
mostrou-se mais adequado do que o modelo utilizando o cigarro por 45 dias pois,
proporcionalmente, o modelo com papaína apresentou uma proporção menor de
macrófagos, ilustração 6, e linfócitos, ilustração 7, em relação ao modelo utilizando o
cigarro. Nesse último, ocorreu neutrofilia acompanhada de acúmulo de macrófagos e
linfócitos, o que já havia sido observado em outros estudos com cigarro (WRIGHT,
2001; MESHI et al., 2002).
Isso, porém, não diminui a importância dos macrófagos e linfócitos na
patogênese da DPOC. Em biópsias brônquicas obtidas a partir de vias aéreas centrais, os
fumantes tiveram um aumento do número de macrófagos e linfócitos T em comparação
com não fumantes (MENEZES et al., 2005). Foi verificado, também, que no tecido
60
pulmonar de pacientes com DPOC as áreas mais destruídas eram circundadas por
processo macrofágico e linfocitário. Estudos do processo inflamatório que ocorre tanto
nas vias aéreas quanto na periferia pulmonar de pacientes com DPOC têm demonstrado
infiltrado de linfócitos T associado aos macrófagos, fazendo com que os autores
sugerissem a interação entre essas células na patogênese da DPOC (HOGG; SENIOR,
2002).
Embora seja menos acessível, uma vez que a papaína é barata e pode ser
comprada na maioria das farmácias de manipulação, também é possível desenvolver
enfisema com EPP. Estudos recentes e relevantes utilizaram o modelo de enfisema com
EPP, dentre esses, podemos citar a pesquisa envolvendo o FCP (HOU; CHENG et al.,
2013) e o anticolinérgico brometo Mepenzolate (TANAKA et al., 2013). Nessas
pesquisas, os autores relatam que encontraram um grau de destruição parenquimatosa
equivalente ao encontrado no grupo papaína 22d e 31d, foco do presente estudo, como
pode ser visto na ilustração 8.
Ilustração 8: Análise histopatológica dos grupos avaliados. Lâminas a, e, j objetiva de
40X, demais lâminas na objetiva de 10X. Legenda: Coloração PAS-Alcian Blue (PAS)
(a) do grupo controle; (b) grupo enfisema papaína 31d; (c e d) grupo cigarro 45d; (e)
Picrosírius do grupo controle; (f e g) Tricrômicos de Masson (Massom) do grupo
papaína; (h) Massom do grupo cigarro 45d; (i) Hematoxilina-Eosina (HE) do grupo
a
l
b c d
e f g h
i j k
61
controle; (j) HE do grupo papaína 31d; (k) HE do grupo papaína 22d; (l) Picrosírius do
grupo cigarro 45d.
Analisando a ilustração 8, podemos notar a ausência de metaplasia de célula
caliciforme e de muco, ilustração 8.a. No entanto na ilustração 8.b, podemos visualizar a
destruição do parênquima alveolar (em destaque) e a presença de pouca metaplasia de
célula caliciforme e de muco; já na ilustração 8.c, o destaque indica a presença de
metaplasia de célula caliciforme e infiltrado celular, nessa lâmina também foi
encontrado um aumento na quantidade de muco, e na ilustração 8.d o destaque indica a
presença de metaplasia de célula caliciforme. Na ilustração 8.e, podemos perceber a
pouca concentração de colágeno (em vermelho), o que foi confirmado quando se corou
o bloco dessa lâmina com Masson (nesse caso, mostrando o colágeno em azul),
enquanto que na ilustração 8.f e 8.g, percebe-se a presença das fibras colágenas,
caracterizada pela cor azul. Na ilustração 8.h, percebe-se uma maior proporção de fibras
colágenas do que o encontrado na ilustração 8.f e 8.g. Por fim, analisando a ilustração
8.i, percebe-se a preservação da estrutura pulmonar, na ilustração 8.j, pode-se visualizar
a presença de infiltrado de células inflamatórias; na ilustração 8.k, nota-se que houve a
perda de parênquima pulmonar e na ilustração 8.l, visualiza-se o aumento na
concentração de fibras colágenas.
Analisando a coloração PAS-Alcian Blue (PAS), ilustração 8, podemos observar
que, em relação ao controle, ilustração 8.a, o grupo cigarro 45d apresentou grandes
áreas de infiltrado inflamatório, presença de metaplasia de células caliciformes e
aumentos na quantidade de muco, ilustração 8.c e 8.d. Esses resultados são mais
característicos da bronquite crônica e não do enfisema (MARTINEZ; GOTTSCHALL,
1979). Apesar dos grupos papaína 22d e 31d apresentarem grandes áreas de infiltrado
celular, ilustração 8.j, não foi encontrado aumento significativo na metaplasia de células
caliciformes e nem no muco. Os achados mais característico desses grupos foi a
destruição parenquimatosa, como pode ser observado nas colorações PAS e HE,
ilustração 8.b e 8.k, respectivamente.
Ainda na ilustração 8, podemos analisar a deposição de colágeno. Essa
deposição, analisada pelos métodos de coração de Tricrômicos de Masson (Masson) e
Picrosírius, revela que o grupo cigarro 45d apresentou maior quantidade de colágeno
que os grupos papaína. Esse resultado pode ser observado ao compararmos a coração
Masson, ilustração 8.h, e Picrosírius, ilustração 8.l, do grupo cigarro 45d com a coração
62
Masson dos grupos papaína, ilustração 8.f e 8.g. O enfisema é uma patologia sem
fibrose óbvia e esta fibrose, em grande parte, esta relacionada à deposição de colágeno
(KIELTY; SHERRATT; SHUTTLEWORTH, 2002). Dessa forma, mais uma vez, o
modelo com papaína se mostra mais adequado para o estudo do enfisema do que o
modelo com cigarro.
Embora não tenhamos desenvolvido uma modelo comparativo entre a papaína e
o EPP, em muitos aspectos, pelos dados da literatura, o modelo de enfisema com
papaína revelou-se mais adequado para o estudo isolado do enfisema do que o com
elastase. Segundo a literatura, no enfisema induzido por EPP, ocorre metaplasia de
células secretoras, anormalidades da função pulmonar, hipoxemia, e hipertrofia
ventricular direita, as quais são características da DPOC humano, ou seja, bronquite
crônica e enfisema. A administração intratraqueal de EPP é seguida pela perda inicial de
elastina e colágeno. Ao longo do tempo, a elastina e os glicosaminoglicanos retornam
ao normal e o colágeno aumenta novamente, ainda que a matriz extracelular
intraparenquimatosa (ECM) permaneça reduzida e distorcida e a arquitetura do pulmão
permaneça grosseira e permanentemente anormal (KUHN et al., 1976).
Na ilustração 9, são apresentados os RX dos grupos avaliados.
Ilustração 9: RX dos grupos avaliados. Legenda: (a) RX em perfil do grupo controle;
(b) RX póstero-anterior (PA) do grupo controle; (c) RX PA do grupo cigarro 45d; (d)
RX PA do grupo papaína castração; (e) RX PA do grupo papaína 22d; (f) RX PA do
grupo papaína 31d.
A radiografia convencional de tórax, exame de simples execução, geralmente é
um dos primeiros a serem solicitados na avaliação de paciente com queixas e história de
exposição compatíveis com o enfisema. Dentre as alterações radiológicas compatíveis
com essa doença, podemos destacar a presença de hiperinsuflação pulmonar, apesar de
poder estar presente em outras situações como no transplante pulmonar e na
63
bronquiolite obliterante, o aumento do diâmetro ântero-posterior e do espaço
retroesternal e o aplainamento e retificação das cúpulas diafragmáticas. Todos esses
achados tendem a aumentar o tamanho pulmonar. Estudos antigos já correlacionavam a
medida objetiva do tamanho pulmonar na radiografia de tórax com alterações
espirométricas, encontrando grande reprodutibilidade e valores preditivos positivos
muito confiáveis. Na análise estatística do tamanho do tórax, ilustração 9, entretanto,
não foram encontradas diferenças significativas nos grupos avaliados, o que pode ser
devido ao estágio inicial da patologia, já que poucas alterações morfológicas podem ser
surpreendidas nas fases iniciais com esse método. À medida que ocorre a progressão da
doença, porém, algumas alterações com razoável sensibilidade e baixa especificidade
podem ser encontradas na radiografia convencional (REICH; WEINSHELBAUM;
YEE, 1985; BRUNO et al., 2009).
Outra apresentação radiológica muito associada à DPOC, e que também não foi
encontrada na ilustração 9, é a formação de bolhas pulmonares, verdadeiras “ilhas”
avasculares e destituídas de parênquima pulmonar funcionante e responsáveis por piora
funcional respiratória atribuída a compressão de tecido preservado adjacente, além de
potencial gerador de pneumotórax, complicação sempre temida no contexto da doença
bolhosa. Apesar da clara associação existente entre enfisema e formação de bolhas,
outras patologias podem cursar com a mesma manifestação. Um exemplo corrente em
nosso meio é a sequela de tuberculose em sua forma de caverna insuflada gerada por
mecanismo de válvula unidirecional e desestruturação da árvore brônquica com
apresentação radiográfica bastante semelhante da bolha enfisematosa (FRIEDMAN,
2008).
Por fim, a curto prazo, quando se comparou as ratas castradas com as não
castradas, não foram observadas alterações significativas na contagem total e diferencial
de células e nem na análise anatomopatológica. Entretanto, a longo prazo, o resultado
encontrado poderia ser diferente, pois tanto o estrogênio quanto os demais hormônios
esteroidais atuam na transcrição gênica (PRENZEL et al., 2011), no processo de
inicialização da lipoperoxidação, na proteção contra dano no DNA (VIGO et al., 2003;
COLARES, 2011; THOMAS et al., 2011) e na regulação da atividade das enzimas
antioxidantes, como a glutationa peroxidase (ROBB; STUART, 2011).
4 CONCLUSÃO
64
De acordo com os resultados dos achados do LBA, podemos concluir que o
modelo de enfisema com papaína revelou-se mais adequado para o estudo isolado do
enfisema do que o modelo utilizando o cigarro como desencadeador do enfisema. No
modelo com papaína foi encontrado um maior recrutamento neutrofílico, em relação aos
macrófagos e linfócitos, bem como uma maior destruição parenquimatosa. Além disso,
foi encontrado uma menor metaplasia de células caliciformes e uma menor deposição de
colágeno do que a encontrada no modelo com cigarro. Dessa forma, no estudo da
bronquite crônica associada ao enfisema, a melhor opção seria o modelo com cigarro.
Pode-se concluir ainda que, na análise do efeito da castração sobre o
desenvolvimento do enfisema, não foram encontradas diferenças significativas, o que
não significa que esse efeito não ocorra, uma vez que esse efeito pode ter sido
mascarado pela agressiva inflamação e destruição proporcionada pela pulverização da
papaína. Uma forma de confirmar isso seria através da análise do efeito da castração
durante um longo período de tempo.
Além disso, não foram encontradas diferenças radiológicas significativas nos
grupos avaliados, o que pode ser devido ao estágio inicial da patologia, já que poucas
alterações morfológicas do enfisema podem ser surpreendidas nas fases iniciais com
Raio-X.
Por fim, podemos concluir que o modelo de enfisema com pulverização de
papaína mostrou ser uma ferramenta útil, particularmente, para o estudo de lesão
proteolítica. Além disso, os achados inflamatórios seguintes à administração de papaína
sugerem que este modelo também pode fornecer informações relevantes no estudo
inflamatório e de proteases endógenas.
65
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70
CAPÍTULO II: Mikania glomerata Spreng.: Desenvolvimento
de uma formulação para entrega pulmonar
Artigo submetido à revista Journal of Pharmaceutical
Sciences
71
Mikania glomerata Spreng.: Desenvolvimento de uma formulação para entrega
pulmonar
DANTAS, R.L.1; CAMPELO, N.B.
2; LEAL, L.H.C.
2; OLIVEIRA, G.L.S.
1; REIS, E. V.
S.3; ALVES W. S.
4; MEDEIROS, M.G.F.
1; NUNES, L.C.C.
1
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do
Piauí, Teresina, Piauí, Brasil.
2Curso de Farmácia da Universidade Federal do Piauí, Teresina, Brasil.
3Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Piauí,
Parnaíba, Brasil.
4Programa de Pós-Graduação em Ciência da Reabilitação da Universidade Nove de
Julho, São Paulo, Brasil.
RESUMO
A Mikania glomerata Sprengel, popularmente conhecida como guaco, atua eficazmente
como broncodilatadora, expectorante e supressora da tosse. Com o objetivo de obter
extratos secos com as características proporcionadas pela secagem por aspersão, que são
necessárias para a entrega pulmonar, e com a estabilidade de constituintes encontradas
na secagem por liofilização, foi realizado um planejamento fatorial para avaliar,
quantitativamente, a influência da temperatura de entrada e da percentagem de
Aerosil®200 sobre as respostas de interesse, bem como as possíveis interações entre os
fatores. Além disso, foi utilizado com marcador a cumarina, em análise feita em um
espectrofotômetro UV, e a atividade antioxidante, avaliada pelo método baseado na
eliminação do radical livre estável 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH•). Também foi
realizada a análise microbiológica dos produtos acabados. Os resultados evidenciaram
uma perda de atividade antioxidante quando a secagem foi realizada com temperatura
de entrada de 170°C e a preservação das características físicas, a longo prazo, nos
extratos secos com 30% de Aerosil®200. Diante disso, podemos concluir que o melhor
método de secagem por aspersão utiliza 30% de Aerosil®
200 e uma temperatura de
entrada de 140°C. Foi observado, também, que a preservação do teor de cumarina no
extrato seco por aspersão, mesmo com a utilização de temperaturas de saída de 106°C,
se deve, provavelmente, a microencapsulação promovida pelo Aerosil®
200. Pôde-se
constatar, ainda, que a cumarina, isoladamente, não deve estar associada a atividade
72
antioxidante. Dessa forma, outros compostos mais termolábeis que ela devem ser os
responsáveis por tal atividade. Por fim, as secagens por aspersão e liofilização
mantiveram, estatisticamente, a mesma população microbiológica e, uma vez que o
tamanho de partícula, 1-5 mµ, a fluidez, a estabilidade e a atividade do extrato seco
foram conseguidos, a formulação seca com 30% de Aerosil®200 e temperatura de
entrada de 140°C poderá ser uma candidata para estudos que a utilizem por via
pulmonar.
PALAVRAS-CHAVE: Asteraceae; Antioxidantes; Guaco; Liofilização; Parâmetros de
secagem.
Abstract: Mikania glomerata Spreng.: Development of a formulation for pulmonary
delivery
The Mikania glomerata Sprengel, popularly known as guaco, effectively acts as a
bronchodilator, expectorant and cough suppressant. In order to obtain powders with the
features offered by spray drying, which are necessary for pulmonary delivery, and the
stability of constituents found in the freeze-drying a factorial experimental design was
conducted to assess quantitatively the influence of temperature input and the percentage
of Aerosil®200 on the responses of interest, as well as possible interactions between
factors. Furthermore, it was used with marker coumarin, in analysis in a UV
spectrophotometer, and antioxidant activity, assessed by eliminating method based on
the stable free radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH •). Microbiological analysis
of finished products was also performed. The results showed a loss of antioxidant
activity when drying was performed with inlet temperature of 170°C and the
preservation of the physical characteristics, long-term, in dry extracts with 30%
Aerosil®200. Therefore, we conclude that the best method of spray drying uses 30% of
Aerosil®200 and an inlet temperature of 140°C. It was also observed that the
microencapsulation promoted by Aerosil®200 preserves the content of coumarin in the
spray dried extract, even with the use of the outlet temperature of 106°C. We could as
well observe that coumarin alone should not be associated with antioxidant activity.
Thus, other more labile compounds that it should be responsible for such activity.
Finally, the spray drying and freeze drying remained statistically similar
microbiological population, and, since the particle size, 1-5 mμ, the fluidity, stability
and activity of the dry extract were obtained, the dry formulation with 30% of
73
Aerosil®200 and inlet temperature of 140°C may be a candidate for use in studies for
pulmonary delivery.
KEYWORDS: Asteraceae; Antioxidants; Guaco; Freeze-dryer; Parameters of drying.
1 INTRODUÇÃO
A Mikania glomerata Sprengel, popularmente conhecida como guaco, é uma
planta da família Asteraceae que atua eficazmente na broncodilatação, expectoração e
supressão da tosse. Esta planta faz parte da "Lista de Fitoterápicos com Registro
Simplificado" da ANVISA e é um dos 12 fitoterápicos de interesse do SUS. O xarope
de guaco, produzido com o extrato fluido alcoólico, e a cápsula, produzida a partir do
extrato seco, são as formas farmacêuticas utilizadas na terapêutica de doenças das vias
aéreas superiores, incluindo bronquite, pleurite, tosse, asma, gripes e resfriados
(RADÜNZ et al., 2012).
Embora disponível em duas formas farmacêuticas, o extrato seco é a
apresentação farmacêutica mais comercializada (ROCHA et al., 2008), uma vez que
apresenta uma série de vantagens em relação ao extrato alcoólico, as quais podemos
destacar: maior estabilidade química, físico-químicas e microbiológicas, mais fácil
padronização, maior concentração de compostos ativos e uma maior capacidade de
transformação em diferentes tipos de formas farmacêuticas sólidas (OLIVEIRA;
PETROVICK, 2010).
Uma das melhores formas de se obter o extrato seco é através da secagem a frio
ou por aspersão. Na secagem por aspersão é realizado a pulverização do fluido dentro
de uma câmara de secagem. Nessa câmera, uma corrente de ar quente gera a evaporação
do solvente em frações de segundos. Essa velocidade de evaporação é, em grande parte,
decorrente da grande área superficial gerada pela atomização do líquido. Como
vantagens desse processo, temos o fato de que o tamanho de partícula, a distribuição de
tamanho, a densidade e o teor de umidade podem ser controlados somente por
modificações nos parâmetros de secagem. Essa versatilidade é primordial, por exemplo,
quando se objetiva a entrega pulmonar. Além disso, esse processo fornece pós com a
fluidez necessária para a utilização dessa via de administração (CARVALHO;
MARTINS, 2004; DOAN; COUET; OLIVIER, 2011; SILVA et al., 2012). Cabe
salientar que, além da secagem por aspersão, é possível produzir pós, com todas as
74
características necessárias para a entrega pulmonar, por secagem a frio (OH et al., 2011;
YOO et al., 2011).
A secagem a frio, também conhecida como liofilização, é amplamente utilizada,
uma vez que permite a secagem e mantém a estabilidade de compostos termicamente
instáveis (por exemplo, medicamentos a base de proteínas) (TANG; PIKAL, 2004).
Como esse método de secagem mantém a estabilidade dos constituintes químicos, é por
vezes utilizado como método de referência para comparar as experiências de secagem
(RATTI, 2001; STRÅLSJÖ et al., 2003).
Porém, é inviável se comparar todos os constituintes químicos de um extrato
vegetal. Dessa forma, o mais adequado é a utilização de marcadores. Neste estudo, que
objetivou a obtenção de extratos secos com as características físicas proporcionadas
pela secagem por aspersão e a estabilidade de constituintes encontradas na secagem por
liofilização, foi utilizada a cumarina (2H-1-benzopiran-2–ona) como marcador (LEITE
et al., 1993).
A cumarina é um dos constituintes majoritários da M. glomerata e contribui,
significativamente, para o efeito farmacológico dessa planta. Ela também é responsável
por cerca de 50 a 60% da atividade broncodilatadora, que ocorre através do relaxamento
do músculo liso pulmonar (CELEGHINI; VILEGAS; LANÇAS, 2001; WANG; LIU,
2009; SOARES et al., 2012).
Além da cumarina, a atividade antioxidante dos extratos secos também foi
utilizada como marcador, alguns extratos vegetais reduzem inflamações por eliminar
superóxidos conhecidos por participarem do recrutamento de células
polimorfonucleares presentes em tecidos inflamados, ou seja, existe uma correlação
entre as atividades antioxidante e anti-inflamatória (THAMBI et al., 2006).
Selecionada a forma de secagem, é preciso escolher o melhor adjuvante, uma
vez que é uma variável particularmente importante na secagem por aspersão de extratos
vegetais. Nesse método de secagem, o adjuvante pode determinar a estabilidade e a
qualidade do extrato, além de afetar as características de biodisponibilidade
(OLIVEIRA; PETROVICK, 2010). Entretanto, do ponto de vista farmacotécnico,
quando se trata da secagem do extrato da M. glomerata por aspersão, a escolha do
Aerosil®200 (dióxido de silício coloidal) já se encontra bem fundamentada. Isso ocorre,
em grande parte, devido à elevada superfície específica e ao alto poder adsorvente desse
adjuvante (SILVA et al., 2012; SOARES et al., 2012). Além disso, não foi encontrado
75
efeito patogênico do Aerosil®200 no pulmão, por se tratar de uma sílica amorfa, a qual
pode ser degradada pelos macrófagos (KAWASHIMA et al., 1998).
Além das análises químicas e físicas, que são relevantes para o desenvolvimento
de uma forma farmacêutica, também é preciso se investigar a existência de
contaminação microbiológica dos produtos acabados. Isso é ainda mais relevante
quando se trabalha com matérias-primas de origem biológica, como os extratos de
plantas. Porém, é impossível monitorar de forma eficiente a contaminação por todos os
micro-organismos. Dessa forma, é utilizado o estudo de micro-organismos indicadores,
que são grupos ou espécies que quando presentes fornecem informações sobre a
ocorrência de contaminação, as quais são uteis no controle da qualidade
(BATTAGLINI, 2010).
Diante do exposto e levando em consideração que na secagem por aspersão, para
desenvolver um extrato vegetal seco para a entrega pulmonar, precisa-se, normalmente,
trabalhar com temperaturas entre 100°C a 200°C, o presente estudo objetivou realizar
uma otimização da secagem dos extratos obtidos a partir da Mikania glomerata
Sprengel. Para tanto, foi realizado um planejamento fatorial, o qual consiste de uma
técnica extremamente econômica que pode ser utilizada para avaliar,
qualiquantitativamente, a influência de vários fatores simultâneos sobre a resposta de
interesse, bem como as possíveis interações entre esses fatores (BARROS, 2003). Neste
estudo, também verificou-se a influência do aumento da temperatura e da proporção de
Aerosil®200 sob a umidade residual, no rendimento líquido, no aspecto físico, no teor
de cumarina e na atividade antioxidante dos extratos secos. Além disso, realizou-se a
análise microbiológica dos extratos.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Extrato vegetal
O extrato vegetal, obtido da Schraiber (São Paulo, Brasil), foi produzido a partir
da M. glomerata oriunda da região sul do Brasil. Esse extrato apresentava as seguintes
propriedades: líquido límpido e homogêneo, cor castanho escuro, pH de 5,97, teor
alcoólico de 36%, densidade de 0,903 g/ml (conforme descrito na farmacopeia
5°edição), resíduo seco de 2,7% (mensurado por sistema de secagem por infravermelho)
e índice de refração de 1,350 nD. Além disso, na análise microbiológica foi encontrado
76
uma quantidade de bactérias heterotróficas de 3x102 UFC/ml (35°C/ 48h) e de fungos e
leveduras de < 102 UFC/ml.
2.2 Secagem do extrato por aspersão e liofilização e análise da influência dos fatores
O cálculo da quantidade de Aerosil®200 a ser adicionado foi feito a partir do
resíduo seco do extrato, conforme equação 1.
( ) ( ) ( )
( ) , Eq. (1)
onde: RS = resíduo seco, VS = volume secado, PA = percentagem de Aerosil®200
Todas as secagens foram realizadas em duplicata. A secagem por aspersão foi
realizada em Mini Spray Dryer (BÜCHI B-290). Os parâmetros de secagem foram
mantidos constantes durante todo o processo de secagem. Foram realizadas seis
secagens organizadas em três planejamentos fatoriais 22: aumento de temperatura de
120 a 140°C, de 140 a 170°C e de 120 a 170°C, com 15 e 30% de Aerosil®200. A
junção dos três planejamentos pode ser visto na tabela 1. Nesses planejamentos, é
possível avaliar, quantitativamente, a influência das três temperaturas (120°C, 140°C e
170°C) e das duas percentagens de Aerosil®200 (15 e 30%) sobre as respostas de
interesse, bem como as possíveis interações desses dois fatores. A análise dos dados
desse planejamento foi realizada conforme descrito anteriormente (BARROS, 2003).
Durante a secagem, as soluções extrativas adicionadas dos adjuvantes tecnológicos
foram mantidas sob agitação durante todo processo de secagem. Para os seis extratos foi
utilizada uma velocidade de fluxo de 7,0 mL/min. e pressão de 600 mmHg. Na secagem
a frio, o solvente etanólico do extrato foi evaporado, a 45°C e sob pressão reduzida, em
seguida a água foi retirada por liofilização, conforme descrito anteriormente (SANTOS
et al., 2012).
Tabela 1: Planejamento fatorial dos experimentos realizados.
Planejamento Temperatura de admissão Percentagem de Aerosil®
200
1° 120 °C
140 °C
15%
30%
2° 140 °C
170 °C
15%
30%
3° 120 °C
170 °C
15%
30%
77
Fonte: Acervo pessoal.
2.3 Rendimento
O rendimento bruto obtido após o processo de secagem dos extratos foi
calculado em relação à massa teórica de sólidos totais presente nas soluções extrativas.
Os sólidos totais correspondem ao teor de resíduo seco da solução extrativa, que é o
resíduo seco (%) vezes o volume secado (ml), somada ao peso do adjuvante adicionado
(resultado da equação 1).
2.4 Análise do tamanho de partícula
Para a análise do tamanho de partícula, foram contabilizadas 500 partículas, em
triplicata, na objetiva de 40X e com a utilização de uma lente óptica especial que
permitia a quantificação do tamanho de partícula. A contagem foi realizada em um
microscópio óptico Olympus BX41 (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010).
2.5 Teor de umidade
A determinação da umidade residual presente em todos os extratos secos foi
realizada logo após a secagem, seguindo metodologia descrita na Farmacopéia
Brasileira 5a edição. Os resultados foram expressos em perda percentual de umidade em
massa através da média de três determinações.
2.6 Avaliação da capacidade antioxidante in vitro
Para avaliar a ação antioxidante foi utilizado o método baseado na eliminação do
radical livre estável 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH•). A molécula de DPPH•,
ilustração 1, é bastante conhecida por caracteriza-se como um radical orgânico livre
estável que tem muitas vantagens, tais como uma boa estabilidade na ausência da luz,
aplicabilidade, simplicidade e viabilidade (SCHERER; GODOY, 2009; DENG;
CHENG; YANG, 2011). O método DPPH é utilizado em mais de 90% dos estudos de
avaliação antioxidante de substâncias puras, misturas ou matrizes complexas (MOON;
SHIBAMOTO, 2009).
78
Ilustração 1: Forma radicalar (1) e não radicalar (2) do DPPH. Acervo pessoal.
2.7 Análise do teor de cumarina por espectrofotômetro-UV
A análise do teor de cumarina foi realizada em um Espectrofotômetro UV
(Micronal AJX-3000PC) em 275 nm. A curva de calibração foi preparada usando como
padrão a cumarina padrão 2H-1-benzopiran-2-ona (Sigma - Aldrich, São Paulo, Brasil).
Como solvente, foi utilizado metanol/água na proporção de 80:20. Para a determinação
da curva de calibração, foram preparadas sete diluições a partir da solução inicial de 480
μg/mL. Assim, a curva de calibração foi determinada, em triplicata, utilizando soluções
com concentrações de 4,80 μg/mL, 5,76 μg/mL, 6,72 μg/mL, 7,68 μg/mL, 8,64 μg/mL,
9,60 μg/mL e 10,56 μg/mL. A equação de linha foi: Y = 0,089x + 0,5601 e R2 =
0,9966.
Para determinar o nível de cumarina dos extratos secos, inicialmente, uma
solução inicial de 480 μg/ml foi preparada por diluição de 24 mg do extrato seco, em 50
mL de uma solução de metanol/água (4:1). Em seguida, uma segunda diluição foi
efetuada, retirando-se uma alíquota de 8 mL da solução-inicial em 25 mL de uma
solução de metanol/água (4:1), obtendo-se uma concentração teórica final de 153,6
mg/mL.
O valor inicial da cumarina (antes do processamento) foi determinado através da
análise da absorvância de uma alíquota de 0,8 mL do extrato fluido de guaco que foi
diluído em 100 ml de uma solução metanol/água (4:1) e lido no espectrofotômetro a 275
nm. O valor obtido foi utilizado na equação de linha revelando o nível de cumarina
presente no extrato fluido. Esta metodologia foi realizada conforme descrito
anteriormente (CARVALHO; MARTINS, 2004; SOARES et al., 2012).
79
4.2 Análise microbiológica
2.8.1 Preparação das amostras e diluições seriadas
Na pesquisa por microrganismos mesófilos em superfície, bolores e leveduras e
Escherichia coli, foram realizadas três diluições com solução salina 0,85% (NaCl). Na
pesquisa por Salmonella spp foi realizado o mesmo número de diluições, no entanto,
utilizando como solvente a água peptonada (APT) 0,1% na proporção de 1:10 (pré-
enriquecimento) (SILVA, 1997; BRASIL, 2010).
2.8.2 Contagem total de microrganismos mesófilos em superfície
A contagem total de microrganismos mesófilos em superfície foi realizada em
meio de cultura ágar padrão para contagem (PCA) através da inoculação de 0,1 ml da
amostra. Após o espalhamento com alça de drigalski, foi realizada a incubação em
estufa a 35-36ºC/48h (SILVA, 1997).
2.8.3 Pesquisa de Escherichia coli
A pesquisa por Escherichia coli foi realizada através de diluições seriadas com
inoculação de 1 mL da amostra em 3 séries de 3 tubos de Caldo Lauril Sulfato Triptose
(LST), incubados em estufa a 35-36ºC/24-48h (SILVA, 1997).
2.8.4 Contagem de bolores e leveduras
A contagem de bolores e leveduras foi realizada em meio de cultura ágar
sabouraud-dextrose inoculando 0,1 ml da amostra. Após espalhamento com Alça de
Drigalski, foi realizada a incubação em estufa a 24-25°C/ 7dias (BRASIL, 2010).
2.8.5 Pesquisa de Salmonella spp
Na determinação da presença de Salmonella spp, inicialmente o extrato foi
diluído em água peptonada 0,1% e incubado a 35-36ºC/24h em estufa para o pré-
enriquecimento. Em seguida uma alíquota de 0,1 mL foi retirada da APT e inoculadas
em Caldo Rappaport, para seleção dos microrganismos, e incubadas em banho-maria a
42ºC/24h (RODRIGUES, 2003). Então, uma alçada foi retirada do Caldo Rappaport e
estriadas em placas contendo meios diferenciais, ágar enteric hecktoen (HE) e ágar
salmonella-shigela (SS), sendo em seguida incubados em estufa a 35-36ºC/24h
(PAIVA, 2006). Por fim, com uma agulha de inoculação, removeu-se a porção central
80
da colônia desejada e inoculou-se em tubos com meios de provas bioquímicas, ágar três
açúcares ferro (TSI) e ágar lisina ferro (LIA), que foram incubados a 35-36ºC/24h em
estufa. A identificação de Salmonlla spp foi feita com base nas características das
colônias nos meios TSI e LIA.
4.3 Planejamento fatorial e análise estatística
Foi utilizado o planejamento fatorial 22, conforme descrito anteriormente
(BARROS, 2003). Para a análise estatística da média ± E.P.M. foi utilizado o GraphPad
Prism 5, que também foi utilizado para realizar a análise estatística da eliminação do
radical DPPH∙, nesse caso, foi realizado pelo método ANOVA seguida de Newman-
Keuls, sendo utilizado p<0,0001.
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 Rendimento líquido dos processos de secagem
Devido à aderência do extrato seco nos compartimentos do Spray Dryer, houve
uma perda de massa no produto seco obtido a partir do processo de secagem por
aspersão em comparação com o processo de liofilização, por conseguinte, o rendimento
líquido médio do processo de secagem por atomização foi de 80%. Tendo por base
outros estudos de otimização do processo de secagem, esse valor apresentou-se dentro
do esperado. Caso o rendimento fosse inferior a 80%, poderia ser realizado uma
diminuição da alimentação, velocidades de alimentação excessivas conduzem à
diminuição da temperatura de saída e ao acúmulo do material sobre as paredes da
câmara (ROCHA, LUCIO et al., 2008; OLIVEIRA; PETROVICK, 2010).
Na ilustração 2, é apresentado a influencia dos fatores sobre o rendimento das
secagens por aspersão. Ao analisarmos os dados do rendimento líquido das secagens por
aspersão, ilustração 2, pode-se observar que houve influência apenas da concentração de
Aerosil®200, ou seja, o aumento da percentagem de 15 para 30%, em qualquer uma das
temperaturas analisadas (120°C, 140°C e 170°C), propiciou, estatisticamente, o
aumento no rendimento.
Esse comportamento, onde os melhores rendimentos foram obtidos nas
concentrações mais altas de Aerosil®200, também foi observado utilizando a
metodologia da superfície de resposta.
81
Ilustração 2: Rendimento das secagens por aspersão. Os valores representam a média ±
E.P.M. dos resultados obtidos, em duplicata (n=4), dos planejamentos fatoriais 22. *
superior ao limite de significância.
Entretanto, se houvesse um aumento ainda maior na percentagem de
Aerosil®200, provavelmente, ocorreria um aumento na quantidade de sólidos, o que
provocaria um aumento da viscosidade do meio, dificultando assim a aspersão da
solução extrativa. Isso, além de influenciar o rendimento, diminuiria a concentração de
ativos vegetais (VASCONCELOS, MEDEIROS et al., 2005).
3.6 Tamanho de partícula
Com relação ao tamanho de partícula, foi verificado que todos os extratos secos
por aspersão apresentaram um tamanho variando de 1 a 2 μm. Partículas com tamanho
entre 1-5 μm possuem uma maior probabilidade de se atingir a porção inferior do
sistema respiratório. Então, se o objetivo terapêutico for as porções superiores deste
sistema, um aumento do tamanho das partículas deverá ser realizado (HASSAN; LAU,
2011).
Esse aumento poderá ser feito através de modificações na viscosidade, no
conteúdo de sólidos, na tensão superficial do produto fluido a secar e no fluxo de
alimentação (SANTOS; SHARAPIN, 2000). O aumento no conteúdo de sólidos eleva a
viscosidade, resultando em pós com maior densidade. Além disso, quanto menor o
82
conteúdo de sólidos em uma suspensão, maior o espaço vazio no interior da partícula
(ballooning) e menor a espessura das paredes (CAO et al., 2000). A tensão superficial
do material a ser seco também exerce influencia proporcional sobre a energia gasta para
formar as gotículas. Nesse caso, a adição de tensoativos é utilizada com a finalidade de
reduzir a tensão superficial, propiciando a formação de gotículas menores e ao aumento
na velocidade de aspersão (DE CAMPOS, 1996; SOARES, 2002). O aumento na
temperatura do material de entrada, normalmente, pode reduzir a tensão superficial e a
viscosidade das amostras, o que também influência o tamanho de partícula (SOARES,
2002). Além disso, a distribuição e o tamanho de partícula estão relacionados ao
tamanho das gotículas formadas pelo processo de aspersão. Portanto, a escolha do tipo
do aspersor é extremamente relevante (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010).
No entanto, é importante levar em consideração que o aumento no tamanho das
partículas, embora não alterem as forças de adesão entre as superfícies dos carreadores,
estão relacionados com a diminuição da aerolização (OOI et al., 2011). Além disso, foi
observado que o desempenho da aerolização é governado por colisões entre as
partículas carreadoras, quando transportadores homogêneos são utilizados,
permanecendo constante em relação à concentração da droga (YOUNG et al., 2011).
Logo, pode-se inferir que uma forma de aumentar o tamanho das partículas e manter seu
desempenho é aumentar o fluxo de aerolização (OOI et al., 2011).
Caso se objetive a entrega de partículas grandes na porção inferior do sistema
respiratório, uma diminuição da densidade da partícula deverá ser realizada pela adição
de agentes porogênicos. Uma das primeiras pesquisas com partículas porosas foi
realizada em 1997. Nessa pesquisa, grandes partículas porosas com densidades de
massa <0,4 g/cm3 e diâmetro médio >5 μm forneceram deposição pulmonar profunda da
droga inalada. A utilização dessas partículas grandes se mostra interessante,
principalmente, se a permanência prolongada da partícula for o desejável. Isso ocorre
porque partículas grandes ajudam a contornar os mecanismos de limpeza nos pulmões.
Para uma deposição profunda, deverá ser mantida uma densidade <1.0 g/cm3. Para
tanto, poderá ser utilizado, por exemplo, o bicarbonato de amônio (EDWARDS et al.,
1997; GUPTA; AHSAN, 2011; OGAIN et al., 2011; OH et al., 2011; YOO et al., 2011).
3.7 Teor de umidade
Outro parâmetro que foi analisado por meio do planejamento fatorial foi o teor
de umidade. O teor de umidade variou de 5 a 10%, no extrato seco a 120ºC e com 15%
83
de Aerosil®200 e no extrato seco a 170°C e com 30% de Aerosil
®200, respectivamente,
ou seja, os fatores temperatura de secagem e percentagem de Aerosil®200 são
inversamente proporcionais. Assim, quanto maior a percentagem de adjuvante e da
temperatura de entrada, menor foi o teor de umidade encontrado. A influência dos
parâmetros avaliados, sobre o teor de umidade, podem ser vistos na ilustração 3.
Ilustração 3: Teor de umidade das secagens por aspersão. Os valores representam a
média ± E.P.M. dos resultados obtidos, em duplicata (n=4), dos planejamentos fatoriais
22. * superior ao limite de significância.
Na ilustração 3, é possível observar que, logo após a secagem do extrato, o fator
com maior influencia sobre o teor de umidade foi a temperatura. Entretanto,
transcorridos 6 meses da secagem por aspersão, independente da temperatura de
secagem, todos os extratos secos que continham 15% de Aerosil®200 apresentavam-se
na forma semi-sólida e com coloração enegrecida, fato que não foi observado nos
extratos secos com 30% de Aerosil®200. Esses últimos extratos, permaneceram com as
mesmas características físicas observadas logo após a secagem, ilustração 4.
Na ilustração 4 também é possível observar outra mudança quanto ao aspecto
físico visual. Nos extratos secos com 30% de adjuvante é possível observar que o
extrato seco se torna mais claro a medida que aumenta a temperatura de secagem. O
aspecto de um pó bege claro, homogêneo e seco, é observado no extrato seco a 170°C e
84
30% de adjuvante. Essa característica é considerada de boa aparência para o
desenvolvimento de cápsulas (SOARES et al., 2012).
Ilustração 4: Análise macroscópica dos extratos após seis meses da secagem.
Esses resultados corroboram com outra pesquisa onde a análise descritiva dos
dados de umidade residual dos extratos secos de Schinus terebinthifolius Raddi mostrou
que o nível que produz os menores valores para teor de umidade é o de 30% de
concentração de Aerosil®200, independente da temperatura. Além disso, a análise de
superfície de resposta ajustada aos dados de umidade residual dos extratos secos mostra
que, à medida que o parâmetro de temperatura é aumentado em associação ao aumento
do percentual de adjuvante, a umidade residual diminui e ocorre uma maior estabilidade
aos efeitos da higroscopicidade (VASCONCELOS et al., 2005). Essa estabilidade pode
ser atribuída a uma possível microencapsulação das partículas do extrato seco pelo
Aerosil®200 (CORNEC, 1990).
A influência da concentração de Aerosil®200 também foi analisada na secagem
de soluções extrativas da Maytenus ilicifolia Martius ex Reissek. Nessa secagem, o
aumento da adição do adjuvante, de 10 para 20%, causou uma redução significativa da
higroscopicidade dos produtos secos (OLIVEIRA, 2010; WANG; WANG, 2000). A
escolha pelo emprego de Aerosil®200 na concentração de 30% também foi observada
em outras pesquisas (SILVA, 2007; OLIVEIRA; PETROVICK, 2010).
85
Entretanto, uma vez que a umidade residual para os medicamentos fitoterápicos
sólidos deve permanecer entre 8% e 14%, apenas os extratos secos a 120 e 140°C
estariam dentro do determinado (MICHELIN et al., 2010). Uma forma de se adequar o
teor de umidade do extrato seco a 170°C seria aumentando o fluxo de alimentação. Esse
aumento de fluxo causaria a diminuição da temperatura de saída, a qual é a responsável
pelo teor de umidade final do extrato seco (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010). As
temperaturas de saída podem ser visualizadas na tabela 2.
Tabela 2: Temperaturas de saída dos ensaios
Ensaios Temperatura de admissão Temperatura de saída
1 120 °C 74 °C
2 140 °C 89 °C
3 170 °C 106 °C
Fonte: Acervo pessoal.
Além do uso do adjuvante, que mostrou-se crucial para a estabilidade do extrato
seco a longo prazo, poderia ser observada a influência da utilização de algum excipiente
farmacotécnico. Em várias pesquisas, a utilização conjunta de adjuvantes e excipientes
trouxe melhor preservação da droga transportada e melhora da fração de partícula fina
(FPF), força de aderência e morfologia, uma vez que a incorporação diminuiu as forças
coesivas e auxiliou no fluxo (DEVRIM; CANEFE, 2011; LEBHARDT et al., 2011;
OSMAN et al., 2011; POURSHAHAB et al., 2011; TAKAMI; MURAKAMI, 2011;
YOUNG et al., 2011; TULI et al., 2012).
Entretanto, uma vez que existe o desafio técnico de entregar uma dosagem
significativa de fitoterápico, sem que exceda o tamanho de partícula ou a densidade de
entrega pulmonar, neste estudo, optou-se pela não utilização do excipiente. Essa mesma
estratégia já havia sido utilizada anteriormente (DOAN et al., 2011; SON;
MCCONVILLE, 2011). Porém, a ausência de excipiente pode, em alguns casos, não
ser adequada em relação à eficiência e segurança no tratamento, uma vez que permite a
liberação imediata (DOAN et al., 2011).
Nesse contexto, poderia ser utilizado um carreador que propiciasse uma entrega
pulmonar com liberação sustentada. Uma opção para tal fim é a incorporação do
polietilenoglicol (PEG), que gera compostos biodegradáveis e mucoadesivos,
principalmente quando o PEG é associado a outros compostos, como a quitosana, que
permite o entumescimento da partícula, o que aumenta a absorção do fármaco por evitar
86
a depuração pelos macrófagos. Outra opção é o copolímero–poli (L-ácido láctico-co-
ácido glicólico)–PLGA (BEYERLE et al., 2011; DOAN et al., 2011; SELVAM et al.,
2011; TAKAMI; MURAKAMI, 2011; E-SHERBINY; SMYTH, 2012).
3.5 Atividade antioxidante
Por meio do método baseado na eliminação do DPPH• foi possível observar que
houve uma perda da atividade antioxidante quando o extrato foi seco a 170°C. Nessa
temperatura, não foi observada nenhuma atividade antioxidante. Entretanto, ainda que a
temperatura de entrada de 170°C possa ser consideravelmente elevada, os sólidos em
cada partícula nunca são aquecidos acima da temperatura de saída. Dessa forma, foi a
temperatura de saída de 106°C quem inviabilizou a atividade antioxidante. Como já foi
discutido anteriormente, seção 3.4, uma forma de reduzir a temperatura de saída seria
aumentar o fluxo de alimentação. Porém, uma vez que trabalhando com solventes com
ponto de ebulição baixo, a secagem com temperatura de entrada de 170°C, torna-se
desnecessária (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010).
Na ilustração 5 são apresentados os dados da análise da eliminação do radical
DPPH.
Ilustração 5: Análise da eliminação do radical DPPH. Os valores representam a média
± E.P.M. dos resultados obtidos. *** estatisticamente significativos, ANOVA seguida
do teste de Newman-Keuls, p<0,0001.
87
Todas as outras temperaturas de secagem, o que também inclui a secagem por
liofilização, apresentaram, estatisticamente, a mesma atividade antioxidante. Além
disso, não foi observada diferença estatisticamente significativa com relação a
percentagem de Aerosil®
200 e a atividade antioxidante, ilustração 5. Esse resultado da
atividade antioxidante acabou por direcionar a escolha pelo extrato seco a 140°C. Além
disso, pela relevância que foi mostrada, pode vir a se tornar uma análise constante na
otimização de secagens por aspersão.
3.6 Análise do teor de cumarina
As principais técnicas para a determinação de cumarinas na M. glomerata e seus
derivados são a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a cromatografia
gasosa (GC) (CELEGHINI; VILEGAS; LANÇAS, 2001). No entanto, devido à
natureza e à posição dos substituintes químicos, as cumarinas podem ser identificadas
por espectrofotometria UV (AMARAL et al.; WAND; LIU, 2009). Essa técnica
analítica, para identificação de cumarinas, tem algumas vantagens em comparação com
a de HPLC-UV, tais como a redução dos custos de operação e tempo de análise, o fato
de ser uma técnica simples e com um menor impacto ambiental, uma vez que o reagente
utilizado no método de HPLC-UV, acetonitrilo, é teratogênico com um perfil tóxico por
várias vias de absorção (SOARES et al., 2012).
88
Ilustração 6: Análise do teor de cumarina.Os valores representam a média ± E.P.M.
dos resultados obtidos. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls, p<0,005.
TROCAR
Dessa forma, foi utilizada a análise do teor de cumarina por meio de um
espectrofotômetro-UV. Nessa análise, foi possível observar que não ocorreu perda de
cumarina ao elevar a temperatura da secagem por aspersão. Os valores encontrados na
secagem por aspersão são semelhantes, estatisticamente, aos encontrados no extrato
seco por liofilização, ilustração 6.
Na ilustração 6, é possível observarmos que, embora não tenha sido
estatisticamente significativa, ocorreu uma discreta perda de cumarina ao aumentarmos
a percentagem de Aerosil®200. Isso já era o esperado uma vez que a percentagem de
extrato seco diminui ao se aumentar a percentagem do adjuvante de secagem.
Porém, a semelhança estatística do teor de cumarina nos extratos secos por
aspersão e liofilização difere de outro estudo. Nesse, constatou-se que o extrato de
guaco seco por liofilização apresentou um nível mais elevado de cumarina em
comparação ao seco por atomização, onde foi utilizada a temperatura de entrada de
170°C e de saída de 80°C (SOARES et al., 2012). No entanto, esses pesquisadores
utilizaram baixos teores de Aerosil®
200, 8 e 10%. Dessa forma, uma vez que a
propriedade de microencapsulação do Aerosil®200 há muito encontra-se fundamentada
(CORNEC, 1990), a utilização de teores mais elevados de Aerosil®200, 15 e 30%, pode
ter permitido a preservação da cumarina, mesmo com temperaturas de saída chegando a
106°C, temperatura essa superior a temperatura de degradação da cumarina, cerca de
69 a 73 °C (MERCK, 2006; SANTOS; SILVA, 2008; ARAÚJO; ECHEVERRIA;
PASTORE, 2012).
Uma vez que a atividade antioxidade não foi preservada quando se utilizou
temperaturas de entrada de 170°C, a cumarina, isoladamente, não deve estar associada a
essa atividade. Além disso, outros compostos mais termolábeis que ela devem ser os
responsáveis por essa atividade antioxidante.
3.7 Análise microbiológica
A contagem total da análise microbiológica, nos extratos secos por aspersão e
liofilização, foi estatisticamente semelhante. No extrato seco por aspersão foi
89
encontrado 5,2x10² UFC/g de bactérias e 1,8x10² UFC/g de fungos. As pesquisas por
Escherichia coli e Salmonella sp deram negativas. Embora muitos microrganismos,
como a Escherichia coli (REMILI; BOUSSARD; DEVLEESCHOUWER, 1994), sejam
sensíveis as temperaturas utilizadas na secagem por aspersão (SILVA et al., 2012), os
fungos e as micotoxinas são, em sua maioria, termoestáveis mantendo-se ativos após
tratamentos térmicos (BATTAGLINI, 2010).
Em 1994, uma pesquisa com 82 extratos de plantas secos por aspersão, de
diferentes lotes e fabricantes, estabeleceu como parâmetro de avaliação o limite de 103
UFC/g para bactérias e de 102
UFC/g para os fungos. Dessa forma, os valores
encontrados estão dentro dos limites aceitáveis (SILVA et al., 2012).
Tendo em vista que o crescimento microbiano é improvável nos extratos secos a
140 e 170°C, devido ao baixo teor de água, (BOSS, 2004), que a contagem total se
mostrou estatisticamente semelhante na liofilização e na secagem por aspersão e que os
valores encontrados no produto acabado foi semelhante ao do extrato bruto, seção 2.1,
os cuidados para o desenvolvimento de uma formulação para a entrega por via aérea
teriam que ser direcionados para a carga biológica da planta original. Logo, uma
solução seria o tratamento físico ou químico do extrato líquido antes do processo de
secagem, o que possibilitaria a diminuição da população microbiológica e tornaria mais
segura à entrega do extrato seco por via aérea.
4 CONCLUSÃO
Tendo em vista a perda de atividade antioxidante que ocorreu na secagem com
temperatura de entrada de 170°C, e a preservação das características físicas, a longo
prazo, nos extratos secos com 30% de Aerosil®
200, podemos concluir que o melhor
método de secagem do extrato da M. glomerata é o que utiliza 30% de Aerosil®200 e
temperatura de entrada de 140°C. Essa escolha da temperatura baseia-se, também, nas
melhores características físicas do extrato seco a 140°C em relação ao seco a 120°C.
Além disso, podemos concluir que a semelhança estatística do teor de cumarina
do extrato liofilizado em relação ao seco por aspersão, mesmo com a utilização de
temperaturas de saída de 106°C, se deve, provavelmente, a microencapsulação
promovida pelo Aerosil®
200, uma vez que a cumarina deveria se degradar na faixa de
temperatura entre 69 e 73 °C. Podemos concluir ainda que, como a atividade
antioxidade não foi preservada quando se utilizou essa mesma temperatura de saída e a
90
percentagem mais alta de Aerosil®
200, a atividade antioxidante não deve estar
associada a cumarina. Dessa forma, outros compostos mais termolábeis que ela devem
ser os responsáveis por essa atividade.
Como as formas de secagem, aspersão e liofilização, mantiveram,
estatisticamente, a mesma população microbiológica, e a análise microbiológica do
extrato bruto foi semelhante ao do produto acabado, uma atenção maior deverá ser dada
ao extrato líquido. Por fim, podemos concluir que, uma vez que foi conseguida um
tamanho de partícula entre 1-5 µm, fluidez, estabilidade e atividade do extrato seco,
essa formulação poderá ser uma candidata para estudos que permitam sua utilização por
via pulmonar.
91
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97
CAPÍTULO III: Avaliação do efeito da Mikania glomerata
Spreng. ao ser pulverizada no pulmão de animais com
enfisema induzido por papaína
Artigo submetido à revista Journal of Pharmaceutical
Sciences
98
Avaliação do efeito da Mikania glomerata Spreng. ao ser pulverizada no pulmão de
animais com enfisema induzido por papaína
DANTAS, R.L.1; CAMPELO, N.B.
2; REIS, E. V. S.
3
ALVES W. S. 4; NUNES, L.C.C.
1
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do
Piauí, Teresina, Piauí, Brasil.
2Curso de Farmácia da Universidade Federal do Piauí, Teresina, Brasil.
3Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Piauí,
Parnaíba, Brasil.
4Programa de Pós-Graduação em Ciência da Reabilitação da Universidade Nove de
Julho, São Paulo, Brasil
RESUMO
O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da M. glomerata sobre o enfisema
pulmonar induzido por papaína. A formulação foi desenvolvida por aspersão e aplicada
por via pulmonar. No grupo controle positivo, foi utilizado o glicocorticoide
budesonida. De acordo com os resultados obtidos podemos concluir que a utilização do
extrato seco da M. glomerata no tratamento do efisema pulmonar mostrou-se muito
eficiente, uma vez que houve uma diminuição significativa no recrutamento neutrofílico
e na contagem total de células. Devido seu potencial terapêutico, há a necessidade de
estudos mais aprofundados sobre a sua utilização, por via pulmonar, para o tratamento
de patologias com predominância de achados inflamatórios. Entretanto, como o
recrutamento de neutrófilos foi, proporcionalmente, menor que o de macrófagos,
podemos concluir que estava ocorrendo acúmulo do extrato seco da M. glomerata no
pulmão. Dessa forma, existe a necessidade de otimizar algumas características do
extrato seco (como a biodegradabilidade) e a dose entregue sem, contudo, afetar a
eficácia de seu efeito terapêutico. Por fim, embora o efeito da M. glomerata tenha sido
estudado em relação aos achados celulares e histopatológicos, um dos seus maiores
benefício para o enfisema, sua ação broncodilatadora, bem como seus efeitos de
toxicidade não foram avaliados. Dessa forma, os benefícios da utilização dessa planta
precisam ser estudados a exaustão.
99
PALAVRAS-CHAVE: Enfisema pulmonar; Mikania glomerata; Modelos Animais;
Papaína; Histopatologia.
Abstract: Evaluation of the effect of Mikania glomerata Spreng. to be sprayed in the
lungs of animals with papain-induced emphysema
The present study aimed to evaluate the effect of M. glomerata on pulmonary
emphysema induced by papain. The spray formulation was developed and applied by
the pulmonary route. In the positive control group, the glucocorticoid budesonide was
used. According to the obtained results we can conclude that the use of the dry extract
of M. glomerata in the treatment of pulmonary emphysema proved to be very effective,
since a significant reduction in neutrophil recruitment and total cell count was found.
Because of its therapeutic potential, there is a need for further studies on its use by the
pulmonary route for the treatment of diseases with predominant inflammatory findings.
However, as the recruitment of neutrophils was proportionally smaller than that of
macrophages, we can conclude that was occurring buildup of the dry extract of M.
glomerata in the lung. Thus, there is a need to optimize certain characteristics of dry
extract (such as biodegradability) and the dose delivered without, however, affecting the
efficacy of therapeutic effect. Finally, although the effect of M. glomerata has been
studied in relation to cellular and histopathological findings, one of its greatest benefit
to emphysema, the bronchodilator effect, and its toxicity effects were not assessed.
Thus, the benefits of using this plant need to be studied to exhaustion.
KEYWORDS: Pulmonary Emphysema; Mikania glomerata; Animal Models; Papain;
Histopathology.
1 INTRODUÇÃO
O enfisema pulmonar é uma patologia progressiva caracterizada pelo aumento
permanente dos espaços aéreos distais ao bronquíolo terminal, acompanhado pela
destruição de suas paredes e perda de elasticidade do parênquima. Todas essas
consequências, que ocorrem sem fibrose óbvia, contribuem para a redução do volume
expiratório forçado em um segundo (VEF1) (KIELTY; SHERRATT;
SHUTTLEWORTH, 2002; ROBBESOM et al., 2007; BARR et al., 2010).
100
Uma vez que o quadro de enfisema esteja estabelecido, nenhum agente anti-
inflamatório ou antioxidante e nem mesmo o pilar de tratamento da patologia, o qual
envolve β2 agonistas, anticolinérgicos de longa ação e corticosteróides inalados,
conseguirá afetar o declínio da FEV1 e nem o curso da doença (CALVERLEY;
RENNARD, 2007; DECRAMER; JANSSENS; MIRAVITLLES, 2012).
Com o enfisema estabelecido, os tratamentos mais promissores são os que
utilizam o uso ou recrutamento de células-tronco endógenas e exógenas ao pulmão.
Como exemplo, temos o fator de crescimento de hepatócitos (FCH) (HEGAB et al.,
2008), a administração exógena de células-tronco (GRIFFITHS; BONNET; JANES,
2005), a utilização do ácido all-trans-retinóico e do fator estimulador de colônias de
granulócitos humanos (FECGH) (ISHIZAWA et al., 2004).
O primeiro passo para evitar que o enfisema se estabeleça é o diagnóstico
precoce. Nesse contexto, os biomarcadores seriam de extrema relevância, uma vez que
através deles os primeiros sinais da doença poderiam ser detectados mesmo quando os
sintomas ainda não estão presentes e os danos irreversíveis do enfisema ainda não se
instalaram. Entretanto, como o enfisema é uma doença multifatorial, esses
biomarcadores teriam que ser múltiplos e baseados nos mecanismos patogênicos mais
relevantes dessa doença (FU et al., 2010; GALBÁN et al., 2012; ROBINSON et al.,
2013).
Porém, mesmo quando o enfisema é diagnosticado em seu estagio inicial, ainda
existe uma carência de estratégias de tratamento que evitem sua evolução
(CALVERLEY; RENNARD, 2007; DECRAMER; JANSSENS; MIRAVITLLES,
2012). Como forma de reverter esse cenário, o uso da tecnologia farmacêutica é uma
opção para otimizar os resultados clínicos de medicamentos que já foram aprovados
para uso e que têm o potencial de se tornarem mais eficazes.
Dentre esses, podemos destacar os medicamentos desenvolvidos a partir da
Mikania glomerata Spreng. Essa planta é um dos 12 fitoterápicos de interesse do SUS
(RODRIGUES, SANTOS; AMARAL, 2006), sendo amplamente utilizada no
tratamento de alergias e inflamação, principalmente do sistema respiratório. Existem
evidências pré-clínicas de sua ação broncodilatadora, anti-inflamatória, antiespasmódica
e inibitória da inflamação imunológica (FALCÃO et al., 2005; GASPARETTO et al.,
2010; CZELUSNIAK et al., 2012).
101
Como forma de avaliar o efeito dessa planta no enfisema pulmonar, este estudo
teve como objetivo desenvolver uma formulação para a administração pulmonar em
ratos com enfisema pulmonar induzido por papaína.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Metodologia com a formulação
2.1.1 Extrato vegetal
O extrato vegetal, obtido da Schraiber (São Paulo, Brasil), foi produzido a partir
da M. glomerata oriunda da região sul do Brasil. Esse extrato apresentava as seguintes
propriedades: líquido límpido e homogênio, cor castanho escuro, pH de 5,97, teor
alcoólico de 36%, densidade de 0,903 g/ml (conforme descrito na farmacopeia
5°edição), resíduo seco de 2,7% (conforme sistema de secagem por infravermelho) e
índice de refração de 1.350 nD. Além disso, na análise microbiológica foi encontrado
uma quantidade de bactérias heterotróficas de 3.102 UFC/ml (35°C/ 48h) e de fungos e
leveduras < 10 UFC/ml.
2.1.2 Secagem do extrato por aspersão
Como adjuvante de secagem foi utilizado o Aerosil®200 (dióxido de silício
coloidal). O cálculo da quantidade de Aerosil®
200 foi baseado no resíduo seco do
extrato, conforme equação 1. A secagem por aspersão foi realizada em Mini Spray
Dryer (BÜCHI B-290). Foi utilizada temperatura de entrada de 140°C, fluxo da amostra
de 7,0 mL/min. e pressão de 600 mmHg. Os parâmetros de secagem foram mantidos
constantes e a solução extrativa adicionada do adjuvante tecnológico foi mantida sob
agitação durante todo processo de secagem.
( ) ( ) ( )
( ) , Eq. (1)
onde: RS = resíduo seco, VS = volume secado, PA = percentagem de Aerosil®200
2.2 Metodologia com Animais
102
Os experimentos com animais foram realizados após sua aprovação pelo Comitê
de Ética e Pesquisa da UESPI (CEP-UESPI 007/2012) e foram desenvolvidos em
conformidade com as diretrizes do conselho nacional de controle de experimentação
animal - CONCEA. Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus, albinus, Wistar), com
três meses de vida e peso médio de 300 g ± 20 g provenientes do Biotério da UFPI. Os
animais foram mantidos sob condições livres de organismos patogênicos. Os
procedimentos de anestesia foram realizados com administração subcutânea de 0,2 ml
de midazolam e 0,3 ml de ketamina. Para a eutanásia foi utilizada tração cervical.
2.2.1 Grupos experimentais
Foram formados 4 grupos (n=10): grupo controle, grupo papaína, grupo
budesonida e grupo M. glomerata.
2.2.2 Indução do enfisema
A indução do enfisema pulmonar por papaína foi realizado por meio de três
pulverizações de 3 mg de papaína, com intervalos de sete dias entre elas. A pulverização
foi realizada utilizando um microspray (Penn-Century®
), ilustração 1.a. Para a
visualização da via aérea dos animais foi desenvolvido um laringoscópio artesanal,
ilustração 1.b. A dosagem de papaína foi estabelecida adaptando o que Fusco
determinou em seu modelo experimental (FUSCO et al., 2002).
Ilustração 1: Laringoscópio artesanal, microspray e esquema de pulverização
2.2.2 Tratamento dos animais
O tratamento dos animais iniciou no 22° dia após a primeira pulverização de
papaína com administração, via microspray (Penn-Century®
), de doses diárias de
103
100mg de Busonid (Biosintética®), o que equivale a 200 mcg de budesonida, e 100mg
de M. glomerata por um período de cinco dias.
2.3 Metodologia com células e tecidos
No 27° dia de experimento, os animais foram eutanasiados para a realização da
análise do lavado broncoalveolar (LBA), análise que permite a contagem total e
diferencial de células, e análise histopatológica.
2.3.1 Lavado broncoalveolar
A canulação da traqueia para a realização do lavado é apresentada na ilustração 2.
Ilustração 2: Lavado broncoalveolar
Após a anestesia, foram retirados 10 ml de sangue pela artéria abdominal. Em
seguida, foi realizado a traqueostomia e o acoplamento da cânula, ilustração 2.a-c, a
qual foi fixada à traqueia para evitar o extravasamento da Solução Salina Fosfatada
Tamponada (PBS), indicada pela seta na ilustração 2.c. Através da cânula, foram
introduzidos 20 ml de PBS, ilustração 2.d. Durante a introdução, foi realizada uma
massagem na região torácica e em seguida, foram aspirados de 17 a 20 ml do lavado, o
qual foi centrifugado por 10 min a 1500 rpm. Então, foram coletados 0,5 ml para
contagem diferenciada (câmera de suta). Ao botão celular, foram adicionados 0,5 ml de
PBS e 0,8 ml de cristal violeta. Em seguida foi coletado 0,1 ml da amostra para
contagem em câmera de Neubauer. A contagem diferenciada foi realizada após coração
com panótico rápido, de acordo com as instruções do fabricante, Laborclin®.
2.3.2 Histopatológico
Para retirada do pulmão foi realizada uma perfusão cardíaca para a retirada do
sangue pulmonar. Em seguida, os animais foram novamente acoplados à cânula.
Através dessa, foi introduzido formaldeído a 10% tamponado. Os pulmões foram
a d c b
104
conservados por um período de 24 horas e então, transferidos para recipientes contendo
álcool etílico a 70%, onde permaneceram por cerca de 72 horas. Em seguida, procedeu-
se à desidratação das peças em série alcoólica de concentração crescente (80% por 1
hora, 90% por uma hora, 95% por uma hora e 100% em dois banhos de uma hora cada).
Então foram diafanizadas em xilol (duas passagens de duas horas), impregnadas em
parafina histológica (duas passagens de duas horas em estufa a 60oC) e colocadas em
blocos de parafina. Os blocos foram seccionados em micrótomo Olympus, modelo CUT
4055 II, em seções com 5,0 µm de espessura. As amostras seccionadas foram, em
seguida, desparafinizadas em xilol (2/ 3 minutos) e hidratadas em série alcoólica de
concentração decrescente até água pura (100%/2 minutos, 95%/2 minutos, 70%/2
minutos e água destilada), conforme descrito anteriormente (SILVA et al., 2004).
As lâminas contendo os cortes histológicos foram, então, coradas com
Hematoxilina-Eosina (HE), PAS-Alcian Blue, Tricrômicos de Masson e Picrosírius, de
acordo com as instruções do fabricante, Easypath®
.
2.4 Análise estatística
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e, em
seguida, ao teste Newman-Keuls. As análises estatísticas foram conduzidas utilizando o
GraphPad Prism 5. Os resultados foram expressos como a média ± erro-padrão da
média (EPM). Valores de p<0,001 foram considerados significativos.
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
No enfisema pulmonar há aumento de células inflamatórias em várias partes do
pulmão. Essas células, que produzem citocinas inflamatórias, tais como o fator de
necrose tumoral (FNT)-α, IL-1β, IL-6 e espécies reativas de oxigênio (ERO); em
particular, o ânion superóxido, e também produzem quimiocinas e outros
quimioatrativos, tais como a interleucina-8 (IL-8), a proteína quimiotática de
monócitos-1 (PQM-1) e o leucotrieno B4 (LTB4), promovem a manutenção do acumulo
de células inflamatórias no pulmão e estão diretamente associadas com a gravidade da
doença (RUBIO et al., 2004; FORONJY et al., 2006; CALVERLEY; RENNARD,
2007; KINOSHITA et al., 2007). Em outras palavras, existe uma interdependência
celular na manutenção da inflamação no enfisema (CHUNG; ADCOCK, 2008;
TARANTINO, 2008).
105
Na ilustração 3, são apresentados os dados da contagem total de células do LBA.
Ilustração 3: Contagem total de células do LBA. Os valores apresentados representam
a média ± E.P.M. dos experimentos realizados (n = 10).***, estatisticamente
significativo, p<0,001. ANOVA seguida de Newman-Keuls.
Analisando a ilustração 3, podemos notar que ocorreu, em relação ao controle,
um aumento significativo na contagem total de células no grupo papaína. Isso mostra
que essa enzima é um potente indutor inflamatório. Além disso, ocorreu, em relação ao
grupo papaína, uma redução significativa na contagem total de células no grupo
budesonida e M. glomerata. Essa redução na contagem total de células é fundamental
para a interrupção da manutenção do recrutamento celular.
Como resultado de uma lesão, as células epiteliais e endoteliais do pulmão,
secretam mediadores inflamatórios que induzem o recrutamento de células
inflamatórias. Essas células aparecem no local da lesão em uma sequência de tempo
determinada, conforme mostrado na ilustração 3 (SCHWACHA, 2009).
Entretanto, dependendo do agente provocador da lesão, bem como de sua
intensidade e frequência de exposição, ocorre a manutenção de tipos específicos de
células inflamatórios no pulmão (TARANTINO, 2002). No enfisema pulmonar, por
exemplo, ocorre a predominância de neutrófilos (RUFINO; SILVA, 2006; RUFINO et
106
al., 2007). Dessa forma, ao avaliarmos o efeito da budesonida e da M. glomerata sobre
o recrutamento celular no enfisema, especial atenção deverá ser dada a ilustração 5.
Ilustração 4: Sequência cronológica do recrutamento celular. Adaptada de Schwacha
(2009)
Na ilustração 5, são apresentados os dados da contagem de neutrófilos do LBA.
Os neutrófilos, uma das principais células presentes na inflamação pulmonar, são
responsáveis pela produção de serinas proteases, que são enzimas proteolíticas no tecido
pulmonar, sendo umas das poucas enzimas humanas com essa capacidade (SERRA et
al., 2008).
Na ilustração 5, é possível observar que a administração da budesonida
provocou a redução drástica no recrutamento de neutrófilos. A contagem diferencial de
neutrófilos neste grupo foi, estatisticamente, igual ao do grupo controle. Esse resultado,
provavelmente, é decorrente da dose significativa de budesonida que foi administrada
(200 mcg por dia, durante 5 dias). No mesmo gráfico, é possível observar que a
administração do extrato seco da M. glomerata também provocou redução significativa
no recrutamento das células características do enfisema, os neutrófilos. Tal resultado
107
deve, provavelmente, a ação anti-inflamatória apresentada pela planta utilizada
(FALCÃO et al., 2005; GASPARETTO et al., 2010; CZELUSNIAK et al., 2012).
Ilustração 5: Contagem de neutrófilos do LBA. Os valores apresentados representam a
média ± E.P.M. dos experimentos realizados (n = 10).***, estatisticamente
significativo, p<0,001. ANOVA seguida de Newman-Keuls.
Na ilustração 6, são apresentados os dados da contagem de macrófagos do LBA.
O LBA é mais confiável para quantificar a abundância de neutrófilos, pois essas células
migram diretamente dos capilares para o espaço alveolar, mas menos confiável para
avaliar a abundância de macrófagos, uma vez que muitos macrófagos permanecem no
espaço intersticial. Entretanto, mesmo menos confiável, a quantificação dos macrófagos
pelo LBA é crucial para o estudo do enfisema (SHAPIRO et al., 2003).
Analisando a quantidade de macrófagos, ilustração 6, é possível observar que a
M. glomerata induziu um recrutamento de macrófagos superior ao grupo papaína. Esse
comportamento é atribuído, principalmente, ao fato do extrato da M. glomerata ter a
característica de ser menos biodegradável que o extrato da papaína. Essa característica
se deve a presença do Aerosil®200, uma sílica amorfa, no extrato seco da M. glomerata,
que dificulta sua fagocitose pelos macrófagos (REHN et al., 2003). Vale lembrar que,
além da fagocitose, os macrófagos são responsáveis pela secreção de citocinas e
108
quimiocinas (ALNAJAR, 2013). As quimiocinas, por sua vez tem como uma de suas
funções, recrutar neutrófilos para pulmão enfisematoso (RUBIO et al., 2004;
FORONJY et al., 2006; KINOSHITA et al., 2007).
Ilustração 6: Contagem de macrófagos do LBA. Os valores apresentados representam a
média ± E.P.M. dos experimentos realizados (n = 10).***, estatisticamente
significativo, p<0,001. ANOVA seguida de Newman-Keuls.
Entretanto, uma vez que o recrutamento de neutrófilos, ilustração 5, foi
proporcionalmente menor ao número de macrófagos, ilustração 6, podemos inferir que
os macrófagos devem ter atuado, principalmente, no processo de fagocitose. Em outras
palavras, estava ocorrendo acúmulo de extrato seco de M. glomerata no pulmão. Tal
fato não ocorreu com a budesonida, provavelmente, por esta ser um medicamento cuja
utilização por via pulmonar já é consolidada.
Na ilustração 7, são apresentados os dados da contagem de linfócitos do LBA.
No LBA de pacientes com DPOC ocorre uma diminuição percentual de macrófagos e
uma manutenção na contagem total de linfócitos (TARANTINO, 2002; RUFINO;
SILVA, 2006; RUFINO et al., 2007). Entretanto, na fase tardia do enfisema ocorre
participação adicional dos linfócitos (RUFINO et al., 2007).
109
Ilustração 7: Contagem de linfócitos do LBA. Os valores apresentados representam a
média ± E.P.M. dos experimentos realizados (n = 10).***, estatisticamente
significativo, p<0,001. ANOVA seguida de Newman-Keuls.
Dessa forma, na fase tardia, o tratamento com a M. glomerata poderá mostrar-se
ainda mais relevante uma vez que no grupo M. glomerata ocorreu uma diminuição
maior de linfócitos do que no grupo budesonida, ilustração 7.
Corroborando com os resultados do LBA, temos os resultados do
histopatológico, que podem ser visualizados na ilustração 8.
Analisando a ilustração 8.a, podemos visualizar o parênquima pulmonar, corado
por PAS-Alcian Blue, de um animal do grupo controle. Nessa lâmina, é possível
observar que não ocorreu metaplasia de célula caliciforme e nem aumento da produção
de muco. Na ilustração 8.b, parênquima pulmonar do grupo controle corado por
Picrosírius. Nela é possível observar que também não ocorreu aumento na deposição de
colágeno (em vermelho). Na ilustração 8.h, podemos observar que não houve aumento
significativo na deposição de colágeno. Isso mostra que a lesão desenvolvida pela
papaína é adequada para o estudo do enfisema, uma vez que essa patologia não se
caracteriza por fibrose obvia e nem com metaplasia de célula caliciforme significativa.
110
Na ilustração 8.h, por exemplo, podemos visualizar a deposição de colágeno, em azul,
no grupo papaína (Masson). A metaplasia de células caliciformes e a fibrose são mais
características da bronquite crônica e não do enfisema (MARTINEZ; GOTTSCHALL,
1979; KIELTY; SHERRATT; SHUTTLEWORTH, 2002).
Ilustração 8: Análise histopatológica dos experimentos realizados. Legenda: coloração
PAS-Alcian Blue (PAS): (a) do grupo controle, (b) PAS do grupo controle; (c)
Hematoxilina-Eosina (HE) do grupo controle; (d) PAS do grupo budesonida; (e)
Picrosírius do grupo M. glomerata; (f) HE do grupo papaína; (g) PAS do grupo papaína;
(h) Tricrômicos de Masson (Masson) do grupo papaína.
Ainda na ilustração 8, podemos observar o que, na verdade já havia sido
reportado: embora os agentes anti-inflamatórios revertam a sintomatologia do enfisema,
eles não alteram o curso da doença (CALVERLEY; RENNARD, 2007; DECRAMER;
JANSSENS; MIRAVITLLES, 2012). Isto pode ser visualizado ao se analisar a
ilustração 8.d, a qual mostra uma destruição moderada do parênquima pulmonar no
grupo budesonida. Já na ilustração 8.e (corada por Tricrômicos de Masson), pode-se
observar o indicativo de uma destruição moderada/severa do parênquima no grupo M.
glomerata.
Por fim, embora o efeito da M. glomerata tenha sido estudado em relação aos
achados celulares e histopatológicos, um dos seus maiores benefício para o enfisema,
sua ação broncodilatadora, bem como seus efeitos de toxicidade não foram avaliados.
Dessa forma, os benefícios da utilização dessa planta precisam ser estudados a exaustão
(FALCÃO et al., 2005; GASPARETTO et al., 2010; CZELUSNIAK et al., 2012).
a d c b
e h g f
111
4 CONCLUSÃO
De acordo com os resultados obtidos podemos concluir que a utilização do
extrato seco da M. glomerata no tratamento do efisema pulmonar mostrou-se muito
eficiente, uma vez que houve uma diminuição significativa no recrutamento neutrofílico
e na contagem total de células. Devido seu potencial terapêutico, há a necessidade de
estudos mais aprofundados sobre a sua utilização, por via pulmonar, para o tratamento
de patologias com predominância de achados inflamatórios. Entretanto, como o
recrutamento de neutrófilos foi, proporcionalmente, menor que o de macrófagos,
podemos concluir que estava ocorrendo acúmulo do extrato seco da M. glomerata no
pulmão. Dessa forma, existe a necessidade de otimizar algumas características do
extrato seco (como a biodegradabilidade) e a dose entregue sem, contudo, afetar a
eficácia de seu efeito terapêutico.
Por fim, podemos concluir que embora o efeito da M. glomerata tenha sido
estudado em relação aos achados celulares e histopatológicos, um dos seus maiores
benefício para o enfisema, sua ação broncodilatadora, bem como seus efeitos de
toxicidade não foram avaliados. Dessa forma, os benefícios da utilização dessa planta
precisam ser estudados a exaustão.
112
REFERÊNCIAS
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115
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O maior desafio no que se refere ao enfisema pulmonar é encontrar uma forma
de reverter/minimizar as suas alterações patológicas, que acabam por ser as
responsáveis pela perda da qualidade de vida e os altos custos com as internações dos
pacientes. O primeiro passo nesse sentido é o diagnóstico precoce, que deverá ocorrer
com o uso de biomarcadores baseados nos mecanismos patogênicos descritos nesta
dissertação, seção 3.2 (artigo “Estado da arte do enfisema pulmonar: mecanismos
patogênicos, biomarcadores e extratos vegetais por vetorização pulmonar”). No
estágio inicial do enfisema, uma opção terapêutica que ainda não foi utilizada
clinicamente, mas que tem potencial (de acordo com os achados pré-clínicos descritos
no artigo “Avaliação do efeito da Mikania glomerata Spreng. ao ser pulverizada no
pulmão de animais com enfisema induzido por papaína”), é a baseada nos
constituintes de plantas medicinais (como é o caso da Mikania glomerata) que seriam
entregues por via pulmonar. Uma vez que as alterações irreversíveis do enfisema já
estejam estabelecidas, a terapia mais promissora envolve, sem dúvidas, o uso ou
recrutamento de células-tronco endógenas e exógenas ao pulmão.
116
PRODUÇÃO CIENTÍFICA
E TECNOLÓGICA
117
Trabalhos publicados em anais de eventos (completo)
DANTAS, R. L., NUNES, L. C. C. Fotobiomodulação experimental na prevenção de
enfisema pulmonar In: 1º Workshop de Projetos e Dissertações, 2012, Teresina. Anais
do 1º Workshop de Projetos e Dissertações. v. 5, 2012.
Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo)
CAMPELO, N. B., LEAL, L. H. C., DANTAS, R. L., NUNES, L. C. C. Influência da
temperatura de secagem e da concentração de Aerosil®200 nas características dos
extratos secos por aspersão da Mikania glomerata Spreng (asteracea) In: III Congresso
Piauiense de Saúde Pública e III Seminário de Ensino na Saúde, 2013, Parnaíba. III
Congresso Piauiense de Saúde Pública e III Seminário de Ensino na Saúde. 2013.
PEREIRA JUNIOR, J. L., DANTAS, R. L., REIS, E. V. S., FONSECA, K. M.,
CAMPELO, N. B., BESERRA, M. R. S., ALVES, W.S. Ação do laser de baixa
intensidade sobre a produção do muco na inflamação pulmonar In: Simpósio Latino-
Americano de Biotecnologia do Nordeste, 2013. Simpósio Latino-Americano de
Biotecnologia do Nordeste. 2013.
SOARES, M. R. B. S., DANTAS, R. L. DPOC: influência da ooforectomia na proteção
pulmonar contra o enfisema pulmonar induzido por papaína In: IV Congresso
Nordestino Médico Acadêmico e XX Congresso Médico Acadêmico do Piauí, 2013,
Teresina. IV Congresso Nordestino Médico Acadêmico e XX Congresso Médico
Acadêmico do Piauí. 2013.
SOARES, M. R. B. S., DANTAS, R. L., NUNES, L. C. C. Enfisema pulmonar: uma
alternativa ao modelo experimental com cigarro In: IV Congresso Nordestino Médico
Acadêmico e XX Congresso Médico Acadêmico do Piauí, 2013, Teresina. IV
Congresso Nordestino Médico Acadêmico e XX Congresso Médico Acadêmico do
Piauí. 2013.
Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo expandido)
118
CAMPELO, N. B., CARVALHO, I. B., LEAL, L. H. C., DANTAS, R. L., NUNES, L.
C. C. Proposition of laryngoscope and technic of sprinkling for development of
emphysema models in rats In: I Encontro Estratégico de Ciências Farmacêuticas e I
Seminário Ibero Americano de P & D de Medicamentos, 2013, Teresina. I Encontro
Estratégico de Ciências Farmacêuticas e I Seminário Ibero Americano de P & D de
Medicamentos. 2013.
Apresentação de trabalho e palestra
CAMPELO, N. B., DANTAS, R. L., LEAL, L. H. C., NUNES, L. C. C. Influência da
temperatura de secagem e da concentração de Aerosil®200 nas características dos
extratos secos por aspersão da Mikania glomerata Spreng (asteracea), 2013.
(Congresso, Apresentação de Trabalho).
CAMPELO, N. B., CARVALHO, I. B., LEAL, L. H. C., DANTAS, R. L., NUNES, L.
C. C. Proposition of laryngoscope and technic of sprinkling for development of
emphysema models in rats, 2013. (Congresso, Apresentação de Trabalho).
DANTAS, R. L., NUNES, L. C. C. Fotobiomodulação experimental na prevenção de
enfisema pulmonar, 2012. (Outra, Apresentação de Trabalho).
PEREIRA JUNIOR, J. L., DANTAS, R. L., REIS, E. V. S., FONSECA, K. M.,
CAMPELO, N. B., BESERRA, M. R. S., ALVES, W.S. Ação do laser de baixa
intensidade sobre a produção do muco na inflamação pulmonar, 2013. (Simpósio,
Apresentação de Trabalho).
SOARES, M. R. B. S., DANTAS, R. L. DPOC: influência da ooforectomia na
proteção pulmonar contra o enfisema pulmonar induzido por papaína, 2013.
(Congresso, Apresentação de Trabalho)
SOARES, M. R. B. S., DANTAS, R. L. Enfisema pulmonar: uma alternativa ao
modelo experimental com cigarro, 2013. (Congresso, Apresentação de Trabalho)
119
ANEXOS
120
ANEXO A: Declaração de aceite do comitê de ética em experimentação animal, 001/12.
121
ANEXO B: Declaração de aceite do comitê de ética em experimentação animal, 007/12.
122
ANEXO C: Declaração do depósito de pedido de patente submetido ao Núcleo de
Inovação e Transferência de Tecnológica da Universidade Federal do Piauí.
123
RESUMO
Composição farmacêutica compreendendo um extrato da Mikania glomerata
Spreng. e seus compostos isolados tendo atividade anti-inflamatória e contra o
enfisema pulmonar
A presente invenção trata de uma composição farmacêutica compreendendo um extrato
seco da planta Mikania glomerata Spreng. e seus compostos isolados, visando sua
aplicação no tratamento e prevenção de processos inflamatórios do pulmão, destinados
principalmente ao tratamento e prevenção do enfisema pulmonar. O extrato seco da
planta Mikania glomerata Spreng. mostrou-se muito eficiente no tratamento do
enfisema induzido por papaína em ratos, uma vez que houve uma diminuição
significativa no recrutamento neutrofílico e na contagem total de células. Dessa forma,
essa composição pode ser utilizada no desenvolvimento de formulações farmacêuticas
para o tratamento e prevenção de processos inflamatórios do pulmão, principalmente no
tratamento e prevenção do enfisema pulmonar.
REIVINDICAÇÕES
1. “Composição farmacêutica compreendendo um extrato da Mikania glomerata
Spreng. e seus compostos isolados tendo atividade anti-inflamatória e contra o enfisema
pulmonar”;
2. A composição da reinvidicação 1, onde o extrato seco foi obtido por secagem,
preferencialmente, em aspersor tipo spray drier, podendo ser realizado também por
liofilização ou leito fluidizado;
3. A composição da reinvidicação 1, em que o gênero Mikania compreende o grupo
formado por Mikania laevigata, Mikania micrantha, Mikania scandens (L.) Willd,
Mikania glomerata, Mikania cordata, Mikania stipulacea, Mikania hoehnei, Mikania
vitifolia, Mikania rimachii, Mikania microptera, Mikania hirsutissima, Mikania minima,
Mikania dusenii, Mikania ypacarayensis, Mikania mendocina, Mikania grazielae,
Mikania periplocifolia, Mikania urticifolia, Mikania alvimii, Mikania triangularis,
Mikania cordifolia, Mikania cynanchifolia, Mikania shushunensis, Mikania congesta,
124
Mikania banisteriae, Mikania haenkeana, Mikania oblongifolia, Mikania hookeriana,
Mikania lindbergii Baker e Mikania mongenansis.
4. A composição da reinvidicação 1, onde o extrato vegetal de plantas do gênero
Mikania pode ser preparado por extração a partir de água, álcool e a mistura desses
solventes.
5. A composição da reinvidicação 1, onde a referida composição é configurada para ser
administrada a um paciente com um veículo farmaceuticamente aceitável selecionado a
partir do grupo constituído por aditivo, diluente, solvente, filtro, lubrificante, excipiente,
aglutinante, estabilizador e suas combinações.
6. A composição da reinvidicação 1, onde o tratamento realizado por via sistêmica e/ou
local compreende a administração por inalação, via oral, nasal e/ou através de um
reservatório.
125
ANEXO D: Confirmação de submissão do artigo “State of the art of pulmonary
emphysema: pathogenic mechanisms, biomarkers and plant extracts via the pulmonary
route” à revista Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada.
126
ANEXO E: Confirmação de submissão do artigo “Animal models of pulmonary
emphysema: spraying papain or cigarette smoke?” à revista Brazilian Journal of
Medical and Biological Research.