UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: Agosto de 2014 a Agosto de 2015 ( ) PARCIAL (X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO TÍTULO DO PROJETO DE PESQUISA: “MARCADORES EPIDEMIOLÓGICOS EM SAÚDE NO ARQUIPÉLAGO DO MARAJÓ” - Subprojeto: Qualidade microbiológica da água de consumo e Estudo de Portadores de Enteropatógenos Bacterianos em Indivíduos Residentes nos municípios de Anajás, Chaves, Portel e São Sebastião da Boa Vista, Ilha do Marajó, Estado do Pará. Nome do Orientador: Antonia Benedita Rodrigues Vieira Titulação do Orientador: Doutorado Faculdade: Faculdade de Biomedicina Unidade: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Laboratório de Microbiologia TÍTULO DO PLANO DE TRABALHO: INCIDÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI PRODUTORAS DE BETA-LACTAMASE DE ESPECTRO ESTENDIDO (ESBL) ISOLADAS DA ÁGUA DE CONSUMO DE MUNICÍPIOS DO ARQUIPÉLAGO DO MARAJÓ - PARÁ. Nome do Bolsista: Roseanne Rollo Nascimento Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq

( x) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PARD ( ) PARD – renovação ( ) Bolsistas PIBIC do edital CNPq 001/2007

INTRODUÇÃO

As doenças diarreicas em termos de morbimortalidade infantil apresentam por ano a

quantia significativa de 2 bilhões de casos, levando a óbito 2,5 milhões deste total em países

ditos subdesenvolvidos e em desenvolvimento. (Kosek et al., 2003). A transmissão destas

doenças ocorre principalmente por água e alimentos contaminados. As de veiculação hídrica

são causadas principalmente por microrganismos patogênicos, incluem-se rotavírus,

calicivírus, astrovírus, Escherichia coli diarreiogênicas, Shigella spp, Salmonella spp,

Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum e Cyclospora cayetanensis

(Grabow,1996; Podewils et al., 2004; Gabbay et al., 2007; Wongstitwilairoong et al., 2007).

A Escherichia coli é um bacilo Gran-negativo, predominante na microbiota normal do

intestino humano e de outras espécies animais. É o principal agente etiológico de infecções

entéricas causada pela água e alimentos contaminados, principalmente em grupos popula-

cionais que não dispõem de sistema de saneamento, ou se apresentam vulneráveis como

os idosos e crianças imunocomprometidos (Vieira et al., 2004). Sendo o indicador de

contaminação de origem fecal mais comumente utilizado, pois ocorre em grande número na

microbiota intestinal de humanos e animais (Amaral et al., 2003).

Compreender a resistência antimicrobiana deste micro-organismo isolado da água é

de suma importância, uma vez que pode indicar o grau de alteração dos ecossistemas pela

ação humana, além de servirem de reservatórios para genes de resistência (Baquero et al.,

2008; Borer et al., 2002). Assim, um dos mecanismos mais importantes é a produção de

beta-lactamases, que são enzimas capazes de hidrolisar o anel beta-lactâmico de

penicilinas, cefalosporinas e outros antimicrobianos relacionados, tornando- os inativos.

Entre estes destacamos a produção de beta-lactamases de espectro ampliado (Extended-

Spectrum Beta-Lactamases (ESBL) (Choque, 1993; Junior; Ferreira; Conceição, 2004).

O tratamento de infecções causadas por estas cepas oferece um substancial desafio

à terapia antimicrobiana, pois as ESBLs são capazes de hidrolisar penicilinas,

cefalosporinas de todas as gerações e monobactâmicos, diminuindo as opções terapêuticas

(Chaudhary, Aggarwal, 2004). Aliado a isso, o uso contínuo e, muitas vezes inadequado, de

agentes antimicrobianos pode induzir à seleção de cepas multirresistentes (Amarante,

2002).

Sendo, relevante o conhecimento das reais condições dos mananciais superficiais

que abastecem as cidades, a fim de contribuir significativamente para a promoção efetiva de

planejamentos que visem melhorar a qualidade microbiológica dos referidos mananciais,

caso seja necessário, este trabalho objetivou determinar a pesquisa de beta-lactamases de

espectro estendido (ESBL) de isolados de Escherichia coli provenientes da água de

consumo de municípios da Ilha do Marajó, Pará, Brasil.

JUSTIFICATIVA

A água é um elemento essencial para a sobrevivência do ser humano. A forma como

o homem utiliza a água, vem sendo abordada em diferentes fóruns mundiais e nacionais,

questionando o esgotamento desse recurso, em grande parte provocado pelas ações

antrópicas de uma população em acelerado crescimento demográfico.

A associação de problemas de saúde à má qualidade da água tem merecido

destaque no cenário mundial devido ao aumento da morbidade e mortalidade, por uma

variedade de doenças de veiculação e origem hídrica.

Na Amazônia, apesar da abundância de água da região, a qualidade dos

ecossistemas aquáticos vem se constituindo em grave problema ambiental devido à falta de

infraestrutura sanitária básica, da ocupação de áreas sujeita às inundações, destruição das

reservas ecológicas, poluição do ambiente aquático por despejos domésticos, industriais e

resíduos sólidos, e consequentemente a redução da qualidade de vida da população

amazônica. Destaca-se que em vários municípios do estado do Pará, grande parcela da

população da área urbana não tem acesso à água do sistema público. E na área rural esta

situação torna-se mais agravante, uma vez que as principais fontes de abastecimento de

água dessa população são os poços rasos e abertos próximos de fontes de contaminação,

como fossas e áreas de pastagem ocupadas por animais.

Em decorrência da má condição de saneamento básico, especialmente na região

Amazônica brasileira, na maioria das vezes as populações ribeirinhas utilizam águas

superficiais e de poços freáticos, como únicas fontes de abastecimento doméstico, as quais

se encontram precariamente protegidas contra o despejo de dejetos humanos ou de

animais, tornando a água um veículo eficiente na transmissão de agentes infecciosos.

Neste sentido, considerando a inexistência e/ou deficiência no setor de saneamento

básico, no que tange ao abastecimento de água potável e esgotamento sanitário, em

municípios paraenses, o presente projeto tem como proposição verificar a qualidade

sanitária da água consumida pela população nas habitações e conhecer os fatores de risco

associados à disseminação de enfermidades de transmissão de hídrica nos municípios de

Chaves, Portel, Anajás e São Sebastião da Boa Vista, Ilha do Marajó, Estado do Pará,

através da pesquisa de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) de E. coli isoladas

de águas de consumo nos municípios citados.

Os resultados obtidos durante a realização deste trabalho serão apresentados em

eventos científicos locais e nacionais, e divulgados através da realização de Trabalhos de

Conclusão de Curso e apresentação de resumos em eventos científicos.

OBJETIVOS

Geral

Determinar a incidência de Escherichia coli produtoras de Beta-lactamases isoladas

de águas de consumo humano de municípios do Arquipélago do Marajó, Estado do Pará.

Específicos

- Identificar amostras de Escherichia coli produtoras de ESBL isoladas de águas de

consumo humano de municípios de Anajás, Chaves, Portel e São Sebastião de Boa Vista,

Arquipélago do Marajó, Estado do Pará.

- Analisar estaticamente a relevância dos achados em amostras ambientais nos municípios

estudados.

METODOLOGIA

Amostras bacterianas

A pesquisa será realizada em amostras de Escherichia coli isoladas de água de

consumo dos municípios da Ilha do Marajó-PA, coletadas no ano de 2012. Para a pesquisa

de enzimas serão testadas 160 isolados, sendo 28 de Chaves, 12 de Portel, 60 de Anajás e

60 de São Sebastião da Boa Vista.

Confirmações de amostras de Escherichia coli

As amostras de E. coli foram isoladas e identificadas em meios específicos, segundo

metodologia descrita na literatura. Os isolados reativados foram semeados em ágar

MacConkey e incubados a temperatura de 37°C por 24 horas. Após a incubação foram

observados os aspectos das colônias isoladas que obtiveram crescimento positivo, como

tamanho, cor e morfologia. As colônias isoladas foram identificadas em meios diferenciais,

como ágar TSI (Tríplice Açúcar Ferro), caldo Vermelho de Metila, Caldo Voges-Proskauer,

ágar Citrato de Simmons, ágar Motilidade Teste, ágar Fenilalanina, ágar Lisina, Caldo Indol

e Caldo Nitrato. Após a identificação, os isolados bacterianos foram conservados em ágar

nutriente semi-sólido até a realização da determinação do perfil de suscetibilidade

antibacteriana e pesquisa fenotípica de ESBL.

Determinação da produção de enzimas bacterianas

A detecção das amostras produtoras de enzimas bacterianas será realizada pelo

método de disco-aproximação em placas contendo Ágar Muller-Hinton com a aplicação dos

seguintes antimicrobianos: Ceftazidima (30µg), Amoxicilina + Ácido Clavulânico

(30µg/10µg), Cefepime (30µg), Aztreonam (30µg) e Ceftriaxona (30µg), depositados a uma

distância de 3 cm um do outro, como, interpretados conforme os critérios recomendados

pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011). Os isolados bacterianos

previamente identificados e conservados em ágar nutriente semissólido serão reativados em

ágar nutriente e, em seguida transferidos para tubo contendo solução salina esterilizada

0,85% para verificação de turbidez segundo a escala de MacFarland. Posteriormente, cada

suspensão bacteriana preparada será semeada em ágar Muller-Hinton por meio de swab

esterilizado. Em seguida serão colocados os discos de antibióticos. Após incubação das

placas a 35°C por 18 horas será realizada a leitura dos resultados. Considera-se positivo

para o fenótipo de ESBL quando ocorre o aumento ou distorção (ghost zone) da zona de

inibição ao redor dos discos de beta-lactâmicos, causado pela sinergia com o ácido

clavulânico.

INFERÊNCIA ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos na pesquisa serão catalogados em um banco de dados, e as

inferências Estatísticas serão plotadas no programa Biostat 5.0.

RESULTADOS

Os dados encontrados neste trabalho demonstram que as amostras de E. coli

isoladas dos municipios de Chaves e Portel não evidenciaram o fenótipo positivo para a

pesquisa de ESBL. No municipio de Anajás foram detectadas três amostras produtoras

desta enzima (5%), e no municipio de São Sebastião da Boa Vista uma cepa

(1,7%)produtora de ESBL (Tabela 1).

Tabela 1– Número absoluto e Percentual de ESBL detectadas nos municipios de Anajás, Chaves, Portel, e São Sebastião no Arquipélago do Marajó, Pará, Brasil.

MUNICIPIOS ESBL (-)

N0 / % ESBL(+)

N0 / % TOTAL N0 / %

ANAJÁS 57 (95%) 3 (5%) 60 (100%)

CHAVES 28 (100%) 0 (0%) 28 (100%)

PORTEL 12 (100%) 0 (0%) 12 (100%)

S. SEBASTIÃO 59 (98,3%) 1 (1,7%) 60 (100%)

TOTAL 156 4 160

Bactérias produtoras de ESBL são relevantes na clínica médica, pois resultam no

crescimento da morbidade e mortalidade de pacientes, pois são usualmente resistentes a

muitos antibióticos, resultando em infecções de difícil tratamento. Outras dificuldades estão

associadas à complexidade de se detectar in vitro a presença de ESBL. A falta de

padronização entre as distâncias dos discos de antibióticos demonstra uma demasiada

dificuldade desse método aplicado no estudo. A detecção laboratorial de ESBL pode ser

complicada e está sujeita a erros de interpretação (Shah et al, 2004).

Nos resultados encontrados do município de Anajás 5% e São Sebastião da Boa

Vista 1,7% das amostras apresentaram fenótipos positivo para ESBL, fato esse que pode

ser associado com o surgimento e a disseminação dessas bactérias produtoras de ESBL no

ambiente extra-hospitalar, pois já se manifesta em níveis alarmantes em vários países no

mundo, através de vários trabalhos realizados(Goldstein, 2004; Lescure et al, 2001; Daza et

al, 2001; Borer et al, 2002; Arpin et al, 2003; Rodrigues-Baño et al, 2004). Nestes trabalhos

se destaca o percentual de E. coli produtoras de ESBL isoladas da microbiota intestinal, que

chega a variar em torno de 7,5%, percentual próximo ao encontrado na água de consumo

do município de Anajás, Pará.

A análise do perfil de suscetibilidade das amostras produtoras de ESBL demonstra

que todos os isolados apresentaram perfil de multirresistência, Esse fato ocorre devido a

produção de ESBL ser geralmente mediadas por plasmídeos que podem contém uma gama

de genes, e estes genes conferirem resistência a uma variedade de antibióticos (Carattoli,

2009).

CONCLUSÂO

Os resultados encontrados do perfil de suscetibilidade e pesquisa de beta-

lactamases de espectro estendido (ESBL) de isolados de E. coli, nos municípios de Chaves,

Portel, Anajás e São Sebastião da Boa Vista, Ilha do Marajó-PA, detectaram alta incidência

de amostras analisadas sensíveis aos antibióticos testados, entretanto, a pesquisa de ESBL

demonstrou a circulação de amostras produtoras destas enzimas em água de consumo das

comunidades da região estudada. Reforçam a necessidade do conhecimento das reais

condições dos mananciais superficiais que abastecem as cidades, visando melhorar a

qualidade microbiológica dos referidos mananciais.

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Carolina estuaries using antibiotic resistance analysis. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 2004; 298:179-195. WONGSTITWILAIROONG, B., SRIJAN, A., SERI-CHANTALERGS, O., FUKUDA, C.D., MCDANIEL, P., BODHIDATTA, L. & MASON, C.J. Intestinal parasitic infections amongpre-school children in Sangkhlaburi, Thailand. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2007; 76:345-350. DIFICULDADES

Não houveram dificuldades durante o desenvolvimento.

PARECER DO ORIENTADOR

O bolsista desenvolveu suas atividades com interesse e participação ativa,

demonstrando habilidades e iniciativa nas tarefas que lhe foram atribuídas no início do

desenvolvimento do plano de trabalho.

INFORMAÇÕES ADICIONAIS

Os resultados da pesquisa serão apresentados no evento abaixo.

28º CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA 2015.

Centro de Convenções de Florianópolis - Centro Sul - Santa Catarina De 18 a 22 de Outubro 2015

Prezado(a) Antonia Benedita Rodrigues Vieira

Carta de Aceite

Declaramos que o resumo submetido por VILHENA, A.F 1, Silva, K.M.C 1, BOUTH, R.C 1, NASCIMENTO,

R.R. 1, MELO, J.S 1, RIBEIRO, K.T.S 1, VIEIRA, A.B.R 1 1 UFPA - UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

(Av. Augusto Correa, 1 Guamá Belém Pará), intitulado Antimicrobial susceptibility profile and extended-

spectrum beta-lactamases (ESBL) of Escherichia coli isolated of human consumption water from four

municipalities from Marajó archipelago, Pará State foi aceito para apresentação no 28º Congresso

Brasileiro de Microbiologia que será realizado de 18 a 22 de outubro de 2015 no Centro de Convenções de

Florianópolis, Santa Catarina, Brasil

ASSINATURA DO ORIENTADOR

____________________________________ ASSINATURA DO ALUNO

DATA: 10 / 08 / 2015