universidade federal do espírito santo programa de pós...
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Universidade Federal do Esprito Santo
Programa de ps-graduao em biotecnologia
Lucas Ferreira da Silva
Anlise da expresso temporal de genes relacionados ao
metabolismo de Saccharomyces cerevisiae em resposta ao
estresse por alta presso hidrosttica
Vitria ES
2012
Lucas Ferreira da Silva
2
Anlise da expresso temporal de genes relacionados ao
metabolismo de Saccharomyces cerevisiae em resposta ao
estresse por alta presso hidrosttica
Dissertao de mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia da Universidade Federal do Esprito Santo sob a orientao da Profa. Dra. Patricia Machado Bueno como parte dos requisitos a obteno do ttulo de mestre em Biotecnologia.
Vitria ES
2012
Lucas Ferreira da Silva
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Anlise da expresso temporal de genes relacionados ao
metabolismo de Saccharomyces cerevisiae em resposta ao
estresse por alta presso hidrosttica
Dissertao de mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia da Universidade Federal do Esprito Santo sob a orientao da Profa. Dra. Patricia Machado Bueno como parte dos requisitos para a obteno do ttulo de mestre em Biotecnologia.
Comisso Examinadora
_________________________________________
Prof. Dra. Patricia Machado Bueno Fernandes
Universidade Federal do Esprito Santo
Orientadora
_________________________________________
Prof. Dr. Iuri Drumond Louro
Universidade Federal do Esprito Santo
_________________________________________
Dra. Fernanda Bravim
Universidade Federal do Esprito Santo
_________________________________________
Prof. Dr. Claudio Akio Masuda
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
4
Dedico este trabalho aos meus pais,
Wangel e Iracema
e aos meus irmos, Vangel, Denison e Dbora
5
AGRADECIMETOS
Profa. Dra. Patricia M. B. Fernandes, pela sua orientao colaborativa durante
esses dois anos, que sempre me motivou e me fez refletir com os seus inmeros
ensinamentos. Agradeo a chance dada por ela, de conhecer e me apaixonar pelo
estudo do estresse e das leveduras.
Ao Prof. Dr. A. Alberto R. Fernandes por depositar sua confiana em um forasteiro.
Agradeo-o pelos seus inmeros incentivos, e pela colaborao em prol da
realizao desse trabalho.
Ao Prof. Dr. James R. Broach e a Dr. Soyeon Lippman da Universidade de
Princeton, por contriburem enormemente na realizao dos experimentos de
microarranjo.
A todos os amigos de laboratrio, especialmente; Diego Trindade de Souza, pela
companhia de todas as horas; Fernanda Bravim , pela enorme pacincia e
colaborao; rica Dutra, por suas infinitas sugestes e David Buss pela amizade e
colaborao.
Aos Professores de graduao, Sandra Lauton, Anderson Chavez, Ronaldo Alvim e
Sabina Maura , por indicarem caminhos, por contriburem na lapidao de meus
pensamentos e na ampliao de minha perspectiva sobre cincia e pesquisa.
minha querida e amada namorada Alessandra Suriani Martins, muito obrigado
pela compreenso da distancia, apoio, incentivo, amor e carinho a mim concedidos.
Aos amigos e companheiros que me trazem esperana, especialmente Vangel
Ferreira, Gustavo Henrique, Valria Alves, David Dias, Thiago Ramos, Mariana
Alves e Elenice Belotti.
As agencias de fomento, FINEP, CNPq, CAPES, FAPES pelo apoio financeiro e
bolsa de estudo que permitiram tanto a minha permanncia no estado do Esprito
Santo, como o desenvolvimento desse trabalho.
6
SUMRIO
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................... 8
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................... 9
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................ 11
RESUMO ............................................................................................................................................. 12
ABSTRACT ......................................................................................................................................... 14
1-INTRODUO ................................................................................................................................ 16
1.1-A levedura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo.................................... 16
1.2-O estresse ................................................................................................................................. 17
1.3- .................................................................................................................................................... 19
Estresse por choque trmico ........................................................................................................ 19
1.4-Estresse por alta presso hidrosttica ................................................................................. 20
1.5-Regulao da resposta ao estresse ..................................................................................... 22
1.6-Modificaes no metabolismo de Saccharomycescerevisiae durante o estresse. ....... 24
1.7-A tecnologia do microarranjo ................................................................................................. 26
1.8- .................................................................................................................................................... 27
Bioinformtica ................................................................................................................................. 27
1.9-Redes Biolgicas ..................................................................................................................... 28
2-OBJETIVO GERAL ......................................................................................................................... 30
2.1- Objetivos especficos. ............................................................................................................ 30
3-MATERIAL E MTODOS .............................................................................................................. 31
3.1.- Linhagens utilizadas, condies de crescimento e tratamento de presso ................. 31
3.2.- Anlise de microarranjo ........................................................................................................ 31
3.2.1.- Extrao do mRNA ........................................................................................................ 31
3.2.2.- Normalizao dos dados .............................................................................................. 32
3.2.3.- Implementao computacional .................................................................................... 33
3.3.- Confirmao dos dados de microarranjo por RT-PCR em tempo real ......................... 36
4-RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................................................... 39
4.1-Perfil global da expresso gnica 0, 5, 10 e 15 minutos aps o tratamento com alta presso hidrosttica. ...................................................................................................................... 39
4.2-Avaliao da expresso dos genes ligados a gliclise e gliconeognese aps o tratamento com a alta presso hidrosttica. .............................................................................. 50
4.3-Anlise das redes de funes moleculares, processos biolgicos e componentes celulares. .......................................................................................................................................... 58
7
4.4-Busca por fatores de transcrio ligados a mudana transcricional temporal ............... 62
4.5-Identificao de elementos regulatrios nos genes que possuem expresso imediatamente aps a pressurizao e represso nos tempos posteriores. ........................ 66
4.6-Rede de motivos de DNA e mRNA compartilhados entre os genes diferencialmente expressos aps o piezotratamento. ............................................................................................. 68
4.6-Validao dos experimentos de microarranjo por RT-PCR em tempo real ................... 72
5-CONCLUSO .................................................................................................................................. 73
6-REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................................................... 76
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Oligonucleotdeos utilizados como primers na reao de RT-PCR em tempo real. ................................................................................................................ 38
Tabela 2 Processos biolgicos atribudos a cada ramo por meio da busca de termos (GO) .......................................................................................................................... 65
Tabela 3 Busca por motivos reguladores no DNA e RNA de genes com a transcrio diminuda a partir de 5 minutos aps o piezotratamento .......................................... 67
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Boxplot mostrando a expresso de todos os genes nos tratamentos de 0, 5, 10 e 15 minutos aps a aplicao de 50 MPa por 30 minutos. Os grupos so representados por : (1) biognese de componentes celulares(2)ciclo celular(3)diferenciao celular(4) proteo celular (5) diferenciao do tipo celular(6)comunicao celular (7) transporte celular(8) desenvolvimento (9) metabolismo energtico (10) interao com o meio (11) metabolismo (12) dobramento, modificao e transporte de protenas(13)sntese protica(14)protenas com funes estruturais ou catalticas(15)regulao do metabolismo(16) transcrio(17) elementos de transposio (18) no classificados ........................... 41
Figura 2 Comparao dos genes ligados a proteo celular no estresse de 50 MPa por 30 minutos e o choque trmico de 25C para 37C por 20 minutos. Os pontos marcados em preto representam os genes da categoria proteo celular. Os pontos em azul representam todos os outros genes............................................................. 43
Figura 3 Comparao dos genes ligados ao Metabolismo energtico no estresse de 50 MPa por 30 minutos e o choque trmico de 25C para 37C por 20 minutos. Os pontos marcados em preto representam os genes da categoria Metabolismo energtico. Os pontos em azul representam todos os outros genes. ........................ 46
Figura 4 Comparao dos genes ligados ao Metabolismo no estresse de 50 MPa por 30 minutos e o choque trmico de 25C para 37C por 20 minutos. Os pontos marcados em preto representam os genes da categoria Metabolismo. Os pontos em azul representam todos os outros genes. ................................................................. 47
Figura 5 Comparao dos genes ligados a sntese protica no estresse de 50 MPa por 30 minutos e o choque trmico de 25C para 37C por 20 minutos. Os pontos marcados em preto representam os genes da categoria de sntese protica. Os pontos em azul representam todos os outros genes. ................................................ 49
Figura 6 Via glicoltica de S.cerevisiae imediatamente aps o tratamento de 50 MPa por 30 minutos. Os genes que apresentam a cor vermelha possuem sua expresso induzida, genes com a cor verde esto reprimidos e genes com a cor branca no tiveram alterao no seu padro de expresso......................................................... 51
Figura 7Via glicoltica de S.cerevisiae 15 minutos aps o tratamento de 50 MPa por 30 minutos. Os genes que apresentam a cor vermelha possuem sua expresso induzida, genes com a cor verde esto reprimidos e genes com a cor branca no tiveram alterao no seu padro de expresso......................................................... 51
Figura 8 Via bioqumica da biosntese e catabolismo de trealose. (A) perfil da via imediatamente aps o tratamento por 30 minutos com 50MPa.(B) perfil da via 15 minutos aps o tratamento por 30 minutos com 50MPa. Os genes que apresentam a cor vermelha possuem sua expresso induzida, genes com a cor verde esto
10
reprimidos e genes com a cor branca no tiveram alterao no seu padro de expresso. ................................................................................................................. 54
Figura 9 Via bioqumica do ciclo do cido ctrico 15 minutos aps o tratamento por 30 minutos com 50MPa. Os genes que apresentam a cor vermelha possuem sua expresso induzida, genes com a cor verde esto reprimidos e genes com a cor branca no tiveram alterao no seu padro de expresso ...................................... 57
Figura 10 Principais termos relacionados aos genes induzidos imediatamente aps o tratamento de 50 MPa por 30 minutos. A intensidade das cores demonstra a significncia estatstica dos termos e o tamanho do nodo mostra a quantidade de genes relacionados com o termo. ............................................................................ 59
Figura 11 Principais termos relacionados aos genes induzidos 15 minutos aps o tratamento de 50 MPa por 30 minutos. A intensidade das cores demonstra a significncia estatstica dos termos e o tamanho do nodo mostra a quantidade de genes relacionados com o termo. ............................................................................ 60
Figura 12 Identificao dos pontos de bifurcao 5, 10 e 15 minutos aps o tratamento com a alta presso hidrosttica (50 MPa por 30 minutos). Os braos formados demonstram grupos gnicos que se diferenciaram medida que o tempo aumentava. As bifurcaes so indicadas pela atribuio de novas cores aos braos. Em alguns braos foram identificados fatores de transcrio que esto relacionados ao comportamento dos grupos gnicos. O tamanho de cada circulo est relacionado a distribuio normal da expresso dos genes que aquele grupo possui. .............. 64
Figura 13 Rede regulatria de motivos de DNA e mRNA. Os crculos em azul representam motivos de DNA e mRNA compartilhados entre os genes diferencialmente expressos aps o tratamento com a alta presso hidrosttica. Os grupos de genes que compartilham as mesmas funes biolgicas ou processos moleculares so representados com a cor vermelha. As letras A e B representam os dois diferentes mdulos encontrados na rede. .......................................................... 70
Figura 14 Grfico de correlao entre as mdias do nvel de expresso relativa (RQ) obtidos por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) e microaranjo (MA). Os dados so plotados em Log2 e os coeficientes da correlao de Pearson so dados para os genes testados nos diferentes tratamentos com alta presso hidrosttica, sendo (A) 50 MPa por 30min; (B) 50 MPa por 30min + 0,1 MPa por 5 min; (C) 50 MPa por 30min.+ 0,1 MPa por 10 min; (D) 50 MPa por 30min.+ 0,1 MPa por 15 min. ............ 72
11
LISTA DE ABREVIATURAS
3' UTR = Regio 3 no traduzida
AMP = Ampicilina
ATP = Adenosina trifosfato
ATPase = Catalisa a hidrlise de ATP
cDNA = cido desoxirribonuclico complementar
D.O. = Densidade ptica
DNA = cido desoxirribonuclico
DNAse = Catalisa a quebra de DNA
dNTP = Desoxirribonuleotdeo trifosfatado
EDTA = cido etilenodiamino tetra-actico
ESR = Resposta ao estresse ambiental
GABA= cido gama-aminobutrico
GEO = Gene Expression Omnibus
HHP = Alta presso hidrosttica
HOG = resposta a alta osmolaridade do glicerol
HSF = fatores de transcrio de choque trmico
HSP = Protena de choque trmico
MA = microarranjo
MIPS = Centro de informao de Munique sobre protenas sequenciadas
MPa = Megapascal
mRNA = RNA mensageiro
NAD+ = Nicotinamida adenina dinucleotdeo
ORF = Open reading frame (Janela aberta de leitura)
PCR = Reao em cadeia da polimerase
pH = Potencial hidrogeninico
RNA = cido ribonuclico
rpm = Rotao por minuto
RT = Transcriptase reversa
STRE = Elementos de resposta ao estresse
YEPD = Extrato de lvedo, peptona dextrose
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RESUMO
Os organismos vivos mantm um complexo equilbrio interno, que os possibilita
controlar seu crescimento e executar suas funes biolgicas, porm, flutuaes nas
condies ambientais podem afetar essa harmonia que indispensvel para a
existncia da vida. A levedura Saccharomycies cerevisiae um organismo modelo
unicelular e eucarioto. Entre os processos biotecnolgicos que essa levedura
utilizada, pode-se destacar a produo de po, queijos, bebidas alcolicas,
combustveis e frmacos. Do ponto de vista fisiolgico, todos esses processos
afetam o funcionamento normal dessas leveduras. Sendo de extrema importncia o
estudo dos mecanismos moleculares que gerem proteo contra essas situaes
estressantes. Um dos modelos utilizados no estudo de estresse a alta presso
hidrosttica. A alta presso hidrosttica conhecida por causar alteraes
morfolgicas e metablicas nas leveduras. Vrios estudos tm demonstrado que o
padro de expresso dos genes de leveduras submetidas alta presso hidrosttica
exibe um complexo perfil, uma vez que, durante a resposta ao estresse por
pressurizao, as leveduras expressam genes de resposta ao estresse oxidativo,
osmtico, trmico, dentre outros. Nesse estudo, clulas da linhagem selvagem,
BT0605, de S. cerevisiae foi submetida ao tratamento de 50 MPa por 30 minutos.
Aps isso, foram analisados com o uso do microarranjo, os valores de expresso de
todos os seus genes imediatamente aps o tratamento e 5, 10 e 15 minutos aps o
piezotratamento. A analise de microarranjo, juntamente com outras ferramentas de
bioinformtica, demonstrou que os genes ligados ao metabolismo dessas leveduras
so altamente afetados pelo tratamento com a alta presso hidrosttica. Alm disso,
observou-se que desde o momento da retirada da presso at 15 minutos aps o
tratamento, genes da gliclise, respirao celular, metabolismo de aminocidos e
carboidratos, tiveram um padro crescente de expresso. A comparao dos dados
referentes a expresso dos genes ligados a sntese protica, metabolismo e
proteo celular em clulas pressurizadas e em clulas submetidas ao choque
trmico, possibilitou a descoberta de genes diferencialmente expressos apenas pelo
tratamento com a alta presso hidrosttica. Estas anlises comparativas
evidenciaram a importncia dos genes relacionados sntese de metionina na
adaptao das clulas a ambientes com alta presso hidrosttica, bem como, o
possvel envolvimento do fator de transcrio Cbf1 na regulao desses genes.
13
Observou-se ainda a induo de genes responsveis por metabolizar uma
diversidade de compostos que minimizam os efeitos deletrios da alta presso
hidrosttica nas protenas, tais como, prolina, trealose, glicerol e metionina. A
induo de genes ligados a produo de GABA (cido gama-amino butirico) e a
reduo do NADP+ sugerem que a biossntese de compostos antioxidantes seja
crucial para a tolerncia ao piezotratamento. A busca por motivos controladores, no
DNA e RNA, nos vrios genes induzidos ou reprimidos durante a pressurizao,
demonstrou que diferentes elementos controladores podem promover tanto a
induo, como o decaimento dos transcritos dos genes diferencialmente expressos,
aps o piezotratamento.
Palavras-chave: Levedura, piezotratamento, barotolerncia, microarranjo, bioinformtica, expresso temporal.
14
ABSTRACT
Living organisms maintain a complex internal balance, which enables them to
optimise their growth and metabolism. However, fluctuations in environmental
conditions can affect this balance. The yeast Saccharomyces cerevisiae is a
unicellular, eukaryote model organism. The biotechnological processes it is used for
include the production of bread, cheese, alcohol, drugs and pharmaceuticals. From a
physiological standpoint, all these processes affect the normal operation of the cell
and it is extremely important to study the molecular mechanisms that provide
protection against these stressful situations. One of the models used to study stress
is high hydrostatic pressure (HHP), which is known to cause morphological and
metabolic changes in yeast. Several studies have demonstrated that the expression
pattern of genes from yeast submitted to high hydrostatic pressure shows a complex
profile, including genes related to oxidative, osmotic, and heat protection.
In this study, cells of the S. cerevisiae strain BT0605 were exposed to HHP (50 MPa)
for 30 minutes and then returned to ambient pressure. Gene expression was
assessed by microarray immediately after HHP treatment and 5, 10 and 15 minutes
thereafter. Microarray analysis, along with other bioinformatics tools, showed that
genes associated with metabolism are highly affected by the treatment by HHP.
During the 15 minutes after HHP, genes involved in glycolysis, carbohydrate and
amino acid metabolism and cellular respiration showed increasing levels of
expression.
Comparison of gene expression data from pressurized cells and cells subjected to
heat shock, showed genes related to protein synthesis, metabolism and cell
protection differentially expressed only under pressure stress. These comparative
analyzes showed the importance especially of genes related to methionine synthesis
in cellular adaptation to high hydrostatic pressure, as well as the possible
involvement of transcription factor Cbf1 in regulating these genes.
Expression of genes responsible for metabolizing a variety of compounds that
minimize the deleterious effect of HHP on proteins, such as proline, trehalose,
glycerol and methionine, was increased. The induction of genes linked to the
production of GABA (gamma amino butyric acid) and the reduction of NADP+
suggests that the biosynthesis of antioxidant compounds is important in
15
piezotolerance. The search for controlling motifs in DNA and RNA, in several genes
induced or repressed during pressurization, found different controlling elements
which may be associated with the induction or the decay of transcripts of genes
differentially expressed after pressure treatment.
Palavraschave: yeast, piezotreatment, barotolerance, microarrays, bioinformatics, temporal expression.
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1-INTRODUO
1.1-A levedura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo
A levedura Saccharomycies cerevisiae um organismo unicelular e eucarioto que
possui forma oval e seu tamanho pode variar entre 5 e 10 micrmetros. Essa
levedura pertence classe Saccharomycetes, ordem Saccharomycetales, famlia
Saccharomycetaceae e subfamlia Saccharomycetoidea.
A S.cerevisiae considerada um organismo modelo de extrema importncia para o
estudo dos eucariotos. Seu genoma j esta totalmente seqenciado e vrias
analises comparativas mostraram que muitos de seus mecanismos como a
replicao do DNA, diviso celular, recombinao e metabolismo, possuem alto grau
de conservao em relao a outros organismos eucariotos, como por exemplo, de
humanos. Essa levedura possui 16 cromossomos lineares contendo 12 Mb de bases
nitrogenadas e aproximadamente 6000 orfs. Essas clulas podem ser encontradas
vivendo tanto em uma forma haplide como diplide. A S.cerevisiae possui ciclo de
vida curto, de fcil cultivo e manipulao gentica, alm de possuir um vasto
banco de dados que disponibiliza milhares de informaes sobre o comportamento
desse organismo em vrios nveis.
Uma vasta quantidade de processos biotecnolgicos feitos nos dias de hoje e,
tambm por nossos ancestrais, a milhares de anos atrs, utilizam esse organismo
como catalisador. Vrias so as serventias dessa levedura para os humanos. Dentre
suas utilidades podemos destacar a produo de po, queijos, bebidas alcolicas,
combustveis, frmacos e etc. Entre todos os processos anteriormente citados,
talvez o mais interessante economicamente, seja a produo do etanol em larga
escala, nas grandes indstrias.
A S.cerevisiae quando crescida em meio com alta concentrao de glicose sofre
uma caracterstica inibio na via do acido tricarboxlico e da cadeia transportadora
de eltrons, atravs de um mecanismo conhecido como, Crabtree effect. Essa
represso faz com que a obteno de ATP dessas clulas seja exclusivamente por
meio da fermentao alcolica, liberando assim grande quantidade de etanol e CO2
(THOMSON et al.,2005). Durante a fase lag de crescimento das leveduras, grande
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quantidade de acar consumida, porem os compostos nitrogenados,
principalmente derivados de amnia, tem o consumo evitado, com isso a populao
das clulas pode aumentar rapidamente (MARIA et al.,2003).
Durante o efeito Crabtree, as clulas desviam o piruvato formado na gliclise para
rotas fermentativas (VAN DIJKEN et al.,1993). A rota fermentativa em leveduras
possui duas enzimas. A primeira a piruvato descarboxilase (Pdc1p), que converte
piruvato em acetaldeido e CO2. A segunda enzima da fermentao se chama lcool
desidrogenase (ADH1 e ADH2) e trabalha na reduo do acetaldeido a etanol, com
a concomitante reduo do NADH.
O etanol formado nesse processo se difunde atravs da membrana plasmtica para
o meio de crescimento, e o NAD+ formado disponibilizado para o metabolismo
glicoltico. O gene ADH1 superexpresso durante o crescimento em glicose, devido
a ativao dos fatores transcricionais Rap1 e Gcr1(SANTANCELO et al.,1990). A
expresso da isoenzima ADH2 e, consequentemente, a utilizao do etanol
controlada pelo fator de transcrio Adr1 (que tambm responsvel pela utilizao
de glicerol e cidos graxos como fonte de carbono).
O acetaldeido formado pela Pdc1p tambm essencial durante o crescimento em
glicose. Sendo que o acetil-CoA citoslico uma molcula muito importante na
disponibilizao de precursores para a formao de ATP, lipdios e aminocidos.
1.2-O estresse
Os organismos vivos mantm um complexo equilbrio interno, que os possibilita
controlar seu crescimento e executar suas funes biolgicas porem, flutuaes nas
condies ambientais podem afetar esse equilbrio que indispensvel para a
existncia da vida. O estresse consiste nas perturbaes internas ou externas que
desestabilizam a dinmica de crescimento de um organismo. O estresse um
fenmeno limitante na vida dos seres vivos, porem, os organismos no so passivos
s situaes estressantes, eles evoluram fisiologicamente e geneticamente para se
protegerem e sobreviverem a flutuaes na temperatura, osmolaridade, acidez,
radioatividade, altas concentraes de substancias txicas e ausncia de nutrientes.
18
A resposta a uma situao de estresse no depende apenas das mudanas na
fisiologia e bioqumica interna da clula, elas dependem tambm da velocidade com
que a nova perturbao percebida e interpretada. (GASH et al.,2000 ).
Vrios autores demonstraram que o tratamento prvio com uma fonte de estresse
sub-letal, pode aumentar a sobrevivncia das clulas que, subseqentemente, sero
expostas a valores letais desse, ou de outro tipo de estresse. Esse interessante
fenmeno real para vrias situaes estressantes, e conhecido como, proteo
cruzada (DRAUZIO, 2010). Em trabalhos prvios do nosso grupo foi demonstrado
que clulas tratadas previamente com H2O2, etanol e baixas temperaturas,
sobreviveram e tornaram-se mais resistentes aos tratamentos com a alta presso
hidrosttica, e que clulas pr-tratadas com valores baixos de presso hidrosttica,
apresentaram maior sobrevivncia, quando submetidas a valores de presso letais.
Essas observaes sugerem que existam mecanismos de resposta ao estresse que
so comuns a vrios tipos de perturbaes, e que o fenmeno da proteo cruzada
estimula uma pr-ativao de componentes importantes para a resposta a outros
estresses posteriormente aplicados (AMIR.,2009).
A dorna de fermentao um ambiente causador de mltiplo estresse nas
leveduras. Situaes como o aumento de temperatura, estresse oxidativo e estresse
osmtico so decorrentes das vrias reaes exotrmicas que acontecem em
grandes concentraes de acar no interior das dornas (PAUL,1997). O controle
dessas condies desfavorveis essencial para uma boa fermentao, porem,
existe uma grande dificuldade em se controlar essas mudanas que ocorrem nas
dornas, principalmente por parte dos pequenos produtores de bebidas. Vrias
leveduras, incluindo a S. cerevsiae so adaptadas s condies ambientais
presentes em uma dorna de fermentao. Sendo essas leveduras capazes de
crescer a 37C, em meio com 50% de glicose e 8% de etanol. Porem, essas
variveis em uma dorna de fermentao podem facilmente ultrapassar esses valores
(PATARO et al.,1998). Por esse motivo muito interessante que as leveduras
usadas em processos industriais, como a fermentao e em vrias outras aplicaes
biotecnolgicas, sejam resistentes a uma vasta gama de estresses.
19
1.3-Estresse por choque trmico
O aumento de temperatura ocorre em vrias partes do globo terrestre, e tambm no
interior das dornas de fermentao, e este aumento, pode afetar bruscamente o
metabolismo celular dos organismos. No caso da dorna de fermentao, as
mudanas no funcionamento da bioqumica das leveduras produzem efeitos
indesejveis, uma vez que o mosto de fermentao altera suas propriedades
qumicas e organolpticas em funo desses microrganismos (FLEET; HEARD,
1993).
A resposta ao estresse em leveduras tem sido amplamente estudada a nvel
genmico. As mudanas causadas durante uma situao estressante implicam em
bruscas alteraes no perfil de expresso de genes e protenas das clulas
(CAUSTON et al.,2006). Muito da compreenso dos mecanismos de reposta vem do
estudo do choque trmico, em que as clulas crescidas a uma temperatura de 28C
so posteriormente transferidas para temperaturas acima de 33C.
O choque trmico uma resposta altamente conservada em todos os organismos,
de humanos a leveduras e pode ser induzido por insultos proteotxicos extremos.
Esse alto grau de conservao entre diferentes eucariotos sugere que a resposta ao
choque trmico seja de extrema importncia para a sobrevivncia em meios
estressantes (AKERFELT et al.,2010).
Em 1970 foi mostrado que de cromossomos politenos de Drosophila melanogaster
surgiam estruturas com imensa quantidade de alas laterais, chamadas de puffs
cromossomicos, e que nessas estruturas aconteciam uma robusta ativao de
genes codificando as mais diversas protenas de choque trmico (HSP heat shock
proteins)(LINDQUIST et al.,1986).
O choque trmico controlado a nvel gentico por vrios elementos regulatrios de
ao cis, chamados de elementos de choque trmico (HSEs heat shock elements),
que esto presentes em vrias copias acima do sitio de inicio da transcrio dos
genes de resposta ao choque trmico (PELHAM,1982). Em leveduras, a resposta ao
choque trmico feita pelos fatores transcricionais Hsf1 e Msn2/Msn4, que so
responsveis pela ativao de vrios genes que codificam protenas que
desempenham papis como dobramento, trafego e maturao de protenas, e
paralelamente, tambm inibem a sntese de genes relacionados a vrios elementos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Akerfelt%20M%22%5BAuthor%5D
20
da biognese de ribossomos (TROTT; MORANO, 2003). Apesar das HSPs serem
chamadas de protenas de choque trmico, elas esto presentes em uma gama de
estresses e herdaram esse nome por terem sido primeiramente observadas na
resposta ao choque trmico ( DE MAIO, 1999; SCHLESINGE, 1990).
Em resposta ao choque trmico, tambm bem documentada a formao de
molculas de carboidratos como o glicognio e a trealose que atuam como
protetores contra o estresse (MAHMUD et al.,2009). A trealose j foi associada ao
controle da progresso do ciclo celular, proteo contra a desidratao, estresse
osmtico, congelamento, calor e proteo contra substncias txicas, tais como o
etanol, radicais livres e metais pesados (THEVELEIN, 1993), alem de evitar a
agregao de protenas e de preservar a integridade das membranas biolgicas
(LUCERO et al., 2000). O glicognio providencia uma rpida mobilizao nas fontes
de carbono no momento em que as leveduras esto se adaptando a uma nova
condio de crescimento, para isso, a degradao do glicognio acompanhada da
formao de esterol, que essencial para o sucesso da fermentao e viabilidade
das leveduras (PRETORIUS, 2000; FRANCOIS et al, 1997). Essas duas molculas
usam a glicose como precursores de sua sntese e dependem da entrada de
aucares na clula para que sejam sintetizadas. Outras modificaes importantes
nas clulas submetidas ao choque trmico a fluidificao nas membranas, que
pode levar a desintegrao na bicamada lipdica (DMITRY;NORIO, 2004).
1.4-Estresse por alta presso hidrosttica
A presso definida com uma fora por unidade rea, aplicada em uma dada
superfcie. Matematicamente a equao abaixo pode explicar este estresse:
P = F / A [equao 1]
Onde, P representa a presso, F representa a fora normal aplicada quela
superfcie e A a rea da superfcie. A alta presso hidrosttica um tipo de
presso esttica, em que o mesmo valor de presso pode ser mantido por um longo
tempo. Na categoria de presso esttica, a presso hidrosttica considerada uma
presso isosttica, em que os valores de presso so os mesmos em todas as
direes do espao (NOLWENNIG; JEAN, 2002).
21
Em diferentes pontos do planeta Terra podemos encontrar grandes variaes na
presso atmosfrica. Por exemplo, o ambiente em que ns humanos vivemos,
possui valor de presso de, aproximadamente, 1 atmosfera, o que equivale a 0,1
megapascal (MPa). Porm, a maioria da nossa biosfera composta por locais onde
os valores de presso so extremamente elevados. Nesses locais, podemos
encontrar organismos piezfilos ou barfilos, que geralmente suportam ambientes
como o fundo oceanico, que em determinados ponto apresenta presses que
excedem 38 MPa.
Sobreviver em ambientes com valores de presso elevados implica em drsticas
mudanas na fisiologia e bioqumica dos organismos. A alta presso hidrosttica
diminui o volume de reao das clulas, o que leva a alterao de diversos
componentes celulares de maneira a favorecer conformaes mais compactas.
(MENTR et al., 1999). Componentes como a membrana plasmtica sofrem
compactao em seus lipdeos, principalmente, nos lipdeos prximos a protenas
que esto inseridas na membrana (REYES; Tauc, 1993). Esse fenmeno contribui
para uma maior fluidez e aumento na espessura da membrana. Essas mudanas
tambm afetam a difuso de molculas pela membrana e comprometem a funo
das protenas membranares. J foi demonstrado que algumas protenas podem
sofrer mudanas conformacionais e funcionais quando submetidas a presses
menores que 20 MPa (MOLINA; SANZ, 2002), essas mudanas ocorrem devido a
capacidade da presso de desestabilizar ligaes fracas (como as pontes de
hidrognio), que tem um importante papel na estabilizao da forma terciria das
protenas (BALNY et al, 2002). Uma resposta diferente para explicar as mudanas
conformacionais causada nas protenas a entrada de gua em suas cavidades.
Acredita-se que esse efeito seja o mais deletrio para as protenas que so
submetidas a altas presses hidrostticas, uma vez que, a exposio de resduos
hidrofbicos a solventes polares cause um forte desarranjo e, consequentemente
perda das funes proteicas (SIlVA; FOGUEL, 2009; HEREMANS, 2005).
A estrutura lipdica de uma clula o componente mais sensvel a ao da alta
presso hidrosttica (WINTER; JEWORREK, 2009). A diminuio da fluidez das
clulas causada pelo piezotratamento j foi relacionada com a sensibilidade ao
tratamento com a alta presso hidrosttica (YALDAGARD et al., 2008). O
piezotratamento pode modificar o aspecto das membranas de liquido-cristalino para
22
um aspecto gelatinoso. Sendo que os organismos que vivem em altas presses
hidrostticas tendem a apresentar membranas mais fluidas. Essa fluidez
parcialmente um reflexo do aumento da taxa de lipdios insaturados em suas
membranas (WINTER; JEWORREK, 2009).
As leveduras quando submetidas a alta presso hidrosttica, sofrem vrios danos
em suas organelas. Entre esses danos, podemos evidenciar a desestabilizao que
as estruturas das mitocndrias sofrem. Altos valores de presso podem causar a
liberao no citocromo C que existe no interior mitocondrial, e alguns autores
supem que essa liberao do citocromo C, atue como um sinalizador chave para a
induo de um processo apopttico (BRUL et al, 2000). Alm das alteraes nas
mitocndrias, a presso pode enfraquecer a interao entre protenas e DNA e
favorecer a dissociao de importantes complexos proticos (LIMA et al, 2000;
AERTSEN et al, 2009).
Vrias so as aplicaes da presso hidrosttica na biocincia, entre essas
aplicaes destacamos a descontaminao de alimentos (TAUSCHER, 1995),
inativao de microrganismos (SATILMIS; SENCER, 2011), germinao de
sementes (XUNCHENG et al, 2008), mudanas na cintica e funo de enzimas
(BANG; CHUNG, 2010) e produo de vacinas (SHEARER; KNIEL, 2009). Alm
dessas utilidades, as alta presso hidrosttica tem sido utilizada como um
importante modelo do estudo da resposta ao estresse, indicando linhagens de
leveduras com importantes caractersticas industriais
1.5-Regulao da resposta ao estresse
Em resposta a estmulos do meio, a quantidade de transcritos de uma grande parte
do genoma das clulas alterada, seja aumentando ou diminuindo seus nveis
(SCOTT et al, 2000). O aumento na quantidade de mRNA pode ser resultado do
aumento da taxa de transcrio ou pela diminuio da taxa de degradao, contudo,
a diminuio nos nveis dos transcritos podem ser alterados pelo aumento na taxa
de degradao ou pelo decrscimo em sua taxa de produo (OPHIR et al, 2008).
Alm disso, os fatores ps-transcricionais podem atuar juntamente com os fatores
de transcrio para controlar a expresso dos genes. Em leveduras, vrios fatores
de transcrio que participam da ativao de centenas de genes j foram
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shearer%20AE%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kniel%20KE%22%5BAuthor%5Dhttp://mcb.asm.org/search?author1=Scott+A.+Jelinsky&sortspec=date&submit=Submit
23
identificados. Alguns desses fatores de transcrio esto relacionados ativao de
grupo de genes para respostas a estresses especficos, enquanto outros esto
relacionados a elementos comuns a uma ampla variedade de estresses (ESTRUCH,
2000).
J bem demonstrado que mecanismos complexos de regulao por meio de
fatores de transcrio so mediados por uma densa rede de interaes que originam
determinados padres que podem induzir ou reprimir a expresso gnica em
determinadas condies ambientais (TARASSOV ET AL, 2008).
As mudanas nos nveis transcricionais que acontecem aps a aplicao de um
estresse, j so correlacionados com a mudana na sntese de protenas. Usando a
tcnica do microaaranjo, Kuhn et al., (2001) identificaram transcritos em leveduras
que demonstraram associao alterada com os polirribossomos (polissomos) aps
as clulas serem trocadas de glicose para meio contendo glicerol. Evidenciando
assim que a taxa de traduo pode ser alterada em funo de modificaes na
transcrio celular.
A grande maioria das situaes estressantes capaz de induzir ou reprimir a
transcrio de 10 a 14% de todos os genes de Saccharomycies cerevisiae. A
maioria dos genes que sofrem induo na sua taxa de expresso esto envolvidos
com o metabolismo de carboidratos, detoxificao de espcies reativas de oxignio,
dobramento de protenas e autofagia. Os genes reprimidos so, geralmente,
relacionados ao crescimento celular, incluindo ainda, o processamento de RNA,
transcrio, traduo, biosntese de nucleotdeos e ribossomos. Como demonstrou
por Gasch et al., (2000) ,esse perfil transcricional caracterstico, que sempre surge
no momento no qual a clula ume submetida ao estresse, gerado pela expresso
de alguns grupos gnicos que receberam o nome de elementos de resposta ao
estresse do meio (ESR).
Um modulador muito importante para a resposta ao estresse designado de
elemento STRE , que um elemento de regulao cis, com a sequencia 5 CCCCT ,
que se encontra em mltiplas cpias acima dos stios de transcrio de,
aproximadamente, 200 genes. Os elementos STRE possuem stios que so
reconhecidos por duas protenas funcionalmente similares, Msn2p e
Msn4p(SCHMITT; MCENTEE, 1996). Ambas as protenas possuem um domnio de
http://www.molbiolcell.org/content/14/1/214.full#ref-14
24
ligao dedo de zinco em suas extremidades C terminais, que possibilita a ligao
aos elementos STRE. Em momentos onde no existe nenhuma perturbao, Msn2p
permanece no citoplasma, se movendo para o ncleo apenas com o surgimento de
uma condio estressante (BOY-MARCOTTE et al.,1998).
Em trabalhos anteriores mostrando o perfil da expresso global de clulas
submetidas ao tratamento de presso de 200 MPa por 30 min, indicaram que 40 %
dos genes com a expresso induzida aps esse tratamento possuam elementos
STRE em suas regies promotoras(FERNANDES et al, 2004).
O controle das respostas celulares ao estresse pode acontecer tambm a nvel ps-
transcricional. A expresso gnica pode sofrer regulao atravs de diversos
mecanismos ps-transcricionais, que envolvem a regulao do transporte, traduo,
e decaimento das molculas de RNA mensageiro (SHEPARD et al., 2003; ARAVA
et al., 2003; WANG et al, 2002). Em muitos casos a regulao ps-transcricional
ocorre atravs de elementos presentes nos RNAs mensageiros que podem interagir
com centenas de protenas ligantes a RNA menssageiro, que so conhecidas como
RBPs (RBPs; RNA binding proteins) (ANANTHARAMAN et al, 2002).
A resposta a vrios estresses segue uma seqncia de prioridades, que devem ser
ativadas em uma ordem temporal. A primeira linha de defesa consiste em ativar
componentes com baixo peso molecular (ex: trealose), protenas do sistema de
reparo e chaperonas que so necessrias para a sobrevivncia imediata. Ao mesmo
tempo, a clula deve ativar o sistema de transduo de sinais, que ento pode
desencadear linhas de defesa secundrias, como a ativao de enzimas
preexistentes e a induo transcricional de genes codificando fatores com funo
protetora (MARTNEZ-PASTOR et al., 1996).
1.6-Modificaes no metabolismo de Saccharomycescerevisiae durante o estresse.
Uma tarefa indispensvel para a sobrevivncia das clulas manter uma fonte de
energia vivel. A glicose a fonte de energia preferida de leveduras e, sob estresse,
as clulas induzem vrios genes que afetam o metabolismo de glicose. Em resposta
ao estresse, o destino metablico da glicose dividido entre a sntese de trealose,
25
armazenamento de glicognio, sntese de ATP e regenerao de NAPH pela via de
troca das pentoses (GASCH, 2002).
Um dos componentes formados a partir do metabolismo da glicose a trealose, um
dissacardeo constitudo por uma ligao -(1,1) entre as glicoses, e est envolvido
com a estabilizao de protenas, preveno da agregao de protenas
desenoveladas, proteo contra dano oxidativo e, alm disso relacionada com a
manuteno do fluxo normal da via glicolitica (DE VIRGILIO et al.,1994;
BENAROUDj; GOLDBERG, 2001; THEVELEIN; HOHMANN, 1995). Outro destino
importante da glicose durante o estresse o armazenamento de glicose em forma
de glicognio. Essa rota anablica desempenha um papel crucial na sobrevivncia
das clulas em respostas a uma ampla variedade de situaes de estresse
(FRANCOIS; PARROU, 2001).Os mecanismos de defesa ao estresse consomem
grande quantidade de ATP, ento de se esperar que a expresso de componentes
da respirao celular sejam induzidos durante as situaes estressantes (GASCH,
2002).
Clulas de leveduras deletadas em Msn2p/Msn4p mostraram que menos de 10 %
dos genes da via respiratria alteram seu padro de expresso em funo dessas
delees. Apesar de 70% dos genes da via respiratria possurem elementos
promotores para a ligao de Msn2p/Msn4p, os mecanismos de regulao parecem
ser independentes desses reguladores. Os poucos fatores induzidos por elementos
STRE, parecem ter o papel mais importante na defesa contra espcies reativas de
oxignio, do que na gerao de ATP propriamente dita (GASCH et al. 2000) .
A beta oxidao de cidos graxos em leveduras feita atravs dos peroxissomos, e
as unidades acetil resultantes so transportadas para as mitocndrias onde
abastecem o ciclo do acido tricarboxilico (HETTEMA; TABAK, 200). Porem, no
comum encontrar a expresso modificada de genes ligados a estes processos
durante a resposta ao estresse (GASCH, 2002).
Os ribossomos, protenas, RNA transportadores e RNA ribossmicos tm suas taxas
de metabolismo rapidamente afetadas aps a aplicao de vrios tipos de estresse.
estimado que durante o crescimento de leveduras sejam encontrados
aproximadamente 200 mil ribossomos, sendo que a massa da parte protica dos
26
ribossomos compreende 15% de toda a massa total de protenas celulares
(WARNER, 1999). Devido elevada quantidade de elementos necessrios para a
sua formao, o metabolismo de ribossomos se torna a tarefa que mais drena
energia celular para sua realizao (JORGENSEN et al., 2004 ). Como demonstrado
por estudos de microarranjo, genes relacionados a sntese de ribossomos esto
entre os genes mais fortemente regulados em leveduras sob estresse (CAUSTON et
al., 2006). Porem, esse evento no surpreendente, uma vez que a resposta ao
estresse demanda um alto gasto energtico (GASCH, 2002).
1.7-A tecnologia do microarranjo
O microarranjo foi desenvolvido para permitir que a expresso de todos os genes de
um determinado organismo seja detectada em um mesmo experimento. Esse tipo
de abordagem holstica pertence genmica funcional, e tem influenciado muito o
surgimento de novas reas, como a biologia dos sistemas, que abandona a viso de
componentes celulares individuais e foca no funcionamento dos seres vivos a partir
das relaes entre todos os genes, protenas e metabolitos presentes em uma dada
situao (DENNIS, 2006).
Um ensaio de microarranjo feito atravs de um microchip que contem sequencias
de DNA aderidas a uma base, que pode ser de vidro, plstico ou nylon. Todos os
genes de um organismo podem ser organizados em um espao nico da placa, que
chamado de Spot. Os transcritos de um organismo ou tecido so ento extrados,
passam por uma reao de transcrio reversa, so amplificados e recebem a
adio de uma sonda marcadora. Sabemos que o microarranjo uma forma de
quantificao relativa da expresso gnica, e para isso necessita da utilizao de
duas amostras diferentes para ser efetuada. A marcao das amostras realizada
atravs de sondas com fluorescncia diferentes (na maioria dos casos cy3 e cy5 que
fluorescem nas cores vermelha e verde, respectivamente). A deteco do sinal
emitido por essas sondas fluorescentes captada por um sofisticado equipamento
de scanner e, logo aps, os dados so importados para um computador, onde as
medidas de fluorescncia so analisadas e quantificadas, o que gera uma enorme
matriz de dados contendo os valores de expresso gnica (REDIG, 2005).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jorgensen%20P%22%5BAuthor%5D
27
1.8-Bioinformtica
Os dados biolgicos vm sendo gerados em uma taxa fenomenal. Na dcada
passada, juntamente com o avano das novas tecnologias de seqenciamento de
DNA, presenciamos o nmero de nucleotdeos nos bancos de dados crescerem
exponencialmente a cada ano (AERTSEN et al, 2009; MONYA, 2010). Essa grande
quantidade de dados, fez florescer a necessidade de organizao, manuteno,
armazenamento e analise dessas informaes, que o papel desempenhado pela
bioinformtica. A bioinformtica pode ser definida de vrias formas. Chamarei aqui a
bioinformtica de uma fuso da matemtica, computao e estatstica que utilizada
na resoluo de problemas de origem biolgica.
Entre as vrias aplicaes da bioinformtica podemos destacar algumas que
merecem ateno especial, como a predio de produtos gnicos a partir de uma
seqncia de DNA/RNA, alinhamento de seqncia, identificao de motivos
conservados, predio de estruturas secundarias e terciarias, analises filogenticas,
correlao de padres de expresso (LUSCOMBE et al., 2001) e a biologia
executvel (JASMIN; THOMAS, 2007).
A bioinformtica tem tentado cada vez mais criar alternativas para coletar e
organizar todos os dados presentes nas publicaes, de forma que a comparao
entre os dados obtidos por diferentes grupos de pesquisa possa ser facilmente
efetuada. Uma iniciativa que surgiu nos ltimos anos e que de extrema importncia
o The Gene Ontology Project (http://www.geneontology.org/), que tem como foco a
padronizao da representao de genes e produtos, independente da espcie ou
do banco de dados. Essa abordagem separa cada gene por um termo, que pode
representar sua localizao celular, funo molecular ou funo biolgica.
Um dos grandes gargalos da bioinformtica ainda hoje a quantidade de
profissionais disponveis no mercado. No Brasil, apesar de notarmos uma tendncia
ao crescimento, existem ainda poucos locais para a formao de mo de obra
qualificada. Outra grande barreira a dificuldade de se encontrar pessoas que tem
experincia com as cincias exatas e as cincias biolgicas e se interessem por
essa nova rea (CHEN et al, 2012).
28
1.9-Redes Biolgicas
No justo descartar o enorme conhecimento que a viso reducionista nos trouxe
sobre os componentes individuais dos seres vivos nesse ultimo sculo, porem tem
ficado cada vez mais claro que a maioria das funes biolgicas pode acontecer de
forma discreta e so extremamente resistentes a abordagens que restringem o foco
em componentes individuais (HARTWELL et al, 2002;KITANO, 2002; OLTVA;
BARABSI, 2002). Um desafio chave que encontramos agora entender como a
estrutura e a dinmica da complexa teia intracelular de interaes contribui para a
estrutura e a funo dos seres vivos (ALBERT-LSZL; ZOLTN , 2004).
O comportamento de muitos sistemas complexos, desde a internet at as clulas,
surge de uma orquestrada atividade de muitos componentes que se relacionam com
os outros atravs de pares de interao. Em um nivel alto de abstrao, os
componentes podem ser reduzidos a uma srie de nodos que so conectados a
outros nodos por meio de links. Sendo cada link o representante da interao entre
dois componentes. O conjunto formado entre vrios nodos e links chamado de
rede, ou em uma linguagem matemtica formal de grafo (ALBERT-LSZL;
ZOLTN , 2004).
Apesar de para muitos parecer apenas uma representao grfica, a topologia e os
atributos de uma rede podem ser extremamente informativos para o entendimento
das relaes dos componentes presentes nela. As redes podem apresentar modelos
de organizao hierrquicos, randmicos ou scale-free. Esses modelos so
determinados pelo padro de conexo entre os diferentes nodos. Por exemplo, uma
grande parte das redes de interao entre os componentes celulares seguem o
modelo de organizao scale-free, que obedece a uma lei de potencia, que
determina que a maioria das conexes feitas nas clulas so estabelecidas por
menos de 20% dos componentes da rede (JEONG et al, 2001). Outras medidas de
atributos como, a conectividade, a centralidade, o grau de distribuio e a
modularidade dos nodos podem definir a importncia de um determinado
componente de uma rede. Uma prtica bem til nos estudos de redes a
identificao dos componentes que possuem o maior grau de conectividade,
chamados de hubs. Os hubs podem indicar quais elementos afetam fortemente a
topologia de uma rede, em termos biolgicos, algumas protenas sinalizadoras e
alguns fatores de transcrio tm esse tipo de comportamento global e podem ser
29
muito informativos para vrios tipos de investigaes (COHEN; HAVLIN, 2003,
EDWIN et al, 2007).
Desta forma o trabalho pretendeu utilizar o microarranjo aliado com as anlises de
bioinformtica, para entender quais genes so importantes para as mudanas
ocorridas no metabolismo de S.cerevisae em resposta ao estresse causado durante
o piezotratamento.
30
2-OBJETIVO GERAL
Analisar por meio do microarranjo a resposta transcricional dos genes envolvidos com o metabolismo celular em clulas de S.cerevisiae submetidas ao estresse por alta presso hidrosttica.
2.1- Objetivos especficos.
Analisar o comportamento transcricional dos genes do metabolismo celular da levedura S.cerevisiae imediatamente aps o tratamento de 50 MPa e 5, 10 e 15 minutos aps o piezotratamento.
Validar os experimentos de microarray por meio de RT-PCR em tempo real
Identificar os fatores de transcrio que se relacionam com o comportamento de determinados grupos gnicos envolvidos com o metabolismo celular.
Predizer motivos de DNA e mRNA que se relacionam com os grupos gnicos diferencialmente expressos.
Comparar transcricionalmente o estresse causado pela alta presso hidrosttica com outras fontes de estresse j descritas na literatura.
31
3-MATERIAL E MTODOS
3.1.- Linhagens utilizadas, condies de crescimento e tratamento de presso
A linhagem selvagem, BT0605, anteriormente isolada de uma alambique, como
descrito em Bravim et al. 2007 foi crescida a 28oC com agitao (160 rpm) em meio
YEPD lquido (1% extrato de levedura, 2% peptona e 2% glicose) at a fase
exponencial de crescimento (D.O.600nm=1,0), antes de ser submetida ao tratamento.
As clulas foram submetidas a quatro tratamentos de presso hidrosttica: (1) 50
MPa por 30 min; (2) 50 MPa por 30 min + 0,1 MPa por 5 min;(3)50 MPa por 30 min +
0,1 MPa por 10 min; e (4) 50 MPa por 30 min + 0,1 MPa por 15 min. Uma alquota
no-pressurizada foi utilizada como controle. No procedimento para o tratamento
com presso, as amostras foram colocadas em um tubo de teflon de 4mL e
pressurizadas na ausncia de ar temperatura ambiente. O aparato para aplicao
de alta presso hidrosttica utilizado neste trabalho uma adaptao de uma clula
de presso fabricada em ao de alta dureza desenvolvida por E. S. Itskevich, em
1962, no Institute for High PressurePhysicsoftheRussianAcademyof Science. Esta
clula est desenhada para pressurizao de amostras em um meio fludo atravs
de um pisto cilndrico de Cobre-Berlio. Um manmetro manual foi utilizado para
aplicar a presso. A vantagem desta montagem que aps a pressurizao, um
conjunto de engrenagens mantm a presso aplicada e a unidade pode ser
removida.
3.2.- Anlise de microarranjo
Aps os tratamentos com alta presso, as clulas foram imediatamente colocadas
no gelo. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 5.000 g por 3 minutos a
5oC, lavadas em gua ultrapura e centrifugadas novamente, sendo o precipitado
imediatamente congelado em N2 lquido e mantido a -80oC at o momento da
extrao do RNA.
3.2.1.- Extrao do mRNA As anlises de microarranjo foram realizadas no Laboratrio Lewis Thomas, do
Departamento de Biologia Molecular, na Universidade de Princeton (Princeton, Nova
32
Jersey, EUA), sob orientao do Dr. James R. Broach. As amostras foram
pressurizadas e enviadas em gelo seco para os Estados Unidos.
O RNA total foi extrado usando o mini kit RNeasy (Qiagen, Califrnia, EUA), que
inclui o tratamento com DNaseI. A integridade do RNA foi verificada em gel de
agarose. O RNA extrado foi quantificado em espectrofotmetro (NanoDrop, ND-
1000 Spectrophotometer, Delaware, EUA) e diludo para 100 ng/L em gua livre de
nuclease.
O cRNA foi sintetizado usando o kit Low RNA Input Linear Amplification (Agilent
Technologies, Califrnia, EUA) com algumas modificaes. Os controles foram
ligados com a sonda Cyanina3-CTP e as amostras tratadas com a sonda Cyanina5-
CTP (PerkinElmer, Massachusetts, EUA). O cRNA amplificado bem como a
incorporao das amostras s sondas, Cy3-CTP e Cy5-CTP, foram quantificados
usando espectrofotmetro (NanoDrop, ND-1000 Spectrophotometer, Delaware,
EUA).
Para o processo de hibridizao 400 ng de cada sonda foi incubado a 60oC por 17 h
com 25 L de 10X controle alvo. O cRNA foi hibridizado na lmina do AgilentYeast
Gene Expression Microarray (V1, 4x44K, G2519F).
3.2.2.- Normalizao dos dados As placas hibridizadas foram lavadas e escaneadas usando AgilentMicroarray
Scanner (Agilent Technologies Califrnia, EUA) no canal PMT 100% verde e
vermelho e em 10 m de resoluo. As imagens escaneadas foram processadas
usando AgilentFeatureExtraction Software verso 9.5 com as configuraes padro.
Os dados normalizados foram armazenados e analisados na Princeton University
MicroArray Database (PUMAdb). A normalizao para cada arranjo foi determinada
pelo filtro de consistncia rankeada (rankconsistencyfilter) e os spots foram
selecionados (filtrados) pelo mtodo de normalizao do algoritmo LOWESS
(locallyweightedscatterplotsmoothing). A normalizao feita pelo LOWESS aplica um
suave ajuste que remove falsas variaes na intensidade de fluorescncia (ZAMAN
et al., 2009).
33
3.2.3.- Implementao computacional Todos os procedimentos de anlises de dados foram implementados na linguagem
de programao estatstica R project verso 2.12.2 obtidos no site http://www.r-
project.org/ [60].
Para seleo de grupos funcionais foi utilizado o arquivo de classificao fornecido
pelo banco de dados do MIPS ComprehensiveYeast Genome Database (CYGD)
(disponvel em http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/yeast/) [120], esse
arquivo integrado com algoritmos feitos no R Project possibilitou a escolha dinmica
de grupos gnicos que se desejava analisar.
3.2.3.1.- Avaliao da expresso gnica
Para produo dos grficos de expresso gnica foi necessrio criar um software
que selecionava classes gnicas e, em seguida, gerava os grficos com base no
valor de expresso de cada gene ou grupo de genes.
A anlise de expresso global dos genes foi feita com as principais categorias
funcionais. Lembrando que em alguns casos a categorizao atribuda pelo MIPS
permite que um gene pertena ao mesmo tempo a mais de um grupo funcional.
Escolhemos o boxplot (ou diagrama de Box e Whisker) para analisar o perfil de
expresso global, por ser uma ferramenta muito utilizada na estatstica descritiva e
que nos permitiu determinar os genes diferencialmente expressos em funo de
uma dada classe. Uma das caractersticas importantes desse tipo de analise a
robustez que ela apresenta. Chamamos de analise estatistica robusta aquela que
no se distorce na presena de valores outliers.
Alm de demonstrar o perfil de cada classe, o boxplot tambm indica quais genes
possuram o comportamento mais anormal dentro de uma classe especifica
(outliers), o que fornece um importante ponto de partida para a procura de genes
envolvidos no processo de resposta ao piezotratamento.
Para relacionar diferentes tipos de estresse, foi necessrio criar uma nova rotina
computacional. A base de dados deste algoritmo foi a mesma utilizada no software
anterior, na qual eram necessrios os dados obtidos do MIPS.
A tarefa desse software era selecionar uma classe funcional que poderia abranger
34
funes mais gerais ou especficas e apresentar a correlao dessa classe em
diferentes tratamentos. Nos grficos so apresentados, a classe selecionada em
pontos pretos e os demais genes ao fundo em pontos azuis.
Os dados dos microarranjos para comparao foram obtidos no banco de Gene
Expression Omnibus (GEO) disponvel em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ [122].
Os genes que possuam ORFs duplicadas ou que possuam dados corrompidos ou
faltantes, em qualquer uma das duas analises, foram excludos pelo programa.
3.2.3.2.- Visualizao das vias metablicas afetadas pelo tratamento com a alta presso hidrosttica.
Para visualizar os genes diferencialmente expressos nas suas respectivas vias
metablicas, utilizamos o banco de dados wikipathways disponvel em
http://www.wikipathways.org. Os arquivos correspondentes as vias metablicas
foram adquiridos via download e exportados para o programa cytoscape. Logo aps,
a tabela contendo as expresses gnicas dos tratamentos foram introduzidas e
analisadas.
3.2.3.3.- Criao de redes de funes moleculares, processos biolgicos e componentes celulares.
A fim de comparar quais redes gnicas foram formadas a partir dos genes induzidos
e reprimidos selecionamos todos os genes com expresso maior do que 2 e menor
do que -2. Esses genes foram exportados para o software cytoscape, onde foram
analisados com o plugin Bingo 2.44. O plugin Bingo 2.44 foi configurado para
categorizar os grupos utilizando os termos com a significncia de 0.01 e o repertorio
de termos foi o GOslim yeast. As redes foram organizadas no cytoscape pelo
Spring Embedded Layout. A intensidade das cores contidas em cada nodo criado
definida pelo valor da significncia do termo, sendo que as cores mais escuras
indicam o maior grau de significncia. As diferenas nos tratamentos foram
computadas atravs da fuso dos elementos no compartilhados entre as duas
redes. Para isso, foi utilizado o plugin Advance Network Merge disponibilizado no
programa cytoscape.
http://www.wikipathways.org/
35
3.2.3.4-Utilizao do software DREM
Utilizamos o software DREM (Dynamic Regulatory Events Miner) para a busca de
fatores de transcrio, que se relacionam com o aumento ou a diminuio da
expresso de alguns grupos gnicos, em funo do tempo aps o tratamento. Esse
software combina a srie de dados da expresso gnica temporal com ferramentas
de atribuio de termos e regresso logstica (JASON et al .,2007). As tabelas
contendo os valores de expresso de 0 a 15 minutos aps o tratamento pela alta
presso hidrosttica foram inseridas no software DREM e o programa foi executado
com as opes default. Aps esse processo, a escolha dos termos relacionados a
cada nodo foi realizada utilizando os valores de significncia menores que
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3.3.- Confirmao dos dados de microarranjo por RT-PCR em tempo real
Para confirmar a induo de alguns genes aps o tratamento de presso
hidrosttica, foi realizado anlise de RT-PCR em tempo real. Os genes escolhidos,
bem como a sequncia e o tamanho de cada fragmento esto descritos na Tabela1.
Os genes TAF10 foram utilizados como genes de referncia (TESTE et al., 2009).
Aps os tratamentos com alta presso, as clulas foram imediatamente colocadas
no gelo. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 5.000 g por 3 minutos a
4oC, lavadas em gua ultrapura e centrifugadas novamente, sendo o precipitado
imediatamente congelado em N2 lquido e mantido a -80oC at o momento da
extrao de RNA.
Para a extrao, os precipitados congelados correspondentes s clulas
pressurizadas e no-pressurizadas foram ressuspendidos em tampo AE (50 mMde
acetato de sdio, 10 mMde EDTA, pH 5,3) e 10% de SDS. A extrao foi feita com
fenol/clorofrmio e precipitado com 3 Mde acetato de sdio e etanol absoluto. Aps
a extrao, o RNA foi lavado com etanol 70% e ressuspendido com gua ultrapura.
As amostras foram quantificadas em espectrofotmetro (NanoDrop, ND-1000
Spectrophotometer, Delaware, EUA) e armazenadas em freezer a -80oC at serem
processadas.
Para a remoo de qualquer resduo de DNA genmico, 1g de RNA total foi tratado
com o kit DNaseRQ1 RNase-FreeDNase(PROMEGA, Madison, EUA) durante 30
min a 37oC. Para inativao da enzima, 1ul de stop solution (20mM de EDTA) foi
adicionado amostra e seguiu-se incubao por 10 min 65oC.
Aps tratamento com a DNase,procedeu-se a confeco da fita de cDNA utilizando
o kit High CapacitycDNA Reverse Transcription (AppliedBiossystems, Califrnia,
EUA). Para isso, utilizou-se 2l de tampo da RT (10x), 0,8 L de 25x mix de dNTP
(100mM), 2 L de primer randmico (10x) e 1 L da MultiScribe Reverse
Transcriptase, mistura foi adicionado gua para um volume total de 10 L.
As amostras foram incubadas na seguinte ordem: 10 minutos a 25C, 50C por 50
minutos e, posteriormente, 85C por 5 minutos, e, posteriormente, puderam ser
armazenadas em gelo.
37
Para a reao do PCR em tempo real utilizou-se o equipamento
AppliedBiosystemsStepOnePlus Real-Time PCR (ABI 6.200, AppliedBiosystems,
Califrnia, EUA). O volume total de reao foi de 25 l contendo: 3,0 l de cDNA (0,2
g do RNA tratado com Dnase), 12,5 l do kitSYBR Green PCR Master Mix
(AppliedBiosystems, Califrnia, EUA), 1,0 l de cada primer a uma concentrao de
10 M. As amostras foram submetidas a um ciclo de 95C por 10 minutos, 40 ciclos
de 95C por 15 segundos e 60C por 1 minuto, finalizando-se por um ciclo de 95C
por 15 segundos. Um controle negativo (contendo todos os reagentes, com exceo
de cDNA que foi substitudo por gua) foi adicionado em todas as corridas.
O nmero de ciclos requeridos para o sinal de fluorescncia ultrapassar o limiar
(Cyclethreshold - Ct), bem como a curva de dissociao (melting curve) para a
verificao da especificidade da reao, ausncia de contaminao e ausncia de
dmeros de primers foram analisados pelo
programaStepOneSoftware(AppliedBiosystems verso 2.1, Califrnia, EUA).
A eficincia de cada par de primer (Tabela 2) foi avaliada pelo mtodo de diluio
seriada usando um mix de cDNA como padro. O valor de eficincia foi calculado
pela seguinte frmula: E=[10^(-1/a)], onde a o slope entre cada concentrao
conhecida de cDNA utilizada na curva padro (primer com eficincia de 100%
apresentam slope de -3,32). Valores de eficincia entre 90 e 110% foram
considerados, utilizando-se a seguinte frmula para o clculo da expresso relativa,
2-CT, onde CT = [(CTTratado - CTControle) - (CTTratado-Referncia - CTControle-Referncia)].
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Tabela 1- Oligonucleotdeos utilizados como primers na reao de RT-PCR em tempo real.
Gene Sequncia do primer
Tamanho
do
amplicon
(pb)
Eficincia
do primer
(%)
ADH1 Forward, 5'ACTACGCCGGTATCAAATGG3'
138 89.63 Reverse, 5'TCAGCGGTAGCGTATTGTTG3'
ADH3 Forward, 5'TATTCAAGCCGCCAAAATTC3'
185 90.70 Reverse, 5'TAACCCATCGCAGTTGCATA3'
HSP26 Foward, 5'ATGCTGGCGCTCTTTATGAT3'
95 98 Reverse, 5'TTCTAGGGAAACCGAAACCA3'
PHM7 Forward, 5'TTGGGGAATTGAACGAAGAG3'
180 88.54 Reverse, 5'TCTTCTGGCGAGTAGCCAAT3'
ROM1 Forward, 5'AAACAAGTGGCACCAACACA3'
166 93.38 Reverse, 5'CATTCTTGGGATTGCTCGTT3'
RTN2 Forward, 5'CGTGCTATCGACAGGATGAA3'
110 106.71 Reverse, 5'GGTTTGGGGTGGGATAATCT3'
TAF10 Forward, 5'GCTAGGCAGCTATTGCAAGG3'
129 98.40 Reverse, 5'CAACAGCGCTACTGAGATCG3'
USV1
Forward, 5'AACGACAGCAACAACACCAA3'
214 80.70
Reverse, 5'CGGAGGAAAGGACGATATGA3'
YGP1 Forward, 5'TGACGGTGGTTACTCTTCCA3'
49 87.26 Reverse, 5'GAACGGCAGAACTCAAGGAG3'
YPS6 Forward, 5'TGGGAGATGCTTTCCTTGTC3'
193 91.71 Reverse, 5'TCCTGTTCCGATGGGACTAC3'
ZEO1 Forward, 5'GCCCAAGATGTCCAACAAAA3'
167 89.43 Reverse, 5'TTCGACACCATCAGCAATGT3'
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4-RESULTADOS E DISCUSSO
4.1-Perfil global da expresso gnica 0, 5, 10 e 15 minutos aps o tratamento com alta presso hidrosttica.
No intuito de mostrar a perturbao transcricional causada s clulas de
S.cerevisiae aps o tratamento com a alta presso hidrosttica, foi utilizado um
diagrama de Box e Whisker, que continha o nvel de expresso dos genes
apresentados em uma funo logartmica na base 2. Esse diagrama teve o intuito de
indicar quais eram as mudanas ocorridas globalmente no perfil de expresso
gnica das leveduras em 0, 5, 10 e 15 minutos aps o tratamento com a alta
presso hidrosttica.
No diagrama mostrado na Figura 1, cada classe de genes representada por um
numero especifico. As classes foram definidas atravs do agrupamento proposto
pela classificao funcional do banco de dados MIPS FunCat (ANDREAS et al,
2004).
A viso geral do grfico demonstra como os genes relacionados ao metabolismo
energtico (9) so positivamente regulados desde o momento inicial ps-estresse.
Sendo esse grupo o mais diferencialmente expresso dentre todos os outros grupos,
em todos os tratamentos feitos. Outros grupos gnicos que possuem sua expresso
perceptivelmente afetada so os dos genes ligados ao mecanismo de proteo
celular (4), sntese proteica (13) e transcrio gnica (16).
Esse diagrama de expresso gnica possibilita observar que com o passar do
tempo, o perfil de expresso se torna mais distante do perfil transcricional das
clulas no tratadas, sugerindo que seja necessrio um tempo maior que 15 minutos
para que as clulas retornem ao estado inicial de homeostase. Uma evidencia para
isso, que, em 15 minutos aps o tratamento encontramos genes que possuem
efeitos crticos na inibio da sntese proteica e diviso celular ainda em forte estado
de represso. Nos dados anteriores do grupo (PALHANO et al, 2004) foi
demonstrado que a taxa de gemulao de leveduras submetidas a esse mesmo
valor de presso torna-se igual a antes do tratamento apenas 120 minutos aps a
retirada da clula do meio estressante. Do momento ps-estresse e at 45 minutos
depois podemos observar as taxas de gemulao reduzidas pela metade, sendo nos
40
50 minutos aps o tratamento, o momento em que a clula inicia a retomada dos
valores iniciais de gemulao.
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Figura 1 Boxplot mostrando a expresso de todos os genes nos tratamentos de 0, 5, 10 e 15 minutos aps a aplicao de 50 MPa por 30 minutos. Os grupos so representados por : (1) biognese de componentes celulares(2)ciclo celular(3)diferenciao celular(4) proteo celular (5) diferenciao do tipo celular(6)comunicao celular (7) transporte celular(8) desenvolvimento (9) metabolismo energtico (10) interao com o meio (11) metabolismo (12) dobramento, modificao e transporte de protenas(13)sntese protica(14)protenas com funes estruturais ou catalticas(15)regulao do metabolismo(16) transcrio(17) elementos de transposio (18) no classificados
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Inmeros autores observaram que em clulas de levedura, os mesmos genes de
resposta ao estresse so utilizados em grande parte das situaes. Esses genes j
foram nomeados como ESR (Enviromental Stress Response ou Resposta ao
Estresse Ambiental) e parecem ser regulados independentemente do tipo de
estresse (BALL et al, 2000)
Essa grande quantidade de genes redundantes, ativados e desativados em diversas
respostas, cria uma enorme dificuldade de se entender como a alta presso
hidrosttica se diferencia em nvel transcricional das respostas geradas por outras
fontes estressantes.
Na tentativa de procurar mudanas singulares no perfil de expresso aps o
tratamento com a alta presso hidrosttica, escolhemos o estresse por choque
trmico como um modelo de resposta comparativo. A escolha do choque trmico
como parmetro de comparao surgiu da observao de que clulas crescidas a
25C e subsequentemente submetidas a um meio com temperatura elevada,
apresentam suas taxas de sobrevivncia semelhante ao tratamento com a alta
presso hidrosttica de 50 MPa por 30 minutos (IWAHASHI et al, 1993 ).
O mtodo utilizado para comparar os dois estresses foi a elaborao de um grfico
que continha em cada eixo os valores de expresso de um dos estresses. A primeira
categoria de genes comparada foi a dos genes de proteo celular. Para essa
analise o tratamento de 50 MPa por 30 minutos (tratamento imediatamente aps a
presso) foi comparado com os dados gerados pela resposta ao estresse por
choque trmico.
Na comparao da classe proteo celular, encontramos alguns genes que
possuam comportamento de expresso que se diferenciavam em ambos os
estresses (Figura 2,). Genes como GCY1, TPO4, TSA2, HSP12, PIR3, PIR1 e SED1
esto reprimidos ou tem a expresso no alterada durante a resposta a alta presso
hidrosttica, porm apresentam aumento durante o tratamento com o choque
trmico. Todos os genes citados acima possuem ligao com a membrana
citoplasmtica ou parede celular, exceto TSA2 que uma tioredoxina citoplasmtica,
envolvida na defesa contra o estresse oxidativo (WONG et al., 2002).
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Figura 2 Comparao dos genes ligados a proteo celular no estresse de 50 MPa por 30 minutos e o choque trmico de 25C para 37C por 20 minutos. Os pontos marcados em preto representam os genes da categoria proteo celular. Os pontos em azul representam todos os outros genes.
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Aps o tratamento com a alta presso hidrosttica, genes positivamente regulados
como CUP1-1, ou genes que no apresentam variao no seu perfil de expresso
aps a pressurizao, como RAD59, YHB1, PHO3, LTV1, SRP40 e KRI1 se
encontram reprimidos no tratamento com o choque trmico.
Quando o procedimento anterior foi realizado para comparar os genes da classe de
metabolismo energtico (Figura 3), encontramos poucos elementos que se diferem
nos dois tratamentos. O tratamento com alta temperatura foi quem apresentou
genes que possuam taxas de expresso maiores. O nico gene do metabolismo
energtico induzido logo aps a alta presso hidrosttica foi GDH1, que codifica a
enzima glutamato desidrogenase, responsvel por sintetizar glutamato, utilizando
amnia e alfa-cetoglutarato como precursores (DELUNA et al., 2001)
A fim de entender um pouco mais as diferenas transcricionais existentes entre
esses dois estresses, um grupo maior de genes denominado Metabolismo foi
utilizado como parmetro de comparao. No conjunto de genes definido como
Metabolismo, se encontram vrios genes responsveis pelo anabolismo e
catabolismo de aminocidos, nucleotdeos e lipdios, alm de genes ligados a
produo de metabolitos secundrios.
Notamos que aps o tratamento com o choque trmico foi promovido um forte
aumento transcricional no gene TOR1. O gene TOR1 tem um importante papel no
controle do crescimento celular durante uma situao de estresse. O gene TKL2 que
possui forte relao com a biosntese de aminocidos aromticos e ALD2 que possui
envolvimento com a produo citoplasmtica de alanina tambm foram fortemente
induzidos aps o choque trmico (Figura 4). Por outro lado, os genes da classe
Metabolismo que sofreram modificaes apenas aps o piezotratamento,
compartilham relaes funcionais diretas com o aminocido metionina. Podemos
citar nesse conjunto, os genes MET14, MET17 e MHT1 que esto relacionados
biosntese da metionina e de outros aminocidos sulfurosos (MASSELOT;
ROBICHON, 1975; THOMAS et al., 2000)
Com o intuito de medir a frequncia em que os genes relacionados metionina so
positivamente regulados durante outros estresses, checamos centenas de situaes
45
estressantes, utilizando para isso o banco de dados de microarranjos fornecido pelo
trabalho de Gash et al,. (2000). Essa anlise mostrou que poucos foram os
tratamentos que apresentavam esse mesmo conjunto de genes co-expressos. Os
estresses que induziram esse grupo de genes, semelhantemente a alta presso
hidrosttica, foram os tratamentos onde existia privao de nitrognio, ausncia de
aminocidos e estresse oxidativo induzido por diamida a concentraes de 1,5mM
por 40 minutos.
O ponto interessante no aparecimento dos genes de metionina aps o
piezotratamento que trabalhos anteriores j haviam demonstrado que leveduras
crescendo em uma presso hidrosttica de 40 MPa por 16 horas (IWAHASHI et al
.,2003) possuem sua lista de genes mais expressos, inmeros representantes do
metabolismo de metionina e aminocidos sulfurosos.
Uma avaliao minuciosa no padro de expresso temporal dos genes que
possuem envolvimento com a sntese de aminocidos sulfurosos e metionina
mostrou que em 5 minutos ps-presso, grande parte desses genes anteriormente
expressos j no so mais regulados. Essas informaes sugerem que a induo
desse grupo possa estar ligada ao mecanismo de adaptao das clulas submetidas
a alta presso hidrosttica. O que fortalece essa hiptese que estes genes no
so comuns a todos os estresses e so ativados apenas no momento em que a
levedura est submetida ao tratamento de alta presso hidrosttica.
A ultima comparao entre o piezotratamento e o choque trmico foi feita com os
grupos gnicos relacionados transcrio e sntese proteica (Figura 5). Nessa
analise percebemos que os dois tratamentos se comportaram de forma bastante
distinta. A resposta transcricional da clula submetida alta temperatura mostrou
possuir uma caracterstica repressora muito potente quando comparada a alta
presso hidrosttica. A maioria dos genes reprimidos nessas categorias pertence s
famlias RPL e RPS, que esto ligados ao surgimento de subunidades dos
ribossomos e envolvidos em processos traducionais. Sabemos que a maquinaria
necessria para a realizao da sntese proteica tem um custo extremamente
elevado, sendo o processo biolgico mais caro energeticamente para uma clula
(PAUL et al., 2004).
46
Figura 3 omparao dos genes ligados ao Metabolismo energtico no estresse de 50 MPa por 30 minutos e o choque trmico de 25C para 37C por 20 minutos. Os pontos marcados em preto representam os genes da categoria Metabolismo energtico. Os pontos em azul representam todos os outros genes.
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Figura 4 Comparao dos genes ligados ao Metabolismo no estresse de 50 MPa por 30 minutos e o choque trmico de 25C para 37C por 20 minutos. Os pontos marcados em preto representam os genes da categoria Metabolismo. Os pontos em azul representam todos os outros genes.
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Como j foi estimado, a levedura S.cerevisiae um organismo que no possui uma
histria evolutiva diretamente relacionada a ambientes com alta presso hidrosttica.
Alm disso, notamos que o padro de represso dos genes de parada do ciclo
celular s se comparam semelhante aos genes do choque trmico 15 minutos aps
o tratamento com a alta presso hidrosttica.
Acreditamos que a falta de uma coevoluo com o estresse de alta presso, diminui
claramente a possibilidade da existncia de uma sinalizao especifica de parada
rpida do ciclo celular, como a que acontece na resposta a alta temperatura
(RABOY et al ., 1999).
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Figura 5 Comparao dos genes ligados a sntese protica no estresse de 50 MPa por 30 minutos e o choque trmico de 25C para 37C por 20 minutos. Os pontos marcados em preto representam os genes da categoria de sntese protica. Os pontos em azul representam todos os outros genes.
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4.2-Avaliao da expresso dos genes ligados a gliclise e gliconeognese
aps o tratamento com a alta presso hidrosttica.
A analise dos genes relacionados com as vias glicoltica e gliconeognica foi
realizada utilizando os dados do tratamento de 0 e de 15 minutos aps a
pressurizao. O objetivo foi mostrar como os nveis de transcritos dessas vias se
modificam durante esse intervalo.
A via da gliclise em leveduras conta com trs isoenzimas responsveis pela
realizao da primeira etapa de fosforilao da glicose, Hxk1p, Hxk2 e Glk2p (104).
Essas enzimas trabalham em situaes fisiolgicas diferentes e possuem princpios
regulatrios particulares (RODRIGUEZ et al., 2001). Aps o tratamento com a alta
presso hidrosttica foi observado que duas dessas fosfoquinases estavam ativadas
transcricionalmente (Figura 6). Imediatamente aps o tratamento de presso, tanto
o gene HXK1 como GLK1, foram altamente regulados, sendo que em 15 minutos
aps a pressurizao, os valores de expresso de ambos se intensificaram (Figura
7). O gene HXK1 conhecido por ter seus nveis ps-transcricionais regulados por
um motivo 3UTR. Esse motivo alvo da ao do complexo PUF (ULBRICHT;
OLIVAS, 2008) Nossos resultados demonstram uma correlao negativa entre a
queda na expresso de PUF1 e PUF4 e o aumento na expresso de HXK1. Esse
padro de expresso inverso poderia indicar que o complexo PUF no opera no
decaimento do transcrito de HXK1 durante a resposta a alta presso hidrosttica.
As enzimas Glk1p e Hxk1p possuem seus genes expressos apenas quando a fonte
predominante de carbono no a glicose (RODRIGUEZ et al., 2001). Porm, o
gene que codifica a enzima Hxk2p, que normalmente induzida pela presena de
glicose demonstrou um perfil de expresso basal e inalterado durante todos os
nossos tratamentos. A enzima Hxk2p existe em leveduras tanto na sua forma
citoplasmtica, quanto na forma nuclear. Em sua forma nuclear ao mesmo tempo em
que reprime a expresso de HXK1 e GLK1 ela pode induzir sua prpria expresso
(HERRERO et al., 1995).
51
Figura 6 Via glicoltica de S.cerevisiae imediatamente aps o tratamento de 50 MPa por 30 minutos. Os genes que apresentam a cor vermelha possuem sua expresso induzida, genes com a cor verde esto reprimidos e genes com a cor branca no tiveram alterao no seu padro de expresso.
Figura 7Via glicoltica de S.cerevisiae 15 minutos aps o tratamento de 50 MPa por 30 minutos. Os genes que apresentam a cor vermelha possuem sua expresso induzida, genes com a cor verde esto reprimidos e genes com a cor branca no tiveram alterao no seu padro de expresso
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Alm disso, nossos resultados demonstram vrios elementos ligados ao fluxo da via
glicoltica positivamente regulados 15 minutos aps o tratamento com a alta presso
hidrosttica. Interessante notar que mesmo com os componentes da via glicoltica
tendendo a ativao, o gene HXK2 que se encontra em um meio com grande
disponibilidade de glicose, no possui seu perfil de expresso alterado. Sugerimos
que a represso dos transcritos relacionados aos transportadores de glicose (famlia
HXT) explique o motivo da no modificao do padro de expresso de HXK2.
Supomos que com a diminuio dos transportadores de glicose, o aumento na
sntese de HXK2 causaria um grande desperdcio energtico, uma vez que a
quantidade de glicose transportada para o meio celular no seria suficientemente
alta a ponto de necessitar de uma produo de novas enzimas (uma vez que o custo
das enzimas hexocinases bem elevado). Por outro lado, seria possvel que uma
maior ativao de HXK2 iniciasse um processo de represso nos genes das
isoenzimas HXK1 e GLK1. A funo desempenhada por HXK1 e GLK1 durante a
resposta ao estresse no bem clara, porm esses genes compartilham diversos
fatores de regulao normalmente utilizados nessas respostas (HERRERO et al.,
1995).
Em vrios estresses j descritos na literatura, nota-se que genes ligados utilizao
de fontes alternativas de carbono podem sofrer regulao positiva durante e aps
uma situao estressante (GASH et al., 2000). Uma parte desse comportamento
acontece como um reflexo da quantidade de diferentes produtos metablicos
gerados ao decorrer de uma situao estressante. O glicerol acumulado durante o
estresse osmtico (REGINA; EDWIL, 2002) e o acetato produzido durante o
desbalano redox (NAVARRO-AVIO et al, 1999), so exemplos dessa situao.
J foi demonstrado que o estresse causado pela pressurizao capaz de gerar
vrios desequilbrios celulares. Entre os efeitos da alta presso podemos citar os
danos causados pelo estresse oxidativo (AERTSEN et al, 2005). Sabemos que
mltiplas vias so ativadas durante a resposta contra espcies reativas de oxignio,
sendo uma delas a regenerao do NADPH pela via das pentoses fosfato
(GONZLEZ-SISO et al., 2009). Em nosso perfil de expresso, encontramos desde
o tempo zero, imediatamente aps o piezotratamento, a ativao do gene ZWF1.
Esse gene conhecido por manter um papel crucial na detoxificao de ROS, tanto
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Navarro-Avi%C3%B1o%20JP%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gonz%C3%A1lez-Siso%20MI%22%5BAuthor%5D
53
em leveduras quanto em humanos (IZAWA et al., 1998). Alm de ZWF1, os genes
SOL4 e GND2 dessa mesma via metablica, tambm foram fortemente expressos.
Em S.cerevisiae, a trealose o carboidrato de reserva mais utilizado durante a
resposta a vrios estresses (PEREIRA et al., 2001). Uma de suas funes j
elucidadas a de suprimir a agregao de protenas desnaturadas (SINGER;
LINDQUIST., 1998). O papel da trealose na proteo contra a agregao proteica
descrito como a via primria de resposta ao desenovelamento de protenas.
Os genes da trealose-6-fosfato apresentaram induo aps os nossos tratamentos
com a pressurizao (Figura 8 ). A enzima trealose-6-fosfato sintase construda
por um interessante complexo proteico sintetizado pelos genes TP1, TPS3 e TSL1
(WINDERICKX et al., 1996), nossos dados mostram que todo esse complexo foi
induzido fortemente.
De forma semelhante a outros e