universidade federal do cearÁ faculdade de … · obrigado por tornarem minha vida melhor. a minha...

FRANCISCO FÁBIO BEZERRA DE OLIVEIRA

MECANISMOS ENVOLVIDOS NA SÍNDROME DA DOR AGUDA INDUZIDA POR

PACLITAXEL EM CAMUNDONGOS: PARTICIPAÇÃO DE MASTÓCITOS E

CÉLULAS SATÉLITES GLIAIS

FORTALEZA

2017

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

1





Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia do Departamento

de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal do Ceará,

como parte dos requisitos para obtenção do

título de Doutor em Farmacologia. Área de

concentração: Farmacologia da Inflamação e

Dor.

Orientadora: Profa. Dra. Mariana Lima Vale

Coorientador: Prof. Dr. Thiago Mattar Cunha

FORTALEZA

2017

3





Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia do Departamento

de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal do Ceará,

como parte dos requisitos para obtenção do

título de Doutor em Farmacologia. Área de

concentração: Farmacologia da Inflamação e

Dor.

Aprovada em: 08/08/2017

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________________

Profa. Dra. Mariana Lima Vale (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará – UFC

_________________________________________________

Profa. Dra. Antoniella Souza Gomes


_________________________________________________

Prof. Dr. Diego Veras Wilke


_________________________________________________

Prof. Dr. José Carlos Farias Alves Filho

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP

_________________________________________________

Profa. Dra. Josenília Maria Alves Gomes

Universidade de Fortaleza – UNIFOR

4

Aos meus pais, Francisco e Maria, pelo amor

incondicional e aos meus irmãos Flávio,

Flaviano, Fabiano e Suzana pelo carinho e apoio

em todos os momentos.

5

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar a Deus e a Nossa Senhora, por estarem sempre presentes em

todos os momentos de minha vida. Por sempre iluminarem meu caminho, por não terem me

deixarem fraquejar diante das dificulades ao longo dessa caminhada.

A Professora Dra. Mariana Lima Vale, minha orientadora, pela oportunidade em

ingressar na pós-graduação, por acreditar em mim e aceitar me orientar. Agradeço pelo tempo

dedicado à orientação e a correção do trabalho. Agradeço a você por me ensinar o caminho da

pesquisa, pela paciência, atenção, dedicação e pelos conhecimentos compartilhados. Obrigado

por todos esses anos de aprendizado.

Ao Professor Dr. Thiago Mattar Cunha, meu coorientador, por me receber em seu

laboratório, pela oportunidade, confiança e disponibilidade no desenvolvimento da minha

pesquisa de doutorado e por todo o aprendizado compartilhado. Obrigado por tudo.

Ao prof. Dr. Ronaldo Ribeiro (in memoriam), pelas contribuições e

ensinamentos, obrigado pela coorientação no inicio desse trabalho.

Aos professores da Pós-graduação em Farmacologia da UFC, pelos ensinamentos

compartilhados. Agradeço de forma especial a Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade pelo

auxilio concedido para que eu pudesse ir a Ribeirão Preto para desenvolver parte da pesquisa.

Aos Professores Dr. José Carlos Alves Filho, Dra. Antoniella Souza Gomes, Dr.

Diego Veras Wilke e Dra. Josenília Maria Alves Gomes, por terem aceitado participar da

correção desse trabalho e pelas valiosas contribuições.

Aos amigos e colaboradores do Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do

Câncer (LAFICA), Anamaria Falcão e Mario Lisboa. Obrigado pela colaboração, discussões,

ajuda na realização dos experimentos e pela amizade.

Aos amigos e colaboradores do Laboratório de Inflamação e Dor (LID) da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP/USP), Miriam Fonseca, Alexandre Lopes e

Rangel Leal. Obrigado pela presteza, disponibilidade, conhecimento, discussão e pela

amizade.

6

A Ieda Regina dos Santos, pelo apoio, pela ajuda constante desde que cheguei a

Ribeirão Preto. Muito obrigado pelos ensinamentos, pela realização dos experimentos e pela

amizade.

Aos meus pais, Francisco Costa de Oliveira e Maria Bezerra de Oliveira, pelos

ensinamentos, dedicação e amor. Obrigado por sempre acreditarem em mim e por permitirem

a realização de mais esse objetivo.

Aos meus irmãos, Flavio, Flaviano e Fabiano, e a minha irmã, Suzana, pela

dedicação e carinho em todos os momentos e por acreditarem sempre em mim. Vocês são

muito importantes em minha vida.

As minhas sobrinhas, Lurya, Livia e Eduarda que mesmo distante fisicamente

sempre estiveram presentes em minha vida. Obrigado por tornarem minha vida melhor.

A minha sobrinha e afilhada, Maria, que em toda a sua inocência consegue tornar

os dias mais fáceis, simples e alegres. Amo você.

Aos amigos do LAFICA, Carlos Wagner, Camila Meireles, Livia Talita, Kalina

Kelma e Rafael Santana. Obrigado pelo apoio, convivência e pela amizade.

Aos amigos do LID, Vanessa Borges, Marcela Davoli, Taty Cecilio, Rafaela

Guimarães, Nathália Quadros, Andreza Urba, Flávia Santa Cecília, Mateus Rossato, Cássia R.

Silva, André Saraiva, Maria Cláudia, David Colon, Bruno Marcel, Paulo H. Melo e a todos

que fazem parte deste laboratório. Obrigado pela receptividade.

Aos amigos da pós-graduação em Farmacologia da UFC, Cecília Mendes, Deysen

Girão, Kaira Emanuella, Samara Rodrigues e Renan Oliveira. Obrigado pelo apoio, ajuda,

conhecimentos, convivência e pela amizade.

Aos alunos de iniciação científica, Bruno Freitas e Jéssica Jamile Nogueira, pela

ajuda na realização dos experimentos, a participação de vocês foi essencial para realização da

pesquisa.

Aos meus familiares, em especial a minha tia Maria Irismar (in Memoriam), que

partiu muito cedo, mas nos deixou vários ensinamentos de vida. Tenho certeza de onde estiver

estará sempre torcendo por mim.

7

Aos amigos/irmãos, Thiago Lima e José Rodrigo, pela força, incentivo e pelo

encorajamento na busca da realização dos meus objetivos. Obrigado pela amizade,

cumplicidade e companheirismo de todas as horas.

Aos amigos da “Pensão da Jô”, Rodrigo Calderari, Lucas Faria, Luan Pereira,

Ivan Lorena, Joelma Cruz, Juliana Oliveira e Bruno Toschi. Vocês tornaram a caminhada

mais fácil durante o período em que estive em Ribeirão Preto. Obrigado pelos laços de

amizade construídos.

A Jô Santos, pela acolhida em sua casa e em sua vida. Muito obrigado pelo apoio,

incentivo, carinho e convivência. Você é muito especial, obrigado por tudo.

Aos amigos, Guilherme Almeida e Diangeles Chagas. Obrigado pela parceria,

pelas conversas, companheirismo, cumplicidade, apoio e amizade que levarei para sempre

comigo.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC,

especialmente Laura Alves e Célia Gonzaga, pela disponibilidade constante em ajudar.

Aos técnicos do LID, Giuliana Bertozi, Sergio Rosa e Kátia Santos. Obrigado

pelo apoio e disponibilidade. Agradeço também aos demais funcionários do departamento de

Farmacologia da FMRP/USP por toda ajuda e apoio. Muito obrigado.

A CAPES, CNPq, FUNCAP e CRID pelo suporte financeiro.

Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente na realização desse

trabalho, muito OBRIGADO!

8

“Se você encontrar um caminho sem

obstáculos, ele provavelmente não leva a lugar

nenhum.”

Frank A. Clark

9

RESUMO




Paclitaxel é um antineoplásico utilizado como primeira linha no tratamento de diversos

tumores sólidos, particularmente em carcinomas de mama, ovário, pulmão, cabeça e pescoço.

Entretanto, os pacientes que recebem tratamento com paclitaxel frequentemente desenvolvem

dor que ocorre imediatamente após o tratamento com este fármaco, conhecida como síndrome

da dor aguda associada ao paclitaxel. No entanto, os mecanismos pelos quais o paclitaxel

induz essa condição dolorosa, ainda não são conhecidos. Neste estudo objetivou-se investigar

o envolvimento de mastócitos e de células satélites gliais na síndrome de dor aguda induzida

pelo paclitaxel. Para isso foram utilizados camundongos C57BL/6 (selvagens), camundongos

que não expressam mastócitos (SH) e camundongos knockout TNFR1/R2; TLR4; IL-1R; IL-6

e CCR2 machos (20-25g). O modelo consiste na administração de paclitaxel por via

intravenosa (4 mg/kg, dose única). Após a administração de Paclitaxel a sensibilidade

mecânica foi avaliada utilizando filamentos de von Frey, mensurado em gramas de pressão. A

sensibilidade ao frio foi avaliada com um estímulo 10 ºC (acetona) aplicado na pata traseira

direita, observando-se comportamentos de agitação e elevação da pata, além de lambidas,

mensurados em segundos. E a sensibilidade ao calor foi avaliada através do teste de

hargreaves, onde uma fonte de luz infravermelha é posicionada sob a pata traseira do animal

durante 20s ou até que o animal exiba resposta positiva (flinch ou retirada da pata), então a

fonte de luz e para automaticamente. Além disso, foi realizada cultura de linhagem de

mastócitos e de células satélites gliais (cultura primária de gânglio da raiz dorsal) que foram

estimuladas com paclitaxel. Foram coletadas amostras (plasma, nervo isquiático, gânglios da

raiz doral e medula espinal) para determinação da expressão gênica e dosagem dos níveis de

citocinas/qumiocinas (IL-1β, TNF-α e IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1). Também foi realizado

imunofluorescência (c-Fos, IL-6 e triptase). A concentração de citocinas/quimiocinas (IL-1β,

TNF-α e IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1) também foi avaliada no sobrenadante das culturas de

mástocitos e de células satélites gliais. Os resultados demonstraram que a injeção intravenosa

de paclitaxel reduziu significativamente (p<0,05) o limiar nociceptivo, induzindo respostas

hiperalgesicas mecânica e térmica ao frio após a administração de paclitaxel. No entanto,

quando se avaliou a resposta térmica ao calor, verificou-se que a latência de retirada da pata

não foi alterada com o tratamento com paclitaxel, quando comparadas ao grupo controle. A

imunofluorescência para c-Fos nos gânglios da raiz dorsal e medula espinal demostrou

10

ativação de celular evidenciado por aumento da imunoexpressão nos grupos tratado com

paclitaxel. A administração de paclitaxel aumentou significativamente (p<0,05) as citocinas

IL-1β, TNF-α e IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1. A hiperalgesia mecânica e térmica ao frio foram

reduzidas significativamente (p<0,05) em animais SH (não possuem mastócitos), quando

comparado aos animais selvagens, bem como o tratamento com cromoglicato de sódio

(estabilizador de membrana de mastócitos) foi eficaz em inibir significativamente (p<0,05) a

hiperalgesia mecânica e térmica ao frio após o tratamento com o quimioterápico. O pré-

tratamento com cromoglicato de sódio preveniu significativamente (p<0,05) o aumento de

citocinas e quimiocinas em camundongos tratados com paclitaxel. Nos camundongos SH

tratados com paclitaxel não foi observado aumento significativo (p<0,05) de citocinas. A

estimulação com paclitaxel provocou aumento significativo (p<0,05) de citocinas e

quimiocinas (TNF-α, IL-6 e MCP-1) em cultura de mastócitos. Além disso, a

imunofluorescência, no gânglio da raiz dorsal, demonstrou um aumento da imunoexpressão

de triptase (marcador de mastócito) e IL-6 após a administração de paclitaxel. Os resultados

mostraram também que o receptor TLR4 está envolvido no desenvolvimento de hiperalgesia

induzida por paclitaxel, pois o tratamento de animais knockout para o receptor TLR4 com este

quimioterápico não foi capaz de desenvolver hiperalgesia mecânica e térmica nesses animais.

Os resultados demonstram ainda, que nos camundongos knockout TLR4 tratados com

paclitaxel não houve aumento significativo (p<0,05) de citocinas e quimiocinas. E quando

comparados ao grupo de camundongos selvagens, observou-se significativa redução (p<0,05)

dos níveis de citocina e quimiocina. Além disso, o paclitaxel causou aumento significativo

(p<0,05) de citocinas (TNF-α e IL-6) e quimiocinas (MCP-1 e KC/CXCL1) em cultura de

células satélites gliais e a deleção gênica para o receptor TLR4 foi capaz de impedir o

aumento dos níveis de citocinas/quimiocinas. O estudo mostra, pela primeira vez, que

mastócitos e células satélites gliais estão envolvidos no desenvolvimento de dor aguda

induzida pelo paclitaxel em camundongos. Adicionalmente, o estudo revelou que a ativação

de mastócitos e de células satélites gliais, possivelmente se dá pela ligação do paclitaxel ao

TLR4, induzindo a liberação de citocinas/quimiocinas que, contribuem para o

desenvolvimento de dor aguda induzida pelo paclitaxel.

Palavras-chave: Paclitaxel; dor aguda; síndrome; mastócitos; células satélites gliais.

11

ABSTRACT

MECHANISMS INVOLVED IN PACLITAXEL-INDUCED ACUTE PAIN

SYNDROME IN MICE: PARTICIPATION OF MAST CELLS AND SATELLITE

GLIAL CELLS IN

Paclitaxel is an antineoplastic drug used as a first line in the treatment of several solid tumors,

particularly in breast, ovarian, lung, head and neck carcinomas. However, patients receiving

paclitaxel treatment often develop a painful condition that occurs immediately after the

treatment with this drug, known as acute pain syndrome associated with paclitaxel.

Nevertheless, the mechanisms by which paclitaxel induces this painful condition is not yet

known. The aim of this study was to investigate the involvement of mast cells and satellite

glial cells in the acute pain syndrome induced by paclitaxel. Adult male wild-type mice

(C57BL/6), SH mutant mice and TNFR1/R2, TLR4, IL-1R, IL-6 and CCR2 knockout mice

were used. Acute pain syndrome was induced by intravenous paclitaxel (4 mg / kg, single

dose). After administration of paclitaxel, mechanical and thermal sensitivity (cold) were

assessed. The mechanical sensitivity was evaluated using von Frey filaments, measuring

pressure in grams. The sensitivity to cold was evaluated with a stimulus of 10 °C (acetone)

applied to the right hind paw, leading to agitation and paw elevation behaviors, as well as

licking, measured in seconds. The heat sensitivity was assessed by the Hargreaves test, where

an infrared light source is positioned under the animal's hind paw for 20s or until the animal

exhibits a positive response (flinch or paw withdrawal), then the light source stop

automatically. In addition, mast cell line culture and satellite glial cells (dorsal root ganglia

primary culture) were stimulated with paclitaxel. Samples (plasma, sciatic nerve, dorsal root

ganglia and spinal cord) were collected for determination of gene expression and cytokine

levels (IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 and KC / CXCL1). Immunofluorescence (c-Fos, IL-6 and

tryptase) was also performed. The concentration of cytokines/chemokines (IL-1β, TNF-α e

IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1) was also evaluated in the supernatant of mast cells and satellite

glial cells. The results demonstrated that intravenous injection of paclitaxel significantly

reduced (p < 0.05) the nociceptive threshold, inducing mechanical and thermal hyperalgesic

responses following administration of paclitaxel. However, when assessing the thermal

response to heat, it was found that paw withdrawal latency was not altered with paclitaxel

treatment when compared to the control group. Immunofluorescence reaction for c-Fos in the

dorsal root and spinal cord ganglia, demonstrated cell activation evidenced by an increased

immunoexpression was observed in the groups treated with paclitaxel. Administration of

paclitaxel caused a significant (p<0.05) increase in IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 and KC /

CXCL1 levels. Mechanical and thermal cold hyperalgesia were significantly reduced (p

12

<0.05) in SH animals (no mast cells) when compared to wild animals, and treatment with

sodium cromoglycate (mast cell membrane stabilizer) was effective (p <0.05) in inhibiting

mechanical and thermal hyperalgesia after the chemotherapic treatment. Pretreatment with

sodium cromoglycate significantly (p<0.05) prevented the increase of cytokines and

chemokines in mice treated with paclitaxel. In the SH mice treated with paclitaxel, no

significant increase (p<0.05) of cytokines was observed. Paclitaxel stimulation resulted in a

significant (p<0.05) increase in cytokines (TNF-α, IL-6) and chemokines (MCP-1)

concentration in mast cell culture. In addition, immunofluorescence of the dorsal root

ganglion demonstrated increased immunoexpression of tryptase and IL-6 after administration

of paclitaxel. The results also showed that the TLR4 receptor was involved in the

development of paclitaxel-induced hyperalgesia, since knockout animals to TLR4 receptor

treated with this chemotherapic did not develop mechanical and thermal hyperalgesia. The

results also demonstrated that, in the TLR4 knockout mice treated with paclitaxel, there was

no significant increase (p <0.05) in cytokines and chemokines; and when compared to the

group of WT mice, a significant reduction (p <0.05) in cytokine and chemokine levels was

observed. In addition, paclitaxel caused a significant (p <0.05) increase of cytokines (TNF-α

and IL-6) and chemokines (MCP-1 and KC/CXCL) in satellite glial cell culture and the

deletion of the TLR4 receptor gene was able to prevent this increase in cytokine/chemokine

levels. The study showed for the first time that mast cells and satellite glial cells are involved

in the development of acute pain induced by paclitaxel in mice. In addition, the study revealed

that the activation of mast cells and satellite glial cells is possibly due to the binding of

paclitaxel to TLR4, inducing the release of cytokines/chemokines that contribute to the

development of acute pain induced by paclitaxel.

Keywords: Paclitaxel; acute pain; syndrome; Mast cells; Glial satellite cells.

13

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Imagem representativa do Taxus brevifolia ............................................................. 34

Figura 2 - Mecanismo de ação antitumoral do Paclitaxel. ....................................................... 36

Figura 3 - Delineamento esquemático do protocolo experimental 1 ........................................ 56






Figura 9 - Fotomicrografia da imunoexpressão de c-Fos no gânglio da raiz dorsal de

camundongos submetidos à administração de paclitaxel ........................................................ 74

Figura 10 - Fotomicrografia da imunoexpressão de c-Fos no corno dorsal da medula espinal

de camundongos submetidos à administração de paclitaxel .................................................... 76

Figura 11 - Fotomicrografia da imunoexpressão de Triptase e IL-6 no gânglio da raiz dorsal

de camundongos submetidos à administração de paclitaxel .................................................. 114

Figura 12 - Participação de mastócitos e células satélites gliais na síndrome de dor aguda

induzida por paclitaxel............................................................................................................ 128

14

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Paclitaxel induz hiperalgesia mecânica e térmica em camundongos ..................... 72

Gráfico 2 - Análise quantitativa da imunoexpressão para c-Fos no gânglio da raiz dorsal de

camundongos submetidos à administração de paclitaxel ......................................................... 75

Gráfico 3 - Análise quantitativa da imunoexpressão para c-Fos no corno dorsal da medula

espinal de camundongos submetidos à administração de paclitaxel ........................................ 77

Gráfico 4 - Paclitaxel induz aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1 no plasma. ......... 79

Gráfico 5 - Paclitaxel induz aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL no nervo

isquiático. .................................................................................................................................. 81

Gráfico 6 - Paclitaxel aumenta a expressão relativa de RNAm de IL-6 no nervo isquiático. .. 83

Gráfico 7 - Paclitaxel induz aumento de IL-6, TNF-α e KC/CXCL1 em gânglios da raiz dorsal85

Gráfico 8 - Paclitaxel aumenta a expressão relativa de RNAm para IL-1β, TNF-α e CCR2 nos

gânglios da raiz dorsal .............................................................................................................. 87

Gráfico 9 - Paclitaxel induz aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1 na medula

espinal ....................................................................................................................................... 88

Gráfico 10 - Paclitaxel aumenta a expressão relativa de RNAm para IL-1β, TNF-α, IL-6,

MCP-1 e CCR2, na medula espinal .......................................................................................... 90

Gráfico 11 - Papel da IL-6 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida pelo paclitaxel ........ 93

Gráfico 12 - Envolvimento do receptor IL-1R na hiperalgesia induzida pelo paclitaxel ......... 95

Gráfico 13 - Envolvimento dos receptores TNFR1 e TNFR2 na hiperalgesia induzida pelo

paclitaxel ................................................................................................................................... 97

Gráfico 14 - Envolvimento do receptor CCR2 na hiperalgesia induzida pelo paclitaxel ........ 99

Gráfico 15 - Envolvimento de mástocitos na hiperalgesia induzida por paclitaxel ............... 101

Gráfico 16 - Cromoglicato de sódio atenua a hiperalgesia induzida pelo paclitaxel ............. 102

15

Gráfico 17 - Pré-tratamento com cromoglicato de sódio ou a ausência mastócitos previnem o

aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6, KC/CXCL1 e MCP-1 no nervo isquiático de camundongos

tratados com paclitaxel ........................................................................................................... 105

Gráfico 18 - Pré-tratamento com cromoglicato de sódio ou a ausência de mastócitos previnem

o aumento dos níveis de citocinas e quimiocina nos gânglios da raiz dorsal de camundongos

tratados com paclitaxel ........................................................................................................... 107

Gráfico 19 - Pré-tratamento com cromoglicato de sódio ou a ausência de mastócitos previne o

aumento de IL-1β, TNF-α IL-6 e KC/CXCL1 na medula espinal de camundongos tratados

com paclitaxel ......................................................................................................................... 109

Gráfico 20 - Paclitaxel aumenta TNF-α, IL-6 e MCP1 em cultura de mastócitos (RBL-2H3)

estimulada com paclitaxel ...................................................................................................... 112

Gráfico 21 - Análise quantitativa da imunoexpressão para Triptase e IL-6 no gânglio da raiz

dorsal de camundongos submetidos à administração de paclitaxel ........................................ 115

Gráfico 22 - Participação do receptor TLR4 na hiperalgesia induzida pelo paclitaxel .......... 117

Gráfico 23 - A deleção gênica do TLR4 previne o aumento de IL-6 e KC/CXCL1 no plasma

de camundongos injetados com paclitaxel ............................................................................. 119

Gráfico 24 - A deleção gênica do TLR4 previne o aumento de IL-1β, IL-6, MCP-1 e

KC/CXCL1 no nervo isquiático de camundongos tratados com paclitaxel ........................... 120

Gráfico 25 - A deleção gênica do TLR4 previne o aumento de TNF-α e KC/CXCL1 nos

gânglios da raiz dorsal de camundongos tratados com paclitaxel .......................................... 121

Gráfico 26 - A deleção gênica do TLR4 previne o aumento de TNF-α, MCP-1 e KC/CXCL1

na medula espinal de camundongos tratados com paclitaxel ................................................. 122

Gráfico 27 - Paclitaxel aumenta IL-6, TNF-α, MCP1 e KC/CXCL1 em cultura primária de

células satélites gliais.............................................................................................................. 124

Gráfico 28 - A deleção gênica do receptor TLR4 previne o aumeno de IL-6, TNF-α, MCP-1 e

KC/CXCL1 em cultura primária de células satélites gliais estimulada com paclitaxel ......... 125

Gráfico 28 - A deleção gênica do receptor TLR4 previne o aumento de IL-6, TNF-α, MCP-1 e

KC/CXCL1 em cultura primária de células satélites gliais estimulada com LPS ou paclitaxel126

16

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Quadro 1 - Sequência de primers utilizados no RT-PCR ......................................................... 65

Quadro 2 - Paclitaxel aumenta a expressão citocinas e/ou quimiocinas no plasma, no nervo

isquiático, nos gânglios da raiz dorsal e na medula espinal de camundongos ......................... 91

Quadro 3 - Papel dos mastócitos na produção/liberação de citocinas e/ou quimiocinas, no

nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal e na medula espinal de camundongos injetados com

paclitaxel ................................................................................................................................. 110

Quadro 4 – A ausência do receptor TLR4 diminui a produção/liberação de citocinas e/ou

quimiocinas, no plasma, nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal e na medula espinal de

camundongos injetados com paclitaxel ................................................................................. 123

17

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMPA Ácido Alfa-Amino-3-Hidroxi-5-Metil-4-Isoxazolpropiónico

AMPc Adenosina Monofosfato Cíclico

ANOVA Análise de Variância

ATP Adenosina Trifosfato

B1 Receptores de Bradicinina 1

B2 Receptores de Bradicinina 2

BMS Myers Squibb Company

BSA Albumina de Soro Bovino

CAPES Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CaV Canais de Cálcio dependentes de Voltagem

CB1 Receptor Canabinóide 1

CCCE Centro de Criação de Camundongos Especiais

CCL2 Quimiocina (padrão C-C) do ligando 2

CCR2 Receptor de Quimiocinas CC Tipo 2

CD14 Cluster of Differentiation 14

cDNA DNA complementar

CEPA Comissão de Ética em Pesquisa Animal

CEUA Comissão de Ética para o Uso de Animais

CGRP Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina

cm Centímetro

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CO2 Dióxido de Carbono

CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

COX-2 Cicloxigenase 2

CRID Centro de Pesquisa em Doenças Inflamatórias

CSG Células Satélites Gliais

CXCL1 Quimiocina (padrão C-X-C) ligando 1

DMEM Eagle modificado por Dulbecco

DNA Ácido Desoxirribonucleico

dNTP Desoxirribonucleotídeos Fosfatados

DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético

18

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

EPM Erro Padrão da Média

et al. E colaboradores

EUA Estados Unidos da América

FAMED Faculdade de Medicina

FDA Food and Drug Administration

FMRP Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

g Gramas

GABA Ácido Gama-Aminobutírico

GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

GDP Guanosina Difosfato

GFAP Proteína Ácida Fibrilar Glial

GLAST Transportador de Glutamato-Aspartato

GRD Gânglios da Raiz Dorsal

GTP Guanosina Trifosfato

h hora

H2SO4 Ácido Sulfúrico

i.p. Intra-Peritonial

i.v. via intravenosa

IARC Agência Internacional para a Pesquisa em Câncer

IASP Associação Internacional para o Estudo da Dor

Iba-1 Molécula de adaptador de ligação de cálcio ionizado 1

IL-10 Interleucina 10

IL-13 Interleucina 13

IL-1R Receptor de Interleucina-1

IL-1β Interleucina 1 beta

IL-4 Interleucina 4

IL-5 Interleucina 5

IL-6 Interleucina 6

INCA Instituto Nacional do Câncer

iNOS Óxido Nítrico Sintase Induzível

IRAK Cinase Associada ao Receptor de Interleucina

KC Quimiocina Derivada de queratinócito

KCl Cloreto de Potássio

https://en.wikipedia.org/wiki/Glyceraldehyde_3-phosphate_dehydrogenase

19

Kg Quilograma

KO Knockout

L3 Segmento Lombar 3




LPS Lipopolissacarídeo

m2

Metros quadrados

MAPK Proteína-quinase ativada por mitógenos

MCP-1 Proteína Quimioatraente de Monócitos

mg Miligrama

MgCl Cloreto de Magnésio

min Minutos

mL Mililitro

mM Milimolar

MRV Medula Rostral Ventromedial

NaCl Cloreto de Sódio

NCI National Cancer Institute

NF-κB Nuclear Factor Kappa B

NGF Fator de Crescimento de Nervos

NIH National Cancer Institute

NK1R Receptor de Neurocinina 1

NMDA N-metil-D-aspartato

NMDAr Receptor N-metil-D-aspartato

NPIQ Neuropatia Periférica Induzida Pela Quimioterapia

OMS Organização Mundial da Saúde

p Nível de significância

P2X7 Receptore Purinérgico P2X7

P2Y Receptore Purinérgico P2Y

PAF Fator de Agregação Plaquetária

P-APS Paclitaxel-Associated Acute Pain Syndrome

PBS Tampão Fosfato Salina

PCX Paclitaxel

pg Picograma

20

pH Potencial Hidrogeniônico

PKA Proteína Quinase A

PKC Proteína Quinase C

PMA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate

RBL-2H3 Rat Basophilic Leukemia cells

RNA Ácido Ribonucleico

RNAm RNA mensagueiro

RT-PCR Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real

s Segundos

SDAAP Síndrome da Dor aguda Associada ao Paclitaxel

SH Sash

SNC Sistema Nervoso Central

SNP Sistema Nervoso Periferico

TCZ Tocilizumabe

TLR Receptores Toll-Like

TLR2 Receptor Toll Like 2

TLR4 Receptor Toll Like 4

TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

TNF- Fator de Necrose Tumoral alpha

TNFR1/R2 Recetor 1 e 2 do Fator de Necrose Tumoral

TRAF-6 Receptor de TNF Associado ao Fator 6

TRP Receptor de Potencial Transiente

TRPV1 Receptor de potencial transiente vanilóide 1

U Unidades

UFC Universidade Federal do Ceará

USP Universidade de São Paulo

WT Wild-Type

μg Micrograma

μL Microlitro

µM Micrometro

5-HT Serotonina

°C Grau Celsius

< Menor que

http://www.revistargo.com.br/include/getdoc.php?id=6658&article=1534&mode=pdf

https://pt.wikipedia.org/wiki/Micr%C3%B3metro_%28unidade_de_medida%29

21

SUMÁRIO

1 Introdução ............................................................................................................................ 25

2 Revisão Bibliográfica. .......................................................................................................... 29

2.1 Dor ...................................................................................................................................... 30

2.1.1 Tipos de dor ..................................................................................................................... 31

2.2 Dor induzida por quimioterápicos ...................................................................................... 32

2.3 Paclitaxel ............................................................................................................................ 33

2.3.1 Mecanismo de ação antitumoral do paclitaxel................................................................ 35

2.3.2 Toxicidade associada ao paclitaxel ................................................................................. 37

2.3.3 Síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel ............................................................ 39

2.4 Mastócitos ........................................................................................................................... 40

2.5 Células satélites gliais ......................................................................................................... 42

3 Justificativa .......................................................................................................................... 46

4 Objetivos ............................................................................................................................... 48

4.1 Objetivo Geral .................................................................................................................... 49

4.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 49

5 Materiais e Métodos ............................................................................................................ 51

5.1 Animais ............................................................................................................................... 52

5.2 Aspectos Éticos .................................................................................................................. 53

5.3 Indução da síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel ............................................... 53

5.4 Experimentos comportamentais ......................................................................................... 54

5.4.1 Avaliação da hiperalgesia mecânica ............................................................................... 54

5.4.2 Avaliação da hiperalgesia térmica ao frio ...................................................................... 54

5.4.3 Avaliação da hiperalgesia térmica ao calor ................................................................... 55

5.5 Delineamento experimental ................................................................................................ 55

5.5.1 Avaliação da hiperalgesia mecânica e térmica no modelo de síndrome da dor aguda

induzida pelo paclitaxel ............................................................................................................ 55

5.5.2 Investigação da participação de mastócitos na síndrome dolorosa aguda induzida pelo

paclitaxel .................................................................................................................................. 56

5.5.3 Avaliação do efeito do cromoglicato de sódi na síndrome dolorosa aguda induzida pelo

paclitaxel .................................................................................................................................. 57

5.5.4 Investigação da participação de citocinas na síndrome da dor aguda induzida pelo

paclitaxel .................................................................................................................................. 58

22

5.5.5 Coleta de sangue venoso periférico, nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal e medula

espinal ....................................................................................................................................... 60

5.6 Cultura de mastócitos ......................................................................................................... 62

5.7 Cultura primária de células satélites gliais de gânglios da raiz dorsal ............................... 62

5.8 Expressão gênica por reação em cadeia da polimerase em tempo real .............................. 63

5.8.1 Coleta de tecidos ............................................................................................................. 63

5.8.2 Extração do RNA total ..................................................................................................... 63

5.8.3 Confecção do DNA complementar .................................................................................. 64

5.8.4 Reação em cadeia da polimerase em tempo real ............................................................ 64

5.9 Dosagem de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas ..................................................... 65

5.9.1 Coleta das amostras ........................................................................................................ 65

5.9.2 Preparação de amostras para análise de citocinas/quimiocinas no plasma .................. 66

5.9.3 Homogenato de Tecidos .................................................................................................. 66

5.9.4 Preparação de amostras para análise de citocinas/quimiocinas de cultura de mastócitos

(RBL-2H3) ................................................................................................................................ 66

5.9.5 Preparação de amostras para análise de citocinas/quimiocinas de cultura de células

satélites gliais ........................................................................................................................... 67

5.9.6 Determinação de citocinas/quimiocinas por ELISA ....................................................... 67

5.10 Imunofluorescência .......................................................................................................... 68

5.10.1 Coleta e preparação das amostras ................................................................................ 68

5.10.2 Imunofluorescência para Triptase, IL-6 e c-Fos ........................................................... 68

5.11 Análise Estatística ............................................................................................................ 69

6 Resultados ............................................................................................................................ 70

6.1 Paclitaxel induz hiperalgesia mecânica e térmica em camundongos ................................. 71

6.2 Imunofluorescência para c-Fos em gânglio da raiz dorsal de camundongos submetidos à

injeção de paclitaxel ................................................................................................................. 73

6.3 Imunofluorescência para c-Fos em corno dorsal da medula espinal de camundongos

submetidos à injeção de paclitaxel ........................................................................................... 75

6.4 Quantificação de citocinas e quimiocinas em camundongos tratados com paclitaxel ....... 78

6.4.1 Quantificação de citocinas e quimiocinas no plasma ..................................................... 78

6.4.2 Quantificação de citocinas e quimiocinas no nervo isquiático ....................................... 79

6.4.3 Expressão relativa de RNAm para citocinas e quimiocinas em nervo isquiático ........... 81

6.4.4 Quantificação de citocinas e quimiocinas nos gânglios da raiz dorsal .......................... 84

6.4.5 Expressão relativa de RNAm de citocinas e quimiocinas em gânglios da raiz dorsal ... 85

23

6.4.6 Quantificação de citocinas e quimiocinas na medula espinal ........................................ 87

6.4.7 Expressão relativa de RNAm de citocinas e quimiocinas em medula espinal ................ 88

6.5 Investigação da participação de citocinas e quimiocinas na hiperalgesia mecânica e

térmica induzida pelo paclitaxel ............................................................................................... 91

6.5.1 Investigação da participação da IL-6 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida pelo

paclitaxel .................................................................................................................................. 91

6.5.2 Investigação da participação de IL-1 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida pelo

paclitaxel .................................................................................................................................. 94

6.5.3 Investigação da participação TNF-α na hiperalgesia mecânica e térmica induzida pelo

paclitaxel .................................................................................................................................. 93

6.5.4 Investigação da participação de MCP-1 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida

pelo paclitaxel .......................................................................................................................... 94

6.6 Investigação da participação de mastócitos na hiperalgesia mecânica e térmica induzida

pelo paclitaxel ......................................................................................................................... 100

6.7 Quantificação de citocinas e quimiocinas em camundongos SH e em camundongos

selvagens pré-tratados com cromoglicato de sódio e injetados com paclitaxel ..................... 103

6.7.1 Quantificação de citocinas e quimiocinas em nervo isquiático .................................... 103

6.7.2 Quantificação de citocinas e quimiocinas em gânglios da raiz dorsal ......................... 106

6.7.3 Quantificação de citocinas e quimiocinas em medula espinal ...................................... 108

6.8 Quantificação de citocinas e quimiocinas em cultura de mastócitos estimulada com

paclitaxel. ................................................................................................................................ 110

6.9 Imunofluorescência para Triptase e IL-6 em gânglio da raiz dorsal de camundongos

submetidos à injeção de paclitaxel ......................................................................................... 113

6.10 Investigação da participação de TLR4 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida pelo

paclitaxel ................................................................................................................................. 116

6.11 Quantificação de citocinas e quimiocinas em camundongos TLR4-/- injetados com

paclitaxel ................................................................................................................................. 118

6.11.1 Quantificação de citocinas e quimiocinas no plasma ................................................. 118

6.11.2 Quantificação de citocinas e quimiocinas no nervo isquiático ................................... 119

6.11.3 Quantificação de citocinas e quimiocinas nos gânglios da raiz dorsal ...................... 120

6.11.4 Quantificação de citocinas e quimiocinas na medula espinal .................................... 121

6.12 Quantificação de IL-6, TNF-α, MCP1 e KC em cultura primária de células satélites gliais

estimulada com paclitaxel ...................................................................................................... 123

6.13 Modelo Conceitual ......................................................................................................... 127

24

7 Discussão ............................................................................................................................ 129

8 Conclusão ........................................................................................................................... 143

Referências ........................................................................................................................... 145

Anexos .................................................................................................................................... 163

25

1. INTRODUÇÃO

26

Câncer é um termo utilizado para definir doenças nas quais células anormais

dividem-se sem controle podendo invadir tecidos circundantes. As células cancerosas também

podem se espalhar para outras partes do corpo através do sangue e do sistema linfático (NIH -

NATIONAL CANCER INSTITUTE, 2015).

De acordo com estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de

14,9 milhões de novos casos de câncer acometeram a população mundial, mais de 60%

ocorreram em países em desenvolvimento, resultando em 8,2 milhões de mortes por câncer,

sendo que 70% ocorreram nesses mesmos países. Os tipos de câncer mais incidentes no

mundo foram o câncer de pulmão, mama, intestino e próstata. O câncer de pulmão foi o que

mais acometeu a população masculina. Já entre as mulheres, o mais frequente foi o de mama.

Em 2025, estima-se que no mundo o número total de novos casos de câncer seja de 20

milhões que acarretaram em 13,2 milhões de mortes (INTERNATIONAL AGENCY FOR

RESEARCH ON CANCER, 2012).

No Brasil, estima-se que para o biênio 2016-2017, ocorram aproximadamente 600

mil novos casos de câncer, excluindo-se os casos de câncer de pele não melanoma (180 mil

novos casos). Em homens, o tipo mais incidente será o câncer de próstata e nas mulheres, o

câncer de mama (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER, 2015).

Ainda que as estimativas sobre a epidemiologia do câncer sejam alarmantes, a

taxa de sobrevivência a estas doenças vem aumentando, e isso se deve aos avanços no

tratamento do câncer obtido nas últimas décadas, como por exemplo, no campo da

quimioterapia, na qual drogas são utilizadas para destruir as células doentes que formam o

tumor. A quimioterapia do câncer conta com um arsenal de fármacos que abrange centenas de

quimioterápicos que apesar da eficácia em limitar ou inibir o crescimento tumoral,

frequentemente é acompanhada de efeitos adversos que dificultam a adesão do paciente ao

tratamento. Portanto, faz-se necessário buscar melhorias para o tratamento do câncer não

apenas no sentido de desenvolver novas abordagens terapêuticas específicas, mas também em

descobrir maneiras de amenizar ou prevenir os efeitos adversos associados à quimioterapia.

O paclitaxel (PCX) é um alcaloide originalmente derivado do Taxus brevifolia, e é

utilizado como agente quimioterápico de primeira linha para o tratamento de diversos tipos de

tumores. No entanto, os pacientes que recebem tratamento com paclitaxel frequentemente

desenvolvem dor patológica, o que reduz significativamente a qualidade de vida desses

pacientes e dificulta a utilização deste quimioterápico. A dor patológica induzida pelo

paclitaxel inclui dor que ocorre imediatamente após o primeiro ciclo do tratamento com este

27

quimioterápico (REEVES et al., 2012; LONPRINZI et al., 2011), e dor que persiste durante

semanas a anos após o fim do tratamento (CATA et al., 2006; DOUGHERTY et al., 2004).

A dor aguda induzida pelo paclitaxel é uma morbidade significativa em pacientes

e, atualmente, não existe um padrão comprovado de cuidados para a sua prevenção ou

tratamento (REEVES et al., 2012; LONPRINZI et al., 2011), além disso, os mecanismos

pelos quais o paclitaxel induz dor aguda não são totalmente conhecidos. Atualmente o

entendimento dos mecanismos subjacentes da dor patológica induzida por paclitaxel em

modelos in vivo é baseado principalmente em estudos que examinam as mudanças patológicas

nos dias após o final do tratamento com essa droga. Até o momento, pouco se sabe sobre a

ação direta e imediata do paclitaxel no sistema de sinalização da dor aguda em modelos in

vivo, e poucos são os estudos que buscam esclarecer esses mecanismos utilizando esses

modelos (YAN et al., 2015, JATOI et al., 2016, BRUSCO et al., 2016). Assim, a

compreensão de tais mecanismos poderia fornecer fundamentos para o desenvolvimento de

tratamentos eficazes para essa síndrome dolorosa (POLOMANO et al., 2001; RIGO et al.,

2013).

Várias células imunitárias tais como macrófagos e mastócitos, têm sido

implicadas na patogênese e no processamento nociceptivo alterado característico de processos

dolorosos. Os mastócitos são agentes cruciais nas desordens alérgicas, no entanto, também

são importantes iniciadores e efetores da imunidade inata. Eles residem em muitos tecidos,

incluindo os nervos (GALLI, NAKAE, TSAI, 2005; METCALFE, BARAM, MEKORI,

1997). Os mastócitos contêm grânulos ricos em fatores pró-inflamatórios e tem sido relatado

que eles desempenham um papel vital no desenvolvimento de hiperalgesia térmica e alodinia

mecânica em camundongos (ZUO et al., 2003). Seus grânulos contêm mediadores tais como

histamina, proteases e citocinas (METCALFE, BARAM, MEKORI, 1997; GALLI et al.,

2005), vários dos quais são capazes de sensibilizar ou ativar neurônios. Os mastócitos

ativados contribuem diretamente para estados de dor, incluindo dor neuropática (XANTHOS

et al., 2011). Foi demonstrado in vitro que a quercetina inibe a liberação de histamina em

cultura de mastócito (RBL-2H3) estimulada com paclitaxel por estabilizar a membrana de

mastócitos (GAO et al., 2016). Uma grande quantidade de evidências suporta a hipótese de

que os mastócitos contribuem para o desenvolvimento de dor patológica. Estes resultados são,

portanto, uma forte indicação de que os mastócitos podem contribuir para a dor aguda

associada ao paclitaxel. Os mastócitos possuem estreita relação anatômica com fibras

nervosas em uma grande variedade de órgãos e tecidos e isso fornece uma comunicação

bidirecional entre mastócitos e neurônios (ALVING et al., 2001; PURCELL; ATTERWILL,

28

1995; ROZNIECKI et al., 1999). Os mastócitos são capazes de ativar neurônios através da

síntese e liberação de uma infinidade de mediadores, incluindo histamina, serotonina (5-HT),

citocinas e metabolitos do ácido araquidônico.

Além do envolvimento de células imunes na dor induzida por quimioterápicos, as

células da glia também podem estar envolvidas. Dentre elas as células satélites gliais (CSG),

estas são células especializadas que envolvem e se comunicam com neurônios sensoriais nos

gânglios da raiz dorsal (GRD), são capazes de modular o microambiente neuronal e a

transmissão sensorial dentro dos gânglios (HANANI, 2005; ZHANG et al., 2007; HANANI,

2010). Tem sido sugerido que as CSG nos gânglios sensoriais desempenham um papel

fundamental na geração e manutenção da dor, (HANANI et al., 2002; HUANG et al., 2010).

Evidencias sugerem ainda que as CSG possuem um papel crítico na dor induzida pela

quimioterapia (CAPUANO et al., 2009; NEEB et al., 2011; LAURSEN et al., 2014;

TAKEDA et al., 2011; WARWICK; HANANI, 2013).

Embora evidências tenham demonstrado o envolvimento de mastócitos e de CSG

na neuropatia induzida por quimioterápicos, não existem estudos que evidênciam a

participação destas células na dor aguda associada ao paclitaxel. Dessa forma, o presente

estudo se propôs a investigar a participação de mastócitos e de CSG na síndrome da dor aguda

associada ao paclitaxel. Essa investigação pode fornecer evidencias para uma melhor

compreensão dos mecanismos pelos quais o paclitaxel causa dor, especialmente a dor aguda.

Portanto, é interessante o estudo do papel dos mastócitos e das CSG na dor aguda induzida

por paclitaxel, tendo em vista que pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos no

desenvolvimento desta síndrome dolorosa.

29

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

30

2.1 Dor

A dor é considerada um mecanismo de defesa contra agentes nocivos ou lesão

tecidual. A capacidade de detectar estímulos nocivos é essencial para a sobrevivência e o

bem-estar de um organismo, além disso, a percepção da dor desempenha uma função

adaptativa e evolutiva, tendo em vista que estímulos térmicos, mecânicos e/ou químicos

precisam ser reconhecidos como potencialmente perigosos (BASBAUM et al, 2009;

BINGHAM et al., 2009). Embora seja uma sensação desagradável, a dor tem função

fundamental, que é a de avisar que ocorreu dano corporal ou que este é iminente. A percepção

de dor é o resultado da integração neuronal e do processamento de informação sensorial que é

geralmente iniciado na periferia e transferido para o Sistema Nervoso Central (SNC)

(BINGHAM et al., 2009). A dor pode ser modulada por vários fatores, tais como fatores

comportamentais, emocionais, sociais, culturais, ambientais e cognitivos (BASBAUM et al,

2009).

Considerando a subjetividade da dor, é importante diferenciar os termos dor e

nocicepção. Nocicepção refere-se ao processo neural de codificação e processamento de

estímulos nocivos, desencadeada por dano ou ameaça ao tecido não neural e é devido à

ativação de nociceptores. A dor é uma experiência humana singular influenciada por diversos

elementos tais como emoção, cognição, memória e construções sociais (INTERNATIONAL

ASSOCIATION FOR THE STUDY OF PAIN, 2012; FARQUHAR-SMITH, 2007). A dor,

de acordo com a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP, sigla em inglês), é

definida como “uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a uma lesão

tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de tal dano”. Essa definição atual de dor,

forneceu uma sólida base conceitual para os avanços científicos e dos profissionais de saúde

em relação à compreensão da natureza e tratamento da dor aguda e crônica. No entanto, o

texto principal encontra-se inalterado desde a primeira publicação em 1979. Desde então,

houve avanços significativos na compreensão, avaliação e tratamento da dor, gerando uma

revolução na compreensão dos mecanismos da dor. Recentemente uma revisão da definição

de dor foi proposta: “A dor é uma experiência angustiante associada a uma lesão real ou

potencial dos tecidos com componentes sensoriais, emocionais, cognitivas e sociais”

(WILLIAMS; CRAIG, 2016). No entanto, os autores afirmam que essa nova definição

também exige revisão e que ela atende apenas elementos problemáticos e que o objetivo deste

relato era gerar debate e discussão que levará a uma melhor definição sobre dor.

Comumente, alterações na via da dor levam a uma hipersensibilidade, de tal forma

que a dor ultrapassa a sua utilidade como um sistema de alerta agudo se tornando crônica e

31

debilitante. Isso pode ser visto, em algum nível, como uma extensão do processo de cura

normal, em que danos no tecido ou nervos provocam hiperatividade para promover a

vigilância da área lesada. Por exemplo, queimaduras solares produzem sensibilização

temporária da área afetada. Como resultado, estímulos normalmente inócuos, como a

incidencia da luz ou calor, são percebidos como sensação dolorosa (fenômeno conhecido

como alodinia), ou estímulos dolorosos que normalmente provocam dor são percebidos com

maior intensidade (referido como hiperalgesia) (INTERNATIONAL ASSOCIATION FOR

THE STUDY OF PAIN, 2012; BASBAUM et al., 2009).

2.1.1 Tipos de dor

Em relação à duração, a dor pode ser classificada em transitória, aguda ou crônica.

Tanto na dor transitória como na dor aguda, a causa é bem definida e o curso de ambas são

limitados, podendo desaparecer antes mesmo da remoção da causa ou do reparo do dano

tecidual. Quando um estímulo nocivo é aplicado ao tecido normal, dor nociceptiva aguda

fisiológica é provocada. Esta dor protege o organismo para que o tecido não seja mais

danificado, através da geração de reflexos de retirada. A dor nociceptiva fisiológica ocorre

quando o tecido está inflamado ou ferido. Essa dor pode aparecer como dor espontânea (dor

na ausência de qualquer estímulo intencional) e/ou como hiperalgesia e/ou alodinia.

Hiperalgesia é um aumento da dor, em resposta a uma estimulação nociva, e alodinia é a

ocorrência de dor provocada por estímulos que são normalmente abaixo do limiar de dor, ou

seja, dor devido a um estímulo que normalmente não provocaria dor. Enquanto a dor

nociceptiva é provocada por estímulo nocivo nas terminações sensoriais nos tecidos e é

devido à ativação de nociceptores (INTERNATIONAL ASSOCIATION FOR THE STUDY

OF PAIN, 2012; SCHAIBLE; RICHTER, 2004), a dor crônica é geralmente causada por

lesões ou doenças que superam a capacidade do organismo de reverter o quadro, podendo

persistir até mesmo após o desaparecimento do trauma inicial, estendendo-se por meses ou

anos e comprometendo a qualidade de vida do indivíduo (LOESER; MELZACK, 1999). A

dor neuropática se desenvolve como resultado de lesão ou doença dos neurônios no SNC ou

Sistema Nervoso Periférico (INTERNATIONAL ASSOCIATION FOR THE STUDY OF

PAIN, 2012; SCHAIBLE; RICHTER, 2004). Esta condição pode apresentar uma combinação

de sintomas, que incluem sintomas negativos, como perda completa ou parcial da

sensibilidade, e sintomas positivos como parestesia (sensação anormal, seja espontânea ou

evocada), disestesia (sensações cutâneas subjetivas como formigamento, dormência e picada)

32

e dor. A sensação permanente de dor em queimação é relatada, e parece decorrer da atividade

espontânea das fibras C nociceptivas, as quais também promovem sensibilização dos

neurônios do corno dorsal na medula espinal. Da mesma maneira, a atividade espontânea de

fibras A, está relacionada à parestesia e, após sensibilização do SNC, à disestesia e à dor

(WOOLF; MANNION, 1999). Numerosos processos patológicos podem causar dor

neuropática, por exemplo, axotomia ou dano do nervo ou plexo, doenças metabólicas como

diabetes mellitus, herpes zoster, ou pós-acidente vascular encefálico (SCHAIBLE; RICHTER,

2004). Clinicamente, a dor neuropática é caracterizada por dor contínua ou espontânea e

respostas amplificadas de dor a estímulos nocivos ou não nocivos (BARON; BINDER;

WASNER, 2010). A dor neuropática pode surgir ainda devido a dano ao tecido neuronal

periférico em consequência da administração de quimioterápicos no tratamento de pacientes

com câncer (MANTYH, 2006). A dor neuropática provocada por quimioterápicos reduz a

qualidade de vida dos pacientes e muitas vezes esse sintoma é dose-limitante,

impossibilitando o tratamento correto do tumor, pois para amenizar o aparecimento da dor a

dose do quimioterápico é diminuída o que leva muitas vezes a perda da ação antitumoral

(QUASTHOFF; HARTUNG, 2002).

2.2 Dor induzida por quimioterápicos

A maioria dos pacientes com câncer utiliza a terapia quimioterápica na tentativa

de combater o tumor e isso se torna um dos fatores mais importantes na determinação da

sobrevivência e qualidade de vida dos mesmos (QUASTHOFF; HARTUNG, 2002). No

entanto, os quimioterápicos causam vários efeitos adversos, dentre eles, a neuropatia

periférica que é um efeito secundário de muitos agentes quimioterápicos. A neuropatia tem

sido descrita principalmente em pacientes tratados com os derivados de platina (cisplatina,

oxaliplatina, carboplatina), alcaloides da vinca (vincristina) e taxanos (paclitaxel, docetaxel,

nab-paclitaxel). A neuropatia periférica induzida pela quimioterapia (NPIQ) é um sintoma

comum e angustiante que precisa de opções preventivas ou terapêuticas eficazes

(ARGYRIOU et al., 2012; PACHMAN et al., 2011; DE IULIIS et al., 2015).

Os taxanos são alguns dos fármacos mais importantes no tratamento de tumores

sólidos. Entretanto, indivíduos submetidos ao tratamento com taxanos frequentemente são

acometidos por neuropatia que pode atingir até 70% dos pacientes. Estas taxas podem ser

alteradas de acordo com a intensidade da dose, número de ciclos de tratamento

quimioterápico, idade do paciente, duração do tratamento ou coadministração de outras

drogas neurotóxicas (ARGYRIOU, 2009; ARGYRIOU et al., 2012). Os taxanos causam dano

33

nos axônios dos neurônios, na mielina e nos gânglios da raiz dorsal (GRD). Os taxanos

estabilizam os microtúbulos e consequentemente interferem na mitose e no transporte

intracelular de proteínas e substâncias entre axônios e corpo celular (ARGYRIOU, 2009).

Uma vez que o transporte nos microtúbulos está danificado, a célula neuronal não pode

sobreviver e sofre apoptose (CARLSON; OCEAN, 2011).

A neuropatia causada pelos taxanos pode manifestar-se como parestesia ou

disestesia, dor em queimação, bem como alodinia mecânica e térmica ao frio e normalmente

envolve mãos e pés (distribuição em meia e luva). Os sintomas começam simetricamente nos

dedos dos pés, porque as extremidades dos nervos mais longos são primeiramente afetadas.

Após as doses conseguintes, os sintomas progridem de forma ascendente dos pés até o

tornozelo e pernas e, em seguida, também para as mãos, pulsos e braços (SWAIN; AREZZO,

2008). A capacidade de manusear objetos pode está comprometida, e, além disso, os pacientes

podem causar por si mesmos ferimentos mecânicos ou induzidos pela temperatura (calor ou

frio). Todos os nervos periféricos (sensoriais, motores e autonômicos) podem ser danificados

pelos taxanos, mas as fibras nervosas sensitivas mielinizadas são mais susceptíveis

(ARGYRIOU, 2009; CARLSON; OCEAN, 2011).

Outra toxicidade comumente relatada aos taxanos, principalmente ao paclitaxel, é

a dor aguda. Esta toxicidade é conhecida como síndrome dor aguda associada ao paclitaxel

(LONPRENZI et al., 2011) ou síndrome da dor aguda induzida por taxanos (FERNANDES

et al., 2016). Esta síndrome é tipicamente caracterizada por mialgias e artralgias que surgem

24-48 horas após o paciente receber a primeira dose da quimioterapia à base de taxano e tem

duração de 5-7 dias (SAIBIL et al., 2010). A síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel

pode dificultar a adesão dos pacientes ao tratamento e, frequentemente, leva a uma

diminuição na dose eficaz contra o tumor ou, até mesmo, interrupção da quimioterapia.

2.3 Paclitaxel

O taxano antimitótico, paclitaxel é um antineoplásico utilizado como primeira

linha no tratamento de diversos tumores sólidos, particularmente em carcinomas de mama,

ovário, pulmão, cabeça e pescoço (ROWINSKY, 1997; ROWINSKY et al., 1993; VON

HOFF, 1997; CROWN; O’LEARY, 2000; MILLER; SLEDGE JUNIOR, 1999).

O paclitaxel foi o primeiro taxano usado em ensaios clínicos com atividade contra

uma variedade de cânceres refratários a quimioterapia convencional. Em 1963, através de um

programa do National Cancer Institute (NCI) dos Estados Unidos da América, um extrato

bruto da casca de um raro teixo do Pacífico, o Taxus brevifolia (Figura 1), foi descoberto, e

34

em estudos pré-clínicos esse extrato demonstrou ter atividade citotóxica contra muitos

tumores. O paclitaxel foi isolado originalmente como sendo constituinte desse extrato (WANI

et al., 1971). Atualmente, ele é obtido através de uma semissíntese do produto originado das

folhas de Taxus baccata, o precursor de paclitaxel e docetaxel.

Figura 1 - Imagem representativa do Taxus brevifolia.

Fonte: Adaptado de Sociedade Brasileira de Química.

Em 1979 foi identificado o mecanismo de ação exclusivo do paclitaxel como

droga antitumoral, que difere dos alcalóides da vinca e derivados da colchicina, pois o

paclitaxel induz uma hiperpolarização dos microtúbulos ao invés de inibir a formação destes,

e este achado representou o estímulo necessário, para que se intensificassem os estudos com a

droga pelo NCI (SCHIFF; HORWITZ, 1980; ROWINSKY, 1990).

O paclitaxel foi o agente antitumoral mais promissor desenvolvido nas décadas de

1980 e 1990. Foi aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento de

câncer ovariano refratário em 1992, e foi introduzido no mercado em 1993 através de Bristol-

Myers Squibb Company (BMS) operando sob uma pesquisa cooperativa e acordo de

desenvolvimento (CRADA) juntamente com o NCI. Foi aprovado para o tratamento do câncer

de mama em 1994, e é a primeira linha de tratamento para este tipo de câncer. Vendas

mundiais de paclitaxel alcançaram $1.2 bilhões em 1998. O paclitaxel também é utilizado em

grande escala no tratamento de linfomas, como primeira linha na abordagem do câncer de

pulmão e ovário (ROWINSKY; DONEWOHER, 1995).

35

2.3.1 Mecanismo de ação antitumoral do paclitaxel

O paclitaxel apresenta um mecanismo de ação exclusivo que o difere dos demais

inibidores mitóticos. Os microtúbulos são essenciais para a manutenção da forma celular,

sendo um dos componentes do fuso mitótico e do transporte dentro das células. A ligação do

paclitaxel aos microtúbulos estimula a polimerização da tubulina, que estabiliza os

microtúbulos. Dessa forma, o ciclo celular acaba sendo bloqueado na sua última fase (G2) na

mitose, impedindo a divisão e proliferação das células neoplásicas, ocasionando morte

subsequentemente por um mecanismo de apoptose (JORDAN; WILSON, 2004; JORDAN et

al., 1993). A ligação do paclitaxel ao longo do lúmen do microtúbulo estabiliza a rede de

microtúbulos, suprimindo assim a despolimerização e a instabilidade dinâmica (Figura 2). Em

concentrações mais elevadas do que as necessárias para suprimir a dinâmica, o paclitaxel

aumenta a polimerização dos microtúbulos (DERRY; WILSON; JORDAN, 1995;

DUMONTET; JORDAN, 2010; JORDAN et al., 1993). O paclitaxel é capaz de promover a

polimerização dos microtúbulos, mesmo na ausência de GTP, e estes microtúbulos são

resistentes à despolimerização (SCHIFF et al., 1979; SCHIFF; HORWITZ, 1981). O

mecanismo molecular descrito subjacente aos efeitos do paclitaxel é através da estabilização

da conformação helicoidal do anel M da β-tubulina, que fortalece os contatos laterais entre as

subunidades tubulínicas (PROTA et al., 2013).

Portanto, o paclitaxel é altamente eficaz contra proliferação de células cancerosas.

É amplamente utilizado, tanto sozinho como em combinação com outros agentes

quimioterápicos, no tratamento de muitos tipos de tumores sólidos, incluindo tumores da

mama, ovário, pulmão e cabeça e pescoço.

36

Figura 2 – Mecanismo de ação antitumoral do Paclitaxel.

Os dímeros de tubulina ligados ao GTP são incorporados na extremidade crescente dos microtúbulos,

e formam uma cápsula estabilizadora de tubulina ligada ao GTP. Ao longo do tempo, o GTP é

hidrolisado para GDP, o que leva a uma mudança conformacional nos dímeros de tubulina e

desestabilização da rede de microtúbulos. A perda do limite GTP-tubulina resulta em

despolimerização de microtúbulos. A troca de nucleotídeos liberou dímeros de tubulina para

reincorporação em um microtúbulo. O paclitaxel impede a despolimerização dos microtúbulos.

Fonte: Adaptado de GORNSTEIN; SCHWARZ. The paradox of paclitaxel neurotoxicity: Mechanisms

and unanswered questions. Neuropharmacology. 2014.

Os microtúbulos são polímeros rígidos formados a partir de heterodímeros de α-

tubulina e β-tubulina que normalmente apresentam uma das extremidades ancorada ao lado do

núcleo da célula (centrossoma) e a outra livre no citoplasma. O paclitaxel se liga à β-tubulina

que foi incorporada nos microtúbulos (NOGALES et al., 1995). Embora sua principal função

seja a formação do fuso mitótico durante a divisão celular, os microtúbulos também estão

envolvidos em muitas funções vitais da interfase, como manutenção da forma, motilidade,

transmissão de sinais e transporte intracelular (DUSTIN, 1980; WILSON, 1975; CROSSING

et al., 1981). Normalmente, os microtúbulos sofrem despolimerização e repolimerização, um

37

processo conhecido como instabilidade dinâmica (MITCHISON; KIRSCHNER, 1984). O

modelo atual para este processo é que as subunidades de tubulina ligadas a GTP são

incorporadas na extremidade do microtúbulo, formando uma tampa. Quando o GTP é

subsequentemente hidrolisado, a subunidade de tubulina muda de conformação, conduzindo à

desestabilização da rede de microtúbulos. Um tampão de tubulina GTP preservará o

microtúbulo, mas se ocorrer hidrólise de GTP das subunidades terminais, pode ocorrer uma

despolimerização extensa do microtúbulo durante o qual as subunidades GDP-tubulina se

dissociarão da extremidade dos microtúbulos (NOGALES; WANG, 2006).

Poucos agentes antineoplásicos exibem características farmacológicas tão

favoráveis e atrativas. Primeiro, porque o paclitaxel se liga a β-tubulina levando a

polimerização dos microtúbulos (SCHIFF, FANT; HORWITZ, 1979; CAPLOW, SHANKS;

RUHLEN, 1994). Essa estabilização dos microtúbulos causa parada da mitose e apoptose in

vitro, agindo independentemente da via p53 supressor, isso foi demostrado em ensaios

experimentais (JORDAN et al., 1996; WOODS et al., 1995; FAN et al.,1998;

VIKHANSKAYA et al., 1998) e clínicos (KING et al., 2000; GADDUCCI et al., 2000). O

paclitaxel induz ainda RNAm para TNF-α, interleucinas (DING et al., 1990; BURKHART et

al., 1994; WHITE et al., 1998; WATSON et al., 1998; COLLINS, LEE; TING, 2000), e

enzimas como iNOS (KIRIKAE et al., 1996; KIRIKAE et al., 2000; KIM; PAIK, 2005) e

COX-2 (MOOS et al., 1998; MOOS et al., 1999; SUBBARAMAIAH et al., 2000) que geram

mediadores da inflamação. A indução desses genes requer 10-30µM de paclitaxel.

2.3.2 Toxicidade associada ao paclitaxel

O paclitaxel exerce seus efeitos tóxicos principais na medula óssea. Neutropenia

geralmente ocorre em 8 a 11 dias após administração de uma dose, revertendo ou

recuperando-se rapidamente entre o 15º e o 21º dia. Reações de hipersensibilidade ocorrem

em pacientes que receberam infusões de paclitaxel de curta duração (1 a 6 horas), mas em

grande parte evitadas pelo pré-tratamento com difenidramina, cimetidina e dexametasona.

Bradicardia e taquicardia ventricular silenciosa também ocorrem, mas resolvem-se

espontaneamente durante as infusões de 3 a 24 horas. Mucosite é outro efeito tóxico comum

aos antineoplásicos e que na quimioterapia com paclitaxel é proeminente em esquemas de

infusões prolongadas.

Os pacientes que recebem tratamento com paclitaxel frequentemente desenvolvem

dor, o que reduz significativamente a sua qualidade de vida e dificulta o uso deste

quimioterápico. A dor induzida pelo paclitaxel inclui a dor que ocorre imediatamente após o

38

tratamento com este fármaco, conhecida como síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel

(REEVES et al., 2012; LOPRINZI et al., 2011). Em adição a esta toxicidade aguda do

paclitaxel, neuropatia periférica pode ser uma consequência devastadora em longo prazo

(ARGYRIOU, 2009).

Os neurônios, apesar de não estarem em divisão constante, são suscetíveis ao

paclitaxel e isso provoca sérias complicações para seu uso como agente terapêutico. Como o

paclitaxel não atravessa a barreira hematoencefálica, esse fármaco afeta especificamente o

SNP, e leva a uma neuropatia axonal predominantemente sensorial (PARK et al., 2011). A

incidência e gravidade da neuropatia aumentam com doses únicas e cumulativas mais

elevadas. Embora a incidência relatada varie de acordo com o estudo, até 30% dos pacientes

apresentam sintomas graves em altas doses cumulativas (CARLSON; OCEAN, 2011). Os

sintomas neurológicos podem atingir tal gravidade que necessitam da cessação ou redução do

tratamento. Embora os sintomas geralmente se resolvam após a interrupção do tratamento,

eles podem persistir por meses ou anos, levando a uma menor qualidade de vida (LEE;

SWAIN, 2006).

Quando uma dose neurotóxica é atingida, os sintomas sensoriais começam nas

mãos e nos pés. Isto é reflexo de uma neuropatia, em que os axônios sensoriais distais se

degeneram (ARGYRIOU et al., 2008). Uma biópsia de um nervo periférico revelou uma

patologia de degeneração axonal, desmielinização secundária e perda de fibras nervosas em

casos de neuropatia grave (SAHENK et al., 1994). No entanto, em modelos animais foi

demonstrado que os sintomas da neuropatia podem estar presentes com a degeneração apenas

das fibras intraepidérmicas distais (SIAU et al., 2006). O paclitaxel pode afetar todas as

modalidades sensoriais, sendo as fibras maiores as mais afetadas (QUASTHOFF;

HARTUNG, 2002; DOUGHERTY et al., 2004). Os sintomas primários nos pacientes

incluem dormência, dor e formigamento (LEE; SWAIN, 2006). O sistema motor é

frequentemente menos afetado, com relatos de sintomas suaves com altas doses de paclitaxel,

e os efeitos no sistema autonômico são raros (FREILICH et al., 1996; WINER et al., 2004).

Embora estudos tenham identificado agentes que protegem contra a degeneração axonal

induzida por paclitaxel em cultura de neurônios, e degeneração axonal e sintomas sensoriais

em modelos animais (MELLI et al., 2006; ROVINI et al., 2010; VERSTAPPEN et al., 2004;

APFEL et al., 1991; BOYLE; WHEELER; SHENFIELD, 1999; PISANO et al., 2003;

WANG et al., 2004), os que foram testados em ensaios clínicos até agora produziram

resultados mistos e não existem atualmente intervenções eficazes ou aprovadas.

39

2.3.3 Síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel

O paclitaxel está associado a uma síndrome peculiar de dores subagudas, que

inicialmente foi referida como artralgias e mialgias induzidas por paclitaxel (ROWINSKY,

1993; GARRISON et al., 2003). Atualmente essa síndrome está sendo designada como

"Síndrome da Dor Aguda Associada ao Paclitaxel" (Paclitaxel-Associated Acute Pain

Syndrome – P-APS) (REEVES et al., 2012; LOPRINZI et al., 2007; LOPRINZI et al., 2011).

Essa síndrome da dor aguda causa significativa morbidade com uma incidência de 70% dos

indivíduos, iniciando no 1º dia e culminando no 4º dia após o primeiro ciclo do paclitaxel. Os

sintomas desaparecem em grande parte dentro de uma semana (SAIBIL et al., 2010; REEVES

et al., 2012).

A síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel pode resultar da sensibilização

do nociceptor, conforme observado em pacientes (LOPRINZI et al., 2007); além disso, em

modelos animais, ratos que receberam infusão de paclitaxel desenvolveram lesão do nervo

isquiático no prazo de 24 horas (JIMENEZ-ANDRADE et al., 2006; PETERS et al., 2007). A

natureza e o perfil temporal da P-APS distingue-se como uma entidade separada da neuropatia

periférica induzida por quimioterapia; no entanto, não se sabe se os pacientes que

desenvolvem P-APS são mais propensos a desenvolver neuropatia periférica (LOPRINZI et

al., 2011). Tal como acontece com P-APS, a neuropatia periférica foi descrito em até 70% dos

pacientes. (ARGYRIOU, 2009).

Um estudo randomizado comparou a eficácia de infusão curta ou prolongada de

paclitaxel no câncer de mama metastático e demonstrou uma incidência de 25% de dor aguda

no grupo de infusão de 3 horas, já no grupo que recebeu infusão de 96 horas a incidência de

foi de 2%. Isto pode sugerir que, os picos de concentração da droga em um tempo mais curto

são responsáveis pela P-APS (MOULDER et al., 2010).

Desde as duas últimas décadas, sabe-se que o tratamento com paclitaxel pode

induzir imediatamente sintoma de dor nos pacientes (ROWINSKY, 1993; GARRISON et al.,

2003). Nos últimos anos essa dor foi definida como P-APS (REEVES et al., 2012; LOPRINZI

et al., 2011). Até o presente, poucos estudos foram realizados a fim de investigar os

mecanismos relacionados com a dor aguda induzida por paclitaxel em modelos animais.

Os mecanismos pelos quais o paclitaxel induz P-APS, ainda hoje não são

conhecidos e nem existe um padrão comprovado de cuidados para a prevenção ou tratamento

da P-APS. Atualmente, o entendimento dos mecanismos subjacentes da dor aguda induzida

por pacliatxel em modelos animais é baseado principalmente em estudos que examinam as

mudanças patológicas nos dias após a interrupção do tratamento repetido com paclitaxel.

40

Pouco se sabe sobre a ação direta e imediata induzida pelo paclitaxel no sistema de

sinalização da dor em modelos in vivo. Uma maior compreensão da natureza e da etiologia da

P-APS pode fornecer esclarecimentos adicionais sobre maneiras de aliviar esta toxicidade

potencialmente incômoda.

Até o momento, poucos mecanismos foram descritos com o intuito de esclarecer o

desenvolvimento de dor aguda induzida por paclitaxel nos pacientes em tratamento com este

fármaco. Recentemente, um estudo demonstrou que o paclitaxel poderia provocar dor aguda

pela ativação do receptor toll like 4 (TLR4) na medula espinal e nos GRDs (YAN et al.,

2015). Outro estudo sugeriu que a ativação dos receptores de bradicinina (B1 e B2) no nervo

isquiático contribuem para o desenvolvimento da dor aguda induzida por paclitaxel

(BRUSCO et al., 2016). A compreensão de tais mecanismos poderia fornecer fundamentos

para o desenvolvimento de tratamentos eficazes para a síndrome dolorosa associada ao

paclitaxel (POLOMANO et al., 2001; RIGO et al., 2013).

2.4 Mastócitos

Os mastócitos são agentes cruciais nas desordens alérgicas, no entanto também

são importantes iniciadores e efetores da imunidade inata, residem em muitos tecidos,

inclusive nos nervos. (GALLI, NAKAE, TSAI, 2005; METCALFE, BARAM, MEKORI,

1997; GALLI et al, 2011). Derivam de células-tronco hematopoéticas e normalmente

circulam em sua forma imatura (CHEN et al., 2005; JAMUR, OLIVER, 2011; GALLI et al,

2011) e maturam em tecidos vascularizados ou cavidades serosas em que finalmente vão

residir sob a influência do fator de células-tronco e várias citocinas (METCALFE, BARAM,

MEKORI, 1997; KAWAKAMI et al., 2002; GALLI et al, 2011). Os mastócitos contêm

grânulos ricos em fatores pró-inflamatórios (ZUO et al., 2003). Além disso, são uma fonte

importante de várias citocinas e quimiocinas (THEOHARIDES, CONTI, 2004; MIDULLA et

al., 2006; THEOHARIDES, KALOGEROMITROS, 2006).

Até 97% dos mastócitos estão no lado abluminal dos vasos sanguíneos. Tal como

os linfoblastos, os mastócitos podem mover-se através do cérebro normalmente na ausência

de inflamação, com entrada rápida e com passagem livre através da barreira hematoencefálica

(LAMBRACHT-HALL, DIMITRIADOU, THEOHARIDES, 1990). Os mastócitos residentes

participam de reações inatas de defesa do hospedeiro e são encontrados em tecidos periféricos

inervados por fibras nervosas sensoriais de pequeno calibre e dentro do compartimento

endoneural, onde orquestram processos inflamatórios. Os mastócitos podem atravessar a

barreira sangue-medula espinal e barreira hematoencefálica quando a barreira está

41

comprometida como resultado de patologias do SNC. A inflamação sistêmica dá origem a

sinais que se comunicam com o cérebro e leva a alterações no metabolismo e comportamento,

incluindo a expressão de um fenótipo iniciado (pró-inflamatório) pela microglia

(SILVERMAN et al., 2000; ENGLER et al., 2011).

Vários tipos de células imunitárias têm sido implicados na patogênese e no

processamento nociceptivo alterado característico de estados dolorosos. Foi demonstrado por

Ribeiro e colaboradores (2000) que mastócitos e macrófagos residentes são cruciais para o

desenvolvimento da dor inflamatória e participam liberando citocinas e quimiocinas quando

ativados. Mastócitos desempenham um papel vital no desenvolvimento de hiperalgesia

térmica e alodinia mecânica em camundongos (ZUO et al., 2003). Os grânulos de mastócitos

contêm mediadores tais como histamina, proteases e citocinas (METCALFE, BARAM,

MEKORI, 1997; GALLI, NAKAE, TSAI, 2005), vários dos quais são capazes de sensibilizar

ou ativar neurônios. Os mastócitos ativados contribuem diretamente para estados de dor,

incluindo dor neuropática, liberando mediadores algogênicos após degranulação (XANTHOS

et al., 2011). Mastócitos residentes de nervos periféricos são as primeiras células ativadas no

local de lesão nervosa e contribuem para o recrutamento de neutrófilos e macrófagos (ZUO et

al., 2003). Os mastócitos também podem contribuir indiretamente, aumentando o

recrutamento de outros tipos de células imunitárias importantes que, por sua vez, liberam

mediadores pró nociceptivos, tais como IL-6 (VALLIE`RES, RIVEST, 1997; LEAL-

BERUMEN, CONLON, MARSHALL, 1994). Em modelos animais, a inibição da

degranulação de mastócitos reduziu a infiltração de neutrófilos e macrófagos e o

desenvolvimento de hiperalgesia após lesão do nervo periférico. Como células imunes

residentes nos nervos periféricos, os mastócitos têm um papel nos estágios iniciais da

inflamação e estabelecimento da hipersensibilidade da dor que acompanha a lesão do nervo

periférico (ZUO et al., 2003).

A estabilização dos mastócitos com cromoglicato de sódio atenua o

desenvolvimento de alodinia, hipersensibilidade mecânica e térmica. Além disso, reduz a

infiltração de neutrófilos e monócitos/macrófagos no local da lesão do nervo após ligadura

parcial do nervo isquiático (ZUO et al., 2003). No entanto, o efeito anti-alodínico com

antagonistas foi menos eficaz do que o tratamento com cromoglicato de sódio, sugerindo que

outros mediadores derivados de mastócitos (neurotrofinas, prostaglandinas, proteases e

citocinas) podem estar envolvidos na geração de dor neuropática (THACKER et al., 2007).

Estes estudos sugerem que os mastócitos ativados contribuem diretamente para a dor

neuropática. Os mastócitos também podem contribuir indiretamente aumentando o

42

recrutamento de outros tipos de células imunes importantes que, por sua vez, liberam

mediadores pró nociceptivos (THACKER et al., 2007).

Outro estudo demonstrou que o tratamento com estabilizador de mastócitos ou a

deleção destes reduziu a dor neuropática crônica em modelos animais (CHATTERJEA,

MARTINOV, 2015). Além disso, foi demosntrado in vitro que a estabilização de mastócitos

em cultura (Rat Basophilic Leukemia, RBL-2H3) com quercetina e posteriormente

estimulados com paclitaxel inibiu a liberação de histamina (GAO et al., 2016). Uma grande

quantidade de evidências suporta a hipótese de que os mastócitos contribuem para a dor

patológica. Estes resultados são uma forte indicação de que os mastócitos podem contribuir

para o desenvolvimento da síndrome da dor aguda induzida por paclitaxel, pois embora se

tenha demonstrado o seu envolvimento na dor neuropática, não há estudos sobre a sua

participação na síndrome dolorosa aguda induzida pelo paclitaxel.

2.5 Células satélites gliais

As células satélites gliais (CSG) são células especializadas que envolvem e se

comunicam com neurônios sensoriais nos gânglios da raiz dorsal. Acredita-se que as CSG são

capazes de modular o microambiente neuronal e a transmissão sensorial dentro dos gânglios

(HANANI, 2005; ZHANG et al., 2007; HANANI, 2010). Estas células são capazes de

expressar diferentes receptores e ainda respondem a substâncias pró-inflamatórias e liberam

transmissores que podem desempenhar um papel na patogênese de vários distúrbios

(HANANI, 2005; CAPUANO et al., 2009; HANANI, 2010; NEEB et al., 2011; HANANI

2012).

As CSG são derivadas a partir de células pluripotentes da crista neural, assim

como as células de Schwann (JESSEN; MIRSKY, 2005). Morfologicamente as CSG se

caracterizam por serem células de forma laminar, irregulares, geralmente mononucleares e

com expansões lamelares e microvilosidades que aumentam sua área de superfície (OHARA

et al., 2009; PANNESE, 2010). As CSG se dispõem em volta dos corpos dos neurônios

sensoriais e da porção proximal do seu axônio, geralmente formam uma bainha de uma única

camada em torno de cada corpo neuronal e se conectam entre si por junções

comunicantes. Cada CSG é separada do corpo do neurônio por um espaço de cerca de 20nm e

a face não neuronal das CSG possuem uma membrana basal de tecido conjuntivo formando

uma unidade estrutural (HANANI, 2005).

Muitas vezes as CSG são consideradas como o equivalente no SNP aos astrócito

do SNC, embora os astrócitos no SNC e as CSG no SNP compartilham funções comuns,

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2852320/#R38

43

como isolamento, regulação da concentração iônica do espaço extracelular e reciclagem de

neurotransmissores, a morfologia dos dois tipos de células é bastante diferente, pois os

astrócitos são comumente multipolares com extensões citoplasmáticas muito atenuadas

(OHARA et al., 2009). CSG e astrócitos compartilham marcadores moleculares, como a

glutamina sintetase e a expressão da proteína ácida fibrilar glial (GFAP). No entanto, ambas,

CSG e astrócitos, parecem diferir quanto à expressão de GFAP que é detectável

constitutivamente em astrócitos, mas não em CSG. Porém, após uma lesão do nervo as CSG

passam a expressar GFAP, semelhante aos astrócitos, que aumentam a expressão de GFAP

após lesão do nervo (OHARA et al., 2009; HANANI, 2005). Além disso, CSG expressam

canais de cálcio e de potássio dependentes de voltagem e Kir 4.1 e componentes de

reciclagem de glutamato, tais como o transportador de glutamato-aspartato (GLAST)

(CHERKAS et al., 2004; ZHANG et al., 2009).

As células de Schwann que também são derivadas da crista neural mantém uma

estreita relação com as CSG (LE DOUARIN et al., 1991). Estudos tem mostrado que, em

vários tipos diferentes de cultura de gânglio, as CSG podem aumentar a expressão de

marcadores de células de Schwann, tais como a proteína básica de mielina de células de

Schwann e do fator de transcrição Krox-20 (MURPHY et al., 1996) e regulam negativamente

a expressão de marcadores específicos tais como Erm (HAGEDORN et al., 2000). Além

disso, as CSG expressam também inúmeros receptores de moléculas bioativas potencialmente

intervenientes em interações com outras células sendo que muitos deles foram, implicados na

gênese e manutenção da dor crônica, como os receptores purinérgicos P2Y e P2X7 (CERUTI

et al., 2008; VILLA et al., 2010; ZHANG et al., 2007), o receptor do peptídeo relacionado ao

gene de calcitonina (CGRP) (LI; VAUSE; DURHAM, 2008), da substância P (TAKEDA;

TAKAHASHI; MATSUMOTO, 2009), de citocinas e quimiocinas, como exemplo TNF-α e

IL-1β (DUBOVY et al., 2006; POMONIS et al., 2001) e do receptor N-metil-D-aspartato

(NMDAr) (CASTILLO et al., 2013).

Há fortes evidências de que a ativação de células gliais (astrócitos e microglia)

dentro do corno dorsal da medula espinal acarreta na subsequente produção de citocinas, tais

como IL-1β e TNF-α, sugerindo um papel fundamental dessas células na gênese e

manutenção da dor patológica (WATKINS; MILLIGAN; MAIER, 2001; WATKINS;

MAIER, 2002). Estudos tem demonstrado a importância das células gliais na modulação da

transmissão sensorial, incluindo a nocicepção (CHERKAS et al., 2004, HANANI, 2005;

TAKEDA et al., 2009). Na verdade, após a lesão local do nervo periférico, as células gliais

começam a apresentar aumento na expressão de GFAP (WOODHAM et al., 1989, LI e




44

ZHOU, 2001) e aumento da produção de citocinas (TAKEDA et al., 2007). Tem sido

sugerido ainda que não só as células gliais centrais estão envolvidas na geração e manutenção

da dor, mas também as CSG nos gânglios sensoriais desempenham esse papel (HANANI et

al., 2002; HUANG; BELZER; HANANI, 2010). Esta ideia tem sido apoiada firmemente por

estudos que demonstraram que as CSG possuem mecanismos para liberação de citocinas

(TAKEDA, TAKAHASHI, MATSUMOTO, 2009; ZHANG et al., 2007), ATP

(SUADICANI et al., 2010) e possivelmente outros mediadores químicos. As CSG sofrem

alterações importantes como resultado de lesão de nervos periféricos, e parecem contribuir

para a dor crônica como demonstrado em modelos animais (DUBLIN; HANANI, 2007;

HUANG; BELZER; HANANI, 2010; OHARA et al., 2009).

Evidências têm sugerido que as CSG possuem um papel crítico na dor induzida

pela quimioterapia e outras condições crônicas de dor (CAPUANO et al., 2009; NEEB et al.,

2011; LAURSEN et al., 2014; TAKEDA et al., 2011; WARWICK; HANANI, 2013). A

neuropatia periférica é um efeito adverso comum causado por diversos quimioterápicos,

incluindo os derivados de platina (cisplatina, oxaliplatina, carboplatina), alcaloides da vinca

(vincristina) e taxanos (paclitaxel, docetaxel). O paclitaxel é um agente quimioterápico que

tem sido conhecido por induzir distúrbios sensoriais periféricos incluindo dor neuropática que

é uma complicação comum do uso deste fármaco entre outros efeitos colaterais

(DOUGHERTY et al., 2004). Acredita-se que o paclitaxel e outros quimioterápicos se

acumulem nos GRD quando administrados para o tratamento de diferentes tipos de cânceres.

A dor induzida por quimioterápicos é acompanhada de distúrbios sensoriais dependentes da

dose cumulativa do agente utilizado no tratamento (WINDEBANK, GRISOLD, 2008;

CAVALETTI; MARMIROLI, 2010). Paclitaxel induz dor caracterizada por

hipersensibilidade a estímulos mecânicos e térmicos (especialmente a estímulos frios) que

começam logo após o início do tratamento e pode persistir por semanas ou anos após o

término da terapia (DOUGHERTY et al., 2004). Alguns mecanismos patológicos estão

associados à patogênese da neuropatia periférica induzida pela quimioterapia (CIPN),

incluindo neurotoxicidade, disfunção mitocondrial e desprendimento do transporte axonal

(FLATTERS; BENNETT, 2006; FIDANBOYLY; GRIFFITHS; FLATTERS, 2011; JAGGI;

SINGH, 2012). Estudos também sugerem o envolvimento de mediadores pró-inflamatórios

produzidos pela microglia na medula espinal no modelo da neuropatia induzida pelo

paclitaxel ou vincristina (JAGGI; SINGH, 2012). No entanto, novas evidências sugerem um

potencial papel das células gliais em associação com a CIPN (WARWICK; HANANI, 2013).

45

No entanto, até o momento, poucos estudos tem evidenciado a participação das

CSG na dor induzida por paclitaxel, especialmente na dor aguda. Estas podem fornecer

evidencias para uma melhor compreensão dos mecanismos pelos quais o paclitaxel causa dor,

principalmente dor aguda. Dessa forma, é interessante o estudo do papel das CSG na dor

aguda induzida por paclitaxel, tendo em vista que pouco se sabe sobre os mecanismos

envolvidos nessa síndrome dolorosa.

46

3. JUSTIFICATIVA

47

O paclitaxel é um antineoplásico derivado do Taxus brevifolia, possuindo potente

atividade citotóxica e utilizado como primeira linha no tratamento de diversos tumores

sólidos, particularmente em carcinomas de mama, ovário, pulmão, cabeça e pescoço. No

entanto, os pacientes que recebem tratamento com paclitaxel frequentemente desenvolvem

dor patológica, o que reduz significativamente a sua qualidade de vida e dificulta a utilização

deste quimioterápico. A dor patológica induzida pelo paclitaxel inclui a dor que ocorre

imediatamente após o primeiro ciclo do tratamento com este quimioterápico (REEVES et al.,

2012; LONPRINZI et al., 2011), e a dor que persiste durante semanas a anos após o fim do

tratamento (CATA et al., 2006; DOUGHERTY et al., 2004).

A dor aguda induzida pelo paclitaxel é uma morbidade significativa em pacientes

e atualmente, não existe um padrão comprovado de cuidados para a sua prevenção ou

tratamento (REEVES et al., 2012; LONPRINZI et al., 2011), além disso, os mecanismos

pelos quais o paclitaxel induz dor aguda não são totalmente conhecidos. Atualmente o

entendimento dos mecanismos subjacentes da dor patológica induzida por paclitaxel em

modelos animais é baseado principalmente em estudos que examinam as mudanças

patológicas nos dias após o final do tratamento com essa droga. Até o momento, pouco se

sabe sobre a ação direta e imediata do paclitaxel no sistema de sinalização da dor aguda em

modelos animais, e poucos são os estudos in vivo que têm investigado os mecanismos pelos

quais o paclitaxel induz dor aguda (YAN et al., 2015, JATOI et al., 2016, BRUSCO et al.,

2016). Assim, a compreensão de tais mecanismos poderia fornecer fundamentos para o

desenvolvimento de tratamentos eficazes para essa síndrome dolorosa (POLOMANO et al.,

2001; RIGO et al., 2013). Além disso, a investigação dos mecanismos envolvidos poderia

auxiliar na redução da intensidade, incidência ou ainda na prevenção de dor crônica.

Evidências clínicas de que a dor aguda pode está relacionada com o aparecimento e

severidade da dor neuropática foi observada após o tratamento com o paclitaxel em pacientes

(REEVES et al., 2012; LOPRINZI et al., 2011).

Diante disso, vê-se a importância de estudar os possíveis mecanismos envolvidos

na dor aguda induzida pelo paclitaxel, assim como uma maior compreensão da natureza e da

etiologia da dor aguda induzida por este quimioterápico pode fornecer esclarecimentos

adicionais sobre maneiras de aliviar esta toxicidade potencialmente incômoda.

48

4. OBJETIVOS

49

4.1 Geral

Investigar a possível participação de mastócitos e de células satélites gliais na

síndrome da dor aguda induzida pelo quimioterápico paclitaxel em camundongos.

4.2 Específicos

• Avaliar o decurso temporal da hiperalgesia mecânica e térmica no modelo de síndrome da

dor aguda induzida pelo paclitaxel em camundongos;

• Investigar o envolvimento dos mastócitos na hiperalgesia mecânica e térmica no modelo de

síndrome da dor aguda induzida pelo paclitaxel em camundongos;

• Investigar a participação da citocina pró-inflamatória IL-6 na hiperalgesia mecânica e

térmica no modelo de síndrome da dor aguda induzida pelo paclitaxel em camundongos, bem

como a participação dos receptores IL-1R, TNFR1/R2, CCR2 e do receptor TLR4;

• Avaliar a expressão gênica das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1β e TNF-α e da

quimiocina MCP-1 (CCL2) no nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal (GRD) e medula

espinal de camundongos injetados com paclitaxel, assim como a participação do receptor

CCR2 nos GRD e medula espinal;

• Avaliar a concentração das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1β e TNF-α e quimiocinas

KC/CXCL1 e MCP-1 (CCL2) no plasma, nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal (GRD) e

medula espinal de camundongos no modelo de síndrome da dor aguda induzida pelo

paclitaxel;

• Quantificar as citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1β e TNF-α e quimiocinas KC/CXCL1 e

MCP-1 (CCL2) no plasma, nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal (GRD) e medula espinal

de camundongos TLR4-/- no modelo de síndrome da dor aguda induzida pelo Paclitaxel;

• Quantificar as citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1β e TNF-α e quimiocinas KC/CXCL1 e

MCP1 (CCL2) no nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal (GRD) e medula espinal de

camundongos que não diferenciam mastócitos e em camundongos selvagens pré-tratados com

cromoglicato de sódio;

50

• Quantificar as citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1β e TNF-α e das quimiocinas

KC/CXCL1 e MCP1 (CCL2) em cultura de linhagem de mastócitos (RBL-2H3) e em cultura

primária de células satélites gliais, ambas estimuladas com paclitaxel;

• Avaliar a expressão de c-Fos, IL-6 e triptase (marcador de mastócitos) e a localização por

imunofuorescência nos gânglios da raiz dorsal (GRD) e na medula espinal de camundongos

injetados com paclitaxel.

51

5. MATERIAIS E MÉTODOS

52

5.1 Animais

Foram utilizados camundongos C57BL/6 (20-25g), machos, provenientes do

biotério setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará – FAMED/UFC e do biotério central da Universidade de São

Paulo – USP, Campus de Ribeirão Preto.

Utilizou-se também camundongos knockouts IL-6, TNFR1/R2, CCR2, IL-1R,

TLR2 e TLR4. Além de camundongos que não diferenciam mastócitos, Kitw-sh

(SH),

provenientes do Centro de Criação de Camundongos Especiais (CCCE) da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – FMRP/USP. Todos os

experimentos com animais knockouts foram realizados no Laboratório de Inflamação e Dor

(LID) do Departamento de Farmacologia da FMRP/USP, sob a orientação do Prof. Dr. Thiago

Mattar Cunha.

Os camundongos SH (ou “sash”) apresentam uma mutação que apareceu

espontaneamente em uma ninhada produzida de um cruzamento C3H/HEH x 101/H no

Radiobiology Unit at Harwell no Reino Unido (LYON; GLENISTER, 1982). A mutação

Kitw-sh

é uma inversão abrangendo um segmento próximo ao lócus c-kit causando a ruptura

das sequências reguladoras 5’, por conseguinte, a sinalização é reduzida através da tirosina

quinase c-kit (DUTTLINGER et al., 1993). Esta expressão reduzida de c-kit na medula óssea

provoca a incapacidade das células-tronco hematopoiéticas de se diferenciarem em

precursores de mastócitos, resultando numa abolição de mastócitos (GRIMBALDESTON et

al., 2005).

Os animais experimentais foram mantidos em microisoladores ventilados

apropriados a uma temperatura controlada (22 ± 2 ºC) no biotério do Departamento de

Farmacologia da FMRP/USP, num ciclo claro-escuro de 12h com ração padrão e água potável

ad libitum. Os animais foram aclimatizados no laboratório durante pelo menos 1h antes da

realização dos experimentos comportamentais. Todos os experimentos foram realizados entre

08:00 e 17:00h. Os animais geneticamente deficientes e seus respectivos controles selvagens

foram utilizados com idade entre 6-8 semanas, pesando entre 20-25g

5.2 Aspectos éticos

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as

diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e as

diretrizes éticas estabelecidas pela IASP sobre o uso de animais de laboratório em pesquisas

experimentais (ZIMMERMANN, 1983). Os protocolos experimentais foram aprovados pela

53

Comissão de Ética em Pesquisa Animal da UFC (CEPA, processo número 17/2014) e pela

Comissão de Ética para o Uso de Animais da FMRP/USP (CEUA, processo número

42/2015). Os estudos comportamentais seguiram as diretrizes segundo os Relatórios de

Experiências in vivo na Pesquisa Animal (ARRIVE) (MCGRATH et al., 2010). Além disso, o

número de animais e a intensidade dos estímulos usados foram os mínimos necessários para

demonstrar efeitos consistentes. Os animais foram distribuídos randomicamente entre os

grupos experimentais (número de 6-8 animais por grupo) e todos os experimentos

comportamentais foram conduzidos de maneira cega em relação à administração de drogas e

/ou linhagem dos animais a fim de reduzir viés experimental.

5.3 Indução da síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel em camundongos

O modelo de síndrome de dor aguda associada ao paclitaxel foi baseado no

protocolo proposto por Polomano et al., (2001), adaptada para camundongos (SMITH et al.,

2004) e descrito por Yan et al., (2015) com algumas modificações. Resumidamente, a dor

aguda associada ao paclitaxel foi induzida pela administração do quimioterápico em uma

única injeção. O paclitaxel (Evotaxel®, Evolabis, 6mg/mL em Cremophor EL e etanol

desidratado) foi diluído em soro fisiológico (NaCl 0,9%) e administrado em camundongos por

via intravenosa (i.v.) na dose de 4mg/kg, através da veia caudal. A via intravenosa foi

escolhida para mimetizar a administração do paclitaxel utilizada na clínica. O veículo foi

composto de Cremophor EL e de etanol desidratado (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, EUA)

diluído em solução de NaCl 0,9%. O volume de administração das soluções foi de 150µL.

Testes nociceptivos ou outros experimentos foram realizados antes da administração da droga

ou veículo (basal ou tempo zero) e 1, 2, 4, 6 e 24h após o tratamento com paclitaxel (4 mg/kg,

i.v.) ou veículo.

54

5.4 Experimentos comportamentais

5.4.1 Avaliação da hiperalgesia mecânica

O limiar de retirada da pata foi avaliado utilizando o método “up-and-down”, tal

como descrito por Chaplan e colaboradores (1994). Em uma sala silenciosa, os camundongos

foram aclimatizados (1 hora) em compartimentos de acrílico transparente individuais (9 x 7 x

11 cm) sobre uma plataforma elevada de malha de arame para permitir o acesso à superfície

plantar das patas traseiras. As medidas foram realizadas somente quando os animais estavam

quietos, não exibindo movimentos exploratórios ou defecação, e sem estarem descansando em

suas patas traseiras. Depois de aclimatizados, uma serie de filamentos de von Frey (North

Coast Medical) de intensidade crescente (0,008g – 1,0g) foram aplicados no centro da pata

posterior direita dos animais com uma pressão suficiente para dobrar o filamento. O estímulo

foi interrompido após a observação da resposta nociceptiva, caracterizada por flexão seguida

de retirada da pata, “flinch”. A ausência da retirada da pata depois de 3 segundos levou ao uso

do próximo filamento com o aumento de peso, ao passo que, quando houve resposta positiva

de retirada da pata, levou-se à utilização do próximo filamento mais fraco. Este método foi

continuado até um total de três medições. O filamento de menor força capaz de induzir

resposta foi determinado como sendo o limiar mecânico do animal. O valor do limiar de

resposta então foi anotado e a hiperalgesia mecânica foi considerada como uma diminuição do

limiar mecânico, quando comparado com valores basais (antes da administração das drogas).

O limiar mecânico foi avaliado antes da administração do paclitaxel (valores basais), e após

diferentes tempos da administração da droga (1, 2, 4, 6, e 24h) e os valores obtidos foram

expressos em miligramas (mg).

5.4.2 Avaliação da hiperalgesia térmica ao frio

A hiperalgesia ao frio foi avaliada conforme o método descrito por Flatters e

Bennett, (2004), Gauchan, et al., (2009) e Smith; Crager; Mogil (2004), com modificações.

Brevemente, os animais foram aclimatados em compartimentos de acrílico individuais (9 x 7

x 11 cm) em uma plataforma elevada de assoalho aramado, permitindo acesso à superfície

plantar das patas, e com auxilio de uma seringa de 1mL, 50μL de acetona foi aplicado de

modo que abrangesse tanto a superfície plantar, como o dorso da pata posterior direita do

animal. O estímulo frio causado pela acetona provoca comportamentos de agitação e elevação

da pata, além de lambidas (CASPANI et al., 2009). Esse tipo de resposta é caracterizada

como comportamento nocifensivo e o tempo gasto pelo animal com esse comportamento foi

mensurado em segundos, com o auxílio de um cronômetro – resposta ao frio. As respostas

55

podem ser intermitentes, por isso, o cronômetro foi parado e ativado conforme o

comportamento do animal. Cada animal foi observado por um total de 60 segundos. Um

espelho foi colocado em inclinação com a superfície, abaixo do compartimento de acrílico

para permitir a observação clara das patas. A hiperalgesia ao frio foi avaliada antes da

administração do paclitaxel (valores basais), e após diferentes tempos da administração da

droga (2, 4, 6, 24, 48 e 72 horas) e os valores obtidos foram expressos em segundos (s).

5.4.3 Avaliação da hiperalgesia térmica ao calor

Com o objetivo de avaliar o limiar de resposta ao estimulo térmico (calor) foi

realizado o teste plantar utilizando-se o aparelho Plantar Test (Ugo Basile, Varese, Itália),

como descrito previamente por Hargreaves et al., (1988). Para isso, os animais foram

alocados cuidadosamente em compartimentos individuais de acrílico e posicionados sobre

uma superfície de vidro especial, que permite a passagem homogênea da luz e do calor, os

animais foram deixados sobre o aparato durante 1h para adaptação ao ambiente. Após esse

período, uma fonte de luz infravermelha com potência previamente estabelecida de 50 watts

foi posicionada sob a pata traseira direita do animal. Já com o animal posicionado, a luz

infravermelha foi acionada simultaneamente com um cronômetro eletrônico, possibilitando a

contagem do tempo e do estímulo ao mesmo tempo. Quando o animal exibiu uma resposta

positiva (“flinch” ou retirada da pata) a fonte de luz e o relógio pararam automaticamente.

Um tempo máximo de 20 segundos de exposição da pata ao raio infravermelho foi

utilizado para evitar danos teciduais. Em cada animal foram realizadas duas medidas, sendo

estas obtidas no intervalo de 5 a 10 minutos e a média destas medidas representaram a

latência de retirada da pata. A hiperalgesia ao calor foi avaliada antes da administração do

paclitaxel (valores basais), e após diferentes tempos da administração da droga (2, 4, 6, 24, 48

e 72 horas) e os valores obtidos foram expressos em segundos (s).

5.5 Delineamento experimental

5.5.1 Avaliação da hiperalgesia mecânica e térmica no modelo de síndrome da dor aguda

induzida pelo paclitaxel

Para verificar se o paclitaxel era capaz de induzir hiperalgesia mecânica e térmica,

foram utilizados camundongos C57BL/6 selvagens. Os animais foram divididos em dois

grupos, cada grupo contendo 6 animais. O primeiro recebeu uma dose única de paclitaxel

(4mg/kg) por via intravenosa (i.v.) e o segundo grupo recebeu veículo (cremophor EL +

álcool absoluto). Em seguida os camundongos foram avaliados através da utilização dos testes

56

comportamentais nos diferentes tempos (1, 2, 4, 6, 24, 48 e 72 horas) após os tratamentos

(Figura 3).

Figura 3 – Delineamento esquemático do protocolo experimental 1

Os camundongos foram divididos em dois grupos, cada grupo contendo 6 animais. O primeiro recebeu

uma dose única de paclitaxel (4mg/kg) por via intravenosa (i.v.) e o segundo grupo recebeu veículo.

Em seguida os camundongos foram avaliados através da utilização dos testes comportamentais nos

diferentes tempos (1, 2, 4, 6, 24, 48 e 72 horas) após os tratamentos.

Fonte: Elaborado pelo próprio autor.

5.5.2 Investigação da participação de mastócitos na síndrome dolorosa aguda induzida por

paclitaxel

Para averiguar o possível envolvimento dos mastócitos na síndrome de dor aguda

induzida por paclitaxel, foram utilizados camundongos C57BL/6 selvagens divididos

aleatoriamente em 2 grupos: paclitaxel e veículo, cada grupo contendo 6 animais. O mesmo

ocorreu para camundongos SH (mutantes com deficiência em mastócitos). Após o tratamento

dos animais com paclitaxel ou veículo, foram avaliadas a hiperalgesia mecânica e térmica nos

tempo de 2, 4, 6 e 24h (Figura 4).

GRUPOS

Camundongos selvagens

C57BL/6

(n = 6)

Paclitaxel (4mg/kg, i.v.)

ou

Veículo (i.v.)

Von Frey

Teste da acetona

Hargreaves

57


Camundongos selvagens (C57BL/6) foram divididos aleatoriamente em 2 grupos, cada grupo

contendo 6 animais. O primeiro foi tartado com paclitaxel e o segundo grupo foi tratado com o

veículo. O mesmo ocorreu para camundongos SH (mutantes, que sãodeficientes para mastócitos).

Após o tratamento, os animais de ambos os grupos foram submetidos a avaliação da hiperalgesia

mecânica e térmica nos tempo de 2, 4, 6 e 24h.


5.5.3 Avaliação do efeito do cromoglicato de sódio na síndrome dolorosa aguda induzida

pelo paclitaxel

Foram utilizados camundongos C57BL/6 selvagens divididos aleatoriamente em 2

grupos, cada grupo com 6 animais. Um grupo foi pré-tratado com cromoglicato de sódio

(30mg/kg) diluído em soro fisiológico e administrado via intra-peritonial (i.p.) diariamente,

durante 3 dias consecutivos (KIMURA et al., 2015). Outro grupo, denominado grupo controle

recebeu soro fisiológico ao invés da droga pela mesma via e período. Após o término do

tratamento, os animais de ambos os grupos foram injetados com paclitaxel ou veículo e a

hiperalgesia mecânica e térmica foram avaliadas nos tempo de 2, 4, 6 e 24h após a

administração dos estímulos (Figura 5).

GRUPOS

Camundongos Selvagens

C57BL/6

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

Veículo (i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

Camundongos

SH

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

Veículo (i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

58


Camundongos selvagens (C57BL/6) foram divididos aleatoriamente em 2 grupos, cada grupo com 6

animais. Um grupo foi pré-tratado com cromoglicato de sódio (30mg/kg) administrado via i.p.

diariamente, durante 3 dias consecutivos. Outro grupo, denominado grupo controle recebeu soro

fisiológico nas mesmas condições que o grupo tratado com a droga. Após o término do tratamento, os

animais de ambos os grupos foram injetados com paclitaxel ou veículo e a hiperalgesia mecânica e

térmica (frio) foram avaliadas nos tempo de 2, 4, 6 e 24h após a administração dos estímulos. Fonte:

Elaborado pelo próprio autor.

5.5.4 Investigação da participação de citocinas na síndrome da dor aguda induzida pelo

paclitaxel

Camundongos C57BL/6 selvagens foram aleatoriamente divididos em 2 grupos,

cada grupo contendo 6 animais. Os grupos foram tratdos com paclitaxel ou veículo. O mesmo

ocorreu para camundongos deficientes (knockouts) para IL-6 (IL-6-/-) e para os camundongos

deficientes para os receptores IL-1β (IL-1R-/-), TNF-α (TNFR1/R2-/-) e MCP-1 (CCR2-/-).

Após o tratamento com paclitaxel ou veículo, foram avaliadas a hiperalgesia mecânica e

térmica (frio) nos tempo de 2, 4, 6 e 24h após a administração dos estímulos (Figura 6).

Camundongos Selvagens

C57BL/6

Cromoglicato de sódio

(10mg/kg, i.p.)

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

Veículo (i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

Veículo (i.p.)

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

Veículo (i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

59


Camundongos selvagens (C57BL/6 ) foram aleatoriamente divididos em 2 grupos, cada grupo

contendo 6 animais. Os grupos foram tratados com paclitaxel ou veículo. O mesmo ocorreu para

camundongos deficientes para IL-6 (IL-6-/-) e para os camundongos deficientes para os receptores IL-

1β (IL-1R-/-), TNF-α (TNFR1/R2-/-) e MCP-1 (CCR2-/-). Após o tratamento com paclitaxel ou

veículo, foram avaliadas a hiperalgesia mecânica e térmica (frio) nos tempo de 2, 4, 6 e 24h após a

administração dos estímulos. Fonte: Elaborado pelo próprio autor.

Em outro delineamento experimental, camundongos C57BL/6 selvagens;

camundongos C57BL/6 selvagens foram pré-tratados com Tocilizumabe (8mg/kg) ou com o

seu veículo 30 minutos antes da administração de paclitaxel e em seguida foram

aleatoriamente divididos em grupos, cada grupo contendo 6 animais. O tocilizumabe (TCZ) é

um anticorpo monoclonal humanizado que se liga ao receptor de IL-6, inibindo o efeito

biológico da IL-6 (SINGH; BEG; LOPEZ-OLIVO, 2011). A dose recomendada de utilização

é de 8mg/kg de peso por dose (MOTA et al., 2012 ).

Após o tratamento, os grupos foram injetados com paclitaxel ou veículo e a

hiperalgesia mecânica e térmica (frio) foram avaliadas nos tempo de 1, 2, 4, 6 e 24h após a

administração dos estímulos (Figura 7).

GRUPOS

Camundongos

Selvagens

C57BL/6

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

Veículo (i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

Camundongos

(IL-6-/-; IL-1R-/-; TNFR1/R2 -/- e CCR2-/-)

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

Veículo (i.v.)

Von Frey

e

Teste da acetona

60


Camundongos selvagens (C57BL/6); camundongos selvagens (C57BL/6) foram pré-tratados com

Tocilizumabe (8mg/kg) ou com o seu veículo e em seguida foram aleatoriamente divididos em grupos,

cada grupo contendo 6 animais. Após o tratamento, os grupos foram injetados com paclitaxel ou

veículo e a hiperalgesia mecânica e térmica (frio) foram avaliadas nos tempo de 2, 4, 6 e 24h após a

administração dos estímulos. Fonte: Elaborado pelo próprio autor.

5.5.5 Coleta de sangue venoso periférico, nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal e medula

espinal

Os animais foram anestesiados, via intraperitoneal (i.p), com uma mistura de

Ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg); em seguida, foi realizada a coleta de sangue

através do plexo retro-orbital. O sangue então foi armazenado em tubos e acondicionado no

gelo. Após a coleta de sangue, procedeu-se a perfusão intracardíaca com solução de PBS. A

medula espinal lombar (L3 – L6), os gânglios da raiz dorsal (GRD; segmentos entre L3 – L5)

e o nervo isquiático foram removidos 2, 4, 6 e 24 horas após a administração de paclitaxel.

Em seguida, os tecidos foram acondicionados em gelo seco e posteriormente, todas as

GRUPOS

Camundongos

Selvagens

C57BL/6

_____

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.) ou

Veículo

Von Frey

e

Teste da acetona

Camundongos

Selvagens

C57BL/6

Tocilizumabe

(8mg/kg, i.p.)

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.) ou

Veículo

Von Frey

e

Teste da acetona

Veiculo (i.p.)

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.) ou

Veículo

Von Frey

e

Teste da acetona

61

amostras coletadas foram acondicionadas em freezer, à temperatura de -80°C para realização

dos ensaios de RT-PCR e/ou ELISA. Os mesmo experimentos realizados foram utilizados

camundongos knockout para o receptor TLR4, divididos em dois grupos, o primeiro grupo

recebeu PCX e segundo grupo recebeu veículo, após o tratamento seguiram-se os mesmo

procedimentos descritos anteriormente (Figura 8).


Os animais foram tratados com as respectivas drogas, em seguida anestesiados para a coleta de

sangue. Após a coleta de sangue, procedeu-se a perfusão intracardíaca para remoção da medula espinal

lombar (L3 – L6), gânglios da raiz dorsal (GRD; segmentos entre L3 – L5) e nervo isquiático e

posteriormente, todas as amostras coletadas foram acondicionadas em freezer, à temperatura de -80°C

para realização dos ensaios de RT-PCR e/ou ELISA. Num outro momento, foram utilizados

camundongos knockout para o receptor TLR4, os animais foram divididos em 2 grupos, o primeiro

grupo recebeu PCX e segundo grupo recebeu veículo, após o tratamento seguiram-se os mesmo

procedimentos descritos anteriormente. Fonte: Elaborado pelo próprio autor.

GRUPOS

Camundongos

Selvagens

C57BL/6

____

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.) ou

Veículo

Coleta das amostras

(2, 4, 6 e 24h)

PCR

ou

ELISA

Camundongos

Selvagens

C57BL/6

Cromoglicato de sódio

(30mg/kg, i.p.)

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.) ou

Veículo

Coleta das amostras

(2, 4, 6 e 24h)

ELISA

Veículo( i.p.)

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.) ou

Veículo

Coleta das amostras

(2, 4, 6 e 24h)

ELISA

Camundongos

SH

____

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.) ou

Veículo

Coleta das amostras

(2, 4, 6 e 24h)

ELISA

Camundongos

TLR4-/-

____

Paclitaxel

(4mg/kg, i.v.) ou

Veículo

Coleta das amostras

(2, 4, 6 e 24h)

ELISA

62

5.6 Cultura de mastócitos

Foram utilizadas células da linhagem de mastócitos de rato RBL-2H3 (MORITA;

SIRAGANIAN, 1981). A linhagem celular foi cultivada em meio essencial de Eagle

modificado por Dulbecco – DMEM (Invitrogen, Gibco, Carlsbad, CA, EUA), suplementado

com 10% de soro fetal bovino (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA), 0,434mg/mL de

glutamina, 100U/mL de penicilina e 100μg/mL de estreptomicina, como previamente descrito

(BASCIANO et al, 1986; PIERINI et al, 1996) e mantidas em atmosfera úmida contendo 5%

de CO2 a 37 ºC.

As células foram monitoradas com o auxílio de microscópio invertido DIAVERT -

Leitz (Leica Microsystemns, Wetzlar, Alemanha). Quando atingiram uma confluência de

90%, as células foram removidas dos frascos de cultivo utilizando-se Tripsina-EDTA

(Invitrogen) por 15 minutos a 37 ºC, em atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Em seguida,

as células foram centrifugadas a 200 g por cinco minutos, o sobrenadante foi descartado e o

sedimento ressuspendido em meio de cultura para posterior quantificação e padronização do

número de células. As células foram contadas e 1x105

células foram semeadas em placa de 96

poços, após 24 horas do plaqueamento, as células foram tratadas com paclitaxel (10, 30 ou 90

μM), veículo, PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) ou ionomicina (Ionóforo divalente de

cálcio que aumenta a permeabilidade das membranas celulares a íons cálcio). As culturas

foram mantidas a 37 ºC numa atmosfera saturada de água com 5% de CO2 e foram utilizadas

para o ensaio de Enzyme-Linked Immuno Assay (ELISA) para TNF-α, IL-6 e MCP-1, após 4

horas da incubação com paclitaxel, veículo, PMA ou ionomicina.

5.7 Cultura primária de células satélites gliais de gânglios da raiz dorsal

A cultura de células satélites gliais de GRD foi realizada conforme descrito por

Belzer, Shraer e Hanani (2010), com modificações. Para isso, foram utilizados camundongos

C57BL/6, os animais foram anestesiados e em seguida procedeu-se a eutanásia por

decaptação para remoção do sangue circulante. Foi então realizado a remoção dos músculos e

a parte óssea da coluna vertebral para expor a medula espinal e os GRD. Todos os gânglios

lombares e torácicos foram removidos e logo transferidos para um tubo de 2mL contendo

solução DMEM incompleto, pH 7,2, 2 °C. Após a coleta o tubo contendo os DRG foi

centrifugado a 400g por 10 min, 4° C, para realização da lavagem, a fim de remover possíveis

vestígios de sangue ou de outros tecidos. Em seguida o sobrenadante foi descartado e o pellet

de GRD foi incubado com colagenase tipo 1A (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA) em

solução de DMEM incompleto, pH 7,2, por 1h, a 37 ºC, e em seguida essa solução foi

63

centrifugada a 400g por 10 min, 4 °C. A solução de colagenase foi substituída por DMEM

completo (10% de soro fetal bovino) e os gânglios foram então triturados por pipetagens

repetidas até a completa homogeneização do tecido, e em seguida esta solução foi filtrada em

peneira de 100 µm. O filtrado foi centrigudado a 400g por 10 min, 4° C, e o pellet foi

ressupendido em DMEM completo, adicionando 1 mL de meio para cada camundongo que

foi utilizado. Os GRD foram alocados em placas de 48 poços num volume de 250 uL por

poço. A cultura foi mantida em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 a 37 ºC durante 7 dias

e o meio foi mudado pelo menos duas vezes por semana.

As culturas foram monitoradas utilizando um microscópio invertido DIAVERT -

Leitz (Leica Microsystemns, Wetzlar, Alemanha). Após o sétimo dia de cultivo as células

foram tratadas com paclitaxel (10, 30 ou 90 μM), veículo, PAm3cys, peptidioglicano ou LPS.

Em seguida, as culturas então foram mantidas a 37°C numa atmosfera saturada de água com

5% de CO2 e foram utilizadas para o ensaio de ELISA após 48 horas da incubação com

paclitaxel, veículo, PAm3cys, peptidioglicano ou LPS.

5.8 Expressão gênica por reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR)

5.8.1 Coleta de tecidos

Camundongos tratados com o PCX ou veículo foram sacrificados (0, 2, 4, 6 e 24

horas) após a injeção de PCX. Os animais foram anestesiados, com uma mistura de Ketamina

(100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg); e, depois, foi realizada a perfusão intracardíaca com

solução de PBS para a coleta das seguintes amostras teciduais: medula espinal lombar,

gânglios da raiz dorsal (GRD; segmentos entre L3 – L5) e nervo isquiático. Após a coleta, as

amostras foram colocadas em gelo seco e em seguida armazenadas no freezer (-80 ºC) até a

extração do RNA total.

5.8.2 Extração do RNA total

A extração do RNA total foi realizada através da homogeneização dos tecidos em

1 mL de reagente de Trizol® (Invitrogen, SP, Brazil), conforme recomendações do fabricante.

Em seguida foram adicionados 200 μL de clorofórmio ao homogenato, sendo este

posteriormente submetido à agitação e centrifugação (14.000 rpm, durante 15 minutos a 4°C).

Após a centrifugação, a fase aquosa contendo o RNA foi transferida para um novo tubo, no

qual foram adicionados 500 μL de álcool isopropílico. O conteúdo do tubo foi misturado por

inversão e posteriormente mantido em repouso. Em seguida submetido à centrifugação

64

(14.000 rpm, 15 minutos, 4°C), o sobrenadante foi desprezado e acrescentado 1 mL de etanol

gelado. O RNA foi novamente centrifugado (7.000 rpm, 10 minutos, 4°C), o etanol foi

desprezado e o precipitado dissolvido em água ultrapura. A concentração e a pureza do RNA

foi determinadas por leitura espectrofotométrica a 260/280 nm. O RNA total foi estocado a -

80°C até o momento do uso.

5.8.3 Confecção do DNA complementar (cDNA)

Para determinar a expressão do RNAm codificador para os genes de IL-1β, TNF-

α, IL-6, GFAP, Iba-1, CCR2 e MCP-1 em diferentes tecidos após o tratamento com PCX, foi

realizado o ensaio de transcrição reversa seguido pela reação em cadeia da polimerase em

tempo real (RT-PCR). Para a reação da transcrição reversa, amostras contendo 1μg de RNA

total foram incubadas com 1μL de oligo dT, 1μL do mix de dNTP (10 mM) em água ultrapura

para um volume final de 12μL. Inicialmente, as amostras foram aquecidas por 5min a 65°C,

resfriadas por 5min a 4 ºC e acrescidas de 4μL de tampão de primeira fita (Tris-HCl 250 mM,

pH 8,3, KCl 375mM e MgCl2 15mM), 2μL de DTT 0,1mM e 1μL de inibidor de RNase

(2500 U). Posteriormente, essa mistura foi incubada a 37 ºC durante 2 minutos e a enzima M-

MLV (1μL, 200 U) foi adicionada. Após a adição da enzima, as amostras foram mantidas a 37

ºC durante 50 minutos e a inativação da reação foi realizada através da incubação das

amostras a 75 ºC durante 15 minutos. O cDNA foi estocado a -20 ºC até a realização da

reação de RT-PCR.

5.8.4 Reação em cadeia da polimerase em tempo real - PCR

O cDNA foi amplificado em duplicata utilizando o kit Master Mix Sibr Green®

Universal PCR, com sondas específicas para camundongos, de IL-1β, TNF-α, IL-6, GFAP,

Iba-1, CCR2 e MCP-1 e GAPDH utilizado como controle endógeno. A reação de PCR foi

realizada em placa de reação óptica de 96 poços. Cada reação continha: 1μL de cDNA,

3,1375μL de master mix, 0,5μL de primer e 1,6125μL de água ultrapura, em um volume final

de 6,25μL. As amplificações foram realizadas em um termociclador (StepOne Plus, Applied

Biosystems) para 60 ciclos. A fluorescência foram coletada a cada ciclo de amplificação e os

dados foram analisados utilizando o método 2-ΔΔCt

para a quantificação relativa. Os Primers

foram projetados com base em sequências de RNAm obtidas a partir do National Center for

Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), como se segue no quadro 1.

65

Quadro 1 – Sequência de primers utilizados no RT-PCR

Alvos Primers

IL-1β

5’ - TGACAGTGATGAGAATGACCTGTTC - 3’ (F)

5’ – TTGGAAGCAGCCCTTCATCT - 3’ (R)

TNF-α

5’ – AGGGATAGAAGTTCCCAAATG – 3’ (F)

5’ – GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA – 3’ (R)

IL-6

5’ – TTCCTACCCCAATTTCCAAT – 3’ (F)

5’- CCTTCTGTGACTCCAGCTTATC – 3’ (R)

MCP-1

5’ – TAGAGATTGAGCTGTCTGCTCATTC – 3’ (F)

5’ – CCTAAAGTATGGGCTGGACTGTTT 3’ (R)

CCR2

5’- AGGGGGCCACCACACCGTATGA - 3’ (F)

5’- CATGTTGCCCACAAAACCAAAGATGAA - 3’(R)

GAPDH

5’- CATCTTCTTGTGCAGTGCCA - 3’(F)

5’- CGGCCAAATCCGTTCAC- 3’(R)

Sequência (Foward – “F”/ Reverse – “R”) dos primers utilizados no estudo na reação de RT-PCR.

5.9 Dosagem de TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1

5.9.1 Coleta das amostras

Camundongos C57BL/6 selvagens; camundongos C57BL/6 selvagens pré-

tratados com cromoglicato de sódio ou com o seu veículo, camundongos SH e camundongos

TLR4-/- foram aleatoriamente divididos em 2 grupos. Os camundongos foram então tratados

com PCX ou veículo e foram eutanasiados (0, 2, 4 e 6 horas) após a injeção de PCX ou

veículo. Os animais foram anestesiados, via intraperitoneal (i.p), com uma mistura de

Ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg); em seguida, foi realizada a coleta do sangue no

plexo retro-orbital. O sangue então foi armazenado em tubos e centrifugado para separação do

plasma que foi acondicionado no gelo. Após a coleta de sangue, procedeu-se a perfusão

intracardíaca com solução de PBS para a coleta das seguintes amostras teciduais: medula

espinal lombar, gânglios da raiz dorsal (GRD; segmentos entre L3 – L5) e nervo isquiático.

66

Após a coleta, todas as amostras foram congeladas (-80 ºC) até a realização do ensaio de

ELISA.

5.9.2 Preparação de amostras para análise de citocinas/quimiocinas no plasma

Os camundongos tratados de acordo como descrito anteriormente foram

eutanizados nos tempos conforme mencionados anteriormente. O sangue total foi colhido pelo

plexo retro-orbital, transferido para microtubos contendo 50µL de heparina e colocados no

gelo e em seguida as amostras foram centrifugadas a aproximadamente 6.000g durante 10

minutos. O plasma separado foi armazenado a -80 ºC até a análise.

5.9.3 Homogenato de Tecidos

Nos pontos de tempo indicados acima, os mesmos camundongos a partir dos quais

o plasma foi recolhido, foram eutanasiados e as amostras (nervo isquiático, gânglios da raiz

dorsal e medula espinal) foram removidas e armazenadas a -80 ºC até à análise. Os tecidos

foram homogeneizados como descrito em Famakin et al., (2012). Resumidamente, as

amostras foram homogeneizadas em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) (pH 7,4),

contendo coquetel de inibidor de protease 1 X (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e 0,2%

de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA), durante 30 segundos, utilizando um

homogeneizador básico IKA T 10 (IKA Works, Wilmington, NC, EUA), todo processo de

hogeneização foi realizado no gelo. Os homogenatos resultantes foram centrifugados a

15.000g durante 30 minutos, a 4 ºC, e os sobrenadantes foram recolhidos e armazenados a -80

ºC até à análise de citocinas/quimiocinas por ELISA.

5.9.4 Preparação de amostras para análise de citocinas/quimiocinas de cultura de

mastócitos (RBL-2H3)

As células foram semeadas em placa de 96 poços em número de 1x105, após 24

horas do plaqueamento, as células foram tratadas com paclitaxel (10, 30 ou 90 μM), veículo,

PMA ou ionomicina. As culturas foram mantidas a 37ºC numa atmosfera saturada de água

com 5% de CO2. Após 4 horas de estimulação da cultura de mastócitos (RBL-2H3), com

paclitaxel, veículo, PMA ou ionomicina, o sobrenadante foi coletado e estocado a -20 ºC até a

realização do ensaio.

67

5.9.5 Preparação de amostras para análise de citocinas/quimiocinas de cultura primária de

células satélites gliais

As células foram semeadas em placa de 96 poços, após o sétimo dia de cultivo as

células foram tratadas com paclitaxel (10, 30 ou 90 μM), veículo, PAm3cys, peptidioglicano

ou LPS. As culturas foram mantidas a 37 ºC numa atmosfera saturada de água com 5% de

CO2 e após 48h de incubação foram utilizadas para o ensaio de ELISA após 48 horas da

incubação com paclitaxel, veículo, PAm3cys, peptidioglicano ou LPS. O sobrenadante foi

coletado e estocado a -20 ºC até a realização do ensaio.

5.9.6 Determinação de citocinas/quimiocinas por ELISA

O plasma, os extratos homogeneizados de nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal

e medula espinal, os sobrenadantes de cultura de mastócitos (RBL-2H3) e da cultura primária

de células satélites gliais foram analisados para averiguar a produção/liberação de citocinas.

Foram avalidas as seguintes citocinas e quimiocinas: TNF-α, IL1-β, IL-6, KC/CXCL1 e

MCP-1, utilizado o método de ELISA.

Placas de 96 poços para ELISA foram incubadas over-nigth em temperatura

ambiente com 2μg/mL de anticorpo de captura diluído em PBS (pH 7.4) – 50 μL/poço. Em

seguida foram realizadas duas lavagens das placas com PBS – Tween 20, 0,05%. Após a

primeira lavagem é realizado o bloqueio com albumina bovina sérica (BSA) 1% diluída em

PBS, 100μl/poço por 2h à temperatura ambiente. Em seguida, duas lavagens das placas.

Procedeu-se então a incubação com a curva padrão das citocinas diluídas na solução de

PBS/BSA 1% e das amostras a serem dosadas (50μL/poço por over-nigth à 4 ºC). Mais duas

lavagens foram realizadas. Posteriormente houve a incubação com anticorpo biotinilado

diluído a em PBS/BSA 1% por 2h em temperatura ambiente. E duas lavagens das placas,

seguida de incubação com estreptoavidina diluída 1:40 em PBS/BSA 1% (100μL/poço) por

1h à temperatura ambiente. Em seguida procederam-se duas lavagens das placas e incubação

com o agente revelador 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB), 100μl/poço. A placa é coberta

e deixada no escuro por 5-20 minutos em temperatura ambiente. A reação é parada com

50μL/poço de H2SO4 4M. A leitura foi feita em espectrofotômetro a 450 nm. E os resultados

são expressos em pg/mL/mg proteína.

68

5.10 Imunofluorescência

5.10.1 Coleta e preparação das amostras

Os animais foram anestesiados, via intraperitoneal, com uma mistura de ketamina

(100mg/kg) e xilazina (10 mg/kg); e, depois, foi realizada a perfusão intracardíaca com 40 mL

de solução tampão fosfato-salino (Phosphate Buffered Saline - PBS) e 40 mL de solução de

paraformaldeído (PFA) 4%. A medula espinal lombar e o gânglio da raiz dorsal (L5) foram

removidos e, em seguida, foi feita a crioproteção em sacarose 30% por 2 dias. Depois, os

tecidos foram acondicionados com tissue-tek®, em freezer, à temperatura de - 80°C.

5.10.2 Imunofluorescência para Triptase, IL-6 e c-Fos

Com os tecidos extraídos, foram feitos cortes com espessura de 10 μm (para gânglios)

ou 20 μm (para medula) no criostato (Leica CM1850), à temperatura de - 24°C. Os cortes foram

fixados por 2 minutos em metanol e ficaram imersos em PBS até o momento de iniciar a

imunofluorescência. Em seguida, foi feita a recuperação antigênica com tampão citrato 0,1M

(pH 6,0), sob aquecimento em forno micro-ondas, por 15 minutos, à temperatura de 95°C.

Após o resfriamento, obtido em temperatura ambiente, por 20 minutos, foi feita a

permeabilização da membrana nuclear (para Triptase, IL-6 e c-Fos) com triton X-100 (0,1%)

e foi feito o bloqueio com albumina sérica bovina (BSA) 5% acrescida de glicina 0,3M por 30

minutos para todas as lâminas. Os cortes foram lavados com PBS e incubados, durante a

noite, à temperatura de 4°C, com o anticorpo primário feito em coelho anti-Triptase

(Abcam®) ou anti-IL-6 (Santa Cruz Biotechnology®) ou anti-c-Fos (Santa Cruz

Biotechnology®) na diluição 1:200 em BSA 5%. As lâminas foram lavadas e incubadas,

durante 1 hora e 30 minutos, com o anticorpo secundário anti-igG de coelho Alexa flúor 568

(Invitrogen®) na diluição de 1:400 em BSA 5%. Para a marcação dos corpos neuronais, os

cortes foram incubados, durante 1 hora e 30 minutos, com o anticorpo NeuN conjugado com

Alexa Flúor 488 (Merck Millipore®) na diluição de 1:100 em BSA 5%. Em seguida, as

lâminas foram lavadas com PBS, montadas com “Prolong Gold” (Invitrogen®) e fotografadas

no microscópio confocal (LM 710, Zeiss).

A quantificação da área marcada nas fotos foi feita diferenciando as áreas

marcadas (pixels) pela maior saturação de cor associada à marcação (vermelha ou verde).

Para isso, foi utilizado o programa Fiji Image J. O procedimento foi baseado na saturação da

cor associada à marcação positiva para um determinado marcador. Os limites necessários para

definição de pixels marcados e não marcados foram definidos previamente. Para a

quantificação da área marcada foram utilizadas quatro fotos (de animais diferentes) por grupo

69

experimental. Os resultados dessa quantificação foram apresentados em porcentagem, a qual

foi calculada a marcação positiva de um determinado marcador em relação à área total da

foto, que foi considerada 100%. Os marcadores quantificados foram Triptase, IL-6 e c-Fos; o

NeuN foi utilizado para marcar os corpos neuronais, de modo que a co-marcação (“merge”)

foi utilizada para mostrar se os neurônios estariam expressando Triptase, IL-6 e c-Fos.

5.11 Análise estatística

Os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média (E.P.M.) de

3-6 animais para os experimentos moleculares e de 6-10 animais para os experimentos

comportamentais (conforme indicado em cada experimento). As porcentagens de inibição

estão apresentadas como a média ± erro padrão das inibições obtidas para cada experimento

individual. A análise estatística dos experimentos comportamentais com decurso temporal foi

realizada por meio de analise de variância (ANOVA) de duas vias com medidas repetidas,

seguida pelo teste de Bonferroni. Valores de P menores que 0,05 (p<0,05) foram considerados

como indicativos de significância. Todas as analises estatísticas foram realizadas através do

programa GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, EUA).

70

6. RESULTADOS

71

6.1 Paclitaxel induz hiperalgesia mecânica e térmica (frio) em camundongos.

Para verificar se a administração intravenosa de paclitaxel era capaz de induzir

hiperalgesia aguda em camundongos, foram realizados testes nociceptivos comportamentais.

Observou-se que uma única injeção i.v. de paclitaxel foi capaz de reduzir (p<0,05) o limiar de

retirada da pata a estímulos mecânicos (filamento de von Frey, gráfico 1A), bem como

induziu um comportamento nocifencivo ao frio (teste da acetona, gráfico 1B). No entanto,

quando se avaliou a resposta térmica ao calor, verificou-se que a latência de retirada da pata

não foi alterada com o tratamento com paclitaxel, quando comparadas ao grupo controle

(Gráfico 1C). As respostas hiperalgesicas mecânica e térmica ao frio começaram dentro de 2

horas e atingiram o pico entre 4 e 6 horas, se resolvendo 24 horas após a administração do

paclitaxel (Gráfico 1A e 1B, respectivamente). Enquanto isso, o limiar de retirada da pata a

estímulos mecânicos do grupo controle permaneceu inalterado, assim como o comportamento

nocifensivo ao frio. Entretanto, em 24, 48 ou 72 horas após a administração única de

paclitaxel não foi observado respostas hiperalgesicas mecânica e térmica (Gráfico 1A e 1B,

respectivamente).

72

Gráfico 1: Paclitaxel induz hiperalgesia mecânica e térmica em camundongos

(A) Limiar de retirada da pata em resposta ao estímulo mecânico. (B) Resposta nocifenciva ao estímulo térmico

ao frio. (C) Latência de retirada da pata ao estímulo térmico ao calor. As respostas hiperalgesicas foram

avaliadas em diferentes tempos (1, 2, 4, 6, 24, 48 ou 72 horas) após a administração de paclitaxel (PCX) ou

veículo. Os valores basais (descritos como “B” nos gráficos) foram determinados antes da administração de PCX

ou veículo. Os dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05: quando

comparado com animais tratados com veículo ou os valores basais, ANOVA de duas vias seguida por teste post-

hoc de Bonferroni.

73

6.2 Imunofluorescência para c-Fos em gânglio da raiz dorsal de camundongos

submetidos à injeção de paclitaxel

Na imunofluorescência para c-Fos, no gânglio da raiz dorsal, foi observado um

aumento da imunoexpressão nas em células que morfologicamnete assemelham-se a células

satélites. Esta marcação está aumentada nas células satélites de neurônios nos grupos tratado

com paclitaxel 4 e 6 horas, após o tratamento. Este aumento da imunoexpressão é evidenciado

quando comparado com o grupo controle (naive) (Figura 9). Na análise quantitativa da

imunoexpressão para c-Fos, a quantificação da área marcada, comparando com o grupo

controle, houve um aumentou significativo (p<0,05) no grupo tratados com paclitaxel, 4 e 6

horas, após o tratamento (Gráfico 2).

74

Figura 9: Fotomicrografia da imunoexpressão de c-Fos no gânglio da raiz dorsal de

camundongos submetidos à administração de paclitaxel

Verde: NeuN (marcador de neurônio); vermelho: c-Fos; amarelo: fusão (MERGE); A, B e C: Naive

normal, sem tratamento; D, E, F: Paclitaxel 4h; G, H e I: paclitaxel 6 h. Setas brancas: marcação para

c-FOS em células não neuronais do GRD. Cabeça de seta branca: marcação para c-Fos em neurônios

do GRD. Cabeça de setas amarelas: co-marcação c-FOS e NeuN em neurônios GRD. Foto

representativa de 1 animal por grupo experimental. Aumento de 200x.

Naive

PCX-4h

PCX-6h

75

Gráfico 2: Análise quantitativa da imunoexpressão para c-Fos no gânglio da raiz dorsal de


A figura representa a quantificação da área marcada pela imunoexpressão de c-Fos. Os resultados são

apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). O grupo tratado com PCX (4 e 6 horas após

o tratamento) são comparados ao grupo controle (naive). *p<0,05: quando comparado com o grupo

controle, ANOVA de uma via seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

6.3 Imunofluorescência para c-Fos em corno dorsal da medula espinal de camundongos

submetidos à injeção de paclitaxel.

Na imunofluorescência para c-Fos, no corno dorsal da medula espinal, foi

observado um aumento da imunoexpressão nos grupos tratados com paclitaxel quando

comparado ao grupo controle (Figura 10).

Na análise quantitativa da imunoexpressão no corno dorsal da medula espinal,

houve diferença significativa (p<0,05) 6 horas após o tratamento com paclitaxel, quando

comparado com o grupo controle (Gráfico 3).

76

Figura 10: Fotomicrografia da imunoexpressão de c-Fos no corno dorsal da medula espinal de


Verde: NeuN (marcador de neurônio); vermelho: c-Fos; laranja: fusão (MERGE); A, B e C: Naive

normal, sem tratamento; D, E, F: Paclitaxel 4h; G, H e I: paclitaxel 6 h. Setas brancas: marcação para

c-FOS em neurônios do corno dorsal da medula espinal. Setas amarelas: co-marcação c-FOS e NeuN

em neurônios do corno dorsal da medula espinal. Foto representativa de 1 animal por grupo

experimental. Aumento de 200x.

Naive

PCX-4h

PCX-6h

77

Gráfico 3: Análise quantitativa da imunoexpressão para c-Fos no corno dorsal da medula

espinal de camundongos submetidos à administração de paclitaxel

O gráfico representa a quantificação da área marcada pela imunoexpressão de c-Fos no corno dosal da

medula espinal. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). O grupo

tratado com PCX (4 e 6 horas) são comparados ao grupo controle (naive). *p<0,05: quando

comparado com o grupo controle; #p<0,05: quando comparado com o grupo PCX 6h, ANOVA de

uma via seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

78

6.4 Quantificação de citocinas e quimiocinas em camundongos tratados com paclitaxel.

Mediante o resultado mostrando a indução de hiperalgesia aguda por paclitaxel,

procurou-se investigar a participação de mediadores da inflamação/hiperlagesia aguda nesse

fenômeno. Assim foram quantificadas as citocinas e quimiocinas no plasma, nervo isquiático,

gânglios da raiz dorsal e medula espinal de camundongos tratados com PCX pelo método de

ELISA. A quantificação dos mediadores da inflamação/hiperlagesia aguda é apresentada nos

gráficos 2, 3, 5 e 7, respectivamente.

Adicionalmente foi quantificada a expressão relativa de mediadores da

inflamação/hiperlagesia aguda no modelo de dor aguda induzida por PCX, através do método

de RT-PCR em amostras de nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal e medula espinal. Os

RNAm das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-6, e da quimiocina MCP-1 e do seu

receptor CCR2 foram expressos (Gráficos 4, 6 e 8, respectivamente), e seus perfis de

expressão foram alteradas com o tratamento com PCX.

6.4.1 Quantificação de citocinas e quimiocinas no plasma.

A administração de paclitaxel provocou aumento significativo (p<0,05) das

citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-6 no plasma de camundongos quando

comparados ao grupo naive. Os valores estão representados nos gráficos 4A, 4B e 4C,

respectivamente. Da mesma forma, também foi observado aumento significativo (p<0,05) da

quimiocina KC/CXCL1 (Gráfico 4D) quando comparados com o grupo naive. Foi observado

um aumento significativo (p<0,05) da IL-β (Gráfico 4A) a partir de 4 horas após

administração de paclitaxel, com pico 6 horas após o tratamento, retornando aos valores

basais 24 horas depois da administração. Já o TNF-α (Gráfico 4B) aumentou

significativamente (p<0,05), a partir de 2 horas e manteve-se até 24 horas após a

administração de paclitaxel. Quando se avaliou a IL-6, foi obervado um aumento

signignificativo (p<0,05) desta citocina 4 horas após a administração de PCX, e 6 horas após

a administração a concentração desta citocina começa a cair, retornando aos valores basais 24

horas após a administração. Os níveis de KC/CXCL1 aumentaram significativamente

(p<0,05) a partir de 2 horas após a administração de paclitaxel, foi observado uma pequena

redução da concentração, no entanto, os valores mantiveram-se significativamente altos

(p<0,05) até a 24ª hora após a administração da droga.

79

Gráfico 4: Paclitaxel induz aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1 no plasma

(A) Quantificação de IL-1β. (B) Quantificação de TNF-α. (C) Quantificação de IL-6. (D)

Quantificação de KC/CXCL1. A quantificação foi determinada pelo método de ELISA. Os dados

foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05: quando comparado com o

grupo naive, ANOVA de uma via seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

6.4.2 Quantificação de citocinas e quimiocinas no nervo isquiático.

A administração de paclitaxel provocou aumento significativo (P<0,05) das

citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-6 no nervo isquiático de camundongos em

relação ao naive, os valores estão representados nos gráficos 5A, 5B e 5C. Da mesma forma,

também foi observado aumento significativo (p<0,05) das quimiocinas MCP-1 e

KC/CXCL1(Gráficos 5D e 5E, respectivamente) quando comparados com o grupo naive.

Duas horas após a administração de paclitaxel, a IL-1β (Gráfico 5A), começou a aumentar e

80

manteve-se alto até 6 horas depois da administração. Pode ser observado que esta citocina foi

reduzindo com o avanço do tempo, e com 24 horas após a administração a IL-1β retornou ao

valor basal em comparação ao naive. O TNF-α, mostrou-se alterado a partir de 2 horas

(Gráfico 5B) depois da administração de paclitaxel, no entanto um aumento significativo

(p<0,05) só foi observado 4 horas após a administração da droga. Daí em diante a

concentração de TNF-α começou a reduzir, não sendo obervado diferença signifivcativa com

6 e 24 horas após a administração do paclitaxel, apesar das concentrações terem se mantidas

elevadas. Após a administração de paclitaxel a IL-6 (Gráfico 5C) começou a aumentar no

nervo isquiático, entretanto, só foi detectado diferença significativa (p<0,05) 4 horas depois

da administração. A partir de 6 horas a concentração caiu e com 24 horas após o tratamento os

níveis retornaram aos valores basais. Quanto aos níveis das quimiocinas MCP-1 (Gráfico 5D)

e KC/CXCL1 (Gráfico 5E), ambas estavam alteradas a partir de 2 horas após o tratamento

com paclitaxel. MCP-1(Gráfico 5D) manteve um aumento significativo (p<0,05) até 6 horas

depois da administração de paclitaxel e houve uma leve redução 24 horas após o tratamento,

neste momento não houve diferença estatística quando comparado ao naive. Já a concentração

de KC/CXCL1(Gráfico 5E) foi reduzida a partir da 6 horas após a administração de

paclitaxel, o que também foi observado em 24 horas.

81

Gráfico 5: Paclitaxel induz aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL no nervo

isquiático

(A) Quantificação de TNF-α. (B) Quantificação de IL-1β. (C) Quantificação de IL-6. (D)

Quantificação de MCP-1. (E) Quantificação de KC/CXCL1. A quantificação foi determinada pelo

método de ELISA. Os dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05:

quando comparado com grupo naive, ANOVA de uma via seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

6.4.3 Expressão relativa de RNAm para citocinas e quimiocinas em nervo isquiático.

Foi avaliado se o tratamento com paclitaxel altera a expressão gênica das citocinas

pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-6 no nervo isquiático de camundongos tratados com

paclitaxel. Para isso, detectou-se a expressão basal do RNAm para estas citocinas no nervo

isquiático, conforme observado no gráfico 6. O tratamento com paclitaxel induziu um

aumento significativo (p<0,05) da expressão relativa do RNAm para a IL-6 (Gráfico 6C)

quando comparados ao naive. No entanto, não houve aumento significativo na expressão das

citocinas IL-1β e TNF-α (Gráficos 6A e 6B).

Apesar de se observar uma tendência ao aumento na expressão relativa de RNAm

da IL-1β (Gráficos 6A) a partir de 2 horas após o tratamento com paclitaxel, esse aumento

não foi suficiente para que ocorresse uma expressão significativa dessa citocina, que

permaneceu nos níveis basais em todos os demais pontos temporais avaliados. A expressão

relativa de RNAm de TNF-α (Gráfico 6B), manteve-se em níveis basais até 4 horas após o

tratamento com paclitaxel, observando-se um aumento na expressão relativa de RNAm da

82

citocina 6 horas após a administração de paclitaxel, no entanto esse aumento na expressão

relativa de RNAm da citocina não foi significativamente diferente do naive. Observa-se ainda

que com 24 horas após o tratamento a expressão relativa do RNAm da citocina retorna ao

nível basal, quando comparado ao naive.

Com relação a IL-6 (Gráfico 6C) o tratamento com paclitaxel induziu aumento

significativo da expressão relativa do RNAm para esta citocina (p <0,05) quando comparados

ao naive. Observa-se um aumento na expressão relativa do RNAm de IL-6 a partir de 2 horas

após a administração de paclitaxel, porém um aumento significativo só é detectado 4 horas

após o tratamento com paclitaxel (p <0,05), mantendo-se até 6 horas e retornando a níveis

basais 24 horas após administração do paclitaxel.

83

Gráfico 6: Paclitaxel aumenta a expressão relativa de RNAm de IL-6 no nervo isquiático

(A) Expressão relativa de RNAm para IL-1β. (B) Expressão relativa de RNAm para TNF-α. (C)

Expressão relativa de RNAm para IL-6. Os dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-

6 animais. *P <0,05: quando comparado com o grupo naive, ANOVA de uma via seguida por teste

post-hoc de Bonferroni.

84

6.4.4 Quantificação de citocinas e quimiocinas nos gânglios da raiz dorsal.

Observou-se que no grupo tratado com paclitaxel, houve um aumento

significativo (p<0,05) das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 nos gânglios da raiz

dorsal em comparação ao grupo naive (Gráfico 7B e 7C). Neste mesmo grupo, observou-se

ainda aumento significativo (p<0,05) da quimiocina KC/CXCL1 (Gráfico 7E) quando

comparados com o grupo naive. Porém a concentração da citocina IL-1β e da quimiocina

MCP-1 não foram aumentadas significativamente pela administração de paclitaxel (Gráficos

7A e 7D). A IL-1β (Gráfico 7A), aumentou moderadamente em relação ao naive, não sendo

observados aumentos significativos nos pontos de tempo avaliados. Já o TNF-α aumentou

significativamente (p<0,05) 2 horas após a administração de paclitaxel, esse aumento foi

observado até 6 horas, reduzindo significativamente 24 horas após a administração de

paclitaxel. A IL-6 teve aumento significativo (p<0,05) em 2 horas após a administração de

paclitaxel e esse aumento também foi observado com 4 horas depois do paclitaxel, com 6

horas não foi mais observada diferença significativa na concentração de IL-6, quando

comparado ao naive, e 24 horas depois da injeção de paclitaxel a concentração de IL-6 nos

GRD praticamente retornou aos valores basais.

85

Gráfico 7: Paclitaxel induz aumento de IL-6, TNF-α e KC/CXCL1 em gânglios da raiz dorsal




quando comparado com o grupo naive, ANOVA de uma via seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

6.4.5 Expressão relativa de RNAm de citocinas e quimiocinas em gânglios da raiz dorsal.

Foi avaliado se o tratamento com paclitaxel altera a expressão relativa de RNAm

das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-6, da quimiocina MCP-1 e do seu receptor

CCR2, nos gânglios da raiz dorsal (GRD). Os resultados da detecção da expressão basal do

RNAm em GRD para estes alvos estão representados na Gráfico 8. O tratamento com

paclitaxel foi capaz de aumentar significativamente (p<0,05) a expressão relativa de RNAm

para IL-1β e TNF-α (Gráficos 8A e 8B). O tratamento com paclitaxel ainda aumentou

significativamente (p<0,05) a expressão relativa de RNAm para CCR2 nos GRD (Gráfico

8E). Entretanto, não foi observada diferença estatística na expressão relativa do RNAm para

IL-6 (Gráfico 8C). Do mesmo modo que para as citocinas, detectou-se a expressão relativa do

RNAm para a quimiocina MCP-1 nos GRD (Gráfico 8D), porém não foi observado aumento

significativo da expressão relativa desta quimiocina após o tratamento com o paclitaxel.

Foi detectado aumento na expressão relativa de RNAm para IL-1β (Gráfico 8A) a

partir de 4 horas após a administração de paclitaxel, após 6 horas esse aumento se manteve,

86

entretanto, com 24 horas os níveis de expressão relativa de RNAm para IL-1β (Gráfico 8A)

retornou aos valores basais. Foi possível detectar aumento significativo (p<0,05) na expressão

relativa de RNAm para TNF-α (Gráfico 8B) a partir de 2 horas, mantendo-se até 6 horas e 24

horas após o tratamento com paclitaxel a expressão basal de RNAm para TNF-α havia

retornado ao valor basal. A expressão relativa de RNAm para IL-6 (Gráfico 8C) nos DRG não

foi alterada com o tratamento com paclitaxel em relação ao naive. A expressão relativa de

RNAm para a quimiocina MCP-1 (Gráfico 8D), também não foi alterada nos animais tratados

com paclitaxel, no entanto, a expressão relativa de RNAm do seu receptor (CCR2) (Gráfico

8E) foi aumenta significativamente (p<0,05) 6 horas após a administração de paclitaxel,

retornando ao nível basal em 24 horas.

87

Gráfico 8: Paclitaxel aumenta a expressão relativa de RNAm para IL-1β, TNF-α e CCR2 nos

gânglios da raiz dorsal

(A) Expressão relativa de RNAm para IL-1β. (B) Expressão do relativa de RNAm TNF-α. (C)

Expressão relativa de RNAm IL-6. (D) Expressão relativa de RNAm MCP-1. (E) Expressão relativa

de RNAm CCR2. Os dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05:


6.4.6 Quantificação de citocinas e quimiocinas na medula espinal.

O tratamento com paclitaxel provocou aumento significativo das citocinas pró-

inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-6 na medula espinal em comparação ao grupo naive, como

observado nos gráficos 9A, 9B e 9C, respectivamente. O tratamento com paclitaxel também

provocou aumento significativo dos níveis das quimiocinas MCP-1 e KC/CXCL1 (Gráficos

9D e 9E, respectivamente) na medula espinal, quando comparados ao grupo naive. A

concentração de IL-1β (Gráfico 9A) encontra-se aumentada significativamente (p<0,05) a

partir de 2 horas após o tratamento com paclitaxel, mantendo-se alterada até 24 horas. O TNF-

α (Gráfico 9B) aumenta moderadamente com 2 horas após o tratamento com paclitaxel, no

entanto, um aumento significativo (p<0,05) só é observado com 4 horas após a administração,

e é reduzido a partir de 6 horas, retornando aos valores basais 24 horas após a injeção de

paclitaxel. A IL-6 (Gráfico 9C) aumenta significativamente (p<0,05) na medula espinal de

camundongos tratados com paclitaxel após 2 horas, mantendo esse aumento até 6 horas, com

88

uma redução após 24 horas. Já a quimiocina MCP-1 (Gráfico 9D), não aumenta nas primeiras

horas após o tratamento com paclitaxel, observando-se aumento significativo (p<0,05) apenas

24 horas depois da administração de paclitaxel. A quimiocina KC/CXCL1 tem um aumento

significativo (p<0,05) já com 2 horas depois do tratamento com paclitaxel se mantendo até 6

horas e retornando ao nível basal 24 horas depois da administração de paclitaxel.

Gráfico 9: Paclitaxel induz aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1 na medula

espinal


Quantificação de MCP1. (E) Quantificação de KC/CXCL1. A quantificação foi determinada pelo



6.4.7 Expressão relativa de RNAm de citocinas e quimiocinas em medula espinal.

Na medula espinal, detectou-se a expressão relativa do RNAm para as citocinas

IL-1β, TNF-α e IL-6, e para a quimiocina MCP-1 e seu receptor CCR2, os valores estão

representados no gráfico 10. O tratamento com paclitaxel aumentou significativamente

(p<0,05) a expressão relativa do RNAm de IL-1β, TNF-α e IL-6 (Gráficos 10A, 10B e 10C,

respectivamente) na medula espinal. Da mesma forma, foi observado aumento significativo

(p<0,05) da expressão relativa do RNAm para MCP-1 (Gráfico 10D), bem como para o seu

receptor (CCR2) (Gráfico 10E).

89

Um aumento significativo (p<0,05) na expressão relativa de RNAm para IL-1β

(Gráfico 10A) foi detectado a partir de 4 horas após a administração de paclitaxel, com 6

horas esse aumento se manteve, no entanto com 24 horas os níveis de expressão relativa de

RNAm para IL-1β (Gráfico 10A) retornou aos valores basais. Foi possível detectar aumento

significativo (p<0,05) na expressão relativa de RNAm para TNF-α (Gráfico 10B) com 4

horas, mas com 6 horas iniciou uma redução que com 24 horas após o tratamento com

paclitaxel o a expressão relativa de RNAm para TNF-α havia retornado ao valor basal. A

expressão relativa de RNAm para IL-6 (Gráfico 10C) apresentou aumento significativo

(p<0,05) em relação ao naive, iniciando 2 horas após a administração de paclitaxel, com um

pico de expressão relativa de RNAm para esta citocina com 4 horas e retonando ao basal com

24 horas. A expressão relativa de RNAm para a quimiocina MCP-1 (Gráfico 10D), também

aumentou significativamente em relação ao naive (p<0,05) com tratamento com o paclitaxel.

A expressão relativa de RNAm do seu receptor CCR2 (Gráfico 10E) aumentou

significativamente 4 horas após a administração de paclitaxel (p<0,05), retornando ao nível

basal em 24 horas.

90

Gráfico 10: Paclitaxel aumenta a expressão relativa de RNAm para IL-1β, TNF-α, IL-6,

MCP-1 e CCR2, na medula espinal

(A) Expressão relativa do RNAm para IL-1β. (B) Expressão relativa do RNAm para TNF-α. (C)

Expressão relativa do RNAm para IL-6. (D) Expressão relativa do RNAm para MCP-1. (E) Expressão

relativa do RNAm para CCR2. Os dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6

animais. *P <0,05: quando comparado com o grupo naive, ANOVA de uma via seguida por teste post-

hoc de Bonferroni.

Os dados apresentados nessa seção demonstram que o a injeção de paclitaxel em

camundongos induz aumento dos níveis de citocinas/quimiocinas no plasma, nervo isquiático,

gânglios da raiz dorsal e medula espinal desses animais quantificada pelo método de ELISA,

bem como aumento da expressão relativa do RNAm para citocinas/quimiocinas no nervo

isquiático, gânglios da raiz dorsal e medula espinal e do receptor CCR2 nos gânglios da raiz

dorsal e medula espinal desses animais, quantificado pelo método de RT-PCR. O resumo dos

dados apresentados podem ser obervado em conjunto no quadro 2.

91

Quadro 2: Paclitaxel aumenta a expressão citocinas e/ou quimiocinas no plasma, no nervo

isquiático, nos gânglios da raiz dorsal e na medula espinal de camundongos

Resultados dos níveis dos níveis de citocinas/quimiocinas no plasma, nervo isquiático, gânglios da raiz

dorsal e medula espinal de animais tratados com paclitaxel (PCX), quantificada pelo método de

ELISA. Expressão relativa do RNAm para citocinas/quimiocinas no nervo isquiático, gânglios da raiz

dorsal e medula espinal e do receptor CCR2 nos gânglios da raiz dorsal e medula espinal de animais

tratados com PCX, quantificado pelo método de RT-PCR. ( + ) Aumento significativo. ( - ) não

significativo. (na) Não Avaliado.

6.5 Investigação da participação de citocinas e quimiocinas na hiperalgesia mecânica e

térmica induzida pelo paclitaxel.

Como ficou demonstrado que citocinas e/ou quimiocinas estavam aumentadas

significativamente (p<0,05) após a administração de paclitaxel tanto no plasma, quanto no

nervo isquiático, GRD, assim como na medula, foi avaliado então o envolvimento das

citocinas IL-6, TNF-α, IL-1 e da quimiocina MCP-1 (os três últimos investigadas através da

avaliação de seus receptores) na hiperalgesia aguda induzida pelo paclitaxel, utilizando

animais knockout para esses alvos.

6.5.1. Investigação da participação da IL-6 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida

pelo paclitaxel.

O gráfico 11 ilustra os efeitos do tratamento com paclitaxel em animais knockout

para a IL-6 (IL-6-/-). Como observado, a hiperalgesia mecânica e térmica ao frio foi reduzida

em animais com deleção da citocina IL-6 durante todo o período de avaliação, quando

comparado aos animais do tipo selvagem C57BL/6 (WT) (p<0,05). A ausência da IL-6

92

preveniu o aparecimento de respostas hiperalgesicas observadas nos animais IL-6-/- (Gráficos

11A e 11B, respectivamente). Além disso, camundongos WT foram previamente tratados com

um antagonista solúvel de IL-6 (tocilizumabe – TCZ) 30 minutos antes da injeção de

paclitaxel. Observou-se que o tratamento com TZC foi capaz de prevenir as respostas

hiperalgesicas induzidas pelo paclitaxel (Gráficos 11C e 11D, respectivamente).

O paclitaxel causou diminuição no limiar mecânico, quando comparado ao grupo

naive (p<0,05), caracterizado por uma maior sensibilidade ao estímulo mecânico de menor

intensidade aplicado (filamentos de von Frey). Também é observado que o tratamento com

paclitaxel induz hipernicepção térmica, caracterizada pelo aumento no tempo da resposta ao

frio 10 ºC (teste da acetona), quando comparado ao grupo controle (p<0,05). As respostas

hiperalgesicas se iniciaram a partir de 2 horas após o tratamento com paclitaxel, com o pico

de hiperalgesia mecânica e térmica 6 horas após, resolvendo-se completamente após 24 horas.

Foi observado que a ausência de IL-6 (Gráfico 11A) previne a hiperalgesia

mecânica desde o inicio em que esta se manifesta até 6 horas (pico da hiperalgesia) após o

tratamento com paclitaxel. Assim como na hiperalgesia mecânica, a ausência de IL-6 previne

o desenvolvimento de hiperalgesia térmica ao frio. Observou-se ainda que o pré-tratamento

com TZC apenas na maior dose utilizada foi capaz de prevenir as respostas hiperalgesicas

induzidas pelo paclitaxel (Gráficos 11C e 11D, respectivamente).

93

Gráfico 11: Papel da IL-6 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida pelo paclitaxel

A ausência de IL-6, bem como o tratamento com um antagonista desta citocina inibe a hiperalgesia

induzida pelo PCX em camundongos. (A) Hiperalgesia mecânica causada pelo PCX em animais

selvagens (WT) e knockout para IL-6 (IL-6-/-). (B) Hiperalgesia térmica ao frio causada pelo PCX em

animais selvagens (WT) e knockout para IL-6 (IL-6-/-). (C) Efeito do tratamento com tocilizumabe na

hiperalgesia mecânica causada pelo PCX em animais selvagens (WT). (D) Efeito do tratamento com

tocilizumabe na hiperalgesia térmica ao frio causada pelo PCX em animais selvagens (WT). Os

valores basais (descritos como “B” nos gráficos) foram determinados antes da administração de PCX


comparado com animais tratados com veículo ou os valores basais, ANOVA de duas vias seguida por

teste post-hoc de Bonferroni.

94

6.5.2 Investigação da participação de IL-1 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida

pelo paclitaxel.

A participação da IL-1 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida pelo

paclitaxel foi investigada através de seu receptor (IL-1R). Utilizou-se então camundongos

knockout para o receptor de IL-1 (IL-1R-/-). Nos gráficos 12A e 12B, respectivamente, são

mostrados os efeitos do tratamento com paclitaxel em animais selvagens (WT) e em animais

IL-1R-/-. Como observado, a hiperalgesia mecânica iniciou 2 horas após a administração de

paclitaxel, culminando entre 4 e 6 horas e retornando aos valores basais após 24 horas da

administração de paclitaxel, quando comparado ao veículo. Observa-se nos gráficos 12A e

12B que a ausência do receptor de IL-1 foi capaz de prevenir o desenvolvimento de

hiperalgesia mecânica e térmica ao frio, quando comparados aos animais WT injetados com

paclitaxel (p<0,05).

95

Gráfico 12: Envolvimento do receptor IL-1R na hiperalgesia induzida pelo paclitaxel

A deleção do gene para o receptor IL-1R, inibe a hiperalgesia induzida pelo paclitaxel em

camundongos. (A) Hiperalgesia mecânica causada pelo PCX em animais selvagens (WT) e animais

IL-1R-/-. (B) Hiperalgesia térmica ao frio causada pelo PCX em animais selvagens (WT) e animais

IL-1R-/-. Os valores basais (descritos como “B” nos gráficos) foram determinados antes da

administração de PCX ou veículo. Os dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6

animais. *P <0,05: quando comparado com animais tratados com veículo ou os valores basais,

ANOVA de duas vias seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

96

6.5.3 Investigação da participação TNF-α na hiperalgesia mecânica e térmica induzida

pelo paclitaxel.

A participação do TNF-α na hiperalgesia induzida pelo paclitaxel foi investigada

através da avaliação dos seus receptores (TNFR1 e TNFR2), para tanto foram utilizados

animais knockout para ambos os receptores. No gráfico 13, é mostrado os efeitos do

tratamento com paclitaxel em animais WT e em animais knockout para os receptores de TNF

(TNFR1/R2-/-). Como observado, a hiperalgesia mecânica e térmica ao frio foi

significativamente (p<0,05) reduzida nos animais com a dupla deleção gênica para os

receptores de TNF. Foi observado uma inibição significativa (p<0,05) das respostas

hiperalgesicas a partir de 2 horas após a administração de paclitaxel, com maior inibição

(p<0,05) entre 4 e 6 horas, onde é obervado o pico da hiperalgesia em animais WT. Após 24

horas da administração de paclitaxel observa-se que os valores retornam para aqueles

observados inicialmente, ou seja, antes da administração de paclitaxel. A ausência dos

receptores foi eficaz sobre as respostas de hiperalgesia mecânica e térmica, quando

comparados com os animais WT (p<0,05) (Gráficos 13A e 13B, respectivamente).

97

Gráfico 13: Envolvimento dos receptores TNFR1 e TNFR2 na hiperalgesia induzida pelo

paclitaxel

A ausência dos receptores TNFR1/R2 inibe a hiperalgesia induzida pelo paclitaxel em camundongos.

(A) Hiperalgesia mecânica causada pelo PCX em animais selvagens (WT) e animais TNFR1/R2-/-.

(B) Hiperalgesia térmica ao frio causada pelo PCX em animais selvagens (WT) animais TNFR1/R2-/-.

Os valores basais (descritos como “B” nos gráficos) foram determinados antes da administração de

PCX ou veículo. Os dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05:

quando comparado com animais tratados com veículo ou os valores basais, ANOVA de duas vias

seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

98

6.5.4 Investigação da participação de MCP-1 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida

pelo paclitaxel.

Foi avaliada a participação da quimiocina MCP-1 através da utilização do seu

receptor (CCR2) na hiperalgesia induzida pelo paclitaxel. Para tanto, foi utilizado animais

knockout para o receptor CCR2 (CCR2-/-). No gráfico 14 é mostrado os efeitos do tratamento

com paclitaxel em animais selvagens WT e em animais CCR2-/-. Como observado, a

hiperalgesia mecânica e térmica ao frio, foi alterada nos animais selvagens WT, a partir de 2

horas, com pico entre 4 e 6 horas e retornando aos valores basais 24 horas após a

administração do paclitaxel, quando comparados ao veículo (p<0,05). Já a ausência dos

receptores foi eficaz em prevenir as respostas hiperalgesicas mecânica e térmica ao frio

induzidas pelo paclitaxel quando comparado aos animais do tipo selvagem WT (p<0,05)

(Gráfico 14A e 14B, respectivamente).

99

Gráfico 14: Envolvimento do receptor CCR2 na hiperalgesia induzida pelo paclitaxel

A ausência do receptor CCR2 inibe a hiperalgesia induzida pelo paclitaxel em camundongos. (A)

Hiperalgesia mecânica causada pelo PCX em animais selvagens (WT) e animais CCR2-/-. (B)

Hiperalgesia térmica ao frio causada pelo PCX em animais selvagens (WT) e animais CCR2-/-. Os

valores basais (descritos como “B” nos gráficos) foram determinados antes da administração de PCX


comparado com animais tratados com veículo ou os valores basais, ANOVA de duas vias seguida por

teste post-hoc de Bonferroni.

100

6.6 Investigação da participação de mastócitos na hiperalgesia mecânica e térmica

induzida pelo paclitaxel.

Tendo em vista que citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas estavam envolvidas

no processo de hiperalgesia aguda induzida por paclitaxel e sabendo-se que células imunes

residentes produzem esses mediadores, foi avaliado o possível envolvimento dessas células na

hiperalgesia aguda induzida pelo paclitaxel. Para isso, optou-se por investigar o envolvimento

de mastócitos na hiperalgesia induzida por paclitaxel. Para tanto, foram utilizados animais

mutantes que não diferenciam mastócitos (SH) (Gráfico 15), assim como também foram feitos

experimentos utilizando o estabilizador de membrana de mastócito, cromoglicato de sódio

(Gráfico 16).

O gráfico 15 ilustram os efeitos da administração do paclitaxel em animais SH e

selvagens (WT). Como pode ser observado, a hiperalgesia mecânica e térmica ao frio

(Gráficos 15A e 15B, respectivamente) foi reduzida significativamente (p<0,05) nos animais

SH, durante todo o período de avaliação, quando comparado aos animais WT.

Para confirmar que os mastócitos estavam envolvidos na hiperalgesia mecânica e

térmica, então animais WT foram pré-tratados com cromoglicato de sódio (CROMO) e

posteriormente injetados com PCX. O gráfico 16 mostra os efeitos do pré-tratamento com o

cromoglicato de sódio, sobre a hiperalgesia induzida pelo paclitaxel. Os resultados

demonstram que o cromoglicado de sódio, um estabilizador de membrana de mastócitos, foi

eficaz em inibir significativamente (p<0,05) a hiperalgesia mecânica (Gráfico 16A) e térmica

ao frio (Gráfico 16B) a partir de 2 horas e permanecendo durante todo o período de avaliação

após o tratamento com o quimioterápico. A inibição da resposta hipernociceptiva mecânica e

térmica dos animais tratados com cromoglicato de sódio sugere que a degranulação dos

mastócitos contribui para a gênese da hiperalgesia.

101

Gráfico 15: Envolvimento de mástocitos na hiperalgesia induzida por paclitaxel

A ausência de mastócitos inibe a hiperalgesia induzida pelo PCX em camundongos. (A) Hiperalgesia

mecânica causada pelo PCX em animais selvagens (WT) e mutantes que não diferenciam mastócitos

(SH). (B) Hiperalgesia térmica ao frio causada pelo PCX em animais WT e SH. Os valores basais

(descritos como “B” nos gráficos) foram determinados antes da administração de PCX ou veículo. Os

dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05: diferença significativa

entre o grupo WT e SH tratados com PCX, ANOVA de duas vias seguida por teste post-hoc de

Bonferroni.

102

Gráfico 16: Cromoglicato de sódio atenua a hiperalgesia induzida pelo paclitaxel

O cromoglicato de sódio, um estabilizador de membrana de mastócito previne a hiperalgesia mecânica

e térmica induzida pelo PCX. (A) Efeito do pré-tratamento com cromoglicato de sódio (30mg/Kg, i.p.)

administrados durante 3 dias consecutivos antes do tratamento com PCX, sobre a hiperalgesia

mecânica. (B) Efeito do pré-tratamento com cromoglicato de sódio durante 3 dias consecutivos antes

do tratamento com PCX na hiperalgesia térmica ao frio. Os valores basais (descritos como “B” nos

gráficos) foram determinados antes da administração de PCX ou veículo. Os dados foram

representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05: diferença significativa do grupo

tratado com PTX, ANOVA de duas vias seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

103

6.7 Quantificação de citocinas e quimiocinas em camundongos SH e camundongos pré-

tratados cromoglicato de sódio e injetados com paclitaxel.

Para confirmar que o aumento de citocinas e quimiocinas era devido à

estimulação dos mastócitos pelo paclitaxel, foi quantificado as citocinas pró-inflamatórias IL-

1β, TNF-α e IL-6 e quimiocinas MCP-1 e KC/CXCL1 no nervo isquiático, nos gânglios da

raiz dorsal e medula espinal de camundongos SH e camundongos selvagens (WT) tratados

com paclitaxel, ou ainda camundongos WT pré-tratados com cromoglicato de sódio e,

posteriormente, injetados compaclitaxel, como mostrado nos gráficos 17, 18 e 19.

6.7.1 Quantificação de citocinas e quimiocinas em nervo isquiático.

O tratamento com paclitaxel provocou aumento significativo (p<0,05) das IL-1β,

TNF-α, IL-6, MCP-1e KC/CXCL1 no nervo isquiático de camundongos WT injetados com

paclitaxel quando comparados com o grupo naive (Gráficos 17A, 17B, 17C, 17D e 17E,

respectivamente). Entretanto, o pré-tratamento com cromoglicato de sódio foi capaz de

prevenir significativamente o aumento destas citocinas e quimiocinas (Gráficos 17A, 17B,

17C, 17D e 17E, respectivamente). Nos camundongos SH tratados com paclitaxel as citocinas

IL-6, IL-1β, TNF-α, MCP-1 e KC/CXCL1 tiveram um aumento moderado, não sendo

observado aumento significativo quando comparado ao grupo naive. Porém, quando

comparados ao grupo de camundongos selvagens tratados com paclitaxel, observa-se uma

redução significativa destas citocinas e quimiocinas (Gráficos 17A, 17B, 17C, 17D e 17E,

respectivamente). Duas horas após a administração de paclitaxel a IL-1β (Gráfico 17A),

começou a aumentar e sua concentração manteve-se alta até 6 horas depois da administração,

pode-se observar que a concentração desta citocina foi reduzinda com o avanço do tempo.

Como ficou demonstrado nos resultados anteriores, apenas com animais WT, que 24 horas

após a administração de paclitaxel a concentração da maioria das citocinas/quimiocinas

retornava aos valores basais, e que neste ponto os animais não mais apresentavam respostas

hiperalgesicas, a partir dessa seção optou-se por não mais avaliar o ponto de 24 horas após a

administração de paclitaxel.

Foi demonstrado que a ausência de mastócitos ou o tratamento com o

cromoglicato de sódio foram eficazes em prevenir o aumento significativo (p<0,05) de IL-1β

(Gráfico 17A) no nervo isquiático com inibição significativa (p<0,05) desta citocina em 2, 4 e

6 horas após o tratamento com paclitaxel. O TNF-α (Gráfico 17B), teve um aumento

significativo (p<0,05) a partir de 2 horas depois da administração de paclitaxel, mantendo-se

em 4 e 6 horas após a administração da droga. Em animais SH ou o tratamento com o

104

cromoglicato de sódio reduziram significativamente (p<0,05) as concentrações de TNF-α

(Gráfico 17B) após a administração de paclitaxel, em todos os pontos avaliados, quando

comparados ao grupo de animais WT. A IL-6 (Gráfico 17C) começou a aumentar no nervo

isquiático, 2 horas depois da administração, entretanto, só foi detectado diferença significativa

(p<0,05) 6 horas após administração do paclitaxel. Pode-se observar que a ausência de

mastócitos ou o tratamento com o cromoglicato de sódio foram eficazes em reduzir

significativamente (p<0,05) as concentrações de IL-6 em todos os pontos avaliados, quando

comparados ao grupo de animais WT. Quanto as quimiocinas MCP-1 (Gráfico 17D) e

KC/CXCL1 (Gráfico 17E), ambas estavam aumentadas significativamente (p<0,05) a partir

de 4 horas após o tratamento com paclitaxel e mantiveram-se altas até 6 horas depois do

tratamento. MCP-1(Gráfico 17D) foi reduzido significativamente (p<0,05), quando

comparado ao grupo de animais WT em 4 e 6 horas quando da ausência de mastócitos ou com

o tratamento com cromoglicato de sódio. A ausência de mastócitos ou o tratamento com o

cromoglicato de sódio foram eficazes em prevenir o aumento significativo (p<0,05) de

KC/CXCL1(Gráfico 17E) a partir de 4 horas após a administração de paclitaxel.

105

Gráfico 17: Pré-tratamento com cromoglicato de sódio ou a ausência mastócitos previnem o

aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6, KC/CXCL1 e MCP-1 no nervo isquiático de camundongos

tratados com paclitaxel

(A) Quantificação de TNF-α. (B) Quantificação de IL-1β. (C) Quantificação de IL-6. (D)


método de ELISA. *P <0,05: quando comparado com o grupo animais selvagens tratados com

paclitaxel; (#) indica aumento significativo em relação ao naive, Os dados foram representados como a

média ± E.P.M. para 4-6 animais, ANOVA de duas vias seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

106

6.7.2 Quantificação de citocinas e quimiocinas em gânglios da raiz dorsal.

O tratamento com paclitaxel provocou aumento significativo (p<0,05) das

citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 e da quimiocina KC/CXCL1, nos gânglios da raiz

dorsal de camundongos selvagens (WT) tratados com paclitaxel em comparação ao grupo

naive (Gráficos 18B, 18C e 18D, respectivamente). Porém, a citocina IL-1β (Gráfico 18A)

não aumentou significativamente. Todavia, o pré-tratamento com cromoglicato de sódio foi

capaz de prevenir de forma significativa (p<0,05) o aumento destas citocinas e da quimiocina

(Gráficos 18B, 18C e 18D, respectivamente). Nos camundongos SH tratados com paclitaxel,

as concentrações de TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1 foram moderadas, não sendo observado

aumento significativo quando comparado ao grupo naive. Quando comparados ao grupo de

camundongos WT tratados com pacliitaxel, observa-se que não houve alteração nas

concentrações destas citocinas e quimiocina (Gráficos 18B, 18C e 18E, respectivamente).

Observou-se que no grupo tratado com paclitaxel, houve um aumento

significativo (p<0,05) das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6, após o tratamento, nos

gânglios da raiz dorsal em comparação ao grupo naive (Gráfico 18B e 18C). Neste mesmo

grupo, observou-se ainda aumento significativo da quimiocina KC/CXCL1 (Gráfico 18D)

quando comparados com o grupo naive. Porém a citocina IL-1β não aumentou

significativamente pela administração de paclitaxel (Gráfico 18A). O TNF-α aumentou

significativamente (p<0,05) 6 horas após a administração de paclitaxel, no entanto, a ausência

de mastócitos ou o tratamento com o cromoglicato de sódio foram eficazes em prevenir o

aumento significativo (p<0,05) de TNF-α nos gânglios da raiz dorsal com inibição desta

citocina em 4 e 6 horas após o tratamento com paclitaxel . A IL-6 (Gráfico 18C) teve um

aumento significativo (p<0,05) 6 horas após a administração de paclitaxel, esse aumento foi

observado a partir de 2 horas depois do paclitaxel, quando comparado ao naive. Ficou

demonstrado que a ausência de mastócitos ou o tratamento com o cromoglicato de sódio

foram eficazes em prevenir o aumento significativo (p<0,05) de IL-6 (Gráfico 18C) em todos

os pontos avaliados, quando comparado aos animais WT. Quanto as quimiocina KC/CXCL1

(Gráfico 18D), esta estava aumentada significativamente (p<0,05) a partir de 4 horas após o

tratamento com paclitaxel e manteve-se alta em todos os pontos de tempo avaliados. No

entanto, a ausência de mastócitos ou o tratamento com o cromoglicato de sódio foram eficazes

em prevenir significativamente (p<0,05) aumento de KC/CXCL1(Gráfico 18D) em 4 e 6

horas após a administração de paclitaxel, quando comparados aos animais WT (p<0,05).

107

Gráfico 18: Pré-tratamento com cromoglicato de sódio ou a ausência de mastócitos previnem

o aumento de de IL-1β, TNF-α, IL-6, KC/CXCL1 e MCP-1nos gânglios da raiz de dorsal

camundongos tratados com paclitaxel


Quantificação de KC/CXCL1. A quantificação foi determinada pelo método de ELISA.*P <0,05:

quando comparado com o grupo animais selvagens tratados com paclitaxel; (#) indica aumento

significativo em relação ao naive, Os dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6

animais, ANOVA de duas vias seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

108

6.7.3 Quantificação de citocinas e quimiocinas em medula espinal.

O tratamento com paclitaxel provocou aumento significativo (p<0,05) das

citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-6 e da quimiocina KC/CXCL1, na medula

espinal de camundongos WT tratados com paclitaxel em comparação ao grupo naive (p<0,05)

(Gráficos 19A, 19B, 19C e 19E, respectivamente). Contudo, o pré-tratamento com

cromoglicato de sódio foi capaz de prevenir de forma significativa (p<0,05) o aumento de IL-

1β, TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1 (Gráficos 19A, 19B, 19C e 19E, respectivamente). Porém

MCP-1 não foi alterado significativamente (Gráficos 19D). Nos camundongos SH tratados

com paclitaxel, IL-1β, TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1 tiveram um aumento moderado, não sendo

observado aumento significativo quando comparado ao grupo naive. Já quando comparados

ao grupo de camundongos WT trattados com paclitaxel, observa-se que não houve alterações

nas concentrações destas citocinas e quimiocina (Gráficos 19A, 19B, 19C e 19E,

respectivamente). Já o MCP-1 não foi alterado.

IL-1β (Gráfico 19A) aumentou significativamente (p<0,05) a partir de 2 horas

após o tratamento com paclitaxel, e se mantive alterado até 6 horas. Observa-se que nos

animais que não possuíam mastócitos ou nos animais WT previamente tratados com

cromoglicato de sódio, a concentração de IL-1β foi reduzida significativamente (p<0,05) em

todos os pontos avaliados quando com parados aos animais WT sem tratamento prévio. TNF-

α (Gráfico 19B) aumentou moderadamente 2 horas após o tratamento com paclitaxel, no

entanto, um aumento significativo (p<0,05) só é observado 4 horas após a administração,

mantendo-se até 6 horas. No entanto a ausência de mastócito ou o pré-tratamento com

cromoglicato de sódio reduziu significativamente (p<0,05) a concentração de TNF-α nos

pontos analisados. IL-6 (Gráfico 19C) estava aumentada significativamente (p< 0,05) na

medula espinal de camundongos tratados com paclitaxel 4 horas após o tratamento, mantendo

esse aumento até 6 horas em camundongos WT, mas observa-se que na ausência de mastócito

esta citocina não se altera e quando os animais são pré-tratados com cromoglicato de sódio

observa-se uma redução significativamente (p<0,05) de IL-6 quando comparados ao grupo de

animais WT. Já a quimiocina MCP-1, não aumentado após o tratamento com paclitaxel.

Porém, KC/CXCL1 aumentou significativamente (p<0,05) 4 horas depois do tratamento com

paclitaxel em animais WT. Verificou-se que a ausência de mastócitos ou o pré-tratamento

com cromoglicato de sódio reduziu significativamente (p<0,05) KC/CXCL1 na medula

espinal quando comparados aos animais do grupo WT.

109

Gráfico 19: Pré-tratamento com cromoglicato de sódio ou a ausência de mastócitos previne o

aumento de IL-1β, TNF-α IL-6 e KC/CXCL1 na medula espinal de camundongos tratados

com paclitaxel


Quantificação de KC/CXCL1. A quantificação foi determinada pelo método de ELISA. *P <0,05:

quando comparado com o grupo animais selvagens tratados com paclitaxel; (#) indica aumento



Os dados apresentados nessa seção demonstram que a ausência de mastócito ou o

pré-tratamento com cromoglicato de sódio, um estabilizador de membrana de mastócito,

previnem o aumento de citocinas/quimiocinas quantificados pelo método de ELISA no nervo

isquiático, gânglios da raiz dorsal e medula espinal de camundongos injetados com PCX. O

resumo dos dados apresentados podem ser obervado em conjunto no quadro 3.

110

Quadro 3: Papel dos mastócitos na produção/liberação de citocinas e/ou quimiocinas, no

nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal e na medula espinal de camundongos injetados com

paclitaxel

Resultados da redução dos níveis de citocinas/quimiocinas no nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal

e medula espinal de animais tratados com paclitaxel (PCX). Quantificação realizada pelo método de

ELISA. ( + ) Aumento significativo em relação ao naive. ( - ) não houve aumento significativo em

relação ao naive. ( < ) diminuição significativa em relação ao WT. ( na ) Não Avaliado.

6.8 Quantificação de citocinas e quimiocinas em cultura de mastócitos estimulada com

paclitaxel.

Com intuito de confirmar que a ativação dos mástócitos é responsável, pelo

menos em parte, pela produção/liberação de citocinas e quimiocinas na dor aguda induzida

pelo paclitaxel, foram quantificados as citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-6 e

quimiocina MCP-1 em cultura de mastócitos (RBL-2H3) estimulada com paclitaxel, como

mostrado no gráfico 20.

A estimulação com paclitaxel provocou aumento significativo (p<0,05) de TNF-α,

IL-6 e MCP-1, em cultura de mastócitos (RBL-2H3), quando comparados com o grupo naive

(Gráficos 20A, 20B e 20C, respectivamente). Quando estimulados com diferentes doses de

paclitaxel, mastócitos em cultura liberam/produzem mediadores. Observa-se que TNF-α

(Gráfico 20A) é aumentado significativamente (P<0,05) com a dose de 30µM de paclitaxel,

apesar das outras doses utilizadas (10 e 90µM) também terem aumento significativamente

(p<0,05) esta citocina no sobrenadante da cultura em comparação com o meio sem o estímulo.

Cultura de mástocito também libera IL-6 (Gráfico 20B) quando estimulada com paclitaxel.

111

Observa-se que esta citocina alcançou seu pico com a utilização da dose de 30µM de

paclitaxel, apesar de se observar também diferença siginificativa (p<0,05) com a utilização de

outras doses (10 e 90µM), quando comparado ao meio sem estímulo. Em relação à

produção/liberação de MCP-1, a estimulação de mastócitos em cultura com paclitaxel,

aumentada significativamente (p<0,05) esta quimiocina nas doses de 10 e 30µM, quando

comparado ao meio sem estímulo. A dose de 90µM também foi capaz de aumentar

significativamente (p<0,05) MCP-1 no sobrenadante de mastócitos estimulados com

paclitaxel, no entanto, este valor foi menor quando comparado as outras doses utilizadas.

112

Gráfico 20: Paclitaxel aumenta TNF-α, IL-6 e MCP-1 em cultura de mastócitos (RBL-2H3)

estimulada com paclitaxel

(A) Quantificação de TNF-α. (B) Quantificação de IL-6. (C) Quantificação de MCP-1. Os dados

foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6 poços. A quantificação foi determinada pelo

método de ELISA. *P <0,05: quando comparado com o grupo controle, ANOVA de uma via seguida

por teste post-hoc de Bonferroni. PMA (ativador da PKC); Ionomicina (IONO - aumenta a

permeabilidade das membranas celulares ao cálcio)

113

6.9 Imunofluorescência para Triptase e IL-6 em gânglio da raiz dorsal de camundongos

submetidos à injeção de paclitaxel

Na imunofluorescência para triptase e IL-6, no gânglio da raiz dorsal, foi

observado um aumento da imunoexpressão tanto de triptase quanto de IL-6, quando

comparado ao grupo naive 4 horas após a administração de paclitaxel (Figura 11). No entanto,

6 horas após a administração de paclitaxel houve uma redução da imunoexpressão para esses

marcadores quando comparado com o grupo tratado com paclitaxel 4 horas após o tratamento.

Na análise quantitativa da imunoexpressão para Triptase, a quantificação da área

marcada, comparando com o grupo naive, houve um aumento significativo (p<0,05) 4 horas

após a administração de paclitaxel (Gráfico 21A). Em relação a quantificação da área marcada

de IL-6, também observou-se um aumento significativo (p<0,05) 4 horas após a administração

de paclitaxel (Gráfico 21B).

114

Figura 11: Fotomicrografia da imunoexpressão de Triptase e IL-6 no gânglio da raiz dorsal de


Verde: Triptase (marcador de mastócitos); vermelho: IL-6; amarelo: fusão (MERGE); A, B e C: Naive

normal, sem tratamento; D, E, F: Paclitaxel 4h; G, H e I: Paclitaxel 6 h. Setas brancas: marcação para

IL-6 em células não neuronais do DRG. Cabeça de seta amarela: marcação para IL-6 em células não

neuronais do GRD. Setas amarelas: co-marcação IL-6 e Triptase em células não neuronais do GRD.

Foto representativa de 1 animal por grupo experimental. Aumento de 200x

Naive

PCX-4h

PCX-6h

115

Gráfico 21: Análise quantitativa da imunoexpressão para Triptase e IL-6 no gânglio da raiz

dorsal de camundongos submetidos à administração de paclitaxel

O gráfico representa a quantificação da área marcada pela imunoexpressão de Triptase (A) e IL-6 (B).

Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). O grupo tratado com PCX

(4 e 6 horas) são comparados ao grupo controle (naive). *p<0,05: quando comparado com o grupo

controle; #p<0,05: quando comparado com o grupo PCX 4h, ANOVA de uma via seguida por teste

post-hoc de Bonferroni.

116

6.10 Investigação da participação de TLR4 na hiperalgesia mecânica e térmica induzida

pelo paclitaxel.

Sabe-se que o paclitaxel provoca dor aguda através da ativação dos receptores

TLR4. De posse dessa evidencia, foi avaliada a participação desse receptor na hiperalgesia

induzida pelo paclitaxel, através do emprego de animais knockout para o receptor TLR4

(TLR4-/-). Verificou-se que as respostas hiperalgesicas mecânica e térmica ao frio

começaram dentro de 2 horas e atingiram o pico entre 4 e 6 horas, se resolvendo 24 horas

após a administração do paclitaxel (Gráficos 22A e 22B, respectivamente). Enquanto isso, o

limiar de retirada da pata a estímulos mecânicos do grupo controle permaneceu inalterado,

assim como o comportamento nocifensivo ao frio. Entretanto, em 24h após a administração

única de paclitaxel não foi observado o desenvolvimento de respostas hiperalgesicas mecânica

e térmica ao frio (Gráficos 22A e 22B, respectivamente) em animais TLR4-/-.

O tratamento de animais knockout para o receptor TLR4 (TLR4-/-) com paclitaxel

não foi capaz de desenvolver hiperalgesia mecânica e térmica nesses animais. Isto pode ser

observado pela redução significativa (p<0,05) das respostas hiperalgesicas nos animais com

deleção gênica para este receptor. Essa inibição das respostas hipernociceptiva mecânica e

térmica foi observado durante todo o período de avaliação, quando comparado aos animais

WT. A delação desse receptor, portanto foi eficaz na prevenção do desenvolvimento de

respostas hiperalgesicas ao paclitaxel em camundongos (Gráfico 22A e 22B).

117

Gráfico 22: Participação do receptor TLR4 na hiperalgesia induzida por paclitaxel

(A) Hiperalgesia mecânica causada por PCX em animais selvagens (WT) e animais TLR4-/-. (B)

Hiperalgesia térmica ao frio causada por PCX em animais selvagens C57BL/6 (WT) e animais TLR4-

/-. Os valores basais (descritos como “B” nos gráficos) foram determinados antes da administração de

PCX ou veículo. Os dados foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05:

quando comparado com animais tratados com veículo ou os valores basais, ANOVA de duas vias

seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

118

6.11 Quantificação de citocinas e quimiocinas em camundongos TLR4-/- tratados com

paclitaxel.

A ativação dos receptores do tipo toll 4 (TLR4), causa dor aguda induzida por

paclitaxel. Então foi avaliado se ativação desse receptor aumenta a expressão de citocinas ou

quimiocinas em camundongos tratados com paclitaxel. Para isso foi administrado em

camundongos TLR4-/- e em camundongos WT dose única de paclitaxel e foi verificado se à

droga provocava aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1 no plasma, nervo

isquiático, gânglios da raiz dorsal e medula espinal nessa linhagem de camundongos, os

valores estão representados nos gráficos 23, 24, 25 e 26.

6.11.1 Quantificação de citocinas e quimiocinas no plasma.

O tratamento com paclitaxel provocou aumento significativo (p<0,05) de IL-1β,

TNF-α e IL-6 em camundongos WT tratados com paclitaxel quando comparados com o grupo

naive (Gráficos 23A, 23B e 23C). Da mesma forma, foi observado aumento significativo

(p<0,05) da quimiocina KC/CXCL1 (Gráfico 23D) quando comparados com o grupo naive.

Entretanto, nos camundongos TLR4-/- tratados com paclitaxel as concentrações

de TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1 encontraram-se moderadas, não sendo observado aumento

significativo quando comparado ao grupo naive. E quando comparados ao grupo de

camundongos WT tratados com paclitaxel, observa-se significativa redução (p<0,05) destas

citocinas e quimiocina, quatro horas após a administração de paclitaxel (Gráficos 23A e 23B).

119

Gráfico 23: A deleção gênica do TLR4 previne o aumento de IL-6 e KC/CXCL1 no plasma

de camundongos tratados com paclitaxel


Quantificação de KC/CXCL1. A quantificação foi determinada pelo método de ELISA. *P <0,05:

quando comparado com o grupo animais selvagens (WT) tratados com paclitaxel; (#) indica aumento



6.11.2 Quantificaçã de citocinas e quimiocinas no nervo isquiático.

O tratamento com paclitaxel provocou aumento significativo (p<0,05) de IL-1β,

TNF-α, IL-6, KC/CXCL1 e MCP-1, em camundongos selvagens tratados com paclitaxel

quando comparados com o grupo naive (Gráficos 24A, 24B, 24C, 24D e 24E).

No entanto, nos camundongos TLR4-/- tratados com paclitaxel a concentração de

IL-1β (Gráfico 24A) foi reduzida significativamente (p<0,05) 4 e 6 horas após o tratamento

com paclitaxel, quando comparados aos animais WT. Não foi observado aumento

significativo de TNF-α (Gráfico 24B) quando comparado ao grupo naive. E quando

comparados ao grupo de camundongos WT tratados com paclitaxel, observa-se significativa

(p<0,05) redução desta citocina 4 e 6 horas após a administração de paclitaxel. IL-6 (Gráfico

120

24C) foi reduzido significativamente (p<0,05) em camundongos TLR4-/-, 2 e 6 horas após o

tratamento com paclitaxel, quando comparados aos animais WT. A quimiocina MCP-1

(Gráfico 24D) aumentou significativamente (p<0,05) no grupo de animais WT tratados com

paclitaxel. No entanto, em camundongos TLR4-/- foi observado uma redução

significativamente (p<0,05) desta quimiocina 4 e 6 horas após a administração de paclitaxel,

quando comparados aos animais WT. Já KC/CXCL1 (Gráfico 24E) foi significativamente

(p<0,05) reduzida apenas 6 horas após o tratamento com paclitaxel, quando comparados com

camundongos WT.

Gráfico 24: A deleção gênica do TLR4 previne o aumento de IL-1β, IL-6, MCP-1 e

KC/CXCL1 no nervo isquiático de camundongos tratados com paclitaxel


Quantificação de MCP-1. (E) Quantificação de KC/CXCL1. Os dados foram representados como a

média ± E.P.M. para 4-6 animais. A quantificação foi determinada pelo método de ELISA. *P <0,05:

quando comparado com o grupo animais selvagens (WT) tratados com paclitaxel; (#) indica aumento



6.11.3 Quantificação de citocinas e quimiocinas nos gânglios da raiz dorsal.

O tratamento com paclitaxel provocou aumento significativo (p<0,05) de TNF-α,

IL-6 e KC/CXCL1, em camundongos WT tratados com paclitaxel quando comparados com o

grupo naive (Gráficos 25B, 25C e 25E, respectivamente).

No entanto, nos camundongos TLR4-/- tratados com paclitaxel não foi observado

aumento significativo de TNF-α (Gráfico 25B) quando comparado ao grupo naive. Quando

121

comparados ao grupo de camundongos WT tratados com paclitaxel, observa significativa

(p<0,05) redução desta citocina, 4 e 6 horas após a administração de paclitaxel. Não foi

observado aumento significativo de KC/CXCL1 (Gráfico 25E) quando comparado ao grupo

naive. Já em comparação ao grupo de camundongos WT tratados com paclitaxel, observa

significativa (p<0,05) redução desta quimiocina, 4 e 6 horas após a administração de

paclitaxel. Não foi observado aumento significativo nos níveis de IL-1β e MCP-1 em

camundongos WT (Gráficos 25A e 25D, respectivamente), e nos animais TLR4-/-. IL-6 não

foi reduzida em comparação ao grupo WT (Gráfico 25C).

Gráfico 25: A deleção gênica do TLR4 previne o aumento de TNF-α e KC/CXCL1 nos

gânglios da raiz dorsal de camundongos tratados com paclitaxel



método de ELISA. *P <0,05: quando comparado com o grupo animais selvagens (WT) tratados com



6.11.4 Quantificação de citocinas e quimiocinas na medula espinal.

O tratamento com paclitaxel provocou aumento significativo de IL-1β, TNF-α,

IL-6, MCP-1e KC/CXCL1 em camundongos selvagens tratados com paclitaxel quando

comparados com o grupo naive (Gráficos 26A, 26B, 26C, 26D e 26E, respectivamente).

Na medula espinal de camundongos TLR4-/- tratados com paclitaxel, não foi

observado aumento significativo de TNF-α (Gráfico 26B) quando comparado ao grupo naive.

122

Porém, quando comparados ao grupo de camundongos WT tratados com paclitaxel, observa

significativa (p<0,05) redução de TNF-α apenas 6 horas após o tratamento com paclitaxel.

Também não foi observado aumento significativo de MCP-1 (Gráfico 26D) quando

comparado ao grupo naive. E quando comparados ao grupo de camundongos tratados com

paclitaxel, observa significativa (p<0,05) redução desta quimiocina 6 horas após o tratamento

com paclitaxel. KC/CXCL1 (Gráfico 26E) não teve aumento significativo quando comparado

ao grupo naive. Já quando comparado ao grupo de camundongos WT tratados com paclitaxel,

observa-se significativa (p<0,05) redução desta quimiocinas com 6 horas após o tratamento

com paclitaxel, em comparação aos animais WT. Não foi observado diminuição significativa

de IL-1β e IL-6 em camundongos TLR4-/- em comparação ao grupo WT (Gráficos 26A e

26C, respectivamente).

Gráfico 26: A deleção gênica do TLR4 previne o aumento de TNF-α, MCP-1 e KC/CXCL1

na medula espinal de camundongos tratados com paclitaxel



método de ELISA. *P <0,05: quando comparado com o grupo animais selvagens (WT) tratados com



Os dados apresentados nessa seção demonstram que a ausência do receptor TLR4

previne o aumento de citocinas/quimiocinas quantificados pelo método de ELISA no plasma,

123

nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal e medula espinal de camundongos tratados com

paclitaxel. O resumo dos dados apresentados pode ser obervado em conjunto no quadro 4.

Quadro 4: A ausência do receptor TLR4 diminui a produção/liberação de citocinas e/ou

quimiocinas, no plasma, nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal e na medula espinal de

camundongos tratados com paclitaxel

Resultados da redução dos níveis de citocinas/quimiocinas no plasma, nervo isquiático, gânglios da

raiz dorsal e medula espinal de animais tratados com paclitaxel (PCX). Quantificação realizada pelo

método de ELISA. ( + ) Aumento significativo em relação ao naive. ( - ) não houve aumento

significativo em relação ao naive. ( < ) diminuição significativa em relação ao WT. ( na ) Não

Avaliado.

6.12 Quantificação de IL-6, TNF-α, MCP-1 e KC/CXCL1 em cultura primária de

células satélites gliais estimulada com paclitaxel.

Foi avaliado o efeito do paclitaxel em cultura de células satélites gliais. Foi

observado que a estimulação com paclitaxel causou aumento significativo dos níveis das

citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α e quimiocinas KC/CXCL1 e MCP-1 em

comparação ao grupo naive, como mostrado no gráfico 27.

124

Gráfico 27: Paclitaxel aumenta IL-6, TNF-α, MCP-1 e KC/CXCL1 em cultura primária de

células satélites gliais

Paclitaxel aumenta os níveis de IL-6, TNF-α, MCP-1e KC/CXCL1 em cultura primária de células

satélites gliais. A quantificação foi determinada pelo método de ELISA. (A) Quantificação de TNF-α.

(B) Quantificação de IL-6. (C) Quantificação de MCP-1. (D) Quantificação de KC/CXCL1. Os dados

foram representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05: quando comparado com o

grupo controle, ANOVA de uma via seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

Adicionalmente foi realizada a dosagem de citocinas/quimiocinas em cultura de

células satélites gliais de camundongos knockout para os receptores do tipo toll (TLR2-/- e

TLR4-/-). Verificou-se que a estimulação com paclitaxel causou aumento significativo das

citocinas IL-6, IL-1β e TNF-α e quimiocinas KC/CXCL1 e MCP-1 em cultura de células

satélites gliais de camundongos selvagens (WT) em comparação ao grupo naive, como

mostrado no gráfico 28. No entanto a deleção gênica para o receptor TLR4 foi capaz de

impedir o aumento de citocinas/quimiocinas em cultura de células satélites gliais, essa

inibição não foi observada nos animais deficientes para TLR2.

125

Gráfico 28: A deleção gênica do receptor TLR4 previne o aumento de IL-6, MCP-1 e

KC/CXCL1 em cultura primária de células satélites gliais estimulada com paclitaxel

A deleção gênica do receptor TLR4 previne o aumento dos níveis de IL-6, TNF-α, MCP1 e

KC/CXCL1 em cultura primária de células satélites gliais. A quantificação foi determinada pelo

método de ELISA. (A) Quantificação de TNF-α. (B) Quantificação de IL-6. (C) Quantificação de

MCP-1. (D) Quantificação de KC/CXCL1. Os dados foram representados como a média ± E.P.M.

para 4-6 animais. *P <0,05: quando comparado com o grupo controle, ANOVA de uma via seguida

por teste post-hoc de Bonferroni.

Para confirmar se a deleção do gene para o receptor TLR4 era capaz de prevenir o

aumento dos níveis de citocinas/quimiocinas em cultura de células satélites gliais de GRD de

camundongos KO para os receptores TLR4, utilizou-se um agonista clássico desse receptor, o

LPS. Verificou-se que tanto a estimulação com LPS quanto com o paclitaxel causaram

aumento significativo das citocinas IL-6, IL-1β e TNF-α e quimiocinas KC/CXCL1 e MCP-1

em camundongos selvagens (WT) tratados com paclitaxel quando comparados ao grupo

naive, como mostrado no gráfico 29. Entretanto a deleção gênica para o receptor TLR4 foi

capaz de impedir o aumento de citocinas/quimiocinas nessa cultura. Em conjunto esses dados

sugerem que o paclitaxel pode sensibilizar os neurônios sensitivos através do aumento dos

126

níveis de citocinas/quimiocinas pela ativação dos receptores TLR4 nas células satélites gliais

dos GRD.

Gráfico 29: A deleção gênica do receptor TLR4 previne o aumento de IL-6, MCP-1 e

KC/CXCL1 em cultura primária de células satélites gliais estimulada com LPS ou paclitaxel

A deleção gênica do receptor TLR4 previne o aumento dos níveis de IL-6, TNF-α, MCP1 e

KC/CXCL1 em cultura primária de células satélites gliais estimuladas com LPS ou PCX. A

quantificação foi determinada pelo método de ELISA. (A) Quantificação de TNF-α. (B) Quantificação

de IL-6. (C) Quantificação de MCP-1. (D) Quantificação de KC/CXCL1. Os dados foram

representados como a média ± E.P.M. para 4-6 animais. *P <0,05: quando comparado com o grupo

controle, ANOVA de uma via seguida por teste post-hoc de Bonferroni.

127

6.13 Modelo conceitual

Basedo nos resultados obtidos neste estudo, os seguintes mecanimos são

propostos: O paclitaxel se liga aos receptores TLR4 presentes em mastócitos na periferia,

estimulado essas células a produzirem/liberam mediadores pró-inflamatórios (TNF-α, IL-1β,

IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1) que sensibilizam o nociceptor. Nos gânglios da raiz dorsal o

paclitaxel que se liga a receptores TLR4 em células satélites gliais, ativa essas células que

liberam mediadores (TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1) sensibilizando neurônios sensoriais.

Adicionalmente mastócitos presentes nesses gânglios contribuem para a sensibilização dos

neuronios através da liberação de mediadores pró-inflamatórios (TNF-α, IL-6 E KC/CXCL1).

Além disso, no corno dorsal da medula espinal ocorre ainda um aumento da liberação de

mediadores pró-inflamatórios (TNF-α, IL-1Β, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1). Esses mediadores

produzindos pelos mastócitos e células satélites gliais contribuem então para o

desenvolvimento de dor aguda induzida por paclitaxel (Figura 12).

128

Figura 12 – Participação de mastócitos e células satélites gliais na síndrome de dor aguda

induzida por paclitaxel

A ativação de mastócitos pela ligação de paclitaxel (PCX) a receptores TLR4 causa liberação de

mediadores hiperalgésicos (citocinas/quimiocinas: TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1) que

ativam os nociceptores periféricos. Adicionalmente ocorre ativação de células satélites gliais (CSG) e

mastócitos presentes nos gânglios da raiz dorsal (GRD), através da ligação de paclitaxel a receptores

TLR4, isso causa a liberação de mediadores (TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1) que sensibilizam os

neurônios. No corno dosal ocorre ainda um aumento da liberação de mediadores (TNF-α, IL-1Β, IL-6,

MCP-1 e KC/CXCL1). Os estímulos hiperalgésicos liberados na periferia e nos GRD geram sinais que

vão até o corno dorsal da medula espinal. Do corno dorsal, os sinais são transportados ao longo da via

de dor ascendente para o córtex. Esses mediadores produzindos pelos mastócitos e células satélites

gliais contribuem então para o desenvolvimento de dor aguda induzida por paclitaxel.


129

7. DISCUSSÃO

130

Os resultados do presente estudo mostraram o envolvimento de citocinas como

TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1, assim como do receptor TLR4 na hiperalgesia

induzida por paclitaxel, quando o mesmo é injetado de forma sistêmica em uma única dose,

mimetizando o que acontece na clínica. Mastócitos aparecem como células que participam

desse mecanismo, provavelmente liberando grande parte desses mediadores investigados. A

injeção intravenosa de paclitaxel induziu respostas hiperalgesicas mecânica e térmicas,

evidenciando que o paclitaxel diminui o limiar de resposta a dor quando esses animais são

testados com estímulos mecânicos e térmicos de frio. As respostas hiperalgésicas começaram

dentro de 2 horas e atingiram o pico entre 4 e 6 horas, se resolvendo 24 horas após a

administração do paclitaxel.

As evidências clínicas mostram que o tratamento com este quimioterápico

frequentemente leva o paciente a experimentar quadros de dor aguda, o que reduz

significativamente a sua qualidade de vida. A dor induzida pelo paclitaxel inclui dor que

ocorre imediatamente após o tratamento com este fármaco, conhecida como síndrome da dor

aguda associada ao paclitaxel (REEVES et al., 2012; LOPRINZI et al., 2011) e

posteriormente desenvolve-se a neuropatia periférica que pode ser uma consequência

devastadora em longo prazo (ARGYRIOU, 2009).

A síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel é uma morbidade significativa

em pacientes que receberam tratamento com esse quimioterápico, atingindo cerca de 88% dos

pacientes tratados com este quimioterápico em doses altas (> 175mg/m2), desenvolvendo-se

logo após o primeiro ciclo de tratamento (REEVES et al., 2012; LOPRINZI et al., 2011). A

síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel ocorre geralmente dentro de 1-3 dias após a

administração da droga e se resolve dentro de 7 dias. A importância dada a síndrome da dor

aguda associada ao paclitaxel aumentou quando foi demonstrado que a sua intensidade pode

estar ligada a severidade da neuropatia crônica por paclitaxel. (LOPRINZI et al., 2011;

REEVES et al., 2012). Em um estudo clinico que avaliou o aparecimento de dor em pacientes

após o primeiro ciclo do tratamento com o quimioterápico paclitaxel verificou-se que

pacientes com altos escores de dor aguda tinham uma baixa recuperação da neuropatia crônica

induzida por esse fármaco (REEVES et al., 2012).

Os dados do presente estudo encontram-se de acordo com os resultados obtidos

por Yan e colaboradores (2015). Os autores também observaram que o paclitaxel induzia dor

aguda em roedores com inicio e duração mais curtos do que aqueles descritos para seres

humanos. No entanto, outros modelos de síndrome da dor aguda induzida pelo paclitaxel são

propostos, no qual os autores observaram que o desenvolvimento da dor aguda ocorre apenas

131

24 a 72 horas após a administração do quimioterápico. Porém nestes casos foram utilizados

ratos Wistar e a injeção de paclitaxel foi realizada por via intraperitoneal e não intravenosa, e

também foi administrada uma dose menor do quimioterápico (1mg/kg) (RIGO et al., 2013,

BRUSCO et al., 2016). Isso pode refletir uma diferença entre as espécies e explicar a

diferença de tempo encontrado entre os pesquisadores.

Diversos estudos clínicos descrevem a síndrome da dor aguda associada ao

paclitaxel, no entanto, os mecanismos pelos quais esse quimioterápico induz dor aguda

continuam pouco esclarecidos (GARRISON et al., 2003; LOPRINZI et al., 2007; LOPRINZI

et al., 2011; PACHMAN et al., 2011; REEVES et al., 2012). Até o momento, poucos estudos

foram desenvolvidos com o intuito de investigar os mecanismos desta síndrome dolorosa

aguda em modelos animais. Recentemente, um estudo demonstrou que o paclitaxel poderia

provocar dor aguda devido à ativação do receptor TLR4 na medula espinal e nos gânglios da

raiz dorsal (GRD) de ratos (YAN et al., 2015). Outro estudo sugeriu que os receptores de

bradicinina (B1 e B2) estão envolvidos no desenvolvimento desta síndrome dolorosa aguda

(BRUSCO et al., 2016). A investigação dos mecanismos moleculares envolvidos na síndrome

da dor aguda associada ao paclitaxel pode fornecer fundamentos para o desenvolvimento de

tratamentos eficazes para essa síndrome dolorosa (POLOMANO et al., 2001; RIGO et al.,

2013). Além disso, a investigação dos mecanismos envolvidos pode auxiliar na redução da

intensidade, incidência ou ainda na prevenção de dor crônica, pois, há evidências que a dor

aguda pode está relacionada com o aparecimento e severidade da dor neuropática observada

após o tratamento com o paclitaxel (REEVES et al., 2012; LOPRINZI et al., 2011).

Os primeiros estudos clínicos que associaram o paclitaxel ao aparecimento de dor

aguda se referiam a essa condição como mialgias e artralgias causadas pelo paclitaxel,

indicando que este quimioterápico possivelmente estaria causando lesão nos músculos ou

articulações dos pacientes (GARRISON et al., 2003). Entretanto, foi demonstrado que o

paclitaxel não causava dor devido a lesões musculares ou articulares, mas sim porque,

possivelmente, o quimioterápico estaria induzindo hipersensibilidade sensorial, devido à

sensibilização dos nociceptores (LOPRINZI et al., 2007). Atualmente, essa morbidade

dolorosa, descrita antes como artralgias e/ou mialgias causadas pelo paclitaxel, é denominada

de síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel (“Paclitaxel-associated Acute Pain

Syndrome, P-APS) (REEVES et al., 2012; LOPRINZI et al., 2011). Estudos realizados em

roedores indicaram que a administração de paclitaxel poderia causar dor neuropática, pois os

animais desenvolveram alodínia mecânica e hiperalgesia térmica (POLOMANO et al., 2001;

FLATTERS et al., 2006; CHEN, YANG, WANG, 2011), no entanto, a avaliação e descrição

132

de um modelo de síndrome de dor aguda em animais não era explorado. Então, para estudar

os mecanismos envolvidos nesta patologia foi desenvolvido um modelo de síndrome de dor

aguda induzida por paclitaxel em roedores (DINA et al., 2001; RIGO et al., 2013; YAN et al.,

2015).

Várias hipóteses são propostas para explicar o desenvolvimento de dor aguda

induzida pelo paclitaxel. A primeira possibilidade seria o envolvimento patológico dos

músculos, articulações, nervos ou outros tecidos. Outra hipótese seria a relação desta

síndrome com uma disfunção das fibras nociceptivas, ou do sistema espinotalâmico. No

entanto, a possibilidade de disfunção dos nociceptores seria o mecanismo primário para o

desenvolvimento da dor, ou ainda, o desenvolvimento da dor seria uma reposta secundária

como, por exemplo, a inflamação induzida pelo paclitaxel. As lesões nervosas provavelmente

se devem a um efeito do agente sobre os tecidos nervosos ou um efeito mediado por

inflamação induzida pelo paclitaxel (LONPRINZI et al., 2007).

A hipótese de que o paclitaxel causa dor aguda devido à indução de uma

inflamação é reforçada pelos dados obtidos no presente estudo. Os resultados mostraram que

a administração de paclitaxel aumenta significativamente a concentração de citocinas no

plasma, nervo isquiático, GRD e medula espinal de camundongos. Adicionalmente a

expressão relativa de RNAm da IL-6 estava alterada no nervo isquiático, GRD e medula

espinal, após o tratamento com paclitaxel. Além disso, ficou demostrado um aumento da

imunoexpressão de IL-6 no GRD de camandugos 4 horas após o tratamento com paclitaxel,

no entanto 6 horas após o tratamento essa marcação começa a desaparecer, passando então os

neurorios a expressá-la. O aumento desses mediadores coincide com o desenvolvimento da

hiperalgesia, apresentado o mesmo curso temporal. Esses mediadores encontram-se em

concentrações basais e aumentam consideravelmente entre 4 e 6 horas após a administração

de paclitaxel, desaparecendo quase que totalmente 24 horas após a administração da droga.

Os resultados mostraram que a administração de paclitaxel provocou aumento das

citocinas pró-inflamatórias IL-1β, TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1 no plasma de camundongos que

receberam paclitaxel. No nervo isquiático o paclitaxel provocou aumento de IL-1β, TNF-α,

IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1. A quantificação relativa do RNAm revelou que o tratamento com

paclitaxel induziu um aumento da expressão gênica para a IL-6. No entanto, não houve

aumento na expressão das citocinas IL-1β e TNF-α, o que pode evidenciar que a IL-6 liberada

é devido exclusivamente a estimulação direta dos mastócitos, já que esse mediador encontra-

se armazenado nos grânulos dessas células (MARSHALL, MCCURDY, OLYNYCH, 2003).

133

Nos gânglios da raiz dorsal de animais tratados com paclitaxel, TNF-α, IL-6 e

KC/CXCL1 estavam aumentados. Porém, IL-1β e MCP-1 não foram aumentados pela

administração de paclitaxel. Quanto a expressão relativa de RNAm, o tratamento com

paclitaxel foi capaz de aumentar a expressão relativa de RNAm para IL-1β, TNF-α e CCR2

nos GRD. Quando realizou-se immunofluorescencia para IL-6 nos GDR, foi observado um

aumento da imunoexpressão para essa citocina 4 horas após a administração de paclitaxel,

corroborando que a produção de citocinas está envolvida no processo de desenvolvimento de

dor induzida por paclitaxel. Entretanto, não foi observada diferença na expressão relativa do

RNAm para IL-6 e MCP-1.

Na medula espinal, o tratamento com paclitaxel provocou aumento de IL-1β,

TNF-α, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1. Detectou-se ainda aumento na expressão relativa do

RNAm para IL-1β, TNF-α e IL-6, MCP-1 e para o receptor CCR2. O paclitaxel pode causar

dor devido à produção desses mediadores que sensibilizaria o nociceptor, já que citocinas pró-

inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-1β, e KC/CXCL1 são essenciais para o desenvolvimento

de doenças inflamatórias e hiperalgesia. Esta sensibilização deixa o neurônio mais suscetível a

estímulos que normalmente não causaria dor, processo conhecido como alodinia. O paclitaxel

poderia desenvolver dor aguda nos pacientes devido à indução de produção de citocinas e/ou

quimiocinas. Zhang e colaboradores (2013) mostraram que a neuropatia induzida por

paclitaxel está associada com uma indução da quimiocina MCP-1 e do seu receptor CCR2 em

neurônios sensoriais primários de GRD. Eles observaram que o MCP-1 estava expresso tanto

na medula espinal quanto nos GRD, mas o CCR2 só estava expresso nos GRD. E essa

expressão se iniciava 4 horas após a administração de paclitaxel. No entanto, no presente

estudo foi observado que o MCP-1 só aumentou significativamente 24 horas após a

administração de paclitaxel apenas na medula espinal. Já o CCR2 estava expresso em ambos,

GRD e medula espinal, isso pode indicar que principalmente o aumento da expressão do

receptor nas primeiras horas após a adiministração de paclitaxel contribui para o

desenvolvimento de dor aguda. E com o avanço do tratamento com paclitaxel essa quimiocina

e seu receptor passam a contribuir para o desenvolvimento da dor na neuropatia.

Separado dos seus efeitos sobre os microtúbulos, o paclitaxel, pode induzir genes

que codificam TNF- (DING et al., 1990; BODGAN et al., 1992; HWANG e DING, 1995;

MANTHEY et al., 1992, 1993; BURKHART et al., 1994; KIRIKAE et al., 1996, 1998),

interleucinas como a IL-1, IL-8 e IL-6 (BODGAN et al., 1992, MANTHEY et al., 1992,

LEE et al., 1996; WHITE et al., 1996; WATSON et l., 1998); e enzimas como a óxido nitrico

sintase (MANTHEY et al., 1992, KIRIKAE et al., 1996, 1998) e cicloxigenase-2 (MOOS e

134

FITZPATRICK, 1998, SUBBARAMAIAH et al., 2000) o que gera a produção de mediadores

inflamatórios e álgicos. O paclitaxel então estimula a produção e/ou a liberação desses

mediadores que sensibilizaram o nociceptor causando o aparecimento de dor aguda.

No presente estudo verificou-se que a deleção gênica para IL-6 ou o uso de um

antagonista dessa citocina, bem como a deleção gênica do receptor IL-1R, ou a deleção dupla

dos receptores de TNF (animais duplo-nocaute, TNFR1/R2), ou ainda a deleção gênica do

receptor da quimiocina MCP-1 (CCR2), inibiram a hiperalgesia aguda mecânica e térmica

induzida pelo tratamento com o paclitaxel, sugerindo o envolvimento destes mediadores na

síndrome aguda associada ao paclitaxel. Portanto, esses resultados são fortes evidencias que a

participação de citocinas/quimiocinas é primordial para o desenvolvimento da dor aguda

induzida por este quimioterápico, sugerindo que essa dor teria uma origem, pelo menos em

parte, inflamatória.

A dor de origem inflamatória resulta essencialmente da sensibilização dos

neurônios sensoriais primários (FERREIRA, 1972). Existe crescente evidência de que, além

da sensibilização periférica, a dor inflamatória pode ser dependente de um processo que

ocorre na medula espinal, assim como nos gânglios da raiz dorsal e gânglio trigeminal. Na

medula espinal, a plasticidade neuronal é modulada dinamicamente pela microglia ativada e

mediadores derivados de astrócitos, o que pode aumentar à capacidade de resposta a dor

(SOUZA et al., 2013). Os mecanismos envolvidos na sensibilização dos neurônios sensoriais

primários podem ser divididos em dois processos. O primeiro inclui eventos não neuronais

residentes que recrutam células imunes, as quais produzem uma sequência de mediadores da

hiperalgesia inflamatória iniciados pelo TNF-α. Isso provoca a liberação de IL-1β e

quimiocinas que por sua vez estimulam a liberação direta de mediadores que atuam no

nociceptor (VALÉRIO et al., 2009). O segundo processo inclui ativação das vias de

sinalização intracelular, tais como o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), proteína

quinase A (PKA) e proteína quinase C (PKC) (ALEY e LEVINE, 1999; KHASAR et

al.,1999).

Várias células imunes como, por exemplo, os mastócitos podem mediar ações

pró-inflamatórias ou imunorregulatórias através de sua degranulação quando ativados

(GALLI, NAKAE, TSAI, 2005). Além disso, os mastócitos são importantes reguladores

celulares das vias fisiológicas e patológicas da dor (WOOLF, 2010). A interação entre o

sistema nervoso e o sistema imunológico desempenha um papel central no processamento da

dor (REN e DUBNER, 2010). O mastócitos são particularmente importante neste aspecto,

uma vez que são frequentemente encontradas nas proximidades de neurônios nociceptivos

135

(FORSYTHE e BIENENSTOCK, 2012) e, portanto, podem participar na sinalização em

sinapses neuro-imunes (FORSYTHE e BIENENSTOCK, 2012). Os mastócitos induzem a

ativação do nociceptor através da liberação de mediadores químicos durante a degranulação e

podem ser ativados por mediadores liberados de nociceptores após lesão (REN e DUBNER,

2010; FORSYTHE e BIENENSTOCK, 2012).

Tem sido proposto que a degranulação de mastócitos pode desempenhar um papel

na dor neuropática induzida por paclitaxel (GAO et al., 2016), pois mediadores químicos

liberados de mastócitos pela sua degranulação ativam nociceptores (FORSYTHE e

BIENENSTOCK, 2012) e consequentemente ocorre geração de dor. Devido a essas

evidências de que os mastócitos participam da neuropatia induzida por paclitaxel, resolveu-se

investigar a participação dessas células imunes na dor aguda induzida por esse

quimioterápico, tendo em vista que os mastócitos estão envolvidos em respostas inflamatórias

e hiperalgesicas agudas. Os resultados do presente estudo demonstraram que em animais que

não que diferenciam mastócitos (SH), as respostas hiperalgesicas desencadeadas por

paclitaxel não se desenvolveram, quando comparados com camundongos selvagens (WT).

Além disso, animais WT foram pré-tratados com cromoglicato de sódio, um estabilizador de

membrana de mastócitos, e posteriormente injetados com paclitaxel. Observou-se então que o

tratamento com cromoglicato de sódio foi capaz de prevenir a hiperalgesia mecânica e

térmica, quando comparados com os animais que não receberam esse tratamento.

Também foi demostrado através de um aumento na imunoexpressão de triptase no

GRD de camundongos tratados com paclitaxel que os mástócitos podem estão envolvidos no

desenvolvimento da dor aguda induzida por esta droga. A triptase é uma protease de serina

tetramérica neutra que existe abundantemente nos mastócitos e, em menor concentração, em

outras linhagens celulares como os basófilos (SCHWARTZ, 2001). A triptase tem sido

vastamente utilizada como indicador do número e da ativação de mastócitos. Conjuntamente

esses resultados revelaram que os mastócitos estão envolvidos no desenvolvimento de

hiperalgesia mecânica e térmica no modelo de síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel.

Provavelmente o paclitaxel estaria ativando os mastócitos que liberariam mediadores

químicos através da degranulação que ativariam nociceptores (REN e DUBNER, 2010;

FORSYTHE e BIENENSTOCK, 2012). Adicionalmente, o aumento da imunoexpressão de

triptase foi acompanhada pela maracação de IL-6, pricipalmente 4 horas após o tratamento

com o paclitaxel. Percebe-se que existem marcações coincidentes de triptase e IL-6, indicando

possivelmente que os mastócitos estão liberando esta citocina. Estudos relataram que a

resposta nociceptiva desencadeada pelos mastócitos está relacionada à liberação de

136

mediadores tais como a histamina, serotonina, IL-1β, TNF-α e IL-6. Estes mediadores têm a

capacidade de induzir hiperalgesia independentemente (CHATTERJEA et al., 2012; CUNHA

et al., 1992; VERRI et al., 2006) ou ainda induzir hiperalgesia evocada por alérgenos

(LAVICH et al., 2003, 2006), através de efeitos diretos em nociceptores, ou por estimulação

da produção de mediadores finais, tais como leucotrienos e prostanóides (CUNHA et al.,

1992). Além disso, os mastócitos que residem nas proximidades de fibras nervosas não

mielinizadas tais como as fibras C nociceptivas, podem sofrer alterações ultraestruturais que

permitem uma degranulação fragmentada diferencial ou seletiva (FORSYTHEAND e

BIENENSTOCK, 2012).

Foi demonstrado em um modelo de neuropatia que o tratamento com

cromoglicato de sódio, que impede que os mastócitos degranulem, eliminou total ou

parcialmente o desenvolvimento de hiperalgesia após a indução de neuropatia em ratos, o que

foi associado a uma redução do número de neutrófilos e macrófagos no local da lesão (ZUO

et al., 2003). Estes resultados contribuem para a hipótese de que os mastócitos estariam sendo

ativados pelo paclitaxel e consequentemente liberando mediadores que sensibilizariam os

nociceptores, isto é reforçado pelo fato que animais SH, não desenvolveram respostas

hiperalgesicas. Adicionalmente o tratamento de animais WT com cromoglicato de sódio, foi

capaz de inibir respostas nociceptivas mecânica e térmica em comparação a animais que não

receberam a droga, mas foram injetados com paclitaxel.

Para confirmar que os mastócitos estariam produzindo mediadores inflamatórios e

esses mediadores estariam contribuindo para o desenvolvimento da dor aguda induzida pelo

paclitaxel, foi realizada a quantificação de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas no nervo

isquiático, gânglios da raiz dorsal e medula espinal de camundongos SH tratados com

paclitaxel, ou ainda camundongos pré-tratados com cromoglicato de sódio e, posteriormente,

injetados com paclitaxel. Demonstrou-se então, que IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1e KC/CXCL1

estavam diminuidas no nervo isquiático dos animais SH, bem como nos animais tratados com

cromoglicato de sódio. Nos gânglios da raiz dorsal de camundongos SH tratados com

paclitaxel, sa concentrações de TNF-α, IL-6 e KC/CXCL1 foram reduzidas. O pré-tratamento

com cromoglicato de sódio também foi capaz de prevenir o aumento destes mediadores. Na

medula espinal dos camundongos SH tratados com paclitaxel, IL-1β, TNF-α, IL-6 e

KC/CXCL1 foram reduzidos quando comparados ao grupo de camundongos WT tratados

com paclitaxel. Já a concentração MCP-1 não foi alterada. Estes dados revelaram que o

aumento da concetração de citocinas e quimiocinas que ocorreu nos camundongos

137

concomitantes ao desenvolvimento de hiperalgesia mecânica e térmica, evidencia que os

mastócitos podem contribuir para a dor aguda induzida por paclitaxel.

Gao e colaboradores (2016) demonstraram que o aumento de histamina no plasma

de ratos tratados com paclitaxel, ocorreu conjuntamente com a hiperalgesia mecânica e

térmica ao calor, os autores então sugerem que a histamina contribui para a dor neuropática

induzida pelo paclitaxel. No entanto, é sabido que os mastócitos produzem uma variedade de

mediadores, além de histamina, como outras aminas bioativas como a serotonina. Produzem

ainda enzimas (hidrolases ácidas, fosfolipases, quimase, triptase e outras proteases), citocinas

(IL-1, IL-6, TGF, GM-GCSF, TNF-α), metabolitos lipídicos (leucotrienos, prostaglandinas,

fator ativador de plaquetas - PAF), ATP (adenosina trifosfato), neuropeptídeos (peptídeo

intestinal vasoativo), fatores de crescimento (fator de crescimento de nervos - NGF) e óxido

nítrico (SCHWARTZ e AUSTEN, 1980; JOHNSON e KRENGER, 1992). Os resultados do

presente estudo demonstraram que além do plasma, o nervo isquiático, os gânglios da raiz

dorsal e a medula espinal apresentaram níveis elevados de citocinas e/ou quimiocinas, que

como demonstrado pode ser produzidas, pelo menos em parte, por mastócitos e liberados pela

quando ativados. Ativação esta induzida pelo paclitaxel. Esses mediadores liberados podem

estar induzindo a produção de novos mediadores pelos mastócitos. Fica claro que a ativação

de mastócitos pelo paclitaxel evidenciado pelo aumento da imunoexpressão para triptase nos

gânglios da raiz dorsal, especialmente 4 horas após o tratamento com esta droga causou um

aumento nos níveis de mediadores que possivelmente estariam sensibilizando o nociceptor.

Fato evidenciado pela comarcação de IL-6 e triptase, indicando possivelmente que são os

mastócitos que produzem/liberam esta citocina.

Com intuito de confirmar a que a ativação dos mastócitos é responsável, pelo

menos em parte, pela produção/liberação de citocinas e quimiocinas na dor aguda induzida

por paclitaxel, foram quantificados IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 em cultura de linhagem de

mastócitos (RBL-2H3) estimulada com paclitaxel. Os resultados mostraram que a estimulação

com paclitaxel provocou aumento de TNF-α, IL-6 e MCP-1. Quando estimulados com

diferentes doses de paclitaxel, mastócitos em cultura liberaram/produziram esses mediadores.

Mediadores esses, que também estavam aumentados no plasma, nervo isquiático, gânglios da

raiz dorsal e medula espinal.

Estudos anteriores demonstraram que essa linhagem de células produzia/liberava

várias citocinas e/ou quimiocinas tais como IL-1β, TNF-α e IL-6 (ZENG et al., 2016; TANG

et al., 2015), e MCP-1 (AHN et al., 2014). No entanto, não existem estudos publicados

mostrando que o paclitaxel ativa mastócito, e estes liberam mediadores hiperalgésicos. Um

138

estudo publicado recentemente demonstrou que a quercetina, melhora a dor neuropática

induzida por paclitaxel. O estudo relata que a quercetina estabiliza a membrana de mastócito

e, assim, a liberação excessiva de histamina é inibida. Sugerindo que a quercetina atenua a dor

neuropática induzida pelo paclitaxel. Esta ação da quercetina sobre os mastócitos impediria o

desenvolvimento de dor neuropática (GAO et al., 2016). Os autores testaram essa hipótese in

vivo e in vitro. Essa investigação pode confirmar a hipótese de que o paclitaxel estimula

mastócitos que por sua vez liberam mediadores hipernociceptivos que sensibilizam o

nociceptor gerando dor aguda. Esse mecanismo, portanto seria fundamental para o

desenvolvimento da síndrome da dor aguda associada ao paclitaxel.

No inicio da década de 1990, foi demonstrado que o paclitaxel mimetizava os efeitos

do lipopolissacarídeo (LPS) em macrófagos murinos, aumentando a liberação de TNF-α. Por

causa do comportamento comparável entre LPS e paclitaxel em células animais nas quais foi

determinado geneticamente o papel do LPS, os autores concluíram que o LPS e o paclitaxel

compartilhavam uma etapa inicial no processo de transdução de sinal (DING et al., 1990;

BODGAN et al., 1992).

Paclitaxel e outros taxanos não são quimicamente relacionados ao LPS, assim é

duvidoso que eles ocupem o mesmo sítio do LPS no receptor. No entanto, desde 1992, vários

autores vêm defendendo a hipótese de que o paclitaxel age através de um mecanismo receptor

dependente (MANTHEY et al., 1992; ZAKS-ZILBERMAN et al., 2001, 1998; PERERA et

al., 1997; MANTHEY et al., 1994; BHAT et al., 1999). Reforçando essa ideia, Manthey e

colaboradores (1993) foram os primeiros a referirem que antagonistas do receptor de LPS

inibem a expressão de genes e a fosforilação da proteína de tirosina pelo paclitaxel. Eles

também demonstraram que outro taxano, potente estabilizador de microtúbulos, o docetaxel,

não ativou as vias de sinalização dependentes de LPS ou induziu TNF-α em macrófagos

murinos. O contraste da potência e eficácia entre paclitaxel e docetaxel como indutores de

genes pró-inflamatórios em macrófagos murinos indicou que a estabilização de microtúbulos

per si era insuficiente para causar indução de gene ou mimetização da sinalização por LPS em

macrófagos murinos. Isto sugere que o mecanismo pelo qual o paclitaxel induz a estabilização

de microtúbulos não é o mesmo da indução de genes pró-inflamatórios. Embora o paclitaxel e

o LPS não sejam estruturalmente relacionados, eles compartilham sua ação no mesmo

receptor. Vários grupos de pesquisadores vêm estudando o envolvimento dos receptores Toll

like (Toll-like receptors - TLR) na via de transdução de sinal paclitaxel/LPS-símile em

camundongos (KAWAZAKI et al., 2000, 2001; BYRD-LEIFER et al., 2001).

139

A família de TLR apresenta um papel crucial nas respostas celulares ao LPS. No

reconhecimento de endotoxina das bactérias gram-negativas. O receptor Toll-like 4 (TLR4)

associa-se fisicamente ao complexo LPS-CD14, no qual o CD14 é o receptor específico para

LPS, ocorrendo ainda a ligação de uma proteína acessória extracelular, chamada MD2

(WRIGHT et al., 1900; KOPP; MEDZHITOV,1999). O TLR4 utiliza uma via de transdução

de sinal que consiste no recrutamento de várias proteínas intracelulares (MyD88, IRAK e

TRAF-6) que vão desencadear as vias JNK e ERK da cascata MAPK, envolvidas na ativação

dos fatores de transcrição AP-1 e NF-κB (nuclear factor kappa B), favorecendo a expressão

de genes envolvidos na resposta inflamatória (BOCHUD e CALANDRA, 2002).

Alguns alvos moleculares foram estudados como sendo mecanismos relevantes para

a dor aguda induzida por paclitaxel, dentre estes alvos pode citar o receptor TLR4.

Recentemente, foi demonstrando que o paclitaxel provoca a ativação deste receptor no corno

dorsal da medula e gânglios da raiz dorsal de ratos, aumentando as atividades sinápticas

glutamatérgicas, e reduzindo as atividades de transporte de glutamato gliais no corno dorsal

da medula e que esses eventos são críticos na gênese da dor aguda induzida por paclitaxel em

animais (YAN et al., 2015). No entanto, ainda não foi investigado se o paclitaxel ativa o

receptor TLR4 em mastócitos, ocasionando sua degranulação, o que contribuiria para o

desenvolvimento da dor aguda associada ao paclitaxel.

Para averiguar a hipótese de que o paclitaxel ativaria o receptor TLR4 em

mastócitos, foi avaliada a participação desse receptor na hiperalgesia induzida por este

quimioterápico. De acordo com o que é descrito na literatura, verificou-se que em animais

TLR4-/- as respostas hiperalgesicas induzidas por paclitaxel não se desenvolveram quando

comparado aos animais WT. Adicionalmente verificou-se que a ativação desse receptor

aumenta a expressão de citocinas ou quimiocinas em camundongos tratados com paclitaxel.

Foi verificado que esse quimioterápico não provocou aumento de IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1

e KC/CXCL1 no plasma, nervo isquiático, gânglios da raiz dorsal e medula espinal de

camundongos TLR4-/-. No plasma desses camundongos tratados com paclitaxel, TNF-α, IL-6

e KC/CXCL1 tiveram uma significativa redução após a administração de paclitaxel. No nervo

isquiático IL-1β, TNF-α, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1 apresentam-se reduzidos, quando

comparados aos animais WT. Nos gânglios da raiz dorsal, observou-se que nos camundongos

TLR4-/- tratados com paclitaxel, TNF-α e KC/CXCL1 foram reduzidos quando comparados

ao grupo de camundongos WT. No entanto IL-6 não foi reduzido em comparação ao grupo

WT nos animais TLR4-/-. Na medula espinal de camundongos TLR4-/- tratados com

140

paclitaxel, TNF-α, MCP-1 e KC/CXCL1 apresentam-se reduzidas em comparação ao grupo

de camundongos WT, apenas 6 horas após o tratamento.

Os mastócitos expressam TLR funcionais (MARSHALL, 2004), o que pode explicar

a proteção conferida por mastócitos contra infecções bacterianas e parasitárias em modelos

animais (GALLI, NAKAE, TSAI, 2005; MARSHALL, MCCURDY, OLYNYCH, 2003). Os

mastócitos ativados liberam uma variedade de potentes mediadores inflamatórios por

descarga rápida de mediadores pré-formados presentes em seus grânulos, além da geração de

lipídios inflamatórios a partir do ácido araquidônico e a produção de numerosas citocinas e

quimiocinas de tipo Th2 (GALLI, NAKAE, TSAI, 2005). Todas estas respostas são evocadas

por alérgenos via FcεRI (receptor de alta afinidade para a IgE), que são membros da família

dos receptores multicadeia de reconhecimento imune (MIRRs) (SHIMIZU et al., 1988;

METZGER, 1992), enquanto que a estimulação de mastócitos através de TLR2 e TLR4

resulta essencialmente na produção de citocinas, tais como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 e

TNF-α (MARSHALL, MCCURDY, OLYNYCH, 2003). Há relatos de que ligantes TLR2

também induzem a degranulação e geração de leucotrienos C4 (SUPAJATURA et al., 2002;

MCCURDY et al., 2003; VARADARADJALOU et al., 2003). No entanto, um estudo

realizado por Qiao e colaboradores (2006) descobriu que o antígeno interage sinergicamente

com ligandos de TLR2 e TLR4 para aumentar acentuadamente a produção de citocinas em

linhagens de mastócitos murinos.

Os dados obtidos demonstram que a ausência tando de mastócitos, quanto à do

receptor TLR4 previnem o aumento de citocinas/quimiocinas no plasma, nervo isquiático,

gânglios da raiz dorsal e medula espinal de camundongos tratados com paclitaxel. Reforçando

a hipótese de que o paclitaxel se liga ao TLR4 presente em mastócitos, ativando essas células

liberando mediadores, e isso levaria ao aumento de citocinas e quimiocinas que por sua vez

sensibilizariam o nociceptor, gerando a dor aguda associada ao paclitaxel. Essa hipótese

poderia se confimada por uma cultura de mastócitos KO para TLR4.

Os resultados do estudo sugerem ainda que o paclitaxel, estimula células satelites

gliais do gânglio da raiz dorsal que liberam citocinas/quimiocinas e a liberação dessas

citocinas/quimiocinas por essas células atuam em neurônios sensitivos do gânglio da raiz

dorsal resultando em uma mudança fenotípica que causa dor. Estudos anteriores sugerem o

envolvimento do TNF-α no desenvolvimento da dor neuropática induzida pelo paclitaxel

(LEDEBOER et al., 2007; CATA; WENG; DOUGHERTY, 2008). Para confirmar essa

hipótese, cultura primária de células satelites gliais de gânglios da raiz dorsal, foram

estimuladas com paclitaxel. Nossos resultados, demonstraram que o paclitaxel induziu a

141

liberação de TNF-α, IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1 nessa cultura. Esses resultados sugerem que

a sinalização de citocinas/quimiocinas produzidas por células satelites gliais é necessária para

a facilitação da dor aguda induzida pelo paclitaxel.

Adicionalmente, os resultados sugerem que a liberação de citocinas/quimiocinas

pelas células satélites gliais é devido a ligação do paclitaxel ao receptores TLR4. Isto foi

evidenciado através da utilização de animais KO para esse receptor. Verificou-se então que a

deleção do gene para o receptor TLR4 foi capaz de prevenir o aumento de

citocinas/quimiocinas em cultura de células satélites gliais de gânglios da raiz dorsal de

camundongos KO para os receptores TLR4. Ficou demonstrado ainda que esse efeito é

seletivo para TLR4, tendo em vista que em animais KO para os receptores TLR2, não foi

observado diminuição dessas citocinas/quimiocinas quando estimulados com paclitaxel. Esses

resultados estão de acordo com o que observado in vivo, pois demostrado que o paclitaxel

aumenta a expressão e a liberação de citocinas/quimiocinas a partir de células satélites gliais,

um efeito que não foi observado em camundongos KO para os receptores TLR4. Estudos têm

demonstrado que o paclitaxel pode alterar o fenótipo dos neurônios e da glia através de

mecanismos de ação que diferem dependendo da concentração. In vitro, o paclitaxel (10 nM)

aumenta a liberação de CGRP atravéz de um agonista de TRPV1 (capsaicina) em neurônios

de gânglios da raiz dorsal. Enquanto o paclitaxel em doses mais altas (300 nM) inibe a

liberação de CGRP evocada por capsaicina (PITTMAN et al., 2014). Outro estudo, in vivo,

relatou que o paclitaxel em doses baixas (1-2 mg/kg) regula a expressão de TLR4 em

neurônios do gânglio da raiz dorsal e em astrócitos do corno dorsal da medula espinal (LI et

al., 2014). Ledeboer e colaboradores (2007) mostraram que citocinas inflamatórias estão

implicadas na patogênese da dor neuropática induzida por paclitaxel. Nós mostramos que isso

também ocorre na dor aguda.

No estudo, foi demonstrado um aumento da imunoexpressão de c-Fos, marcador

de ativação neuronal, nas células satélites glias de gânglio da raiz dorsal, 4 e 6 horas após a

administração de paclitaxel. Já no corno dorsal da medula espinal, houve aumento da

imunoexpressão de c-Fos apenas 6 horas após a administração da droga. A expressão de c-fos,

pode ser induzido por estímulos nocivos, tendo em vista que os níveis de Fos são baixos em

condições basais, no entanto, estímulos externos podem resultar em reprogramação fenotípica

da célula, aumentando os níveis de c-fos. Assim, Fos é um marcador útil para rastrear os

efeitos de estímulos farmacológicos, elétricos e fisiológicos no sistema nervoso e tem sido

utilizado para indicar dor e neuroplasticidade (AZEVEDO et al., 2013).

142

Diante disso, a realização da imunofluorescência para c-fos, no gânglio da raiz

dorsal e no corno dorsal da medula espinal, demonstram que o paclitaxel causa ativação

neuronal, observado pelo aumento da imunoexpressão de c-Fos em células satélites gliais e

em neurônios. Este aumento na expressão de c-Fos está relacionada à atividade neuronal e à

intensidade da dor (TEIXEIRA, 2009). Além de neurônios, células satélites gliais tembém

expressam c-Fos. A morfologia das células marcadas na imunofluorescência para c-fos

assemelham-se a células satélites gliais. Roivainen e Koistinaho (1990) demonstraram que

células satélites gliais expressam c-fos após a transecção do tronco simpático. Diante dessas

evidencias, sugere-se o paclitaxel possa estar ativando neurônios e células satélites gliais,

estas liberam mediadores inflamatórios que desencadeiam um processo doloroso logo após a

primeira administração de paclitaxel.

Os resultados obtidos no presente estudo indicaram que mastócitos e células

satélites gliais podem estar envolvidos na hipernociepção aguda causada pela administração

de paclitaxel em camundongos. Os dados indicam que o paclitaxel estimula os mastócitos

células satélites gliais que, por conseguinte produzem e/ou liberam mediadores que por sua

vez sensibilizaram os neurônios nociceptivos após a administração da droga, contribuindo

assim para o desenvolvimento da dor aguda. Estes mecanismos conjuntamente podem

contribuir para a nocicepção aguda que se manifesta após a administração de paclitaxel.

Portanto, esse estudo pode fornecer informações para se elucidar o mecanismo pelo qual o

PCX induz dor aguda e fornecer subsídios para a prevenção do aparecimento dessa condição.

Implica também na prevenção ou na atenuação da neuropatia, tendo em vista que a dor aguda

prediz o aparecimento e a severidade da neuropatia crônica induzida pelo paclitaxel.

143

8. CONCLUSÃO

144

Concluiu-se que a administração de paclitaxel induz hiperalgesia mecânica e

térmica ao frio em camundongos, iniciando 2h, com pico na 6ª hora e resolução 24h pós-

administração. O estudo, mostra pela primeira vez, que mastócitos e células satélites gliais

estão envolvidos na sídrome de dor aguda induzida por paclitaxel. Adicionalmente, o estudo

revelou que a ativação de mastócitos e de células satélites gliais, possivelmente pela ligação

do paclitaxel a TLR4 leva a liberação de mediadores inflamatórios, tais como IL-1β, TNF-α,

IL-6, MCP-1 e KC/CXCL1, que possivelmente sensibilizam o nociceptor, gerando dor aguda

após administração da droga.

145

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ANEXOS

universidade federal do cearÁ faculdade de … · obrigado por tornarem minha vida melhor. a minha...

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