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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ANA FLÁVIA SERAINE CUSTÓDIO VIANA
EFEITO GASTROPROTETOR E CICATRIZANTE DO (-)-MIRTENOL
FORTALEZA
2017
ANA FLÁVIA SERAINE CUSTÓDIO VIANA
EFEITO GASTROPROTETOR E CICATRIZANTE DO (-)-MIRTENOL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia. Orientadora: Profa. Dra. Flávia Almeida Santos Coorientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia Meneses Oliveira
FORTALEZA
2017
ANA FLÁVIA SERAINE CUSTÓDIO VIANA
EFEITO GASTROPROTETOR E CICATRIZANTE DO (-)-MIRTENOL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia
Aprovada em: ___/___/______
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Profª. Drª. Flávia Almeida Santos
(Orientadora) Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Profª. Drª. Rita de Cássia Meneses Oliveira (Coorientadora)
Universidade Federal do Piauí (UFPI)
_________________________________________ Profª. Drª. Nylane Maria Nunes de Alencar
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães
Universidade Federal do Ceará (UFC)
__________________________________________ Prof. Dr. Fábio Miyajima
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profª. Drª. Adriana Rolim Campos Barros
Universidade de Fortaleza (UNIFOR)
Ao grande arquiteto do universo, Deus,
minha eterna fonte de força, amor e
proteção em todos os momentos.
Aos meus amados pais Ândrea Maria e
Edivaldo Viana meus heróis, meu
exemplo de vida, minha base sólida, pela
compreensão, amor e apoio incondicional.
A minha amada Avó Maria Élia (in
memorian) por todo amor, dedicação,
carinho e proteção.
A minha irmã Danielle Seraine e meu
primo-irmão Rafael Seraine pelo
incentivo e ajuda.
A toda minha família.
AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal do Ceará. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Ensino Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro e técnico.
A minha orientadora Profª. Drª. Flávia Almeida Santos, pelo incentivo e apoio científico.
Obrigada pela oportunidade, por me aceitar, pela paciência e por toda ajuda.
A minha coorientadora Profª. Drª. Rita de Cássia Meneses Oliveira da Universidade
Federal do Piauí, pelo incentivo, apoio científico e amizade. Minha mãe-científica
obrigada por toda ajuda.
Ao professor Dr. Vietla Satyanarayana Rao, um grande mestre, pelos conselhos e
contribuições científicas.
Aos professores participantes da banca examinadora de qualificação e de defesa, pelo
tempo, pelas valiosas colaborações e sugestões.
Aos professores e demais funcionários do Programa de Pós Graduação em
Farmacologia da Universidade Federal do Ceará.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Produtos Naturais (LPN), levarei todos no
coração. As doutorandas Rose Anny Costa, sempre solícita e Tuelly Bandeira, obrigada
amiga pelas palavras de força nos momentos de fraqueza. A pós doc Franciele Lunardi
sempre disponível para ajudar. A mestranda Karina Moura, um dos seres humanos mais
puros que conheci nessa vida. Aos meninos da iniciação científica que passaram pelo
laboratório, Bruno Rodrigues, Bruno Ripardo, Ana Patrícia Lima e Anderson Dantas, e
aos atuais, Mirela Magalhães, Amanda Braga, Renam Lima e Thais Moreira em especial
a um grande jovem que virou um amigo-irmão, Iury Nunes estarei sempre torcendo por
você. As técnicas, Gabrielle de Paula, pelo apoio e Aguinea Rocha (Gui), que não está
mais no LPN, mas continua como amiga presente no coração e na minha vida. As
queridas “agregadas do laboratório” Milena Aguiar, Greyce Luri e Diana Valesca, boas
amigas e ouvintes das lamúrias experimentais. A amiga Anastácia de Araújo que
durante sua passagem pelo laboratório me ajudou bastante nos experimentos.
Aos colegas e amigos que fiz ao longo dessa jornada, por compartilhar momentos
acadêmicos e de lazer, vocês contribuíram para a caminhada ficar mais leve, em
especial aos colegas e amigos Pedro Everson, Júnior Nogueira, Michelle Soeiro e
Kalinne Kelly. Aos amigos do Piauí, e também alunos do Programa de Pós Graduação
em Farmacologia, Lucas Brito e Lucas Nicolau, em especial a Emanuella Carvalho
(Manu), obrigada por toda ajuda, moramos longe de nossas famílias e compartilhamos
do sentimento saudade.
Aos amigos do laboratório de Gastro do Núcleo de Pesquisa em Plantas Medicinais
(NPPM), da Universidade Federal do Piauí, Francilene Vieira, Irisdalva Oliveira, Hélio
Fernandes e Kamila Lopes, pela ajuda nos experimentos, amizade e pelos momentos
de descontração, mesmo distantes fisicamente, a amizade e parceria permaneceram.
Aos colegas da Universidade Federal de Minas Gerais pela colaboração e oportunidade
concedida para realização de alguns experimentos, em especial a Profª. Drª. Miriam
Teresa Paz Lopes por disponibilizar o laboratório para realização dos experimentos e
pela receptividade. A Profª. Drª. Ana Cândida Silva, as doutorandas Verlane Santos e
Ariadne Duarte pela ajuda prestada de todas as formas dentro e fora do laboratório
durante a minha estadia em Minas Gerais.
Ao Patologista Dr. Daniel Viana, pela parceria e conhecimentos compartilhados ao longo
desta pesquisa e ao Prof. Dr. Damião Pergentino pela parceria no estudo com
monoterpenos.
A Deus e minha Família que além de dedicar este trabalho eu também agradeço, meu
spectro de luz e força para toda a vida e durante essa jornada. Não foi fácil.
“A TODOS MUITO OBRIGADA”
“Sê humilde para evitar o orgulho, mas
voa alto para alcançar a sabedoria”
(Santo Agostinho)
EFEITO GASTROPROTETOR E CICATRIZANTE DO (-)-MIRTENOL
RESUMO
O (-)-mirtenol é um monoterpeno álcool bicíclico, com estrutura semelhante ao α-pineno, presente em algumas espécies vegetais, como a Myrtus communis L. (Myrtaceae) utilizada tradicionalmente para tratar problemas gastrintestinais. No presente estudo avaliou-se a atividade gastroprotetora e cicatrizante do (-)-mirtenol, e os possíveis mecanismos envolvidos nesse efeito, em modelos experimentais de lesão gástrica in vivo e de ferida in vitro. A administração oral e única do (-)-mirtenol na dose de 2000 mg/kg, não promoveu toxicidade aguda, durante 14 dias de observação, em camundongos. O pré-tratamento com (-)-mirtenol (50 e 100 mg, v.o) reduziu significativamente (p<0,05) a área de lesões gástricas induzidas por etanol (83 e 83%, respectivamente), por indometacina (89 e 87%, respectivamente), e por estresse de retenção e frio (79 e 73%, respectivamente), quando comparados aos respectivos grupos veículo. A avaliação mecanística do (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) em modelo de lesões gástricas induzida por etanol, em camundongos, envolveu ação antioxidante e anti-inflamatória, com aumento da atividade das enzimas catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase, aumento dos grupamentos sulfidrilas não proteicos, dos níveis de nitrato/nitrito e do conteúdo de muco gástrico aderido, redução dos níveis de malondialdeido e da atividade de mieloperoxidase. O pré-tratamento com antagonista dos recepetores GABA-A (flumazenil), com inibidor das ciclo-oxigenases (indometacina) e da sintase de óxido nítrico (L-NAME), inibiu estatisticamente (p<0,05) o efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol em modelo de lesão induzida por etanol. O (-)-mirtenol (50 e 100 mg/kg), administrado durante sete dias, também foi capaz de reduzir significativamente (p<0,05) a área da lesão gástrica induzida por ácido acético, aumentando a taxa de cicatrização da lesão em 47 e 32%, respectivamente, quando comparados com o grupo veículo. O tratamento com o (-)-mirtenol (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.), durante sete dias, em modelo de lesão gástrica induzida por ácido acético em ratos, não promoveu alterações estatísticas nos parâmetros bioquímicos, no peso dos animais e dos órgãos avaliados. O (-)-mirtenol ainda estimulou a reepitelização na área da lesão, reduziu a atividade da enzima N-acetilglicosaminidase e a expressão das citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e TNF-α, enquanto aumentou a expressão de ciclo-oxigenase-2, o conteúdo de muco gástrico, a porcentagem de fibras de colágeno e reduziu a expressão da atividade de metaloproteinases 2 e 9, comparados com os respectivos grupos veículo. Em modelo de ferida in vitro (Scratch), com células AGS, o (-)-mirtenol (0,1; 1; 10 e 100 nM) não alterou a viabilidade celular, estimulou a proliferação e migração celular na presença e na ausência de hidroxiureia, com 6 e 24 horas de incubação, comparados com o grupo controle. Em suma, os resultados encontrados elucidam as primeiras evidências científicas para o efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol, com possíveis mecanismos relacionados à inibição do estresse oxidativo e modulação dos receptores GABA-A periféricos, regulando o fluxo sanguíneo na mucosa, provavelmente por estimular a produção de óxido nítrico e prostaglandinas. O efeito cicatrizante gástrico promovido pelo (-)-mirtenol envolve modulação da expressão de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e TNF-α) e de COX-2, aumento do conteúdo de muco, reepitelização e remodelamento da matriz celular gástrica. Palavras-chave: (-)-Mirtenol, Cicatrização, Lesão, Gástrica.
GASTROPROTECTIVE AND ULCER HEALING EFFECTS OF (-)-MYRTENOL
ABSTRACT
(-)-Myrtenol is a bicyclic monoterpene alcohol structurally related to a-pinene found in diverse plant, such as herb Myrtus communis L. (Myrtaceae) used traditionally for the treatment of gastrointestinal disorders. This study was aimed to assess the potential gastroprotective and ulcer healing effects of (-)-myrtenol and the possible mechanisms involved, in vivo experimental models of gastric lesion and in vitro scratch assay. The results showed that (-)-myrtenol at the dose of 2000 mg/kg did not promote acute toxicity during the 14 days observation period in mice. Pretreatment with (-)-myrtenol (50 and 100 mg/kg, p.o.) significantly reduced (p<0.05) the area of gastric lesions induced by ethanol (83 and 83%, respectively) by indomethacin (89 and 87%, respectively), and by retention cold stress (79 and 73%, respectively), as compared to the respective vehicle groups. The mechanistic evaluation of (-)-myrtenol (50 mg/kg, p.o.) in ethanol-induced gastric ulcer involved antioxidant and anti-inflammatory activity, with increase in the activity of glutathione peroxidase, superoxide dismutase and catalase, a decrease in the activity of myeloperoxidase and malondialdehyde in gastric tissue and with increase in levels of nitrite/nitrate, gastric mucus and non-protein sulfhydryls. Pretreatment with GABA-A receptor antagonist flumazenil, the cyclooxygenase inhibitor indomethacin, and nitric oxid synthase inhibitor L-NAME significantly (p<0.05) blocked the (-)-myrtenol gastroprotection. The (-)-myrtenol (50 and 100 mg/kg) administered for seven days was also able to significantly reduced (p<0.05) acetic acid-induced gastric ulcer, increasing the rate of wound healing (47 and 32%, respectively) as compared to the vehicle group. Treatment with (-)-myrtenol (25, 50 and 100 mg/kg, v.o.) in acetic acid-induced gastric ulcer model did not changes significantly the body weight, absolute organ weight and biochemical parameters. The (-)-myrtenol also stimulated re-epithelialization in the ulcer area, reduced activity of N-acetylglicosaminidase and metalloproteinases (2 and 9) and proinflammatory cytokines expression (IL-1β and TNF-α), increased cyclooxygenase-2 expression, gastric mucus content and percentage of collagen fibers, as compared to the respective vehicle groups. In vitro scratch assay with AGS cells, (-)-myrtenol (0.1, 1, 10 and 100 nM) did not alter cell viability, stimulated cell migration in the presence and absence of hydroxyurea, with 6 and 24 hours of incubation, compared to the control group. In summary, these results provide, for the first time, evidence that (-)-myrtenol exert gastroprotective effect mainly due to inhibition of oxidative stress and peripheral GABA-A receptor modulation, regulating blood flow in the mucosa, probably by stimulate the production of nitric oxide and prostaglandins. The (-)-myrtenol shows a healing-promoting effect on acetic acid-induced gastric ulcers to modulate the proinflammatory cytokines expression (IL-1β and TNF-α) and COX-2 expression and to increase the mucus content of the stomach, reepithelialization and gastric cell matrix remodeling.
Keywords: (-)-Myrtenol, Healing, Lesion, Gastric.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Descrição anatômica do estômago humano (A) e do estômago de
roedores (B) .............................................................................................................. 22
Figura 2. Anatomia funcional das estruturas glandulares que formam a mucosa
gástrica ...................................................................................................................... 23
Figura 3. Controle da secreção de ácido clorídrico pelas células parietais ............... 27
Figura 4. Ação enzimática no sistema de defesa antioxidante .................................. 32
Figura 5. Cicatrização da úlcera: reepitelização, reconstrução glandular e
angiogênese .............................................................................................................. 34
Figura 6. Estrutura química do (-)-mirtenol ................................................................ 53
Figura 7. Efeito do (-)-mirtenol e da N-acetilcisteína sobre lesões gástricas
induzidas por etanol absoluto em camundongos ...................................................... 73
Figura 8. Efeito do (-)-mirtenol e da N-acetilcisteína sobre as alterações
histológicas do tecido gástrico, induzidas por etanol absoluto em camundongos ..... 74
Figura 9. Efeito do (-)-mirtenol e da N-acetilcisteína sobre o conteúdo de muco
na mucosa gástrica de camundongos submetidos ao protocolo de lesões
gástricas induzidas por etanol ................................................................................... 76
Figura 10. Efeito do (-)-mirtenol e do misoprostol sobre lesões gástricas
induzidas por indometacina em camundongos ........................................................ 77
Figura 11. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre lesões gástricas induzidas
por estresse de retenção e frio em ratos ................................................................... 78
Figura 12. Efeito do (-)-mirtenol e do misoprostol sobre lesões gástricas
induzidas por etanol em camundongos pré-tratados com indometacina ................... 82
Figura 13. Efeito do (-)-mirtenol e da L-arginina sobre lesões gástricas induzidas
por etanol absoluto em camundongos pré-tratados com o L-NAME ......................... 83
Figura 14. Efeito do (-)-mirtenol e do diazóxido sobre lesões gástricas induzidas
por etanol absoluto em camundongos pré-tratados com glibenclamida .................... 84
Figura 15. Efeito do (-)-mirtenol e do muscimol sobre lesões gástricas induzidas
por etanol absoluto em camundongos pré-tratados com flumazenil ......................... 85
Figura 16. Fotografias de estômagos de ratos submetidos ao modelo de lesão
gástrica induzida por ácido acético 80% ................................................................... 86
Figura 17. Ganho de massa corporal dos ratos tratados com (-)-mirtenol e
cimetidina em protocolo de lesão gástrica induzida por ácido acético 80% .............. 87
Figura 18. Fotomicrografias dos cortes histológicos do tecido gástrico de ratos
com e sem alterações induzidas por ácido acético 80% ........................................... 90
Figura 19. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre a atividade da N-
acetilglicosaminidase em lesão gástrica induzida por ácido acético 80%, em
ratos .......................................................................................................................... 91
Figura 20. Fotomicrografias dos cortes histológicos de lesão gástrica induzida
por ácido acético 80% em ratos, corados com ácido periódico de Shiff .................... 92
Figura 21. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre o conteúdo de muco na
lesão gástrica induzida por ácido acético 80% em ratos ........................................... 93
Figura 22. Fotomicrografias da imunomarcação para PCNA (antígeno nuclear de
proliferação celular) em lesão gástrica induzida por ácido acético, em ratos ............ 94
Figura 23. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre a imunomarcação do
antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) em lesão gástrica induzida por
ácido acético 80%, em ratos ..................................................................................... 95
Figura 24. Efeito do (-)-mirtenol sobre a expressão relativa do gene de TNF-α
(A), IL-1β (B) e COX-2 (C) na lesão gástrica induzida por ácido acético 80% em
ratos .......................................................................................................................... 96
Figura 25. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre a expressão da atividade
gelatinolítica das metaloproteinases de matriz 2 e 9 em gel de poliacrilamida com
gelatina ...................................................................................................................... 97
Figura 26. Atividade gelatinolítica de metaloproteinases 2 (A) e 9 (B) na área
ulcerada do tecido gástrico de ratos tratados com (-)-mirtenol e com cimetidina,
em protocolo de lesão gástrica induzida por ácido acético 80% ............................... 98
Figura 27. Fotomicrografias representativas das fibras de colágeno na lesão
gástrica induzida por ácido acético em ratos............................................................. 99
Figura 28. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre a deposição de fibras de
colágeno na lesão gástrica induzida por ácido acético 80% em ratos .................... 100
Figura 29. Efeito do (-)-mirtenol sobre a viabilidade de células AGS em ensaio
com MTT ................................................................................................................. 101
Figura 30. Efeito do (-)-mirtenol sobre proliferação de células AGS em ensaio
com BrdU ................................................................................................................ 102
Figura 31. Efeito do (-)-mirtenol sobre a migração de células AGS depois de 6 e
24 horas de exposição, sem hidroxiuréia ................................................................ 103
Figura 32. Fotomicrografias da fenda em monocamada de células AGS
incubadas com (-)-mirtenol em meio sem hidroxiuréia, com 0, 6 e 24 horas de
incubação ................................................................................................................ 104
Figura 33. Efeito do (-)-mirtenol sobre a migração de células AGS, em meio com
hidroxiuréia após 6 e 24 horas de exposição .......................................................... 105
Figura 34. Fotomicrografias da fenda em monocamada de células AGS
incubadas com (-)-mirtenol na presença de hidroxiuréia, com 0, 6 e 24 horas de
incubação ................................................................................................................ 106
Figura 35. Esquema representativo e resumido dos mecanismos de ação e dos
principais achados, associados a gastroproteção e cicatrização promovidos pelo
(-)-mirtenol ............................................................................................................... 128
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Substâncias utilizadas na experimentação laboratorial e seus
fabricantes ................................................................................................................. 50
Tabela 2. Equipamentos utilizados nos experimentos e seus fabricantes ................ 52
Tabela 3. Sequência gênica e temperatura de anelamento dos primers utilizados
na PCR em tempo real .............................................................................................. 67
Tabela 4. Efeito do (-)-mirtenol e da N-acetilcisteína (NAC), sobre as alterações
histológicas das lesões gástricas induzidas por etanol, em camundongos ............... 75
Tabela 5. Efeito do (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou N-acetilcisteína (200 mg/kg,
v.o.) sobre os marcadores do estresse oxidativo e da inflamação ............................ 81
Tabela 6. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina, sobre lesão gástrica induzida por
ácido acético 80%, em ratos, depois de sete dias de tratamento .............................. 86
Tabela 7. Peso dos órgãos de ratos tratados com (-)-mirtenol e cimetidina, em
protocolo de lesão gástrica induzida por ácido acético 80% ..................................... 88
Tabela 8. Parâmetros bioquímicos séricos dos ratos tratados com (-)-mirtenol e
cimetidina, em protocolo de lesão gástrica induzida por ácido acético 80% ............. 88
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADP Difosfato de adenosina
AINES Anti-inflamatórios não esteroides
ALT Alanina Aminotransferase
AMPc Monofosfato cíclico de adenosina
ATP Trifosfato de adenosina
BrDU Bromodeoxiuridina
CAT Catalase
CCK-2 Receptores de colecistocinina tipo 2
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
CGRP Peptídeos relacionados ao gene da calcitonina
cNOS Sintase de óxido nítrico constitutivas
COX Ciclo-oxigenase
Ct Cycle threshold
D.O. Densidade ótica
DAB Diaminobenzidina
DAG Diacilglicerol
DL50 Dose letal 50%
DMAPP Dimetilalil difosfato
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DTNB Ácido 5,5-ditiobis (2-nitrobenzóico)
ECL Células enterocromafins
ECSOD Superóxido extracelular
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EGF Fator de crescimento epidermal
eNOS Sintase de óxido nítrico endotelial
ERN Espécies reativas de nitrogênio
EROs Espécies reativas de oxigênio
GABA-A Ácido gama-aminobutírico tipo A
GC Guanilato ciclase
GMPc M Monofosfato cíclico de guanosina
GPx Glutationa peroxidase
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSH Glutationa oxidada
H&E Hematoxilina e eosina
H+/K+-ATPase Bomba de prótons
H2 Receptor de histamina do tipo 2
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HCl Ácido clorídrico
HCO3 Bicarbonato
HO· Radical hidroxil
HTAB Brometo de hexadeciltrimetilamônio
IBPs Inibidores de bomba de prótons
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1
IL Interleucina
iNOS Sintase de óxido nítrico induzível
IP3 1, 4, 5- trisfosfato de inositol
IPP Difosfato de isopentenilo
KATP Canais de potássio sensíveis ao ATP
L-NAME Nω-nitro-L-arginina metil éster
MAPK Proteínoquinases ativadas por mitógenos
MDA Malondialdeido
MMP Metaloproteinases
MnSOD Superóxido mitocondrial
MPO Mieloperoxidase
MTT (3-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromo tetrazólio
NAC N-acetilcisteína
NADP+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidada
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
NAG N-acetilglicosaminidase
NBT Azul de nitrotetrazólio
NEED Dicloridrato de N-(1-naftil)-etilenodiamina
nNOS Sintase de óxido nítrico neuronal
NP-SHs Grupamentos sulfidrilas não proteicos
O2-. Radical superóxido
PAS Ácido periódico de Schiff
PCNA Antígeno nuclear de proliferação celular
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas
pH Potencial hidrogeniônico
PIP2 Fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato
PKA Proteína quinase A
PKC Proteína quinase C
ROOH Peróxidos lipídicos
ROOH. Radicais peroxila
SDS Dodecil sulfato de sódio
SFB Soro fetal bovino
SNC Sistema nervo central
SOD Superóxido dismutase
SSTR2 Receptor de somatostatina do tipo 2
TBA Ácido 2-tiobarbitúrico
TGI Trato gastrintestinal
TMB Tetrametilbenzidina
TNF Fator de necrose tumoral
VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 21
1.1 HISTOMORFOLOGIA GÁSTRICA ...................................................................... 21
1.2 FISIOLOGIA DA SECREÇÃO ÁCIDA GÁSTRICA .............................................. 24
1.2.1 Mecanismos que controlam a secreção ácida gástrica .............................. 25
1.3 MECANISMOS PROTETORES DA MUCOSA GÁSTRICA ................................ 28
1.3.1 Sistemas antioxidantes e proteção gástrica ................................................ 31
1.3.2 Processos moleculares de renovação e cicatrização do epitélio
gástrico .................................................................................................................... 33
1.4 ÚLCERA PÉPTICA ............................................................................................. 35
1.4.1 Fatores causadores da úlcera gástrica ........................................................ 37
1.4.2 Tratamento da úlcera gástrica ...................................................................... 39
1.5 ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS COM ATIVIDADE
GASTROPROTETORA ............................................................................................. 42
1.5.1. Terpenos ....................................................................................................... 43
1.5.2 Monoterpenos ................................................................................................. 44
1.5.3 (-)-Mirtenol ....................................................................................................... 45
2 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 48
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 49
3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 49
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 49
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 50
4.1 DROGAS E REAGENTES .................................................................................. 50
4.2 EQUIPAMENTOS UTILIZADOS ......................................................................... 52
4.3 OBTENÇÃO DO (-)-MIRTENOL .......................................................................... 53
4.4 ANIMAIS .............................................................................................................. 53
4.5 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DO (-)-MIRTENOL ............................... 54
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO (-)-MIRTENOL ......... 54
4.6.1 Lesões gástricas induzidas por etanol absoluto ......................................... 54
4.6.2 Análise histológica das lesões gástricas induzidas por etanol
absoluto ................................................................................................................... 55
4.6.3 Determinação do conteúdo de muco gástrico ............................................. 55
4.6.4 Lesões gástricas induzidas por indometacina ............................................ 56
4.6.5 Lesões gástricas induzidas por estresse de retenção e frio ...................... 56
4.6.6 Avaliação de marcadores do estresse oxidativo e inflamação .................. 57
4.6.6.1 Ensaio enzimático da catalase ...................................................................... 57
4.6.6.2 Ensaio enzimático da superóxido dismutase ................................................. 57
4.6.6.3 Ensaio da glutationa peroxidase ................................................................... 58
4.6.6.4 Determinação dos níveis de grupamentos sulfidrilas não proteicos (NP-
SHs) .......................................................................................................................... 58
4.6.6.5 Determinação dos níveis de malondialdeído ................................................. 59
4.6.6.6 Ensaio da atividade enzimática da mieloperoxidase ..................................... 59
4.6.6.7 Avaliação dos níveis de nitrato/nitrito ............................................................ 60
4.6.7 Avaliação do papel das Prostaglandinas, do Óxido Nítrico (NO), dos
Canais de Potássio Sensíveis ao ATP (KATP) e dos receptores GABA-A no
efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol ...................................................................... 61
4.7 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CICATRIZANTE GÁSTRICA DO (-)-
MIRTENOL ............................................................................................................... 62
4.7.1 Lesão gástrica induzidas por ácido acético 80% ........................................ 62
4.7.2 Avaliação do efeito do (-)-mirtenol sobre peso dos órgãos, parâmetros
bioquímicos e peso dos animais no protocolo de lesão gástrica induzida
por ácido acético 80% ............................................................................................. 63
4.7.3 Análise histológica da lesão gástrica induzida por ácido acético ............. 63
4.7.4 Quantificação da atividade da N-acetilglicosaminidase (NAG) na lesão
gástrica induzida por ácido acético ....................................................................... 64
4.7.5 Determinação do conteúdo de muco gástrico com ácido periódico de
Schiff (PAS) na lesão gástrica induzida por ácido acético .................................. 64
4.7.6 Ensaio imunohistoquímico ............................................................................ 65
4.7.7 Expressão do RNAm de TNF-α, IL-1β e COX-2 no tecido gástrico de
ratos pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) ................... 66
4.7.7.1 Extração do RNA do tecido gástrico .............................................................. 66
4.7.7.2 Transcrição reversa e PCR em tempo real (RT-qPCR)................................. 66
4.7.8 Análise da expressão de atividade das metaloproteinases de matriz
MMP-2 e 9 ................................................................................................................. 67
4.7.9 Mensuração da deposição de colágeno na mucosa gástrica .................... 68
4.8 ENSAIOS DE MIGRAÇÃO E PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO ................ 68
4.8.1 Cultura de Células .......................................................................................... 68
4.8.2 Ensaio de viabilidade celular por MTT ......................................................... 69
4.8.3 Ensaio de proliferação celular por BrdU ...................................................... 70
4.8.4 Ensaio de migração celular ........................................................................... 70
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................... 71
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 72
5.1 TOXICIDADE AGUDA DO (-)-MIRTENOL .......................................................... 72
5.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO GASTROPROTETOR DO (-)-MIRTENOL ................. 72
5.2.1 Efeito do (-)-mirtenol sobre lesões gástricas induzidas por etanol ........... 72
5.2.2 Efeito do (-)-mirtenol sobre as alterações histológicas induzidas por
etanol absoluto ........................................................................................................ 73
5.2.3 Efeito do (-)-mirtenol sobre o conteúdo de muco gástrico ......................... 75
5.2.4 Efeito do (-)-mirtenol sobre lesões gástricas induzidas por
indometacina ........................................................................................................... 76
5.2.5 Efeito do (-)-mirtenol sobre lesões gástricas induzidas por estresse de
retenção e frio .......................................................................................................... 77
5.2.6 Efeitos do (-)-mirtenol sobre os marcadores do estresse oxidativo e
da inflamação .......................................................................................................... 78
5.2.6.1 Estimativa da atividade enzimática da catalase ............................................ 78
5.2.6.2 Estimativa da atividade da superóxido dismutase (SOD) .............................. 78
5.2.6.3 Estimativa da atividade da glutationa peroxidase (GPx) ............................... 79
5.2.6.4 Níveis dos grupamentos sulfidrilas não proteicos (NP-SH) ........................... 79
5.2.6.5 Níveis de malondialdeído (MDA) ................................................................... 79
5.2.6.6 Atividade da mieloperoxidase (MPO) ............................................................ 79
5.2.6.7 Níveis de nitrato/nitrito ................................................................................... 80
5.2.7 O envolvimento das Prostaglandinas, do Óxido Nítrico (NO), dos
Canais de Potássio Sensíveis ao ATP (KATP) e dos receptores GABA-A no
efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol ...................................................................... 82
5.3 AVALIAÇÃO DO EFEITO CICATRIZANTE GÁSTRICO DO (-)-MIRTENOL ....... 85
5.3.1 Efeito do (-)-mirtenol sobre lesões gástricas induzidas por ácido
acético ...................................................................................................................... 85
5.3.2 Efeito do (-)-mirtenol sobre peso dos órgãos, parâmetros bioquímicos
e peso dos animais no protocolo de lesão gástrica induzida por ácido
acético 80% .............................................................................................................. 87
5.3.3 Efeito do (-)-mirtenol nas alterações histológicas induzida por ácido
acético ...................................................................................................................... 89
5.3.4 Efeito do (-)-mirtenol sobre a atividade da enzima N-
acetilglicosaminidase (NAG) .................................................................................. 90
5.3.5 Efeito do (-)-mirtenol sobre o conteúdo de muco gástrico ......................... 91
5.3.6 Efeito do (-)-mirtenol sobre a marcação imunohistoquímica do
antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) ................................................. 93
5.3.7 Efeito do (-)-mirtenol na expressão relativa do gene de TNF-α, IL-1β e
COX-2 por PCR em tempo real ............................................................................... 95
5.3.8 Efeito do (-)-mirtenol sobre a expressão da atividade das
metaloproteinases de matriz MMP-2 e 9 ............................................................... 97
5.3.9 Efeito do (-)-mirtenol sobre a deposição de colágeno ................................ 98
5.4 AVALIAÇÃO DO EFEITO DO (-)-MIRTENOL SOBRE MIGRAÇÃO E
PROLIFERAÇÃO CELULAR in vitro ....................................................................... 100
5.4.1 Efeito do (-)-mirtenol na viabilidade celular em ensaio com MTT ............ 100
5.4.2 Efeito do (-)-mirtenol na proliferação de células AGS em ensaio com
BrdU ....................................................................................................................... 101
5.4.3 Efeito do (-)-mirtenol na migração celular em meio sem hidroxiureia..... 102
5.4.4 Migração celular na presença de hidroxiureia ........................................... 104
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 107
7 CONCLUSÕES .................................................................................................... 127
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 129
ANEXO I - FOLHA DE APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE
ANIMAIS ................................................................................................................. 152
ANEXO II - ARTIGO PUBLICADO ........................................................................ 153
ANEXO III- TABELAS DOS PARÂMETROS AVALIADOS NO PROTOCOLO
DE TOXICIDADE AGUDA ..................................................................................... 154
21
1 INTRODUÇÃO
1.1 HISTOMORFOLOGIA GÁSTRICA
O trato gastrintestinal (TGI) no indivíduo adulto mede cerca de 9 metros,
começa na cavidade oral (boca) e termina na cavidade pélvica (ânus). O TGI
atravessa a cavidade torácica, onde está localizado o esôfago e a cavidade
abdominal, que acomoda o estômago, intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e
intestino grosso (cécum, cólon, reto, canal anal e ânus). O estômago é a estrutura
mais dilatada do TGI, situado entre o esôfago e o duodeno. A capacidade normal do
estômago humano varia entre 0,25 a 1,7 litros em um indivíduo adulto (FERRUA;
SINGH, 2010).
Anatomicamente o estômago humano é dividido em: cárdia, região mais
próxima à junção gastroesofágica, corpo, fundo, antro, piloro ou região pilórica. É um
órgão limitado nas suas extremidades por dois esfíncteres, na parte superior o
esfíncter esofagiano e na parte inferior o esfíncter pilórico, os quais regulam a
passagem de alimento (Figura 1-A) (SHEH; FOX, 2013). O estômago dos roedores
de pequeno porte, como os ratos Wistar e camundongos Swiss utilizados na
pesquisa pré-clínica, também apresentam as mesmas delimitações anatômicas do
estômago humano com uma diferença, o estômago do roedor apresenta ainda uma
área não-glandular constituída por epitélio escamoso estratificado queratinizado
(Figura 1-B) (HORN et al., 2013; SHEH; FOX, 2013).
22
Figura 1. Descrição anatômica do estômago humano (A) e do estômago de roedores
(B)
Fonte: (SHEH; FOX, 2013), adaptado.
As estruturas glandulares que formam a mucosa gástrica humana são
diferenciadas pela funcionalidade, composição e distribuição. A mucosa oxíntica é a
mais extensa, formada por glândulas oxínticas, ocupa a região do fundo e corpo do
estômago. A mucosa antral ou da região pilórica está mais próxima do esfíncter
pilórico e é formada por glândulas pilóricas. Tanto as glândulas oxínticas como as
pilóricas são formadas por células mucosas produtoras de muco, que ocupam a
região do pescoço das glândulas gástricas, células D produtoras de somatostatina e
células enterocromafins (ECL) que liberam histamina. Além disso, as glândulas
oxínticas possuem células parietais secretoras de ácido clorídrico (HCl) e células
principais (zimogênicas) produtoras de pepsinogênio. As glândulas pilóricas
possuem células G produtoras de gastrina (Figura 2) (SCHUBERT; PEURA, 2008).
23
Figura 2. Anatomia funcional das estruturas glandulares que formam a mucosa
gástrica
Fonte: (SCHUBERT; PEURA, 2008), adaptado.
Histologicamente o estômago é formado por diferentes camadas
denominadas de mucosa, submucosa, muscular e serosa, diferenciadas pelo tipo de
tecido que as formam, os quais são responsáveis pela funcionalidade de cada
camada no sistema digestivo (FERRUA; SINGH 2010).
A mucosa e a submucosa são formadas por tecido epitelial colunar
simples, apoiado na lâmina própria. Esse epitélio apresenta células superficiais, que
tem o citoplasma apical composto por vesículas de glicoproteínas, mucinas. As
mucinas provenientes de vários tipos de genes (MUC1, MUC5AC, MUC5AB e
MUC6) formam a camada de muco, sendo os genes MUC5AC e MUC6 de mucina
mais expressos no estômago. Uma parte da camada de muco fica aderida ao
epitélio e a outra fica em contato com o lúmen gástrico protegendo a mucosa do
ácido clorídrico produzido pelas células parietais e da ação proteolítica da pepsina,
além de manter o microambiente neutro, com pH de 6-7 na superfície da mucosa
(JIN et al., 2017).
24
A camada muscular é responsável pelas contrações segmentares e
movimentos peristálticos ao longo do trato gastrintestinal, é constituída por músculo
liso circular e longitudinal. O músculo liso circular sofre algumas modificações em
determinadas regiões ao longo do trato gastrintestinal para formar os esfíncteres,
que são controlados pela inervação do trato gastrintestinal para regular a passagem
de comida. A serosa é a última camada que completa a estrutura histológica do trato
gastrintestinal, sendo formada por tecido conectivo fibroso e coberta por epitélio
escamoso simples, que forma o peritônio visceral e tecido conectivo subjacente
(KIM; SHIVDASANI, 2016).
1.2 FISIOLOGIA DA SECREÇÃO ÁCIDA GÁSTRICA
Uma das principais funções do estômago é produzir ácido clorídrico (HCl)
pelas células parietais. O HCl é o responsável pelo pH de 1-2 no lúmem gástrico
humano e juntamente com o bicarbonato, as pepsinas, a água, o muco, o fator
intrínseco e os sais compõem o suco gástrico. Este, por sua vez está envolvido na
digestão de proteínas, pois torna o meio gástrico favorável para a conversão do
pepsinogênio em pepsina, enzima com atividade proteolítica. Além disso, o suco
gástrico facilita a absorção de ferro, vitamina B12, cálcio e dificulta o crescimento
bacteriano (MARTINSEN; BERGH; WALDUM, 2005).
A secreção de ácido clorídrico através da célula parietal é realizada pela
bomba de prótons (H+/K+-ATPase), que é responsável por bombear íons hidrogênio
(H+) contra um gradiente de concentração, para o lúmen gástrico, em troca de íons
potássio (K+) exercendo um papel fundamental na secreção de ácido gástrico. No
seu estado de repouso, a bomba de prótons encontra-se em compartimentos túbulo-
vesiculares citoplasmáticos da célula parietal. Quando a célula parietal recebe o
estímulo secretor as túbulo vesículas movem-se para a região apical das células e
se fundem a membrana plasmática. A meia-vida da H+/K+-ATPase é cerca de 50
horas, portanto aproximadamente 25% das bombas de prótons são sintetizadas por
dia (HAN et al., 2016).
A H+/K+-ATPase é formada por duas subunidades: a subunidade α que
contém o sítio catalítico e é responsável pela troca de H+ por K+, com gasto
energético fornecido pela catalisação do trifosfato de adenosina (ATP) gerando
25
difosfato de adenosina (ADP); e a subunidade β que é altamente glicosilada, protege
a bomba de prótons da degradação e é necessária para o deslocamento da bomba
de prótons das túbulo vesículas para a região apical da membrana da célula parietal
(SHIN et al., 2009).
A ativação da bomba de prótons (H+/K+-ATPase) acontece quando
receptores acoplados as células parietais são ativados, estimulando a sinalização de
segundos mensageiros que controlam a secreção de ácido gástrico. Esse processo
complexo e dinâmico é regulado por estímulos neurais regidos pela acetilcolina,
hormonais pela gastrina, parácrinos pela histamina e somatostatina, químicos pelas
proteínas, glutamato, etanol, e físicos pela distensão (SCHUBERT, 2010).
1.2.1 Mecanismos que controlam a secreção ácida gástrica
Os agentes reguladores e moduladores da secreção ácida gástrica
podem atuar estimulando ou inibindo a secreção. A acetilcolina, histamina e gastrina
são as principais moléculas que atuam estimulando a secreção de HCl pela célula
parietal. Essas moléculas interagem com receptores presentes nas células parietais
associados a duas grandes vias de transdução de sinal: a via dependente do
monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e a via de sinalização dependente de
cálcio, as duas ativam as proteínas quinases resultando na ativação da bomba de
prótons (H+/K+-ATPase). Quando as túbulo-vesículas fundem-se a região apical da
membrana plasmática da célula parietal a bomba de prótons apresenta-se na sua
forma ativa, promovendo o efluxo de íons H+ e o influxo de íons K+ (SHIN et al.,
2009; BITZIOU; PATEL, 2012). A atividade da H+/K+-ATPase é acoplada com a
extrusão de K+ via canais de potássio e de íons cloreto (Cl-) via canais de Cl-
presentes nos canalículos apicais das células parietais, o que garante a formação de
HCl no lúmen gástrico (Figura 3) (FUJII et al., 2009).
A acetilcolina é um neurotransmissor liberado por fibras pós-sinápticas de
neurônios do sistema nervo central (SNC) e entérico, mediando diversas funções
autonômicas no trato gastrintestinal, quando se liga aos receptores muscarínicos. Os
receptores muscarínicos pertencem a um grupo de cinco principais subtipos de
receptores muscarínicos transmembranares do tipo 1 ao 5 (M1-M5) e são
amplamente distribuídos. Esses receptores encontram-se acoplados a proteínas G
26
heterotriméricas, sendo o M1, M3 e M5 acoplados a proteína G do tipo q (Gq), que
ativa a fosfolipase C e o M2 e M4 acoplados a proteínas G do tipo i (Gi), que inibe a
atividade da adenilato ciclase (AIHARA et al., 2005).
A secreção ácida gástrica pode ser regulada através da ligação da
acetilcolina aos receptores muscarínicos, especificamente o do tipo 3 (M3), por ser
mais distribuído no tecido gástrico (HAGA, 2013). Quando ativados os receptores
muscarínicos ativam a proteína Gq, que estimula a fosfolipase C a hidrolisar o
fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2), gerando como produto da hidrólise o
diacilglicerol (DAG) e 1, 4, 5- trisfosfato de inositol (IP3). O IP3 aumenta os níveis de
cálcio no citoplasma da célula, recrutando o cálcio do meio extracelular ou de
organelas citoplasmáticas. O DAG atua como um cofator junto com o cálcio na
ativação de proteína quinase C (PKC), que é uma proteína quinase dependente de
cálcio, o que resulta na ativação da bomba de prótons e secreção de ácido clorídrico
(Figura 3) (MÖSSNER; CACA, 2005).
A gastrina é o principal hormônio envolvido na indução da secreção ácida
gástrica, atuando de maneira direta via ativação de receptores de colecistocinina tipo
2 (CCK-2), acoplados a proteína Gq, presentes nas células parietais, e de maneira
indireta quando se liga a receptores CCK-2 encontrados nas células
enterocromafins, o que estimula a liberação de histamina e das duas formas
aumentam os níveis de cálcio citoplasmático (Figura 3) (FOURMY; GIGOUX;
REUBI, 2011). A histamina é uma amina biogênica formada a partir da L-histidina
pela ação da histidina descarboxilase, essa amina fica armazenada em vesículas
secretoras nas células enterocromafins e quando liberadas se ligam a receptores de
histamina do tipo 2 (H2) presentes nas células parietais (Figura 3) (KAZUMORI et al.,
2004).
Os receptores H2 são acoplados a isoforma Gs da proteína G, quando
ativados pela histamina estimulam a enzima adenilato ciclase a converter trifosfato
de adenosina (ATP) em monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). O AMPc ativa a
proteína quinase A (PKA), estimulando a via dependente de AMPc, aumentando os
níveis de cálcio intracelular, o que leva a ativação da bomba de prótons na célula
parietal e consequente estimulação da secreção ácida gástrica (Figura 3)
(METTLER et al., 2007).
27
Figura 3. Controle da secreção de ácido clorídrico pelas células parietais
Fonte: Elaborada pelo autor.
CCK2 (receptor de colecistocinina tipo 2); ECL (célula enterocromafin); H2 (receptor de histamina tipo
2); M3 (receptor muscarínico tipo 3); AMPc (monofosfato cíclico de adenosina); ATP (trifosfato de
adenosina); ADP (difosfato de adenosina); H+/K
+ ATPase (bomba de prótons).
O controle da secreção de ácido gástrico, frente aos processos
estimulatórios vistos, pode ser realizado por mecanismos inibitórios, com a finalidade
de manter a função fisiológica do estômago. Entre os agentes responsáveis pelos
mecanismos inibitórios da secreção de ácido estão a somatostatina, a
adrenomedulina, a amilina, o peptídeo natriurético atrial (PNA) e as prostaglandinas
(TULASSAY; HERSZÉNYI, 2010).
A somatostatina é um peptídeo hormonal secretado e produzido pelas
células D, é o principal inibidor da secreção ácida gástrica. O efeito inibitório da
somatostatina na secreção de HCl é mediado principalmente pela ativação do
receptor de somatostatina do tipo 2 (SSTR2), acoplado a proteína G inibitória (Gi)
que quando ativada inibe a produção de AMPc e consequentemente a secreção
ácida. O SSTR2 está localizado principalmente em células parietais e
28
enterocromafins, onde atua inibindo a secreção de histamina e indiretamente
inibindo a secreção ácida (PIQUERAS; MARTÍNEZ, 2004). O estudo realizado por
Takeuchi et al. (2016) demonstrou que a ativação de receptores muscarínicos do
tipo 4 (M4) em células D, pela acetilcolina inibe a liberação de somatostatina,
resultando no aumento da secreção ácida, pois elimina a influência negativa da
somatostatina causada pela ativação dos SSTR2.
A adrenomedulina é um pequeno peptídeo formado por 52 aminoácidos
com ação hormonal, que apresenta semelhança estrutural com os peptídeos
relacionados ao gene da calcitonina (CGRP). No estômago a adrenomedulina tem
sido encontrada em células enterocromafins e nas células principais do fundo
gástrico. Acredita-se que a adrenomedulina produzida no estômago e em outros
órgãos possa atuar no nervo vago indiretamente controlando a liberação de
somatostatina ou atuar diretamente em receptores de adrenomedulina presentes em
células D estimulando a liberação de somatostatina e consequentemente inibindo a
secreção ácida gástrica (MARTÍNEZ-HERRERO; MARTÍNEZ, 2016).
As prostaglandinas (PGs) são derivadas do ácido araquidônico por meio
da reação catalizada pelas ciclo-oxigenases principalmente pelas isoformas de ciclo-
oxigenase 1 e 2 (COX-1 e COX-2). As PGs estão presentes em todo o trato
gastrintestinal e são envolvidas na regulação de várias funções, incluindo a
regulação da secreção de ácido gástrico, pois quando se ligam ao receptor de
prostaglandina E do tipo 3 (PE3) presente na célula parietal acoplado a uma proteína
G inibitória (Gi), ativa essa proteína Gi que inibe a enzima adenilato ciclase,
consequentemente promove redução dos níveis de AMPc, que não são suficientes
para ativar a bomba de prótons e prover a secreção de HCl (SULEYMAN et al.,
2010).
1.3 MECANISMOS PROTETORES DA MUCOSA GÁSTRICA
A mucosa gástrica é constantemente exposta a fatores agressores
endógenos como o ácido clorídrico, pepsina, sais biliares e fatores agresssores de
origem exógena como o consumo de álcool, fumo e de anti-inflamatórios não
esteroides (AINES), o estresse físico e emocional e a infecção por Helicobacter
pylori, dentre outros. Apesar dessa exposição, a mucosa gástrica em condições
29
fisiológicas mantém a integridade estrutural e resiste ao 0,1 mol/L de HCl e pepsina
presentes no lúmen gástrico (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008; YANDRAPU;
SAROSIEK, 2015). Isso acontece graças aos mecanismos de defesa da mucosa,
que incluem componentes pré-epiteliais, muco, bicarbonato e fosfolipídios formando
a barreira protetora da mucosa; componentes epiteliais, células superficiais da
mucosa ligadas por junções oclusivas e produtoras de muco, proteínas do choque
térmico, prostaglandinas; e componentes subepiteliais, fluxo sanguíneo contínuo
mantido por microvasos da mucosa, produção de óxido nítrico, produção de enzimas
antioxidantes, mecanismo de renovação constante do epitélio, realizado pela
proliferação de células progenitoras reguladas por diversos fatores (TARNAWSKI;
AHLUWALIA; JONES, 2013).
A barreira protetora da mucosa gástrica, constituída principalmente por
muco, glicoproteínas mucinas, bicarbonato, fosfolipídios e prostaglandinas, está
tenazmente aderida à superfície do epitélio gástrico. O muco é gerado por grânulos
de mucinas secretados da região apical da célula epitelial de superfície, contém 95%
de água e 5% de mucinas (HAM; KAUNITZ, 2007). As mucinas, principalmente as
provenientes dos genes MUC5AC e MUC6, se polimerizam para dar consistência
viscosa ao muco que constitui a barreira da mucosa gástrica (SQUIRE et al., 2013).
Essa barreira protege o epitélio gástrico neutralizando ácidos, impedindo a difusão
de moléculas de pepsina para o epitélio subjacente à superfície da mucosa. Além
disso, 25% do muco é formado por lipídios na forma de lipídios neutros, fosfolipídios
e glicolipídios, que tornam o muco mais viscoso e hidrofóbico impedindo a difusão
retrógrada do íon H+ (De FONESKA; KAUNITZ, 2010).
O íon bicarbonato (HCO3-) também é um elemento chave na proteção da
mucosa gástrica é secretado por células do epitélio de superfície, e juntamente com
o muco proporciona proteção a mucosa gástrica contra o ácido luminal e pepsina,
mantendo o gradiente de pH na superfície de células epiteliais maior que o do lúmen
gástrico. Durante a secreção de ácido gástrico pelas células parietais ocorre também
o fenômeno da “maré alcalina”, que representa a formação de mol por mol de HCO3-.
Enquanto a célula parietal secreta íons H+ na superfície apical para os canalículos,
simultaneamente na região basolateral ocorre a troca de HCO3- por Cl-, garantindo o
aumento da quantidade de HCO3- nos vasos sanguíneos e na mucosa por
subsequente captação e também por secreção pelas células do epitélio de
30
superfície, para constituir a barreira protetora da mucosa gástrica (ALLEN;
FLEMSTRÖM, 2005).
As prostaglandinas principalmente as do tipo E e I exercem ações
biológicas via receptores de prostaglandina E do tipo 1 ao 4 favorecendo a
manutenção da integridade da mucosa gástrica e cicatrização. As PGE2 quando
ativam receptores EP3 estimulam a secreção de bicarbonato e muco pelas células
superficiais, e quando ativam os receptores EP1 estimulam a proliferação celular,
inibem a ativação de mastócitos, favorecem o aumento do fluxo sanguíneo da
mucosa, promovendo a citoproteção gástrica, assim como a prostaglandina I do tipo
2 (PGI2) ou prostaciclinas quando ativam receptores EP3 (TAKEUCHI, 2014).
O fluxo sanguíneo além de suprir a mucosa gástrica com oxigênio,
nutrientes e hormônios, também regula a secreção de ácido, a produção de muco e
bicarbonato. A integridade da mucosa é mantida pela rápida resposta da
musculatura vascular à presença de ácido na superfície da mucosa gástrica, agindo
para favorecer o tamponamento do meio, a diluição e remoção do ácido. Isso é
mediado pelo reflexo nervoso aferente sensorial. Assim, as terminações nervosas
aferentes sensitivas na superfície da mucosa podem detectar a presença de ácido, e
responderem liberando na vizinhança das arteríolas da submucosa, substâncias
vasodilatadoras, como a prostaglandina E2 e o óxido nítrico, que atua sobre a
guanilato ciclase solúvel, o que resulta no relaxamento do músculo liso em torno das
arteríolas, causando o aumento do fluxo sanguíneo (WALLACE, 2008).
O óxido nítrico (NO) é uma molécula de sinalização autócrina e parácrina,
e pode ser sintetizado a partir da reação do oxigênio molecular (O2) com a L-arginina
catalisada pela enzima sintase de óxido nítrico (NOS) em meio que forneça oxigênio,
ou pode ser produzido pela redução de nitrato para nitrito em meio com condições
limitadas de oxigênio, como em situações de hipóxia no tecido gástrico
(LUNDBERG; WEITZBERG; GLADWIN, 2008). Como mediador dos mecanismos
citoprotetores gástricos o óxido nítrico aumenta o fluxo sanguíneo, através da
ativação da enzima guanilato ciclase (GC) e o consequente acúmulo de monofosfato
cíclico de guanosina (GMPc) que promove a vasoadilatação no tecido gástrico. O
óxido nítrico ainda inibe a migração de leucócitos para a mucosa intestinal, através
da modulação da expressão de molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e P-
selectina (ROCHA et al., 2016).
31
Foram identificadas três isoformas de sintase de óxido nítrico (NOS): NOS
endotelial (eNOS), NOS neuronal (nNOS) e NOS induzível (iNOS). A eNOS e nNOS
são expressas em condições normais e são referidas como NOS constitutivas
(cNOS). Ainda se discute o obscuro papel bifásico que o NO pode desempenhar,
protegendo ou agredindo a mucosa gastrintestinal, com base nos níveis da produção
de NO encontrados no tecido e do tipo de enzima sintase que o produz (NISHIO et
al., 2006).
Além desses, vários outros fatores como enzimas antioxidantes,
grupamentos sulfidrilas não proteicos, metaloproteinases de matriz, proliferação e
migração celular fazem parte dos complexos mecanismos protetores da mucosa
gástrica (AL-JIBOURY; KAUNITZ, 2012).
1.3.1 Sistemas antioxidantes e proteção gástrica
O metabolismo normal de algumas células, como os macrófagos,
eosinófilos, células do epitélio gástrico, envolve a produção de espécies reativas de
oxigênio (EROs) ou de nitrogênio (ERN), mas quando a produção de EROs e ERN é
excessiva e descontrolada, danos as estruturas celulares podem ser causados. As
EROs são formadas pela redução parcial do oxigênio molecular para superóxido (O2-
), peróxido de hidrogênio (H2O2), peróxidos lipídicos (ROOH) ou os correspondentes
hidroxil (HO·) e radicais peroxila (ROOH·). O peróxido lipídico é um mediador chave
de diversos processos inflamatórios, de úlceras gástricas, do câncer e de doenças
neurodegenerativas (GASCHLER; STOCKWELL, 2017).
Em um processo chamado de peroxidação lipídica esses radicais livres
agem sobre lipídios insaturados de membranas celulares gerando os produtos de
peroxidação lipídica, como o malondialdeído (MDA), que é um dos mais produzidos.
Em concentrações subletais ou marginais os produtos de peroxidação são capazes
de induzir resposta adaptativa para melhorar a tolerância das células ao estresse
oxidativo (NIKI, 2012), mas em altas concentrações causam alterações na
membrana celular, que levam a desordens no influxo e efluxo de íons, causam
danos no DNA, culminando em efeitos genotóxicos, metilação do DNA, modificações
de histonas e consequente morte celular (ECKL; BRESGEN, 2017). Para controlar
32
ou evitar essas alterações, as células produzem enzimas antioxidantes: superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx).
A SOD é uma enzima óxido-redutase que catalisa a dismutação do radical
superóxido (O2-.) em oxigênio molecular (O2) e um radical menos nocivo, o peróxido
de hidrogênio (H2O2). Com base na localização e no íon metálico que ocupa o sítio
catalítico, a SOD pode ser classificada em citoplasmática (Cu-Zn-SOD), mitocondrial
(MnSOD) e extracelular (ECSOD) (WEYDERT; CULLEN, 2010). O H2O2 produzido é
degradado pelas enzimas CAT e GPx, gerando O2 e/ou água. A CAT é encontrada
principalmente em peroxissomas e no citoplasma celular, e a GPx pode ser
encontrada em diferentes compartimentos celulares incluindo mitocôndria e núcleo.
A GPx é uma enzima dependente de selênio e necessita de outros cofatores para
desempenhar suas funções, tais como: glutationa reduzida (GSH), glutationa
redutase (GR) e nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH).
Assim, a Gpx catalisa a degradação do H2O2 em água convertendo a glutationa
reduzida (GSH) em oxidada (GSSH), a qual pode ser reconvertida em GSH pela
ação da GR, em um processo que utiliza como doador de elétrons o NADPH (Figura
4) (LUANGWATTANANUN et al., 2017).
Figura 4. Ação enzimática no sistema de defesa antioxidante
Fonte: Elaborada pelo autor.
Superóxido (O2-·), superóxido dismutase (SOD), peróxido de hidrogênio (H2O2), catalase (CAT),
glutationa peroxidase (GPx), glutationa reduzida (GSH), glutationa oxidada (GSSH), glutationa
redutase (GR), nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) e nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato oxidada (NADP+).
33
O maior regulador não enzimático da homeostase antioxidante intracelular
é o tripeptídeo tiol glutationa (ү-glutamil-cisteinil-glicina), encontrado na forma
reduzida (GSH) ou oxidada/dissulfeto (GSSH), está presente intracelularmente em
concentrações milimolares, no citosol, núcleo e mitocôndria. Esses tióis juntamente
com outros agentes antioxidantes de baixo peso molecular como o α-tocoferol, os
carotenóides, flavonoides, ácido ascórbico, melatonina, ácido úrico e metionina,
compõem uma segunda linha de defesa antioxidante do organismo. É evidente que
o GSH é importante, mas sozinho não é suficiente para prevenir ou defender a
célula das EROs, sendo fundamental a participação de enzimas, como a GPx, que
participam da ação de defesa associadas com GSH e com a GR, enzima que
mantém os níveis de GSH intracelulares, garantindo assim proteção contra danos
oxidativos (MASELLA et al., 2005).
1.3.2 Processos moleculares de renovação e cicatrização do epitélio gástrico
O epitélio gástrico, além de proteger a mucosa por seus constituintes
químicos, como as substâncias antioxidantes, também mantém a integridade da
mucosa gástrica por sua disposição histológica. Para isso, o epitélio gástrico deve
estar em constante renovação com substituição de células antigas ou danificadas
por células jovens a cada 2-4 dias, e o equilíbrio entre a perda e a renovação é
primordial para a manutenção da integridade epitelial. Nos episódios em que os
eventos fisiológicos são alterados por danos no epitélio gástrico, como na úlcera
gástrica, a reconstituição epitelial envolve processos mais complexos de
cicatrização. A migração, proliferação e angiogênese envolvidas na cicatrização são
controladas por diversos fatores, dentre eles, o fator de crescimento epidermal
(EGF), o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), o fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF) e a ciclo-oxigenase 2 (COX-2) (TARNAWSKI;
AHLUWALIA; JONES, 2012).
A úlcera consiste de duas estruturas principais, a base e a borda, que é
formada por componentes epiteliais não necrotizantes. A base é formada por tecido
de granulação, constituído por fibroblastos, macrófagos e células endoteliais
proliferativas que formam microvasos. A cicatrização envolve uma cascata de
eventos coordenados que resultam na reconstituição do tecido. Didaticamente esses
34
eventos podem ser divididos em três fases: inflamação, proliferação/migração e
finalmente remodelamento ou maturação do tecido (Figura 5) (TARNAWSKI, 2005).
Figura 5. Cicatrização da úlcera: reepitelização, reconstrução glandular e
angiogênese
Fonte: (TARNAWSKI, 2005), adaptado.
No processo inflamatório da úlcera gástrica os mastócitos e os
macrófagos residentes na lâmina própria atuam como "células de alarme", contra
substâncias estranhas liberando mediadores inflamatórios, interleucinas 1 e 8 (IL-1,
IL-8) e fator de necrose tumoral (TNF-α), os quais podem alterar o fluxo sanguíneo e
recrutar granulócitos para a região da lesão no tecido gástrico. Esse processo tende
ainda a ser modulado, mais tardiamente, pela ação das prostaglandinas, óxido
nítrico, e citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10, com a finalidade de reduzir os
danos teciduais causados pela inflamação. Concomitantemente, as células do
epitélio gástrico são estimuladas a proliferar e diferenciar para reconstruir a lâmina
própria e microvasos na base da úlcera, o que caracteriza o processo de
cicatrização (SYAM, 2009).
Na proliferação e diferenciação celular o antígeno nuclear de proliferação
celular (PCNA) é expresso atuando como um fator que controla a replicação do DNA
35
pela DNA polimerase. Por isso, o PCNA encontra-se mais expresso na fase S do
ciclo celular, caracterizada como a fase de replicação do material genético, do que
na fase G1 onde os precursores da replicação começam a ser sintetizados e na fase
G2, onde as proteínas estão sendo sintetizadas (MILLER et al., 2010). A
proliferação, diferenciação e migração durante a cicatrização podem ser controladas
por macromoléculas que interagem com a matriz extracelular, a exemplo das
moléculas inibidoras de metaloproteinases de matriz tecidual (MMP). As MMP são
proteinases fundamentais no processo de reparação tecidual; entretanto, um
desequilíbrio na quantidade de MMPs produzidas e na sua inibição pode
desencadear a degradação da matriz extracelular, que persiste causando danos ao
tecido, que levam a formação da úlcera (PERCHES et al., 2015).
A matriz extracelular é formada por uma complexa e intrincada rede de
moléculas organizadas com precisão. Essas redes moleculares determinam a
histoarquitetura específica dos tecidos e fornecem às células informações biológicas
e estruturas que possibilitam a adesão e migração celular. A Matriz extracelular da
mucosa gástrica é composta de colágeno, laminina, proteoglicano, elastina,
fibronectina e ácido. Os colágenos fibrilares são especialmente importantes no
processo de cicatrização do epitélio gástrico e a síntese de colágenos do tipo I, III e
IV é estimulada durante a cicatrização no epitélio gástrico ulcerado. Na fase final do
processo de cicatrização o colágeno é uma das proteínas mais abundantes e
desempenha um papel fundamental na reorganização tecidual da mucosa. Em
constante deposição e reabsorção as fibras de colágeno favorecem o
remodelamento do tecido gástrico cicatricial (DE MELLO; PISSINATTI; FERREIRA,
2010; SOUZA, et al., 2016).
1.4 ÚLCERA PÉPTICA
O termo úlcera péptica refere-se a uma lesão no trato digestivo, que
resulta em ruptura da mucosa, atingindo a submucosa. As lesões são causadas
quando ocorre o desequilíbrio entre fatores protetores (PGs, Muco, bicarbonato
dentre outros) e agressores na mucosa gástrica (HCl, pepsina, H.pylori, álcool, etc.)
(FALCÃO et al., 2008). As úlceras pépticas são lesões usualmente encontradas no
estômago ou no duodeno. Quando encontradas no estômago são chamadas de
36
úlceras gástricas, quando encontradas no duodeno são denominadas de úlceras
duodenais. Mas as úlceras pépticas também podem ser encontradas no esôfago e
no divertículo de Meckel (SOUZA et al., 2016), que é uma anomalia congênita
gastrintestinal mais frequente, localizado entre 40 e 100 cm a montante da válvula
íleo-cecal, no bordo antimesentérico (BRÁSIO et al., 2015).
A úlcera péptica é uma doença que afetada 4 milhões de pessoas no
mundo, com incidência estimada em cerca de 1,5 a 3% por ano (ZELICKSON et al.,
2011). A prevalência e a incidência da úlcera péptica atualmente são provavelmente
mais baixas do que essas estimativas em todo o mundo, especialmente em países
desenvolvidos, porque estudos epidemiológicos mostraram uma tendência
acentuadamente decrescente de mortalidade associada à doença nos últimos 20 a
30 anos (LANAS; CHAN, 2017).
A taxa de mortalidade causada por úlcera péptica diminuiu nos últimos
anos. Mas essa redução não foi mostrada para as complicações relacionadas às
úlceras pépticas, como perfuração do tecido gástrico e hemorragia (SØREIDE;
THORSEN; SØREIDE, 2014). A incidência anual estimada em alguns países
europeus, da úlcera péptica hemorrágica e perfurativa são de 19,4 a 57,0 e 3,8 a 14
por 100.000 indivíduos, respectivamente (LAU et al., 2011). A prevalência mundial
da úlcera difere com relação ao tipo; a úlcera duodenal é mais comum nos países
ocidentais e a úlcera gástrica apresenta-se com maior frequência na Ásia, em
especial no Japão, a idade média das pessoas com úlcera é entre 30 e 60 anos,
mas pode e vem acometendo pessoas mais jovens. A diferença entre os sexos
também tem sido observada como um fator que influencia a prevalência da úlcera,
uma vez que em homens é mais predominante (VOMERO; COLPO, 2014). O ônus
causado pela úlcera péptica nos Estados Unidos anualmente é de 3,4 bilhões de
dólares, incluindo cuidados de morbidade como despesas relacionadas à perda de
trabalho (YUAN; PADOL; HUNT, 2006).
A úlcera péptica é considerada um relevante problema de saúde pública,
frequentemente associada à perda na qualidade de vida e crescentes gastos no
tratamento das complicações da doença, impactando o indivíduo acometido e a
sociedade. No Brasil apesar de ser uma doença frequente, sua real prevalência é
desconhecida, pois são poucos os estudos de base populacional que quantificam
sua magnitude. Os estudos referentes ao ano de 2008 no Brasil mostraram que a
37
prevalência da úlcera péptica é de 0,2% em homens e 0,1% em mulheres e a taxa
de mortalidade é de 3 mortes/100.000 habitantes; maior em indivíduos com idade
avançada e em ambos os sexos (DE OLIVEIRA et al,. 2015). A infecção
por Helicobacter pylori e o consumo de anti-inflamatórios não esteroides (AINES)
estão associados ao aumento da incidência de úlcera gástrica no Brasil e no mundo
(CARLI et al., 2015). Com isso, torna-se necessário o conhecimento dos fatores que
causam ou predispõem o desenvolvimento dessa doença para que se possa
preveni-la.
1.4.1 Fatores causadores da úlcera gástrica
A Infecção por H.pylori e o consumo de AINEs estão entre os principais
fatores responsáveis pelo desenvolvimento da úlcera péptica. A H.pylori é uma
bactéria gram-negativa que coloniza a mucosa gástrica humana há mais de 58.000
mil anos, mas só foi descoberta quando cultivada e isolada por Marshall e Warren
(1984, apud ABBASI, 2017). Essa descoberta mudou o paradigma dos fatores
causadores das úlceras pépticas, gastrites, antes atribuídos a fatores idiopáticos
pelos médicos. A H.pylori é altamente adaptada para colonizar o estômago, pois
resiste à acidez estomacal devido a sua capacidade de produzir a enzima urease,
que catalisa a hidrólise de uréia em dióxido de carbono e amônia. As moléculas de
amônia promovem o tamponamento do microambiente bacteriano, garantindo a
sobrevivência e colonização desse micro-organismo no estômago. Além disso, a H.
pylori também pode regular a expressão gênica em resposta as alterações do pH,
adaptando-se rapidamente as mudanças ambientais e sua forma helicoidal
juntamente com os flagelos facilita o movimento dessa bactéria na camada de muco
gástrico (LERTSETHTAKARN; OTTEMAN; HENDRIXSON; 2011). Vários fatores
genotípicos e fenotípicos relacionados aos seres humanos e a virulência da bactéria
podem atuar em conjunto como fatores de risco para infecção. Esses fatores
incluem citotoxinas bacterianas e polimorfismos nos genes do homem responsáveis
por direcionar a resposta imune (TESTERMAN; MORRIS, 2014).
Os AINES são amplamente prescritos para o tratamento da dor, febre,
inflamação e doença trombótica. No entanto, o seu uso descontrolado está
associado à ocorrência de efeitos indesejados que atingem o trato gastrintestinal
38
levando a formação de úlceras hemorrágicas ou erosivas no epitélio gástrico e
gastrite medicamentosa (COLUCCI et al., 2009). Os AINES atuam inibindo ou
reduzindo a biossíntese de prostaglandinas por inibir as ciclo-oxigenases. A ciclo-
oxigenase 1 (COX-1) é uma enzima constitutivamente expressa em muitos tecidos,
inclusive no tecido gástrico, e a ciclo-oxigenase 2 (COX-2) é uma enzima induzível
frequentemente relacionada as reações inflamatórias. As protaglandinas produzidas
pela COX- 1 ou 2 contribuem para proteção gástrica. Com isso, a inibição das COXs
pelos AINES promove danos à mucosa gástrica, com disfunção mitocondrial,
alteração da permeabilidade celular e ativação de neutrófilos, que favorecem a
formação da úlcera gástrica (GUDIS; SAKAMOTO, 2005).
Diferentes fatores de risco, além do uso de AINES e infecção por H.
pylori, também são responsáveis pelo desenvolvimento da úlcera gástrica, como o
estresse físico e psicológico, o tabagismo, o consumo exagerado de álcool, a
predisposição genética e o uso de corticosteróides orais. Mas nem todos os
indivíduos que de alguma forma entram em contato com os fatores de risco
desenvolvem a úlcera gástrica, pois, na sua grande maioria, as causas são
multifatoriais (BEGOVIC; SELMANI, 2015).
O estresse é consequência das alterações fisiológicas do organismo
quando o corpo ou a mente humana são submetidos a uma situação de pressão. Os
danos na mucosa gástrica causados pelo estresse podem ser agudos, erosivos e
inflamatórios, normalmente acometendo a porção superior do trato gastrintestinal. As
lesões na mucosa são geralmente superficiais e assintomáticas, mas podem
estender-se para a submucosa e muscular rompendo vasos maiores causando
sangramento evidente e clinicamente significativo. Esse agravamento confirma que,
os principais danos causados pelo estresse na mucosa gástrica estão relacionados
a mudanças na microcirculação e hipóxia (PLUMMER; BLASER; DEANE, 2014).
A ingestão de álcool, tanto aguda compulsiva, como crônica, afeta
diferentes órgãos em todo o corpo, inclusive o trato gastrintestinal com ações
multifatoriais nas células e funções moleculares. Quando metabolizado o álcool gera
moléculas de acetaldeído e oxigênio reativo. O estresse oxidativo gerado pelas
espécies reativas de oxigênio/nitrogênio, a depleção do sistema de defesa
antioxidante e estímulos inflamatórios são os grandes responsáveis pelos danos
causados no tecido gástrico, associados ao consumo de álcool (JUNG et al., 2011).
39
1.4.2 Tratamento da úlcera gástrica
O tratamento cirúrgico da úlcera perfurativa data do ano de 1880, como
único método de escolha, o que resultava em elevadas taxas de mortalidade ou
morbidade. Hoje passou a ser um método de escolha alternativo dependendo do
grau da úlcera, uma vez que os fármacos utilizados no tratamento, tanto da úlcera
perfurativa ou hemorrágica, foram surgindo ao longo dos anos. Os primeiros
fármacos que atuam inibindo a secreção de ácido gástrico foram introduzidos em
1970, representados pelos antagonistas dos receptores de histamina do tipo 2 (H2),
a cimetidina e ranitidina. Logo depois, surgiram os inibidores da bomba de prótons
(IBP), que reduzem a secreção de ácido, sem causar taquifilaxia rápida, garantindo
elevadas taxas de cicatrização em úlceras gástricas e duodenais, representados
pelo omeprazol, pantoprazol e rabeprazol. Nesse mesmo período surgem os
antiácidos, para o tratamento sintomático da úlcera gástrica e duodenal, e os
anticolinérgicos, apresentando inúmeros efeitos adversos. Com a descoberta da
H.pylori, há mais de 30 anos, o diagnóstico e tratamento da úlcera foram entendidos
e se tornaram mais específicos, com a finalidade de erradicar essa bactéria e
prevenir o desenvolvimento da úlcera (YUAN; PADOL; HUN, 2006).
Os antiácidos tais como bicarbonato de sódio, hidróxido de alumínio e
hidróxido de magnésio, fornecem alívio dos sintomas da úlcera gástrica, uma vez
que a cicatrização da lesão é muito difícil de alcançar, exceto com doses altas e
frequentes de antiácidos. Estes por sua vez, não atuam alterando a secreção de
ácido clorídrico e sim alterando o potencial hidrogeniônico (pH) do estômago ou
gerando uma barreira protetora. Apresentam alguns efeitos colaterais como diarréia
ou constipação e ainda interferem na absorção de outros fármacos no trato
gastrintestinal. Ademais, o uso de antiácidos se tornou um fator de risco para a
sensibilização do trato gastrintestinal contra proteínas provenientes da alimentação e
fármacos administrados oralmente. Assim, os antiácidos são vistos apenas como
paliativos, com limitado efeito no tratamento sintomático das úlceras gástricas (PALI-
SCHÖLL; JENSEN-JAROLIM, 2011).
Os anticolinérgicos, pirenzepina, telenzepina e atropina, que atuam
bloqueando os receptores muscarínicos do tipo 3 (M3), proporcionam alívio da dor
contribuindo para cicatrização da úlcera através da supressão da secreção de ácido
40
gástrico. Assim como os antagonistas dos receptores de colecistoquinina 2 (CCK-2)
eles tiveram seu desenvolvimento descontinuado. O uso de anticolinérgicos é
limitado ou quase não existem mais no ambiente clínico para tratamento da úlcera
gástrica. Como eles inibem receptores M1 em diferentes locais fora do estômago, os
anticolinérgicos promovem efeitos colaterais que limitam seu uso, como boca seca,
embasamento da visão, dificuldade em esvaziar a bexiga (AIHARA, 2003).
Os antagonistas dos receptores de histamina (H2), ranitidina, famotidina e
cimetidina, são mais eficazes do que os antiácidos para proporcionar alívio dos
sintomas e cicatrização da úlcera gástrica. No entanto, esses fármacos têm uma
duração de efeito relativamente curta e os seus efeitos são atenuados pela ingestão
de alimentos. Uma limitação adicional é a tolerância aos efeitos supressores dos
antagonistas dos receptores H2, sobre a secreção de ácido, que pode desenvolver-
se após alguns dias de dosagem contínua, um fenômeno clinicamente relevante em
alguns pacientes que fizeram uso de ranitidina e famotidina por 14 dias. A
sensibilidade diminuída a esses fármacos pode resultar do efeito da
hipergastrinemia secundária, que estimula a liberação de histamina das células
enterocromafins (KOMAZAWA et al., 2003; TAKAHASHI; KATAYAMA, 2010).
Os inibidores de bomba de prótons (IBPs), omeprazol, lansoprazol,
pantoprazol, rabeprazol, esomeprazol e tenatoprazol, aliviam os sintomas e ajudam
na cicatrização das lesões de maneira mais eficaz que os antagonistas dos
receptores H2, pois inibem a bomba de prótons independente da natureza do
estímulo que gera a secreção de ácido (SALAS; WARD; CARO, 2002). Todos os
IBPs são compostos lipofílicos com propriedades de base fraca, por isso, eles
penetram facilmente nas membranas celulares e são acumulados nos canalículos
das células parietais. No meio ácido do estômago em milissegundos os IBPs são
degradados para formar a sulfenamida, agente inibidor da bomba de prótons, que se
liga aos resíduos de cisteína, por ligação dissulfeto covalente, presentes no lado
luminal da subunidade da bomba de prótons. Essa ligação impede a alteração
conformacional da bomba para se tornar ativa. Logo, com a administração de um
IBPs a secreção de ácido só voltará a acontecer com a síntese de uma nova bomba
de prótons que não esteja ligada ao IBPs. Os IBPs atualmente são os medicamentos
mais indicados no tratamento da úlcera gástrica. No entanto, esses fármacos
apresentam consideráveis efeitos colaterais, como diarréia, tonturas,
41
hipergastrinemia e infecções entéricas, principalmente quando utilizados por longos
períodos (ANDERSSON; CARLSSON, 2005; JAIN et al., 2007).
Estudos recentes têm evidenciado que o uso prolongado de inibidores de
bomba de prótons pode levar a deficiência na absorção de ferro, favorecendo
quadros de anemia ferropriva em alguns indivíduos (DADO; LOESCH;
JAGANATHAN, 2017). A hipomagnesemia, causada pela deficiência na absorção de
magnésio, é outro efeito adverso relacionado ao uso a longo e curto prazo de IBPs,
em alguns pacientes (KRZYCH et al., 2017; TOH; ONG; WILSON, 2015). O uso de
IBPs por longo perído foi associado com a progressão de nefropatias e aumento do
risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares em população com
diabetes tipo 2 (DAVIS; DRINKWATER; DAVIS, 2017).
A erradicação da bactéria H.pylori, na mucosa gástrica, cuja infecção é
um dos princiapis fatores de risco para o desenvolvimento de úlceras gástricas,
consiste no tratamento com antimicrobianos (claritromicina e amoxicilina ou
claritromicina e metronidazol). Este tratamento com vários antibióticos apresenta
diversos efeitos colaterais incluindo náusea, diarréia e tonturas. Quando a infecção é
diagnosticada com aparecimento de lesões gástricas o tratamento ainda é
combinado com IBPs ou bloqueadores de receptor H2 (JAIN et al., 2007).
Novas estratégias terapêuticas vêm sendo estudadas e desenvolvidas, a
exemplo do supressor da secreção de ácido gástrico, o fumarato de vonoprazan,
que é um bloqueador da bomba de prótons (H+/K+- ATPase) por competição com o
potássio (K+), tem o efeito mais forte e mais longo no bloqueio da bomba de prótons
do que os IBPs convencionais (TSUCHIYA et al., 2017). Em dezembro de 2014, o
Ministério da Saúde do Japão aprovou o uso do vonoprazan para o tratamento de
pacientes adultos com doenças relacionadas à secreção de ácido gástrico, incluindo
úlcera gástrica ou duodenal, bem como adjuvante no tratamento de erradicação da
H.pylori em pacientes com úlcera gástrica. O vonoprazan apresentou alguns efeitos
adversos semelhantes ao dos IBPs, mas geralmente é bem tolerado nas triagens
clínicas (GARNOCK-JONES, 2015).
Nesse contexto torna-se evidente a necessidade de novas pesquisas que
visem buscar fármacos cada vez mais específicos para o tratamento de lesões
gástricas e para infecção por H.pylori, uma vez que, os fármacos hoje disponíveis
para o tratamento da úlcera apresentam vários efeitos adversos e alguns são caros,
42
o que limita o seu uso durante um tratamento crônico. As plantas medicinais têm
sido tradicionalmente uma fonte importante para a origem e o desenvolvimento de
medicamentos (BI; MAN; MAN, 2014).
1.5 ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS MEDICINAIS COM ATIVIDADE
GASTROPROTETORA
O uso de plantas como alternativa para tratar diversas enfermidades é
datado desde a antiguidade por populações de diversos países. No Brasil, a
utilização de espécies vegetais com atividade terapêutica foi disseminada
principalmente pela cultura indígena. Só o Brasil possui 20-22% de todas as plantas
e micro-organismos existentes no planeta, e juntamente com outros países da
América Latina comportam a maior parte da biodiversidade de todo o mundo
(HELMSTÄDTER; STAIGER, 2014). Em países ainda em desenvolvimento como o
Brasil a descoberta de novas fontes terapêuticas diminuiria a importação de
medicamentos e estimularia o desenvolvimento econômico, além do que fármacos
obtidos de produtos naturais são mais atrativos e tendem a ser menos dispendiosos
para população, quando comparados aos produtos sintéticos importados de países
desenvolvidos (NEWMAN; CRAGG, 2012).
Com o crescente interesse e a necessidade da descoberta de novos
fármacos, os extratos de plantas têm-se tornado fonte atrativa e vem apresentando
resultados promissores no tratamento de úlceras gástricas. Até o ano de 2008, 58
espécies de plantas medicinais foram listadas com atividade antiulcerogênica e
essas espécies são distribuídas em 37 famílias, algumas delas Asteraceae,
Fabaceae, Celastraceae e Turneraceae. Essas plantas produzem compostos
químicos através da sua atividade metabólica. Os metabólitos gerados podem ser
primários, entre eles os açucares e gorduras que são encontrados em todas as
plantas, e secundários encontrados em uma quantidade menor de plantas, dentre
eles os alcaloides, glicosídeos, resinas, flavonoides, taninos e terpenos. Esses
metabólitos secundários apresentam ações terapêuticas e são vistos como fonte
alternativa para a produção de medicamentos (BI; MAN; MAN, 2014).
Os metabólitos secundários constituem os óleos essenciais de plantas
aromáticas que em geral são líquidos, voláteis, lipossolúveis e com um forte odor.
43
Na natureza, os óleos essenciais protegem as plantas servindo como,
antibacterianos, antivirais e antifúngicos; repelem os herbívoros e atraem insetos
para facilitar a polinização e a comunicação alelopática entre as plantas. Os óleos
essenciais são parte importante da farmacopeia tradicional principalmente em
países tropicais, e eles também apresentam características que os tornam populares
na indústria de alimentos, cosmética e farmacêutica (BAKKALI et al., 2008).
Alguns óleos essenciais de espécies vegetais possuem atividade
terapêutica e profilática sobre úlceras gástricas, como exemplo do óleo essencial
das raízes de Carlina acanthifolia All. (Asteraceae), das folhas de Casearia sylvestris
Sw. (Flacourtiaceae), da casca da fruta de Citrus aurantium L. (Rutaceae), da casca
do caule de Croton cajucara Benth. (Euphorbiaceae), das partes aéreas de Hyptis
spicigera Lam (Lamiaceae), das sementes de Pterodon emarginatus Vogel
(Fabaceae) e dos botões das flores de Syzygium aromaticum L. (Myrtaceae). Esses
óleos essenciais são misturas complexas, com 20 a 60 componentes que se
apresentam em diferentes concentrações (ROZZA; PELLIZZON, 2013).
1.5.1 Terpenos
Os terpenos formam a maior classe de compostos orgânicos naturais,
com mais de 40.000 moléculas já identificadas. A estrutura básica dos terpenos
consiste em uma unidade isoprenoide (C5H8), que formam os hemiterpenos (C5),
monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterpenos (C25),
triterpenos (C30) e tetraterpenos (40C). A biossíntese dos terpenos, pela ação das
preniltransferases acontece com a conversão dos substratos difosfato de
isopentenilo (IPP) e o seu isômero dimetilalil difosfato (DMAPP) no prenildifosfato
alélico que por ação catalítica das sintetases específicas de terpenos formam o
esqueleto precursor dos mesmos (THOLL, 2006; BAKKALI et al., 2008; CHO et al.,
2017).
Os terpenos têm um valor econômico significativo devido ao seu uso no
setor industrial cosmético e alimentício, como aditivos alimentares, aromatizantes e
especiarias. Na indústria farmacêutica, os terpenos além de serem utilizados como
excipientes de fármacos (para melhorar penetração na pele), eles também são
princípios ativos de alguns medicamentos, como exemplo de produto farmacêutico a
44
base de terpeno tem-se a Artezine® com atividade antimalárica, o Taxol®, com
atividade antitumoral e o salonpas® a base de mentol e cânfora, com atividade
analgésica local (GUIMARÃES; SERAFINI; QUINTANS, 2014). Existem numerosos
estudos sobre os efeitos farmacológicos dos terpenos incluindo, efeitos
anticancerígeno, analgésico, anti-inflamatório, neuroprotetor, modulador imunológico
e cicatrizante de feridas (ALI et al., 2013; QUINTANS et al., 2013; BARRETO et al.,
2014; GUIMARÃES; SERAFINI; QUINTANS, 2014; ARAÚJO-FILHO et al., 2016;
RODRIGUES; SIEGLITZ; BERNARDES, 2016).
Diversos terpenos já foram avaliados experimentalmente quanto ao seu
potencial antiulcerogênico, incluindo os carotenoides tetraterpênicos, como o
licopeno encontrado no tomate, na melancia e no mamão, os diterpenos, como ácido
carnósico encontrado nas espécies vegetais Rosmarinus officinalis L. e Salvia
officinalis L. e os sesquiterpenos, como a zerumbona, encontrada nos rizomas de
Zingiber zerumbet L. O efeito protetor gástrico promovido por esses terpenos pode
ser atribuído principalmente à atividade antioxidante (THEODULOZ; PERTINO;
SCHMEDA-HIRCHMANN, 2014; SIDAHMED et. al., 2015; BOYACIOGLU et al.,
2016).
1.5.2 Monoterpenos
Os monoterpenos são moléculas aromatizantes, odorificantes e
constituintes majoritários de 90% dos óleos essenciais. Os monoterpenos são
divididos em três maiores subgrupos: monoterpeno linear (Mirceno, linalol e neral),
monocíclico (p-cineno, mentol e carveol) e bicíclico: ((-)-mirtenol, α-pineno e
borneol). Dentro desses subgrupos os monoterpenos ainda podem ser divididos de
acordo com o grupo funcional que apresentam, em álcoois, hidrocarbonetos,
aldeídos, cetonas, éteres e esteres (CHERN; SHUKOR; MUSE 2013). Diversas
atividades biológicas promovidas pelos monoterpenos já foram identificadas, dentre
elas ação anti-inflamatória, antioxidante, analgésica e antimicrobiana, tornando-os
atrativos como substâncias com significante potencial farmacológico
(GUIMARÃES; QUINTANS J.; QUINTANS L., 2013; SÁ; ANDRADE; De SOUSA,
2013; WANG et al., 2017).
45
Estudos evidenciaram atividade protera e/ou cicatrizante gástrica dos
monoterpenos timol, α-terpineol e β-mirceno. O Timol é um monoterpeno fenol
derivado do cimeno, encontrado em abundância nos óleos essenciais de plantas do
gênero Thymus, Origanum e Lippia. A ação gastroprotetora apresentada pelo timol
envolve aumento da produção de muco e prostaglandinas, e ativação dos canais de
potássio sensíveis a ATP (KATP) (RIBEIRO et al., 2016). O α-terpineol é um
monoterpeno álcool presente no óleo essencial da Pandanus odoratissimus L., a
atividade antiulcerogênica apresentada pelo α-terpineol envolve aumento dos níveis
de óxido nítrico endógeno e atividade antioxidante (SOUZA et al., 2011). O β-
mirceno é um monoterpeno hidrocarboneto acíclico encontrado no óleo essencial da
Citrus aurantium L., com atividade antiulcerogênica relacionada ao seu efeito
antioxidante (BONAMIN et al., 2014). Essas descobertas reforçam a importância e
utilidade dos monoterpenos, constituintes dos óleos essenciais, como promissores
agentes no tratamento da úlcera gástrica, uma doença global, que carece de novas
fontes terapêuticas em termos de eficácia, segurança e baixo custo (OLIVEIRA et
al., 2014).
Alguns monoterpenos são frequentemente encontrados nos óleos
essenciais de espécies vegetais como mistura racêmica, a exemplo do (±)-citronelol.
No entanto, pode acontecer da molécula ser opticamente ativa e os seus
enantiômeros serem encontrados em diferentes espécies de plantas, como o próprio
citronelol, com o (+)-citronelol encontrado no Eucalyptus citriodora Hook e (-)-
citronelol presente no óleo essencial de rosa e gerânio. Isso acontece também com
o pineno onde o (+)-α-pineno está presente na Pinus pallustris Mills e o (-)-β-pineno
na Pinus caribaea Morelet (BAKKALI et al., 2008; CHERN; SHUKOR; MUSE, 2013).
1.5.3 (-)-Mirtenol
O (-)-mirtenol é um monoterpeno álcool bicíclico, volátil, com fórmula
C10H16O e peso molecular de 152,23 g/mol (KESKİN; YILDIRIM; UYANIK, 2010).
Esse monoterpeno é muito utilizado na produção de perfumes, xampus, sabonetes e
detergentes (BHATIA et al., 2008).
Em geral os monoterpenos são extraídos de espécies vegetais e o
isolamento destes compostos, com alto grau de pureza, a partir de espécies
46
vegetais é difícil e dispendioso devido à obtenção de baixas quantidades. Além do
mais, o fornecimento de materiais vegetais pode se tornar limitado, principalmente
por causa das variações sazonais e pragas que acometem as plantações. Outra
forma de se obter os monoterpenos de interesse econômico e farmacêutico é
através da transformação oxidativa de monoterpenos que são mais abundantes e
mais baratos, como o α-pineno (TRYTEK; JĘDRZEJEWSKI; FIEDUREK, 2015).
Estudo realizado por Schewe; Holtmann e Schrader (2009) apresentou resultados
promissores na obtenção de quantidades satisfatórias do (-)-mirtenol através da
oxidação do α-pineno usando biocatalisadores de bactérias, Escherichia coli
recombinantes. Esses resultados são promissores economicamente para obtenção
em larga escala desse monotepeno. Uma vez que, o (-)-mirtenol é um monoterpeno
muito utilizado na indústria cosmética e vem apresentando resultados promissores
nas pesquisas farmacológicas. Ademais, o monoterpeno bicíclico, α-pineno,
presente no óleo essencial de plantas do gênero Hyptis apresentou efeito
gastroprotetor em modelo de lesões gástricas induzidas por etanol e indometacina,
aumentando o conteúdo de muco e reduzindo a secreção gástrica de H+ (PINHEIRO
et al., 2015).
Para garantir a segurança do (-)-mirtenol nas formulações químicas da
indústria cosmética foi realizado um estudo de toxicidade aguda. Este estudo
mostrou que a dose letal do (-)-mirtenol, com capacidade de matar 50% dos animais
(DL50), administrado por via oral em ratos, é de 2450 mg/kg em ratos e 630 mg/kg
em ratas (BELSITO et al., 2008). Contudo, não existem resultados, na literatura
científica, da avaliação da toxicidade aguda ou subcrônica do (-)-mirtenol em
camundongos.
Quantidades variáveis do (-)-mirtenol já foram obtidas do extrato e óleo
essencial de diversas espécies vegetais com propriedade terapêuticas, como
exemplo do extrato diclorometano de Sideritis arguta Boiss, Sideritis condensata
Boiss, Sideritis stricta Boiss, e Sideritis sipylea Boiss (Lamiaceae) com propriedades
sedativas (KESSLER et al., 2014), do extrato metanólico de Myrtus communis L.
(Myrtaceae) com atividade antiulcerogênica (SUMBUL et al., 2010) e do óleo
essencial da mesma espécie com efeito hipnótico (BIRHANIE; WALLE; REBBA,
2016) e antimicrobiano (PIRBALOUTI et al., 2014), do óleo essencial de Lavandula
stoechas L (Lamiaceae) com propriedades hipoglicêmicas e antioxidantes (SEBAI et
47
al., 2013) e do óleo essencial da Ferula gummosa Boiss (Apiaceae) com atividade
antimicrobiana (ABBASZADEGAN et al., 2015).
Estudos apontam diversas atividades biológicas do (-)-mirtenol, com efeito
ansiolítico mediado pela via GABAérgica (MOREIRA et al., 2014), atividade
antimicrobiana contra bactérias causadoras de problemas intestinais (NGAN et al.,
2012), um sintético derivado do (-)-mirtenol apresentou promissora atividade anti-
influenza em cultura de células contaminadas com o vírus (KHOMENKO et al.,
2017), efeito antiproliferativo, desse monoterpeno, sobre células tumorais
(YAMAMOTO et al., 2008), ações anti-inflamatórias e antinociceptiva pela via do
glutamato (SILVA et al., 2014) foram também reportados. Segundo estudo
recentemente realizado por Gomes et al. (2017) as propriedades anti-inflamatórias
apresentadas pelo monoterpeno (-)-mirtenol, parece envolver modulação direta da
migração de neutrófilos e do estresse oxidativo.
Diante dessas informações que denotam estudos promissores e atuais
sobre a atividade biológica do (-)-mirtenol, no presente trabalho buscou-se avaliar a
atividade gastroprotetora e cicatrizante do (-)-mirtenol e seus possíveis mecanismos
de ação, in vivo e in vitro, como também sua toxicidade em camundongos.
48
2 JUSTIFICATIVA
Os estudos sobre citoproteção gástrica, que visam à descoberta de
substâncias gastroprotetoras são extremamente relevantes, pois apesar das
inúmeras pesquisas nos últimos 30 anos, os mecanismos gastroprotetores não são
completamente entendidos e é perceptível a necessidade de fármacos com ação
preventiva e terapêutica sobre as úlceras gástricas (SZABO, 2014). As complicações
relacionadas à úlcera promovem frequentemente perda na qualidade de vida e
produtividade do indivíduo acometido (BARKUN; LEONTIADIS, 2010).
Os inibidores de bomba de prótons (IBPs) e os antagonistas H2 são os
principais fármacos utilizados no tratamento da úlcera gástrica, mas, apresentam
ação gastroprotetora limitada. Além disso, os IBPs têm custo consideravelmente
elevado e são utilizados por longos períodos no tratamento da úlcera, o que
favorece o aparecimento de efeitos indesejados, como a hipomagnesemia (KRZYCH
et al., 2017; MO et al., 2015). Alguns monoterpenos voláteis apresentaram potencial
atividade antiulcerogênica, evidenciada na literatura científica, como os levogiros (-)-
linalol (Da SILVA et al., 2016) e o (-)-mentol (ROZZA et al., 2014), e o α-pineno
(PINHEIRO et al.,2015) vistos como potenciais fontes terapêuticas ou adjunvantes
no tratamento da úlcera gástrica. O α-pineno quando metabolizado gera como
produto, monoterpenos com similaridade estrutural, o (-)-mirtenol e o verbenol
(TAKAYAMA et al., 2015). O verbenol é um monoterpeno ácool bicíclico com
propriedades anti-inflamatória e antioxidante (CHOI et al., 2010).
O (-)-mirtenol é um monoterpeno encontrado no extrato e óleo essencial
de diversas espécies vegetais com atividade antiulcerogênica comprovada, dentre
eles o extrato metanólico da Myrtus communis L.(SUMBUL et al., 2010). A obteção
do (-)-mirtenol pela oxidação do α-pineno, um monoterpeno mais abundante e
barato, por biocatalizadores, conjectura a produção do (-)-mirtenol, economicamente
mais viável e com redução do extrativismo vegetal, pelas indústrias (SCHEWE;
HOLTMANN; SCHRADER, 2009). Antes da realização do presente trabalho não
existia na literatura científica, informações sobre o efeito protetor e cicatrizante
gástrico do (-)-mirtenol, apesar de ensaios farmacológicos preliminares já revelarem
efeitos ansiolítico, anti-inflamatório, antinociceptivo e antimicrobiano desse
monoterpeno (NGAN et al., 2012; MOREIRA et al., 2014; SILVA et al., 2014).
49
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar o possível efeito gastroprotetor e cicatrizante do (-)-mirtenol e os
mecanismos envolvidos, em modelos experimentais in vivo e in vitro.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Pesquisar a toxicidade aguda do (-)-mirtenol em camundongos.
Avaliar o efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol sobre lesões gástricas agudas
induzidas por etanol, indometacina e estresse de retenção e frio em camundongos
ou ratos.
Estudar, em modelo de lesão gástrica induzida por etanol em camundongos,
os mecanismos envolvidos no possível efeito gastroprotetor apresentado pelo (-)-
mirtenol, através da ação sobre muco aderido, marcadores do estresse oxidativo e
inflamatório, sintase de óxido nítrico, canais de potássio sensíveis ao ATP e
receptores GABA-A.
Avaliar a atividade cicatrizante do (-)-mirtenol em modelo de lesão gástrica
induzida por ácido acético e as alterações em parâmetros bioquímicos séricos, no
peso dos órgãos e dos animais.
Avaliar o efeito do (-)-mirtenol sobre a regeneração tecidual em modelo de
lesão gástrica induzida por ácido acético, através das análises histológicas e
imunohistoquímica para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA).
Investigar os mecanismos envolvidos no possível efeito cicatrizante gástrico
apresentado pelo (-)-mirtenol, em modelo de lesão induzida por ácido acético,
através da análise dos níveis de muco gástrico e NAG, da expressão de citocinas IL-
1β, TNF-α e COX-2, da expressão da atividade de MMP-2 e 9 e da marcação de
fibras de colágeno.
Verificar o efeito do (-)-mirtenol sobre a migração e proliferação das células de
adenocarcinoma gástrico humano (AGS), em modelo de ferida in vitro.
50
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 DROGAS E REAGENTES
Tabela 1. Substâncias utilizadas na experimentação laboratorial e seus fabricantes
Substância Fabricante
Acetato de sódio Vetec química, Brasil
Ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) Sigma Aldrich, EUA
Ácido acético Vetec química, Brasil
Ácido clorídrico (HCl) Dinâmica, Brasil
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) Dinâmica, Brasil
Ácido fosfórico Dinâmica, Brasil
Ácido periódico Sigma Aldrich, EUA
Ácido tricloroacético (TCA) Sigma Aldrich, EUA
Ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB) Sigma Aldrich, EUA
Acrilamida Sigma Aldrich, EUA
Ampicilina Sigma Aldrich, EUA
Azul de Alcian Sigma Aldrich, EUA
Azul de Coomasie Sigma Aldrich, EUA
Azul de nitrotetrazólio (NBT) Sigma Aldrich, EUA
Bicarbonato de sódio Vetec química, Brasil
Brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB) Sigma Aldrich, EUA
Cimetidina EMS, Brasil
Cloreto de magnésio Vetec química, Brasil
Clorofórmio Dinâmica, Brasil
Diaminobenzidina (DAB) Sigma Aldrich, EUA
Diazóxido Sigma Aldrich, EUA
Dicloridrato de N-(1-naftil)-etilenodiamina (NEED) Sigma Aldrich, EUA
(3-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromo tetrazólio (MTT) Sigma Aldrich, EUA
Dimetilsulfóxido (DMSO) Dinâmica, Brasil
Direct red 80 Sigma Aldrich, EUA
Dodecil sulfato de sódio (SDS) Sigma Aldrich, EUA
Eosina Sigma Aldrich, EUA
51
Entelan Novo Merck, Brasil
Estreptomicina Sigma Aldrich, EUA
Etanol absoluto Sigma Aldrich, EUA.
Éter dietílico Dinâmica, Brasil
Flumazenil BioChimico
Formaldeído Alphatec , Brasil
Fosfato de potássio dibásico Vetec química, Brasil
Fosfato de potássio monobásico Vetec química, Brasil
Fosfato de sódio dibásico Vetec química, Brasil
Fosfato de sódio monobásico Vetec química, Brasil
Glibenclamida Sigma Aldrich, EUA
Glutationa redutase Sigma Aldrich, EUA
Hematoxilina Sigma Aldrich, EUA
Indometacina Sigma Aldrich, EUA
Ketamina Syntec, Brasil
L-arginina Sigma Aldrich, EUA
L-glutationa Sigma Aldrich, EUA
L-metionina, Vetec química, Brasil
Misoprostol HeBron Farmacêutica
Muscimol Sigma Aldrich, EUA
N-acetilcisteína (NAC) Sigma Aldrich, EUA
Nitrito de sódio Vetec química, Brasil
Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) Sigma Aldrich, EUA
O-dionisidina Sigma Aldrich, EUA
Peróxido de hidrogênio Dinâmica, Brasil
p-nitrofenil-n-acetil-b-d-glicosamina Sigma Aldrich, EUA
p-nitrofenol Sigma Aldrich, EUA
Reagente de Shiff Sigma Aldrich, EUA
Riboflavina Vetec química, Brasil
Sacarose Vetec química, Brasil
Soro fetal bovino Gibco, EUA
Sulfanilamida Sigma Aldrich, EUA
Tripsina Cultilab, Brasil
52
1,1,3,3-Tetrametoxipropano Sigma Aldrich, EUA
Triton-X-100 Dinâmica, Brasil
Trizma Sigma Aldrich, EUA
Xilazina Syntec, Brasil
Xilol Dinâmica, Brasil
Fonte: Elaborada pelo autor.
4.2 EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
Tabela 2. Equipamentos utilizados nos experimentos e seus fabricantes
Equipamento Fabricante
Agitador de microplacas Biomixer, Brasil
Balança analítica Shimadzu, Japão
Balança para pesar animais Filizola, Brasil
Banho-Maria Quimis, Brasil
Câmera do microscópio Nikon (DS-Ri2)
Centrífuga de eppendroff’s Hermle, Alemanha
Centrífuga de placas Biomixer, Brasil
Centrífuga de tubos Cientec, Brasil
Espectrofotômetro Beckman Coulter, E.U.A.
Homogeneizador de tecidos Marconi, Brasil
Leitor de microplacas Asys, Reino Unido
Microcentrífuga Bio-Rad, E.U.A.
Microscópio Olympus modelo CK40
(Binocular microscope)
Microscópio Nikon (Eclipse Ni-U)
Mx3005p PCR System Agilent, German
NaNodrop ThermoFisher, EUA
Tissue lyser LT Qiagen, EUA
Fonte: Elaborada pelo autor.
53
4.3 OBTENÇÃO DO (-)-MIRTENOL
O (-)-mirtenol (Figura 6) sinônimo (1R)-2-Pinen-10-ol, (1R)-6,6-
Dimethylbicyclo[3.1.1]hept-2-ene-2-methanol, foi obtido da Sigma-Aldrich, (Cat.
n°70158), com fórmula molecular C10H16O, massa molar de 153,23 g/mol e grau de
pureza maior que 98,5%. Na temperatura ambiente é uma substância de
consistência líquida. Por ocasião do uso nos protocolos experimentais o (-)-mirtenol
foi emulsificado em Tween 80 (1% em salina).
Figura 6. Estrutura química do (-)-mirtenol
Fonte: Elaborada pelo autor.
Programa de desenho químico (ChemDraw).
4.4 ANIMAIS
Para a realização dos experimentos com animais foram utilizados
camundongos (Mus musculus, da linhagem Swiss, 25-30 g) machos e ratos (Rattus
norvegicus, da linhagem Wistar 180-220 g), fornecidos pelo Biotério Central da
Universidade Federal do Ceará. Os animais foram mantidos em gaiolas de
polipropileno, com temperatura controlada (24 ± 1 °C) e ciclo de 12 horas
claro/escuro, tendo livre acesso à água e ração. Antes da realização de cada
experimento, os animais passaram por um período de 2 horas no local de
experimentação para aclimatização ao novo ambiente. Após os procedimentos
experimentais os animais foram eutanasiados com sobredose de tiopental sódico
(100 mg/kg, i.p.) com lidocaína (10 mg/mL, i.p.) (Procedimentos para Anestesia de
Animais de Laboratório – CREAL/2013). Os ensaios experimentais foram aprovados
54
pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFC) sob protocolo de número
18/15 (Anexo I).
4.5 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DO (-)-MIRTENOL
A avaliação da toxicidade foi realizada seguindo as diretrizes da OCDE
425, estudo da toxicidade aguda (OECD GUIDELINE, 2001). Para isso, os
camundongos machos foram divididos em dois grupos, cada grupo com 3 animais, o
grupo veículo recebeu por via oral Tween 80 (1% em salina), e o grupo teste
recebeu por via oral, 2000 mg/kg de (-)-mirtenol. Imediatamente após a
administração do (-)-mirtenol os animais foram observados 1, 2, 4, 6 e 8 horas e a
partir de então, diariamente, até o décimo quarto dia, para verificar a ocorrência e
número de mortes. Além disso, o peso dos animais e do consumo de ração e água,
também foram avaliados através do peso da ração e do volume da água
mensurados diariamente (ANEXO III).
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO (-)-MIRTENOL
4.6.1 Lesões gástricas induzidas por etanol absoluto
Após jejum de sólidos de 12 horas, os camundongos foram divididos em
grupos (n=6 animais/grupo) e tratados com veículo (Tween 80 1% em salina, 10
mL/kg), (-)-mirtenol (25, 50 e 100 mg/kg) ou N-acetilcisteína (NAC) 200 mg/kg,
administrados por via oral. Após 1 hora do tratamento as lesões gástricas foram
induzidas pela administração oral de etanol absoluto (0,2 mL/animal), segundo
metodologia descrita por Morimoto et al. (1991). Decorridos 30 minutos após a
administração do etanol, os animais foram eutanasiados, seus estômagos foram
retirados e abertos ao longo da curvatura maior, limpos com salina (NaCl 0,9%) e a
área glandular foi desenhada em transparências, as quais foram escaneadas para
permitir a mensuração da área ulcerada, utilizando técnica de planimetria (mm2)
computadorizada através do software ImageJ 1.43. Os resultados foram expressos
como área de lesão gástrica (mm2).
55
4.6.2 Análise histológica das lesões gástricas induzidas por etanol absoluto
Após as avaliações realizadas no protocolo anterior a área glandular dos
estômagos foi retirada, fixada em formalina tamponada (10%, pH entre 6,8 e 7,4) e
emblocada em parafina. Adicionou-se um grupo Sham, com animais que não
receberam tratamento e nem etanol. Os blocos de parafina foram cortados, os cortes
com espessura de 5 µm foram fixados em lâminas histológicas, em seguida corados
com hematoxilina e eosina (H&E) para avaliação microscópica. As lâminas foram
examinadas com auxílio de um microscópio óptico com câmera acoplada para
obtenção das fotomicrografias com aumento de 20x. As alterações histológicas
avaliadas foram erosão, hemorragia, edema e infiltrado de células inflamatórias, com
sua intensidade expressa como escore, onde (+++) indica alterações severas, (++)
moderadas, (+) média e (–) ausente (AL-SAYED; EL-NAGA, 2015). Todas as
análises foram realizadas por patologista habilitado, Dr. Daniel Viana, sem
conhecimento prévio dos grupos, para evitar interferência nos resultados.
4.6.3 Determinação do conteúdo de muco gástrico
A determinação do conteúdo de muco, que forma a barreira protetora da
mucosa gástrica, foi realizada nos estômagos de camundongos (n= 6 animais/grupo)
submetidos ao protocolo de lesões gástricas induzidas por etanol, seguindo
metodologia descrita por Corne e Morrissey (1974). Para isso, a região glandular do
estômago foi pesada, segmentada e transferida imediatamente para solução de azul
de alcian 1% (solução de sacarose 0,16 M com 0,05 M de acetato de sódio, pH 5)
onde ficou por 2h. Em seguida o excesso de azul de Alcian (1%) dos segmentos foi
removido deixando-os em uma solução de sacarose (0,2 M) por 15 minutos, e por
mais 45 minutos em uma nova solução de sacarose (0,2 M). Após as lavagens os
segmentos foram colocados em solução de cloreto de magnésio (0,5 M) e 4 mL
dessa solução foram misturados em igual volume de éter dietílico. Essa mistura foi
centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi retirado e a
absorbância mensurada em espectrofotômetro no comprimento de onda de 580 nm.
A quantificação do azul de alcian foi calculada através da equação da reta de
regressão linear da curva de calibração com diferentes concentrações de azul de
56
alcian (6,25-100 µg/mL). Os resultados foram expressos como micrograma de azul
de alcian extraído por grama de tecido gástrico.
4.6.4 Lesões gástricas induzidas por indometacina
Logo após jejum de sólidos de 12 horas os camundongos (n=7/grupo)
receberam veículo (1 % de Tween 80 em salina 10 mL/kg, v.o.), (-)-mirtenol (25, 50 e
100 mg/kg, v.o.) ou misoprostol (50 µg/kg, v.o). Depois de 1 hora, todos os grupos
receberam indometacina por via subcutânea (30 mg/kg, diluída em solução de
bicarbonato de sódio 5%) (OLINDA et al., 2008). Os animais foram eutanasiados 6
horas após a administração de indometacina, os estômagos foram retirados, abertos
ao longo da curvatura maior e a área de lesão gástrica (mm2) foi mensurada através
do software ImageJ 1.43 (BREVIGLIERI et al.,2017).
4.6.5 Lesões gástricas induzidas por estresse de retenção e frio
Os ratos (n= 7/grupo), após jejum de 12 horas receberam veículo (Tween
80 1% em salina 10 mL/kg), (-)-mirtenol (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) ou cimetidina (100
mg/kg, v.o.). Uma hora depois, os animais foram colocados individualmente em
garrafas de plástico de 500 mL. Para manter o animal imobilizado dentro da garrafa,
a mesma foi vedada com fita adesiva. Em seguida foram colocados em caixas de
contenção (6 animais/caixa), onde permaneceram em decúbito ventral com
inclinação de 45 graus. Após imobilização, os animais foram mantidos em ambiente
com temperatura de 3 ± 1 °C, durante 3 horas, de acordo com metodologia descrita
por Senay e Levine (1967). Depois desse tempo, os animais foram eutanasiados,
seus estômagos removidos e abertos ao longo da curvatura maior, lavados com
salina (NaCl 0,9%) e desenhados em transparências, as quais foram escaneadas
para permitir a mensuração da área ulcerada, utilizando técnica de planimetria (mm2)
computadorizada (ImageJ 1.43.). Os resultados foram expressos em área de lesão
(mm2).
57
4.6.6 Avaliação dos marcadores do estresse oxidativo e da inflamação
Os camundongos utilizados nos protocolos dos marcadores do estresse
oxidativo e inflamação foram previamente submetidos ao experimento de lesões
gástricas induzidas por etanol (n=6 animais/grupo), tratados com veículo (Tween 80
1% em salina, 10 mL/kg, v.o.), (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) e N-acetilcisteína (200
mg/kg, v.o.). O grupo Sham não recebeu etanol e nem os tratamentos.
4.6.6.1 Ensaio enzimático da catalase
A região glandular dos estômagos dos camundongos que foram
previamente submetidos ao protocolo de lesão gástrica induzida por etanol absoluto,
como já descrito anteriormente, foram utilizadas para verificar a participação da
enzima catalase na proteção da mucosa gástrica pelo (-)-mirtenol (BEERS; SIZER,
1952). Os tecidos foram pesados e homogeneizados em solução tampão fosfato de
potássio gelado (0,05 M, pH 7,4), na proporção de 10% p/v (100 mg de tecido/1 mL
de tampão), utilizando um homogeneizador de tecido. O homogenato obtido foi
centrifugado a 3.000 rpm durante 15 min em 4 ºC. Uma solução de peróxido de
hidrogênio (0,059 M) foi preparada com o tampão, e utilizada como solução
substrato para o ensaio. Em uma cubeta de quartzo 10 µL do sobrenadante da
amostra foi misturado a 2 mL da solução tampão/peróxido de hidrogênio (0,059 M).
A absorbância foi lida em espectrofotômetro em comprimento de onda de 240 nm,
durante 6 min, e a variação da absorbância do primeiro e do sexto minuto foi
considerada. Os resultados foram expressos em mmol de catalase pelo tempo por
100 miligramas de tecido (mmol/min/mg de tecido).
4.6.6.2 Ensaio enzimático da superóxido dismutase
O sobrenadante proveniente do ensaio enzimático da catalase foi retirado
e centrifugado novamente por 20 min, 12000 rpm, 4 °C. Em uma câmara escura,
dentro dos tubos de vidro foram misturados 10 μL do sobrenadante, 1 mL do meio
de reação (tampão fosfato de potássio 50 mM, EDTA 100 nM e L-metionina 13 mM
pH 7,8), 150 μL do NBT (Azul de nitrotetrazólio, 750 μM) e 300 μL de riboflavina
58
(2 μM). Os tubos contendo a mistura foram expostos à lâmpada fluorescente (15 W)
por 15 minutos e em seguida a mensuração da absorbância foi realizada em
espectrofotômetro, em comprimento de onda de 560 nm (BEAUCHAMP;
FRIDOVICH 1971). Os resultados foram expressos como unidade da enzima, que é
a quantidade de SOD necessária para inibir a taxa de redução do NBT em 50% por
miligrama de proteína (U/mg). A dosagem de proteína nas amostras foi determinada
pelo método descrito por Lowry et al. (1951).
4.6.6.3 Ensaio da glutationa peroxidase
A região glandular dos estômagos dos camundongos submetidos ao
protocolo de lesão gástrica induzida por etanol foi pesada e homogeneizada em
tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 7,4) na proporção de 10%. O homogenato foi
centrifugado a 1200 rpm, por 15 minutos, 4 ºC. Depois da centrifugação, 100 µL do
sobrenadante foi adicionado a 150 µL do cocktail (Glutationa redutase (1U): 50 µL;
GSH: 0,0768g, NADPH: 0,0167g e peróxido de hidrogênio H2O2 0,4%, diluídos em
25 mL de tampão fosfato de potássio) em placa de 96 poços. A placa foi lida em
leitor de microplacas por 10 minutos, em intervalos de 1 minuto e em comprimento
de onda de 365 nm (YOSHIKAWA et al., 1993). A área sobre a curva dos valores
das absorbâncias, nos intervalos de tempo de 1 minuto foi calculada e dividida pelo
coeficiente de extinção do NADPH = 6,22 M-1 x cm-1 e multiplicado por 1000. Os
resultados obtidos foram expressos em µmol de glutationa peroxidase, pelo tempo,
por miligrama de proteína (µmol/min/mg de proteína). A dosagem de proteína nas
amostras foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951).
4.6.6.4 Determinação dos níveis de grupamentos sulfidrilas não proteicos (NP-SHs)
Os NP-SHs da mucosa gástrica foram determinados pelo reagente de
Ellman`s, o ácido 5,5-ditiobis (2-nitrobenzóico) (DTNB), segundo protocolo descrito
por Sedlak e Lindsay (1968). Para isso, a região glandular dos estômagos dos
camundongos submetidos ao protocolo de lesão gástrica induzida por etanol foram
pesadas e homogeneizadas em solução de ácido etilenodiaminotetracético gelado
(EDTA, 0,02 M; pH 8,9), em 10% de proporção, com auxílio do homogeneizador de
59
tecidos. Quarenta microlitros do homogenato 10% foi misturado com 50 µL de água
destilada, mais 10 µL de ácido tricloroacético (TCA, 50%) e centrifugados a 5000
rpm por 15 minutos, a 4 °C. O sobrenadante obtido foi pipetado em placa de 96
poços com tampão Trizma (0,4 M) mais EDTA (0,02 M, pH 8,9) e DTNB (0,01M). A
absorbância foi mensurada em leitor de microplaca, dentro de 5 minutos depois da
adição de DTNB, em comprimento de onda de 412 nm. Os valores das absorbâncias
foram interpolados a curva padrão de glutationa e os resultados foram expressos
como µmol de NP-SH por miligrama de tecido gástrico (µmol/mg de tecido).
4.6.6.5 Determinação dos níveis de malondialdeído
A região glandular dos estômagos de camundongos previamente
submetidos ao protocolo de lesão gástrica induzida por etanol absoluto, foi utilizada
para determinar a peroxidação lipídica por mensuração do malondialdeído (MDA)
usando o método descrito por Agar et al. (1999) com algumas modificações. A
região glandular foi removida, pesada e homogeneizada em tampão fosfato de sódio
gelado (0,1 M, pH=7,0), com homogeneizador de tecido na proporção de 10%. Em
seguida o homogenato foi centrifugado a 10000 rpm, durante 5 minutos, a 4 °C.
Alíquotas de 100 µL do sobrenadante foram misturadas com ácido acético 20% e
ácido 2-tiobarbitúrico 0,5% (diluído em ácido acético 20%, pH 2,4 - 2,6). A mistura foi
transferida para o banho-maria com temperatura de 95ºC, onde ficou durante 1 hora,
e sequencialmente para o banho de gelo onde ficou durante 30 minutos. Em seguida
recebeu dodecil sulfato de sódio (SDS, 8,1%) e foi imediatamente centrifugada a
12000 rpm, durante 15 min, a 25 °C. A leitura da amostra foi realizada em
espectrofotômetro com comprimento de onda em 532 nm. A curva padrão foi obtida
usando 1,1,3,3-tetrametoxipropano como padrão. Os resultados foram expressos em
nanomols de MDA por miligrama de tecido (nmol/mg tecido).
4.6.6.6 Ensaio da atividade enzimática da mieloperoxidase
A atividade da mieloperoxidase foi avaliada segundo protocolo descrito
por Bradley et al., (1982). Para isso, a região glandular dos estômagos dos animais
submetidos ao protocolo de lesão gástrica induzida por etanol foram pesadas e
60
homogeneizadas em solução de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB, 0,5%
diluído em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0) na proporção de 5%. Em
seguida o homogenato passou por um processo de três congelamentos e
descongelamentos seguidos. Logo após, o homogenato foi centrifugado em 8300
rpm, por 10 minutos, a 4 °C. Cem microlitros do sobrenadante foram adicionados a
1,9 mL da solução de reação (cloridrato de o-dionisidina, 0,167 mg/mL, tampão
fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0 e peróxido de hidrogênio 0,0005%). Rapidamente
após a mistura, a reação foi lida em espectrofotômetro em comprimento de onda de
450 nm, durante seis minutos, com variação do primeiro e do sexto minuto sendo
consideradas. Os resultados foram expressos como unidade de mieloperoxidase por
miligrama de tecido (U/mg de tecido).
4.6.6.7 Avaliação dos níveis de nitrato/nitrito
Os níveis de nitrato/nitrito (óxido nítrico), na região glandular dos
estômagos, foram determinados através da reação de Griess (GREEN et al., 1982).
A região glandular dos estômagos dos animais previamente submetidos ao protocolo
de lesões gástricas induzidas por etanol, foram homogeneizadas em tampão fosfato
de potássio gelado (50 mM, pH 7,8) utilizando um homogeneizador de tecidos para
obtenção do homogenato a 10% e centrifugados a 12000 rpm, por 15 minutos, a 4
ºC. Cem microlitros do sobrenadante foram misturados a 100 μL do reagente de
Griess (0,1% Dihidrocloreto de N-(1-naftill) etilenodiamida e 1% sulfanilamida em
ácido fosfórico 5%) e após 10 minutos a absorbância foi mensurada em
espectrofotômetro em 540 nm. As absorbâncias obtidas foram interpoladas à curva
padrão de nitrito de sódio. Os resultados foram expressos como micromols de
nitrato/nitrito por miligrama de proteína (µmol/mg de proteína). A dosagem de
proteína nas amostras foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951).
61
4.6.7 Avaliação do papel das Prostaglandinas, do Óxido Nítrico (NO), dos
Canais de Potássio Sensíveis ao ATP (KATP) e dos receptores GABA-A no efeito
gastroprotetor do (-)-mirtenol
Para avaliar a participação das prostaglandinas no efeito gastroprotetor
do (-)-mirtenol, os camundongos (n=6/grupo) foram pré-tratados com indometacina
(10 mg/kg, s.c., diluída em solução de bicarbonato de sódio 5%) 30 minutos antes da
administração do veículo (Tween 80 1% em salina 10 mL/kg, v.o.), (-)-mirtenol (50
mg/kg, v.o.) ou misoprostol (50 µg/kg, v.o.). Após 60 minutos dos tratamentos, todos
os animais receberam etanol absoluto (0,2 mL/animal, v.o.) para a indução das
lesões, de acordo com protocolo descrito por Matsuda e Yoshikawa (1999), com
modificações. Depois de 30 minutos, os animais foram eutanasiados e as lesões
gástricas mensuradas como descrito no item 4.6.1.
Para avaliar a participação do óxido nítrico no efeito gastroprotetor do (-)-
mirtenol os animais (n=6 animais/grupo) foram pré-tratados com Nω-nitro-L-arginina
metil éster (L-NAME, 20 mg/kg, i.p.), um inibidor da atividade enzimática da sintase
de óxido nítrico. Depois de 30 minutos os animais receberam veículo, (-)-mirtenol (50
mg/kg, v.o.) ou L-arginina (600 mg/kg, i.p.) (LEITE et al., 2009). Após 45 min da
administração do veículo e (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.), e 30 minutos após a
administração de L-arginina, todos os animais receberam etanol absoluto (0,2
mL/animal). Depois de 30 minutos da administração do etanol os animais foram
eutanasiados e as lesões gástricas mensuradas como descrito no item 4.6.1.
Para averiguar a participação dos canais de potássio sensíveis ao ATP
(KATP) no efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol os animais (n=6 animais/grupo) foram
pré-tratados com glibenclamida (3 mg/kg, i.p.), um bloqueador dos canais de
potássio sensíveis ao ATP (KATP), 30 minutos antes da administração do veículo, (-)-
mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou diazóxido (3 mg/kg, i.p.), seguindo protocolo descrito por
Leite et al. (2009). Após 45 minutos da administração do veículo e (-)-mirtenol (50
mg/kg, v.o.), e 30 min após a administração de diazóxido, todos os animais
receberam etanol absoluto (0,2 mL/animal). Trinta minutos depois os animais foram
eutanasiados e as lesões gástricas mensuradas como descrito no item 4.6.1.
Para investigar a participação dos receptores do ácido ү-aminobutírico
(GABA-A) no efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol os animais (n=6 animais/grupo)
62
foram pré-tratados com flumazenil (20 mg/kg, i.p.), bloqueador dos receptores
GABA-A. Depois de 30 minutos os animais receberam veículo, (-)-mirtenol (50
mg/kg, v.o.) ou muscimol (0,1 mg/kg, i.p.) agonista dos receptores GABA-A (NAJIM;
KARIM, 1991). Após 45 minutos da administração do veículo e (-)-mirtenol (50
mg/kg, v.o.), e 30 min após a administração de muscimol, todos os animais
receberam etanol absoluto (0,2 mL/animal). Depois de 30 min os animais foram
eutanasiados e as lesões gástricas mensuradas como descrito no item 4.6.1.
4.7 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CICATRIZANTE GÁSTRICA DO (-)-MIRTENOL
4.7.1 Lesão gástrica induzida por ácido acético 80%
Para indução da lesão gástrica por ácido acético, após um jejum de 12
horas, os ratos (n=5-7/grupo) foram anestesiados com ketamina (80 mg/kg) e
xilazina (10 mg/kg) administradas por via intraperitoneal. Sob efeito da anestesia os
animais foram submetidos ao processo cirúrgico, no qual uma incisão longitudinal foi
realizada, logo abaixo do processo xifoide, o estômago foi exposto e a lesão foi
induzida por aplicação tópica de 70 µL de ácido acético a 80% (v/v), durante um
minuto, na superfície da serosa gástrica. O ácido acético foi colocado dentro de um
tubo de polietileno, com 6 mm de diâmetro e 2 cm de altura, que delimitou o espaço
de contato do ácido com a superfície serosa do estômago durante o tempo
determinado de 1 minuto (TAKAGI; OKABE; SAZIKI, 1969). Passado este tempo, o
ácido acético foi removido, com auxilio de uma pipeta automática, e a região da
serosa foi lavada repetidamente com salina. O estômago foi acomodado na
cavidade abdominal e o corte foi suturado. Um dia após o procedimento cirúrgico foi
iniciado o tratamento com veículo (Tween 80 1% em salina 10 mL/Kg), (-)-mirtenol
(25, 50 e 100 mg/kg) ou cimetidina (100 mg/kg), administrados por via oral, um vez
por dia, durante sete dias. No oitavo dia os animais foram eutanasiados seus
estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior. A lesão gástrica
foi mensurada, com auxílio de um paquímetro digital (Digmess, 100.174B), avaliando
a área da lesão (mm2), a área de lesão x profundidade da lesão (mm3) (SILVA et al.,
2012), e a taxa de cicatrização da lesão (área de lesão do grupo veículo – área de
lesão do grupo teste/ área de lesão do grupo veículo x 100%). Após essas
63
mensurações, parte da lesão foi retirada e armazenada em freezer -80°C para
análises gênicas e enzimáticas, e a outra parte foi fixada em formalina tamponada
(10%) para procedimentos histopatológicos e imunohistoquímicos.
4.7.2 Avaliação do efeito do (-)-mirtenol sobre peso dos órgãos, parâmetros
bioquímicos e peso dos animais no protocolo de lesão gástrica induzida por
ácido acético 80%
Foram avaliadas as alterações provocadas pela exposição diária dos
ratos ao veículo (Tween 80 1% em salina 10 mL/kg, v.o.), (-)-mirtenol (25, 50 e 100
mg/kg, v.o.) ou cimetidina (100 mg/kg, v.o.) depois de sete dias de tratamento, no
modelo descrito anteriormente. O peso dos animais foi aferido diariamente. Além do
ganho de massa corporal, a análise dos parâmetros bioquímicos e do peso absoluto
dos órgãos dos animais também são considerados importantes indicadores para
avaliação da possível toxicidade de uma substância (Da SILVA et al., 2013; HILALY;
ISRAILI; LYOUSSI, 2004). Assim, no oitavo dia, os animais foram anestesiados com
ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), por administração intraperitoneal, e 4 mL
de sangue da veia cava inferior foram coletados, em tubo a vácuo com gel
separador, e centrifugados a 3500 rpm durante 15 minutos para separação do soro,
que foi aliquotado e ficou estocado no freezer -20 ºC até a análise dos parâmetros
bioquímicos: ALT (Alanina Aminotransferase), uréia, creatinina, albumina e
colesterol total. Os ensaios foram realizados em aparelho automático (Cobas c 111
da Roche), com reagentes Labtest®. Após a coleta do sangue os animais foram
eutanasiados e os órgãos (coração, pulmão, baço, fígado e rins) foram retirados
para verificação do peso absoluto.
4.7.3 Análise histológica da lesão gástrica induzida por ácido acético
Os estômagos dos ratos submetidos ao protocolo descrito no item 4.7.1
foram abertos ao longo da curvatura maior e a lesão gástrica foi retirada e fixada em
formalina tamponada (10% em PBS), durante 24 h, à temperatura ambiente. Em
seguida, as amostras foram preparadas de acordo com a descrição no item 4.6.2.
Finalmente as lâminas foram observadas em microscópio óptico e as imagens
64
capturadas com aumento de 10x e 20x. As análises das alterações histológicas
foram realizadas como descrito por Da Silva et al. (2013). Todas as análises foram
realizadas por patologista habilitado, Dr. Daniel Viana, sem conhecimento prévio dos
grupos, para evitar interferência nos resultados.
4.7.4 Quantificação da atividade da N-acetilglicosaminidase (NAG) na lesão
gástrica induzida por ácido acético
Para avaliação da atividade da enzima NAG, a lesão gástrica proveniente
dos estômagos dos animais submetidos ao protocolo descrito no item 4.7.1, foi
pesada (150 mg) e homogeneizada em 1 mL de solução salina/triton-X-100 (0,1%),
utilizando para isso o homogeneizador de tecidos. O homogenato foi centrifugado a
3000 rpm, por 10 min, em 4ºC. Cem microlitros do sobrenadante diluído (1:2 em
solução salina/triton X, 0,1%) foi incubado em placa de 96 poços com tampão citrato
(4 mmol, pH 4,5) e substrato (p-nitrofenil-N-acetil-B-D-glicosamina, 2,24 mmol). Em
seguida a placa foi colocada em estufa a 37°C por 30 minutos, passado esse tempo
a reação foi interrompida com tampão glicina (200 mmol, pH 10,6) (BAILEY;
STURM; LOPEZ-RAMOS, 1982). O p-nitrofenol produzido pela reação enzimática foi
mensurado em leitor de microplacas com comprimento de onda em 400 nm. Os
resultados foram interpolados à curva com diferentes concentrações de p-nitrofenol
e expressos como nanomol de NAG por micrograma de proteína (nmol/µg proteína).
O sobrenadante foi submetido à dosagem de proteínas pelo método descrito por
Bradford (1976).
4.7.5 Determinação do conteúdo de muco gástrico com ácido periódico de
Schiff (PAS) na lesão gástrica induzida por ácido acético
A coloração com PAS é usada para marcar estruturas que contenham
altas proporções de macromoléculas de carboidratos (glicogênio, glicoproteína,
proteoglicano), tipicamente encontradas no muco gástrico. Para realização do
experimento, a lesão gástrica emblocada em parafina, proveniente do protocolo
descrito no item 4.7.1, foi cortada em micrótomo. Os cortes de 5 µm foram colocados
em lâminas histológicas, desparafinizados, reidratados, oxidados em ácido periódico
65
(0,5%) por 5 minutos e lavados em água destilada. As lâminas foram coradas com
reagente de Schiff por 20 minutos, em seguida lavadas em água sulfurosa e água
corrente. Logo após, as lâminas foram contra coradas com hematoxilina por 20
minutos e montadas com bálsamo do Canadá (MOWRY; WINKLER, 1956). Após a
montagem e secagem das lâminas os cortes foram observados em microscópio
óptico e a imagem foi capturada pela câmera, aumento de 20x. As glicoproteínas
presentes no muco gástrico foram coradas por ácido periódico de Schiff (PAS) e o
muco foi quantificado em porcentagem de área marcada com a cor magenta, usando
o sistema de deconvolução do ImageJ software 1.43. Três lâminas para cada grupo,
cada uma relativa a um animal, tiveram diferentes campos analisados e os
resultados foram expressos como muco gástrico (% Área marcada).
4.7.6 Ensaio imunohistoquímico
O ensaio imunohistoquímico foi realizado para pesquisar o antígeno
nuclear de proliferação celular (PCNA) em lesão gástrica induzida por ácido acético
em ratos. Para isso, as amostras provenientes do protocolo descrito no item 4.7.1,
emblocadas em parafina foram cortadas em micrótomo, os cortes com espessura de
4 µm foram fixados em lâminas imunohistológicas silanizadas, desparafinizados em
xilol e hidratados em álcoois de diferentes concentrações. As lâminas foram
colocadas em tampão citrato (pH 6) e a recuperação antigênica foi realizada em
banho-maria com temperatura de 85 - 95°C. Em seguida foram deixadas em
temperatura ambiente por 30 minutos e sequencialmente o bloqueio da peroxidase
endógena foi realizado com incubação das lâminas em solução bloqueadora de
peroxidase, por 15 minutos. Após serem lavadas três vezes com tampão fosfato
salina (PBS 1x concentrado, pH 7,4), as lâminas receberam o anticorpo primário
para PCNA (AV03018, Sigma-Aldrich, diluição 1:200, overnight) e anticorpo
secundário (ab98505, Abcan, diluição 1:200, por duas horas). Depois das duas
horas as lâminas foram novamente lavadas três vezes com PBS (1x concentrado,
pH = 7,4) e reveladas com o cromógeno diaminobenzidina (DAB Substrate,
k346889-2), por 15 minutos.
Finalmente os cortes foram contra corados com hematoxilina,
desidratados com álcoois, clarificados com xilol e as lâminas foram montadas com
66
entelan. Para avaliar a marcação do PCNA as imagens foram visualizadas em
microscópio óptico e obtidas por câmera acoplada ao microscópio, aumento de 20x.
A quantificação das células positivamente marcadas para PCNA foi realizada
utilizando o sistema de deconvolução do ImageJ software (1.43). Foram analisadas
três lâminas de cada grupo. Os resultados foram expressos como porcentagem (%)
de células imunomarcadas para o PCNA.
4.7.7 Expressão do RNAm de TNF-α, IL-1β e COX-2 no tecido gástrico de ratos
pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR).
4.7.7.1 Extração do RNA do tecido gástrico
O RNA total das amostras de tecido gástrico dos ratos submetidos ao
protocolo de lesão induzida por ácido acético, item 4.7.1, foi extraído usando
reagente de lise Qiazol (100 mg de tecido para cada 1 mL de reagente de lise). As
amostras foram homogeneizadas por 3 minutos no aparelho TissueLyser LT. Em
seguida foram adicionados 200 µL de clorofórmio, em cada homogenato, de acordo
com as indicações do fabricante do kit (RNeasy Lipid Tissue Mini, Qiagen). As
concentrações de RNA foram estimadas em NaNodrop na absorbância de 260 nm.
A qualidade do RNA extraído foi determinada pela razão entre os valores obtidos
nas absorbâncias de 260/280 nm, onde os valores entre 1,8 - 2,0 indicam alto grau
de pureza do RNA extraído (PAN et al., 2002).
4.7.7.2 Transcrição reversa e PCR em tempo real (RT-qPCR)
As amostras de RNA (1 µg) foram reversamente transcritas para cDNA,
de acordo com as indicações do fabricante do kit High-Capacity cDNA Reverse
Transcription (Thermofisher). As condições do ciclo termal para a reação
de transcrição reversa (RT-PCR) foram 25°C-10 min, 37°C-120 min e 85 °C-
5 minutos. Para a reação do PCR em tempo real foi utilizado o kit master mix
GoTaq® contendo a sonda SYBER green® (PROMEGA). Esta reação foi realizada
em 40 ciclos no aparelho Mx3005p PCR System, com desnaturação em 95°C, por 2
minutos, e anelamento/extensão em 59/60°C, por 1 minuto, para os primers TNF-α,
67
IL-1β e β-actina. Para o primer da COX-2 o anelamento/extensão foi de 60/60°C
também por 1 minuto. A sequência gênica dos primers e a temperatura de
anelamento são mostrados na tabela 3. A curva de melting ou curva de dissociação
foi utilizada para avaliar a especificidade dos primers na amplificação dos genes de
interesse. Os dados foram analisados pela comparação do Cycle threshold (Ct) de
cada amostra com as médias relativas à quantificação com o gene de referência (β-
actina) para obtenção do delta delta Ct (2-ΔΔ Ct) (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). Todos
os ensaios foram realizados em triplicada experimental.
Tabela 3. Sequência gênica e temperatura de anelamento dos primers utilizados na
PCR em tempo real
Gene
Sequência
Temperatura de
anelamento (°C)
TNF-α Forward 5′-AAATGGGCTCCCTCTCATCAGTT-3′
Reverse 5′-TCTGCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3
59
IL-1β Forward 5′-CACCTCTCAAGCAGAGCACAG-3′
Reverse 5′-GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC-3′
59
COX-2 Forward 5′-GGTTCACCCGAGGACTGGGC-3′
Reverse 5′-CGCAGGTGCTCAGGGACGTG-3′
60
Β-actin Forward 5`GGGAATGGGTCAGAAGGACTC3′
Reverse 5′ GGTGTGGTGCCAGATCTTCTC3′
59
Fonte: (DHARMANI; De SIMONE; CHADEE, 2013).
4.7.8 Análise da expressão de atividade das metaloproteinases de matriz
(MMP-2 e 9)
A pesquisa da expressão de atividade das metaloproteinases de matriz 2
e 9 foi realizada de acordo com metodologia descrita por Baragi et al.(1997). Para
avaliar a atividade das MMP-2 e 9 foi utilizado o mesmo sobrenadante obtido do
homogenato no protocolo descrito no item 4.7.4. Assim, inicialmente o sobrenadante
foi submetido a dosagem de proteínas pelo método de Bradford (1976) e em seguida
diluído 10x para eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
(SDS) e 1 mg/mL de gelatina sob condições não redutoras. Em seguida o gel foi
lavado com triton-X-100 (2,5%), incubado em tampão contendo Tris/HCl (50 nM, pH
68
7,4, NaCl 0,15 M e CaCl2 10 mM), overnight em 37°C e logo após corado com azul
de coomassie 0,05%. Os locais da atividade gelatinolítica foram vistos como bandas
não coradas no gel. A expressão da atividade gelatinolítica das MMP-2 e 9 foi
estimada por análise densitométrica no software ImageJ 1.43. Os resultados foram
apresentados como expressão da atividade gelatinolítica de MMP-2 ou 9
correlacionada com os dados do veículo, considerando o veículo ~100%.
4.7.9 Mensuração da deposição de colágeno na mucosa gástrica
A lesão gástrica emblocada em parafina proveniente do protocolo descrito
no item 4.7.1, foi cortada em micrótomo com espessura de 5 µm. Os cortes foram
fixados em lâminas histológicas, desparafinizados com xilol, hidratados com álcoois,
coradas com solução de picrosirius (Direct Red 80 e ácido pícrico 1,3%) por 60
minutos e finalmente foram desidratados e a lâmina foi montada com entelan. A
análise das lâminas foi realizada com auxílio de microscópio óptico (Leica
microsystems DM2000, Wetzlar, Alemanha) com e sem luz polarizada e câmera
acoplada (Leica DFC 295) para obtenção das imagens com aumento de 20x
(JUNQUEIRA, BIGNOLAS, BRENTANI, 1979). As fibras de colágeno podem ser
analisadas de acordo com sua cor no sistema RGB (red, green, blue), onde as
marcações de vermelho, laranja e amarelo são indicativas de colágeno tipo I e
marcações de verde são indicativas de colágeno tipo III (BONIN et al., 2005). A
porcentagem das fibras de colágeno marcadas foi quantificada usando o sistema de
deconvolução do ImageJ software (1.43). Para isso, foram analisadas três lâminas
de cada grupo e de cada lâmina foram fotografados dez campos diferentes para
análise. Os resultados foram expressos como porcentagem (%) de fibras de
colágeno.
4.8 ENSAIOS DE MIGRAÇÃO E PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO
4.8.1 Cultura de Células
Na avaliação da atividade cicatrizante in vitro foram utilizadas células
AGS (células de adenocarcinoma gástrico humano), adquiridas da American Type
69
Culture Collection (ATCC – CRL-1739). As células foram cultivadas em frascos de
cultivo sob atmosfera com 5% de CO2, a 37 °C em meio F12-K (Sigma) contendo
100 mg/L de ampicilina e 100 mg/L de estreptomicina e suplementado com soro fetal
bovino (SFB) a 10% (SÁNCHEZ et al., 2006). Ao atingir confluência de 90%, a
monocamada de células foi lavada uma vez com PBS e submetida à tripsinização
utilizando solução 0,25% de tripsina, para permitir que as células aderidas a garrafa
se soltassem. Em seguida, foi adicionado meio suplementado com SFB 10% para
inativar a tripsina, as células foram contadas em câmara de Neubauer e suspensas
na densidade adequada para cada experimento. Todos os experimentos foram
realizados no laboratório de substâncias antitumorais (LSAT) da Universidade
Federal de Minas Gerais, sob supervisão da professora Dra. Miriam Teresa Paz
Lopes.
4.8.2 Ensaio de viabilidade celular por MTT
O ensaio de viabilidade celular foi realizado de acordo com o método
descrito por Twentyman e Luscombe (1987). As células AGS foram cultivadas em
placas de 96 poços na densidade 5x103 células/100 µL de meio de cultivo F12-K
suplementado com SFB 10%. Após 24 horas, o meio de cultivo foi removido e o
meio com os tratamentos que consistiam em controle (SFB 10%) ou (-)-mirtenol
(0,01; 0,1; 1; 10; 100; 1000; 10000 e 10000 nM), foram colocados em cada poço,
que recebeu 100 µL de cada condição. As células ficaram incubadas com os
tratamentos durante 48 horas, a 37 ºC, em atmosfera com 5% de CO2. Após esse
período, foram adicionados 10 µL de uma solução (5 mg/mL) de MTT (3-4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromo tetrazólio) em cada poço e a placa permaneceu
em estufa por 4 horas. Em seguida a solução foi aspirada e 100 µL de
dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados em cada poço para a solubilização dos
cristais de formazan. A placa foi agitada por alguns minutos, em agitador de
microplaca, e a leitura foi realizada em leitor de microplaca em comprimento de onda
de 570 nm. E os resultados foram expressos como porcentagem de viabilidade
considerando o controle~100%.
70
4.8.3 Ensaio de proliferação celular por BrdU
Células AGS foram cultivadas em placas de 96 poços (5 x 103
células/poço) em meio F12-K com SFB 10%. Após 24 horas, as células foram
cultivadas com meio carente em fatores de crescimento, suplementado apenas com
SFB 0,5%. Depois de 24 horas o meio foi aspirado e os tratamentos com (-)-mirtenol
(1; 10; 100 e 1000 nM), que foi diluído em meio F12-K com SFB 0,5%, foram
colocados em cada poço. Além do controle negativo de SFB 0,5% também foi
mantido um controle positivo com SFB 10%, ambos diluídos em F12-K. Após 6 horas
de incubação dos tratamentos, foram adicionados 10 µL de bromodeoxiuridina
(BrdU) na concentração de 100 µM, deixando as placas em condições de cultivo por
18 horas. Em seguida, as células foram processadas conforme indicado pelo
fabricante do kit (Cell Proliferation Elisa, BrdU colorimetric–Roche), passando por
fixação e desnaturação durante trinta minutos, imunomarcação com anti-BrdU
conjugado com peroxidase por 90 minutos, revelação através da adição do substrato
tetrametilbenzidina (TMB) e após 15 minutos foi realizada determinação
espectrofotométrica dos produtos em leitor de microplaca, pela diferença entre a
densidade óptica (D.O.) obtida pelas leituras em comprimento de onda em 370 e 492
nm e normalização dos resultados para 1. Todos os ensaios foram feitos em
quadruplicata.
4.8.4 Ensaio de migração celular
O ensaio de migração celular foi realizado de acordo com o método
descrito por Liang, Park e Guan (2007). As células AGS (2 x 105 células/poço) foram
cultivadas em placas de 24 poços em meio F12-K com SFB 10% e mantidas nas
condições de cultivo descritas anteriormente. Quando a monocamada celular atingiu
a confluência de 90%, as células foram cultivadas em meio carente de fatores de
crescimento, suplementado apenas com SFB a 0,5%, o que permite a sincronização
das células em fase G0 do ciclo celular. Após 24 horas, foi feita uma fenda ou risco
(mimetizando uma ferida in vitro - Schatch) o mais retilíneo possível no meio do
poço, na monocamada celular, com o auxílio de uma ponteira amarela (200 µL)
apoiada em uma pipeta de vidro de 2 mL. Em seguida, os poços foram lavados duas
71
vezes com meio F12-K para eliminar os restos celulares formados durante a
produção da fenda. Após as lavagens, foram adicionados os tratamentos que
consistiam em controle negativo (SFB 0,5%), controle positivo (SFB 10%) ou (-)-
mirtenol (0,1; 1; 10 e 100 nM). O fechamento da fenda foi visualizado por fotos
obtidas em microscópio invertido com câmera acoplada, com aumento de 40x, nos
tempos de 0, 6 e 24 horas logo após o tratamento das células. As fotos foram
analisadas pelo software TScratch e os resultados foram expressos como
porcentagem de fechamento da fenda.
Para verificar a participação da migração independente da proliferação na
atividade cicatrizante, os ensaios de migração in vitro foram realizados utilizando um
inibidor de proliferação, a hidroxiureia (5 mM). Este é um agente antineoplásico que
atua bloqueando a síntese de DNA celular devido a sua capacidade de inibir a
ribonucleotídeo redutase, fazendo com que a célula permaneça antes da fase S ou
na fase S do ciclo celular e não prolifere (DAVIES; GILMOR, 2003). O experimento
foi realizado como descrito no parágrafo anterior, com algumas modificações: as
células não foram cultivadas em meio carente de fatores de crescimento, SFB 0,5%,
e a hidroxiureia (5 mM) foi adicionada juntamente com os tratamentos. Todos os
testes foram realizados em quadruplicatas.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores obtidos nos ensaios experimentais foram expressos como
média ± E.P.M. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) de um
via ou duas vias, seguida dos testes de Tukey ou Bonferroni. Os resultados obtidos
da quantificação da PCR em tempo real foram avaliados se seguiam ou não uma
distribuição normal, pelo teste de Kolmogorov–Smirnov. A diferença entre as médias
da distribuição normal (dados paramétricos) foram analisados pelo teste t de
Student. Valores de p menor que 0,05 foram considerados estatisticamente
significativos. O programa utilizado na análise estatística foi o GraphPad Prism®
5.03.
72
5 RESULTADOS
5.1 TOXICIDADE AGUDA DO (-)-MIRTENOL
A administração oral aguda do (-)-mirtenol na dose de 2000 mg/kg não
produziu alterações no peso dos camundongos, nem no consumo de ração e água
durante as primeiras 8 horas ou nos 14 dias seguintes à sua administração (ANEXO
III). Nenhuma morte foi observada e após os 14 dias a autópsia não mostrou
alterações significativas ou lesões nos órgãos internos. Esses dados certificam a
seguridade das doses utilizadas para estudar o efeito farmacológico do (-)-mirtenol.
5.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO GASTROPROTETOR DO (-)-MIRTENOL
5.2.1 Efeito do (-)-mirtenol sobre lesões gástricas induzidas por etanol
Os camundongos do grupo veículo que receberam apenas etanol
absoluto apresentaram lesões gástricas hemorrágicas com uma área total de 38,8 ±
5,1 mm2. Enquanto os animais pré-tratados com (-)-mirtenol (25, 50 e 100 mg/kg,
v.o.) demonstraram uma redução significativa da área de lesões gástricas para 23,2
± 4,5; 6,6 ± 1,0 e 6,5 ± 1,8 mm2, respectivamente, reduzindo em 40; 83 e 83% a área
de lesão respectivamente, quando comparados ao grupo veículo (38,8 ± 5,1 mm2).
Assim como, os animais que receberam a droga padrão, NAC (200 mg/kg, v.o.)
também apresentaram significante redução da área de lesão gástrica (8,1 ±3,5
mm2), em 79% quando comparados com os animais do grupo veículo (38,8 ± 5,1
mm2) (Figura 7).
73
Figura 7. Efeito do (-)-mirtenol e da N-acetilcisteína sobre lesões gástricas induzidas
por etanol absoluto em camundongos
0
10
20
30
40
50
****** ***
*
Veículo
(-)-Mirtenol 25 mg/kg
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
(-)-Mirtenol 100 mg/kg
NAC 200 mg/kg
Área
de l
esã
o (
mm
2)
Os resultados são apresentados como média ± E.P.M. (n=6 animais/ grupo). NAC, N-acetilcisteína.
*p<0,05, ***p<0,001 comparados com o veículo (controle negativo) (ANOVA “one way”, seguida do
pós-teste de Tukey).
5.2.2 Efeito do (-)-mirtenol sobre as alterações histológicas induzidas por
etanol absoluto
As alterações histológicas nos espécimes de estômagos dos diferentes
grupos experimentais são apresentadas na Figura 8. Os estômagos dos
camundongos do grupo Sham, que não receberam tratamento e nem etanol,
apresentaram mucosa e submucosa com aspectos normais. Enquanto os animais do
grupo veículo, que receberam apenas etanol absoluto, apresentaram danos
gástricos graves: erosões, hemorragia na camada da mucosa, edema e infiltrado de
células inflamatórias. Ao passo que, os animais que receberam (-)-mirtenol (50
mg/kg, v.o.) tiveram a mucosa gástrica protegida apresentando leve edema
submucoso, ausência de erosão, hemorragia e infiltrado de células inflamatórias nas
regiões da mucosa e submucosa. A análise histológica do grupo pré-tratado com
NAC não apresentou sinais de alterações. Os resultados foram apresentados
também na forma de escore de alterações: (+++) indica alterações severas, (++)
moderadas, (+) média e (-) ausente (Tabela 4). Os experimentos que avaliaram os
mecanismos envolvidos na atividade gastroprotetora do (-)-mirtenol, foram
realizados com (-)-mirtenol na dose de 50 mg/kg a melhor dose (menor dose com
melhor efeito farmacológico) nos experimentos de triagem.
74
Figura 8. Efeito do (-)-mirtenol e da N-acetilcisteína sobre as alterações histológicas
do tecido gástrico, induzidas por etanol absoluto em camundongos
Fonte: Elaborada pelo autor.
Fotomicrografias representativas do estômago dos animas do grupo Sham (a), do grupo veículo (b),
do grupo tratado com (-)-mirtenol (50 mg/kg) (c) e NAC (200 mg/kg) (d). Coloração com hematoxilina
e eosina e aumento de 10x. Mucosa (mu), submucosa (sm), edema (e), hemorragia (h), erosão (er) e
infiltrado de células inflamatórias (ic).
75
Tabela 4. Efeito do (-)-mirtenol e da N-acetilcisteína (NAC), sobre as alterações
histológicas das lesões gástricas induzidas por etanol, em camundongos
Grupos Erosão na área da mucosa
Hemorragia na área da
mucosa
Edema na submucosa
Infiltrado de células
inflamatórias na submucosa
Sham - - - -
Veículo +++ ++ ++ +
(-)-Mirtenol (50 mg/kg)
- - + -
NAC (200 mg/kg)
- - - -
Fonte: Elaborada pelo autor.
(+++) alterações severas, (++) alterações moderadas, (+) alterações médias, (-) sem alterações, (n=3
lâminas por grupo).
5.2.3 Efeito do (-)-mirtenol sobre o conteúdo de muco gástrico
Os camundongos do grupo veículo apresentaram redução significativa do
conteúdo de muco na mucosa gástrica (504,4 ± 32,0 µg de Azul de Alcian/g de
tecido), quando comparados ao grupo Sham (895,1 ± 38,9 µg de Azul de Alcian/g de
tecido). Ao passo que, os animais tratados com (-)-mirtenol (50 mg/kg,v.o.) ou NAC
(200 mg/kg, v.o.) apresentaram significativo aumento no conteúdo de muco gástrico
(742,9 ± 27,1 e 866,4 ± 54,9 µg Azul de Alcian/g de tecido, respectivamente),
quando comparados com o grupo veículo (504,4 ± 32,0 µg de Azul de Alcian/g de
tecido) (Figura 9).
76
Figura 9. Efeito do (-)-mirtenol e da N-acetilcisteína sobre o conteúdo de muco na
mucosa gástrica de camundongos submetidos ao protocolo de lesões gástricas
induzidas por etanol
0
200
400
600
800
1000Sham
Veículo
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
NAC 200 mg/kg
b
b
a
Azu
l d
e A
lcia
n (
g/
g d
e t
ecid
o)
Os resultados são apresentados como média ± E.P.M. (n=6 animais/ grupo). NAC, N-acetilcisteína, ap<0,05 comparado com o Sham,
bp<0,05 comparado com o veículo (ANOVA “one way”, seguida do
pós-teste de Tukey).
5.2.4 Efeito do (-)-mirtenol sobre lesões gástricas induzidas por indometacina
Os camundongos do grupo veículo, que receberam apenas indometacina
(30 mg/kg, s.c.), apresentaram área de lesão gástrica de 25,5 ± 7,8 mm2. Ademais,
os animais tratados com (-)-mirtenol (50 e 100 mg/kg, v.o.) apresentaram redução da
área de lesão para 2,7 ± 0,7 e 3,3 ± 0,5 mm2, respectivamente, o que corresponde
em 89 e 87%, de redução, quando comparados com os animais do grupo veículo
(25,5 ± 7,8 mm2). Assim como, os animais tratados com misoprostol (50 µg/kg, v.o.)
também apresentaram significante redução da área de lesão em 80% (5,1 ± 0,6
mm2), quando comparados com os animais do grupo veículo (25,5 ± 7,8 mm2).
Contudo, o (-)-mirtenol na dose de 25 mg/kg, v.o., não promoveu redução
significativa da área de lesão gástrica (Figura 10).
77
Figura 10. Efeito do (-)-mirtenol e do misoprostol sobre lesões gástricas induzidas
por indometacina em camundongos
0
10
20
30
40Veículo
(-)-Mirtenol 25 mg/kg
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
(-)-Mirtenol 100 mg/kg
Misoprostol 50 g/kg
*** *****Á
rea d
e lesão
(m
m2)
Os resultados são apresentados como média ± E.P.M. p (n=5-6 animais/ grupo). **p<0,01, ***p<0,001
comparados com o veículo (ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de Tukey).
5.2.5 Efeito do (-)-mirtenol sobre lesões gástricas induzidas por estresse de
retenção e frio
Os ratos do grupo veículo apresentaram área de lesão gástrica de 13,9 ±
1,0 mm2 induzidas por estresse de retenção e frio. O tratamento com (-)-mirtenol (50
e 100 mg/kg, v.o.) reduziu estatisticamente a área de lesões gástricas em 79 e 73%,
respectivamente (2,9 ± 0,4 e 2,7 ± 0,9 mm2, respectivamente), quando comparados
ao grupo veículo (13,9 ± 1,0 mm2). Do mesmo modo, os animais tratados com
cimetidina (100 mg/kg, v.o.) também apresentaram redução da área de lesões
gástricas em 84% (2,0 ± 0,8 mm2), quando comparados ao grupo veículo. Isso não
foi observado nos animais que receberam o (-)-mirtenol na dose de 25 mg/kg v.o.,
pois não apresentaram significativa redução da área de lesão gástrica (Figura 11).
78
Figura 11. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre lesões gástricas induzidas por
estresse de retenção e frio em ratos
0
5
10
15
20
*** *** ***
Veículo
(-)-Mirtenol 25 mg/kg
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
(-)-Mirtenol 100 mg/kg
Cimetidina 100 mg/kg
Áre
a d
e lesão
(m
m2)
Resultados expressos como média ± E.P.M., ***p<0,001 comparados com o veículo (ANOVA “one
way”, seguida do pós-teste de Tukey).
5.2.6 Efeito do (-)-mirtenol sobre os marcadores do estresse oxidativo e da
inflamação
5.2.6.1 Estimativa da atividade enzimática da catalase
A atividade da enzima catalase nos animais do grupo veículo que
receberam apenas etanol (42,0 ± 11,1 mmol/min/100 mg de tecido) foi reduzida em
92% comparado com os valores observados em camundongos do grupo Sham
(513,3 ± 67,8 mmol/min/100 mg de tecido). Contudo, a atividade enzimática da
catalase foi significativamente maior em animais tratados com (-)-mirtenol (50 mg/kg,
v.o.) para 291,3 ± 64,0 mmol/min/100 mg de tecido ou NAC (200 mg/kg, v.o.) para
524,5 ± 69,2 mmol/min/100 mg de tecido, quando comparados com o grupo veículo
(42,0 ± 11,1 mmol/min/100 mg de tecido) (Tabela 5).
5.2.6.2 Estimativa da atividade da superóxido dismutase (SOD)
A atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD) nos animais do
grupo veículo foi reduzida em 67%, (0,4 ± 0,0 U/mg de proteína) quando comparado
com o grupo Sham (1,2 ± 0,1 U/mg de proteína). Entretanto, o tratamento com (-)-
mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou NAC (200 mg/kg, v.o.) estimulou a atividade enzimática
79
de SOD (2,0 ± 0,2 e 2,2 ± 0,3 U/mg de proteína, respectivamente), quando
comparados com o grupo veículo (0,4 ± 0,0 U/mg de proteína) (Tabela 5).
5.2.6.3 Estimativa da atividade da glutationa peroxidase (GPx)
A atividade enzimática da glutationa peroxidase nos animais do grupo
veículo foi reduzida em 51% (24,5 ± 3,2 µmol/min/mg de proteína), quando
comparado com o grupo Sham (50,3 ± 5,7 µmol/min/mg de proteína). Em
contrapartida a atividade da Gpx foi estatisticamente maior em animais tratados com
(-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) para 50,8 ± 5,3 µmol/min/mg de proteína ou com NAC
(200 mg/kg) para 50,0 ± 5,2 µmol/min/mg de proteína, quando comparados com o
grupo veículo (24,5 ± 3,2 µmol/min/mg de proteína) (Tabela 5).
5.2.6.4 Níveis dos grupamentos sulfidrilas não proteicos (NP-SH)
Os animais do grupo veículo apresentaram níveis de grupamentos
sulfidrilas não proteicos reduzidos em 32% (231,8 ± 28,8 µmol/mg de tecido) quando
comparado com o grupo Sham (340,9 ± 14,5 µmol/mg de tecido). Todavia, os níveis
de NP-SH foram significativamente aumentados em animais tratados com (-)-
mirtenol (50 mg/kg, v.o.) para 348,4 ± 8,0 µmol/mg de tecido ou com NAC (200
mg/kg, v.o.) para 561,1± 20,0 µmol/mg de tecido, quando comparados com o grupo
veículo (231,8 ± 28,8 µmol/mg de tecido) (Tabela 5).
5.2.6.5 Níveis de malondialdeído (MDA)
Os animais do grupo veículo apresentaram níveis de malondialdeído
aproximadamente 2 vezes maiores (61,3 ± 7,6 nmol/mg de tecido), quando
comparado com o grupo Sham (36,3 ± 3,2 nmol/mg de tecido). Contrário a isso,
animais tratados com (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou NAC (200 mg/kg, v.o.)
apresentaram significativa redução dos níveis de MDA no tecido gástrico, induzidos
pelo etanol, para 34,9 ± 2,3 e 43,2 ± 1,7 nmol/mg de tecido, respectivamente,
quando comparados ao grupo veículo (61,3 ± 7,6 nmol/mg de tecido) (Tabela 5).
5.2.6.6 Atividade da mieloperoxidase (MPO)
80
A atividade enzimática da mieloperoxidase nos animais do grupo veículo
foi aumentada em 4,8 vezes (20,1 ± 3,1 U/mg de tecido), quando comparado ao
grupo Sham (3,4 ± 1,4 U/mg de tecido). Enquanto os animais tratados com (-)-
mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou NAC (200 mg/kg, v.o.) apresentaram redução da
atividade de MPO (10,2 ± 1,8 e 7,2 ± 1,2 U/mg de tecido, respectivamente), quando
comparados com o grupo veículo (20,1 ± 3,1 U/mg de tecido) (Tabela 5).
5.2.6.7 Níveis de nitrato/nitrito
Na avaliação dos níveis de nitrato/nitrito no tecido gástrico, foi observado
que nos animais do grupo veículo a administração do etanol reduziu os níveis de
nitrato/nitrito em 52% (3,1 ± 0,3 µmol/mg de proteína), quando comparado ao grupo
Sham (6,5 ± 0,6 µmol/mg de proteína). Contrapondo a isso, o tratamento com (-)-
mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou NAC (200 mg/kg, v.o.) aumentou os níveis de
nitrato/nitrito para 5,4 ± 0,4 e 6,4 ± 0,6 µmol/mg de proteína, respectivamente, no
tecido gástrico dos animais, comparados ao grupo veículo (3,1 ± 0,3 µmol/mg de
proteína) (Tabela 5).
81
Tabela 5. Efeito do (-)-mirtenol e da N-acetilcisteína sobre os marcadores do estresse oxidativo e da inflamação
Grupos Sham Veículo (-)-Mirtenol
(50 mg/kg, v.o.)
NAC
(200 mg/kg, v.o.)
CAT (mmol/min/mg tecido) 513,3 ± 67,8 42,0 ± 11,1a 291,3 ± 64,6b 524,5 ± 69,2b
SOD (U/mg de proteína) 1,2 ± 0,1 0,4 ± 0,0a 2,0 ± 0,2b 2,2 ± 0,3b
GPx (µmol/min/mg de proteína) 50,3 ± 5,7 24,5 ± 3,2a 50,8 ± 5,3b 50,0 ± 5,2b
NP-SHs (µmol/mg de tecido) 340,9 ± 14,5 231,8 ± 28,8a 348,4 ± 8,0b 561,1 ± 20,0b
MDA (nmol/mg de tecido) 36,3 ± 3,2 61,3 ± 7,6a 34,9 ± 2,3b 43,2 ± 1,7b
MPO (U/mg de tecido) 3,4 ± 1,4 20,1 ± 3,1a 10,2 ± 1,8b 7,2 ± 1,2b
Nitrato/nitrito (µmol/mg de proteína) 6,5 ± 0,6 3,1 ± 0,3a 5,4 ± 0,4b 6,4 ± 0,6b
Fonte: Elaborada pelo autor.
CAT (catalase); GPx (glutationa peroxidase); MDA (malondialdeido); MPO, (mieloperoxidase); NP-SHs (grupamentos sulfidrilas não proteicos); SOD
(superóxido dismutase). Resultados expressos como média ± E.P.M., ap<0,05 comparado com o grupo Sham,
bp<0,05 comparado com grupo veículo (n=6
animais/grupo). ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de Tukey.
82
5.2.7 O envolvimento das Prostaglandinas, do Óxido Nítrico (NO), dos Canais
de Potássio Sensíveis ao ATP (KATP) e dos receptores GABA-A no efeito
gastroprotetor do (-)-mirtenol
Os camundongos do grupo veículo apresentaram área de lesões
gástricas induzidas por etanol absoluto de 48,8 ± 11,8 mm2, que foi reduzida para
12,2 ± 2,0 e 4,6 ± 0,1 mm2 quando os camundongos foram tratados com (-)-mirtenol
(50 mg/kg, v.o.) ou misoprostol (50 µg/kg, v.o.), respectivamente. O efeito
gastroprotetor promovido pelo (-)-mirtenol, assim como pelo misoprostol foi
significativamente inibido quando os camundongos foram pré-tratados com
indometacina (42,5 ± 3,8 e 42,1 ± 8,8 mm2, respectivamente) (Figura 12).
Figura 12. Efeito do (-)-mirtenol e do misoprostol sobre lesões gástricas induzidas
por etanol em camundongos pré-tratados com indometacina
0
20
40
60
80Veículo
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
Misoprostol 50 g/kg
a
a
Indometacina(10 mg/kg)
Etanol Absoluto
bb
Áre
a d
e le
sã
o (
mm
2)
Os resultados são apresentados como média ± E.P.M. p (n=5-6 animais/ grupo). a
p<0,05
comparados com o veículo e bp<0,05 comparado com o respectivo grupo (-)-mirtenol ou misoprostol
(ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de Tukey).
Os animais do grupo veículo apresentaram área de lesões gástricas
induzida por etanol absoluto de 40,9 ± 5,4 mm2, que foi reduzida para 6,9 ± 1,8 e 7,6
± 1,7 mm2, quando os animais foram tratados com (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou L-
arginina (600 mg/kg, i.p.) respectivamente. O efeito gastroprotetor promovido pelo (-
83
)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.), assim como pela L-arginina (600 mg/kg, i.p.), foi
significativamente inibido quando os camundongos foram pré-tratados com L-NAME
(20 mg/kg, i.p.), (47,4 ± 9,1 e 42,8 ± 9,1 mm2 , respectivamente) (Figura 13).
Figura 13. Efeito do (-)-mirtenol e da L-arginina sobre lesões gástricas induzidas por
etanol absoluto em camundongos pré-tratados com o L-NAME
0
20
40
60Veículo
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
L-arginina 600 mg/kg
a a
bb
L-NAME (20 mg/kg)
Etanol Absoluto
Áre
a d
e lesão
(m
m2)
Resultados expressos como média ± E.P.M., ap<0,05 comparados com o veículo,
bp<0,05 comparado
com (-)-mirtenol ou L-arginina (n=6 animais/grupo). (ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de
Tukey).
Os camundongos do grupo veículo apresentaram área de lesão gástrica
induzida por etanol de 42,7 ± 9,8 mm2. Quando os animais foram tratados com (-)-
mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou diazóxido (3 mg/kg, i.p.), á área de lesão foi reduzida
para 10,2 ± 3,3 e 9,9 ± 4,1 mm2, respectivamente, comparados ao grupo veículo
(42,7 ± 9,8 mm2). O efeito gastoprotetor promovido pelo (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.),
não foi inibido (8,6 ± 1,4 mm2) quando os animais foram pré-tratados com
glibenclamida (3 mg/kg, i.p.). Contrário a isso, o efeito gastroprotor apresentado pelo
diazóxido (3 mg/kg, i.p.), foi inibido (37,4 ± 4,3 mm2) quando os animais foram pré-
tratados com glibenclamida (3 mg/kg, i.p.) (Figura 14).
84
Figura 14. Efeito do (-)-mirtenol e do diazóxido sobre lesões gástricas induzidas por
etanol absoluto em camundongos pré-tratados com glibenclamida
0
20
40
60 Veículo
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
Diazóxido 3 mg/kg
a a
b
Glibenclamida (3 mg/kg)
Etanol Absoluto
Áre
a d
e le
sã
o (
mm
2)
Resultados expressos como média ± E.P.M., ap<0,05 comparados com o veículo,
bp<0,05 comparado
com diazóxido (n=6 animais/grupo). (ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de Tukey).
Os camundongos do grupo veículo, que receberam apenas etanol,
apresentaram área de lesão gástrica de 47,7 ± 3,9 mm2. Nos animais tratados com (-
)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou muscimol (0,1 mg/kg, i.p.) a área de lesão gástrica foi
reduzida para 6,8 ± 1,7 e 4,8 ± 0,7 mm2, respectivamente, quando comparados ao
grupo veículo (47,7 ± 3,9 mm2 ). O efeito gastroprotetor apresentado pelo (-)-
mirtenol, assim como pelo muscimol foi estatisticamente inibido quando os
camundongos foram pré-tratados com o flumazenil (20 mg/kg, i.p.) (21,6 ± 2,9 e 28,7
± 4,3 mm2, respectivamente) (Figura 15).
85
Figura 15. Efeito do (-)-mirtenol e do muscimol sobre lesões gástricas induzidas por
etanol absoluto em camundongos pré-tratados com flumazenil
0
20
40
60
a
b
a
b
Flumazenil (20 mg/kg)
Etanol Absoluto
Veículo
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
Muscimol 0,1 mg/kg
Áre
a d
e le
sã
o (
mm
2)
Resultados expressos como média ± E.P.M., ap<0,05 comparados com o veículo,
bp<0,05 comparado
com (-)-mirtenol e muscimol (n=6 animais/grupo). (ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de
Tukey).
5.3 AVALIAÇÃO DO EFEITO CICATRIZANTE GÁSTRICO DO (-)-MIRTENOL
5.3.1 Efeito do (-)-mirtenol sobre lesão gástrica induzida por ácido acético
Os ratos do grupo veículo, com lesão gástrica induzida por ácido acético
80%, apresentaram área de lesão gástrica de 67,6 ± 11,0 mm2, que foi reduzida
quando os animais foram tratados com o (-)-mirtenol (50 e 100 mg/kg, v.o.) ou
cimetidina (100 mg/kg, v.o.) para 30,6 ± 3,6; 26,2 ± 5,0 e 16,8 ± 4,1 mm2
respectivamente. Junto a isso, foi observado também em animais tratados com (-)-
mirtenol (50 e 100 mg/kg, v.o.) ou cimetidina (100 mg/kg, v.o.) um aumento
significativo da taxa de cicatrização da lesão em 47, 32 e 67% respectivamente,
quando comparados ao grupo veículo, após sete dias de tratamento (Tabela 6 e
Figura 16).
86
Tabela 6. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina, sobre lesão gástrica induzida por
ácido acético 80%, em ratos, depois de sete dias de tratamento
Grupos Dose (mg/kg, v.o.)
Área da lesão (mm2)
Volume da lesão (mm3)
Taxa de cicatrização (%)
Sham - 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Veículo - 67,6 ± 11,0a 499,6 ± 147,9a -
(-)-Mirtenol 25 43,3 ± 11,7 251,4 ± 116,5 27,8 ± 9,8
50 30,6 ± 3,6 b 175,3 ± 31,8 b 47,1 ± 10,2 b
100 26,2 ± 5,0 b 76,4 ± 11,5 b 31,7 ± 6,7 b
Cimetidina 100 16,8 ± 4,1 b 25,66 ± 8,5 b 66,8 ± 5,3 b Fonte: Elaborada pelo autor.
Dados são expressos como média ± E.P.M. a
p< 0,05 comparado com o grupo Sham. b
p<0,05
comparado com o grupo veículo. N=7 animais/grupo (ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de
Tukey).
Figura 16. Fotografias de estômagos de ratos submetidos ao modelo de lesão
gástrica induzida por ácido acético 80%
Fonte: Elaborada pelo autor.
Nota: Visualização macroscópica representativa dos estômagos de ratos submetidos ao protocolo de
lesão induzida por ácido acético 80%, depois de sete dias de tratamento e do estômago de animais
do grupo Sham que não receberam ácido acético e nem tratamento.
87
5.3.2 Efeito do (-)-mirtenol sobre peso dos órgãos, parâmetros bioquímicos e
peso dos animais no protocolo de lesão gástrica induzida por ácido acético
80%
A administração por via oral do (-)-mirtenol (25, 50 e 100 mg/kg) ou
cimetidina (100 mg/kg) durante sete dias nos animais submetidos ao modelo de
lesão induzida por ácido acético 80%, não promoveu alterações significativas no
ganho de massa corporal desses animais quando comparados com o grupo veículo
(Figura 17), também não foram encontradas diferenças estatísticas no peso absoluto
dos órgãos (Tabela 7). Os parâmetros bioquímicos séricos avaliados não
apresentaram variações significativas nos grupos tratados, quando comparados com
o grupo veículo (Tabela 8).
Figura 17. Ganho de massa corporal dos ratos tratados com (-)-mirtenol e cimetidina
em protocolo de lesão gástrica induzida por ácido acético 80%
1 3 5 70
3
6
9
12Sham
Veículo
(-)-Mirtenol 25 mg/kg
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
(-)-Mirtenol100 mg/kg
Cimetidina 100 mg/kg
Dias
Gan
ho
de m
assa c
orp
ora
l (g
)
Os valores são expressos como média ± E.P.M (n=7 animais/grupo). ANOVA “two way” pós-teste de
Bonferroni.
88
Tabela 7. Peso dos órgãos de ratos tratados com (-)-mirtenol e cimetidina, em protocolo de lesão gástrica induzida por ácido
acético 80%
Órgãos (g) Sham Veículo (-)-Mirtenol
(25 mg/kg)
(-)-Mirtenol
(50 mg/kg)
(-)-Mirtenol
(100 mg/kg)
Cimetidina
(100 mg/kg)
Pulmão 1,3 ± 0,1 2,4 ± 0,2 1,1 ± 0,0 1,4 ± 0,1 1,1 ± 0,1 1,3 ± 0,0
Coração 0,7 ± 0,0 0,8 ± 0,0 0,6 ± 0,0 0,6 ± 0,0 0,6 ±0,0 0,7 ±0,0
Baço 0,9 ±0,0 0,7 ± 0,0 0,8 ± 0,0 0,9 ± 0,0 0,7± 0,0 0,8 ± 0,0
Fígado 6,7 ± 0,3 8,1 ± 3,6 5,8 ± 0,2 7,1 ± 0,3 6,1 ±0,2 7,6 ± 0,3
Rins 1,3 ± 0,2 2,0 ± 0,2 1,1 ± 0,2 1,4 ± 0,1 1,3 ± 0,0 1,4 ± 0,0
Fonte: Elaborada pelo autor. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (n=7 animais/grupo). ANOVA “two way” pós-teste de Bonferroni.
Tabela 8. Parâmetros bioquímicos séricos dos ratos tratados com (-)-mirtenol e cimetidina, em protocolo de lesão gástrica induzida
por ácido acético 80%
Parâmetros Bioquímicos Sham Veículo (-)-Mirtenol
(25 mg/kg)
(-)-Mirtenol
(50 mg/kg)
(-)-Mirtenol
(100 mg/kg)
Cimetidina
(100 mg/kg)
Creatinina (mg/dL) 0,3 ± 0,0 0,3 ± 0,0 0,3 ± 0,0 0,3 ± 0,0 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,02
ALT (U/L) 25,0 ± 1,7 31,3 ± 4,7 28 ± 2,6 28,3 ± 0,5 16,8 ± 5,2 15 ± 5,1
Ureia (mg/DL) 29,8 ± 2,2 39 ± 2,6 36,3 ± 1,0 34 ± 3,3 36,5 ± 3,5 29,5 ± 4,2
Albumina (mg/DL) 3,2 ± 0,2 2,7 ± 0,4 3,2 ± 0,2 3,2 ± 0,1 2,2 ± 0,7 1,7 ± 0,06
Colesterol Total (mg/DL) 45,8 ± 3,4 54,8 ± 8,2 42,0 ± 5,1 47 ± 2,9 30 ± 10,3 23 ± 8,5
Fonte: Elaborada pelo autor. Os valores são expressos como média ± E.P.M. (n=7 animais/grupo). ANOVA “two way” pós-teste de Bonferroni.
89
5.3.3 Efeito do (-)-mirtenol nas alterações histológicas induzidas por ácido
acético
A análise histotógica da lesão gástrica induzida por ácido acético nos
animais do grupo veículo apresentou reparo mínimo, com exsudatos inflamatórios
elevados e tecidos de granulação imaturos. Os animais tratados com (-)-mirtenol (50
e 100 mg/kg, v.o.) apresentaram uma redução significativa no tamanho da área
ulcerada, com a base da lesão coberta por tecido epitelial de restauração, poucas
células inflamatórias e glândulas secretoras foram organizadas. Os animais tratados
com cimetidina (100 mg/kg, v.o.) apresentaram remodelamento completo da
cobertura epitelial com evidente reconstrução de estruturas glandulares, com
infiltrado moderado de células polimorfonucleares e mononucleares (Figura 18). Os
experimentos que avaliaram os mecanismos envolvidos na atividade cicatrizante
foram realizados com (-)-mirtenol na dose de 50 mg/kg, melhor dose (menor dose
com melhor efeito farmacológico), no protocolo de lesão gástrica induzida por ácido
acético.
90
Figura 18. Fotomicrografias dos cortes histológicos do tecido gástrico de ratos com e sem alterações induzidas por ácido acético
80%
Fonte: Elaborada pelo autor
Ratos do grupo Sham (A), Veículo, (B), (-)-Mirtenol 25 mg/kg, v.o. (C), 50 mg/kg, v.o. (D) e 100 mg/kg, v.o. (E) ou Cimetidina 100 mg/kg ,v.o. (F); após 7 dias
de tratamento, aumento de 10x e 20x.
91
5.3.4 Efeito do (-)-mirtenol sobre a atividade da enzima N-acetilglicosaminidase
(NAG)
Os ratos do grupo veículo, com lesão gástrica induzida por ácido acético,
apresentaram atividade de NAG aumentada em 81% (163,0 ± 15,9 nmol de NAG/µg
de proteína), quando comparado ao grupo Sham (77,2 ± 4,1 nmol de NAG/µg de
proteína). Enquanto os ratos tratados com (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) apresentaram
significativa redução de 28% da atividade de NAG (116,4 ± 7,3 nmol de NAG/µg de
proteína) quando comparado com o grupo veículo (163,0 ± 15,9 nmol de NAG/µg de
proteína).
Figura 19. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre a atividade da N-
acetilglicosaminidase em lesão gástrica induzida por ácido acético 80%, em ratos
0
50
100
150
200Sham
Veículo
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
Cimetidina 100 mg/kg
a
b
NA
G(n
mo
l/
g d
e p
rote
ína)
Resultados expressos como média ± E.P.M., ap<0,05 comparado com o Sham,
bp<0,05 comparado
com o veículo (n=5 animais/grupo). (ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de Tukey).
5.3.5 Efeito do (-)-mirtenol sobre o conteúdo de muco gástrico
O conteúdo de muco gástrico corado com ácido periódico de Shiff em
lesão gástrica induzida por ácido acético, nos animais do grupo veículo foi 8,1 ±
1,0% de área marcada. Ao passo que, os animais tratados com (-)-mirtenol (50
mg/kg, v.o.) ou cimetidina (100 mg/kg, v.o.) durante sete dias, apresentaram
aumento do conteúdo de muco referente a 37,0 ± 4,1 e 36,5 ± 5,2% de área
marcada, respectivamente, quando comparados com o grupo veículo (8,1 ± 1,0% de
área marcada) (Figura 20 e 21).
92
Figura 20. Fotomicrografias dos cortes histológicos de lesão gástrica induzida por
ácido acético 80% em ratos, corados com ácido periódico de Shiff
Fonte: Elaborada pelo autor.
A- Animais que receberam veículo (1% Tween 80 em salina 1mL/100 g de animal). B- Animais
tratados com (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.). C- Animais tratados com cimetidina (100 mg/kg, v.o.).
Aumento de 20x.
93
Figura 21. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre o conteúdo de muco na lesão
gástrica induzida por ácido acético 80% em ratos
Resultados expressos como média ± E.P.M., **p<0,01 comparados com o veículo, (n=3
lâminas/grupo). (ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de Tukey).
5.3.6 Efeito do (-)-mirtenol sobre a marcação imunohistoquímica do antígeno
nuclear de proliferação celular (PCNA)
Os animais do grupo veículo, com lesão gástrica induzida por ácido
acético apresentaram 2,7 ± 0,8% de células imunomarcadas, referentes à marcação
para PCNA. O tratamento com (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) intensificou a marcação
para o PCNA nos ensaios imunohistoquímicos, pois os animais tratados com (-)-
mirtenol (50 mg/kg, v.o.) apresentaram aumento do número de células
imunomarcadas (14,1 ± 1,0%) quando comparados com o grupo veículo (2,7 ±
0,8%). De maneira semelhante, os animais tratados com cimetidina também
apresentaram aumento do número de células imunomarcadas para PCNA (6,3 ±
1,0%) quando comparados ao grupo veículo (2,7 ± 0,8%). O tratamento com (-)-
mirtenol ainda aumentou estatisticamente a marcação para PCNA (14,1 ± 1,0%)
quando comparado com o grupo cimetidina (6,3 ± 1,0%), fármaco utilizado no
tratamento da úlcera gástrica (Figura 22 e 23).
0
10
20
30
40
50Veículo
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
Cimetidina 100 mg/kg
** **
Mu
co
gástr
ico
% Á
rea m
arc
ad
a
94
Figura 22. Fotomicrografias da imunomarcação para PCNA (antígeno nuclear de
proliferação celular) em lesão gástrica induzida por ácido acético, em ratos
Fonte: Elaborada pelo autor
A - Grupo veículo (Tween 80 1% em salina 1mL/100 g de animal). B - Animais tratados com (-)-
Mirtenol (50 mg/kg, v.o.). C - Animais tratados com cimetidina (100 mg/kg, v.o.), durante sete dias.
Aumento de 40x.
95
Figura 23. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre a imunomarcação do antígeno
nuclear de proliferação celular (PCNA) em lesão gástrica induzida por ácido acético
80%, em ratos
0
5
10
15
20
***
*
Veículo
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
Cimetidina 100 mg/kg
##
% C
élu
las im
un
om
arc
ad
as
Resultados expressos como média ± E.P.M., ***p<0,001, *p<0,05 comparados com o veículo,
##p<0,01 (-)-mirtenol versus cimetidina (n=3 lâminas/grupo) (ANOVA “one way”, seguido do pós-teste
de Tukey).
5.3.7 Efeito do (-)-mirtenol na expressão relativa do gene de TNF-α, IL-1β e
COX-2 por PCR em tempo real
A análise da curva de dissociação mostrou um único pico indicando
amplificação específica para o gene de TNF-α, IL-1β e COX-2 e a razão da
absorbância obtida em 260/280 nm ficou entre 1,8 e 2,0. Nos animais do grupo
veículo, com lesão gástrica induzida por ácido acético, a expressão relativa do gene
de TNF-α e IL-1β foi 2,5 e 2,0 vezes maior, respectivamente, que a expressão
relativa dos genes (TNF-α e IL-1β) no grupo Sham, normalizado para 1. Enquanto
nos animais tratados com (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou cimetidina (100 mg/kg,v.o.),
a expressão relativa do gene de TNF-α, foi 5 e 3,6 vezes menor, respectivamente,
que a expressão do gene de TNF-α no grupo veículo (2,5 ± 0,5). Assim como, a
expressão relativa do gene de IL-1β, nos animais tratados com mirtenol (50 mg/kg,
v.o.) ou cimetidina (100 mg/kg,v.o.) foi 2,0 e 2,5 vezes menor, respectivamente, que
a expressão do gene de IL-1β no grupo veículo (2,0 ± 0,3). Também foi visto que,
nos animais do grupo veículo a expressão relativa do gene de COX-2 foi 1,5 vezes
menor, que a expressão relativa do gene no grupo Sham normalizado para 1. Ao
96
passo que, nos animais tratados com (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) ou cimetidina (100
mg/kg,v.o.), a expressão do gene de COX-2 foi 4 e 3,7 vezes maior,
respectivamente, que a expressão relativa do gene de COX-2 no grupo veículo (0,7
± 0,1) (Figura 24).
Figura 24. Efeito do (-)-mirtenol sobre a expressão relativa do gene de TNF-α (A), IL-
1β (B) e COX-2 (C) na lesão gástrica induzida por ácido acético 80% em ratos
Resultados expressos como média ± E.P.M., ap<0,05 comparado com o Sham,
bp<0,05 comparado
com o veículo (n=5 animais/grupo). (Test t de Student).
97
5.3.8 Efeito do (-)-mirtenol sobre a expressão da atividade das
metaloproteinases de matriz, MMP-2 e 9
O efeito do tratamento com (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) durante sete dias
sobre a expressão da atividade gelatinolítica das MMP-2 e 9, foi observado no
homogenato gástrico de ratos submetidos ao protocolo de lesão gástrica induzida
por ácido acético (Figura 25). Os resultados mostraram que a expressão da
atividade gelatinolítica das MMP-2 e 9 no tecido ulcerado dos animais do grupo
veículo foi 62,9 e 90,9% maior que a expressão de MMP-2 e 9 no grupo Sham (38,4
e 9,1%, respectivamente). Enquanto nos animais tratados com (-)-mirtenol (50
mg/kg, v.o.) a expressão da atividade gelatinolítica das MMP-2 e 9 foi
significativamente menor (54 e 77%, respectivamente) quando comparados com o
grupo veículo (~100%). De maneira semelhante, o tratamento com a cimetidina (100
mg/kg, v.o.) reduziu significativamente a expressão da atividade de MMP-2 e MMP-9
para 59% e 81% respectivamente, quando comparados ao grupo veículo (~100%)
(Figura 26).
Figura 25. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre a expressão da atividade
gelatinolítica das metaloproteinases de matriz 2 e 9 em gel de poliacrilamida com
gelatina
Fonte: Elaborada pelo autor.
98
Figura 26. Atividade gelatinolítica de metaloproteinases 2 (A) e 9 (B) na área
ulcerada do tecido gástrico de ratos tratados com (-)-mirtenol e com cimetidina, em
protocolo de lesão gástrica induzida por ácido acético 80%
Resultados expressos como média ± E.P.M., ap<0,05 comparado com o Sham,
bp<0,05 comparado
com o veículo, (n=5 animais/grupo). (ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de Tukey).
5.3.9 Efeito do (-)-mirtenol sobre a deposição de colágeno
Os ratos do grupo veículo, com lesão gástrica induzida por ácido acético,
apresentaram apenas 10,8 ± 4,5% de fibras de colágeno, na lesão gástrica.
Enquanto, os animais tradados com (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) e cimetidina (100
mg/kg, v.o.), durante sete dias, apresentam considerável aumento das fibras de
colágeno (30,5 ± 4,2 e 29,0 ± 7,8% respectivamente) nas lesões gástricas induzidas
por ácido acético, quando comparados com o grupo veículo (10,8 ± 4,5%) (Figura 27
e 28).
99
Figura 27. Fotomicrografias representativas das fibras de colágeno na lesão gástrica
induzida por ácido acético em ratos
Fonte: Elaborada pelo autor.
Grupo veículo com (A) e sem luz polarizada (B); do grupo tratado com (-)-mirtenol 50 mg/kg, v.o.,
com (C) e sem luz (D) polarizada e do grupo tratado com cimetidina (100 mg/kg, v.o.) com (E) e sem
luz polarizada (F) após 7 dias de tratamento. Aumento de 20x.
100
Figura 28. Efeito do (-)-mirtenol e da cimetidina sobre a deposição de fibras de
colágeno na lesão gástrica induzida por ácido acético 80% em ratos
0
10
20
30
40Veículo
(-)-Mirtenol 50 mg/kg
Cimetidina 100 mg/kg
**
(%)
Fib
ras d
e c
olá
gen
o
Resultados expressos como média ± E.P.M., *p<0,05 comparados com o veículo (n=3
lâminas/grupo). (ANOVA “one way”, seguida do pós-teste de Tukey).
5.4 AVALIAÇÃO DO EFEITO DO (-)-MIRTENOL SOBRE MIGRAÇÃO E
PROLIFERAÇÃO CELULAR in vitro
5.4.1 Efeito do (-)-mirtenol na viabilidade celular em ensaio com MTT
Os resultados evidenciaram que o (-)-mirtenol em todas as concentrações
testadas de 0,01; 0,1; 1; 10; 100; 1000; 10000 e 10000 nM, depois de 48 horas, não
promoveu alterações na viabilidade de células AGS, em ensaio com MTT, quando
comparados com o grupo controle sem tratamento (Figura 29).
101
Figura 29. Efeito do (-)-mirtenol sobre a viabilidade de células AGS em ensaio com
MTT
C 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 1000000
50
100
150
(-)-mirtenol (nM)
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
(%)
Os dados são expressos como média ± E.P.M. e representam a porcentagem de viabilidade celular.
C=controle sem tratamento (ANOVA “one way” pós-teste de Tukey).
5.4.2 Efeito do (-)-mirtenol na proliferação de células AGS em ensaio com BrdU
O (-)-mirtenol nas concentrações de 100 e 1000 nM aumentou
significativamente o índice de proliferação celular (1,1 ± 0,0 e 1,2 ± 0,0,
respectivamente) quando comparados com o controle negativo, SFB 0,5% (1,0 ±
0,0) (Figura 30). Os resultados foram expressos em índice de proliferação, tomando
o controle negativo (SFB 0,5%) como índice normalizado igual a 1.
102
Figura 30. Efeito do (-)-mirtenol sobre proliferação de células AGS em ensaio com
BrdU
0,5% 10% 1 10 100 10000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
(-)-Mirtenol (nM)SFB
***
****
Índ
ide d
e p
rolif
era
ção
Os dados são expressos como média ± E.P.M. e representam o índice de proliferação
celular.**p<0,01; ***p<0,001 comparado com o controle negativo, SFB 0,5% (ANOVA “one way” pós-
teste de Tukey).
5.4.3 Efeito do (-)-mirtenol na migração celular em meio sem hidroxiureia
Na monocamada de células AGS, onde foi produzida a fenda pelo arraste
mecânico das células, o (-)-mirtenol nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100 nM,
estimulou significativamente o fechamento da fenda (31,0 ± 1,0; 31,6 ± 3,5; 32,8 ±
2,6 e 32,3 ± 2,9% respectivamente), assim como o SFB 10% (33,6 ± 3,0%) depois
de 6 horas de exposição, comparados com o controle negativo, SFB 0,5% (19,5 ±
0,9%). O (-)-mirtenol nas mesmas concentrações (0,1; 1; 10 e 100 nM) estimulou
significativamente, depois de 24 horas de incubação com células AGS, o
fechamento da fenda para 58,8 ± 2,2; 54,9 ± 2,7; 53,5 ± 3,8 e 49,7 ± 2,5%,
respectivamente, assim como o SFB 10% (95,1 ± 1,0%) quando comparados com
SFB 0,5% (35,2 ± 2,9%) (Figura 31 e 32).
103
Figura 31. Efeito do (-)-mirtenol sobre a migração de células AGS depois de 6 e 24
horas de exposição, sem hidroxiuréia
6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 240
20
40
60
80
100
SFB 0,5%
SFB 10%
(-)-Mirtenol 0,1 nM
(-)-Mirtenol 1 nM
(-)-Mirtenol 10 nM
(-)-Mirtenol 100 nM
***
***
**
***
**
***
**
***
**
***
Tempo (h)
Fech
am
en
to d
a f
en
da (
%)
Os dados são expressos como média ± E.P.M. e representam a porcentagem de fechamento da
fenda. **p<0,01 e ***p<0,001 comparados com o controle negativo, SFB 0,5% (ANOVA “two way”,
seguido do pós-teste de Bonferroni).
104
Figura 32. Fotomicrografias da fenda em monocamada de células AGS incubadas
com (-)-mirtenol em meio sem hidroxiuréia, com 0, 6 e 24 horas de incubação
Fonte: Elaborada pelo autor.
5.4.4 Migração celular na presença de hidroxiureia
Mesmo na presença de hidroxiureia (5 mM), um inibidor da proliferação
celular, o (-)-mirtenol nas concentrações de 0,1; 1; 10 e 100 nM aumentou o
fechamento da fenda produzida na monocamada de células AGS no tempo de 6
105
horas (44,7 ± 9,1; 54,5 ± 6,9; 51,5 ± 3,5 e 52,7 ± 3,3%, respectivamente), assim
como o SFB 10% (46,0 ± 5,3%) quando comparados com o controle negativo, SFB
0,5% (24,6 ± 3,8%). O (-)-mirtenol nas mesmas concentrações já citadas, também
aumentou o fechamento da fenda (58,3 ± 7,7; 66,5 ± 3,4; 59,9 ± 3,1 e 60,6 ± 5,4%,
respectivamente), assim como o SFB 10% (98,7 0,4%) quando comparados com o
SFB 0,5% (28,5 2,1), depois de 24 horas de exposição (Figura 33 e 34).
Figura 33. Efeito do (-)-mirtenol sobre a migração de células AGS, em meio com
hidroxiuréia após 6 e 24 horas de exposição
6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 240
20
40
60
80
100
SFB 0,5%
SFB 10%
(-)-Mirtenol 0,1 nM
(-)-Mirtenol 1 nM
(-)-Mirtenol 10 nM
(-)-Mirtenol 100 nM
**
***
******
*** ***
*******
*
Tempo (h)
Fech
am
en
to d
a f
en
da (
%)
Os dados são expressos como média ± E.P.M. e representam a porcentagem de fechamento da
fenda. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 comparados com o controle negativo, SFB 0,5% (ANOVA “two
way”, seguido do pós-teste de Bonferroni).
106
Figura 34. Fotomicrografias da fenda em monocamada de células AGS incubadas
com (-)-mirtenol na presença de hidroxiuréia, com 0, 6 e 24 horas de incubação
Fonte: Elaborada pelo autor.
107
6 DISCUSSÃO
Os metabólitos de espécies vegetais são apresentados frenquentemente
em pesquisas pré-clínicas como potenciais fontes terapêuticas no tratamento de
úlceras gástricas, elencados como promissores candidatos a fármacos ou como
protótipos para novos medicamentos. O (-)-mirtenol, produto investigado no presente
trabalho, é um monoterpeno com relevantes atividades biológicas já documentadas,
como efeito, anti-inflamatório (GOMES et al., 2017), antinociceptivo (SILVA et al.,
2014) e antimicrobiano (NGAN et al., 2012). Esse monoterpeno é um metabólito
secundário obtido de algumas espécies vegetais, como também através da oxidação
do α-pineno utilizando biocatalisadores, bactérias ou fungos. O α-pineno é um
subproduto barato da indústria de processamento de madeira, o que pode tornar a
obtenção do (-)-mirtenol economicamente viável para indústria farmacêutica
(SCHEWE; HOLTMANN; SCHRADER, 2009).
Neste estudo foi investigada, com considerável ineditismo, a toxicidade
aguda, a atividade gastroprotetora e cicatrizante do (-)-mirtenol e seus possíveis
mecanismos de ação, em diferentes modelos de lesão gástrica. No protocolo de
toxicidade aguda o (-)-mirtenol administrado por via oral na dose única de 2000
mg/kg, não promoveu morte nos camundongos, nem alteração no peso ou consumo
de água e ração dos animais, por um período de até 14 dias depois da
administração. Esse achado garante dentro do contexto avaliado a segurança do
uso desse monoterpeno administrado oralmente nos tratamentos agudos em
camundongos.
No estudo realizado por Belsito et al. (2008) o (-)-mirtenol administrado
por via oral apresentou DL50 de 2450 mg/kg para ratos, superior a dose investigada
no presente trabalho de 2000 mg/kg para camundongos machos, na qual não foi
observada morte dos animais, indicando que a DL50 do (-)-mirtenol para
camundongos é maior do que 2000 mg/kg. Segundo Kenedy; Ferenz; Burgess,
(1981) uma substância que apresenta DL50 maior que 2000 mg/kg por via oral, pode
ser considerada praticamente não tóxica. Além disso, a maior dose do (-)-mirtenol
(100 mg/kg)administrada em camundongos, nos testes farmacológicos apresentados
no presente trabalho, é 24 vezes menor do que a dose considerada letal para ratos.
Em geral os camundongos têm uma maior atividade metabólica para substâncias
108
químicas do que os ratos, essa diferença entre as espécies pode ser devido, pelo
menos em parte, a diferença na distribuição das isoenzimas do citocromo P450, que
estão envolvidas na metabolização de diversas substâncias, o que pode contribuir
para os diferentes resultados entre as espécies, nos testes de toxicidade da DL50 de
uma substância (NAKAJIMA et al., 1993). Assim como o (-)-mirtenol, outro álcool
monoterpênico o l-mentol, também apresentou DL50 maior que 2000 mg/kg para
camundongos, por via oral, estimada em 3400 mg/kg (BHATIA et al., 2008).
Para avaliação da atividade gastroprotetora e cicatrizante do (-)-mirtenol
foram utilizados, neste estudo, modelos de lesão gástrica induzida por diferentes
agentes, etanol, anti-inflamatório não esteroide, estresse de retenção e frio e ácido
acético 80%, todos com efeitos lesivos a mucosa gástrica bem conhecidos. A
formação de lesões ulcerativas por esses modelos experimentais, assim como as
encontradas em humanos, envolve o desequilíbrio entre os fatores agressores e
protetores da mucosa gástrica (De ALMEIDA et al., 2012).
O consumo abusivo de álcool ainda é um dos fatores de risco para o
desenvolvimento de úlceras gástricas (PAUDEL et al., 2017). Isso valida a
importância do modelo de lesões gástricas induzidas por etanol, utilizado há vários
anos, como relevante protocolo de triagem para avaliar a atividade gastroprotetora
de potenciais subtâncias, produtos ou moléculas, incluindo os produtos naturais e
seus diversos metabólitos secundários. O etanol induz danos à mucosa e
submucosa gástrica gerando congestão e estase microvascular, o que contribui para
formação de lesões hemorrágicas na região glandular, redução dos fatores
protetores da mucosa, muco, prostaglandinas, GSH, SOD e catalase, e aumento das
lipo-oxigenases no tecido gástrico (ABDEL-SALAM et al., 2001; SIEGMUND, 2003).
O (-)-mirtenol administrado por via oral nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg apresentou
efeito gastroprotetor em modelo de lesões gástricas induzidas por etanol. Esse
resultado é condizente com o efeito gastroprotetor apresentado na literatura por
outros monoterpenos levogiros, como o (-)-linalol (Da SILVA et al., 2016) e o (-)-
mentol (ROZZA et al., 2014), além dos monoterpenos α-pineno (PINHEIRO et al.,
2015), 1,8-cineol (SANTOS; RAO, 2001; CALDAS et al., 2015), timol
(CHAUHAN; KANG, 2015; RIBEIRO et al., 2016), carvacrol (OLIVEIRA et al., 2012),
α- terpineol (SOUZA et al., 2011) limoneno e β-pineno (ROZZA et al., 2011) em
modelo de lesões gástricas induzidas por etanol, envolvendo primordialmente efeito
109
antioxidante, atividade anti-inflamatória e aumento da produção de muco e
prostaglandinas.
As doses de 50 e 100 mg/kg do (-)-mirtenol, administradas por via oral,
apresentaram similar efeito gastroprotetor em modelo de lesões gástricas induzidas
por etanol, bem como nos modelos de lesão induzida por ácido acético. Com base
nessa avaliação, a dose de 50 mg/kg, menor dose com melhor efeito farmacológico,
foi escolhida para realização dos protocolos que avaliaram os possíveis mecanismos
de ação envolvidos no efeito gastroprotetor e cicatrizante gástrico do (-)-mirtenol.
Este monoterpeno reduziu os danos macroscópicos diminuindo à área de lesão,
bem como os danos microscópicos reduzindo a hemorragia, edema e infiltrado de
células inflamatórias, causados pelo etanol; e os mecanismos relacionados a esses
efeitos foram investigados.
O muco é um dos constituintes da barreira protetora da mucosa gástrica,
que é a primeira linha de defesa da mucosa contra agentes agressores, como ácido
e pepsina (ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005). A glicoproteína mucina é o principal
componente do muco e responsável pelas propriedades mecânicas da barreira
protetora da mucosa, forma uma rede interligada altamente viscoelástica que regula
o transporte na superfície do epitélio gástrico (MURILLO et al., 2015). (-)-Mirtenol, na
dose de 50 mg/kg aumentou o conteúdo de muco na mucosa gástrica em protocolo
de lesões induzidas por etanol, assim como a N-acetilcisteína (200 mg/kg), que
apesar de ser mucolítica, é relatada na literatura como uma substância que
administrada oralmente em doses acima de 100 mg/kg aumenta os níveis de muco
gástrico em protocolo de lesões induzida por etanol, sem efeitos tóxicos
(PENUGONDA; ERCAL, 2011; JACCOB, 2015).
Cabe ressaltar que as prostaglandinas são agentes gastroprotetores
endógenos e atuam estimulando a secreção de muco, além de estimular a migração
e proliferação celular, controlar o fluxo sanguíneo e inibir a ativação de neutrófilos
(TAKEUCHI, 2014). Os estímulos para secreção de muco são mediados
principalmente pela prostaglandina E2, ao se ligar e ativar receptores de
prostaglandina E do tipo 4 e 2 em células mucosas do epitélio gástrico (MARD et al.,
2017). No presente trabalho, o efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol 50 mg/kg foi
inibido pelo pré-tratamento com indometacina, um anti-inflamatório não esteroide,
em modelo de lesões induzidas por etanol, sugerindo um possível envolvimento das
110
prostaglandinas no efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol. O que possibilita aventar,
que possivelmente o aumento do conteúdo de muco gástrico, assim como, a
redução da hemorragia, do edema e do infiltrado neutrofílico promovidos pelo (-)-
mirtenol, em lesões gástricas induzidas por etanol, possam ser consequências da
ação das prostaglandinas estimuladas por esse monoterpeno.
Os anti-inflamatórios não esteróis (AINES), indometacina, ibuprofeno,
estão entre os fármacos mais utilizados em todo o mundo, com propriedades
terapêuticas sobre diversas doenças musculoesqueléticas, dentre elas a artrite
reumatoide. O uso excessivo de AINEs é um dos principais fatores de risco para o
desenvolvimento de úlcera gástrica (BRZOZOWSKI et al., 2007). A indometacina,
utilizada como ferramenta farmacológica para indução de úlcera gástrica, inibe as
isoformas da ciclo-oxigenase 1 e 2, resultando na redução da síntese de
prostaglandinas. Isso contribui para formação de lesão na mucosa gástrica atribuída
a redução da secreção de muco e bicarbonato, com difusão de ácido clorídrico para
células do epitélio gástrico, a redução do fluxo sanguíneo, com infiltrado e adesão de
neutrófilos em células do endotélio vascular e aumento das EROs (LANZA et al.,
2009).
No presente trabalho o (-)-mirtenol (50 e 100 mg/kg) apresentou efeito
gastroprotetor, sobre lesões gástricas induzidas por indometacina, assim como o
misoprostol (50 µg/kg), análogo sintético da prostaglandina E
(GARRIS; KIRKWOOD, 1989). Resultados gastroprotetores correspondentes ao do
(-)-mirtenol foram encontrados em animais tratados com o monoterpeno 1,8 cineol
(eucaliptol) também nas doses de 50 e 100 mg/kg, em modelo de lesões gástricas
induzidas por indometacina (CALDAS et al., 2015), sugerindo que nessas doses a
propriedade gastroprotetora apresentada por esses monoterpenos parece envolver
produção de prostaglandinas e/ou de muco.
O estresse é um importante agente para o desenvolvimento da úlcera
gástrica nos seres humanos, e são vários os agentes estressores físicos e
psicológicos que causam lesão na mucosa gástrica (MILLER, 1987). O protocolo, de
lesões gástricas agudas induzidas por estresse de retenção e frio em ratos, é
frequentemente utilizado e clinicamente relevante, principalmente devido à
reprodutibilidade dos dados e similaridade morfohistológica das lesões geradas com
as úlceras gástricas humanas, induzidas pelo estresse (HASSAN et al., 2016). A
111
fisiopatologia das lesões gástricas induzidas pelo estresse é complexa e
multifatorial, assim como a das lesões induzidas por etanol. O estresse pode
estimular o desenvolvimento das úlceras pelo aumento da atividade vagal e
liberação de histamina, o que aumenta a secreção de ácido gástrico, diminui o
conteúdo de muco, altera o fluxo sanguíneo e aumenta a produção de espécies
reativas de oxigênio (EROs). A diminuição da qualidade e quantidade de muco
aderente à mucosa gástrica é uma das principais alterações causadas pelo estresse
(ADINORTEY et al., 2013). O monoterpeno, (-)-mirtenol, nas doses de 50 e 100
mg/kg protegeu a mucosa gástrica reduzindo as lesões induzidas por estresse de
retenção e frio, apresentando efeito gastroprotetor possivelmente relacionado a
fatores citoprotetores e/ou antioxidantes.
Entre os principais fatores citoprotetores gástricos destacam-se o muco
gástrico, as prostaglandinas, o fluxo sanguíneo adequado, o óxido nítrico, os
compostos sulfidrilas e as enzimas antioxidantes (REPETTO; LLESUY 2002). A fim
de fornecer evidências concretas da participação de outros agentes citoprotetores,
além do muco, no efeito gastroprotetor do (-)-mirtenol, foram analisados os níveis
dos marcadores do estresse oxidativo, como os grupamentos sulfidrilas não
proteicos, malondialdeído e a atividade de enzimas antioxidantes (superóxido
dismutase, glutationa peroxidase, catalase), e marcadores da inflamação na
mucosa, como a atividade da mieloperoxidase, em modelo de lesões gástricas
induzidas por etanol, bem como os níveis de nitrato/nitrito, indicadores da produção
de óxido nítrico. O etanol como substância irritante, estimula a peroxidação lipídica
em células do epitélio gástrico, aumentando os níveis de MDA, reduzindo os níveis
de grupamentos sulfidrilas e a atividade de enzimas antioxidantes, o que contribui
para o aumento das EROs (LIEBER, 1993; ADINORTEY et al., 2013).
Os grupamentos sulfidrilas não proteicos ou tióis são as mais abundantes
biomoléculas não enzimáticas antioxidantes encontrada nos tecidos, atuam como
substrato da enzima GPx, que remove o peróxido de hidrogênio e radicais livres. Em
condições normais as células possuem um poderoso sistema de defesa enzimático
antioxidante (Catalase, SOD, GPx), que desempenha um papel protetor contra
xenobióticos, impedindo o aumento desordenado de radicais livres e produtos de
peroxidação, como o MDA, que pode causar danos diretos às proteínas celulares e
112
ao ácido desoxirribonucleico, (DNA), levando à perda da fluidez, integridade da
membrana e funções celulares (HUET; DURANTEAU, 2008; BEN ALI et al., 2015).
A atividade das enzimas antioxidantes (SOD, catalase, GPx) e os níveis
dos grupamentos sulfidrilas não proteicos foram significativamente elevados,
enquanto os níveis de MDA foram reduzidos, na mucosa gástrica dos animais que
receberam (-)-mirtenol (50 mg/kg) e também N-acetilcisteína (200 mg/kg). Sugerindo
que o efeito gastroprotetor apresentado pelo (-)-mirtenol é promovido possivelmente
pela ação antioxidante desse monoterpeno. A N- acetilcisteina (NAC) é um derivado
de aminoácido cisteína contendo grupo tiol em sua estrutura, um precursor para a
glutationa intracelular. Essa substância apresenta evidente efeito antioxidante,
erradicando neutrófilos reativos e radicais livres, através da reação de redução ou
conjugação (JACCOB, 2015).
Assim como o (-)-mirtenol, outros monoterpenos levogiros, o (-)-mentol e
o (-)-linanol, também apresentaram ação gastroprotetora em modelo de lesões
induzidas por etanol, provavelmente devido a suas atividades antioxidantes,
reduzindo significativamente a peroxidação lipídica, mensurada pelos níveis de
MDA, e diminuindo a migração e ativação de neutrófilos, por reduzir a atividade de
MPO. Esse efeito antioxidante do (-)-linalol foi ainda potencializado quando
complexado com a β-ciclodextrina (β-CD), que é uma alternativa biotecnológica para
melhorar a solubilidade e estabilidade de substâncias lipofílicas (ROZZA et al., 2014,
Da SILVA et al., 2016).
A MPO é uma enzima reportada como marcador de infiltrado neutrofílico
em tecido inflamado. A formação de úlceras gástricas pode estar associada com o
aumento dos níveis dessa enzima. Produzidas e liberadas por neutrófilos as
mieloperoxidases catalisam a formação de potentes oxidantes como ácido
hipocloroso a partir do peróxido de hidrogênio (H2O2), que causam sérios danos à
mucosa gástrica (DERIN et al., 2006). O (-)-mirtenol na dose de 50 mg/kg reduziu a
atividade de MPO no protocolo de lesões gástricas induzidas por etanol. Silva et al.
(2014) investigou o efeito do (-)-mirtenol em camundongos submetidos ao protocolo
de peritonite induzida por carragenina e evidenciou que (-)-mirtenol (75 mg/kg) reduz
os níveis de MPO, em concordância com os resultados aqui encontrados, que
demonstram potencial efeito anti-inflamatório envolvidos na ação gastroprotetora do
(-)-mirtenol. Esse potencial efeito anti-inflamatório está possivelmente relacionado
113
com a capacidade do (-)-mirtenol em modular a migração de leucócitos, reduzindo a
quimiotaxia de neutrófilos, o rolamento e adesão de dessas células, revelados por
microscopia intravital (GOMES et al., 2017). Isso fundamenta os resultados
encontrados no presente trabalho, relativos à redução da atividade de MPO causada
pelo (-)-mirtenol, no tecido gástrico de camundongos.
O monoterpeno, (-)-mirtenol em protocolo de lesões gástricas induzidas
por etanol aumentou os níveis de nitrato/nitrito, que é um marcador de óxido nítrico
endógeno, no tecido gástrico. Uma vez que, o óxido nítrico (NO) pode ser produzido
na mucosa gástrica pela reação de redução, por enzimas redutases que convertem
nitrato a nitrito, em ambiente anóxico. Essa reação é acelerada em meios ácidos e
redutores como o suco gástrico do estômago (BJÖRNE et al., 2004). Além disso, o
NO também pode ser produzido pela atividade da enzima sintase de óxido nítrico
(NOS), na presença de oxigênio. O NO é caracterizado como um mediador chave na
defesa da mucosa gastrintestinal, pois além de aumentar fluxo sanguíneo gástrico,
pela via da guanilato ciclase-GMPc, interage com prostaglandinas e regula a
secreção de ácido gástrico, por suprimir a liberação de histamina das células
enterocromafins (LUNDBERG; WEITZBERG; GLADWIN, 2008; MARD et al., 2014).
No presente trabalho também foi observado que, o efeito gastroprotetor
do (-)-mirtenol (50 mg/kg) e L-arginina (600 mg/kg), precursor da NOS, foi inibido na
presença de um inibidor não seletivo da NOS, o L-NAME. Ratificando os achados
com os marcadores de óxido nítrico, esses resultados alvitram fortemente que a
produção de óxido nítrico estimulada pelo (-)-mirtenol está possivelmente envolvida
no efeito gastroprotetor apresentado por esse monoterpeno. O NO produzido pela
sintase de óxido nítrico endotelial (eNOS), favorece a cicatrização da úlcera ou
gastroproteção, por modular o fluxo sanguíneo, estimular a angiogênese, a secreção
de muco e bicarbonato (GUO et al., 2006). Ademais, foram detectadas, por
imunofluorescência, eNOS na região glandular da mucosa gástrica humana, onde a
produção de óxido nítrico parece inibir diretamente a secreção de ácido pela célula
parietal (BERG et al., 2004).
O NO e as protaglandinas endógenas atuam como moduladores dos
canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP) e este mecanismo, pelo menos em
parte, medeia a gastroprotecção (MURPHY; BRAYDEN, 1995;
PESKAR; EHRLICH; PESKAR, 2002). Isso porque, a ativação dos canais KATP,
114
presentes no endotélio dos vasos sanguíneos do tecido gástrico, aumenta o fluxo
sanguíneo na mucosa gástrica, como consequência essa vasodilatação
concomitantemente protege a mucosa de agentes ulcerogênicos. Quando ativados
os canais KATP se abrem e permitem o efluxo de íons potássio, alterando o potencial
elétrico da membrana celular, o que reduz a entrada de cálcio através dos canais de
cálcio dependentes de voltagem, culminando na vasodilatação (NILIUS;
DROOGMANS, 2001). Contudo, o efeito gastroprotetor exercido pelo (-)-mirtenol
parece não envolver a ativação dos canais KATP, pois seu efeito protetor gástrico não
foi inibido na presença do bloqueador dos canais KATP, glibenclamida. Achados
semelhantes foram apresentados pelo sesquiterpeno (-)-alfa bisabolol, que
promoveu efeito gastroprotetor, em modelo de lesões gástricas induzidas por etanol,
independente da ativação dos canais KATP (ROCHA et al., 2010).
O ácido gama aminobutírico (GABA) é um neurotransmissor sintetizado
pela enzima glutamato descarboxilase e encontrado no sistema nervoso central e
periférico em vários tecidos, incluindo o trato gastrintestinal. Quando administrado
por via oral o GABA exerce efeito gastroprotetor contra lesões gástricas induzidas
por etanol e estresse, em animais experimentais, aumentando o fluxo sanguíneo da
mucosa, por estimular a liberação de peptídeos relacionados ao gene da calcitonina,
de neurônios sensoriais gástricos, estimulando a produção de óxido nítrico (HARTY
et al., 2004). Essa capacidade do GABA de estimular a produção de óxido nítrico
também foi observada em estudo in vitro, com estômago de camundongos
(ROTONDO; SERIO; MULÈ, 2010) e parece ser mediada pelo receptor GABA-A,
que quando ativado desempenha um papel inibitório na motilidade gástrica,
enquanto os receptores GABA-B medeiam às contrações gástricas por estimular a
liberação de acetilcolina, mostrando que o GABA é capaz de modular o tônus
gástrico atuando perifericamente através de receptores neurais. Similarmente ao
GABA, a somatostatina também controla a molitidade gástrica, por estimular a
transmissão de receptores GABAérgicos presentes no núcleo motor dorsal do vago
(LEWIN et al., 2016).
A distribuição de GABA e seus receptores ao longo do trato gastrintestinal
denota seu potencial papel multifuncional no trato gastrintestinal em condições
fisiológicas e patológicas (AUTERI; ZIZZO; SERIO, 2015). O GABA ainda estimula a
expressão do gene de mucina MUC 1 na superfície de células da mucosa, um tipo
115
de mucina que atua principalmente impedindo a adesão de micro-organismos na
mucosa gástrica (BRAUN et al., 2015).
As evidências científicas apoiam fortemente a ampla representação do
sistema GABAérgico no meio entérico. O estudo realizado por Kessler et al. (2014)
mostrou que o mirtenol em baixas concentrações (10 µM) é um potente modulador
alostérico positivo de receptores GABA-A, o que condiz com o efeito ansiolítico
promovido pelo monoterpeno envolvendo receptores GABA-A, em estudos pré-
clínicos (MOREIRA et al., 2014). Kessler et al. (2014) também observou que os
monoterpenos, verbenol e carvacrol, assim como o mirtenol apresentam potente
efeito modulador alostérico positivo sobre receptores GABA-A, ionotrópicos,
favorecendo o influxo de íons cloreto e hiperpolarização da membrana. Essas
substâncias têm algumas semelhanças estruturais compartilhadas, como o caráter
cíclico (mono- ou bicíclico) e a presença de um grupo hidroxila, o que possivelmente
justificaria esse efeito. Tomando como base as informações abordadas, avaliou-se
no presente estudo se o efeito gastroprotetor apresentado pelo (-)-mirtenol envolve
mecanismos de transmissão GABAérgica. Os resultados encontrados evidenciaram
que, o efeito gastroprotetor apresentado pelo (-)-mirtenol (50 mg/kg, v.o.) e muscimol
(0,1 mg/kg, i.p.), agonista dos receptores GABA-A, em modelo de lesões induzidas
por etanol foi inibido pelo flumazenil (20 mg/kg, i.p.) um antagonista dos receptores
GABA-A, permitindo aventar que a atividade gastroprotetora apresentada pelo (-)-
mirtenol parece ser mediada por efeito modulador sobre receptores GABA-A.
Após averiguar o efeito gastroprotetor apresentado pelo (-)-mirtenol e os
possíveis mecanismos envolvidos, o modelo de lesão gástrica induzida por ácido
acético foi utilizado, para investigar o efeito cicatrizante do (-)-mirtenol depois de
sete dias de tratamento. O ácido acético induz a lesão gástrica inicialmente
causando dano vascular e necrose isquêmica, com consequente destruição da
barreira protetora gástrica, formação de espécies reativas de oxigênio, citocinas e
apoptose celular, além de promover mudanças no padrão de aderência do muco
(OKABE; AMAGASE, 2005). A lesão induzida por ácido acético é a que mais se
aproxima em termos de similaridade macroscópica e microscópica com a úlcera
encontrada em humanos, envolvendo camadas mais profundas do estômago o que
complica o processo de cicatrização (BONAMIN et al., 2011). A cicatrização da
úlcera pode demorar semanas ou meses para o total reestabelecimento tecidual,
116
envolvendo vários mecanismos celulares, incluindo migração, proliferação,
angiogênese e deposição de matriz extracelular, que podem ser mediados ou
modulados por citocinas, prostaglandinas, óxido nítrico e fatores de crescimento. A
qualidade da restauração da estrutura da mucosa é uma condição determinante
para garantir que não ocorra recidiva da úlcera (TARNAWSKI, 2005).
O (-)-mirtenol (50 e 100 mg/kg), apresentou efeito antiulcerogênico
reduzindo significativamente a área de lesão gástrica (mm2) induzida por ácido
acético, após sete dias de tratamento. Esse efeito antiulcerogênico ou cicatrizante
também foi visto pela cimetidina (100 mg/kg). A cimetidina (40 mg/kg) administrada
por via oral estimula a cicatrização da lesão gástrica induzida por ácido acético em
ratos, após uma semana de tratamento por inibir a secreção de ácido gástrico
(KANG; TENG; CHE 1996; ISHIHARA; ITO, 2002).
Tendo em vista a exposição às doses de 25, 50 e 100 mg/kg do (-)-
mirtenol administradas uma vez por dia, durante sete dias, o ganho de massa
corporal, o peso dos órgãos e os parâmetros bioquímicos séricos dos animais foram
avaliados. Pois estudos mostram que alterações nesses critérios podem indicar
sinais toxicidade do produto testado (PATIL; SURANA, 2010; CORDEIRO et al.,
2012; MORAES et al., 2013). O tratamento com (-)-mirtenol nas doses pesquisadas
não apresentou alterações significativas no ganho de massa corporal, no peso dos
órgãos e também nos parâmetros bioquímicos avaliados nos animais. Tais
parâmetros indicaram que não houve significativas alterações hepáticas nos animais
tratados com (-)-mirtenol, observadas através dos níveis de alanina
aminotransferase (ALT), um marcador específico para lesão parenquimatosa
hepática, nem disfunções renais avaliadas pela mensuração dos níveis de ureia e
creatinina, indicador de redução da taxa de filtração glomerular (DUGO et al., 2004).
Assim como, os níveis de colesterol total e albumina que podem sinalizar alterações
metabólicas e funcionais no organismo também não foram alterados, nos animais
tratados com (-)-mirtenol nas três doses quando comparados aos animais do grupo
veículo que não receberam tratamento.
A análise histológica realizada no presente estudo autenticou que o
tratamento com o (-)-mirtenol, durante sete dias, em protocolo de lesão induzida por
ácido acético, estimula a cicatrização da lesão, com restauração do tecido epitelial
na base da lesão, organização e regeneração de glândulas secretoras gástricas e
117
redução do infiltrado de células inflamatórias. As principais células inflamatórias
envolvidas na formação da úlcera gástrica são macrófagos e neutrófilos. Ao longo do
processo inflamatório os macrófagos podem recrutar mais macrófagos e neutrófilos
para o local da inflamação, através de mecanismos diretos ou indiretos estimulando
moléculas de adesão e a expressão de mediadores pró-inflamatórios, TNF-α e iNOS
(HUANG et al., 2001).
A N-acetilglicosaminidase (NAG) é uma enzima presente nos lisossomos
dos macrófagos ativados, facilmente quantificada e muito utilizada como marcador
para detectar o acumulo/ativação de macrófagos no tecido, envolvido no processo
inflamatório (COELHO et al., 2014). Em modelo de lesão gástrica induzida por ácido
acético é intenso o infiltrado de leucócitos mono e polimorfonucleares no tecido
gástrico (OKABE; AMAGASE, 2005) e a persistência de grande quantidade de
macrófagos têm um papel fundamental como causador de recidiva de úlceras
gástricas (ARAKAWA et al., 2012).
Os animais tratados com (-)-mirtenol (50 mg/kg) apresentaram redução da
atividade de NAG, indicando diminuição da quantidade ou atividade de macrófagos
na lesão tecidual induzida por ácido acético. Esse achado condiz com as análises
histológicas, que mostraram redução do infiltrado de células inflamatórias no tecido
gástrico de animais tratados com (-)-mirtenol. De maneira contraditória aos
resultados do (-)-mirtenol, a cimetidina não reduziu a atividade de NAG em modelo
de lesão induzida por ácido acético. A cimetidina é um antagonista de receptores de
histamina H2, utilizada no tratamento de úlcera gástrica principalmente por inibir os
efeitos da histamina na secreção de ácido gástrico (HASTURK et al., 2006). Mas a
cimetidina não inibe os efeito da histamina, mediados pela ativação de receptores
H1, que envolvem a diferenciação de macrófagos e reações inflamatórias
(SASAGURI; TANIMOTO, 2004), o que justifica pelo menos em parte o fato da
cimetidina não ter reduzido a atividade de NAG no presente estudo.
A coloração com PAS evidenciou aumento do conteúdo de muco gástrico
em animais tratados com (-)-mirtenol e cimetidina, permitindo aventar que
provavelmente algumas das estruturas glandulares gástricas restauradas nas
análises histológicas são relativas às glândulas produtoras de muco, o que não foi
observado nos animais do grupo veículo que apresentaram reduzida restauração
glandular, com baixa quantidade de muco gástrico. A coloração do tecido com PAS
118
é uma técnica utilizada para detectar a presença de macromoléculas encontras no
muco como as glicoproteínas, que protegem e ajudam na regeneração da mucosa
gástrica (Da SILVA et al., 2015). Os resultados indicam que o efeito cicatrizante
promovido pelo (-)-mirtenol sobre lesão gástrica induzida por ácido acético é
provavelmente mediado pelo aumento das glicoproteínas presentes na camada de
muco.
O complexo processo programado de cicatrização da úlcera gástrica
requer a restauração continuada do epitélio gástrico, com reepitelização através da
migração e proliferação de células epiteliais, reguladas por fatores de crescimento e
fatores envolvidos na sinalização intracelular (TARNAWSKI; AHLUWALIA, 2012). O
antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) é uma proteína conhecida como
marcador do ciclo celular durante a proliferação celular, que desempenha um
importante papel na replicação e reparado do DNA cromossômico em células
eucarióticas (NARYZHNY, 2008). Nas análises imunohistológicas das lesões foi
possível observar que, o tratamento com (-)-mirtenol depois de sete dias estimulou a
proliferação celular, na lesão gástrica, evidenciado por aumento da marcação
imunohistoquímica para o PCNA maior na área de lesão dos animais tratados com (-
)-mirtenol e cimetidina, do que na lesão dos animais que receberam apenas ácido
acético. Esse resultado permite sugerir que o aumento da proliferação celular é
provavelmente um mecanismo envolvido no efeito cicatrizante apresentado pelo (-)-
mirtenol, em modelo de lesão induzida por ácido acético.
Além da proliferação e diferenciação celular, o reestabelecimento da
estrutura e função tecidual durante o processo de cicatrização da úlcera também
requer uma rápida migração de células epiteliais, da margem da úlcera para a região
que sofreu desnudamento (TARNAWSKI, 2005). Com isso, no presente estudo
células AGS foram utilizadas em modelo in vitro alternativo para confirmar o efeito do
(-)-mirtenol na proliferação e avaliar seu efeito na migração celular. As AGS são
células do epitélio gástrico humano, derivadas de adenocarcinoma e caracterizadas
por uma elevada proliferação e pelo uso em procedimento de cultura padronizado
(SCHNEIDER et al., 2001). Essa linhagem de células AGS, escolhida para
realização dos protocolos in vitro, tem uso respaldado em modelos experimentais de
monocamada celular para analisar a migração, proliferação, citotoxicidade (HALL et
al., 2006; SÁNCHEZ, 2006; LI et al., 2013) e atividade gastroprotetora de algumas
119
substâncias, inclusive de espécies vegetais, como o extrato aquoso de Lippia
integrifolia Hieron (MARCIAL et al., 2014; LIN et al., 2016).
Antes da realização do protocolo de migração cellular in vitro, o ensaio de
viabilidade cellular foi realizado com MTT, que consiste na redução do sal de
tetrazolium (MTT) pela desidrogenase mitocondrial presente nas células, com a
formação de um produto final de cristais de formazan. Os resultados obtidos no
ensaio com MTT mostram que, o (-)-mirtenol nas concentrações de 0,01 a 10000 nM
não reduz a viabilidade cellular após 48 horas de incubação com células AGS. O
que indica certa segurança, por não alterar a atividade metabólica das células nas
concentrações testadas, para o uso do (-)-mirtenol nos protocolos subsequentes.
O efeito do (-)-mirtenol na proliferação cellular foi avaliado em ensaio com
BrdU, que consiste na incorporação de um análogo de nucleotídeo sintético (BrdU)
durante a fase S da mitose. Dessa forma, esse ensaio pode realmente detectar a
replicação do DNA e consequentemente a proliferação celular, através do uso de
anticorpos específicos anti-BrdU e subsequente quantificação de células que
incorporaram o BrdU (VEGA-AVILA; MICHAEL, 2011). Nesse ensaio o (-)-mirtenol
nas concentrações de 100 e 1000 nM, aumentou a taxa de proliferação celular
ratificando o efeito proliferativo já evidenciado pela análise da marcação
imunohistoquímica do PCNA, envolvido na ação cicatrizante apresentada pelo (-)-
mirtenol.
O ensaio de ferida in vitro (In vitro Scratch Assay) é um método simples e
econômico para estudar a migração celular. Esse método baseia-se na observação
e análise, após a criação de uma fenda na monocamada de células AGS, do
fechamento dessa fenda pela migração ou proliferação de células para a região da
fenda, em intervalos de tempo regulares, o que determina a taxa de migração e/ou
proliferação celular (LIANG; PARK; GUAN, 2007). (-)-Mirtenol em todas as
concentrações testadas (0,1, 1, 10 e 100) aumentou a porcentagem de fechamento
da fenda na monocamada de células AGS. Esse resultado sugere que o (-)-mirtenol
promove a reepitelização na área desnudada por estimular a migração e/ou
proliferação celular. Para avaliar se esse efeito in vitro promovido pelo (-)-mirtenol
envolve a migração celular, independente da proliferação, o ensaio foi realizado na
presença de hidroxiureia. Este é um agente antiproliferativo, atua bloqueando a
síntese do DNA celular, devido a sua capacidade de inibir a ribonucleotídeo
120
redutase, enzima envolvida na síntese do DNA (LIEB et al., 2010; HUANG et al.,
2016).
Com base nessas informações, a hidroxiureia foi utilizada no ensaio
experimental para inibir o efeito da proliferação sobre a cicatrização in vitro,
permitindo analisar apenas a migração celular. O resultado evidenciou que o (-)-
mirtenol estimula o fechamento da fenda através da migração de células AGS,
independente da proliferação das mesmas. O que nos leva a denotar que, o efeito
cicatrizante promovido pelo (-)-mirtenol também envolve a migração celular. A
migração celular é vista como um processo de múltiplos passos e de suma
importância que abrange rearranjos no citoesqueleto da célula com mudanças nos
microfilamentos de actina, microtúbulos, filamentos intermediários e nas proteínas
associadas, o que garante a movimentação da célula para reepitelizar a área
desnudada da lesão gástrica (LEDUC; ETIENNE-MANNEVILLE, 2015). Os dados
obtidos reforçam o potencial efeito cicatrizante do (-)-mirtenol envolvendo migração
e proliferação celular.
Outros possíveis mecanismos envolvidos no efeito cicatrizante promovido
pelo (-)-mirtenol estão associados à inibição da expressão de citocinas pró-
inflamatórias, fator de necrose tumoral α (TNF-α) e interleucina- 1β (IL-1β), e o
aumento da expressão de ciclo-oxigenase 2 (COX-2). Na fase inicial do
desenvolvimento da úlcera gástrica, a perturbação do estado redox, a necrose
tecidual e a liberação de leucotrienos B atraem macrófagos e leucócitos
polimorfonucleares que liberam citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β. As
citocinas são moléculas peptídicas solúveis que medeiam diversas interações do
sistema imunológico com outros sistemas ou células e são produzidas por uma
variedade de células em resposta a ativação, principalmente por macrófagos e
células T helper. As citocinas exercem seus efeitos biológicos pela interação com
receptores específicos nas células alvo e desempenham um papel fundamental na
homeostasia do sistema imune, pela modulação e regulação da resposta imune
(TARNAWSKI; AHLUWALIA, 2012; STENKEN; POSCHENRIEDER, 2015).
A interleucina-1β pode ser produzida por monócitos/macrófagos, linfócitos
e fibroblastos e desempenha um papel fundamental em muitos processos
inflamatórios. Em modelos experimentais pré-clínicos a IL-1β foi capaz de induzir a
recorrência de úlcera gástrica por estimular reações inflamatórias na mucosa já
121
cicatrizada (KONTUREK et al., 2000; WATANABE et al., 2001). O TNF-α tem um
papel central na regulação da cascata de citocinas, regulando a expressão de IL-1β
e de outras citocinas (KUMAR et al., 2013). Além disso, o estudo realizado por
Shimizu et al. (2000) mostrou que a produção excessiva de TNF-α pode causar
também ativação de neutrófilos, macrófagos ou monócitos na margem da úlcera
prejudicando a cicatrização da lesão gástrica.
No presente estudo o (-)-mirtenol reduziu o infiltrado de células
inflamatórias no tecido gástrico e a atividade de MPO e NAG, sugerindo redução
e/ou ativação de neutrófilos e macrófagos/monócitos na lesão gástrica induzida por
ácido acético. Esse efeito do (-)-mirtenol está possivelmente relacionado com a
redução da expressão de citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e TNF-α, promovida por
esse monoterpeno. Logo, suporta fortemente a hipótese que o (-)-mirtenol modula o
processo inflamatório induzido pelo ácido acético, contribuindo para a cicatrização
da lesão gástrica. De maneira similar ao efeito do (-)-mirtenol, o monoterpeno (-)-
mentol também reduziu a atividade de células inflamatórias e os níveis de citocinas
pró-inflamatórias na lesão gástrica, o que contribuiu para o efeito gastroprotetor
promovido pelo (-)-mentol (ROZZA et al., 2014). Vários monoterpenos bioativos
encontrados em plantas aromáticas são reportados na literatura por modular a
resposta inflamatória, em diversos modelos experimentais, como exemplo do 1,8
cineol e α-terpineol, que inibem a expressão de citocinas inflamatórias (IL-1β, TNF-α
e IL-6) em modelos in vitro, com macrófagos estimulados por lipopolisacarídeo
(TRINH et al., 2011; SÁ; ANDRADE; De SOUSA, 2013). Isso sugere que
possivelmente a atividade gastroprotetora apresentada por esses monoterpenos
possa ser atribuída aos seus efeitos moduladores sobre a ativação e migração de
células inflamatórias e expressão de citocinas inflamatórias (OLIVEIRA et al., 2014).
A inibição da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) reduz drasticamente a
cicatrização de úlceras gástricas em modelos pré-clínicos e clínicos. A COX-2 é a
enzima responsável por catalisar a reação da metabolização do ácido araquidônico
para formar prostaglandinas (HALTER et al., 2001). No estômago, o aumento da
expressão de COX-2 resulta no consequente aumento da produção de
prostaglandinas E principalmente a do Tipo 2 (PGE2). A PGE-2 estimula a secreção
de mucina por células do epitélio gástrico através da ativação do receptor EP4, via
de sinalização AMPc e proteína quinase A. Assim, o aumento de PGE-2 na mucosa
122
gástrica provavelmente contribui para o aumento do conteúdo de muco gástrico
promovido pelo (-)-mirtenol, no presente trabalho. Além disso, a PGE-2 tem ação
trófica na mucosa gastrintestinal, por estimular a proliferação celular (TARNAWSKI;
AHLUWALIA, 2012). Essas informações tornam evidente o papel positivo da PGE2
produzida por COX-2 no processo de cicatrização da úlcera gástrica. Neste estudo,
o tratamento com (-)-mirtenol aumentou a expressão da COX-2 na lesão gástrica
induzida por ácido acético em ratos, o que é provavelmente mais um possível
mecanismo de ação envolvido no efeito cicatrizante gástrico promovido por esse
monoterpeno. O monoterpeno alfa-pineno, similar estruturalmente ao (-)-mirtenol,
presente no óleo essencial de Hyptis spicigera Lam. (Lamiaceae), também
apresentou considerável efeito cicatrizante gástrico, em modelo de lesão induzida
por ácido acético possivelmente estimulado pelo aumento da expressão da COX-2
na mucosa gástrica (TAKAYAMA et al., 2011).
A cimetidina assim como o (-)-mirtenol inibiu a expressão de IL-1β e TNF-
α e aumentou a expressão de COX-2, possivelmente por seus efeitos
antissecretórios, inibindo a ação da histamina por antagonizar os receptores de
histamina H2 em células do epitélio gástrico. A histamina é uma amina que exerce
ação em diferentes subtipos de receptores (H1, H2, H3 e H4) e pode mediar efeitos
inflamatórios quando se liga a receptores H1, encontrados em macrófagos,
estimulando a liberação de citocinas pró-inflamatórias (WANG et al., 2006). Essas
citocinas estão implicadas na modulação de diversas vias do processo inflamatório
incluindo a via de sinalização das proteínoquinases ativadas por mitógenos (MAPK),
que envolve a expressão de metaloproteinases (MMP) em vários tipos de tecidos e
células do organismo. Essa ação, quando descontrolada de fato promove o aumento
da expressão de alguns tipos de MMP no tecido inflamado (CLUTTERBUCK et al.,
2009). Contrário a isso, a secreção de MMP por células do epitélio gástrico pode ser
conduzida ou modulada por prostaglandinas ou fator de crescimento epidermal, que
são importantes reguladores do processo inflamatório no tecido gástrico ulcerado
(PILLINGER et al., 2005).
As MMPs são uma família de endopeptidases que dependem do zinco e
desempenham papel crucial em vários processos fisiológicos e fisiopatológicos,
incluindo remodelamento de tecido, desenvolvimento de órgãos, reparação de
feridas e reações inflamatórias (KUNDU et al., 2011). Entre essas MMPs estão as
123
metaproteinases de matriz 2 e 9, que degradam a matriz extracelular e são
caracterizadas como gelatinases, pois clivam gelatina e por isso podem ser
estudadas pela técnica de zimografia em gel, que mostra a expressão da atividade
enzimática com base na degradação do substrato (VANDOOREN et al., 2013). Essa
técnica de zimografia em gel é validada e utilizada para expressar a atividade de
metaloproteinases 2 e 9, presentes na lesão gástrica induzida por ácido acético em
ratos. Estudos prévios têm demonstrado que o ácido acético estimula a ativação das
MMP gelatinases na área ulcerada, de tecido gástrico de rato quando comparados
com tecido gástrico sem lesão do animal que não recebeu ácido acético (SILVA et
al., 2015).
Na úlcera gástrica a degradação da matriz extracelular é estimulada pela
ação das MMPs gelatinases, que também estão associadas aos eventos
inflamatórios e oxidativos no tecido. Isso denota o envolvimento negativo dessas
MMPs na cicatrização gástrica, pois o aumento da expressão de MMP-2 e MMP-9
no tecido gástrico está frequentemente associado com o desenvolvimento e
progressão da úlcera gástrica (SRIKANTA; SATHISHA; DHARMESH, 2010; LI et al.,
2013). No presente estudo, o (-)-mirtenol (50 mg/kg) depois de sete dias de
tratamento reduziu a expressão da atividade de MMP 2 e 9 na lesão gástrica
induzida por ácido acético em ratos, quando comparados com a expressão da
atividade de MMP-2 e 9 na lesão dos animais que receberam apenas ácido acético.
Assim como o (-)-mirtenol, o monoterpeno β-mirceno (7,5 mg/kg) também reduziu a
expressão da atividade de MMP-2 na lesão gástrica induzida por ácido acético. Visto
como um relevante processo envolvido no remodelamento do tecido durante a
cicatrização (BONAMIN, 2014).
Resultados diferentes dos obtidos na vigente pesquisa para a MMP-2
foram observados, em experimento de lesões gástricas induzidas por indometacina
utilizando como tratamento a melatonina. Nesse estudo a MMP-2 apresentou
reduzida expressão de sua atividade em lesão gástrica aguda induzida por
indometacina (GANGULY et al., 2005). Contrário a isso, no presente estudo a
expressão da atividade de MMP-2 foi aumentada em lesão gástrica induzida por
ácido acético 80%. A explicação para essa contradição nos resultados pode ser
entendida, pelo fato de diferentes agentes indutores de lesão gástrica experimental
causarem diferentes efeitos. Os anti-inflamatórios não esteroides, a exemplo da
124
indometacina, podem inibir fatores de transcrição ligados aos genes responsáveis
pela síntese de MMP-2, com isso reduzindo a expressão dessa enzima no tecido
gástrico (PAN; HUNG, 2002). Além dos diferentes agentes indutores de úlcera
gástrica, a diferença nos tipos de protocolos escolhidos se agudo ou crônico, podem
tornar compreensível essas divergências apresentas na expressão da atividade de
MMP-2 no tecido gástrico (SRIKANTA; SATHISHA; DHARMESH, 2010).
A cicatrização como já enfatizado é um processo complexo e multifatorial,
e o (-)-mirtenol por reduzir a expressão da atividade de MMP-2 e 9 na lesão gástrica,
pode ser visto como um potencial agente terapêutico para tratamento de lesões
gástricas, com relevante efeito cicatrizante e anti-inflamatório. A cimetidina utilizada
como droga padrão no presente trabalho, já evidenciou em outros estudos
resultados satisfatórios na redução da expressão de MMPs gelatinases (De
OLIVEIRA et al., 2017). A redução da expressão de MMP-2 no tecido gástrico
lesionado, após tratamento, está possivelmente relacionada ao equilíbrio funcional
na degradação da matriz tecidual, acompanhado de aumento na expressão de
colágenos do tipo I, III e IV envolvidos na cicatrização e no remodelamento tecidual
da lesão (SHAHIN et al., 2001).
A maior parte do colágeno que compõe a matriz extracelular é encontrado
na forma fibrilar, como filamentos finos e longos (WESS, 2005). Pesquisas recentes
confirmam que o colágeno do tipo I e III são os principais componentes das fibras de
colágeno no tecido gástrico humano, durante a cicatrização. A deposição excessiva
do colágeno I resulta na formação do tecido cicatricial ou de granulação
desempenhando papel fundamental na cicatrização da lesão gástrica. A forte
expressão do colágeno III é encontrada nos períodos de angiogênese e
diferenciação celular, durante a reepitelização da lesão gástrica (YANG et al., 2017).
De acordo com o estudo realizado por Shahin et al. (2001), o colágeno IV, apesar de
não ser muito evidente no tecido gástrico, foi encontrado na borda da úlcera durante
o processo de cicatrização e envolvido na formação de novos vasos na membrana
basal.
Com base nas informações relatadas é evidente a importância das fibras
de colágeno na cicatrização da úlcera gástrica. Os ratos tratados com (-)-mirtenol
(50 mg/kg), após de sete dias de tratamento, apresentaram aumento significativo da
quantidade de fibras de colágeno na lesão gástrica induzida por ácido acético,
125
quando comparados com animais que receberam somente ácido acético. O
resultado encontrado condiz com as análises histológicas indicando formação de
tecido de granulação, proliferação e reepitelização na área da lesão gástrica do
animal tratado com (-)-mirtenol. Isso fortemente correlaciona o efeito cicatrizante
desse monoterpeno com o aumento da produção de colágeno na região cicatrizada.
Efeitos similares foram promovidos pela curcumina uma substância antioxidante
obtida do açafrão, que apresentou atividade cicatrizante por estimular a restauração
de fibras de colágeno no tecido gástrico ulcerado, associada à regulação da
expressão de MMP-2 e 9 (SHARMA et al., 2012).
Em síntese, mesmo com o conhecimento do processo multifatorial da
formação da úlcera e da cicatrização, os resultados demonstram potencial efeito
gastroprotetor e cicatrizante do (-)-mirtenol, elencando-o como um possível e
interessante produto para a prevenção e tratamento da úlcera gástrica. O (-)-mirtenol
já é uma substância muito utilizada pela indústria cosmética, alimentícia e de
produtos de higiene, como flavorizante e aromatizante. Os resultados encontrados
apresentam esse monoterpeno como promissor protótipo para novos fármacos
antiulcerogênicos, com considerável potencial para despertar o interesse crescente
da indústria de medicamentos na busca de novos fármacos mais eficazes, seguros e
economicamente viáveis.
Diante dos resultados obtidos, evidenciou-se o efeito gastroprotetor e
cicatrizante do (-)-mirtenol, frente aos fatores ulcerogênicos etanol, indometacina,
estresse de retenção e frio, e ácido acético. O (-)-mirtenol, não apresentou
toxicidade aguda, e o seu efeito gastroprotetor envolve mecanismos relacionados
com o aumento de fatores protetores da mucosa gástrica, como a manutenção do
muco gástrico, envolvimento de defesas antioxidantes e produção de óxido nítrico,
acompanhado da modulação dos receptores GABA-A, estimulando a transmissão
gabaérgica. O efeito cicatrizante gástrico promovido pelo (-)-mirtenol também está
relacionado com a produção de muco gástrico, além da modulação da expressão de
citocinas pró-inflamatórias (IL-1β e TNF-α), e de COX-2, mostrando pelo menos em
parte a participação das prostaglandinas. O (-)-mirtenol ainda intensificou o reparo
tecidual, estimulando a reepitelização, com migração e proliferação celular e
controlando o remodelamento da matriz celular gástrica, por reduzir a atividade de
metaloproteinases gelatinolíticas 2 e 9, e aumentar a deposição de fibras de
126
colágeno. Por fim, os achados com expressivo ineditismo apresentam o (-)-mirtenol
como potencial produto antiulcerogênico e fornecem novas perspectivas para
estudos mecanísticos e de toxicidade mais aprofundados desse monoterpeno.
127
7 CONCLUSÕES
Assim, mesmo com o conhecimento do processo multifatorial da formação
da úlcera e da cicatrização, os resultados demonstram potencial efeito gastroprotetor
e cicatrizante do (-)-mirtenol, elencando-o como um possível e interessante produto
para a prevenção e tratamento da úlcera gástrica. O (-)-mirtenol já é uma substância
muito utilizada pela indústria cosmética, alimentícia e de produtos de higiene, como
flavorizante e aromatizante. Os resultados encontrados apresentam esse
monoterpeno como promissor protótipo para novos fármacos antiulcerogênicos, com
considerável potencial para despertar o interesse crescente da indústria de
medicamentos na busca de novos fármacos mais eficazes, seguros e
economicamente viáveis.
128
Figura 35. Esquema representativo e resumido dos mecanismos de ação e dos principais
achados, associados a gastroproteção e cicatrização promovidos pelo (-)-mirtenol
Fonte: Elaborada pelo autor.
129
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152
ANEXO I - FOLHA DE APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE
ANIMAIS
153
ANEXO II-ARTIGO PUBLICADO
154
ANEXO III- TABELAS DOS PARÂMETROS AVALIADOS NO PROTOCOLO DE TOXICIDADE AGUDA
Tabela 1. Massa corporal (g) dos animais que receberam 1% Tween 80 em salina
Massa corporal dos animais (g) Horas Dias
1 2 4 6 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 40 41 41 41 41 42 42 42 41 42 45 44 45 46 47 47 47 48 47
2 35 35 36 36 35 35 34 36 33 34 37 37 36 36 38 38 39 39 40
3 38 40 40 39 40 40 40 42 40 39 41 41 41 41 40 43 39 42 40
Nota: O peso dos animais no início das observações foi correspondente a 38 g para o animal 1, 33 g para o animal 2 e 37 g para o animal 3.
Tabela 2. Peso da ração (g) no grupo dos animais que receberam 1% Tween 80 em salina
Peso da ração (g) Horas Dias
1 2 4 6 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 78 77 76 75 75 67 59 53 46 38 30 23 15 45 35 27 20 12 22
2 76 75 75 74 73 67 61 55 52 46 38 33 27 56 48 41 33 26 38
3 75 73 72 71 69 61 53 50 40 33 25 17 11 39 30 20 13 5 16
Nota: Os animais foram acomodados em gaiolas individuais. Inicialmente foram colocados 80 g de ração, para cada animal. Depois de 9 e 14 dias do início
das observações foram colocados 37 g de ração para todos os animais.
155
Tabela 3. Volume de água (mL) no grupo dos animais que receberam 1% Tween 80 em salina
Volume de água
(mL)
Horas Dias
1 2 4 6 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 96 87 80 74 69 242 223 190 173 152 320 302 281 266 232 200 172 153 120
2 97 90 79 70 68 222 198 171 149 120 295 270 253 220 217 192 166 142 118
3 95 85 75 67 50 220 195 164 130 112 284 263 240 210 188 155 123 98 66
Nota: Os animais foram acomodados em gaiolas individuais. Inicialmente foram colocados 100 mL de água em garrafas de água, para cada animal. Depois
de mensurar o volume de água no tempo de 8 horas e no dia 5 foram adicionados 200 mL de água para todos os animais.
Tabela 4. Massa corporal (g) dos animais que receberam (-)-mirtenol (2000 mg/kg, v.o.)
Massa corporal dos animais (g)
Horas Dias
1 2 4 6 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 29 31 31 31 31 30 30 31 31 30 31 30 30 30 31 31 28 32 30
2 31 32 32 32 31 31 31 32 30 31 32 32 31 32 33 33 33 33 33
3 30 32 32 32 32 32 32 32 31 30 31 31 32 33 33 33 32 35 34
Nota: O peso dos animais no início das avaliações foi correspondente a 27 g para o animal 1, 29 g para o animal 2 e 30 g para o animal 3.
156
Tabela 5. Peso da ração (g) no grupo dos animais que receberam (-)-mirtenol (2000 mg/kg, v.o.)
Peso da ração (g)
Horas Dias
1 2 4 6 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 76 74 74 73 72 63 54 46 35 26 19 14 8 38 29 20 13 5 17
2 77 75 74 73 73 66 58 53 46 39 31 25 19 47 38 30 22 16 28
3 78 78 77 77 76 69 61 56 49 44 37 32 26 55 48 41 33 25 38
Nota: Os animais foram acomodados em gaiolas individuais. Inicialmente foram colocados 80 g de ração, para cada animal. No dia 9 e 14 foram colocados 37 g de ração para todos os animais.
Tabela 6. Volume de água (mL) no grupo dos animais que receberam (-)-mirtenol (2000 mg/kg, v.o.)
Volume de água (mL)
Horas Dias
1 2 4 6 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 97 80 74 68 50 228 220 196 170 142 319 265 244 221 200 174 150 126 103
2 94 86 75 62 55 230 207 183 154 131 307 270 259 227 203 175 143 117 96
3 95 90 86 78 67 244 218 191 176 158 325 304 286 262 237 223 198 175 154
Nota: Os animais foram acomodados em gaiolas individuais. Inicialmente foram colocados 100 mL de água em garrafas de água, para cada animal. Depois de mensurar o volume de água no tempo de 8 horas e no dia 5 foram adicionados 200 mL de água para todos os animais.