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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
GDAYLLON CAVALCANTE MENESES
RELAÇÃO ENTRE MARCADORES TRADICIONAIS DE FUNÇÃO RENAL E A
PROTEÍNA QUIMIOTÁTICA DE MONÓCITOS-1 (MCP-1) URINÁRIA EM
PACIENTES COM HANSENÍASE
FORTALEZA-CE 2013
RELAÇÃO ENTRE MARCADORES TRADICIONAIS DE FUNÇÃO RENAL E A
PROTEÍNA QUIMIOTÁTICA DE MONÓCITOS-1 (MCP-1) URINÁRIA EM
PACIENTES COM HANSENÍASE
Dissertação apresentada à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, da Universidade Federal do
Ceará, como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre em Farmacologia.
Orientadora: Profa. Dr. Alice Maria Costa Martins.
FORTALEZA-CE 2013
RELAÇÃO ENTRE MARCADORES TRADICIONAIS DE FUNÇÃO RENAL E A
PROTEÍNA QUIMIOTÁTICA DE MONÓCITOS-1 (MCP-1) URINÁRIA EM
PACIENTES COM HANSENÍASE
Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Farmacologia.
Aprovada em: ____/____/___
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________ Profa. Dra. Alice Maria Costa Martins-(Orientadora)
Universidade Federal do Ceará - (UFC)
___________________________________________________ Prof. Dr. Alexandre Braga Libório
Universidade Federal do Ceará - (UFC)
___________________________________________________ Prof. Dr. Geraldo Bezerra da Silva Junior
Universidade de Fortaleza - (UNIFOR)
AGRADECIMENTOS
À DEUS, pela minha vida, pelas oportunidades que tem me
proporcionado e pelo Seu amor infinito e misericordioso.
Aos pacientes que aceitaram participar da pesquisa, personagens
principais desse estudo.
À Profa Dra Alice Maria Costa Martins por seus ensinamentos, exemplo
de vida e confiança em meu trabalho e potencial todos esses anos.
Ao Dr Alexandre Libório pelo apoio constante, por suas idéias e
contribuição na construção desse trabalho.
Ao Dr Geraldo e a Dra Elizabeth Daher pelos ensinamentos, idéias e
confiança em meu trabalho que me motivam cada vez mais a buscar o
conhecimento.
Aos meus amigos do LCC: Jáder, Louise, Dania, Ramon, Alba, Clarissa,
Tici, Rodrigo, Kamila, IsabelA, Bel e Thiago. Obrigado pela paciência, e
amizade verdadeira e feliz, diariamente.
Ao Ramon pela disponibilidade e ajuda em parte das análises desse
estudo, sempre te devo uma!
Ao Marcus Felipe (Marcondes) por sua amizade e companheirismo.
Aos colegas: Adelvane, Fernanda, Natália, Talyta, pela amizade, união e
contribuição para o presente trabalho.
A meu Irmão caçula Rarison, pelo exemplo de vida e de perseverança e
pelo seu companheirismo.
À Nathalia Cavalcante, por seu apoio e amor verdadeiro principalmente
nos momentos difíceis, inspirando meus sonhos.
À toda a minha família, em especial meus pais, pelo apoio, educação,
exemplo de vida, amor e ensinamentos que levarei para o resto de minha vida.
Devo tudo o que tenho a vocês!!!
“O Senhor se inclinou para mim e ouviu meu clamor; pôs os meus pés sobre
uma rocha e firmou os meus passos”.
(Salmo 40)
RESUMO
Introdução: As lesões renais na hanseníase tem grande importância, pois podem evoluir para uma doença renal de etiologia glomerular (glomerulonefrites, amiloidose) ou tubulointersticial. Objetivo: Investigar disfunções renais em pacientes com hanseníase utilizando marcadores tradicionais de função renal e a Proteína Quimiotática de Monócitos-1 (MCP-1) urinária. População e Metodologia: Foi realizado estudo transversal e prospectivo de 44 pacientes com hanseníase em todas as formas clínicas, antes do início do tratamento, sem estado reacional e sem outras nefropatias. Os pacientes foram acompanhados em centros públicos de saúde em Fortaleza, Ceará, Brasil entre agosto de 2012 e agosto de 2013. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Walter Cantídio da Universidade Federal do Ceará (No: 267.426). Os pacientes foram comparados com um grupo controle composto por 15 indivíduos sadios. Foi calculada a fração de excreção de eletrólitos, estimada a taxa de filtração glomerular (TFG), proteinúria e microalbuminúria. O estresse oxidativo urinário foi quantificado pelo Malonaldeído (MDA) urinário e o MCP-1 urinário foi quantificado através da técnica do ELISA sanduíche. Os valores foram normalizados pela creatinina urinária. Resultados: Não houve diferença significativa entre a idade, sexo, peso corporal e pressão arterial entre os grupos. A idade média dos pacientes foi de 36±10 anos, sendo 61 % do gênero masculino. O tempo de doença variou de um mês a 8 anos, com média de 17 meses. A baciloscopia foi positiva em 26 pacientes (59,1%) e negativa em 18 (40,9%). Quanto à classificação: 14 pacientes (31,8%) eram do pólo tuberculóide (TT/DT), 19 (43,2%) eram dimorfos (DD) e 11 (25%) eram do pólo virchowiano (DV/VV). As provas de função renal não diferiram (p>0,05), com exceção da proteinúria. Os pacientes com hanseníase tiveram níveis elevados de proteinúria (97,6±69,2 vs 6,5±4,3 mg/g-Cr, p<0,001) do MDA urinário (1,77±1,31 vs 1,27±0,66 mmol/g-Cr, p=0,0372) e do MCP-1 urinário (101±79,8 vs 34,5±14,9 mg/g-Cr, p=0,006) em relação ao grupo controle respectivamente. O MCP-1 urinário esteve maior nos pacientes multibacilares em relação aos paucibacilares (122,1±91,9 vs 72±46,1 mg/g-Cr, p=0,023), respectivamente e se correlacionou positivamente com a baciloscopia (r=0,104; p=0,035), com a albuminúria (r=0,171; p=0,006) e com o MDA urinário (r=0,205; p=0,002). Conclusão: Em pacientes com hanseníase sem doença renal clínica, o MCP-1 urinário esteve aumentado sobretudo no pólo virchowiano, e se associou com marcadores de progressão de lesão renal, apresentando grande utilidade como preditor de disfunção renal.
Palavras-chave: Hanseníase, Disfunção renal, Biomarcadores, Estresse
oxidativo urinário, MCP-1 urinário.
ABSTRACT
Introduction: Leprosy patients can present with kidney disease from glomerular (glomerulonephritis, amyloidosis) or tubule-intertitial etiology. Aims: To evaluate renal abnormalities in leprosy patients through traditional markers of renal disease and Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1). Methods: This is a cross-sectional study of 44 patients with clinical and laboratory diagnosis of leprosy and with no previous anti-mycobacterium treatment and reaction episode. Patients were recruited in public health centres in Fortaleza, Ceara, Brazil between August 2012 and August 2013. The protocol of this study was approved by the Ethical Comitee of the Walter Cantidio University Hospital, Federal University of Ceara, Brazil (Nº 267.426). Also, a group of 15 healthy subjects were included as a control group. Glomerular filtration rate (GFR), protein excretion, microalbuminuria and Urinary oxidative stress (malondialdehyde-MDA) were estimated. Urinary MCP-1 was determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. All urine measurements were normalized by urinary creatinine concentration. Results: Age and gender were similar between leprosy patients and control groups. Patients’ average age was 36±10 years, and 61% were male. Time from symptoms to leprosy diagnosis varied from one month to 8 years, with a median time of 17 months. Twenty-six patients had skin smear-positive test (59,1%) and 18 were negative (40,1%). Clinically, there were 14 (31,8%) tuberculoid polar form (TT/BT), 19 (43,2%) boderline (BB) and 11 (25%) lepromatous polar form (LL/BL). Regarding renal function, no patient had chronic kidney disease. Leprosy patients had a higher urine protein excretion (97,6±69,2 vs 6,5±4,3 mg/g-Cr, p<0,001), urinary MDA (1,77±1,31 vs 1,27±0,66 mmol/g-Cr, p=0,0372) and urinary MCP-1 (101±79,8 vs 34,5±14,9 mg/g-Cr, p=0,006) than healthy controls. Urinary MCP-1 was higher in multibacillary than in paucibacillary patients (122,1±91,9 vs 72±46,1 mg/g-Cr, p=0,023). There was a positive correlation between urinary MCP-1 and bacteriological index in skin smear (r=0,104; p=0,035), urinary MCP-1 and albumin excretion rate (r=0,171; p=0,006) and urinary MCP1 and urinary MDA (r=0,205; p=0,002). Conclusion: Leprosy patients with no clinical kidney disease have increased urinary MCP-1 and its levels are even higher according patients approximates to lepromatous polar form. Moreover, urinary MCP-1 was associated with urinary oxidative stress and urine albumin excretion, suggesting these patients are at increased risk of developing clinical kidney disease in the future. Keywords: Leprosy, Renal lesions, Biomarkers, Urinary oxidative stress,
Urinary MCP-1.
LISTA DE ABREVIATURAS
M.leprae Mycobacterium leprae
OMS Organização Mundial de Saúde
BAAR Bacilo ácido álcool resistente
IL Interleucina
TT Tuberculóide
DT Dimorfa-Tuberculóide
DD Dimorfa
DV Dimorfa-virchowiana
VV Virchowiana
IRC Insuficiência renal crônica
IRA Insuficiência renal aguda
PNa+ sódio plasmático
PK+ potássio plasmático
UNa+ sódio urinário
UK+ potássio urinário
FENa+ fração de excreção de sódio
FEK+ fração de excreção de potássio
TFG taxa de filtração glomerular
Ucr creatinina urinária
Pcr creatinina plasmática
MDA Malonaldeido
MCP-1 Monocyte Chemotactic Protein-1
LISTA DE FIGURAS
1. Mycobacterium leprae............................................................................18
2. Padrão da resposta imunológica na hanseníase.................................20.
3. População de Estudo..............................................................................41
4. Quantificação do Malonaldeído (MDA) urinário.....................................45
5. Níveis da excreção de proteínas totais e de MCP-1 urinário dos
pacientes com hanseníase e suas formas clínicas e do grupo
controle...................................................................................................52
6. Correlação linear de Pearson entre MCP-1 urinário e a baciloscopia dos
pacientes com hanseníase....................................................................53
7. Correlação linear de Pearson entre MCP-1 urinário e a microalbuminúria
dos pacientes com hanseníase............................................................54
8. Níveis de Malondealdeído (MDA) urinário nas formas clínicas da
hanseníase e no grupo controle...........................................................55
9. Correlação linear de Pearson entre MCP-1 urinário e MDA urinário dos
pacientes com hanseníase...................................................................56
10. Organograma das correlações entre MCP-1 urinário, baciloscopia,
estresse oxidativo e microalbuminúria.................................................56
LISTA DE TABELAS
1. Características gerais dos pacientes com hanseníase e do grupo
controle...................................................................................................48
2. Características clínicas dos pacientes com hanseníase atendidos em
centros de referência de Fortaleza- CE, de agosto de 2012 a agosto de
2013........................................................................................................49
3. Comparação de parâmetros de função renal entre os pacientes
paucibacilares, multibacilares e o grupo controle................................50
4. Comparação dos parâmetros de função renal entre os pacientes com
hanseníase e suas formas clínicas, e o grupo
controle...................................................................................................51
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 14
1.1. Epidemiologia 15
1.2. Etiologia e transmissão 17
1.3. Diagnóstico e classificação 18
1.4. Imunologia 19
1.5. Formas clínicas da hanseníase 21
1.5.1. Forma indeterminada 21
1.5.2. Forma tuberculóide 21
1.5.3.Forma virchowiana 21
1.5.4. Forma dimorfa e surtos reacionais 22
1.6. Tratamento poliquimioterápico 22
1.7. Alterações renais na hanseníase 23
1.7.1. Glomerulonefrites 24
1.7.2. Nefropatias tunulointerticiais 27
1.8. Biomarcadores renais 28
1.9. Proteína Quimiotática de Monócitos-1 (MCP-1) 29
1.9.1 MCP-1 e doenças renais 31
1.9.2. MCP-1 e hanseníase 33
2. OBJETIVOS 36
2.1. Objetivo Geral 37
2.2. Objetivos Específicos 37
3. MÉTODOLOGIA 38
3.1. Tipo de estudo 39
3.2. Caracterização do local de estudo 39
3.3. Critérios de inclusão e exclusão 39
3.4. Diagnóstico da hanseníase 40
3.5. População de estudo 41
3.6. Coleta de material biológico 41
3.7. Parâmetros estudados 42
3.7.1. Características clínicas 42
3.7.2. Avaliação da função renal 42
3.7.3. Parâmetros de disfunção renal 43
3.8. Métodos analíticos 44
3.9. Análise estatística e Comitê de ética 46
3.10 Comitê de Ética 46
4. RESULTADOS 47
4.1. Características clínicas e epidemiológicas da população estudada 48
4.2. Avaliação laboratorial e dos parâmetros de função renal 49
4.3. Avaliação dos níveis de MCP-1 urinário 52
4.4. Correlação entre MCP-1 urinário e a baciloscopia 53
4.5. Correlação do MCP-1 urinário com a proteinúria e
microalbuminúria
4.6. Avaliação dos níveis de Malonaldeído (MDA) urinário
4.7.Correlação entre MCP-1 urinário e o MDA urinário
54
54
55
5. DISCUSSÃO
6. CONCLUSÃO
57
65
7. REFERÊNCIAS
8. ANEXOS
67
78
14
Introdução
15
1. INTRODUÇÃO
A hanseníase é uma doença infecciosa de evolução crônica que tem
afetado a humanidade por milênios, e até hoje continua sendo um
importante problema de saúde pública em diversos países no mundo. Ela é
causada pelo Mycobacterium leprae, identificado pela primeira vez em
humanos pelo médico norueguês Gerhard Armauer Hansen em 1873 e
caracteriza-se principalmente por lesões tegumentares e do sistema
nervoso periférico (SUZUKI et al., 2012).
A hanseníase é descrita como uma das doenças mais antigas
conhecidas pelo homem, porém não se sabe ao certo a época do seu
aparecimento. Nos séculos XVI e XVII, a hanseníase pode ter chegado a
América do Sul com a vinda dos colonizadores espanhóis e portugueses,
pois os primeiros doentes observados na Colômbia eram de origem
espanhola e não havia evidências da existência da doença nas tribos que
habitavam o continente americano (OPROMOLA, 1981, 2000;
MARGARIDO et al., 2002).
A chegada da hanseníase no Brasil parece ter ocorrido com a vinda
dos colonizadores portugueses e dos escravos africanos ao litoral brasileiro,
pois como em outras regiões da América, os povos indígenas brasileiros
não tinham a doença (EIDT, 2004). Acredita-se que com o aumento da
colonização e produção agrícola na região Nordeste, a hanseníase tenha se
disseminado pelos estados de Pernambuco, Paraíba, Alagoas e Ceará
(MAURANO, 1944).
1.1. Epidemiologia
No mundo, a taxa de detecção de novos casos de hanseníase ainda
é alta, cerca de 230 mil novos casos por ano, mas esse número vem
diminuindo desde 2004. A maior parte dos casos se concentra na África, no
16
sudeste da Ásia e nas Américas (WHO, 2011). Do ano de 2002 até 2009,
houve uma queda significativa dos valores de prevalência da doença, de
cerca de 620 mil para 240 mil casos, devido em parte ao tratamento feito
com múltiplas drogas (ANON, 2008, 2009). Em 2010 foram detectados cerca
de 230 mil novos casos e em 2011 o número baixou para 192 mil casos
registrados, com os continentes americanos ocupando a segunda posição
com uma média de 35 mil casos registrados nesse período, perdendo
apenas para a Índia (WHO, 2011).
Atualmente, o Brasil é o país americano com o maior número de
casos novos detectados todo o ano (WHO, 2011). Historicamente, a taxa de
prevalência da hanseníase no Brasil foi reduzida em 85%, passando de 17
para 4,6 casos por 10 mil habitantes no período de 1985 a 2000. Em 2001,
os índices continuaram decrescendo: 3,8 casos por 10 mil, aproximando-se
da meta proposta pela Organização Mundial da Saúde (OMS) de eliminar
essa doença como problema de saúde pública com a redução de sua
prevalência para 1,0 por 10.000 habitantes até o ano de 2005 (MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2011). Entretanto, no início de 2008, apenas o Brasil, Nepal e
Timor- Leste, ainda apresentavam prevalência maior que 1,0 caso por 10 mil
habitantes (WHO, 2011).
No Brasil, apesar da redução da taxa de prevalência, a detecção de
novos casos continua elevada, indicando uma contínua transmissão da
hanseníase (RODRIGUES; LOCKWOOD, 2011). A detecção de novos casos
sofreu uma queda significativa de cerca de 50 mil novos casos em 2004 para
cerca de 34 mil em 2010 (WHO, 2011). As regiões Norte, Nordeste e Centro-
Oeste são as que apresentam os coeficientes de detecção mais elevados do
país (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).
No Estado do Ceará, no período de 2001 a 2012, houve uma queda
do número de casos notificados, de 2.594 para 2.066 casos no ano de 2012
com uma taxa de detecção de 24,0/100.000 habitantes. Apesar da redução,
a taxa de detecção é considerada muito alta, segundo os parâmetros da
OMS. O coeficiente de detecção em menores de 15 anos nesse período é
considerado muito elevado com 5,8 e 5,3/100.000 habitantes, caracterizando
17
focos de transmissão ativos da doença (SECRETARIA DA SAÚDE, 2013).
Em 2012, os municípios de Fortaleza e Juazeiro do Norte apresentaram o
maior número de casos novos com respectivamente 611 e 114 casos dos
2.066 casos registrados em todo o Estado (SECRETARIA DA SAÚDE,
2013).
1.2. Etiologia e Transmissão
O Mycobacterium leprae é uma bactéria gram-positiva em forma de
bastão com cerca de 1 a 8 µm de comprimento e 0,3 µm de diâmetro. Cora-
se em vermelho pela fucsina e não se descora pela lavagem álcool ácido,
portanto é álcool-ácido resistente (BAAR) (figura 1) (GOULART et al.,
2002). O M.leprae apresenta uma parede celular rica em lipídeos e
glicolipídeos antigênicos, onde o mais importante é denominado
glicolipídeo-fenólico1 (PGL-1) (RENAULT; ERNST, 2007). O bacilo é um
parasita intracelular obrigatório que infecta primeiramente macrófagos
residentes da pele e células de Schwann nos nervos periféricos e apresenta
um crescimento bastante lento e um longo período de incubação de 2 a 12
anos (SUZUKI et al., 2012; RODRIGUES; LOCKWOOD, 2011).
A transmissão do M.leprae ainda não está totalmente esclarecida,
mas acredita-se que o contato por longo período de tempo com pessoas
infectadas, principalmente na forma multibacilar da doença, aumentam o
risco de desenvolver a hanseníase (JOB et al., 2008). A principal rota de
infecção parece ser devido à exposição a gotículas expelidas pelo trato
respiratório de pessoas na forma multibacilar da doença, mas também pode
haver excreção da bactéria através da mucosa nasal e da pele (SUZUKI et
al., 2012).
Ainda hoje, o cultivo do M.leprae in vitro não foi realizado e todo o
seu conhecimento biológico foi devido a caracterização bioquímica e
fisiológica das bactérias isoladas de animais, como tatus infectados
(RENAULT; ERNST, 2007). Os seres humanos são os maiores
18
reservatórios da infecção que pode ocorrer também em espécies de tatu e
de primatas (TRUMAN et al., 2011).
Figura 1. Mycobacterium leprae.
Fonte: (SUZUKI .,et al 2012).
1.3. Diagnóstico e Classificação
O diagnóstico de hanseníase é basicamente clínico. É baseado na
avaliação da lesão de pele com alteração de sensibilidade, espessamento de
tronco nervoso, avaliação da função motora e exame de baciloscopia na pele.
Em casos de dúvidas no diagnóstico e classificação realiza-se exame
histopatológico da lesão. Em alguns casos é necessário a biópsia do nervo
afetado para diferenciar a hanseníase de outras possíveis neuropatias (WHO,
2012; ARAÚJO, 2005; RODRIGUES; LOCKWOOD, 2011; SUZUKI et al.,
2012).
A baciloscopia é um exame rápido e de baixo custo, bastante útil para o
diagnóstico. É coletado do paciente um raspado dérmico dos cotovelos, dos
lóbulos das orelhas e da lesão suspeita para a pesquisa do bacilo. O resultado
da baciloscopia é expresso como índice baciloscópico em uma escala de 0 a
6+. O resultado apresenta-se negativo nas formas paucibacilares e positivo nas
formas multibacilares da hanseníase, ajudando a confirmar o diagnóstico e
19
classificar a forma da doença, direcionando o paciente ao esquema terapêutico
adequado para sua forma clínica (ARAÚJO, 2005).
As classificação mais usadas no Brasil são as de Madri (BASOMBRIO et
al., 1953) e de Ridley e Jopling. Na de Madri os pacientes são classificados em
dois “pólos” estáveis e opostos da doença, o Tuberculóide e o Virchowiano. Os
“grupos” instáveis seriam o Indeterminado (I) e dimorfo (D) (ARAÚJO, 2005).
A classificação de Ridley e Jopling, proposta em 1966 (RIDLEY;
JOPLING, 1966), é a mais utilizada em pesquisas científicas e é baseada na
resposta imunológica do hospedeiro frente ao M. leprae. São descritos dois
tipos polares, estáveis e mutuamente excludentes, tuberculóide (TT) e
virchovianos (VV) e o grupo dimorfo ou boderline: dimorfo-tuberculóide,
(DT); dimorfo-dirmorfo, (DD); e dimorfo virchowiano, (DV), bem como o
grupo indeterminado, fase inicial e não granulomatosa da doença.
Em 1981, a Organização Mundial da Saúde criou uma classificação
operacional para a hanseníase, visando facilitar a escolha do esquema
terapêutico para os pacientes. A classificação divide os pacientes em dois
grupos: grupo paucibacilar; com até 5 lesões de pele e baciloscopia negativa, e
grupo multibacilar; com mais de 5 lesões de pele ou com baciloscopia positiva.
De acordo com a classificação de Ridley e Jopling o grupo paucibacilar incluem
os indeterminados, TT e DT, e o grupo multibacilar corresponde aos DD, DV e
VV (WHO, 2012).
1.4. Imunologia
Na forma TT o indivíduo manifesta uma resposta imune celular eficaz e
predominante que impede a proliferação do bacilo, já na forma VV predomina a
resposta imune humoral que é ineficaz, resultando na multiplicação acelerada
do bacilo e aumento da carga bacilar do indivíduo. Entre esses pólos, formas
intermediárias, a resposta imunológica varia entre os extremos (SANTANA et
al., 2009).
A imunidade mediada por célula tem um papel crucial, uma vez que
protege contra a disseminação da doença. Essa imunidade não somente
protege como também pode causar danos, levando ao desenvolvimento da
forma TT, com lesões na pele e danos no nervo. Células T do perfil Th1
20
produzem IL-2 e IFN-y que estimulam o crescimento e proliferação de células T
antígeno-específicas, e ativam macrófagos, contribuindo para o estado de
imunidade resistente nos pacientes TT (SANTANA et al., 2009).
O IFN-y estimula o aumento da produção de intermediários reativos de
oxigênio e nitrogênio nos macrófagos que leva a destruição do bacilo. Os
macrófagos ativados produzem TNF-α, que aumentam a resposta macrofágica
causando granuloma imune, e IL-12, que estimula células natural killer e
células T CD4+ a liberar mais IFN-y, direcionando a um padrão de citocinas
Th1 (GOULART et al., 2002).
A imunidade humoral predomina apenas no pólo virchowiano (DV, VV).
Esses pacientes apresentam um padrão de citocinas do tipo Th2 nas lesões
(IL-4, IL-5 e IL-10) que devem contribuir para a ineficácia da resposta imune,
através da falha da ativação de macrófagos e defeitos na produção de IL-2 e
IFN-y (SUZUKI et al., 2012). Além disso, as citocinas Th2, sobretudo a IL-4 e
IL-10 causam supressão da resposta Th1, resultando em infecção progressiva
(figura 2).
Figura 2. Padrão da resposta imunológica na hanseníase.
Fonte: (GOULART et al., 2002).
21
A IL-4 estimula as células B a se diferenciarem e produzirem anticorpos
das classes IgG, IgE e da classe IgM, a qual é específica para o principal
antígeno do M.leprae, o PGL-1 (GOULART et al., 2002). Estudos mostram que
há uma correlação positiva com os níveis de anticorpos anti-PGL-1 e o índice
baciloscópico, caracterizando a ineficácia da resposta imune humoral nos
pacientes DV e VV.
1.5. Formas clínicas da Hanseníase
1.5.1. Forma indeterminada
A hanseníase se manifesta em diferentes formas clínicas dependendo
da resposta imunológica do individuo ao M. leprae. Não havendo sua
destruição, o bacilo irá habitar as células de Schwann e a pele e iniciar os
processos patológicos da doença. Na forma indeterminada há o aparecimento
de poucas lesões hipocrômicas na pele com alteração de sensibilidade.
Geralmente, apenas a sensibilidade térmica está comprometida. Além disso,
não há acometimento dos troncos nervosos e a baciloscopia é negativa
(ARAÚJO, 2005; SUZUKI et al., 2012).
1.5.2. Forma tuberculóide
A forma indeterminada pode evoluir para a hanseníase tuberculóide (TT,
DT). Nesta forma encontram-se poucas lesões que são bem delimitadas e de
distribuição assimétrica. Pode haver apenas o envolvimento nervoso, “neural
pura”, com espessamento do tronco nervoso e dano neural grave. A
baciloscopia também é negativa como na forma indeterminada, constituindo o
grupo paucibacilar da hanseníase (ARAÚJO, 2005; LOCKWOOD, 2005;
RODRIGUES; LOCKWOOD, 2011).
22
1.5.3. Forma Virchowiana
A hanseníase virchowiana (DV, VV) está associada com várias lesões
de pele (>5) como pápulas, nódulos, máculas. Com a sua evolução, pode
haver infiltração progressiva da pele, da mucosa nasal com congestão nasal,
dos olhos, testículos, nervos, linfonodos, fígado e baço. A infiltração da face e
pavilhões auriculares caracteriza as “faces leoninas” característica dessa forma
da doença. O acometimento nervoso pode causar deficiências funcionais e
sequelas tardias (CHIMENOS KÜSTNER et al., 2006). A baciloscopia mostra-
se fortemente positiva, um sinal de alerta para o início do tratamento o quanto
antes, no intuito de anular o foco de transmissão, que é devido principalmente
a essa forma clínica.
1.5.4. Forma dimorfa e Surtos reacionais
A forma dimorfa é caracterizada por uma instabilidade imunológica,
apresentando atividade tanto da imunidade celular como da humoral. Isso
reflete em variações nas suas manifestações clínicas, observadas na pele, nos
nervos e a nível sistêmico (ARAÚJO, 2005). As manifestações clínicas podem
caminhar do pólo tubérculóide para o pólo virchowiano e vice-versa.
Portanto, o curso clínico da hanseníase irá depender principalmente da
resposta imunológica do paciente. Além disso, podem haver surtos agudos de
reações denominadas reação reversa ou do tipo 1 e a reação eritema nodoso
ou do tipo 2. Estas podem ocorrer espontaneamente ou serem induzidas por:
infecções (virais, bacterianas, fúngicas), parasitose, estresse físico ou mental,
puberdade, gravidez, parto, intervenções cirúrgicas, tratamentos específicos ou
uso de outras drogas (progesterona, iodeto de potássio, vitamina A). Às vezes,
não se identifica o fator precipitante. Eles podem anteceder a doença, ocorrer
simultaneamente ou ainda após o término do tratamento específico (ARAÚJO,
2005).
23
1.6. Tratamento poliquimioterápico
Em 1997, a OMS implantou o esquema poliquimioterápico como
tratamento para a hanseníase, obtendo grande sucesso nas últimas três
décadas. Houve aumento da taxa de cura e diminuição da prevalência da
doença. Somado a isso, o esquema poliquimioterápico dificulta o surgimento de
resistência bacteriana aos antibióticos, evitando falha no tratamento
(RENAULT; ERNST, 2007).
As drogas padronizadas pela OMS para esse esquema são os
“medicamentos de primeira linha”: dapsona, rifampicina e clofazimina (“WHO
Expert Committee on Leprosy.,” 2012). Desde o início do tratamento, os
pacientes recebem os medicamentos nos centros de saúde de forma gratuita,
suficientes para 28 dias, e retornam depois para receberem a dose
supervisionada (por profissionais da saúde) e os medicamentos dos próximos
28 dias. O tratamento para os pacientes paucibacilares tem duração de 6
meses e incluem: dose diária de dapsona e dose supervisionada de
rifampicina. Nos pacientes multibacilares temos: dose diária de dapsona e
clofazimina, e dose supervisionada de rifampicina e clofazimina, com duração
de 12 meses.
Durante o período de tratamento, os pacientes também podem
apresentar surtos reacionais da doença e devem se dirigir ao centro de saúde
imediatamente. As drogas utilizadas para tratamento dessas reações são
analgésicos, talidomida, clofazimina, pentoxifilina e prednisona (ARAÚJO,
2005).
1.7. Alterações Renais na Hanseníase As doenças renais são um grande problema de saúde pública que
acomete aproximadamente 850 mil pacientes por ano em todo o mundo
(CONCEI; COSTA; LIMA, 2007; SCHIEPPATI; REMUZZI, 2005). O dano renal
pode ser causado por diversas causas, uma delas é devido a doenças
infecciosas (TESCH, 2010). Em pacientes com hanseníase, a insuficiência
renal crônica é uma importante causa de morte (SINGHAL et al., 1977).
24
Os primeiros relatos de acometimento renal na hanseníase aconteceram
em 1937 com MITSUDA & OGAWA, analisando 150 autópsias de pacientes
hansenianos (MITSUDA; OGAWA, 1937). Desde então, inúmeros estudos de
necropsias, biópsias foram feitos na tentativa de explicar a nefropatia na
hanseníase.
Kean & Childress (1942) analisaram 103 autópsias e encontraram
glomerulopatias, tubulopatias ou nefrosclerose em 54 casos. Outros autores
relataram alterações renais inespecíficas associadas à hanseníase, como
glomerulonefrites agudas e crônicas, nefrites intersticiais, amiloidose
secundária, pielonefrites (GROVER; BOBHATE; CHAUBEY, 1983; PETER et
al., 1981; SENGUPTA et al., 1983). Em um estudo com 199 autópsias de
hansenianos brasileiros, 144 deles apresentavam lesões renais inespecíficas,
como amiloidose, glomerulonefrite, nefrosclerose, nefrites tubulointersticiais e
outras lesões (NAKAYAMA et al., 2001).
A amiloidose, com incidência de 2 a 55% na hanseníase, é atribuída a
reações granulomatosas crônicas causadas pelo M.leprae, a qual se manifesta
por elevada proteinúria, podendo progredir para insuficiência renal crônica.
(OLIVEIRA et al., 2008).
Alterações renais específicas da hanseníase foram pouco descritas,
como a presença de granuloma epitelióide e do bacilo de Hansen no
parênquima renal (AHSAN; WHEELER; PALMER, 1995; NAKAYAMA et al.,
2001). Alguns autores acreditam que o tecido renal tenha uma certa resistência
ao M. leprae. Uma hipótese é de que a bactéria tenha pouca afinidade pelo
tecido renal ou ainda talvez pela pequena quantidade de elementos do sistema
fagocítico-mononuclear (PHADNIS et al., 1982).
A doença renal está mais relacionada com a forma multibacilar
(virchowiana) e estados reacionais tipo eritema nodoso, mas também pode
ocorrer em outras formas da doença e sem estado reacional (GELBER, 1986;
NAKAYAMA et al., 2001).
No estudo retrospectivo de DAHER et al., (2011), 923 pacientes
hansenianos foram selecionados no intuito de investigar alterações renais. Os
fatores mais associados com a disfunção renal foram os episódios reacionais, a
forma multibacilar, maior tempo de doença e a idade avançada.
25
1.7.1. Glomerulonefrites
As glomerulonefrites parecem ser os tipos mais comuns de nefropatias
na hanseníase (AHSAN; WHEELER; PALMER, 1995; CHUGH et al., 1983;
DAHER et al., 2011; NAKAYAMA et al., 2001; SHUTTLEWORTH et al., 1956).
O mecanismo exato que leva ao desenvolvimento da glomerulopatia não está
completamente esclarecido. O M. leprae não parece estar diretamente
envolvido, embora ele já tenha sido encontrado em glomérulos de alguns
pacientes (AHSAN; WHEELER; PALMER, 1995).
A incidência da glomerulonefrite varia de 6% a 63%, dependendo da
forma de hanseníase, de episódios reacionais e material avaliado, com média
de 22% (DATE et al., 1977; NAKAYAMA et al., 1995)
NAKAYAMA et al., (1995) fez um levantamento de diversos trabalhos
com achados clínicos, laboratoriais e morfológicos das lesões renais na
hanseníase. Em estudos de autópsias foram observados 11% de
glomerulonefrites e em biópsias 31,3%. Entre pacientes virchowianos a
frequência de glomerulonefrites foi de 24,7% e entre os não-virchowianos de
12,3%. Dos pacientes com história de reação hansênica, 27% apresentaram
glomerulonefrites. Além disso, as manifestações clínicas mais frequentes
caracterizavam consequências da agressão glomerular: diminuição da
depuração de creatinina (84,3%), proteinúria (46,3%), cilindrúria (25,3%) e
hematúria (22%). Esses achados clínicos foram observados em todas as
formas da hanseníase, principalmente nos pacientes em estados reacionais.
No estudo de DAHER et al., (2011) os pacientes multibacilares tiveram
elevada frequência de disfunção glomerular quando comparados com os
paucibacilares. Nos multibacilares houve hematúria (13,5%), proteinúria
(18,7%), cilindruria (6,8%).
OLIVEIRA et al.,(2008) estudou a função renal de 59 pacientes com
hanseníase através da avaliação clínica, laboratorial e testes de função renal.
Nesse estudo, 50% dos pacientes, principalmente os multibacilares,
apresentaram diminuição da taxa de filtração glomerular (≤80mL/min/1,73m2)
quando comparados com o grupo controle. Além disso foi observado
proteinúria em dois pacientes e microalbuminúria em 4 (8,4%).
26
Na hanseníase, praticamente todos os tipos de glomerulonefrite já foram
descritos em estudos por biópsia renal e autópsias (DATE, 1982; CHUGH,
1986; SCHUTTIEWORTH et al., 1956; CHUGH et al., 1983; AHSAN et al.,
1995; NAKAYAMA et al., 1995; NAKAYAMA et al., 2001).
A glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP) é a forma histológica
mais observada em pacientes com hanseníase, principalmente na forma
virchowiana (BEDI et al., 1977; DA SILVA JÚNIOR; DAHER, 2006; DAHER et
al., 2011; NAKAYAMA et al., 1995; NG; SCOLLARD; HUA, 1981). Johny et al.,
(1975) realizaram biópsia renal em 35 pacientes com hanseníase e
identificaram alterações histológicas em 45% delas, sendo a mais frequente a
GNMP. Grupta et al, (1981) submeteram 21 pacientes com a forma virchowiana
à biópsia renal, encontrando GNMP em 13 deles. Phadnis et al., (1982)
realizaram 50 biópsias renais e identificaram glomerulopatia membranosa em 2
casos e GN membranoproliferativa em 6 casos. Destes, 45 pacientes tinham a
forma virchowiana e estavam em reação hansênica.
Morfologicamente, a GNMP é caracterizada pela presença de
hipercelularidade com expansão da matriz mesangial, espessamento das
paredes dos capilares e duplicação da membrana basal glomerular decorrente
da presença de depósitos imunes (WALKER, 2007; ALCHI; JAYNE, 2010). A
patogenia da GNMP ainda não é completamente entendida. Ela está
comumente associada a doenças infecciosas e a ativação do sistema
complemento, com hipocomplementemia devido à queda de C3, e também a
deposição renal de imunocomplexos circulantes (ALCHI; JAYNE, 2010; SETHI;
FERVENZA, 2011).
A maior parte das glomerulonefrites é mediada pelo sistema imune,
principalmente devido à deposição de imunocomplexos que podem ativar o
sistema complemento, levando ao aumento da permeabilidade glomerular e
consequentes alterações clínicas e laboratoriais (RIELLA, 2012).
Estudos tem mostrado a contribuição da imunidade inata na geração de
anticorpos que são depositados como imunocomplexos no glomérulo, levando
a respostas inflamatórias locais (SMITH; ALPERS, 2005). O imunocomplexo
ativa a via clássica do complemento, levando a geração de fatores
quimiotáticos que atraem plaquetas e leucócitos para o local. Os leucócitos
liberam oxidantes e proteases que causam danos nas paredes dos capilares
27
glomerulares que pode causar proteinúria, hematúria e queda na taxa de
filtração glomerular, os quais são achados laboratoriais observados na GNMP
(ALCHI; JAYNE, 2010; RIELLA, 2012).
1.7.2. Nefropatias Tubulointersticiais
O papel da imunidade celular na produção de inflamação e lesão
intersticial primária ou secundária a eventos glomerulares tem apresentado
grande importância na etiologia da lesão tubulointersticial. As agressões
infecciosas ao interstício estão associadas a processos imunológicos com
infiltrado mononuclear e produção de citocinas e outros mediadores
inflamatórios que amplificam a inflamação (RIELLA, 2012).
A nefrite intersticial é um dos achados histológicos mais comuns em
pacientes com hanseníase (DATE et al., 1977; GUPTA et al., 1981; MITTAL;
MAHESHWARI; KUMAR, 1972). A sua frequência é variável de até 25%, com
média de 11,8% (NAKAYAMA et al., 1995). A maioria dos casos de nefrite
tubulointersticial ocorrem na forma virchowiana, mas há relatos dessas
alterações em pacientes na forma tuberculóide (PHADIS et al., 1982; GROVER
et al., 1983; NIGAM et al., 1986).
OLIVEIRA et al.,(2008) encontraram diversas alterações renais
características de nefropatias tubulointersticiais em pacientes sob tratamento
para hanseníase. Foram observados que 30% dos pacientes apresentavam
defeitos de acidificação urinária, 84% tinham defeitos na concentração urinária
e houve valores significantemente maiores da fração de excreção de potássio
nos grupos multibacilares e paucibacilares quando comparados com o grupo
controle. Outros dados que podem estar relacionados com alterações
tubulointersticiais são a hematúria em 27%, leucocitúria em 22%, proteinúria
observada em dois dos 59 pacientes estudados, e microalbuminúria presente
em 8,5% dos pacientes.
A patogênese da nefrite tubulointersticial na hanseníase é pouco
estudada. Provavelmente, pode estar relacionada com a interação com drogas
utilizadas no tratamento da hanseníase e por depósitos de imunocomplexos.
Contudo, novos estudos são necessários para obtenção de resultados mais
28
concretos a respeito dessas nefropatias e sua relação com a hanseníase
(NAKAYAMA et al., 1995; RIELLA, 2012).
Para tentar explicar e caracterizar a patogênese das nefropatias nas
diferentes formas clínicas da hanseníase, foram investigados diversos
biomarcadores renais em pacientes sem a influência do tratamento com
multidrogas.
1.8. Biomarcadores Renais
A doença renal na hanseníase é frequentemente diagnosticada apenas
quando está completamente estabelecida, com evidentes sinais clínicos,
sintomas ou alterações laboratoriais (KIRSZTAJN et al., 1993). Daí a
importância da descoberta de marcadores renais mais específicos para o
diagnóstico precoce de alterações renais, possibilitando intervenções
terapêuticas antes da evolução da doença renal (URBSCHAT; OBERMÜLLER;
HAFERKAMP, 2011).
Biomarcadores podem fornecer valiosas informações sobre o estado
fisiopatológico do local de origem, contribuindo para o desenvolvimento de
medicamento, estratégias de manejo terapêutico, e descoberta de mecanismos
fisiopatológicos. Exemplos de biomarcadores são: proteínas, lipídeos, padrões
genômicos, determinações de imagem, sinais elétricos e células presentes na
urina (SABBISETTI; BONVENTRE, 2012).
Em indivíduos sadios, aproximadamente 70% do proteoma urinário é
originado do trato urinário e do rim. Desse modo, a urina é uma valiosa fonte de
biomarcadores para diversas doenças renais (KIM; TAM, 2011). Um marcador
ideal para as doenças renais deve ser específico para cada porção do néfron,
permitindo a diferenciação das causas de Lesão Renal Aguda (LRA), bem
como de lesão glomerular aguda, correlacionando-se a achados histológicos
em biópsias renais. Além disso, devem ter a capacidade de identificar as
causas da LRA de forma precoce e predizer as futuras complicações através
de métodos rápidos, fáceis, confiáveis, de baixo custo e não invasivos (coleta
de urina) (SABBISETTI; BONVENTRE, 2012; TESCH, 2010).
29
Os métodos clássicos para avaliar e monitorar a função renal e várias
doenças renais envolvem a medida de uréia e creatinina sérica, a uroanálise e
a medição do volume urinário. Esses biomarcadores tradicionais não são
sensíveis o bastante para predizer precocemente o desenvolvimento de uma
doença renal, sendo reconhecidos como marcadores de disfunção renal, em
vez de marcadores diretos de lesão renal (MCCULLOUGH et al., 2013;
SABBISETTI; BONVENTRE, 2012; TESCH, 2010; VAIDYA; FERGUSON;
BONVENTRE, 2008).
A procura de biomarcadores sensíveis capazes de detectar
precocemente a lesão renal antes do desenvolvimento de LRA tem sido um
grande desafio para os pesquisadores (MCCULLOUGH et al., 2013).
Recentemente, novos biomarcadores têm sido bastante estudados para
preencher essas lacunas. Os novos biomarcadores são agrupados conforme
sua associação com o tipo de lesão em particular como: marcadores de lesão
glomerular e lesão tubular, ou de acordo com o mecanismo de dano renal:
estresse oxidativo, inflamação e fibrose renal (SABBISETTI; BONVENTRE,
2012; TESCH, 2010).
Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), Kidney Injury
Molecule-1 (KIM-1), Interleucina-18 (IL-18), N-Acetyl-β-D-glucosaminidase
(NAG), Plasma Asymmetric Dimethylarginine (ADMA) e Monocyte chemotactic
peptide-1 (MCP-1) são novos biomarcadores que mostraram bastante utilidade
nas doenças renais (BAGSHAW; BELLOMO, 2007; DEVARAJAN, 2010; KIM;
TAM, 2011; MCCULLOUGH et al., 2013; SABBISETTI; BONVENTRE, 2012;
TESCH, 2010; VAIDYA; FERGUSON; BONVENTRE, 2008).
No presente estudo foi analisada a excreção da proteína MCP-1 na
urina. Essa quimiocina é um importante mediador produzido por células renais
em diversas nefropatias (KIM; TAM, 2011), que ainda não havia sido estudado
na hanseníase.
1.9. Proteína Quimiotática de Monócitos – 1 (MCP-1)
Quimiocinas (citocinas quimiotáticas) são uma família de pequenas
proteínas (5 – 20 KDa), apresentando estruturas homólogas, de 20 a 70%, na
30
sequência de aminoácidos, caracterizada pela presença de quatro resíduos de
cisteína conservados na porção amino terminal (VAN COILLIE; VAN DAMME;
OPDENAKKER, 1999). Quimiocinas atuam na resposta inflamatória através da
ativação de receptores acoplados a proteína G, induzindo o recrutamento de
populações de leucócitos para o local da inflamação, a degranulação e
liberação de outros mediadores inflamatórios pelas células efetoras (HYDUK et
al., 2007). Já foram identificados mais de 50 quimiocinas e 20 receptores
acoplados a proteína G (BAGGIOLINI; LOETSCHER, 2000).
MCP-1, cujo receptor é o CCL2, é um membro da família de quimiocinas
CC e pertence ao grupo das quimiocinas inflamatórias (NAVRATILOVA, 2006).
Ela foi a primeira quimiocina CC humana a ser descoberta, sendo uma das
quimiocinas mais estudadas dessa família (KIM; TAM, 2011). MCP-1 é formado
por 76 aminoácidos e contém quatro resíduos de cisteína, com uma
configuração semelhante de outras quimiocinas CC (KIM; TAM, 2011).
Grandes quantidades de MCP-1 podem ser encontradas em células
endoteliais, fibroblastos e células mononucleares. Muitas células do tecido
renal também produzem MCP-1, como as células epiteliais tubulares, células
mesangiais, células endoteliais e podócitos (KIM; TAM, 2011). A regulação da
expressão de MCP-1 na célula é devido a indutores que alteram o nível de
transcrição do gene para o MCP-1 humano, localizado no cromossomo 17, na
região 17q11,2-q12 (LUBKOWSKI et al., 1997).
A função biológica do MCP-1 é mediada pela ligação a receptores de
quimiocinas CC (CCL2), acoplados a proteína G, na superfície da célula alvo.
MCP-1 é considerada a quimiocina mais potente para monócitos, mas também
atua em células T de memória, células dendríticas, natural killer e basófilos,
desempenhando importante papel em diversas condições fisiopatológicas em
diversos órgãos (DESHMANE et al., 2009; GU; TSENG; ROLLINS, 1999;
MELGAREJO et al., 2009). Assim como as outras quimiocinas, MCP-1 tem
outros efeitos em células alvo, estimulando a liberação de enzimas, citocinas
pró-inflamatórias e expressão de moléculas de adesão, como ICAM-1. Outra
ação celular importante é a ativação do fator nuclear-Κb, fator de transcrição
comumente envolvido na resposta imune e inflamatória (RUIZ-ORTEGA;
LORENZO; EGIDO, 2000; VIEDT; ORTH, 2002). Além disso, MCP-1 pode
31
atuar sobre as atividades dos macrófagos na fibrose através de mecanismos
diretos e indiretos (TESCH, 2008).
1.9.1. MCP-1 e Doenças Renais
A detecção de MCP-1 no tecido renal normal e em várias doenças renais
teve início em 1995 (PRODJOSUDJADI et al., 1995). Desde então, a detecção
de MCP-1 em tecidos renais e em amostras de urina tem sido estudado e
associado com diversas doenças renais, como: nefropatia diabética (TESCH,
2008), nefrite lúpica (ZOJA et al., 1997), nefropatia por IgA (STANGOU et al.,
2009), glomerulonefrite crescêntica (VIEDT; ORTH, 2002), e a glomerulonefrite
membranoproliferativa (GRANDALIANO et al., 1997; ROVIN; DOE; TAN,
1996).
Estudos com nefropatia diabética experimental e em humanos mostram
que a acumulação de macrófagos no rim está associada com o
desenvolvimento de lesão renal, fibrose e declínio da função renal, sugerindo
uma doença renal mediada por mecanismos infalamatórios (TESCH, 2008). A
produção de MCP-1 está aumentada no tecido renal de pacientes com
nefropatia diabética, particularmente devido aos podócitos e células tubulares,
em resposta a elevados níveis de glicose e aos produtos finais da glicolisação
(BURT et al., 2007; GU et al., 2006; TARABRA et al., 2009).
Elevados níveis de MCP-1 na urina também foi relatado em pacientes
com nefrite lúpica, caracterizando sua expressão no tecido renal (NORIS et al.,
1995). Estudos mostram níveis mais elevados de MCP-1 urinário na nefrite
lúpica ativa quando comparados a níveis de pacientes sem nefrite e indivíduos
sadios (MARKS et al., 2010; ROVIN et al., 2005). Com isso, a medida do MCP-
1 urinário mostra grande potencial no diagnóstico de doença renal ativa e em
distinguir pacientes com doença ativa de pacientes em remissão.
Estudos com pacientes apresentando doenças renais associadas com a
inflamação glomerular mostram elevadas concentrações de MCP-1 na urina
quando comparados ao grupo controle (KIM; TAM, 2011). Rovin et al., (1996)
quantificaram o MCP-1 urinário em pacientes com diversos tipos de lesão
glomerular e correlacionaram com níveis séricos de MCP-1 e parâmetros
clínicos de função renal. Eles observaram que os níveis de MCP-1 urinário foi
32
seis vezes maior na lesão glomerular ativa (crescente, necrose e proliferação
endocapilar) do que em lesões glomerulares menos ativas (expansão e
proliferação mesangial, esclerose segmentar). Não houve correlação entre o
MCP-1 urinário e sérico, sugerindo que o MCP-1 urinário é resultado de uma
produção local de MCP-1 pelo rim em vez de ser produto da filtração de MCP-1
sérico (SABBISETTI; BONVENTRE, 2012).
Gesualdo et al., (1997) estudaram a expressão gênica da proteína do
MCP-1 em pacientes com glomerulonefrite membranoproliferativa secundária a
crioglobulinemia mista, uma doença vascular rara, onde há lesão e inflamação
dos vasos sanguíneos. Eles observaram um aumento da expressão gênica na
região túbulo-intersticial e no glomérulo lesados, apresentando significante
correlação com o infiltrado de macrófagos. Aumento nos níveis de MCP-1
urinário também foi encontrado, sugerindo que o MCP-1 desempenha um
importante papel na modulação do processo inflamatório nessa patologia.
Outra doença renal associada ao MCP-1 urinário é a nefropatia por IgA.
Stangou et al., (2009) observaram que os pacientes com essa nefropatia
apresentaram níveis mais elevados de MCP-1 urinário quando comparados a
indivíduos sadios. O aumento do MCP-1 urinário acompanhava a severidade
das alterações histológicas e correlacionava-se com o grau de lesão
tubulointersticial e infiltração de monócitos no interstício. Esses resultados
mostram a grande utilidade do MCP-1 quanto à informação da gravidade das
lesões tubulintersticiais na nefropatia por IgA.
A glomerulonefrite crescêntica também parece estar relacionada com o
envolvimento tubulointersticial (VIEDT; ORTH, 2002). Estudos mostram a
presença de MCP-1 no glomérulo e, sobretudo em lesões tubuintersticiais com
correlação ao infiltrado de macrófagos (COCKWELL et al., 1998; SEGERER et
al., 2000). Outros estudos mostram que os níveis de MCP-1 urinário de
pacientes com glomerulonefrite crescêntica foi significantemente maior quando
comparado a outras doenças renais (TAM et al., 2004; WADA et al., 1999).
Além de glomerulopatias, também já foi mostrado o aumento da
expressão gênica da proteína de MCP-1 em biópsias renais de pacientes
submetidos a transplante renal, os quais apresentavam rejeição celular aguda
(GRANDALIANO et al., 1997). Além disso, foi observado nesses pacientes
correlação entre o aumento do MCP-1 urinário e sua expressão tissular. Nos
33
pacientes que respondiam ao tratamento anti-rejeição com corticosteróides, os
níveis de MCP-1 urinário tiveram redução significativa, sugerindo que o MCP-1
urinário pode ser um marcador precoce útil para detectar uma resposta do
paciente ao tratamento anti-rejeição na rejeição aguda (GRANDALIANO et al.,
1997).
Como mostrado, MCP-1 desempenha um papel importante na
patogênese da progressão da lesão renal. Quase todas as células renais
intrínsecas são capazes de produzir MCP-1: células endoteliais, células do
músculo liso vascular, células mesangiais, tubulares epiteliais e podócitos (KIM;
TAM, 2011). Além disso, células mononucleares e inflamatórias, que invadem o
tecido renal atraídas pelo MCP-1, também contribuem para essa produção que
pode ser excretada na urina (WADA et al., 2000).
A produção local de MCP-1 por essas células é uma resposta a
estímulos de agentes indutores, os principais são a IL-1β, TNF-α e IFN-γ.
Outras citocinas, como IL-4 e TNF-β, produtos exógenos, LPS, vírus e
imunocomplexos também podem ser potentes indutores (HORA et al., 1992;
KIM; TAM, 2011).
Todas as evidências clínicas e modelos experimentais demonstraram
que o MCP-1 desempenha funções críticas no desenvolvimento de doenças
renais (AMANN; TINZMANN; ANGELKORT, 2003; WADA et al., 2000). A
investigação da patogênese que envolve o MCP-1 nas doenças renais é
importante para caracterizar e explicar mecanismos de lesão renal.
1.9.2. MCP-1 e Hanseníase
A expressão de quimiocinas tem sido associada com doenças
inflamatórias crônicas, como a hanseníase, tuberculose, leishmaniose cutânea
e psoríase (GELUK et al., 2012; HASAN et al., 2006; KIRKALDY et al., 2003).
Na hanseníase, a ativação diferencial de quimiocinas pode ser crítica para a
disseminação da infecção (HASAN et al., 2006).
Estudos mostram que quimiocinas CC tem um importante papel no
controle da infecção pelo Mycobacterium leprae através do recrutamento de
macrófagos, células dendríticas, linfócitos T e formação de granuloma,
34
principalmente nas formas paucibacilares, onde a resposta imune celular é
eficaz (ROACH et al., 2002; KIRKALDY et al., 2003; GELUK et al., 2012).
As quimiocinas CC estão comumente envolvidas com a infiltração
leucocitária nas lesões cutâneas de várias formas da hanseníase. Elevada
expressão de MCP-1 foi detectada em lesões na pele de pacientes com a
forma dimorfa-tuberculóide em reação reversa, apresentando granulomas,
quando comparado a mesma forma sem reação (KIRKALDY et al., 2003).
Geluk et al., (2012) estimularam células sanguíneas de pessoas em
diversas áreas endêmicas, incluindo Bom Jardim em Fortaleza, com 17
antígenos do M.leprae, no intuito de buscar novos biomarcadores para o
diagnóstico da hanseníase. Foi feita a coleta de sangue de pacientes com a
forma paucibacilar, de indivíduos sadios e de pessoas que moravam com
doentes na forma multibacilar e transmissível da doença. O sangue coletado foi
estimulado com os antígenos, e depois houve a avaliação da expressão de
várias citocinas e quimiocinas. MCP-1 estava significantemente aumentado nos
pacientes paucibacilares quando comparado aos outros grupos, mostrando a
importância do MCP-1 no controle da disseminação da bactéria e consequente
aumento da carga bacilar. Nesse mesmo estudo, níveis mais elevados de IL-
1β, um potente agente indutor da produção e expressão de MCP-1 (KIM; TAM,
2011), foram observados nos pacientes paucibacilares quando comparados ao
grupo controle.
Hasan et al., (2006) também caracterizaram a relação do MCP-1 com a
disseminação do M. leprae. Eles observaram níveis sistêmicos de quimiocinas
CC através da medida de CCL2, ligante para MCP-1, no soro de pacientes com
a forma virchowiana. Houve níveis aumentados de CCL2 no soro dos
pacientes, sugerindo que o aumento da carga bacilar e de antígenos, livres ou
na forma de imunocomplexos, podem ter estimulado outros tecidos e órgãos,
resultando no aumento da resposta inata e de mecanismos inflamatórios nos
pacientes virchowianos.
Diversos estudos com outras doenças inflamatórias mostram que há
uma falta de correlação entre o MCP-1 sérico e urinário, sugerindo uma
produção ativa de MCP-1 no ambiente renal (SABBISETTI; BONVENTRE,
2012). Somado a isso, não há estudos que investigaram o MCP-1 urinário em
pacientes com hanseníase. Sabe-se que as glomerulopatias se destacam entre
35
as alterações renais observadas na hanseníase (DAHER et al., 2011) e que
muitos estudos mostram níveis elevados de MCP-1 urinário em diversos tipos
de glomerulopatias, principalmente associadas com a inflamação glomerular
(KIM; TAM, 2011).
No presente estudo, a quantificação do MCP-1 urinário em pacientes
com hanseníase nas suas diferentes formas clínicas e sem a influência do
tratamento é importante para a investigação de possíveis mecanismos
inflamatórios no ambiente renal que podem estar causando alterações renais
significativas. Além disso, a avaliação do MCP-1 urinário é um procedimento
não invasivo com grande potencial como biomarcador precoce para detectar a
progressão da doença renal (KIM; TAM, 2011).
36
Objetivos
37
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar a relação entre marcadores tradicionais de função renal, a
Proteína Quimiotática de Monócitos-1 (MCP-1) urinária e o estresse oxidativo
urinário em pacientes com hanseníase.
2.2 Objetivos Específicos
- Investigar disfunção renal em pacientes nas diferentes formas clínicas da
hanseníase, utilizando marcadores tradicionais de função renal e o MCP-1
urinário;
- Avaliar o papel da proteína MCP-1 como novo biomarcador para a detecção
de alterações renais subclínicas na hanseníase;
- Investigar se a forma clínica da doença está associada com o
desenvolvimento de alterações renais;
- Verificar níveis de estresse oxidativo urinário nas formas clínicas da
hanseníase através da quantificação do malondealdeído (MDA) urinário;
- Verificar níveis de MCP-1 urinário e sua correlação com marcadores
tradicionais de função renal e o estresse oxidativo urinário nos grupos de
estudo.
38
Metodologia
39
3. METODOLOGIA
3.1. Tipo de Estudo
Estudo transversal, prospectivo, de pacientes com hanseníase em todas
as formas clínicas e antes do início do tratamento.
3.2. Caracterização do local de estudo
Foram estudados pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de
hanseníase acompanhados no ambulatório de Dermatologia do Hospital
Universitário Walter Cantídio da Universidade Federal do Ceará, e no Centro
de Dermatologia Dona Libânia no Centro de Fortaleza, Ceará, Brasil.
3.3. Critérios de Inclusão e Exclusão
Foram incluídos:
§ Pacientes de ambos os sexos;
§ Com diagnóstico confirmado de hanseníase atendidos nos locais de
estudo;
§ Idade entre 18 e 60 anos;
§ Pacientes que ainda não iniciaram o tratamento para a hanseníase;
§ Os que concordaram assinar o termo de consentimento livre e
esclarecido após esclarecimento adequado em relação aos
procedimentos e a pesquisa.
40
Foram excluídos:
§ Pacientes com diagnóstico de diabete melito tipo 1 e tipo 2, hipertensão
arterial sistêmica, insuficiência cardíaca congestiva, nefrolitíase, doença
renal crônica prévia, lupus eritematoso sistêmico e infecção do trato
urinário;
§ Uso de drogas nefrotóxicas, inclusive as utilizadas no tratamento
específico da doença;
§ Pacientes em estado reacional.
3.4. Diagnóstico da hanseníase
O diagnóstico da hanseníase foi realizado através de dados clínicos e
quando pelo menos um dos seguintes sinais cardinais foi detectado (WHO
Expert Committee on Leprosy., 2012):
• Placas hipopigmentadas ou eritematosas com perda da sensibilidade;
• Acometimento de nervos periféricos com ou sem espessamento
associado a alterações sensitivas ou motoras;
• Identificação do BAAR na linfa ou em biópsias de pele.
Os pacientes foram classificados segundo a classificação operacional da
OMS de 1997 em paucibacilares e multibacilares, e de acordo com a
classificação proposta por Ridley e Jopling, em 1966 (RIDLEY; JOPLING,
1966), onde são descritos a forma tuberculóide (TT), dimorfa-tuberculóide (DT),
dimorfa-dimorfa (DD), dimorfa-virchowiano (DV) e virchowiano (VV). Foi
realizado exame histopatológico da lesão nos casos de dúvidas na
classificação.
41
3.5. População de estudo
Foram entrevistados 67 pacientes com diagnóstico de hanseníase,
sendo que 23 pacientes foram excluídos de acordo com os critérios já citados.
Ao todo, 44 pacientes foram incluídos para a coleta de material biológico,
sendo 14 paucibacilares e 30 multibacilares (Figura 3). Após esclarecimento
adequado a respeito dos objetivos do estudo, os pacientes foram submetidos a
uma anamnese e exame físico no primeiro contato em caráter ambulatorial.
O grupo de estudo foi comparado com um grupo controle composto por
15 indivíduos sadios sem histórico familiar de hanseníase, com faixa etária
semelhante a dos pacientes.
Figura 3. População de estudo.
3.6. Coleta do material biológico
Após o diagnóstico, foi coletado 3 mL de sangue, por punção venosa,
utilizando tubos BD SST® II Advance® com ativador de coágulo, que acelera o
42
processo de coagulação, e gel separador para a obtenção de soro após a
centrifugação. As amostras de soro foram identificadas, aliquotadas e uma
parte congelada em freezer a -80°C. A urina foi coletada em frasco coletor
estéril e processada conforme feito com as amostras de soro. Os pacientes
estavam com pelo menos 4 horas de jejum antes da coleta do material.
3.7. Parâmetros estudados
3.7.1 Características clínicas:
a) Identificação: Nome, idade, gênero, cor, profissão, naturalidade, procedência;
b) Exame físico: Pressão arterial sistólica e diastólica, peso, estatura e índice
de massa corporal (IMC);
c) Forma clínica da Hanseníase: Pólo Paucibacilar (TT, BT) e pólo
Multibacilar (BV, VV);
d) Tempo de doença: Tempo decorrido entre o primeiro sintoma e o
diagnóstico;
e) Número de lesões cutâneas;
f) Troncos nervosos acometidos;
g) Baciloscopia.
3.7.2 Avaliação da função renal
Para avaliar a função glomerular, a taxa de filtração glomerular foi
estimada usando a equação de Cockcroft-Gault (COCKCROFT; GAULT, 1976)
e a creatinina sérica (SCr). Foi mensurada a proteinúria e a microalbuminúria,
normalizando os valores pela creatinina urinária em (mg/g-Creatinina).
43
A função tubular renal foi avaliada através da fração de excreção urinária
dos eletrólitos: sódio (FENa+),potássio (FEK+), cloreto (FECl-), magnésio (FEMg2+),
cálcio (FECa2+), fósforo (FEPO4-).
a) Taxa de filtração glomerular estimada (TFGE):
• Equação de Cockcroft-Gault:
- TFGE= (140 - idade) x Peso (Kg) x 0,85 (sexo feminino) 72 x SCr
• SCr= Creatinina sérica
b) Fração de excreção urinária dos eletrólitos:
- FE (%)= (EU x SCr) x 100 (UCr x ES) • EU=eletrólito urinário • ES=eletrólito sérico • UCr=creatinina urinária • SCr= creatinina sérica
3.7.3. Parâmetros de disfunção renal
• Taxa de filtração glomerular abaixo de 60mL/min/1.73m2;
• Fração de excreção de sódio > 1,6%;
• Fração de excreção de potássio > 15%;
• Proteinúria > 150mg/g-Creatinina;
• Microalbuminúria > 30mg/g-Creatinina;
3.8. Métodos analíticos
44
- Creatinina plasmática e urinária: Determinada pelo método
colorimétrico, ácido pícrico, de Taussky e Bonsness (Labtest®). Os
resultados foram expressos em mg/dL.
- Proteinúria: Determinada pelo método colorimétrico do biureto
(Labtest®). Os resultados foram normalizados pela creatinina urinária.
- Proteína-C reativa (PCR) e microalbuminúria: Determinados pelo
método de imunoturbidimetria automatizado (Cobas C 111, Roche®).
- Sódio, Potássio, cloreto (Na+, K+ e Cl-) plasmático e urinário: Foram
quantificados utilizando o eletrodo íon seletivo (AVL 9180, Roche®). Os
resultados foram expressos em mEq/L.
- Uréia urinária e plasmática: Determinada pelo método de uricase
colorimétrico (Labtest®). Os resultados foram expressos em mg/dL.
- Albumina: Determinada pela reação do verde de bromocresol (labtest®).
Os resultados foram expressos em g/dL.
- Glicose: Determinada pelo método colorimétrico glicose oxidase
(Labtest®). Os resultados foram expressos em mg/dL.
- Ácido úrico, magnésio, cálcio, fósforo (Mg2+, Ca2+, PO4-) plasmático e urinário: Determinados por métodos colorimétricos (labtest®).
- Quantificação do Malonaldeído (MDA) urinário
45
O método empregado para determinação do MDA em amostras
biológicas foi baseado na sua reação com ácido tiobarbitúrico (TBARS). Nesta
reação, duas moléculas de TBARS reagem estequiometricamente com uma
molécula de MDA para formar um cromóforo róseo que tem absorbância
máxima em solução ácida 535 a 560 nm (DRAPER; HADLEY, 1990).
Foi retirado 125µL das amostras de urina e incubadas em banho-maria a
37°C por 1 hora. Depois, adicionou-se 200µL de ácido perclórico (35%) a
todas as amostras para precipitar as proteínas. As amostras foram então
centrifugadas a 14000 rpm por 20 minutos. Depois foi retirado 100µL do
sobrenadante e adicionado a 100µL de acido tiobarbitúrico (0,6%) em tubos de
vidro que foram posteriormente incubados em banho-maria a 90 – 100°C por
30 minutos. Após resfriada, a absorbância foi medida em um leitor de
microplacas a 560 nm (Figura 4).
Figura 4. Quantificação do Malonaldeído (MDA) urinário.
46
- Quantificação da Proteína Quimiotática de Monócitos-1 (MCP-1) urinário
O MCP-1 urinário foi quantificado através da técnica do ELISA (Enzyme-
linked immuno sorbent assay) sanduíche utilizando o kit da empresa Boster
Biological Technology (Fremont, CA, USA). A técnica do ELISA sanduíche se
baseia na quantificação do antígeno (MCP-1 urinário) através de sua ligação
com anticorpos anti-MCP-1 adsorvidos na placa de 96 poços (placa
sensibilizada e fornecida pelo fabricante). Foram seguidos os procedimentos de
acordo com as normas do fabricante. Para a leitura colorimétrica foi utilizado
espectrofotômetro com comprimento de onda de 450 nm. Os resultados do
MCP-1 urinário foram normalizados pela creatinina urinária da mesma amostra
e expressos em “mg/g-Creatinina”.
3.9. Análise estatística
Os dados obtidos dos pacientes foram digitados em planilha no
programa Microsoft Excel 2003. Os resultados foram expressos em tabelas e
médias (média±DP) no caso de variáveis quantitativas.
As análises foram realizadas por meio do programa SPSS para Windows
versão 10.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Os grupos foram comparados
usando o teste t-Student e Fisher, e por meio da análise ANOVA com pós-teste
de Bonferroni. As correlações foram realizadas utilizando o coeficiente de
correlação de Pearson. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente
significantes.
3.10. Comitê de ética
O protocolo desse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Universitário Walter Cantídio da Universidade Federal do
Ceará (No: 267.426).
47
Resultados
48
4. RESULTADOS 4.1. Características clínicas e epidemiológicas da população estudada Foram incluídos no estudo um total de 44 pacientes com diagnóstico
confirmado de hanseníase. A média de idade foi de 36±10,7 anos, sendo 27 do
gênero masculino (63,6%) e 17 (36,4%) do gênero feminino. Não houve
diferença significativa em relação a idade, sexo, peso corporal e pressão
arterial comparado ao grupo controle (Tabela 1).
Tabela 1. Características gerais dos pacientes com hanseníase e do grupo controle.
Parâmetros Hanseníase (n=44)
Controle (n=15) P
Idade (anos) 36±10,7 34±9,8 0,50
Gênero
Masculino
Feminino
27
17
5
10
0,07
PAS, mmHg 119±10 119±4,7 1,0
PAD, mmHg 77±7,0 77±4,2 1,0
Peso corporal, Kg 66±11 70±12 0.23
PAS – Pressão arterial sistólica; PAD – Pressão arterial diastólica. Dados expressos como média ± desvio-padrão ou números absolutos e porcentagens. Significativo P < 0,05 vs. controle pelo teste t de Student e Fisher.
Quanto à classificação da hanseníase segundo a OMS, 30 pacientes
(68%) eram multibacilares e 14 pacientes (32%) eram paucibacilares. De
acordo com a classificação de Ridley e Jopling, 14 pacientes (31,8%) eram TT/
DT, 19 pacientes (43,2%) eram DD e 11 pacientes (25%) eram DV/VV. O
tempo de doença variou de um mês a 8 anos com média de 17 meses. A
baciloscopia foi positiva em 26 casos (59,1%) e negativa em 18 (40,9%). Em
relação ao número de lesões cutâneas encontradas, 28 pacientes (63,6%)
apresentavam mais que cinco lesões (Tabela 2).
49
Tabela 2. Características clínicas dos pacientes com hanseníase atendidos em
centros de referência de Fortaleza- CE, de agosto de 2012 a agosto de 2013.
Parâmetros N=44 (100%)
Forma clínica (OMS):
Paucibacilar
Multibacilar
Ridley e Jopling:
TT / DT
DD
DV / VV
Tempo de Doença (meses)
Baciloscopia (+)
Número de lesões cutâneas:
> 5
≤ 5
14 (32%)
30 (68%)
14 (31,8%)
19 (43,2%)
11 (25%)
18±19
26 (59,1%)
28 (63,6%)
16 (36,4%)
TT - tuberculóide; DT – dimorfa-tuberculóide; DD – dimorfa-dimorfa; DV – dimorfa-virchowiana;
VV – virchowiana. Dados expressos como média ± desvio-padrão ou números absolutos e
porcentagens.
4.2. Avaliação laboratorial e dos parâmetros de função renal
Dos 44 pacientes, nenhum apresentou creatinina plasmática > 1,2mg/dL
e microalbuminúria > 30mg/g-creatinina. Apenas um teve a TFG abaixo de
60mL/min/1.73m2 e 3 pacientes tiveram fração de excreção de sódio e potássio
elevados. Portanto, os pacientes não apresentaram clinicamente doença renal.
Os valores dos parâmetros tradicionais de função renal foram
comparados entre os grupos (Tabela 3 e Tabela 4). Foram observados valores
elevados e significantes na proteinúria de pacientes do pólo virchowiano
(DV/VV) em relação ao pólo tuberculóide (TT/DT) e ao grupo controle.
50
Tabela 3. Comparação de parâmetros de função renal entre os pacientes
paucibacilares, multibacilares e o grupo controle.
Parâmetros Multibacilar (n=30)
Paucibacilar (n=14)
Controle (n=15)
SCr(mg/dL) 0,8±0,1 0,8±0,2 0,81±0,14
SUr(mg/dL) 21±6,7 22±5,5 26,1±3,9
TFGE mL/min/1.73m2 110±27 124±30 115±18
Proteinúria (mg/g-Cr)
102±62,5 88,2±83,5 62±37
Microalbuminúria
(mg/g-Cr)
4,7±3,7 4,3±3,9 2,0±1,2
SNa (mEq/L) 140±3,2 142±2,7 139±1,5
SK (mEq/L) 4,4±0,4 4,5±0,2 4,4±0,4
FENa (%) 0,7±0,5 0,7±0,4 0,5±0,3
FEK (%) 6,8±5,0 4,3±2,3 5,6±3,0
FECl (%) 1,2±0,8 1,0±0,6 0,9±0,5
FEMg (%) 1,9±1,3 1,8±1,7 1,3±0,6
FECa (%) 1,0±1,1 0,7±0,9 0,7±0,4
FEPO4 (%) 6,7±3,8 4,9±3,0 6,2±2,8
PCR 12,9±24,6 1,4±0,9 -‐-‐-‐
Glicemia 80±8,6 104±57 93±9,9
Albumina 3,5±0,5 3,6±0,3 3,9±0,5
Ácido Úrico 4,9±1,2 5,2±1,7 4,4±1,2
SCr – creatinina sérica, SUr – ureia sérica, TFGE – taxa de filtração glomerular estimada, FENa –
fração de excreção de sódio, SNa – sódio sérico, SK – potássio sérico, FEK – fração de excreção
de potássio, , FECl – fração de excreção de cloro, FEMg – fração de excreção de magnésio, FECa
– fração de excreção de cálcio, FEPO4 – fração de excreção de fósforo, PCR – proteína-C
reativa. Dados expressos como media ± desvio-padrão.
51
Tabela 4. Comparação de parâmetros de função renal entre as formas clínicas da
hanseníase e o grupo controle.
Parâmetros TT/DT (n=14)
DD (n=19)
DV/VV (n=11)
Controle (n=15)
SCr(mg/dL) 0,85±0,21 0,89±0,12 0,80±0,17 0,81±0,14
SUr(mg/dL) 22,3±5,5 22,7±6,8 18,4±6 26,1±3,9
TFGE mL/min/1.73m2 124±31 107±23 117±35 115±18
Proteinúria (mg/g-Cr)
60±29 86±52 129±72* 62±37
Albuminúria
(mg/g-Cr)
4,4±3,9 4,5±3,7 5,1±3,7 2,0±1,2
SNa (mEq/L) 142±2,8 141±2,6 139±3,8 139±1,5
SK (mEq/L) 4,5±0,3 4,4±0,4 4,5±0,7 4,4±0,4
FENa (%) 0,7±0,5 0,8±0,6 0,7±0,5 0,5±0,3
FEK (%) 4,4±2,3 6,9±5,1 6,8±5,4 5,6±3,0
FECl (%) 1,1±0,7 1,2±0,8 1,2±0,7 0,9±0,5
FEMg (%) 1,9±1,7 1,8±1,2 2,3±1,6 1,3±0,6
FECa (%) 0,6±0,6 0,8±1,1 1,4±1,2 0,7±0,4
FEPO4 (%) 6,9±4,5 5,9±3,8 6,5±3,7 6,2±2,8
PCR 1,4±0,9 6,0±13 22,9±33,4 -‐-‐-‐
Glicemia 88±8,7 81±8,3 80±9,4 93±9,9
Albumina 3,7±0,3 3,7±0,5 3,3±0,6 3,9±0,5
Ácido Úrico 5,3±1,7 5,1±1,2 4,6±1,3 4,4±1,2
SCr – creatinina sérica, SUr – ureia sérica, TFGE – taxa de filtração glomerular estimada, FENa –
fração de excreção de sódio, SNa – sódio sérico, SK – potássio sérico, FEK – fração de excreção
de potássio, , FECl – fração de excreção de cloro, FEMg – fração de excreção de magnésio, FECa
– fração de excreção de cálcio, FEPO4 – fração de excreção de fósforo, PCR – proteína-C
reativa. Dados expressos como media ± desvio-padrão. ∗ p<0,05 em: (DV/VV) vs controle;
(DV/VV) vs (TT/DT).
52
4.3. Avaliação dos níveis de MCP-1 urinário A avaliação da expressão de MCP-1 urinário foi feita através da
quantificação da excreção de MCP-1 na urina. Foram observados níveis
elevados de MCP-1 urinário e proteinúria nos pacientes com hanseníase
(n=44) em relação ao grupo controle (n=15): (101±79,8 vs 34,5±14,9 mg/g-Cr,
p=0,006) e (97,6±69,2 vs 6,5±4,3 mg/g-Cr, p<0,001) respectivamente. Além
disso, houve significância em relação a níveis aumentados do MCP-1 urinário
nos pacientes multibacilares quando comparados aos pacientes paucibacilares
(122,1±91,9 vs 72±46,1 mg/g-Cr, p=0,023) respectivamente.
Foi observado um aumento significativo da excreção de MCP-1 urinário
e da proteinúria a medida que se deslocava do pólo tuberculóide para o pólo
virchowiano (Figura 5).
Figura 5. Níveis da excreção de proteínas totais e de MCP-1 urinário dos pacientes com hanseníase e suas formas clínicas e do grupo controle.
TT - tuberculóide; DT – dimorfa-tuberculóide; DD – dimorfa-dimorfa; DV – dimorfa-virchowiana; VV – virchowiana. MCP-1 urinário: p<0.05 em todos os grupos. Proteinúria: p<0.05 para DV/VV vs Controle; DV/VV vs TT/DT; TT/DT vs controle; DD vs controle.
MCP-‐1-‐urinário Proteinúria
Controle TT/DT DD DV/VV
Valores (mg/g-‐Cr)
53
4.4. Correlação entre o MCP-1 urinário e a baciloscopia
Foi observada correlação positiva entre o MCP-1 urinário e a
baciloscopia dos pacientes com hanseníase (Figura 6). Quanto ao tempo de
doença, não foi observada correlação significante com o MCP-1 urinário
(r=0,014, p=0,938).
Foi quantificada a proteína-C reativa (PCR) no soro dos pacientes com
hanseníase. Entretanto, não houve correlação positiva entre o MCP-1 urinário e
o PCR (r=-0,095, p=0,606).
Figura 6. Correlação linear de Pearson entre MCP-1 urinário e a baciloscopia dos pacientes com hanseníase.
* (p=0,035).
54
4.5. Correlação do MCP-1 urinário com a proteinúria e microalbuminúria
O MCP-1 urinário também teve correlação positiva com a proteinúria
(r=0,547. P<0,001) e com a microalbuminúria (Figura 7). Em relação a taxa de
filtração glomerular, não houve correlação com o MCP-1 urinário (r=-0,018,
p=0,906).
Figura 7. Correlação linear de Pearson entre MCP-1 urinário e a microalbuminúria dos pacientes com hanseníase.
*(p=0,006).
4.6. Avaliação dos níveis de Malonaldeído (MDA) urinário
A avaliação do estresse oxidativo urinário foi realizado através da
quantificação de Malondealdeído (MDA) urinário. Foram observados níveis
elevados de MDA urinário nos pacientes com hanseníase (n=44) em
comparação ao grupo controle (1,77±1,31 vs 1,27±0,66 mmol/g-Cr, p=0,0372)
respectivamente.
55
Avaliando o estresse oxidativo nas formas clínicas da hanseníase, não
foi observada diferença significativa entre elas, apesar do nível discretamente
aumentado no pólo virchowiano (Figura 8).
Figura 8. Níveis de Malondealdeído (MDA) urinário nas formas clínicas da hanseníase e no grupo controle.
TT - tuberculóide; DT – dimorfa-tuberculóide; DD – dimorfa-dimorfa; DV – dimorfa-virchowiana; VV – virchowiana. MDA urinário: p<0.05 em todos os grupos vs controle.
4.7. Correlação entre MCP-1 urinário e o MDA urinário
O MCP-1 urinário teve correlação positiva com o estresse oxidativo
urinário, observado através da análise de sua correlação com níveis do MDA
urinário (Figura 9).
Em resumo, foi observada correlação entre o MCP-1 urinário e a
baciloscopia, estresse oxidativo urinário e microalbuminúria. Além disso, o
MDA urinário teve correlação positiva com a microalbuminúria (Figura 10).
56
Figura 9. Correlação linear de Pearson entre MCP-1 urinário e MDA urinário dos pacientes com hanseníase.
*(p=0,002).
Figura 10. Organograma das correlações entre MCP-1 urinário, baciloscopia, estresse oxidativo e microalbuminúria.
Baciloscopia
MCP-‐1 urinário
MDA urinário Microalbuminúria
r=0,322
r=0,414 r=0,453
r=0,405
57
Discussão
58
5. DISCUSSÃO
A hanseníase é uma doença de curso crônico que pode levar ao
acometimento sistêmico do indivíduo. Isso pode explicar em parte, as lesões
renais observadas em todas as formas da hanseníase descritas na literatura,
principalmente em análises de autópsias e biópsias, onde os pacientes podem
apresentar alterações renais glomerulares e tubulointersticiais. Contudo, as
manifestações clínicas associadas com a perda da função renal nos pacientes
são pouco observadas, sendo algumas vezes reportadas como relato de caso
(AHSAN; WHEELER; PALMER, 1995; DA SILVA JÚNIOR; DAHER, 2006).
Apesar disso, o estudo das lesões renais na hanseníase apresenta grande
importância, pois elas podem evoluir para a insuficiência renal crônica, uma
das causas de morte desses pacientes (AHSAN; WHEELER; PALMER, 1995;
RIELLA, 2012). Daí a importância do presente trabalho no intuito de buscar
alterações subclínicas e prever complicações renais futuras através de
marcadores mais sensíveis de lesão renal.
No presente estudo, não foi detectado doença renal clinicamente
evidente nos pacientes com haseníase. Poucos pacientes, em sua maioria
virchowianos, tiveram diminuição da TFG e apenas um teve a TFG abaixo de
60mL/min/1.73m2. Esses resultados corroboram com de outros estudos, onde a
diminuição da TFG ocorre principalmente na forma virchowiana e TFG abaixo
de 60mL/min/1.73m2 é encontrada sobretudo em estados reacionais da
doença, um dos critérios de exclusão da população de estudo do presente
trabalho (AL-MOHAYA et al., 1988; GUPTA et al., 1981; SRITHARAN et al.,
1981; WEINER; NORTHCUTT, 1989). O estudo de OLIVEIRA et al., (2008)
com 59 pacientes com hanseníase também mostrou que a forma multibacilar
apresentou TFG significativamente menor que a forma paucibacilar da doença.
Na população estudada, houve um aumento significativo na excreção de
proteínas totais na urina pelos pacientes virchowianos quando comparados ao
grupo controle e aos pacientes do pólo tuberculóide (TT, DT). Outros estudos
mostram que as lesões renais na hanseníase são mais frequentes na forma
virchowiana e a proteinúria é um achado bastante encontrado (DA SILVA
JÚNIOR; DAHER, 2006; DAHER et al., 2011; BAJAJ et al., 1981; GROVER;
59
BOBHATE; CHAUBEY, 1983; GUPTA et al., 1981). Nakayama et al., (1995)
investigaram as manifestações clínicas de 367 casos da literatura e
encontraram 46,3% de proteinúria com prevalência significativamente maior em
pacientes com hanseníase virchowiana do que em outras formas (50,9% vs
2,7%).
A proteinúria é uma alteração clínica característica de glomerulonefrites
que são bastante relatadas no pólo virchowiano (DAHER et al., 2011;
KIRSZTAJN et al., 1993; NAKAYAMA et al., 1995; PHADNIS et al., 1982).
OLIVEIRA et al., (2008) avaliou a função renal de pacientes com hanseníase e
encontrou proteinúria em 11,9% dos pacientes e microalbuminúria em 8,5%,
além de hematúria (27%) e leucocitúria (22%), caracterizando disfunções
glomerulares sobretudo nos pacientes multibacilares.
Baseado em estudos prévios da prevalência dessas alterações renais na
hanseníase, foi avaliada a expressão da proteína MCP-1 no rim, através da
quantificação dos níveis de MCP-1 urinário em pacientes com hanseníase.
MCP-1 é produzido por diversos tipos de células renais e está envolvido de
forma crítica no desenvolvimento de várias doenças renais, sobretudo de
glomerulopatias e lesões tubulointersticiais com o envolvimento de processos
inflamatórios (KIM; TAM, 2011; ROVIN; DOE; TAN, 1996).
No presente estudo, os níveis de MCP-1 urinário estiveram
significativamente aumentados nos pacientes com hanseníase em relação ao
grupo controle. Foi observado também que à medida que se deslocava do pólo
tuberculóide para o pólo virchowiano, os níveis de MCP-1 aumentaram de
forma significativa.
Esses resultados podem ser explicados pelo estado imunológico dos
pacientes nas diferentes formas clínicas e suas consequências para o
organismo. No pólo tuberculóide predomina a resposta imune Th1 com perfil de
citocinas que potencializam a resposta imune celular em detrimento da
resposta imune humoral, apresentando pouca produção de anticorpos. No pólo
virchowiano predomina a resposta imune Th2 com pouca resposta imune
celular e forte resposta imune humoral, caracterizada pela grande produção de
anticorpos específicos para antígenos do M.leprae. Desse modo, a grande
produção de anticorpos no pólo virchowiano pode provocar o aumento da
60
produção de imunocomplexos, possivelmente formados por anticorpos IgM
ligados ao antígeno PGL-1 (GOULART et al., 2002), que podem se depositar
no rim e estimular mecanismos inflamatórios. Estudos mostram que os
imunocomplexos podem ser potentes agentes indutores da produção de MCP-
1 em células renais (BAGGIOLINI; LOETSCHER, 2000; HORA et al., 1992;
KIM; TAM, 2011).
As glomerulonefrites na hanseníase são bastante associadas com a
deposição de imunocomplexos (NAKAYAMA et al., 1995). Na glomerulonefrite
membranoproliferativa, a forma mais predominante de glomerulopatia na
hanseníase (DAHER et al., 2011), já foram detectados níveis elevados de
MCP-1 urinário quando comparados a outras glomerulopatias de caráter não
inflamatório (ROVIN; DOE; TAN, 1996). Níveis elevados de MCP-1 urinário
associado a glomerulonefrite membranoproliferativa pode ser devido a
deposição de imunocomplexos que estão bastante presentes nessa
glomerulopatia através de achados histológicos (RIELLA, 2012).
Somado a isso foi observado correlação positiva entre o MCP-1 urinário
e a baciloscopia dos pacientes estudados, mostrando que a resposta imune
humoral deficiente na hanseníase com elevada produção de anticorpos aliada
ao aumento da carga bacilar e seus antígenos pode aumentar a produção de
imunocomplexos e refletir no aumento de processos inflamatórios e produção
de MCP-1 urinário, observados principalmente nos pacientes multibacilares.
Portanto esse resultado reforça o possível papel dos imunocomplexos nas
lesões renais subclínicas observadas no presente estudo.
Outros estudos também apontam os imunocomplexos como mediadores
das lesões renais na hanseníase. (AHSAN; WHEELER; PALMER, 1995; DATE;
HARIHAR; JEYAVARTHINI, 1985; DATE, 1982; KAUR et al., 1987;
NAKAYAMA et al., 1995; NG; SCOLLARD; HUA, 1981; NIGAM et al., 1986;
VAISHNAVI et al., 1987). VAISHNAVI et al., (1987) inocularam M.leprae nas
patas de camundongos, sendo encontrados em pequena quantidade no rim,
juntamente com lesões proliferativas e complexos imunes. Outro estudo em
camundongos encontrou resultados semelhantes com identificação dos
complexos imunes no rim (KAUR et al., 1987). AHSAN; WHEELER; PALMER,
(1995) em um relato de caso de paciente virchowiano, encontraram oclusão de
61
alça capilar por infiltrado neutrofílico, com depósitos eletrodensos de
imunocomplexo no espaço subendotelial.
Estudos de imunohistoquímica de tecido renal têm identificado a
presença de depósitos granulares de IgG e C3 e menos frequentemente de
IgA, IgM e fibrina no mesângio e/ou ao longo dos capilares glomerulares, o que
caracteriza a glomerulonefrite por depósito ou por formação in situ. A
microscopia eletrônica confirmou a presença de depósitos densos granulares
mesângio-subendoteliais (DATE; NEELA; SHASTRY, 1983) e subepiteliais
(DATE; JOHNY, 1975). Além disso, o consumo do complemento sérico em
algumas situações reforça a hipótese de doença mediada por imunocomplexo
(NAKAYAMA et al., 1995).
De acordo com a literatura, a deposição de imunocomplexos circulantes
no glomérulo pode ser o principal mecanismo responsável por desencadear o
início da resposta inflamatória renal em outras patologias que estão ligadas a
elevados níveis de MCP-1 urinário, como na nefrite lúpica e nefropatia
diabética, levando a glomerulonefrites (BORCHERS et al., 2012; CAMERON,
1999). ANDERS et al., (2001) demonstraram glomerulonefrite por
imunocomplexo em modelo animal, no qual houve lesão glomerular com
proliferação de células mesangiais e aumento da expressão de MCP-1 e de
seus receptores CCL2 somente na região glomerular. A expressão de MCP-1
precedeu a proteinúria e o pico de infiltração leucocitária e voltou ao normal
quando revertido o quadro de glomerulonefrite mediada por imunocomplexo.
No presente estudo, foi avaliado se os níveis de MCP-1 urinário foram
reflexo apenas da inflamação sistêmica através da quantificação da proteína-C
reativa (PCR) sérica. Os níveis de MCP-1 urinário permaneceram se
correlacionando com a microalbuminúria e a proteinúria após correção com o
PCR, indicando que a expressão renal está aumentada nesses pacientes
independente da inflamação sistêmica. Outros estudos sugerem que o MCP-1
urinário é resultado de uma produção local e independente no ambiente renal,
sem influência da produção de MCP-1 a nível sistêmico (SABBISETTI;
BONVENTRE, 2012;BANBA et al., 2000; ROVIN; DOE; TAN, 1996).
62
Foi observado no presente estudo que os níveis de MCP-1 urinário
tiveram correlação positiva com a proteinúria e com a microalbuminúria,
conhecidos marcadores de progressão da doença renal (MURUSSI et al.,
2007). Diversos estudos com variadas doenças renais, também observaram
correlação positiva do MCP-1 urinário com a proteinúria ou com a
microalbuminúria. ROVIN; DOE; TAN, (1996) estudaram a expressão de MCP-
1 em pacientes com variadas glomerulopatias através da quantificação do
MCP-1 urinário. Foi observado que pacientes com glomerulopatias
inflamatórias apresentaram níveis significativamente maiores de MCP-1
urinário e que se correlacionaram positivamente com a proteinúria. Em outro
estudo em pacientes com nefropatia por IgA, foi relatado correlação positiva do
MCP-1 urinário com a severidade da proteinúria e das alterações histológicas
renais desses pacientes (STANGOU et al., 2009).
Estudos de pacientes com nefrite lúpica também mostram correlação
positiva do MCP-1 urinário com a proteinúria e microalbuminúria (WADA et al.,
1996). Estudos em modelos animais mostram uma correlação entre o aumento
da progressão da nefrite lúpica com a expressão de MCP-1 no tecido (ZOJA et
al., 1997). Além disso, já foi relatada uma reversão da severidade da nefrite
lúpica após a administração de inibidores da produção de MCP-1 (KULKARNI
et al., 2007; SHIMIZU et al., 2004), fato que demonstra a importância do MCP-1
e seus ligantes na patogênese do dano renal com consequente proteinúria ou
microalbuminúria observadas nos pacientes.
No estudo de WU et al., (2010), níveis aumentados de MCP-1 urinário
também se correlacionaram positivamente com a proteinúria, dessa vez em
pacientes com nefropatia diabética. Outro estudo com essa nefropatia mostrou
níveis mais elevados de MCP-1 urinário em pacientes com macroalbuminúria
do que naqueles com microalbuminúria (TAM et al., 2009). BANBA et al.,
(2000) observaram correlação positiva do MCP-1 urinário com a
microalbuminúria de pacientes com a mesma nefropatia. Sabe-se que a
microalbuminúria é um fiel marcador do grau de gravidade das lesões
tubulointersticiais nessa patologia. Desse modo, elevados níveis urinários de
MCP-1 podem ser reflexo do avanço das lesões tubulointersticiais,
63
caracterizando-o como potencial biomarcador para a progressão dessas lesões
(SABBISETTI; BONVENTRE, 2012).
Outro ponto importante associado com o MCP-1 urinário, proteinúria e
microalbuminúria é a perda de podócitos no glomérulo. GU et al., (2006)
mostraram com estudo em ratos que os podócitos produziram MCP-1 em
resposta a elevados níveis de glicose na nefropatia diabética e SEOK et al.,
(2013) mostraram in vitro que a ligação de MCP-1 com seu receptor (CCR2) é
capaz de induzir a lesão de podócitos e aumentar sua permeabilidade a
albumina, causando microalbuminúria. Somado a isso, CHOW et al., (2006)
também demonstraram em modelos de indução da nefropatia diabética em
ratos que o MCP-1 está bastante expresso no glomérulo e no espaço túbulo-
intersticial e contribui para a infiltração de macrófagos e fibrose nesses tecidos,
contribuindo para o dano glomerular através de mecanismos inflamatórios. A
resposta dos macrófagos estimulados podem causar lesão renal e promover
inflamação nessa região através da secreção de espécies reativas de oxigênio,
óxido nítrico, TNF-α e IL-1 (CHOW et al., 2004; SEOK et al., 2013). Esses
mecanismos ajudam a explicar as correlações observadas no presente trabalho
e em diversos estudos, onde o MCP-1 pode atuar no ambiente renal como
mediador de lesões renais e causar proteinúria e microalbuminúria.
Além disso, no presente estudo o estresse oxidativo urinário,
caracterizado pela quantificação do MDA urinário, esteve aumentado em
pacientes com hanseníase e se correlacionou positivamente com o MCP-1
urinário e com a microalbuminúria. Esse resultado pode estar relacionado com
o estudo de SEOK et al., (2013) em camundongos com diabetes, onde foi
demonstrado que antagonistas da ação do MCP-1 causaram diminuição do
estresse oxidativo urinário através da diminuição do MDA urinário e de outros
marcadores de estresse. O estudo de SUNG et al., (2002) também demonstrou
que o aumento da expressão de MCP-1 no rim de ratos, durante lesão por
isquemia/reperfusão, foi mediado pela ativação do fator NF-κB e pelo estresse
oxidativo. Portanto, inibindo a ação do MCP-1 temos a diminuição da infiltração
leucocitária que leva a diminuição de mecanismos inflamatórios e, finalmente,
do estresse oxidativo. Isso poderia explicar em parte a correlação entre o MCP-
1 urinário e o MDA urinário observada nos paciente com hanseníase. Também
64
poderia explicar os danos renais observados nos pacientes do presente
trabalho, onde o aumento da expressão de MCP-1 e do estresse oxidativo
certamente contribuiu para lesões renais, pois houve a correlação de ambos
com a microalbuminúria.
Assim, os níveis elevados de MCP-1 urinário nos pacientes com
hanseníase e sua correlação positiva com níveis subclínicos de marcadores de
progressão de doença renal mostraram que o MCP-1 urinário foi útil como
preditor de doença renal a longo prazo nos pacientes, sobretudo na forma
virchowiana. Além disso, sua associação com o estresse oxidativo urinário e
marcadores tradicionais de progressão de lesão renal sugerem o importante
papel do MCP-1 em mecanismos que levam ao desenvolvimento da lesão renal
nesses pacientes.
65
Conclusão
66
6. CONCLUSÕES
- Não foi observada disfunção renal clinicamente evidente utilizando os
marcadores tradicionais de função renal;
- A forma virchowiana esteve mais associada com disfunção renal detectada
pelo MCP-1 urinário;
- O estresse oxidativo urinário esteve aumentado na hanseníase e se
correlacionou com marcadores de progressão de lesão renal;
- Em pacientes com hanseníase antes do início do tratamento, o MCP-1
urinário apresentou níveis elevados;
- O MCP-1 urinário se mostrou útil como biomarcador para a detecção
subclínica de disfunção renal e como preditor de uma doença renal a longo
prazo na hanseníase.
67
Referências
68
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78
Anexos
79
ANEXO A
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
80
ANEXO B
Parecer Consubstanciado do CEP
81
82