universidade federal do cearÁ centro de ciÊncias ... · resumo os metabólitos conhecidos do...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: QUÍMICA ORGÂNICA
Irvila Ricarte de Oliveira
Estudo Químico e Farmacológico de Senna georgica H. S Irwin & Barneby.
Fortaleza-Ceará
2012
Irvila Ricarte de Oliveira
Estudo Químico e Farmacológico de Senna georgica H. S Irwin & Barneby.
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Química Orgânica, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de mestre em Química. Área de concentração: Química Orgânica. Orientadora: Profa. Dra. Maria Goretti de Vasconcelos Silva
FORTALEZA
2012
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus,
À professora Maria Goretti pela orientação, compreensão, disponibilidade e acima
de tudo amizade investida em todos esses anos;
À banca examinadora pelos comentários e melhorias desse trabalho;
Agradeço aos meus professores da graduação e de pós-graduação, pois eles
foram meu alicerce no ensino superior;
Aos funcionários da Universidade Federal do Ceará, em especial Lana, Orlando,
Célia;
Agradeço aos funcionários do Horto de Plantas Medicinais Francisco José de
Abreu Matos;
Agradeço a minha família em especial minha mãe Tereza Ricarte e minha irmã
Itala Ricarte, pelo apoio e amor;
Agradeço um grande amigo Gustavo Maia, pelo carinho e calma;
Aos meus amigos Karine, Samira, Elis, Thiago, Rafael, pelos momentos de
descontração e palavras de conforto;
Agradeço aos amigos de laboratório Juliana, Elayne, Jackeline, Carol, Artemisia,
Ricardo, Tiago e Jeison, obrigado por me roubarem meus melhores risos.
Agradeço aos meus mestres Edângelo e Fábio pelos ensinamentos.
Agradeço as instituições financiadoras, CNPQ, CAPES e FUNCAP.
À todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO
Os metabólitos conhecidos do gênero Senna apresentam uma variedade de
aplicações, embora a mais antiga seja como purgativa e sua preparação está
presente na Farmacopéia britânica, européia, americana e brasileira com
indicação para casos de constipação. Na medicina popular são utilizadas
preparações de várias espécies do gênero como tônica, estomáquica, febrífuga,
anti-herpética, antianêmica, antiblenorrágica, antinefrítica, antídota, antimicótica,
diurética, parasiticida, laxante, e contra doenças de pele. Este trabalho descreve a
investigação química de Senna georgica H. S. Irwin & Barneby (Leguminoseae),
popularmente conhecida como “mata pasto” e “lava prato”. O levantamento
bibliográfico revelou a completa ausência de estudos químicos, biológicos e
farmacológicos realizados com esta espécie, motivo pela qual selecionou-se a
planta para o estudo. O estudo químico iniciou-se com o tratamento
cromatográfico dos extratos hexânico e etanólico do caule de S. georgica o que
possibilitou o isolamento e identificação das antraquinonas crisofanol e fisciona, o
triterpeno de esqueleto lupano, o lupeol, dois fitoesteroides em forma livre e
glicosilados e o ácido triacontanóico. Outra etapa do trabalho foi dedicada ao
estudo farmacológico de S. georgica, que através de ensaios analisou o potencial
antioxidante, citotoxidade e anticolinasterásico dos extratos etanólico e hexânico
das flores, vagens, folhas, caule e raiz da planta. As determinações estruturais
foram realizadas através das técnicas espectrométricas de infravermelho,
ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 e carbono-13 uni e
bidimensionais, espectrometria de massas e comparações com dados relatados
na literatura.
Palavra-chave: Senna, Antraquinonas, Triterpeno.
ABSTRACT
The known metabolites of the genus Senna have a variety of applications, among
which the oldest use is as a laxative. Powdered leaf tea has been used for many
centuries as a laxative, especially in the USA and methods of preparation are
described in the British, European, American and Brazilian Pharmacopoeia.
Extracts of various of species of the genus have been used in traditional folk
medicine preparations as a stomachic, febrifuge, anti-
anaemic, antiblenorrágica, antinefrítica, antidota, antimycotic, diuretic, fungicidal,
laxative and to treat skin diseases. The study the phytochemical composition of
Senna georgica H. S. Irwin Barneby (Leguminoseae), popularly known as "Lava
prato” and "mata pasto".
A literature review revealed a complete absence of phytochemical, biological and
pharmacological studies performed on this species, which is the reason why the
plant was selected for study. The chemical study began
with chromatographic evaluation of hexane and ethanol extracts of Senna
georgica which allowed the isolation and identification of
two anthraquinones crisofanol and fisciona,
the triterpene lupeol, two phytosteroid shaped and acid free and
glycosylated triacontanóico. The antioxidant, cytotoxic (against cancer cell lines)
and anticholinesteric are currently being studied in a battery of tests as well as the
raw hexane and ethanol extracts of the flowers, seeds, leaves, bark, and root of
the plant. Confirmation of the structures of the purified compounds is being
conducted using nuclear magnetic resonance of a 1-H-and C-13 uni-dimensional,
mass spectrometry and comparison with data reported in the literature.
Key Word: Senna, Antraquinones, Triterpene
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Fotos das folhas, flores e vagens de Senna georgica H.S.
Irwin & Barneby em seu habitat natural.
8
Figura 02: Esqueleto básico da antraquinona. 10
Figura 03: Cromatograma dos ácidos graxos de caule de S. georgica 26
Figura 04: Espectro de massas do éster metílico do ácido
Tetradecanóico
26
Figura 05: Espectro de massas do éster metílico do ácido
Hexadecanóico
26
Figura 06: Espectro de massas do éster metílico do ácido
Octadecanóico
26
Figura 07: Espectro de massas do éster metílico do ácido
nonadecanóico
27
Figura 08: Espectro de massas do éster metílico do ácido eicosanóico 27
Figura 09: Espectro de massas do éster metílico do ácido docosanóico 27
Figura 10: Espectro de massas do éster metílico do ácido tricosanóico 27
Figura 11: Espectro de massas do éster metílico do ácido
Tetracosanóico
27
Figura 12: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV, KBr)
de SGC-01
31
Figura 13: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de SGC-01 31
Figura 14: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3) de SGC-01 32
Figura 15: Espectro de RMN 13C-DEPT 135° (125 MHz, CDCl3) de
SGC-01
32
Figura 16: Espectro de absorção na região do IV (KBr) de SGC1-02. 37
Figura 17: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de SGC1-02 38
Figura 18:. Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3) de SGC1-02. 38
Figura 19: Espectro de RMN 13C-DEPT 135° (125 MHz, CDCl3) de
SGC1-02.
39
Figura 20: Espectro de HMQC (500, 125 MHz, CDCl3) de SGC1-02. 39
Figura 21: Espectro de HMBC (500MHz, 125 MHz, CDCl3) de SGC1-
02.
40
Figura 22: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) de
SGC2-02.
44
Figura 23: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de SGC2-02. 44
Figura 24: Sub-espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) faixa de 6,5 -8,0
ppm de SGC2-02.
45
Figura 25: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3) de SGC2-02. 45
Figura 26: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV, KBr)
de SGC-03
47
Figura 27: Espectro de RMN 1H (300 MHz, C5D5N) de SGC-03. 48
Figura 28: Espectro de RMN 13C (75 MHz, C5D5N) de SGC-03. 48
Figura 29: Espectro de RMN 13C-DEPT 135º (75 MHz, C5D5N) de
SGC-03.
49
Figura 30: Espectro de massas de SGC-03. 49
Figura 31: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV, KBr)
de SGC-03.
53
Figura 32: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) de SGC-04. 53
Figura 33: Espectro de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) de SGC-04. 54
Figura 34: Espectro de RMN 13C-DEPT 135º (125 MHz, CDCl3) de
SGC-04.
54
Figura 35: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV, KBr)
de SGC-05.
56
Figura 36: Espectro de RMN 1H (500 MHz, C5D5N) de SGC-05 56
Figura 37: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, C5D5N) de SGC-05 57
Figura 38: Espectro de DEPT 135° de SGC-05 57
Figura 39: Acompanhamento cinético da atividade antioxidante de
Senna georgica.
76
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Número de registros nos últimos dez anos (2011-2001). 11
Tabela 2: Compostos Antraquinônicos isolados de espécies de Senna e
Cassia nos últimos 10 anos.
12
Tabela 3: Representação estrutural dos compostos antraquinônicos
isolados de espécies de Senna e Cassia nos últimos 10 anos.
18
Tabela 4: Teor (%) de ácidos graxos presentes, do extrato hexânico do
caule de Senna georgica
25
Tabela 5: Deslocamento químico de RMN 13C (125 MHz, CDCl3) de
SGC-01 comparados com os dados da literatura [KONGDUANG et al.
2008].
30
Tabela 6: Deslocamentos químicos (δ), dos carbonos metínicos (C-H),
metílicos (CH3) e não hidrogenados (C) para SGC1-02 com padrão de
hidrogenação obtido pela comparação dos espectros DEPT 135o com o
RMN 13C-BB.
34
Tabela 7: Dados de RMN13C (125 MHz, CDCl3) de SGC1-02
comparados com dados da literatura [DAGNE,1984].
36
Tabela 8: Deslocamento químico de RMN 13C e seus respectivos
hidrogênios mostrados pelo espectro de HMQC, bem como as
correlações a longa distância (HMBC) de SGC1-02.
37
Tabela 9: Deslocamentos químicos (δ), dos carbonos metínicos (C-H),
metílicos (CH3) e não hidrogenados(C) para SGC2-02 (500 MHz,
CDCl3) com padrão de hidrogenação obtido pela comparação dos
espectros DEPT 135° com o RMN 13C-BB.
42
Tabela 10: Deslocamento químico de carbono-13 (δ) para SGC1-02
(125 MHz, CDCl3) em comparação com os dados de carbono-13 de
SGC2-02 e fisciona (HÖFLE, 1977).
43
Tabela 11: Dados de RMN13C (125 MHz, CDCl3) de SGC-04
comparados com dados da literatura (MAHATO e KUNDU,1994).
52
Tabela 12: Tabela dos extratos obtidos de Senna georgica 66
Tabela 13: Dados oriundo do tratamento cromatográfico de SGC 68
Tabela 14: Dados oriundo do tratamento cromatográfico de SGC-HD 69
Tabela 15: Dados oriundos do tratamentos cromatagráfico do extrato
etanólico do caule de Senna georgica (EESGC).
71
Tabela 16- Dados oriundos do tratamento cromatográfico da fração
EESGC-D do caule de Senna georgica.
72
Tabela 17: Dados oriundos do tratamentos cromatagráfico da fração
EESGC-D(1-7) do caule de Senna georgica
72
Tabela 18: Dados oriundos do tratamentos cromatagráfico da fração
EESGC-D (16-18) do caule de Senna georgica
73
Tabela 18: Acompanhamento cinético da atividade antioxidade e
Percentual de varredura de radicais livres de Senna georgica
73
Tabela 19: Percentual do grau de inibição do crescimento celular (GI%)
das amostras em três linhagens tumorais testadas na dose única de 50
µg/mL.
76
Tabela 20: Avaliação da atividade anticolinesterásica dos extratos de
Senna georgica
78
Tabela 21- Avaliação da atividade anticolinesterásica dos extratos de
Senna georgica.
79
LISTA FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1- Saponificação e metilação do extrato hexânico do caule
de Senna georgica.
67
Fluxograma 2- Obtenção e isolamento de SGC-01, SGC1-02, SGC2-02
e SGC-03 a partir do extrato hexânico de Senna georgica.
70
Fluxograma 3- Obtenção de SGC-04 e SGC-05 a partir do tratamento
cromatográfico de EESGC.
75
LISTA DE ABREVIATURAS
BB: Broad Band
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
COSY: Correlation Spectroscpy
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO: Dimetil-Sulfóxido
DPPH: Difenil-picril-hidrazil
EM: Espectro de Massas
eV: Elétron volts
HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
IV: Infravermelho
MTT: Sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium
RMN 13C: Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13
RMN 1H: Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1
NUVET: Núcleo de Vetores do Estado do Ceará
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1
1- INTRODUÇÃO 1
CAPÍTULO 2
2 CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS 5
2.1 Considerações Botânicas sobre a Família Leguminosae 5
2.2 Considerações Botânicas sobre o gênero Senna Mill 7
2.3 Considerações Botânicas sobre o gênero Senna georgica 8
CAPÍTULO 3
3-LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO 10
3.1 Considerações sobre as antraquinonas e suas bioatividades. 10
3.1.1 Antraquinonas isoladas de espécies de Senna. 11
CAPÍTULO 4
4. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL 25
4.1 Determinação dos constituintes do óleo fixo de Senna
georgica
25
4.2 Determinação dos constituintes químicos do caule de Senna
georgica
28
4.2.1 Determinação Estrutural de SGC-01 29
4.2.2 Determinação Estrutural de SGC1-02 34
4.2.3 Determinação Estrutural de SGC2-02 42
4.2.4 Determinação estrutural de SGC-03 47
4.2.5 Determinação Estrutural de SGC-04 51
4.2.6 Determinação Estrutural de SGC-05 57
CAPÍTULO 5
5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 60
5.1 Material botânico 61
5.1.1 Coleta do material botânico para estudo dos constituintes
químicos de Senna georgica H. S. Irwin & Barneby
61
5.2 Métodos Cromatográficos 61
5.2.1 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 61
5.2.2 Cromatografia em Coluna 62
5.2.3 Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de
massas
62
5.3 Técnicas Espectroscópicas 63
5.3.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de
Hidrogênio (RMN 1H) e de Carbono-13 (RMN 13C)
63
5.3.2 Espectrometria de massas (EM) 64
5.3.3 Espectroscopia na Região do infravermelho (IV) 64
5.4 Ponto de Fusão 64
5.5 Avaliação do potencial farmacológico de Senna georgica 65
5.5.1 Avaliação da Atividade Antioxidante de Senna georgica 65
5.5.2 Teste de Citotoxidade 66
5.5.3 Inibição da Enzima Acetlcolinasterase 67
5.6 Extração do Material Botânico 68
5.7 Estudo dos constituintes fixos de Senna georgica 68
5.7.1 Estudo dos ésteres metílicos dos ácidos graxos do caule
de Senna georgica
68
5.7.2 Fracionamento preliminar do extrato hexânico do caule de
Senna georgica
70
5.7.2.1 Isolamento de SGC-01 a partir de SGC-HA 70
5.7.2.2 Fracionamento cromatográfico de SGC-HD de Senna
georgica
71
5.7.2.3 Isolamento de SGC1-02, SGC2-02 e SGC-03 a partir de
SGC-HD 5-11
72
5.7.3 Fracionamento preliminar do extrato etanólico do caule de
S. georgica
74
5.7.3.1 Tratamento cromatográfico de EESGC-D de Senna
georgica
74
5.7.3.2 Tratamento cromatográfico de EESGC-D (1-7) de Senna
georgica
75
5.7.3.3 Isolamento de SGC-04 a partir de EESGC-D(13-29) 76
5.7.3.4 Tratamento cromatográfico de EESGC-D (16-18) 76
5.7.3.5 Isolamento de SGC-05 a partir de EESGC-D (110-125) 77
CAPÍTULO 6
6.Avaliação do Potencial Biológico de Senna georgica 78
6.1 Avaliação da atividade antioxidante de Senna georgica 79
6.2 Teste de citotoxidade dos extratos de Senna georgica 81
6.3 Teste de atividade Anticolinasterásica 82
CAPÍTULO 7
7.Conclusões 83
CAPÍTULO 8
8.Referências Bibliografia 85
1
INTRODUÇÃO
Capítulo I
HO
CH3 CH3
CH3HH
H
CH3
H2C
H3C CH3
HO
OH
CH3
OH O
O
HO
2
1 INTRODUÇÃO
A natureza é capaz de produzir moléculas de grande complexidade e capacidade de
interação com diferentes sistemas biológicos. A prática do uso dos produtos naturais como
agentes terapêuticos remonta de longa data, mas somente em meados do século XIX, a partir
dos primeiros princípios ativos isolados, o homem moderno começou a se interessar em
aplicar preparados medicinais para enfermidades que viessem acometer, segundo a
experiência popular, desde então a abordagem cientifica foi estabelecida.
Os produtos naturais têm sido fontes para novos medicamentos. Mesmo nos dias
atuais, os produtos encontrados na natureza continuam a representar um papel essencial no
processo de descoberta e desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Os estudos em
química de produtos naturais, de uma maneira geral, envolvem a coleta, extração, isolamento
e caracterização de metabolitos secundários.
Os metabólitos conhecidos do gênero Senna apresentam uma variedade de aplicações,
embora a mais antiga seja como purgativa e sua preparação está presente na Farmacopéia
britânica, européia, americana e brasileira com indicação para casos de constipação. Os
compostos mais ativos são os isômeros dos senosídeos A e B. Na medicina popular são
utilizadas preparações de várias espécies do gênero como tônica, estomáquica, febrífuga, anti-
herpética, antianêmica, antiblenorrágica, antinefrítica, antídota, antimicótica, diurética,
parasiticida, laxante, e contra doenças de pele [RODRIGUES, 2005].
Neste trabalho é relatado o estudo químico e farmacológico de Senna georgica H. S.
Irwin & Barneby, conhecida popularmente como “mata-pasto” e “lava-prato”, pertencente à
família Fabaceae. Apresenta-se como arbusto de flores amarelas exuberantes que habita na
caatinga, cerrado e Amazônia.
O levantamento bibliográfico não revelou nenhum estudo sobre a espécie, porém foi
possível encontrar um vasto estudo com espécies pertencentes ao gênero Senna, que é muito
apreciado pela beleza de suas flores amarelas e pelas propriedades de uso popular como
purgativa e corante [VIEGAS, 2006].
Estudos químicos e farmacológicos com espécies comprovaram também propriedades
antibacteriana, antifúngica, hepatoprotetora, antimalárica, anticarcinogênica, helminticida,
3
antipsoriática, moluscicida, antiparasitária e tuberculostática. Diversas classes de metabólitos
bioativos estão presentes em espécies de Senna como flavonoides, alcaloides, triterpenos,
esteroides e principalmente antraquinonas nas formas monoméricas e diméricas, livres e
glicosiladas.
O estudo químico do caule de Senna georgica H. S. Irwin & Barneby compreende a
descrição dos procedimentos utilizados no isolamento e determinação estrutural dos
compostos isolados além das técnicas empregadas uma breve descrição da espécie estudada, a
análise do potencial antioxidante, citotóxica e inibição da enzima acetilcolinasterase dos
extratos das várias partes da planta.
4
CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS
Capítulo II
HO
CH3 CH3
CH3HH
H
CH3
H2C
H3C CH3
HO
OH
CH3
OH O
O
HO
5
2 CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS.
2.1 Considerações Botânicas sobre a Família Leguminoseae
A família Leguminoseae possui uma ampla distribuição geográfica, representada por
cerca de 650 gêneros e mais de 18.000 espécies subordinadas a três subfamílias
(Caesalpinioideae, Mimosoideae e Fabaceae-sinônimo papilonoideae). As espécies das
subfamílias Caesalpinioideae e Mimosoideae são, principalmente, tropicais, e as da Fabaceae
encontram-se mais frequentemente nas regiões temperadas. Essa subfamília abrange espécies
com características morfológicas consideradas mais avançadas dentro das Leguminoseae,
Também são de grande importância econômica pela produção de alimentos como: soja
(Glycine max); ervilha (Pisum sativum); feijão (Phaseolus vulgaris) e alfafa (Medicago
sativa) [IRWIN, 1982].
Em 1984 foi determinado que as três subfamílias das leguminosas por possuírem
algumas diferenças anatômicas e pelo grande número de espécies que cada subfamília possuía
passassem a ser classificadas como famílias. No entanto, a partir de 1988, Arthur Cronquist e
colaboradores passaram a recomendar que a classificação anterior, ou seja, Caesalpinoideae,
Mimosoideae e Fabaceae voltassem a ser classificadas como subfamílias, pois as diferenças
anatômicas eram poucas em comparação a quantidade de semelhanças estruturais que estas
possuíam. [BARROSO, 1984; CRONQUIST, 1988].
Segundo JOLY (1985) a família Legumnoseae é contituida por:
Plantas de hábito muito variado, desde grandes árvores das matas tropicais, subarbustos,
ervam anuais ou perenes e também muitas trepadeiras; vivem nos mais variados ambientes,
em diferentes latitudes e altitudes. As folhas são sempre de disposição alternada, compostas,
pari ou imparipenadas, com estípulas e estipelas ás vezes transformadas em espinhos. Flores
variadas, sempre cíclicas, de simetria radial até fortemente zigomorfas. Frutos variados, em
geral legume, seco, deiscente por duas valvas ou tipo lomento, seco e indescente ou de
6
pericarpo mais ou menos carnosa. Sementes as vezes envoltas em mucilagem ou polpa doce,
ou com arilo ou ainda com testa duríssima.
De modo geral, caracterizam-se as leguminoseae como ervas anuais ou perenes, eretas,
prostradas, difusas ou escandentes, subarbustos, arbustos eretos, sarmentos ou escandentes, e
árvores de pequeno, médio ou grande porte, com sistema radicular bem desenvolvido e
predominância da raiz principal sobre suas ramificações. Os tipos foliares são muito variados.
Podem ser encontradas folhas de simples a pinadas, bipinadas, trifolioladas, digitadas e
unifoliadas. O indumento pode estar constituído de pêlos simples, unisseriados ou
multisseriados, ou de tricomas glandulosos. O tipo de inflorescência das Leguminosae é o
racemoso. O androceu típico é o de dez estames. O fruto característico da família é o legume,
um tipo que pode ser definido como monocarpelar, seco, deiscente ao longo da sutura do
carpelo e da costa mediana. [BARROSO, 1984].
7
2.2 Considerações botânicas sobre o gênero Senna Mill
O gênero Senna Mill. pertence à tribo Cassineae Bronn, subtribo Cassinae Irwin &
Barneby. As espécies de Chamaecrista e Senna eram incluídas em Cassia até o tratamento
taxonômico de Irwin & Barneby (1981), quando estes gêneros foram separados. Após o novo
sistema de classificação taxonômica adotado, o grupo Senna constituem um dos maiores
gêneros da família Fabaceae [VIEGAS, 2006]. Senna distingue-se de Cassia principalmente
pelos filetes retos, mais curtos ou até duas vezes o comprimento das anteras, pelas anteras
basifixas e pela presença de nectários extraflorais na maioria das espécies. Por outro lado,
Senna difere de Chamaecrista principalmente pela ausência de bractéolas (excepcionalmente
presentes), pelo androceu zigomorfo e pelos legumes que podem ser indeiscentes. São
caracterizados como árvores, arbustos ou subarbustos [PAROLIN, 2001].
O gênero Senna é constituído por:
"Árvores, arbustos ou subarbustos. Folhas paripinadas, multijugas,
raro escamiformes; folíolos opostos; rásquis foliar e pecíolo com ou
sem glândulas; estípulas de formas variadas, persistentes ou caducas.
Flores amarelas ou alaranjadas, dispostas em racemos ou panículas;
brácteas caducas ou persistentes; bractéolas ausentes; cálices com 5
sépalas desiguais; corola zigomorfa ou assimétrica, com 5 pétalas;
androceu com 7 ou 7 estamos férteis em dois grupos heteromorfos,
com anteras poricidas e 3 estaminóides adaxiais; ovário glabro ou
pubescente. Frutos cilíndricos, comprimidos ou
quandrangulares,restos ou curvos, endocarpo seco ou pulposo.
Sementes 1-2-seriadas, rômbicas, oblongas ou
orbiculares,castanha,negras ou oliváceas."[RODRIGUES,2005].
8
2.3 Considerações botânicas de Senna georgica H. S. Irwin & Barneby
Senna georgica (Figura 01, p.8) é uma espécie pertencente à família Leguminoseae
papilonoideae (Fabaceae), sendo conhecida popularmente como “mata pasta” e “lava prato”.
Espécie não-endêmica, nativa da flora nordestina, cerrado, e caatinga. Caracteriza-se por
arbustos e pequenas arvores de 2-5 m, ereto quando autônomo. Pecíolos fortes e glandulosos,
penduculos de 2-6 cm, flores com pétalas amarela-dourado, vagem marron [IRWIN, 1982].
As espécies de Senna georgica distribuem-se geograficamente em quase toda a América
Latina.
Figura 01: Fotos das folhas, flores e vagens de Senna georgica H. S. Irwin & Barneby em
seu habitat natural. Foto de M. G. V Silva.
9
LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO
Capítulo III
HO
CH3 CH3
CH3HH
H
CH3
H2C
H3C CH3
HO
OH
CH3
OH O
O
HO
10
O
O
1
2
3
4
6
7
5
8
9
10
8a
5a
1a
4a
3 LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO
3.1 Considerações sobre as antraquinonas e suas bioatividades
As antraquinonas são compostos pertencentes a classe das quinonas, constituem o
grupo mais numeroso das quinonas naturais. São quinonas tricíclicas derivados do antraceno
com grupo cetônico em C-9 e C-10 (Figura 02), que são originadas da oxidação dos fenóis.
Sua principal característica estrutural é a presença de dois grupos carbonílicos que formam
um sistema conjugado de três anéis. Apresentam-se geralmente como substâncias cristalinas
de cor amarela, vermelha ou laranja e estão distribuídas largamente no reino vegetal, desde as
plantas superiores até aos fungos e liquens.
Figura 02: Esqueleto básico da antraquinona.
As antraquinonas geralmente apresentam substituintes em várias posições do esqueleto
básico (Figura02) principalmente grupos hidroxilas, metilas e açúcares. Descobriu-se que
estas moléculas apresentam uma variedade de funções biológicas, tais como laxantes,
diuréticas, fitoestrogênicas, estimulantes de imunidade, antifúngicas, antivirais, e agentes
anticancerígenos. Estudos revelam que as antraquinonas com maior nível de oxidação
possuíam maior bioatividade [LIU, 2009].
Em plantas superiores, as antraquinonas estão distribuídas em cerca de 300 espécies
pertencentes a uma grande diversidade de famílias botânica, principalmente em quatro
famílias Polygonaceae (Ruibarbo), Liliaceae (Aloe), Leguminoseae (Sene), Rhamnaceae
(Cáscara sagrada). Mais da metade das antraquinonas naturais são encontrados em fungos,
notadamente em Penicillium spp. e Aspergillus spp. e, em liquens, e em casos isolados, em
insetos como o ácido carmínico, extraído das fêmeas da colchinilha (Dactylopius coccus
Costa) que é utilizado na industria alimentícia e cosmética desde os incas até os dias de hoje.
[MORAES, 2010]. A rota biossintética das antraquinonas de plantas superiores se divide em
duas vias: via chiquimato-mevalonato e via acetato-malonato.
11
3.1.1 Antraquinonas isoladas de espécies de Senna
O levantamento bibliográfico foi realizado nos últimos 10 anos utilizando as
ferramentas de busca SciFinder® SholarTM
e Scopus, e permitiu localizar os dados
compilados que são apresentados na Tabela 01, além do registro de 53 compostos da classe
das antraquinonas (Tabela 03, p.19) em espécies dos gêneros Senna e Cassia. Dentre as
antraquinonas detectadas, 92,5% apresentam substituintes nas posições 1 e 8, permitindo
atribuir a rota biossintética via acetato-malonato para estas substâncias, corroborando com
relatos da literatura [DEWICK, 1998]. 24,5 % dos compostos presentes nos registros
encontrados são dímeros, 18,9% são glicosídeos e 56,6% são antraquinonas livres. Todos os
compostos apresentam substituintes oxigenados, diferenciando-se quanto ao número destes.
Somente um composto é monoxigenado, 11 apresentam dois substituintes, 14 são
trioxigenados, 11 tetraoxigenados, 13 pentaoxigenadas e 3 são antraquinonas hexaoxigenadas.
As diferentes propriedades que são conferidas ás estruturas das antraquinonas podem ser
correlacionadas com o padrão de oxigenação e a posição em que os substituintes estão
dispostos no esqueleto antraquinônico são relacionados por alguns autores, com as diferentes
propriedades que em que os substituintes estão dispostos no anel antraquinônico. Por
exemplo, quando os substituintes oxigenados estiverem nas posições 1 e 2, o composto
apresentará propriedades corantes, no entanto se estiverem nas posições 1 e 8 apresentam
principalmente propriedades laxativas [ACCAME, 2000].
Tabela 01: Número de registros nos últimos 10 anos (2011-2001).
Dados copilados Número de trabalhos
Antraquinona 6.476
Antraquinona /Senna 280
Antraquinona /Senna /Atividades 169
Antraquinona /Senna / Patentes 93
Senna /Atividades /Antioxidante 53
Senna /Atividades/Acetilcolinasterásica 3
Senna /Atividades / Citotoxica/ Antitumoral 57
12
Na Tabela 02, encontram-se listadas as antraquinonas e respectivas bioatividades, isoladas
nos últimos 10 anos (2011-2001) de várias espécies de Senna e Cassia dispostas em ordem
cronológica crescente. Algumas representações das estruturas apresentadas que são mostradas
sem a estereoquímica definida, estão em conformidade com sua citação na literatura.
13
Tabela 02- Compostos antraquinônicos isolados de espécies de Senna e Cassia nos últimos 10 anos
Espécie Parte da
Planta
Atividades
biológicas
comprovadas
Constituintes Químicos REF
Cassia siamea
raiz - 1,1’,6,8,8’-penta-hidroxi-3,3-dimetil-2,2’-
biantraquinona (1); 7-cloro-1,1’,6,8,8’-pentaidroxi-
3,3’-dimetil-2,2’-biantraquinona (2)
KOYAMA et al, 2001
caule - crisofanol (3); crisofanol-1-O-β-D-glicopiranoside (4);
1-[(6-O-Acetil- β-D-glicopiranosil)oxi]-8-hidroxi-3-
metil -9,10-antracenodiona (5).
LU et al, 2001
*
Antitumoral
HepatoprotetoraAnti
oxidante,
Antiinflamatória
Analgésica
Fungicida Inseticida.
crisofanol (3), emodina (6), cassiamina C (7),
cassiamina A (8), cassiamina B (9), 1,1′,6,8,8′-
pentaidroxi-3′,6-dimetil-2,2′ biantraquinona (1);
madagascarina (10); 7′-cloro-1,1′,6′,8,8′-penta-
hidroxi-3,3′-dimetil-2,2′-biantraquinona (2); aloe-
emodina (11); 1,1′,8,8′-tetra-hidroxi-3,3′-dimetil-2,2′-
biantraquinona (12).
KOYAMA et al ,
2001
Cassia
angustifolia
sementes - 1-hidroxi-6,8-dimetoxi-3-metilanthraquinona (13) GUPTA et al,2002
14
Espécie Parte da
Planta
Atividades
biológicas
comprovadas
Constituintes Químicos REF
Senna racemosa caule Hepatoprotetora,Anti
oxidante,
Antiinflamatória,Ana
lgésica.
crisofanol(3); fisciona (14) MENA et al, 2002
Cassia siamea * - emodina (6); crisofanol (3); cassiamin A (8)
cassiamina B(9)
KOYAMA et al,2002
Cassia tora raiz - emodina (6), crisofanol (3).
KOYAMA et al,2003
Cassia fistula raiz - crisofanol (3); fisciona (14), emodina (6); aloe-
emodina (11); 11-acetil aloe-emodina (15), reína (16);
citreoroseina (17)
LEE et al, 2003
Cassia
obtusifolia
sementes Atividade larvicida Emodina (6) YANG et al,, 2003
S. rugosa raiz - crisofanol (3), fisciona,(14); BARBOSA et
al,2004
Cassia
obtusifolia
sementes - 1,2-diidroxianthraquinona (18),
1,4diidroxianthraquinona (19); 1,8-
diidroxianthraquinona (20).
SUNG et al,,2004
Cassia
obtusifolia
* Fungicida alizarina (18) e quinizarina (19); LEE et al,2005
15
Espécie Parte da
Planta
Atividades
biológicas
comprovadas
Constituintes Químicos REF
Senna
obtusifolia
sementes - reína (16), aloe-emodina (11); fisciona(14);
Emodina (6); reína (16).
HARRY et al, 2005
Cassia
angustifolia
Carcinogênica,
mutagênica
reína (16); aloe-emodina (11);
1-hidroxiantraquinona. (21)
BORRELLI et al,,
2005
Cassia
obtusifolla
sementes - crisofanol (3), fisciona (14) emodina (6), aloe-emodina
(11), reína (16).
JIANG et al, 2005
Cassia fistula,
Cassia siamea
caule - 1,8-diidroxi-6-metoxi-3-metil antraquinona (14); 1,8-
dihidroxi-3-metil antraquinona (3); cassiamina A e B
(8) (9).
LEDWANI,e
SINGH,
2006
Cassia
occidentalis
*
Antibactericida,
Anti-stress,
Antimicrobiana,
Laxantivo,
Antifúngico
emodina (6) CHUKWUJEKWU et
al, 2006
Senna alata
raiz
Antioxidante,
Laxante
sennosideo A (22); sennosideo B (23)
PUTALUN et
al,,2006
Cassia
obtusifolia
raiz
-
crisofanol (3); fisciona(14), 1-hidroxi-7-metoxi-3-
metil-antraquinona (24), crisofanol 8 metil éter (25);
aloe-emodina (11),
YANG et al,, 2006.
16
Espécie Parte da
Planta
Atividades
biológicas
comprovadas
Constituintes Químicos REF
Cassia seed. sementes
-
1,2,6-triidroxi-7,8-dimetoxi-3-metil antraquinona (26);
1,2,6,8-tetraidroxi-7-metoxi-3-metil-antraquinona
(27); 2-hidroxi-1, 6,7,8-tetrametoxi-3-metil anthraquinona
(28); 2,6-diidroxi -1,7,8- trimetoxi-3-metil
anthraquinona (29);
1,2-diidroxi-6,7,8-tri-metoxi-3- metil anthraquinona
(30)
XIE et al, 2007.
Cassia
nigricans
folhas Citotóxica,
antimicrobiana
emodina (6)
AYO et al, 2007.
Cassia
angustifolia
folhas - emodina-8-O-β-D-glicopiranosideo (31), aloe emodina
(11)..
WU et al,, 2007
Cassia alata raiz - reína (16); aloe-emodin (11); emodina (6); crisofanol
(3); fisciona (14).
FERNAND et
al,,2008
Cassia tora * - 2-hidroxi-1,6,7,8-tetrametoxi-3-metil anthraquinona
(criso obtusina) (32).
ZHU et al,, 2008
Cassia javanica caule - 1,3,5,8-tetraidroxi-6-metoxi-2-metil anthraquinona
(33).
SINGH, 2008.
Cassia tora sementes Anti-hipertensiva aurantio obtusina (34);
glico-aurantio-obtusina (35); criso-obtusina (36),
obtusina (37).
ZHU et al, 2008.
17
Espécie Parte da
Planta
Atividades
biológicas
comprovadas
Constituintes Químicos REF
Senna reticulata lenho - crisofanol (3); fisciona (14), aloe-emodina (11), 1,3,8-
triidroxantraquinona (39), 3-metoxi-1,6,8-
triidroxiantraquinona(40), emodina(6); crisofanol-
10,10′ biantrona (41).
DOS SANTOS et al,
2008
Cassia tora sementes Anti-hipertensiva emodina (6), alaternina (38); glico-obtusifolina
(42), glico-aurantio obtusina (35);
2-hidroxiemodina metil éter (44),
ZHU et al, 2008.
Senna martiana * Anti-chagásica martianina 1 (10,10'-crisofanol-10-oxi-10,10'-bi-
glicosideo).(45)
DE MACEDO et al,
2009.
Cassia tora. * Anti-hipertensiva
crisofanol triglicosideo (43), glico-obtusifolina (42),
glico-aurantio-obtusina(35)
HYUN et al, 2009
Senna
septemtrionalis
caule Citotóxica crisofanol (3), fisciona (14), emodina (6); floribundona
(46).
ALEMAYEHU et al,
2010.
18
(*) O trabalho não relata a parte da planta utilizada e (-) Atividade biológica não comprovada ou não relatada.
Espécie Parte da
Planta
Atividades
biológicas
comprovadas
Constituintes Químicos REF
Cassia
Artemi|ioides
casca da
raiz
Antibacteriana,Antio
xidante e
Antifúngica.
1,6-diidroxi-8-metoxi-3-metil antraquinona (47); 1-
hidroxi-8-metoxi-3-metil antraquinona (48), 1,8-
diidroxi-6-metoxi-3- metil antraquinona (49); 1,6,8-
triidroxi-3-metil antraquinona (6).
ZAMAN et al, 2011
Senna
macranthera
var. nervosa
* -
2-acetil fisciona (2-acetil-1,8-diidroxi-6-metoxi-3-
metil-9,10-antraquinona (50), crisofanol (3),
crisofanol-8-metil éter (25); fisciona (14)
BRANCO et al,,2011
Cassia
occidentalis
sementes
-
4,4',5,5' tetraidroxi 2,2' metoxi 9,9' bisanthraquinona
(51).
SASTRY et al,,2011
Cassia tora
sementes
Antitumor,
Anti-hipertensiva
obtusifolina-2-glicosideo (52),criso-obtusina-6-
glicosideo (53); questina (47), criso-obtusina (36)
PARK e KIM, 2011.
19
Tabela 03- Representação estrutural dos compostos antraquinônicos isolados de espécies de
Senna e Cassia nos últimos 10 anos
O
O
OH OH
CH3
O
O
OH OH
CH3HO
1,1’,6,8,8’-pentaidroxi-3,3’-dimetil-2’,7-
biantraquinona (1)
O
O
OH OH
CH3
O
O
OH OH
OHCH3
Cl
7’-cloro-1,1’,6’,8,8’-pentaidroxi-3,3’-
dimetil- 2,2’-biantraquinona.(2)
O
O
CH3
OHOH
1,8-diidroxi-3-metilantraquinona (crisofanol) (3)
OOH O
O
HO
O
O
HO
HO
HO
OHHO
HO
OH
crisofanol-1-O-β-D-glicopiranosideo (4)
OOH O
O
Me
O
AcO
HO
HO
HO
1-[(6-O-Acetil-D-glicopiranosil)oxi]-8-hidroxi-3-
metil-9,10-anthracenodiona (5)
O
O
CH3
OHOH
HO
1,6,8-Triidroxi-3-metilantraquinona (Emodina) (6)
O
O
OH OH
CH3
O
O
OH OH
CH3
O
O
OH OH
CH3
O
O
OH OH
CH3HO
Cassiamina A (8).
20
cassiamina C (7)
O
O
OH OH
CH3
O
O
OH OH
CH3HO OH
1,1’,6,6’,8,8’-pentaidroxi-3,3’-dimetil-2,2’-biantraquinona
(cassiamina B) (9).
O
O
OH OH
CH3
O
O
OH OH
HOHO CH3
1,1’,6,6’,8,8’-hexaidroxi-3,3’-dimetil-2,6’-
biantraquinona (madagascarina) (10).
O
O
CH2OH
OHOH
3-carbinol-1,8-hidroxiantraquinona Aloe-emodina (11)
O
O
OH OH
CH3
O
O
OH OH
CH3
1,1′,8,8′-tetraidroxi-3,3′-dimetil-2,2′-
biantraquinona (12).
O
O
OCH3 OH
CH3H3CO
1-hidroxi-6,8-dimetoxi-3-metilanthraquinona
(13)
O
O
OH
CH3O
OH
CH3
1,8-di-hidroxi-6-metoxi-3-
metilantraquinona Fisciona (14)
O
O
OH OH
O
11-acetil-aloe-emodina (15).
O
O
OH
CO2H
OH
reína (16)
O
O
OCH3 OH
CH3H3CO
Citreoroseina (17)
O
O
OH
OH
alizarina (18)
21
O
O
OH
OH
quinizarina (19)
O
O
OHOH
crisazina (20)
1-Hidroxiantraquinona (21)
OOH
HO2C
O
O
CO2H
OHO
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
HO
HO
HO Senosídeo A (22)
OOH
HO2C
O
O
CO2H
OHO
H H
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
HO
HO
HO Senosídeo B (23)
O
O
OH
CH3
H3CO
1-Hidroxi-7-metoxi-3-metilantraquinona (24)
O
O
CH3
OHOCH3
Crisofanol 8-metil éter (25)
O
O
OCH3 OH
CH3HO
OHH3CO
1,2,6-
triidroxi-7,8-dimetoxi-3-metilanthraquinona
(26)
O
O
OH
22
O
O
OH OH
CH3HO
OHH3CO
1,2,6,8-tetraidroxi-7-metoxi-3-metil-
anthraquinona (27)
O
O
OCH3 OCH3
CH3H3CO
OHH3CO
2-hidroxi-1,6,7,8-tetrametoxi-3-
metilantraquinona (28)
O
O
OH OH
CH3HO
OHH3CO
6-dihidroxi-1,7,8- trimetoxi-3-
metilanthraquinona (29);
O
O
OCH3 OH
CH3H3CO
OHH3CO
1,2-diidroxi-6,7,8-trimetoxi-3-
metilanthraquinona (30)
O
O
OH
CH3
O
HO
O
HO
HO
HO
emodina-8-O-beta-D-glicopiranosideo (31)
OOCH3 OCH3
CH3
O
OCH3H3CO
H3CO
2-hidroxi-1,6,7,8-tetrametoxi-3-
metilanthraquinona (criso-obtusina) (32).
OOH OH
OH
O
H3CO
CH3
OH
1,3,5,8-tetraidroxi-6-metoxi-2-metil anthraquinona (33)
OOCH3 OCH3
CH3
O
OHH3CO
H3CO
Aurantio obtusina (34).
O
O
OH OMe
CH3
OHMeO
OGlu
Glico-aurantio-obtusina (35)
OOCH3 OCH3
CH3
O
H3CO
H3CO
OCH3
criso-obtusina (36)
23
O
O
OH OMe
CH3
Obtusifolina (37)
O
O
OH
CH3HO
OH
OH
1,2,6,8-tetraidroxi-2-metilantraquinona
(alaternina) (38) O
O
OH
OH
OH
1,3,8-triidroxianthraquinona (39)
O
O
OH
OCH3
OH
HO
3-metoxi-1,6,8-triidroxianthraquinona (40)
O
O
OH
H3C
OH
CH3
OHOH Crisofanol-10,10′ biantrona (41).
O
O
OH OMe
CH3
O Glu
Glico-obtusifolina (42)
O
O
OH OH
CH3
O Glu Glu Glu
Crisofanol triglicosideo (43)
OOH
HO
OCH3
O
OH
CH3
2-hidroxiemodina metil éter (44)
Glc
O OH
CH3
OH
Glc
O
H3C
OH OH
M Martianina 1 (10,10'-crisofanol-10-oxi- 10,10'-bi-glucosideo) (45)
O
R
OHOH
CH3H3CO
O
OH
OH
H3CO
O
CH3 Floribundona (46).
24
O
O
OMe
HO
OH
CH3
1,6-diidroxi-8-metoxi-3-metilantraquinona
(Questina) (47)
O
O
OCH3
HO
OH
CH3
1-hidroxi-8-metoxi-3-metilantraquinona
(48)
O
O
OH
CH3
OH
H3CO
1,8-diidroxi-6-metoxi-3- metilantraquinona
(Isofisciona) (49);
O
O
OH
CH3O
OH
CH3
CH3
O
2-acetil fisciona (2-acetil-1,8-dihidroxi-6-metoxi-3-metil-9,10-anthraquinona (50)
OOH OH
OCH3
O
OCH3
OHOH 4,4',5,5' tetraidroxi 2,2' metoxi 9,9'
bisanthraquinona (51).
OOH OH
O
O
CH3
Glu
Obtusifolina-2-glicosídeo (52)
OOCH3 OCH3
CH3
O
OGluH3CO
H3CO
Criso-obtusina-6-glicosídeo (53)
25
DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL
Capítulo IV
HO
CH3 CH3
CH3HH
H
CH3
H2C
H3C CH3
HO
OH
CH3
OH O
O
HO
26
4 DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL
4.1 Determinação dos constituintes do óleo fixo de Senna georgica.
Os ésteres metílicos obtidos segundo Fluxogramas 01, p. 69, foram analisados por
CG/EM. A identificação dos constituintes presentes no óleo fixo do caule foi realizada por
comparação dos espectros de massas com uma espectroteca de padrões [ADAMS, 2001].
Com os dados obtidos a partir da análise por CG/EM foi possível caracterizar os
ácidos graxos (Figura 03, p.27), permitindo identificar 83,13% da composição do óleo fixo.
Destacaram-se como componentes majoritários os ácidos graxos dos ácidos saturados
palmítico (26,83%), 9,12-ocatadecanóico (18,60 %) e o esteárico (11,18%) os resultados
podem ser vistos na Tabela 04.
Tabela 04 – Teor (%) de ácidos graxos presentes, do extrato hexânico do caule de Senna
georgica.
CONSTITUINTES TEOR (%) IK
Ácido tetradecanóico (Ac. mirístico) (C14:0) 2,29 1728
Ácido hexadecanóico (Ac.palmítico) (C16:0) 26,83 1970
Ácido 9,12 octadecanóico (C18:0)
18,60 2094
Ácido octadecanóico (Ác. esteárico) (C19:0) 11,18 2124
Ácido eicosanóico (Ác. araquídico) (C20:0) 8,38 2338
Ácido docosanóico (Ác. behêmico) (C22:0) 6,46 2510
Ácido tricosanóico (C23:0) 2,04 2612
Ácido tetracosanóico (Ác. lignoléico) (C24:0) 5,95 2669
Rendimento 82,13%
27
Figura 03 - Cromatograma dos ácidos graxos do caule de S. georgica.
Figura 04- Espectro de massas do éster metílico do ácido Tetradecanóico .
Figura 05- Espectro de massas do éster metílico do ácido Hexadecanóico.
28
Figura 06- Espectro de massas do éster metílico do ácido 9,12 octadecanóico.
Figura 07- Espectro de massas do éster metílico do ácido octadecanóico
Figura 08- Espectro de massas do éster metílico do ácido eicosanóico
Figura 09- Espectro de massas do éster metílico do ácido docosanóico.
Figura 10- Espectro de massas do éster metílico do ácido tricosanóico.
Figura 11- Espectro de massas do éster metílico do ácido tetracosanóico.
29
4.2 Determinação dos constituintes químicos do caule de Senna georgica
4.2.1 Determinação estrutural de SGC-01
O fracionamento cromatográfico do extrato hexânico do caule de S. georgica
(Fluxograma 02, p. 73), levou ao isolamento de cristais incolores na forma de agulhas
solúveis em clorofórmio que apresentaram uma faixa de fusão de 142,6 à 144ºC,
apresentaram teste de Lieberman-Burchard positivo para esteróides (MATOS, 2009).
No espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (Figura 12, p. 32), foi
possível observar uma banda larga em 3415 cm-1
referente a deformação axial da ligação O-
H, as absorções em 2937 e 2860 cm-1
características de deformação axial da ligação C-H de
carbonos sp3, ainda se observa uma banda em 1455 cm
-1 que se refere a deformação angular
da ligação C-H de carbono metilênico de sistema cíclico, uma absorção em 1380 cm-1
relacionada à deformação angular da ligação C-H de carbono metílico,uma fraca absorção em
1630 cm-1
associada deformação axial da ligação C=C de carbono sp2
e uma banda em 1050
cm-1
característica de deformação axial de ligação C-O e 961 cm-1
referentes a deformação
angular da ligação C-H de alquenos.
O espectro de RMN 1H (Figura 13, p. 32), obtido com CDCl3, a 300 MHz mostrou a
presença de sinais em δ 0,69 (s); 1,02 (s) e 0,79 – 0,88 (m) referentes à absorção de
hidrogênios de grupos metílicos (CH3). Dois sinais em δ 5,16 (m) e δ 5,02 (m),
característicos de prótons olefínicos, dos hidrogênios H-22 e H-23. Sinais em δ 5,35 (d) de
hidrogênio olefínico e δ 3,51 (m) de hidrogênio ligado a carbono oxigenado.
A comparação do espectro de RMN 13
C - DEPT 135° (Figuras 14 e 15, p.33) com o
espectro de RMN 13
C-BB revelou a presença de três carbonos não-hidrogenados (C), onze
carbonos metínicos (CH), onze carbonos metilênicos (CH2) e seis carbonos metílicos (CH3).
Os deslocamentos dos carbonos comparados com aqueles encontrados na literatura para os
dois esteróides podem ser observados na Tabela 05, p.31.
Com base nos dados de infravermelho (banda em 3420 cm-1
), no deslocamento de
hidrogênio em δ 3,54 e de carbono em δ 71,99, foi possível constatar a presença de um
carbono carbinólico, além dos sinais do carbono olefínico não hidrogenado em δ 140,96 (C-5)
e mono-hidrogenados em δ 129,49(C-23), 138,51(C-22) e 121,90 (C-6) nessa substância.
30
Desta forma pode-se propor para SGC-01 as fórmulas moleculares C29H50O e C29H48O para
β-sitosterol e estigmasterol respectivamente.
O β-sitosterol e o estigmasterol são fitoesteroides comum, citado na literatura como
constituinte químico de espécies de vários gêneros e famílias. São consideradas moléculas
promissoras, pois diversas atividades biológicas lhes são atribuídas, como antineoplásica,
antipirética (BOUIC et al, 1999), antiinflamatória e analgésica [DELPORTE, 2005].
HO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21 22
23
2425
26
27
28
29
Estigmasterol
HO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21 22
23
2425
26
27
28
29
B-sitosterol
31
Tabela 05– Deslocamento químico de RMN 13
C de SGC-01 comparados com os dados da
literatura [KONGDUANG et al. 2008].
CARBONO δ SGC-01 δ LITERATURA
(β-sitosterol)
δ SGC-01 δ LITERATURA
(Estigmasterol)
1 37,47 37,21 37,47 37,21
2 31,82 31,62 31,82 31,62
3 71,99 71,80 71,99 71,80
4 42,46 42,18 42,53 42,29
5 140,96 140,72 140,96 140,72
6 121,90 121,71 121,90 121,71
7 31,82 31,87 31,82 31,87
8 32,11 31,87 32,11 31,87
9 50,35 50,08 50,35 50,08
10 36,35 36,48 36,71 36,48
11 21,29 21,07 21,29 21,07
12 39,89 39,73 39,89 39,73
13 42,46 42,29 42,46 42,29
14 56,22 56,73 56,94 53,83
15 24,51 24,28 24,51 24,34
16 28,45 28,23 28,45 28,92
17 56,22 56,00 56,22 55,90
18 12,06 11,84 12,06 12,03
19 19,58 19,38 19,58 19,38
20 36,35 36,12 40,69 40,50
21 18,98 18,75 21,29 21,05
22 32,11 33,90 138,51 138,32
23 26,31 25,99 129,49 129,22
24 46,06 45,78 51,44 51,21
25 29,37 29,08 31,82 31,87
26 20,02 19,81 21,29 21,20
27 19,19 19,00 18,98 18,95
28 23,28 23,02 23,28 25,40
29 12,18 11,96 12,25 12,25
32
Figura 12– Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) de SGC-01.
Figura 13– Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de SGC-01.
33
Figura 14–Espectro de RMN 13
C (125 MHz, CDCl3) de SGC-01.
Figura 15– Espectro de RMN 13
C-DEPT 135° (125 MHz, CDCl3) de SGC-01.
34
4.2.2 Determinação estrutural de SGC1-02
O tratamento cromatográfico da fração diclorometânica obtida do extrato hexânico do
caule de S. georgica, segundo o Fluxograma 02, p.73, levou ao isolamento de um sólido
alaranjado, solúvel em CHCl3, com uma faixa de fusão de 192,2 à 196,6oC, que quando
exposto a presença de vapores de hidróxido de amônio, apresentou coloração avermelhada.
Denominado SGC1-02.
O espectro na região do infravermelho (IV) de SGC1-02 (Figura 16, p. 38),
apresentou uma banda em 3434 cm-1
de deformação axial de ligação O-H, outra banda em
3053 cm-1
característico da deformação axial da ligação =C-H compatível com carbono sp2
do
anel aromático, uma absorção em 1677 cm-1
característico de deformação axial da ligação
C=O α, β insaturada, e outra banda em 1627 cm-1
de deformação axial da ligação C=O de
carbonila quelada, duas bandas em 1566 e 1474 cm-1
de deformação axial da ligação C=C de
aromáticos, uma banda em 1370 cm-1
de deformação angular da ligação C–H de metila, uma
absorção em 1273 cm-1
que está de acordo com a deformação axial da ligação C–O, as bandas
de absorção em 839 e 752 cm-1
de deformação angular fora do plano da ligação =C-H de anel
aromático.
O espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) (Figura 17, p.39), de SGC1-02 apresentou
sinais correspondentes aos hidrogênios do grupamento metila com um sinal simples em δ 3,08
(3H, s). Sinais em δ 7,89 (1H, d, J = 7,9 Hz), 8,28 (1H, t, J = 7,9 Hz) e 8,41 (1H, d, J = 7,9
Hz) característicos de hidrogênios aromáticos com acoplamento orto. Sinais em δ 7,69 (1H, s)
e 8,23 (1H, s) referentes a hidrogênios aromáticos posicionados de forma meta ou para. Além
dos sinais dos mostrados, também é possível observar sinais localizados em região mais
desprotegida, δ 12,58 (1H, s) e δ 12,70 (1H, s) que podem ser relacionados a duas hidroxilas
fenólicas queladas por ligação de hidrogênio.
O espectro de RMN 13
C-BB (500 MHz, CDCl3) de SGC1-02 (Figura18, p. 39)
observa-se quinze linhas espectrais. A linha espectral com deslocamento químico em δ 22,4
estava de acordo com um carbono metílico, provavelmente ligado a anel aromático, é possível
também observar dois sinais na região de carbonos carbonílicos em δ 182,0 e 192,6. O
35
deslocamento em δ 192,6 confirma a presença de uma carbonila quelada. Na região
característica de carbonos aromáticos foram observados doze sinais, dos quais os carbonos
com deslocamento em δ 162,9 e 162,6 característicos a carbonos sp2 oxigenados de anel
aromático e outros sinais correspondentes a carbono sp2
não oxigenados de anel aromático (δ
113,9 a 149,5). É possível observar ainda na região de aromáticos, em comparação com o
espectro RMN 13
C - DEPT 135º (Figura 19, p.40), a presença de cinco carbonos metínicos
(CH) e nove carbonos não hidrogenados (C). Com os dados apresentados foi possível propor
para SGC-02, segundo a Tabela 06, p.35, a fórmula molecular C15H10O4, cujo índice de
deficiência de hidrogênio foi igual a onze.
Tabela 06– Deslocamentos químicos (δ), dos carbonos metínicos (C-H), metílicos (CH3) e
não hidrogenados(C) para SGC1-02 (500 MHz, CDCl3) com padrão de hidrogenação obtido
pela comparação dos espectros DEPT 135° com o RMN 13
C-BB.
C CH CH3 Oxigênios TOTAL
192,6 137,1 22,4 1 carbonila
182,0 124,7 1 carbonila
162,9 124,5 1 hidroxila
162,6 121,5 1 hidroxila
149,5 120,1
133,8
133,4
116,0
113,9
C15H8
C9 C5H5 CH3 O4H2 C15H10O4
Os dados discutidos até o presente momento, em especial o padrão de acoplamento
obtido no espectro de RMN 1H e a diferença entre os espectros de RMN
13C – BB e RMN
13C
– DEPT 135º sugerem para SGC1-02 uma estrutura antraquinônica trissubstituída. O padrão
de substituição pode ser observado pela presença de nove carbonos não hidrogenados, dos
36
quais seis referem-se aos carbonos pertencentes ao esqueleto antraquinônico (δ 192,6; 182,0;
133,8; 133,4; 113,9 e 116,0) e os outros três aos carbonos antraquinônicos substituídos (δ
162,9; 162,6 e 149,5). O caráter dioxigenado pode ser comprovado através do espectro de
RMN 13
C, com absorções em δ 162,9 e 162,6.
O acoplamento orto observado no espectro de RMN 1H para três hidrogênios sugere
que um dos núcleos antraquinônicos seja monossubstituído, da mesma forma os dois
hidrogênios mostrados como singletos referem-se a hidrogênios com um acoplamento meta
ou para, sendo assim, o outro núcleo antraquinônico é dissubstituído.
A partir dos dados apresentados acima foi possível sugerir para SGC1-02 a estrutura
antraquinônica dioxigenada, nos quais os substituintes são dois grupos hidroxila e um grupo
metila.
Os registros bidimensionais de correlação de deslocamentos químicos de hidrogênio e
carbono-13, foi confirmada pela análise do espectro de RMN bidimensional de correlação
heteronuclear 1H x
13C COSY à uma ligação (HMQC,
1JCH) (Tabela 08, p. 38), mostrando os
seguintes acoplamentos: hidrogênios em δ 3,08; 7,69; 7,89; 8,23; 8,28; 8,41 com os carbonos
em δ 22,4; 124,5; 124,7; 121,6; 137,1 e 120,1 respectivamente.
As atribuições dos deslocamentos químicos foram confirmadas através do espectro de
RMN bidimensional de correlação heteronuclear à longa distância 1H,
13C (HMBC,
nJCH, n=2
e 3) (Figura 21, p. 41 e Tabela 08, p.38), o qual mostrou os seguintes acoplamentos: os
hidrogênios em δ 3,08 e 8,23 com o carbono em δ 124,5, o hidrogênio em δ 3,08 com o
carbono em δ 149,5, os hidrogênios em δ 3,08 e 7,69 com o carbono em δ 121,5, o hidrogênio
em 7,89 δ com o carbono em δ 120,1, o hidrogênio em δ 8,41 com o carbono em δ 124,7, os
hidrogênios em δ 8,28 e 7,89 com o carbono em δ 162,6, os hidrogênios em δ 7,69 e 8,23 com
o carbono em δ 113,9, os hidrogênios em δ 8,23 e 8,41 com o carbono em δ 182,0 e o
hidrogênio em δ 8,28 com o carbono em δ 133,8.
A análise dos dados apresentados permitiu identificar para a substância SGC1-02
como 1,8-diidroxi-3-metil-antraquinona, conhecida como crisofanol, uma substância já
referenciada na literatura, em espécies deste gênero.
Registros revelam atividades biológicas comprovadas para esta substância, desde seu
uso como purgativa, no tratamento de doenças hepáticas e psoríase [YEN, 2000]. Além de
37
possuir atividade antiplasmódica, é comprovadamente um agente antifúngico e antioxidante
[AGARWAL, S.K et al, 2000].
O
O
OH OH
12
3
456
7
8 9
10
8a 9a
10a 4a
CH3
Crisofanol
Tabela 07– Dados de RMN13
C (125 MHz, CDCl3) de SGC1-02 comparados com dados da
literatura [DAGNE,1984].
CARBONO δ SGC1-02 δLITERATURA
1 162,9 162,4
2 124,5 124,5
3 149,5 149,3
4 121,5 121,4
4ª 133,4 133,2
5 120,1 119,9
6 137,1 136,9
7 124,7 124,3
8 162,6 162,7
8ª 116,0 115,8
9 192,6 192,5
9ª 113,9 113,7
10 182,0 181,9
10ª 133,8 133,6
Me 22,4 22,3
38
Tabela 08– Deslocamento químico de RMN 13
C e seus respectivos hidrogênios mostrados
pelo espectro de HMQC, bem como as correlações a longa distância (HMBC) de SGC1-02.
HMQC HMBC
CARBONO δC δH J2
CH J3
CH
1 162,9 -
2 124,5 7,69 - 3,08; 8,23
3 149,5 - 3,08
4 121,5 8,23 - 3,08; 7,69
4ª 133,4 - - -
5 120,1 8,41 - 7,89
6 137,1 8,28 - -
7 124,7 7,89 - 8,41
8 162,6 - 7,89 8,28
8ª 116,0 - - 7,89; 8,41
9 192,6 - - -
9ª 113,9 - - 7,69; 8,23
10 182,0 - - 8,23; 8,41
10ª 133,8 - - 8,28
Me 22,4 3,08 - 7,69; 8,23
Figura 16– Espectro de absorção na região do IV (KBr) de SGC1-02.
39
Figura 17- Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de SGC1-02.
Figura 18– Espectro de RMN 13
C-BB (125 MHz, CDCl3) de SGC1-02.
40
Figura 19– Espectro de RMN 13
C-DEPT 135° (125 MHz, CDCl3) de SGC1-02.
Figura 20– Espectro de HMQC (500, 125 MHz, CDCl3) de SGC1-02.
OH OH
H
CH2
HH
H
H
H
O
O
3 4
6
215
41
Figura 21– Espectro de HMBC (500MHz, 125 MHz, CDCl3) de SGC1-02.
OH OH
H
CH3
HH
H
H
O
O
10
4
5 2
31
OH OH
H
CH3
HH
H
H
O
O
12
11 6 7
813
42
4.2.3 Determinação estrutural de SGC2-02
O tratamento cromatográfico extrato hexânico da fração SGC-HD 5-10 (Fluxograma
02, p.73) do de Senna georgica, apresentou como resultado um sólido alaranjado em forma de
agulhas, solúvel em clorofórmio com faixa de fusão de 200,5 à 201,7 °C que foi denominado
SGC2-02.
O espectro de absorção na região do infravermelho (IV) de SGC2-02 (Figura 21 p.44)
permitiu a identificação de uma banda larga em 3433 cm-1
característico de deformação axial
de ligação O-H, duas bandas de absorção em 2923 e 2847 cm-1
de deformação axial referente
a ligação C-H, em 1728 cm-1
de deformação axial de ligação C=O, uma banda de absorção
intensa em 1627 cm-1
de deformação axial de C=O de carbonila quelada, duas bandas em
1566 e 1420 cm -1
de deformação axial de ligação C=C de sistema aromático, 1368 cm-1
de
deformação angular de ligação C=C, as bandas em 1323, 1272 e 1224 cm-1
de deformação
axial de ligação C-O indicam o caráter fenólico, como também bandas de absorção em 1160
cm-1
, 1100 cm-1
, 758,41 cm-1
e 714,99 cm-1
caracterizam a deformação angular do anel
aromático e duas bandas em 758 e 610 cm-1 de deformação angular fora do plano de ligação
O-H.
O espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3 ) (Figuras 22, p. 45) mostrou um sinal
intenso em δ 2,46 (3H, s) um sinal integrado referente a um grupo metila, um singleto intenso
em δ 3,95(3H, s) referente a uma metoxila, mostrou quatro sinais na região de hidrogênios de
sistema aromático sendo um singleto em δ 7,64 (1H), δ 7,10 (1H), e dois outros hidrogênios
em 7,38 (1H, d, J = 2,5 Hz) e 6,70 (1H, d, J = 2,5 Hz), referentes a hidrogênios meta
posicionados. Foram evidenciados ainda dois singletos, em região de desproteção em δ 12,14
(1H, OH) e 12,34 (1H, OH), referentes a hidroxilas queladas por ligação de hidrogênio.
Ao se comparar os espectros de RMN 1H de SGC1-02 e SGC2-02, foi possível
evidenciar a ausência de um sinal de hidrogênio aromático. Esta observação pode ser
comprovada ao se analisar o espectro de RMN 13
C-DEPT 135°, onde foi observado a
presença de 10 carbonos não hidrogenados para SGC1-02, ao passo que o mesmo espectro de
SGC2-02 mostra a presença de 9 carbonos não hidrogenados. O que evidencia que SGC2-02
apresenta um substituinte a mais do que SGC1-01.
43
Os dados dos espectros de RMN 13
C – BB (125 MHz, CDCl3 ) de SGC2-02 e SGC1-
02 foram comparados, observando-se que a principal diferença entre tais dados foi a presença
do pico em δ 56,3 no espectro de SGC2-02, foi possível obter a fórmula molecular C16O12O5.
De acordo com os resultados mostrados pode-se concluir que SGC2-02, trata-se de
uma antraquinona tetrassubstituída, denominada, 1,8-diidroxi-3-metil-6-metoxi-antraquinona,
também usualmente conhecida como fisciona.
Um grande número de estudos científicos mostra o potencial antioxidante da fisciona,
e também demonstrou ser capaz de proteger em acidente vascular cerebral (AVC) ou acidente
cerebral (ZHANG, 2005a, 2005b).
Tabela 09– Deslocamentos químicos (δ), dos carbonos metínicos (C-H), metílicos (CH3) e
não hidrogenados(C) para SGC2-02 (500 MHz, CDCl3) com padrão de hidrogenação obtido
pela comparação dos espectros DEPT 135° com o RMN 13
C-BB.
C CH CH3 TOTAL
191,02 127,71 22,4
182,0 121,47 56,28
166,79 108,41
165,42 106,99
162,75
148,65
135,50
133,46
113,9
110,50
C10O4 C4H4 C2H6O C16H12O5
44
Tabela10– Deslocamento químico de carbono-13 (δ) para SGC1-02 (125 MHz, CDCl3) em
comparação com os dados de carbono-13 de SGC2-02 e fisciona (HÖFLE, 1977).
SGC1-01 SGC2-02 δ FISCIONA
CARBONO
1 162,9 162,7 165,5
2 124,5 124,7 124,5
3 149,5 148,7 148,6
4 121,5 121,5 121,3
4ª 133,4 133,4 133,2
5 120,1 108,4 108,2
6 137,1 166,8 166,6
7 124,7 107,0 106,8
8 162,6 165,4 165,2
8ª 116,0 110,5 110,3
9 192,6 191,0 190,8
9ª 113,9 113,9 113,7
10 182,0 182,3 182,0
10ª 133,8 135,5 135,8
Me 22,4 22,4 22,2
OMe --- 56,4 56,1
O
O
OH OH
12
3
456
7
8 9
10
8a 9a
10a 4a
H3CO
Fisciona
CH3
45
Figura 22– Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) de SGC2-02.
Figura 23– Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) de SGC2-02.
46
Figura 24– Sub-espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) faixa de 6,5 -8,0 ppm de SGC2-02.
Figura 25– Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz, CDCl3) de SGC2-02.
47
4.2.4 Determinação estrutural de SGC-03
O tratamento cromatográfico do extrato hexânico do caule de Senna georgica,
forneceu a fração SGC-HD/5-10, que após a recristalização, como um sólido branco amorfo
com ponto de fusão entre 78-79ºC denominada SGC-03.
O espectro de absorção na região do infravermelho (IV) de SGC-03 (Figura 26, p. 48)
permitiu a identificação de uma banda larga centrada em 3412 cm-1
de deformação axial
referente a ligação O-H, duas bandas de absorção em 2915 cm-1
e 2850 cm-1
característica de
deformação axial da ligação C-H de ligação de carbono sp3, uma banda de absorção em 1728
cm-1
de deformação axial da ligação dupla C=O, uma banda média em 1461 cm-1
de
deformação angular da ligação C–H de metileno, uma banda em 1180 cm-1
de deformação
angular da ligação C-H de metileno e uma banda em 720 cm-1
de deformação angular de
ligação CH.
No espectro de RMN 1H (300 MHz, C5D5N) (Figura 27, p. 49) de SGC-03 observou-
se os seguintes sinais: δ 0,89 (3H, t, J= 6,0 Hz), 1,29 (21H, sl), 1,41 (2H, m), 1,82 (2H, m, J=
7,31) e 2,54 (2H, t, J= 7,38) que podem ser atribuídos a hidrogênios de hidrocarboneto
alifático. O sinal em δ 2,54 sugere uma proximidade destes hidrogênios com algum grupo de
desproteção provavelmente uma carbonila.
No espectro de RMN 13
C (75 MHz, C5D5N) (Figura 28, p. 49) apresenta 8 linhas
espectrais, onde o deslocamento químico de δ 14,2 é referente a um grupamento metila.
Foram observados sinais em δ 22,9, 25,6, 29,6, 29,81, 32,1 e 34,9 referentes a carbonos
metilênicos. O sinal em δ 34,9 é compatível com um grupamento metilênico de maior
desproteção que pode estar ligado à uma carbonila, que pode ser confirmado no espectro de
hidrogênio. Também foi possível observar um sinal com deslocamento químico em δ 175,9
referente ao carbono de carbonila. Em comparação do espectro de RMN 13
C - DEPT 135º de
SGC-03 (Figura 28 e 29, p 49.) com o espectro de RMN 13
C-BB revelou o padrão de
substituição dos carbonos, confirmando assim a presença de um carbono metílico e de vários
carbonos metilênicos, como também o sinal em δ 175,9 que é referente a carbono não
hidrogenado.
48
O espectro de massas de SGC-03 (Figura 30, p. 50) mostrou o pico do íon molecular
com razão massa/carga (m/z) em 452 daltons que juntamente com os dados apresentados foi
possível sugerir para SGC-03 a fórmula molecular C30H60O2.
Com os dados apresentados foi possível concluir que SGC-03 tratava-se de um ácido
graxo de cadeia longa denominado ácido triacontanóico, conhecido na literatura como ácido
melíssico.
25
OH
O
Ácido Triacontanóico
Figura 26– Espectro de absorção na região do infravermelho (IV, KBr) de SGC-03
49
Figura 27– Espectro de RMN
1H (300 MHz, C5D5N) de SGC-03.
Figura 28– Espectro de RMN 13
C (75 MHz, C5D5N) de SGC-03.
50
Figura 29– Espectro de RMN 13C-DEPT 135º (75 MHz, C5D5N) de SGC-03.
Figura 30– Espectro de massas de SGC-03.
51
4.2.5 Determinação Estrutural de SGC-04
O tratamento cromatográfico do extrato etanólico da fração SGCD/1-5 do caule de
Senna georgica, (Fluxograma 03, p.77), resultou no isolamento de cristais incolores em
forma de agulhas, solúvel em diclorometano e com o ponto de fusão de 198 a 198,8 oC. Com
a utilização do teste de Lieberman-Buchard conforme a literatura (MATOS, 2009) a amostra
apresentou teste positivo para triterpenos.
O espectro de absorção na região do infravermelho (IV) de SGC-04 (Figura 31, p.54)
permitiu a identificação de uma banda larga em 3300 cm-1
de deformação axial de ligação O-
H, outra banda em 3068 cm-1
característico da deformação axial da ligação =C-H, uma banda
intensa em 2946 cm- 1
atribuída a deformação axial da ligação C-H de carbono sp3, uma banda
fraca em 1640 cm-1
representativas da deformação axial de ligação C=C, 1454 cm-1
de
deformação angular da ligação dos carbonos metílicos, as bandas em 1302, 1038 cm-1
representativa de deformação axial da ligação C-O e as bandas em 981, 944 e 880 cm-1
característicos da deformação angular fora do plano da ligação C-H.
O espectro de RMN 1H de SGC-04 (Figura 32, p.55), obtido com CDCl3 a 500 MHz,
apresentou sete singletos intensos na região δ 0,7691(3H, s) a δ 1,6889(3H, s) referentes à
absorção de hidrogênios de metilas terciárias. Sendo que a última encontra-se na região mais
desprotegida, sugerindo estar ligada a um carbono sp2.
Na região de δ 3,20 (1H, dd), à
absorção de hidrogênio carbinólico. Os sinais em δ 4,57 (1H) e δ 4,69 (1H) caracterizam
hidrogênios em uma dupla ligação terminal.
Analisando os dados do espectro de RMN 13
C-BB em comparação com os
dados de RMN 13
C-DEPT 135o de SGC-04 (Figuras 33 e 34, p.56), obtido em CDCl3 a 125
MHz, (Tabela 11, p. 53) obteve-se os valores de sete carbonos metílicos (CH3), onze
carbonos metilênicos (CH2), seis carbonos metínicos (CH) e seis carbonos não hidrogenados
(C), resultando um total em trinta linhas espectrais de carbonos, característicos de triterpenos
pentacíclicos. No espectro pode-se observar sinais considerados característicos para um
esqueleto lupano, esses sinais são: δ 79,22 (HC-OH), além das absorções em δ 151,2 (C-20) e
δ 109,54 (C-29) foram condizentes com a presença de uma dupla ligação terminal.
52
Após a análise dos dados de RMN 1H,
13C-BB e
13C-DEPT 135
o obtidos e em
comparação com os dados da literatura foi possível sugerir para SGC-04 a estrutura do
triterpeno de esqueleto do tipo lupano, de nomenclatura usual lupeol (β-lup-20 (29)-en-3-ol).
Diversas atividades biológicas são atribuídas ao lupeol dentre estas antitumoral (SALEEM,
2001) cardioprotetora e gastropotetora [SUDHARSAN, 2005].
OH
CH3CH3 H3C
H H CH3
H
H3C CH3
CH3
H2C
1
2
3
4 5
6
7
8
9
10
11
12
13
1415
2324
25 26
27
28
29
30
16
1718
19
20
21
22
Lupeol
53
Tabela 11– Dados de RMN13
C (125 MHz, CDCl3) de SGC-04 comparados com dados da
literatura (MAHATO e KUNDU,1994).
SGC04
(125MHz,CDCl3)
Lupeol (125MHz,CDCl3)
[MAHATO e KUNDU,1994]
C δC δC
1 38,91 38,7
2 27,62 27,4
3 79,22 78,9
4 38,91 38,8
5 55,5 55,5
6 18,53 18,3
7 34,48 34,3
8 40,21 40,8
9 50,64 50,4
10 37,38 37,1
11 21,14 20,9
12 25,34 25,1
13 38,26 38,0
14 43,21 42,8
15 27,65 27,4
16 35,79 35,5
17 43,04 43,0
18 48,51 48,0
19 48,20 47,9
20 151,21 150,9
21 30,05 29,8
22 39,07 40,0
23 28,20 28,0
24 15,58 15,4
25 16,33 16,1
26 16,18 15,9
27 14,76 14,5
28 18,21 18,0
29 109,54 109,3
30 19,53 19,3
54
Figura 31– Espectro de absorção na região do infravermelho (IV, KBr) de SGC-04.
55
Figura 32– Espectro de RMN
1H (CDCl3, 500 MHz) de SGC-04.
Figura 33– Espectro de RMN
13C (125 MHz, CDCl3) de SGC-04.
56
Figura 34– Espectro de RMN 13C-DEPT 135º (125 MHz, CDCl3) de SGC-04.
57
4.2.6 Determinação Estrutural de SGC-05
O tratamento cromatográfico do extrato etanólico da fração EESGC-D (110-125) do
caule de Senna georgica, (Fluxograma 03, p.77), resultou no isolamento de um sólido branco
amorfo, solúvel em piridina com faixa de fusão de 273 a 275,2 oC.
O espectro de absorção na região do infravermelho (IV) de SGC-05 (Figura 35, p.58)
permitiu a identificação de uma banda larga em 3407,09 cm-1
de deformação axial de ligação
O-H, bandas intensas em 2917,75 cm-1
e 2836,92 cm-1
atribuída a deformação axial da ligação
C-H de carbono sp3, duas bandas em 1732,59 cm
-1 representativas da deformação axial de
ligação C=C carbono sp2, 1469,91 cm
-1 de deformação angular da ligação dos carbonos
metílicos, uma banda em 1045,57 cm-1
característica de deformação axial de ligação C-O.
O espectro de RMN 1H (500 MHz, C5D5N) de SGC-05 (Figura 36, p.58) apresentou
vários sinais na faixa em H 3,96-4,99, absorções características de compostos glicosilados,
sinais de hidrogênios olefínicos na região de δ 5,38 a δ 5,06. Sinais com diferentes
multiplicidades na região entre δ 1,75 a δ 0,68 relacionados a hidrogênios do esqueleto
terpênico ou esteroidal.
Analisando o espectro de RMN 13
C-BB (125 MHz, C5D5N), (Figura 37, p.59)
observaram-se além de outros sinais, os característicos da presença de açúcar existentes em
glicosídeos, na faixa de C 64,3-80,0 (64,3; 73,2; 76,8; 79,7; 79,9 e 80,0) sugerindo uma
aglicona esteroidal.
R = Gli
RO
1
2
3
4
5
6
7
89
10
11
12
13
1415
16
17
18
19
2021
22
23
2425
26
27
28
29
-sitosterol
( )22Estigmasterol
58
Figura 35– Espectro de absorção na região do infravermelho (IV, KBr) de SGC-05.
Figura 36– Espectro de RMN 1H (500 MHz, C5D5N) de SGC-05
59
Figura 37– Espectro de RMN 13
C-BB (125 MHz, C5D5N) de SGC-05,
Figura 38– Espectro de DEPT 135° de SGC-05.
60
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Capítulo V
HO
CH3 CH3
CH3HH
H
CH3
H2C
H3C CH3
HO
OH
CH3
OH O
O
HO
61
5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
5.1 Material botânico
5.1.1 Coleta do material botânico para estudo dos constituintes químicos de Senna
georgica H. S. Irwin & Barneby
O material botânico caule, folhas, raízes, flores e frutos de Senna georgica H. S. Irwin
& Barneb foram coletadas em Pico Alto, Guaramiranga-CE no dia 09 de fevereiro de 2008,
pelos professores Edilberto Rocha Silveira, Otília Deusdênia Loiola Pessoa do Departamento
de Química Orgânica e Inorgânica e Maria Goretti de Vasconcelos Silva do Departamento de
Química Analítica e Físico-Química da Universidade Federal do Ceará.
A certificação botânica foi realizada pelo professor Afrânio Fernandes do
Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará. A exsicata referente a coleta da
espécie citada encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra do Departamento de
Biologia da Universidade Federal do Ceará, sob os números de registro 41630 e 41631.
5.2-Métodos Cromatográficos
5.2.1-Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
As análises por cromatografia de adsorção em camada delgada (CCD) foram
realizadas utilizando-se cromatoplacas de vidro, com uma das faces revestida por uma fina
camada de sílica gel 60G F254 da VETEC. Também foram utilizadas cromatofolhas de gel de
sílica sobre alumínio CCF-C/25 da MERCK, com camadas de 250 µm de espessura e
dimensões de 20 x 20 cm (com indicador de fluorescência na faixa de 254 nm).
Os eluentes utilizados como fase móvel, seguiram uma série eluotrópica, que podia ser
tanto isocrática ou com aplicação de gradiente de polaridade. Os solventes mais usados foram
éter de petróleo, hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, todos de qualidade P.A.
ou previamente destilados.
A revelação das substâncias nas cromatoplacas foi realizada utilizando-se o método
físico de exposição à radiação de luz ultravioleta (UV) em dois comprimentos de ondas 312
nm e 365 nm obtidos em lâmpada modelo UVLS-28 da Sovereign Computer Systems; e
62
também por métodos químicos: com vapores de iodo granulado e pela pulverização com
solução de vanilina (C8H8O3) e ácido perclórico (HClO4) 10% em etanol P.A., seguido de
aquecimento em estufa a 100o C por cerca de 5 min.
5.2.2 Cromatográfica em Coluna
A técnica de cromatografia de adsorção em coluna clássica foi amplamente utilizada
no isolamento e purificação dos compostos identificados de S. georgica. O comprimento e o
diâmetro dos suportes para as colunas variaram de acordo com o material a ser purificado. A
fase estacionária (adsorvente) usada foi: gel de sílica 60 da VETEC (Ø µm 70-230 mesh) para
cromatografia em coluna de fase normal. Os eluentes mais utilizados como fases móveis
nesses procedimentos foram hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, seguindo a
ordem crescente de polaridade.
5.2.3 Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de massas
Os espectros de massas dos ésteres metílicos dos ácidos graxos extraídos do caule de
S. georgica foram analisados por CG-EM (Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria
de Massas) QP 5000/QP5050A da SHIMADZU, usando coluna capilar OV-5, fase
estacionária de dimetilpolisiloxano com 30,0 m de comprimento; 0,25 mm de diâmetro
interno e 0,25 µm de filme, mantendo-se fluxo de 1 mL/min. de Hélio como gás de arraste e
com a temperatura do injetor de 280ºC.
63
5.3 Técnicas Espectroscópicas
5.3.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e de
Carbono-13 (RMN 13
C)
Os dados técnicos e as condições operacionais sobre os espectros de RMN 1H e
RMN13
C unidimensionais e bidimensionais foram obtidos junto ao Centro Nordestino de
Aplicação e uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREMN). Os espectros foram
obtidos em espectrômetros Bruker, modelo Avance DPX-300 e modelo Avance DRX-500,
operando na freqüência do hidrogênio a 300 e 500 MHz, e na freqüência do carbono a 75 e
125 MHz respectivamente.
Na dissolução das amostras foram utilizados os seguintes solventes: clorofórmio
deuterado (CDCl3) e piridina deuterada (C5D5N).
Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e
referenciados, no caso dos espectros de RMN 1H, pelos picos dos hidrogênios pertencentes as
moléculas residuais não deuteradas dos solventes deuterados utilizados: clorofórmio (δ 7,27) e
piridina (δ 8,7; 7,6 e 7,2). Para os espectros de RMN13
C, os deslocamentos químicos (δ)
foram referenciados pelos picos dos carbonos-13 dos solventes: clorofórmio (δ 77,0) e
piridina (δ 123,9; 135,9 e 150,2).
Os conceitos de multiplicidades dos sinais dos espectros de RMN 1H foram indicadas
segundo a convenção: s (singleto), d (dubleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto), sl
(singleto largo) e dd (duplo-dubleto).
O padrão de hidrogenação dos carbonos em RMN 13
C foi determinado através da
técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com ângulo de nutação
de 135º, CH e CH3 com amplitudes em oposição aos CH2), e foi descrito segundo a
convenção: C (carbonos não-hidrogenado); CH (carbono metínico); CH2 (carbono metilênico)
e CH3 (carbono metílico). Os carbonos não hidrogenados foram caracterizados pela
comparação do espectro DEPT 135º do espectro RMN 13
C-BB.
Obteve-se também os espectros de RMN bidimensionais de correlação homonuclear
(1H,
1HCOSY) e de correlação heteronuclear com detecção inversa (HMQC e HMBC) para
associar as absorções dos hidrogênios aos seus respectivos carbonos.
64
5.3.2 Espectrometria de massas (EM)
Os espectros de massa das substâncias isoladas foram obtidas por impacto eletrônico a
70eV em espectrômetro da marca SHIMADZU, modelo QP5000/QP5050.
5.3.3 Espectroscopia na região do infravermelho (IV)
Os espectros vibracionais na região do Infravermelho foram obtidos utilizando-se um
espectrofotômetro FTLA 2000-102, ABB-BOMEM, na região de 4000 a 400 cm-1
, utilizando-
se pastilhas de KBr para análise das substâncias sólidas.
5.4 Ponto de fusão (pf)
Na determinação dos pontos de fusão das substâncias isoladas usou-se um aparelho de
microdeterminação da Microquímica provido de placa aquecedora modelo MQAPF-301. As
determinações foram realizadas a velocidade de aquecimento de 2,5º C/min.
65
5.5 Avaliação do potencial farmacológico de Senna georgica.
5.5.1 Avaliação da Atividade Antioxidante de Senna georgica
Ensaio DPPH
Os ensaios quantitativos frente ao radical sintético DPPH foram realizados com o
radical estável DPPH absorve entre 515-528 nm (cor violeta). A medida de absorbância dessa
solução violeta foi feita, em triplicata, a 515 nm, em leitora de Elisa Thermoplate.
10 mg de cada extrato etanólico de S. georgica dissolvido em 1 mL de metanol e
alíquotas de 0,1 mL das soluções das amostras foram individualmente colocadas em frascos e
adicionado a cada uma delas 3,9 mL da solução de DPPH (1,1-dimetil-2-picril hidrazil). Com
a concentração de 6,5x10-5
mol/L. As soluções foram protegidas da luz, homogeneizadas e a
solução para serem aplicados na microplaca de 96 poços. As leituras foram feitas no leitor de
Eliza nos tempos 0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos em um comprimento de onda de 515nm
utilizou-se o padrão eugenol.
O índice de varredura é calculado de acordo com a seguinte expressão:
Onde: AbsDPPH = absorbância da solução inicial do DPPH
AbsSUBST = absorbância da substância após 300 minutos
Os resultados encontram-se na Tabela 18, p.79.
66
5.5.2 Teste de Citotoxidade
Ensaio MTT
Análise de citotoxicidade pelo método do MTT foi realizada no laboratório de
Oncologia Experimental sob orientação da Profa. Letícia Veras Lotufo do Departamento de
Farmacologia da Universidade Federal do Ceará.
O programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI),
utilizada esta metodologia para mais de 10.000 amostras a cada ano [SKEHAN et al., 1990].
Foi descrita primeiramente por Mosman (1983), tendo a capacidade de analisar a
viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica baseada na
conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT) em
azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células
metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente
a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação [BERRIDGE et al., 1996].
Neste experimento foram utilizadas as linhagens tumorais utilizadas, MDA-MB435
(mama - humano), HCT-8 (cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma - humano), cedidas pelo
Instituto Nacional do Câncer (EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640,
suplementados com 10 % de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em estufa a 37
C e atmosfera contendo 5% de CO2. Estas células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x
106
cél/mL para as linhagens MDA/MB-435 e SF-295 e 0,7 x 105 cél/mL para a linhagem
HCT-8.
Os extratos etanólico do caule,folhas e raiz de S. georgica diluídos em DMSO puro
estéril na concentração de 125 µg/mL, foram colocados em placas e logo após adicionadas as
células. Estas foram incubadas juntamente com o extrato por 72 horas em estufa a 5% de CO2
a 37C. Ao término deste, as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante, removido. Em
seguida, foram adicionados 150 L da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram
incubadas por 3h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 L de
DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 595 nm. Os resultados podem ser observados na
Tabela 19, p.81.
67
5.5.3 Ensaio da Inibição da Enzima Acetilcolinasterase
Para a realização do ensaio de inibição da enzima acetilcolinesterase faz-se necessário
a preparação das seguintes soluções:
(1) 50 mmol.L-1
Tris/HCl pH 8; (2) 50 mmol.L-1
Tris/HCl pH 8, contendo 0,1% de albumina
sérica bovina (BSA); (3) 50 mmol.L-1
Tris/HCl pH 8, contendo 0,1 mol/L de NaCl e 0,02
mol/L de MgCl2.6.H2O; (4) 3 mmol.L-1
de ácido 5,5’-ditiobis-[2-nitrobenzóico] (DTNB ou
reagente de Ellman), (5) 15 mmol.L-1
de Iodeto de acetilcolina (ACTI), (6) 1 mmol.L-1
de
ácido 5,5’-ditiobis-[2-nitrobenzóico] (DTNB ou reagente de Ellman) e (7) 1 mmol.L-1
de
iodeto de acetiltiocolina (ACTI).
A metodologia, segundo o Método de Ellman modificado por Rhee et al (2001),
utiliza a enzima AChE liofilizada, a qual foi dissolvida na solução tampão (1) deixando-se na
solução por 20 min, depois sob agitação por mais um período de 10-15 min, para obtenção de
uma solução homogênea de 1000 U/mL, que servirá como solução estoque. Para as diluições
posteriores, utilizou-se a solução tampão (2). Os extratos foram aplicados em CCD, DC-
Alufolien, Silica gel 60 F254, 0.2 mm Merck. Borrifou-se a placa com as soluções (6) + (7),
deixando 3 min. Após secar, borrifou-se a enzima 3 U/mL e, em 10 min, apareceu a coloração
amarela, mas se houvesse inibição da enzima, observar-se-ia um halo branco. Em 20 - 30 min
a coloração desaparece. A representação destas reações pode ser observada abaixo:
Acetilcolina +H2O Acetato + Tiocolina
Tiocolina + DTNB 5-tio-2-nitrobenzoato (cor amarela) + 2-nitrobenzoato-5-
mercaptocolina.
Os resultados da análise encontram-se na Tabela 20, p.82.
AchE
68
5.6 Extração do Material Botânico
As amostras de caule, folhas, raiz, flores e vagens foram secos, trituradas e colocadas
separadamente em contato com hexano bruto e posteriormente, colocadas em contato com
etanol bruto obtendo-se as quantidades mostradas na Tabela 12.
Tabela 12- Tabela dos extratos obtidos de Senna georgica.
PARTE DA
PLANTA
Peso (g) EXTRATO
HEXÂNICO
%
EXTRATO
ETANÓLICO
%
Aspecto
Caule 1.890,0 4,68 65,0 Marrom escuro
pastoso
Folhas 273,0 4,45 12,5 Verde escuro
Pastoso
Raiz 400,0 2,048 6,12 Marrom claro
pastoso
Flores 10,110 0,27 0,66 Amarelo claro
Pastoso
Frutos 30,022 0,03 1,78 Verde escuro
pastoso
5.7 Estudo dos constituintes fixos de Senna georgica.
5.7.1 Estudo dos ésteres metílicos dos ácidos graxos do caule de Senna georgica.
O caule de Senna georgica (1.890g), após ser triturado foi macerado com hexano por
um período de uma semana, em seguida o material foi filtrado obtendo-se o extrato hexânico
que foi submetido à evaporação em evaporador rotativo sob pressão reduzida, obtendo-se
assim um material de aspecto pastoso e de cor amarelada. Uma fração do material obtido foi
submetido a uma reação de saponificação, em seguida, de uma reação de metilação, segundo
Fluxograma 01, p.69 respectivamente.
69
Fluxograma 01- Saponificação e metilação do extrato hexânico do caule de Senna georgica.
Extrato Hexânico
0,978g
FASE ORGÂNICA
INSAPONIFICÁVEIS
1- KOH/MeOH
2- Refluxo 1h
3- Adição de Água
4- Extração com Hexano (3x 20mL)
FASE AQUOSA ALCALINA
SAPONIFICÁVEIS
1- HCl
2- Extração com Hexano (3x 20mL)
FASE ORGÂNICA FASE AQUOSA
1-Na2SO4 anidro
2- Filtração
3- Concentração em Evaporador
Rotativo
SAPONIFICÁVEIS
54,1mg
1-HCl/MeOH
2-Refluxo
3- Extração Éter-Etílico
FASE ORGÂNICA FASE AQUOSA
1-Na2SO4 anidro
2- Filtração
3- Conc. Evaporador Rotativo
ESTERES METÍLICOS DOS
ÁCIDOS- análise por CG
Desprezada
70
5.7.2 Fracionamento preliminar do extrato hexânico do caule de Senna georgica.
O estudo cromatográfico iniciou-se com a utilização de uma coluna filtrante, usando-
se gel de sílica como fase estacionária do extrato hexânico do caule de Senna georgica
(EHSGC).
O extrato (4,0 g) pulverizado em gral de porcelana e acondicionado sobre 200 g de gel
de sílica em coluna cromatográfica. Utilizou-se como eluentes os seguintes solventes em
ordem crescente de polaridade: hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, puros.
Todas as frações obtidas foram concentradas em evaporador rotativo. A quantidade de
material de cada fração é mostrada na Tabela 13, p. 69.
Tabela 13- Dados Oriundos do tratamento cromatográfico de SGC.
ELUENTES FRAÇÕES (Rótulo) PESO (g)
HEXANO EHSGC-HH 0,485
DICLOROMETANO EHSGC-HD 1,611
ACETATO DE ETILA EHSGC-HÁ 0,880
METANOL EHSGC-HM 0,992
RENDIMENTO = 99%
5.7.2.1 Isolamento de SGC-01 a partir de SGC-HA
O tratamento cromatográfico do extrato hexânico de S. georgica forneceu a fração
SGC-HA (0,880 g), oriunda da eluição com acetato de etila. Esta fração apresentava-se como
uma mistura de um sólido branco e uma substância de aspecto amarelado.
A purificação da fração SGC-HA foi realizada com sucessivas extrações com solvente
(acetona) resultou na obtenção de uma nova fração denominada SGC-01 (120 mg), que se
apresentava como cristais incolores na forma de agulhas, solúveis em diclorometano com
faixa de fusão de 142,6 à 144,0ºC. O isolamento desta fração pode ser resumido no
fluxograma 02, p.73.
71
5.7.2.2 Fracionamento cromatográfico de SGC-HD de Senna georgica
O tratamento cromatográfico do extrato hexânico de Senna georgica forneceu a fração
SGC-HD (1,6110 g), que foi adsorvida em 2,4594 g de gel de sílica, pulverizado em gral de
porcelana e devidamente acondicionado sobre 16,6750 g de gel de sílica em coluna
cromatográfica. Utilizou-se como eluentes os seguintes solventes em ordem crescente de
polaridade: hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, puros ou em conbinações
binárias seguindo uma ordem crescente de polaridade. As frações de 1-4 eluídas com hexano
foram coletados em um volume de 50 mL e os demais volumes variados em 50 e 100mL. As
frações 5-10 foram eluídas com hexano/diclorometano (1:1), 10 e 11 com diclorometano, 12-
14 com diclorometano/acetato de etila(1:1), 15 com acetato de etila. Todas as frações
coletadas foram concentradas em evaporador rotativo, e reunidas segundo os resultados
observados pela análise em CCD de acordo com a semelhança do Rf. A quantidade de
material de cada fração é mostrada na Tabela 14, p.71.
Tabela 14- Dados Oriundos do tratamento cromatográfico de SGC-HD.
ELUENTES FRAÇÕES (Rótulo) PESO (g)
HEXANO SGC-HD 1-4 0,3600
HEXANO/DICLOROMETANO SGC-HD 5-9 0,5020
DICLOROMETANO SGC-HD 10-11 0,1740
DICLOROMETANO /
ACETATO DE ETILA
SGC-HD 12-14 0,0590
ACETATO DE ETILA SGC-HD 15 0,4000
RENDIMENTO = 92,8%
72
5.7.2.3 Isolamento de SGC1-02, SGC2-02 e SGC-03 a partir de SGC-HD 5-11
O tratamento cromatográfico de SGC-HD forneceu entre outras frações as frações 5-9
e 10-11 que ao serem analisadas por CCD apresentaram-se semelhantes, desta forma foram
reunidas e denominadas SGC-HD 5-11 (0,676 g), esta apresentava-se um aspecto de um
sólido amorfo amarelado. Que após sucessivas lavagens com diclorometano resultou em um
sólido branco amorfo solúvel em piridina denominada SGC-03 (15 mg), com faixa de fusão
de 77 à 79ºC.
A fração SGC-HD 5-11 foi purificada, utilizando-se a técnica de cromatografia em
placa preparativa. Amostra dissolvida na menor quantidade possível em diclorometano e
realizada a aplicação uma placa cromatográfica preparativa, eluída 2 vezes com hexano
/diclorometano (8:2). A faixa da amostra foi retirada por raspagem e deixadas em contato com
diclorometano por 20 min, depois filtrados forneceu cristais amarelado em forma de agulhas,
solúvel em diclorometano, com uma faixa de fusão de 193-195ºC, a amostra denominada
SGC1-02 (10 mg) e outra fração de cristais amarelo-alaranjado em forma de agulhas, solúvel
em diclorometano com uma faixa de fusão de 205 – 206,2 ºC, denominado SGC2-02 (5 mg).
Resumo da obtenção no fluxograma 02.
73
Fluxograma 02- Obtenção e isolamento de SGC-01, SGC1-02 SGC2-02e SGC-03 a partir do
extrato hexânico de Senna georgica.
EXTRATO HEXÂNICO DE Senna georgica (SGC)
4,0g
1- Coluna filtrante 2- CCD
FRAÇÃO SGC-HH
485mg
Purificação (Diclorometano)
1- Coluna Cromatográfica 2- CCD
FRAÇÃO SGC-HD
1,6110g
FRAÇÃO SGC-HD/5-10
10mg
DEMAIS FRAÇÕES
(Em Estudo)
SGC1-02
10mg
SGC-03
15mg
1- CCP 2- CCD
SGC2-02
5mg
Fração SGC-HA
0,880g
SGC-01
120 mg
Purificação (Acetona)
74
5.7.3 Fracionamento preliminar do extrato etanólico do caule de S. georgica
O estudo cromatográfico do extrato etanólico do caule de Senna georgica (EESGC),
iniciou-se com o fracionamento do utilizando a técnica de partição por solventes orgânicos de
polaridade crescente.
O extrato etanólico de S. georgica (65 g) solubilizado em metanol/água (1:1), a
metodologia empregada baseou-se no processo de partição líquido-líquido, utilizando-se uma
série de solventes com gradiente crescente de polaridade, como segue: diclorometano, acetato
de etila, puros. Após a eliminação completa dos solventes obteve-se as respectivas frações:
fração diclorometano, fração acetato de etila, fração metanólica (fração residual). Todas as
frações obtidas foram concentradas em evaporador rotativo. A quantidade de material de cada
fração é mostrada na Tabela 15, p.74.
Tabela 15- Dados Oriundos do tratamento cromatográfico do extrato etanólico do caule de
Senna georgica (EESGC).
ELUENTES FRAÇÕES (Rótulo) PESO (g)
DICLOROMETANO EESGC-D 7,467
ACETATO DE ETILA EESGC-A 28,699
METANOL EESGC-M 15,300
RENDIMENTO = 79,18%
5.7.3.1-Tratamento cromatográfico de EESGC-D de Senna georgica.
O tratamento cromatográfico do extrato etanólico de S. georgica forneceu a fração
EESGC-D (7,467 g) adsorvida em 6,010 g de gel de sílica, pulverizada em gral de porcelana e
devidamente acondicionada sobre 105 g de gel de sílica em coluna cromatográfica. Usando
como solvente hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol puros ou em combinações
binárias seguindo uma escala crescente de polaridade.
As frações de 1- 7 foram eluídas com hexano, as frações 8-10 com
hexano/diclorometano (1:1), as frações 11-15 diclorometano, as frações 16-18 com
diclorometano/acetato de etila (1:1), 19-20 com acetato de etila, 21-24 com acetato de
etila/metanol (1:1) e a fração 25-27 com metanol.
75
As massas (m) das frações coletadas encontram-se na Tabela 16, as amostras foram reunidas
segundo os resultados observados pela análise em CCD de acordo com a semelhança dos Rf.
Tabela 16- Dados oriundos do tratamento cromatográfico da fração EESGC-D do caule de
Senna georgica.
FRAÇÃO m (g)
EESGC-D (1-7) 0,124
EESGC-D(8-10) 0,278
EESGC-D(11-15) 0,680
EESGC-D(16- 18) 3,356
EESGC-D(19- 20) 0,522
EESGC-D(21-24) 0,487
EESGC-D(25-27) 1,020
RENDIMENTO 86,62%
5.7.3.2 Tratamento cromatográfico de EESGC-D (1-7) de Senna georgica.
A fração EESGC-D 1-7 (0,125 g) do material adsorvida em 0,500 g de gel de sílica,
pulverizada em gral de porcelana e devidamente acondicionada sobre 5,1800g de gel de sílica
em coluna cromatográfica. Usando como solvente hexano, diclorometano, acetato de etila e
metanol puros ou em combinações binárias seguindo uma escala crescente de polaridade.
As frações de 1- 12 foram eluídas com hexano, as frações 13-29 com
hexano/diclorometano (1:1), as frações 30-41 diclorometano, as frações 42-48 com
diclorometano/acetato de etila (1:1), 49-57 com acetato de etila, 58-67 com acetato de
etila/metanol (1:1) e a fração 68 com metanol.
As massas (m) das frações coletadas encontram-se na Tabela 17, as amostras foram
reunidas segundo os resultados observados pela análise em CCD de acordo com a semelhança
dos Rf.
Tabela 17- Dados oriundos do tratamento cromatográfico da fração EESGC-D (1-7) do caule
de Senna georgica.
FRAÇÃO m (g)
EESGC-D (1-12) 0,020
EESGC-D(13-29) 0,052
EESGC-D(30-41) 0,032
EESGC-D(42- 48) 0,015
EESGC-D(49-57) 0,003
RENDIMENTO 98 %
76
5.7.3.3 Isolamento de SGC-04 a partir de EESGC-D (13-29)
A fração EESGC-D 13-29 (0,052) apresentava-se como uma mistura de um sólido
amarelo claro com forma de agulhas. A fração foi submetida a um processo de recristalização
utilizando a acetona com solvente. Resultou na obtenção de sólido branco com forma de
agulhas, solúvel em diclorometano apresentando faixas de fusão entre 198-198,8°C,
denominada de fração SGC-04 (20 mg). O isolamento de fração pode ser resumido no
Fluxograma 03, p.73.
5.7.3.4 Tratamento cromatográfico de EESGC-D (16-18) de Senna georgica.
A fração EESGC-D (16-18) 3,3566 g do material adsorvida em 2,5003 g de gel de
sílica, pulverizada em gral de porcelana e devidamente acondicionada sobre 45g de gel de
sílica em coluna cromatográfica.
As frações de 1-6 foram eluídas com hexano, as frações 7-15 com
hexano/diclorometano (8:2), as frações 16-44 com hexano/diclorometano (5:5), as frações 45-
80 com diclorometano, as frações 81-98 com diclorometano/acetato de etila (3:7), 99-109
com acetato de etila, 110-125 com acetato de etila/metanol (1:1) e a fração 126 com metanol.
As massas (m) das frações coletadas encontram-se na Tabela 18, as amostras foram
reunidas segundo os resultados observados pela análise em CCD de acordo com a semelhança
dos Rf.
Tabela 18- Dados oriundos do tratamento cromatográfico em gel de sílica da fração EESGC-
D (16-18) do caule de Senna georgica.
FRAÇÃO m (g)
EESGC-D (1-6) 0,228
EESGC-D(7-15) 0,043
EESGC-D(16-44) 0,621
EESGC-D(45- 80) 0,202
EESGC-D(81-98) 1,052
EESGC-D(99-109) 0,478
EESGC-D(110-125) 0,525
EESGC-D(126) 0,018
RENDIMENTO 94%
77
5.7.3.5 Isolamento de SGC-05 a partir de EESGC-D (110-125)
A fração EESGC-D (110-125) apresentava-se como uma sólido marron. A fração
EESGC-D(110-125) 0,5252 g foi submetida a um processo de lavagem com metanol como
solvente. Resultou na obtenção de sólido branco amorfo, solúvel em piridina apresentando
faixas de fusão entre 273-275,8°C, denominada de fração SGC-05 (15 mg). O isolamento de
fração pode ser resumido no Fluxograma 03, p.77.
Fluxograma 03- Obtenção de SGC-04 e SGC-05 a partir do tratamento cromatográfico de
EESGC.
1- Partição MeoH/H2O (1:1) 2- CCD
DEMAIS FRAÇÕES
(Em Estudo)
FRAÇÃO EESGC-D
7,4675 g
FRAÇÃO EESGC-D/110-
125
0,5252g
FRAÇÃO EESGC-D/13-29
0,0520 g
FRAÇÃO SGC-04
20 mg
Recristalização (Acetona)
1- Coluna Filtrante 2- CCD
EXTRATO ETANÓLICO DE Senna georgica (EESGC)
65 g
FRAÇÃO SGC-05
15 mg
78
ESTUDOS FARMACOLÓGICOS
Capítulo VI
HO
CH3 CH3
CH3HH
H
CH3
H2C
H3C CH3
HO
OH
CH3
OH O
O
HO
79
6 Avaliação do Potencial Biológico de Senna georgica
6.1 Avaliação da Atividade Antioxidante de Senna georgica
A análise do potencial antioxidante utilizando o método na captura por uma substância com
potencial antioxidante do radical livre DPPH (1,1-dimetil-2-picril-hidrazil) foi realizado
utilizando os extratos etanólico do caule, folha e raiz de Senna georgica. Os resultados
encontram-se na Tabela 19 e na Figura 39.
Tabela 19- Acompanhamento cinético da atividade antioxidade e Percentual de varredura de
radicais livres de Senna georgica.
0 2 4 6 8 10 20 30 40 50 IV %
Branco 0,1 0,099 0,099 0,098 0,98 0,97 0,1 0,1 0,1 0,1
DPPH 0,829 0,821 0,829 0,824 0,83 0,832 0,832 0,846 0,855 0,856
Eugenol 0,12 0,121 0,121 0,121 0,122 0,121 0,121 0,119 0,119 0,12 85,51
SGF 0,757 0,755 0,754 0,749 0,752 0,753 0,75 0,759 0,765 0,764 7,73
SGC 0,2 0,16 0,151 0,146 0,14 0,136 0,123 0,111 0,097 0,079 90,46
SGR 0,336 0,273 0,254 0,247 0,235 0,225 0,197 0,182 0,169 0,134 83,82
Figura 39- Acompanhamento cinético da atividade antioxidante de Senna georgica.
Onde: SGF- S. georgica folhas, SGC- S. georgica caule,.SGR- S. georgica raiz
80
De acordo com os resultados observados pode-se concluir que somente o extrato das
folhas não apresentou atividade antioxidante significativa, destacando-se o extrato etanólico
do caule de S. georgica cujos excelentes índices de varredura (90,46%) de radicais livres na
concentração testada, apresentou índice de varredura maior que o padrão eugenol (85,51%). A
análise pelo método do DDPH para as antraquinonas isoladas, crisofanol e fisciona com
índices de 34,60% e 45,60 % respectivamente, permite atribuir para estas duas substâncias
pelo menos parte da atividade que apresentam os extratos testados. Os resultados apresentados
indica que o extrato etanólico do caule apresenta-se como uma fonte promissora de
antioxidantes naturais.
81
6.2 Teste de Citotoxidade dos extratos de Senna georgica
O teste de citotoxidade foi realizado no Laboratório de Oncologia Experimental da
Universidade Federal do Ceará sob a orientação da professora Letícia Veras Lotufo,
utilizando o método MTT, testados nos extratos etanólico da raiz (SG-R), folhas (SG-F) e
caule (SG-C). Os resultados encontram-se na Tabela 20.
Tabela 20 - Percentual do grau de inibição do crescimento celular (GI%) das amostras em
três linhagens tumorais testadas na dose única de 50 µg/mL.
Amostra SF295
GI%
HCT-8
GI%
MDA- MB435
GI%
SG-R 23,07±3,87 -3,37±9,13 0,38±8,18
SG-F 7,54±1,89 7,15±8,23 12,96±8,54
SG-C 12,25±3,33 2,29±6,76 20,63±3,74
MDA-MB435 (mama - humano), HCT-8 (cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma -
humano).
Os resultados mostram que o extrato etanólico da raiz de Senna georgica produziu o
melhor resultado com a inibição do crescimento para a linhagem de glioblastoma humano, no
entanto, somente percentuais acima de 75% são considerados
bons para a realização de estudos mais detalhados de atividade
citotóxica, portanto, como se pode observar, o extrato etanólico
de Senna georgica não apresentou um resultado relevante neste
ensaio, embora vários compostos antraquinônicos sejam
relatados como agentes antitumorais, como por exemplo a
daunorubicina (estrutura ao lado), que com o nome comercial
de Cerubidine®, já é utilizada em quimioterapia, no tratamento
de leucemia [MANEA et al., 2011].
82
6.3 Teste de atividade Anticolinesterásica
O teste de inibição da enzima acetilcolinesterase foi realizado no Laboratório de
Produtos Naturais da Universidade Federal do Ceará, sob a orientação da professora Maria
Tereza Salles Trevisan. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 21.
Tabela 21- Avaliação da atividade anticolinesterásica dos extratos de Senna georgica.
EXTRATO ATIVIDADE
ANTICOLINESTERÁSICA
TAMANHO DO HALO
Hexânico (Folhas) Negativo ---
Hexânico (Flores) Negativo ---
Hexânico (Caule) Positivo 7mm
Hexânico (Raiz) Positivo 10mm
Etanólico (Flores) Positivo 8mm
Etanólico (Frutos) Positivo 9mm
Etanólico (Raiz) Positivo 10mm
Etanólico (Folhas) Negativo ---
Etanólico (Caule) Negativo ---
Padrão(Carbachol) 9mm
De acordo com os resultados observados, somente os extratos hexânico das folhas e
flores e etanólico do caule e folhas de Senna georgica não apresentaram atividade para esse
teste. Na avaliação anticolinesterásica o aparecimento de halos em tornos dos "spots" das
amostras é indicativo de que ocorreu a inibição da enzima AChE. Os halos de inibição
apresentados no teste inibitório da AChE foram relevante, uma vez que os valores
encontrados são bastante próximos e até superior ao do padrão utilizado.
83
CONCLUSÕES
Capítulo VII
HO
CH3 CH3
CH3HH
H
CH3
H2C
H3C CH3
HO
OH
CH3
OH O
O
HO
84
7 CONCLUSÃO
O estudo do óleo fixo do caule de Senna georgica resultou na identificação de oito
ácidos graxos: ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido nonadecanóico, ácido
araquídico, ácido behêmico, ácido tricosanóico e ácido lignoléico totalizando 83,13% da
composição do óleo fixo. Destacaram-se como componentes majoritários os ácidos graxos
dos ácidos saturados palmítico (26,83%), lignocérico (18,60 %) e o nonadecanóico (11,18%).
Não foi identificado nenhum ácido graxo insaturado.
O estudo do extrato hexânico do caule de Senna georgica possibilitou o isolamento e
caracterização de uma mistura de esteroides β-sitosterol e estigmasterol de duas antraquinonas
1,8-diidroxiladas, crisofanol e fisciona e de um ácido carboxílico de cadeia longa denominado
de ácido triacontanóico.
O tratamento cromatográfico do extrato etanólico do caule de Senna georgica
possibilitou o isolamento e caracterização de uma mistura de fitoesteroides β-sitosterol e
estigmasterol glicosilado e um triterpeno pentacíclico conhecido como lupeol. Todas as
substâncias tiveram suas identidades químicas confirmadas pela análise de seus espectros de
RMN 13
C e 1H uni e bi dimensional, infravermelho, espectrometria de massas e comparadas
com os dados da literatura, sendo que estas substâncias são inéditas na espécie estudada.
Os extratos etanólico e hexânico do caule, folhas, raiz, flores e frutos também foram
investigados quanto ao seu potencial biológico, sendo realizados os testes de atividade
antioxidante, citotoxidade e a inibição da enzima acetilcolinasterase. Destes bioensaios, a
avaliação da atividade antioxidante e de inibição da enzima acetilcolinasterase apresentou
bons resultados, comprovando que Senna georgica é uma fonte promissora de antioxidantes
naturais.
.
85
Referências Bibliográficas
Capítulo VIII
HO
CH3 CH3
CH3HH
H
CH3
H2C
H3C CH3
HO
OH
CH3
OH O
O
HO
86
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA
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