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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

RICARDO BASTO SOUZA

ALGA MARINHA VERMELHA Gracilaria cornea: NOVAS PERSPECTIVAS

BIOTECNOLÓGICAS E IMPLICAÇÕES NEUROFARMACOLÓGICAS

Fortaleza-CE

2015

RICARDO BASTO SOUZA

ALGA MARINHA VERMELHA Gracilaria cornea: NOVAS PERSPECTIVAS

BIOTECNOLÓGICAS E IMPLICAÇÕES NEUROFARMACOLÓGICAS

Tese apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Bioquímica da

Universidade Federal do Ceará como

parte dos requisitos para obtenção do

título de Doutor em Bioquímica. Área de

concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientadora: Prof. Dra. Norma Maria Barros

Benevides

Fortaleza-CE

2015

AGRADECIMENTOS

À Deus, pela oportunidade de ter uma vida cheia de novas experiências, conhecer

novos lugares e pessoas, pelas oportunidades, momentos bons e ruins, bons amigos e

motivação e a capacidade para sempre estar pronto para lutar uma “boa batalha”, pelas quais

são o motivo da nossa existência a caminho da nossa iluminação espiritual.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), através

do convênio com o curso de Pós-Graduação em Bioquímica do Departamento de Bioquímica

e Biologia Molecular do Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará e pela bolsa

concedida.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, por

formentar a o desenvolvimento deste projeto.

À Universidade Federal do Ceará, através do Departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular, que viabilizou a execução deste trabalho em seus laboratórios e que

contribuíram para enriquecer o meu conhecimento científico.

À Profa. Dra. Norma Maria Barros Benevides, minha orientadora e amiga, a quem

sou eternamente grato por ter me acolhido e dado à oportunidade de me conhecer como eu

realmente sou. Além da força e confiança para desenvolver e completar a minha pesquisa no

Laboratório de Carboidratos e Lectinas (CarboLec) da UFC, foi indispensável para meu

crescimento e para minha formação pessoal e científica. Aptidões estas que a tornam a

orientadora mais disputada entre os alunos de mestrado e doutorado do programa de

Bioquímica – UFC.

À Profa. Dra. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar, da Faculdade de Medicina –

Campus Sobral/UFC, minha co-orientadora e amiga, pelo respeito, confiança e acolhimento

durante o desenvolvimento dessa nova parceria bem estabelecida. Sempre estarei a sua

disposição para apoiá-la e ajudá-la no meio científico e pessoal quando precisar.

À Dra. Lucia Helena Sider, pesquisadora da Empresa Brasileira de Pesquisa

Agropecuária – EMBRAPA, minha “mãe científica”, pelo acolhimento, amizade e todo

ensinamento durante o breve período que possuí vínculo com a EMBRAPA. Sou muito grato

e espero sempre manter nossa amizade e, assim que possível, tentarmos novamente criar uma

parceria na pesquisa.

Ao prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha, da Universidade Estadual Vale do

Acaraú e, idealizador e coordenador do Núcleo de Biotecnologia de Sobral – NUBIS, meu co-

orientador, “pai científico” e amigo, pela disposição em sempre ajudar seus “pulpilos”

independentemente da situação. Apesar de sempre me citar como “teimoso” e nem sempre

concordarmos em um assunto, sou e serei sempre grato por sua amizade e reconhecimento dos

meus esforços perante aos desafios científicos e na vida pessoal.

À Profa. Dra. Mirna Marques Bezerra, da Faculdade de Medicina – Campus

Sobral/UFC, pela atenção durante o período que estive no Laboratório de Farmacologia –

Campus Sobral/UFC, pelo apoio e orientação durante o mestrado em Sobral, a quem sempre

busquei realizar todo o possível para agradá-la, por ter proporcionado a minha inclusão no

laboratório da profª Norma.

Aos Professores doutores Gerardo Cristino Filho e José Ronaldo Vasconcelos da

Graça, da Faculdade de Medicina de Sobral - UFC (FAMED), pelo apoio fornecido ao

desenvolvimento e conclusão dos trabalhos dispostos nesta tese.

À profa. Dra. Silvânia Maria Mendes Vasconcelos, do laboratório de

Neurofarmacologia – UFC, por ter disponibilizado o laboratório e permitido a realização de

análises neuroquímicas, bem como ao Valdécio pelo auxílio na realização destas análises.

À profa. Dra. Silvia Lima Costa, da Universidade Federal da Bahia – UFBA, pelo

grande acolhimento que me foi proporcionado durante minha breve passagem por Salvador,

bem como para o seu orientando Wagno, por todo o auxílio para o desenvolvimento de

ensaios in vitro.

À profa. Dra. Márjory Lima Holanda, pela amizade, confiança e participação para a

conclusão do doutorado.

Ao prof. Dr. João Paulo e Raulzito pelas contribuições importantes para a realização

das análises dos dados transcriptômicos.

À Annyta Fernandes Frota, por ter me apresentado a profa. Lissiana, e também pela

ajuda e força para o desenvolvimento de todas as etapas realizadas deste trabalho, bem como

pelo apoio e companheirismo. Este trabalho só foi possível por sua causa. Muito Obrigado!

À Chistiane, principalmente pela amizade, por permitir trabalhar com a mesma alga e

também pela parceria e ajuda no desenvolvimento de vários trabalhos e atividades

relacionadas com esta tese e com nosso período acadêmico. Muito obrigado!

À Rayane, Thomas, Nayara, Tarcízio, Lulu e Cirlânio pela amizade e ajuda nos

experimentos e amizade.

Aos meus amigos, colegas e profissionais da Faculdade de Medicina de Sobral

(FAMED): Profª Lissiana, Prof. Rodrigo, prof. João Garcia, Prof. Ronaldo, Profª. Auxiliadora

(Dôra), Annyta, Rayane, Nayara, Tarcízio, Thomas, Cirlânio, Lulu, Francisco (FranJomes),

Alexandre, Emanuelle, Thales, Mary Star, Edilda, Alice, Samuel, Nayane, Vitória, Carlos,

Rafael e Jordânia, pela amizade e cooperação, também a Gade, Riviane, Maiara, Jonatas e

Jonas (gêmeos), Isabel, Bruna, Suelen e vigias, por contribuições adicionais.

Aos amigos e integrantes e ex-integrantes do laboratório de Carboidratos e Lectinas

(Carbolec) da Universidade Federal do Ceará: Profa. Dra. Norma Maria Barros Benevides,

Profa. Dra. Marjory Lima Holanda, Chistiane (Chis), Ticiana Lima (Tici II), Neto, Gerardo

(Zé), Ariévilo (Ari), Edfranck (Ed), Ianna, Ana Luíza (Aninha), Ismael, Gabriela (Gabi I),

Luana, Renata, Valdécio, Natássia, Ticiana Abreu (Tici I), Ygor, Willame (Will), Jane,

Beatriz (Bia), Patrício (Patu), Clara, Lívia, George, Renato, Melissa e Géssica pela amizade e

coleguismo, pelo ótimo convívio, diversão e pelo conhecimento que adquiri durante estes

quatro anos em Fortaleza.

Aos amigos e colegas de doutorado: Sra Nágila, Mayron, Raulzito, Gleyciane,

Cleane, Daniel, Antônio Rocha, Beatriz, Camila, Daniela e Fred.

Aos amigos de Salvador, da Universidade Federal da Bahia, Profa. Dra. Silvia, Profa.

Dra. Maria de Fátima Dias Costa, Wagno, Lívia e Joana por todo o apoio e amizade.

Aos professores Dr. Márcio Viana Ramos e Prof. Dr. José Hélio Costa por todo o

auxílio e colaboração nas atividades acadêmicas.

Aos meus amigos da secretaria de Pós-graduação em Bioquímica, Maria de Fátima

Andrade e Daniel Torres Medeiros, que sempre me ajudaram na resolução de todos os

problemas burocráticos.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

À minha mãe, Maria da Conceição Couto Basto (Ceiça), que sempre me trouxe seu

maior amor e dedicação em momentos bons e ruins, sem transparecer os ruins, confiando,

sempre acreditando e tornando possível chegar aonde eu cheguei. Dedico todo meu amor a

você!

Às minhas irmãs (Cristina e Lucianna Basto), pelo apoio durante a minha vida.

Às minhas primas Rosana e Regina (minha madrinha), por todo o apoio durante meu

período de graduação e amizade.

Ao meu cunhado, Fábio, pai do meu sobrinho e afilhado, Arthur.

À minha falecida tia Magali Basto, que deu todo o apoio para minha realização

acadêmica desde a graduação e que, onde estiver, está sempre de olho em nós.

À Annyta, que com muito carinho participou e ajudou o máximo possível para a

conclusão deste trabalho.

Novamente, a todos os meus amigos.

Agradeço e dedico todas as minhas conquistas a todos vocês!

“O bem que praticares, em algum lugar, é teu advogado em toda a parte.”

“A prática do bem, simples e infatigável, pode modificar a rota do destino.”

Emmanuel

RESUMO

A alga marinha vermelha Gracilaria cornea apresenta-se como uma fonte natural ainda pouco

explorada, com bioativos em potencial, como os polissacarídeos sulfatados. Seu

polissacarídeo sulfatado, do tipo agarana (AS-Gc), possui sua estrutura caracterizada e

atividade anti-inflamatória e anti-nociceptiva reportada na literatura. Entretanto, avaliações

metodológicas no seu processo de extração, bem como novas atividades biológicas em

potencial ainda são pouco reportadas na literatura. Deste modo, o presente estudo objetivou

analisar um novo reagente para o isolamento de AS-Gc e, posteriormente, avaliar seus efeitos

e possíveis mecanismos de ação em modelos de avaliação de atividades psicotrópicas e

neuroprotetoras in vivo e in vitro. Inicialmente, realizou-se uma avaliação da metodologia de

isolamento de polissacarídeos sulfatados isolados da alga G. cornea utilizando álcool

isoamílico (AIA), em relação ao método clássico utilizando cloreto de 1-hexadecilpiridinio

(CCP), considerando parâmetros qualitativos e quantitativos (análises de percentual de

rendimento, de caracterização físico-química e estrutural) e de uma avaliação de atividade

anticoagulante in vitro. Para análise de efeitos psicotrópicos de AS-Gc, avaliou-se a

administração aguda de três doses (0,3; 3 ou 30 mg/Kg) e duas vias de administração (oral-

v.o. ou subcutânea-s.c.) em camundongos. Em seguida, os animais foram submetidos a

avaliação fisiológica e a ensaios neurocomportamentais, indicativo de nível de ação no

sistema nervoso e relacionados a alterações locomotoras e de comportamentos associados de

ansiedade, depressão e sedação. Para a investigação do potencial neuroprotetor, realizou-se o

modelo de indução de doença de Parkinson em ratos com injeção intraestriatal da neurotoxina

6-hidroxidopamina (6-OHDA), seguido por única administração de AS-Gc (15, 30 ou 60 µg),

via intraestriatal. Após 14 dias, os animais foram submetidos a análises locomotoras,

neurocomportamentais e fisiológicas. Após eutanásia, áreas cerebrais (hipocampo, córtex pré-

frontal e corpos estriados) foram dissecadas e utilizadas para análises neuroquímicas e

transcricionais. Adicionalmente, avaliou-se o potencial antioxidante de AS-Gc em ensaios in

vivo e in vitro. Os resultados sugerem que o método clássico, utilizando CCP, apresenta maior

eficiência e qualidade para obtenção de AS-Gc, em relação ao uso de AIA. Entretanto, o

método alternativo, utilizando AIA, demonstrou potenciais aplicações biotecnológicas para

obtenção de outras moléculas de interesse comercial e científico. AS-Gc (30 mg/kg, v.o. e

s.c.) apresentou uma segurança farmacológica e promoveu o aumento da atividade

exploratória em camundongos. AS-Gc (60 µg, intraestrital) promoveu uma atividade

neuroprotetora in vivo e in vitro, através de proteção mitocondrial, indução de glutationa

reduzida, redução dos níveis de peroxidação lipídica e de nitrito, e modulação de vias

transcricionais em corpo estriado de ratos, retornando atividades locomotoras e renais a

condições normais. Desta forma, o presente estudo apresenta novas perspectivas

biotecnológicas para obtenção de moléculas quimicamente diferentes de algas marinhas e

sugere novas implicações neurofarmacológicas para o uso da agarana sulfatada de G. cornea.

Adicionalmente, AS-Gc apresenta potencial terapêutico contra desordens neurodegenerativas.

Palavras-chave: Gracilaria cornea, Álcool isoamílico, Atividade exploratória, Atividade

neuroprotetora.

ABSTRACT

The red seaweed Gracilaria cornea is presented as a natural source still little explored, with

potential bioactive, such as sulfated polysaccharides. Its sulfated polysaccharide, agaran-type

(AS-Gc), wherein its structure and has anti-inflammatory and anti-nociceptive activity

reported in the literature. However, methodological evaluations in their extraction process as

well as new potential biological activities are still little reported in the literature. Thus, this

study aimed to analyze a new reagent for isolation of AS-Gc and then evaluate its effects and

possible mechanisms of action on valuation models psychotropic activity and neuroprotective

in vivo and in vitro. Initially, we evaluated the method for isolating sulfated polysaccharides

from algae G. cornea using isoamyl alcohol (IAA), in relation to the classical method using 1-

hexadecylpyridinium chloride (CPC), considering qualitative and quantitative parameters

(percentage yield analysis, physical-chemical and structural characterization) and evaluation

of anticoagulant activity in vitro. For analysis of psychotropic effects of AS-Gc, we evaluated

the acute administration of three doses (0.3, 3 or 30 mg / kg) and two routes of administration

(per os-p.o. or subcutaneous-s.c.) in mice. Then, animals were assessed in physiological and

neurobehavioural tests indicative of action level on nervous system and locomotive disorders

and behaviors associated with anxiety, depression and sedation. To investigate the potential

neuroprotective, we carried out the Parkinson's disease model in rats induced by intrastriatal

injection of the neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA), followed by a single dose of AS-

GC (15, 30 or 60 μg) via intrastriatal. After 14 days, locomotives, neurobehavioral and

physiological analyzes were performed. After euthanasia, brain areas (hippocampus, the

prefrontal cortex and striatum) were dissected and used to neurochemical and transcriptional

analyzes. Additionally, we evaluated the antioxidant potential of AS-Gc in in vivo and in

vitro. The results suggest that the classical method using CCP has greater efficiency and

quality to obtain a AS-Gc, in relation to the use of AIA. However, the alternative method,

using AIA showed potential biotechnological applications to obtain other molecules of

commercial and scientific interest. AS-Gc (30 mg / kg, p.o. and s.c.) presented a safety

pharmacology and promoted increased exploratory activity in mice. AS-Gc (60 μg,

intraestrital) promoted a neuroprotective activity in vivo and in vitro through mitochondrial

protection, reduced glutathione induction, lipid peroxidation and nitrite levels reduction, and

modulation of transcriptional pathways in the striatum of rats and returning locomotive and

renal activities to normal conditions. Thus, this study show new perspectives for

biotechnological obtaining chemically different molecules seaweed and suggests new

neuropharmacological implications for the use of sulfated agaran from G. cornea.

Furthermore, the AS-Gc present therapeutic potential against neurodegenerative disorders.

Keywords: Gracilaria cornea, Isoamyl alcohol, Exploratory activity, Neuroprotective

activity.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Distribuição de Algas no Mundo................................................... 28

Figura 2 –

Representação da Estrutura de Polissacarídeos Sulfatados de Algas

Pardas....................................................................................................

32

Figura 3 – Representação da Estrutura de Polissacarídeos Sulfatados de Algas

Verdes...................................................................................................

33

Figura 4 –

Representação da Estrutura de Polissacarídeos Sulfatados de Algas

Vermelhas.............................................................................................

34

Figura 5 – Estrutura química do reagente CCP...................................................... 40

Figura 6 – Estrutura química do álcool Isoamílico (AIA)...................................... 40

Figura 7 – G. cornea............................................................................................... 42

Figura 8 – Aspectos gerais observados nos métodos de precipitação por CCP e

AIA.....................................................................................................

48

Figura 9 – Análise eletroforese.............................................................................. 50

Figura 10 – Análise estrutural parcial por Infravermelho (Carboidratos totais)....... 51

Figura 11 – Análise estrutural parcial por Infravermelho (Lipídio)......................... 53

Figura 12 – Ilustração da Análise Neurocomportamental Preliminar....................... 66

Figura 13 – Ilustração do Campo Aberto (Open Field test)..................................... 67

Figura 14 – Ilustração do equipamento utilizado para o teste da Placa perfurada

(Hole Board test).................................................... ............................

68

Figura 15 – Ilustração do equipamento utilizado para o teste da Cruz Elevada

(Plus Maze test)..................................................... ............................

69

Figura 16 – Ilustração do equipamento utilizado para o teste do Nado Forçado...... 70

Figura 17 – Ilustração do equipamento utilizado para o teste do teste da

Suspensão por cauda..............................................................................

71

Figura 18 – Ilustração do Sono Induzido por Pentobarbital...................................... 72

Figura 19 – Análise macroscópica da mucosa gástrica interna após tratamento via

oral de AS-Gc........................................................................................

76

Figura 20 –

Análise da atividade motora no Teste do Campo aberto (Open Field

test).........................................................................................................

77

Figura 21 – Hole Board test..................................................................................... 78

Figura 22 – Plus Maze test........................................................................................ 79

Figura 23 – Análise de Atividade Antidepressiva................................................... 81

Figura 24 – Tempo de Sono Induzido por Pentobarbital.......................................... 81

Figura 25 – Ilustração do Modelo de Doença de Parkinson induzido por injeção

unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA)..........................................

100

Figura 26 – Teste do Campo Aberto (Open Field test)........................................... 101

Figura 27 – Teste de Rota-Rod................................................................................. 102

Figura 28 – Teste rotacional induzido por apomorfina............................................. 103

Figura 29 – Gaiola Metabólica para Ratos................................................................ 105

Figura 30 – Ilustração da Reação de Griess.............................................................. 106

Figura 31 – Ilustração da reação entre ácido tiobarbitúrico com os produtos de

decomposição dos hidroperóxidos........................................................

107

Figura 32 – Ilustração da reação entre a glutationa reduzida e DTNB (reagente de

Ellman) para a determinação de hidroperóxidos empregando a

enzima glutationa reduzida.................................................................

108

Figura 33 – Ilustração da reação da oxidação de Amplex Red, em presença de

horseradish peroxidase, para o fluoróforo resorufina...........................

116

Figura 34 – Ilustração da reação de estabilização do radical livre DPPH................. 117

Figura 35 – Análise da atividade motora no Teste do Campo aberto (Open Field

test).........................................................................................................

120

Figura 36 – Treinamento para o Teste do Rota-Rod................................................ 122

Figura 37 – Teste do Rota-Rod.................................................................................. 123

Figura 38 – Análise Temporal da Variação Rotacional induzido por Apomorfina.. 125

Figura 39 – Teste Rotacional induzido por Apomorfina........................................... 126

Figura 40 – Análise do tempo de tratamento - Teste Rotacional induzido por

Apomorfina............................................................................................

127

Figura 41 – Teste da Cruz Elevada (Plus Maze test)................................................. 129

Figura 42 – Análise da variação ponderal................................................................. 131

Figura 43 – Análise de alterações da atividade renal................................................ 132

Figura 44 – Análise dos níveis de nitrito/nitrato nas áreas cerebrais....................... 134

Figura 45 – Análise dos níveis de Peroxidação lipídica (TBARS) nas áreas

cerebrais.................................................................................................

135

Figura 46 – Análise dos níveis de Glutationa Reduzida (GSH) nas áreas

cerebrais.................................................................................................

136

Figura 47 – Análise dos níveis de Monoaminas em Corpo Estriado........................ 138

Figura 48 – Eletroforese do RNA total isolado de corpo estriado de

ratos........................................................................................................

141

Figura 49 – Análise da expressão de RNA mensageiro dos genes de controle

endógeno................................................................................................

144

Figura 50 – Análise do perfil de expressão do RNAm de BDNF, p65, iNOS e

IL1β no striatum (núcleo ipsilateral).....................................................

147

Figura 51 – Efeitos de AS-Gc contra Mitocondriais induzidos por Indutores

Oxidativos..............................................................................................

149

Figura 52 – Atividade antioxidante – Ensaio de Inibição de DPPH......................... 150

Figura 53 – Mapa KEGG da via de sinalização de TNF........................................ 200

Figura 54 – Mapa KEGG da via de sinalização de Quimiocinas............................. 201

Figura 55 – Mapa KEGG da via de sinalização de receptores de citocinas.............. 202

Figura 56 – Mapa KEGG da via de sinalização para migração transendotelial de

leucócitos...............................................................................................

203

Figura 57 – Mapa KEGG da via de sinalização de apoptose................................... 204

Figura 58 – Mapa KEGG da via de sinalização da doença de Alzheimer............... 205

Figura 59 – Mapa KEGG da via de sinalização da doença de Príon........................ 206

Figura 60 – Mapa KEGG da via de sinalização de cascatas de complemento e

coagulação..............................................................................................

207

Figura 61 – Mapa KEGG da Diabetes mellitus tipo II............................................. 208

Figura 62 – Mapa KEGG da via de sinalização de secreção biliar.......................... 209

Figura 63 – Mapa KEGG da via de metabolismo de drogas e outras enzimas......... 210

Figura 64 – Mapa KEGG da via de interação de receptores de neuroativos

ligantes...................................................................................................

210

Figura 65 – Mapa KEGG da via de sinalização de proteoglicanos em câncer.......... 211

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Análise bioquímica dos extratos obtidos dos dois métodos........... 50

Tabela 2 – Principais sinais característicos de agaranas no infravermelho

por espectroscopia transformada de Fourier..................................

52

Tabela 3 – Análise do Potencial efeito anticoagulante in vitro dos

polissacarídeos isolados da alga marinha vermelha G. cornea em

comparação a heparina..................................................................

54

Tabela 4 – Análises neurofarmacológicas preliminares.................................. 74

Tabela 5 – Análise da micção e atividade excretória após administração de

AS-Gc............................................................................................

75

Tabela 6 – Protocolo de Tratamento Experimental do Modelo de Doença de

Parkinson........................................................................................

99

Tabela 7 – Descrição dos oligonucleotídeos (primers) utilizados na reação

de qPCR.........................................................................................

112

Tabela 8 – Análise quantitativa do RNA total isolado de núcleos da base

(estritado).......................................................................................

140

Tabela 9 – Quantificação do RNA total........................................................... 143

Tabela 10 – Identificação de genes diferencialmente expressos entre os

grupos 6-OHDA e Sham................................................................

178


grupos AS-Gc e Sham....................................................................

181


grupos 6-OHDA e AS-Gc.............................................................

183

Tabela 13 – Identificação de LOCs diferencialmente expressos entre os

grupos 6-OHDA e Sham...............................................................

185


grupos AS-Gc e Sham....................................................................

186


grupos 6-OHDA e AS-Gc.............................................................

187

Tabela 16 – Termos de KO identificados de genes diferencialmente

expressos para o grupo 6-OHDA, em relação ao grupo Sham.....

192


expressos para o grupo AS-Gc, em relação ao grupo Sham..........

194


expressos para o grupo AS-Gc, em relação ao grupo 6-OHDA....

195

Tabela 19 – Mapa KEGG identificados de genes diferencialmente expressos

para o grupo 6-OHDA, em relação ao grupo Sham.......................

196


para o grupo AS-Gc, em relação ao grupo Sham...........................

198


para o grupo AS-Gc, em relação ao grupo 6-OHDA.....................

199

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Melting curve....................................................................... 146

Gráfico 2 – Escores de Qualidade............................................................ 169

Gráfico 3 – Distribuição do Escore de Qualidade...................................... 171

Gráfico 4 – Análise do Perfil da Densidade e expressão global de genes..... 174

Gráfico 5 – Análise Global de Genes Diferencialmente Expressos.............. 177

Gráfico 6 – Histograma de Classificação da ontologia do gene................... 189

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

(w/v) Massa/volume

∆ Variação

∑ Somatório

°C Graus Célcius

µL Microlitros

µM Micromolar

µMol Micromol

6-OHDA 6-hidroxidopamina

A/ABS Absorbância

AP Antero-posterior

AP-1 Fator de transcrição ativador de proteína 1

AS-Gc Agarana sulfatada isolada da alga marinha Gracilaria cornea

ATP Adenina trifosfatada

BDNF Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro

BDZ Benzodiazepínicos

BSA Albumina soro-bovina

cDNA DNA complementar

CE Corpo estriado

CEPA Comissão de Ética em Pesquisa Animal

CFP Córtex Pré-frontal

Cm Centímetros

CREB Fator de transcrição do elemento de ligação proteico

Ct Cycle threshold

DEPC Dietilpirocarbonato

DNA Ácido desoxirribonucleico

dNTP Desoxiiribonucleotídeos trifosfatados

DP Doença de Parkinson

dT Desoxitimina

DTNB Ácido 2-nitrobenzóico

DTT Ditiotreitol

DZP Diazepam

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

EGTA Ácido etileno glicol tetra-acético

eNOS/NOS3/Cnos Óxido nítrico sintase endotelial

EPM Erro padrão da média

FLU Flumazenil

g Gramas

GAPDH Gliceraldeído 3 fosfodesidrogenase

GSH Glutationa reduzida

GSSG Glutationa oxidada

GSTNB Aduto Glutationa-ácido 2-nitro-5-mercapto-benzóico

h Hora

H+ Próton de Hidrogênio

H3PO4 Ácido fosfórico

HC Hipocampo

HCl Ácido clorídrico

HEPES Ácido 2-[4-(2-hidroxietil) piperazina-1-yl]etanosulfônico

HPRT Hipoxanthina-guanina fosforibosil transferase

HRP Horseradish peroxidase

i.p. Intraperitoneal

IL1β Interleucina 1 beta

IMI Imipramina

iNOS/NOS2 Óxido nítrico sintase induzida

ipsi Ipsilateral

K+ Íon de Potássio

KCl Cloreto de potássio

Kg Quilogramas

L Médio-lateral

MCF-7 Linhagens de células de câncer humano

MDA Malonildialdeído

Mg Miligramas

Mg2+

Magnésio

min Minutos

Mix Mistura

mM Milimolar

n Quantidade de animais por grupo

NaNO2 Nitrito de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

NCBI National Center for Biotechnology Information

NEBA Número de entratadas nos braços abertos

NEED N-naftil-etilenodiamina

NFKB Fator Nuclear Kappa B

Nm Nanômetros

NMDA N-metil D-aspartato

nNOS/NOS1 Óxido nítrico sintase neuronal

NO Óxido nítrico

OH Hidroxila

p65 Proteínas 65 (componente do fator de transcrição NFKB)

PCR Reação em cadeia da polimerase

PEBA Percentagem de entradas nos braços abertos

Per os Via oral

PGE2 Prostaglandina da série E2

pH Potencial Hidrogeniônico

PKA Proteína quinase A

PTBA Percentagem do tempo de permanência nos braços abertos

qPCR PCR em tempo real

RNA Ácido ribonucleico

RNAm RNA mensageiro

ROS Espécies reativas de oxigênio

rpm Rotações por minuto

s Segundos

SBCAL Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

SNC Sistema nervoso central

TBARS Substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico

TGI Trânsito gastrointestinal

TNB Ácido 2-nitro-5-mercapto-benzóico

TNF Teste do nado forçado

TNFα Fator de necrose tumoral alfa

TPBA Tempo de permanência nos braços abertos

TRKB Receptor tropomiosina quinase B

TSC Teste de suspensão da cauda

U Unidades

UFC Universidade Federal do Ceará

V Vertical

Vol Volume

W Watts

α-Tub Alfa tubulina

β-Act Beta actina

SUMÁRIO

1 REVISÃO DE LITERATURA........................................................... 28

1.1 Algas e sua Importância...................................................................... 28

1.2 Polissacarídeos Sulfatados.................................................................. 29

1.2.1 Classificação dos Polissacarídeos Sulfatados de Macroalgas

Marinhas..............................................................................................

31

1.2.1.1 Fucoidanas ou Fucanas Sulfatadas..................................................... 31

1.2.1.2 Arabino-galactanas.............................................................................. 32

1.2.1.3 As Galactanas Sulfatadas..................................................................... 33

1.3 O gênero Gracilaria............................................................................. 35

1.3.1 Estrutura Química e Atividades Biológicas de Polissacarídeo

Sulfatado de G. cornea.........................................................................

35

CAPÍTULO I - ANÁLISE COMPARATIVA DE DOIS

MÉTODOS DE ISOLAMENTO DE POLISSACARÍDEOS

SULFATADOS DA MACROALGA MARINHA VERMELHA

Gracilaria córnea..................................................................................

37

2 INTRODUÇÃO.................................................................................... 38

2.1 Polissacarídeos Sulfatados de Macroalgas Marinhas

Vermelhas.............................................................................................

38

2.1.2 Importância Econômica-Industrial-Biotecnológica.......................... 38

2.2 Métodos de Isolamento de Polissacarídeos Sulfatados de Algas..... 39

2.3 Hipótese Científica............................................................................... 41

3 OBJETIVOS......................................................................................... 42

3.1 Geral...................................................................................................... 42

3.2 Específicos............................................................................................. 42

4 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................. 43

4.1 Coleta de Espécimes da Macroalga Marinha Gracilaria................. 43

4.2 Aspéctos Éticos..................................................................................... 44

4.3 Isolamento de Polissacarídeos Sulfatados.......................................... 44

4.4 Análises Bioquímicas........................................................................... 45

4.4.1 Análise do Rendimento........................................................................ 45

4.4.2 Determinação do Teor de Sulfato....................................................... 46

4.4.3 Análise de Possíveis Contaminantes Proteicos.................................. 46

4.4.4 Análise de Dispersão em gel por Eletroforese................................... 46

4.4.5 Espectroscopia por Infravermelho..................................................... 46

4.5 Análise de Atividade Anticoagulante por Ensaio do Tempo de

Tromboplastina Parcial Ativada – (TPPa)........................................

46

4.6 Análises Estatísticas............................................................................. 47

5 RESULTADOS.................................................................................... 48

5.1 Observações Preliminares dos dois Métodos..................................... 48

5.2 Análises Bioquímicas........................................................................... 49

5.2.1 Rendimento, Teor de Sulfato e Presença de contaminantes

proteicos................................................................................................

49

5.2.2 Análise Eletroforética.......................................................................... 49

5.2.3 Análise por Infravermelho.................................................................. 51

5.3 Avaliação de Atividade Anticoagulante (Ensaio do Tempo de

Tromboplastina Parcial Ativada - TPPA).........................................

54

6 DISCUSSÃO......................................................................................... 55

7 CONCLUSÃO...................................................................................... 58

CAPÍTULO II - AGARANA SULFATADA DE G. cornea:

AVALIAÇÃO DE EFEITOS

NEUROPSICOFARMACOLÓGICOS EM CAMUDONGOS.......

59

8 INTRODUÇÃO.................................................................................... 60

8.1 Atividades Biológicas de Polissacarídeos Sulfatados de

Macroalgas Marinhas.........................................................................

60

8.2 Uso de Modelos Animais para a Investigação de Possíveis

Alterações Neurocomportamentais induzidas por Bioativos...........

61


9 OBJETIVOS........................................................................................ 63

9.1 Geral..................................................................................................... 63

9.2 Específicos............................................................................................ 63

10 MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 64

10.1 Obtenção de espécimes da alga Gracilaria córnea............................ 64

10.2 Isolamento da Agarana sulfatada...................................................... 64

10.3 Animais................................................................................................. 64

10.4 Aspectos éticos...................................................................................... 64

10.5 Modulação Farmacológica.................................................................. 65

10.6 Investigação dos Efeitos Neurocomportamentais da Agarana

Sulfatada (AS-Gc) em Camundongos................................................

65

10.6.1 Analises Neurocomportamentais e Fisiológicas Preliminares......... 65

10.6.2 Análise de Alterações Locomotoras pelo teste do Campo Aberto

(Open Field test)...................................................................................

67

10.6.3 Teste da Placa Perfurada (Hole Board test)....................................... 68

10.6.4 Teste da Cruz Elevada (Pluz Maze test)............................................. 69

10.6.5 Teste do Nado Forçado........................................................................ 70

10.6.6 Teste de Suspenção por Cauda........................................................... 71

10.6.7 Tempo de Sono induzido por Pentobarbital...................................... 72


11 RESULTADOS.................................................................................... 73

11.1 Análises Neurocomportamentais e Fisiológicas Preliminares......... 73

11.2 Avaliação da Atividade Locomotora pelo teste do Campo Aberto

(Open Field test)....................................................................................

73

11.3 Análise da Atividade Exploratória através do Teste da Placa

Perfurada (Hole Board test)................................................................

78

11.4 Análise do Potencial Ansiolítico através do Teste da Cruz

Elevada (Plus Maze test)...................................................................

79

11.5 Avaliação de Potencial Atividade Antidepressiva através dos

testes de Nado Forçado e Suspensão por Cauda..............................

80

11.6 Análise de Atividade Hipnótico/Sedativa através do Modelo de

Tempo de Sono induzido por Pentobarbital.....................................

80

12 DISCUSSÃO......................................................................................... 82

13 CONCLUSÃO...................................................................................... 85

CAPITULO III - AGARANA SULFATADA DE G. cornea:

ATIVIDADE NEUROPROTETORA EM MODELO DE

DOENÇA DE PARKINSON EM RATOS.......................................

86

14 INTRODUÇÃO.................................................................................... 87

14.1 O Sistema Nervoso Central a importância de sua integridade

funcional...............................................................................................

87

14.2 A Neurodegeneração......................................................................... 88

14.2.1 Neurodegeneração e a plasticidade neural..................................... 88

14.2.2 A neuroinflamação.......................................................................... 89

14.3 Doença de Parkinson.......................................................................... 90

14.3.1 Epidemiologia....................................................................................... 90

14.3.2 Etiologia/Fisiopatologia....................................................................... 91

14.4 Indução Experimental de Doença de Parkinson como Modelo de

Estudo de Processos de Neurodegeneração......................................

92

14.5 Polissacarídeos Sulfatados: Moléculas Bioativas com Potencial

para Neuroproteção.............................................................................

94


15 OBJETIVOS......................................................................................... 95

15.1 Geral...................................................................................................... 95

15.2 Específicos............................................................................................. 95


16.1 Obtenção de espécimes da alga Gracilaria cornea............................ 97

16.2 Isolamento da Agarana sulfatada....................................................... 97

16.3 Animais................................................................................................. 97

16.4 Aspectos éticos...................................................................................... 97


16.6 Investigação dos Efeitos Neuroprotetores da Agarana Sulfatada

(AS-Gc) em Ratos.................................................................................

98

16.6.1 Indução do Modelo de Doença de Parkinson através de injeção

unilateral de 6-OHDA em ratos.........................................................

98

16.6.2 Teste do Campo Aberto (Open Field test)......................................... 101

16.6.3 Teste do Rota-Rod............................................................................... 102

16.6.4 Teste Rotacional induzido por Apomorfina...................................... 103

16.6.5 Teste da Cruz Elevada (Plus Maze test)............................................ 104

16.6.6 Análise de Variação Ponderal............................................................. 104

16.6.7 Análise da Atividade Renal (Micção)................................................. 104

16.6.8 Dissecação de Áreas Cerebrais........................................................... 104

16.6.9 Determinação da Concentração de Nitrito (NO2) / Nitrato (NO3).. 106

16.6.10 Determinação dos Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS).......... 107

16.6.11 Determinação dos Níveis de Glutationa Reduzida (GSH).............. 108

16.6.12 Determinação dos níveis de Monoaminas.......................................... 109

16.7 Análises Preliminares de parâmetros de Armazenamento e

Extração de RNA total de Corpo Estriado de Ratos........................

110

16.8 Extração de RNA total, Síntese de cDNA e Análise da Expressão

Relativa por qPCR.........................................................................

110

16.8.1 Extração do RNA total................................................................. 110

16.8.2 Análise Quantitativa e Qualitativa do RNA total........................... 111

16.8.3 Síntese de cDNA........................................................................... 111

16.8.4 Contrução dos oligonucleotídeos (primers)...................................... 111

18.8.5 PCR quantitativa em tempo real (qPCR)....................................... 113

16.9 Análise de Atividade Antioxidante in vitro........................................ 114

16.9.1 Ensaio de Atividade Antioxidante em Mitocôndrias Submetidas a

Estresses Oxidativos............................................................................

114

16.9.2 Ensaio de Inibição de DPPH............................................................... 117


17 RESULTADOS.................................................................................... 119

17.1 Avaliação da Atividade Locomotora................................................. 119

17.1.1 Teste do Campo Aberto (Open Field test).......................................... 119

17.1.2 Teste do Rota-Rod................................................................................ 121

17.2 Teste Rotacional induzido por Apomorfina...................................... 124

17.3 Análise de Efeitos Colaterais Sistêmicos na via de Administração

utilizada.................................................................................................

128

17.3.1 Atividade Ansiolítica............................................................................ 128

17.3.2 Análise Ponderal.................................................................................. 130

17.3.3 Análise de alterações da Atividade Renal.......................................... 130

17.6 Análises Neuroquímicas...................................................................... 133

17.6.1 Determinação da concentração de Nitrito (NO2)/Nitrato (NO3)

em áreas cerebrais..............................................................................

133

17.6.2 Determinação dos Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) em

áreas cerebrais......................................................................................

133

17.6.3 Determinação dos Níveis de Glutationa Reduzida (GSH) em

áreas cerebrais.....................................................................................

134

17.6.4 Determinação dos níveis de Monoaminas em Corpo Estriado........ 137

17.7 Análises Transcricionais................................................................ 139

17.7.1 Análises Preliminares de parâmetros de Armazenamento e

Extração de RNA total de Corpo Estriado de Ratos.......................

139

17.7.2 Análise do RNA Total Isolado de Corpo Estriado de Ratos

Submetidos ao Modelo de DP Induzido por 6-OHDA.....................

142

17.7.3 Análises dos Genes de Controle Endógeno (Housekeepings) nas

Condições de Estudo Utilizadas......................................................

142

17.7.4 Avaliação da Especificidade dos Oligonucleotídeos (primers)

utilizados através da Análise da Melting Curve...............................

145

17.7.5 Análise da Expressão Relativa dos Genes BDNF, p65, iNOS e

IL1β por qPCR...............................................................................

145

17.8 Análise da Atividade Antioxidante in vitro........................................ 148

17.8.1 Ensaio de Atividade Antioxidante em Mitocôndrias Submetidas a

Estresses Oxidativos............................................................................

148

17.8.2 Ensaio de Inibição de DPPH............................................................... 148

18 DISCUSSÃO......................................................................................... 151

19 CONCLUSÃO...................................................................................... 161

CAPITULO IV - ATIVIDADE NEUROPROTETORA DE

AGARANA SULFATADA DE G. CORNEA EM MODELO DE

DOENÇA DE PARKINSON: ANÁLISES

TRANSCRIPTÔMICAS................................................................

162

20 INTRODUÇÃO................................................................................... 163

20.1 O Potencial Uso de Análises Transcriptômicas como Ferramentas

Aplicadas na Investigação de Estratégias Farmacológicas com

Foco em Desordens Neurodegenerativas.........................................

163


21 OBJETIVOS........................................................................................ 165

21.1 Geral...................................................................................................... 165

21.2 Específicos............................................................................................. 165


22.1 Obtenção de espécimes da alga Gracilaria córnea............................ 166

22.2 Isolamento da Agarana sulfatada....................................................... 166

22.3 Animais................................................................................................. 166

22.4 Aspectos éticos...................................................................................... 166


22.6 Indução do Modelo de Doença de Parkinson através de injeção

unilateral de 6-OHDA em ratos.......................................................... 166

22.7 Dissecação de Áreas Cerebrais........................................................... 167

22.8 Extração e Análise do RNA total................................................... 167

22.9 Análises Transcriptômicas.................................................................. 167

22.9.1 Sequenciamento do RNA utilizando a plataforma Illumina Hi-

Seq2000.................................................................................................

167

22.9.2 Análises in sílico................................................................................... 168

22.10 Análise Estatística................................................................................ 169

23 RESULTADOS.................................................................................... 169

23.1 Análises Transcriptômicas.................................................................. 169

23.1.1 Análise do Sequenciamento dos RNA pela Próxima Geração de

Sequenciamento (NGS)........................................................................

169

23.1.2 Identificação e Análise do Perfil Transcriptômico.......................... 173

23.1.2.1 Indentificação das Sequencias............................................................ 173

23.1.2.2 Alterações no Perfil de Expressão dos Genes...................................... 173

23.1.2.3 Análise de LOCs.................................................................................... 184

23.1.2.4 Anotação Funcional dos Genes Identificados..................................... 188

24 DISCUSSÃO......................................................................................... 212

25 CONCLUSÃO...................................................................................... 218

26 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS........................... 219

REFERÊNCIAS................................................................................ 220

28

1 REVISÃO DE LITERATURA

1.1 Algas e sua Importância

Entre os organismos fotossintetizantes com maior diversidade no mundo, podem ser

citadas as algas (Figura 1). A classificação desses organismos está sobre constante revisão à

medida que mais evidências genéticas e de ultra-estruturas são acumuladas (BARSANTI,

GUALTIERI, 2006). Apesar das incertezas em relação a classificação de alguns organismos

como algas, uma abordagem taxonomista conservadora estima, aproximadamente, 72.500 mil

espécies de algas, dentre as quais 42 mil se encontram taxonomicamente classificadas

(GUIRY, 2012). Atualmente, entre os países com maior diversidade taxonômica, o Brasil

descreve 4.892 espécies de algas (ALGABASE) (Figura 1).

Estes organismos podem ser encontrados em ambientes aquáticos e terrestres

úmidos, podendo assumir estilos de vida na forma de seres planctônicos (microalgas) e

bentônicos (macroalgas) (SZE, 1997; VAN DEN HOECK; MANN; JAHNS, 1999).

Figura 1 - Distribuição de Algas no Mundo

Fonte: Adaptado à partir de AlgaBase. Legenda: Áreas escuras indicam a quantidade de espécies de algas

catalogadas.

29

As algas são reconhecidas pelo seu elevado valor ecológico, como fotossintetizantes,

e são utilizadas pelo homem, aproximadamente, desde 2700 a.C. pelos chineses, os quais as

utilizavam como alimento. Na Europa, as civilizações utilizavam as algas como suplemento

na alimentação de animais e fertilizantes (ZEMKE-WHITE; OHNO, 1999).

As macroalgas marinhas estão classificadas em 3 filos principais: Chlorophyta (algas

verdes), Phaeophyta (algas pardas ou marrons) e Rhodophyta (algas vermelhas) (VIDOTTI;

ROLLEMBERG, 2004; BARSANTI, GUALTIERI, 2006).

Atualmente, a investigação de muitos dos metabólitos (polissacarídeos, lectinas,

lipídios, carotenoides, peptídeos, aminoácidos e outras moléculas) de macroalgas marinhas

tem despertado o interesse crescente nestes organismos, uma vez que as algas são organismos

com grande potencial para a bioprospecção de novas substâncias biologicamente ativas

(bioativos), biopolímeros e de compostos essenciais para a nutrição humana (DOS SANTOS

et al., 2005; CARDOZO et al., 2007; BROWN et al., 2014; RIVANOR et al., 2014). Por esse

motivo, as algas e seus metabólitos vêm sendo utilizadas na indústria principalmente para as

aplicações farmacêuticas, biotecnológicas e têxteis, aplicações medicinais, fertilizantes,

fungicidas, herbicidas, biocombustíveis, emulsificantes, espessantes, geleificantes, e também

para uso na dieta alimentar e como nutracêuticos (TURK; SCHNEIDER, 2000; GRESSLER

et al. 2010; ŠKROVÁNKOVÁ, 2011; ALVARO-MORALES et al., 2012).

Entre os bioativos, derivados de macroalgas marinhas, investigados atualmente pelo

grande potencial biotecnológico e farmacológico, podem-se citar os polissacarídeos sulfatados

(JIAO et al., 2011).

1.2 Polissacarídeos Sulfatados

Os polissacarídeos sulfatados representam uma classe de macromoléculas

polianiônicas complexas e heterogêneas formadas por unidades repetitivas de açúcares e

carregadas negativamente devido à presença de grupos sulfatados (PERCIVAL;

MCDOWELL, 1967). Os polissacarídeos sulfatados são encontradas no reino animal

(MEDEIROS et al., 2000) e em algas marinhas (JIAO et al., 2011).

Os polissacarídeos sulfatados de animais mais conhecidos são os

glicosaminoglicanos (GAGs). Estes são polissacarídeos polidispersos lineares compostos de

unidades dissacarídicas, ligados por ligações glicosídicas, com a sulfatação ocorrendo em

diferentes posições. Quase todos os GAGs estão distribuídos nos tecidos na forma de

30

proteoglicanos, onde as cadeias desses polissacarídeos estão covalentemente ligadas a uma

proteína (DREYFUSS et al., 2009).

Os GAGs exibem uma variabilidade estrutural peculiar de acordo com o tecido e a

espécie do animal de onde é extraído. Considerando a sua localização celular, diversidade

estrutural e mudanças de expressão durante diferentes condições fisiológicas, tais como

divisão, crescimento, adesão, migração e diferenciação celular, entre outras, levanta-se a

hipótese de que os proteoglicanos e GAGs desempenham um papel específico nas interações

celulares (DANTAS-SANTOS et al., 2012). Entre os GAGs, podem ser citados: o ácido

hialurônico (AH), que é destituído de grupamentos sulfato; o condroitim sulfato, queratan

sulfato, o dermatam sulfato e o heparan sulfato (NELSON; COX, 2011). Estes polissacarídeos

são possuem a capacidade de interação com um grande número de proteínas, incluindo fatores

de crescimento e componentes da matriz extracelular, assim como várias enzimas e fatores

presentes no plasma, servindo como um receptor para muitos agentes microbianos, incluindo

bactérias, parasitas e vírus (ROSTAND; ESKO, 1997; SPILLMANN, 2001; NELSON; COX,

2011).

Nas algas marinhas, os polissacarídeos sulfatados são encontrados na matriz

mucilaginosa extracelular da parede celular. Sua função fisiológica nestes organismos seria de

formação da estrutura da parede celular e de proteção contra a desidratação que ocorre em

maré baixa. Isso explicaria o maior teor de polissacarídeos sulfatados de algas na zona entre-

marés (MICHEL et al., 2010; DANTAS-SANTOS et al., 2012).

Segundo Wijesekara e colaboradores (2011), os polissacarídeos sulfatados de

macroalgas marinhas têm ganhado muita atenção como novos bioativos (anticoagulantes,

antivirais, antioxidantes, antitumorais, imunomoduladores, etc.) e a grande diversidade

química-estrutural dessas macromoléculas presentes nesses organismos também desperta o

interesse industrial e de pesquisadores para o uso como materiais funcionais de importância

alimentícia e biomédica.

O interesse biomédico pelos polissacarídeos sulfatados de algas é justificado por suas

diversas atividades biológicas descritas na literatura, como: anticoagulante (POMIN;

MOURÃO, 2008; RODRIGUES et al., 2009b; ARAÚJO et al., 2012; RODRIGUES et al.,

2013; QUINDERÉ et al., 2014), antioxidante (COSTA et al. 2009; COSTA et al., 2011),

antiviral (MAZUMDER et al., 2002; DUARTE et al., 2004; CHEN et al., 2010;

BANDYOPADHYAY et al., 2011; LEE et al., 2011; BOUHLAL et al., 2011); antitumoral e

imunomodulatória (ZHOU et al., 2004; AHN et al., 2008; LINS et al., 2009) e antinociceptiva

(VIANA et al., 2002; ASSREUY et al. 2008, ARAÚJO et al., 2011; COURA et al., 2012;

31

RODRIGUES et al., 2013; QUINDERÉ et al., 2013; CARNEIRO et al., 2014; RIBEIRO et

al., 2014) e anti-inflamatória (ANANTHI et al. 2010; VANDERLEI et al., 2011; COURA et

al., 2012; MARQUES et al., 2012; CARNEITO et al., 2014; RIBEIRO et al., 2014) e

próinflamatória (ONG et al., 2003; SILVA et al., 2010; ARAÚJO et al., 2011).

1.2.1 Classificação dos Polissacarídeos Sulfatados de Macroalgas Marinhas

Devida a diversidade químico-estrutural, os polissacarídeos sulfatados das

macroalgas marinhas são classificados em: fucoidanas ou fucanas sulfatadas, as quais são

encontradas nas algas pardas; arabino-galactanas, ramnanas ou ulvanas, nas algas verdes; e

galactanas sulfatadas, nas algas vermelhas (PERCIVAL; McDOWELL, 1967).

1.2.1.1 Fucoidanas ou Fucanas Sulfatadas

Um dos polissacarídeos sulfatados de algas marinhas mais investigados quanto a

bioatividades são as fucoidanas ou fucanas sulfatadas. As fucoidanas representam uma classe

de polissacarídeos sulfatados ricos em α-L-fucopiranoses, unidas por ligações glicosídicas tipo

1→2 e com éster sulfato nas posições C-3, C-2 ou C-4 (Figura 2). Frequentemente estão

presentes na composição de fucoidanas outros monossacarídeos como galactose, manose,

xilose, ácidos urônicos e também grupos acetis (USOV; BILAN, 2009). Segundo

recomendações da IUPAC, são fucanas sulfatadas polissacarídeos baseados principalmente

em L-fucose com menos de 10% de outros monossacarídeos. Desta forma, o termo fucanas

sulfatadas se aplica às obtidas de invertebrados marinhos, enquanto o termo fucoidana refere-

se a polissacarídeos mais complexos obtidos de algas (BERTEAU; MULLOY, 2003).

32

Figura 2 - Representação da Estrutura de Polissacarídeos Sulfatados de Algas Pardas

Fonte: LEITE et al., 1998. Legenda: Fucana sulfatada da alga parda S. schoederi.

1.2.1.2 Arabino-galactanas

Polissacarídeos sulfatados de algas verdes representam o grupo mais diversificado e

mais complexo entre essas macromoléculas. São heteropolissacarídeos aniônicos não

repetitivos, apresentando-se, geralmente, bastante ramificados, complexos e constituídos de

unidades de monossacarídeos ou dissacarídeos compostos por unidades de galactose e

arabinose (PERCIVAL; McDOWELL, 1967). Dependendo da espécie de onde são isolados,

polissacarídeos de algas verdes recebem denominações específicas, como o “ulvan”, das algas

pertencentes à ordem Ulvales. Cladophora socialis (RAMANA; RAO, 1990) e

Spongomorpha indica (RAO et al., 1991), são alguns exemplos de espécies de algas verdes

ricas em arabino-galactanas, enquanto outras espécies, pertencentes aos gêneros Ulva e

Monostroma, são predominantemente ricas em raminose (RAY; LAHAYE, 1995; HAQ;

PERCIVAL, 1996; HAYAKAWA et al., 2000; MAO et al., 2006; CHATTOPADHYAY et

al., 2007a; ZHANG et al., 2008; MAO et al., 2008; MAO et al., 2009; ROBIC et al., 2009).

Outro monossacarídeo encontrado em grandes concentrações em clorofíceas dos gêneros

Caulerpa e Codium é a galactose (HAYAKAWA et al., 2000; MATSUBARA et al., 2001;

CHATTOPADHYAY et al., 2007b; FARIAS et al., 2008).

33

Figura 3 - Representação da Estrutura de Polissacarídeos Sulfatados de Algas Verdes

Fonte: JIAO et al., 2011. Legenda: Uma das principais repetições das unidades dissacarídicas reportadas: (a) [

→4)-β - D -Glc p-(1→4)-α-L- Rhap3S-(1→]n e (b) [→4)- α - L-Ido p-(1→4)- α - L-Rha p3S-(1→]n.

1.2.1.3 As Galactanas Sulfatadas

Entre as macroalgas marinhas, as macroalgas vermelhas (Rhodophytas) apresentam

uma grande variedade estrutural de polissacarídeos. São homopolissacarídeos constituídos

predominantemente por monômeros de galactose e denominadas galactanas, as quais são

classificadas quanto a sua estrutura química em carragenanas e agaranas (PAINTER, 1983;

POMIN; MOURÃO, 2008).

De acordo com Usov (2011), as carragenenanas e agaranas são polissacarídeos

constituídos basicamente por seqüências compostas de dois tipos de unidades

galactopiranosídicas repetitivas e estruturalmente distintas, denominadas de A e B. Tanto nas

carragenanas quanto nas agaranas, a unidade A é a denominação para (1→3)-β-D-

galactopiranose. Entretanto, a unidade B difere em ambos os polissacarídeos, quanto a sua

configuração estereoquímica, sendo nas carragenanas (1→4)-α-D-galactopiranose e nas

agaranas (1→4)-α-L-galactopiranose (Fig. 4). Portanto, as carragenanas diferem das agaranas

quanto à estereoquímica da unidade B, em configuração D ou L, respectivamente. Geralmente

as carragenanas apresentam uma alta porcentagem de grupos sulfato, além de pouca ou

nenhuma presença de grupos O-metil (PAINTER, 1983), e são classificadas em quatro

grandes famílias: Kappa (κ), Beta (β), Lambda (λ) e Ômega (Ω) (KNUTSEN et al., 1994).

A classificação das agaranas não é tão específica quanto à das carragenanas. Além

disso, a substituição das agaranas por grupos sulfato, metil e pirúvico difere do observado nas

carragenanas. A presença de unidades A piruvatadas [4,6-O-(1-carboxietilideno)-D-

galactopiranose] e com grupos metil (6-O-metil-D-galactopiranose) é frequente, bem como

34

cadeias laterais de 4-O-metil-L-galactopiranose e unidades B metiladas em C-2 (STORTZ;

CEREZO, 2000).

A agarose é uma das estruturas encontrada nas agaranas, a qual possui estrutura

linear e regular constituída por unidades dissacarídicas repetitivas de β–D-galactopiranose

ligadas glicosidicamente através da posição 3 (unidades A) e 3,6-anidro-α-L-galactopiranose

ligadas glicosidicamente através da posição 4 (unidades B) (ARAKI; HIRASE, 1983). A

agarose normalmente é desprovida de sulfato e é a galactana com maior propriedade

geleificante dentro do grupo das agaranas. Entretanto, a substituição das unidades

anidrogalactosídicas por unidades de α-L-galactopiranose-6-sulfato reduz consideravelmente

a propriedade de geleificação desses polímeros, enquanto que a introdução de grupos metil

nessa mesma posição tem pouca influência sobre tal propriedade (USOV; IVANONO;

SHASHKOV, 1983; USOV, 2011).

Espécies produtoras de ágar (agarófitas) são encontradas principalmente nas famílias

Gracilariaceae, Gelidiaceae, Phyllophoraceae e Ceramiaceae (STEPHEN, 1995). Dentre a

família Gracilariaceae, pode-se citar o gênero Gracilaria.

Figura 4 - Representação da Estrutura de Polissacarídeos Sulfatados de Algas Vermelhas

Fonte: POMIN (2010). Legenda: Estrutura química de unidades dissacarídicas repetitivas de galactanas

sulfatadas de algas marinhas vermelhas.

35

1.3 O gênero Gracilaria

As algas marinhas vermelhas do gênero Gracilaria apresentam talo cilíndrico ou

achatado, filamentoso ou pseudoparenquimatoso, com comprimento podendo variar entre 0,1

a 5,0 metros (GUIMARÃES, PLASTINO, OLIVEIRA, 1999).

A maior parte das espécies ocorre nos mares tropicais e temperados, distribuindo-se

desde a linha do equador até altas latitudes, mas também são encontradas em zona entre-

marés, até o infralitoral raso. São comuns em locais protegidos do batimento de ondulações,

suportam a exposição ao ar por curtos períodos de tempo e possuem alta tolerância a

variações das condições ambientais, como salinidade, temperatura e circulação de água,

devendo ser consideradas fundamentais quando trabalhadas em ambientes de cultivo

(OLIVEIRA, PLASTINO, 1994).

Entre as espécies do gênero Gracilaria, pode-se citar a Gracilaria cornea

(AGARDH, 1852). Esta macroalga marinha vermelha está distribuída desde oeste do Oceano

Atlântico de Bermudas, através do Golfo do México, até Cabo Frio, Brasil (BIRD et al.,

1986).

Junto com G. birdiae, G. cornea é a principal espécie utilizada para a produção de

ágar no Brasil (PLASTINO; OLIVEIRA; 2002). Estudos demonstram também a espécie

como uma importante opção para a aquicultura no México (ORDUÑA-ROJAS; ROBLEDO,

2002) e detentora de bons rendimentos de ágar (FREILE-PELEGRÍN; ROBELDO, 1997a;

1997b). Como consequência dessa importância econômica, muitos aspectos da fisiologia têm

sido estudados, tais como crescimento sob condições de laboratório (YOKOYA; OLIVEIRA,

1992; NAVARRO-ANGULO; ROBLEDO 1999), translocação de fotossintatos (GONEN et

al., 1996), fotossíntese e pigmentos (DAWES et al., 1999), compostos que absorvem radiação

ultravioleta (SINHA et al., 2000), qualidade do ágar (LEON, 1990; FREILE-PELEGRIN et

al., 2002; ESPINOZA et al., 2003) e reprodução (GUZMÁN-URIÓSTEGUI; ROBLEDO,

1999; ORDUÑA-ROJAS; ROBLEDO, 2002).

1.3.1 Estrutura Química e Atividades Biológicas de Polissacarídeo Sulfatado de G.

cornea

Os polissacarídeos sulfatos isolados da macroalga marinha vermelha Gracilaria

cornea tem sua estrutura química caracterizada por Melo e colaboradores (2002). De acordo

36

com o referido estudo, os polissacarídeos sulfatados da macroalga marinha vermelha G.

cornea compõe cerca de 21,4% da massa da alga, apresentando-se hidrossolúvel, com baixa

viscosidade e ausência de formação de gél. Sua composição monossacarídica indica presença

de galactose (64,66%), 3,6-anidrogalactose (24,7%), 6-O-metilgalactose (8,5%) e, em

menores concentrações, glicose (1,5%) e xilose (0,7%), portanto, apresentando composição

predominante de agarose e menos de 3% de outros sacarídeos. A análise por infravermelho e

por ressonância nuclear magnética por transformada de Fourier revelaram a presença de

grupos éster sulfatos (C-4, C-6 e C-2) na unidade B do dissacarídeo e sendo os principais

sinais identificados como unidades constituídas por β-D-galactose e 3,6-anidrogalactose. Em

adição, outros elementos presentes foram relatados, como: sódio (2,33%), cálcio (0,21%),

magnésio (0,09%) e potássio (0,26%). A massa molecular estimada obtida nas análises variou

de 3 x 104 a 1,9 x 10

5 g/mol.

Além das características químico-estruturais, algumas atividades biológicas do

polissacarídeo sulfatado de G. cornea foram descritas por estudo de Coura e colaboradores

(2012), as quais revelaram atividade anti-inflamatória e antinociceptiva, sendo esta a nível

periférico e central, através de modelos experimentais em ratos e camundongos.

Adicionalmente, de acordo com referido estudo, relata-se a ausência de efeitos tóxicos in vivo.

Apesar das informações descritas sobre a alga marinha vermelha G. cornea e seu

polissacarídeo sulfatado, ainda são poucos os relatos na literatura sobre avaliações de novos

métodos de isolamento deste bioativo, bem como seus possíveis efeitos fisiológicos e a nível

de sistema nervoso central in vivo, e em investigações que busquem analisar potenciais

atividades neurofarmacológicas.

37

CAPITULO I

ANÁLISE COMPARATIVA DE DOIS MÉTODOS DE ISOLAMENTO DE

POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA MACROALGA MARINHA VERMELHA

Gracilaria cornea

38

2 INTRODUÇÃO

2.1 Polissacarídeos Sulfatados de Macroalgas Marinhas Vermelhas

A demanda global por produtos naturais de algas marinhas tem aumentado

mundialmente. Entre estes produtos, podemos citar os polissacarídeos sulfatados, moléculas

biocompatíveis, biodegradáveis e de baixo custo (MILLEDGE et al., 2014; PRAJAPATI et

al., 2014), que tem chamado cada vez mais atenção de pesquisadores e companhias

farmacêuticas e biotecnológicas devido as várias aplicabilidades descritas na literatura

(CARDOZO et al., 2007; PATEL et al., 2012; MILLEDGE et al., 2014; PRAJAPATI et al.,

2014), como propriedades reológicas (gelificantes, espessantes e estabilizantes) (CAMPO et

al., 2009; CARDOZO et al., 2007) e farmacológicas (anticoagulantes, antivirais,

antinociceptivas e anti-inflamatórios) (MAZUMDER et al., 2002; RODRIGUES et al., 2009;

COURA et al., 2012; QUINDERÉ et al., 2013, QUINDERÉ et al., 2014).

2.1.2 Importância Econômica-Industrial-Biotecnológica

A aplicação biotecnológica de carragenanas se encontra principalmente na indústria

alimentícia, a qual responde por 70 a 80% da utilização mundial de carragenana, na qual 45%

são direcionados para os produtos lácteos e cerca de 30% para derivados da carne.

(McHUGH, 2003). Em relação as agaranas, normalmente, são utilizadas em diferentes setores

industriais: na indústria de alimentos, como na fabricação de gelatinas e doces; na indústria

farmacêutica, como laxantes, e agentes emulsificantes e estabilizadores de medicamentos; em

pesquisas de laboratório, como um meio de cultura e nas aplicações biotecnológicas em geral

(McHUGH, 2003), como na produção de géis cromatográficos (Sephadex e Sepharose), para

aplicação em cromatografias de exclusão molecular e de troca iônica, respectivamente.

Adicionalmente, os géis de agarose estão entre os meios mais utilizados para eletroforese

(NOSEDA, 1994).

Dentre os principais países produtores de ágar estão o Chile, Espanha, Portugal,

Coréia, França, Marrocos, Estados Unidos (EUA), México, Nova Zelândia e Japão, com uma

produção, cujo valor aumentou de 1999 à 2009, de 128 para 173 milhões de dólares por ano

(DHARGALKAR; VERLECAR, 2009; FAO, 2015).

39

2.2 Métodos de Isolamento de Polissacarídeos Sulfatados de Algas

As estruturas químicas dos polissacarídeos sulfatados de macroalgas variam de

acordo com a espécie da alga de origem (MAZUMDER et al., 2002; POMIN, 2012;

QUINDERÉ et al., 2014). Durante o processamento industrial, por exemplo, alguns fatores,

como rendimento (quantidade) e pureza (qualidade) (CAMPO et al., 2009; MILLEDGE et al.,

2014; PRAJAPATI et al., 2014), tem sido considerados, assim como a dificuldade na

padronização da produção de um produto comercial (PEREIRA; COSTA-LOTUFO, 2012).

Entretanto, o rendimento, qualidade e características bioquímicas podem variar de acordo com

a técnica de extração ou tipos de solventes utilizados no processo (RODRIGUES et al., 2009,

RODRIGUES et al., 2011b; YAICH et al., 2013).

Atualmente, entre os métodos de isolamento de polissacarídeos sulfatados de algas,

podem-se citar a extração aquosa (a quente ou a frio), com ou sem a presença de soluções

etanólicas, salinas e/ou ácidas ou básicas, bem como a presença de agentes proteolíticos

(digestão enzimática), ultrassom e/ou utilizando solventes orgânicos (MARAIS; JOSELEAU,

2001; RIOUX et al., 2007; WANG et al., 2008; YANG et al., 2008; RODRIGUES et al.,

2011; COURA et al., 2012; ARAÚJO et al., 2012; CARNEIRO et al., 2014; QUINDERÉ et

al., 2014; FIDELIS et al., 2014).

Entre os reagentes mais utilizados atualmente para o isolamento de polissacarídeos

sulfatados por precipitação, pode-se citar o CCP (cloreto de 1-hexadecilpiridinio) (Figura 5)

(COURA et al., 2012; QUINDERÉ et al., 2013; CARNEIRO et al., 2014; QUEIROZ et al.,

2014; RODRIGUES et al., 2014). Este reagente precipitante é um composto químico

quaternário de amônio catiônico utilizado na indústria higiênica, como componente de

enxaguantes bucais, cremes dentais, sprays e antissépticos (LEWIS, 1996). Apesar do uso de

CCP apresentar-se bastante eficiente para o procedimento de isolamento de polissacarídeos

sulfatados de algas, este reagente possui um custo relativamente elevado. Por este motivo, a

análise de novos reagentes ou otimização de métodos para o isolamento destas

macromoléculas devem ser realizados.

40

Figura 5 - Estrutura química do reagente CCP

Fonte: NEUROtiker

Entre os solventes orgânicos utilizados rotineiramente em processos de isolamento

de macromoléculas, pode-se citar o álcool Isoamílico (AIA) (3-metil-1-butanol) (Figura 6).

Este álcool é um composto de cadeia alcoólica pequena, incolor, polar, levemente solúvel em

água e é utilizado na indústria alimentícia, em processos de fermentação e bebidas lácteas

(MAMENDE; PASTORE, 2004); na biotecnologia, para o isolamento de ácidos nucléicos,

lipídios e proteínas de componentes celulares (YEH; CHEN, 2004; OLIVIERI et al., 2012;

EL BAZ et al., 2013); e outros processos industriais, incluindo aditivos hidráulicos, óleos

lubrificantes, agentes espumantes em produtos de limpeza e em processos de recuperação de

petróleo bruto (LIDE, 1998). Entretanto, não existem relatos na literatura sobre estudos de

isolamento de polissacarídeos sulfatados com o uso desse solvente.

Figura 6 - Estrutura química do álcool Isoamílico (AIA)

Fonte: http://www.mpbio.com/.

41

2.3 Hipótese Científica

Visto o potencial uso do AIA para o isolamento de polissacarídeos, o presente

trabalho levanta a hipótese de que a implementação deste solvente na metodologia usual de

extração de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas, em substituição ao reagente CCP,

poderia otimizar o processo ou reduzir o custo para a obtenção dessas moléculas para

posteriores estudos e aplicações industriais e farmacológicas.

42

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Portanto, no presente capítulo, objetivou-se avaliar qualitativamente e

quantitativamente dois métodos de isolamento de polissacarídeos sulfatados da macroalga

marinha vermelha G. cornea.

3.2 Específicos

- Avaliar a eficiência do método utilizando AIA para isolamento de polissacarídeos

sulfatados;

- Determinar o rendimento de polissacarídeos sulfatos pelo método utilizando AIA;

- Analisar características bioquímicas (teor de sulfato, mobilidade eletroforética e

características estruturais) das macromoléculas obtidas;

- Avaliar uma possível atividade anticoagulante das amostras.

43

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Coleta de Espécimes da Macroalga Marinha Gracilaria cornea

Exemplares da alga marinha vermelha G. cornea (J. Agardh, 1852) foram coletados

na Praia de Flecheiras, município de Trairi – CE (maré baixa -0,2 a 0,3 m) e conduzidos em

sacos plásticos ao Laboratório de Carboidratos e Lectinas (CarboLec) do Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará (UFC). No Laboratório, as

algas foram lavadas com água destilada para a retirada de areia, epífitas e/ou organismos

incrustantes, e posteriormente estocadas em freezer (-20 °C) até o uso. A espécie G. cornea

(Figura 7) foi identificada e uma exsicata foi depositada no Herbário Prisco Bezerra da UFC

sob o número 34739.

Figura 7 - G. cornea

Fonte: Algaebase. Legenda: Aspecto macroscópico do talo cilíndrico dotado de ramificações dicotômicas da

alga marinha vermelha Gracilaria cornea (A) e sua classificação taxonômica (B).

Filo: Rodophyta

Classe: Floridophyceae

Ordem: Gracilariales

Família: Gracilariaceae

Gênero: Gracilaria J. Agardh

Epíteto específico: cornea

Nome botânico: Gracilaria cornea. J. Agardh

A B

http://64.233.179.104/translate_c?hl=pt-BR&u=http://zipcodezoo.com/Plants/C/%255CKey%255CChlorophyta_Phylum.asp&prev=/search%3Fq%3Dcaulerpa%2Bcupressoides%2B-%2Bwikipedia%26hl%3Dpt-BR%26lr%3D%26sa%3DG

44

4.2 Aspéctos Éticos

O presente estudo não envolveu danos a espécies ameaçadas ou protegidas, e o

mesmo foi conduzido de acordo como descrito na legislação na Medida Provisória nº 2.186-

16/2001, resolução 29 do Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN).

4.3 Isolamento de Polissacarídeos Sulfatados de G. cornea

Inicialmente, para o processo de extração de polissacarídeos sulfatados da referida

alga, a mesma foi desidratada à 25 ºC e cortadas em pequenos pedaços, como descrito por

Coura e colaboradores (2012). Em seguida, 5 gramas da alga desidratada foi submetido ao

método de extração aquosa a quente (6 horas/ 60 ºC) na presença de agente proteolítico

(papaína; Vetec Química, Rio de Janeiro, Brasil) em tampão de acetato de sódio (100 mM, pH

5.0) contendo cisteína (5 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e EDTA (5 mM; Vetec

Química, Rio de Janeiro, Brasil). Após filtração (em membrana de náilon) e centrifugação

(2.725 x g/ 4 ºC/ 30 minutos), a solução filtrada foi submetida a cada um dos dois protocolos

de isolamento de polissacarídeos sulfatados, como descrito abaixo:

- Método I (CCP)

Adicionou-se, na solução descrita anteriormente, 50 mL de cloreto de cetilpiridinio

(CCP) a 10 % (5 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e permanecendo em repouso por

24 h à 25 ºC, seguido por lavagem com CCP (0,05%, 300 mL) para isolamento de

polissacarídeos sulfatados por precipitação, de acordo como descrito por Farias e

colaboradores (2000), com adaptações (COURA et al., 2012).

- Método II (AIA)

Adicionou-se 50 mL de álcool isoamílico (AIA; Vetec Química, Rio de Janeiro,

Brasil) e permanecendo em repouso por 24 h à 25 ºC. As diferentes fases características do

uso de AIA foram separadas por decantação. Entretanto, para os procedimentos seguintes,

foram utilizadas apenas o precipitado. O presente método foi realizado em triplicata.

45

Adicionalmente, a fase orgânica também foi isolada, submetida a sucessivas diálises

em água destilada em membrana de celulose (47 x 27 mm; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,

EUA), seguida por liofilização e, posteriormente, armazenadas a temperatura ambiente.

Para isolamento de polissacarídeos sulfatados, foram utilizados apenas os

precipitados obtidos durante o procedimento. Os precipitados obtidos pelos dois métodos do

foram centrifugados (2.725 x g/ 4 ºC/ 30 minutos) e dissolvidos em solução etílica (100:15;

v:v) contendo NaCl (2M), seguido por duas lavagens com etanol 80% e uma com 300 mL de

etanol (100%). Posteriormente, as soluções obtidas foram submetidas a sucessivas diálises em

água destilada em membrana de celulose (47 x 27 mm; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).

Em seguida, as amostras obtidas foram submetidas a liofilização (Labconco FreeZone 4.5),

como descrito por Coura e colaboradores (2012), e armazenadas a temperatura ambiente.

4.4 Análises Bioquímicas

Para caraterização físico-química das amostras isoladas pelos métodos, realizaram-se

análises comumente utilizadas para auxiliar na caracterização de polissacarídeos sulfatados de

algas marinhas, as quais são referentes ao rendimento metodológico, teor de sulfato, possível

presença de contaminantes proteicos, dispersão em gel por eletroforese e identificação de

sinais por Infravermelho, respectivamente, como descrito abaixo:

4.4.1 Análise do Rendimento

Para a análise do rendimento dos polissacarídeos sulfatados obtidos, calculou-se a

massa, em percentagem, das referidas macromoléculas por grama de alga utilizada (5

gramas), de acordo como descrito por Araújo e colaboradores (2012). O rendimento dos

polissacarídeos foi calculado com base na massa desidratada da alga, segundo a equação:

Rendimento = peso x 100% / peso da alga (5g)

46

4.4.2 Determinação do Teor de Sulfato

O Teor de Sulfato foi determinado por hidrólise ácida (1,0 mL de HCl / 5 h/ 105 ºC)

em gel de acordo com o método de gelatina/bário descrito por Dogson e Price (1962).

4.4.3 Análise de Possíveis Contaminantes Proteicos

O teor de proteínas foi determinado pelo método de Bradford (1976).

4.4.4 Análise de Dispersão em gel por Eletroforese

Para a análise de dispersão em gel, utilizou-se o método de eletroforese em gel de

agarose descrito por Dietrich e Dietrich (1976), utilizando como marcadores, os

polissacarídeos sulfatados: condroitam (CS), dermatam (DS) e heparam sulfato (HS).

4.4.5 Espectroscopia por Infravermelho

Para a determinação parcial da estrutura das amostras isoladas, utilizou-se

Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier em

espectrofotômetro (Shimadzu IR, modelo 8300, entre 4000 a 400 cm-1

). As amostras foram

avaliadas em partilhas de KBr (MELO et al., 2002). A presença de lipídios e outros

componentes químicos também foram avaliados (MI-KYUNG; JEUNE, 2009).

4.5 Análise de Atividade Anticoagulante por Ensaio do Tempo de Tromboplastina

Parcial Ativada – (TPPa)

Para se determinar uma possível atividade biológica das amostras polissacarídicas

isoladas pelos dois métodos utilizados, realizou-se o ensaio de TPPa, o qual avalia uma

possível ação anticoagulante de um determinado bioativo. O referido ensaio foi realizado com

kit comercial (CLOT, Bios diagnóstica, Sorocaba, SP, Brasil), seguido por especificações do

47

fabricante e utilizando plasma humano normal (obtido de 10 diferentes doadores do Centro

Hematológico e Hemoterápico do Ceará – HEMOCE). Para isso, 50 µL de plasma humano

foram incubados a 37 °C por 3 min com 10 µL da solução polissacarídica e 50 µL do reagente

TTPa. Após a incubação, foram adicionados 50 µL de cloreto de cálcio 25 mM à mistura para

ativar a cascata de coagulação. Os ensaios foram realizados em duplicata, sendo o tempo de

coagulação registrado automaticamente em um coagulômetro (DRAKE, modelo QUICK-

TIMER).

A atividade anticoagulante foi expressa em termos de unidades internacionais (UI)

por mg de polissacarídeo sulfatado, utilizando uma curva-padrão de heparina não-fracionada

(193 UI mg-1

), oriunda do Instituto Nacional de Padrão Biológico e Controle (Potters Bar,

Herts, UK).

4.6 Análises Estatísticas

No ensaio de TPPa, os valores numéricos foram apresentados com média e erro

padrão da média (EPM) e submetidos a análises de diferenças estatísticas através da análise

de variância (One-way ANOVA), seguido pelo teste de Comparações Múltiplas de

Bonferroni. Consideraram-se os valores com P<0,05 como estatisticamente significativos. As

análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prism, versão 4.0, (San Diego,

CA, EUA). Adicionalmente, todos os experimentos foram realizados por observadores

“cegos”.

48

5 RESULTADOS

5.1 Observações Preliminares dos dois Métodos

Os métodos analisados para a extração de polissacarídeos sulfatados revelaram

algumas diferenças. Por exemplo, na Figura 8 A, observa-se a formação de precipitado (c) e

ausência de fases, características comuns observadas no método de extração utilizando-se

CCP. No método utilizando-se AIA (Figura 8 B), pôde-se observar a presença de fases (a e c)

semelhantes a métodos de extração de ácidos nucléicos, bem como a presença de um

precipitado semelhante ao encontrado na Figura 8 A. Adicionalmente, também pôde-se

observar um aumento da presença de pigmentos avermelhados na fase inferior (Figura 8 B).

Figura 8 - Aspectos gerais observados nos métodos de precipitação por CCP e AIA

A cc

ba

B

Fonte: Arquivo Pessoal do Autor. Legenda: Inicialmente, os extratos polissacarídicos foram extraídos por

digestão enzimática (solução contendo papaína, tampão de acetate de sódio 100 mM, pH 5.0; cisteína e EDTA 5

mM, por 6 h/ 60°C). Após filtração e centrifugação (2,725 × g, 4°C, 30 min), adicionaram-se 50 mL de CCP

10% (A) ou AIA (B) e, posteriormente, armazenados por 24 h à 25°C. (a) Indica fase contendo possível presença

de ácidos nucléicos, (b) lipídios e (c) polissacarídeos sulfatados, respectivamente.

49

5.2 Análises Bioquímicas

5.2.1 Rendimento, Teor de Sulfato e Presença de contaminantes proteicos

De acordo com as análises bioquímicas, o rendimento obtido de polissacarídeos

utilizando o método com CCP foi superior, apresentando cerca 21% de rendimento de

polissacarídeos a partir de 5 gramas de alga desidratada, enquanto que no método utilizando

AIA observou-se um percentual quase três vezes inferior, de apenas 8% (Tabela 1). O teor de

sulfato analisado revelou percentuais similares entre os dois métodos empregados, em torno

de aproximadamente 25-27%. Adicionalmente, não foram detectadas presenças de proteínas

em nenhuma das amostras.

5.2.2 Análise Eletroforética

Os resultados da análise eletroforética revelaram diferenças quanto a densidade da

carga e polidispersão de polissacarídeos obtidos pelos dois métodos em gel de agarose (Figura

9). Pôde-se observar que ambas as amostras analisadas apresentaram similaridade na

mobilidade no gel, com migração para o polo positivo devido a presença de grupos sulfatados,

estes com carga negativa. Entretanto, polissacarídeos isolados pelo método I (CCP)

mostraram-se em uma única banda (assim como os polissacarídeos sulfatados utilizados como

marcadores: condroitam sulfato - CS, dermatam sulfato - DS e heparam sulfato – HS),

indicativa da presença de um único tipo de polissacarídeo sulfatado, enquanto que os

polissacarídeos obtidos pelo método II (AIA) apresentaram-se polidispersos no gel.

50

Tabela 1 – Rendimento e Teor de sulfato de polissacarídeos sulfatados isolados de G. cornea

Método Rendimento (%) a Teor de sulfato

(%) b

Proteínas (%) c

CCP 21,17 25,97 -

AIA 8,18 26,99 -

Fonte: Autor – Laboratório de Carboidratos e Lectinas (CarboLec). Legenda: (a) – Rendimento foi calculado

como percentagem de gramas de polissacarídeos obtidos para 5 gramas de alga desidratada; (b) –Teor de sulfato

em percentagem determinado pelo método de Dodgson e Price (1962) utilizando NaSO3 como padrão; (c) –

Determinação do percentual de proteínas totais presentes pelo método de Bradford (1976) utilizando albumina

de soro bovino como padrão (- não detectado).

Figura 9 - Análise do perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados isolados de G.

cornea

Fonte: Arquivo Pessoal do Autor. Legenda: Os polissacarídeos sulfatados isolados da macroalga marinha

vermelha G. cornea por ambos os métodos (I e II) foram analisados em eletroforese em gel de agarose a 0,5%,

utilizando o tampão 1,3 - acetato diaminopropano 0,05 M (pH 9,0) e corada com azul de toluidina a 0,1%

(DIETRICH; DIETRICH, 1976) Utilizaram-se como marcador (M) de GAGs condroitam sulfato (CS),

dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS) presentes no gel foram corados com azul de toluidina a 0,1%.

51

5.2.3 Análise por Infravermelho

De acordo com os sinais obtidos dos espectros das amostras polissacarídicas, foi

possível identificar diferenças quanto a intensidade de bandas, relacionadas a presença de

grupos éster sulfatos (banda 1250 cm-1

) entre as duas amostras isoladas pelos dois métodos

(Figura 10 e Tabela 2).

A análise por espectroscopia na região do infravermelho revelou similaridades

estruturais entre as amostras obtidas por ambos os métodos, das quais foram possíveis

identificar os principais sinais relativos a polissacarídeos do tipo ágar, relativos a G. cornea

(MELO et al., 2002), bem como sinais relativos a presença de grupos sulfatos.

Figura 10 – Espectro de absorção na região do infravermelho dos polissacarídeos sulfatados

isolados de G. cornea

Fonte: Arquivo Pessoal do Autor. Legenda: Espectros na região do infravermelho de polissacarídeos isolados

da alga G. cornea por ambos os métodos foram obtidos em espectrofotômetro (Shimadzu IR, modelo 8300).

52

Tabela 2 - Principais sinais característicos de agaranas no infravermelho por espectroscopia

transformada de Fourier.

Fonte: Adaptado a partir de informações de Mollet e colaboradores (1998), Melo e colaboradores (2002) e

Pereira e colaboradores (2003).

Comprimento de onda

(cm-1

)

Designação /Identificação

1370

Éster sulfato

1250

1150

1070

930

890

845

830

820

770

740

716

vx S=O (éster sulfato)

C-O de hidratos de carbonos

Esqueleto de galactana

Vibrações de C-O-C de 3,6-anidro-L-galactose

Banda específica de ágar

Galactose 4-sulfato

Galactose 2-sulfato

Galactose 6-sulfato

Dobramento de esqueleto de anél de galactose

Ligações glicosídicas (C-O-C)

Ligações glicosídicas (C-O-C)

53

De acordo com a análise por infravermelho da amostra lipídica (Figura 11), isolada a

partir do método II, foram possíveis identificar sinais indicativos característicos de lipídios,

correspondentes a presença de grupos hidroxilas -OH (banda 3432 cm-1

), grupos metila -CH3

(1375 cm-1

), estiramento de C-H (2930 cm-1

), este último atribuído a presença de ácidos

graxos e/ou a presença de SO3 (sulfolipídios) (MI-KYUNG; JEUNE, 2009; EL BAZ et al.,

2013). Adicionalmente, foram detectados sinais 1640 (elongação de C=O), 1232 (-OH) e

1730 cm-1

, relacionados a presença de carbonilas derivadas de lipídios de membrana, como

gliceroglicolipídios, colesteróis e alguns fosfolipídios (poliésteres), respectivamente,

(SHEVCHENKO et al., 2007), sugerindo assim a presença de diferentes classes de lipídios

compondo a lipidoma da alga G. cornea isolados pelo método utilizando-se AIA

(MIYASHITA et al., 2013).

Figura 11 - Análise estrutural parcial por Infravermelho

Fonte: Arquivo Pessoal do Autor. Legenda: Espectros na região do infravermelho de polissacarídeos isolados

da alga G. cornea por ambos os métodos foram obtidos em espectrofotômetro (Shimadzu IR, modelo 8300).

54

5.3 Avaliação de Atividade Anticoagulante (Ensaio do Tempo de Tromboplastina

Parcial Ativada - TPPa)

Para se determinar uma possível ação anticoagulante, realizou-se o ensaio de TPPa.

Os resultados obtidos pelo ensaio pelo referido ensaio indicaram a ausência de atividade

anticoagulante de polissacarídeos sulfatados isolados de G. cornea por ambos os métodos

(CCP: 46,80 ± 0,56 e AIA: 48,30 ± 0,30 segundos, respectivamente), em comparação com

heparina (193 IU/mg; 44,20 ± 0,52 s) (Tabela 3).

Tabela 3 - Análise do Potencial efeito anticoagulante in vitro dos polissacarídeos isolados da

alga marinha vermelha G. cornea em comparação a heparina

Amostra Teste de TPPa *

Concentração

(mg/mL)

**

TTPa

(Segundos)

***

Atividade

anticoagulante

(IU/ mg)

****

M I (CCP) 1,00 46,80 ± 0,56 1,95

M II (AIA) 1,00 48,30 ± 0,30 2,00

Controle (+) (Heparina) 0,01 46,10 ± 0,81 193,00

Controle (-) - 44,20 ± 0,52 -

Fonte: Autor – Laboratório de Carboidratos e Lectinas (CarboLec). Legenda: * Tempo de Tromboplastina

Parcial ativada (TTPa); ** Concentração polissacarídica e ***prolongamento do TTPa em segundos; ****

Atividade anticoagulante expressa em unidades internacionais (IU) por mg de polissacarídeo (IU mg-1);

Controle positivo: heparina (HEP, 193,00 IU/mg; 0.01 mg/mL).

55

6 DISCUSSÃO

Para se avaliar uma possível otimização do processo de extração de polissacarídeos

sulfatados de algas marinhas, analisou-se a substituição do reagente precipitante CCP por

AIA.

O reagente CCP possui natureza catiônica e, por este motivo, possui a habilidade de

interagir com regiões hidrofílicas de carga aniônica, como grupos éster sulfatos encontrados

em polissacarídeos sulfatados, e promovendo assim a formação de precipitados como o

observado (Figura 8) (LEWIS, 1996; CARDOZO et al., 2007; CAMPO et al., 2009).

Possivelmente, AIA, um solvente orgânico não-polar, seja capaz de “separar”

metabolitos de acordo com características físico-químicas das moléculas, como por

hidrofobicidade e pesos moleculares (LIDE, 1998). Estas características observadas sugerem

que o método utilizando AIA estaria auxiliando tanto na precipitação de polissacarídeos,

quanto na separação de outras moléculas, como ácidos nucléicos (Figura 2B a) e lipídios

(Figura 10 B b) e pigmentos (YEH; CHEN, 2004; EL BAZ et al., 2013; FARIAS et al., 2000).

A literatura descreve que a obtenção de lipídios de algas marinhas por solventes não-

polares, como hexano e acetona, poderiam ser acompanhados de pigmentos, como o pigmento

fucoxantina, no caso da alga Laminaria gurjanovae (Phaeophyceae) (SHEVCHENKO et al.,

2007). Neste presente método, utilizando AIA, possivelmente o aumento da presença desses

pigmentos estariam ocorrendo por interações hidrofóbicas com grupos N-H e/ou por uma

baixa densidade deste solvente em relação a água (LIDE, 1998). Entre os possíveis pigmentos

observados que possam estar presentes na solução, pode-se citar a ficoeritrina, um pigmento

vermelho facilmente encontrado em Rhodophyceae. É descrito na literatura que o referido

pigmento possui uma função biológica importante para a alga, auxiliando na proteção contra

danos oxidativos induzidos por exposição excessiva a luz solar, e também possui aplicações

biotecnológicas em várias áreas, como alimentação, medicina e aquacultura (CARDOZO et

al., 2007).

Para analises bioquímicas, foram realizadas a determinação do percentual do

rendimento de obtenção de polissacarídeos sulfatados, a partir de 5 g de alga triturada; o teor

de sulfato; a presença de possíveis contaminantes proteicos (Tab. 1), bem como uma análise

eletroforética em gel de agarose (Figura 9) e uma identificação estrutural parcial por

espectroscopia por infravermelho (Figura 10).

Os resultados mostram que, similar ao descrito por Melo e colaboradores (2002), o

rendimento obtido para o método utilizando CCP foi de 21%, enquanto que o método

56

utilizando AIA observou-se um percentual inferior, de apenas 8%. Como também pode-se

observar na Figura 10, após as amostras de ambos os métodos estarem liofilizadas. Como

sugerido, a diferença de rendimento de polissacarídeos pode estar associada a diferentes

interações físico-químicas entre os métodos analisados (LEWIS, 1996; LIDE, 1998;

CARDOZO et al., 2007; CAMPO et al., 2009).

Apesar da diferença no rendimento (Tabela 1 e Figura 10), o teor de sulfato analisado

demonstrou um percentual de similaridade entre os dois métodos (25-27%). Estes dados

corroboram com outros descritos na literatura, os quais revelam que polissacarídeos

sulfatados do tipo ágar, derivados de espécies de algas vermelhas, apresentam percentual de

teor de sulfato entre 14-26% (CARDOZO et al., 2007). Estes dados sugerem que o método

utilizando AIA estaria auxiliando no isolamento de polissacarídeos sulfatados, pois foram

encontrados proporções semelhantes de sulfato.

Para se avaliar características físico-químicas dos polissacarídeos isolados pelos dois

métodos, realizou-se eletroforese em gel de agarose (Figura 9), onde pode-se identificar

características moleculares importantes, tais como: mobilidade eletroforética, modo de

dispersão em gel de agarose e teor qualitativo de grau de sulfatação através de reação

metacromática (RODRIGUES et al., 2011a, 2011b; QUINDERÉ et al., 2013). Corroborando

com os resultados da análise bioquímica anterior de Teor de sulfato, estes dados sugerem o

método I (CCP) é mais eficiente para o isolamento de polissacarídeos sulfatos, em relação aos

obtidos pelo método II (AIA).

O método de isolamento de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas,

utilizando como agente precipitante o solvente catiônio CCP, descrito inicialmente por Farias

e colaboradores (2000), têm sido relatado na literatura pela sua eficácia para estes tipos de

macromoléculas (RODRIGUES et al., 2011a, 2011b; ARAÚJO et al., 2012; COURA et al.,

2012; QUINDERÉ et al., 2013; CARNEIRO et al., 2014). Adicionalmente, as análises da

amostra polissacarídica, isolada pelo método I (CCP), demonstraram características similares

as descritas na literatura (MELO et al., 2002; COURA et al., 2012), as quais são apresentados

dados indicativos do polissacarídeo ser uma agarana sulfatada.

O termo agarana sulfatada têm sido empregado na literatura para designar galactanas

sulfatados do tipo agarana, isolados de algumas algas marinhas vermelhas, como as do gênero

Gracilaria, pois, mesmo submetidos a técnicas de fracionamento, ainda apresentam

características estruturais e composição básica similares, e com quantidades insignificantes

(menos de 3%) de outros polissacarídeos, como xilose (0,7%) e glicose (1,5%) (MELO et al.,

57

2002; et al., 2004; CHATTOPADHYAY et al., 2008; JIAO et al., 2011; FERREIRA et al.,

2012).

Os presentes dados corroboram com a literatura e sugerem que o uso de CCP é o

melhor reagente para o isolamento de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas. Apesar

disso, o método II, utilizando AIA mostrou-se promissor para a obtenção de outros tipos de

moléculas, como lipídios, pigmentos e possivelmente ácidos nucleicos. Os achados

observados até o momento, no presente estudo, sugerem que o método utilizando álcool

isoamílico revela-se como uma nova alternativa para a obtenção de outras moléculas de algas

marinhas, apresentando-se como um método em potencial para futuras aplicações

biotecnológicas.

Para avaliar uma possível atividade biológica das amostras isoladas nos dois métodos

analisados, avaliou-se o potencial efeito anticoagulante in vitro, através do teste de APTT. A

análise de uma possível atividade anticoagulante no presente estudo, foi realizado devido a

algumas algas marinhas apresentam um efeito positivo para essa referida atividade, cujo efeito

é relatado na literatura por estar associado com características físico-química e estruturais

relativas a molécula, como tamanho, composição (tipo de açúcar constituinte), densidade da

carga, teor de sulfato, bem como a geometria molecular e posicionamento do grupo sulfatado

nas unidades das cadeias polissacarídicas (POMIN; MOURÃO, 2008; RODRIGUES et al.,

2009; 2011a; POMIN, 2012). Os dados obtidos no ensaio de TPPa sugerem que os

polissacarídeos isolados de G. cornea não apresentam efeito intrínseco e/ou ação nas vias

comuns do sistema de coagulação (ARAÚJO et al., 2012; QUINDERÉ et al., 2014).

Cardozo e colaboradores (2007) relatam que espécies do gênero Gracilaria

apresentam diferenças na proporção relativa de sulfato, o que possivelmente poderia estar

relacionado com suas atividades biológicas. Além disso, estudos prévios reportam que

polissacarídeos do tipo ágar, como o apresentado pela espécie G. cornea é composto

principalmente por resíduos de β-D-galactopiranosídeos (Unidade A) e α-L-

galactopiranosídeos (Unidade B), também conhecido por 3,6-anidrogalactopiranosídeo,

apresentando baixo teor de sulfatação, quando comparado a polissacarídeos sulfatados de

outras espécies de algas marinhas (CARDOZO et al., 2007; CAMPO et al., 2009).

De acordo com Dantas-Santos e colaboradores (2012), altas taxas de galactose-6-

sulfato tem sido sugeridos como um importante marcador estrutural para uma possível

atividade anticoagulante em polissacarídeos sulfatados de algas marinhas. Corroborando essa

informação, a análise dos resultados apresentados dos espectros na região do infravermelho

no presente estudo, revelaram que, apesar de ter identificado a presença de sinal característico

58

para galactose-6-sulfato, o mesmo revelou-se baixo, e portanto, não apresentando aspectos

estruturais importantes para a referida atividade (Figura 10 e Tabela 2). Deste modo, pode-se

sugerir que o fato de polissacarídeos sulfatados, do tipo agarana, isolados de G. cornea, não

interferirem no tempo de coagulação normal (Tababela 2), pode estar correlacionado com

aspectos relacionados com estrutura-função da molécula (MAZUMDER et al., 2002; POMIN,

2012).

Em resumo, este estudo representa uma nova abordagem para análise de

polissacarídeos sulfatados de algas marinhas, auxiliando a identificação de grupos funcionais,

bem como para quimiotaxonomia, ou seja, a identificação de espécies de algas a nível

bioquímico e molecular (YEH; CHEN, 2004; POMIN; MOURÃO, 2008; RODRIGUES et

al., 2012). Adicionalmente, o presente trabalho poderá contribuir para a identificação de

novas fontes de lipídios e pigmentos para indústrias de biocombustíveis, alimentícia e

farmacêutica, respectivamente (CARDOZO et al., 2007).

7 CONCLUSÃO

O método de precipitação usando cloreto de cetilpiridínio (CCP) é mais apropriado

para a obtenção de polissacarídeos sulfatados da macroalga marinha vermelha Gracilaria

cornea, em comparação com o uso de álcool isoamílico. Entretanto, o método utilizando AIA

revelou-se um método a ser investigado para uma possível aplicação biotecnológica para a

obtenção de lipídios e, possivelmente, outras moléculas, como pigmentos e ácidos nucléicos.

Adicionalmente, os polissacarídeos analisados a partir do método utilizando CCP foi

identificado como uma agarana sulfatada (AS-Gc) e a qual mostrou-se não ter atividade

anticoagulante.

O presente estudo se encontra publicado no periódico Acta Scientiarum -Biological

Science (ANEXO I).

59

CAPITULO II

AGARANA SULFATADA DE G. cornea:

AVALIAÇÃO DE EFEITOS NEUROPSICOFARMACOLÓGICOS EM

CAMUDONGOS

60

8 INTRODUÇÃO

8.1 Atividades Biológicas de Polissacarídeos Sulfatados de Macroalgas Marinhas

Como descrito anteriormente, algas marinhas têm sido bastante exploradas como

fontes de polissacarídeos sulfatados, os quais são utilizados e/ou investigados em diversas

aplicações, como em indústrias alimentícias, cosméticas, biotecnológicas e farmacológicas

(WIJESKARA; PANGESTUTI; KIMA, 2011; PATEL, 2012).

Estudos prévios têm relatado diversas propriedades biológicas com potencial

farmacológico desses referidos bioativos, como atividades anticoagulante (PEREIRA et al.,

SILVA et al., 2010; RODRIGUES et al., 2013a), antitrombótica (RODRIGUES et al., 2011;

QUINDERÉ et al., 2014), antimicrobiana (AMORIM et al., 2012), antioxidante (ALVES et

al., 2012), antinociceptiva e anti-inflamatória (COURA et al., 2012; QUINDERÉ et al., 2013;

RIBEIRO et al., 2014; CARNEIRO et al., 2014). Adicionalmente, estudos toxicológicos têm

reportado que polissacarídeos sulfatados não apresentam efeitos deletérios em modelos

utilizando animais (ASSREUY et al., 2008; ARAÚJO et al., 2011; VANDERLEI et al., 2011;

RODRIGUES et al., 2013b). Entre estes estudos, Coura e colaboradores (2012) reportaram

que polissacarídeos sulfatados isolados da macroalga marinha G. cornea não produziram

efeitos tóxicos significativos e promoveram efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios in

vivo.

Assim como descrito no capítulo I desta tese, os polissacarídeos sulfatados desta

referida alga possuem composições e características estruturais já conhecidas (MELO et al.,

2002), pelas quais são sugestivas para que o mesmo seja descrito como uma agarana

sulfatada. Assim como sua estrutura bem definida, como relatado anteriormente, a literatura

descreve atividades biológicas com grande potencial farmacológico (COURA et al., 2012).

Apesar disso, a literatura ainda carece de estudos sobre os efeitos desta e de outros

polissacarídeos sulfatados em atividades psicotrópicas, bem como na descrição de possíveis

efeitos colaterais necessários para a descrição farmacológica de drogas.

Por este motivo, avaliações neurocomportamentais são componentes importante para

a determinação de possíveis toxicidades induzidas por compostos químicos, os quais podem

promover alterações em funções cognitivas, motores e afetivas (FIEDLER et al., 1996;

MOSER, 2001).

61

8.2 Uso de Modelos Animais para a Investigação de Possíveis Alterações

Neurocomportamentais induzidas por Bioativos

De acordo com Fieldler e colaboradores (1996), o comportamento é o resultado de

vários mecanismos associados ao sistema nervoso central (SNC). A resposta emocional ao

estresse, processos de aprendizado, conclusão de tarefas são atividades esperadas de um

sistema nervoso intacto, o qual está vulnerável a fatores ambientais que incluem condições

físicas (traumas e alterações na temperatura), bem como fatores químicos. A exposição a

químicos podem resultar em efeitos neurocomportamentais dependendo da substância

química em particular, as circunstâncias de exposição, duração e intensidade de exposição,

bem com a susceptibilidade do organismo.

Apesar de algumas limitações entre a aplicabilidade de processos neurais em

desordens neuropsiquiátricas e descobertas de novas drogas, múltiplos ensaios

neurocomportamentais têm sido utilizados por décadas para se compreender sobre as bases

neurais do comportamento (GERLAI, 2002; WAHLSTEN et al., 2003).

O uso de modelos animais permite uma investigação científica do comportamento de

processos e mecanismos patofisiológicos envolvidos no controle de comportamentos normais

e anormais (RODGERS et al., 1997; OVERMIER, 1999; PETTERS; SOMMER, 2000;

PHILLIPS et al., 2002; HOLMES, 2003; MATTHEWS et al., 2005; RAND, 2008). Por este

motivo, modelos animais de avaliação de alterações neurocomportamentais são importantes

em todas as áreas de pesquisas biomédicas.

Os testes de análises neurocomportamentais podem avaliar uma variedade de

aspectos, incluindo funções autonômicas, neuromusculares, sensitivas e excitatórias

(MOSER, 2001).

Os modelos animais de avalição neurocomportamental têm sido caracterizados em

três classes: modelos animais de desordens clínicas, bioensaios comportamentais e teste de

screenig comportamentais (WILLNER, 1991). Entre eles, o screening neurocomportamental

têm sido utilizados para avaliar o impacto de manipulações genéticas e/ou farmacológicas em

comportamentos específicos, os quais estão envolvidos em distúrbios comportamentais de

interesse, como a ansiedade e a depressão (TECOTT; NESTLER, 2004).

62


Devido à ação central relatada em modelos de nocicepção por Coura e colaboradores

(2012), bem como a escassez de estudos dos efeitos neurocomportamentais de polissacarídeos

sulfatados derivados de algas, no presente estudo hipotetizou-se uma possível atividade

psicotrópica induzida por AS-Gc e, portanto, realizou-se um screening em modelos clássicos

neuropsicofarmacológicos utilizando camundongos.

63

9 OBJETIVOS

9.1 Geral

O objetivo do presente capítulo foi determinar os efeitos neuropsicofarmacológicos

da administração de AS-Gc em camundongos.

9.2 Específicos

- Identificar os possíveis efeitos neurocomportamentais da administração de AS-Gc

administrada por vias oral e subcutânea em camundongos;

- Avaliar possíveis alterações fisiológicas indicativas de toxicidade;

- Investigar os potenciais efeitos locomotores, ansiolíticos, antidepressivos e

sedativo/hipnóticos.

64

10 MATERIAL E MÉTODOS

10.1 Obtenção de espécimes da alga Gracilaria cornea

Assim como descrito no tópico 4.1 do capítulo I.

10.2 Isolamento da Agarana sulfatada

Assim como descrito no tópico 4.3 (Método I - CCP) do capítulo I.

10.3 Animais

Neste capítulo do presente estudo, foram utilizados camundongos machos Swiss

(Mus musculus albinus), de 6-7 semanas de idade e com peso variando entre 25-30 g, todos

provenientes do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC. Os

animais foram mantidos em caixas de prolipropileno com no máximo 6 animais por caixa, em

condições de biotério com temperatura média de 24 ± 2°C em ciclos de alternância

claro/escuro de 12 horas, recebendo ração padrão e água a vontade.

10.4 Aspectos éticos

Com relação aos aspectos éticos, os protocolos experimentais foram elaborados de

acordo com o “Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório” da Sociedade Brasileira

de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL), o qual foi devidamente aprovado pela

Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA, da Universidade Federal do Ceará – Campus

de Fortaleza, sob o número 45/13 (ANEXO II). Todos os esforços foram feitos para

minimizar o número e o sofrimento dos animais utilizados.

65

10.5 Modulação Farmacológica

Para maiores informações, no presente Capítulo, as doses utilizadas de AS-Gc em

todos os ensaios in vivo foram pré-determinadas de acordo com informações obtidas por

Coura e colaboradores (2012), com algumas adaptações, a qual realizou todos os ensaios com

doses a partir de 3,0 mg/Kg, administradas por via subcutânea (s.c.). Para se avaliar alterações

farmacológicas, optou-se por doses em concentrações com diferença de 10 vezes de uma para

outra, tomando como partida, a menor dose descrita pelo autor. Portanto, foram padronizadas

as doses de 0,3; 3,0 e 30 mg/Kg. Paras as vias utilizadas, considerou-se a via subcutânea, já

descrito na literatura (COURA et al., 2012) e, adicionalmente, a via oral (v.o.), por ser

considerada a via mais conveniente de administração farmacológica, por não necessitar de

auxílio de um profissional de saúde para sua execução (SCHELLACK, 2006). Para as outras

drogas utilizadas no presente estudo, baseou-se com recomendações descritas na literatura, as

quais estão devidamente descritas em cada seção metodológica deste capítulo.

10.6 Investigação dos Efeitos Neurocomportamentais da Agarana Sulfatada (AS-Gc) em

Camundongos

Antes dos experimentos, os animais foram colocados em ambiente fechado,

desprovido de barulho externo, com a temperatura constante (24 ± 1º C) e, em alguns casos,

sob uma iluminação de baixa intensidade e de cor avermelhada (lâmpada vermelha de 15 W),

a qual não é perceptível pelos animais utilizados no presente estudo, de modo que se

adaptassem com o ambiente do experimento a ser realizado. Após as observações durante um

modelo comportamental, com exceção, apenas, do nado forçado e do teste de Suspensão por

Cauda, utilizou-se álcool 30% para remoção de resíduos e odores do animal.

10.6.1 Analises Neurocomportamentais e Fisiológicas Preliminares

Os animais foram divididos aleatoriamente em grupos compostos por três animais,

cada, os quais foram pré-tratados com AS-Gc (0,3; 3,0 ou 30,0 mg/Kg, v.o. ou s.c.) ou Salina

(0,9 %; v.o. ou s.c.) e alocados em gaiolas para observações de possíveis alterações

neurocomportamentais (Figura 12) e fisiológicas (atividade renal e do cólon) nos períodos de

66

0-5, 15 e 30 minutos, e 1, 2, 4 e 24 horas após a administração farmacológica (CARLINI,

1972; RODRIGUES; DUARTE-ALMEIDA; PIRES, 2010). Após 24 h, os animais foram

eutanasiados e, em seguida, estômago (grupos tratados por via oral somente), fígado e rins

foram removidos para análises. Os parâmetros analisados nos órgãos foram: (estômago)

presença de danos na mucosa gástrica interna e (fígado e rins) alterações na massa úmida,

respectivamente.

Figura 12 - Ilustração da Análise Neurocomportamental Preliminar

Fonte: Frota (2015). Legenda: (A) Gaiolas apropriadas utilizadas e exemplos de alguns parâmetros

neurocomportamentais observados: (B) Permanência nos cantos, (C) Escalar, (D) Sonolência, (E) Tônus

muscular, entre outros, por um período de: 0-5 min; 30 min; 1 h; 2 h; 4 h e 24 h.

Considerando que apenas a dose de 27,0 mg/Kg, descrita por Coura e colaboradores

(2012), apresentou um efeito sugestivo de ação central, e para respeitar os aspectos éticos de

uso de animais, optou-se por realizar todos ensaios posteriores apenas com uma dose

aproximada, a de 30,0 mg/Kg.

67

10.6.2 Análise de Alterações Locomotoras pelo teste do Campo Aberto (Open Field test)

O teste do Campo Aberto é comumente utilizado para avaliar locomoção e

indicativos de comportamento exploratório e ansiolítico em animais de laboratório. Este teste

é particularmente utilizado para avaliar os efeitos de drogas ansiolíticas e ansiogênicas, assim

como repostas comportamentais a um novo ambiente. A área do referido teste consiste de um

quadrado ou círculo rodeado por paredes, para prevenir que o animal escape, e sob iluminação

(Figura 13). Para o teste, o animal é alocado no centro da arena, seguido por uma análise de

parâmetros comportamentais por um período de tempo pré-determinado (ROYCE, 1977).

No presente estudo, o referido teste foi realizado em uma área de madeira (30 x 30 x

15 cm) dividida por nove linhas de áreas iguais. Inicialmente, os camundongos foram tratados

com AS-Gc (n = 9; 30,0 mg/Kg; v.o. ou s.c.), Salina (n = 8; 0,9 %; v.o. ou s.c.) ou Diazepam

(n = 8; 2,0 mg/Kg, intraperitonealmente – i.p.). 1 h após a administração v.o., e 30 min da s.c.

ou i.p., respectivamente, os animais foram colocados no centro da arena e, mensurado a

atividade locomotora durante um período de 5 minutos. Os parâmetros analisados foram:

número de linhas cruzadas (atividade locomotora horizontal), rearing (levanta-se - atividade

locomotora vertical), tempo parado e, adicionalmente, o grooming (auto-limpeza) (SIELGEL,

1946; ARCHER, 1973).

Figura 13 - Ilustração do Campo Aberto

Fonte: Frota (2015).

68

10.6.3 Teste da Placa Perfurada (Hole Board test)

O teste da Placa Perfurada é utilizado para determinar a ação de bioativos no

comportamento exploratório e, em especial no aprendizado. O aparato utilizado consiste em

uma plataforma plana com orifícios, pelos os quais os camundongos podem colocar suas

cabeças afim de explorar o ambiente (CLARK et al., 1971) (Figura 14). Através da análise da

quantidade de vezes do animal em colocar a cabeça nos orifícios, bem como pelo tempo de

permanência da mesma, é possível avaliar drogas quanto a possíveis efeitos psicotrópicos

(DHARA et al., 2002). Deste modo, buscou-se utilizar o teste da Placa Perfurada para avaliar

os efeitos de AS-Gc na atividade exploratória de camundongos. Inicialmente, os

camundongos foram tratados com AS-Gc (n = 9; 30,0 mg/Kg; v.o. ou s.c.), Salina (n = 8; 0,9

%; v.o. ou s.c.) ou Diazepam (n = 8; 1,0 mg/Kg, intraperitonealmente – i.p.). 1 h após a

administração v.o., e 30 min da s.c. ou i.p., respectivamente, cada animal foi analisado no

referido teste por um período de 5 min.

Figura 14 - Ilustração da Placa Perfurada

Fonte: Arquivo Pessoal do Autor.

69

10.6.4 Teste da Cruz Elevada (Pluz Maze test)

O teste da Cruz Elevada, descrito inicialmente por Lister (1987), é utilizado como

ensaio comportamental para avaliar possíveis efeitos ansiolíticos de agentes farmacológicos,

bem como para auxiliar na determinação de regiões cerebrais e mecanismos envolvidos no

comportamento relacionado com a ansiedade. Brevemente, camundongos são colocados no

centro da junção de quatro braços elevados a 45 centímetros do chão, consistindo de dois

braços abertos (30 x 5 cm) (sem paredes, deixando os animais expostos ao meio) e dois

fechados (30 x 5 x 25 cm) (com paredes, servindo com um abrigo seguro para o animal)

perpendiculares (Figura 15), os quais são quantificados o percentual relativo ao número de

entradas do animal em cada braço (WALF; FRYE, 2007). Compostos ansiolíticos reduzem a

aversão do animal aos braços abertos e promovem uma exploração no referido braço. Por

outro lado, a passagem forçada ou voluntária do animal para os braços fechados está

associada com mudanças hormonais e comportamentais indicativas de aumento da ansiedade

(HOGG, 1996). Inicialmente, os camundongos foram tratados com AS-Gc (n = 9; 30,0

mg/Kg; v.o. ou s.c.), Salina (n = 8; 0,9 %; v.o. ou s.c.) ou Diazepam (n = 8; 1,0 mg/Kg,

intraperitonealmente – i.p.). 1 h após a administração v.o., e 30 min da s.c. ou i.p.,

respectivamente, cada animal foi analisado no referido teste por um período de 5 min. Os

parâmetros analisados foram: percentagem do número de entradas e do tempo de permanência

nos braços abertos (PEBA e TPBA, respectivamente) e fechados (PEBF e TBPF,

respectivamente).

Figura 15 - Ilustração do equipamento utilizado para o teste da Cruz Elevada


70

10.6.5 Teste do Nado Forçado

No teste do Nado Forçado em camundongos (PORSOLT; BERTIN; JALFRE, 1977),

avalia-se uma possível atividade antidepressiva induzida por drogas, pelo o qual se é induzido

um grande estresse, este ocasionado pela ausência de suporte para se manter fora d’água

(Figura 16). A referida atividade pode ser observada considerando o aumento do tempo de

nado (sobrevivência) do animal. Para isso, inicialmente, os animais são individualmente

inseridos em um cilindro de 10 cm contendo água, com temperatura a 25 ºC. Após um breve

teste para avaliar se o animal consegue se manter na água sem afundar, estes são utilizados no

referido teste. No presente estudo, os camundongos foram tratados com AS-Gc (n = 9; 30,0

mg/Kg; v.o. ou s.c.), Salina (n = 8; 0,9 %; v.o. ou s.c.) ou Imipramina (n = 9; 10 mg/Kg, i.p.),

sendo este um antidepressivo padrão, utilizado como controle experimental. 1 h após a

administração v.o., e 30 min da s.c. ou i.p., respectivamente, cada animal foi submetido ao

teste do Nado Forçado, o qual mensurou-se o tempo de imobilidade (segundos), por um

período de 5 min.

Figura 16 - Ilustração do equipamento utilizado para o teste do Nado Forçado


71

10.6.6 Teste de Suspenção por Cauda

Assim como o modelo anterior, o teste de Suspensão por Cauda é utilizado para

avaliar os efeitos antidepressivos de drogas (CRYAN; MOMBEREAU; VASSOUT, 2005). O

presente modelo baseia-se em induzir um estresse no animal através de sua suspensão pela

cauda e avaliação da sua tentativa de escape (Figura 17). No presente estudo, os camundongos

foram tratados com AS-Gc (n = 9; 30,0 mg/Kg; v.o. ou s.c.), Salina (n = 8; 0,9 %; v.o. ou s.c.)

ou Imipramina (n = 9; 30 mg/Kg, i.p.), sendo este um antidepressivo padrão, utilizado como

controle experimental. 1 h após a administração v.o., e 30 min da s.c. ou i.p., respectivamente,

cada animal foi submetido ao referido modelo, o qual mensurou-se o tempo de imobilidade

(segundos), por um período de 6 min (STERU et al., 1985).

Figura 17 - Ilustração do equipamento utilizado para o teste do teste da Suspensão por cauda


72

10.6.7 Tempo de Sono induzido por Pentobarbital

Para avaliar um possível efeito hipnótico/sedativo induzido por AS-Gc, realizou-se o

ensaio de Tempo de sono induzido por Pentobarbital (Figura 18). No presente modelo, os

camundongos foram tratados com AS-Gc (n = 9; 30,0 mg/Kg; v.o. ou s.c.), Salina (n = 8; 0,9

%; v.o. ou s.c.) ou Diazepam (n = 8; 3,0 mg/Kg, i.p.) e, decorridos 1 h após a administração

v.o., e 30 min da s.c. ou i.p., respectivamente, os animais foram submetidos a injeção

intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/Kg). Posteriormente, avaliou-se o tempo de latência e

de sono (LOLLATO; SCARMINIO; MOREIRA, 2010).

Figura 18 – Ilustração do Sono Induzido por Pentobarbital



Todos os valores numéricos foram apresentados como erro padrão da média (EPM) e

submetidos a análises de diferenças estatísticas. No caso de dados paramétricos, utilizou-se a

análise de variância (one-way ANOVA), seguido pelo teste de Comparações Múltiplas de

Bonferroni, e, no caso de dados não-paramétricos, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis,

seguido pelo teste de Comparações Múltiplas de Dunn. Consideraram-se os valores com

P<0,05 como estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram realizadas no

programa GraphPad Prism, versão 4.0, (San Diego, CA, EUA). Adicionalmente, todos os

experimentos foram realizados por observadores “cegos”.

73

11 RESULTADOS

11.1 Análises Neurocomportamentais e Fisiológicas Preliminares

As alterações neurocomportamentais e fisiológicas estão indicadas nas tabelas 4 e 5,

respectivamente. De acordo com as avaliações preliminares, os resultados sugerem que AS-

Gc, nas doses 0,3; 3,0 e 30,0 mg/Kg, apresentam efeitos similares por ambas as vias de

administradas utilizadas (v.o. e s.c.). AS-Gc demonstrou efeitos indicativos de ação a nível de

sistema nervoso central, tais como: piloereção, tremor, ptose palpebral, grooming e

sonolência; e também a nível de sistema nervoso autônomo, com animais apresentando

redução do tônus muscular, em relação ao grupo controle tratado com salina (Tabela 4).

Não foram identificadas nenhuma alteração fisiológica significativa, em relação a

atividade renal (micção) e do cólon (defecação), bem como nas massas úmidas dos órgãos

analisados (fígado e rins), quando comparado ao grupo controle negativo (Salina) (Tabela 5).

Adicionalmente, a análise macroscópica da mucosa interna gástrica de animais tratados com

AS-Gc (0,3; 3,0 e 30,0 mg/Kg) por via oral não indicou sinais indicativos de danos, em

relação ao grupo tradado com Salina (Figura 19).

11.2 Avaliação da Atividade Locomotora pelo teste do Campo Aberto (Open Field test)

No Teste do Campo Aberto, pôde-se observar que camundongos tratados com

Diazepam (DZP, 2,0 mg/Kg; i.p.) apresentaram diminuição significativa na atividade

locomotora vertical (rearing, 11,6 ± 3,0 número de vezes executado) e horizontal

(cruzamento, 36,0 ± 4,6 número de linhas cruzadas), bem como um aumento no tempo parado

(144,3 ± 27,9 segundos), em relação aos grupos Salinas (0,9%, v.o. e s.c.) (rearing: 45,7 ± 9,3

e 47,3 ± 2,7; cruzamento: 87,1 ± 17,1 e 90,4 ± 5,3 linhas cruzadas; tempo parado: 29,7 ± 10,3

e 10,8 ± 4,5 sec., respectivamente) (Figura 20). Por outro lado, animais tratados com AS-Gc

(30,0 mg/Kg, v.o. ou s.c.) não apresentaram alterações locomotoras vertical (rearing: v.o.:

42,7 ± 3,9 e s.c.: 48,0 ± 3,1 número de vezes executadas) e horizontal (cruzamento: v.o.: 80,8

± 3,9 e s.c.: 94,0 ± 8,4 linhas cruzadas), bem como no tempo parado (v.o.: 10.8 ± 4.3 and s.c.:

23.0 ± 4.2 sec.), em relação ao grupo Salina (v.o. ou s.c.). Adicionalmente, os grupos DZP e

AS-Gc (30,0 mg/Kg, v.o. ou s.c.) demonstraram uma tendência de redução do grooming, mas

não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos analisados.

74

Tabela 4 – Análises neurofarmacológicas preliminares

Grupo/via Efeito comportamental observado

Salina (v.o.) Sem alterações comportamentais significativas observadas.

Salina (s.c.)

Sem alterações comportamentais significativas observadas.

0,3 mg/kg (v.o.)

Piloereção a partir da 4ªh, diminuição da atividade motora (em relação ao

grupo salina), permanência nos cantos, tremor a partir da 4ªh, ptose semi-

parcial na 24ªh.

3 mg/kg (v.o.)


grupo salina), permanência nos cantos, tremor a partir do 15º min,

alteração na postura (L), ptose parcial a partir da 2ª h, grooming,

sonolência.

30 mg/kg (v.o.)


grupo salina), permanência nos cantos, tremor a partir do 15º min, ptose

semi-parcial a partir da 2ª h e total a partir da 24ª h, grooming excessivo.

0,3 mg/kg (s.c.)

Piloereção a partir da 4ªh, diminuição da atividade motora (em relação

ao grupo salina), permanência nos cantos, ptose semi-parcial, redução

do tônus muscular durante as primeiras 4 horas e grooming excessivo.

3 mg/kg (s.c.) Diminuição da atividade motora (em relação ao grupo salina),

permanência nos cantos, ptose parcial na 2ª h.

30 mg/kg (s.c.)

Piloereção a partir da 1ª e 2ªh, diminuição da atividade motora (em

relação ao grupo salina), permanência nos cantos, tremor a partir da

4ªh, ptose semi-parcial, parcial e/ou total a partir de 30 min, redução do

tônus muscular até a 1ª h e alteração até a 24ªh e sonolência.

Fonte: Arquivo Pessoal do Autor. Legenda: Os camundongos (n = 3 por grupo, machos, pesando

aproximadamente 35-40 g) foram tratados com AS-Gc (0,3; 3 ou 30 mg/Kg; v.o., ou s.c.). Observou-se

parâmetros neucomportamentais segundo Carlini (1972), durante os primeiros 5 min, e, posteriormente, nos

tempos 15, 30, 60 min e 2, 4 e 24 h.

75

Tabela 5 - Análise da micção e atividade excretória após administração de AS-Gc

Grupo

Via de

. administração

Micção

(Número de vezes)

média ± EPM

Defecação

(Número de bolos

fecais)

média ± EPM

Fígado

(Massa úmida - g)

média ± EPM

Rins

(Massa úmida - g)

média ± EPM

Salina (v.o.) 2,714 ± 1,19 16,667 ± 6,34 2,02 ± 0,12 0,75 ± 0,05

Salina (s.c.) 0,714 ± 0,42 5,167 ± 1,35 1,47 ± 0,17 0,60 ± 0,04

0,3 mg/kg (v.o.) 2,000 ± 1,13 18,333 ± 4,57 1,70 ± 0,14 0,65 ± 0,06

3,0 mg/kg (v.o.) 3,714 ± 1,36 18,167 ± 6,53 1,93 ± 0,06 0,80 ± 0,04

30,0 mg/kg (v.o.) 2,286 ± 1,04 22,333 ± 6,92 1,80 ± 0,03 0,73 ± 0,01

0,3 mg/kg (s.c.) 0,571 ± 0,57 4,333 ± 1,23 1,44 ± 0,09 0,60 ± 0,05

3,0 mg/kg (s.c.) 1,000 ± 0,44 8,667 ± 1,87 1,51 ± 0,06 0,56 ± 0,02

30,0 mg/kg (s.c.) 0,714 ± 0,57 6,000 ± 0,97 1,43 ± 0,10 0,56 ± 0,04


aproximadamente 35-40 g) foram tratados com AS-Gc (0,3; 3 ou 30 mg/Kg; v.o. ou s.c). Foram contabilizados

os bolos fecais e sinais de micção segundo Carlini (1972), durante os primeiros 5 min, e, posteriormente, nos

tempos 15, 30, 60 min e 2, 4 h. Adicionalmente, foram contabilizadas a micção em 24 h. Teste de Kruskal-Wallis,

Dunn.

76

Figura 19 - Análise macroscópica da mucosa gástrica interna após tratamento via oral de AS-

Gc


aproximadamente 35-40 g) foram tratados com AS-Gc (0,3; 3 ou 30 mg/Kg; v.o.). Após 24 h, decorrido as

análises comportamentais, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e estômago foi removido,

aberto e fotografado para análise. (A) Salina e (B, C e D) AS-Gc 0,3; 3,0 e 30,0 mg/Kg, v.o., respectivamente.

77

Figura 20 - Análise da atividade motora no Teste do Campo aberto (Open Field test)

Fonte: Autor. Legenda: Os camundongos foram tratados com AS-Gc (n = 9; 30 mg/Kg; v.o. ou s.c.), Diazepam

(n = 8; DZP; 2,0 mg/Kg; i.p.) ou Salina (n= 8; 0,9%, v.o. ou s.c.). 1 h após a administração v.o. ou i.p., e 30 min

da s.c., os animais foram submetidos ao teste de Campo Aberto, sendo analisados os seguintes parâmetros: (A)

número de cruzamentos, (B) rearing, (C) Tempo de Imobilidade e (D) grooming. One-way ANOVA,

Bonferroni. *, ** e *** indicam diferenças P<0,05, P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo

DZP.

78

11.3 Análise da Atividade Exploratória através do Teste da Placa Perfurada (Hole Board

test)

A Figura 21 mostra a atividade exploratória dos animais durante 5 minutos de teste

de Hole Board. Camundongos tratados com AS-Gc (30,0 mg/Kg, v.o. ou s.c.) apresentaram

um aumento significativo (P<0,05) de aproximadamente 62 e 76%, respectivamente, em

relação ao número de head dips (39,8 ± 3,4 e 43,2 ± 4,0, respectivamente), similarmente ao

grupo DZP (1 mg/Kg, i.p.; 41,8 ± 3,0 número de vezes executado) e, ambos,

significativamente diferentes do grupo Salina (0,9%; v.o. ou s.c.; v.o.: 24,5 ± 3,0 e s.c.: 25,1 ±

1,9, respectivamente).

Figura 21 - Teste da Placa Perfurada (Hole Board test)

Fonte: Autor. Legenda: Os camundongos (n = 9 por grupo, machos, pesando aproximadamente 35-40 g) foram

tratados com AS-Gc (n = 9; 30 mg/Kg; v.o. ou s.c.), Diazepam (n = 8; DZP; 1 mg/Kg; i.p.) ou Salina (n= 8;

0,9%, v.o. ou s.c.). 1 h após a administração v.o. ou i.p., e 30 min da s.c., os animais foram observados durante 5

min na placa perfurada (hole board), sendo considerados o número de vezes que o animal colocou a cabeça (A) e

o tempo de permanência dentro de cada orifício (B). One-way ANOVA, Bonferroni. # indica diferença P<0,05,

em relação ao grupo Salina (v.o. e s.c.).

79

11.4 Análise do Potencial Ansiolítico através do Teste da Cruz Elevada (Plus Maze test)

Para analisar uma possível atividade ansiolítica induzida por AS-Gc, realizou-se o

teste da Cruz Elevada (Plus Maze test). DZP (1 mg/Kg, i.p.) induziu um aumento significativo

(P<0,001) quanto a entrada nos braços abertos (NEBA) e o tempo de permanência (TPBA)

dos camundongos nesses braços e reduziu o número de entradas (NEBF) e o tempo de

permanência (TPBF) nos braços fechados, em relação ao grupo Salina (0,9%, v.o. ou s.c.)

(Figura 22). Entretanto, não foram detectadas diferenças entre os parâmetros analisados de

animais tratados com AS-Gc (30,0 mg/Kg, v.o. ou s.c.), em relação ao grupo Salina.

Figura 22 - Plus Maze test


tratados com AS-Gc (n = 9; 30 mg/Kg; v.o. ou s.c.), Diazepam (n = 8; DZP; 1 mg/Kg; i.p.) ou Salina (n= 8;

0,9%, v.o. ou s.c.). 1 h após a administração v.o. ou i.p., e 30 min da s.c., os animais foram observados durante 5

min na cruz elevada (plus maze), sendo considerados: o percentual do número de vezes que o animal entrou nos

braços abertos e o seu o tempo de permanência no mesmo (A e B), bem como as respectivas percentagens de

entrada e tempo de permanência nos braços fechados (C e D), respectivamente. One-way ANOVA, Bonferroni.

### indica diferença P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Salina (v.o. e s.c.).

80

11.5 Avaliação de Potencial Atividade Antidepressiva através dos testes de Nado

Forçado e Suspensão por Cauda

Para avaliar uma possível atividade antidepressiva induzida por AS-Gc (v.o. e s.c.),

realizaram-se os testes de Suspensão por Cauda (Figura 23A) e Nado Forçado (Figura 23B),

respectivamente. No teste de Suspensão por Cauda, as análises dos resultados revelaram uma

diminuição significativa (44,4 ± 9,2 segundos; P<0,05) em animais tratados com Imipramina

(30,0 mg/Kg, i.p.) (grupo controle positivo), em relação ao grupo negativo tratado com Salina

(0,9%; v.o.:109,7 ± 17,7 s; s.c.: 167,3 ± 6,0 s, respectivamente) (Figura 23A). Os animais

tratados com AS-Gc (30,0 mg/Kg, v.o. ou s.c.) não apresentaram diferenças no tempo de

imobilidade (v.o.: 105,0 ± 19,9; s.c.: 145,6 ± 4,7 s, respectivamente), em comparação ao

grupo controle negativo (Salina 0,9 %; v.o. e s.c.). No teste de Nado Forçado, os animais

tratados com Imipramina (10,0 mg/Kg, i.p.) (grupo controle positivo) apresentaram uma

redução (60,9 ± 7,8 s; P<0,001) no tempo de imobilidade, em relação ao grupo tratado com

Salina (0,9%, v.o.: 146,0 ± 10,8 s; s.c.: 126,7 ± 11,5 s, respectivamente) (grupo controle

negativo) (Figura 23B). Entretanto, o grupo tratado com AS-Gc (30,0 mg/Kg, v.o. ou s.c.) não

apresentou alterações significativas (v.o.: 153,4 ± 10,6 s; s.c.: 143,6 ± 143,6 ± 4,7 s,

respectivamente), em comparação ao grupo Salina (0,9%; v.o. e s.c.).

11.6 Análise de Atividade Hipnótico/Sedativa através do Modelo de Tempo de Sono

induzido por Pentobarbital

Devido a presença de ptoses, redução do tônus muscular e sonolência observados

anteriormente em camundongos tratados com AS-Gc, então decidiu-se investigar uma

possível ação hipnótico/sedativa do referido bioativo. De acordo com os resultados, DZP (3

mg/Kg, i.p.) aumentou (P<0,05) o tempo de sono (13.848 ± 608 segundos) e diminuiu

(P<0,01) o tempo de latência de sono (140 ± 20 s), em comparação ao grupo Salina (0,9%;

v.o.: 228 ± 12 s; e s.c.: 265 ± 19 s, respectivamente) (Figura 24). O grupo AS-Gc (30,0

mg/Kg; tempo de sono – v.o.: 5.137 ± 418 e s.c.: 4.274 ± 265 s; tempo de latência – v.o.:

257 ± 11; s.c.: 326 ± 18 s) não revelaram diferenças significativas nos parâmetros

analisados, em relação ao grupo Salina (0,9%; v.o. ou s.c.).

81

Figura 23 - Análise de Atividade Antidepressiva


tratados com AS-Gc (n = 9; 30 mg/Kg; v.o. ou s.c.), Imipramina (n = 9; A: 30,0 ou B: 10,0 mg/Kg; i.p.,

respectivamente) ou Salina (n = 8; 0,9%, v.o. ou s.c.). 1 h após a administração v.o. ou i.p., e 30 min da s.c., os

animais foram submetidos ao teste de Suspensão por Cauda (A) ou ao teste de Nado Forçado (B), sendo

observados em relação ao tempo de imobilidade em segundos, por um período de 5 e 6 minutos,

respectivamente. One-way ANOVA, Bonferroni. # e ### indicam diferenças P<0,05 e P<0,01, respectivamente,

em relação ao grupo Salina (v.o. e s.c.). * e *** indicam diferenças P<0,05 e P<0,001, respectivamente, em

relação ao grupo DZP.

Figura 24 - Tempo de Sono Induzido por Pentobarbital


tratados com AS-Gc (30 mg/Kg; v.o. ou s.c.), Diazepam (DZP; 3 mg/Kg; i.p.) ou Salina (0,9%, v.o. ou s.c.). 1 h

após a administração v.o. ou i.p., e 30 min da s.c., os animais foram tratados com pentobarbital (50 mg/Kg, i.p.)

e, posteriormente, observados em relação ao tempo de latência de sono (A) e de sono (B). One-way ANOVA,

Bonferroni. # e ### indicam diferenças P<0,05 e P<0,01, respectivamente, em relação ao grupo Salina (v.o. e

s.c.). ** e *** indicam diferenças P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo DZP.

82

12 DISCUSSÃO

Recentemente, agarana sulfatada isolada de G. cornea foi descrita como um

bioativo natural com atividades antinociceptiva e anti-inflamatória in vivo por Coura e

colaboradores (2012). De acordo com o este estudo, sugeriu-se que este polissacarídeo

sulfatado (na dose de 27 mg/Kg, s.c.) possuía atividade antinociceptiva, similarmente a

morfina, atuando através de uma ação analgésica via SNC. Desta forma, para se esclarecer

os efeitos de AS-Gc no SNC, o presente estudo realizou investigações do referido

polissacarídeo em duas vias usualmente utilizadas de administração (v.o. e s.c.) e em

diferentes modelos in vivo relacionados com as atividades locomotora, exploratória,

ansiolítica, antidepressiva e hipnótico/sedativa, respectivamente.

Inicialmente, foram realizados observações préclínicas, as quais são descritas na

literatura por estarem associadas a alterações no sistema nervoso e auxiliarem na

indentificação de ação a nível central, como estimulantes ou depressores, e/ou no sistema

nervoso autônomo, resultados em alterações neurocomportamentais e fisiológicas

(CARLINI, 1972; DUARTE-ALMEIDA; PIRES, 2010). Os dados obtidos no presente

estudo indicaram que a administração de AS-Gc (0.3; 3,0 e 30,0 mg/kg; v.o. e s.c.) poderia

estar promovendo alterações no sistema nervoso central e autonômico (Tabela 4).

Estudos prévios de avaliação toxicológica aguda e/ou subcrônica de polissacarídeos

sulfatados de algas marinhas têm reportado ausência de efeitos adversos em modelos in vivo,

como alterações ponderais, morte, alterações macro ou microscópica em órgãos (fígado, rins e

coração), ou nos níveis séricos de alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase

(AST/ALT) nas doses de: 10,0 mg/Kg/animal/intraperitonelamente (i.p.) por 48 h ou 14 dias

consecutivos (VANDERLEI et al., 2011); 9,0 mg/Kg/i.p. por 14 dias consecutivos (ARAÚJO

et al., 2011; COURA et al., 2012); 1,0, 5,0 e 25,0 mg/Kg/intravenosa (i.v.) por 48 h

consecutivas (ASSREUY et al., 2008). Entretanto, poucas análises comportamentais e

fisiológicas têm sido relatadas.

No presente estudo, as análises não revelaram alterações fisiológicas indicativas de

toxicidade nas vias de administração utilizadas (Tabela 4, Figura 19). Estes resultados

corroboram com os achados encontrados por Coura e colaboradores (2012), os quais são

indicativos de ausência de toxicidade in vivo e, portanto, apresentando uma potencial

segurança farmacológica para o uso farmacológico desta agarana sulfatada em modelos in

vivo. Adicionalmente, como os resultados nas observações préclínicas não demonstrara

diferenças entre as doses utilizadas (0,3; 3,0 e 30,0 mg/Kg; v.o. ou s.c.), e como foi sugerido

83

na literatura que apenas a dose de 27 mg/Kg revelou uma possível ação central (COURA et

al., 2012), optou-se por realizar análises comportamentais mais específicas apenas com a dose

mais alta de AS-Gc (30,0 mg/Kg; v.o. ou s.c.).

Para avaliar se os efeitos analgésicos relatados por Coura e colaboradores (2012)

estariam implicados em possíveis efeitos sobre o SNC, realizaram-se ensaios psicotrópicos in

vivo clássicos, relacionados a investigação de possíveis alterações locomotoras, e efeitos

ansiolíticos, antidepressivos e sedativo/hipnóticos, os quais poderiam estar implicados e/ou

ser confundidos com respostas anti ou pró-nociceptivas.

Os dados obtidos no presente trabalho sugerem ausência de alterações na atividade

locomotora (Figuras 22), assim como em relação a possíveis efeitos ansiolíticos (Figura 22),

antidepressivos (Figura 23) e sedativo/hipnóticos (Figura 24) associados a administração de

AS-Gc nas vias e doses utilizadas. Entretanto, AS-Gc (30 mg/Kg, v.o. e s.c.) apresentou um

aumento da atividade exploratória no Hole Board test (teste da Placa Perfurada) (Figura 21).

Os resultados indicam uma divergência entre os dados obtidos pelas observações

préclinicas e o Teste do Campo Aberto. Possivelmente, esta divergência pode estar associada

a diferenças relacionadas aos parâmetros de análise utilizados em cada teste. As observações

préclínicas providenciam o potencial efeito de um bioativo sobre o SNC (RODRIGUES et al.,

2008; RODRIGUES; DUARTE-ALMEIDA; PIRES, 2010). Entretanto, o Teste do Campo

Aberto pode ser considerado um modelo neurocomportamental mais eficiente para avaliar a

atividade locomotora, em comparação as observações préclínicas. Assim, o Teste do Campo

Aberto pode ser utilizado para confirmar ou refutar possíveis achados comportamentais

relacionados a atividade locomotora observados nas análises préclínicas.

Apesar do teste do Campo Aberto também indicar uma possível atividade

exploratória, estudos tem mostrado que ambas as atividades, locomotora e exploratória,

podem variar independentemente uma da outra (FILE 1977, LISTER 1987; DURCAN;

LISTER 1989, ABEL 1995; DHARA et al., 2002). De acordo com Brown e Nemes (2008),

altos níveis de atividade exploratória podem ser interpretados como indicativos de neofilia, o

qual é definido como uma preferência pelo novo, enquanto que baixos níveis exploratórios

são sugeridos como uma diminuição de neofilia ou um estado de alta ansiedade pelo animal.

De acordo com Dhara e colaboradores (2002), alta frequência de head dipping é

usualmente um indicativo de níveis normais de ansiedade, enquanto que a diminuição dessa

atividade está relacionada a um aumento da ansiedade. Entretanto, os resultados obtidos no

teste de Cruz Elevada (Plus maze test) não confirmaram uma atividade ansiolítica induzida

por AS-Gc em camundongos.

84

De acordo com a literatura, a pré-disposição de animais a diferentes ambientes

novos, como nos testes do Campo Aberto e a Placa perfurada têm sido utilizados para avaliar

comportamentos relacionados ao estado de ansiedade de roedores (WALF; FRYE, 2007). O

teste da Placa perfurada é mencionado na literatura como um teste indicativo de

comportamento exploratório relacionado a ansiedade (CASARRUBEA et al., 2010; MAGAJI

et al., 2014; BARTH; MODI, 2014; MATEOS-GARCIA et al., 2015). Apesar disso, de

acordo com Walf e Frye (2007), os índices de comportamentos de ansiedade observados no

teste da Cruz elevada não podem ser correlacionados com a atividade exploratória. Assim, os

resultados obtidos em ambos os testes sugerem que AS-Gc induz a um aumento da atividade

exploratória, mas não relacionado a uma ação ansiolítica.

Estudos sugerem que a atividade exploratória pode estar associada com os níveis de

dopamina. Ikemoto e Panksepp (1999) relatam que os efeitos de agonistas dopaminérgicos

são melhor caracterizados como um aumento em geral da atividade exploratória do que por

um aumento da atividade locomotora. Do mesmo modo, outros estudos têm sugerido o

envolvimento do sistema serotoninérgico na atividade exploratória (TAMADA et al., 2010).

De acordo com estes estudos, alterações no sistema nervoso serotoninérgico central são

capazes de comprometer o desempenho de uma tarefa e/ou um aprendizado já adquirido

significativamente, os quais podem ser concluídos por um cérebro com mecanismos

serotoninérgicos normais (MOGENSEN et al., 2003). Desta maneira, os dados deste estudo

sugerem que AS-Gc poderia estar atuando em vias dopaminérgicas e/ou serotoninérgicas,

estimulando um comportamento exploratório de camundongos.

Em resumo, o presente estudo descreve, em geral, uma ausência de alterações

adversas relacionadas a atividades neurocomportamentais e fisiológicas de AS-Gc, nas vias e

doses analisadas, em modelos clássicos experimentais in vivo. Adicionalmente, AS-Gc

aumentou a atividade exploratória de camundongos, a qual, possivelmente, pode estar

envolvida na modulação neuroquímica de dopamina e serotonina.

85

13 CONCLUSÃO

AS-Gc induziu alterações neurocomportamentais, promovendo aumento da atividade

exploratória e, pela qual, pode-se sugerir uma possível ação via sistema dopaminérgico e/ou

serotoninérgico. Adicionalmente, o presente estudo pode sugerir que o referido bioativo

apresenta segurança farmacológica pela ausência de alterações significantes nos órgãos

analisados (fígado, rins e mucosa gástrica) e efeitos adversos relacionados a locomoção,

ansiedade, depressão e atividade hipnótico/sedativa em camundongos nas doses e vias

analisadas.

86

CAPITULO III

AGARANA SULFATADA DE G. cornea:

ATIVIDADE NEUROPROTETORA EM MODELO DE DOENÇA DE PARKINSON

EM RATOS

87

14 INTRODUÇÃO

14.1 O Sistema Nervoso Central a importância de sua integridade funcional

De acordo com Golam (2009), o sistema nervoso humano contém mais de 10 bilhões

de neurônios, onde, em sua maioria, formam milhares de conexões sinápticas, conferindo ao

sistema nervoso uma complexidade diferente daquela observada em qualquer outro sistema

orgânico. As interações entre os circuitos neuronais medeiam funções que incluem desde

reflexos primitivos até a linguagem, o humor, e a memória.

O sistema nervoso pode ser dividido, em nível estrutural e funcional, em

componentes periférico e central. O sistema nervoso periférico inclui todos os nervos que

seguem o seu percurso entre o sistema nervoso central e os locais somáticos e viscerais.

Enquanto que o sistema nervoso central (SNC) transmite e processa sinais recebidos do

sistema nervoso periférico, cujo processamento resulta em respostas que são formuladas e

retransmitidas à sua periferia. O SNC é responsável por funções importantes, como:

percepção, incluindo processamento sensitivo, auditivo e visual; estado de vigília, linguagem

e consciência (GOLAN, 2009).

Desordens no sistema nervoso, denominadas de desordens neurológicas, têm efeitos

devastadores e são amplamente distribuídas em toda a população, sendo especialmente

prevalente na população mais idosa. Essas desordens neurológicas são multifatoriais e podem

ter origem genética, epigenética e/ou serem induzidas por estresses ambientais, injúrias,

doenças e/ou processos inflamatórios (SIMONATO et al., 2013). Entre essas desordens

neurológicas, podem-se citar as desordens neurodegenerativas (DJALDETTI; LEV;

MELAMED, 2003).

A degeneração dos tecidos neurais, a qual pode ser denominada de

neurodegeneração, é considerado um grave problema de saúde de desordem neurológica.

Atualmente, com o aumento do envelhecimento da população, inclusive nos países em

desenvolvimento como o Brasil, tem recebido cada vez mais uma atenção especial pelas

conseqüências geradas, como: declínio em habilidades cognitivas e/ou locomotoras, perda de

memória, mudanças de personalidade e manifestações psiquiátricas. Além do envelhecimento,

a manifestação da neurodegeneração está relacionada a injúrias neurológicas, processos

inflamatórios, fatores nutricionais, predisposição genética, estresse, fumo e exposição a

toxinas ambientais (HO et al., 2012).

88

14.2 A Neurodegeneração

A neurodegeneração é considerada um grave problema de saúde de desordem

neurológica. Atualmente, com o aumento do envelhecimento da população, inclusive nos

países em desenvolvimento como o Brasil, tem recebido cada vez mais atenção especial

principalmente devido às consequências geradas, como: declínio em habilidades cognitivas

e/ou locomotoras, perda de memória, mudanças de personalidade e manifestações

psiquiátricas. Além do envelhecimento, as manifestações da neurodegeneração estão

relacionadas a injúrias neurológicas, processos inflamatórios, fatores nutricionais,

predisposição genética, estresse, fumo e exposição a toxinas ambientais (HO et al., 2012).

Os estudos de vias moleculares relacionadas a processos neurodegenerativos sejam

eles por mecanismos fisiológicos ou patológicos, têm propiciado a validação de genes

relacionados a perda de componentes e funções neurais, e contribuído para a elucidação de

mecanismos moleculares envolvidos. Através desses estudos têm-se verificado vias similares

nos processos neurodegenerativos, os quais estariam associados com as vias de sinalização

pró-apoptótica, pró-inflamatória e na modulação de processos relacionados à plasticidade

neural (CAO et al., 2010; AENLLE; FOSTER, 2010).

14.2.1 Neurodegeneração e a plasticidade neural

A neuroplasticidade é a habilidade do SNC, ou parte deste, de promover alterações

morfofisiológicas e moleculares em respostas às mudanças ambientais. A integridade dos

mecanismos neurofisiológicos, hábeis em sofrer adaptações ao meio, representa um papel

importante durante toda a vida. Entretanto, a eficiência da plasticidade desses mecanismos

pode ser influenciada por fatores genéticos, estilo de vida ou fatores ambientais, os quais

podem gerar uma cascata de eventos resultando na diminuição da plasticidade neural. Esse

desequilíbrio neuroplástico está relacionado à deterioração cognitiva e desempenha um

importante papel na indicação do desenvolvimento de fisiopatologias, em desordens

neurogênicas e neurodegenerativas (PASCUAL-LEONE et al., 2011).

Um dos genes mais estudados associados à neuroplasticidade é o fator neurotrófico

derivado do cérebro (BDNF), sendo também o fator de crescimento mais produzido e

essencial para o SNC. Estudos têm demonstrado que uma diminuição da síntese do RNAm de

89

BDNF está associado a problemas de estresse e depressão em pacientes com desordens

neurológicas (AUTRY; MONTEGGIA, 2012).

Em modelos de indução de doenças degenerativas experimentais, in vivo ou in vitro,

observa-se um aumento da regulação dos níveis de transcritos de BDNF, indicando uma

neurogenicidade natural responsiva ou induzida por fármacos (CORVINO et al., 2012).

Portanto, o RNAm de BDNF é utilizado como um indicador de atividade de fármacos com

ação neuroprotetora e um alvo em potencial para o tratamento de patologias de muitas

desordens neurológicas (ZHANG et al., 2012).

14.2.2 A neuroinflamação

O processo de inflamação do SNC denomina-se de neuroinflamação, o qual consiste

na ativação de mediadores inflamatórios, como a interleucina 1 beta (IL1β) e o fator

transcricional NFKB (sigla em inglês para nuclear factor kappa B). Estudos relatam a

neuroinflamação como um componente-chave na indução e progressão de processos

degenerativos no SNC. De acordo com estes estudos, a ocorrência da neuroinflamação pode

induzir desordens neurodegenerativas no SNC através do aumento da expressão de genes

relacionados à produção de mediadores neurotóxicos, os quais contribuem induzindo apoptose

de células neuronais (FRANK-CANNON et al., 2009; GUEDES; da SILVA, 2010).

Diversos estudos têm confirmado a regulação de outros genes pró-inflamatórios

responsáveis pela presença de citocinas comumente encontrados em processos inflamatórios,

como a IL1β e NFKB, ambos atuando como mediadores do processo inflamatório e, em

excesso, como fatores neurotóxicos associados com o início de processos de degeneração

neural (SEKIYAMA et al., 2012).

Em modelos de neurodegeneração experimental, o aumento de IL1β e NFKB no

SNC implica em mudanças comportamentais, como sonolência, distúrbios de memória, falta

de apetite e concentração, redução da atividade locomotora e depressão; modula o mecanismo

molecular neurodegenerativo e reduz o processo de neurogênese (KUBERA et al., 2011).

Portanto, a expressão de RNA’s mensageiros (RNAm) de IL1β e NFKB em modelos

experimentais de avaliação de disfunções comportamentais em ratos, sugerem o envolvimento

destes com a ocorrência de danos a células neurais (CASSANO et al., 2006; JARVELA et al.,

2011).

90

De acordo com a literatura, outra via importante para ser investigada e presente em

desordens neurodegenerativas é a via do óxido nítrico, a qual desempenha funções

importantes no sistema nervoso central tanto em condições fisiológicas quanto em condições

patológicas. Nessa via, a proteína óxido nítrico sintase induzida (iNOS) tem sua expressão

modulada positivamente durante processos inflamatórios em células neuronais auxiliares

responsivas a inflamação, os astrócitos e a microglia, resultando na elevação de óxido nítrico

e seus derivados e, quando em excesso nas células neurais, se torna tóxico e induz um

processo apoptótico (ZHANG; DAWSON; DAWSON, 2006). Por estes motivos, a análise da

via do óxido nítrico se torna uma ferramenta importante para o desenvolvimento de novas

estratégias farmacológicas, tanto para o tratamento quanto para o esclarecimento de processos

neurodegenerativos, como realizado atualmente em pesquisas relacionadas à doença de

Parkinson.

14.3 Doença de Parkinson

14.3.1 Epidemiologia

Entre as desordens neurodegenerativas, doença de Parkinson (DP) se encontra em

segundo lugar, perdendo apenas para a doença de Alzheimer, e afetando milhões de pessoas

no mundo, principalmente com idade acima dos 50 anos, sendo um dos distúrbios do

movimento mais comum do sistema nervoso (DORSEY et al., 2007; TOULOUSE;

SULLIVAN, 2008).

De acordo com Valadas e colaboradores (2014), dada a relevância do processo de

envelhecimento na DP e no aumento da expectativa de vida na população mundial, a

incidência desta patologia está aumentando drasticamente. Estima-se que afete 6 milhões de

pessoas no mundo (BOVÉ; PERIER, 2012), afetando cerca de 1 a 2 % da população acima de

65 anos de idade (SUBRAMANIAN; CHESSELET, 2013). De acordo com a

PARKINSON’S DISEASE FOUNDATION (2014), em países, como os Estados Unidos, há

um gasto anual de cerca de 25 bilhões de dólares com tratamento da doença, sendo o custo

médio por pessoa de 2.500 dólares por ano apenas com medicação. Adicionalmente, no Brasil

estima-se que cerca de 200 mil pessoas sofram com a doença de Parkinson (MS, 2014). A

incidência da DP tem aumentado junto com a idade, os homens apresentam 1,5 vezes a mais

de adquirir a doença.

91

14.3.2 Etiologia/Fisiopatologia

Apesar de décadas de estudo intensivo, a etiologia do mal de Parkinson permanece

desconhecida. Muitos especialistas afirmam que a doença é causada por uma combinação de

fatores genéticos e ambientais, que podem variar de pessoa para pessoa (SULZER;

SURMEIER, 2013; RIHMER; GINDA; DÖME, 2014; CHUKHLOVINA, 2014). Evidências

sugerem o envolvimento de processos nitrosativos/oxidativos e neuroinflamatórios na

progressão da doença de Parkinson (COLLINS et al., 2012). Assim, esta patologia vem sendo

caracterizada como uma doença multifatorial.

Acredita-se que a perda de dopamina faz com que a desregulação dos circuitos dos

gânglios basais resultem em proeminentes sintomas motores clínicos incluindo bradicinesia,

tremor em repouso, rigidez e instabilidade postural. Em adição aos sintomas motores, os

sintomas não motores, tais como distúrbios do sono, depressão, déficits cognitivos, e

autonômicos e disfunção sensorial, também estão bem associados à DP (PEREZ;

PALMITER, 2005; CHOI et al., 2008; McDOWELL; CHESSELET, 2012).

Segundo Winge e colaboradores (2006), do ponto de vista clínico, a DP caracteriza-

se também por insuficiência autonômica, apresentando distúrbios no trato urinário frequentes

em cerca de 27 a 78% dos pacientes.

Entre um dos principais problemas promovidos por essa doença é a incapacidade

severa, a qual pacientes são acometidos após 10 a 15 anos do início desta patologia, e

ocasionando um impacto social e financeiro elevado (PARKINSON’S DISEASE

FOUNDATION, 2013; AJETUNMOBI et al., 2014). Desta forma, novas abordagens

terapêuticas para o tratamento de DP se fazem necessários.

Em geral, para o estudo de novas estratégias no tratamento de DP, modelos animais

de DP são utilizados por serem capazes de reproduzirem bem os principais achados em

pacientes com DP, assim como também no reestabelecimento da performance locomotora

(MORIN; JOURDAIN; DI PAOLO, 2014). Apesar disso, os medicamentos atuais para

tratamento de DP são aplicados meramente para o alívio sintomático, sendo ineficazes para

combater os efeitos deletérios que levam à disfunção neuronal e a morte de neurônios

dopaminérgicos (VALADAS; VOS; VERSTREKEN, 2014).

92

14.4 Indução Experimental de Doença de Parkinson como Modelo de Estudo de

Processos de Neurodegeneração

Os tratamentos para a DP levam a uma melhora inicial enquanto a doença progride,

entretanto, com o passar do tempo sua eficácia diminui bastante (XU; BASTIA;

SCHWARZSCHILD, 2005).

O desenvolvimento de novos tratamentos que melhoram a sintomatologia da doença

de Parkinson e com menos efeitos colaterais são importantes em curto prazo, mas o

tratamento ideal seria aquele o qual se pudesse aliar a essa terapêutica convencional drogas

que impedissem a progressão da doença, como os neuroprotetores. Essas estratégias

neuroprotetoras estão sendo propostas à medida que o entendimento dos mecanismos

moleculares envolvidos na patogênese da doença de Parkinson está sendo elucidados.

O uso de modelos experimentais para o estudo de doença de Parkinson em animais,

induzidos por neurotoxinas, tem sido crucial para elucidação do entendimento da

fisiopatologia da doença e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Entre

esses modelos, o modelo experimental de doença de Parkinson, induzido por injeção

unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) em roedores (DUTY; JENNER, 2011), tem sido

amplamente utilizado por sua eficácia em mimetizar muitas das alterações neuroquímicas e,

cerca de 60-70%, dos sintomas motores observados em pacientes com este distúrbio

neurodegenerativo (BOVÉ; PERIER, 2012).

O procedimento do referido modelo envolve a administração unilateral da

neurotoxina, 6-OHDA, por injeção intracraniana, utilizando coordenadas estereotáxicas,

direcionadas para o corpo estriado (também chamado de striatum), onde se localizam

neurônios dopaminérgicos. Logo após administrada, a neurotoxina induz um processo

apoptótico seletivo desses neurônios dopaminérgicos através de mecanismos pró-oxidativos e

próinflamatórios (DEXTER; JENNER, 2013), resultando nos achados clínicos da doença de

Parkinson como: desordens motoras, comportamentais e neuroquímicas (BOVÉ; PERIER,

2012). Nesse modelo, os processos de neurodegeneração e de neuroinflamação ocorrem

concomitantemente (MAIA et al., 2012). Em geral, a partir de 6 µg desta neurotoxina injetada

em corpo estriado é o suficiente para promover a apoptose de cerca de 70% de neurônios

dopaminérgicos em 2 semanas (DUTY; JENNER, 2011).

Portanto, o referido modelo tem se mostrado como uma ferramenta bastante eficiente

para testar novas estratégias pré-clínicas preventivas e terapêuticas para a doença de

Parkinson e para estudos de neuroproteção (BROOM et al., 2011).

93

14.5 Polissacarídeos Sulfatados: Moléculas Bioativas com Potencial para Neuroproteção

Ainda hoje, a prática médica e cirúrgica padrão mostram-se com poucos avanços

para a resolução ou tratamento destas desordens neurológicas, e fármacos apropriados ainda

não existem ou são insuficientes para retardar a progressão dessas desordens

neurocomportamentais e neurodegenerativas (SIMONATO et al., 2013).

A neuroproteção pode ser definida como uma intervenção terapêutica para prevenção

ou tratamento dos processos neurodegenerativos e desordens neurocomportamentais relatados

anteriormente (DJALDETTI; LEV; MELAMED, 2003).

Na investigação de novas estratégias neuroprotetoras, as moléculas de elevada massa

molecular, como os polissacarídeos têm sido negligenciados em modelos de desordens

neurológicas e neurodegenerativas por causa de suas estruturas complexas. Entretanto, alguns

estudos têm demonstrado polissacarídeos com potencial atividade neuroprotetora (NANDINI

et al., 2004; YANG et al., 2011; PANGESTUTI; KIM, 2011; GAO et al., 2012; HO et al., 2012).

Os polissacarídeos obtidos de organismos de origem marinha apresentam uma

enorme variedade de estruturas e, por este motivo, são considerados como uma extraordinária

fonte natural de químicos para a prospecção de novos fármacos (SENNI et al., 2011). Entre

esses polissacarídeos, são descritos polissacarídeos constituídos por grupos sulfatados, os

quais têm sido relatados na literatura com diversas aplicações industriais e farmacológicas


Para o sucesso do desenvolvimento de novos fármacos efetivos no tratamento de

processos neurodegenerativos, é crucial a prospecção de novas fontes naturais com este

potencial, assim como a elucidação dos mecanismos de ação envolvidos. Entre as potenciais

fontes de bioprospecção de novos fármacos, as algas têm sido descritas na literatura como um

recurso vegetal e com a presença de moléculas bioativas diversas e atóxicas, como os

polissacarídeos sulfatados mencionados anteriormente, os quais vêm despertando o interesse

científico por apresentarem uma diversa variedade de potenciais implicações farmacológicas


Estudos têm demonstrando que polissacarídeos sulfatados obtidos a partir de algas

marinhas possuem capacidade de modular mediadores inflamatórios (PANGESTUTI; KIM,

2011), propiciar proliferação em células neuronais (LEE et al., 2007) e modular a plasticidade

neural em hipocampo (GAO et al., 2012).

Apesar da variedade de estruturas químicas de polissacarídeos sulfatados obtidos a

partir de macroalgas marinhas, atualmente a literatura ainda carece de informações sobre os

94

efeitos e os mecanismos neuroquímicos e moleculares envolvidos em modelos experimentais

de avaliação neurocomportamental e da aplicabilidade desses bioativos em processos

neurodegenerativos.


Como descrito nos capítulos anteriores, a agarana sulfata obtida da macroalga

marinha vermelha Gracilaria cornea tem sua estrutura química caracterizada por Melo e

colaboradores (2002) e, mais recentemente, os efeitos desse bioativo, em modelos clássicos in

vivo de inflamação e nocicepção, foram descritos na literatura, os quais apresentaram ausência

de toxicidade e atividade anti-inflamatória e antinociceptiva, sendo este último demonstrado

possuir ação tanto central quanto periférica (COURA et al., 2012). Por estes motivos, no

presente Capítulo, testou-se a hipótese de que a agarana sulfatada, da macroalga vermelha

Gracilaria cornea, possui um potencial neurofarmacológico, com atividade neuroprotetora

em ratos submetidos ao modelo de experimental de neurodegeneração induzido por injeção

unilateral de 6-hidroxidopamina.

95

15 OBJETIVOS

15.1 Geral

O Objetivo do presente Capítulo foi avaliar as potenciais implicações

neurofarmacológicas do uso da agarana sulfatada, da alga marinha G. cornea (AS-Gc), contra

alterações locomotores, neuroquímicas e transcricionais induzidas por 6-OHDA, em modelo

de doença de Parkinson em ratos, e identificar possíveis mecanismos de ação envolvidos.

15.2 Específicos

- Analisar a segurança farmacológica da administração de AS-Gc pela via intracraniana, em

corpo estriado, de ratos, através da determinação de possíveis alterações sistêmicas;

- Avaliar os efeitos de AS-Gc na atividade locomotora de ratos submetidos ao modelo de PD

induzido por 6-OHDA;

- Determinar os efeitos de AS-Gc em alterações neuroquímicas (níveis de nitrito/nitrato,

peroxidação lipídica, glutationa reduzida e monoaminas) em ratos submetidos ao modelo de

PD induzido por 6-OHDA;

- Otimizar as condições relacionados aos processo de armazenamento de tecidos e de extração

e isolamanto de RNA total de corpo estriado de ratos;

- Analisar o uso da expressão dos genes Gliceraldeído 3-fosfodesidrogenase (GAPDH), β-

Actina e α-Tubulina como genes de controle endógeno para normalização de dados de qPCR

em estudo de modelo experimental de Doença de Parkinson induzido por injeção unilateral de

6-OHDA em corpo estriado de ratos tratados com AS-Gc;

- Investigar os efeitos de AS-Gc sobre os níveis dos RNAm do fator neurotrófico derivado do

cérebro (BDNF), proteína p65, interleucina 1 β (IL1β) e óxido nítrico sintase induzida

(iNOS), respectivamente, envolvidos no processo neurodegenerativo induzido pela

neurotoxina em corpo estriado de ratos através de qPCR;

96

- Analisar possíveis efeitos de AS-Gc em mitocôndrias submetidas a indutores pró-oxidantes

in vitro;

- Determinar a potencial ação redutora de AS-Gc in vitro.

97



Assim como descrito no tópico 4.1 do capítulo I.


Assim como descrito no tópico 4.3 (Método I - CCP) do capítulo I.

16.3 Animais

Neste capítulo do presente estudo, foram utilizados ratos machos Wistar (Rattus

novergicus albinus), com peso variando entre 250-350 g, todos provenientes do Biotério

Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC. Os animais foram mantidos

em caixas de prolipropileno com no máximo 6 animais, em condições de biotério com

temperatura média de 24 ± 1°C em ciclos de alternância claro/escuro de 12 horas, recebendo

ração padrão e água a vontade.


Com relação aos aspectos éticos, os protocolos experimentais foram elaborados de

acordo com o “Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório” da Sociedade Brasileira

de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL), o qual foi devidamente aprovado pela

Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA, da Universidade Federal do Ceará – Campus

de Fortaleza, sob o número 45/13 (ANEXO II). Todos os esforços foram feitos para

minimizar o número e o sofrimento dos animais utilizados.

98


Para maiores informações, no presente Capítulo, as concentrações e vias utilizadas de

AS-Gc, em todos os ensaios in vivo e in vitro, foram pré-determinadas de acordo com

informações obtidas por Ong e colaboradores (2003), com algumas adaptações, a qual

realizou administração, via intracraniana, de 10 µg de um polissacarídeo sulfatado comercial,

do tipo carragenana, isolado de algas marinhas vermelhas. Assim, para se avaliar alterações

locomotoras e neuroquímicas, tomando como partida uma concentração similar a descrita

pelo referido autor (carragenana, 10 µg), optou-se por utilizar 15, 30 e 60 µg de AS-Gc. Para

as outras drogas utilizadas no presente estudo, baseou-se com recomendações descritas na

literatura, as quais estão devidamente descritas em cada seção metodológica deste capítulo.

16.6 Investigação dos Efeitos Neuroprotetores da Agarana Sulfatada (AS-Gc) em Ratos

Antes dos ensaios comportamentais, os animais foram colocados em ambiente

fechado, desprovido de barulho externo, com a temperatura constante (24 ± 1º C) e, em alguns

casos, sob uma iluminação de baixa intensidade e de cor avermelhada (lâmpada vermelha de

15 W), a qual não é perceptível pelos animais utilizados no presente estudo, de modo que se

adaptassem com o ambiente do experimento a ser realizado. Após as observações durante um

modelo comportamental, com exceção, apenas, do nado forçado e do teste de Suspensão por

Cauda, utilizou-se álcool 30% para remoção de resíduos e odores do animal.

16.6.1 Indução do Modelo de Doença de Parkinson através de injeção unilateral de 6-

OHDA em ratos

Os animais foram divididos aleatoriamente em oito grupos, com o n = 10 animais por

grupo (Tabela 6). Posteriormente, os animais foram anestesiados com cetamina (100 mg/Kg;

i.p.) e xilasina (10 mg/Kg; i.p.), após anestesiado, foi verificado se o animal apresentava

qualquer reflexo doloroso. A cabeça do animal foi fixada no aparelho estereotáxico

(INSIGHT), através de duas barras de fixação inseridas nos meatos auditivos externos do

animal e os dentes incisivos fixados em uma barra de sustentação (Figura 25).

99

Logo após a fixação do animal, foi feita uma tricotomia e assepsia da região superior

da cabeça (álcool 70%). Após a incisão da pele, foi feita e remoção do periósteo e exposto o

bregma. Após, foram determinadas as coordenadas estereotáxicas (em milímetros), segundo o

atlas de Paxinos e Watson (1986), para a realização de 3 orifícios: 1º: L: −2,5; AP: +0,5; V:

+5,0; 2º: L:−3,0; AP: −0,5; V: +6,0; e 3º: L: −3,7; AP: −0,9; V: +6,5; todos em relação ao

bregma, como descrito por Araújo e colaboradores (2013). Em seguida, com uma seringa de

Hamilton de 5 µL, os animais receberam três injeções intraestriatais (intracraniana, em corpo

estriado) como descritas na Tabela 6.

Tabela 6 – Protocolo de Tratamento Experimental do Modelo de Doença de Parkinson


GRUPOS

Experimentais

AS-Gc

(µg/ animal)

6-OHDA

(µg/ animal)

Via de

administração

Número de animais

por grupo (n)

1- Sham (Salina; 0,9 %) - - Intraestriatal 10

2- 6-OHDA - 20 Intraestriatal 10

3- AS-Gc 60 + 6-OHDA 60 20 Intraestriatal 10



6- AS-Gc 60 60 - Intraestriatal 10



100

Figura 25 - Ilustração do Modelo de Doença de Parkinson induzido por injeção unilateral de

6-hidroxidopamina (6-OHDA)


101

16.6.2 Teste do Campo Aberto (Open Field test)

Como descrito no tópico 10.6.2, do Capítulo II desta Tese, este teste, é baseado na

metodologia descrita por Sielgel (1946) e validada por Archer (1973), é utilizado para analisar

a atividade exploratória do animal. No 14º dia, os animais foram submetidos ao campo aberto

(Figura 26) para avaliação dos seguintes parâmetros comportamentais: número de linhas

cruzadas (atividade locomotora horizontal), rearing (levanta-se - atividade locomotora

vertical), tempo parado e, adicionalmente, o grooming (auto-limpeza) (SIELGEL, 1946;

ARCHER, 1973).

Figura 26 - Teste do Campo Aberto (Open Fild test)

Fonte: Arquivo Pessoal do Autor. Legenda: Ilustração do aparato utilizado.

102

16.6.3 Teste do Rota-Rod

O teste do Rota-rod mesura o efeito do relaxamento muscular ou desordem da

coordenação motora ocasionada pela ação de drogas em animais (CARLINI; BURGOS,

1979).

Inicialmente, os animais foram submetidos a um treinamento para devida adaptação no

equipamento no 7º, 13º e 14º dias após a cirurgia, com rotações inicial e final de 5 e 10 RPM,

respectivamente. Decorridos 1 hora, os animais foram reavaliados no equipamento, com

rotações inicial e final de 10 e 14 RPM, respectivamente. Os parâmetros analisados foram:

Tempo de Latência (segundos), Velocidade da primeira queda, Número de quedas e Tempo

de Permanência na barra giratória (DUNHAM; MIYA, 1957 com adaptações) (Figura 27).

Figura 27 - Teste de Rota-Rod

Fonte: Arquivo Pessoal do Autor. Legenda: Ilustração do equipamento utilizado.

103

16.6.4 Teste Rotacional induzido por Apomorfina

O comportamento rotacional, induzido por apomorfina, representa o principal teste

de validação do processo neurodegenerativo dopaminérgico no modelo de DP, apenas no caso

de lesão unilateral por 6-OHDA. O teste reflete a hipersensibilidade do animal a dopamina

(escassa) no lado lesionado, ocasionado pela administração intraperitoneal de apomorfina, um

agonista dopaminérgico. A apomorfina induz a um aumento temporário da atividade

locomotora no lado contralateral a lesão, promovendo uma rotação do animal no sentido para

o mesmo lado e, portanto, possibilitando uma quantificação comportamental do nível da lesão

(HEFTI et al., 1980; GREALISH et al., 2010). Para o referido teste, os animais foram

submetidos ao teste Rotacional no 14° dia, após a lesão com 6-OHDA. O comportamento

rotacional foi determinado através do monitoramento das rotações induzidas pela apomorfina

(3 mg/kg, i.p.), que induz um comportamento rotacional na direção contrária à lesão (lado

contralateral) e o número de rotações completas em volta do próprio eixo foi mensurado a

cada 10 min, durante um período total de 60 minutos (KIM et al, 1998) (Figura 28).

Figura 28 - Teste rotacional induzido por apomorfina

Fonte: Frota (2015). Legenda: Ilustração do teste Rotacional induzido por apomorfina (3 mg/Kg, i.p.) utilizado

para confirmar processo neurodegenerativo em ratos submetidos ao modelo de DP induzido por injeção

unilateral de 6-OHDA.

104

16.6.5 Teste da Cruz Elevada (Plus Maze test)

Como descrito no tópico 10.6.4, do Capítulo II desta Tese, o teste da Cruz Elevada é

utilizado para mensurar atividade ansiolítica (LISTER, 1987). No 14º dia, os ratos foram

analisados no referido teste por um período de 5 min. Os parâmetros analisados foram:

percentagem do número de entradas e do tempo de permanência nos braços abertos (PEBA e

TPBA, respectivamente) e fechados (PEBF e TBPF, respectivamente).

16.6.6 Análise de Variação Ponderal

Para se avaliar possíveis alterações sistêmicas, realizou-se uma da análise da curva

ponderal. Para isso, a massa corpórea dos animais foi medida (g) diariamente, desde o tempo

zero (antes da cirurgia estereotáxica), até o 14º dia após a indução do modelo de DP. Os

valores encontrados foram expressos como variação (∆) de massa corpórea (g), em relação à

massa inicial.

16.6.7 Análise da Atividade Renal (Micção)

No 13º dia, os animais foram relocados e mantidos em gaiolas metabólicas (Figura

29), sem comida, mas com água ad libitum, para análise de possíveis alterações renais, através

da quantidade total de urina (µL) excretada durante um período de 12 horas (20 h/ pm – 8 h/

am).

16.6.8 Dissecação de Áreas Cerebrais

Após a realização dos testes neurocomportamentais, os animais foram devidamente

eutanasiados por decapitação e, logo em seguida, os encéfalos foram retirados rapidamente e

colocados superfície de alumínio resfriada com gelo. Em seguida, os corpos estriados

(ipsilateral e contralateral), o córtex pré-frontal e o hipocampo foram isolados das estruturas

circunjacentes por divulsionamento com auxílio de uma pinça e tesoura cirúrgica de

microdissecação. Após a dissecação, cada área foi colocada em papel de alumínio, sob gelo,

seu peso úmido mensurado e, em seguida, armazenada a -20 °C para análises posteriores.

105

Figura 29 - Gaiola Metabólica para Ratos

Fonte: Insight, com adaptações. Legenda: Ilustração de equipamento utilizado para análise da Atividade Renal.

106

16.6.9 Determinação da Concentração de Nitrito (NO2) / Nitrato (NO3)

O óxido nítrico possui papeis essenciais na vida de mamíferos, participando de

múltiplas funções fisiológicas e patológicas (MONCADA; PALMER, 1991; SCHMIDT;

WALTER, 1994). Alterações nos níveis de óxido nítrico podem causar estresse nitrosativo, o

qual pode levar a danos em proteínas e no DNA, injúrias celulares e apoptose

(HAUSLADEN; STAMLER, 1999; MURPHY, 1999).

A reação de Griess foi primeiramente descrita em 1879, a qual e descrita assim: em

condições ácidas o nitrito reage com a sulfonilamida formando um composto intermediário, o

sal diazônico. Em seguida este sal reage com o N-naftil-etilenodiamina (NEED) formando um

azo estável de coloração púrpura (Figura 30), com o pico de absorbância em 540 nm

(GREEN; TANNEMBAUN; GOLDMAN, 1981).

Figura 30 - Ilustração da Reação de Griess

Fonte: Ramos et al (2006), com adaptações.

Inicialmente, para a determinação da produção de Nitrito/Nitrato, primeiramente foi

preparado uma curva padrão. Para isso, foram pesados 6,9 mg de NaNO2 e dissolvidos em 10

mL de água destilada. Em seguida foram feitas as diluições em série (10 e 20x), ficando 1

mM, 100 µM, 10 µM, 5 µM, 2,5 µM, 1,25 µM, 0,625 µM, 0,312 µM. Realizou-se uma

equação da reta para o cálculo das concentrações do teste (GREEN; TANNEMBAUN;

GOLDMAN, 1981). Para a determinação da concentração de nitrito em cada tecido, foram

107

preparados homogenatos das áreas cerebrais a 10% (w/v) em solução de fosfato de potássio

150 mM, pH 7,4, após centrifugação (11000 g/15 min/4°C), os sobrenadantes foram coletados

e a produção de óxido nítrico (NO) determinada através da reação de Griess. Uma alíquota de

100 μL do sobrenadante foi incubada com 100 μL do reagente de Griess [sulfanilamida 1 %

em H3PO4 1 %/N-(-1-naphthyl)-ethylenediamine 0,1 %/ H3PO4 1 % / diluído em água

(1:1:1:1)] a temperatura ambiente por 10 minutos. A absorbância foi medida em

espectrofotômetro a 540 nm. A concentração de nitrito (μM) foi determinada a partir de uma

curva padrão de NaNO2. Os resultados foram expressos em µM/mg de tecido.

16.6.10 Determinação dos Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS)

Em estudos clínicos, a atividade oxidativa pode ser um fator determinante para o

aparecimento de muitas patologias, como câncer, doenças cardiovasculares, diabetes e

distúrbios psiquiátricos, como esquizofrenia, demência e depressão, bem como para doenças

neurodegenerativas, como doença de Alzheimer e Parkinson (TSALUCHIDU et al., 2008;

ADLY, 2010; LINHART et al., 2014). Nesse contexto, biomarcadores para o estresse

oxidativo são utéis. Entre estes biomarcadores, pode-se citar o malondialdeído (MDA), um

bioproduto da oxidação lipídica, e o qual pode ser quantificado através do teste de

determinação das concentrações de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS),

conforme o método de Draper e Hadley (1990). O teste basea-se na reação do ácido

tiobarbitúrico com os produtos de decomposição dos hidroperóxidos (Figura 31).

Figura 31 - Ilustração da reação entre ácido tiobarbitúrico com os produtos de decomposição

dos hidroperóxidos

Fonte: Eagle Biosciences.

108

O grau de lipoperoxidação em corpo estriado de ratos foi medido através do ensaio

de TBARS, conforme descrito por Draper e Hadley (1990). Para isso, foram preparados

homogenatos da área cerebral a 10% em solução fosfato de potássio 150 mM, pH 7,4. Um

volume de 0,25 mL do homogeneizado foi mantido em banho maria a 37 °C por 1 hora,

seguido por precipitação com 400 µL de ácido perclórico (35%). Após centrifugação (14000

g/15 mim/4°C), o sobrenadante foi transferido e, a ele, adicionado 200 µL de solução de ácido

tiobarbitúrico (1,2%). Após banho de água fervente (95-100 °C/30 min), o conteúdo de

TBARS foi determinado em espectrofotômetro a 532 nm. Os resultados foram expressos em

micromol de MDA por mg de tecido.

16.6.11 Determinação dos Níveis de Glutationa Reduzida (GSH)

A glutationa é o maior agente antioxidante produzido por células animais, e o qual

pode ser encontrado em sua forma oxidada (GSSG) ou reduzida (GSH) (SCHOLZ et al.,

1989; POMPELLA et al., 2003).

A determinação da concentração da GSH basea-se na reação do reagente de Ellman,

o 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), com o tiol livre, originando um dissulfeto

misto mais o ácido 2-nitro-5-tiobenzóico (Figura 32). A medida do produto de reação

formado foi feita por leitura da absorbância a 412 nm. Os resultados da concentração da

glutationa reduzida foram expressos em nanograma de GSH / g de tecido, conforme descrito

por Sedlak e Lindsay (1968).

Figura 32 - Ilustração da reação entre a glutationa reduzida e DTNB (reagente de Ellman)

para a determinação de hidroperóxidos empregando a enzima glutationa reduzida

Fonte: Rover Junior et al (2001).

109

Para a determinação da concentração de GSH, foi construída uma curva padrão a

partir da solução padrão de GSH (1 mg/mL), a qual foi preparada em triplicata de soluções a

6,25; 12,5; 25; 50 e 100 μg/mL. O branco foi feito com água destilada (4 mL) e a cada tudo

das soluções de GSH foi acrescentado 4 mL de tampão Tris HCl 0,4M (pH 8,9). Para a

determinação da equação da curva padrão de GSH, foi adicionado ainda a cada tubo 0,1 mL

de DTNB (0,01 M) e, logo após, feita a leitura da absorbância a 412 nm.

Preparou-se o homogenato a 10% em EDTA 0,02 M, em seguida foi retirado 400 μL

desse homogenato e adicionado 320 μL de água destilada e mais 80 μL de ácido

tricloroacético a 50%. O material foi agitado e centrifugado (3000 g/15 min/4 °C). Em

seguida foi recolhido 400 μL do sobrenadante e acrescido 800 μL de tampão Tris-HCl 0,4 M,

pH 8,9 e mais 20 μL de DTNB 0,01 M. Após 1 minuto da reação foi feita a leitura da

coloração em 412 nm, através de um espectrofotômetro. A concentração da glutationa

reduzida foi expressa em nanograma de GSH por grama de tecido.

16.6.12 Determinação dos níveis de Monoaminas

A determinação de alterações pela técnica de HPLC nos níveis de neurotransmissores

do tipo monoaminas, principalmente a dopamina (DA), em corpo estriado e substância nigra

pars compacta em pacientes com DP, bem como animais submetidos a modelos

experimentais de DP, são considerados como importantes biomarcadores do processo

neurodegenerativo nessa patologia (YANG; BEAL, 2011).

Inicialmente, corpo estriado ipsilateral coletado dos animais foi homogeneizado em

solução de ácido perclórico (10 %), seguido por centrifugação a (14000 x g/ 15 min/ 4ºC) e

filtragem por membrana milipore. Para a determinação dos níveis de monoaminas e seus

respectivos metabólitos secundários, como: norepinefrina (NE); dopamina DA, ácido 3,4-

hidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA); e Serotonina (5-HT) e ácido

hidroxiindoleacético (5-HIAA); utilizou-se uma coluna CLC-ODS(M) com comprimento de

25 cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3 m (Shimadzu, Japão). A fase móvel

utilizada foi composta por tampão de ácido cítrico (0,163 M, pH 3,0), contendo ácido

octanosulfônico sódico (SOS) (0,69 M), como reagente formador do par iônico; acetonitrila

(4% v/v) e tetrahidrofurano (1,7% v/v). Os níveis de DA, DOPAC, HVA e 5-HT foram

eletronicamente detectados através de um detector amperométrico (Modelo L-ECD-6A da

110

Shimadzu, Japão) pela oxidação em um eletrodo de carbono vítreo fixado em 0,85 V, relativo

a um eletrodo de referência de Ag-AgCl.

16.7 Análises Preliminares de parâmetros de Armazenamento e Extração de RNA total

de Corpo Estriado de Ratos

Para avaliar a melhor condição de armazenamento de corpo estriado de ratos para o

processo de extração de RNA total, testaram-se os seguintes parâmetros: em Trizol®, à -196

ºC (nitrogênio líquido) (Amostras 1, 2 e 3); em Trizol® à -20 ºC (Amostra 4); e à -20 ºC por

48 h (Amostra 5), respectivamente. Para determinar a melhor condição de extração de RNA

total, utilizaram-se diferentes volumes a serem transferidos para o processo de isolamento por

lavagem com isopropanol. Para isso, utilizaram-se apenas as amostras 1, 2 e 3, armazenadas

em Trizol®, à -196 ºC (nitrogênio líquido), as quais, após maceração, adição de clorofórmio e

centrifugação, foram retirados os seguintes volumes da fase superior: (Amostra 1) 100 μL;

(Amostra 2) 200 μL; e (Amostra 3) 300 μL, respectivamente. Os demais parâmetros utilizados

seguiram-se de acordo com o método guanidino-isotiocianato-fenol-clorofórmio

(CHOMCZYNSKI; SACCHI, 1987). A quantificação do RNA total das referidas amostras foi

avaliada por espectrofotometria, e a qualidade foi observada em gel de agarose a 1%, corado

com brometo de etídio (10 mg/ml).

16.8 Extração de RNA total, Síntese de cDNA e Análise da Expressão Relativa por

qPCR

16.8.1 Extração do RNA total

O RNA total foi extraído de corpo estriado (ipsilateral) dos ratos utilizando TRIzol®

(Life Tecnhologies/Invitrogen), seguindo as orientações do fabricante baseado no método de

isolamento de RNA num único passo desenvolvido por Chomczynski e Sacchi (1987). Para

isso, a referida área cerebral foi colocada em homogeneizador manual na presença de 1 mL do

reagente TRIzol®. Posteriormente o RNA total foi purificado pelo método guanidino-

isotiocianato-fenol-clorofórmio e, após posterior precipitação com uso de iso-propanol

111

(isopropanol ou 2-propanol) e etanol 75 % (diluído com água tratada com DEPC), o RNA

total foi mantido (– 80 °C) em água ultra pura tratada com DEPC.

16.8.2 Análise Quantitativa e Qualitativa do RNA total

Para testar a eficácia da extração e pureza do RNA total, foi determinada a

concentração de RNA total nas amostras por diluição do RNA (fator de diluição conhecido),

em espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm (A260) e 260/280 nm (A260/A280).

A qualidade do RNA total foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1,2 %, corado

com brometo de etídio (10 mg/mL) e visualizado em um equipamento de luz ultravioleta.

16.8.3 Síntese de cDNA

Para a síntese de cDNA (DNA complementar) foi utilizado por reação 1 µg de RNA

total, 0,3 µg do primer oligo (dT) (Invitrogen), 1 µL de dNTPs Mix 10 mM (Invitrogen) e

água mili-q estéril, que, após misturadas, foram aquecidas a 65 °C por 5 min e depois

resfriados em gelo. Posteriormente, foi adicionado 1 µL da Superscript III reverse transcript

10000 U (Invitrogen) (200U), 2 µL de DTT 0,1 M, 4 µL de Fist-Strind Buffer 5X

(Invitrogen), e a mistura foi incubada no termociclador a 25 °C por 5 min, 50 °C por 60 min,

sendo depois aquecido a 70 °C por 15 min e posteriormente armazenado a -20 °C.

16.8.4 Construção dos oligonucleotídeos (primers)

Os primers foram desenhados, com exceção do BDNF, com base em dados obtidos

do Gene Bank (NCBI), sob junções éxon-éxon, e submetidos à análise através do programa

PrimerBlast (ROSEN; SKALETSKY, 2000), com especificidade somente para RNAm de

Rattus novergicus. Todos foram sintetizados pela Invitrogen (Tabela 7).

112

Tabela 7 - Descrição dos oligonucleotídeos (primers) utilizados na reação de qPCR

Fonte: He et al. (2013), Autor e NCBI. Legenda: Nd: não definido pelo autor.

Nome Sigla Sequência Número de Acesso /

Fonte

Tamanho do

amplicon

Junção

exon/exon

Fator Neurotrófico

Derivado do Cérebro

BDNF F 5’- AggCACTggAACTCgCAATg -3’

R 5’- AAgggCCCgAACATACgATT -3’

HE et al., 2013 nd nd

Subunidade do

complexo de NFkB

p65 F 5’- AgCCCCATTAAgTACCACCg -3’

R 5’- ATCgCAgTCTCTgTCTAgCg -3’

AJ00242.4 / NCBI 114 -

Óxido nítrico sintase

induzida

iNOS F 5’- gACTgTTTCCTTTCACAgCCC -3’

R 5’- AgggATTCTggAACATTCTgTg -3’

XM_003750865.1 /

NCBI

133 96/97

(reverse)

Interleucina 1 beta IL1β R 5’- CCCTgCAgCTggAgAgTgTgg -3’

F 5’- TgTgCTCTgCTTgAgAggTgCT -3’

NM_031512.2 / NCBI 153 653/654

(foward)

Beta actina β-Act F 5’- CCACACCCGCCACCAGTTCG-3’

R 5’- GCGAAGCCGGCCTTGCACAT-3’

NM_031144.2 / NCBI 87 75/76

(foward)

Alfa tubulina α-Tub F 5’- GCCCGTGGCCACTACACCAT -3’

R 5’- CCGTGCACTGGTCAGCCAGC -3’

NM_022298.1 / NCBI 82 441/442

(reverse)

Gliceraldeído-3-

fosfodesidrogenase

GAPDH F 5’- GGGGGCTCTCTGCTCCTCCC -3’

R 5’- CGGCCAAATCCGTTCACACCG -3’

NM_017008.3 / NCBI 108 99/100

(reverse)

113

16.8.5 PCR quantitativa em tempo real (qPCR)

As análises quantitativas da expressão dos genes foram realizadas através de PCR em

Tempo Real (qPCR). Para tanto, 0,1 µg do cDNA de cada amostra foi utilizado na reação de

qPCR. Além dos ácidos nucléicos, a reação foi composta de iniciadores específicos (300 nm

cada) e 10 µL de 2X Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), com volume final

de 20 µL. A reação de amplificação foi realizada no termociclador Mastercycler® ep

realplex4 (Eppendorf) consistindo de desnaturação inicial de 95 °C/10 min seguido de 40

ciclos térmicos de 95 °C por 15 s, 55 °C por 15 s e 60 °C por 20 s. Para análise de prováveis

contaminantes foi realizada detecção da presença de produtos (amplicons) inespecíficos por

análise da curva de Melting, constando de temperatura inicial de 55 °C/15 s, seguido por

gradiente de 20 min e temperatura final de 95 °C/15 s. Para as análises da expressão dos

genes, a amplificação das sequências alvos foram detectadas em tempo real pela emissão de

fluoróforos, a qual foi captada pela unidade óptica do aparelho. As análises dos dados de

fluorescência obtidos foram realizadas pelo Realplex Software 2.2 ®. Todas as reações, tanto

dos genes alvo quanto dos controles endógenos, foram realizadas em triplicatas. Os Cycle

threshold – Ct, utilizados para a normalização de dados e para as análises, foram a média

aritmética entre as triplicatas dos genes alvo e controles endógenos. A obtenção da expressão

relativa foi realizada pelo método descrito por Livak e Schmittgen (2001), adaptada por

Esteves e colaboradores (2013). Para a normalização, foi utilizada a equação ΔCt = Ct (gene

alvo) – Ct (controle endógeno). A calibração foi determinada pela fórmula: ΔΔCt = ΔCt

(amostra) – ΔCt (calibrador). A quantificação relativa (valores arbitrários – ESTEVES et al.,

2013) foi obtida pela fórmula 2 – (ΔΔCt)

(LIVAK; SCMITTGEN, 2001, adaptada por

ESTEVES et al., 2013). Utilizou-se o grupo Salina como calibrador. A expressão dos genes

constitutivos GAPDH, β-Actina e α-Tubulina foram utilizados para a normalização dos

referidos dados.

114

16.9 Análise de Atividade Antioxidante in vitro

16.9.1 Ensaio de Atividade Antioxidante em Mitocôndrias Submetidas a Estresses

Oxidativos

Alterações na integridade estrutural e no metabolismo eletroquímico mitocondrial

ocorrem como resultado de diversos estados patológicos, como isquemia e exposição a

toxinas, e podem iniciar processos apoptóticos, resultado na morte celular (MANELLA;

PARSONS, 1977; HERTSENS; JACOB, 1987; ZOROV et al., 2000; JUHASZOVA et al.,

2004; AON et al., 2006). Entre estas alterações, podem-se citar o inchamento, alterações no

potencial de membrana e a produção de ROS mitocondriais.

- Isolamento de Fração Mitocondrial

O isolamento mitocondrial foi realizado como descrito por Schinzel e colaboradores

(2005). Inicialmente, cérebros frescos de ratos foram homogeneizados em tampão de lise

gelado contendo Mannitol (200 mM), HEPES (80 mM; pH 7.4) e coquetel inibidor de

protease. Posteriormente, os homogenatos foram centrifugados (750 rpm/ 10 min/ 4ºC) e o

sobrenadante transferido e submetido a centrifugação (8.000 rpm/ 20 min/ 4ºC). Os péletes

foram lavados 3 vezes, ressuspensos no mesmo tampão de lise descrito anteriormente e

submetidos a ultracentrifugação (100.000 rpm/ 1 h/ 4ºC). A concentração proteica da solução

com mitocôndrias isoladas foi determinada utilizando o método de Lowry.

- Inchamento Mitocondrial.

O inchamento mitocondrial foi estimado através de mudanças no espalhamento

de luz devido à captação de K+. Sabe-se que a entrada de K+ na mitocôndria é

acompanhada pela entrada de fosfato e água (KOWALTOWSKI et al., 2001). Com isso,

pode-se observar uma diminuição do espalhamento de luz de mitocôndrias em suspensão

e, assim, pode-se avaliar a atividade do mitoKATP através da medida do espalhamento

de luz: quanto maior a diferença de espalhamento de luz, maior será a atividade do

canal. Para isso, acompanha-se o inchamento de mitocôndrias isoladas utilizando um

115

fluorímetro (Thermo Scientific Varioskan FLASH), operando em comprimento de excitação

e emissão de 520 nm, com slit de 2.5 nm, a 37ºC, e sob agitação constante.

Inicialmente, AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) ou 6-OHDA (20 µg) foi adicionado em um

meio de reação com baixa concentração de K+ (KCl 100 mM, succinato 1 M, Hepes 5 mM,

BSA 0,1 mg/ml, EGTA 100 µM, Mg2+

5 mM, fosfato 2 mM, pH 7,4) e oligomicina 1 µg/ml,

em placa de ELISA. Logo em seguida, as mitocôndrias isoladas foram incubadas em meio

reacional contendo AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) ou 6-OHDA (20 µg), à temperatura ambiente.

Após 50 segundos, a placa foi analisada, como descrito anteriormente, através de

espectrofotometria (Thermo Scientific Varioskan FLASH). Utilizaram-se como controles

mitocôndrias isoladas não submetidas ao meio reacional (controle negativo) e submetidas ao

referido meio (controle positivo). O volume em cada poço da placa totalizou um volume

final de 200 µL. Todas as reações foram realizadas em triplicata. Os resultados foram

expressos em porcentagem, em relação ao controle negativo.

- Medidas de Potencial de Membrana Mitocondrial.

Para estimar o potencial de membrana mitocondrial, foi utilizada a safranina, um

cátion lipofílico que se acumula em membranas mitocondriais proporcionalmente ao

potencial de membrana (AKERMAN; WIKSTROM, 1976; FIQUEIRA et al., 2012).

Assim, o acúmulo de safranina promove uma redução na fluorescência da suspensão.

Inicialmente, AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) ou 6-OHDA (20 µg) foi adicionado ao meio

de reação (KCl 150 mM, succinato 1 M, BSA 0,1 mg/mL, EGTA 100 µM, Mg2+

5 mM,

fosfato 2 mM pH 7,4), ATP 1 µM, safranina 5 µM. Logo em seguida, as mitocôndrias

isoladas foram incubadas em meio reacional contendo AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) ou 6-OHDA

(20 µg), à temperatura ambiente. Após 50 segundos, a placa foi analisada em fluorímetro

(Thermo Scientific Varioskan FLASH), utilizando como parâmetros 496 nm de excitação e

586 nm de emissão (KOWALTOWSKI et al., 2002). Utilizaram-se como controles


referido meio (controle positivo). O volume em cada poço da placa totalizou um volume

final de 200 µL. Todas as reações foram realizadas em triplicata. Os resultados foram

expressos em porcentagem, em relação ao grupo controle negativo.

116

- Medida de ROS Mitocondrial.

A quantidade de ROS gerado pela mitocôndria foi medida através da oxidação de

Amplex Red 50 uM (Molecular Probes A12222), em presença de horseradish peroxidase

(HRP 1 U/mL), a um composto fluorescente denominado resorufina (Figura 33)

(MURPHY et al., 2009). Inicialmente, AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) ou 6-OHDA (20 µg) foi

adicionado ao meio de reação (Hepes 5 mM, contendo KCl 150 mM, succinato 5 mM, malato

2 mM, piruvato 2 mM, glutamato 2 mM, BSA 0,1 mg/mL, EGTA 100 µM, Mg2+

5 mM,

fosfato 2 mM e oligomicina 1 µg/mL, pH 7,4). Logo em seguida, as mitocôndrias isoladas

foram incubadas em meio reacional contendo AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) ou 6-OHDA (20 µg),

à temperatura ambiente. As medidas foram feitas utilizando um fluorímetro (Thermo

Scientific Varioskan FLASH) operando em comprimentos de excitação e emissão de 563 e

587 nm, respectivamente, em agitação constante a 37ºC. Utilizaram-se como controles


referido meio (controle positivo). O volume em cada poço da placa totalizou um volume final

de 200 µL. Todas as reações foram realizadas em triplicata. Os resultados foram expressos

em produção de ROS/ mg de proteína.

Figura 33 - Ilustração da reação da oxidação de Amplex Red, em presença de horseradish

peroxidase, para o fluoróforo resorufina.

Fonte: Bio Tek. Com adaptação.

117

16.9.2 Ensaio de Inibição de DPPH

O método é descrito de acordo com Blois (1985), com adaptações. O ensaio

fundamenta-se na propriedade do DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) apresentar uma forte

absorção no espectro visível, comprimento de onda de 517 nm, caracterizado por uma

coloração violácea intensa, devido à presença de elétrons livres. Quando o DPPH é colocado

em presença de substâncias capazes de sequestrar radicais livres (antioxidantes), a absorção é

inibida, resultando em uma descoloração estequiométrica em relação ao número de elétrons

retirados e independente de qualquer atividade enzimática (Figura 34). O grau de

descoloração indica a capacidade sequestradora de radical livre. Para a análise do potencial

antioxidante de AS-Gc, inicialmente, 1 mL do mesmo, nas concentrações de 20-10.000

µg/mL, foi adicionado a 2 mL de solução etanólica de DPPH (100 µM) e, posteriormente

homogeneizado vigorosamente em vórtex e mantido em ambiente escuro. Após 30 min,

realizou-se a leitura em espectrofotômetro (517 nm). Todas as reações foram realizadas em

triplicata. Para a determinação do potencial antioxidante, utilizou-se a seguinte fórmula: (%) =

[(A0-A1)/A0] x 100; onde A0 é absorbância do controle negativo (solução de DPPH +

solvente) e A1 é a absorbância da média obtida da triplicata de cada amostra. O resultado foi

apresentado em % de ação antioxidante e admitiu-se ação antioxidante positiva quando o

resultado for igual ou superior a 50%. Como controle da reação utilizou-se o solvente (salina

0,9%) e como amostra padrão, utilizou-se ácido ascórbico (20-200 µg/mL).

Figura 34 - Ilustração da reação de estabilização do radical livre DPPH

Fonte: Oliveira et al. (2013).

118


Todos os valores numéricos foram apresentados como erro padrão da média (EPM) e

submetidos a análises de diferenças estatísticas através da análise de variância (One-way ou

Two-way ANOVA), seguido pelo teste de Comparações Múltiplas de Bonferroni.

Consideraram-se os valores com P<0,05 como estatisticamente significativos.

Para as análises de qPCR, todos os valores numéricos foram apresentados como erro

padrão da média (EPM) e submetidos a análises de diferenças estatísticas através da análise

de variância (One-way ANOVA), seguido pelo teste de Comparações Múltiplas de

Bonferroni. Consideraram-se os valores com P<0,05 como estatisticamente significativos.

A análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prism, versão 4.0,

(San Diego, CA, EUA). Adicionalmente, todos os experimentos foram realizados por

observadores “cegos”.

119

17 RESULTADOS

17.1 Avaliação da Atividade Locomotora

17.1.1 Teste do Campo Aberto (Open Field test)

No Teste do Campo Aberto, pôde-se observar que ratos submetidos a neurotoxina (6-

OHDA; 20 µg; controle positivo) apresentaram diminuição significativa (P<0,001) da

atividade locomotora, considerando os parâmetros analisados: diminuindo aproximadamente

50% da atividade locomotora horizontal (43,7 ± 4,9 número de linhas cruzadas) e 49% da

vertical (18,8 ± 2,6 rearings); e aumentando o tempo parado em mais de 400% (83,4 ± 15,0

segundos), em relação ao grupo Sham (Salina, 0,9% - controle negativo) (cruzamento: 87,0 ±

6,3; rearings: 36,8 ± 3,0; tempo parado: 16,0 ± 4,9 s, respectivamente) (Figura 35). Por outro

lado, houve uma reversão, de ação dose-dependente, dos danos locomotores induzidos por 6-

OHDA observados em animais tratados com AS-Gc (15 µg: cruzamento: P>0,05; 49,3 ± 4,9;

rearings: P>0,05; 24,2 ± 2,5; tempo parado: P>0,05; 60,2 ± 10,7 s, respectivamente; 30 µg:

cruzamento: P>0,05; 67,8 ± 7,0; rearings: P>0,05; 31,0 ± 4,7; tempo parado: P<0,01; 32,2 ±

6,8 s, respectivamente; e 60 µg: cruzamento: P<0,01; 74,9 ± 5,8; rearings: P<0,001; 35,1 ±

2,6; tempo parado: P<0,001; 18,1 ± 3,9 s, respectivamente). Ratos do grupo 6-OHDA

apresentaram um aumento (P<0,001) do grooming em quase 300% (11,9 ± 1,3 vezes

executados), em relação ao grupo Sham (3,0 ± 1,1). Entretanto, os animais tratados com AS-

Gc (15, 30 e 60 µg) demonstraram um retorno a atividade de grooming normal, também com

tendência de efeito dose-dependente (10,8 ± 2,2; 7,4 ± 2,0; 4,6 ± 0,9 vezes executados), em

relação ao grupo 6-OHDA. Adicionalmente, não houveram alterações significativas na

atividade locomotora e no comportamento de auto-limpeza em animais que receberam

unicamente AS-Gc (15, 30 e 60 µg) via intracraniana (em corpo estriado ipsilateral), em

relação ao grupo Sham, considerando os parâmetros analisados.

120

Figura 35 - Análise da atividade motora no Teste do Campo aberto (Open Field test)

Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 10 por grupo) foram tratados através de injeção intraestriatal, com 6-

OHDA (20 µg) e, 10 minutos após com injeções contendo AS-Gc (15, 30 ou 60 µg), totalizando um volume

final aplicado de 10 µL. Foram utilizados como grupos controles animais tratados somente com AS-Gc (15, 30

ou 60 µg), 6-OHDA (20 µg) ou somente Salina (0,9 %; Sham). Todos os tratamentos foram diluídos em Salina

(0,9%). Após 14 dias, os animais foram submetidos ao teste de Campo Aberto, sendo analisados os seguintes

parâmetros: (A) número de cruzamentos, (B) rearing, (C) Tempo de Imobilidade e (D) grooming. One-way

ANOVA, Bonferroni. ** e *** indicam P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA; e #,

## e ### indicam P<0,05, P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham.

121

17.1.2 Teste do Rota-Rod

Para se examinar mais especificamente distúrbios locomotores no presente estudo,

utilizou-se o teste do Rota-Rod. Contudo, como não foram observadas alterações

significativas nos animais submetidos a injeção intracraniana, unicamente com AS-Gc (15; 30

ou 60 µg), relação ao grupo Sham. Além disso, considerando que AS-Gc na dose de 15 µg

não demonstrou efeitos neuroprotetores significativos, em relação ao grupo 6-OHDA, na

avaliação locomotora no teste do Campo Aberto, estes não foram submetidos ao presente

ensaio.

Para a referida análise locomotora, inicialmente, todos os animais foram submetidos

a um treinamento em 3 períodos diferentes no equipamento, afim de descartar possíveis

efeitos relacionados a ausência de adaptação do animal ao equipamento. Os resultados obtidos

podem ser visualizados na Figura 36. De acordo com os dados, os animais, principalmente do

grupo 6-OHDA, apresentaram algumas dificuldades iniciais, como problema de agarre e

equilíbrio em cima do cilindro, tremor e agitação excessivos, os quais resultavam na

diminuição do tempo (tempo de latência) (Figura 36A) e da velocidade da primeira queda

(Figura 36B), assim como o aumento do número de quedas durante o treinamento (Figura

36C). Entretanto, a partir do 2º dia de treino, os animais apresentaram-se mais adaptados,

principalmente os do grupo Sham, as velocidades utilizadas (inicial: 5 RPM; final: 10 RPM) e

no período realizado (5 min).

Após 1h depois do último treinamento, os animais foram ressubmetidos ao teste do

Rota-Rod, sob velocidade inicial e final de 10 e 14 RPM, respectivamente. Os dados

revelaram que animais submetidos a neurotoxina (6-OHDA) apresentam uma diminuição

significativa (P<0,05) no tempo de latência (70,7 ± 13,3 segundos), em relação ao grupo

Sham (232,7 ± 23,0 s) (Figura 37A). Entretanto, quando tratado com AS-Gc (60 µg), o efeito

induzido pela 6-OHDA foi significativamente revertido (P<0,05; 198,9 ± 40,6 s), em relação

ao grupo não tratado (6-OHDA). Não houveram diferenças significativas nos outros

parâmetros analisados no referido teste (velocidade no momento da queda, número de quedas

e tempo de permanência do animal no equipamento). Entretanto, pôde-se observar a tendência

do grupo 6-OHDA para o aumento do número de quedas (Figura 37C).

122

Figura 36 - Treinamento para o Teste do Rota-Rod





(0,9%). No 7°, 13° e 14° dias, os animais foram treinados em Rota-Rod sob rotação de inicial de 5 RPM e final

de 10 RPM, por 5 minutos. Os parâmetros analisados foram: Tempo de Latência (A), Velocidade da primeira

queda (B), Número de quedas (C) e Tempo de permanência (D). One-way ANOVA, Bonferroni. * P<0,05, em

relação ao grupo 6-OHDA; e # P<0,05, em relação ao grupo Sham.

123

Figura 37 - Teste do Rota-Rod (14º dia)





(0,9%). 14° dia, 30 min após o último treino, os animais foram submetidos ao teste de Rota-Rod sob uma

rotação inicial de 10 RPM e final de 14 RPM, por 5 min. Os parâmetros analisados foram: Tempo de Latência

(A), Velocidade da primeira queda (B), Número de quedas (C) e Tempo de permanência (D). One-way ANOVA,

Bonferroni. * P<0,05, em relação ao grupo 6-OHDA; e # P<0,05, em relação ao grupo Sham.

124

17.2 Teste Rotacional induzido por Apomorfina

Para quantificar a atividade neurodegenerativa induzida pela neurotoxina (6-OHDA),

foi utilizado o teste Rotacional induzido por apomorfina, o qual se quantifica o número de

rotações contralaterais a injeção intracraniana (ipsilateral). Em adição, também foi avaliada

uma possível atividade de neurodegenerativa induzida por AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) pela

referida via utilizada.

Os resultados indicam um processo neurodegenerativo induzido por 6-OHDA (20

µg) em estriado de ratos, os quais apresentaram rotações contralaterais significativamente

elevadas (P<0,001) e, no período de 10 a 50 minutos, respectivamente, após a injeção

intraperitoneal de apomorfina (Figura 38), e totalizando 245,1 ± 53,6 rotações contralaterais,

em relação ao grupo Sham (4,6 ± 2,7 rotações) (Figura 39). Em contrapartida, animais

tratados com AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) foram capazes de reduzir significativamente (P<0,001)

o número de rotações contralaterais em 80,6 %; 86,0 % e 91,4 %, respectivamente, em relação

ao grupo 6-OHDA. Adicionalmente, não houve diferenças, quanto o número de rotações

contralaterais induzidas por apomorfina, entre os animais submetidos a injeção unicamente de

AS-Gc (15; 30 ou 60 µg), em relação ao grupo Sham.

Para se avaliar uma possível diferença temporal no efeito do tratamento com AS-Gc

(60 AS-Gc µg), o mesmo foi aplicado 30 minutos após a injeção de 6-OHDA (20 µg). Os

resultados indicam que o tempo de administração, via intracraniana, de AS-Gc (60 AS-Gc µg;

30 min após 6-OHDA) não apresentou diferença temporal significativa quanto ao número de

rotações contralaterais, em relação ao grupo AS-Gc (60 AS-Gc µg; 10 min após 6-OHDA,

como pode ser observado na Figura 40.

125

Figura 38 - Análise Temporal da Variação Rotacional induzido por Apomorfina

Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 10 por grupo) foram tratados através de injeção intracraniana, em corpo

estriado, com 6-OHDA (20 µg) e, 10 minutos após com injeções contendo AS-Gc (15, 30 ou 60 µg), totalizando

um volume final aplicado de 10 µL. Foram utilizados como grupos controles animais tratados somente com AS-

Gc (15, 30 ou 60 µg), 6-OHDA (20 µg) ou somente Salina (0,9 %; Sham). Todos os tratamentos foram diluídos

em Salina (0,9%). Após 14 dias, os animais foram submetidos ao teste Rotacional induzido por apomorfina (3

mg/kg; i.p.), sendo contabilizados o número de rotações contralaterais a cada 10 min. Two-way ANOVA,

Bonferroni. ## P<0,01 e ### P<0,001, em relação ao grupo Sham.

126

Figura 39 - Teste Rotacional induzido por Apomorfina


OHDA (20 µg) e, 10 minutos após com injeções contendo AS-Gc (15; 30 ou 60 µg), totalizando um volume

final aplicado de 10 µL. Foram utilizados como grupos controles animais tratados somente com AS-Gc (15; 30


(0,9%). Após 14 dias, os animais foram submetidos ao teste Rotacional induzido por apomorfina (3 mg/kg; i.p.),

sendo contabilizados o número total de rotações contralaterais durante 60 min. As percentagens indicam valor

(%) de redução em relação ao grupo 6-OHDA. One-way ANOVA, Bonferroni. *** indica diferença significativa

P<0,001, em relação ao grupo 6-OHDA; e ### indica diferença significativa P<0,001, em relação ao grupo

Sham.

127

Figura 40 - Análise do tempo de tratamento - Teste Rotacional induzido por Apomorfina


OHDA (20 µg) e, 10 minutos após com injeções contendo AS-Gc (30 ou 60 µg) e, 30 min após com, AS-Gc (60

µg), totalizando um volume final aplicado de 10 µL. Como controles, positivo e negativo, respectivamente,

utilizaram-se os grupos 6-OHDA (20 µg) ou somente Salina (0,9 %; Sham). Todos os tratamentos foram diluídos

em Salina (0,9%). Após 14 dias, os animais foram submetidos ao teste Rotacional induzido por apomorfina (3

mg/kg; i.p.), sendo contabilizados o número total de rotações contralaterais durante 60 min. As percentagens

indicam valor (%) de redução em relação ao grupo 6-OHDA. One-way ANOVA, Bonferroni. ** e *** indicam

diferenças P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA; e ### indica diferença

significativa P<0,001, em relação ao grupo Sham. (a) indica similaridade estatística, em relação aos grupos AS-

Gc.

128

17.3 Análise de Efeitos Colaterais Sistêmicos na via de Administração utilizada

Para investigar possíveis efeitos sistêmicos colaterais, induzidos pela neurotoxina (6-

OHDA) e/ou por AS-Gc pela via de administração utilizada, realizaram-se as seguintes

análises: atividade ansiogênica ou ansiolítica, através do teste da Cruz Elevada (Plus Maze

test); determinação de variação ponderal e atividade renal, respectivamente.

17.3.1 Atividade Ansiolítica

Para analisar uma possível atividade ansiolítica em animais parkisionianos, bem

como de AS-Gc pela via administrada, realizou-se o teste da Cruz Elevada. Para o referido

teste, utilizaram-se 30 e 60 µg (10 min após injeção de 6-OHDA) e 60 µg (30 min após

injeção de 6-OHDA), respectivamente, de AS-Gc, pela via intracraniana, em corpo estriado.

Os ratos do grupo 6-OHDA não apresentaram diferenças significativas, em relação

ao grupo Sham (Figura 41). Por outro lado, o grupo DZP (1 mg/kg, i.p.) apresentou um

aumento significativo (P<0,001) nos percentuais do número de entradas (NEBA), e no tempo

de permanência (TPBA), respectivamente, nos braços abertos, assim como uma diminuição

dos percentuais do número de entradas (NEBF) e tempo de permanência (TPBF),

respectivamente, nos braços fechados, quando comparado com ambos os grupos 6-OHDA e

Sham. Animais submetidos ao modelo de doença de Parkinson e tratados com AS-Gc (60 µg,

10 e 30 min após injeção de 6-OHDA) apresentaram uma tendência de ação ansiolítica,

considerando o número de entradas nos braços abertos e fechados, em relação ao grupo DZP.

Entretanto, os mesmos grupos não apresentaram diferenças significativas, em comparação ao

grupo Sham.

129

Figura 41 - Teste da Cruz Elevada (Plus Maze test)


OHDA (20 µg) e, 10 minutos após com injeções contendo AS-Gc (30 ou 60 µg) e, 30 min após com, AS-Gc (60

µg), totalizando um volume final aplicado de 10 µL. Como controles positivo e negativo, respectivamente,

utilizaram-se os grupos Diazepam (DZP 1 mg/Kg; i.p.) ou somente Salina (0,9 %; Sham). Todos os tratamentos

foram diluídos em Salina (0,9%). Após 14 dias, os animais foram submetidos ao teste da Cruz Elevada (Plus

Maze test), para análise de uma possível atividade ansiolítica pela via de administração utilizada. Os animais

foram observados durante 5 min na cruz elevada (plus maze), sendo considerados: o percentual do número de

vezes que o animal entrou nos braços abertos e o seu o tempo de permanência no mesmo (A e B), bem como as

respectivas percentagens de entrada e tempo de permanência nos braços fechados (C e D), respectivamente. Os

dados estão expressos em médias ± EPM. One-way ANOVA, Bonferroni. ### indica diferença P<0,001,

respectivamente, em relação ao grupo Sham. * e *** indicam diferenças P<0,05 e P<0,001, respectivamente, em

relação ao grupo 6-OHDA. Letras iguais (a ou b) indicam similaridade estatística entre os grupos DZP e AS-Gc.

130

17.3.2 Análise Ponderal

Para auxiliar na determinação dos efeitos sistêmicos induzidos pela cirurgia

estereotáxica e pelas alterações dopaminérgicas induzidas pela neurotoxina, respectivamente,

realizou-se uma análise de variação ponderal da massa corpórea dos animais utilizados

durante o período de estudo.

De acordo com a análise dos dados, todos os ratos apresentam uma perda de massa

corpórea entre o 1º e 8º dia após a cirurgia, sendo esta mais acentuada em animais submetidos

ao modelo de doença de Parkinson induzido por 6-OHDA (Figura 42). Entretanto, a partir do

12º dia, foi possível observar diferenças significativas (P<0,01 e P<0,001 e P<0,001,

respectivamente) do grupo 6-OHDA, os quais não foram capazes de ganhar mais do que 17

gramas, em relação ao grupo Sham (aumento normal de massa). Os grupos com 6-OHDA +

AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) ou somente com AS-Gc (60 µg), não apresentaram diferenças

significativas, em relação ao grupo Sham.

17.3.3 Análise de alterações da Atividade Renal

Para se determinar outras possíveis alterações sistêmicas, avaliou-se a atividade

renal. Para este ensaio, os animais foram mantidos em isolamento em gaiolas metabólicas,

sem acesso a alimentos sólidos, para a coleta de urina.

De acordo com resultados apresentados na Figura 43, ratos do grupo 6-OHDA

apresentaram um aumento significativo (P<0,05) da atividade renal (variando de 30 a 280 µL

de urina), em relação ao grupo Sham (variando de 0 a 70 µL de urina). Por outro lado, o grupo

tratado com AS-Gc (60 µg) reverteu significativamente (P<0,05) atividade renal a condições

normais (variando de 0 a 110 µL de urina), em relação ao grupo 6-OHDA.

131

Figura 42 - Análise da variação ponderal

Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 10 por grupo) foram submetidos a injeção intraestriatal, somente de salina

0,9% (SHAM - controle negativo) ou AS-Gc (60 µg) (ambos representados por círculos vazios), ou contendo 6-

OHDA (20 µg) (controle positivo) e, 10 min após, submetidos a injeção de AS-Gc (15; 30 ou 60 µg) (ambos

representados por quadrados). Os animais foram mantidos em condições de biotério e alimento ad libitum, sendo

os mesmos pesados diariamente no mesmo horário. Todas as soluções foram dissolvidas em Salina (0,9%) e

performando o volume final aplicado de 10 µL por animal. Os animais foram mantidos em condições de biotério

e alimento ad libitum, sendo os mesmos pesados diariamente no período da manhã. Two-Way ANOVA,

Bonferroni. *, ** e *** indicam diferenças de P<0,05, P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo

6-OHDA.

132

Figura 43 - Análise de alterações da atividade renal

Fonte: Autor. Legenda: Os ratos (n = 10 por grupo) foram submetidos a injeção intraestriatal somente de salina

0,9% (Sham - controle negativo), ou contendo a neurotoxina 6-OHDA (20 µg) (controle positivo), sendo os

grupos tratados submetidos a injeção de AS-Gc (30 ou 60 µg) decorridos 10 minutos após a injeção de 6-OHDA.

Os animais foram mantidos em condições de biotério e alimento ad libitum. No 13º dia, os animais foram

colocados em gaiolas metabólicas sem acesso a ração. No dia seguinte, após 8 h do isolamento nas gaiolas

metabólicas, a urina excretada durante o período foi coletada e mensurada. One-way ANOVA, Bonferroni. *

indica diferença de P<0,05, em relação ao grupo 6-OHDA. # indica diferença P<0,05, em relação ao grupo Sham.

133

17.6 Análises Neuroquímicas

17.6.1 Determinação da concentração de Nitrito (NO2)/Nitrato (NO3) em áreas cerebrais

A análise neuroquímica das áreas cerebrais revelou que os ratos submetidos a

neurotoxina apresentaram um aumento significativo nos níveis de nitrito/nitrato de mais de

100% no corpo estriado (P<0,001) e de 81% no hipocampo (P<0,05), em relação ao grupo

Sham (Figura 44). Por outro lado, os animais tratados com AS-Gc (15; 30 ou 60 µg)

mostraram uma redução significativa de nitrito/nitrato de aproximadamente 90, 42 e 60 %,

respectivamente, em corpo estriado, e de aproximadamente 76, 62 e 55%, respectivamente,

em hipocampo, em relação ao grupo 6-OHDA. Entretanto, apenas a administração de 60 µg

de AS-Gc foi capaz de retornar a níveis basais os níveis de nitrito/nitrato em todas as áreas

cerebrais dos ratos, quando comparado com o tratamento com 15 e 30 µg, respectivamente, de

AS-Gc. Adicionalmente, o grupo AS-Gc 15 µg demonstrou uma diminuição significativa dos

níveis basais de nitrito/nitrato em todas as áreas analisadas, em relação ao grupo Sham.

17.6.2 Determinação dos Níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) em áreas cerebrais

Para investigar uma possível ação antioxidante, utilizou-se o ensaio de TBARS em

amostras de áreas cerebrais. De acordo com os dados, a neurotoxina (6-OHDA) promoveu um

aumento significativo (P<0,001) dos níveis de malondialdeído (MDA), um dos principais

produtos de processo de peroxidação lipídica, em todas as áreas cerebrais analisadas, em

relação ao grupo Sham (Figura 45), principalmente no corpo estriado ipsilateral (aumentando

mais de 800% os níveis de MDA). Por outro lado, todas as amostras cerebrais coletadas de

animais tratados com AS-Gc (15, 30 e 60 µg) demonstraram uma redução significativa

(P<0,001) dos níveis de peroxidação lipídica, em relação ao grupo 6-OHDA, principalmente

no corpo estriado ipsilateral (de aproximadamente 75, 84 e 90%, respectivamente) e sem

diferenças significativas, em comparação ao grupo Sham.

134

17.6.3 Determinação dos Níveis de Glutationa Reduzida (GSH) em áreas cerebrais

De acordo com a análise de GSH (Figura 46), houve um aumento significativo em

todas as áreas cerebrais do grupo 6-OHDA, em relação as do grupo Sham. Animais tratados

com AS-Gc (15, 30 e 60 µg) promoveram um aumento da atividade antioxidante, via GSH, no

corpo estriado ipsilateral e hipocampo, em relação ao grupo Sham. Entretanto, apenas ratos

tratados com 60 µg de AS-Gc apresentaram um aumento significativo de GSH em todas as

áreas analisadas, em comparação ao grupo 6-OHDA.

Figura 44 - Análise dos níveis de nitrito/nitrato nas áreas cerebrais




Os animais foram mantidos em condições de biotério e alimento ad libitum. Após 14 dias, os animais foram

eutanasiados e o corpo estriado (A) ipsilateral e (B) contralateral, respectivamente, (C) hipocampo e (D) córtex

frontal foram removidos para análise dos níveis de nitrito/nitrato. One-way ANOVA, Bonferroni. *, ** ou ***

135

indicam diferença de P<0,05, P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA; e #,

## e

###

indicam P<0,05, P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham.

Figura 45 - Análise dos níveis de Peroxidação Lipídica (TBARS) nas áreas cerebrais






frontal foram removidos para análise dos níveis de TBARS. One-way ANOVA, Bonferroni. *** indica diferença

de P<0,001, em relação ao grupo 6-OHDA; e ###

indica P<0,001, em relação ao grupo Sham.

136

Figura 46 - Análise dos níveis de Glutationa Reduzida (GSH) nas áreas cerebrais






frontal foram removidos para análise dos níveis de GSH. One-way ANOVA, ANOVA, Bonferroni. *, ** e ***

indicam diferença P<0,05, P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA. #, ##

e ###

indicam

P<0,05, P<0,01 e P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham.

137

17.6.4 Determinação dos níveis de Monoaminas em Corpo Estriado

Devido as maiores alterações neuroquímicas induzidas por 6-OHDA ocorrerem em

neurônios dopaminérgicos na área cerebral a qual é administrada, então, apenas o corpo

estriado foi utilizado para as análises de alterações nos níveis de monoaminas.

De acordo com os dados obtidos, a neurotoxina (6-OHDA) reduziu (P<0,001) os

níveis de dopamina (DA: 36,0 ± 10,3 µM/ mg de tecido) e aumentou (P<0,001) os níveis de

serotonina (5-HT: 113,19 ± 9,3 µM/ mg de tecido), em relação ao grupo Sham (DA: 325,0 ±

45,2 µM/ mg de tecido; 5-HT: 3,1 ± 0,6 µM/ mg de tecido, respectivamente). O grupo 6-

OHDA demonstrou uma tendência em reduzir os níveis dos metabólitos secundários DOPAC

(611,7 ± 62,5 µM/ mg de tecido) e HVA (296,5 ± 50,2 µM/ mg de tecido), respectivamente,

em relação ao grupo Sham (DOPAC: 1590,6 ± 210,3 µM/ mg de tecido; HVA: 484,4 ± 29,1

µM/ mg de tecido, respectivamente). Em contrapartida, animais submetidos a DP e tratados

com AS-Gc apresentaram um aumento significativo de DA (30 µg: 117,9 ± 24,0; 60 µg:

291,3 ± 76,9 µM/ mg de tecido, respectivamente), em relação a animais não-tratados (grupo

6-OHDA). AS-Gc (60 µg) também reduziu (P<0,05) os níveis de 5-HT (85,1 ± 4,5 µM/ mg

de tecido), em relação ao grupo 6-OHDA. Animais dos grupos AS-Gc (30 e 60 µg) não

apresentaram diferenças significativas nos níveis de norepinefrina (NE) (30 µg: 130,3 ± 10,7;

60 µg: 125,4 ± 6,1 µM/ mg de tecido, respectivamente), DOPAC (30 µg: 1317,0 ± 247,4; 60

µg: 1634,2 ± 495,1 µM/ mg de tecido, respectivamente) e HVA (30 µg: 553,3 ± 74,3; 60 µg:

621,9 ± 121,6 µM/ mg de tecido, respectivamente), em relação ao grupo Sham (NE: 109,1 ±

15,7 µM/ mg de tecido; HVA: 484,4 ± 29,1 µM/ mg de tecido, respectivamente).

Adicionalmente, não houve alterações nos níveis de NE no grupo 6-OHDA (127,4 ± 4,5 µM/

mg de tecido), em relação ao grupo Sham, e não foram detectadas presenças do ácido

hidroxiindoleacético (5-HIAA), metabólito secundário da serotonina, em nenhuma das

amostras analisadas (Figura 47).

138

Figura 47 - Análise dos níveis de Monoaminas em Corpo Estriado





eutanasiados e o corpo estriado ipsilateral foi removido para determinação dos níveis de (A) norepinefrina (NE),

(B) dopamina (DA), (C) Serotonina (5-HT) e os metabólitos secundários (D) Ácido 3-4-hidrofenilacético e (E)

Ácido homovanílico (HVA), respectivamente. One-way ANOVA, Bonferroni. * e ** indicam diferença P<0,05 e

P<0,01, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA. # e

### indicam P<0,05 e P<0,001, respectivamente, em

relação ao grupo Sham.

139

17.7 Análises Transcricionais

17.7.1 Análises Preliminares de parâmetros de Armazenamento e Extração de RNA

total de Corpo Estriado de Ratos

Para analisar possíveis alterações na qualidade e concentração do RNA total isolado

a partir de corpo estriado (striatum) de ratos, verificaram-se variáveis relacionadas a

temperatura e a presença do reagente Trizol nas amostras, durante o período de

armazenamento, e volume da fase superior transferido inicialmente antes da etapa de

precipitação com isopropanol, durante o processo de isolamento.

Os resultados obtidos por espectrofotometria e eletroforese revelaram diferenças da

concentração do RNA total entre as amostras, sugerindo que a concentração destas moléculas

está relacionada com o volume da fase superior transferido durante o processo de isolamento

(Tabela 8 e Figura 48). Análise da qualidade pela relação ab260/280 nm revelou que as

amostras 1 (transferência de 100 µL) e 5 (transferência de 300 µL) apresentaram menores

índices de contaminação proteica (AB > 1,7), quando comparadas com as outras amostras

(AB < 1,7). Apesar disso, a literatura indica que a presença de fenol (contido no Trizol) pode

contribuir para falsos positivos, com relação ab260/280 nm com resultados de AB > 1,7, pois

apresenta pico de absorbância em 270 nm (SAMBROOK; RUSSEL, 2001). Todos os RNA’s

analisados não apresentaram sinais de degradação (pela presença das bandas ribossomais 28 e

18 S) e também ausência de DNA genômico (Figura 48). Adicionalmente, a presença do

reagente Trizol, assim como as temperaturas analisadas, durante o período de armazenamento,

não apresentaram interferências nos parâmetros e condições analisados no RNA total das

amostras. Desta forma, apesar das metodologias aplicadas para as amostras 1 e 5

apresentarem-se adequadas para a obtenção de RNA total da referida amostra, todas as

análises posteriores foram padronizadas considerando o método de armazenamento e extração

empregados somente para a amostra 1.

140

Tabela 8 - Análise quantitativa do RNA total isolado de corpo estriado (striatum).

AMOSTRA CONCENTRAÇÃO

(μg/mL)

260/280

(nm)

1 210 2,234

2 192 1,433

3 368 1,484

4 380 1,638

5 652 1,801

Fonte: Laboratório de Genética Molecular – NUBIS/Sobral. Legenda: Foram testadas duas variáveis: Forma de

armazenamento da amostra e quantidade da fase superior transferida. Para isso, as amostras foram separadas em

1 (armazenamento com Trizol® e em nitrogênio líquido e coleta de 100 μL da fase superior), 2 (armazenamento

com Trizol® em nitrogênio líquido e coleta de 200 μL da fase superior), 3 (armazenamento com Trizol® em

nitrogênio líquido e coleta de 300 μL da fase superior), 4 (armazenamento com Trizol® a -20ºC/48 h e coleta de

200 μL da fase superior) e 5 (armazenamento sem Trizol® a -20ºC/48h e coleta de 200 μL da fase superior). As

amostras de RNA total isoladas foram ressuspensas em 50 μL água tratada com DEPC e, em seguida,

quantificadas por espectrofotometria.

141

Figura 48 - Eletroforese do RNA total isolado de corpo estriado de ratos

Fonte: Laboratório de Genética Molecular – NUBIS/Sobral. Legenda: As amostras foram separadas em 1

(armazenamento com Trizol® e em nitrogênio líquido e coleta de 100 μL da fase superior), 2 (armazenamento

com Trizol® em nitrogênio líquido e coleta de 200 μL da fase superior), 3 (armazenamento com Trizol® em

nitrogênio líquido e coleta de 300 μL da fase superior), 4 (armazenamento com Trizol® a -20ºC/48 h e coleta de

200 μL da fase superior) e 5 (armazenamento sem Trizol® a -20ºC/48h e coleta de 200 μL da fase superior). As

amostras de RNA total isoladas foram ressuspensas em 50 μL água tratada com DEPC e, em seguida, analisadas

por eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio (10 mg/mL).

142

17.7.2 Análise do RNA Total Isolado de Corpo Estriado de Ratos Submetidos ao Modelo

de DP Induzido por 6-OHDA

Os RNA’s isolados de todas as amostras apresentaram-se com qualidade, quando

analisados por espectrofotometria (ab260/280 nm; AB > 1,7) (Tabela 9) e por eletroforese

(dados não mostrados).

17.7.3 Análises dos Genes de Controle Endógeno (Housekeepings) nas Condições de

Estudo Utilizadas

Antes da normalização dos dados da expressão gênica, obtidos por PCR em tempo

real, inicialmente, avaliaram-se possíveis alterações na expressão nos genes de controle

endógeno (housekeeping) utilizados no presente estudo (GAPDH, α-Tubulina e β- Actina).

Os dados obtidos, considerando a expressão basal de cada gene analisado em

cyclothreshold (CT), mostram ausência de diferenças significativas na expressão dos genes de

controle endógeno analisados entre os grupos 6-OHDA (GAPDH: 24,9 ± 1,3; α-Tubulina:

26,3 ± 1,8; β- Actina: 29,9 ± 2,1), 6-OHDA + AS-Gc (60 µg) (GAPDH: 25,8 ± 0,9 ; α-

Tubulina: 28,8 ± 1,5; β- Actina: 30,6 ± 2,0) e Sham (GAPDH: 25,7 ± 2,0 ; α-Tubulina: 29,9 ±

1,7; β- Actina: 32,2 ± 3,0) (Figura 49). Desta forma, os referidos genes de controle endógeno

analisados mostram-se eficientes como normalizadores fisiológicos, uma vez que não

apresentaram alterações significantes decorrentes das administrações farmacológicas

utilizadas (6-OHDA ou AS-Gc), em relação a animais Sham.

143

Tabela 9 - Quantificação do RNA total

Grupo/amostra Concentração (µg/µL) AB 260/280

SHAM 1 268 1,839

SHAM 2 412 1,807

SHAM 3 414 1,935

SHAM 4 290 1,795

SHAM 5 282 1,8

SHAM 6 116 1,987

SHAM 7 306 2,04

SHAM 8 350 1,804

SHAM 9 544 1,93

SHAM 10 316 1,872

6-OHDA 1 350 1,804

6-OHDA 2 1188 1,947

6-OHDA 3 424 1,981

6-OHDA 4 518 1,75

6-OHDA 5 692 1,774

6-OHDA 6 788 1,894

6-OHDA 7 470 1,822

6-OHDA 8 462 1,724

6-OHDA 9 683 1,822

6-OHDA 10 487 1,799

AS-Gc 60 1 270 1,786

AS-Gc 60 2 320 1,988

AS-Gc 60 3 305 1,825

AS-Gc 60 4 333 1,847

AS-Gc 60 5 263 1,741

AS-Gc 60 6 235 1,989

AS-Gc 60 7 243 1,71

AS-Gc 60 8 318 1,868

AS-Gc 60 9 315 1,797

AS-Gc 60 10 291 1,85

Fonte: Laboratório de Genética Molecular – NUBIS/Sobral.

144

Figura 49 - Análise da expressão de RNA mensageiro dos genes de controle endógeno

Fonte: Autor. Legenda: Os animais foram sujeitos ao modelo experimental de doença de Parkinson induzido

por 6-OHDA e/ou a injeção com AS-Gc (60 µg, intraestriatal). Após eutanásia, corpo estriado (ipsilateral) foi

removido e armazenado em nitrogênio líquido (-196 °C). Os RNA’s totais foram extraídos e purificados para a

síntese de cDNA, seguido pela reação de qPCR. Posteriormente, a análise da expressão dos genes (A) GAPDH,

(B) α-Tubulina e (C) β-Actina foi realizada utilizando valores de CT obtidos. One-way ANOVA, Bonferroni.

145

17.7.4 Avaliação da Especificidade dos Oligonucleotídeos (primers) utilizados através da

Análise da Melting Curve

No presente estudo, as análises da melting curve indicaram a ausência de

amplificações inespecíficas em todas os produtos amplificados (amplicons), após a reação de

qPCR, demonstrando especificidade de todos os oligonucleotídeos (primers) utilizados no

experimento (Gráfico 1).

17.7.5 Análise da Expressão Relativa dos Genes BDNF, p65, iNOS e IL1β por qPCR

De acordo com os resultados da análise de expressão relativa de genes realizados por

qPCR, em corpo estriado ipsilateral de ratos, e após normalização dos dados de CT com seus

respectivos genes de controle endógeno (GAPDH, α-Tubulina e β- Actina), observou-se uma

diminuição significativa (P<0,05) dos níveis de RNAm de BDNF (0,6 ± 0,1 vezes) e um

aumento nos níveis de RNAm de p65 (P<0,01; 2,3 ± 0,2 vezes), iNOS (P<0,001; 4,5 ± 0,4

vezes) e IL1β (P<0,05; 1,9 ± 0,2 vezes), no grupo 6-OHDA, em relação ao grupo Sham

(BNDF: 1,2 ± 0,1; p65 1,0 ± 0,0; iNOS 0,9 ± 0,1; IL1β 1,0 ± 0,0 vezes, respectivamente)

(Figura 50). Por outro lado, animais submetidos ao modelo de DP por 6-OHDA e tratados

com AS-Gc (60 µg) apresentaram um retorno dos níveis destes genes analisados ao níveis

basais, não apresentando alterações significativas em relação ao grupo Sham, e aumentando

(P<0,05) os níveis de RNAm de BDNF (1,8 ± 0,2 vezes) e diminuindo os níveis do RNAm de

p65 (P<0,01; 1,3 ± 0,1 vezes), iNOS (P<0,001; 0,8 ± 0,1 vezes) e IL1β (P<0,01; 0,4 ± 0,1

vezes), respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA.

146

Gráfico 1 - Melting curve

Fonte: Autor, Realplex (Eppendorf). Legenda: Imagem ilustrativa dos resultados obtidos da melting curve após

a reação de amplificação por qPCR.

147

Figura 50 - Análise do perfil de expressão do RNAm de BDNF, p65, iNOS e IL1β em corpo

estriado (ipsilateral)

Fonte: Autor. Legenda: Os animais foram sujeitos ao modelo experimental de doença de Parkinson induzido

por 6-OHDA e tratamento com AS-Gc 60 µg. Após eutanásia, o corpo estriado (ipsilateral) foi removido e

armazenado a -196 °C. Em seguida, foram extraídos os RNA’s totais destas amostras e estes utilizados na síntese

de cDNA, seguida pela reação de qPCR e análise da expressão dos genes (A) BDNF, (B) p65, (C) iNOS e (D)

IL1β pelo método 2-ΔΔCt

. Os genes foram normalizados através do uso de genes de controle endógeno: GAPDH,

β-Actina e α-Tubulina. One-way ANOVA, Bonferroni. *, ** e *** indicam diferenças P<0,05; P<0,01 e

P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo 6-OHDA. #,

## e

### indicam diferenças P<0,05; P<0,01 e

P<0,001, respectivamente, em relação ao grupo Sham.

148

17.8 Análise da Atividade Antioxidante in vitro

17.8.1 Ensaio de Atividade Antioxidante em Mitocôndrias Submetidas a Estresses

Oxidativos

Como o mecanismo de ação neurodegenerativo de 6-OHDA está envolvido com

alterações estruturais e eletroquímicas na mitocôndria, investigou-se os possíveis efeitos de

AS-Gc contra danos oxidativos induzidos em mitocôndrias isoladas de cérebros de ratos. Os

resultados obtidos revelam alterações mitocondriais similares induzidas pela neurotoxina, em

relação aos indutores oxidativos utilizados (KCL e Amplex Red), os quais provocaram

aumentos significativos (P<0,001) no inchamento (6-OHDA: 103,1 ± 3,5 %; KCl: 100,6 ± 3,6

%) (Figura 51A), potencial de membrana (6-OHDA: 210,4 ± 2,4 %; KCl: 205,8 ± 1,4 %)

(Figura 51B) e produção de ROS (6-OHDA: 1,9 ± 0,1 ROS/mg de proteínas; KCl: 1,9 ± 0,1

ROS/mg de proteínas) (Figura 51C), em relação a mitocôndrias não submetidas ao referido

estresse oxidativo (controle: 3,1 ± 0,6 %; 102,3 ± 2,3 %; 0,1 ± 0,0 ROS/mg de proteínas,

respectivamente). Por outro lado, mitocôndrias submetidas ao referido estresse oxidativo e

pré-tratadas com AS-Gc (30 ou 60 µg) promoveram uma ação dose-dependente contra danos

mitocondriais induzidos pelos indutores oxidativos (KCL e Amplex Red), diminuindo

significativamente todos os parâmetros analisados (AS-Gc 30: 79,6 ± 3,7 %; 159,9 ± 6,1 %;

1,3 ± 0,1 ROS/mg de proteínas; AS-Gc 60: 63,1 ± 4,3 %; 138,2 ± 3,0 %; 0,8 ± 0,1 ROS/mg

de proteínas, respectivamente) (Figura 51).

17.8.2 Ensaio de Inibição de DPPH

Para se avaliar um possível efeito redutor de AS-Gc, utilizou-se o ensaio de inibição

de DPPH, o qual se considera uma molécula antioxidante quando esta apresenta a capacidade

de inibir (sequestrar radicais livres de) DPPH em, pelo menos, 50 %. O screening de

concentrações de AS-Gc (20-10.000 µg/mL: 0-48 %) não apresentou efeito antioxidante no

referido ensaio, quando comparado com Ácido Ascórbico (20-200 µg/mL: 86-93 % de

inibição de DPPH) (Figura 52). Entretanto, pôde-se observar uma tendência de ação

antioxidante entre as concentrações de 200 e 625 µg/mL (AS-Gc 312 µg/mL: 48 % de

inibição de DPPH).

149

Figura 51 - Efeitos de AS-Gc contra Mitocondriais induzidos por Indutores Oxidativos

Fonte: Autor. Legenda: Alterações estruturais e eletroquímicas induzidas pelos indutores oxidativos KCl ou

Amplex Red + HRP, respectivamente, em mitocôndrias foram avaliados. Os parâmetros analisados foram (A)

Inchamento, (B) Potencial de Membrana e (C) Produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS). Utilizou-se 6-

OHDA e mitocôndrias não tratadas com AS-Gc como controles positivos. Mitocôndrias não submetidas aos

indutores oxidativos foram utilizadas como controle negativo. One-way ANOVA, Bonferroni. ###

indica

diferença P<0,001, em relação ao grupo Controle negativo. Letras iguais indicam similaridade estatística.

150

Figura 52 - Atividade antioxidante – Ensaio de Inibição de DPPH

Fonte: Autor. Legenda: O método é descrito de acordo com Blois (1985), com adaptações. A reação foi

realizada com DPPH (100 µM) diluído em etanol e lido após 30 min à 517 nm. (%) = [(A0-A1) / A0] x 100;

onde A0 é absorbância do controle negativo (solução de DPPH + solvente) e A1 é a absorbância da média obtida

da triplicata de cada amostra. O resultado é expresso em % de ação antioxidante e admite-se ação antioxidante

positiva quando o resultado for superior a 50 %.

151

18 DISCUSSÃO

O presente estudo descreve, pela primeira vez, os efeitos de uma agarana sulfatada

associados a proteção contra alterações locomotoras, neuroquímicas e transcricionais em

animais submetidos a um modelo de doença de Parkinson, bem como a análise de possíveis

mecanismos de ação envolvidos em ensaios in vivo e in vitro.

Visto a associação entre mecanismos neuroinflamatórios e neurodegenerativos, o

qual foi discutido no tópico introdutório do presente capítulo (FRANK-CANNON et al.,

2009; GUEDES; da SILVA, 2010; JARVELA et al., 2011; SEKIYAMA et al., 2012), pode-se

hipotetizar que drogas ou bioativos com ação anti-inflamatória são alvos em potencial para a

elaboração de novas estratégias farmacológicas em tratamentos contra DP (MULLER;

MUNICH, 2011; COLLINS et al., 2012). Por este motivo, o presente estudo buscou

investigar os efeitos de um polissacarídeo sulfatado, da agarana, já descrito como sendo

portador de atividade anti-inflamatória (COURA et al., 2012), em modelo animal de DP

induzido pela neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) em ratos.

Entre os principais problemas da DP, pode-se citar os distúrbios locomotores

induzidos pelas alterações neuroquímicas decorrentes da morte de neurônios dopaminérgicos.

No modelo de DP, induzido por 6-OHDA, pôde-se observar alguns dos principais

achados descritos na literatura desta neurotoxina em ratos, como uma diminuição da atividade

locomotora e alterações no ganho normal de peso (Figuras 38 e 45), além de alterações

neuroquímicas características do modelo, como aumento dos níveis de nitrito/nitrato e de

processos oxidativos (Figuras 47 e 48), bem como alterações nos níveis de monoaminas em

áreas cerebrais de ratos (Figura 47) (BJORKLUND et al., 2010; CHOTIBUT et al., 2012;

ARAÚJO et al., 2013; JING et al., 2014). De acordo com a literatura, o referido modelo tem

sido amplamente utilizado por sua excelência na reprodução de achados encontrados em

pacientes com DP, principalmente em relação aos efeitos neuroquímicos (DUTY; JENNER,

2011; BOVÉ; PERIER, 2012).

O mecanismo de ação desta neurotoxina (6-OHDA) envolve um processo apoptótico

seletivo de neurônios dopaminérgicos através de vias pró-oxidativas e próinflamatórias

(DEXTER; JENNER, 2013), resultando nos achados clínicos da doença de Parkinson, como:

desordens motoras, comportamentais e neuroquímicas (BOVÉ; PERIER, 2012). No referido

modelo, os processos de neurodegeneração e de neuroinflamação ocorrem concomitantemente

(MAIA et al., 2012).

152

Pela presença de mecanismos próinflamatórios envolvidos na via neuroapoptótica de

6-OHDA, estudos têm analisados agentes anti-inflamatórios em modelos utilizando esta

neurotoxina, os quais têm demonstrado resultados positivos contra a ação de 6-OHDA em

roedores (COLLINS et al., 2012). Com isso, pode-se sugerir que a investigação de bioativos

com atividade anti-inflamatória poderiam auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias

neurofarmacológicas contra processos neurodegenerativos e suas respectivas implicações

neurocomportamentais e neuroquímicas.

Entre os bioativos descritos na literatura com atividade anti-inflamatória, podemos

citar os polissacarídeos obtidos de organismos de origem marinha, os quais apresentam uma

enorme variedade de estruturas e, por este motivo, são considerados como uma extraordinária

fonte natural de químicos para a prospecção de novos fármacos (SENNI et al., 2011; JIAO,

2011; PATEL, 2012). Entre esses polissacarídeos, são descritos polissacarídeos constituídos

por grupos sulfatados, os quais têm sido relatados na literatura com diversas aplicações

industriais e farmacológicas (JIAO et al., 2011).

Nandini e colaboradores (2004) relataram que polissacarídeos sulfatados, extraídos

de notocorda de peixe, modulam positivamente a produção de fatores de crescimento em

cultura de células de hipocampo de rato, como BDNF, fator neurotrófico derivado de glia

(GDNF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e fatores de crescimento de

fibroblasto (FGF). De acordo com os autores, as interações entre os polissacarídeos sulfatados

e esses fatores de crescimento neurotróficos sugerem a possibilidade de implicações in vivo

no desenvolvimento de agentes terapêuticos para o tratamento de doenças neuronais e injúrias

cerebrais.

A partir de então, a literatura tem demonstrado que vários tipos de polissacarídeos

compostos por grupos sulfatados, de origem animal e vegetal, com efeitos neuroprotetores,

como: proliferação de células neurais (LEE et al., 2007; ZHANG et al., 2010; SHENG et al.,

2011); antineurotóxicidade (SATO et al., 2008; LUO et al., 2009; PANGESTUTI; KIM,

2011; GAO et al., 2012); antioxidante (YANG et al., 2011; PANGESTUTI; KIM, 2011); e

anti-neuroinflamatório, através da modulação de mediadores inflamatórios, como óxido

nítrico (NO) (LEE et al., 2007), ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e, consequentemente, da

prostaglandina E2 (PGE2), bem como da citocina fator de necrose tumoral alfa (TNFα), e das

interleucinas IL-6 e IL1β (PANGESTUTI; KIM, 2011).

Contudo, estas macromoléculas têm sido negligenciadas em modelos de desordens

neurológicas e neurodegenerativas por causa de suas estruturas complexas e, portanto, ainda

são escassos na literatura os estudos dos efeitos de polissacarídeos sulfatados de algas

153

marinhas no SNC. Visto isso, o presente estudo investigou o potencial neuroprotetor de uma

agarana sulfatada, isolada da macroalga marinha vermelha G. cornea (AS-Gc), em modelo de

DP em ratos induzido por 6-OHDA.

De acordo com Ali e Rajini (2011), pacientes com DP apresentam, em comum, as

desordens neurodegenerativas do movimento características da perda de neurônios

dopaminérgicos, seguida pela diminuição dos níveis de dopamina. De acordo com os

resultados, AS-Gc promoveu uma proteção contra alterações locomotoras típicas de um

animal afligido pela neurotoxina (6-OHDA) (Figura 35) e, em alguns casos, retornando a

atividades normais. Estas alterações comportamentais, características em um animal com

parkinsonismo, estão, assim como em humanos, relacionadas a diminuição de neurônios

dopaminérgicos, provocados pela atividade neurodegenerativa induzida pela neurotoxina

(BOVÉ; PERIER, 2012). Este fato pode ser observado no comportamento rotacional induzido

por apomorfina, o qual representa o principal teste de verificação do processo

neurodegenerativo dopaminérgico no modelo de DP induzido por injeção unilateral de 6-

OHDA, por refletir a hipersensibilidade por dopamina do lado lesionado e, no caso do

agonista dopaminérgico apomorfina, induzir a uma rotação no sentido contralateral a lesão

(HEFTI et al., 1980; GREALISH et al., 2010) (Figura 39). Corroborando com estes achados

comportamentais observados no teste rotacional, a análise dos níveis de monoaminas

revelaram um retorno a condições basais em animais tratados com AS-Gc, em relação a não-

tratados, assim como uma diminuição dos níveis de serotonina (Figura 47). Adicionalmente,

esta modulação dopaminérgica e serotonérgica corrobora com os achados

neurocomportamentais descritos no Capítulo II desta Tese, os quais descrevem um aumento

da atividade exploratória induzida por AS-Gc, por administração oral ou subcutânea,

possivelmente relacionada a modulação desses neurotransmissores em camundongos.

Entretanto, não foram analisadas alterações nos produtos dessas vias metabólicas em animais

tratados com AS-Gc e não submetidos a neurotoxina.

Apesar da exata patogênese da doença de Parkinson ainda permanecer desconhecida,

sabe-se do envolvimento de processos oxidativos no desenvolvimento desta patologia

(JENNER, 2003; HWANG, 2013). Entre os mecanismos de pró-apoptóticos de 6-OHDA,

encontram-se o estresse nitrosativo e oxidativo, os quais envolvem o aumento dos níveis de

nitrito/nitrato (NO2/NO3) e peroxidação lipídica em áreas cerebrais de roedores (ATTA;

SINHA; CHATTOPADHYAY, 2000; GILGUN-SHERKI; MELAMED; OFFEN, 2001;

DAUAER; PRZEDBORSKI, 2003; ARAÚJO et al., 2013). No presente estudo, AS-Gc

apresentou uma ação antioxidante contra 6-OHDA in vivo, reduzindo os níveis aumentados de

154

NO2/NO3 e peroxidação lipídica a condições normais (Figuras 47 e 48) e, possivelmente,

atuando via indução de glutationa (Figura 46).

De acordo com a literatura, GSH é um potente antioxidante presente por todos os

tecidos em mamíferos como o tiol não-proteico mais abundante, participando da sinalização

REDOX para o controle da peroxidação lipídica, bem como para espécies reativas de

oxigênio e nitrogênio, e atuando também na regulação da proliferação celular, apoptose,

função imune e fibrogênese (SCHOLZ et al., 1989; YANG et al., 2002; XU et al., 2002; LU,

2013). Os resultados indicam que animais submetidos ao modelo de DP, induzido por 6-

OHDA, apresentam um aumento do estresse oxidativo e nitrosativo, e também de GSH

(Figura 46). Corroborando com estes achados, Tirmenstein e colaboradores (2005), em

estudos in vitro, observaram o aumento da concentração de glutationa reduzida em cultura de

neuroblastomas humanos (SH-SY5Y) na presença de 6-OHDA (25, 50 e 100 µM), por um

período superior a 24 h, sugerindo uma adaptação celular para autoproteção contra o estresse

oxidativo induzido pela neurotoxina.

Deste modo, pode-se sugerir que AS-Gc possui um mecanismo neuroquímico de

neuroproteção, agindo através da indução da bioprodução de GSH nas áreas cerebrais

analisadas (corpo estriado, hipocampo e córtex pré-frontal) (Figura 46), por consequência,

modulando negativamente a peroxidação lipídica e os níveis de nitrito/nitrato (Figuras 47 e

48). Assim, AS-Gc estaria inibindo a ação pró-oxidante induzida por 6-OHDA, possivelmente

reduzindo apoptose de neurônios dopaminérgicos e, consequentemente, mantendo os níveis

basais de dopamina (Figura 47), e, por fim, reverteria os efeitos observados no teste rotacional

e na atividade locomotora (Figuras 38 e 42).

Para se investigar os efeitos de AS-Gc a nível transcricional, inicialmente,

realizaram-se algumas análises afim de se otimizar os processos de armazenamento e

isolamento de moléculas de RNA total das amostras teciduais com maior qualidade. A partir

destas avaliações, pôde-se determinar algumas condições para melhorar o armazenamento e

isolamento do RNA total a partir de corpo estriado de ratos (Figura 48).

De acordo com Conway e colaboradores (2014), a otimização de métodos para o

isolamento de RNA, especialmente quando se utiliza pequenas quantidades de amostras de

material para análises transcricionais, garantir a integridade dos resultados pode aumentar

potencialmente a compreensão e elucidação dos mecanismos envolvidos em uma determinada

patologia. Estes tipos de análises são comumente relatados na literatura para diversos tipos

diferentes de estudos e para diferentes finalidades (CHAI et al., 2005; ABRAMOVITZ et al.,

2008; LAN et al., 2009; SPORNRAFT et al., 2014; DASTGHEIB et al., 2014). Assim, as

155

informações obtidas no presente estudo indicam fatores que otimizam a obtenção de

moléculas de RNA com integridade e pureza de corpo estriado de ratos, fornecendo maior

veracidade nos resultados obtidos e que poderão contribuir para a realização de pesquisas

posteriores que possuam como o tecido-alvo de estudo o corpo estriado.

Para os ensaios de expressão de genes por qPCR, os dados demonstraram que os

genes de controle endógeno utilizados (GAPDH, β-Actina e α-Tubulina) não apresentaram

alterações entre os grupos analisados (Sham, 6-OHDA e AS-Gc) (Figura 49), sugerindo-os

como normalizadores eficientes para as condições analisadas.

A análise de genes do tipo housekeeping, como candidatos a genes de controle

endógeno é importante para a biologia molecular, pois estes genes compõem uma parte

experimental importante para a obtenção dos dados de expressão de genes, que é a

normalização e remoção de alterações fisiológicas, que poderiam levar a resultados falsos

(GALIVETI et al., 2010; EISENBERG; LEVANON, 2014). Entretanto, é sempre importante

verificar possíveis alterações nesses genes de controle endógeno, pois, dependendo do tecido

ou condição a ser estudado, inclusive em condições patológicas, pode ocorrer alterações

significativas em sua expressão, que fazem esses genes deixarem de ser genes de controle

endógeno (TURABELIDZE; GUO; DIPIETRO, 2010; THORREZ et al., 2011; LIU et al.,

2015). Estas análises de genes de candidatos a controles endógenos são comumente relatadas

em diferentes estudos da literatura, inclusive para a doença de Parkinson (KHIMANI et al.,

2005; BAMIAS et al., 2013; LIN et al., 2014; DUPASQUIER et al., 20014; SERAFIN et al.,

2014).

Apesar da literatura relatar o uso de alguns genes como normalizadores em

experimentos de análise de expressão gênica, os resultados obtidos no presente estudo são os

primeiros relatos sobre a validação preliminar de genes de controle endógeno no modelo de

DP induzido por 6-OHDA e para polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas. Desta

forma, este estudo auxilia na indicação dos genes de controle endógeno, GAPDH, β-Actina e

α-Tubulina, para investigações moleculares por qPCR em modelo de DP induzido por 6-

OHDA em corpo estriado de ratos, bem como para análises de polissacarídeos sulfatados.

Ainda na análise de genes por qPCR neste estudo, pôde-se observar alterações nos

genes-alvo analisados (BDNF, p65, iNOS e IL1β) induzidas por 6-OHDA, em relação ao

grupo Sham (Figura 50). Estes resultados corroboram com dados da literatura, que indicam

que 6-OHDA promove uma redução de fatores de neuroproteção, como o BDNF, e induz vias

neuroinflamatórias, como a p65, iNOS e IL1β em neurônios durante processos de

156

neurodegeneração (SEKIYAMA et al., 2012; MAIA et al., 2012; DEXTER; JENNER, 2013,

ZHANG et al., 2013; LI et al., 2013; GAO et al., 2014).

De acordo com a literatura, p65, é uma das principais proteínas constituinte do fator

de transcrição NFKB (Nuclear fator kappa B), e está relacionado com a etiopatologia da

doença de Parkinson, atuando como um ativador de NFKB, proporcionando sua translocação

para o núcleo (FLOOD et al., 2011; PRANSKI et al., 2013). Entre os resultados dessa

translocação de NFKB para o núcleo via p65, está uma modulação negativa de fatores

neurotróficos (CAO et al., 2013), corroborando para a diminuição na expressão do gene

BDNF observada neste estudo por qPCR, e um aumento da expressão de genes pró-

inflamatórios, como iNOS e IL1β (McADAM et al., 2012; DATTA DE et al., 2013).

A iNOS (forma induzida da enzima óxido nítrico sintase) está envolvida na via de

produção de óxido nítrico (NO), sendo este um importante regulador de processos biológicos

em concentrações basais, como antiplaquetário, anti-inflamatório e antioxidante (AKTAN,

2004). Entretanto, na doença de Parkinson, os níveis de iNOS e, consequentemente, NO se

encontram elevados, promovendo danos mitocondriais e teciduais, e reduzindo a ação de

antioxidantes naturalmente produzidos no organismo (DURRENBERGER et al., 2012;

ARAÚJO et al., 2013). Li e colaboradores (2012) relatam que 6-OHDA é capaz de induzir o

aumento de iNOS em modelos in vivo e in vitro, sugerindo, assim, que a via iNOS/NO possui

um papel importante no mecanismo neurodegenerativo desta neurotoxina.

Assim como a iNOS, a IL1β é regulada positivamente por NFKB e que o aumento

dos níveis transcricionais deste gene está relacionado com uma atividade neuroinflamatória

associada com a patogênese de doenças neurodegenerativas como Parkinson e Alzheimer

(FRANK-CANNON et al., 2009; GUEDES et al., 2010; LEAL et al., 2013; CIFUENTES;

MURILLO-ROJAS, 2014). Em modelos experimentais de indução de processos

neurodegenerativos, o aumento dos níveis de IL1β tem sido descrito por estar envolvido com

alterações comportamentais, redução da atividade locomotora e diminuição do processo de

neurogênese (KUBERA et al., 2011; JARVELA et al., 2011).

Em contrapartida, quando ratos submetidos a neurotoxina foram tratados com AS-Gc

(60 µg), pôde-se observar um retorno dos níveis destes genes (BDNF, p65, iNOS e IL1β) a

condições basais (Figura 50). Desta forma, mantendo a homeostase do mecanismo

transcricional e proteção contra os efeitos deletérios de 6-OHDA em corpo estriado.

Estudos relatam que fatores neurotróficos, como BDNF, podem atuar na

neuroproteção, auxiliando no tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença de

Parkinson (SCALZO et al., 2010; ATHAUDA; FOLTYNIE, 2015). Em modelos in vivo,

157

utilizando em ratos, ou in vitro, é sugerido que o aumento dos níveis de BDNF age como um

biomarcador de ação neuroprotetora (SHULTS et al., 1995; SINGH et al., 2006; ZHANG et

al., 2012; TUON et al., 2014). Esta modulação de BDNF por AS-Gc corrobora com dados da

literatura que descrevem a atividade de polissacarídeos sulfatados isolados de algas atuando

como indutores de proliferação de células neuronais e também moduladores da plasticidade

neural, sendo estas funções biológicas relacionadas com o BDNF (LEE et al., 2007; GAO et

al., 2012; CORVINO et al., 2012). Entretanto, este é o primeiro relato de uma agarana

sulfatada atuando como agente modulador da via transcricional de BDNF.

Outro ponto de regulação apresentado por AS-Gc, contra alterações induzidas por 6-

OHDA, foi a diminuição dos níveis dos genes envolvidos com o processo neuroinflamatório

(p65, iNOS e IL1β) (Figura 50). É descrito na literatura a ação anti-inflamatória de diversos

polissacarídeos sulfatados isolados de macroalgas marinhas, sendo estes reportados inclusive

como potenciais bioativos para terapias de doenças neurodegenerativas (pardas, verdes e

vermelhas) (PANGESTUTI; KIM, 2011; PATEL, 2012; BARBOSA; VALENTÃO;

ANDRADE, 2014). Entre estes polissacarídeos com atividade anti-inflamatória, pode-se citar

a AS-Gc (COURA et al., 2012). Apesar do exposto, não existem descrições de efeitos de

polissacarídeos sulfatados, do tipo agarana, em modelos de neurodegeneração in vivo. Deste

modo, o presente estudo relata, pela primeira vez na literatura, um efeito neuroprotetor de um

polissacarídeo sulfatado, do tipo agarana, em modelo de DP em ratos.

Em resumo, os dados de qPCR obtidos neste estudo indicam que AS-Gc possui uma

ação neuroprotetora contra alterações transcricionais induzidas pela neurotoxina 6-OHDA,

através de uma atividade anti-neuroinflamatória. Assim, o presente estudo sugere uma

possível implicação de AS-Gc no tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença

de Parkinson.

Apesar das alterações locomotoras, neuroquímicas e transcricionais demonstradas

anteriormente, o principal e, possivelmente, o primeiro alvo da neurotoxina, 6-OHDA, é a

mitocôndria (XIE; BEZARD; ZHAO, 2005). A 6-OHDA penetra no neurônio dopaminérgico

pelo transportador de dopamina, por mimetismo molecular, ocasionando distúrbios

eletroquímicos nas membranas mitocondriais, como o aumento do potencial de membrana

(Figura 51B) e da produção de ROS (Figura 51C), podendo ocorrer concomitantemente, em

algumas vezes, alterações na estrutura da organela, como inchaço o mitocondrial (Figura

51A) pela abertura de poros (XIE; BEZARD; ZHAO, 2005; GALINDO et al., 2012; WANG

et al., 2013). Após o início deste processo citotóxico, resulta-se na diminuição da produção de

energia (ATP) para a célula, fissão mitocondrial e/ou mitofagia, bem como em ativação de

158

cascatas intracelulares envolvidas na apoptose celular (GOMEZ-LÁZARO et al., 2008;

TÓBON-VELASCO et al., 2013). Por este motivo, investigou-se os efeitos de AS-Gc em

mitocôndrias isoladas de cérebros de ratos, estas submetidas a um ambiente e condições de

estresse oxidativo.

Os dados mostram uma diminuição das alterações estruturais e eletroquímicas

analisadas (inchamento, potencial de membrana e produção de ROS, respectivamente) (Figura

51), sugerindo um efeito protetor de AS-Gc contra danos mitocondriais induzidos por estresse

oxidativo. Desta maneira, o presente estudo sugere que AS-Gc estaria apresentando uma

atividade neuroprotetora através da proteção mitocondrial, regulando alterações estruturais e

eletroquímicas na organela, induzidas por ROS, auxiliando assim na manutenção celular e,

consequentemente, na sua sobrevivência.

Até o momento, os presentes resultados descritos, sugerem uma atividade

neuroprotetora de AS-Gc, atuando através de efeitos antioxidantes, dentre os quais podem-se

citar a modulação dos níveis de NO2/NO3 e peroxidação lipídica, possivelmente via GSH in

vivo, e protegendo mitocôndrias contra alterações induzidas por ROS in vitro. Entretanto, os

efeitos observados não indicam o potencial redutor do polissacarídeo.

Na literatura, vários estudos relatam polissacarídeos sulfatados de algas marinhas

com propriedades redutoras (PATEL, 2012). Entre estes estudos, Souza e colaboradores

(2012) descrevem potencial de redução, na presença de radicais livres, in vitro de

polissacarídeo sulfatado isolado de uma alga marinha vermelha, de mesmo gênero que a

utilizada neste estudo, a Gracilaria birdiae. Assim, o presente estudo buscou avaliar também

uma possível capacidade de redutora in vitro de AS-Gc.

Em desacordo com os dados descritos por Souza e colaboradores (2012), os

resultados obtidos no presente estudo indicam que AS-Gc não apresenta propriedade redutora

contra o radical DPPH, nas condições experimentais utilizadas. Desta maneira, pode-se

sugerir que, possivelmente, apesar das duas espécies serem do mesmo gênero e apresentarem

polissacarídeos sulfatados, ambas do tipo agarana, com estrutura e constituição relativamente

semelhantes (MELO et al., 2002; SOUZA et al., 2012), estas moléculas apresentam-se com

propriedades físico-químicas diferenciadas, resultando em atividades nem sempre

semelhantes. Por este motivo, cada polissacarídeo sulfatado, mesmo de espécies próximas,

apresentam-se com diversas bioatividades e características bioquímicas distintas (JIAO, 2011;

PATEL, 2012).

Mesmo AS-Gc não apresentando propriedade redutora no ensaio de DPPH, analisou-

se possíveis alterações dos resultados obtidos quanto a uma possível interação da neurotoxina

159

(6-OHDA) com o referido polissacarídeo. A avaliação foi feita através de ensaios

comportamentais em animais que foram submetidos a um aumento relativo do tempo em que

a administração de AS-Gc ocorria, esta após a injeção da neurotoxina. Corroborando com os

resultados anteriores, AS-Gc (60 µg), aplicado em tempos diferentes, em relação a injeção de

6-OHDA, não apresentou alterações nos resultados comportamentais analisados (teste

Rotacional e teste da Cruz Elevada) de ratos submetidos ao modelo de DP, sugerindo que as

moléculas de AS-Gc e 6-OHDA não interagem entre si e, além disso, que o tempo de

administração do polissacarídeo (10 ou 30 min, após a injeção da neurotoxina) não é uma

variável no presente estudo (Figuras 42 e 44). Portanto, de acordo com o dados analisados,

pode-se sugerir que AS-Gc apresenta atividade neuroprotetora contra alterações

mitocondriais, neuroquímicas e locomotoras induzidos por 6-OHDA em ratos, através da

modulação positiva de via antioxidante (GSH) e protegendo mitocôndrias contra danos

oxidativos.

Além de distúrbios motores e neuroquímicos, ocorrem uma variedade de problemas

não-motores, descritos na literatura em pacientes com DP, os quais afetam a qualidade de vida

dos pacientes consideravelmente. Dentre os problemas não-motores, podem ser citados: o

aumento ansiedade, (afetando aproximadamente entre 25-43% da população com DP)

(RICHARD; SCHIFFER; KURLAN, 1996; PONTONE et al., 2009; DISSANAYAKA et al.,

2010), os distúrbios renais (WANG et al., 2014) e a perda de peso (GUIMARÃES et al.,

2013).

Afim de determinar a presença de distúrbios não-motores e/ou possíveis efeitos

colaterais nos grupos analisados, realizou-se uma investigação do potencial ansiolítico ou

ansiogênico, bem como possíveis alterações renais e no ganho de massa corpórea de animais

submetidos a neurotoxina e ao tratamento com AS-Gc no modelo utilizado.

Bonito-Oliva e colaboradores (2014) relata sobre uma atividade ansiogênica

apresentado em ratos submetidos a injeção bilateral de 6-OHDA (20 µg) através do teste de

Cruz Elevada. Segundo o autor, diminuições dos níveis de dopamina e noradrenalina

contribuem para desordens afetivas, como no caso da atividade ansiogênica. Entretanto, na

análise da atividade ansiolítica/ansiogênica realizado no presente estudo, animais

hemiparkinsonianos (submetidos a injeção unilateral de 6-OHDA) não apresentaram

diferenças significativas nos parâmetros utilizados no teste da Cruz Elevada (Figura 41),

sugerindo uma ausência de ação ansiolítica, como descrito pelo autor. Por outro lado, pôde-se

observar um aumento no percentual de entrada nos braços abertos em animais

160

hemiparkinsonianos tratados com AS-Gc (60 µg), pela via de administração utilizada,

sugerindo uma possível atividade ansiolítica deste bioativo.

As análises sobre alterações renais e no ganho de massa corpórea indicaram

alterações significativas em animais hemiparkinsonianos. Os resultados mostram um aumento

do índice de urina nesse grupo (Figura 43), sugerindo que 6-OHDA induz um aumento da

atividade renal, possivelmente ocasionado por um descontrole da retenção. Este dado

corrobora com Wang e colaboradores (2014), que relata que doenças renais crônicas estão

associadas com o aumento do risco de DP.

Em relação a análise de massa corpórea, os dados indicam que animais

hemiparkinsonianos apresentam uma capacidade reduzida na recuperação e no ganho de

massa após a cirurgia estereotáxica (Figura 42). Este resultado corrobora com os dados

descritos por Guimarães e colaboradores (2013), ao analisar ratos com lesão bilateral em

corpo estriado com 6-OHDA (20 µg). De acordo com a literatura, pacientes com PD mostram

uma desregulação na massa corpórea, quando comparado com sujeitos sadios de mesma idade

(VAN DER MARCK et al., 2012). Em contrapartida, animais hemiparkinsonianos tratados

com AS-Gc apresentaram um retorno a níveis normais do ganho de massa corpórea.

Os avanços no desenvolvimento de fármacos para o tratamento da DP têm

possibilitado uma melhoria, principalmente, a nível sintomático (XU; BASTIA;

SCHWARZSCHILD, 2005). Entretanto, existe a ocorrência de efeitos adversos, como

psicose, síndrome da desregulação de dopamina, transtornos de controle e de humor, e

também outros sintomas relacionados a abstinência dos fármacos de tratamento (AARONS;

PEISAH; WIJERATNE, 2012). Por este motivo, a prospecção e investigação de novos

bioativos em modelos de DP podem auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias

farmacológicas para a neuroproteção e menos efeitos adversos.

Na literatura, estudos com polissacarídeos sulfatados de algas marinhas normalmente

são relatados com ausência de alterações sistêmicas e, portanto, ausência de toxicidade

(ASSREUY et al., 2008; ARAÚJO et al., 2011; VANDERLEI et al., 2011; COURA et al.,

2012; RODRIGUES et al., 2013b.). Entretanto, não há relato na literatura sobre os efeitos

sistêmicos do presente polissacarídeo sulfatado pela via de administração utilizada. Portanto,

no presente estudo, realizaram-se analises relacionadas a determinação de possíveis alterações

nas atividades locomotora, bem como uma possível neurodegeneração dopaminérgica

induzido por AS-Gc.

Os dados obtidos, no presente estudo, demonstram que AS-Gc apresenta ausência de

alterações locomotoras e indicação do processo de neurodegeneração dopaninérgica no teste

161

Rotacional, quando comparados a animais Sham (Figuras 38 e 42). Estes fatos corroboram

com os dados obtidos no capítulo II, sugerindo uma segurança farmacológica do uso de AS-

Gc em modelos experimentais in vivo, bem como pela via de administração utilizada neste

estudo.

Em resumo, os presentes resultados sugerem que AS-Gc apresenta atividade

neuroprotetora in vivo e in vitro, com efeitos demonstrando relativa dose-dependência. O

mecanismo de ação envolve o aumento da produção do agente antioxidante biológico GSH

que, por sua vez, pode estar atuando no controle dos níveis de nitrito/nitrato e de peroxidação

lipídica in vivo. AS-Gc também demonstra uma modulação dos níveis de neurotransmissores,

principalmente dopamina e serotonina, possivelmente devido a uma regulação da homeostase

celular, como pela proteção mitocondrial contra danos oxidativos. Em consequência dessa

atividade neuroprotetora, a nível neuroquímico e intracelular, AS-Gc é capaz de reduzir a

hipersensibilidade a agonistas dopaminérgicos, decorrente da neurodegeneração

dopaminérgica, além de retornar as atividades locomotoras a níveis normais. A ação

neurofarmacológica apresenta efeito terapêutico independente do tempo de administração do

bioativo, considerando o período de injeção da neurotoxina. Adicionalmente, AS-Gc revelou

uma possível ação ansiolítica, e apresenta uma proteção contra alterações fisiológicas, em

relação a função renal e no ganho de massa corpórea em animais hemiparkinsonianos. Os

resultados também demonstram a ausência de efeitos adversos induzidos por AS-Gc, em

relação a atividade locomotora, a uma hipersensibilidade a agonistas dopaminérgicos e a

possíveis alterações no ganho de massa corpórea pela via de administração intraestriatal.

19 CONCLUSÃO

O presente estudo conclui que a referida agarana sulfatada possui atividade

neuroprotetora, impedindo alterações transcricionais, neuroquímicas, mitocondriais e

comportamentais induzidas por 6-hidroxidopamina e, portanto, apresenta-se como uma

ferramenta neurofarmacológica em potencial a ser pesquisada contra distúrbios neurológicos

decorrentes de processos neurodegenerativos.

162

CAPITULO IV

ATIVIDADE NEUROPROTETORA DE AGARANA SULFATADA DE G. cornea EM

MODELO DE DOENÇA DE PARKINSON:

ANÁLISES TRANSCRIPTÔMICAS

163

20 INTRODUÇÃO

20.1 O Potencial Uso de Análises Transcriptômicas como Ferramentas Aplicadas na

Investigação de Estratégias Farmacológicas com Foco em Desordens

Neurodegenerativas

Os estudos de vias moleculares relacionadas a processos neurodegenerativos sejam

eles por mecanismos patológicos ou fisiológicos, têm propiciado a validação de genes

indicativos para a perda de componentes e funções neurais, e para a elucidação de

mecanismos moleculares envolvidos. Através desses estudos têm-se verificado vias similares

nos processos neurodegenerativos, os quais estariam associados com as vias de sinalização

próapoptótica induzida por mecanismos pró-oxidantes envolvidos (CAO et al., 2010;

AENLLE; FOSTER, 2010).

Por outro lado, as informações contidas na literatura ainda são poucas, quando

comparadas ao número real de genes modulados durante desordens neurológicas. Portanto, a

inclusão de novas ferramentas para obtenção desses dados, como o sequenciamento de

transcritos (RNA’s mensageiros), podem contribuir com um número maior de informações

sobre mecanismos de ação envolvidos em desordens neurológicas, como a depressão,

ansiedade e a doença de Parkinson (PARCHMAN et al., 2010; WANG et al., 2010).

Entre as ferramentas de análise de genes envolvidos em desordens neurológicas, as

atuais tecnologias de sequenciamento têm permitido a obtenção de genomas inteiros em

pouco tempo, bem como a obtenção de transcriptomas em diferentes organismos (WANG et

al., 2010). Tais resultados são obtidos com custos razoavelmente baixos, em relação à

tecnologia de sequenciamento de Sanger. Deste modo, muitos grupos vêm usando essas

plataformas para a obtenção de dados de genes expressos, os quais podem auxiliar no

esclarecimento de mecanismos envolvidos a doenças e de ação de bioativos de interesse

farmacológico.

164


Como descrito no Capítulo III, a agarana sulfata, isolada da macroalga marinha

vermelha Gracilaria cornea, apresentou efeitos indicativos de neuroproteção em modelos in

vivo e in vitro. Assim, no presente Capítulo, testou-se a hipótese de que estes efeitos estariam

ligados a eventos de regulação a nível transcricional, além dos já analisados no capítulo

anterior pela técnica de qPCR.

165

21 OBJETIVOS

21.1 Geral

O Objetivo do presente Capítulo foi determinar as alterações transcricionais

envolvidas no processo neurodegenerativo induzido por 6-OHDA e na atividade

neuroprotetora proveniente do uso da agarana sulfatada, da alga marinha G. cornea (AS-Gc),

em modelo de doença de Parkinson em ratos.

21.2 Específicos

- Determinar o perfil transcriptômico em corpo estriado de animais submetidos ao referido

modelo de DP e tratamento com o AS-Gc;

- Identificar as possíveis vias transcriptômicas envolvidos nos mecanismos

neurodegenerativos de 6-OHDA e neuroprotetor de AS-Gc, respectivamente.

166



Assim como descrito no tópico 4.1 do Capítulo I.


Assim como descrito no tópico 4.3 (Método I - CCP) do Capítulo I.

22.3 Animais

Assim como descrito no tópico 16.3 do Capítulo III.





22.6 Indução do Modelo de Doença de Parkinson através de injeção unilateral de 6-

OHDA em ratos

Assim como descrito no tópico 16.6.1 do Capítulo III.

167

22.7 Dissecação de Áreas Cerebrais

Assim como descrito no tópico 16.6.8 do Capítulo III.

22.8 Extração e Análise do RNA total

Assim como descrito no tópico 16.8.1 e 16.8.2 do Capítulo III.

22.9 Análises Transcriptômicas

Os dados referentes ao transcriptoma foram obtidos através da tecnologia de próxima

geração de sequenciamento de DNA, do tipo Illumina, garantindo uma grande quantidade de

sequências em curto tempo. Todas as análises por bioinformática foram realizadas utilizando

programas gratuitos e amplamente utilizados pela comunidade científica.

22.9.1 Sequenciamento do RNA utilizando a plataforma Illumina Hi-Seq2000

Para as análises trascriptômicas, utilizou-se um pool, contendo aproximadamente 40

µg do RNA total isolado de corpo estriado dos animais de cada grupo (Sham, 6-OHDA e AS-

Gc 60 µg, respectivamente), com relação de absorbância 260/280 igual ou superior a 1,7.

Posteriormente, as amostras de RNA foram levadas ao Laboratório de Biotecnologia Animal

(ESALQ-USP) para a construção das bibliotecas de cDNA (tipo Paired End). A construção

de bibliotecas de cDNA e ligação de adaptadores foram realizadas utilizando o kit TruSeq(tm)

RNA and DNA Sample Preparation kit (Illumina), utilizando de 1-10 µg do RNA total, de

acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos de cDNA ligados aos adaptadores

foram amplificados por Bridge PCR utilizando o equipamento cBOT. Em seguida, as

amostras de cDNA foram sequenciadas utilizado a plataforma Illumina HiSeq2000.

168

22.9.2 Análises in sílico

Mapeamento e Diferenças de Expressão

O processamento dos dados foi realizado em um computador HP Proliant com 24

núcleos de processamento e 16,7 Gb de memória RAM. Os dados brutos filtrados (arquivos

no formato fastq) contendo dados de sequência e qualidade de base em Phred foram avaliados

pelo programa FastQC (ANDREWS, 2013). As leituras de baixa qualidade foram removidos

utilizando a ferramenta FastX Toolkit

(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).

Para a identificação gênica dos reads (sequências de pares de bases nucleotídicas

curtas, detectadas através de sequenciamento) obtidos, utilizou-se como referência o genoma

conhecido da própria espécie de rato utilizado neste estudo (Rattus norvegicus), baixado do

National Center for Biotechnology Information (NCBI) e indexado usando o programa

Bowtie 1.1.1 (LANGMEAD, TRAPNEEL; SAÇZBERG, 2009). O mapeamento foi realizado

com o programa TopHat 2.0.13, sendo descartados da analise os reads com qualidade de

bases Phred < 33 (ERWING; GREEN, 1998; TRAPNELL; PACHTER; SALZBERG, 2009).

Para as análises de expressão global de genes, utilizou-se o programa Cufflinks 2.2.1

(TRAPNELL et al., 2012). Adicionalmente, os dados obtidos do Cuffdiff foram submetidos a

análise usando o programa CummeRbund 2.7.2 do R (http://www.r-project.org). Os valores de

expressão gênica obtidos foram descritos como Fragments Per Kilobase of Exon per Million

Fragments Mapped (FPKM).

Análise de termos de GO e mapa KEGG

Após a identificação dos genes expressos, estes foram classificados, de acordo com

diferença de expressão, de acordo com os termos definidos pelo Gene Onthology (GO):

função molecular, processo biológico e componente celular (ASHBURNER et al., 2000).

Adicionalmente, realizou-se o mapeamento destes genes em vias metabólicas conhecidas,

com base na Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG pathways) (KANEHISA;

GOTO, 2000).

http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

169

22.10 Análise Estatística

Para as análises transcriptômicas, todos os valores de expressão gênica foram

descritos como FPKM (Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped) e

submetidos a análises de diferenças estatísticas utilizando o programa Cufflinks 2.2.1

(TRAPNELL et al., 2012). Adicionalmente, os dados obtidos do Cuffdiff foram submetidos a

análise usando o programa CummeRbund 2.7.2 do R. Consideraram-se os valores p e q <0,05

como estatisticamente significativos. Adicionalmente, todos os experimentos foram realizados

por observadores “cegos”.

23 RESULTADOS

23.1 Análises Transcriptômicas

23.1.1 Análise do Sequenciamento dos RNA pela Próxima Geração de Sequenciamento

(NGS)

Todos os reads, utilizados para as análises transcriptômicas no presente estudo,

apresentaram tamanho de 101 pb e qualidade Fhred igual ou superior a 33 (Gráficos 2 e 3).

Gráfico 2 - Escores de Qualidade

170

Fonte: Autor: Legenda: Distribuição do escore de qualidade (Phred) (eixo y), em relação a posição em reads

(pares de pases – pb) (eixo x) nos grupos Sham (A), 6-OHDA (B) e AS-Gc (C), respectivamente.

171

Gráfico 3 - Distribuição do Escore de Qualidade

172

Fonte: Autor. Legenda: Distribuição do escore de qualidade (Phred) (eixo X), em relação a quantidade de

sequencias (eixo y) nos grupos Sham (A), 6-OHDA (B) e AS-Gc (C), respectivamente.

173

23.1.2 Identificação e Análise do Perfil Transcriptômico

23.1.2.1 Indentificação das Sequências

Todas as sequências de qualidade foram identificadas por homologia através de

alinhamento no programa BLAST, considerando somente aquelas com valor E igual 10 -5

,

cerca de 37.779 sequências foram identificadas, sendo 21.802 sequências de genes conhecidos

e 15.977 LOCs (sequências gênicas com funções incertas) (dados não mostrados).

23.1.2.2 Alterações no Perfil de Expressão dos Genes

A análise da densidade e da expressão global dos genes identificados entre os grupos

não demonstrou muitas diferenças significativas (considerando p e q > 0,05, respectivamente)

(Gráficos 4 e 5). Entretanto, animais submetidos a neurotoxina e tratados com AS-Gc (60 µg)

apresentaram uma tendência a modular um número maior da expressão de genes, em relação

ao grupo 6-OHDA (animais não-tratados).

A análise trascriptômica do grupo 6-OHDA revelou 78 genes/LOCs diferencialmente

expressos, em relação ao grupo Sham, sendo 57 genes e 21 LOCs. 6-OHDA regulou

negativamente a expressão de 72 genes/LOCs e, positivamente, a expressão de 2 genes

(glicoproteína ligante de P-selectina-1 – SELPLG e proteína ribossomal Rps15al4) e 4 LOCs

(LOC100911372, LOC100909878, LOC100909510 e LOC100911844) (Tabela 10).

Por outro lado, no grupo AS-Gc (60 µg) houve uma redução de 78 para 44, o número

de genes diferencialmente expressos, em relação ao grupo Sham, sendo 27 genes e 17

genes/LOCs, respectivamente. AS-Gc (60 µg) modulou negativamente 37 genes/LOCs e,

positivamente, 3 genes (transtirretina - Ttr, polipeptídeo CD74 - associado ao principal

complexo de histocompatibilidade classe II – MHC II e proteína ribossomal Rps15al4) e 4

LOCs (LOC100911575, LOC103689983, LOC100909878 e LOC100909510) (Tabela 11).

Adicionalmente, foram identificados 23 genes/LOCs diferencialmente expressos

entre os grupos 6-OHDA e AS-Gc (60 µg), sendo 18 genes e 5 LOCs, respectivamente. AS-

Gc (60 µg) modulou negativamente 18 genes/LOCs e, positivamente, 2 genes (GH1 –

hormônio de crescimento 1 e HPRT1 – hipoxantina fosforibosil transferase 1) e 3 LOCs

(LOC497796, LOC100911372 e LOC100911575) (Tabelas 12).

174

Gráfico 4 - Análise do Perfil da Densidade e expressão global de genes

176

Fonte: Autor. Legenda: Setas pretas indicam diferenças na densidade de genes entre os grupos 6-OHDA (A) e

AS-Gc (B), respectivamente, em relação ao grupo Sham.

177

Gráfico 5 - Análise Global de Genes Diferencialmente Expressos

Fonte: Autor. Legenda: Análise da expressão dos genes do grupo 6-OHDA (A) e AS-Gc (60 µg) (B), em

relação ao grupo Sham (linha serrilhada central). Pontos em vermelho representam genes identificados com a

expressão significativamente diferente, em relação ao grupo Sham. Pontos em preto representam genes com

expressão inalterada. Consideraram-se q < 0,05 como significativamente diferentes.

178

Tabela 10 - Identificação de genes diferencialmente expressos entre os grupos 6-OHDA e Sham

Gene locus Sham

(FPKM)

6-OHDA

(FPKM)

Valor p Valor q

Tfec NC_005103.4:44063532-44136815 1.67605 0.299365 5,00E-005 0.0140806

RGD1564861 NC_005103.4:98481227-98523276 34824 2.08184 5,00E-005 0.0140806

Orm1 NC_005104.4:79179667-79182820 0 0.457429 5,00E-005 0.0140806

LOC100911372 NC_005104.4:105209843-105212791 3.33193 0 5,00E-005 0.0140806

C1qb NC_005104.4:155246443-155251995 190124 95.3079 5,00E-005 0.0140806

C1qc NC_005104.4:155255012-155258631 151985 58.5809 5,00E-005 0.0140806

Tnfrsf14 NC_005104.4:172328258-172337219 4.76971 1.00832 5,00E-005 0.0140806

Isg15 NC_005104.4:173624861-173629131 10.7475 3.77368 5,00E-005 0.0140806

Ifi27l2b NC_005105.4:127336304-127337791 45.5926 7.94382 5,00E-005 0.0140806

LOC102546876 NC_005105.4:138092061-138093766 55.6388 1.90105 5,00E-005 0.0140806

LOC362795 NC_005105.4:138193222-138685823 8.16877 1.04266 5,00E-005 0.0140806

LOC314492 NC_005105.4:138193222-138685823 39.8501 3.47477 5,00E-005 0.0140806

LOC366752 NC_005105.4:140485427-140502212 2.96719 0 5,00E-005 0.0140806

LOC691892 NC_005105.4:142099701-142100836 6.73763 0 5,00E-005 0.0140806

Siglec8 NC_005100.4:99576945-99587908 2.12058 0.41379 5,00E-005 0.0140806

Csf2rb NC_005106.4:119554382-119568248 4.3235 1.56965 5,00E-005 0.0140806

Rac2 NC_005106.4:119783871-119797111 30.3373 15.1995 5,00E-005 0.0140806

Faim NC_005107.4:107223471-107241225 0.331904 0 5,00E-005 0.0140806

Siglech NC_005100.4:114046307-114152925 0.383918 0 5,00E-005 0.0140806

Emr1 NC_005108.4:9431887-9585875 60.2845 26.1772 5,00E-005 0.0140806

Mrpl30 NC_005108.4:44483810-44496116 0.493069 0 5,00E-005 0.0140806

Mrpl30 NC_005108.4:44560887-44571332 0.831367 0 5,00E-005 0.0140806

Ccl20 NC_005108.4:88918356-88921011 0.375874 0 5,00E-005 0.0140806

LOC363527 NC_005109.4:1737207-1739808 0.230039 0 5,00E-005 0.0140806

Slfn5 NC_005109.4:70298091-70312065 3.21666 1.34861 5,00E-005 0.0140806

179

Slfn2 NC_005109.4:70370380-70376718 7.70271 2.85246 5,00E-005 0.0140806

Slfn3 NC_005109.4:70411687-70435162 1.67308 0.228047 5,00E-005 0.0140806

Lgals3bp NC_005109.4:107415333-107424672 50.4319 26.3238 5,00E-005 0.0140806

LOC365305 NC_005100.4:152582407-152594898 0.466498 0 5,00E-005 0.0140806

Mx1 NC_005110.4:37891149-37916777 9.43547 2.59503 5,00E-005 0.0140806

Mx2 NC_005110.4:38035307-38062685 13.4354 4.22925 5,00E-005 0.0140806

LOC680329 NC_005110.4:86088628-86092916 19.3477 3.97689 5,00E-005 0.0140806

Oas1b NC_005111.4:41255761-41266430 4.05166 1.04742 5,00E-005 0.0140806

Selplg NC_005111.4:48577904-48579196 16269 32458 5,00E-005 0.0140806

Fcgr3a NC_005112.4:89385772-89396047 32.3056 9.83114 5,00E-005 0.0140806

Plac8 NC_005113.4:10692798-10714556 18.3551 6.40007 5,00E-005 0.0140806

Cxcl13 NC_005113.4:15253145-15258223 504672 12.9572 5,00E-005 0.0140806

Naaa NC_005113.4:17283261-17302364 20.8751 8.92044 5,00E-005 0.0140806

Igj NC_005113.4:21177236-21183542 22.9983 1.15488 5,00E-005 0.0140806

LOC103693757 NC_005113.4:46523657-46528336 1.52008 0 5,00E-005 0.0140806

F10 NC_005115.4:81803168-81822476 6.9397 2.54989 5,00E-005 0.0140806

Tnfsf13b NC_005115.4:85275689-85306412 5.50813 1.49245 5,00E-005 0.0140806

Itgal NC_005100.4:198744050-198781745 6.68575 3.05343 5,00E-005 0.0140806

Cfb NC_005119.4:4536205-4542073 5.10724 1.6859 5,00E-005 0.0140806

C2 NC_005119.4:4542339-4561152 44.9307 20.2279 5,00E-005 0.0140806

LOC100911840 NC_005100.4:214015059-214017131 2.7839 0 5,00E-005 0.0140806

Irf7 NC_005100.4:214249387-214252909 9.11996 2.05781 5,00E-005 0.0140806

Cybb NC_005120.4:14578329-14610049 3.64306 0.855262 5,00E-005 0.0140806

H19 NC_005100.4:215744403-215747080 2.7208 0.377723 5,00E-005 0.0140806

LOC100910973 NC_005100.4:227110935-227113844 103135 46.4133 5,00E-005 0.0140806

Rps15al4 NC_005101.4:55055273-55055761 0 89.2849 5,00E-005 0.0140806

LOC100909878 NC_005101.4:55108772-55109260 4.75717 89.2849 5,00E-005 0.0140806

180

Fyb NC_005101.4:55834906-55983805 6.73994 2.96842 5,00E-005 0.0140806

Fcrl2 NC_005101.4:186594441-186605115 82.2347 40.0033 5,00E-005 0.0140806

LOC100909510 NC_005100.4:64092223-64100055 0 0.42373 5,00E-005 0.0140806

Lcn2 NC_005102.4:11414188-11417534 42.0658 8.16737 5,00E-005 0.0140806

LOC102551491 NC_005102.4:16753702-16754306 1.26998 0 5,00E-005 0.0140806

LOC102553449 NC_005102.4:17889971-17890738 26.8914 1.81924 5,00E-005 0.0140806

LOC690509 NC_005102.4:18823729-18824297 6.6151 0 5,00E-005 0.0140806

LOC500175 NC_005102.4:19771900-19772382 1.31265 0 5,00E-005 0.0140806

Il1b NC_005102.4:121876255-121882637 9.60984 1.77791 5,00E-005 0.0140806

Oxt NC_005102.4:123106693-123107534 1.56244 0 5,00E-005 0.0140806

Clec4a1 NC_005103.4:155947793-155959909 12.9494 5.13679 0.0001 0.0249429

Ccl2 NC_005109.4:69412064-69413863 6349 1.0195 0.0001 0.0249429

Socs3 NC_005109.4:106973862-106976969 2.43686 0.788466 0.0001 0.0249429

Lrrc25 NC_005115.4:20555394-20563772 2.49558 0.579261 0.0001 0.0249429

Cfp NC_005120.4:1311120-1316683 11.4999 4.91493 0.0001 0.0249429

Cldn2 NC_005120.4:111122507-111133188 7.35149 3.6837 0.0001 0.0249429

LOC685067 NC_005101.4:248215327-248241278 2.62284 1.05456 0.0001 0.0249429

LOC100911844 NC_005102.4:167346120-167346630 2.19146 10.4152 0.0001 0.0249429

C1qa NC_005104.4:155261253-155264101 288561 160308 0.00015 0.0353919

Ncf4 NC_005106.4:119481707-119499426 4.6359 1.45197 0.00015 0.0353919

Ifit2 NC_005100.4:252894662-252900727 2.86779 1.14404 0.00015 0.0353919

Il1rn NC_005102.4:1366122-1468624 2.98076 0.806563 0.00015 0.0353919

LOC100911516 NC_005108.4:101106891-101107583 9.38622 2.79001 0.0002 0.0447692

Ifi47 NC_005109.4:34277992-34290659 10.6199 5.05345 0.0002 0.0447692

Dhx58 NC_005109.4:88599721-88611565 4.58769 2.06723 0.0002 0.0447692

Folr2 NC_005100.4:166915044-166933377 2.86945 0.552469 0.0002 0.0447692

Fonte: Autor. Legenda: Amarelo indica genes/LOCs regulados positivamente, em relação ao grupo Sham.

181

Tabela 11 - Identificação de genes diferencialmente expressos entre os grupos AS-Gc e Sham

Gene locus Sham

(FPKM)

AS-Gc

(FPKM)

Valor p Valor q

Npy NC_005103.4:79557855-79565059 1.01174 0 0.0001 0.0396591

Aqp1 NC_005103.4:85551502-85563683 5.92419 0.504915 5,00E-005 0.0223718

Slc4a5 NC_005103.4:114918487-115002290 4.55301 0.388211 5,00E-005 0.0223718

Klrk1 NC_005103.4:163392651-163403732 0.368153 0 5,00E-005 0.0223718

Slco1a5 NC_005103.4:176445855-176528117 3.51317 0.166847 5,00E-005 0.0223718

Rps6 NC_005104.4:105197820-105200681 1.39885 0 5,00E-005 0.0223718

Tnfrsf14 NC_005104.4:172328258-172337219 4.61604 0.548856 5,00E-005 0.0223718

Sostdc1 NC_005105.4:55812819-55816994 12.2176 0.777194 5,00E-005 0.0223718

LOC314492 NC_005105.4:138193222-138685823 38.5687 1.38955 5,00E-005 0.0223718

LOC366752 NC_005105.4:140485427-140502212 2.87227 0 5,00E-005 0.0223718

LOC691892 NC_005105.4:142099701-142100836 6.52225 0 5,00E-005 0.0223718

LOC102551959 NC_005105.4:142352999-142353523 28.9418 0 5,00E-005 0.0223718

LOC691946 NC_005105.4:143206454-143206912 8.55231 0 5,00E-005 0.0223718

Mfrp NC_005107.4:48437813-48443421 14.0509 0.873713 5,00E-005 0.0223718

C3 NC_005108.4:9721136-9747084 288132 73.5212 5,00E-005 0.0223718

Mrpl30 NC_005108.4:44483810-44496116 0.477367 0 5,00E-005 0.0223718

Mrpl30 NC_005108.4:44560887-44571332 0.804834 0 5,00E-005 0.0223718

LOC363527 NC_005109.4:1737207-1739808 0.222696 0 5,00E-005 0.0223718

Slfn5 NC_005109.4:70298091-70312065 3.11521 0.693744 0.0001 0.0396591

LOC103690039 NC_005109.4:105215868-105228740 0.308551 0 0.0001 0.0396591

LOC365305 NC_005100.4:152582407-152594898 0.451765 0 5,00E-005 0.0223718

Clic6 NC_005110.4:32655652-32698004 9.13735 1.33457 5,00E-005 0.0223718

182

Mx1 NC_005110.4:37891149-37916777 9.13608 2.03692 5,00E-005 0.0223718

Kl NC_005111.4:942973-987206 8.09156 0.646769 5,00E-005 0.0223718

F5 NC_005112.4:82479996-82535540 3.78081 0.210035 5,00E-005 0.0223718

Plac8 NC_005113.4:10692798-10714556 17.7676 2.20458 0.0001 0.0396591

Cxcl13 NC_005113.4:15253145-15258223 488869 11.8041 5,00E-005 0.0223718

LOC103693757 NC_005113.4:46523657-46528336 1.46981 0 5,00E-005 0.0223718

Lrrc25 NC_005115.4:20555394-20563772 2.41419 0.282818 0.0001 0.0396591

Ttr NC_005117.4:14814149-15780290 3054.88 206872 5,00E-005 0.0223718

Cd74 NC_005117.4:56071419-56080851 1023.19 289018 5,00E-005 0.0223718

LOC100911575 NC_005100.4:213991138-213993645 0 1.71922 5,00E-005 0.0223718

LOC100911840 NC_005100.4:214015059-214017131 2.69293 0 5,00E-005 0.0223718

Igf2 NC_005100.4:215828101-215844406 18.8961 4.86575 5,00E-005 0.0223718

Cldn2 NC_005120.4:111122507-111133188 7.11754 0.45068 5,00E-005 0.0223718

LOC103689983 NC_005120.4:158623230-158655274 0 1.32398 5,00E-005 0.0223718

Rps15al4 NC_005101.4:55055273-55055761 0 94097 5,00E-005 0.0223718

LOC100909878 NC_005101.4:55108772-55109260 4.60673 105.59 5,00E-005 0.0223718

Gnat2 NC_005101.4:210880753-210890765 0.233035 0 5,00E-005 0.0223718

LOC100909510 NC_005100.4:64092223-64100055 0 0.675857 5,00E-005 0.0223718

Lcn2 NC_005102.4:11414188-11417534 40.7145 4.42902 5,00E-005 0.0223718

LOC102553449 NC_005102.4:17889971-17890738 26.0385 0 5,00E-005 0.0223718

LOC690509 NC_005102.4:18823729-18824297 6.40533 0 5,00E-005 0.0223718

LOC100363282 NC_005102.4:20303798-20304278 6.22185 0 5,00E-005 0.0223718

Fonte: Autor. Legenda: Amarelo indica genes/LOCs regulados positivamente, em relação ao grupo Sham.

183

Tabela 12 - Identificação de genes diferencialmente expressos entre os grupos 6-OHDA e AS-Gc

Gene locus 6-OHDA

(FPKM)

AS-Gc

(FPKM)

Valor p Valor q

Pclo NC_005103.4:16454903-16669367 4.46457 1.42164 0,00005 0.0374283

Aqp1 NC_005103.4:85551502-85563683 3.41173 0.50078 0,00005 0.0374283

Slc4a5 NC_005103.4:114918487-115002290 2.87574 0.384998 0,00005 0.0374283

LOC497796 NC_005103.4:164174738-164211869 0 0.263508 0,00005 0.0374283

Slco1a5 NC_005103.4:176445855-176528117 2.27857 0.165486 0,00005 0.0374283

Rps6 NC_005104.4:105197820-105200681 1.54344 0 0,00005 0.0374283

LOC100911372 NC_005104.4:105209843-105212791 0 4.27821 0,00005 0.0374283

RGD1309903 NC_005100.4:13837864-13918312 3.08445 0.872406 0,00005 0.0374283

Sostdc1 NC_005105.4:55812819-55816994 7.89113 0.770743 0,00005 0.0374283

Igsf9b NC_005107.4:28352513-28398659 2.48941 0.491478 0,00005 0.0374283

Mfrp NC_005107.4:48437813-48443421 7.83255 0.866518 0,00005 0.0374283

Gh1 NC_005109.4:94486203-94488181 0 0.443683 0,00005 0.0374283

Clic6 NC_005110.4:32655652-32698004 5.9206 1.32335 0,00005 0.0374283

LOC102548388 NC_005110.4:85430399-85430866 1.40872 0 0,00005 0.0374283

Kl NC_005111.4:942973-987206 6.02833 0.641371 0,00005 0.0374283

Tnr NC_005112.4:77602248-77678385 6.00925 1.58997 0,00005 0.0374283

F5 NC_005112.4:82479996-82535540 3.07737 0.208306 0,00005 0.0374283

Atxn1 NC_005116.4:19160985-19533814 5.73289 1.47079 0,00005 0.0374283

Ttr NC_005117.4:14814149-15780290 1908.14 205.16 0,00005 0.0374283

LOC100911575 NC_005100.4:213991138-213993645 0 1.70471 0,00005 0.0374283

Cldn2 NC_005120.4:111122507-111133188 3.53717 0.446991 0,00005 0.0374283

Hprt1 NC_005120.4:158196639-158228815 0 1.19713 0,00005 0.0374283

LOC102553449 NC_005102.4:17889971-17890738 1.74667 0 0,00005 0.0374283

Fonte: Autor. Legenda: Amarelo indica genes/LOCs regulados positivamente, em relação ao grupo 6-OHDA.

184

23.1.2.3 Análise de LOCs

Dentre os 15.977 LOCs identificados em Rattus novergicus, cerca de 21 LOCs

apresentaram sua expressão modulada em animais submetidos a neurotoxina, 6-OHDA, em

relação ao grupo Sham. Os LOCs foram identificados em sua maioria como genes

codificadores de proteínas constituintes de imunoglobulinas, seguido principalmente por

genes codificadores de proteínas ribossomais e quinases. Entre estes LOCs, 6-OHDA reduziu

a expressão de genes codificadores de proteínas constituintes de imunoglobulinas e quinases,

e aumentou a expressão de genes codificadores de proteínas ribossomais, em relação ao grupo

Sham (Tabela13).

Por outro lado, animais com DP e tratados com AS-Gc apresentaram uma redução do

número de LOCs modulados de 21 para 17, dentre os quais 6 LOCs não foram detectados no

grupo 6-OHDA. Assim como no grupo 6-OHDA, a maioria dos LOCs foram identificados

como genes codificadores de proteínas constituintes de imunoglobulinas, seguido por genes

codificadores de proteínas ribossomais. Entre estes LOCs, AS-Gc induziu a expressão de dois

genes codificadores de proteínas ribossomais, de uma endonuclease de RNAt (Sen34) e do

gene HPRT (hipoxantina-guanina fosforibosil transferase) (Tabela 14).

Adicionalmente, quando comparados os grupos, tratados e não-tratados, AS-Gc

apresentou uma modulação positiva para dois genes codificadores de proteínas ribossomais

(S6 e P2) e para uma proteína hipotética, em relação ao grupo 6-OHDA. Além disso, AS-Gc

apresentou uma redução da expressão de genes codificadores de imunoglobulinas, em relação

ao grupo 6-OHDA.

185

Tabela 13 - Identificação de LOCs diferencialmente expressos entre os grupos 6-OHDA e Sham

Gene Locus (R. novergicus) Identificação

LOC100911372 NC_005104.4:105209843-105212791 40S ribosomal protein S6-like

LOC102546876 NC_005105.4:138092061-138093766 Ig gamma-2B chain C region-like

LOC362795 NC_005105.4:138193222-138685823 Immunoglobulin G heavy chain

LOC314492 NC_005105.4:138193222-138685823 Immunoglobulin heavy chain variable region

LOC366752 NC_005105.4:140485427-140502212 Ig heavy chain V 6.96-like

LOC691892 NC_005105.4:142099701-142100836 Ig heavy chain V-III region ABE-47N-like

LOC363527 NC_005109.4:1737207-1739808 Similar to serine/threonine protein kinase 6

LOC365305 NC_005100.4:152582407-152594898 Similar to Phosphoglycerate kinase 1

LOC680329 NC_005110.4:86088628-86092916 Immunoglobulin lambda-like polypeptide 5-like

LOC103693757 NC_005113.4:46523657-46528336 Collagen alpha-1(I) chain-like

LOC100911840 NC_005100.4:214015059-214017131 DNA-directed RNA polymerases I, II and III subunit RPABC5-like

LOC100910973 NC_005100.4:227110935-227113844 NÃO CARACTERIZADO

(TIPO DE RNA não codificante)

LOC100909878 NC_005101.4:55108772-55109260 40S RIBOSOMAL PROTEIN S15a-like

LOC100909510 NC_005100.4:64092223-64100055 tRNA-splicing endonuclease subunit Sen34-like

LOC102551491 NC_005102.4:16753702-16754306 Ig kappa chain V-IV region-like

LOC102553449 NC_005102.4:17889971-17890738 Ig kappa chain V-II region 26-10-like

LOC690509 NC_005102.4:18823729-18824297 Ig kappa chain V-VI region NQ2-48.2.2-like

LOC500175 NC_005102.4:19771900-19772382 Ig kappa chain V-I region HK 101-like

LOC685067 NC_005101.4:248215327-248241278 Similar to guanylate binding protein Family, member 6

LOC100911844 NC_005102.4:167346120-167346630 60S ribosomal protein L24-like

LOC100911516 NC_005108.4:101106891-101107583 Coiled-coil-helix domain-containing protein 2

Fonte: Autor. Legenda: Amarelo indica LOCs modulados positivamente, em relação ao grupo Sham.

186

Tabela 14 - Identificação de LOCs diferencialmente expressos entre os grupos AS-Gc e Sham


LOC314492 NC_005105.4:138193222-138685823 Immunoglobulin heavy chain variable region

LOC366752 NC_005105.4:140485427-140502212 Ig heavy chain V 6.96-like

LOC691892 NC_005105.4:142099701-142100836 Ig heavy chain V-III region ABE-47N-like

LOC102551959 NC_005105.4:142352999-142353523 Ig heavy chain V region IR2-like

LOC691946 NC_005105.4:143206454-143206912 Ig heavy chain V region 108A-like

LOC363527 NC_005109.4:1737207-1739808 Similar to serine/threonine protein kinase 6

LOC103690039 NC_005109.4:105215868-105228740 Signal recognition particle subunit SRP68-like

LOC365305 NC_005100.4:152582407-152594898 Similar to Phosphoglycerate kinase 1

LOC103693757 NC_005113.4:46523657-46528336 Collagen alpha-1(I) chain-like

LOC100911575 NC_005100.4:213991138-213993645 60S acidic ribosomal protein P2-like

LOC100911840 NC_005100.4:214015059-214017131 DNA-directed RNA polymerases I, II and III subunit RPABC5-

like

LOC103689983 NC_005120.4:158623230-158655274 Hypoxantine-guanine phosphoribosyltransferase

LOC100909878 NC_005101.4:55108772-55109260 40S RIBOSOMAL PROTEIN S15a-like

LOC100909510 NC_005100.4:64092223-64100055 tRNA-splicing endonuclease subunit Sen34-like


LOC690509 NC_005102.4:18823729-18824297 Ig kappa chain V-VI region NQ2-48.2.2-like

LOC100363282 NC_005102.4:20303798-20304278 Igk protein-like

Fonte: Autor. Legenda: Verde indica LOCs exclusivos de AS-Gc, em relação a 6-OHDA. Amarelo indica LOCs modulados positivamente, em relação ao grupo 6-OHDA.

187

Tabela 15 - Identificação de LOCs diferencialmente expressos entre os grupos 6-OHDA e

AS-Gc

Fonte: Autor. Legenda: Amarelo indica LOCs modulados positivamente, em relação ao grupo 6-OHDA.


LOC497796 NC_005103.4:164174738-164211869 Hypothetical protein

LOC100911372 NC_005104.4:105209843-105212791 40S ribosomal protein S6-like

LOC102548388 NC_005110.4:85430399-85430866 Ig lambda-2 chain V region-like

LOC100911575 NC_005100.4:213991138-213993645 60S acidic ribosoal protein P2-like


188

23.1.2.4 Anotação Funcional dos Genes Identificados

Termos de GO

De acordo com a análise de GO, foi possível identificar 736 termos em corpo

estriado de ratos submetidos a neurotoxina (6-OHDA), relacionados a categoria Função

Molecular, como: promotor nuclear da RNA polimerase II (1), atividade catalítica (18),

atividade de receptores (3) e receptores transmembrana (2), atividade transportadora (3),

atividade moleculares estruturais (23), ligantes (44) e proteínas de sinalização (1) (Gráfico

6A); genes envolvidos a funções relacionadas a categoria de Componentes Celulares, como:

ativação enzimática (2), região extracelular (25), colágeno (3), célula (51) e junção celular

(24), membrana (41), complexos macromoleculares (9), botão terminal (1), organelas (27),

parte organelar (3), parte membranar (36), parte celular (51) e matriz extracelular (1) (Gráfico

6B); bem como a categoria Processo Biológico, como: reprodução (5) e processos

reprodutivos (8), processos imunológicos (22), adesão celular (10), processos metabólicos

(30) e regulação biológica (39), sinalização (16), desenvolvimento (17), locomoção (6),

estímulo a respostas (42), localização (13), biogênese ou organização celular (8), ciclo

circadiano (1) e secreção de insulina (1) (Gráfico 6C).

Por outro lado, quando os animais submetidos a neurotoxina foram tratados com AS-

Gc (60 µg), estes demonstraram alterações na quantidade de genes identificados (450) em

algumas das funções biológicas, em relação ao grupo 6-OHDA. Entre essas alterações no

número de genes em atividades, podem-se citar: a atividade de transdução de sinais (4),

atividade reguladora de enzimas (2), ativação de receptores (2) (Gráfico 6A), relacionado ao

núcleo (1) (Gráfico 6B), secreção hormonal (1), processo rítmico (2) (Gráfico 6C), entre

outros.

189

Gráfico 6 - Histograma de Classificação da ontologia do gene

190

Fonte: Autor. Legenda: Os resultados estão sumarizados em três categorias: Funções moleculares (Molecular

function) (A), Componentes celulares (Cellular component) (B) e processos biológicos (Biological process) (C).

O eixo Y indica o número de genes identificados em cada categoria.

191

Termos de KO e Mapa KEGG

Quando os dados dos genes diferencialmente expressos do transcriptoma do grupo 6-

OHDA, em relação ao grupo Sham, foram analisados através das vias canônicas (KEGG),

identificaram-se 39 termos de KO, que encontram-se distribuídos em 73 mapas KEGG

(Tabelas 16, 17, 18 e 19). Por outro lado, a análise dos genes diferencialmente expressos do

grupo AS-Gc (60 µg), em relação ao grupo Sham, apresentou uma redução da quantidade de

termos de KO para 18 e mapas KEGG para 27, respectivamente (Tabelas 16, 17, 18 e 20).

Adicionalmente, quando comparados os genes diferencialmente expressos do grupo AS-Gc

(60 µg), em relação ao grupo 6-OHDA, identificaram-se 12 termos de KO e 26 mapas KEGG

(Tabelas 16, 17 18 e 21).

Entre os mapas KEGG que podem ser considerados mais relevantes para este estudo,

podem-se citar vias de sinalização relacionadas com processos inflamatórios, como: TNF

(Figura 53), quimiocinas (Figura 54), citocinas (Figura 55), migração de leucócitos (Figura

56) e apoptose (Figura 57); vias de sinalização relacionadas com processos

neurodegenerativos, como: doença de Alzheimer (Figura 58) e doença de Príon (Figura 59);

com cascatas de complemento e coagulação (Figura 60) e com a diabetes mellitos tipo II

(Figura 61).

Por outro lado, animais submetidos a neurotoxina e tratados com AS-Gc,

apresentaram, entre os mapas KEGG mais relevantes para este estudo, vias de sinalização

relacionadas com o transporte de ácidos biliares e de água (Figura 62), com o metabolismo da

droga azotiaprina (Figura 63), com a interação de receptores de ligantes neuroativos (Figura

64) e com a sinalização de condroitam/dermatam sulfato (Figura 65).

192

Tabela 16 - Termos de KO identificados de genes diferencialmente expressos para o grupo 6-OHDA, em relação ao grupo Sham

Gene Descrição KO

Tfec TFEC; transcription factor EC K15591

Orm1 ORM1, AGP1; alpha-1-acid glycoprotein 1 K17308

C1qb C1QB; complement C1q subcomponent subunit B K03987

C1qc C1QG; complement C1q subcomponent subunit C K03988

Tnfrsf14 TNFRSF14, HVEM; tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 K05152

Isg15 ISG15; ubiquitin cross-reactive protein K12159

Csf2rb CSF2RB, IL3RB; cytokine receptor common subunit beta K04738

Rac2 RAC2; Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 K07860

Siglech CD33, SIGLEC3; CD33 antigen K06473

Emr1 EMR1; egf-like module containing, mucin-like, hormone receptor-like 1 K04591

Ccl20 CCL20; C-C motif chemokine 20 K14625

Lgals3bp LGALS3BP; galectin-3-binding protein K17300

Mx2 MX1; interferon-induced GTP-binding protein Mx1 K14754

Oas1b OAS; 2'-5'-oligoadenylate synthetase [EC:2.7.7.84] K14216

Selplg SELPLG; selectin P ligand K06544

Fcgr3a FCGR3, CD16; low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III K06463

Cxcl13 CXCL13; C-X-C motif chemokine 13 K10032

Naaa NAAA; N-acylethanolamine-hydrolysing acid amidase [EC:3.5.1.-] K13720

Igj CCL2, MCP1; C-C motif chemokine 2 K14624

F10 F10; coagulation factor X [EC:3.4.21.6] K01314

Tnfsf13b TNFSF13B, TNFSF20; tumor necrosis factor ligand superfamily member K05476

193

13B

Itgal ITGAL; integrin alpha L K05718

Cfb CFB; component factor B [EC:3.4.21.47] K01335

Irf7 IRF7; interferon regulatory factor 7 K09447

Cybb NOX, GP91; NADPH oxidase K08008

Fyb RICTOR; rapamycin-insensitive companion of mTOR K08267

Il1b IL1B; interleukin 1 beta K04519

Oxt OXT; oxytocin-neurophysin 1 K05243

Clec4a1 CLEC4A; C-type lectin domain family 4 member A K10057

Ccl2 CCL2, MCP1; C-C motif chemokine 2 K14624

Socs3 SOCS3, CIS3; suppressor of cytokine signaling 3 K04696

Cfp CFP; complement factor properdin K15412

Cldn2 CLDN; claudin K06087

C1qa C1QA; complement C1q subcomponent subunit A K03986

Ncf4 NCF4, P40PHOX; neutrophil cytosolic factor 4 K08012

Il1rn IL1RN, IL1F3; interleukin 1 receptor antagonist K05481

Ifi47 IFI47; interferon gamma inducible protein 47 K17072

Dhx58 DHX58, LGP2; ATP-dependent RNA helicase DHX58 [EC:3.6.3.14] K12649

Folr2 FOLR; folate receptor K13649

Fonte: Autor.

194

Tabela 17 - Termos de KO identificados de genes diferencialmente expressos para o grupo AS-Gc, em relação ao grupo Sham

Gene Descrição KO

Npy NPY2R; neuropeptide Y receptor type 2 K04205

Aqp1 AQP1; aquaporin-1 K09864

Slc4a5 SLC4A4, NBC1; solute carrier family 4 (sodium bicarbonate cotransporter), member 4 K13575

Klrk1 KLRK1; killer cell lectin-like receptor subfamily K member 1 K06728

Slco1a5 SLCO1A; solute carrier organic anion transporter family, member 1A K03460

Rps6 RP-S6e, RPS6; small subunit ribosomal protein S6e K02991

Tnfrsf14 TNFRSF14, HVEM; tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 K05152

Mrpl30 RP-L30, MRPL30, rpmD; large subunit ribosomal protein L30 K02907

Mrpl30 RP-L30, MRPL30, rpmD; large subunit ribosomal protein L30 K02907

Clic6 CLIC6; chloride intracellular channel protein 6 K05026

Mx1 LMX1; LIM homeobox transcription factor 1 K09371

Kl KL; klotho [EC:3.2.1.31] K14756

F5 F5; coagulation factor V (labile factor) K03902

Cxcl13 CXCL13; C-X-C motif chemokine 13 K10032

Cd74 CD74, DHLAG; CD74 antigen K06505

Igf2 IGF2; insulin-like growth factor 2 K13769


Gnat2 GNAT; guanine nucleotide-binding protein G(t) subunit alpha K04631

Fonte: Autor.

195

Tabela 18 - Termos de KO identificados de genes diferencialmente expressos para o grupo AS-Gc, em relação ao grupo 6-OHDA

Gene Descrição KO

Pclo PCLO; protein piccolo K16882

Aqp1 AQP1; aquaporin-1 K09864

Slc4a5 SLC4A5, NBC4; solute carrier family 4 (sodium bicarbonate cotransporter), member 5 K13857

Slco1a5 SLCO1A; solute carrier organic anion transporter family, member 1A K03460

Rps6 RP-S6e, RPS6; small subunit ribosomal protein S6e K02991

Gh1 GH; growth hormone K05438

Clic6 CLIC6; chloride intracellular channel protein 6 K05026

Kl KL; klotho [EC:3.2.1.31] K14756

Tnr TN; tenascin K06252

F5 F5; coagulation factor V (labile factor) K03902


Hprt1 hprT, hpt, HPRT1; hypoxanthine phosphoribosyltransferase [EC:2.4.2.8] K00760

Fonte: Autor.

196

Tabela 19 - Mapa KEGG identificados de genes diferencialmente expressos para o grupo 6-

OHDA, em relação ao grupo Sham

Identificação do Mapa KEGG

Descrição (número de genes identificados)

ko05168 Herpes simplex infection (7)

ko04060 Cytokine-cytokine receptor interaction (7)

ko05150 Staphylococcus aureus infection (7)

ko05164 Influenza A (6)

ko04670 Leukocyte transendothelial migration (5)

ko04668 TNF signaling pathway (5)

ko05142 Chagas disease (American trypanosomiasis) (5)

ko05323 Rheumatoid arthritis (5)

ko04380 Osteoclast differentiation (5)

ko04610 Complement and coagulation cascades (5)

ko04062 Chemokine signaling pathway (4)

ko05133 Pertussis (4)

ko05322 Systemic lupus erythematosus (4)

ko05160 Hepatitis C (4)

ko05162 Measles (4)

ko05020 Prion diseases (4)

ko05144 Malaria (3)

ko04650 Natural killer cell mediated cytotoxicity (3)

ko05140 Leishmaniasis (3)

ko04145 Phagosome (3)

ko04622 RIG-I-like receptor signaling pathway (3)

ko04514 Cell adhesion molecules (CAMs) (3)

ko04810 Regulation of actin cytoskeleton (2)

ko04932 Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) (2)

ko04210 Apoptosis (2)

ko04630 Jak-STAT signaling pathway (2)

ko04015 Rap1 signaling pathway (2)

ko04010 MAPK signaling pathway (2)

ko05416 Viral myocarditis (2)

ko04620 Toll-like receptor signaling pathway (2)

ko05152 Tuberculosis (2)

ko04064 NF-kappa B signaling pathway (2)

ko04640 Hematopoietic cell lineage (2)

ko04623 Cytosolic DNA-sensing pathway (2)

ko04621 NOD-like receptor signaling pathway (2)

ko04664 Fc epsilon RI signaling pathway (1)

ko05203 Viral carcinogenesis (1)

ko05134 Legionellosis (1)

ko04921 Oxytocin signaling pathway (1)

197

ko05210 Colorectal cancer (1)

ko04530 Tight junction (1)

ko04930 Type II diabetes mellitus (1)

ko05212 Pancreatic cancer (1)

ko04940 Type I diabetes mellitus (1)

ko04024 cAMP signaling pathway (1)

ko04144 Endocytosis (1)

ko04672 Intestinal immune network for IgA production (1)

ko05161 Hepatitis B (1)

ko04120 Ubiquitin mediated proteolysis (1)

ko05010 Alzheimer's disease (1)

ko04666 Fc gamma R-mediated phagocytosis (1)

ko05321 Inflammatory bowel disease (IBD) (1)

ko05132 Salmonella infection (1)

ko05169 Epstein-Barr virus infection (1)

ko04150 mTOR signaling pathway (1)

ko04066 HIF-1 signaling pathway (1)

ko04370 VEGF signaling pathway (1)

ko05146 Amoebiasis (1)

ko05200 Pathways in cancer (1)

ko05143 African trypanosomiasis (1)

ko05166 HTLV-I infection (1)

ko04520 Adherens junction (1)

ko04917 Prolactin signaling pathway (1)

ko04360 Axon guidance (1)

ko04014 Ras signaling pathway (1)

ko04662 B cell receptor signaling pathway (1)

ko04920 Adipocytokine signaling pathway (1)

ko04910 Insulin signaling pathway (1)

ko04510 Focal adhesion (1)

ko05332 Graft-versus-host disease (1)

ko05231 Choline metabolism in cancer (1)

ko04750 Inflammatory mediator regulation of TRP channels (1)

ko04310 Wnt signaling pathway (1)

Fonte: Autor.

198

Tabela 20 - Mapa KEGG identificados de genes diferencialmente expressos para o grupo AS-

Gc, em relação ao grupo Sham

Identificação do Mapa KEGG Descrição (número de genes identificados)

ko04976 Bile secretion (3)

ko04060 Cytokine-cytokine receptor interaction (2)

ko04964 Proximal tubule bicarbonate reclamation (2)

ko05168 Herpes simplex infection (2)

ko03010 Ribosome (2)

ko05205 Proteoglycans in cancer (2)

ko00500 Starch and sucrose metabolism (1)

ko05152 Tuberculosis (1)

ko00040 Pentose and glucuronate interconversions (1)

ko01100 Metabolic pathways (1)

ko04062 Chemokine signaling pathway (1)

ko05144 Malaria (1)


ko04650 Natural killer cell mediated cytotoxicity (1)



ko04744 Phototransduction (1)





ko04612 Antigen processing and presentation (1)

ko04972 Pancreatic secretion (1)

ko04961 Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption (1)

ko04080 Neuroactive ligand-receptor interaction (1)


Fonte: Autor.

199

Tabela 21 - Mapa KEGG identificados de genes diferencialmente expressos para o grupo AS-

Gc, em relação ao grupo 6-OHDA

Identificação do Mapa KEGG Descrição (número de genes identificados)

ko04976 Bile secretion (3)

ko04151 PI3K-Akt signaling pathway (3)

ko01100 Metabolic pathways (2)

ko00500 Starch and sucrose metabolism (1)

ko05206 MicroRNAs in cancer (1)

ko00040 Pentose and glucuronate interconversions (1)

ko04911 Insulin secretion (1)

ko00230 Purine metabolism (1)




ko04510 Focal adhesion (1)

ko04964 Proximal tubule bicarbonate reclamation (1)





ko04512 ECM-receptor interaction (1)

ko04961 Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption (1)

ko03010 Ribosome (1)

ko05205 Proteoglycans in cancer (1)

ko00983 Drug metabolism - other enzymes (1)

ko04080 Neuroactive ligand-receptor interaction (1)


ko01110 Biosynthesis of secondary metabolites (1)

Fonte: Autor.

200

Figura 53 - Mapa KEGG da via de sinalização de TNF

Fonte: Kanehisa Laboratories. Legenda: Em vermelho, são indicados os genes alterados no transcriptoma do grupo 6-OHDA, em relação ao grupo Sham.

201

Figura 54 - Mapa KEGG da via de sinalização de Quimiocinas

Fonte: Kanehisa Laboratories. Legenda: Em vermelho, são indicados os genes alterados no transcriptoma do

grupo 6-OHDA, em relação ao grupo Sham.

202

Figura 55 - Mapa KEGG da via de sinalização de receptores de citocinas



203

Figura 56 - Mapa KEGG da via de sinalização para migração transendotelial de leucócitos



204

Figura 57 - Mapa KEGG da via de sinalização de apoptose



205

Figura 58 - Mapa KEGG da via de sinalização da doença de Alzheimer

Fonte: Kanahisa Laboratories. Legenda: Em vermelho, são indicados os genes alterados no transcriptoma do


206

Figura 59 - Mapa KEGG da via de sinalização da doença de Príon



207

Figura 60 - Mapa KEGG da via de sinalização de cascatas de complemento e coagulação



208

Figura 61 - Mapa KEGG da Diabetes mellitus tipo II



209

Figura 62 - Mapa KEGG da via de sinalização de secreção

biliar


grupo AS-Gc, em relação ao grupo 6-OHDA.

210

Figura 63 - Mapa KEGG da via de metabolismo de drogas e outras enzimas



Figura 64 - Mapa KEGG da via de interação de receptores de neuroativos ligantes



211

Figura 65 - Mapa KEGG da via de sinalização de proteoglicanos em câncer



212

24 DISCUSSÃO

O presente estudo mostra, pela primeira vez na literatura, os efeitos neuroprotetores

de um polissacarídeo sulfatado isolado de alga marinha através da regulação de vias de

expressão de genes, estas alteradas pela presença de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) em corpo

estriado de ratos. Adicionalmente, este é o primeiro trabalho que demonstra a atividade da

neurotoxina 6-OHDA sobre vias de ação a nível intranuclear, em neurônios encontrados em

corpo estriado de ratos submetidos a modelo experimental de doença de Parkinson, revelando

potenciais mecanismos de ação desta neurotoxina para a indução do processo

neurodegenerativo.

Complementando a técnica de análise de expressão de genes por qPCR, o presente

estudo buscou obter o máximo de dados possíveis com eficiência e qualidade sobre os efeitos

neuroprotetores de AS-Gc a nível transcricional, por este motivo, optou-se por realizar uma

análise global de genes alterados em corpo estriado de ratos utilizados neste estudo.

Para analisar a expressão global de genes envolvidos na ação neuroprotetora de AS-

Gc contra 6-OHDA, realizou-se as análises transcriptômicas por Sequenciamento de Próxima

Geração (NGS). A análise transcriptômica por NGS é uma ferramenta do campo da biologia

molecular a nível trascricional com uma resolução que permite investigações comparativas

entre espécies e em diversas condições específicas de interesse científico, como em eventos

patológicos (HOEIJMAKERS; BÁRTFAI; STUNNENBERG, 2013; NA et al., 2014;

LENNINGTON et al., 2014).

De acordo com as análises dos dados obtidos foram possíveis identificar diferenças

significativas no perfil transcriptômico entre os grupos analisados (Sham, 6-OHDA e AS-Gc).

Dentre estas alterações, podem-se destacar uma modulação na expressão de 78 genes/LOCs,

quando comparado a animais não submetidos a neurotoxina, apresentando, em sua maioria,

uma regulação negativa da expressão destes genes (Tabela 10). Um achado interessante é que

a presença da neurotoxina em corpo estriado de ratos promoveu alterações em um número

relativamente pequeno de genes/LOCs (78), quando comparado ao número global de genes

identificados (37.779 genes/LOCs). Possivelmente, este efeito modulatório na diminuição da

expressão gênica, induzido por esta neurotoxina, sobre um número relativamente pequeno e

talvez específico de genes, quando comparado ao número total de genes identificados, pode

ser sugestiva de que a atividade neurodegenerativa de 6-OHDA envolve mecanismos de ação

específicos para indução de apoptose.

213

De acordo com Bernstein e colaboradores (2011), devido a estrutura de 6-OHDA ser

um análogo hidroxilado da dopamina, esta possui uma ação específica para neurônios

dopaminérgicos, ocasionando danos no DNA e a indução de vias transcricionais relacionadas

a processos tóxicos em modelos in vivo e in vitro e, assim, apresentando uma atividade

apoptótica.

Entre os genes identificados neste estudo que apresentaram uma modulação positiva

por 6-OHDA, foram os genes Orm1, Selplg e Rps15a14 (Tabela 10).

De acordo com Breslow e colaboradores (2010), o gene Orm1, conhecido como

glicoproteína 1 ácida 1α, codifica uma proteína de mesmo nome que está relacionada a

inflamação aguda. Apesar, a função específica desta proteína ainda não está esclarecida, o

aumento dos níveis de RNAm desse gene está associado a uma desregulação do metabolismo

de esfingolipídios, inibindo a produção destas moléculas. Por sua vez, esses lipídeos

apresentam papel essencial na estrutura celular e funções sinalizatórias, por isso, alterações

nos níveis de esfingolipídios estão associados a desordens neurodegenerativas, como nas

doenças de Alzheimer, Huntington e Parkinson (ZHAO et al., 2011).

A Selpl1 (glicoproteína ligante 1 de selectina P) é um receptor de alta afinidade de

selectina P em células mielóides, que possui como função biológica o recrutamento de

leucócitos em tecidos inflamados (FURIE; FURIE, 2004; LEE; CHAIT; KIM, 2012).

Rps15a14 é uma proteína ribossomal constituinte da unidade 40S, que tem sido

encontrado ativado em diversos tipos de tumores, como insulimonas, câncer esofágico e

câncer de cólon e, recentemente, associado com o processo neurodegenerativo durante a

doença de Parkinson (MARTIN et al., 2014).

De acordo com as análises de ontologia genética, os 78 genes/LOCs modulados em

ratos submetidos a 6-OHDA apresentaram-se envolvidos com 736 termos de GO,

respectivamente, relacionados com funções moleculares, composição celular e processos

biológicos (Gráfico 6). Dentre estes termos de GO, podem-se destacar os identificados

somente em animais submetidos a neurotoxina e não tratados com AS-Gc, como a modulação

de genes relacionados a funções moleculares relacionados as atividades catalíticas e de

receptores transmembranares; a modulação de genes relacionados composição celular, como

atividades ativadoras de enzimas, regiões extracelulares e junção celular; e a modulação de

genes relacionados a processos biológicos, como na secreção de insulina. Assim, os

resultados obtidos sugerem que o mecanismo de ação da 6-OHDA desencadeia um processo

apoptótico que afeta o neurônio dopaminérgico em diversos níveis celulares, que pode estar

promovendo alterações funcionais e estruturais, não somente neste tipo de neurônio, mas em

214

todas as células do corpo estriado. Estes dados corroboram com a descrição do mecanismo de

ação neurodegenerativo da 6-OHDA, que envolve principalmente o estresse oxidativo e que,

além de alterações transcricionais, desencadeia desordens no metabolismo e estruturas

neuronais (SOLIS et al., 2007; ELKON; MELAMED; OFFEN, 2014).

Entre os outros mecanismos que podem induzir a neurodegeneração, pode-se citar o

processo neuroinflamatório (SEKIYAMA et al., 2012). De acordo com as análises, foram

identificados genes e, possivelmente, vias relacionadas ao processo neuroinflamatório

induzido por esta neurotoxina (Tabela 16). Dentre as vias com genes modulados pela 6-

OHDA identificadas, podem-se citar as vias de sinalização de TNF (Figura 53), quimiocinas

(Figura 54) e citocinas (Figura 55), bem como para a migração de leucócitos (Figura 56) e

sinalização de apoptose (Figura 57). Estes achados corroboram com dados da literatura que

reportam que a 6-OHDA possui um mecanismo neurodegenerativo que envolve a indução de

processos neuroinflamatórios (MAIA et al., 2012).

Em adição, também foram identificados genes pertencentes a vias relacionadas

doenças de Alzheimer (Figura 58), de Príon (Figura 59) e de diabetes mellitus tipo II (Figura

61), e ainda a sinalização de cascatas de complemento e coagulação (Figura 60). Estes dados

sugerem que o uso da 6-OHDA, além de ser utilizado para a indução do modelo de doença de

Parkinson em ratos, apresenta um potencial em apresentar alguns achados moleculares

reportados em outras doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer ou doença de

Príon, bem como, possivelmente, para desenvolvimento de modelos de coagulação e diabetes.

Entretanto, outros estudos devem ser realizados para se investigar o uso desta neurotoxina

para estas potenciais implicações.

Entre os mapas KEGG identificados, a via da diabetes mellitus tipo II foi um achado

interessante. Pois, de acordo com Aviles-Olmos e colaboradores (2012), existe uma

correlação entre doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, e o diabetes

mellitus tipo II, associado a disfunções mitocondriais e, como identificado no presente estudo,

a alterações transcricionais induzidas por 6-OHDA.

Em contrapartida dos achados transcricionais relatados até o momento, ratos tratados

com AS-Gc apresentaram uma menor alteração significativa de genes (44), em relação ao

grupo Sham (Tabela 11). Entre os genes regulados positivamente em ratos tratados com AS-

Gc, e não identificados no grupo 6-OHDA, pode-se citar o Ttr.

De acordo com Li e colaboradores (2013), Ttr (gene da transtirretina) codifica uma

proteína de mesmo nome que está relacionada ao transporte do hormônio tiroxina (T4) e

proteínas ligantes a retinol através do sangue ou no líquido cefalorraquidiano. De acordo com

215

o autor, Ttr possui uma função importante, que é inibir a formação do acúmulo de peptídios β-

amilóide, que por sua vez está associado a doença de Alzheimer.

Entre os genes regulados positivamente por AS-Gc, em relação ao grupo 6-OHDA,

podem-se citar o Gh1 e a Hprt1 (Tabela 12).

De acordo com Garperi e castellano (2010), Gh1 (hormônio ou fator de crescimento

1) é um hormônio que auxilia na manutenção do crescimento de tecidos e também está

envolvido na produção de proteínas e na quebra de lipídeos e carboidratos. Os autores

reportam que a deficiência nos níveis de Gh1 é um fator que contribui para a patogênese de

doenças neurodegenerativas.

Segundo Narsinh e Wu (2010), Hprt1 (hipoxantina-guanina fosforibosil transferase)

é uma enzima que possui um papel central na geração de purinas, catalisando a conversão de

hipoxantina para inosina monofosfato e guanina para guanosina monofosfato. De acordo com

o autor, a deficiência dessa enzima está relacionada a síndrome de Lesch-Nyhan, uma sídrome

metabólica rara que promove alterações comportamentais e retardo mental.

Estes resultados sugerem que o efeito neuroprotetor de AS-Gc está possivelmente

associado a indução de vias transcriptômicas relacionados a inibição da agregação de

peptídios β-amilóide, e homeostase da produção de hormônio de crescimento e geração de

purinas.

Corroborando com estes achados, os resultados da análise da ontologia genética

apresentaram resultados relativamente similares entre os grupos AS-Gc e 6-OHDA,

entretanto, foi notório uma redução da quantidade total de termos de GO identificados no

grupo AS-Gc (450), em relação ao grupo 6-OHDA (736) (Gráfico 6) reforçando a hipótese de

que AS-Gc possui um mecanismo de ação neuroprotetor que atua na regulação da homeostase

celular, reduzindo alterações transcricionais induzidas pela neurotoxina.

As análises de possíveis vias atuantes no mecanismo de ação de AS-Gc identificaram

genes envolvidos com o transporte de ácidos biliares e de água (Figura 62).

De acordo com Mantopoulos e colaboradores (2011), ácidos biliares estão associados

com a diminuição do estresse oxidativo e da atividade de caspases, o que pode auxiliar contra

processos apoptóticos.

Segundo Foglio e Fabrizio (2010), o transporte de água das células é realizado

através de poros formados por canais proteicos denominados de aquaporinas, e a deficiência

dessas proteínas são relacionados com várias doenças humanas, como doenças cardíacas,

edemas cerebrais, diabetes insípida nefrogênica e doenças neurodegenerativas, como doença

de Alzheimer, Parkinson e Esclerose amiotrófica lateral (ELA). Dentre estas proteínas, pode-

216

se citar a aquaporina 1 (AQP1), que é uma aquaporina amplamente expressa em células e tem

sido relatada por estar associada a doença de Azheimer. De acordo com os autores, alterações

na expressão de AQP1 em condições de processo neurodegenerativo podem ser um risco para

a condição de homeostase cerebral.

Outro mapa KEGG identificado foi uma sinalização relacionada ao metabolismo da

droga azatioprina (Figura 63). Esta droga é um análogo sintético da purina utilizada na

medicina devido a suas propriedades antileucêmicas, anti-inflamatórias e imunossupressoras

(DUBINSKY, 2004). Possivelmente, a identificação desta via transcricional está relacionada a

ativação de purinas mencionado anteriormente por AS-Gc.

Um achado interessante neste estudo foi a identificação de um gene presente em uma

via ativada pelos polissacarídeos sulfatados, condroitam e dermatam sulfato, a via

PIK3/AKT/mTOR, uma importante via de sinalização de regulação do ciclo celular associada

a sobrevivência e proliferação celular e, recentemente, a atividade neuroprotetora em ratos

(ZHANG et al., 2014).

Lee e colaboradores (2012) relata um efeito anti-metastático de um polissacarídeo

sulfatado, do tipo fucoidana, isolado da alga marinha parda Fucus vesiculosus, atuando via

PIK3/AKT/mTOR. Assim, pode-se sugerir que polissacarídeos sulfatados isolados de algas

marinhas, como o AS-Gc, poderiam atuar em um mecanismo de ação similar a

polissacarídeos sulfatados normalmente produzidos no cérebro, como o dermatan/condroitam

sulfato, e a presença destes polissacarídeos atuariam na regulação da homeostase celular.

Apesar disso, análises complementares são necessárias para se determinar o mecanismo de

ação neuroprotetor de AS-Gc contra 6-OHDA em ratos.

No presente estudo, também foram identificados e analisados LOCs, sequências de

genes com função biológica ainda não determinadas. Identificaram-se cerca de 15.977 LOCs,

sendo 21 LOCs apresentando-se diferencialmente expressos no grupo 6-OHDA e 17 LOCs no

grupo AS-Gc, respectivamente, em relação ao Sham (Tabelas 13 e 14). Apesar de não

apresentarem funções biológicas bem definidas, foram possíveis identificar LOCs, modulados

pela neurotoxina, relacionados a codificação de imunoglobulinas e proteínas constituintes de

ribossomos, sugerindo uma diminuição da resposta imune do organismo e ativação de vias

por quinases. Por outro lado, apesar do grupo tratado com AS-Gc apresentar resultados

relativamente similares ao grupo 6-OHDA, não conseguindo reduzir os efeitos da neurotoxina

sobre a modulação da produção de imunoglobulinas e proteínas ribossomais, houve uma

indução de um LOC associado a HPRT, com importância e função descrita anteriormente, e

para o LOC identificado como S6, associado a via PIK3/AKT/mTOR, também mencionada

217

anteriormente. Estes dados corroboram para uma atribuição funcional para os LOCs

modulados, auxiliando para suas descrições de funções biológicas preliminarmente reportadas

no genebank.

Resumidamente, as análises transcricionais por NGS, realizadas no presente estudo,

sugerem que a atividade neuroprotetora de AS-Gc contra a neurotoxina, 6-OHDA, atua

através de uma manutenção da homeostase celular, por um possível mecanismo de ação a

nível transcricional, modulando genes envolvidos na inibição da agregação de peptídios β-

amilóide, na produção do hormônio de crescimento Gh1, na via de geração de purinas, no

transporte de ácidos biliares, na regulação de transporte de água intracelular pela expressão de

aquaporina 1 e atuando na regulação da via PIK3/AKT/mTOR. Adicionalmente, LOCs foram

identificados e o presente estudo pode auxiliar na atribuição de suas respectivas funções

biológicas e, possivelmente, uma associação de efeito/resposta a presença da neurotoxina e

AS-Gc.

Em adição, pode-se observar diferenças nos genes diferencialmente expressos

identificados entre as técnicas de qPCR, descritos no capítulo anterior, e NGS. Possivelmente

a diferença dos parâmetros de normalização, seleção de dados, identificação de diferenças de

expressão entre estas duas técnicas pode ter influenciado na discriminação dos resultados

obtidos. Entretanto, a qPCR é uma técnica mais sensível e quantitativa para a detecção da

expressão de genes-alvos específicos e, portanto, fornece maior confiabilidade nos dados.

Apesar disso, a NGS é uma técnica qualitativa que fornece um maior banco de dados que

auxiliam na compreensão global da genética funcional relacionada a eventos e locais

específicos. Desta forma, ambas as técnicas complementam-se na obtenção de dados

genéticos para a elucidação de mecanismos transcriptômicos.

218

25 CONCLUSÃO

O presente estudo revela que a agarana sulfatada (AS-Gc) possui efeito neuroprotetor

contra alterações na expressão de genes induzidos por 6-OHDA, promovendo uma

manutenção da homeostase da expressão dos genes analisados. Adicionalmente, e

corroborando com os achados por qPCR, as análises por NGS permitiram a identificação de

vias transcricionais possivelmente associadas a atividade neurodegenerativa induzida por 6-

OHDA e a neuroprotetora atribuída ao polissacarídeo sulfatado da alga marinha vermelha G.

cornea.

219

26 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS

A presente tese de doutorado em Bioquímica descreve em quatro capítulos inovações

tecnológicas e novas implicações farmacológicas voltadas para a pesquisa básica,

relacionadas ao estudo de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas. Dentre estas

inovações e achados inéditos na literatura, podem-se citar:

Uma nova abordagem metodológica para a obtenção de polissacarídeos sulfatados,

entre outras moléculas de interesse científico, para possíveis aplicações biotecnológicas e/ou

farmacológicas futuras;

A potencial aplicação de modelos neuropsicofarmacológicos clássicos para avaliação

da segurança farmacológica do uso de polissacarídeos sulfatados, por diferentes vias de

administração, em modelos in vivo;

A descrição de novos efeitos biológicos, relacionados a atividade neuroprotetora a

nível central e sistêmico, para polissacarídeos sulfatados de algas em modelos in vivo e in

vitro;

O primeiro relato do transcriptoma de corpo estriado de ratos submetidos a

neurotoxina, 6-hidroxidopamina (6-OHDA);

A primeira descrição de um transcriptoma relacionado aos efeitos de um

polissacarídeo sulfatado de alga;

A apresentação de um possível mecanismo de ação neuroprotetor de uma agarana

sulfatada em modelo experimental de doença de Parkinson, com potencial implicações

neurofarmacológicas para o tratamento deste distúrbio neurodegenerativo.

220

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ANEXOS

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Acta Scientiarum. Biological Science Maringá, v. 37, n. 1, p. 31-39, Jan.-Mar., 2015

Analysis of two precipitation methods on the yield, structural features and activity of sulfated polysaccharides from Gracilaria cornea (Rhodophyta)

Ricardo Basto Souza1, Ismael Nilo Lino de Queiroz2, Antônio Alves da Silva Neto1, José Gerardo Carneiro3, José Ariévilo Gurgel Rodrigues2 and Norma Maria Barros Benevides1* 1Laboratório de Carboidratos e Lectinas, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Av. Mister Hull, s/n, Bloco 907, 60455-970, Fortaleza, Ceará, Brazil. 2Laboratório de Tecido Conjuntivo, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil. 3Instituto Federal do Ceará, Acaraú, Ceará, Brazil. *Author for correspondence. E-mail: [email protected]

ABSTRACT. The global demand for natural products from seaweeds has increased worldwide; however, no description of the use of isoamly alcohol (IAA) for obtaining of sulfated polysaccharides (SPs) has been reported. We investigated the efficiency of two precipitation methods (M) in obtaining SPs from the red seaweed Gracilaria cornea. SPs enzymatically isolated were concentrated with cetylpyridinium chloride (M I) or IAA (M II) and extracts were examined with regard to their yield, structural features and in vitro effects on the activated partial thromboplastin time (APTT) using normal human plasma and standard heparin (193 IU mg-1). Yield difference reached 12.99%. Quantitative determination of sulfate was similar between the two methods (̴ 26%), but extracts revealed different pattern on charge density by agarose gel electrophoresis. Whereas both extracts revealed as agarocolloids, alternative M II was also efficient for lipids, proteins and nucleic acids according to the infrared analysis. Extracts had virtually no effect on APPT (1.95 and 2 IU mg-1 for M I and M II, respectively). The results revealed IAA as an alternative solvent for obtaining SPs from the red seaweed G. cornea, depending on the industry’ usage criterion. Keywords: Rhodophyceae, polysulfated, precipitation methods, structural analysis, APTT test.

Análise de duas metodologias de precipitação sobre o rendimento, características estruturais e atividade de polissacarídeos sulfatados de Gracilaria cornea (Rhodophyta)

RESUMO. A demanda global de produtos naturais de algas marinhas tem aumentado mundialmente. Entretanto, a obtenção de polissacarídeos sulfatados (PSs) com álcool isoamílico (AIA) não é relatada. Investigou-se a eficiência de dois métodos (M) de precipitação de PSs da alga marinha vermelha Gracilaria cornea. Os PSs isolados enzimaticamente foram concentrados com cloreto cetilpiridimínio (M I) ou AIA (M II). Os extratos foram examinados, segundo seu rendimento, características estruturais e efeitos in vitro sobre o tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) usando plasma humano normal e heparina padrão (193 UI mg-1). A diferença nos rendimentos foi 12,99% e semelhante determinação quantitativa de sulfato foi obtida entre os métodos ( ̴ 26%). A eletroforese em gel de agarose revelou diferenças em termos de densidade de cargas entre os extratos. Enquanto ambos os extratos revelaram agarocoloides, o método M II também se mostrou alternativo para lipídios, proteínas e ácidos nucleicos de acordo com a análise de infravermelho. Os extratos praticamente não modificaram o TTPA (1,95 e 2 UI mg-1 para M I e M II, respectivamente). Os resultados revelaram AIA como um solvente alternativo para obtenção de PSs da alga marinha vermelha G. cornea, dependendo do critério de utilização na indústria. Palavras-chave: Rhodophyceae, polissulfatados, métodos de precipitação, análise estrutural, teste do TTPA.

Introduction

The global demand for chemical metabolites derived from seaweeds has increased worldwide, especially sulfated polysaccharides (SPs). Agar and carrageenans are the most common sources of commercially important red seaweeds SPs (PEREIRA; COSTA-LOTUFO, 2012). These SPs differ on their stereochemistry, specifically galactans

with 4-linked-α-galactose residues of the L-series are termed agarans and those of the D-series are termed carrageenans (Figure 1) (CARDOZO et al., 2007; CAMPO et al., 2009; PRAJAPATI et al., 2014).

An increasing demand based on their applications has been widely preferred over the synthetic polymers because seaweeds SPs are inert, safe, non-toxic, biocompatible, biodegradable and low cost (PRAJAPATI et al., 2014).

32 Souza et al.


-

-

O

O

O

OSO3

OOH

OSO3

OO

-

OH

HO

OSO3O O

OSO3

OOH

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-

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-OSO3

HO

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-

-

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O

O

OH

OO

OSO3

OO

OSO3- -

OH-

EnzymeMu-carrageenan

Kappa-carrageenan

OH-

Enzyme

OH-

Nu-carrageenanIota-carrageenan

Lambda-carrageenan Theta-carrageenan

A

O

OH

HO

O

CH2OR

HOO

R'OH2C O

OR''

B

R = H or CH3

R’ = H or SO3-

R’’ = H or CH3

Figure 1. Chemical structures of Mu (μ)-, (Nu (ν)-, Lambda (λ)-, Kappa (κ)-, Iota (ι)- and Theta (θ)-carrageenans (A) and agar (B). Polysaccharides are formed by alternate units of D-galactose and 3,6-anhydro-D-galactose (A) or D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose (B) joined by α-1,3 and β-1,4-glycosidic linkage. Source: Cardozo et al. (2007) and Campo et al. (2009).

Furthermore, their rheological (e.g., gelling, thickening and stabilizing) (CARDOZO et al., 2007; CAMPO et al., 2009) and pharmacological (e.g., anticoagulation, antiviral, antinociceptive and anti-inflammatory) (MAZUMDER et al., 2002; RODRIGUES et al., 2009; QUINDERÉ et al., 2013) applications have attracted more and more attention by pharmaceutical companies and scientists in recent times (CARDOZO et al., 2007; ARAÚJO et al., 2012; PRAJAPATI et al., 2014).

Rhodophyceae biosynthesize high amounts of SPs (RODRIGUES et al., 2009; ARAÚJO et al., 2012) compared with Chlorophyceae (RODRIGUES et al., 2011c, 2012) and Phaeophyceae (POMIN; MOURÃO, 2008; SIQUEIRA et al., 2011) and other natural sources (AQUINO et al., 2005; POMIN; MOURÃO, 2008; DANTAS-SANTOS et al., 2012; CHANG et al., 2013). The genera Hypnea, Chondrus, Eucheuma, Gigartina, Kappaphycus (carragenophytes) (CAMPO et al., 2009) and Gracilaria (agarophyte) (CARDOZO et al., 2007) of edible red seaweeds have been widely exploited in large scale to supply SPs to the industries. Their structures vary with algal species (MAZUMDER et al., 2002; POMIN, 2012; QUINDERÉ et al., 2014), but the quality and the specific physical and chemical and biological aspects can vary depending on harvest time and collection site of the algae, as well as the techniques used, such as extraction protocols and precipitation solvents (RODRIGUES et al., 2009, 2011a; YAICH et al., 2013). During the industrial processing, some factors, such as yield and purity, have also been considered as attributes of quantity and quality

(CAMPO et al., 2009; PRAJAPATI et al., 2014; MORONEY et al., 2015), considering the difficulty in the standardization of a commercial product (PEREIRA; COSTA-LOTUFO, 2012).

Heparin (HEP) is a SP member of a family of glycosaminoglycans commercially extracted from pig or bovine tissue and is widely used in anticoagulant therapy, especially in extracorporeal circulation. By contrast, its prolonged administration cause several adverse consequences (e.g., hemorrhage and thrombocytopenia) (NADER et al., 2001), encouraging the search for new surrogates from different natural origins (POMIN; MOURÃO, 2008; RODRIGUES et al., 2009, 2011b; DANTAS-SANTOS et al., 2012; POMIN, 2012).

Isoamly alcohol (IAA) (3-methyl-1-butanol) is a clear and colorless liquid, very soluble in organic compounds (LIDE, 1998). In the food industry, it is commonly found as a final product in fermentation processes and milk beverages (MAMEDE; PASTORE, 2004). Furthermore, it is also usually employed in scientific studies to obtain cell components, such as DNA, lipids and proteins (YEH; CHEN, 2004; OLIVIERI et al., 2012; EL BAZ et al., 2013), and other industrial processes, including hydraulic and lube oil additives, frothing agent in mineral dressing applications and crude oil recovery processes (LIDE, 1998). To the best of our knowledge, there are no studies concerning the employment of this solvent to obtain seaweeds SPs.

Gracilaria cornea J. Agardh (Gracilariales, Gracilariaceae) is a red seaweed widely found along the Brazilian coast. The biotechnological importance

Industrial solvents to obtain seaweed polysaccharides 33


of this species has been recognized (LIMA et al., 2005; VALENTE et al., 2006; SOUZA et al., 2011). Melo et al. (2002) enzymatically extracted a crude polysaccharide fraction containing a agar consisting of 3,6-anhydro-α-L-galactose, with minor occurrence of 6-O-methyl-galactose, glucose, xylose and sulfated radicals. A subsequent study from Coura et al. (2012) revealed that this biopolymer had in vivo antinociceptive and anti-inflammatory effects, without toxicological significance in mice. This study analyzed two precipitation methods using cetylpyridinium chloride or IAA on the yield, structural features and the possible effect in vitro on coagulation of the crude SPs extracts. A structural analysis of lipids and other chemical components was also conducted.

Material and methods

Seaweed and isolation of SPs

Samples of G. cornea were collected on the seashore from the Flecheiras Beach, Trairí, Ceará State, Northeastern Brazil. After collection, specimens were taken to Carbohydrates and Lectins Laboratory (CarboLec), Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceará, and then cleaned of epiphytes, washed with distilled water and stored at -20°C until use. A voucher specimen (#34739) was deposited in the Herbarium Prisco Bezerra in the Department of Biological Sciences, Federal University of Ceará, Brazil. The SPs were obtained through two different protocols, from dehydrated algal tissue (5 g, 25°C) cut into small pieces (COURA et al., 2012). This study did not involve endangered or protected species and was conducted in accordance with the law MP 2.186-16/2001, number resolution 29 of the Dispatch Component of Genetic Patrimony (CGEN).

Method I (M I)

Crude SPs were extracted by papain digestion (6h, 60°C) (Vetec Química, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro State, Brazil) in 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) containing cysteine (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri State, USA) and EDTA (both 5 mM). Then, the material was filtered, centrifuged (2,725 × g, 4°C, 30 min.) and then 50 mL of 10% cetylpyridinium chloride (CPC) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) were added to the supernatant for precipitation of the SPs (24h, 25°C) as previously described by Coura et al. (2012).

Method II (M II)

Crude SPs were extracted by papain digestion (6h, 60°C) (Vetec Química, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro State, Brazil) in 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) containing cysteine (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri State, USA) and EDTA (both 5 mM) (COURA et al., 2012). Then, the material was filtered, centrifuged (2,725 × g, 4°C, 30 min.) and 50 mL of IAA (Vetec Química, Rio do Janeiro, Rio de Janeiro State, Brazil) were added to the supernatant for precipitation of the SPs (24h, 25ºC).

Crude SPs extracts obtained by the two methods were centrifuged, redissolved in distilled water, dialyzed against distilled water for 24 h (47 × 27 mm cellulose membrane, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri State, USA), and then freeze-dried (Labconco FreeZone 4.5 apparatus) (COURA et al., 2012). Yields (%) of crude SPs extracts were calculated as the percentage of dehydrated matter (ARAÚJO et al., 2012).

Chemical analyses and physical and chemical characterization

Total sugars (TSs) content was estimated by phenol-sulfuric acid analysis using D-galactose as a standard (DUBOIS et al., 1956). After acid hydrolysis of soluble polysaccharides (1 mL of HCl for 5 h at 105°C), the sulfate (S) content was measured by the BaCl2 gelatin-1 method (DODGSON; PRICE, 1962). The content of contaminant proteins (CPs) was measured by the Bradford’s method (BRADFORD, 1976), using bovine serum albumin as reference. The degree of polydispersion and the charge density of SPs of each extract were checked by agarose gel electrophoresis as described in (DIETRICH; DIETRICH, 1976).

Infrared (IR) spectroscopy

To analyze the chemical structure, IR spectra of both algal crude SPs extracts were determined. Fourier transform IR spectrum (FT-IR) was recorded with a SHIMADZU IR spectrophotometer (model 8300) between 4000 and 400 cm-1. Samples were evaluated as KBr pellets (MELO et al., 2002). The presence of lipids and other chemical components was also evaluated (MI-KYUNG; JEUNE, 2009).

Activated partial thromboplastin time (APTT) assay

The APTT assay was performed using normal human plasma (obtained from 10 different donors at the Hematology and Hemotherapy Center of Ceará - HEMOCE) following manufacturer’s specifications (CLOT, Bios diagnostic, Sorocaba, São Paulo State, Brazil). For this, 50 μL of citrated human plasma was

34 Souza et al.


mixed with 10 μL of a solution of different polysaccharide amounts before adding 50 μL of APTT reagent. The mixture was then incubated at 37°C for 3 min. Then, 50 μL of 0.025 M calcium chloride reagent was added to the mixture to trigger the coagulation cascade. The clotting time was recorded in a coagulometer (Drake Quick Timer). The possible anticoagulant effect of crude SPs extracts was expressed as international units per mg of polysaccharide using standard heparin (193 IU mg-1). All the tests were performed in triplicate.

Results and discussion

Effect of precipitation methods on the yield and chemical composition

The result of adding CPC (M I) or IAA (M II) after papain incubation (6h, 60°C) to obtain crude SPs extracts from the red seaweed G. cornea is illustrated in Figure 2. The use of M II led us to obtain at least three different components present at two phases in the supernatant compared with M I. Possibly, IAA, a nonpolar organic solvent, would be capable of ‘separating’ metabolites according to physical and chemical characteristics (Figure 2B), such as hydrophobicity and molecular weight (LIDE, 1998). These hypotheses suggested the presence of nucleic acids (phase I) (YEH; CHEN, 2004), lipids (EL BAZ et al., 2013) and SPs (phase II) (MELO et al., 2002; COURA et al., 2012). As expected, only one phase was observed for M I (Figure 2A) because CPC, due to its cationic nature (LEWIS, 1996), had ability to more specifically interact with the hydrophilic (anionic) regions (ester sulfate groups) (CARDOZO et al., 2007; CAMPO et al., 2009) of the SPs extracted from the red seaweed G. cornea (COURA et al., 2012).

A B

cc

ba

Figure 2. General aspects of CPC (M I-A) or IAA (M II-B) precipitate solution after papain incubation (6h, 60°C) to obtain crude SPs extracts from the red seaweed Gracilaria cornea. Different phases are observed. Arrows indicate the presence of nucleic acids (a), lipids (b) and pigments and SPs (c), respectively.

Another interesting observation was the presence of other useful components of the algal biomass, such as pigments, by M II (phase II) (Figure 2B).

Literature describes that in obtaining lipids from seaweeds in the presence of nonpolar organic solvents (e.g., hexane and acetone), they could be accompanied with pigments, such as fucoxanthin in Laminaria gurjanovae (Phaeophyceae) (SHEVCHENKO et al., 2007). In our case, possibly IAA separated pigments by hydrophobic interaction with N-H groups of the proteins and by low relatively density of this solvent compared with water (LIDE, 1998) (Figure 2), especially phycoerythrin, a red protein-pigment complex from the light-harvesting phycobiliprotein family, which is easily extracted from Rhodophyceae, in which it play an important protective role against oxidative damage provoked by excess light exposure, and have several biotechnological applications for various fields, including food, medicine and aquaculture (CARDOZO et al., 2007). It is also believed that sources of antioxidants would stimulate coastal communities to produce high added-value products (SOUZA et al., 2011). Further studies concerning the structural conformation of these algal pigments are needed (CARDOZO et al., 2007; CAMARA-ARTIGAS et al., 2012).

Table 1 summarizes the yield and the S and TSs contents of the lyophilized polysaccharide precipitates obtained from both methods. Depending on the organic solvent, the higher yield was obtained by M I (21.17%), similarly to that (21.4%) previously found for G. cornea SPs by Melo et al. (2002), Brazil. However, this contrasts with the result obtained by M II (8.18%), which yielded about 2.6-fold lower compared with M I. Although revealing difference on the yield, interestingly, the S content (25-27%) was similar between the methods based on quantitative analysis (DODGSON; PRICE, 1962). These values were not in accordance with those previously obtained (4-15%) for the same algal species (MELO et al., 2002; COURA et al., 2012), but were in conformity with those found for other investigated agarophyte species (14-26%); thus, studies on the seasonal, regional and species variations of SPs compositions are needed (CARDOZO et al., 2007). The TSs content showed a difference between the protocols as measured by Dubois’ method. This could be explained by the selectivity of M I for obtaining seaweed carbohydrates (ARAÚJO et al., 2012), confirming thus its higher yield. The presence of pigments did not alter the quality of lyophilized raw precipitate (Figure 2c) since CPs were not detected in both crude SPs extracts based on the Bradford’ method (COURA et al., 2012). Melo et al. (2002) found a higher protein content (2.8%) in the crude SPs (M I) from Brazilian samples of G. cornea, when over



dried (60°C, 24h). Therefore, in the present study, the precipitation yields and the TSs contents of crude SPs extracts from G. cornea varied according to the method (CARDOZO et al., 2007; RODRIGUES et al., 2011a; YAICH et al., 2013).

Table 1. Yield and chemical analyses of crude SPs extracts from the red seaweed Gracilaria cornea from both precipitation methods.

Method Yield (%) a TSs (%) b S (%) c CPs (%) d M I 21.17 69.00 25.97 - M II 8.18 9.17 26.99 - a – Yield was calculated as the percentage of dehydrated matter; b – Dosage by Dubois et al. method using D-galactose as standard; c – Dosage by Dodgson and Price method using NaSO3 as standard; d – Dosage by Bradford method using bovine serum albumin (- not detected).

Agarose gel electrophoresis

To evaluate the physical and chemical characteristics of the crude SPs extracts (M I and M II), agarose gel electrophoresis was performed (Figure 3). This technique revealed marked differences on the charge density and polydispersion of the crude SPs extracts between the analyzed methods. The electrophoretic profile also showed similar mobility of both polysulfated on gel, in which M I exhibited a single band; therefore, it was a homogeneous crude SPs extract in charge density than that obtained from the M II which revealed a polydisperse crude SPs extract and weak metachromasia, suggesting a low sulfate content in the sample (RODRIGUES et al., 2011a and c; QUINDERÉ et al., 2013). These observations could be supported by the differences in the crude SPs extract yields (Table 1), with better concentration capacity by M I for G. cornea SPs (Figure 2B).

Origin

+

Figure 3. Agarose gel electrophoresis of SPs extracted from the red seaweed Gracilaria cornea. Crude SPs extracts (CPC-M I and IAA-M II) present on gel were stained with 0.1% toluidine blue.

From these data, our studies were also extended to investigate the presence of different molecular groups in G. cornea (M I and M II) by IR spectroscopy, a qualitative technique that provides

structural information regarding sulfate (CAMPO et al., 2009) and other chemical components (MI-KYUNG; JEUNE, 2009).

Spectral analysis of SPs

Both IR spectra of SPs (M I and M II), as seen in Figure 4, were very similar. Characteristic absorption signals (at 1370, 1250, 1153, 1070, 930, 890 and 740 cm-1) related to the presence of polysaccharide agar were found and were in accordance with a previous study performed by Melo et al. (2002) who revealed the occurrence of this group of SP from the red seaweed G. cornea. As another result, biogenetic precursor (at 820 cm-1, galactose-6-sulfate) of 3,6-anhydro-α-L-galactose (at 930 cm-1) was also found in the spectra, confirming a degree of substitution on C-6 of the analyzed polymer (MELO et al., 2002). By contrast, the intensity of the peaks was not correlated with the S content of the studied raw material (M II) (Table 1), while M I showed higher absorption bands, especially for ester sulfate (at 1250 cm-1), corroborating thus its metachromasia, when verified by electrophoresis (Figure 3). These data confirmed our previous observations (Figure 2 and Table 1) and showed CPC (M I) as a more appropriate solvent to obtain seaweeds SPs (ARAÚJO et al., 2012; RODRIGUES et al., 2011a).

Figure 4. IR spectra (at 2000 and 200 cm-1, kBr pellets) of crude SPs extracts from the red seaweed Gracilaria cornea in both precipitation methods (CPC-M I and IAA-M II).

Spectral analysis of lipids and other chemical components (M II)

The spectral analysis of a lyophilized lipid sample and other chemical components is shown in Figure

36 Souza et al.


5. Based on our main findings, it was proposed the occurrence of –OH stretching at 3432 cm-1 corresponding to some hydroxyl groups (EL BAZ et al., 2013), which is indicative of the presence of proteins (ESTEVEZ et al., 2009) and lipids (MI-KYUNG; JEUNE, 2009). The detection of this signal also leads to postulate a polysaccharide-protein complex (MELO et al., 2002).

Figure 5. IR spectrum reveal lipids, proteins and nucleic acids of the raw material (AIA-M II) from the red seaweed Gracilaria cornea at 4000 and 400 cm-1 in kBr pellets. Source: The authors.

Symmetric CH3 bending at around 1375 cm-1 and C-H stretching at 2930 cm-1 were attributed to the fatty acids and/or indicated the presence of SO3 (sulfolipids) (EL BAZ et al., 2013). Possibly, the presence of this component could perhaps explain the sulfate content (Table 1) and the weak metachromasia (Figure 3) due to the solubility of lipids in benzine, a nonpolar organic solvent obtained from oil refineries and mostly used by pharmaceutical companies and in the manufacturing process (WILLIAMSON, 2004), during electrophoresis procedure (M II) (DIETRICH; DIETRICH, 1976). 1640 (C=O elongation), 1232 (–OH) and 1730 cm-1 suggested proteins and ester carbonyl derived from membrane lipids, such as glyceroglycolipids, cholesterols and some phospholipids (polyesters), respectively (SHEVCHENKO et al., 2007), postulating different class composition of G. cornea lipids (MIYASHITA et al., 2013). It was also speculated the presence of algaenans, a highly resistant and non-hydrolysable bioproduct naturally found in some microalgae (ALLARD et al., 2002), but additional studies on this hypothesis are required because seaweed lipid content varies along the year (MIYASHITA et al., 2013) and tropical species have significantly lower

lipid content (CARNEIRO et al., 2014) than those collected from cold-water zones (MIYASHITA et al., 2013). Spectral analysis would also lead to a suggestion of nucleic acids in the analyzed raw material (MI-KYUNG; JEUNE, 2009) since AIA is usually used to DNA isolation from algae (YEH; CHEN, 2004).

In vitro anticoagulant assay

In order to evaluate the in vitro anticoagulant potential of both crude SPs extracts (M I and M II) from the red seaweed G. cornea, the APTT test was carried out using normal human plasma, as shown in Table 2. According to our findings, testing samples containing SPs from both precipitation methods, no effect in vitro was found (1.95 and 2 IU mg-1 for M I and M II, respectively), as measured by APTT assay, in comparison with HEP (193 IU mg-1). This meant that crude SPs extracts isolated from this algal species had no inhibitory effect on the intrinsic and/or common pathways of the coagulation system (ARAÚJO et al., 2012).

Table 2. In vitro anticoagulant effect of the crude SPs extract obtained by M I or M II from the red seaweed Gracilaria cornea in comparison to HEP.

Method APTT test* 1.00 mg mL-1** IU mg-1*** M I 46.80 ± 0.56 s 1.95 M II 48.30 ± 0.30 s 2.00 M I – cetylpyridinium chloride or M II – isoamly alcohol; *Activated partial thromboplastin time (APTT); **SP concentration to prolong the APTT in seconds; ***Anticoagulant activity expressed in international units (IU) per mg of SPs (IU mg-1); HEP (193.00 IU mg-1; 0.01 mg mL-1; APTT: 46.10 ± 0.81 s); Control: 44.20 ± 0.52 s (n = 3). Source: The authors.

Some seaweed SPs have in vitro anticoagulant effect, and their actions have been naturally attributed to the molecular size, type of sugar, charge density and sulfate content (POMIN; MOURÃO, 2008; RODRIGUES et al., 2009, 2011c; POMIN, 2012). Structural requirements, such as the occurrence of dissulfated units in the same sugar residue, sulfate position, type of linkage and molecular geometry, have also been reported for their anticoagulant effects (POMIN; MOURÃO, 2008; CAMPO et al., 2009; POMIN, 2012). Furthermore, literature reports that the high galactose-6-sulfate content had been suggested as an important structural feature for anticoagulation of SPs (DANTAS-SANTOS et al., 2012). Serpin-independent anticoagulation had also been recently reported for a SPs fraction from the red alga Acanthophora muscoides (QUINDERÉ et al., 2014).

It has been reported that the agar polysaccharide from Gracilaria species is mainly composed of alternating 3-linked β-D-galactopyranosyl residues



(A-units) and 4-linked α-L-galactopyranosyl (or 3,6-anhydrogalactopyranosyl) residues (B-units). This backbone is further modified by different substitutions. Agar has low sulfate content when compared to other seaweeds SPs (Figure 1) (CARDOZO et al., 2007; CAMPO et al., 2009).

Previous study demonstrated that the crude SPs extract (M I) from the red seaweed G. cornea acted as an antinociceptive and anti-inflammatory agent (COURA et al., 2012). However, the SPs dose administrated in rodents was 27-fold higher than the concentration used on APTT assay in the present study (Table 2). Therefore, treatment of blood with both extracts at high concentration of SPs (1 mg mL-1) did not modify the normal coagulation time (Table 2) and could be not correlated to other physiological interactions due to a lack of structure-function relationship data (MAZUMDER et al., 2002; POMIN, 2012). Gracilaria species could reveal differences in the relative proportions of sulfate and composition with possible impacts on their bioactivities (CARDOZO et al., 2007).

Another important observation was the addition of calcium chloride reagent to display the APTT assay which did not alter the evaluation by in vitro testing according to Araújo et al. (2012) who also verified a lack of anticoagulant action for the SPs from the red seaweed Solieria filiformis. It is described that the water solubility of seaweeds SPs depends essentially on the levels of sulfate groups and associated cations, like calcium, which contribute to the viscosity of solutions or strength of gels formed by SPs (CAMPO et al., 2009). Melo et al. (2002), investigating some chemical aspects of a crude SPs fraction from G. cornea, revealed that the structure deviation and the high sulfate content could explain the absence of a gelling behavior in comparison with the agar obtained from Mexican species. High values of calcium and aluminum present in SPs could determine a cross-linking property, which are also favorable for gelling formation. A more detailed study concerning these observations is needed using animals (RODRIGUES et al., 2011b; QUINDERÉ et al., 2014).

Overall, our study represents a good approach for identifying different functional groups of chemical metabolites from seaweeds (Figure 2). Results could open new frontiers for different areas, including chemotaxonomy due to the environmental plasticity and temporal variation in the morphology of some algae, which make species identification difficult at the biochemical and molecular level (YEH; CHEN, 2004; POMIN; MOURÃO, 2008; RODRIGUES et al., 2012), and identification of algae species as sources of biofuels

and pigments for oil, food and pharmaceutical industries, respectively (CARDOZO et al., 2007). Additional studies on the effects of the different isolated metabolites from G. cornea focusing on their pharmacological effects should also be conducted inferring the use of AIA (M II), including in vitro and in vivo assays (EL BAZ et al., 2013; QUINDERÉ et al., 2013).

Conclusion

The precipitation method using cetylpyridinium chloride is more appropriated for obtaining sulfated polysaccharides from the red seaweed Gracilaria cornea in comparison with isoamyl alcohol. Infrared and agarose gel electrophoresis revealed agar and marked differences on their physical and chemical characteristics between examined methods, respectively. The clotting assay (APTT) did not have significantly change after polysaccharide-treated plasma. By contrast, isoamyl alcohol reveals a good approach to obtain lipids, nucleic acids and proteins in order to further explore new biotechnological applications.

Acknowledgements

We thank to CNPq, MCT, MS and Capes for providing support to this study. Also, to Dr. Regina Célia Monteiro de Paula from the Department of Organic and Inorganic Chemistry for the use of the Shimadzu IR spectrophotometer (model 8300). N.M.B. Benevides is a senior investigator of CNPq/Brazil.

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Received on June 1, 2014. Accepted on November 10, 2014.

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