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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E ATIVIDADE BIOLÓGICA in
vitro CONTRA INSETOS PRAGA DE UM NOVO INIBIDOR DE TRIPSINA ISOLADO
DE SEMENTES DE Sapindus saponaria L. (SAPINDACEAE)
GLAUBER PACELLI GOMES DE LIMA
FORTALEZA-CEARÁ
2012
GLAUBER PACELLI GOMES DE LIMA
PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E ATIVIDADE BIOLÓGICA in
vitro CONTRA INSETOS PRAGA DE UM NOVO INIBIDOR DE TRIPSINA ISOLADO
DE SEMENTES DE Sapindus saponaria L. (SAPINDACEAE)
Dissertação submetida à coordenação do
Programa de Pós-graduação em Bioquímica, do
departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular da Universidade Federal do Ceará
como requisito parcial para obtenção de grau de
mestre em Bioquímica
Área de concentração: Bioquímica Vegetal
Orientadora: Profa. Dra. Ana de Fátima
Fontenele Urano Carvalho
FORTALEZA-CEARÁ
2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências e Tecnologia
L696p Lima, Glauber Pacelli Gomes de.
Purificação, caracterização bioquímica e atividade biológica in vitro contra insetos praga de um
novo inibidor de tripsina isolado de sementes de Sapindus Saponaria L. (Sapindaceae) / Glauber
Pacelli Gomes de Lima – 2012. 122 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Fortaleza, 2012.
Área de Concentração: Bioquímica vegetal.
Orientação: Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho.
Coorientação: Dra. Maria Fátima Grossi de Sá.
1. Sapindus saponaria. 2. Inibidor de tripsina. 3. Inseto praga. I. Título.
CDD 574.192
A Deus, por mais essa oportunidade de evoluir intelectual e moralmente.
À Elizabeth Gomes, grande mãe e amiga, por confiar e investir cegamente no
meu potencial.
“Você nasceu no lar que precisava, Vestiu o corpo físico que merecia, Possui os recursos financeiros coerentes com suas necessidades… Nem mais, nem menos, mas o justo para as tuas lutas terrenas, Seu ambiente de trabalho é o que você elegeu espontaneamente para a sua realização, Seus parentes e amigos são as almas que você mesmo atraiu, com sua afinidade. Portanto, seu destino está constantemente sob seu controle. Você escolhe, recolhe, elege, atrai, busca, expulsa, modifica tudo aquilo que te rodeia a existência. Seus pensamentos e vontades são a chave de seus atos e atitudes São as fontes de atração e repulsão na jornada da tua vivência. Não reclame nem se faça de vítima. Antes de tudo, analise e observa. A mudança está em tuas mãos. Re-programe sua meta, busque o bem e viverá melhor”.
“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim”.
Chico Xavier.
Que alegria! É chegado o final de mais uma etapa na minha vida profissional e pessoal!
Durante esses aproximadamente vinte e seis meses, tive momentos de grandes alegrias e
conquistas, assim como derrotas e momentos em que desespero tomou conta. Em todos esses
momentos, entretanto, estive acompanhado por novos e velhos amigos, que se fizeram
presentes e me auxiliaram imensamente durante esse período de grande desenvolvimento
intelectual, moral e espiritual. Dessa forma, agradeço:
Inicialmente, a Deus pelo constante auxílio e por se fazer presente durante mais essa etapa da
minha vida.
À minha mãe Elizabeth Gomes pelos sacrifícios, perseverança e imensurável amor dedicado
que caracterizam as grandes mães. Sei que não costumo dizer isso, mas a amo e sou
imensamente grato por tudo que me proporcionou durante todos os anos da minha vida.
Agradeço à minha irmã Amanda Gomes, por sempre acreditar e investir em meu potencial,
eis minha segunda mãe.
Ao Erandir Silva, melhor cunhado que poderia ter, pelo apoio e solicitude para me buscar a
qualquer hora e dia em um campus tão isolado do mundo durante dias de experimentos
intermináveis.
À Isabela e Gabriela Gomes, amadas sobrinhas, por reacenderem em mim o valor do amor e
dedicação à família.
À Claudia Cysne, José Lindival e Freitas júnior, por desde cedo reconhecerem e investirem
em meu potencial.
À Profa Dra. Ana de Fátima Carvalho, orientadora, por ainda durante minha graduação ter
me aceitado como pupilo em seu laboratório. Mais importantes que os ensinamentos
acadêmicos, ficarão as valiosas lições éticas e morais, valores lamentavelmente incipientes
nos dias atuais.
À Dra. Fátima Grosssi, coorientadora, por ter me acolhido no seu laboratório durante um
grande período do meu mestrado. Sou grato ainda pelos apoios, incentivos e pela
disponibilidade em contribuir mais ainda para a concretização deste trabalho, através de
participação na banca examinadora.
À Profa Dra. Ilka Vasconcelos, pelos valiosos ensinamentos científicos compartilhados
durante essa etapa acadêmica e pela pronta solicitude para resolução de qualquer problema.
Muito obrigado pelos valiosos diálogos e incentivos, e ainda, por ter aceitado prontamente
fazer da banca examinadora dessa dissertação.
Ao Dr. Marcelo Porto Bemquerer, pela frequente e valiosíssima ajuda em várias etapas do
desenvolvimento desse trabalho. Pela paciência, sugestões e preciosos ensinamentos. Sou
imensamente grato também por ter acrescentado fundamentais correções e sugestões na
redação dessa dissertação. Indubitavelmente, seu auxílio acrescentou um imenso valor
científico a esse trabalho, muito obrigado Dr. Marcelo!!
Ao Dr. Carlos Bloch Jr., coordenador do Laboratório de Espectrometria de Massa (LEM),
locado na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, em Brasília (DF). Por ter permitido
que parte dos experimentos desse trabalho fossem lá realizados. Obrigado pela paciência,
sugestões e enriquecimento científico.
À Lady Clarissa Bezerra, “coorientadora” e grande amiga. Como co-orientadora, essa
dissertação não teria tal valor sem sua colaboração, apoio e sugestões. Mesmo as acalentadas
discussões tiveram grande valia. Como amiga, me ensinou a necessidade da força,
perseverança e resignação. Infelizmente, forças maiores nos interpuseram a distância física,
mas nada será capaz de se interpor à nossa afinidade moral e espiritual. Não me acanho em
repetir que me arrependo de não ter aproveitado mais seus conselhos e companhia, muito
obrigado por sentir-se e agir como grande irmã.
Ao Davi Farias, por me ter coorientado no início da minha vida profissional e pela grande
amizade. Com pulso forte me ensinou valores e lições que não irei jamais esquecer. Sou
imensamente grato pela paciência, dedicação e incentivos, sendo assim um grande exemplo
profissional. Como amigo, me ensinou que nunca é tarde pra mudar. Será sempre um
acalentador e maduro ombro amigo que sei que possa contar a qualquer hora.
Ao Martônio Viana, um dos poucos cientistas inatos que tive o prazer de conhecer e
acompanhar o desenvolvimento. Agradeço pelo imenso companheirismo, sugestões
profissionais e conselhos pessoais. Homem, eu acredito que você não tem noção do quanto
valorizo tua companhia e amizade, muito obrigado!
Aos demais membros do laboratório de Bioprospeção de Recursos Regionais Renalison
Farias, Geórgia Sampaio, Katharine Gurgel, Alison Rebouças, Gabrielle de Paula, Renata
Silva, Jackeline Medeiros e outros que eu possa ter esquecida de mencionar e, em especial, à
Terezinha Souza, Luiz Filho, Nathanna Sousa e Berenice Alves pela solicitude,
companheirismo e discussões filosóficas e científicas, assim como pelas constantes risadas e
alegrias compartilhadas.
Ao Leonardo Pepino, grande amigo e parceiro profissional, pelos frequentes incentivos,
ajudas, sugestões e significativa amizade. Amigo, Muito obrigado por ter tornado essa
dissertação possível!
À Raquel Sampaio, Caroline Bezerra, Luciane Guimarães, Karla Graziela e Ticiana
Amorim, fortes e excepcionais mulheres que conheci durante minhas estadias no Laboratório
de Interação Molecular Planta Praga I (LPPI), da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, em Brasília (DF). Acredito que nada nem ninguém entram na sua vida por
acaso, e todas vocês são mais uma prova disso. Indubitavelmente, as saudades de casa foram
compensadas pelo frequente e fraterno carinho de vocês. Sou muito grato pela companhia,
apoio, paciência, conselhos, incentivos e ideias compartilhadas durante esses períodos. Muito
obrigado garotas, de coração!
Aos demais membros do LPPI, Roberta Coelho, Vanessa Evangelista, Bruna Araújo,
Angelina, Tiago Siqueira, Alexandre Firmino, Fernando, Flávia Furtado, Eduardo
Mullinari, Patricia Pelegrini, Itamara Mezzalira, Antônio Américo, Wagner Lucena e
tantos outros que me receberam tão bem, me fazendo sentir parte dessa grande equipe!
Obrigado também pelas sugestões e discussões científicas!
Aos Membros do Laboratório de Espectrometria de Massa (LEM), locado na Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, em Brasília (DF). Em especial à Dra. Maura Viana
Prates, Dr. Luciano Paulino, Nathalia e “Zé”, pela apoio e sugestões a esse trabalho.
Aos colegas Ludovico Migliolo e Michelle Flaviane do Centro de análises proteômicas e
bioquímica (UCB), pelo companheirismo e auxílio durante as digestões enzimáticas, pelas
interessantes discussões e idéias.
Aos Colegas do Laboratório de Toxinas Vegetais (LABTOX) da UFC, pela frequente
colaboração e boa convivência, em especial a Hellen Paula, Mirella Pereira, Daniele Sousa
e Paulo Carvalho, pelo companheirismo, apoio e solicitude.
À Adeliana Oliveira, do Laboratório de Química e função de Proteínas Bioativas da UFRN,
pelas sugestões e incentivos.
Aos melhores amigos do mundo: Vanderson Costa, Eliardo Cavalcante, Sayonara e
Shemariah Melo, Sandino Moreira, David Ribeiro, Sammya Araújo, Bruno Soares, Felipe
Vasconcelos, Rebeka Lúcio, Rafaely Alcântara, Marcio Souza e tantos outros que há muito
tempo fazem parte desta densa teia que é minha vida. Pelo constante apoio, ‘‘puxões de
orelha’’, longas conversas e agradáveis momentos de descontração. Muito obrigado por
fazerem parte da minha vida, porque afinal “sem vocês sou pá furada”.
Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes instituições:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, Ceará
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,
Ceará.
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências, Universidade Federal
do Ceará, Fortaleza, Ceará.
Departamento de Biologia, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,
Ceará.
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) – Recursos Genéticos e
Biotecnologia, Brasília, Distrito Federal.
Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais (Bioprospec), Centro de Ciências,
Departamento de Biologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará.
Laboratório de Interação Molecular Planta Praga I , Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, Brasília, Distrito Federal
Centro de Análises Proteômicas e Bioquímicas, Universidade Católica de Brasília (UCB),
Brasília, Distrito Federal.
RESUMO
A toxicidade ao meio ambiente, a baixa biodegrabilidade e a crescente resistência de insetos
praga da agricultura e de insetos vetores de doenças aos inseticidas tradicionalmente
utilizados tem estimulado o desenvolvimento de alternativas com maior biodegradabilidade e
especificidade, especialmente de origem vegetal. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na
purificação, caracterização e avaliação do efeito biológico in vitro de um novo inibidor de
tripsina obtido das sementes de Sapindus saponaria sobre as enzimas digestivas de insetos.
Através de precipitação com ácido tricloroacético (TCA), cromatografia de afinidade à
tripsina e cromatografia de fase reversa em sistema UFLC, foi purificado um novo inibidor de
tripsina (SSTI2) pertencente ao grupo de inibidores do tipo Batata I, uma categoria de
inibidores de peptidases serínicas com reconhecido efeito tóxico sobre insetos. O inibidor
nativo e fragmentos desse gerados por tratamento enzimático com tripsina e pepsina foram
analisados e sequenciados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e ESI-TOF,
determinando assim a sua massa molecular acurada (MM = 7571, 976 Da) e elucidando a sua
estrutura primária (64/69 aminoácidos). O inibidor apresentou uma IC50 de 8,3 x 10-2
µmol.L-1
contra a tripsina bovina, mas apresentou baixa atividade inibitória sobre as enzimas
quimotripsina (13,24 ± 0,28%) e papaína (5,28 ± 0,42%), e não foi capaz de inibir a proteólise
promovida pela bromelaína. O SSTI2 inibiu moderadamente a atividade catalítica das
enzimas digestivas totais dos insetos, com percentual de inibição variando entre 4,74 ± 0,45%
a 56,06 ± 1,41%. No entanto, o inibidor foi eficaz em atuar sobre as enzimas digestivas do
tipo tripsina presentes nos intestinos dos insetos Aedes aegypti (92,44 ± 0,99%), Anthonomus
grandis (77,93 ± 0,12%), Anticarsia gemmatalis (32,21 ± 0,57%) e Spodoptera frugiperda
(71,44 ± 1,23%). Esse expressivo efeito inibitório do SSTI2 sobre a atividade catalítica das
peptidases do tipo tripsina provenientes do intestino médio dos insetos sugere um possível
efeito supressor no desenvolvimento e sobrevivência de insetos alimentados com dietas
contendo o inibidor. Assim, futuros estudos in vivo e avaliações de outras propriedades
bioquímicas do inibidor serão importantes para determinar a potencial aplicação
biotecnológica do SSTI2, especialmente para o combate de A. aegypti, A. grandis e A.
gemmatalis. Além disso, a sequência do SSTI2 elucidada nesse estudo possibilita a síntese,
clonagem do gene codificante e expressão heteróloga dessa potencial ferramenta
biotecnológica.
Palavras-chave: Sapindus saponaria; Inibidor de tripsina; sequenciamento de proteínas;
insetos praga; Batata I
ABSTRACT
Environmental toxicity, low biodegradability and increased resistance in agricultural pest
insects and in insect vectors of diseases to insecticides traditionally used for their control have
encouraged the development of chemical alternatives with greater specificity and
biodegradability especially from plants. In this way, the present study aimed the purification,
characterization and evaluation of activity towards pest insect digestive enzymes of a new
trypsin inhibitor obtained from Sapindus saponaria seeds. This new trypsin inhibitor obtained
from S. saponaria seeds (SSTI2) belongs to Potato I inhibitor family and was purified by
protein precipitation with trichloroacetic acid, affinity chromatography and reverse phase
chromatography using UFLC system. The native inhibitor and its fragments generated by
enzymatic treatment with trypsin and pepsin were analyzed and sequenced by MALDI-TOF
and ESI-TOF mass spectrometry, determining its accurate molecular mass (MM = 7571, 976
Da) and primary structure (64 of 69 amino acids). The SSTI2 showed an IC50 of 8.3 x 10-2
μmol.L-1
against bovine trypsin, and a much lower inhibitory activity on the enzymes
chymotrypsin (13.24 ± 0.28%) and papain (5.28 ± 0 , 42%), but was unable to inhibit
proteolysis promoted by bromelain. In spite to show moderate inhibition of total digestive
enzymes (4.74 ± 0.45% to 56.06 ± 1.41%), the inhibitor was very effective upon trypsin-like
enzymes present in Aedes aegypti (92.44 ± 0.99%), Anthonomus grandis (77.93 ± 0.12%),
Anticarsia gemmatalis ( 32.21 ± 0.57%) and Spodoptera frugiperda (71.44 ± 1.23%) guts.
This strong inhibitory effect of SSTI2 on the catalytic activity of trypsin-like peptidases of
insect’s midguts suggests a possible suppressive effect on development and survival of insects
fed with diets containing the inhibitor. Thus, future in vivo assays and evaluation of other
biochemical properties will be important to establish the potential biotechnological
application of SSTI2, especially for the combat of Ae. aegypti, A. grandis and An.
gemmatalis. Furthermore, the sequence of SSTI2 elucidated in this study allows the chemical
synthesis, cloning of coding gene sequence and heterologous expression of this potential new
biotechnological tool.
Key-words: Sapindus saponaria; Trypsin inhibitor; Protein sequencing; Pest insects; Potato I
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Anticarsia Gemmatalis, considerada a pincipal praga da soja (Glycine max)........30
Figura 2 – Spodoptera frugiperda, uma das principais pragas do milho (Zea mays)...............31
Figura 3 – Anthonomus grandis, inseto-praga do algodão (Gossypium sp.).............................32
Figura 4 – Aedes aegypti, vetor da dengue...............................................................................36
Figura 5 – Ciclo de vida de Aedes aegypti................................................................................37
Figura 6 – Sapindus saponaria L., planta-alvo do estudo........................................................44
Figura 7 – Estratégia utilizada para isolamento e purificação do novo inibidor de tripsina das
sementes de S. saponaria (SSTI2)............................................................................................65
Figura 8 – Estratégia utilizada para a elucidação da estrutura primária do novo inibidor de
tripsina de sementes de S. saponaria (SSTI2)..........................................................................66
Figura 9 – Atividade inibitória das frações proteicas de S. saponaria obtidas através de
precipitação com ácido tricloroacético (TCA)..........................................................................67
Figura 10 – Perfil de eluição da F1% em matriz de afinidade Tripsina-Sepharose
4B..............................................................................................................................................70
Figura 11 – Perfil cromatográfico de SS1Af aplicado em coluna de fase reversa semi
preparativa do tipo C4, em sistema em sistema UFLC.............................................................72
Figura 12 – Espectros de massa dos produtos cromatográficos presentes em P1 e P2
adquiridos em espectrômetro de massa do tipo MALDI-TOF.................................................75
Figura 13 – Espectros de massa molecular do SSTI2 adquiridos em espectrômetro de massa
do tipo ESI-TOF........................................................................................................................77
Figura 14 – Perfil eletroforético das etapas de purificação do SSTI2......................................79
Figura 15 – Determinação da concentração inibitória média (CI50) do inibidor SSTI2 sobre
tripsina bovina...........................................................................................................................81
Figura 16 – Sobreposição manual de sequências obtidas através de sequenciamento direto na
fonte (ISD-DAN) e após tratamentos enzimáticos...................................................................85
Figura 17 – Perfil cromatográfico da repurificação do inibidor SSTI2 reduzido e alquilado
aplicado em coluna de fase reversa analítica do tipo C4, em sistema em sistema UFLC........86
Figura 18 – Perfil cromatográfico (Em sistema RP-UFLC) da separação de peptídeos de
SSTI2 gerados por tratamento enzimático com tripsina imobilizada em agarose....................87
Figura 19 – Perfil cromatográfico (Em sistema RP-UFLC) da separação de peptídeos de
SSTI2 gerados por tratamento enzimático com pepsina imobilizada em agarose....................87
Figura 20 – Alinhamento da sequência aminoacídica do SSTI2 com sequências de outros
inibidores da família de inibidores Batata I..............................................................................93
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Produção agrícola brasileira de algodão, milho e soja............................................29
Tabela 2 – Classificação de peptidases de acordo com diversidade estrutural e bioquímica...41
Tabela 3 – Gradiente crescente de solução B empregado durante cromatografia de fase reversa
em sistema RP-UFLC de material proveniente da cromatografia de afinidade (Ss1Af)......... 53
Tabela 4 – Gradiente crescente de solução B empregado durante cromatografia de fase reversa
em sistema RP-UFLC para purificação do SSTI2 reduzido e alquilado...................................58
Tabela 5 – Gradiente crescente de solução empregado durante cromatografia de fase reversa
em sistema RP-UFLC para purificação de peptídeos gerados por hidrólises enzimáticas
independentes de SSTI2 com pepsina e tripsina imobilizadas em agarose..............................60
Tabela 6 – Atividade inibitória específica e percentual de inibição das frações proteicas de
Sapindus saponaria obtidas por fracionamento com ácido tricloroacético (TCA)...................68
Tabela 7 – Tabela de purificação do inibidor de tripsina obtido de sementes de Sapindus
saponaria..................................................................................................................................73
Tabela 8 – Avaliação da especificidade do SSTI2 para enzimas serínicas e cisteínicas..........82
Tabela 9 – Comparação entre as massas teóricas e experimentais dos peptídeos oriundos da
digestão enzimático do SSTI2 com tripsina imobilizada em agarose.......................................90
Tabela 10 – Comparação entre as massas teóricas e experimentais dos peptídeos oriundos da
digestão enzimático do SSTI2 com pepsina imobilizada em agarose......................................91
Tabela 11 – Lista de massas de dipeptídeos, úteis para determinação de íons –b2 sequenciados
por espectrometria de massa.....................................................................................................92
Tabela 12 – Especificidade de inibição do SSTI2 para enzimas digestivas de insetos.............95
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACN Acetonitrila
CI50
Concentração de inibidor capaz de causar 50% de inibição na atividade
proteolítica da tripsina bovina
ESI Ionização por electron spray, do inglês electron spray ionization
EB Extrato proteico bruto de Sapindus saponaria
F1%
Fração proteica do EB precipitado com um volume de ácido tricloroacético
e encerrando uma concentração final de 1%
ISD Fragmentação direta na fonte, do inglês In-source-decay
Ki Constante de inibição
MALDI
Dessorção/ionização da matriz assistida por laser, do inglês Matrix assisted
laser dessorption/ionization
MM Massa molecular
SSTI2
Novo inibidor de tripsina de Sapindus saponaria, do inglês Sapindus
saponaria trypsin inhibitor
Ss1Af Fração proteica retida em matriz de afinidade Tripsina-Sepharose 4B
TCA Ácido tricloroacético, do inglês Tricloroacetic acid
TFA Ácido tricloroacético, do inglês Trifluoroacetic acid
TOF Tempo de vôo, do inglês Time of flight
LISTA DE RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS
Resíduo Símbolo
de 3
letras
Símbolo
de 1 letra
Massa
monoisotópica
(Da)
Imônio
(Da)
Ácido aspártico Asp D 115,027 88
Ácido glutâmico Glu E 129,042 102
Alanina Ala A 71,037 44
Arginina Arg R 156,101 129
Asparagina Asn N 114,042 87
Cisteína Cys C 103,009 76
Fenilalanina Phe F 147,068 120
Glicina Gly G 57,021 30
Glutamina Gln Q 128,058 101
Histidina His H 137,058 110
Isoleucina Ile I 113,084 86
Leucina Leu L 113,084 86
Lisina Lys K 128,094 101
Metionina Met M 131,040 104
Prolina Pro P 97,052 70
Serina Ser S 87,032 60
Tirosina Tyr Y 163,063 136
Treonina Thr T 101,047 74
Triptofano Trp W 186,079 159
Valina Val V 99,068 72
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO..................................................................................................................23
1.1 – Aspectos gerais.............................................................................................................. ..23
1.2 – Insetos como pragas da agricultura..................................................................................26
1.3 – Insetos como vetores de doenças humanas e animais......................................................33
1.4 – Inibidores de peptidases...................................................................................................38
1.4.1 – Inibidores de peptidases da família Batata I.................................................................40
1.5 – Sapindus saponaria..........................................................................................................42
2 – OBJETIVOS.......................................................................................................................45
2.1 – Objetivo geral...................................................................................................................45
2.2 – Objetivos específicos.......................................................................................................45
3 – MATERIAL........................................................................................................................46
3.1 – Material biológico.........................................................................................................46
3.1.1 – Sementes de Sapindus saponaria..................................................................................46
3.1.2 – Insetos...........................................................................................................................46
3.2 – Reagentes químicos..........................................................................................................46
3.2.1 – Proteínas........................................................................................................................46
3.2.2 – Substratos enzimáticos..................................................................................................47
3.2.3 – Outros reagentes............................................................................................................47
4.0 – MÉTODOS......................................................................................................................48
4.1 – Processamento de sementes de Sapindus saponaria........................................................48
4.2 – Quantificação de proteínas solúveis.................................................................................48
4.3 – Ensaio de determinação da atividade inibitória de peptidases serínicas..........................48
4.4 – Ensaio de determinação da atividade inibitória de peptidases cisteínicas.......................49
4.5 – Ensaio de determinação da atividade inibitória de tripsina..............................................50
4.6 – Purificação do inibidor de tripsina das sementes de S. saponaria...................................50
4.6.1 – Preparo do extrato proteico bruto de S. saponaria........................................................50
4.6.2 – Obtenção de frações proteicas ricas em inibidores de tripsina de S. saponaria............51
4.6.3 – Cromatografia de afinidade a matriz de Tripsina-Sepharose 4B................................51
4.6.4 – Cromatografia de fase reversa em coluna C4 semi preparativa....................................52
4.7 – Caracterização bioquímica...............................................................................................54
4.7.1 – Avaliação da diversidade e pureza das frações obtidas em RP-UFLC.........................54
4.7.2 – Determinação da massa molecular acurada por espectrometria de massa....................54
4.7.3 – Perfil eletroforético em gel de poliacrilamidada...........................................................55
4.7. 4 – Determinação da CI50 contra tripsina bovina...............................................................56
4.7.5 – Sequenciamento do SSTI2............................................................................................56
4.7.5.1 – Sequenciamento de SSTI2 por ionização direto na fonte..........................................56
4.7.5.2 – Tratamento de SSTI2 com enzimas proteolíticas......................................................57
4.7.5.3 – Purificação dos peptídeos gerados por tratamentos enzimáticos...............................59
4.7.5.4 – Sequenciamento de novo dos peptídeos.....................................................................61
4.7.5.5 – Análise e alinhamento da sequência de aminoácidos do SSTI2................................61
4.8 – Atividade biológica in vitro.............................................................................................62
4.8.1 – Extração e preparo do homogenato intestinal de insetos..............................................62
4.8.2 – Ensaio de inibição enzimática de peptidases digestivas de insetos..............................62
5 – RESULTADOS...................................................................................................................64
5.1 – Isolamento e purificação..................................................................................................64
5.1.1 – Seleção da fração proteica obtida por precipitação com TCA......................................64
5.1.2 – Cromatografia de afinidade de F1% em matriz de afinidade Tripsina-Sepharose 4B..69
5.1.3 – Cromatografia de SS1Af em coluna de fase reversa acoplada a sistema UFLC.........71
5.1.4 – Rendimento do SSTI2...................................................................................................71
5.2 – Caracterização bioquímica...............................................................................................74
5.2.1 – Análise por MALDI-TOF das frações com atividade inibitória de tripsina.................74
5.2.2 – Determinação da massa molecular acurada através de MS-ESI...................................76
5.2.3 – Perfil elefrorético das etapas de purificação de SSTI2 em gel de poliacrilamidada.....78
5.2.4 – Determinação da CI50....................................................................................................80
5.2.5 – Especificidade do inibidor a enzimas serínicas e cisteínicas........................................80
5.2.6 – Sequenciamento do SSTI2............................................................................................83
5.2.6.1 – Sequencimento por ionização direto na fonte............................................................83
5.2.6.2 – Purificação dos fragmentos de SSTI2 gerados por hidrólises enzimáticas com
tripsina e pepsina.......................................................................................................................83
5.2.6.3 – Sequenciamento de novo dos peptídeos de SSTI2 e alinhamento das sequências.....88
5.3 – Efeito do SSTI2 sobre enzimas digestivas de insetos......................................................94
6 – DISCUSSÃO......................................................................................................................96
7 – CONCLUSÃO..................................................................................................................105
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................106
20
1. INTRODUÇÃO
1.1 – Aspectos gerais
Atualmente, o ataque de plantas por insetos-pragas e patógenos causa severos
prejuízos à agricultura mundial. Apesar da aplicação anual de 3 bilhões de toneladas de
pesticidas, 40% das plantações em todo o mundo ainda são perdidas devido ao ataque de
patógenos, ervas daninhas, insetos e outras pragas agrícolas, antes e após as colheitas
(OERKE et al., 1994; PIMENTEL, 2009). Estes dados se tornam ainda mais preocupantes
quando analisamos as projeções para o crescimento populacional da humanidade, com um
ritmo anual de 80 milhões por ano e uma estimativa de até 7,7 bilhões de pessoas até o ano de
2020. Esses dados, aliados a fatores como a crescente substituição da alimentação
convencional de gados por grãos e crescentes mudanças climáticas no mundo tornam
imprescindíveis a disponibilidade de solos férteis, o desenvolvimento de variedades vegetais
com alto rendimento e a proteção dessas colheitas quanto às pragas e patógenos para que,
assim, a disponibilidade e qualidade dos alimentos vegetais acompanhem a crescente
demanda mundial (OERKE; DEHNE, 2004, SUTHERST et al., 2011).
De acordo com Oerke et al. (1994), as maiores perdas nas colheitas são devidas ao
ataque de artrópodes e os métodos convencionais disponíveis para conter a predação dos
insetos consistem da utilização de compostos químicos extremamente agressivos ao meio-
ambiente e cuja estimativa em reduzir as perdas aproxima-se de apenas 7%. Outra
problemática é a resistência que esses herbívoros podem desenvolver aos inseticidas
utilizados, tornando urgente a busca e o desenvolvimento de alternativas ao uso desses
pesticidas (OERKE, 2006).
Aliados a esses problemas da humanidade estão também os mosquitos, que são os
principais vetores de diversas doenças como, por exemplo, dengue, febre amarela, filariose,
encefalite japonesa e outras doenças (VENKATACHALAM; JABANESAN, 2001). Dentre
essas, a dengue, considerada a principal doença reemergente da atualidade, atinge até 50
21
milhões de pessoas em todo o mundo e pelo menos 2,5 bilhões residem em áreas onde a
doença é endêmica (TAUIL, 2002; WHO, 2009). O mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti é
considerado o principal vetor dos quatro sorotipos do vírus que têm causado a forma benigna
e hemorrágica da doença.
Devido à falta de uma vacina eficaz contra o vírus, o controle da dengue se dá
tentando impedir a proliferação de seu vetor através do controle químico e biológico, pela
erradicação dos depósitos de reprodução dos mosquitos, aplicação de larvicidas em hábitat
larvais e pela educação da população (GUBLER, 1989). Entretanto, o uso maciço de
pesticidas de natureza orgânica ou inorgânica como organoclorados, organofosforados,
carbamatos e piretróides tem acarretado problemas como o desenvolvimento de resistências
e toxicidade ao meio ambiente. A racionalização do emprego de inseticidas, sua utilização
rotativa e o uso integrado com medidas de controle físico e biológico, poderiam diminuir os
riscos de aparecimento ou agravamento de resistência em populações de vetores (BRAGA;
VALLE, 2007ab; BROWN, 1986). Nesse sentido, a busca por novas alternativas como
inseticidas naturais, especialmente de origem vegetal, com especificidade mais elevada
contra o alvo, maior biodegradabilidade e segurança ao meio ambiente tem sido estimulada
(CHAIYASIT et al., 2006).
As inúmeras estratégias de plantas para evitar a predação podem ser classificadas
em diretas, quando causam efeitos negativos imediatos aos herbívoros, ou indiretas, ao atrair
os predadores dos seus predadores através de sofisticadas estratégias químicas a fim de que
esses atuem como agentes defensores indiretos dessas plantas. A defesa direta é ainda muito
diversa, podendo a planta evitar a predação através de barreiras físicas como tricomas,
espinhos, ceras etc. ou através da síntese de moléculas como proteínas e compostos
secundários tóxicos aos herbívoros (ARIMURA et al., 2005).
Segundo descrito por Carlini e Grossi-de-Sá (2002), as plantas expressam,
especialmente em sementes, uma grande diversidade de proteínas com papel defensivo, como
arcelinas, inibidores de peptidases, lectinas, RIP’s (do inglês, Ribosome-inactivating
proteins), quitinases etc., as quais apresentam um amplo espectro entomotóxico para
diferentes ordens de insetos. Nesse sentido, as técnicas de DNA recombinante para a
construção de plantas transgênicas expressando essas proteínas vegetais conferindo resistência
22
a insetos surgiram como uma alternativa promissora e eficaz para o controle de pragas
agrícolas (CARLINI; GROSSI-DE-SÁ, 2002; SMITH; CLEMENT, 2012). Essas mesmas
tecnologias ainda possibilitam a expressão heteróloga em larga escala de proteínas vegetais
tóxicas a Aedes aegypti, oferecendo, assim, uma promissora alternativa para o controle
tradicional do mosquito.
23
1.2 Insetos como pragas da agricultura
Agricultores têm lidado com insetos-praga e patógenos prejudiciais às plantações
desde os primórdios da agricultura, há cerca de 10.000 anos. Registros arqueológicos egípcios
datados de aproximadamente 3.800 a.C. comprovam a antiga relação existente entre alimentos
estocados para alimentação humana e pragas agrícolas (BOROJEVIC et al., 2010). No
entanto, a relação entre vegetais e suas respectivas pragas e patógenos é muito mais antiga,
tendo sido acompanhada pela intrínseca co-evolução desses organismos (ARIMURA et al.,
2005).
Dentre as principais pragas de importância agrícola da atualidade, os insetos e
ácaros fitófagos destacam-se como responsáveis por aproximadamente 13,6% das perdas
mundiais de colheitas de trigo, algodão, milho, batatas, arroz, soja e cevada (BENEDICT,
2003). Só a America do sul é responsável pelo consumo de 43% dos micoinseticidas e
micoacaricidas aplicados na agricultura mundial para controle dessas pragas (LI et al., 2010).
Ficando atrás apenas da produção de cana de açúcar, a cultura de soja (Glycine
max L.) responde pela segunda maior produção agrícola brasileira. Produzindo quase 75
milhões de toneladas de grãos apenas no ano de 2011 (Tabela 1), o Brasil é o segundo maior
produtor de soja do mundo (FAO, 2012; IBGE, 2012). No entanto, a cada 10 sacos de grãos
de soja produzidos ocorrem perdas de em média 1,3 sacos antes e após a colheita. Grande
parte desse desperdício ocorre devido ao ataque de patógenos, insetos praga, transporte
inadequado, armazenamento ineficiente etc., causando prejuízos de aproximadamente R$
1.000.000,00 por ano (BELINE et al., 2009). A cultura de soja pode ser atacada por uma
variedade de artrópodes desde a germinação à colheita, sendo o inseto Anticarsia gemnatalis
Hubner (Figura 1) considerada a principal praga. Esse inseto da ordem Lepidoptera é nativo
de áreas tropicais e subtropicais do Ocidente, e sua primeira ocorrência registrada foi na
Flórida (EUA) em 1903. No Brasil, conhecida como a ‘‘lagarta da soja’’, ataca folhas de G.
max, podendo gerar desfolhamentos de até 100%. Cada fêmea adulta, de coloração cinza,
marrom ou bege, é capaz de depositar até mil ovos nas plantas, os quais eclodem após três
dias de incubação. As larvas se desenvolvem por 12-15 dias, consumindo entre 100-150 cm2
24
de área foliar cada uma, sendo as larvas de 4-6° ínstar as mais vorazes (HINDS, 1931;
HOFFMANN-CAMPO et al,, 2000).
O Brasil é o terceiro maior produtor de milho (Zea mays) do mundo, tornando este
um dos produtos agrícolas com maior produção anual do país (Tabela 1). Apenas em 2011
foram produzidas aproximadamente 56 milhões de toneladas de grãos de milho, havendo uma
expectativa de mais 66 milhões de toneladas a serem gerados no ano de 2012 (FAO, 2012;
IBGE, 2012). Uma das principais pragas do milho nas Américas, particularmente na América
do Sul, é o inseto Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), Figura 2. Esse artrópode pertencente à
ordem Lepidoptera ocorre em grande parte do continente Americano, da Argentina aos EUA,
causando sérios danos às plantações de milho e outras espécies vegetais da família Poacea em
vários países Latino-Americanos. O inseto é facilmente encontrado em plantações de Z. mays
durante o período larval, sendo então capaz de reduzir em até 57% a produção do vegetal.
Conhecido no Brasil como ‘‘lagarta militar’’, é ainda um importante predador do algodão e da
soja no cerrado Brasileiro, predação essa relacionada com o estágio de desenvolvimento da
planta e sobrevivência do inseto às altas temperaturas do bioma (BARROS et al., 2010;
VILARINHO et al., 2011) .
Com uma perda anual de aproximadamente 30% das colheitas em todo o mundo
devido ao ataque de pestes e patógenos, o algodão (Gossypium spp) é o mais importante
produto agrícola fibroso, sendo de fundamental importância para a indústria têxtil. De acordo
com OERKE (2006), as plantações de algodão são comumente confrontadas por insetos das
ordens Homoptera, Lepdoptera, Coleoptera e Trysanoptera, e ainda por ervas daninhas. A
produção anual de mais de três milhões de toneladas posiciona o Brasil como o quinto maior
produtor de sementes de algodão no mundo, sendo dessa forma o algodão mais um produto
agrícola de grande importância no país (FAO; IBGE, 2012).
O inseto Coleóptero Anthonomus grandis Boheman (Figura 3), conhecido como
“Bicudo do algodoeiro”, é a maior praga do algodão nas Américas, embora haja pouca
informação sobre o aparecimento e dispersão do inseto na America do Sul. Só nos EUA o
inseto já causou prejuízos de cerca de 17 bilhões de dólares, referentes a custos despendidos
para o seu controle e aos danos causados nas plantações de algodão desde a introdução do
inseto no país, em 1892. Apesar de excelentes programas de controle de A. grandis no EUA
terem obtido até 94% de erradicação nas plantações de algodão, é necessária vigilância
25
constante devido à enorme capacidade de reinfestação desse Coleóptero. No Brasil os
programas de controle que fazem uso de pesticidas químicos não têm sido uma abordagem
efetiva para a erradicação do “bicudo do algodoeiro”. Uma alternativa que tem sido
estimulada é o uso de algodão transgênico resistente a A. grandis (GUZMAN et al., 2007;
OLIVEIRA et al., 2011; WESTBROOK; EYSTER; ALLEN, 2011).
26
Tabela 1 – Produção agrícola brasileira de algodão, milho e soja. Os valores de produção são expressos em
toneladas (t)
Produtos agrícolas Produção (t) Colocação do Brasil na produção
mundial Obtida em 2011 Prevista para 2012
Algodão (Caroço) 3 083 775 3 129 960 5°
Milho (em grãos) 56 271 772 66 014 465 3°
Soja (em grãos) 74 941 773 66 597 687 2°
Total 160 091 013 158 601 837 -
Fonte: Adaptado de IBGE (2012)
27
Figura 1 – Anticarsia Gemmatalis, considerada a pincipal praga da soja (Glycine max). Estágio Larval em
(A) e adulto em (B)
Fonte: DOWAGRO (2012)
Fonte: WIKIPEDIA (2012a)
A
B
28
Figura 2 – Spodoptera frugiperda, uma das principais pragas do milho (Zea mays). Fase larval em (A) e
inseto adulto em (B)
Fonte: WIKI.BUGWOOD (2012a)
Fonte: WIKIMEDIA (2012)
A
B
29
Figura 3 – Anthonomus grandis, inseto-praga do algodão (Gossypium sp.). Fase larval em (A) e inseto adulto
em (B)
Fonte: FORESTRYIMAGES (2012)
Fonte: IPMIMAGES (2012)
A
B
30
1.3 Insetos como vetores de doenças humanas e animais
Dentre os metazoários, os artrópodes são os que obtiveram maior sucesso
evolutivo e ecológico, perfazendo o maior filo de animais existentes. Só os insetos totalizam
mais de um milhão de espécies e dentre esses cerca de 14 000 desenvolveram o hábito da
hematofagia, ou seja, obtenção de nutrientes através do repasto sanguíneo em outros animais
(RIBEIRO, 1995). Durante um repasto sanguíneo em mamíferos pode se iniciar uma relação
parasita-hospedeiro intermediário entre o inseto e diferentes tipos de patógenos, como vírus e
protozoários, os quais passam parte do seu ciclo de vida no intestino dos insetos. Os insetos
hematófagos podem ainda atuar como vetores de doenças ao transmitir, através da
hematofagia, os parasitas para a corrente sanguínea de hospedeiros definitivos como humanos
e outros animais, causando enfermidades nesses (GOODING, 1966).
O mosquito Aedes aegypti é o maior vetor urbano da dengue em todo o mundo.
Nos últimos 25 anos houve um aumento na distribuição do inseto e na atividade epidêmica do
vírus (MACKENZIE et al., 2004). No Brasil, apesar dos programas de vigilância e controle, o
país tem registrado números alarmantes de casos de dengue nos últimos 21 anos. Segundo
informes epidemiológicos do Ministério da Saúde (SINAN, 2012ab), apenas em 2010 foram
registrados mais de um milhão de casos de dengue clássica, o maior número já registrado no
País. Em 2011 foram registrados 764.032 casos, uma diminuição de quase 25%, com maior
incidência nas regiões Norte, Nordeste e Sudeste. Em relação à dengue hemorrágica ou febre
hemorrágica da dengue (DFH), uma forma mais severa e mortal da doença, foram registrados
3700 casos em 2010 e 2801 casos em 2011, com maior prevalência nas regiões Sudeste (1338
casos) e Nordeste (1056 casos) do país.
Recentemente, um estudo detalhado sobre a filogenia do gênero Aedes e de outros
45 taxa, resultou na reclassificação taxonômica desses mosquitos. Uma das mais importantes
alterações foi no subgênero Stegomyia, que foi elevado ao status de gênero. Desta forma, o
então Aedes aegypti tornou-se Stegomyia aegypti, que pode ser abreviado como St. aegypti, e
o Aedes albopictus tornou-se Stegomyia albopicta. Neste último caso, o nome masculino foi
passado para a forma feminina para concordar com o nome do gênero Stegomyia (REINERT;
HARBACH; KITCHING, 2004).
31
Os mosquitos se desenvolvem através de metamorfose completa, e o ciclo de vida
compreende quatro estágios: ovo, larva, pupa e adulto, das quais as três primeiras fases são
aquáticas, e a que corresponde ao mosquito adulto ocorre na terra. Os ovos são depositados
pela fêmea, após repasto sanguíneo, em superfícies úmidas logo acima da linha da água,
havendo preferência por locais artificiais, geralmente ao redor de casas, como jarros de flores,
pneus, garrafas, cisternas e quaisquer outros recipientes capazes de armazenar água limpa
(WHO, 1999). As larvas são providas de grande mobilidade e não selecionam alimentos, o
que facilita a ação de larvicidas por via oral (CONSOLI e OLIVEIRA, 1994). As larvas
passam por quatro estádios (L1, L2, L3 e L4). A duração do desenvolvimento larval depende
da temperatura, da disponibilidade de nutrientes e da densidade de larvas. Sob condições
ótimas, o tempo necessário para atingir a fase adulta pode ser somente de 7 dias, incluindo os
dois dias da fase de pupa. Os machos e a fêmeas adultos alimentam-se de carboidratos
extraídos de vegetais, sendo que as fêmeas se alimentam mais frequentemente de sangue de
animais vertebrados, mostrando, no entanto, marcada predileção pelo homem. Tão logo se
tornem adultos, acasalam-se, e as fêmeas alimentam-se de sangue nas 36 h seguintes, devido
ao fato de que o sangue contém proteínas necessárias à maturação dos ovos. O mosquito
adulto prefere ficar dentro de casa, alimentando-se mais durante o dia (WHO, 1999). Em
média, cada Ae. aegypti vive em torno de 30 dias e a fêmea chega a colocar entre 150 e 200
ovos de cada vez, sendo capaz de realizar inúmeras posturas no decorrer de sua vida mesmo
copulando com o macho uma única vez, já que armazena os espermatozoides em suas
espermatecas (reservatórios presentes dentro do aparelho reprodutor) (CONSOLI;
OLIVEIRA, 1994).
Atualmente, a prospecção por alternativas aos inseticidas sintéticos tem se
concentrado em fontes vegetais, especialmente oriundas do metabolismo secundário de
angiospermas (CARVALHO et al., 2003; FARIAS et al., 2009; SHAALAN et al, 2005;
SOUZA et al., 2012). No tocante aos inseticidas vegetais de natureza proteica, muitos estudos
tem demonstrado o efeito de lectinas vegetais no desenvolvimento e mortalidade de larvas de
Ae. aegypti (COELHO et al., 2009; SÁ et al., 2009; NAPOLEÃO et al., 2012) e ainda, De
Arruda et al.(2010) avaliaram o efeito do inibidor de tripsina purificado de sementes de soja
(SBTI) sobre a mortalidade das larvas do mosquito (LC50 = 32,65 mg.L-1
). Nesse sentido, há
32
ainda uma carência de estudos que avaliem o potencial de inibidores de peptidases para o
controle do vetor da dengue.
33
Figura 4 – Aedes aegypti, vetor da dengue. Fase larval (A) e fêmea adulta (B)
Fonte: BLOGSPOT (2012)
Fonte: WIKIMEDIA (2012b)
A
B
34
Figura 5 – Ciclo de vida do culicídeo vetor da dengue, Aedes aegypti
Fonte: França (2000)
35
1.4 Inibidores de peptidases
Um dos eventos mais frequentes e importantes em enzimologia é a clivagem de
ligações peptídicas de proteínas, evento esse desempenhada por enzimas proteolíticas,
também conhecidas como peptidases ou proteases. Uma vez que os primeiros estudos com
peptidases focavam no processo digestivo humano e animal, acreditava-se que esse era o seu
único papel fisiológico. No entanto, hoje sabemos que são ubíquas e estão envolvidas em um
grande repertório de processos fisiológicos-chave, como eventos hormonais, cascata da
coagulação sanguínea, respostas imunes, progressão do ciclo celular, morte celular,
homeostase, replicação do DNA etc. (NEURATH, 1989, TURK, 2006).
As peptidases estão divididas em dois grandes grupos: exopeptidases (quando
atuam hidrolisando ligações peptídicas nas extremidades N-terminal ou C-terminal da cadeia
proteica) e endopeptidases (quando hidrolisam ligações peptídicas dentro da proteína). Devido
à alta diversidade estrutural e bioquímica, as endopeptidases são categorizadas em diferentes
grupos (Tabela 1), classificação essa atualmente baseada em seus mecanismos de ação,
estruturas tridimensionais e resíduos de aminoácidos do sítio ativo envolvido na ligação ao
substrato e na catálise (NEURATH, 1989; SALAS et al., 2008; STOREY; WAGNER, 1986).
Inibidores de peptidases (IP’s) são proteínas, geralmente de baixa massa
molecular, que formam complexos estequiométricos inativos com peptidases, inibindo e
regulando assim a atividade catalítica dessas proteínas (VALUEVA; MOSOLOV, 1999).
Bem como as peptidases, os inibidores de natureza proteica são ubíquos, ocorrendo em
plantas, animais e micro-organismos (RYAN, 1990). Em plantas, são encontrados em todos
os tecidos vegetais, principalmente em tecidos de reserva como tubérculos e sementes de
monocotiledôneas e dicotiledôneas, onde perfazem entre 5-10% das proteínas solúveis em
água desses tecidos (VALUEVA; MOSOLOV, 1999). Sua função tem sido atribuída à
regulação de atividade proteolítica endógena, estocagem de proteínas e, mais comumente,
defesa contra insetos e outras pragas (CHAUDHARY et al., 2008).
Os IP’s envolvidos com a defesa vegetal podem ser expressos de forma
constitutiva ou induzível. Os inibidores de defesa constitutiva são sempre expressos pela
planta independentemente da predação por herbívoros. Em contrapartida, um IP é considerado
36
como induzível quando sua expressão ocorre apenas após o ataque da praga. Se o inibidor é
expresso apenas no tecido atacado, a defesa é dita local. Por outro lado, quando é expressa em
outros tecidos vegetais além do atacado pela peste, a defesa é sistêmica (CHEN, 2008;
PADUL; TAK; KACHOLE, 2012). A defesa constitutiva não é muito vantajosa para o
vegetal, pois há um grande gasto energético para manutenção da concentração de IP’s. A
defesa induzida é mais eficiente também devido à menor probabilidade de insetos-praga
desenvolverem resistência aos inibidores (PADUL; TAK; KACHOLE, 2012).
A estrutura terciária nativa da peptidase e do inibidor e a termodinâmica das
interações envolvidas determinam a especificidade do inibidor (MACEDO; XAVIER-FILHO,
1992). Essa especificidade levou à categorização dos IP’s de acordo com a classe mecanística
de enzimas que inibem, de forma que quatro classes de inibidores de proteinases foram
estabelecidas: inibidores de proteinases serínicas, cisteínicas, aspárticas e de metalo-
proteinases, sendo os inibidores de proteinases serínicas e os de peptidases cisteínicas os mais
estudados (RYAN, 1990; RICHARDSON, 1991; SALAS et al., 2008 ). Alguns inibidores são
capazes de inibir mais de uma enzima, sendo assim chamados de ‘‘inibidores bifuncionais’’
(OLIVEIRA et al, 2007ab).
Os inibidores de peptidases serínicas são categorizados de acordo com as
propriedades estruturais (sequência aminoacídica, massa molecular, conteúdo de cisteínas e
pontes dissulfeto) em sete famílias de inibidores: Kunitz, Bowman-Birk, Batata, Ragi I-2/
milho, Mostarda, Cereal e Taumatina (OLIVA, 2000; RICHARDSON, 1991). Dentre esses,
os inibidores do tipo Bowman-Birk e do tipo Kunitz são os mais amplamente estudados. Vale
também ressaltar que de várias espécies vegetais foi purificado mais de um inibidor, muitas
vezes pertencentes a diferentes famílias de inibidores; Dois exemplos a destacar são a soja
(Glycine max), de cujas sementes foram purificados inibidores do tipo Bowman-Birk e Kunitz
(KUNITZ, 1946; KUNITZ, 1947; OLIVA; SAMPAIO, 2009) e Momordica charantia, com
pelo menos dez IP’s de quatro diferentes categorias de inibidores isolados de suas sementes
(TSOI et al., 2004).
Os inibidores de peptidases de origem vegetal têm apresentado atividades
biológicas de importância fisiopatológica e agronômica como, por exemplo, efeito inseticida
(DUNSE et al., 2010; LAWRENCE; KOUNDAL, 2002), antimicrobiano (KIM et al., 2005),
antiproliferativo (CACCIALUPI; CECI, 2010; CLEMENTE et al., 2005), quimiopreventivo
37
(DE FLORA; FERGUSON, 2005; MCCORMICK et al., 2007), antiviral (LIN; NG, 2008),
inflamatório (MELLO et al., 2009), anti-inflamatório (RIBEIRO et al., 2010)
etc.comprovando, dessa forma, a flexibilidade o e potencial biotecnológico dessas moléculas.
No que concerne à atividade tóxica contra insetos, há relatos de avaliação do
efeito de inibidores de peptidases em insetos de diferentes ordens (CARLINI; GROSSI DE
SÁ, 2002) e estágios de vida, tanto in vitro (MACEDO et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2007a
) quanto in vivo (BROADWAY; DUFFEY, 1986; MACEDO et al., 2003). Além disso,
alguns genes codificando inibidores de peptidases foram inseridos em plantas transgênicas,
conferindo nesses vegetais a resistência contra importantes insetos-praga (DUNSE et al.,
2010). Tamanho efeito é decorrente da inibição da atividade hidrolítica das várias proteinases
digestivas encontradas no intestino médio desses insetos para a digestão de proteínas vitais
para a sua sobrevivência e desenvolvimento (TERRA, 1999; TERRA; FERREIRA, 1994).
1.4.1 Inibidores de peptidase do tipo Batata I
A superfamília de IP’s do tipo Batata reúne dois grupos, a família de inibidores do
tipo Batata I e a família de Inibidores do tipo Batata II. De acordo com Dunse et al. (2010),
ambos as tipos de inibidores são produzidos por plantas da família botânica Solanaceae como
um mecanismo de defesa contra insetos e microorganismos. No entanto, enquanto os
inibidores do tipo Batata II são restritos a espécies dessa família botânica, os inibidores do
tipo Batata I são difundidos entre eucariotos como plantas e animais (HABIB; FAZILI, 2007).
Também chamados de família de inibidores de proteinases do tipo I, os membros
da família Batata I são proteínas geralmente monoméricas de aproximadamente 8 kDa,
frequentemente sem pontes dissulfeto (HABIB; FAZILI, 2007). Esses inibidores podem ser
expressos de forma contitutiva ou induzível, possuindo variação na especificidade para
diferentes peptidases, incluindo tripsina, quimotripsina, elastase, catepsina B e subtilisina,
nesse último caso sugerindo envolvimento desses inibidores em defesa contra
microoganismos. Outra característica comum no grupo é a aparente falta de hipervariabilidade
na região do sítio reativo (CAI et al., 1995; BEUNING; SPRIGGS; CHRISTELLER, 1994).
38
Tabela 2 – Classificação de peptidases de acordo com diversidade estrutural e bioquímica
Famílias Faixa de pH ótimo Resíduos do sítio
ativo
Enzimas Principais sítios de ação Observação
Resíduos P1 Resíduos P1’ -
Serínicas 7,0-9,0 Asp, Ser, His Elastase Não carregados e não
aromáticos. Especialmente
Ala, Ser e Gly
Não específico -
Quimotripsina Trp, Tyr e Phe Não específico -
Subtilisina Aminoácidos ácidos e
neutros
Não específico -
Tripsina Arg, lys Não específico -
Cisteínicas 4,0-7,0 Cys, Asp, His Papaína Pouco específico,
preferencialmente
aromáticos e hidrofóbicos, em especial Arg, Lys
Não específico -
Bromelaína Lys, Ala, Tyr Não específico -
Aspárticas <5,0 Asp Pepsina Clivam preferencialmente
resíduos aromáticos e outros hidrofóbicos, em especial
Phe e Leu
Não específico P1 e P1’ não
podem ser Ala, Val, Gly Catepsina D
Metalo-proteases 7,0-9,0 Zn, Glu, His Termolisina Não específico Leu, Phe, Ile, Val,
Met, Ala
-
Fonte: Adaptado de BEYNON; BOND, 1989; VARELA, 2010.
39
1.5 Sapindus saponaria L.
Sapindus saponaria L.(Figura 6), conhecida popularmente como sabonete ou
sabão de macaco, é uma árvore de porte regular com madeira branco-amarelada, folhas
pinadas e flores amareladas ou brancas em cachos terminais. O fruto é uma cápsula
transparente e globosa de cor amarelada, contendo uma semente negra e globoide (MATOS,
1997). Nativa da região amazônica, essa espécie da família botânica Sapindaceae é
amplamente distribuída no Norte, Nordeste e Centro-Oeste Brasileiro. É uma planta perene,
florescendo no fim do verão (KISSMAN; GROTH, 2000).
A espécie é reconhecidamente tóxica, devido à presença de saponinas em toda a
planta, sobretudo nas sementes, aonde a concentração desse grupo de metabólitos secundários
atinge níveis de até 30% (KISSMAN; GROTH, 2000). Ainda devido à ocorrência desses
metabólitos, as sementes são utilizadas por populações carentes como sabão para lavagem de
roupas e utensílios domésticos (ALBIERO; BACCHI; MOURÃO, 2001).
Apesar da reconhecida toxicidade, S. saponaria possui diversos usos
etnobotânicos, o tegumento do caule, folhas, raiz e frutos dessa espécie vegetal são
administrados em forma de infusão para o tratamento de leucorreia, uretrites, anemias, úlceras
etc. (BALBACH, 1926; MATOS, 1997). Devido o alto teor de compostos secundários como
triterpenóides e saponinas, pesquisas de interesse cosmético e farmacológico têm sido
realizadas com espécies do gênero Sapindus (ALBIERO; BACCHI; MOURÃO, 2001).
Estudos realizados por Dos Santos et al. (2008) avaliaram o efeito de extratos
aquosos de sementes de S. saponaria sobre a sobrevivência e desenvolvimento do inseto
Spodoptera frugiperda. As larvas alimentadas com folhas de milho contendo o extrato aquoso
de S. saponaria na concentração de 1%, tiveram um decréscimo significativo no peso (70%) e
uma alta mortalidade (63,3%) em comparação com o grupo controle (alimentados com folhas
de milhos sem o extrato aquoso de S. saponaria). Os autores mostraram ainda a provável
relação entre a atividade tóxica e a presença de inibidores de peptidases nas sementes de S.
saponaria.
40
Macedo et al. (2011) purificaram e caracterizaram um inibidor de tripsina das
sementes de S. saponaria. Com uma massa molecular de 18 kDa, o primeiro inibidor de
tripsina de sementes de S. saponaria, nomeado de SSTI, pertence à família de inibidores do
tipo Kunitz e é composto por duas cadeias polipetídicas ( 15 e 3 kDa) ligadas por uma a duas
pontes dissulfeto. O SSTI apresenta um baixa constante de inibição (2,4 x 10-9
mol.L-1
), sendo
assim, altamente eficaz em inibir a atividade proteolítica da tripsina, apresentando, no entanto,
atividade inibitória pouco representativa contra outras enzimas (quimotripsina, elastase
pancreática, plasmina, trombina humana etc) e mostrando também elevada inibição contras
as enzimas digestivas de Anagasta kuehniella, Anticarsia gemmatalis, Corcyra cephalonica e
Diatrea saccharalis.
De posse do grande potencial inseticida das sementes de S. saponaria, do elevado
teor de inibidores de peptidases e da capacidade de algumas sementes em expressar mais de
um inibidor de peptidese, é válido investigar a presença de outros inibidores inseticidas em
sementes de S. saponaria.
41
Figura 6 – Sapindus saponaria L., planta-alvo do estudo. Frutos em (A) e exemplar de uma planta adulta em
(B)
Fonte: DISCOVERLIFE (2012)
Fonte: WIKIMEDIA (2012c)
A
B
42
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito biológico de um novo inibidor de
tripsina purificado das sementes de Sapindus saponaria L. sobre as enzimas digestivas de
insetos pragas e insetos vetores de doenças.
2.2 Objetivos específicos
Purificar um inibidor de tripsina de sementes de S. saponaria;
Caracterizar o inibidor purificado quanto à massa molecular acurada, estrutura
primária, especificidade enzimática e concentração inibitória média (CI50);
Determinar a família do inibidor purificado através de ferramentas de bioinformática;
Avaliar o efeito in vitro do inibidor sobre enzimas do mosquito vetor da dengue
(Aedes aegypti) e de insetos pragas da agricultura brasileira (Anthonomus grandis,
Anticarsia gemmatalis e Spodoptera frugiperda).
43
3. MATERIAL
3.1 Material biológico
3.1.1 Sementes de Sapindus saponaria
Os frutos de S. saponaria foram coletados no município de Tamboril, no interior
do Ceará, localizado a 284 km de Fortaleza. Um ramo terminal com folhas e frutos foi
coletado, prensado e desidratado para posterior incorporação e identificação no Herbário
Prisco Bezerra (EAC), Universidade Federal do Ceará, sob a identificação EAC 38-601.
3.1.2 Insetos
Larvas de Aedes aegypti, foram coletadas no insetário de culicídeos do
Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais (Bioprospec), do Departamento de
Biologia da UFC. Larvas de Anthonomus grandis, Anticarsia gemmatalis, e Spodoptera
frugiperda foram gentilmente cedidas pelo setor de Controle Biológico da Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia (Brasília, DF).
3.2 Reagentes químicos
3.2.1. Proteínas
Albumina sérica bovina (BSA), tripsina, quimotripsina, papaína e bromelaína
foram adquiridas da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EEUU). Marcadores de massa molecular
foram obtidos da Invitrogen (USA) e misturas de peptídeos foram adquiradas da Bruker
Daltonics (Billerica, EUA).
44
3.2.2. Substratos Enzimáticos
Os substrato sintético BApNA (Nα-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida) e o
substrato proteico azocaseína foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, EEUU).
3.2.3. Outros reagentes
Pepsina e tripsina imobilizadas em agarose foram obtidas da PIERCE (Rockford,
EUA), Matriz cromatográfica Sepharose 4B foi adquirida da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis,
EEUU).
45
4. MÉTODOS
4.1 Processamento de sementes de Sapindus saponaria
Após a coleta, o exocarpo e o endocarpo dos frutos de S. saponaria foram
excisados e a semente foi recolhida para posterior processamento em moinho de café e
peneiramento em malha de 1 mm². Em seguida, devido ao alto percentual de lipídeos (25%), a
farinha homogênea foi delipidada com n-hexano na proporção 1:3 (p/v), sendo realizado um
número total de 4 trocas. A farinha delipidada foi então armazenada em recipiente plástico à
temperatura ambiente até a preparação dos extratos.
4.2 Quantificação de proteínas
O teor de proteínas solúveis foi determinado pela metodologia de Bradford (1976)
usando-se albumina sérica bovina (BSA) como proteína padrão. Durante as etapas
cromatográficas, leituras de absorbância a 216 e 280 nm foram empregadas no monitoramento
das frações proteicas.
4.3 Ensaio de determinação da atividade inibitória de peptidase serínicas
Para avaliar a capacidade das amostras em inibir a atividade proteolítica das
enzimas tripsina e quimotripsina, foi utilizada a metodologia descrita por Charney e Tomarelli
(1947). Nessa metodologia, que faz uso do substrato inespecífico azocaseína, pode ser
avaliada a capacidade de inibidores em interferir na atividade proteolítica de determinada
enzima, a depender da enzima utilizada no ensaio. Dessa forma, 5 µL de uma solução de
tripsina (0,3 µg/µL em HCl 1 mmol.L-1
) ou de quimotripsina bovina (0,3 µg/µL em HCl 1
46
mmol.L-1
) foram pré-incubados por 15 min a 37 °C com 220 µL de tampão Tris-HCl 50
mmol.L-1
com CaCl2 20 mmol.L-1
, pH 7,5 e 25 µL da solução teste. Após esse período, a
reação foi iniciada adicionando-se 100 µL de uma solução de azocaseína a 1% (p/v) em
tampão Tris-HCl 50 mmol.L-1
, pH 7,5. Decorridos 30 min, a reação foi interrompida
adicionando-se 150 µL de uma solução de TCA a 20%. A mistura de reação foi centrifugada a
10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante alcalinizado com hidróxido de sódio 2 mol.L-1
na
proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor do produto da clivagem da azocaseína pela
enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm em espectrofotômetro 700 Plus
(Femto, São Paulo, Brasil). Provas em branco foram realizadas em duplicata e os testes em
triplicata. Os resultados foram expressos em Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição
(UI), definida como o decréscimo em 0,01 da absorbância a 440 nm.
4.4. Ensaio de determinação da atividade inibitória de peptidase cisteínicas
Para a determinação da atividade do inibidor purificado sobre a catalítise proteica
promovida por bromelaína e papaína, a metodologia descrita por Charney e Tomarelli (1947),
com algumas modificações, foi utilizada:
No caso do ensaio de determinação da inibição da bromelaína, 10 µL de uma
solução da enzima (1 µg/µL em HCl 1 mmol.L-1
) foram pré-incubados por 20 min a 45 °C
com 399,06 µL de tampão acetato de sódio 50 mmol.L-1
, pH 6,0, 40 µL de solução ativadora
(DTT 3 mmol.L-1
e EDTA 2 mmol.L-1
) e 0,94 µL (1 µg/µL) do inibidor purificado. No ensaio
de determinação da atividade inibitória da papaína, 40 µL de solução da enzima (0,2 µg/µL
em HCl 1 mmol.L-1
) foram pré-incubados por 10 min a 37 °C com 369,06 µL de tampão
acetato de sódio 50 mmol.L-1
, pH 6,0, 40 µL de solução ativadora (DTT 3 mmol.L-1
e EDTA
mmol.L-1
) e 0,94 µL (1 µg/µL) do inibidor purificado. Em ambos os casos, após o período de
incubação, a reação foi iniciada adicionando-se 200 µL de azocaseína a 1% (p/v) em tampão
acetato de sódio 50 mmol.L-1
, pH 6,0. Decorridos 40 min, a reação foi interrompida
adicionando-se 150 µL de uma solução de TCA 20%. A mistura de reação foi centrifugada a
10.000 x g, por 10 min e o sobrenadante alcalinizado com hidróxido de sódio 2 mmol.L-1
na
proporção 1:2 (v/v), a fim de intensificar a cor do produto da clivagem da azocaseína pela
47
enzima. A leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm em espectrofotômetro 700 Plus
(Femto, São Paulo, Brasil). Provas em branco foram realizadas em duplicata e os testes em
triplicata. Os resultados foram expressos em Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição
(UI), definida como o decréscimo em 0,01 da absorbância a 440 nm.
4.5 Ensaio de determinação da atividade inibitória de tripsina
Para determinação da atividade inibitória da tripsina, foi empregado o ensaio
proposto por ERLANGER, KOLOWSKY e COHEN (1961). Nesse ensaio, o substrato
sintético BApNA (N-α-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida) é utilizado por ser específico para
clivagem por tripsina. Assim, 5 µL de uma solução de tripsina (0,3 µg/µL em HCl 1 mmol.L-
1) foram pré-incubados com 345 µL de tampão Tris-HCl 50 mmol.L
-1com CaCl2 20 mmol.L
-1,
pH 7,5 e com 50 µL da solução teste. Decorridos 10 min, foram adicionados 250 µL de uma
solução de BApNA 1,25 mmol.L-1
e então deixado sob incubação por 15 min. A reação
enzimática foi interrompida com a adição de 60 µL de ácido acético a 30% e a leitura da
absorbância das amostras realizada em leitor de microplacas Spectramax 190 (Molecular
Devices, Sunnyvale, EUA) utilizando o comprimento de onda de 410 nm. Provas em branco
foram realizadas em duplicata e os testes em triplicata. Os resultados foram expressos em
Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição (UI), definida como o decréscimo em 0,01
da absorbância a 440 nm.
4.6 Purificação do inibidor de tripsina das sementes de Sapindus saponaria (SsTI2)
4.6.1 Preparo do extrato proteico bruto (EB) de sementes S. saponaria
A farinha delipidada de sementes de S. saponaria foi dissolvida em tampão Tris-
HCl 50 mmol.L-1
pH 7.5, na proporção 1:10 (p/v), sendo a suspensão deixada sob agitação à
48
temperatura ambiente por 3 horas, filtrado em malha de nylon, seguida de centrifugação- a
10.000 x g, durante 30 min a 4 °C. O precipitado foi descartado e o sobrenadante, utilizado
para os passos posteriores de purificação, foi denominado de Extrato proteico bruto de S.
saponaria (EB).
4.6.2 Fracionamento do EB com ácido tricloroacético
Com a finalidade de remover proteínas de alta massa molecular do extrato
proteico bruto de S. saponaria (EB) antes de se iniciar os procedimentos cromatográficos, o
EB foi submetido à precipitação de proteínas por adição de ácido tricloroacétio (TCA). Dessa
forma, soluções de EB encerrando uma concentração final entre 1-5% de TCA foram
cuidadosamente preparadas e o sobrenadante resultante foi avaliado em relação ao teor de
proteínas solúveis e à capacidade de inibir tripsina e quimotripsina bovinas, indicando assim
qual fração precitada com o ácido seria a mais promissora para os passos posteriores de
purificação. O processo de precipitação foi realizado com a lenta adição de TCA 20% sob
agitação em banho de gelo, seguida de repouso por 40 min e centrifugação por 10.000 x g à
temperatura de 4 °C durante 30 min. O sobrenadante resultante de cada precipitação foi
transferido para membranas com poros de 3,5 kDa e submetido à diálise por 10-12 h contra
Tris-HCl 50 mmol.L-1
, pH 7,5. A fração proteica com maior atividade inibitória específica de
tripsina foi selecionada para os passos posteriores de purificação.
4.6.3 Cromatografia de afinidade à matriz de Tripsina-Sepharose 4B
Para a cromatografia de afinidade à tripsina, foram acoplados aproximadamente
60 mg de tripsina bovina a 3 g de resina Sepharose 4B ativada com brometo de cianogênio
(Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), seguindo instruções do fabricante . Após a preparação da
matriz, o gel de aproximadamente 11 mL foi transferido para uma coluna cromatográfica de
vidro (15,2 x 2,4 cm) e então, realizado o primeiro passo cromatográfico. A F1% (obtida por
precipitação com TCA 20%) previamente dialisada contra tampão Tris-HCl 50 mmol.L-1
, pH
49
7,5, foi aplicada (6 mg de proteína por cromatografia) na coluna equilibrada com o mesmo
tampão. Para eluição do material retido, foi aplicada na coluna uma solução de HCl 50
mmol.L-1
, usando-se o fluxo constante de 1,0 mL.min-1
e coletando-se 1,5 mL de material
adsorvido em cada tubo de ensaio. O perfil cromatográfico das proteínas foi acompanhado por
espectrofotometria a 280 nm e a fração adsorvida na matriz de afinidade, denominada de
Ss1Af, foi dialisada contra água Milli-Q durante 24 horas, sendo realizadas duas trocas e,
então, o material liofilizado. Esse procedimento foi realizado diversas vezes até a obtenção de
material suficiente para o passo cromatográfico posterior.
4.6.4 Cromatografia de fase reversa em coluna C4 semi preparativa
A fração proteica Ss1Af foi submetida à cromatografia de fase reversa em sistema
de cromatografia líquida de alta eficiência (RP-UFLC), em uma coluna semi-preparativa
Jupiter do tipo C4 (10 µm, 250 x 10 mm) (Phenomenex, Torrance, EUA). Devido à baixa
solubilidade do material, a cada cromatografia 1 miligrama de Ss1Af era ressuspenso em 500
µL de solução A – ácido trifluoracético TFA 0,1% (v/v) em água Milli-Q e aplicado na
coluna previamente equilibrada com 5% de solução B - TFA 0,1% (v/v) em acetonitrila
(ACN). A cromatografia foi iniciada com uma lavagem com 5% de solução B para retirada do
material não retido na coluna e então foi aplicado um gradiente crescente de ACN (Tabela 3).
O procedimento foi conduzido à temperatura ambiente durante 60 min e monitorado por
medidas de absorbância a 216 e 280 nm. Os produtos cromatográficos gerados foram
individualmente coletados e avaliados quanto à capacidade de inibir a tripsina bovina. Os
produtos cromatográficos que apresentaram elevado percentual de inibição proteolítica (>
95%) foram analisados por espectrometria de massa a fim de avaliar a diversidade, pureza e
massa molecular dos componentes dessas frações proteicas.
50
Tabela 3 – Gradiente crescente de solução B (ácido trifluoroacético 0,1% em acetonitrila) empregado
durante cromatografia de fase reversa em sistema RP-UFLC¹ de material proveniente da cromatografia
de afinidade (Ss1Af)
Tempo
(minutos)
Solução A
(%)
Solução B
(%)
0-5 95 5
5-35 95-40 5-60
35-40 40 60
40-45 40-5 60-95
45-50 5 95
50-55 5-95 95- 5
55-60 95 5
¹Foi utilizada uma coluna semi preparativa C4 sob um fluxo constante de 2,5 mL/min. Antes da
aplicação da amostra, a coluna foi previamente equilibrada com Solução A, que consistia de
TFA 0,1% (v/v) em água milli-Q.
51
4.7 Caracterização Bioquímica
4.7.1 Avaliação da diversidade e pureza das frações cromatográficas obtidas em RP-UFLC
(do inglês, Reverse Phase-Ultra Fast Liquid Chromatography)
Com a finalidade de avaliar a diversidade de proteínas presentes nas frações 1 e 2
obtidos em RP-UFLC, o material liofilizado foi resuspenso em água Milli-Q e adicionado a
uma solução saturada de matriz α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA) em uma proporção
1:3(v/v), aplicados em placa de MALDI-TOF/TOF e cristalizados à temperatura ambiente. A
solução de CHCA foi preparada em H2O/ACN/TFA (50/50/0,3, v/v/v) a 10 mg.mL-1
(50 mmol.L-
1). Em seguida, as amostras foram analisadas por espectrometria de massa do tipo MALDI-
TOF em um espetrômetro Microflex (Bruker Daltonics, Billerica, EUA) em modo linear
positivo em duas faixas de detecção 3.500-24.500 Da (Fração 1) e 4.000-20.000 Da ( Fração
2). O aparelho foi calibrado manualmente com o auxílio de uma mistura de peptídeos
denominada de “Peptide Calibration Standard II” (Bruker Daltonics, Billerica, EUA). As
condições do aparelho foram as seguintes: fonte de íon 1 com voltagem de 20 kV, fonte de
íon 2 com 18 kV e lentes com 9,5 kV.
4.7.2 Determinação da massa molecular acurada por espectrometria de massa
O inibidor purificado foi também analisado por espectrometria de massa do tipo
com ionização induzida por electrospray (ESI-TOF) em espectrômetro micrOTOF-Q II
(Bruker Daltonics, Billerica, EUA), onde a sua massa molecular acurada foi determinada.
Para isso, uma pequena alíquota do inibidor purificado foi dissolvida em ácido
fórmico/ACN/H2O (1/50/50, v/v/v) e então aplicada no equipamento. O espectro foi adquirido
por 15 min com seleção de íons positivos e voltagem do capilar de 4,5 kV, com detecção de
espectros entre 50-3000 Da. Para calibração manual do aparelho, foi utilizado o kit ESI tuning
mix (Agilent technologies, Santa Clara, EUA).
52
4.7.3 Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida
Para acompanhar a purificação do inibidor de tripsina de S. saponaria, o perfil
eletroforético das proteínas das diferentes etapas de purificação foi analisado por eletroforese
em gel de poliacrilamida em presença de SDS, através da metodologia descrita por Schägger e
Von Jagow (1987), com algumas modificações. Quinze microgramas de proteína obtida em
cada etapa de purificação foram ressuspensos em tampão de amostra (glicerol 10%, β-
mercaptoetanol 10%, SDS 2,3%, Tris 124 mM, Azul de bromofenol 0,01%) e aplicadas em
um gel sólido bifásico de poliacrilamida entre placas de vidro com dimensões de 10 x 8 cm.
O gel espaçador (15% de poliacrilamida) foi preparado com 800 µL de uma solução aquosa
de acrilamida-bisacrilamida 49,5% (p/v), 1.333 µL de solução tampão Tris-HCl 3 mol.L-1
, pH
8,45 com SDS 10 mmol.L-1
, 1.867 µL de água Milli-Q, 37 µL de persulfato de amônio 10%
(p/v) e 5 µL de temed. O gel de empilhamento (5% de acrilamida) foi preparado pela adição
de 367 µL de uma solução aquosa de acrilamida-bisacrilamida 49,5% (p/v), 588 µL de
solução tampão Tris-HCl 3 mol.L-1
, pH 8,45 com SDS 10 mmol.L-1
, 1.544 µL de água Milli-
Q, 37 µL de persulfato de amônio 10% (p/v) e 3 µL de temed. A solução tampão do catodo
era composta por Tris-HCl 0,1 mol.L-1
, tricina 0,1 M e SDS 3 mmol.L-1, pH 8,2. O tampão
do anodo usado na eletroforese era composto por Tris-HCl 1 M, pH 8,9. A eletroforese
ocorreu em sistema mini-gel Mini-Protean 3 (Biorad, Hercules, EUA) com voltagem
crescente de 40 – 80 V, durante 4 h. O gel de poliacrilamida foi corado com uma solução
contendo Comassie Brilliant Blue R-250 em MeOH/AcOH/H2O (4/1/5, v/v/v).
Posteriormente, o gel foi revelado com MeOH/AcOH/H2O (4/1/5, v/v/v) em água destilada.
Para estimar a massa molecular aparente de SsTI2 os demais componentes dos diferentes
passos de purificação foi utilizado o marcador molecular SeeBlue plus2 pre-stained Stanford
(Invitrogen®, USA).
53
4.7.4 Determinação da CI50 (concentração inibitória media) contra tripsina bovina
Para determinar a massa de inibidor que causa 50% de redução na atividade
proteolítica da tripsina bovina, o ensaio de inibição descrito no item 4.5 foi realizado
utilizando-se diferentes concentrações de SsTI2 (3 x 10-3
µmol.L-1
– 3,8 x 10-1
µmol.L-1
) e
concentrações constantes de enzima (0,3 µg/µL em HCl 1 mmol.L-1
) e substrato (BApNA,
1,25 mmol.L-1
). Os crescentes percentuais de inibição observados e as concentrações
utilizadas foram plotados em um gráfico e a CI50 foi calculada através de regressão linear
simples.
4.7.5 Sequenciamento do SsTI2
O sequenciamento do SsTI2 foi realizado no Laboratório de Espectrometria de
Massa (LEM), da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília, DF), coordenado
pelo pesquisador Carlos Bloch Júnior. Os experimentos foram realizados sob a supervisão e
colaboração do pesquisador Marcelo Porto Bemquerer. Para o sequenciamento completo do
novo inibidor de tripsina purificado das sementes de S. saponaria, foi necessário o uso de
diferentes técnicas de espectrometria de massa, tais como sequenciamento direto na fonte
(ISD, do inglês ion source decay), sequenciamento de novo de peptídeos gerados por
tratamento enzimático e comparação da massa molecular acurada (obtida por ESI-TOF) com
a massa teórica calculada a partir da sequência proposta. As técnicas utilizadas são descritas
nos tópicos seguintes.
4.7.5.1 Sequenciamento de SsTI2 por ionização direto na fonte
Inicialmente, o inibidor de tripsina purificado das sementes de S. saponaria foi
sequenciado por ionização direta na fonte (In Source Decay, ISD). Para isso, uma baixa
54
quantidade, cerca de 5 µg da proteína liofilizada, foi ressuspensa em 50 μL de água milli-Q,
acrescentada a uma solução saturada de 1,5-diaminonaftaleno (DAN) na proporção de 1:3
(v/v), aplicadas em placa de MALDI-TOF/TOF e cristalizadas à temperatura ambiente. A
solução de DAN foi preparada em H2O/ACN/TFA (50/50/0,3, v/v/v) a 10 mg.mL-1
(50 mmol.L-1
).
O espectro foi obtido em método RPISD, com voltagem da fonte de íon 1 de 20,0 kV, fonte
de íon 2 com 17,7 kV, lentes com 8,0 kV, refletor com 22,0 kV e refletor 2 com voltagem de
9,8 kV.
4.7.5.2 Tratamento de SSTI2 com enzimas proteolíticas
Antes de cada tratamento enzimático, o inibidor purificado sofreu redução e
alquilação. Para isso, 10 µg de inibidor liofilizado foram ressuspensos em 300 µL de uma
solução bicarbonato de amônio 100 mmol.L-1
com DTT 50 mmol.L-1
e incubados a 70 °C por
60 min. Em seguida, foram adicionados 300 µL de uma solução bicarbonato de amônio 100
mmol.L-1
com iodoacetamida 100 mmol.L-1
e, então, incubados a 37 °C por 40 min. Após a
interrupção do tratamento, a solução foi imediatamente filtrada em filtro de 0,22 µm e então
aplicada em uma coluna analítica de fase reversa C4 214 TP (Vydac Grace, EUA) (dimensões
4,6 x 250 mm), em sistema UFLC com loop de 500 µL. Antes do início da corrida, a coluna
foi equilibrada com uma solução de TFA 0,1% em água (Solução A). A corrida foi conduzida
à temperatura ambiente e monitorada nos comprimentos de onda de 216 e 280 nm sob fluxo
constante de 1,0 mL/min com gradiente crescente de TFA 0,1% (v/v) em acetonitrila
(Solução B) o qual é descrito na Tabela 4.
55
Tabela 4 – Gradiente crescente de solução B (ácido trifluoroacético 0,1% em acetonitrila) empregado
durante cromatografia de fase reversa em sistema RP-UFLC¹ para purificação do SSTI2 reduzido e
alquilado
¹Foi utilizada uma coluna analítica C4 sob um fluxo constante de 1,0
mL/min. Antes da aplicação da amostra, a coluna foi previamente equilibrada
com Solução A, que consistia de TFA 0,1% (v/v) em água milli-Q.
Tempo
(minutos)
Solução A
(%)
Solução B
(%)
0-15 95 5
15-20 95-75 5-25
20-50 75-40 25-60
50-55 40-5 60-95
55-60 5 95
60-65 5-95 95- 5
65-70 95 5
56
O tratamento enzimático específico para cada enzima foi realizado como descrito
a seguir:
Tripsina: Uma alíquota de 10 µL de tripsina imobilizada (PIERCE, Rockford,
EUA) em gel de agarose foi lavada sucessivas vezes com tampão bicarbonato de amônio 100
mmol.L-1
, pH 8,0 e então adicionada ao inibidor reduzido e alquilado, o qual foi previamente
ressuspenso em 50 μL do mesmo tampão, sendo então deixado sob agitação constante a 37 °C
por 90 min. Esse procedimento foi baseado nas instruções do fabricante.
Pepsina: Seguindo instruções do fabricante (PIERCE, Rockford, EUA), 15 µL de
pepsina imobilizada em gel de agarose foram ressuspensos em 240 µL de tampão acetato de
sódio 100 mmol.L-1
, pH 4,5, centrifugados a 1.000 x g por 10 min. Em seguida, descartou-se
o tampão e foram adicionados mais 240 µL do mesmo. Após quatro sucessivas lavagens, o
inibidor liofilizado foi ressuspenso em 60 μL do mesmo tampão e então adicionado a 10 μL
de resina contendo pepsina imobilizada. Essa solução foi deixada sob agitação constante a 37
°C overnight.
4.7.5.3 Purificação dos peptídeos de SSTI2 gerados por tratamentos enzimáticos
Os peptídeos gerados por hidrólise enzimática com tripsina e pepsina imobilizadas
em agarose foram purificados em coluna de fase reversa narrowbore, modelo XR-ODS
(Shimadzu Co., Japan) (2 x 30 mm), em sistema UFLC. Para isso, 40 µL da solução de
peptídeos gerados pelos diferentes tratamentos foram aplicados na coluna. A corrida
cromatográfica foi realizada sob fluxo constante de 0,4 mL/min e temperatura constante de
30°C (no caso dos peptídeos gerados por tratamento com tripsina) e 40 °C (peptídeos gerados
por tratamento com pepsina). O gradiente das soluções de TFA 0,1% em água milli-Q
(solução A) e TFA 0,1% em acetonitrila (solução B) aplicados nas corridas cromatográficas é
descrito na Tabela 5.
57
Tabela 5 – Gradiente crescente de solução B (ácido trifluoroacético 0,1% em acetonitrila) empregado
durante cromatografia de fase reversa em sistema RP-UFLC¹ para purificação de peptídeos gerados por
hidrólises enzimáticas independentes de SSTI2 com pepsina e tripsina imobilizadas em agarose
¹Foi utilizada uma coluna narrowbore sob um fluxo constante de 0,4 mL/min. Antes da
aplicação das amostras, a coluna foi previamente equilibrada com Solução A, que consistia de
TFA 0,1% (v/v) em água milli-Q.
Tempo
(minutos)
Concentração da
solução A (%)
Concentração solução B
(%)
5 95 5
5-25 95-40 5-60
25-27 40-10 60-90
27-30 10 90
58
4.7.5.4 Sequenciamento de novo dos peptídeos gerados por clivagem com enzimas
proteolíticas
Os peptídeos de SSTI2 gerados por hidrólises enzimáticas e purificados em
sistema UFLC foram acrescentados a uma matriz saturada de α-ciano-4-hidroxicinâmico
(CHCA) em uma proporção 1:3, aplicados em placa de MALDI-TOF/TOF e cristalizados à
temperatura ambiente. A solução de CHCA foi preparada em H2O/ACN/TFA (50/50/0,3, v/v/v) a
10 mg.mL-1
(50 mmol.L-1
). Os fragmentos foram analisados e sequenciados manualmente por
espectrometria de massa MALDI-TOF/TOF em espectrômetro ULTRAFLEX (Bruker
Daltonics, Billerica, EUA) e em espectrômetro AUTOFLEX SPEED (Bruker Daltonics,
Billerica, EUA). As sequências de alguns desses peptídeos foram ainda analisados e
confirmados em espectrômetro micrOTOF-Q II (Bruker Daltonics, Billerica, EUA).
Inicialmente, os peptídeos foram analisados e os seus respectivos espectros
adquiridos em modo refletido positivo, com detecção de massas entre 700-3.500 Da e então
entre 50 – 1200 Da. Em seguida, os íons foram fragmentados na célula de lift com aceleração
de 18,89 kV(AUTOFLEX SPEED) e 19,0 (ULTRAFLEX). As demais condições de modo lift
em aparelho AUTOFLEX SPEED foram as seguintes: 6,04 kV (fonte de íon 1), 5,29 kV(fonte
de íon), 3,0 kV (lentes), 27,0 kV (refletor 1), 11,7 kV (refletor 2) , 19,0 kV (célula de lift 1) e
4,3 kV (célula de lift 2). No equipamento ULTRAFLEX, as condições foram: 8,0 kV (fonte
de íon 1), 7,2 kV (fonte de íon 2), 3,6 kV (lentes), 29,5 kV (refletor 1), 13,8 kV (refletor 1) e
3,5 kV (célula de lift 2). A estrutura primária dos peptídeos foi interpretada manualmente por
sequenciamento de novo dos espectros obtidos nas análises de MS/MS. Os espectros foram
processados e visualizados utilizando o software FlexAnalysis 3.3.
4.7.5.5 Análise e alinhamento da sequência primária de SSTI2
As sequências aminoacídicas obtidas por ionização direto na fonte e as sequências
interpretadas pela fragmentação dos peptídeos gerados por tratamentos enzimáticos foram
alinhadas manualmente, comparadas e então uma estrutura primária para o SSTI2 foi
59
proposta. A sequência proposta para o inibidor foi analisada e comparada com sequências
existentes no banco de dados através da ferramenta BlastP presente na plataforma online
NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov). Em seguida,
as sequências que apresentaram maior identidade com o SSTI2 foram alinhadas com o
inibidor no software BioEdit v. 7.0.9.0, através da ferramenta de múltiplos alinhamentos
ClustalW.
4.8 Atividade biológica in vitro
4.8.1 Extração e preparo do homogenato intestinal de insetos
Larvas entre 3° e 4° ínstar de Aedes aegypti, Anticarsia gemmatalis, Anthonomus
grandis e Spodoptera frugiderda foram mantidas em banho de gelo por 15 min, mergulhadas
em uma solução de cloreto de sódio 150 mmol.L-1
e, com o auxílio de lupa estereoscópica e
pinças entomológicas, tiveram seus intestinos cuidadosamente retirados e transferidos para
microtubos de 1,5 mL contendo 100 µL de uma solução de Tris HCl 50 mmol.L-1
, pH 7,5 em
banho de gelo. Em seguida, os intestinos foram macerados com um macerador potter de vidro
por 10 min e, então, centrifugados durante 30 min a 10.000 x g em temperatura constante de 4
°C. Os sobrenadantes (homogenatos enzimáticos intestinais) obtidos foram imediatamente
utilizados para ensaios de inibição como descrito no próximo item.
4.8.2 Ensaio de inibição enzimática de peptidases digestivas de insetos
Para determinar a capacidade do SSTI2 em inibir a atividade proteolítica das
enzimas intestinais de Ae. aegypti, A. grandis, An. genmatalis e S. frugiperda, foram
realizados dois ensaios enzimáticos in vitro, nos quais o homogenato intestinal dos insetos foi
utilizado como fonte de peptidase. No primeiro ensaio, semelhante àquele descrito no item 4.3
60
utilizando o substrato inespecífico azocaseína, foi avaliada a atividade inibitória de SSTI2
sobre o pool de peptidase intestinais dos insetos. No segundo ensaio, foi avaliado o efeito
inibitório de SSTI2 sobre as enzimas do tipo tripsina presentes no homogenato intestinal dos
insetos, utilizando-se BApNA como substrato, como descrito no item 4.5 . Em ambos os
ensaios, foi utilizado 0,94 µg (0,192 µmol.L-1
) de SSTI2. Esse valor foi escolhido após a
determinação da CI50, onde também foi determinada a menor massa de inibidor capaz de
causar 100% de inibição.
61
5. RESULTADOS
Como pode ser observado na Figura 7, nesse estudo foram realizadas a
purificação, caracterização bioquímica parcial e avaliação da atividade inibitória in vitro sobre
as enzimas digestivas de insetos pragas de um novo inibidor de tripsina obtido de sementes de
Sapindus saponaria (SSTI2). O SSTI2 foi purificado após etapas de precipitação com ácido
tricloroacético, cromatografia de afinidade à tripsina e cromatografia de fase reversa. Em
seguida, os produtos cromatográficos com atividade inibitória de tripsina foram analisados
por espectrometria de massa, sendo então verificada a purificação do SSTI2. O inibidor
purificado caracterizado bioquímicamente e foi realizada a avaliação do efeito desse inibidor
sobre enzimas digestivas de insetos-praga. A Figura 8 mostra ainda o esquema utilizado para
a determinação da estrutura primária do SSTI2. Os passos utilizados no trabalho são
detalhadamente descritos nos item abaixo.
5.1 Isolamento e Purificação do novo inibidor de tripsina de sementes de Sapindus
Saponaria (SSTI2)
5.1.1 Seleção da fração proteica obtida por fracionamento com TCA 20%
Os resultados do fracionamento do extrato bruto de sementes de S. saponaria
estão apresentados na Figura 9. Como pôde ser observado, o aumento na concentração de
TCA causou um decréscimo na atividade inibitória de tripsina e quimotripsina em relação à
observada no extrato bruto. Além disso, pôde-se observar que entre as duas enzimas serínicas
testadas, a tripsina é a enzima cuja atividade proteolítica é mais afetada pelos inibidores de
protease das sementes de S. saponaria. Em vista disso, apenas a atividade inibitória de
tripsina foi monitorada durante os demais passos de purificação. Baseado-se nos resultados de
atividade específica e percentual de inibição da atividade proteolítica da tripsina descritos na
Tabela 6, a fração contendo 1% de TCA foi escolhida para os passos seguintes de
purificação.
62
Figura 7 – Estratégia utilizada para isolamento e purificação do novo inibidor de tripsina das sementes de
S. saponaria (SSTI2)
63
Figura 8 – Estratégia utilizada para a elucidação da estrutura primária do novo inibidor de tripsina de
sementes de S. saponaria (SSTI2)
64
Figura 9 – Atividade inibitória das frações proteicas de S. saponaria obtidas através de precipitação com
ácido tricloroacético (TCA). Foram realizados ensaios utilizando-se azocaseína 1 % (v/v) como substrato. Os
valores são médias de ensaios em triplicata, com seus respectivos desvios padrão
65
Tabela 6 – Atividade inibitória específica e percentual de inibição das frações proteicas de Sapindus
saponaria obtidas por fracionamento com ácido tricloroacético (TCA). Atividade inibitória específica
expressa em unidades de inibição¹ por miligrama de proteína (UI/mgP). Foram realizados ensaios utilizando-se azocaseína 1 % (v/v) como substrato. Destacada em negrito, a fração escolhida para os passos posteriores de
purificação por apresentar a maior atividade específica
Grupo Inibição de tripsina
(%)
Atividade inibitória
específica
(UI/mgP)
EB 91 115,56
F1% 91 1740,20
F2% 88 1627,36
F3% 91 1337,12
F4% 81 1309,92
F5% 79 860,72
¹ Uma unidade de inibição é definida como o decréscimo em
0,01 na absorbância a 440 nm no ensaio de atividade inibitória de quimotripsina segundo Charney e Tomarelli (1947).
66
5.1.2 Cromatografia de afinidade de F1% em matriz de Tripsina-Sepharose 4B
A fração proteica de S. saponaria precipitada com TCA na concentração final de
1% (F1%) foi submetida à cromatografia de afinidade em uma matriz de tripsina-Sepharose
4B (Figura 10), gerando uma fração de moléculas não retidas e uma fração de moléculas
retida à matriz. Alíquotas de 1,5 mL de cada fração foram coletadas em tubos de ensaio. As
frações não adsorvidas na matriz foram eluídas com tampão Tris-HCl, 50 mmol.L-1
, pH 7,5, e
as frações proteicas adsorvidas foram eluídas com HCl 50 mmol.L-1
. O fluxo aplicado durante
a cromatografia foi de 1 mL/min e a densidade óptica monitorada a 280 nm. Foram juntados
os tubos contendo o material não retido (pool não retido) e os tubos contendo material retido
(pool retido) e avaliados quanto à capacidade de inibir a tripsina bovina, apresentando,
respectivamente, 19 e 100% de inibição sobre a atividade proteolítica da tripsina bovina.
Apenas a fração retida na matriz (denominada de SS1Af) foi dialisada e, posteriormente,
utilizada nas demais etapas de purificação.
67
Figura 10 – Perfil de eluição da F1% em matriz de afinidade Tripsina-Sepharose 4B. Foram aplicados 6 mg
de proteína. A coluna foi previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mmol.L-1, pH 7,5 e as proteínas
retidas na matriz foram eluídas com HCl 50 mmol.L-1. Alíquotas de 1,5 mL de cada fração foram coletadas em tubos de ensaio e monitoradas a 280 nm. Foram juntados os tubos contendo o material não retido (pool não
retido) e os tubos contendo material retido (pool retido) e avaliados quanto à capacidade de inibir a tripsina
bovina
68
5.1.3 Cromatografia de SS1Af em coluna de fase reversa acoplado a sistema UFLC
Na Figura 11, pode ser observado o perfil cromatográfico obtido através de
cromatografia de fase reversa em sistema UFLC (LC – 20AD/T/Shimadzu, Kioto, Japan),
acompanhado por medidas de absorbância no comprimento de onda de 216 nm. Foram
geradas várias frações cromatográficas, as quais foram coletadas, liofilizadas e avaliadas
quanto à capacidade de inibir tripsina bovina. Dentre as frações coletadas, apenas duas
apresentaram percentual de inibição elevado (> 95%): as frações eluídas com 38,61 e 46,81%
de acetonitrila, sendo nomeados Pico 1 (P1, 95% de inibição) e Pico 2 (P2, SSTI2, 100% de
inibição), respectivamente. A diversidade proteica e massa molecular das frações ativas foram
analisadas por espectrometria de massa em espectrômetro do tipo MALDI-TOF.
5.1.4 Rendimento do SSTI2
As etapas utilizadas no processo de purificação do inibidor de tripsina de
sementes de S. saponaria estão sumarizadas na Tabela 7. O extrato bruto (EB), obtido na
primeira etapa do processo de purificação dos inibidores de sementes de S. saponaria, serviu
como referência para as demais frações proteicas, sendo o valor de purificação 1 e um
rendimento de 100% atribuídos a esse. O índice de purificação das demais frações foi
calculado como sendo a razão entre sua atividade especifica e a atividade especifica do EB. A
percentagem de rendimento das demais frações foi calculada com base na razão entre a sua
atividade inibitória e a atividade inibitória do extrato bruto multiplicado por 100. A atividade
específica foi calculada com base na razão entre a atividade inibitória da fração obtida e
proteína total da mesma fração. A tabela de purificação mostra que SSTI2 apresentou um
índice de purificação de 155 e um rendimento de 0,0033%.
69
Figura 11 – Perfil cromatográfico de SS1Af aplicado em coluna de fase reversa semi preparativa do tipo
C4, em sistema em sistema RP-UFLC. O material liofilizado foi ressuspenso em solução aquosa de ácido
trifluoracético 0,1% (v/v) e aplicado na coluna (2 mg.mL-1) previamente equilibrada com acetonitrila 5%. A cromatografia foi realizada à temperatura ambiente, sob um fluxo constante de 2,5 mL.min
-1. Inicialmente, a
coluna foi lavada com acetonitrila (ACN) 5% e, em seguida, foi aplicado um gradiente crescente de ACN (5-
95%) para eluição do material retido na coluna. As frações cromatográficas coletadas foram acompanhadas por
espectrofotometria a 216 nm e submetidas a ensaio de inibição de tripsina bovina. Os produtos cromatográficos
P1 e P2 foram eluídos com 39 e 47% de ACN, respectivamente, e selecionados para fins de purificação por
terem apresentado alta atividade inibitória de tripsina (> 95%).
70
Tabela 7 – Tabela de purificação do inibidor de tripsina obtido de sementes de Sapindus saponaria1. O cálculo foi baseado em uma extração de seis gramas de farinha
delipidada de sementes
Etapas
(Abreviaturas)
Massa de
proteína (mg)
Atividade
específica (UI/mg
prot)
Atividade
inibitória total
(UI)
Purificação²
(X)
Rendimento³ em
termo de proteína
(%)
Rendimento4 em
termo de
atividade (%)
EB 882,85 220,98 195.092,19 1,00 100,00 100
F1% 45,54 3.064,76 139.569,17 13,87 5,15 71,54
Ss1Af 1,96 17.348,72 34.003,44 78,51 0,22 17,42
SSTI2 0,03 34.202,13 1.026,06 154,77 0.0033 0,52
¹ O extrato bruto (EB) obtido na primeira etapa de purificação serviu como referência para as demais amostras. ² Índice de purificação 1 e rendimento de 100% foram atribuídos ao EB. O índice de purificação nos passos subsequentes foi calculado como sendo a razão entre a sua
atividade específica e aquela do EB.
³ O rendimento foi calculado como sendo a razão entre a quantidade de proteína total em cada etapa e aquela do EB, multiplicada por 100. 4 O rendimento foi calculado como sendo a razão entre a atividade total em cada etapa e aquela do EB, multiplicada por 100.
EB: Extrato proteico bruto; F1%: Fração proteica do EB precipitado com àcido tricloroacético; Ss1Af: fração proteica obtida em Tripsina-Sepharose; SSTI2: Novo inibidor
purificado de Sapindus saponaria.
71
5. 2 Caracterização bioquímica
5.2.1 Análise das frações com atividade inibitória de tripsina em MALDI-TOF
As frações resultantes do RP-UFLC que apresentaram alto percentual de inibição
(> 95%) sobre a atividade proteolítica da tripsina bovina foram analisadas por espectrometria
de massa do tipo MALDI-TOF em modo linear. A Figura 12a mostra a presença de pelo
menos sete proteínas na fração denominada de P1 (Pico 1) com diferentes massas moleculares
na faixa analisada (3.500-24.500 Da). Devido a essa heterogeneidade, não foi dado
prosseguimento aos passos de purificação e caracterização dessa fração proteica. Por outro
lado, a fração inicialmente denominada de P2 (Pico 2), cujo espectro de massa é mostrado na
Figura 12b, apresentou uma proteína majoritária com um intenso sinal de 7.578 Da na faixa
analisada (4.000 a 21.000 Da). A proteína purificada evidenciada nessa análise foi então
denominada SSTI2 (do inglês, Sapindus saponaria trypsin inhibitor 2). Vale ressaltar que um
desses sinais com baixa intensidade observados na Figura 12b possui aproximadamente o
dobro da massa de SSTI2, sugerindo formação de dímero.
72
Figura 12 – Espectros de massa dos produtos cromatográficos presentes em P1 e P2 adquiridos em
espectrômetro de massa do tipo MALDI-TOF. Os espectros foram obtidos em modo linear utilizando faixa de
detecção entre 3.500 – 24.500 Da para análise dos componentes de P1 (Figura 10a, acima) e entre 4.000-21.000 Da para análise dos produtos de P2 (Figura 10b, abaixo) (SSTI2). Devido ao grau de pureza observado na
análise, o SSTI2 foi submetido a procedimentos diversos para sua caracterização
B
A
73
5.2.2 Determinação da massa molecular acurada através de MS-ESI
A massa molecular acurada do inibidor de tripsina de S. saponaria foi
determinada por espectrometria de massa do tipo eletrospray (MS-ESI). A distribuição
multicargas do SSTI2 na faixa de massa situada entre aproximadamente 300 e 2.200 Da é
mostrada na Figura 13a, onde se podem observar os íons carregados com 6 – 10 prótons. O
íon carregado com 7 prótons (M + 7H+) foi escolhido para determinação da massa da
proteína, por ser aquele com sinal mais intenso. Na mesma figura, é apresentada a massa
molecular média do SSTI2, calculada a partir do íon. A Figura13b mostra a distribuição
isotópica desse mesmo íon, através do qual foi determinada a massa molecular exata do
SSTI2, 7.571, 976 Da. Para esse cálculo foi escolhido o primeiro pico da distribuição
isotópica.
74
Figura 13 – Espectros de massa molecular do SSTI2 adquiridos em espectrômetro de massa do tipo ESI-
TOF. A Figura 13a (acima) apresenta a distribuição multicargas da proteína. Sobre cada íon de SSTI2, os
respectivos números de prótons. O íon carregado com sete prótons (M+7H+ = 1.083,131) foi escolhido para a determinação das massas moleculares média e acurada do inibidor por ser o mais intenso na região analisada.
Em azul, a massa molecular média calculada. Os íons com massas de 415,205, 622,029 e 922,868 são
pertencentes ao kit de calibração do aparelho, os demais íons não assinalados são contaminantes da amostra. A
Figura 13b (abaixo) apresenta a distribuição isotópica do íon M + 7H+ (massa média: 1.083,131) da proteína. O
isótopo mais leve (assinalado na figura) foi escolhido para o cálculo da massa molecular acurada do inibidor. A
massa do SSTI2 foi determinando como sendo de 7.591,976 Da
M + H+
A = 7571.976
B
A
75
5.2.3 Perfil eletroforético das etapas de purificação de SSTI2 em gel de poliacrilamida
A fim de acompanhar a purificação do inibidor e analisar a diversidade proteica
das frações resultantes dos diferentes passos de purificação, uma eletroforese em gel de tricina
foi realizada. O gel resultante da eletroforese realizada sob condições redutoras e
desnaturantes pode ser visto na Figura 14. A diversidade das frações proteicas diminui com o
decorrer da purificação. Inicialmente, o extrato bruto (raia 2) da farinha de sementes de S.
saponaria apresenta uma grande diversidade de proteínas em um amplo espectro de massa
molecular (~8,0 – 180,0 kDa), que cai drasticamente após o fracionamento com TCA (raia 3).
Após a cromatografia de afinidade à tripsina, a diversidade de proteínas diminui para uma
faixa entre aproximadamente 8,0 – 24 kDa. Ao final da purificação, pode-se observar uma
única banda com massa molecular aparente de aproximadamente 8,0 kDa, correspondente ao
pico gerado em RP-UFLC com tempo de retenção de 27,08 minutos (46,81% de acetonitrila),
denominado de SSTI2.
76
Figura 14 – Perfil eletroforético das etapas de purificação do SSTI2. Raia 1- Marcador de massa molecular;
Raia 2- Extrato bruto da farinha de sementes de Sapindus saponaria; Raia 3 – Fração resultante da adição de 1%
de ácido tricloroacético (TCA) ao extrato bruto EB (F1%); Raia 4- F1% retida em coluna de afinidade em matriz de Tripsina-Sepharose 4-B; Raia 5 – SSTI2 purificado. Foram aplicados 15 µg de cada amostra. A
eletroforese ocorreu em sistema mini-gel Mini-Protean 3 com voltagem crescente de 40 – 80 V, durante 4 h. O
gel de poliacrilamida (15%) foi corado com uma solução contendo Comassie Brilliant Blue R-250 em
MeOH/AcOH/H2O (4/1/5, v/v/v). A seta indica o inibidor purificado, com uma massa molecular aparente de
aproximadamente 8 kDa
MM (Da)
77
5.2.4 Determinação da CI50
Através do ensaio de inibição específica de tripsina com uma concentração fixa de
enzima e substrato, e concentrações crescentes de inibidor, foi possível calcular a
concentração do SSTI2 capaz de causar 50% de inibição da atividade proteolítica da tripsina
(CI50). Como pode ser observado na Figura 15, a CI50 determinada foi de 8,3 x 10-2
mmol.L-1
ou 0,41 µg. Outro dado importante obtido no ensaio foi que a menor concentração de SSTI2
capaz de causar 100% de inibição da ação proteolítica da tripsina é 0,192 µmol.L-1
(0,94 µg).
Essa concentração foi utilizada em ensaios de atividade biológica e caracterização bioquímica
do inibidor que estão descritos adiante.
5.2.5 Especificidade do inibidor a enzimas serínicas e cisteínicas
O inibidor não apresentou atividade inibitória expressiva sobre as enzimas
quimotripsina, bromelaíma e papaína (Tabela 8). Dentre as enzimas serínicas, foi observado
efeito expressivo apenas sobre a tripsina (100%). Em contrapartida, nenhum efeito foi
observado sobre bromelaína e efeito inibitório muito baixo foi observado sobre quimotripsina
(13,94%) e papaína (5,28%).
78
Figura 15 – Determinação da concentração inibitória média (CI50) do inibidor SSTI2 sobre tripsina
bovina. Foram utilizadas concentrações crescentes de SSTI2 (3 x 10-3 µmol.L-1 – 3,8 x 10-1 µmol.L-1) e
concentrações fixas de tripsina bovina e BApNA, substrato específico da tripsina. De acordo com o ensaio, a
CI50 do SSTI2 sobre a tripsina é 0,083 µmol.L-1 ou 0,41 µg
79
Tabela 8 – Avaliação da especificidade do SSTI2 para enzimas serínicas e cisteínicas
Enzimas Inibição (%)
Serínicas Tripsina¹ 100
Quimotripsina² 13,94 ± 0,28
Cisteínicas Bromelaína² ND³
Papaína² 5,28 0,42
¹ Ensaio de inibição utilizando N-α-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BapNA) como substrato; ²Ensaio de
inibição utilizando azocaseína como substrato; ³Atividade inibitória não detectada. Todos os valores são médias
de ensaios realizados em triplicata.
80
5.2.6 Sequenciamento do SSTI2
5.2.6.1 Sequenciamento por ionização direto na fonte
Através da adição de uma pequena alíquota do inibidor à matriz DAN, foi
realizado o sequenciamento direto na fonte (ISD). Através deste procedimento, sem
necessidade de tratamento enzimático, foram determinados 48 dos 69 aminoácidos de SSTI2
(Figura 16). A estrutura primária parcial foi então analisada e comparada com outras
sequências depositadas em bancos de dados (BlastP, NCBI), onde foi observado que as
extremidades aminoterminal e carboxiterminal do SSTI2 não foram elucidadas através de
ISD. Sabe-se que uma das limitações da aplicação dessa técnica com uso da matriz DAN é
que os primeiros aminoácidos da região N-terminal geralmente não são determinados por
interferência de íons provenientes da matriz. Dessa forma, foi necessário o tratamento
enzimático do inibidor com tripsina e pepsina imobilizadas em agarose para a obtenção de
fragmentos proteicos que quando sequenciados por sequenciamento de novo pudessem
completar as extremidades da estrutura primária da proteína, assim como confirmar a
sequência parcial obtida por sequenciamento direto na fonte.
5.2.6.2 Purificação dos fragmentos de SSTI2 gerados por hidrólises enzimáticas com tripsina
e pepsina
Antes de cada tratamento enzimático, o inibidor de tripsina purificado das
sementes de S. saponaria sofreu redução e alquilação através de tratamento com ditiotreitol
(DTT) e iodoacetamida, para que não ocorresse inibição da atividade proteolítica das enzimas
durante a digestão enzimática. Após o tratamento com DTT e iodoacetamida, a proteína foi
repurificada em sistema RP-UFLC, onde foi eluída com aproximadamente 42% de
acetonitrila (Figura 15). Após esse passo cromatográfico, foram realizados tratamentos
81
enzimáticos independentes com tripsina e pepsina imobilizadas e então os peptídeos gerados
durante as hidrólises enzimáticas foram também separados por RP-UFLC (Figuras 18 e 19).
82
Figura 16 – Sobreposição manual de sequências obtidas através de sequenciamento direto na fonte (ISD-
DAN) e após tratamentos enzimáticos. Em preto, a sequência da proteína íntegra, obtida através da
sobreposição das sequências obtidas. Em azul, a sequência parcial obtida por sequenciamento direto na fonte com uso da matriz DAN. As sequências dos peptídeos gerados por hidrólise enzimática com pepsina e tripsina
imobilizadas estão representadas, respectivamente, pelas cores verde e laranja. Na primeira linha, os resíduos de
aminoácidos X indicam o isóbaro (L/I) e o resíduo Z indica o isóbaro (K/Q)
83
Figura 17 – Perfil cromatográfico da repurificação do inibidor SSTI2 reduzido e alquilado aplicado em
coluna de fase reversa analítica do tipo C4, em sistema em sistema UFLC. Um volume de 500 µL da solução
aquosa contendo SSTI2, ditiotreitol (DTT) e iodoacetamida foram aplicados em uma coluna semi-analítica C4, previamente equilibrada com 5% da solução B (ácido trifluoracético, TFA 0,1% em acetonitrila). Após a
aplicação do material, a coluna foi lavada com o mesmo gradiente por 15 minutos para eluição do material não
retido na coluna, a um fluxo de 1,0 mL/min, seguida de um gradiente crescente da solução B no mesmo fluxo. A
cromatografia foi acompanhada por espectrofotometria a 216 nm e a proteína coletada foi liofilizada e, em
seguida, submetida aos tratamentos enzimáticos
84
Figura 18 – Perfil cromatográfico (Em sistema RP-UFLC) da separação de peptídeos de SSTI2 gerados
por tratamento enzimático com tripsina imobilizada em agarose. O material liofilizado foi ressupenso em 40
µL de solução A (ácido trifluoracético, TFA 0,1% em água Milli-Q) e então aplicado em uma coluna de fase reversa narrowbore previamente equilibrada com 5% da solução B (TFA 0,1% em acetonitrila). Após a
aplicação do material, a coluna foi lavada com o mesmo solvente por 5 minutos para eluição do material não
retido na coluna a um fluxo constante de 0,4 mL/min, sequido de um gradiente crescente da solução B no mesmo
fluxo. A cromatografia foi acompanhada por detecção de absorbância nos comprimentos de onda de 216 e 280
nm. Os produtos cromatográficos gerados foram separadamente coletados, liofilizados e sequenciados por
espectrometria de massa dos tipos MALDI-TOF e ESI-TOF
Figura 19 – Perfil cromatográfico (Em sistema RP-UFLC) da separação de peptídeos de SSTI2 gerados
por tratamento enzimático com pepsina imobilizada em agarose. O material liofilizado foi ressupenso em 40
µL de solução A (ácido trifluoracético, TFA 0,1% em água Milli-Q) e então aplicado em coluna de fase reversa
narrowbore previamente equilibrada com 5% da solução B (TFA 0,1% em acetonitrila). Após a aplicação do
material, a coluna foi lavada com a mesmo solvente por 5 minutos para eluição do material não retido na coluna
a um fluxo constante de 0,4 mL/min, seguido de um gradiente crescente da solução B no mesmo fluxo. A
cromatografia foi acompanhada por detecção de absorbância nos comprimentos de onda de 216 e 280 nm. Os
produtos cromatográficos gerados foram separadamente coletados, liofilizados e sequenciados por espectrometria de massa dos tipos MALDI-TOF e ESI-TOF
85
5.2.6.3 Sequenciamento de novo dos peptídeos de SSTI2 e alinhamento das sequências
Os fragmentos obtidos após o tratamento enzimático de SSTI2 com tripsina e
pepsina foram sequenciados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e/ou do tipo
ESI-TOF e, então, manualmente alinhados com a sequência parcial obtida por ionização
direta na fonte. As sequências dos peptídeos confirmaram a sequência parcial gerada por
análise ISD, completaram a extremidade aminoterminal do inibidor e parte da região
carboxiterminal, faltando apenas dois resíduos de aminoácidos nessa extremidade. Apesar de
nenhum dos peptídeos sequenciados apresentarem esses dois resíduos, há consistentes
evidências de que esses sejam isoleucina (I) e glicina (G). A sequência final obtida foi então
alinhada com sequências de outros inibidores da superfamília Batata (Figura 20) e com a
sequência da região aminoterminal do primeiro inibidor de tripsina purificado das sementes
de S. saponaria (SSTI, MACEDO et al., 2011), no entanto, devido ao baixo percentual de
identidade (5,5%) entre as sequências, não é mostrado no alinhamento.
Através de análises de bioinformática, foi possível comparar a massa dos
peptídeos sequenciados com a massa teórica de peptídeos com sequências correspondentes
(Tabelas 9 e 10). Essa análise é mais uma evidência que corrobora os dados experimentais
das sequências obtidas e, consequentemente, com a sequência total proposta para o SSTI2.
Como pode ser observado nas tabelas, há pouca ou nenhuma diferença entre as massas
calculadas e as massas experimentais, diferenças essas que podem ser atribuídas à calibração
do aparelho.
Outra forma de confirmar a estrutura primária proposta para o inibidor foi a
comparação da massa real obtida por ESI-MS com a massa molecular para a sequência
teórica. Essa comparação mostrou que a diferença entre as duas massas é de 171 Da (para o
cálculo da massa teórica foram utilizados apenas os resíduos de aminoácidos encontrados, ou
seja, 67 dos 69 aminoácidos previstos para SSTI2), restando assim apenas duas possibilidades
de dipeptídeos (Tabela 11) para a extremidade carboxiterminal: 1- isoleucina (I) ou leucina
(L) e glicina (G) ou 2- valina (V) e alanina (A). Essa abordagem, aliada aos resultados de
alinhamento com sequências de proteínas já depositadas em bancos de dados (NCBI), sugere
que os dois últimos aminoácidos da extremidade carboxi terminal sejam isoleucina (I) e
86
glicina (G), como pode ser visto na Figura 20. A Figura 20 apresenta ainda a identidade
encontrada entre o SSTI2 e sequências de outros inibidores da família Batata I (55-64%). Os
36 primeiros aminoácidos da região aminoterminal do SSTI2 foram também alinhados com os
36 primeiros aminoàcidos da mesma região do SSTI (MACEDO et al., 2011), no entanto,
devido a baixissíma identidade encontrada (5,56%) não é mostrado na figura.
87
Tabela 9 – Comparação entre as massas teóricas e experimentais dos peptídeos oriundos da digestão
enzimático do SSTI2 com tripsina imobilizada em agarose. Os peptídeos obtidos foram sequenciados e as
massas observadas foram comparadas com a massa teórica das sequências obtidas pela ferramenta MS-Isotope,
presente na plataforma online ProteinProspector v 5.10.0
SEQUÊNCIA MASSA (Da)
CALCULADA EXPERIMENTAL
VTKAPR 671,4 671,3
(L/I)AECPGQK 902,4 902,4
VWVNNHGK 953,5 953,8
VRVWVNNHGK 1208,6 1208,6
VWVNNHGKVT(K/Q)APR 1605,9 1605,9
VRVWVDNHGKVT(K/Q)APR 1862,0 1861,9
SWPE(L/I)VGASGEVAATKIER 2000,0 2000,0
(I/L)ERENHNVDAVV(L/I)(L/I)EGTPVTR 2361,3 2361,2
QSWP(L/I)VGASGEVAATK(L/I)ERENHNVDAVV(L/I)(L/I)EGTPVTR 3943,7 3943,7
88
Tabela 10 – Comparação entre as massas teóricas e experimentais dos peptídeos oriundos da digestão enzimático do SSTI2 com pepsina imobilizada em agarose. Os peptídeos obtidos foram sequenciados e as
massas observadas foram comparadas com a massa teórica das sequências obtidas pela ferramenta MS-Isotope,
presente na plataforma online ProteinProspector v 5.10.0
SEQUÊNCIA MASSA (Da)
CALCULADA EXPERIMENTAL
(L/I)AECPGQKSW
1175,5
1175,6
(L/I)ERENHNVDA 1196,6 1196,6
WVNNHGKVT(K/Q)A 1253,7 1253,8
ATKIERENHNVDA 1496,6 1496,0
(L/I)AECPGQKSWPE(L/I) 1514,7 1514,8
89
Tabela 11 – Lista de massas de dipeptídeos, úteis para determinação de íons –b2 sequenciados por
espectrometria de massa. Os valores correspondem à soma das massas dos aminoácidos acrescidos de uma
unidade de Da (referente a um próton)
Legendas: *Oxidação;**Carboxidometilcisteína.
Fonte: Cantú et al. (2008).
90
Figura 20 – Alinhamento da sequência aminoacídica do SSTI2 com sequências de outros inibidores da família de inibidores Batata I. O alinhamento foi realizado
utilizando a ferramenta Clustal W de múltiplos alinhamentos disponível na plataforma BioEdit V. 7.0.9.0.. Em azul, o sítio reativo dos inibidores do grupo. Em verde, os dois
últimos aminoácidos da extremidade carboxi terminal. Em amarelo, os resíduos de aminoácidos X indicam os isóbaros (L/I) e o resíduo Z indica os isóbaros (K/Q). Devido a baixa identidade (5,5%), a sequência da região N-terminal do primeiro inibidor purificado das sementes de S. saponaria (SSTI) não é mostrado na figura. ¹Linum
usitatissimun
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| .. Identid.
5 15 25 35 45 55 65
SSTI2 -XAECP-GQK SWPELVGASG EVAATKXERE NHNVDAVVXX EGTPVTRDFR CNZVZVWVNN HGKVT-ZAPR IG -
P. tricocarpa MASRCP-GKS SWPELVRAYG EAAAATIERE NRNVDAIVLR EGTPVTKDFR CNRVW--VNE QGVVTRSVP- -- (64%)
R. communis MSNVCL-GKD SWPELVGAKG DDAAATVEKE NKHVHAIVLK EGTPVTRDFR CNRVWVWVDE NGVVT-RAPK TG (63%)
C. maxima --SSCP-GKS SWPHLVGVGG SVAKAIIERQ NPNVKAVILE EGTPVTKDFR CNRVRIWVNK RGLVV-SPPR IG (58%)
J. curcas MASECP-GKS SWPELLGANG KAAAALIEKE NRHVNAIVLK EGTPVTRDFR CDRVWVWVNE CGVVV-RVPI IT (60%)
G. max MASECK-GKS SWPELVGVEG TVAVATIERE NPLVDANTVL KGSIVTADFR CDRVRVWVTK HGIVY-QAPR IG (56%)
V. vinifera MAT-CPDGKS SWPELVGVHG EAAAAIIERE NLNVKAGVVK EGTLVTTDFR CDRVRVWVDS YGIVS-MVPK IG (60%)
A. lyrata MSSECP-RKN SWPELRGTNG DYAATVIERE NPTVDAVVIL DGSPVTADFR CDRVRVFVDR HRIVV-KTPT SG (55%)
L. usitatiss¹ XSRRCP-GKN AWPELVGKSG NMAAATVERE NRNVHAIVLK EGSAMTKDFR CDRVWVIVND HGVVT-SVPH IT (58%)
91
5.3 Efeito do SSTI2 sobre enzimas digestivas de insetos
O inibidor de tripsina obtido de sementes de S. saponaria foi capaz de causar
inibição das enzimas digestivas de todos os insetos testados (Tabela 12), com porcentuais de
inibição variando entre 4,74 a 56,06 quando avaliados em relação às enzimas intestinais totais
dos insetos e 32,21 ± 0,57 a 92,44 ± 0,99 para enzimas digestivas do tipo tripsina. O maior
efeito foi observado em enzimas intestinais do tipo tripsina de Aedes aegypti (92,44%).
92
Tabela 12 – Especificidade de inibição do SSTI2 para enzimas digestivas de insetos
Insetos
Inibição das enzimas
digestivas totais¹ (%)
Inibição das enzimas
digestivas do tipo tripsina²
(%)
Aedes aegypti 56,06 ± 1,41 92,44 ± 0,99
Anticarsia genmatalis 4,74 ± 0,45 32,21 ± 0,57
Anthonomus grandis 19,06 ± 0,49 77,93 ± 0,12
Spodoptera frugiperda 18,31 ± 1,92 71,44 ± 1,23
¹Ensaios realizados utilizando o homogenato intestinal do inseto como fonte de enzimas e azocaseína como
substrato.
²Ensaios realizados utilizando o homogenato intestinal do inseto como fonte de enzimas e N-α-benzoil-DL-
arginina-p-nitroanilida (BapNA) como substrato.
Todos os valores são médias de ensaios realizados em triplicata, utilizando 0,94 µg de inibidor.
93
6. DISCUSSÃO
Muitos autores descreveram a presença de inibidores de peptidase obtidos em
sementes de espécies de diversas famílias botânicas, como Leguminosae (KUNITZ, 1947;
LIN; NG, 2008; MACEDO; XAVIER-FILHO, 1992; OLIVEIRA et al., 2007ab), Solanaceae
(JACINTO et al., 1998; VALUEVA et al., 1997, 1998; WALDRON et al., 1993), Poaceae
(ABE; ARAI, 1991; ABE; KONDO; ARAI, 1987; ABE; SIDENIUS; SVENSON, 1993;
ABE; WHITAKER, 1988; KONDO et al., 1990), Cucurbitaceae (KRISHNAMOORTHI;
GONG; RICHARDSON, 1990; WONG; FONG; NG, 2004; TSOI et al., 2004;), Asteraceae
(KOUZUMA et al., 1996, 2000), Rutaceae (SHEE; SHARMA, 2007; SHEE et al., 2007ab) e
Euphorbiaceae (CHAUDARY et al., 2008; SRITANYARAT et al., 2006). Dentre esses, a
maioria é inibidor de serinopeptidases oriundos das famílias Leguminosae, Solanaceae e
Poaceae (RICHARDSON, 1991), exibindo diferentes propriedades bioquímicas e biológicas.
No presente estudo, um inibidor de tripsina foi purificado das sementes de Sapinus saponaria,
uma espécie pertencente à família Sapindaceae, consistindo no segundo relato da purificação
de um inibidor de peptidases nessa família. Macedo et al. (2011) relataram a obtenção do
primeiro inibidor de peptidases de sementes de S. saponaria, o qual, além das diferenças nas
técnicas utilizadas para purificação, possui algumas características divergentes do purificado
nesse trabalho. Nomeado de SSTI, o inibidor descrito por Macedo et al. (2011) é um dímero
de 18 kDa (uma cadeia de 3 kDa e outra de 15 kDa) que possui alta atividade inibitória in
vitro (2,4 x 10-9
mol.L-1
) sobre a tripsina bovina e enzimas digestivas de insetos-praga e cuja
sequência aminoacídica da região aminoterminal mostrou considerável identidade (50-63%)
com sequências de outros inibidores do tipo Kunitz. Por outro lado, o inibidor purificado no
presente estudo é uma cadeia polipeptídica de 7,6 kDa, possuindo expressiva atividade
inibitória in vitro sobre a atividade proteolítica da tripsina bovina e de enzimas digestivas de
insetos, apresentando alta identidade (58-64%) com outros inibidores da família Batata I e
apenas 5,56% de identidade com os 36 primeiros aminoácidos da região N-terminal do SSTI.
Assim, o novo inibidor purificado no presente estudo foi denominado de SSTI2.
O novo inibidor de tripsina de S. saponaria (SSTI2) foi purificado após
precipitação do extrato proteico bruto (EB) com ácido tricloroacético (TCA), seguida de
cromatografia de afinidade à matriz de Tripsina-Sepharose 4B e cromatografia de fase reversa
94
em sistema RP-UFLC, técnicas essas frequentemente utilizadas na purificação desse grupo de
moléculas (KRISHNAMOORTHI; GONG; LORENC-KUBIS et al., 2001; RICHARDSON,
1990; RICHARDSON, 1991; OLIVEIRA et al., 2007ab). O fracionamento do EB com adição
de volumes diferentes de TCA (encerrando concentrações finais entre 1-5%) levou a uma
diminuição expressiva no teor de proteínas solúveis e a uma discreta diminuição no percentual
de atividade inibitória de tripsina das frações (Figura 9) em relação ao extrato bruto.
Ademais, com o aumento da concentração do ácido houve a manutenção do teor de proteínas
e uma diminuição progressiva na atividade inibitória da enzima, levando a diferenças na
atividade específica (Tabela 6). Assim, a F1% (fração obtida quando a concentração final de
ácido no volume total do EB correspondia a 1%) foi escolhida por manter a mais alta
atividade específica. A Figura 14 mostra o perfil eletroforético obtido em gel de tris-tricina
dos diferentes passos de purificação, onde é possível observar que na F1% ocorreu uma
diminuição expressiva na diversidade de proteínas em relação ao EB, principalmente aquelas
de massa molecular alta. Sabe-se que o ácido tricloroacético precipita principalmente
proteínas de elevada massa molecular (CARREIRA et al., 2003; GREENBERG; SHIPE,
1979), sendo assim uma excelente ferramenta na purificação de proteínas de baixa massa
molecular como os IP’s.
O primeiro passo cromatográfico, realizado após a precipitação com TCA, foi a
cromatografia de afinidade (Figura 10), uma técnica de separação baseada na interação
reversível entre uma proteína (ou um grupo de proteínas) e um ligante específico acoplado a
uma matriz cromatográfica (AMERSHAM-BIOSCIENCES, 2012). Neste estudo, foi utilizada
uma matriz cromatográfica de Tripsina-Sepharose 4B, a qual possuía moléculas de tripsina
bovina ligadas covalentemente à matriz de agarose. Krishnamoorthi, Gong e Richardson
(1990) descreveram a purificação de um inibidor de tripsina e do fator de Hageman (uma
peptidase serínica envolvida na coagulação sanguínea) pertencente ao grupo Batata I em
sementes de abóbora (Cucurbita maxima), utilizando a cromatografia de afinidade como
primeiro passo de purificação. Os autores observaram ainda a propriedade da tripsina
imobilizada na matriz em clivar o sítio reativo de inibidores íntegros no complexo inibidor-
enzima, produzindo assim formas modificadas (clivadas) dos inibidores, os quais levaram a
formação de picos cromatográficos de pares de inibidores íntegros (com massa molecular de
aproximadamente 7 kDa) e de inibidores modificados (com massa molecular de cerca de 3
kDa) no passo cromatográfico subsequente (RP-UFLC), os quais foram diferenciados através
95
de sequenciamento dos resíduos de aminoácidos. No presente estudo, formas modificadas não
foram observadas, mas podem ter sido geradas durante o processo, uma vez que apenas o
SSTI2 teve sua massa molecular acurada e a sequência primária determinada por
espectrometria de massa, informações essas que, comparadas com dados da literatura
(BEUNING; SPRIGGS; CHRISTELLER, 1994; KRISHNAMOORTHI; GONG;
RICHARDSON, 1990) sugerem que essa é forma íntegra do inibidor.
O perfil eletroforético em gel de tris-tricina (Figura 14), o perfil cromatográfico
gerado em coluna de fase reversa do inibidor reduzido e alquilado (Figura 17) e as análises
por espectrometria de massa (Figuras 12b e 13ab) comprovam a pureza do SSTI2, o qual
apresentou um índice de purificação de 155 vezes (Tabela 7), valor esse comparável aos
inibidores de tripsina obtidos de sementes de Tamarindus indica (127 vezes) e Pithecelobium
dumosum (176 vezes) (ARAÚJO et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2007a ) e bem superior aos
obtidos pelos inibidores de Momordica cochinchinensis (5-10 vezes), Glycine max (65 vezes)
e Vigna mungo (55 vezes) (LIN; NG, 2008; PRASAD; DUTTA-GUPTA; PADMASREE,
2010; WONG; FONG; NG, 2004). Por outro lado, o rendimento do inibidor purificado foi de
0,0034%, um rendimento extremamente baixo quando comparado com os inibidores de
tripsina purificados de Enterolobium contortisiliquum (0,56%), Lupinus albus (0,022%)
(BEZERRA, 2010; SCARAFONI et al., 2008), porém comparável com o inibidor de
quimotripsina do tipo Kunitz purificado de sementes Erythrina velutina (0,002%) (LUCENA,
2010).
Dentre as frações cromatográficas majoritárias geradas durante a última etapa de
purificação (RP-UFLC), apenas duas (Figura 11) apresentaram percentual elevado de
inibição da tripsina bovina (>95%). Esses produtos cromatográficos foram analisados por
espectrometria de massas em aparelho do tipo MALDI-TOF. A fração nomeada de P1
(Figura 12a) apresentou uma grande diversidade de proteínas na faixa analisada (3,5 - 24,5
kDa), sendo então descartada. Em contraponto, a análise de espectrometria de massa em
modalidade MALDI-TOF da fração P2 (Figura 12b) revelou que há apenas uma proteína
majoritária purificada nesse produto cromatográfico (SSTI2), a qual foi ainda analisada por
espectrômetro de massa do tipo ESI-TOF (Figuras 13 a,b) para determinação da massa
molecular acurada (7571, 976 Da.) Muitos grupos de inibidores de peptidases serínicas
apresentam essa faixa de massa molecular, incluindo aquelas do tipo Bowman-Birk, Mostarda
96
e Batata I (HABIB; FAZILI, 2007). Contudo, o sequenciamento do SSTI2 mostrou que este
pertence à superfamília dos inibidores do tipo Batata, apresentando alta identidade com
inibidores do tipo Batata I (Figura 16) e uma baixa identidade (5,5%) com o primeiro
inibidor purificado de sementes de S. saponaria, purificado por Macedo et al., 2011 (SSTI,
família de inibidores do tipo Kunitz; Sequência não incluída na Figura 16). Apesar da
maioria dessas sequências com elevada identidade com o SSTI2 corresponderem a sequências
previstas através do genoma das espécies (Jatropha curcas, Populus trichocarpa, Ricinus
communis, Glycine max etc.), os inibidores de tripsina da família batata I foram purificados de
sementes de Cucurbita maxima, com 7106 Da (KRISHNAMOORTHI; GONG;
RICHARDSON, 1990) e Linum usitatissimum, com 7655 Da (LORENC-KUBIS et al., 2001)
através de técnicas semelhantes de purificação. Em comparação com os outros grupos de
inibidores de peptidase serínicas, há poucos estudos descrevendo a purificação e determinação
da estrutura primária de inibidores do tipo Batata I, uma família de inibidores presente em
anelídeos (SHEMULLER et al., 1980; WOJTASZEK et al., 2006) e plantas (CHAUDARY et
al., 2008; KRISHNAMOORTHI; GONG; RICHARDSON, 1990; SRITANYARAT et al.,
2006; TSOI et al., 2004). Esse grupo é composto por inibidores de peptidase serínicas que
geralmente apresentam uma massa molecular entre 6-8 kDa, falta de hipervariabilidade no
sítio reativo e um teor baixo de cisteínas que geralmente formam uma única ponte dissulfeto,
cujo rompimento, diferentemente da maioria dos grupos de inibidores, não apresenta
influência na função da proteína (BEUNING; SPRIGGS; CHRISTELLER, 1994;
RICHARDSON, 1991; TSOI et al., 2004).
No que diz respeito à elucidação da estrutura primária do inibidor, foram
utilizadas análises de espectrometria de massa com ionização induzida por laser assistida por
matriz (MALDI) e com ionização induzida por electrospray (ESI), tendo sendo em ambas as
técnicas utilizados analisadores de tempo de voo (TOF). Nessas análises, foram utilizadas
estratégias como fragmentação por decaimento direto na fonte (ISD) e fragmentação de
peptídeos gerados por hidrólises enzimáticas com peptidases, técnicas amplamente utilizadas
no sequenciamento de proteínas (CANTÚ et al., 2008; HARDOUIN, 2007; TANAKA et al.,
1996). A primeira técnica utilizada foi a ISD-MALDI-TOF, através da qual foram
determinados 48 dos 69 aminoácidos. No entanto, os demais aminoácidos das extremidades
amino e carboxi-terminal do inibidor continuavam desconhecidos (Figura 16). O SSTI foi
então submetido a tratamentos proteolíticos independentes com pepsina e tripsina. O
97
tratamento enzimático com tripsina imobilizada em agarose gerou peptídeos que confirmaram
a sequência determinada por ISD e revelaram os aminoácidos restantes na região N-terminal.
O tratamento enzimático com pepsina gerou também outros peptídeos que confirmaram a
sequência obtida pelas demais técnicas e elucidaram parte da extremidade C-terminal,
restando apenas dois resíduos de aminoácidos não revelados.
Através de ferramentas de bioinformática, as massas dos peptídeos obtidas através
de MALDI-TOF/MS foram comparadas com suas massas teóricas, corroborando assim a
exatidão da interpretação de suas sequências (Tabelas 9 e 10). Essa mesma ferramenta foi
utilizada para calcular a massa teórica de toda a sequência obtida para, em seguida, compará-
la com a massa obtida por ESI-TOF (Figuras 13b). A diferença de massas encontrada nessa
comparação foi de 171 Da, referentes aos resíduos não determinados experimentalmente,
restringindo assim as possibilidades para apenas dois dipeptídeos, A e V ou G e I/L. Apesar
dessa ambiguidade, a alta identidade do SSTI2 com inibidores que possuem a terminação IG
no C-terminal sugere que esses sejam os dois últimos resíduos de aminoácidos da região
(Figura 16).
A rigor, outros resíduos de aminoácidos do SSTI2 ainda não foram totalmente
determinados (Figura 20), sendo isso devido ao fato de que uma das limitações do
sequenciamento por espectrometria de massa é a dificuldade na distinção entre espécies
isobáricas, ou seja, resíduos de aminoácidos com a mesma ou aproximadamente a mesma
massa molecular monoisotópica, como lisina (K; 128,09496 Da) com glutamina (Q;
128,05858 Da) e leucina (L; 113,08406 Da) com isoleucina (I; 113,08406 Da). Contudo, os
padrões de clivagem por enzimas específicas de alta pureza e equipamentos com exatidão de
massa e resolução elevadas, como o micrOTOF-Q II utilizado neste estudo são ferramentas
úteis na diferenciação entre lisina e glutamina (CANTÚ et al., 2008). No entanto, mesmo
assim a espécie isobárica K/Q na posição 67 (Figura 20) não foi determinada
inequivocamente, apesar da não ocorrência de clivagens na ligação peptídica entre esse
resíduo e o resíduo vizinho durante o tratamento com tripsina, o que indicaria que esse pode
ser um resíduo de glutamina. Dessa forma, tratamentos enzimáticos com outras peptidases,
sequencimento pelo método da degradação de Edman, ou ainda, técnicas de biologia
molecular são necessárias para determinar com maior precisão o resíduo de aminoácido da
98
posição 67, os dois últimos resíduos da região C-terminal e os isóbaros do tipo L/I das
posições 2, 27, 39 e 40.
É importante ressaltar que através do tratamento do SSTI2 com pepsina era
esperado principalmente a geração de peptídeos, provenientes da quebra do inibidor, quando
na posição P1 residissem resíduos de fenilalanina (F) e leucina (L). Entretanto,
surpreendentemente foram gerados peptídeos quando resíduos de prolina (P), valina (V),
triptofano (W) e alanina (A) ocupavam essa posição (MEROPS, 2012). Esse fato pode ser
explicado por contaminação da pepsina com outras peptidases e pela faixa de pH
recomendada pelo fabricante (PIERCE, Rockford, USA) para o tratamento enzimático ser
mais elevada que o pH ótimo da peptidase.
Devido às limitações de rendimento, uma série de características bioquímicas do
SSTI2 não foram determinadas, como constante de inibição (Ki), modo de inibição e
resistência a pH, temperatura e a agentes redutores. A estabilidade funcional é bastante
conhecida em inibidores e comumente avaliada em trabalhos que relatam a sua purificação
(CHAUDARY et al., 2008; LIN; NG, 2008; PRASAD; DUTTA-GUPTA; PADMASREE,
2010). No entanto, a concentração do inibidor que reduz em 50% a atividade proteolítica da
tripsina (IC50) foi determinada. Assim, O inibidor purificado apresenta uma IC50 sobre a
tripsina bovina na magnitude de 8,32 x 10-8
mol.L-1
ou 0,083 µmol.L-1
(Figura 15), um valor
consideravelmente baixo quando comparado com uma defensina com atividade inibitória de
tripsina, que foi purificada de sementes de Cassia fistula ( IC50 = 2 µmol.L-1
) (WYJAYA et
al., 2000) e com inibidores de tripsina purificado de Jatropha curcas (IC50 = 1,10 µmol.L-1
),
Phaseolus vulgaris (IC50 = 0,6 µmol.L-1
) e Glycine max (IC50 = 19 µmol.L-1
) (DA COSTA,
2012; SUN; WANG; NG, 2010; YE; NG, 2009).
Dentre as enzimas avaliadas quanto à especificidade enzimática do SSTI2
(Tabela 8), o inibidor apresentou inibição potente apenas sobre a atividade proteolítica da
tripsina bovina (100%), apresentando uma atividade inibitória baixa sobre a quimotripsina
(13,94%) e papaína (5,28%) e nenhum efeito sobre a bromelaína. Uma explicação plausível
para esses resultados pode ser a maior especificidade do SSTI2 a enzimas do tipo tripsina.
Tsoi et al. (2004) relataram que quando cerca de 1 micrograma do inibidor da família Batata I
purificado de sementes de Momordica cochinensis foi utilizado em ensaio de avaliação da
capacidade inibitória de enzimas serínicas, este foi capaz de causar completa inibição da
99
atividade proteolítica da quimotripsina e subtilisina, sendo necessário cerca de dez vezes essa
massa para causar o mesmo efeito inibitório sobre a elastase e mais de cem vezes para causar
o mesmo efeito sobre a tripsina, mostrando assim a diferença na especificidade do inibidor.
Muitos inibidores são capazes de atuar sobre enzimas de mais de uma classe mecanicística
(GOMES et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2007ab), o que não é o caso dos inibidores da
família Batata I, os quais costumam atuar exclusivamente em enzimas serínicas (TURRÀ;
LORITO, 2011), o que explicaria o baixo efeito sobre as enzimas cisteínicas bromelaína e
papaína.
Como forma preliminar de avaliar o efeito de inibidores de peptidase em insetos
alvo, muitos autores avaliam a sua especificidade sobre as enzimas intestinais desses insetos
em experimentos in vitro (JONGSMA; BOLTER, 1997; KOIWA et al., 1998; MACEDO et
al., 2011; OLIVEIRA et al., 2007ab; PANNETIER et al., 1997;). Muitos desses inibidores
são ainda incorporados à dieta de insetos em ensaio in vivo, apresentando efeitos supressores
no desenvolvimento, crescimento e sobrevivência desses animais (MACEDO et al., 2003;
MACEDO et al., 2004; CHOUGULE et al., 2008), comprovando, assim, a correlação entre os
ensaios in vivo e in vitro. O potencial biotecnológico do inibidor purificado nesse estudo para
o controle de insetos-praga foi avaliado através de ensaios de inibição in vitro sobre as
enzimas digestivas totais e do tipo tripsina de insetos de grande importância agrícola (Tabela
12), como Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae), Anticarsia gemmatalis
(Lepidoptera: Erebidade) e Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), bem como sobre
enzimas digestivas do vetor da dengue, Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).
Geralmente, peptidases digestivas do tipo serínica como tripsina, quimotripsina e
elastase são predominantes em insetos da ordem Lepidóptera e Díptera (GATEHOUSE et al.,
1999; HAQ; KHAN, 2004; SILVA et al., 2006; TERRA; FERREIRA, 1994), isso inclui os
lepidópteros da família Noctuidae, os quais apresentam uma predominância de enzimas do
tipo tripsina e quimotripsina (CHOUGULE et al., 2008) e dípteras como Aedes aegypti, que
apresentam enzimas do tipo tripsina como principais peptidases digestivas (KUNZ, 1978;
VENANCIO et al., 2009). Por outro lado, insetos da ordem Coleóptera possuem uma
predominância de enzimas dos tipos cisteínica e aspártica em seus intestinos médios (LEMOS
et al., 1990; LECARDONNEL et al., 1999). No entanto, no caso do coleóptero A. grandis,
Oliveira-Neto et al. (2004) descreveram a presença de uma diversificada família de genes que
100
espressam peptidases serínicas no intestino do inseto, com predominância de enzimas
semelhantes à tripsina. Dessa forma, na concentração de 0,192 µmol.L-1
, o SSTI2 apresentou
uma baixa atividade inibitória sobre a atividade proteolítica intestinal total de A. grandis
(19,06%), An. gemmatalis (4,74%) e S. frugiperda (18,31%), embora uma moderada atividade
inibitória tenha sido detectada sobre as enzimas digestivas totais de Ae. aegypti (56,06%). Em
contraste, na mesma concentração o inibidor causou uma expressiva inibição sobre as enzimas
digestivas do tipo tripsina de Ae. aegypti (92,44%), A. grandis (77,93%) e S. frugiperda
(71,44%), ao passo que em An. gemmatalis o efeito inibitório observado foi de apenas
32,21%. A predominância das enzimas digestivas nessas espécies de insetos, aliado à aparente
especificidade do SSTI2 frente a enzimas do tipo tripsina, justificam os percentuais de
inibição observados frente às peptidases intestinais dos insetos avaliados. Os resultados
observados para A. grandis são condizentes com os resultados apresentados pelo inibidor de
tripsina purificado de Piptadenia moniliformis, o qual causou um percentual elevado de
inibição (89,93%) sobre a atividade proteolítica intestinal total do inseto (CRUZ, 2008). Além
disso, o valor de inibição do SSTI2 em enzimas digestivas do tipo tripsina do An. gemmatalis
foi comparável ao observado pelo primeiro inibidor purificado das sementes de S. saponaria
(MACEDO et al., 2011), o qual, quando utilizado uma massa semelhante à utilizada no
presente estudo, causou aproximadamente 40% de inibição.
Os resultados de especificidade a enzimas digestivas de insetos acima descritos
atestam o potencial do SSTI2 na produção de plantas transgênicas resistentes ao ataque de
insetos fitófagos. Vale ressaltar que alguns inibidores de peptidases foram utilizados com
sucesso nesse sentido, incluindo inibidores to tipo batata I (HABIB; FAZILI, 2007;
MOSOLOV; SMITH; CLEMENT, 2012; TURRÀ; LORITO, 2012; VALUEVA, 2008).
Dunse et al. (2010), por exemplo, inseriram genes codificantes de um inibidor do tipo Batata
I oriundo de Solanum tuberosum (batata) e de um inibidor do tipo Batata II oriundo de
Nicotiana alata (tabaco) em plantas de algodão, conferindo grande resistência ao inseto
lepidóptero Helicoverpa punctigera. Em relação aos promissores resultados observados sobre
as enzimas digestivas de Ae. aegypti, é importante ressaltar que há raros relatos de estudos
enfocando o efeito de inibidores de peptidases sobre o inseto (DE ARRUDA et al., 2011).
Esses resultados, aliados a ensaios de toxicidade in vivo, trazem inúmeras possibilidades para
o uso desse inibidor no controle do inseto, como, por exemplo, através da aplicação direta do
SSTI2 ou de formulações de liberação controlada do mesmo em locais de proliferação do
101
mosquito. De acordo com Jeffers e Roe (2008), outra perspectiva promissora para o uso de
inibidores de peptidase no controle de insetos é a aplicação de tais inibidores em associação
com outras proteínas tóxicas a esses animais. E ainda, de acordo com Lehane (1994), o uso
de moléculas essenciais para a digestão de insetos hematófagos como alvos moleculares para
o desenvolvimento de vacinas é uma abordagem promissora para o controle de doenças
transmitidas por esses insetos como a dengue, malária, etc.
102
7 – CONCLUSÕES
As conclusões do presente estudo foram as seguintes:
As sementes de Sapindus saponaria expressam mais de um inibidor de peptidase,
pertencentes a diferentes famílias de inibidores.
Um novo inibidor de tripsina foi purificado das sementes de S. saponaria, através de
fracionamento com ácido tricloroacético (TCA), cromatografia de afinidade a tripsina
e cromatografia de fase reversa em sistema UFLC. Nomeado de SSTI2, o inibidor
apresenta baixa massa molecular (7,5 kDa) e grande especificidade para tripsina
bovina (IC50 = 0,083 µmol.L-1
), possuindo, no entanto, um efeito inibitório baixo
sobre a quimotripsina e papaína e nenhuma inibição sobre a atividade proteolítica da
bromelaína.
Além disso, o inibidor teve sua estrutura primária elucidada e foi identificado como
pertencente à família de inibidores do tipo Batata I, apresentando identidade elevada
com sequências de outros inibidores do grupo (55-64%).
O SSTI2 foi capaz de causar intensa inibição in vitro de enzimas digestivas do tipo
tripsina de importantes insetos-praga de plantas e de insetos vetores de doenças (71,44
– 92,44%), sendo assim uma nova e potente molécula com grande potencial
biotecnológico no controle desses insetos
103
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