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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
ESTUDO FITOQUMICO E ATIVIDADES BIOLGICAS DE Eperua duckeana
E Eperua glabriflora (FABACEAE)
LIDIAM MAIA LEANDRO
MANAUS
2011
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
LIDIAM MAIA LEANDRO
ESTUDO FITOQUMICO E ATIVIDADES BIOLGICAS DE Eperua duckeana e
Eperua glabriflora (FABACEAE)
Orientador: Prof. Dr. Valdir Florncio da Veiga Junior
MANAUS
2011
Dissertao apresentada ao Programa
de Ps-Graduao em Qumica da
Universidade Federal do Amazonas,
como parte do requisito para obteno
do ttulo de Mestre em Qumica, rea de
concentrao em Qumica Orgnica.
ii
Ficha Catalogrfica (Catalogao realizada pela Biblioteca Central da UFAM)
L437e
Leandro, Lidiam Maia
Estudo fitoqumico e atividades biolgicas de Eperua duckeana e Eperua glabriflora (Fabaceae) / Lidiam Maia Leandro. - Manaus: UFAM, 2011.
217 f.; il.
Dissertao (Mestrado em Qumica Orgnica) Universidade Federal do Amazonas, 2011.
Orientador: Prof. Dr. Valdir Florncio da Veiga Junior
1. Essncias e leos essenciais 2. Plantas medicinais 3. Fitoqumica 4. Bioqumica I. Veiga Junior, Valdir Florncio da (Orient.) II. Universidade Federal do Amazonas III. Ttulo
CDU 665.325.3(043.3)
ii
LIDIAM MAIA LEANDRO
ESTUDO FITOQUMICO E ATIVIDADES BIOLGICAS DE Eperua
duckeana e Eperua glabriflora (FABACEAE)
Aprovada em 18 de abril de 2011.
BANCA EXAMINADORA
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Qumica da Universidade
Federal do Amazonas, como parte do requisito
para obteno do ttulo de Mestre em Qumica,
rea de concentrao em Qumica Orgnica.
iii
AGRADECIMENTOS
Deus por ter estado comigo e me reanimado quando mais precisei, por ter me dado
sade e colocado pessoas boas no meu caminho. Obrigada por mais essa conquista!
Aos meus pais, Maria Rosivalda M. Leandro (a melhor me do mundo!) e Joo
Batista A. Leandro pelo amor, carinho, incentivo e apoio financeiro e minha querida irm
Lilian M. Leandro pelos conselhos e por sempre ter estado presente, mesmo distante.
Obrigada famlia pelo amor imensurvel de vocs!
A toda Famlia Maia e Famlia Leandro, em especial ao meu Tio Silas pelo incentivo.
Ao Leandro Prado por todo amor, pacincia e compreenso.
Ao Prof. Dr. Valdir F. Veiga Jnior, que me acolheu como aluna de iniciao
cientfica e se disponibilizou a me orientar no curso de mestrado. Meus agradecimentos e
admirao pelo exemplo de excelente orientador, incansvel e determinado e que demonstra
um amor incondicional pesquisa, difcil de ser encontrado.
s minhas queridas amigas Klenicy Yamaguchi, Priscilla Oliveira , Joelma
Alcntara, Milena Campelo e Paula Barbosa que aps vrias batalhas, vitrias e derrotas,
se tornaram parte da minha vida. Obrigada meninas por tornarem momentos de intenso
trabalho em algo mais descontrado, e principalmente pelas palavras de alento sempre vindas
em boa hora. Sucesso na carreira de vocs!
Aos amigos Igor Medeiros, e Carol Mathias pelos bons momentos de convivncia e
ajuda nas dificuldades.
Ao amigo e mano Andr Rdiger pelos conhecimentos compartilhados e conversas
que me ajudaram a tomar decises importantes.
bolsista de iniciao Dborah pelas companhias noturnas e nos fins de semanas no
laboratrio.
A todos os alunos (e ex-alunos) do Laboratrio B-09 pela ajuda nas horas necessrias:
Daniele Cardoso, Lamark, Vanessa Campos, Priscila Moraes, rika Izumi, Fabiano
Vargas, Roosevelt Haad, Diego Rabelo, Iuri Barros e Daiana Custdio.
Aos alunos do B-08, em especial, Dominique Fernandes e Jnior Ribeiro por me
ajudarem sempre quando precisei.
A Dra. Rita de Cssia Nunomura e seus alunos de iniciao cientfica, Viviane
Guedes e ao Magno, pelas ajudas iniciais dos ensaios antioxidantes. E ao bolsista do INPA
Nerilson por sempre se mostrar prestativo.
iv
Ao Prof. Dr. Afonso Duarte por disponibilizar os aparelhos do Laboratrio da
Central Analtica (UFAM) e aos alunos Felipe Moura, Mayane Souza, Hctor pelas anlises
realizadas.
Aos professores da Ps-graduao em Qumica PPGQ-UFAM pelas aulas
ministradas contribuindo na minha formao.
As Profa. Rita de Cssia Nunomura e Maria da Paz pelas contribuies no Exame
de Conhecimento.
Ao Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura do Laboratrio de Microbiologia Aplicada aos
Produtos Naturais da Universidade Estadual de Maring e alunos que realizaram os ensaios de
atividade antimicrobiana.
Profa. Patrcia Orlandi e as bolsistas Ivanildes e Renata da FIOCRUZ-AM que
me ensinaram e ajudaram a realizar os ensaios atividade antibacteriana.
Aos Profs. Dr. Manoel Odorico e Cludia Pessoa do Laboratrio de Oncologia
Experimental da Universidade Federal do Cear pela realizao dos ensaios de atividade
citotxica em clulas tumorais.
Ao Prof. Massayoshi e aos tcnicos Raimundo Jnior e Laura Cristina pelas
anlises de RMN e CG e Danielle Paiva pela intermediao das solicitaes de oramentos.
Aos Professores da Banca.
Ao CNPq pela concesso da bolsa.
Enfim, muito obrigada a todos que direta ou indiretamente contriburam para a
realizao deste trabalho!
v
RESUMO Eperua um gnero da famlia Fabaceae, endmico da Amaznia Central. O leo exsudado das espcies Eperua oleifera, Eperua purpurea e Eperua falcata utilizado na medicina popular de modo anlogo ao da copaba, como cicatrizante, antifngico e bactericida. De modo geral, duas classes de substncias tm sido isoladas de espcies desse gnero: terpenos e flavonides. Apesar das espcies Eperua glabriflora e Eperua duckeana serem comuns na Amaznia, nunca foram estudadas qumica ou farmacologicamente. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a composio qumica dos extratos obtidos das cascas do tronco e folhas e determinar as atividades antioxidantes, antibacteriana, antifngica, antiprotozoria e citotoxicidade em clulas tumorais, alm de analisar a composio qumica dos leos essenciais das folhas e talos dessas espcies. O material vegetal foi coletado na Reserva Ducke em Manaus e as cascas e folhas foram secas temperatura ambiente e posteriormente trituradas. Os extratos foram preparados por macerao com solvente em ordem crescente de polaridade (hexano, acetato de etila e metanol). Foram obtidos doze extratos brutos. Os extratos apolares das cascas foram analisados por Cromatografia Gs acoplada ao Espectrmetro de Massas (CG-EM) e ao Detector de Ionizao de Chama (CG-DIC). Foram identificadas quatorze substncias, sendo essas: seis cidos graxos (cido hexadecanico, cido 9,12-octadecadienico, cido 9-octadecenico, cido octadecanico, cido tetracosanico e cido hexacosanico); quatro cidos diterpnicos (cido catvico, cido 3-hidroxi-labda-7,13-dieno-15-ico, cido 3-clerodeno-15-ico e um ismero dele); um hidrocarboneto (esqualeno); uma vitamina (-tocoferol); e dois esteris (estigmasterol e -sitosterol). As duas ltimas substncias foram isoladas em mistura e identificadas por mtodos espectromtricos. Do extrato obtido em acetato de etila das cascas de E. glabriflora foi isolado um 3-O-glicosil-flavanonol conhecido como engeletina, presente tambm no extrato da E. duckeana, porm, em menor concentrao; e um flavonide de M+ 476. Os leos essenciais foram obtidos por hidrodestilao, em aparelho clevenger modificado durante 4h, e seco com sulfato de sdio e analisados por CG-DIC e CG-EM. Foram identificados nos leos essenciais 35 constituintes, sendo o -cariofileno e o germacreno D os constituintes majoritrios. Os leos essenciais das folhas e talos apresentaram atividade citotxica em linhagens de clulas tumorais de cncer de mama (MDA/MB-435), clon (HCT8) e sistema nervoso central (SKF-295) com inibies de crescimento de aproximadamente 90%. Os extratos testados apresentaram fraca ou nenhuma atividade antileishmania, trypanosoma cruzi, antifngica e antibacteriana, exceto para o extrato obtido em hexano das cascas de E. glabriflora que apresentou significativa atividade contra a bactria gram-positiva Bacillus subtilis (CIM= 62,5 g/mL). Com relao ao potencial antioxidante, a maior atividade de seqestro de radical livre DPPH foi apresentada pelos extratos obtidos em acetato de etila e metanol das cascas (CI50 10,5 -17,8 g/mL) e ambas espcies. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para o conhecimento qumico e biolgico de duas espcies da biodiversidade amaznica. Palavras chaves: Leguminosae, muirapiranga, antioxidante, citotoxicidade, diterpenos e engeletina.
vi
ABSTRACT Eperua is a genus of the Fabaceae-Caesalpinioideae, endemic to the Central Amazon. The oil-resin of E. oleifera, E. purpurea e E. falcata is used in folk medicine in order analogous to copaiba, as a healing agent antifungal and bactericide. In general, two class substances have been isolated from this species: terpenes and flavonoids. Despite the species E. glabriflora and E. duckeana are common in the Amazon, have never been studied chemically and pharmacologically. This study aimed to evaluate the chemical composition of extracts of bark of trunk and leaves and to determine the antioxidant, antibacterial, antifungal, antiprotozoal and cytotoxic activity against tumor cells, and analyzing the chemical composition of essential oils from leaves and stems of these species. The plant material was collected in Ducke Reserve near Manaus and the bark and leaves were dried at room temperature and later crushed. The extracts were prepared by maceration with solvent in order of increasing polarity (hexane, ethyl acetate and methanol) were obtained twelve crude extracts. The non-polar extracts of bark of trunk were analyzed by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) and flame ionization detector (GC-FID). It was identified fourteen substances among them: six fatty acids (hexadecanoic acid, 9,12-octadecadienoic acid, 9-octadecenoic acid, octadecanoic acid, tetracosanoic acid and hexacosanoic acid); four diterpene acids (cativic acid, 3-hydroxylabd-7,13-dien-15-oic acid, 3-cleroden-15-oic acid and one isomer); one hydrocarbon (squalene); one vitamin (-tocopherol); and two sterols (stigmasterol and -sitosterol). The latter two substances were isolated in mixture and identified by spectrometric methods. From ethyl acetate extract of bark of trunk E.glabriflora was isolated from 3-O-glycoside-flavanonol, engeletin also present in the extract of E. duckeana, but in lower concentration. Other flavonoid was isolated from M+ 476 u.ma. Essential oils were obtained by hydrodistillation in Clevenger apparatus changed during 4h, then dried with sodium sulfate and analyzed by GC-FID and GC-MS. We identified 35 constituents in essential oils, and the -caryophyllene and germacrene D the major constituents. Essential oils from leaves and stems showed cytotoxic activity against tumor cell lines of breast cancer (MDA/MB-435), colon (HCT8) and central nervous system (SKF-295) with inhibitions of growth of approximately 100%. The extracts tested showed weak or no trypanosoma cruzi or leishmania activity and antibacterial and antifungal activity, except the hexane extract of the bark of E. glabriflora that showed significant activity against gram-positive bacterium Bacillus subtilis (MIC = 62.5 g /mL). With respect to antioxidant potential, the highest activity of free radical sequestration was presented by the extracts in ethyl acetate and methanol of bark of trunk (IC50 10.5 -17.8 mg / mL) in both species. The results of this study contribute to the knowledge of chemical and biological of two species from Amazonian biodiversity. Key-words: Leguminosae, muirapiranga, antioxidant, cytotoxicity, diterpenes and engeletin.
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estruturas do sesquiterpeno e triterpeno encontrados em espcies de
Eperua......................................................................................................
32
Figura 2. Esqueletos e numerao dos diterpenos labdanos e clerodanos.............. 33
Figura 3. Estruturas de diterpenos labdnicos isolados de espcies de Eperua... 35
Figura 4. Estruturas de diterpenos clerodnicos isolados de espcies de Eperua... 36
Figura 5. cidos fenlicos e flavonides identificados em espcies de Eperua..... 38
Figura 6. Estrutura do cido labda-8-eno-15-ico................................................ 40
Figura 7. Rota biossinttica dos diterpenos............................................................. 41
Figura 8. Diterpenos com atividades biolgicas...................................................... 43
Figura 9. Estrutura bsica dos flavonides: ncleo flavona...................................... 44
Figura 10. Rota biossinttica dos flavonides............................................................ 45
Figura 11. Estrutura da quercetina. Principais aspectos responsveis pela atividade
antioxidante dos flavonides.....................................................................
48
Figura 12. Mecanismo da estabilizao eltron desemparelhado............................... 49
Figura 13. Estrutura da quercetina. Atribuio dos principais pontos responsveis
pela atividade antioxidante........................................................................
49
Figura 14. Reao de reduo da radical DPPH......................................................... 50
Figura 15. Descolorao da soluo de DPPH na presena de substncias
antioxidantes..............................................................................................
51
Figura 16. Reao do cido glico com molibdnio, componente do reagente de
Folin-Ciocalteu..........................................................................................
52
Figura 17. Aumento da absorvncia devido presena de compostos fenlicos... 52
Figura 18. Estrutura e classe dos principais frmacos antibacterianos de origem
natural.........................................................................................................
53
Figura 19. Estrutura e classe dos principais frmacos antifngicos........................... 56
Figura 20. Leishmaniose............................................................................................. 57
Figura 21. Doena de Chagas..................................................................................... 58
Figura 22. Frmacos derivados de plantas usados na terapia do cncer..................... 60
Figura 23. Substncias derivados de plantas em estudo pr-clnico ou clnico para a
terapia do cncer........................................................................................
62
viii
Figura 24. Etapas da revelao de placa de cromatografia em camada delgada
preparativa..................................................................................................
68
Figura 25. Sistema de cromatografia em coluna utilizando slica flash...................... 71
Figura 26. Localizao da Reserva Florestal Adolpho Ducke.................................... 76
Figura 27. Exsicatas depositadas no Herbrio do INPA............................................ 76
Figura 28. Separao e etapas do tratamento do material vegetal............................... 77
Figura 29. Frmula para o clculo do ndice de Reteno......................................... 79
Figura 30. Frmula para clculo da porcentagem de inibio da atividade
antioxidante.....................................................................................
87
Figura 31. Etapas do Ensaio de atividade bacteriana........ 90
Figura 32. Estruturas dos constituintes majoritrios dos leos essenciais................. 98
Figura 33. Ampliao dos cromatogramas de ons totais dos leos essenciais de E.
duckeana....................................................................................................
99
Figura 34. Ampliao dos cromatogramas de ons totais do leo essencial das
folhas da 1 coleta de E. glabriflora..........................................................
100
Figura 35. Ampliao dos cromatogramas de ons totais do leo essencial das
folhas e talos de E. glabriflora da 2 coleta..............................................
101
Figura 36. Resultado do ensaio qualitativo da presena de compostos fenlicos em
CCD utilizando FeCl3...............................................................................
107
Figura 37. CCD dos extratos obtidos em acetato de etila das cascas.......................... 107
Figura 38. Curva de calibrao (padro) para o teor de fenlicos totais..................... 108
Figura 39. Comparativo dos contedos fenlicos dos extratos brutos das folhas e
cascas da E. duckeana e E. glabriflora......................................................
109
Figura 40. Resultado do teste de shinoda.................................................................... 110
Figura 41. Resultado do ensaio qualitativo de Captura do radical livre DPPH em
CCD utilizando DPPH.............................................................................
111
Figura 42. CCD dos extratos brutos das cascas reveladas com DPPH..................... 112
Figura 43. CCD dos extratos brutos das folhas revelados com DPPH....................... 112
Figura 44. Grfico de correlao entre fenis totais e atividade de captura do
DPPH dos extratos brutos........................................................................
114
Figura 45. Ensaios de atividade antibacteriana (mtodo de difuso de disco)............ 116
Figura 46. CCD comparativa dos extratos das cascas de E. dukeana e E.
glabriflora..................................................................................................
125
ix
Figura 47. Cromatogramas de ons totais dos extratos obtido em hexano das cascas
das duas espcies de Eperua......................................................................
127
Figura 48. Estrutura do cido palmtico..................................................................... 131
Figura 49. Espectros de massas da substncia identificada como cido palmtico... 131
Figura 50. Rearranjo de McLafferty resultando em fragmento de m/z 60.................. 132
Figura 51. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
cido palmtico...........................................................................................
132
Figura 52. Mecanismo de formao do on molecular e fragmentao do pico base
de steres metlicos saturados....................................................................
133
Figura 53. Estrutura do cido 9,12-octadecadienico................................................. 133
Figura 54. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
cido linoleico............................................................................................
134
Figura 55. Mecanismo de fragmentao do 9,12-octadecadienico de metila............ 134
Figura 56. Estrutura do cido 9-octadecenico........................................................... 135
Figura 57. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
cido oleico................................................................................................
135
Figura 58. Mecanismo de fragmentao do 9-octadecenoato de metila..................... 136
Figura 59. Estrutura do cido octadecanico.............................................................. 136
Figura 60. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
cido esterico............................................................................................
137
Figura 61. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
ismero do cido 3-clerodeno-15-ico......................................................
137
Figura 62. Espectro de massas da substncia com tr: 32,3 minutos............................ 138
Figura 63. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
cido 3-clerodeno-15-ico.........................................................................
139
Figura 64. Fragmentao do composto identificado como ster metlico do cido 3-
clerodeno-15-ico......................................................................................
139
Figura 65. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
cido catvico.............................................................................................
140
Figura 66. Mecanismo de fragmentao do ster metlico do cido catvico........... 140
Figura 67. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico de
um cido diterpnico no identificado.......................................................
141
Figura 68. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico de
x
um cido graxo no identificado............................................................... 141
Figura 69. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
cido 3-hidroxi-labda-7,13-dieno-15-ico.................................................
142
Figura 70. Fragmentao do composto identificado com ster metlico do cido 3-
hidroxi-labda-7,13-dieno-15-ico..............................................................
142
Figura 71. Estrutura do cido tetracosanico.............................................................. 142
Figura 72. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
cido lignocrico........................................................................................
143
Figura 73. Estrutura do cido hexacosanico.............................................................. 144
Figura 74. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico do
cido hexacosanico..................................................................................
144
Figura 75. Espectro de massas da substncia identificada como ster metlico de
um cido graxo no identificado................................................................
145
Figura 76. Estrutura do esqualeno.............................................................................. 145
Figura 77. Espectros de massas da substncia identificada como esqualeno.............. 146
Figura 78. Clivagem allica do esqualeno.................................................................. 146
Figura 79. Estrutura do -tocoferol........................................................................... 147
Figura 80. Espectros de massas da substncia com tr = 41,6 min e do -tocoferol..... 147
Figura 81. Fragmentao do -tocoferol.................................................................. 148
Figura 82. Estrutura do estigmasterol.......................................................................... 148
Figura 83. Espectros de massas da substncia com tr = 42,5 min e do estigmasterol. 149
Figura 84. Estrutura do -sitosterol............................................................................ 149
Figura 85. Espectros de massas da substncia com tr =43,1min e do -sitosterol...... 150
Figura 86. Proposta de fragmentao do -sitosterol................................................ 150
Figura 87. Cromatograma de ons totais da frao f1-PP1-HCd................................ 154
Figura 88. Espectros de massas do pico de tempo de reteno 15,5 minutos da
frao f1-PP1-HCd e do lupeol.................................................................
155
Figura 89. Espectro de IV da frao f4-PP2-HCd..................................................... 156
Figura 90. Cromatograma de ons totais da frao f4-PP2-HCd................................. 157
Figura 91. Espectro de RMN 13C da frao f4-PP2-HCd......................................... 157
Figura 92. Espectros de RMN 1H da frao f4-PP2-HCd.......................................... 159
Figura 93. Mapa de contornos HSQC da frao f4-PP2-HCd..................................... 160
Figura 94. Estrutura do -sitosterol e estigmasterol................................................... 161
xi
Figura 95. CCD comparativa dos extratos das cascas de E. duckeana e E.
glabriflora..................................................................................................
168
Figura 96. Cromatograma obtido por CLAE, espectro de UV e EM da frao f1-
PP4-ACg2.................................................................................................
171
Figura 97. Espectro de RMN 1H da frao f1-PP4-ACg2.......................................... 172
Figura 98. Suposies da estrutura do flavonide da frao f1-PP4-ACg2............... 173
Figura 99. Cromatograma obtido por CLAE e espectro de UV da frao f2-PP4-
ACg2..........................................................................................................
174
Figura 100. Cromatograma obtido por CLAE e espectro de UV da substncia com
tempo de reteno 17,7 min da frao f7-C3-ACglab..............................
176
Figura 101. Espectro de massas da substncia com tempo de reteno 17,7 min....... 176
Figura 102. Ampliao do espectro de RMN 1H da amostra f7-C3-ACg..................... 177
Figura 103. Mapa de contornos 1H-1H-COSY da frao f7-C3-ACg........................... 179
Figura 104. Espectro de RMN 13C da amostra f7-C3-ACglab...................................... 181
Figura 105. Mapa de contornos HSQC da frao f7-C3-ACglab................................. 182
Figura 106. Expanso do mapa de contornos HMBC da frao f7-C3-ACglab.......... 183
Figura 107. Estrutura da engeletina............................................................................ 184
Figura 108. Resultado da purificao da frao f9-C2-ACd......................................... 189
Figura 109. Espectros de RMN 1H dos extratos brutos obtidos em metanol............... 190
Figura 110. Ampliao da regio 1 dos espectros de RMN 1H dos extratos
metanlicos................................................................................................
191
Figura 111. Ampliao da regio entre H 5,5 4,5 ppm dos espectros de RMN 1H
dos extratos brutos metanlicos...............................................................
192
Figura 112. Ampliao da regio H 4,1 3,3 ppm dos espectros de RMN 1H dos
extratos brutos metanlicos.......................................................................
193
Figura 113. Ampliao da regio H 3,2 0 ppm dos espectros de RMN 1H (500
MHz, CD3OD) dos extratos brutos..........................................................
194
Figura 114. CCD comparativa dos extratos das folhas de E. duckeana e E.
glabriflora..................................................................................................
195
Figura 115. CCD comparativa dos extratos das folhas obtidos e acetato de etila......... 199
Figura 116. Espectros de RMN 1H dos extratos metanlicos das folhas...................... 200
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Informaes taxonmicas sobre o gnero Eperua................................... 28
Tabela 2. Espcies e partes da planta estudadas em trabalhos anteriores............... 31
Tabela 3. Diterpenos encontrados em espcies de Eperua...................................... 34
Tabela 4. Compostos fenlicos encontrados em espcies de Eperua..................... 37
Tabela 5. Relao entre dimetro da coluna e quantidade da amostra na
cromatografia em coluna com slica flash................................................
71
Tabela 6. Eluentes utilizados na CCD comparativa dos extratos brutos.................. 81
Tabela 7. Bactrias gram (+) e (-) utilizadas no ensaio de atividade bacteriana..... 89
Tabela 8. Massas dos materiais vegetais aps secagem e triturao........................ 96
Tabela 9. Rendimento dos leos essenciais............................................................. 97
Tabela 10. Espectros de massas dos constituintes majoritrios no identificados no
OF2Eglab e OTEglab...............................................................................
102
Tabela 11. Diterpenos identificados no OTEglab...................................................... 103
Tabela 12. Composio qumica percentual do leo essencial das folhas (1 e 2
coleta) e talos de E. duckeana e E. glabriflora ........................................
104
Tabela 13. Massas e rendimentos dos extratos brutos e dos materiais vegetais da
primeira coleta...........................................................................................
105
Tabela 14. Resultado da quantificao de fenlicos totais.......................................... 109
Tabela 15. Resultado do ensaio quantitativo de Captura do radical DPPH.............. 113
Tabela 16. Resultados do Ensaio Antibacteriano (Mtodo de difuso em gar)........ 117
Tabela 17. Resultados do Ensaio Antibacteriano (Mtodo de diluio de caldo)....... 120
Tabela 18. Resultados do Ensaio Antifngico (Mtodo de diluio de caldo)........... 121
Tabela 19. Resultados da atividade Antiparasitria expressa em CI50........................ 122
Tabela 20. Resultado do ensaio de Atividade Citotxica em Linhagens de Clulas
Tumorais dos leos essenciais...................................................................
123
Tabela 21. Resultado do ensaio de atividade citotxica em linhagens de clulas
tumorais dos extratos brutos.....................................................................
124
Tabela 22. Substncias detectadas a partir do CG-DIC e CG-EM............................. 128
Tabela 23. Substncias detectadas nos extratos hexnicos derivatizados com TSM.. 130
Tabela 24. Dados de RMN 1H da mistura de estigmasterol e -sitosterol.................. 162
xiii
Tabela 25. Dados de RMN 13C e DEPT da mistura de estigmasterol e -sitosterol.. 163
Tabela 26. Eluentes e massa das fraes da coluna C1-ACg2................................... 169
Tabela 27. Dados de RMN 1H e [1H-1H]-COSY da frao f7-C3-ACg e
engelentina.................................................................................................
184
Tabela 28. Dados de RMN 13C da frao f7-C3-ACg e engeletina............................ 185
Tabela 29. Eluentes e massas das fraes coletadas no fracionamento do extrato
das folhas obtido em hexano de E. glabriflora.........................................
197
xiv
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Esquema geral da obteno das fraes neutra e cida dos
extratos brutos.................................................................................
70
Esquema 2. Esquema geral das extraes realizadas a partir do material
vegetal seco.....................................................................................
78
Esquema 3. Esquema geral dos Ensaio qumicos e biolgicas realizados com
os extratos brutos............................................................................
83
Esquema 4. Pr-fracionamento do extrato hexnico das cascas da E.
duckeana.........................................................................................
151
Esquema 5. Fracionamento da frao no-cida do EHCEduck........................ 152
Esquema 6 Fracionamento da frao f4-C2-HCd............................................. 153
Esquema 7 Fracionamento da frao cida A1-EHCEduck............................. 164
Esquema 8 Fracionamento do extrato EHCEglab1........................................... 165
Esquema 9. Fracionamento da frao cida A1-EHCEglab1............................ 166
Esquema 10. Pr-fracionamento do extrato EHCEglab2..................................... 167
Esquema 11. Fracionamento da frao f4-C1-ACg2........................................... 170
Esquema 12. Fracionamento da frao f5-C1-ACg2.......................................... 175
Esquema 13 Fracionamento da frao f6-C1-ACg2........................................... 186
Esquema 14 Pr-fracionamento do EACEduck.................................................. 187
Esquema 15 Fracionamento da frao f4-C1-ACd.............................................. 188
Esquema 16 Fracionamento da frao cida f4-C1-HFEg2................................ 198
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Abs.: absorvncia
AcOEt: acetato de etila
CG-DIC: cromatografia gs acoplada ao detector de ionizao de chama
CG-EM: cromatografia gs acoplada ao espectrmetro de massa
CIM: concentrao inibitria mnima
CBM: concentrao bactericida mnima
CFM: concentrao fungincida mnima
CCD: cromatografia em camada delgada
CCDP: cromatografia em camada delgada preparativa
CI50: concentrao inibitria de 50 %
CHCl3: clorofrmio
CLAE: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
DMSO: dimetilsulfxido
DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
DPPH-H: 2,2-difenilpicril-hidrazina
EAG: equivalente de cido glico
EHCEduck: extrato obtido em hexano das cascas de E. duckeana
EACEduck: extrato obtido em acetato de etila das cascas de E. duckeana
EMCEduck: extrato obtido em metanol das cascas de E. duckeana
EHCEglab: extrato obtido em hexano das cascas de E. glabriflora
EACEglab: extrato obtido em acetato de etila das cascas de E. glabriflora
EMCEglab: extrato obtido em metanol das cascas de E. glabriflora
EtOH: lcool etlico
FeCl3: cloreto frrico
FIOCRUZ: Fundao Oswaldo Cruz
Hex: hexano
HCl: cido clordrico
HPLC: High Performance/Pressure Liquide Chromatography
INCA: Instituto Nacional do Cncer (Brasil)
INPA: Instituto de Pesquisas da Amaznia
xvi
LIT: Meio de cultura liver infusion tryptose
LOExp: Laboratrio de Oncologia Experimental
MH: Mller Hinton
MeOH: metanol
m/z: razo massa/carga
MTT: sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium
NCI: National Cancer Institute (Estados Unidos)
nm: nanmetro
OFduck: leo essencial das folhas de E. duckeana
OFglab: leo essencial das folhas de E. glabriflora
OMS: Organizao Mundial da Sade
OTduck:leo essencial dos talos de E. duckeana
OTglab: leo essencial dos talos de E. glabriflora
RDA: Reao de retro Diels-Alder
rH: rearranjo de hidrognio
RL: radicais livres
SFB: Soro Fetal Bovino
SVS: Secretaria de Vigilncia Sanitria
UEM: Universidade Estadual de Maring
UFAM: Universidade Federal do Amazonas
UFC: Universidade Federal do Cear
xvii
SUMRIO
1. INTRODUO .............................................................................................................. 23
2. REVISO DA LITERATURA ..................................................................................... 26
2.1. Consideraes gerais sobre a Famlia Fabaceae........................................................... 27
2.2. Gnero Eperua Aublet................................................................................................. 28
2.2.1. Usos etnofarmacolgicos......................................................................................... 29
2.2.2. Constituintes qumicos do gnero Eperua................................................................ 30
2.2.2.1. Terpenos de Eperua................................................................................................ 32
2.2.2.2. Compostos fenlicos de Eperua.............................................................................. 36
2.2.3. Atividades biolgicas do gnero Eperua................................................................... 38
2.3. Diterpenos..................................................................................................................... 40
2.3.1. Atividades biolgicas de diterpenos........................................................................... 42
2.4. Flavonides................................................................................................................... 44
2.4.1. Biossntese dos flavonides....................................................................................... 45
2.5. Consideraes gerais sobre atividades qumicas e biolgicas estudadas..................... 46
2.5.1. Atividade antioxidante............................................................................................... 46
2.5.1.1. Flavonides como antioxidantes............................................................................. 47
2.5.1.2. Captura de radical livre DPPH- Ensaio indicativo de atividade antioxidante....... 50
2.5.2. Determinao de fenlicos totais - Mtodo de Folin-Ciocalteu................................. 51
2.5.3. Atividade antimicrobiana........................................................................................... 52
2.5.3.1. Frmacos antibacterianos de origem naturais disponveis...................................... 53
2.5.3.2. Frmacos antifngicos disponveis......................................................................... 55
2.5.4. Atividade antiprotozoria........................................................................................... 57
2.5.4.1. Leishmaniose........................................................................................................... 57
2.5.4.2. Doena de Chagas.................................................................................................. 58
xviii
2.5.5. Cncer........................................................................................................................ 59
2.5.5.1. Agentes antineoplsicos a partir de plantas............................................................. 60
3. OBJETIVOS................................................................................................................... 63
3.1. Objetivo geral............................................................................................................... 64
3.2. Objetivos especficos.................................................................................................... 64
4. MATERIAIS E MTODOS ......................................................................................... 65
4.1. Mtodos Cromatogrficos............................................................................................. 66
4.1.1. Cromatografia em Camada Delgada (CCD).............................................................. 66
4.1.1.1. Reveladores de CCD.............................................................................................. 66
4.1.2. Cromatografia em Camada Delgada Preparativa (CCDP)......................................... 67
4.1.3. Cromatografia em Coluna Aberta e sob presso........................................................ 69
4.1.4. Cromatografia em fase Gasosa (CG)......................................................................... 72
4.1.4.1. Derivatizao das amostras para injeo em cromatgrafo em fase gasosa........... 72
4.1.5. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)................................................... 72
4.2. Mtodos espectromtricos............................................................................................. 73
4.2.1. Espectroscopia no Infravermelho (IV)....................................................................... 73
4.2.2. Ressonncia Magntica Nuclear (RMN).................................................................... 74
4.2.3. Espectroscopia de massa por electronspray (ESI-EM).............................................. 74
4.3. Solventes....................................................................................................................... 75
4.4. Equipamentos e acessrios do laboratrio................................................................... 75
4.5. Coleta e identificao do material vegetal.................................................................... 75
4.6. Tratamento do material vegetal.................................................................................... 77
4.7. Extrao do material vegetal......................................................................................... 78
4.7.1. Extrao dos leos essenciais..................................................................................... 78
4.7.1.1. Anlises cromatogrficas e espectromtricas dos leos essenciais......................... 78
xix
4.7.1.2. Identificao dos componentes dos leos essenciais.............................................. 79
4.7.2. Obteno dos extratos brutos..................................................................................... 80
4.7.2.1. Nomenclatura dos extratos e fraes...................................................................... 80
4.8. Anlise comparativa dos extratos brutos por CCD....................................................... 81
4.9. Anlise dos extratos apolares das cascas por CG-DIC e CG-EM................................ 82
4.10. Ensaios qumicos e biolgicos.................................................................................... 82
4.10.1. Ensaios qumicos..................................................................................................... 83
4.10.1.1. Fenlicos Totais.................................................................................................... 83
4.10.1.1.1. Ensaio qualitativo de compostos fenlicos........................................................ 84
4.10.1.1.2. Quantificao de Fenlicos Totais..................................................................... 84
4.10.1.2. Teste de Shinoda.................................................................................................. 85
4.10.1.3. Ensaios indicativos de atividade antioxidante...................................................... 86
4.10.1.3.1. Captura do Radical Livre DPPH-Ensaio qualitativo......................................... 86
4.10.1.3.2. Captura do Radical Livre DPPH-Ensaio quantitativo..................................... 86
4.10.2. Ensaios Biolgicos................................................................................................... 88
4.10.2.1. Ensaios de Atividade Antimicrobiana.................................................................. 88
4.10.2.1.1. Ensaio de Atividade Antibacteriana-Mtodo de difuso em gar (disco).......... 88
4.10.2.1.2. Ensaio de Atividade Antibacteriana-Mtodo de diluio em caldo................... 90
4.10.2.2. Ensaio de Atividade Antifngica.......................................................................... 91
4.10.2.3. Ensaios de Atividade Antiprotozoria................................................................... 91
4.10.2.3.1. Ensaio de Atividade Antileishmania.................................................................. 92
4.10.2.3.2. Ensaio de Atividade Antitrypanossoma cruzi.................................................... 92
4.10.2.4. Ensaio de Citotoxicidade em Linhagens de Clulas Tumorais............................. 93
5. RESULTADOS E DISCUSSO.................................................................................. 96
5.1. Coleta dos materiais vegetais..................................................................................... 96
xx
5.2. Extrao e anlise dos leos essenciais......................................................................... 96
5.3. Obteno dos extratos brutos........................................................................................ 105
5.4. Ensaios qumicos........................................................................................................... 106
5.4.1. Ensaio qualitativo de compostos fenlicos................................................................ 106
5.4.2. Quantificao de fenlicos totais............................................................................... 108
5.4.3. Teste de Shinoda........................................................................................................ 109
5.4.4. Ensaio indicativo de atividade antioxidante............................................................... 110
5.4.4.1. Ensaio qualitativo da Captura do Radical Livre DPPH......................................... 110
5.4.4.2. Ensaio quantitativo da Captura do Radical Livre DPPH....................................... 113
5.4.4.3. Compostos fenlicos vs. Captura do Radical Livre DPPH................................... 114
5.5. Ensaios Biolgicos........................................................................................................ 115
5.5.1. Ensaios de Atividade Antimicrobiana....................................................................... 115
5.5.1.1. Ensaio de Atividade Antibacteriana- Mtodo de difuso em gar.......................... 115
5.5.1.2. Ensaio de Atividade Antibacteriana- Mtodo de diluio de caldo........................ 119
5.5.1.3. Ensaio de Atividade Antifngica............................................................................ 120
5.5.2. Ensaio de Atividade Antiprotozoria......................................................................... 121
5.5.3. Ensaio de Citotoxicidade em Linhagens de Clulas Tumorais.................................. 122
5.6. Estudo Fitoqumico ...................................................................................................... 125
5.6.1. Extratos das cascas obtidos em hexano................................................................. 125
5.6.1.1. Avaliao dos perfis cromatogrficos dos extratos por CCD................................. 125
5.6.1.2. Anlise dos extratos apolares das cascas por CG-DIC e CG-EM.......................... 126
5.6.1.2.1. Compostos identificados por dados espectrais..................................................... 131
5.6.1.2.1.1. cido hexadecanico (cido palmtico)............................................................ 131
5.6.1.2.1.2. cido 9,12-octadecadienico (cido linolico)................................................. 133
5.6.1.2.1.3. cido 9-octadecenico (cido olico)............................................................... 135
xxi
5.6.1.2.1.4. cido octadecanico (cido esterico)............................................................. 136
5.6.1.2.1.5. Ismero do cido 3-clerodeno-15-ico............................................................. 137
5.6.1.2.1.6. cido 3-clerodeno-15-ico.............................................................................. 138
5.6.1.2.1.7. cido catvico.................................................................................................. 140
5.6.1.2.1.8. cido diterpnico no-identificado.................................................................. 141
5.6.1.2.1.9. cido graxo no-identificado........................................................................... 141
5.6.1.2.1.10. cido 3-hidroxilabda-7,13-dieno-15-ico...................................................... 142
5.6.1.2.1.11. cido tetracosanico (cido lignocrico)....................................................... 143
5.6.1.2.1.12. cido hexacosanico (cido certico)............................................................ 144
5.6.1.2.1.13. cido graxo no-identificado......................................................................... 145
5.6.1.2.1.14. Esqualeno....................................................................................................... 145
5.6.1.2.1.15. -tocoferol...................................................................................................... 147
5.6.1.2.1.16. Estigmasterol.................................................................................................. 148
5.6.1.2.1.17. -sitosterol..................................................................................................... 149
5.6.1.3. Fracionamentos cromatogrficos do extrato bruto EHCEduck.............................. 151
5.6.1.3.1. Fracionamento da frao C1-EHCEduck............................................................. 152
5.6.1.3.1.1. Fracionamento da frao f4-C2-HCd................................................................ 153
5.6.1.3.1.2. Purificao da frao f6-C3-HCd...................................................................... 153
5.6.1.3.1.3. Frao f1-PP1-HCd........................................................................................... 154
5.6.1.3.1.4. Purificao da frao f5-C2-HCd..................................................................... 155
5.6.1.3.1.5. Frao f4-PP2-HCd........................................................................................... 156
5.6.1.3.2. Fracionamento da frao A1-EHCEduck............................................................. 164
5.6.1.4. Fracionamento cromatogrfico do extrato bruto EHCEglab1............................... 165
5.6.1.4.1. Fracionamento da frao A1-EHCEglab1........................................................... 166
5.6.1.5. Fracionamento cromatogrfico do extrato bruto EHCEglab2................................ 167
xxii
5.6.2. Extratos das cascas obtidos em acetato de etila........................................................ 168
5.6.2.1. Avaliao dos perfis cromatogrficos dos extratos por CCD................................. 168
5.6.2.2. Fracionamento do extrato bruto EACEglab2 ........................................................ 169
5.6.2.2.1. Fracionamento da frao f4-C1-ACg2................................................................. 170
5.6.2.2.2. Purificao da frao f1-C2-ACg2....................................................................... 171
5.6.2.2.3. Frao f1-PP4-ACg2............................................................................................ 171
5.6.2.2.4. Frao f2-PP4-ACg2............................................................................................ 173
5.6.2.2.5. Fracionamento da frao f5-C1-ACg2................................................................. 174
5.6.2.2.6. Elucidao estrutural da frao f7-C3-ACg2....................................................... 175
5.6.2.2.7. Fracionamento da frao f6-C1-ACg2................................................................. 186
5.6.2.2.8. Purificao da frao f7-C4-ACg2....................................................................... 186
5.6.2.3. Fracionamento do extrato bruto EACEduck........................................................... 187
5.6.2.3.1. Fracionamento da frao f4-C1-ACd................................................................... 188
5.6.2.3.2. Purificao da frao f9-C2-ACd......................................................................... 188
5.6.3. Extrato metanlicos das cascas: Avaliao por RMN 1H.......................................... 189
5.6.4. Extratos das folhas obtidos em hexano...................................................................... 195
5.6.4.1. Avaliao dos perfis cromatogrficos dos extratos por CCD................................ 195
5.6.4.2. Pr-fracionamento do extrato bruto EHFEglab2..................................................... 196
5.6.5. Extratos das folhas obtidos em acetato de etila.......................................................... 198
5.6.5.1. Avaliao dos perfis cromatogrficos dos extratos por CCD................................ 198
5.6.6. Extratos metanlicos das folhas: Avaliao por RMN 1H......................................... 199
6. CONCLUSO................................................................................................................ 201
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................... 204
23
1. INTRODUO
24
1. INTRODUO
A utilizao de plantas para tratamento, cura e preveno de doenas uma das mais
antigas formas de prtica medicinal da humanidade. A Organizao Mundial da Sade estima
que 80% da populao mundial utiliza plantas como medicamentos (VEIGA-JUNIOR et al.,
2005). Alm do seu uso na medicina popular com finalidades teraputicas, as plantas tm
contribudo para a obteno de vrios frmacos, at hoje amplamente utilizados, como
exemplo a morfina, a emetina, a vincristina, a colchichina, a rutina, etc (CECHINEL FILHO
& YUNES, 1998). Cerca de 30% dos medicamentos mais prescritos e vendidos no mundo
foram desenvolvidos a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2003).
A busca de novas substncias bioativas foi intensificada especialmente nas florestas
tropicais, onde se concentra grande parte da biodiversidade (PINTO et al., 2002). Como
conseqncia, pode-se esperar que as potenciais descobertas de novos produtos naturais
biologicamente ativos ocorrero nas florestas tropicais, como a da Amaznia (GARCIA,
1995).
O Brasil possui cerca de 60.000 espcies de plantas, o que corresponde 20% de toda
flora mundial, porm a flora brasileira praticamente desconhecida em termos qumicos, pois
de toda essa riqueza tm-se estudos qumicos e/ou farmacolgicos de apenas 1% dessas
plantas (BARATA, 2001; GARCIA, 1995). Alm disso, o Brasil considerado o maior pas
do planeta em nmero de espcies endmicas (BARREIRO & BOLZANI, 2009), porm, a
maioria das plantas medicinais comercializadas no pas foram introduzidas de outros pases.
Assim, as plantas medicinais endmicas ainda so pouco conhecidas o que constituem em um
fascinante assunto de pesquisa acadmica e de desenvolvimento (PINTO et al., 2002).
Apesar das doenas tropicais (malria, mal de Chagas, esquistossomose e
leishmaniose), juntamente com a tuberculose, somarem cerca de 5% das doenas do mundo,
25
elas no recebem a ateno que merecem. Dos mais de 1.300 novos medicamentos
introduzidos entre 1975 e 1999, apenas 13 eram para doenas tropicais. Alm disso, no ano de
2000 somente cerca de 0,1% do investimento global em pesquisa em sade foi dedicada
descoberta de medicamentos para as doenas tropicais (PINK et al., 2005). Isto ocorre porque
o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento dessas doenas, que afetam sobretudo
populaes de pases em desenvolvimento, pouco interessa indstria farmacutica, pois
embora estes pases renam 80% da populao mundial, correspondem a apenas 20% das
vendas globais de remdios (FUNARI & FERRO, 2005).
Considerando a escassez e a importncia de estudos qumicos das plantas endmicas
e a necessidade de pesquisas por substncias que auxiliem no tratamento de doenas que
afligem a humanidade, o objetivo desse trabalho foi estudar a composio qumica e
atividades biolgicas das espcies Eperua duckeana e Eperua glabriflora que apesar de serem
endmicas e comuns na Amaznia Central no possuem estudo qumico ou farmacolgico.
26
2. REVISO DA LITERATURA
27
2. REVISO DA LITERATURA
2.1. CONSIDERAES GERAIS SOBRE A FAMLIA FABACEAE
A famlia Fabaceae, equivalente Leguminosae, pertence ordem Fabales, classe
Magnoliopsida e diviso Magnoliophyta (ROSKOY et al., 2007) e composta por cerca de
19.000 espcies distribudas em 695 gneros (GIULIETTI et al., 2005). Esta famlia
formada por rvores, arbustos, lianas e ervas e tem distribuio cosmopolita, ou seja,
distribudas mundialmente (DI STASI & HIRUMA-LIMA, 2002). O Brasil possui cerca de
3.200 espcies dessa famlia distribudas em 176 gneros, sendo que aproximadamente 2.144
dessas espcies so endmicas (32 gneros endmicos) (GIULIETTI et al., 2005).
uma das maiores e mais importantes famlias botnicas, visto o grande nmero de
espcies vegetais e a sua importncia como fonte de produtos alimentares, medicinais,
ornamentais, madeireiros e fornecedores de forragem, fibras, corantes, gomas, resinas e leos
(DI STASI & HIRUMA-LIMA, 2002; WATSON & DALLWITZ, 2009). Essa famlia
geralmente dividida em trs subfamlias: Faboideae, Caesalpinioideae e Mimosoideae
(SOUZA & LORENZI, 2008).
A famlia Fabaceae uma das poucas famlias que possui isoflavonas, subclasse de
flavonides conhecida pelas suas propriedades bactericidas, antifngicas e estrognicas
(SIMES et al., 2007).
28
2.2. O GNERO Eperua Aublet
O gnero Eperua Aublet constitudo por 14 espcies distribudas pela Amaznia
Central, principalmente pelo sul do Equador, Venezuela, Guianas e norte do Brasil, em
especial nas reas da cidade de Manaus (COWAN, 1975). Na Tabela 1 encontra-se a posio
taxonmica do gnero Eperua (ROSKOY et al., 2007). Em geral, as espcies desse gnero
so rvores de grande porte, podendo variar de 5 a 70 metros de altura. Apresentam vagens de
colorao esverdeada a tons enegrecidos.
Categoria Taxn Diviso Magnoliophyta
Classe Magnoliopsida
Ordem Fabales Famlia Fabaceae
Subfamlia Caesalpinioideae Gnero Eperua
Segundo Cowan (1975) existe uma relao entre o tipo de solo e as diferentes espcies
de Eperua que eles suportam. Por exemplo, E. glabriflora encontrada apenas em locais com
solos midos e cidos de areia branca e hmus negro, j a E. schomburgkiana encontrada
em solos pantanosos s margens de rios e crregos em pequena florestas.
O principal uso das espcies de Eperua est relacionado com a indstria madeireira,
pois as rvores possuem crescimento e regenerao rpida, cerca de 30 anos de corte a corte,
alm disso, possuem particular resistncia deteriorao em contato com a gua, por esse
motivo so usadas em construes de casas, cercas e telhas e tambm como lenha e carvo
vegetal (COWAN, 1975). As madeiras retiradas de rvores desse gnero so conhecidas
comercialmente como wallaba, mas podem ser encontradas pelos nomes de espadeira,
copaibarana, muirapiranga, yoboko, bois-de-sabre, eperu, wapa, roode walaba, bijlhout e
tamoene (COWAN, 1975; RICHTER & DALLWITZ, 2009).
Tabela 1. Informaes taxonmicas sobre o gnero Eperua
29
As espcies do gnero Eperua encontradas na Amaznia brasileira so conhecidas
popularmente como Muirapiranga (SILVA et al., 2004). Vrias espcies exsudam leo-resina
do tronco, segundo Janzen (1974 apud MEDINA & DE SANTIS, 1981, p. 202) o leo-resina
exsudado da E. purpurea o responsvel pela notvel resistncia ao ataque de insetos ao
tronco da rvore. Alguns dos leos-resinas de Eperua so conhecidos popularmente com
nomes correlatos aos da copaba, como os das espcies E. oleifera e E. purpurea, que so
conhecidas como copaba-jacar e copaibarana, respectivamente. A espcie E.duckeana
recebeu esse nome em homenagem ao Adolpho Ducke, pioneiro na coleo e estudo de
Leguminosas do Brasil (COWAN, 1975) e conhecida vulgarmente por muirapiranga de
folha mida (ou Pau-de-leo). A espcie E. glabriflora tem a sinonmia: Eperua bijuga var.
glabriflora Ducke e conhecida como muirapiranga de folha grande (SILVA et al., 2004). Os
fololos dessa espcie possuem margem revoluta, o que facilita reconhecer os mesmos na
liteira da floresta (MARTINS & SILVA, 1999). Apesar das espcies E. duckeana e E.
glabriflora serem comuns na Amaznia Central, nunca foram estudadas quimicamente e/ou
farmacologicamente.
2.2.1. USOS ETNOFARMACOLGICOS
Muitas das espcies do gnero Eperua so indicadas para o tratamento de lcera e
diarreia e como emtico. H relatos que a infuso de wallaba (Eperua sp.) juntamente com
o suco dos galhos de Saccharum officinarum so usados para o tratamento de
envenenamento por curare pelos ndios Macusi da Guiana. Alm disso, a decoco da parte
interna das cascas de E. grandiflora usada para aliviar dor de dente (DEFILIPPS et al.,
2004).
30
A espcie com mais indicaes etnofarmacolgicas E. falcata. A decoco das
cascas do caule dessa espcie usada como: analgsico dental (HENRY et al., 2007), para
induzir vmito e para tratamento de diarreia (DEFILIPPS et al., 2004). Alm disso, o leo da
espcie E. falcata utilizado na medicina popular de modo anlogo ao da copaba (como
cicatrizante, antifngico e bactericida) (VEIGA-JUNIOR & PINTO, 2002); e usado como
pomada contra reumatismo e na cicatrizao de feridas. A mistura do leo-resina da E. falcata
com a resina da espcie Protium aracouchini usada como emplastro para feridas
(DEFILIPPS et al., 2004).
Apesar das espcies do gnero Eperua apresentarem vrias indicaes
etnofarmacolgicas, nenhuma das atividades descritas para os leos-resinas ou para os
extratos possui comprovao cientfica.
2.2.2. CONSTITUINTES QUMICOS DO GNERO Eperua
Por ser um gnero endmico da Amaznia, grande parte dos estudos fitoqumicos
foram realizados por pesquisadores de pases desta Regio. Destacando-se os estudos
realizados na Venezuela por vila, De Santis, Medina e Maillo. A maioria dos estudos foi
feito nas dcadas de 1980 e 1990.
Dois trabalhos foram realizados no Brasil com a qumica das Eperuas, ambos com E.
bijuga, porm com propsitos diferentes. Um deles, realizado por Braz Filho e colaboradores
(1973) teve como objetivo buscar flavonides em leguminosas, e o outro referente anlise
de leo essencial das folhas da mesma espcie, realizado por Maia e Godoy (1984), este
citado no Banco de Dados de Plantas Aromticas da Regio Amaznica elaborado por Maia e
Andrade (2009).
31
Os poucos trabalhos fitoqumicos encontrados na literatura se concentram nas
espcies: E. purpurea, E. leucantha, E. falcata, E. bijuga e E. grandiflora. As espcies, as
partes das plantas utilizadas, os nmeros de trabalhos e as classes das substncias isoladas nos
estudos fitoqumicos esto expostos na Tabela 2.
As classes de substncias investigadas foram basicamente terpenos (principalmente
diterpenos) e flavonides. A espcie com o maior nmero de estudos a E. falcata, talvez por
ser a espcie com maior nmero de relatos de uso etnofarmacolgico.
Espcie Parte
estudada Classes de substncias Referncias
E. bijuga folhas sesquiterpenos,
triterpenos e flavonoides
BRAZ FILHO et al., 1973
MAIA & ANDRADE, 2009
E. falcata madeira
diterpenos,
cidos fenlicos e flavonoides
KING & JONES, 1955
BLAKE & JONES, 1963
VILLENEUVE et al., 1988
AMUSANT et al., 2007
ROYER et al., 2010
E. grandiflora madeira Diterpenos AMUSANT et al., 2007
E. leucantha resina Diterpenos MAILLO et al., 1987
sementes Diterpenos VILA et al., 1992
E. purpurea
resina Diterpenos
MEDINA & DE SANTIS, 1981
DE SANTIS & MEDINA, 1981
DE SANTIS & MEDINA, 1987
sementes Diterpenos VILA & MEDINA, 1991
VILA & MEDINA, 1993
Tabela 2. Espcies e partes da planta estudadas em trabalhos anteriores
32
2.2.2.1. TERPENOS DE Eperua
Os estudos fitoqumicos com o gnero Eperua relatam diversos terpenos,
principalmente diterpenos. Maia e Godoy (1984 apud MAIA & ANDRADE, 2009, p. 595)
descreveram o componente majoritrio dos leos essenciais das folhas de E. bijuga como
sendo (E)-cariofileno (1). Braz Filho e colaboradores (1973) isolaram o triterpeno friedelano-
3-ol (2) de E. bijuga, o nico identificado no gnero at o momento (Figura 1).
Os leos-resinas exsudados do tronco das espcies do gnero Eperua so conhecidos
por apresentarem uma grande quantidade de cidos diterpnicos. King e Jones (1955) citam
que os leos-resinas de E. falcata e de outras espcies de Eperua da Guiana Inglesa so
constitudas por cerca de 85% de cidos diterpnicos, principalmente o cido eperico, que
recebeu esse nome por ter sido isolado pela primeira vez em espcies do gnero Eperua.
Em geral, os diterpenos relatados para esse gnero so de estruturas labdnicas e
clerodnicas (Figura 2). As diferenas dos esqueletos labdanos para os clerodanos so as
posies das metilas 19 e 20. Em geral os diterpenos de Eperua apresentam estes dois
esqueletos com algumas modificaes.
1
HO
H HH
2
Figura 1. Estruturas do sesquiterpeno e triterpeno encontrados em espcies de Eperua: (E)-cariofileno (1) e friedelano-3-ol (2)
33
As modificaes mais freqentes so: posio e o nmero de insaturaes, as mais
comuns em 8-17 e 13-14; presena de hidroxilas e carboxilas na posio 15 e a ocorrncia de
norditerpenos. A Tabela 3 apresenta os diterpenos identificados no gnero Eperua e as
Figuras 3 e 4 apresentam as estruturas dos diterpenos correspondentes.
Todos os diterpenos clerodnicos foram isolados das sementes das vagens e nenhum
deles foi encontrado em outra parte da planta, o que pode indicar a possibilidade das espcies
do gnero Eperua produzirem diterpenos clerodnicos apenas nas sementes das vagens.
1
2
3 45
6
7
89
10
11
1213
14
15
16
1819
20
17
A B
labdano
1
2
3 45
6
7
8910
11
1213
14
15
16
18
19
20
17
A B
clerodano
Figura 2. Esqueletos e numerao dos diterpenos labdanos e clerodanos
34
N Constituinte Referncias Cetonas
3 14,15-bisnor-labda-13-ona DE SANTIS & MEDINA (1987)c 4 9-metil-14,15,20-trinor-labda-1(10)-eno-13-ona DE SANTIS & MEDINA (1987)c 5 14,15-bisnor-labda-7-eno-13-ona DE SANTIS & MEDINA (1987)c steres 6 eperuato de metila MAIA & GODOY (1984 apud MAIA &
ANDRADE, 2009)a 7 labda-8(17)-eno-15-oato de labda-8(17)-eno-15-ila MEDINA & DE SANTIS (1981)c
MAILLO et al. (1987)d lcoois 8 labda-8(17)-eno-15-ol MEDINA & DE SANTIS (1981)c
MAILLO et al. (1987)d 9 labda-8(17),13E-dieno-15-ol MEDINA & DE SANTIS (1981)c
MAILLO et al. (1987) d cidos (labdanos) 10 cido labda-8(17)-eno-15-ico
(cido eperico) KING & JONES (1955) b
MEDINA & DE SANTIS (1981)c MAILLO et al. (1987)d
AMUSANT et al. (2007)b,e 11 cido labda-8(17),13E-dieno-15-ico
(cido coplico) VILA & MEDINA (1993) c
MEDINA & DE SANTIS (1981)c DE SANTIS & MEDINA (1981)c
AMUSANT et al. (2007)e 12 cido ent-coplico MAILLO et al. (1987)d 13 cido labda-7-eno-15-ico (cido catvico) MAILLO et al. (1987)d AMUSANT et al. (2007)b 14 cido 7-oxo-labda-8-eno-15-ico VILA & MEDINA (1993) c
AMUSANT et al. (2007)e 15 cido (-)-7-oxo-labda-8,13E-dieno-15-ico AMUSANT et al. (2007)e cidos (clerodanos) 16 cido (-)-cleroda-7,13E-dieno-15-ico VILA & MEDINA (1993)c 17 cido (-)-2-oxo-cleroda-3,13E-dieno-15-ico
(cido 2-oxo-covalnico) VILA & MEDINA (1991) c
VILA et al. (1992)d VILA & MEDINA (1993) c
18 cido (-)-7-hidrxicleroda-8(17),13E-dieno-15-ico VILA et al. (1992)d 19 cido nor-hardwkiico VILA et al. (1992)d 20 cido 16-oxo-13,14H-hardwkiico VILA et al. (1992)d
Tabela 3. Diterpenos encontrados em espcies de Eperua
a- Isolado de E. bijuga; b- Isolado de E. falcata; c- Isolado de E. purpurea; d- Isolado de E. leucantha; e- Isolado de E. grandiflora
35
Figura 3. Estruturas de diterpenos labdnicos isolados de espcies de Eperua
1
2
3 45
6
7
89
10
11
1213
14
15
16
1819
20
17
A B
labdano
7
COOCH2R
6 R= COOMe
8 R= CH2OH
10 R= COOH
9 R= CH2OH
11 R= COOH
RCOOH
12
COOH
13
15
COOH
O
COOH
O
14
O
5 4
O
3
O
36
2.2.2.2. COMPOSTOS FENLICOS DE Eperua
Braz e colaboradores (1973) isolaram a flavona tricina (26), das folhas de E. bijuga.
Do cerne de E. falcata foram isoladas a (+)-catequina (23) e a (-)- epicatequina (24)
(VILLENEUVE et al., 1988).
1
2
3 45
6
7
8910
11
1213
14
15
16
18
19
20
17
A B
clerodano
Figura 4. Estruturas de diterpenos clerodnicos isolados de espcies de Eperua
H
COOH
COOH
19
H
COOH
O
O
20
COOH
H
OH
18 16
COOH
H
COOH
H
O
17
37
Em 2007, Henry e colaboradores depositaram uma patente relatando que no extrato
das cascas de E. falcata, os flavonides engeletina e a astilbina so os principais responsveis
pela atividade antiinflamatria.
O trabalho realizado por Royer e colaboradores em 2010 apresentou treze substncias
do extrato metanlico de E. falcata. As molculas foram isoladas por CLAE e identificadas
por comparao dos espectros de RMN 1D e 2D com os dados da literatura, sendo onze
flavonides (23 - 33) e dois cidos fenlicos: o cido glico (21) e cido p-hidroxibenzico
(22). Quatro dos flavonides isolados (23), (24), (27) e (31) j tinham sido isolados
anteriormente.
A Tabela 4 apresenta os compostos fenlicos isolados das espcies de Eperua e a
Figura 5 apresenta a estrutura dos flavonides e cidos fenlicos correspondentes.
N Substncia Referncia cidos fenlicos 21 cido glico ROYER et al. (2010) b 22 cido p-hidroxibenzico ROYER et al. (2010) b
Flavonides 23 (+)-catequina VILLENEUVE et al. (1988)b ROYER et al. (2010) b 24 (-)- epicatequina VILLENEUVE et al. (1988)b ROYER et al. (2010) b 25 (-)-3-(4-hidroxibenzoil)epicatequina ROYER et al. (2010) b 26 tricina BRAZ FILHO et al. (1973)a 27 engeletina ROYER et al. (2010) b 28 isoengelentina ROYER et al. (2010) b 29 neoengelentina ROYER et al. (2010) b 30 neoisoengelentina ROYER et al. (2010) b 31 astilbina ROYER et al. (2010) b 32 neoastilbina ROYER et al. (2010) b 33 (-)-dihidrocampferol ROYER et al. (2010) b
Tabela 4. Compostos fenlicos encontrados em espcies de Eperua
a- Isolado de E. bijuga; b- Isolado de E. falcata.
38
2.2.2. ATIVIDADES BIOLGICAS DO GNERO Eperua
Grande parte dos ensaios biolgicos realizados com extratos ou resinas de Eperua
direcionada para testes com microorganismos que degradam a madeira, pois uma das
principais interessadas nas espcies desse gnero so as indstrias madeireiras. Entretanto, as
Figura 5. cidos fenlicos e flavonides identificados em espcies de Eperua (Rha=-L-raminose)
R1 CO2H
HO
R2
21 R1=OH, R2= OMe 22 R1=R2=H
O
OH
OMe
OOH
HOOMe
26
OHO
OH
OH
OH
O 33
OHO
OH O
O
R
OH
Rha
3
2
27 2R, 3R, R=H 28 2R, 3S, R=H 29 2S, 3S, R=H 30 2S, 3R, R=H 31 2R, 3R, R=OH 32 2S, 3S, R=OH
OHO
OH
R1
OH
OH
3
2
23 2R, 3S, R1=OH 24 2R, 3R, R1=OH 25 2R, 3R, R1=p-hidroxibenzoato
39
indstrias farmacuticas tambm se interessam pelos constituintes sintetizados por espcies de
Eperua, em especial pelos compostos fenlicos.
A resina de E. grandiflora apresentou atividade inseticida contra cupim (DL50: 1,261
g/2 mg) (GOURNELIS et al., 1986). Nos extratos de E. falcata e E. grandiflora foi
observada atividade contra o fungo Coriolus versicolor (AMUSANT et al., 2007) e atribuda
a maior durabilidade da madeira composio de cidos diterpnicos e compostos
polifenlicos. No trabalho de Royer e colaboradores (2010) foi atribuda a estabilidade da
madeira da E. falcata aos polifenis, comprovadas atravs de isolamento e identificao dos
constituintes do extrato metanlico.
O trabalho realizado por Gournelis e colaboradores (1986) comprovou a atividade
bactericida (CIM: 12,5 g/mL) para Staphylococcus aureus e Streptococcus hemolyticus da
resina de Eperua grandiflora.
As propriedades dos extratos de E. falcata so relatadas em patentes na rea de
cosmticos. Pauly e Moretti (2003a,b e 2005) relatam a ao antiradicalar do extrato e
licenciaram um cosmtico com ao anti-rugas. Henry e colaboradores (2007) licenciaram
uma preparao contendo o extrato de E. falcata, que til para inibir a liberao de pro-
mediadores inflamatrios e neuropeptdeos incluindo CGRP e SP, para tratamento de pele e
cabelo e que tambm os protege dos efeitos danosos dos raios UV-A e UV-B.
A mistura dos cidos eperico (10), catvico (13) e cido labda-8-eno-15-ico (34)
usada como acelerador da produo de colgeno (YAMAMOTO et al., 2005), ativador do
crescimento celular (TAMAI et al., 1999) e inibio de melanina (TAMAI et al., 2001). As
mesmas atividades so relatadas para os sais e steres metlicos e etlicos desses cidos. Dois
desses diterpenos, (10) e (13), j foram isolados de espcies de Eperua. Nas patentes geradas
pela utilizao dessas molculas, E. falcata citada como fonte dessas molculas.
40
2.3. DITERPENOS
Os diterpenos so metablitos secundrios formados por 20 tomos de carbonos
derivados biogeneticamente a partir do geranil-geranilpirofosfato (GGPP), que contm quatro
unidades isoprenos ligados no modo cabea-cauda (HANSON, 1991).
As unidades isoprenos so formadas a partir da condensao entre as unidades
difosfato de 3,3-dimetilalila (DMAPP) e o difosfato de 3-isopentenila (IPP). Existem duas
vias biossintticas possveis para a formao do DMAP e do IPP: a via do mevalonato e a via
do fosfato de deoxixilulose (LOBO & LOURENO, 2007).
A condensao cabea-cauda entre as unidades DMAPP e IPP, catalisada pela
enzima prenil-tranferase, forma a cadeia de geranil pirofosfato (GPP), precursora dos
monoterpeno. A condensao desta cadeia com novas unidades de IPP origina sucessivamente
as cadeias de farnesil pirofosfato (C15), geranilgeranil pirofosfato (C20) precursoras dos
sesquiterpenos e diterpenos, respectivamente (DEWICK, 2001; LOBO & LOURENO,
2007). A Figura 7 mostra resumidamente a rota biossinttica dos diterpenos.
COOH
34
Figura 6. Estrutura do cido labda-8-eno-15-ico
41
Figura 7. Rota biossinttica dos diterpenos (FONTE: modificado de LOBO & LOURENO, 2007)
diterpenos tricclicos
diterpenos tetracclicos
diterpenos acclicos
diterpenos bicclicos
diterpenos macrocclicos
OPP
geranil pirofosfato
Via do mevalonato Via do fosfato deoxixilulose
OPP
HSHR
IPP
OPP
DMAPP
IPP
IPP
OPP
farnesil pirofosfato (FPP)
OPP
geranilgeranil pirofosfato (GGPP)
42
Diferentes esqueletos de diterpenos so formados a partir do GGPP: diterpenos
acclicos, bicclicos, tricclicos, tetracclicos e macrocclicos. De modo geral, o GGPP pode se
ciclizar de duas maneiras, para formar os diterpenos bicclicos (e a partir desses os tri- e
tetracclicos) e os macrocclicos (HANSON, 1991).
2.3.1. ATIVIDADES BIOLGICAS DE DITERPENOS
O principal interesse no isolamento de molculas de diterpenos est relacionado sua
ampla rea de atividades biolgicas. Os estudos com essa classe devem-se principalmente ao
diterpeno da classe dos taxanos, taxol (Paclitaxel) (35) que possui atividade antitumoral
comprovada e atualmente utilizado no tratamento do cncer de mama e ovrio (CORRA,
1995; KINGSTON, 2007).
Hanson (1998 e 2000) listou, em dois artigos, cerca de 300 diferentes diterpenos dos
mais variados esqueletos isolados a partir de propriedades relatadas pela medicina popular.
Para os diterpenos labdnicos so descritas diversas atividades biolgicas, tais como:
antibacteriana, antifngica, anti-inflamatria, cardiotnica, antileishmania e citotxica
(SINGH et al., 1999). Dimas e colaboradores (1998) relataram a atividade citotxica in vitro
do diterpeno labda-13(E)-eno-8-15-diol (38) contra 13 linhagens de clulas leucmicas
humanas.
Vrios diterpenos labdnicos e clerodnicos so indicados como sendo os compostos
responsveis pela atividade biolgica de seus extratos brutos. Por exemplo, o diterpeno
clerodnico trans-desidrocrotonina (36), substncia majoritria das cascas do caule de Croton
cajucara, responsvel por grande parte das propriedades teraputicas dessa planta, tais
como: ao antiinflamatria, antinociceptiva, efeito hipoglicemiante, atividade
antiespasmdica e atividade antiulcerognica (MACIEL et al., 2002). Outro exemplo o leo
43
de copaba, que constitudo por uma mistura de sesqui- e diterpenos e nenhuma outra classe
de substncias. Esses leos so amplamente utilizados na medicina popular e possuem
diversas atividades biolgicas comprovadas, tais como: atividade antiinflamatria,
antitumoral, analgsica, antineoplsica, tripanossomicida e entre outras. Dentre os
constituintes diterpnicos dos leos de copaba, encontra-se: covalenol, cido coplico, cido
hardwkiico e o cido caurenico (VEIGA-JUNIOR. & PINTO, 2002).
Os diterpenos clerodnicos tambm so conhecidos por inibirem crescimento fngico
(CAVIN et al., 2006). Por exemplo, os cidos covalnico (37) e o 2-oxo-covalnico (20), o
ltimo j isolado de Eperua, apresentam atividade antifngica contra Phomopsis viticola e
Botrytis cinerea (SALAH et al., 2003).
Figura 8. Diterpenos com atividades biolgicas
O
NH
O
O
O
O
O
OH
O
O OOH
H
OH OO
35 36
O
O
H
H
OO
CH2OH
OH
38
COOH
H
37
44
2.4. FLAVONIDES
Flavonides so metablitos secundrios caracterizados pela presena de 15 tomos
de carbono em seu esqueleto bsico (ncleo flavona) arranjados em trs anis (C6-C3-C6),
designado como A, B e C, como mostrado na Figura 9 (PIETTA, 2000; ZUANAZZI &
MONTANHA, 2007).
As diversas classes de flavonides diferem no nvel de oxidao e padro de
substituio do anel C, enquanto compostos individuais dentro de uma classe diferem no
padro de substituio dos anis A e B. As estruturas das principais classes de flavonides
esto mostradas na Figura 10.
Flavonides desempenham diferentes funes nas plantas, como: proteo contra a
radiao ultravioleta, patgenos e herbvoros, atrao de animais com finalidade de
polinizao, controle da ao de hormnios vegetais e agentes alelopticos (HEIM et al.,
2002; ZUANAZZI & MONTANHA, 2007). Tambm so importantes para a sade humana
devido sua elevada atividade farmacolgica como seqestradores de radicais livres, sendo
relacionados preveno de doenas humanas tais como cncer e doenas cardiovasculares e
algumas patologias de lceras gstricas e duodenais, alergias, doenas vasculares, infeces
virais e bacterianas (YAO et al., 2004).
O
A C
B1
2
3
45
6
7
8
2'
3'
4'
5'
6'
1'9
10
Figura 9. Estrutura bsica dos flavonides: ncleo flavona
45
2.4.1. BIOSSNTESE DOS FLAVONIDES
Os flavonides so compostos de biossntese mista, trs unidades de acetato do
origem ao anel A, enquanto que os trs tomos de carbono que interligam os anis,
juntamente com o anel B, derivam da rota do chiquimato. Durante a biossntese dos
flavonides, o primeiro a ser formado a chalcona e os outros so seus derivados (PIETTA,
2000; LOBO & LOURENO, 2007; DEWICK, 2001). A Figura 10 mostra resumidamente a
biossntese de alguns flavonides, incluindo chalconas, flavanonas, flavonas, isoflavonas,
flavononol e flavonol.
Figura 10. Rota biossinttica dos flavonides- incluindo chalconas, flavanonas, flavonas, isoflavonas, flavanonol e flavonol (FONTE: modificado de DEWICK, 2001)
O
OH
HO
OH O
flavona
O
OH
HO
OH O
flavanona
O
OH
HO
OH O
OH
flavanonol
O
OH
HO
OH O
OH
flavonol isoflavonas
OHO
OH OOH
Acetil-CoA
cido chiqumico
OH
CoAS
O 4-hidrxicinamoil-CoA
Carboidratos
Malonil-CoA
3X SCoA
CO2H
O
SCoA
OH
OO
O
O
OH
OH
HO
OH O
chalcona
Claisen (chalcona sintase)
46
2.5. CONSIDERAES GERAIS SOBRE AS ATIVIDADES QUMI CAS
E BIOLGICAS ESTUDADAS
2.5.1. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Atualmente existe um grande interesse nos estudos dos antioxidantes devido,
principalmente, s descobertas sobre o efeito dos radicais livres (RL) no organismo. Os RL
so espcies qumicas (tomos, molculas orgnica ou inorgnica) que possuem um ou mais
eltrons desemparelhados. Quando o eltron desemparelhado encontra-se localizado nos
tomos de oxignio ou nitrognio so denominados Espcies Reativas de Oxignio (ERO) ou
Espcies Reativas de Nitrognio (ERN), respectivamente. As principais ERO distribuem-se
em dois grupos, os radicalares: hidroxila (HO), superxido (O2_), peroxila (ROO), alcoxila
(RO); e os no-radicalares: oxignio, perxido de oxignio, cido hipocloroso. Dentre as
ERN incluem-se o xido ntrico (NO), xido nitroso (N2O3), cido nitroso (HNO2) e
peroxinitritos (ONOO-) (BARREIROS et al., 2006).
Espcies reativas so formadas continuamente durante os processos metablicos-
normais ou patognicos- ou so provenientes de fontes exgenas. Porm, quando a
concentrao excede ao normal ocorre o chamado estresse oxidativo, ento esse excesso de
espcies reativas produz danos oxidativos s biomolculas, como por exemplo, peroxidao
dos lipdios das membranas celulares, agresses s protenas dos tecidos e membranas,
enzimas e DNA (OLIVEIRA et al., 2009; BIANCHI & ANTUNES, 1999). Desta forma, os
RL esto relacionados ao envelhecimento e ao desenvolvimento de diversas patologias, tais
como: cncer, doenas cardacas, stress, doenas neurodegenerativas e inflamatrias (CHOI et
al., 2002; LUXIMON-RAMMA et al., 2002; SOLER-RIVAS et al., 2000).
47
Os RLs so controlados pelas substncias antioxidantes que podem ser de origens
endgenas ou exgenas. Porm, os componentes celulares no so totalmente protegidos
pelos antioxidantes endgenos, por isso os antioxidantes obtidos da dieta alimentar so
indispensveis contra as oxidaes (CERQUEIRA et al., 2007 )
As substncias antioxidantes so capazes de retardar ou inibir a oxidao de um
substrato bloqueando a formao dos radicais livres ou interagindo com estes, inativando-os
(SOUSA et al., 2007). Neste contexto, os antioxidantes de origem natural merecem ateno
especial, pois as plantas sintetizam um grande nmero de metablitos capazes de captar os
radicais livres, tais como: vitaminas, carotenides, cidos fenlicos, flavonides, antocianinas,
catequinas e procianidinas (LARSON, 1988).
As principais substncias naturais com atividade antioxidantes so os compostos
polifenlicos, devido ao poder redutor do grupo hidroxila aromtico, que reduz radicais livres
reativos e produz o radical fenoxila estabilizado por ressonncia (CERQUEIRA et al., 2007).
2.5.1.1. FLAVONIDES COMO ANTIOXIDANTES
Segundo Barreiros e colaboradores (2006), a atividade antioxidante dos flavonides
depende da sua estrutura e pode ser determinada por cinco fatores: (1) reatividade como
agente doador de H e eltrons, (2) estabilidade do radical flavonoil formado, (3) reatividade
frente a outros antioxidantes, (4) capacidade de quelar metais de transio e (5) solubilidade e
interao com as membranas.
Entre os principais aspectos responsveis pela capacidade antioxidantes podemos
citar: presena de hidroxila na posio C-7 no anel A e C-3 no heterocclico, hidroxilas na
posio orto (especialmente na posio 3,4-diidroxi- sistema catecol); ligao dupla 2,3
conjugada com o grupo 4-oxo no anel C; conjugao da carbonila em C4 com hidroxilas em
48
C5 do anel A e C3 do anel C; estabilidade do radical flavanoil formado; solubilidade e
interao com as membranas (BARREIROS et al., 2006; PIETTA, 2000; WILLIAMS et al.,
2004). Os principais aspectos esto mostrados na Figura 11.
Em geral, quanto maior o nmero de hidroxilas, maior a atividade como agente doador
de H e de eltrons. A doao do H ocorre principalmente nas posies 7, 4 e 5, sendo maior
na posio 7 e menor na posio 5. Foi constatado a necessidade de no mnimo 2 hidroxilas
fenlicas, preferivelmente orto difenlicas como a apresentada pelo sistema catecol (3,4-
diidroxi).
A estabilidade do radical flavonoil formado depende da habilidade do flavonide em
deslocalizar o eltron desemparelhado. Os radicais aroxil formados podem ter seu eltron
deslocalizado pela estrutura com maior estabilidade devido estabilizao resultante das
ligaes de H (Figura 12).
Figura 11. Estrutura da quercetina. Principais aspectos responsveis pela atividade antioxidantes dos flavonides (FONTE: modificado de WILLIAMS et al., 2004).
O
OH
OH
OH
OOH
HO7
5
2
3
4
3'
4'
49
Para a quelao de metais de transio fundamental a presena de grupos orto-
fenlicos e /ou estruturas cetol como 4-ceto-3-hidroxi e 4-ceto-5-hidroxi (Figura 13).
HO Men+
OH
Men+
OHO
O
OH
Men+
3
45
3'
4'
Figura 13. Estrutura da quercetina. Atribuio dos principais pontos responsveis pela atividade antioxidantes dos flavonides (FONTE: PIETTA, 2000).
Figura 12. Mecanismo da estabilizao eltron desemparelhado (FONTE: BARREIROS et al., 2006)
O H
O
O
H
OO
O
O
H
O H
O