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Universidade Federal de Uberlndia
Instituto de Qumica
Ps-Graduao em Qumica
Desenvolvimento de sensor bioeletroqumico para deteco da hansenase
Mestrando: Andr Santiago Afonso
Orientadora: Profa. Dra. Ana Graci Brito-Madurro
Co-orientador: Prof. Dr. Joo Marcos Madurro
Uberlndia
Fevereiro de 2008
ii
Andr Santiago Afonso
Desenvolvimento de sensor bioeletroqumico para deteco da hansenase.
Dissertao de mestrado apresentado ao programa de Ps-Graduao em Qumica da Universidade Federal de Uberlndia, como requisito parcial para a obteno do ttulo de mestre em Qumica. rea de concentrao: Qumica Orientador. Ana Graci Brito-Madurro.
Uberlndia MG 2008
iii
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) A257d
Afonso, Andr Santiago, 1981- Desenvolvimento de sensor bioletroqumico para deteco da hansenase / Andr Santiago Afonso. - 2008.
103 f. : il.
Orientador: Ana Graci Brito-Madurro. Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Uberlndia,Programa de Ps-Graduao em Qumica.
Inclui bibliografia.
1. Qumica - Teses. 2. Biossensores - Teses. I. Brito-Madurro, Ana Graci. II. Universidade Federal de Uberlndia. Programa de Ps-Graduao em Qumica. III. Ttulo.
CDU: 54 Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogao e Classificao
iv
v
queles que me deram a vida. Joaquim e Sonia.
vi
Agradecimentos
Por mais uma etapa de um sonho concludo, quero agradecer ao meu Deus pela beno,
pelo nimo de todas as manhs, por me fazer acreditar que eu posso chegar no meu
desejado sonho. Pela vida maravilhosa e por me dar uma famlia que sempre me apoiou, me
dando amor, carinho, coragem e valores incontestveis.
Agradecer ao meu pai, Joaquim, smbolo de dedicao e perseverana, por proporcionar
esse sonho realidade, sem ele no poderia ter dedicado todo o meu tempo exclusivamente a
esse trabalho. minha me, Sonia, por ser mezona, e de sua natureza evocar aquilo que
tem de mais mgico, o amor.
minha irm, Andra, sempre esteve disposta em ouvir, as alegrias, conquistas,
desejos, sonhos, dificuldades, tristezas e magoas. Vocs ajudaram a construir este valoroso
trabalho.
Parceria, companheirismo e pacincia. Voc me ensinou no s o amor. Deyse
obrigado.
Agradeo aos professores Ana Graci Brito-Madurro e Joo Marcos Madurro, que
confiaram no meu trabalho, e pelo crescimento profissonal.
A CAPES, FAPEMIG e CNPq por financiarem este trabalho.
Enfim, a todos do laboratrio de filmes polimricos e aqueles que contriburam de
alguma forma para a realizao desse trabalho. Muito Obrigado.
vii
Para ser grande, s inteiro...nada de ti aumento ou exclua. S todo em cada coisa...pe o mximo que s, no mnimo que fazes. Assim, a lua inteira em cada lago brilha porque alta vive
Fernando Pessoa.
viii
Lista de abreviaturas e siglas:
4-AF: 4-aminofenol
A: adenina
A: ampre
AM: azul de metileno
ATP: adenosina trifosfato
BL: dimorfa virchowiana
BN: bases nitrogenadas
BT: dimorfa tuberculide
C: citosina
C: coulombs
DNA: cido desoxirribonuclico
dNTPs: deoxinucleotdeos trifosfatos
E: emeraldina
Ea: potencial andico
Ec: potencial catdico
ECS: eletrodo de calomelano saturado
EDTA: cido etilenodiamino tetra-actico
ELISA: enzimaimunoensaio
f: frequncia
FTIR: infravermelho transformada de Fourier
G: guanina
GTP: guanosina trifosfato
HT: hansenase tuberculide.
HV: hansenase virchowiana.
ia: corrente andica
LB: azul de leucometileno
LE: leucoemeraldina
LL: polar lepromatus
MB: multibacilar
ix
MFA: microscopia de fora atmica
OMS: Organizao Mundial da Sade
p(4AF): poli 4-aminofenol
PB: paucibacilar
pb: pares de bases
PCR: Reao em cadeia da polimerase
pH: potencial hidrognio inico
PN: pernigranilina
Q: capacitncia
R: resistncia
RLEP3: Fragmentos lepra especficos - Seqncia repetitiva do genoma.
dsDNA: double strand DNA (dupla fita DNA)
ssDNA: single strand DNA (simples fita DNA)
SSC: tampo citrato de sdio
T: timina
TE: tris edta
TT: polar tuberculide
V: volts
VC: voltametria cclica
VPD: voltametria de pulso diferencial
W: linhas de Warburg
WHO: world Health Organization
YSI: Yellow Spring Instruments
Z: resistncia
Z: reatncia
x
Sumrio: Introduo..........................................................................................................................1
Hansenase .........................................................................................................................2
Biossensores ....................................................................................................................10
Aspectos Gerais .........................................................................................................10
Biossensor de DNA ...................................................................................................14
Filmes polimricos aplicados a biossensores ..................................................................18
Filmes condutores e no condutores..........................................................................20
Filmes formados com 4-aminofenol (4-AF)..............................................................23
Tcnicas eletroqumicas ..................................................................................................25
Voltametria cclica e pulso diferencial .....................................................................25
Espectroscopia de Impedncia Eletroqumica...........................................................25
Microbalana de Cristal de Quartzo ..........................................................................26
Objetivos..........................................................................................................................27
Objetivo geral ............................................................................................................27
Objetivos especficos.................................................................................................27
Parte experimental ...........................................................................................................27
Metodologia.....................................................................................................................31
Pr-tratamento dos eletrodos .....................................................................................31
Prepara das solues utilizadas..................................................................................31
Voltametria cclica e Voltametria de pulso diferencial .............................................32
Microbalana eletroqumica de cristal de quartzo (MECQ)......................................33
Determinao da massa depositada de poli(4-aminofenol).......................................33
Estabilidade trmica do poli(4-aminofenol) ..............................................................34
Espectroscopia de infravermelho...............................................................................34
Espectroscopia de impedncia eletroqumica............................................................35
Microscopia de fora atmica ...................................................................................35
Dosagem do DNA .....................................................................................................35
Anlise molecular de gene especfico para hansenase .............................................35
Imobilizao e deteco de bases nitrogenadas.........................................................36
xi
Imobilizao e deteco de RLEP3...........................................................................37
Imobilizao da simples fita do DNA .................................................................37
Hibridizao do alvo complementar e no complementar do DNA....................37
Tempo de vida do biossensor ....................................................................................38
Resumo do procedimento utilizado na construo do biossensor .............................39
Resultados e discusso ....................................................................................................40
Estudos de formao de poli(4-aminofenol) .............................................................40
Determinao da massa de poli(4-aminofenol) .........................................................44
Determinao da massa do poli(4aminofenol) utilizando MECQ ............................44
Estabilidade trmica de poli(4-aminofenol) ..............................................................47
Estudos de espectroscopia de infravermelho do poli(4-aminofenol) ........................49
Imobilizao e deteco de bases nitrogenadas.........................................................51
Imobilizao e deteco de produtos de PCR ...........................................................54
Espectroscopia de impedncia eletroqumica............................................................57
Anlises de microscopia de fora atmica ................................................................60
Deteco de produtos de PCR utilizando-se indicadores ..........................................61
Deteco de produtos de PCR utilizando ferrocenocarboxaldedo ...........................61
Deteteo de produtos de PCR utilizando-se azul de metileno como indicador .......66
Tempo de vida do biossensor ....................................................................................70
Concluses.......................................................................................................................71
Referncias Bibliogrficas...............................................................................................73
xii
Listas de Figuras:
Figura 1. Mortalidade proporcional por causas definidas, segundo as regies . ..............2
Figura 2. Aparncia de uma pessoa com hansenase........................................................3
Figura 3. Classificao Ridley e Jopling baseada na resposta imunolgica do hospedeiro.
TT polar tuberculide, BT: dimorfa tuberculode, BB: dimorfa ou borderline, BL: dimorfa
virchowiana, LL: polar lepromatus ou virchowiana ........................................................5
Figura 4. Nmero de casos detectados mundialmente referentes ao perodo de 2001 a
2006... ................................................................................................................................7
Figura 5. Taxa de prevalncia no Brasil, referente ao ano de 2004 .................................9
Figura 6. Esquema das geraes dos biossensores. 1: primeira gerao; 2: segunda gerao
e 3: terceira gerao. M: mediador reduzido. M: mediador oxidado. ............................11
Figura 7. Configurao de um glicosmetro da YSI.......................................................12
Figura 8. Terceira gerao de biossensores....................................................................14
Figura 9: Deteco especifica de uma seqncia de DNA usando um biossensor. .......15
Figura 10. Biossensor eletroqumico de DNA baseado na reao redox entre Co(bpy)33+ e
resduos de guanina. ........................................................................................................16
Figura 11. Diferena entre intervalos de bandas ............................................................21
xiii
Figura 12. Estruturas do processo de oxidao eletroqumico e processo qumico do 4-AF.
.........................................................................................................................................24
Figura 13. Proposta para acoplamento 1-4 via nitrognio..............................................24
Figura 14. Materiais utilizados para estudos eletroqumicos A: eletrodo de grafite e barra de
grafite B: cela de trs compartimentos com respectivos eletrodos de trabalho, auxiliar e
referncia.. .......................................................................................................................29
Figura 15. Equipamentos utilizados para os experimentos eletroqumicos e para limpeza
dos eletrodos. ..................................................................................................................29
Figura 16. Equipamentos utilizados para os experimentos de infravermelho e para anlise
morfolgica dos eletrodos modificados...........................................................................31
Figura 17. Voltamograma cclico de um eletrodo de carbono grafite em soluo contendo
5x10-3 mol.L-1 de K3Fe(CN)6, 5x10-3 mol.L-1 de K4Fe(CN)6 e 0,1 mol.L-1 KNO3, 100mV.s-
1........................................................................................................................................40
Figura 18. (A) Eletropolimerizao de 4-aminofenol 2,5 x 10-3 em HCLO4 0,5 mol.L-1
sobre eletrodo de grafite...................................................................................................41
Figura 19. Voltamograma cclico de eletrodo de carbono grafite em soluo contendo
5x10-3 mol.L-1 de K3Fe(CN)6, 5x10-3 mol.L-1 de K4Fe(CN)6 e 0,1 mol.L-1 KNO3 .........42
Figura 20. Voltamograma cclico de eletrodo de carbono grafite sem filme e modificado
com poli(4-aminofenol), 100 varreduras em soluo aquosa de HClO4 0,5 mol/L-1, 50mV.s-
1. ...................................................................................................................................43
Figura 21. Diferentes estados redox para poli(metilanilina) (LE) Leucomeraldina, (E)
emeraldina e (PN) pernigranilina ....................................................................................43
xiv
Figura 22: (A) perfil i/E para 10 ciclos da eletropolimerizao de 2,5mmol.L-1 de 4-
aminofenol em 0,2 mol.L-1 de H2SO4, 50mV/s. (B) perfil dm/E para 10 ciclos da
eletropolimerizao de 2,5mM de 4-aminofenol em 0,2 mol.L-1 de H2SO4 ...................45
Figura 23: Plot da massa versus o nmero de ciclos no fim de cada ciclo. ...................46
Figura 24. Voltamogramas cclicos dos eletrodos de grafite modificados com poli(4-
aminofenol) (A) submetido temperatura de 98C (B) apenas ciclagens de potencial em
HClO4 0,5 mol.L-1 a temperatura ambiente................................................................................. 47
Figura 25. Valores de carga dos picos de oxidao nos voltamogramas cclicos do filme
com ou sem tratamento trmico em soluo de HCLO4 .................................................48
Figura 26. Espectro de infra-vermelho do (A) poli(4-aminofenol) preparado em soluo de
HClO4, pH 0,5 e (B) 4-aminofenol. ................................................................................50
Figura 27. Voltamogramas de pulso diferencial de eletrodos de grafite modificados com
poli(4-aminofenol), 100 varreduras, com as bases nitrogenadas isoladas. Guanina (G),
adenina (A), timina (T) e citosina (C) em tampo fosfato, pH 7,4 (A) ou tampo acetato pH
4,5 (B), incremento de 0,01mV, perdo do pulso 0.2s, velocidade de varredura 5mVs-1. As
setas indicam presena de dmeros ou impurezas. ..........................................................52
Figura 28. Bases purnicas (A) guanina e (B) adenina. O crculo representa regio de
menor potencial de oxidao ...........................................................................................53
Figura 29. Voltamogramas de pulso diferencial para a oxidao da mistura de guanina (G),
adenina (A), timina (T) e citosina (C) em tampo fosfato, pH 7,4, (A) e acetato pH 4,5 (B).
.........................................................................................................................................53
xv
Figura 30. Voltametria de pulso diferencial de eletrodo de grafite modificado com poli(4-
aminofenol) contendo dsDNA, 78pb em: (A) tampo fosfato, pH 7,4 ou (B) tampo acetato,
pH 4,5. .............................................................................................................................55
Figura 31. Mecanismo de oxidao das bases purnicas ................................................56
Figura 32. Pareamento Watson-Crick de bases e os respectivos pontos de oxidao e
reduo. ...........................................................................................................................57
Figura 33. Diagramas de Nyquist (A) ou admitncia (B) para eletrodo de grafite
modificado 5x10-3 mol.L-1 de K3Fe(CN)6 e 5x10-3 mol.L-1/K4Fe(CN)6 em 0,1 mol.L-1 KNO3
com: () poli(4-aminofenol), () poli(4-aminofenol) contendo ssDNA, () poli(4-
aminofenol) contendo dsDNA.........................................................................................58
Figura 34: Circuito equivalente. Rs: resitncia da soluo, Rtc: resistncia a transferncia
de Carga, Rf: resistncia do filme, Qdc: capacitncia da dupla camada eletretrica, Qf:
capacitncia do filme: ZW1: resitencia ao transporte de ons da duplca camada eltrica: ZW2:
resistncia ao transporte de ons dentro do filme. ...........................................................58
Figura 35. Imagens de MFA de eletrodos de grafite modificados com poli(4-aminofenol)
sem DNA: (a) e (b), ou contendo DNA: antes da hibridao, ssDNA (c), aps a hibridao
com o alvo complementar, dsDNA (d)............................................................................60
Figura 36. Representao das interaes inicas entre o polmero e a molcula de DNA,
R1 = guanina, adenina, timina ou citosina, R2 = ribose, R3 = grupo fosfato. ..................62
Figura 37. Voltametria linear para eletrodo de grafite modificado com poli(4-aminofenol)
contendo 3,93 x 10-8 mol.L-1ssDNA (a) e aps hibridao com o alvo complementar,
dsDNA (b) de ferrocenocarboxaldedo 6,5 x 10-4 molL-1 em tampo fostato pH 7,4 0,1
mol/L. 10 mVs-1. .............................................................................................................63
xvi
Figura 38. Representao entre ligaes de hidrognio entre ferrocenocarboxaldedo e
ssDNA. ............................................................................................................................64
Figura 39. Tempo de hibridizao do biossensor com o alvo complementar a 42C. A
anlise foi feita por voltametria cclica, 10mVs-1, monitorando-se o pico de oxidao do
650 mol.L-1 de ferrocenocarboxaldedo. .......................................................................65
Figura 40. Resposta de corrente em funo de diferentes concentraes do alvo
complementar (3,93 x 10-8; 3,93 x 10-9; 3,93 x 10-10; 3,93 x 10-11 mol.L-1) monitorando-se
o pico de oxidao do ferrocenocarboxaldedo. A concentrao da sonda imobilizada na
superfcie do biossensor foi 3,93 x 10-8 mol.L-1. .............................................................65
Figura 41. Deteco com azul de metileno 6,5 x 10-4 molL-1. (A) voltametria cclica. (B)
voltametria de pulso diferencial. Sonda imobilizada (ss DNA) 3,93 x 10-8 mol.L-1; alvo
complementar (sd DNA) 3,93 x 10-8 mol.L-1 em tampo fostato pH 7,4 0,1 mol/L. Tempo
de hibridizao 15 minutos. Vc 10 mVs-1 e VPD 5mV.s-1..............................................66
Figura 42. Esquema de reduo do azul de metileno em azul de leucometileno em
substratos slidos.............................................................................................................67
Figura 43. Voltamograma de pulso diferencial de azul de metileno como indicador redox
em tampo fosfato, pH 7,4, em eletrodo de grafite modificado com poli(4-aminofenol).
hibridizado com diferentes concentraes do alvo complementar: (a) 3,93 x 10-8 mol.L-1,
(b) 3,93 x 10-9 mol.L-1, (c) 3,93 x 10-10 mol.L-1, (d) 3,93 x 10-11 mol.L-1 (e) 3,93 x 10-12
mol.L-1 ou (f) no hibridizado (ssDNA 3,93 x 10-8 mol.L-1)...........................................68
Figura 44. Porcentagem de corrente em relao a simples fita em funo de diferentes
concentraes do alvo complementar (3,93 x 10-8, 3,93 x 10-9, 3,93 x 10-10, 3,93 x 10-11
mol.L-1, 3,93 x 10-12 mol.L-1) monitorando-se o pico de oxidao do azul de metileno. 69
xvii
Figura 45. Voltamograma de pulso diferencial de azul de metileno como indicador redox
em tampo fosfato, pH 7,4 em eletrodo de grafite modificado com poli(4-aminofenol) antes
da hibridao (A), aps a hibridao com: alvo no complementar (B) ou alvo
complementar (C). 5mVs-1, 0,01mV, 0,2ms. ..................................................................70
Figura 46. Resposta de corrente em funo do tempo monitorando-se o pico de oxidao
do azul de metileno. As concentraes utilizadas para o indicador, ssDNA imobilizado
sobre a superfcie do eletrodo e analito alvo foram 6,5 x 10-4 molL-1, 3,93 x 10-8 mol.L-1 e
3,93 x 10-8 mol.L-1, respectivamente................................................................................71
.
xviii
Lista de Tabelas: Tabela 1. Diagnstico da hansenase. BT: dimorfa tuberculode; BL: dimorfa virchowiana;
PB: paucibacilar; MB: multibacilar.................................................................................. 4
Tabela 2. Taxas de prevalncia e deteco nos quatro pases mais endmicos do planeta.
...........................................................................................................................................8
Tabela 3. Procedimento para imobilizao de biomolculas. Processos qumicos e fsicos.
.........................................................................................................................................13
Tabela 4. Valores de massa do polmero, carga e rendimento eletroqumico para 4-
aminofenol sobre a superfcie de grafite..........................................................................44
Tabela 5. Valores de potencial e corrente das respectivas bases nitrogenadas isoladas.52
Tabela 6. Valores de potencial e corrente de oxidao de uma mistura das bases
nitrogenadas imobilizadas sobre eletrodos de grafite modificados com poli(4-aminofenol).
.........................................................................................................................................54
Tabela 7: Parmetros obtidos do circuito equivalente ajustado ao diagramas de Nyquist.
.........................................................................................................................................59
xix
Resumo: A hansenase uma doena crnica granulomatosa e dermatolgica, proveniente
de infeco causada pelo bacilo Mycobacterium leprae. objeto de interveno do estado,
pois quando no tratada causa incapacidade na populao economicamente ativa. O Brasil
continua sendo um dos quatro pases endmicos responsveis por 34% de todos os casos
registrados no incio de 2007. O diagnstico da doena s pode ser feito depois do
aparecimento dos sintomas da doena. Medidas profilticas so possveis quando se
utilizam tcnicas como ELISA e PCR, que podem ser realizados apenas em laboratrios
especializados, no atendendo as necessidades dos pases endmicos. Tais problemas
podem ser contornados utilizando ferramentas de baixo custo, simples manuseio e sensveis
como biossensores. Neste trabalho, a matriz de poli(4-aminofenol) foi utilizada para
imobilizao e deteco de produto de PCR especfico para bacilo de Hansen. A
modificao da superfcie com o filme foi confirmada observando as diferenas
eletroqumicas do eletrodo sem modificao frente ao par redox Fe2+/Fe3+ e eletrlito
suporte. A caracterizao da matriz polimrica foi conduzida por meio de FTIR,
espectroscopia de impedncia eletroqumica, microbalana eletroqumica de cristal de
quartzo e estudos de estabilidade trmica. Dados de FTIR indicam possvel polimerizao
via ligaes C-N-C. A estabilidade do filme a 98C foi avaliada e o mesmo manteve 60%
de suas propriedades eletroativas aps vinte minutos de tratamento trmico, sendo,
portanto, adequado para a metodologia utilizada, neste trabalho, para imobilizao de
biomolculas. A deteco de bases nitrogenadas sobre a nova matriz foi possvel em
valores de pH 4,5 e 7,4. O eletrlito, tampo fosfato em pH 7,4 foi o mais adequado para
deteco das bases nitrogenadas e por sua vez, para produtos de PCR. Este eletrlito foi
utilizado para imobilizao do produto de PCR desnaturado (RLEP3) contendo 78pb e
especfico para o bacilo de Hansen. A imobilizao deste fragmento de DNA foi
confirmada monitorando os picos de oxidao da guanosina monofosfato e adenosina
monofosfato e tambm por meio de estudos de espectroscopia de impedncia
eletroqumica. Indicadores de hibridizao, ferrocenocarboxaldedo e azul de metileno,
foram utilizados para diferenciar alvos complementares ou no complementares. Com a
ocorrncia da hibridao, foi observada reduo nos valores de sinal de corrente, para
ambos indicadores, monitorando-se o sinal do indicador. O menor limite de deteco, 10-10
mol.L-1, do alvo complementar, foi atingido utilizando azul de metileno como indicador.
xx
Quando a sonda foi submetida ao alvo no complementar, no foi observada mudana nos
valores de corrente da sonda imobilizada. Aps trinta dias de preparao, o biossensor
manteve 60% de suas propriedades eletroqumicas Estes estudos demonstraram a
viabilidade de construo de um biossensor eletroqumico utilizando indicadores
eletroativos de baixo custo, que pode ser usado em amostras reais com DNA do bacilo de
Hansen.
Pela primeira vez, foi demonstrada a produo de eletrodos modificados com poli(4-
aminofenol) como matriz para imobilizao e deteco de produto de PCR especfico para
deteco da hansenase.
xxi
Abstract: Leprosy is a chronic, granulomatous and dermatological disease, from infection
caused by the bacillus Mycobacterium leprae. It is object of intervention of the state,
because when untreated cause disability in the economically active population. Brazil
remains one of the four endemic countries responsible for 34% of all cases registered at the
beginning of 2007. The disease diagnosis can only be done after the onset of disease
symptoms. Prophylactic measures are possible when using techniques such as ELISA and
PCR, which can be performed only in specialized laboratories, not considering the needs of
the endemic countries. Such problems can be circumvented by using tools of low cost,
simple and sensitive handling as biosensors.
In this work, poly(4-aminophenol) matrix, was used for immobilization and detection of
specific PCR product for Hansen bacillus. The surface modification with the film was
confirmed observing the electrochemical differences of the electrode without modification
front at redox pair Fe2+/Fe3+ and supported electrolyte. The characterization of the
polymeric matrix was carried out by FTIR, electrochemical impedance spectroscopy,
electrochemical quartz crystal microbalance and studies of thermal stability. The FTIR data
indicate polymerization possible by C-N-C bonds. The stability of the film at 98 C was
measured and even showed 60% of its electroative properties after twenty minutes of heat
treatment. being, therefore, adequate for the used methodology, in this work, for
biomolecules immobilization. The detection of nitrogenated bases on the new matrix was
possible in pH 4.5 and 7.4.
The eletrolite, phosphate buffer in pH 7.4, was the most adequate to nitrogenated bases
detection and in turn, for PCR products. This electrolyte was used for immobilization of the
denaturated PCR product (RLEP3), contained 78pb, and specific for the Hansen bacillus.
The DNA fragment immobilization was confirmed monitoring the oxidation peaks of
guanosine monophosphate and adenosine monophosphate and also by means of
electrochemical impedance spectroscopy studies. Hybridization indicator,
ferrocenecarboxyaldehyde and methylene blue, had been used to differentiate
complementary or not complementary target. With the hibridization occurrence, a reduction
in the current signal values was observed, for both indicators, monitoring the indicator. The
small detection limit, 10-10 mol.L-1, of the complementary target, was reached using
methylene blue as indicator.
xxii
When the probe was submitted to not complementary target, it was not observed change in
the current values of immobilized probe. At the end of thirty days the biosensor kept 60%
of their electrochemical properties These studies demonstrated the viability of constructing
of an electrochemical biosensor using eletroactive indicators of low-cost, which can be
used in real samples with the DNA of Hansen bacillus.
For the first time, in the open literature, it was demonstred the modified electrodes
production with poly(4-aminophenol) as matrix to immobilization and detection of specific
PCRproduct to leprosy detection.
1
1. Introduo
Doenas infecciosas e parasitrias contribuem para o aumento da morbidade humana e
so responsveis por uma grande proporo de mortes do planeta, sobretudo nos pases
menos desenvolvidos (SAKER et al., 2004).
Nas ltimas dcadas, o perfil de mortalidade da populao brasileira foi
substancialmente alterado, sendo um trao marcante do declnio no peso relativo das
doenas infecciosas e parasitrias, as quais foram responsveis por quase metade de todos
os bitos ocorridos nas capitais dos estados brasileiros, na primeira metade do sculo XX.
As doenas infecciosas determinaram 35,9% do total de mortes em 1950, 25,9% em 1960,
15,7% em 1970, 11,4% em 1981 e apenas 6,0% em 1989 (WALDMAN et al., 1999).
Apesar dessa evoluo favorvel, o Brasil ainda apresentou, na segunda metade da
dcada de 80, coeficiente de mortalidade por doenas infecciosas e parasitrias em torno de
33,0 por 100.000 habitantes, prximo das taxas encontradas na Colmbia e Suriname. Estas
taxas esto acima das verificadas em pases como o Chile (19,2/100.000 habitantes), Costa
Rica (11,8/100.000 habitantes) e Cuba (9,1/100.000 habitantes) (WALDMAN et al., 1999).
Nos ltimos vinte anos do sculo XX, as doenas infecciosas e parasitrias ressurgiram
no Brasil, anteriormente controladas ou extintas, devido ao aumento da pobreza, falta de
higiene e m alimentao da populao, ocupando um papel relevante entre as causas de
morte e favorecendo o estabelecimento de um novo quadro de morbimortalidade no pas
(CAMPELO et al., 2005). Segundo o Ministrio da sade, 46.067 pessoas chegaram ao
bito por doenas infecciosas e parasitrias em 2004, o que equivale a 5,3% do total das
mortes no pas. Na regio sudeste o percentual chega a 5% das mortes registradas (SADE
BRASIL, 2006). Estes dados esto representados na figura 1.
2
Figura 1. Mortalidade proporcional por causas definidas, segundo as regies Brasil 2004.
Doenas infecciosas e parasitrias tais como hansenase, chagas, dengue, tuberculose,
leishmaniose e outras, tm expressivo impacto social, j que esto diretamente associados
pobreza e qualidade de vida (PAES et al., 1999) e so agravadas por polticas que
resultam em desemprego, baixos salrios, pssimas condies alimentares e de moradia
(DORNELES, 2005).
1.1. Hansenase
A hansenase uma doena crnica granulomatosa proveniente de infeco causada
pelo bacilo Mycobacterium leprae (WARWICK and DIANA, 2004), figura 2. uma das
mais antigas doenas que acometem o homem, sendo que as referncias mais remotas
datam de 600 a.C., procedentes da ndia, que juntamente com a frica podem ser
consideradas o bero desta doena (DORNELES, 2005).
Esse bacilo tem a capacidade de infectar grande nmero de indivduos, mas poucos
adoecem pela sua baixa patogenicidade, propriedade que no funo apenas de suas
caractersticas intrnsecas, mas que depende, sobretudo, de sua relao com o hospedeiro e
3
grau de endemicidade do meio. O domiclio apontado como importante espao de
transmisso da doena, embora ainda exista grande lacuna de conhecimento quanto aos
provveis fatores de risco implicados, especialmente aqueles relacionados ao ambiente
social. Apesar de baixa patogenicidade, o poder imunognico do M. leprae responsvel
pelo alto potencial do parasita, intracelular obrigatrio, que apresenta afinidade por clulas
cutneas de potencial incapacitante da hansenase, o que permite afirmar que este bacilo
de alta infectividade (FOSS, 1997).
Figura 2. Aparncia de uma pessoa com hansenase (STEPHEN and DIANA, 2007).
O tratamento para pacientes com hansenase baseado no sistema de multidrogas que
deve ser ministrado de acordo com a classificao da doena. Segundo a Organizao
Mundial da Sade, a classificao de todos os pacientes (tabela 1) deve ser baseada na
estimativa de bacilos na pele lesionada, ndice baciloscpico. Este determinado pela
contagem dos cidos graxos do bacilo e no sistema Ridley e Jopling (figura 3) que se baseia
na resposta imunolgica do hospedeiro o qual compreende dois polos, a tuberculide e a
virchowiana (SAMUEL, 2004).
A hansenase tuberculide (HT) est relacionada com a exacerbao da resposta imune
celular e a hansenase virchowiana (HV) a forma de alta susceptibilidade que se
caracteriza por deficincia de resposta imune celular, excessiva multiplicao bacilar e
disseminao da infeco para vsceras e tecido nervoso. Esta ltima a forma de maior
importncia epidemiolgica, pois os bacilos esto maciamente presentes nas leses
4
cutneas, na proporo de 1010 bacilos/g tecido, propiciando a transmisso da doena por
contato fsico (SAMUEL, 2004, STEPHEN and DIANA, 2007).
Tabela 1. Diagnstico da hansenase (WHO, 2007)
CARACTERSTICAS
Clnica Baciloscopia Forma
Clnica
Classificao
Operacional
para a rede bsica
reas de hipo ou anestesia, parestesias,
manchas hipo-crmicas e, ou
eritematohipocrmicas,
com ou sem diminuio
da sudorese e rarefao de plos.
Negativa Indeterminada
(BT ou BL)
Placas eritematosas,
eritematohipocrmicas,
bem definidas, hipo ou
anestsicas, comprometimento de nervo.
Negativa Tuberculide
PB
At 5 leses de pele
Leses pr-foveolares (eritematosas,
planas com o centro claro). Leses
foveolares (eritematopigmentares, de
tonalidade ferruginosa ou pardacenta).
Apresenta alteraes de sensibilidade.
Positiva
(bacilos e globias
ou com raros
bacilos) ou
Negativa
Borderline ou
dimorfa
Eritema e infiltrao difusas, placas
eritematosas infiltradas e de bordas mal
definidas, tubrculos e ndulos,
madarose, leses das mucosas, com
alterao de sensibilidade.
Positiva
(bacilos
abundantes e
globias)
Virchowiana
MB
Mais que 5 leses de
pele
BT: dimorfa tuberculode; BL: dimorfa virchowiana; PB: paucibacilar; MB: multibacilar.
Entre as formas polares, situam-se as formas instveis da doena, com amplo espectro
de manifestaes clnicas. Hansenase borderline (ou dimorfa) a forma intermediria,
resultante de uma imunidade tambm intermediria, podendo adquirir caractersticas
tuberculode (BT), virchowiana (BL) ou simplesmente permanecer dimorfa. O nmero de
leses maior na bordeline, formando manchas que podem atingir grandes reas da pele,
envolvendo partes da pele sadia. O acometimento dos nervos mais extenso.
5
A medida da resposta imunolgica pode ser efetuada por meio da reao de Mitsuda
(FOSS, 1997), que consiste na inoculao intradrmica de suspenso de bacilos mortos pelo
calor, cuja leitura feita aps quatros semanas, resultando em ppula infiltrada (reao
positiva) ou ausncia de alterao cutnea (reao negativa).
Figura 3. Classificao Ridley e Jopling baseada na resposta imunolgica do hospedeiro. TT polar
tuberculide, BT: dimorfa tuberculode, BB: dimorfa ou borderline, BL: dimorfa virchowiana, LL:
polar lepromatus ou virchowiana (STEPHEN and DIANA, 2007). IL: interleucina; IFN: interferon;
ENL: leprose eritema nodoso.
Segundo o resultado da reao de Mitsuda (FOSS, 1997) os pacientes podem ser
classificados em suscetveis ou resistentes doena, pois a reao sempre negativa em
virchowianos e positiva em tuberculides.
Os aspectos morfolgicos das leses cutneas e classificao clnica das quatro formas
apresentadas (tabela 1) so utilizados por profissionais especializados e em investigao
cientfica. No campo, para fins teraputicos, a OMS recomenda que se use a classificao
operacional baseada no nmero de leses cutneas (SAMUEL, 2004, STEPHEN and
DIANA, 2007).
6
Em relao s manifestaes neurolgicas, estas so comuns a todas as formas clnicas.
Na hansenase indeterminada, no h comprometimento de troncos nervosos, expressos
clinicamente. Na hansenase tuberculide, o comprometimento dos nervos mais precoce e
mais intenso. Na hansenase virchowiana, ocorrem leses dermatolgicas das mucosas e
tambm leses viscerais. Portanto hansenase doena dermatolgica, pois seus primeiros
sinais e sintomas manifestam-se na pele, mas, tambm infecciosa, imunolgica e
neurolgica (SAMUEL, 2004, STEPHEN and DIANA, 2007). objeto de interveno do
aparelho do estado, pois quando no adequadamente tratada pode incapacitar a populao
na fase etria economicamente ativa (WHO, 2007).
Aps a implementao da poliquimioterapia, em 1982, foi observado grande declnio
mundial no nmero de pacientes com lepra, com a cura de mais de dez milhes de pessoas
em dez anos. Essa melhoria possibilitou a OMS pactuar compromisso entre os pases
endmicos de que a hansenase seria eliminada como problema da sade pblica at o ano
de 2000, prazo estendido at 2010, visto que, para erradicar a doena, necessrio reduzir a
taxa de prevalncia para menos de 1 caso para cada 10 mil habitantes (SAMUEL, 2004,
WEEKLY EPIDEMIOLOGICAL, 2007).
Atualmente os ndices mundiais de deteco continuam em queda como pode ser
observado na figura 4. Os casos de prevalncia registrados no incio de 2007 foram de
224.717 pessoas e o nmero de pacientes infectados durante o ano de 2006 foi de 259.017
pessoas, acumulando um declnio de 13,4% em relao ao ano de 2005 (WEEKLY
EPIDEMIOLOGICAL, 2007).
7
2001 2002 2003 2004 2005 20060
200
400
600
800
Nov
os c
asos
(x 1
0-3 )
Ano
Figura 4. Nmero de casos detectados mundialmente referentes ao perodo de 2001 a 2006
(WEEKLY EPIDEMIOLOGICAL, 2007).
Apesar dos nmeros favorveis no mbito mundial, o Brasil continua sendo um dos
quatro pases endmicos responsveis por 34% de todos os casos registrados no incio de
2007, tabela 2. Nosso pas ocupa o segundo lugar no mundo e o primeiro das Amricas em
nmeros de casos de hansenase, com 44.436 casos detectados em 2006 (WEEKLY
EPIDEMIOLOGICAL, 2007). Esses nmeros levam a uma taxa de 23.53 casos para cada
100.000 habitantes. Os primeiros dados disponveis do primeiro semestre de 2007 revelam
aumento na taxa de prevalncia quando comparado com os dois anos anteriores, atingindo
valores 3.21 para cada 10.000 (WEEKLY EPIDEMIOLOGICAL, 2007). Esse aumento
pode ser explicado devido elevada endemicidade do meio, favorecendo o contgio de
outras pessoas e assim, a continuidade da prevalncia da doena.
8
Tabela 2. Taxas de prevalncia e deteco nos quatro pases mais endmicos do planeta.
Prevalncia registradaa Novos casos registradosb
Pases Incio de
2005 Incio de 2006
Incio de
2007 2004 2005 2006
Brasil 30.693 (1,7) 27.313 (1,5) 60.567 (3,21) 49.384 (26,9) 38.410 (20,6) 44.436 (23,53)
Repblica
Democrata do
Congo
10.530 (1,9) 9.785 (1,7) 8.261 (1,39) 11.781 (21,1) 10.737 (18,0) 8.257 (13,92)
Moambique 4.692 (2,4) 4.889 (2,5) 2.594 (1,29) 4.266 (22,0) 5.371 (27,1) 3.637 (18,04)
Nepal 4.699 (1,8) 4.921 (1,8) 3.951 (1,43) 6.958 (26,2) 6.150 (22,7) 4.253 (10,37)
*O nmero entre parnteses indica em (a) nmero de prevalncia/10.000 habitantes; em (b) casos
detectados/100.000 habitantes.
Embora a hansenase seja prevalente em todo territrio brasileiro, sua distribuio
desigual, existindo reas de baixa ( 15 casos/10.000 hab.) como pode ser observado na figura 5 (SADE,
2007).
A regio Sudeste uma rea de baixa endemicidade, sendo seus coeficientes de
prevalncia e deteco de 0,93/10.000 e 0,96/10.000, respectivamente (DATASUS, 2007).
Contudo os dados epidemiolgicos no medem a real extenso do problema, uma vez que
foi demonstrado, usando provas sorolgicas para determinao de anticorpos especficos,
que a infeco pelo M. leprae muito mais freqente do que o nmero de casos clnicos
conhecidos (LOMBARDI and SUREZ, 1997).
A prevalncia de casos ativos de hansenase no Brasil, comparada aos anos anteriores,
sofreu forte reduo devido aos programas de controle adotados, contudo a incidncia
decresceu muito lentamente, demonstrando ainda pouco entendimento sobre a
epidemiologia desta doena (RAMAPRASAD et al., 1997). Este fato pode ser explicado
pela transmisso por pessoas sem nenhum sintoma de hansenase, porm com a presena do
M. leprae na mucosa.
9
Figura 5. Taxa de prevalncia no Brasil, referente ao ano de 2004 (SADE, 2007).
Deste modo, existe um nmero no definido de pessoas infectadas, assintomticas e que
podem exercer papel ativo na transmisso da doena, prejudicando o seu efetivo controle
(TALHARI and NEVES, 1997).
Ferramentas modernas de biologia molecular e imunologia tem se apresentado de
grande valor para o diagnstico da hansenase e para a pesquisa epidemiolgica (VAN
BEERS et al., 1996). As tcnicas da Reao em cadeia da polimerase (PCR) e
enzimaimunoensaio (ELISA) tornam possvel detectar com alta sensibilidade e
especificidade o bacilo de Hansen em stios especficos (DE WIT et al., 1991; YOON et
al., 1993). Entretanto, o tempo atual destas tcnicas demanda tempo, pessoal qualificado,
custo elevado e, sobretudo a disseminao das mesmas, em centros perifricos de sade;
local de maior procura populacional (DAVID et al., 2004).
A hansenase hoje tem cura e esta tanto mais rpida quanto mais cedo a doena for
detectada. O diagnstico precoce, tratamento regular e acompanhamento da equipe mdica
podero impedir o aparecimento das deformidades fsicas, modificando a imagem da
doena no Brasil e no mundo.
10
1.2. Biossensores
1.2.1. Aspectos Gerais
A habilidade dos organismos vivos de reconhecer diversos alvos biolgicos inspirou
vrios cientistas a desenvolver novas ferramentas analticas de deteco, conhecidos como
biossensores. Utilizando-se biomolculas ou receptores de organismos biolgicos, esses
aparelhos possuem vrias caractersticas analticas favorveis tais como; seletividade,
sensibilidade, especificidade, portabilidade, rapidez, baixo custo, capacidade de
miniaturizao e rpido tempo de deteco. Estas caractersticas favorecem a aplicao
desses instrumentos no diagnstico de doenas, monitoramento ambiental, bem como no
controle de qualidade dos alimentos e, portanto, uma alternativa as metodologias atuais de
anlises clnicas (DORAZIO, 2003).
De acordo com a literatura (DORAZIO, 2003), biossensores so aparelhos analticos
compostos por uma camada de reconhecimento biolgico imobilizada sobre um transdutor.
A biomolcula, que pode ser uma enzima, anticorpo, seqncia de DNA, peptdeo ou
microorganismo, fornece ao sistema seletividade pelo analito de interesse, possibilitando
dessa forma discriminar a molcula em uma matriz complexa. O sinal do transdutor
determina a extenso do bio-reconhecimento e o converte em um sinal (GOODING, 2006)
o qual pode ser, eletroqumico, tico, gravimtrico ou ressonncia plasmnica. As tcnicas
eletroqumicas utilizadas para deteco, podem ser amperometria ou potenciometria. De
ambas as tcnicas, a amperomtrica a mais atrativa devido a maior sensibilidade (FREIRE
et al., 2003b).
Os biossensores podem ser divididos em duas classes: os catalticos, que utilizam
enzimas imobilizadas e os de afinidade, que utilizam anticorpos, DNA ou peptdeos, como
molculas de bio-reconhecimento (GOODING, 2006, DORAZIO, 2003).
Freqentemente, os elementos de reconhecimento requerem compostos intermedirios
chamados de mediadores para o funcionamento apropriado do biossensor. Tais compostos
so transportadores redox equivalentes entre o elemento de reconhecimento e o transdutor,
resultando no aumento da seletividade e sensibilidade do biossensor (CASTILLO et al.,
2004).
11
Os biossensores, dependendo do mtodo de imobilizao e da natureza do mediador,
podem ser classificados em primeira, segunda e terceira gerao (figura 6) (CASTILLO et
al., 2004, PEREIRA, 2003).
21
3
Figura 6. Esquema das geraes dos biossensores. 1: primeira gerao; 2: segunda gerao e 3:
terceira gerao. M: mediador reduzido. M: mediador oxidado.
A primeira gerao compreende apenas a biomolcula de reconhecimento e o
transdutor. O biossensor da Yellow Spring Instruments (figura 7) representa bem esta
gerao.
A enzima fisicamente imobilizada em um eletrodo sensvel ao produto enzimtico por
duas membranas: uma permevel a gs e outra de dilise, garantindo que apenas a glicose e
o co-substrato, gs oxignio, cheguem at a enzima.
O transdutor monitora a concentrao de glicose na amostra por meio da oxidao do
perxido de hidrognio gerado, segundo as reaes 1 e 2, abaixo (CASTILLO et al., 2004)
(1) Glicose(aq) + O2 (g) cido glicnico(aq) + H2O2 (aq)(2) H2O2(aq) O2(g) + H+(aq) + 2e-
12
As principais desvantagens desses sensores so: a necessidade de aplicao de altos
potenciais e dependncia enzimtica do co-substrato, uma vez que, em amostras reais h
baixa concentrao de O2, dificultando a anlise de amostra com concentrao de glicose
acima de 500 mg/dl. O gs oxignio funciona como mediador redox natural e regenerador
do stio ativo enzimtico (DORAZIO, 2003).
Na segunda gerao, utilizam-se mediadores livremente difundidos na superfcie do
transdutor. Esta gerao foi desenvolvida para minimizar os problemas dos biossensores da
primeira gerao, substituindo os mediadores naturais (co-substrato) por mediadores
artificiais. Estes compostos podem ser molculas inorgnicas ou organometlicos derivados
do Fe2+ (ferrocenos), ou complexos de smio (Os2+) ou rutnio (Ru2+) (CASTILLO et al.,
2004, BRETT et al., 1999). Segundo TURNER et al., 1987 apud CASTILLO et al., 2004,
um mediador ideal aquele que possui as formas oxidadas e reduzidas estveis, rpida taxa
de transferncia eletrnica entre a biomolcula e o transdutor e janela eletroqumica entre -
100 a 0mV vs. ECS, evitando assim, a ao de diversos interferentes.
Em geral, alguns problemas so enfrentados como perda de sinal com os biossensores
da segunda gerao quando as anlises so feitas em amostras complexas, cuja
contaminao da amostra (processos de monitoramento em alimentos industriais e
aplicaes biomdicas) com o mediador artificial deve ser rigorosamente evitada.
Na terceira gerao (figura 6-3), o mediador integrado junto com componente de bio-
reconhecimento
um processo reversvel.
transferindo os eltrons da biomolcula para o transdutor polarizado em
igura 7. Configurao de um
licosmetro da Yellow
pring instruments
F
g
s
(DORAZIO, 2003).
13
Obviamente que a diferena entre a segunda e terceira gerao no muito significante. A
ao dos componentes de reconhecimento sobre a superfcie do transdutor
ssos qumicosa e
fsicosb
Contudo, essa gerao gera algumas controvrsias, pois eratura
uas definies: a primeira acima citada e a segunda definida por GORDON et al.,1999
Tcnicas utilizadas para imobilizao de biomolculas
imobiliz
representa o fator determinante para o bom funcionamento do biossensor. Usualmente, os
mtodos utilizados para imobilizao de biomolculas (tabela 3) so tambm utilizados
para imobilizar os mediadores (adsoro, ligao covalente, ocluso, ligao cruzada) que
so necessrios para assegurar o mecanismo de transferncia eletrnica.
Tabela 3. Procedimento para imobilizao de biomolculas. Proce
.
Mtodo Vantagens Desvantagens Adsorob
Van der Wliga s e
hidrofbicas. b
endentes do ra,
baixa estabilidade. a
es inicaals,
Procedimento simples, condies brandas, menos dano
Interaes deppH, solvente e
iomolcula. temperatu
OclusobMembranas de
lise, polmerodi s.
Pro h prob eio. ca a
biomolcula causando baixa
cedimento simples, no lemas com o m
Resistncia difusional, pode usar desnaturao d
sensibilidade e limite de deteco.
Ligao CruzadaaGlutaraldedo, bis-
diazobenzidina,
Procedimento simples, ligaes qumicas fortes. r
de bio aixa cloreto cianrico.
Dificuldade em controlar a eao, grande quantidade
molcula, bsensibilidade.
Ligao covalenteaobre membranas
ou matrizes S
Estv e biomolcula. Ligao entre
grupos especficos biomolcula e m
Possibilidade de perda de at s insolveis.
el complexo matriz
atriz. Ideal para produo emmassa e comercializao.
Complicado e elevado tempo de produo.
ividade devido a reaeenvolvendo grupos
essenciais da atividade biolgica.
so encontradas na lit
d
apud KUBOTA et al., 2002 (figura 8) como sendo uma transferncia direta da biomolcula
e o transdutor sem a presena de mediadores artificiais ou naturais.
14
Figura 8. Terceira gerao de biossensores proposto por GORDON et al., 1999 apud KUBOTA et
al., 2002.
De acordo com o autor, essa configurao a torna bastante vantajosa, j que promove
uma maior seletividade, medida que eles operam em potenciais mais prximos ao da
prpria biomolcula, diminuindo como conseqncia reaes interferentes, assim como
dispensando o uso de outros reagentes na seqncia das reaes enzimticas.
1.2.2. Biossensores de DNA
Na ltima dcada, o progresso tecnolgico no campo da biologia molecular possibilitou
a revelao da estrutura genmica de vrios organismos, dentre eles o genoma humano. A
elucidao dessa estrutura revelou que as mutaes do gene so responsveis por diversas
doenas genticas e virais (KARA et al., 2004). Em vrios campos da medicina, como na
medicina forense e biologia molecular, o estabelecimento de mtodos de deteco e anlise
de seqncias especficas de DNA tornou-se muito importante (LUCARELLI et al., 2004).
Em geral, a deteco especifica de seqncias de DNA so realizadas por eletroforese
de fragmentos amplificados por PCR ou por radioistopos utilizando a seqncia
complementar marcada com 32P e fluorescncia, monitorando reaes enzimticas
acopladas ao DNA. Contudo, esses mtodos so problemticos, pois utilizam a fixao de
amostras de DNA e hibridizao em membranas de nitrocelulose, procedimento que
demanda tempo e manejo laboratorial complicado, pois se trata de reaes em ambiente
heterogneo.
Alm desse inconveniente, as anlises simultneas de vrias amostras so difceis de
serem realizadas, devido ao tempo e o uso de agentes carcinognicos como o brometo de
etdio em gis de DNA e marcadores radioativos, pois, apesar de serem sensveis so
agentes perigosos sade e ao ambiente (UMEZAWA, 2007; IHARA et al., 1996).
15
No intuito de contornar esses problemas, a comunidade cientifica tm trabalhado no
desenvolvimento de biossensores eletroqumicos de DNA, visto que uma ferramenta para
rpida aplicao em anlise gentica. Esta tcnica pode ser utilizada como alternativa ao gel
de eletroforese e marcadores radioativos, uma vez que esses sensores so capazes de
detectar a presena de genes ou genes mutantes associados a doenas hereditrias ou
doenas infecciosas, pois so sensveis, seletivos e no causam dano ao operador e ao
ambiente (UMEZAWA, 2007; PINGANG, 2005).
Basicamente, um biossensor de DNA constitudo de simples fitas (ssDNA)
imobilizadas na superfcie do transdutor, (tabela 3) para reconhecer sua seqncia
complementar. A dupla fita formada na superfcie do eletrodo conhecida como hbrido (ds
DNA) e este evento convertido em sinal analtico pelo transdutor, figura 9 (KERMAN et
al., 2003). Os biossensores eletroqumicos possuem alta sensibilidade, so simples e de
baixo custo, fornecendo propriedades superiores a outros sensores, quando comparado com
outras tcnicas analticas (KERMAN et al., 2003, WANG, 2000).
Figura 9. Deteco especifica de uma seqncia de DNA usando um biossensor.
A deteco eletroqumica do DNA pode ser realizada por oxidao direta de bases do
DNA ou por indicadores de hibridizao, os quais so: mediadores, intercaladores, enzimas
ou nanopartculas. O monitoramento feito pelo aumento ou decrscimo das correntes de
oxidao ou de reduo dos indicadores, ou oxidao direta da guanina na dupla fita de
DNA (WANG, 2000).
16
O uso de enzimas ou nanopartculas na construo de biossensores menos vantajoso
em relao aos mediadores ou intercaladores, pois necessitam de vrias etapas de
construo, alm de reagentes de alto custo e baixa estabilidade (KERMAN, et al., 2003;
DRUMMOND et al., 2003).
O primeiro relato na literatura com indicadores redox foi feito por MIKKELSEN et al.,
(1994), para detectar seqncias relacionadas fibrose cstica. Neste trabalho foi possvel
detectar em 70% dos pacientes a seqncia relacionada fibrose cstica atingindo um limite
deteco de 1,8 femtomoles de DNA, contendo 4000 bases, sendo utilizado Co(bpy)33+
como indicador.
Esse indicador, em sua forma oxidada, capaz de extrair eltrons dos resduos de
guanina em um alvo hibridizado (figura 10) passando para sua forma reduzida; aplicando
um potencial positivo no eletrodo, o indicador oxidado retornando ao primeiro estgio,
completando assim, o ciclo redox. Isso possibilita a participao do indicador em vrios
ciclos redox, o que conduz a amplificao do sinal eletroqumico. Alm disso, o tempo de
resposta do sistema foi mais rpido quando comparado com a oxidao direta do cido
nuclico no eletrodo, devido a taxa de transferncia de eltrons entre o Co(bpy)33+ e
guanina ser mais rpida.
Figura 10. Biossensor eletroqumico de DNA baseado na reao redox entre Co(bpy)33+ e resduos
de guanina.
17
YAN et al., (2001) reportaram a deteco do gene de cianobactrias utilizando-se
Ru(bpy)33+ como indicador sobre eletrodos de ouro. O pico de corrente do indicador foi
linearmente relacionado com a concentrao da seqncia complementar e a sensibilidade
do sistema foi da ordem de 10-11 mol.L-1. Alm disso, o biossensor foi capaz de distinguir
polimorfismos no alvo complementar.
Em outro trabalho, XU et al., (2000) marcaram DNA de calf thymus desnaturado com
ferrocenocarboxaldeido via 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida (EDC). A sonda
marcada foi utilizada para hibridizar o complementar, imobilizado sobre a superfcie do
eletrodo de grafite. A imobilizao da sonda no transdutor foi efetuada aplicando um
potencial positivo em uma soluo tampo contendo as seqncias, no danificadas ou
danificadas com radicais hidroxilas. Aps o processo de hibridizao com a sonda, os
autores conseguiram diferenciar por voltametria de pulso diferencial as seqncias no
danificadas ou danificadas, monitorando o pico de oxidao do ferrocenocalboxaldedo.
BOON et al., (2001) desenvolveram um mtodo sensvel para detectar bases
nitrogenadas danificadas ou pontos de mutao na dupla fita de DNA por mtodos
eletrocatalticos. Eletrodos de ouro foram utilizados para monitorar o sinal eletrocataltico
do azul de metileno (AM), como intercalador redox de DNA, acoplado ao ferricianeto
[Fe(CN)6]-3. Aplicando-se um potencial de reduo o AM intercalado reduzido para azul
de leucometileno (LM), posteriormente AM reduz o ferricianeto em soluo, regenerando
AM cataliticamente, conduzindo ao aumento do sinal de hibridao. A presena de pontos
de mutao ou bases nitrogenadas danificadas diminui substancialmente o sinal
eletrocataltico (DRUMMOND et al., 2003).
Estudos similares com seqncias especficas do vrus da hepatite B, amplificadas por
PCR, foram detectadas por MERIC et al., (2002), pela tcnica de voltametria. Eles
imobilizaram 21 ou 24 bases de ssDNA, relacionadas hepatite sobre eletrodos de pasta de
carbono para detectar sua seqncia complementar. A hibridizao foi detectada utilizando
azul de metileno como indicador, o que resultou no decrscimo de sinal do hbrido em
relao a simples fita. Essa diferena de sinal foi usada para rastrear a seqncia de DNA
especfica para esta doena infecciosa.
Pode-se observar o uso de diversos tipos de eletrodos na construo de biossensores
eletroqumicos com boa performance, como por exemplo, os sensores acima citados.
18
Todavia, na tentativa de melhorar a transduo do sinal de hibridizao, esses eletrodos
podem ser submetidos a modificaes qumicas da superfcie para aumentar a reatividade e
seletividade do sensor base.
Estas caractersticas podem ser obtidas com filmes gerados eletroquimicamente sobre
diferentes superfcies. Algumas vantagens na aplicao de eletrodos modificados com
filmes em biossensores sero discorridas abaixo.
1.3. Filmes polimricos aplicados a biossensores
A crescente busca por sensores com melhores caractersticas um dos maiores desafios
entre os qumicos eletroanalticos, principalmente devido s diversas amostras de interesse
existentes atualmente.
Apesar da grande versatilidade e perspectivas apresentadas pelos sensores
eletroqumicos, a utilidade de um eletrodo muitas vezes limitada devido a passivao
gradual de sua superfcie, que conseqncia, principalmente, da adsoro dos produtos da
prpria reao de xido-reduo utilizada na deteco, ou ainda, dos subprodutos destas
reaes que podem se polimerizar e depositar sobre a superfcie dos eletrodos (ROSATTO
et al., 2001). Alm disso, a sensibilidade de muitos analitos de interesse pode ser
prejudicada em funo da cintica de transferncia de eltrons entre estes compostos e os
materiais dos eletrodos, serem excessivamente lenta (WANG, 1991). Uma outra limitao
a dificuldade de discriminar entre compostos alvos que possuam caractersticas redox
similares (WANG, 1991).
A modificao qumica da superfcie de eletrodos oferece grande potencial para
amenizar os problemas acima descritos, e conseqentemente pode aumentar a eficincia e
aplicabilidade dos sensores eletroqumicos (WANG, 1991).
A habilidade para controlar e manipular deliberadamente as propriedades das
superfcies dos eletrodos pode proporcionar uma variedade de efeitos atrativos, os quais
podem contornar efetivamente muitos dos problemas apresentados pelos sensores
eletroqumicos tradicionais (FREIRE, 2003a) A utilizao de filmes polimricos oferece
vrias vantagens na construo de sensores, visto que so materiais relativamente baratos,
as tcnicas de fabricao so simples, podem ser depositados em vrios tipos de substratos
19
e a possibilidade de escolha de diferentes estruturas moleculares proporciona a construo
de filmes com diversas caractersticas (HARSANYI, 2000).
As tcnicas atualmente utilizadas na deposio de filmes em diferentes superfcies so
bastante diversificadas. Os mtodos de Langmuir-Blodgett e polimerizao eletroqumica
so os mais utilizados para a construo de biossensores (PEREIRA, 2002; HARSANYI,
2000). A vantagem do mtodo eletroqumico o controle na deposio do filme como
espessura, morfologia e homogeneidade na formao da cadeia, variando-se o potencial e o
nmero de varreduras sobre o eletrodo de trabalho (HARSANYI, 2000; SADKI, 2000).
O recobrimento de superfcies com filmes polimricos tem sido empregado no
desenvolvimento de biossensores para proteger a superfcie dos eletrodos de impurezas,
bloquear interferentes, imobilizar biocomponentes, incorporar mediadores e fornecer
biocompatibilidade (PEREIRA, 2002).
A etapa de imobilizao da biomolcula ou o indicador na superfcie do eletrodo
desempenha um papel importante na obteno da sensibilidade, seletividade e estabilidade
do biossensor. Estas caractersticas so alcanadas por meio do controle qumico e
cobertura da superfcie, assegurando assim, reatividade, acessibilidade e estabilidade
biomolcula imobilizada (TLILI, 2005).
Uma forma comum de imobilizar biomolculas e indicadores sobre superfcies de
monocamadas automontadas e filmes eletrodepositados. Grupos funcionais dos filmes
podem se ligar a grupos reativos da biomolcula ou indicador, por reaes com a prpria
molcula ou atravs do uso de reagentes como carbodiimida, biotina, estreptavidina ou por
adsoro (TLILI, 2005).
O uso de filmes condutores e no condutores so adequados para imobilizar sondas de
DNA (TLILI, 2005). Esta caracterstica se deve a fcil processabilidade sobre os eletrodos
condutores, combinado com o aumento da rea de contato da biomolcula com o eletrodo,
o que possibilita maior acomodao da molcula simulando seu ambiente natural,
favorecendo a converso do sinal biolgico em sinal analtico mensurvel, com rpido
tempo de resposta e alta estabilidade (SADKI, 2000; CHRISTINE, 1997).
Devido s diversas caractersticas apresentadas pelos filmes polimricos, vrios
trabalhos so encontrados na literatura visando construo de biossensores (LEE et al.,
2001, HACCOUN et al., 2005; CHAKER et al., 2005).
20
A utilizao de microeletrodos modificados com filmes polimricos para a deteco de
DNA apresenta elevada sensibilidade, visto que, nestes sistemas, possvel obter resposta
eletroqumica em concentraes em torno de zeptomoles de DNA (XIE et al., 2004;
ZHANG, 2003).
1.3.1. Filmes condutores e no condutores
Os filmes polimricos podem ser formados na superfcie de eletrodos por oxidao
eletroqumica de diversas estruturas eletroativas em meio aquoso ou em meio orgnico. A
partir dessas diferentes estruturas podem-se criar filmes condutores e no-condutores
(LONG, 2001; SADKI, 2000).
O mecanismo de conduo de filmes polimricos baseado na teoria de banda nos
slidos, a mesma dos metais e semicondutores inorgnicos. A condutividade eltrica nos
slidos pode ser explicada em termos de orbitais moleculares.
Segundo a teoria citada acima, N orbitais atmicos se combinam em uma molcula,
formando N orbitais moleculares, que se espalham em toda a molcula. O mesmo
fenmeno observado em metais, porm, o valor de N elevado, por exemplo, 1023 para
10g de Cu. Em vez de poucos orbitais moleculares com energias extremamente espaadas,
um enorme nmero de orbitais moleculares em um metal apresenta os nveis de energia to
prximos que formam uma banda quase contnua (THE NOBEL PRIZE, 2000; ATKINS
and JONES, 2001).
Em contraste com os gases nobres, a valncia dos metais no so totalmente
preenchidas. Assim, a banda de N orbitais moleculares no ser totalmente ocupada, e a
partir de um nvel de energia todos os orbitais acima estaro vazios. Esse espao entre o
mais alto orbital ocupado Homo, (banda de valncia) e o mais baixo orbital desocupado
Lumo, (banda de conduo) denominado intervalo de banda ou band gap. A
condutividade devida ao preenchimento parcial da banda de conduo ou de valncia,
bem como intervalos de bandas prximos de zero.
Em um semicondutor, o intervalo entre as bandas de valncia e de conduo prximo,
de forma oposta, em um isolante as bandas esto separadas por um grande intervalo de
energia (Figura 11).
21
Figura 11. Diferena entre intervalos de bandas (THE NOBEL PRIZE, 2000).
Estruturalmente, os polmeros condutores possuem uma cadeia orgnica alternada entre
ligaes simples e duplas (HARSANIY, 2000). Vrias teorias predizem que os eltrons
so deslocalizados sobre toda a cadeia e que o intervalo entre bandas torna-se menor quanto
maior for a extenso da conjugao. (THE NOBEL PRIZE, 2000). Alm disso,
MacDiarmid e colaboladores (MACDIARMID et al., 1977 apud DE PAOLI et al., 2000)
demonstraram aumento na condutividade eltrica desses polmeros tratando-os com cidos
ou bases de Lewis, em um processo de adio e remoo de eltrons denominado dopagem,
em analogia aos semicondutores inorgnicos. Este processo nada mais do que reaes de
oxi-reduo envolvendo transporte de ons para dentro e fora do polmero (DE PAOLI et
al., 2000).
Uma questo fundamental a ser debatida a relao entre a resposta eletroqumica das
espcies em soluo sobre a superfcie de eletrodos modificados por polmeros condutores
e a localizao eletroqumica da reao redox. Do ponto de vista terico, h pelo menos
dois stios de reaes possveis: (1) a interfase polmero e soluo e (2) o eletrodo slido
subjacente e a soluo.
A converso eletroqumica de espcies em soluo em eletrodos modificados por
polmeros um processo complexo, existindo pelo menos trs processos que interferem na
localizao da reao, tais como: (i) fluxo de difuso das espcies em soluo em uma
camada subjacente ao polmero; (ii) reao qumica redox das espcies difundidas com o
material do eletrodo (camada de polmero condutor); (iii) transporte de carga dentro da
camada do polmero.
22
Os dois primeiros processos so caracterizados por reaes eletrocatalticas, enquanto
que a terceira especfica para polmeros condutores. Se a taxa total de uma reao qumica
( ii ), e o transporte de carga ( iii ) excederem substancialmente o transporte de massa das
espcies da soluo ao eletrodo ( i ), a converso eletroqumica poderia ocorrer na interface
polmero/soluo. Este caso refere-se difuso eletrocataltica controlada e espera-se uma
acelerao da oxidao andica em espcies com reaes redox rpidas, tendo como
resultado aumento da corrente andica e uma sobretenso relativamente baixa. Assim, esta
combinao de taxas para os trs processos favorece a oxidao andica eficiente e
reversvel do analito e poderia ser usada para sua deteco amperomtrica no potencial de
eletrodo relativamente baixo.
Em caso oposto, quando a reao redox entre o analito e polmero ( ii ) lento, ou se a
condutividade do polmero for baixa para assegurar um eficiente transporte de carga entre a
zona de reao e o eletrodo ( iii ), a converso eletroqumica do analito procede no eletrodo
suporte. Em alguns casos o polmero retarda a penetrao do analito, permitindo a seleo
das espcies a serem oxidadas/reduzidas (MALINAUSKAS et al., 2004).
A maioria dos trabalhos nessa linha de pesquisa est direcionado para a construo de
filmes condutores ou redox. No entanto, polmeros no-condutores tm mostrado elevado
grau de permesseletividade na superfcie do eletrodo, formando membranas adequadas para
construo de biossensores ( PEREIRA et al., 2002).
Outra aplicao a construo de eletrlitos slidos polimricos, os quais so
basicamente formados por polmeros no condutores que contm sais inicos dissolvidos
em sua matriz e o transporte inico ocorre por meio do movimento segmental da cadeia
polimrica (DE PAOLI et al., 2000).
O crescimento de polmeros no-condutores so auto-limitados e conseqentemente os
filmes tendem a serem muito finos, entre 10 a 100 nm, resultando em rpida difuso de
substratos e produtos no eletrodo (LONG, 2001).
1.3.2. Filmes formados com 4-aminofenol (4-AF)
possvel encontrar na literatura vrios trabalhos envolvendo a formao de filmes
polimricos construdos a partir de monmeros com tomos de oxignio acoplados ao anel
23
aromticos (EKINCI et al., 1996, MENEZES and MAIA, 2006, VIEIRA et al., 2006,
FERREIRA et al., 2007, FRANCO et al., 2007, BRITO-MADURRO et al., 2007,
FRANCO et al., 2008). Estudos tm comprovado que esses filmes apresentam facilidade de
polimerizao, alm de resistncia mecnica do filme obtido, propiciando maior
estabilidade para o eletrodo modificado formado.
O estudo de aminofenis interessante do ponto de vista eletroqumico, pois apresenta
dois grupos oxidveis (-NH2 e -OH) diferentemente da anilina e do fenol. A presena
desses grupos funcionais adequada para imobilizao de biomolculas. Alm disso,
apesar da diferena estrutural, entre esses trs compostos (4-AF, anilina e fenol), existe um
comportamento eletroqumico similar, pois tanto a anilina e o fenol so molculas
precursoras na formao de filmes com ampla aplicao em sensores e biossensores.
(SALAVAGIONE et al., 2003).
TAJ et al., (1992) reportaram pela primeira vez a formao do primeiro filme de 4-AF
em eletrodo de platina, por voltametria cclica. A partir da, outros grupos mostraram
interesse na formao e na elucidao da estrutura desses filmes, bem como na sua
aplicao (SALAVAGIONE et al., 2003).
VIEIRA et al., (2006) tambm demonstraram a formao de poli(4-AF) sobre eletrodos
de grafite em diferentes valores de pH. As anlises indicaram que filmes preparados em
meio cido favorecem a transferncia de carga. Por outro lado, filmes preparados em meio
bsico geraram filmes passivantes, os quais dificultam a transferncia eletrnica.
BRITO-MADURRO et al., (2007) modificaram eletrodos de grafite com poli(4-AF), o
qual indicou ser eficiente para imobilizao das biomolculas; adenosina trifosfato e
guanosina trifosfato. A amplitude do sinal de deteco dessas bases foi vinte e quatro vezes
maior quando comparado ao eletrodo de grafite no modificado com poli(4-AF).
Estudos (HAWLEY and ADAMS, 1965) sugeriram que a eletrooxidao do poli(4-AF)
envolve a sada de dois eltrons e dois prtons, produzindo quinoneimina seguida por
hidrlise, produzindo p-benzoquinona (figura 12). Em maiores valores de pH, os autores
sugerem reaes de acoplamento 1-4 e posteriormente a formao do polmero.
24
OH
NHH
O
NH O
O
+ N H3-2 e -
-2 H++ H2O
pAF p-quinoneimina p-benzoquinona
Figura12. Estruturas do processo de oxidao eletroqumico e processo qumico do pAF.
A mesma proposta mecanstica foi descrita por MENEZES and MAIA (2006) em
estudos de filmes derivados de 4-aminofenol sobre superfcie de platina, em diferentes
valores de pH. Os polmeros produzidos indicaram diferentes valores de reteno de carga
em funo do pH que esto relacionados com grande nmero de ligaes fenil-N-fenil
(figura 13).
O
ONH
NH
OH
OH
Figura 13. Proposta para acoplamento 1-4 via nitrognio
Teoricamente esta caracterstica favorvel imobilizao de biomolculas, como
DNA, por meio de interao entre grupos fosfato da estrutura do DNA e o esqueleto do
polmero ou ligaes covalentes entre os grupos funcionais da biomolcula e polmero,
sendo uma etapa fundamental na construo do biossensor.
25
Para a modificao da superfcie do eletrodo, anlise e desenvolvimento do biossensor
eletroqumico desenvolvido podem ser utilizadas algumas tcnicas, descritas abaixo.
1.4. Tcnicas eletroqumicas
1.4.1. Voltametria cclica e pulso diferencial
Tcnicas voltamtricas englobam um grupo de mtodos eletroanalticos em que as
informaes sobre o analito so obtidas atravs da medida de intensidade de corrente como
funo do potencial. A voltametria cclica (VC) consiste na aplicao ao eletrodo de
trabalho de um repetitivo potencial triangular variando continuamente com o tempo, o que
conduz a ocorrncia de reaes de oxidao e reduo de espcies eletroativas em soluo.
Este mtodo tem sido extensivamente usado, para obter informaes qualitativas sobre o
comportamento eletroqumico de filmes polimricos depois da eletropolimerizao, e para
identificar espcies presentes na soluo. Outra tcnica, mais poderosa a voltametria de
pulso diferencial (VPD). A polarizao da superfcie do eletrodo feita aplicando-se pulsos
de potencial. Ao mesmo tempo, a corrente amostrada imediatamente antes e depois de
cada pulso sendo o valor final de corrente a diferena entre os dois valores medidos.
Para este tipo de anlise so utilizados trs eletrodos. O indicador, conhecido como
eletrodo de trabalho onde so medidos os processos redox de interesse. O eletrodo de
referncia, de potencial conhecido e constante, a referncia em relao a qual o potencial
do eletrodo de trabalho pode ser medido. E o eletrodo auxiliar (tambm chamado de contra-
eletrodo) onde tambm ocorre os processos redox e o fechamento do circuito eltrico.
1.4.2. Espectroscopia de Impedncia Eletroqumica
A impedncia baseia-se na aplicao de uma pequena perturbao senoidal de tenso ao
sistema, de pequena amplitude e de freqncia , gerando assim uma corrente AC
provocado por um potencial E = sen(t) que, de acordo com a lei de Ohm, origina a
impedncia, Z = [E sen(t)]/R (GIROTTO and DE PAOLI, 1999).
26
Os resultados da tcnica de impedncia so normalmente apresentados na forma de
grficos que relacionam os parmetros de freqncia de excitao(f), em Hz, ngulo de
fase, magnitude e componentes real e imaginrio da impedncia. A representao utilizada,
neste trabalho foi o diagrama de Nyquist que representa os valores da componente real (Z)
versus componente imginrio (Z). A principal caracterstica desse diagrama a clareza
com que pode ser visualizado os efeitos de resistncia hmica do sistema.
A anlise desse sistema realizada comparando o sistema eletroqumico estudado com
um circuito eltrico equivalente, formado pela combinao de resistores e capacitores. Este
circuito deve conter, pelo menos, componentes para representar; a dupla camada eltrica:
um capacitor de capacidade Qdl; a impedncia dos processos faradaicos, relativo a
transferncia de carga ou transporte de massa das espcies eletroativas conhecido por
impedncia de warburg, representado por Zf e Zw. E por fim, a resistncia no compensada,
ou seja, a resistncia da soluo entre os eletrodos de trabalho e de referncia representado
por R. O sistema mais simples contendo, Rs, Qdl, Rct Zw conhecido como o circuito de
Randles.
1.4.3. Microbalana de Cristal de Quartzo
Esta tcnica, eletrogravimtrica, consiste basicamente de um disco de cristal de quartzo
piezoeltrico parcialmente recoberto em ambas faces com um filme metlico fino. As faces
deste cristal so conectadas a um circuito eltrico que aplica um sinal de corrente alternada,
gerando assim um campo eltrico que causa a vibrao do cristal a uma determinada
freqncia de ressonncia, f.
Quando uma das faces do cristal colocada em contado com uma soluo eletroltica,
esta face passa a ter a funo de eletrodo de trabalho, como em uma clula eletroqumica
convencional.
As sensveis mudanas de massa ocorrida na superfcie do eletrodo so investigadas
monitorando as variaes de freqncia do cristal utilizando a equao de Sauerbrey
(SAUERBREY, 1959) para obter a relao massa/freqncia.
ccAmff
=
202 (3)
27
Onde f a variao da freqncia de ressonncia, f a freqncia de ressonncia
fundamental do cristal, m a variao de massa na superfcie do eletrodo, o modulo
de cisalhamento do cristal, a densidade do cristal e A a rea geomtrica do eletrodo.
2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral
Desenvolver sensor bioeletroqumico baseado em sondas de DNA para deteco do
bacilo M. leprae.
2.2. Objetivos especficos:
Construo e caracterizao de filmes polimricos derivados de 4-aminofenol;
Incorporao de bases nitrogenadas do DNA, adenina, timina, citosina, guanina ao
eletrodo sem filme e eletrodo modificado com filme polimrico;
Incorporao ao suporte polimrico de produtos de PCR da regio conservada do
genoma do bacilo M. leprae;
Deteco do alvo complementar e avaliao do desempenho eletroqumico do
sensor utilizando-se mediadores ou indicadores;
Anlise da superfcie do eletrodo modificado com filme polimrico contendo DNA
imobilizado, utilizando-se microscopia de fora atmica.
3. Parte Experimental
- 4-aminofenol (C6H7NO), 97,5%, Across organics, P.M.= 109,13 g. mol-1
- cido ntrico (HNO3), 65%, Cintica, P.M.= 63,01 g.mol-1
- cido perclrico (HClO4),70%, A.C.S, P.M.= 100,46 g.mol-1
- cido sulfrico (H2SO4), 98%, Merck, P.M.= 98,08 g.mol-1
- cido actico glacial (CH3COOH), 100%, A.C.S. P.M.= 60,05 g.mol-1
- Hidrxido de sdio (NaOH), 100%, Vetec, P.M.= 40,00 g.mol-1
- Nitrato de potssio (KNO3), A.C.S, P.M.= 101,10 g.mol-1
28
- Ferrocianeto de potssio [K4Fe(CN)6.3H2O], 100%, Vetec, P.M.= 422,39 g.mol-1
- Ferricianeto de potssio [K3Fe(CN)6], 100%, Reagen, P.M.= 329,25 g.mol-1
- Fosfato de sdio monobsico anidro (NaH2PO4), 100%, P.M.= 119,98 g.mol-1
- Fosfato de sdio dibsico anidro (Na2HPO4), 100%, Vetec, P.M.= 141,96 g.mol-1
- Acetato de sdio anidro (CH3COONa.), 100%, Vetec, P.M.= 82,03 g.mol-1
- ter de petrleo(C13H12O2), 100%, Biotec, P.M.=236,45 g.mol-1
- Acetona (CH3OCH3), 100%, A.C.S, P.M.= 58,08 g.mol-1
- Guanina (C5H5N5O) 99%, Acros Organics, P.M.= 151,13 g.mol-1
- Adenina (C5H5N5), 99,5%, Acros Organics, P.M.= 135,13 g.mol-1
- Timina (C5H6N2O2), 99%, Acros Organics, P.M.= 126,11 g.mol-1
- Citosina (C4H5N3O), 99%, Acros Organics, P.M.= 111,1 g.mol-1
- Ferrocenocarboxialdedo (C11H8OFe) , 100%, Fluka, P.M.= 214,05 g.mol-1
- Metanol (CH3OH), 99,9%, Merck. P.M.= 32,04 g.mol-1
- Azul de metileno (C16H18ClN3S) P.M.= 319,85 g.mol-1
- Tris-HCl (C4H11NO3ClH), 99%, GiBcoBRL, P.M.= 157,64 g.mol-1 - cido etilenodiamino tetra-actico (C10H14N2O8Na2 .2H2O), 100%, Vetec, P.M.= 372,54 g.mol-1 - Citrato de sdio (N3C6H5O7.H2O), 100%, Reagen. P.M.= 294,11 g.mol-1 - Cloreto de sdio (NaCl), 100%, Biotec. P.M.= 58,44 g.mol-1
Os reagentes foram utilizados conforme recebidos. Para os estudos eletroqumicos foi
utilizada uma clula eletroqumica de trs compartimentos. Como eletrodo auxiliar foi
utilizado uma placa de platina de 2cm2 de rea aparente. Todos os potenciais so referidos a
um eletrodo de calomelano saturado. O eletrodo de trabalho utilizado foi um disco de
grafite (6mm de dimetro), figura 14A. Um sistema contendo a clula de trs
compartimentos e os eletrodos citados acima, est ilustrado na figura 14B.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Carbonohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Hidrog%C3%A9niohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Clorohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Nitrog%C3%A9niohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Enxofre
29
A B
Figura 14. Materiais utilizados para estudos eletroqumicos A: eletrodo de grafite e barra de
grafite B: cela de trs compartimentos com respectivos eletrodos de trabalho, auxiliar e referncia.
A vidraria utilizada para os experimentos eletroqumicos foi deixada em banho de cido
ntrico concentrado por aproximadamente 24 horas e a seguir, lavada com gua deionizada.
Para as medidas eletroqumicas foi utilizado um potenciostato CH Instruments modelo
1120 A (figura 15A). Medidas de espectroscopia de impedncia eletroqumica foram
realizadas utilizando um Autolab PGSTAT20 (Eco Chemie, Holland) equipado com FRA
(Frequency Response Analyzer) (Figura 15B). Uma politriz Aropol 2V da Arotec (figura
15C) foi utilizada para polimento mecnico dos eletrodos de trabalho.
A B C
Figura 15. Equipamentos utilizados para os experimentos eletroqumicos e para limpeza dos
eletrodos.
30
Para os estudos com a MECQ, foi utilizado um potenciostato da CH Instruments
Modelo 420A para as medidas de variao de freqncia do cristal de quartzo. O eletrodo
de trabalho foi um cristal de quartzo de 13,7 mm de dimetro (corte AT), com o
recobrimento, em ambos as superfcies, com uma pelcula de ouro com 5,11 mm de
dimetro. Um fio de platina de 1cm de comprimento foi usado como eletrodo auxiliar e um
eletrodo de prata/cloreto de prata (Ag/AgCl/KCl 3,5 mol.L-1
) como eletrodo de referncia.
O sistema foi conectado a uma clula eletroqumica de teflon com capacidade de 4ml. Os
eletrodos auxiliar e referncia foram conectados ao potenciostato e os dois contatos
eltricos do eletrodo de trabalho conectados a um frequencmetro.
gua deionizada foi obtida de um ultrapurificador microprocessado Master System
Gehaka. Medidas de pH foram realizadas utilizando pHmetro Digital PG1800. Para
remoo de partculas dos eletrodos e preparo de solues foi utilizado um ultra-som
Ultrasonic Cleaner 1450 USC.
Para determinao da massa de polmero foi utilizada uma balana com cinco casas
decimais, Shimadzu AUW220D.
Os produtos de PCR foram quantificados em um espectrofotmetro da Shimadzu UV-
1650PC com duplo feixe e amplificados em termociclador Modelo TC412, Techne,
Barloworld Scientific Ltd.
Os espectros de infravermelho das amostras foram obtidos atravs de FTIR (Fourier
Transforme Infrared) em um Perking Elmer Spectrum 1000 (figura 16A), resoluo de 4
cm-1
, em pastilha de KBr. As superfcies modificadas dos eletrodos foram analisadas em
microscpico de fora atmica Nanoscope IIIa da Digital Instruments (figura 16B).
31
A B
Figura 16. Equipamentos utilizados para os experimentos de infravermelho e para anlise
morfolgica dos eletrodos modificados. As anlises de MFA foram realizadas no Instituto de Fsica
USP/So Carlos.
4. Metodologia
4.1. Pr-tratamento dos eletrodos
O eletrodo auxiliar de platina foi aquecido at sua superfcie apresentar uma colorao
avermelhada indicando a remoo de resduos orgnicos na superfcie.
O eletrodo de trabalho de carbono grafite foi polido em uma politriz. Em seguida foi
polido em feltro, ambos contendo suspenso de alumina (0,30 m). Aps esse tratamento
os eletrodos foram levados a um ultra-som para remoo de partculas residuais de alumina.
4.2 Preparo de solues utilizadas
Todas as solues foram preparadas utilizando-se gua deionizada. Solues padro
contendo o par redox Fe2+/Fe3+ foram preparadas utilizando-se K3Fe(CN)6 (5x10
-3 mol.L-1
) /
K4Fe(CN)6 (5x10-3
mol.L-1
) em 0,1 mol.L-1
de KNO3.
A soluo do monmero 4-aminofenol (2,5x10-3 mol.L-1 ) foi preparada em soluo
aquosa de cido perclrico 0,5 mol.L-1.
32
Tampo de imobilizao do DNA (tampo TE) foi preparado com Tris-HCl 10x10-3
mol.L-1, pH 8,0, contendo EDTA 1x10-3 mol. L-1. Tampo de hibridao utilizado (tampo SSC) foi preparado com citrato de sdio 9x10 -
2 mol.L-1, pH 7,0 contendo NaCl 0,9 mol.L-1.
Tampo cido actico/acetato de sdio 0,1 mol.L-1, pH 4,5, e monofosfato/difosfato de
sdio 0,1 mol. L-1, pH 7,4, foram utilizados como eletrlitos para deteco eletroqumica
das biomolculas.
Solues de indicadores de hibridizao foram preparadas utilizando-se
ferrocenocarboxaldedo 4,8x10 -3 mol. L-1 diludo em metanol ou azul de metileno 20x10-3
mol. L-1 em NaCl 20 x 10-3 mol.L-1.
4.3. Voltametrias cclica e de pulso diferencial
Para as medidas eletroqumicas (voltametrias cclica e de pulso diferencial) a soluo de
eletrlito foi desoxigenada durante 1 hora utilizando-se N2 (g) grau analtico.
Os eletrodos polidos foram transferidos para a clula eletroqumica, contendo a soluo
com o par redox K3Fe(CN)6 / K4Fe(CN)6 previamente desoxigenada. Foram feitos
voltamogramas cclicos variando-se o potencial entre -0,10V a +0,50 V a uma velocidade
de varredura de 100mV. s-1.
Aps esse processo, os eletrodos foram lavados, secos e transferidos para uma clula
eletroqumica contendo o eletrlito suporte na ausncia do monmero. A velocidade de
varredura foi de 50 mV.s-1 em todos os experimentos.
A seguir, os eletrodos foram transferidos para a clula eletroqumica contendo o
monmero 4-aminofenol. A eletropolimerizao foi realizada com sucessivas varreduras
variando-se o potencial limite entre 0 a 0,64V vs. ECS a temperatura ambiente (251C).
Os eletrodos modificados foram, em seguida, transferidos para a clula eletroqumica
contendo o par redox K3Fe(CN)6 / K4Fe(CN)6 com o objetivo de analisar as diferenas
eletroqumicas no eletrodo modificado.
33
4.4. Microbalana eletroqumica de cristal de quartzo
O eletrodo de quartzo foi lavado com ter de petrleo, acetona e gua deionizada,
respectivamente e seco com nitrognio ultra-puro. Um tratamento eletroqumico foi
realizado antes da eletropolimerizao, variando o potencial entre -0,25 e +1,25V em uma
soluo de cido sulfrico 0,2 mol.L-1 para o polimento eletroqumico do eletrodo de ouro.
A solu