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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E CONSERVAÇÃO
AVALIAÇÃO MORFOMÉTRICA E MOLECULAR DE ABELHAS MANDAÇAIAS (Melipona spp.) DA REGIÃO DA FOZ DO RIO SÃO
FRANCISCO
Higor César Menezes Calasans
Mestrado Acadêmico
São Cristóvão Sergipe - Brasil
2012
HIGOR CÉSAR MENEZES CALASANS
AVALIAÇÃO MOLECULAR E MORFOMÉTRICA DE ABELHAS MANDAÇAIAS (Melipona spp.) DA REGIÃO DA FOZ DO RIO SÃO
FRANCISCO
Dissertação apresentada ao Núcleo de
Pós-Graduação em Ecologia e conservação,
Universidade Federal de Sergipe, como exigência
parcial para obtenção do Título de Mestre em
Ecologia e Conservação.
Orientador: Prof. Dr. Genésio T. Ribeiro
Co-orientador: Prof. Dr. Edilson D. de Araújo
São Cristóvão Sergipe - Brasil
2012
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
C143a Calasans, Higor César Menezes Avaliação molecular e morfométrica de abelhas
mandaçaias (Melípona spp.) da região da foz do rio São Francisco / Higor César Menezes Calasans ; orientador Genésio T. Ribeiro. – São Cristóvão, 2012. 52 f. ; il. Dissertação (Mestrado em Ecologia e Conservação)-Universidade Federal Sergipe, 2012.
1. Melípona quadrifasciata. 2. Morfometria animal. 3. Apicultura. 4. Distribuição espacial. I. Ribeiro, Genésio T., orient. II. Título.
CDU: 638.12
AGRADECIMENTO
Em primeiro lugar agradeço a Deus por ter me guiado e dado força
para iniciar e concluir mais um sonho.
Aos meus pais, Rasiel e Maria Bethânia, que sempre me apoiaram
nas decisões que tomei e encorajado nos momentos difíceis. Por confiarem
em mim e estarem sempre ao meu lado.
Aos meus irmãos, João Paulo e Thaís Regina, que também sempre
estão ao meu lado me ajudando e dando força.
A minha noiva e amiga Katiana que em todos os momentos, sejam
alegres ou tristes, fáceis ou difíceis, está por perto compartilhando o seu
carinho, amor, me encorajando, me dando forças para concluir mais este
sonho.
A toda a minha família, tios, avós, primos, que acreditaram e
acreditam em mim.
Aos amigos do Laboratório de Biologia Molecular (Sona, Jonatas,
Rosane, Sophia, Valdson, Ronaldo, Carina) pelo aprendizado e os bons
momentos que tivemos juntos.
Ao meu orientador, Genésio, que confiou em mim para execução
deste trabalho.
A um grande Amigo e co-orientador Edilson, com quem iniciei os
trabalhos de pesquisa, agradeço pelos ensinamentos e conselhos
dedicados durante todo este trabalho.
A ABECA (Associação Brejograndense de Criadores de Abelhas e
Artesãos) pela ajuda nos trabalhos de campo.
A todos os colegas de Mestrado da turma 2010.1 e 2010.2,
agradeço por todos os bons momentos que vivemos.
A UFS e ao núcleo de Pós-graduação em Ecologia e Conservação,
pela oportunidade de cursar o mestrado.
A FAPITEC pelo financiamento de projetos que subsidiaram este
trabalho.
Á CAPES pela bolsa concedida.
A todos que direta ou indiretamente ajudaram na execução deste
trabalho.
RESUMO
No gênero Melipona, a abelha Melipona quadrifasciata é uma das espécies mais conhecida e está dividida em duas subespécies M. q. quadrifasciata e M. q. anthidioides. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a identidade das abelhas mandaçaia do litoral norte do Estado de Sergipe por meio de técnicas moleculares e morfométrica, e verificar a possível barreira geográfica representada pelo Rio São Francisco. A pesquisa foi realizada em uma área total 30ha subdividida em três fragmentos nos municípios de Piaçabuçu – AL, Brejo Grande –SE e Ilha da Criminosa – SE. Foram registradas 14 colônias de mandaçaia em Brejo Grande e coletados 10 espécimes de cada colônia. Nenhum ninho foi localizado na Ilha da Criminosa e em Piaçabuçu, o que reforça a hipótese de que o Rio São Francisco poderia está representando uma barreira geográfica para a dispersão das colônias. A distribuição espacial de ninhos em uma escala de 10ha, pode ser considerada como aleatória. Na morfometria foram utilizadas as asas dos espécimes coletados e de 3 outras amostras identificadas de M. q. quadrifasciata, M. q. anthidioides e M. mandacaia. Os dados foram submetidos a Análises de Agrupamento, Análise de Componentes Principais, Análise de Variáveis Canônicas, Análise de Variância de Procrustes e teste de correlação de matrizes. As análises dos dados morfométricos são congruentes e apontaram a M. q. quadrifascita como a identidade da espécie coletada. A análise de validação cruzada e a correlação de matrizes não apresentou significância, denotando grande similaridade intrapopulacional. O DNA total de cada amostra foi submetido a análise de PCR/RFLP (enzimas: Taq I, Vsp I e Mbo II), identificando um único padrão de haplótipos para a população de abelhas da foz, evidenciando a grande similaridade genética. É importante ressaltar que todos os ninhos estavam localizados em coqueiros que seriam condenados pela baixa produção ocasionada pelos danos decorrente de pragas, além da baixíssima oferta de outros locais para nidificação, o que configura altíssimo risco de extinção populacional. Palavras-chave: Melipona quadrifasciata, Morfometria, Distribuição espacial, PCR/RFLP.
ABSTRACT
In the genus Melipona, a bee Melipona quadrifasciata is one of the best known species and is divided into two subspecies M. q. quadrifasciata and M. q. anthidioides. This study aimed to evaluate the identity of bees mandaçaia the northern coast of Sergipe through morphometric and molecular techniques, and verify the possible geographic barrier represented by the Rio São Francisco. The survey was conducted in a total area of 30ha subdivided into three fragments in the municipalities of Piaçabuçu - AL, Brejo Grande – SE, Ilha da Criminosa - SE. Were recorded in 14 colonies mandaçaia Brejo Grande and collected 10 specimens of each colony. No nest was located on the Ilha da Criminosa and Piaçabuçu, which reinforces the hypothesis that the Rio São Francisco could're representing a geographical barrier to the spread of the colonies. The spatial distribution of nests on a scale of 10ha, can be considered as random. Morphometry were used in the wings of the specimens collected and identified three other specimens of M. q. quadrifasciata, M. q. anthidioides and M. mandacaia. The data were subjected to cluster analyzes, principal component analysis, canonical variate analysis, Procrustes analysis of variance test and correlation matrices. Analyses of morphometric data are congruent and identified the M. q. quadrifascita as the identity of the species collected. The analysis of cross-validation and correlation matrices showed no significance, showing great similarity intrapopulation. Total DNA from each sample was subjected to analysis of PCR / RFLP (enzymes: Taq I, Vsp I and Mbo II), identifying a unique pattern of haplotypes for the bee population of the mouth, showing the high genetic similarity. All nests were located in palm trees that would be condemned by the low production due to damage caused by pests, besides the very low supply of other sites for nesting, which sets very high risk of population extinction.
Keywords: Melipona quadrifasciata, Geometric morphometry, Spatial distribution,
PCR / RFLP.
SUMÁRIO
RESUMO .........................................................................................................................
ABSTRACT .....................................................................................................................
1 - INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 9
1.1 - Sobre Melipona spp. ......................................................................................... 9
1.2 - Técnicas Moleculares ...................................................................................... 15
1.3 – A morfometria Geométrica .............................................................................. 16
1.4 – A região da foz do Rio São Francisco ............................................................ 19
2 – OBJETIVOS .......................................................................................................... 21
2.1 - Geral ............................................................................................................... 21
2.2 - Específico ....................................................................................................... 21
3 – MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 22
3.1 – Área de Estudo ............................................................................................... 22
3.2 – Coleta de material .......................................................................................... 23
3.3 – Análises moleculares ..................................................................................... 23
3.3.1 - Extração de DNA ....................................................................................... 23
3.3.2 - Identificação Genética das espécies pelo método PCR/RFLP ............... 25
3.4 – Análise morfométrica ..................................................................................... 26
3.5 – Padrão de distribuição espacial dos ninhos ................................................... 28
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 30
4.1 – Identidade e estrutura populacional ................................................................ 30
4.2 – Distribuição espacial dos ninhos ................................................................... 40
5 – CONCLUSÃO ....................................................................................................... 44
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 46
9
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – Sobre o gênero Melipona.
As abelhas da tribo Meliponini estão entre as mais diversificadas em sua
morfologia e comportamento biológico dentre as abelhas eussociais, sendo
denominadas popularmente como abelhas sem ferrão, por possuírem ferrão
atrofiado. Essas abelhas são altamente diversificadas na região neotropical, com
aproximadamente 55 gêneros e cerca de 350 espécies (MICHENER, 2000). São
abelhas que vão de minúsculas a médias, em geral robustas, que de maneira geral
desempenham importantes funções ecológicas, especialmente como polinizadoras.
Todas as espécies do gênero Melipona Illiger (1806), são eussociais, embora
algumas delas apresentem comportamento de pilhagem de colônias de outras
espécies (SILVEIRA et al., 2002). A Melipona quadrifasciata é uma das espécies
mais conhecida deste gênero e é denominada popularmente por Mandaçaia, nome
que tem origem indígena que significa vigia bonito (manda: vigia; çai: bonito),
derivado do comportamento dessa espécie em manter uma abelha presente na
entrada do ninho vigiando a colmeia. A Mandaçaia está dividida em duas
subespécies Melipona quadrifasciata quadrifasciata (Lepeletier) e Melipona
quadrifasciata anthidioides (Lepeletier) (MOURE e KERR, 1950).
A identificação morfológica da M. q. quadrifasciata e da M. q. anthidioides
é feita pelo padrão de bandas tergais amarelas e contínuas (três a cinco bandas) do
3º ao 6º segmento em operárias e machos de M. q. quadrifasciata, e bandas
interrompidas (de duas a cinco bandas), em M. q. anthidioides (SCHWARZ, 1948),
(observar Figura 1).
10
Figura 1: Padrão de bandas tergais de abelhas Mandaçaia. A Melipona mandacaia; B – Melipona quadrifasciata anthidioides; C – Melipona quadrifasciata quadrifasciata.
Os Meliponíneos ocupam grande parte da região tropical do planeta, mas
ocorrem também em regiões de clima temperado subtropical (NOGUEIRA-NETO,
1997). Cerca de 40 espécies de melíponas estão distribuídas do México até a
Argentina (CAMARGO, 1979; MICHENER, 2000). A M. quadrifasciata segundo
Camargo e Pedro (2008) está distribuída na região neotropical, Argentina, Paraguai
e Brasil nos Estados de Alagoas, Bahia, Espírito Santo, Goiás, Mato Grosso do Sul,
Minas Gerais, Paraná, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro,
Santa Catarina, Sergipe e São Paulo. Tratando-se das duas subespécies de M.
quadrifasciata, Waldschmidt et al., (2000) e Batalha-Filho et al., (2009) relataram a
ocorrência da subespécie M. q. quadrifasciata no Estado de Sergipe, informação
conflitante com Camargo e Pedro (2008) que citam a ocorrência da M. q.
anthidioides em Sergipe e a ausência de M. q. quadrifasciata.
Regiões com a ocorrência das duas subespécies de M. quadrifasciata são
encontradas entre os Estados de São Paulo e Minas Gerais caracterizadas pela
formação de indivíduos com fenótipos intermediários para o padrão de bandas
tergais, fato amplamente divulgado na literatura científica (MOURE e KERR, 1950;
MOURE, 1975; MELO; CAMPOS, 1987; SOUZA et al., 2008). Batalha-Filho et al.
(2009) também relatou que na região central do Estado de São Paulo observou
padrões de listas tergais com formas híbridas entre M. q. anthidioides e M. q.
quadrifasciata.
11
A fim de diferenciar as subespécies de M. quadrifasciata, Waldschmidt et
al., (2000) utilizaram padrões moleculares de RAPD para as espécies de M. q.
quadrifasciata e M. q. anthidioides que apresentavam padrões divergentes. Porém
indivíduos fenotipicamente parecidos com M. q. quadrifasciata do norte do Estado de
Minas Gerais não apresentavam esse mesmo padrão, indicando um possível local
de hibridização (WALDSCHMIDT et al, 2002).
Apesar da ocorrência de espécies de mandaçaia no Estado de Sergipe,
poucos estudos foram desenvolvidos com essas abelhas nessa região. Souza et al
(2006) relataram a ocorrência de M. q. quadrifasciata em Brejo Grande, município
sergipano localizado na região da foz do rio São Francisco, na qual predominam
áreas de coqueirais distribuídas em regiões de restinga. Esses autores encontraram
ninhos localizados em troncos de coqueiro (Cocos nucifera), provavelmente pela
inexistência de outros locais para nidificação (Souza et aI., 2006).
A biogeografia das espécies também pode ser modificada por ações
antrópicas em função do grande potencial do homem em causar impactos nas
comunidades locais de abelhas, em função da eliminação de fontes de alimento,
destruição de substratos de nidificação, especialmente na medida em que esta
ocupação se estende por grandes regiões (SILVEIRA, 2002).
Algumas espécies de Melipona e de outros meliponíneos constroem seus
ninhos somente em ocos de árvores vivas e são bem sensíveis ao desmatamento
(ZANELLA et al., 2003). O processo de escolha de um novo local de nidificação
inicia-se quando a colônia está bem desenvolvida e em condições para a formação
de um novo ninho. Assim começa a atividade de enxameagem a procura de um
novo local de nidificação. Neste período é possível perceber um grupo de operárias
à procura de local para estabelecer uma nova colônia (KERR et al, 1996). Oco de
árvores, paredes ou pedras são os principais locais para nidificação. Para a sua
criação é comum o uso de cortiços e/ou caixas racionais (CARVALHO et al., 2003).
Nas mandaçaias a entrada do ninho é construída com geoprópolis (mistura de barro
com resina de plantas), apresentando um orifício com diâmetro suficiente para a
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passagem de uma única abelha por vez, e geralmente ornamentado com sulcos
radiais (NUNES et al., 2007).
Nas espécies generalistas, como os Meliponini, os indivíduos têm
habilidade física, fisiológica e comportamental para visitar vários tipos de flores,
sendo numericamente dominantes entre os insetos visitantes florais (RAMALHO,
2004). As abelhas sem ferrão coletam o pólen e néctar saindo à procura de flores
poliníferas e nectaríferas, deixando uma pequena trilha de cheiro na fonte de
alimento encontrada. As campeiras chegam a colônia e distribuem alimentos para as
outras operárias emitindo sons que indicam a distância da fonte, nesta a operária
marca a flor com uma secreção glandular identificando a fonte de alimento (KERR et
al, 1996).
A atividade de forrageio das melíponas sofre influência de diversos fatores
abióticos, que isolados ou em conjunto, afetam a atividade de voo, tais como a
temperatura, umidade relativa, a intensidade luminosa e a velocidade do vento
(KLEINERT et al, 2009). Para os meliponíneos, há duas premissas para o forrageio:
o deslocamento com ponto central, isto é, a colônia, e a necessidade de voltar a
essa, o que torna crítico o equacionamento do custo de forrageio associado à
distância da fonte floral. Para esses forrageadores tão pequenos, com consumo
elevado de energia durante o voo, a distância de forrageamento depende da
capacidade de estoque de néctar no papo (KLEINERT et al., 2009).
O surgimento de um novo ninho de M. quadrifasciata é gradativo e a
colônia “filha” fica dependente da colônia mãe por algum tempo, até que o novo
ninho fique estruturado e independente para a sobrevivência. Dessa forma a
proximidade entre a colônia mãe e filha é fundamental, pois quando o ninho estiver
pronto para receber a nova rainha ela migra da colônia mãe para o novo local onde
se desenvolverá a colônia filha; com ela partem mais operárias e, finalmente, a
colônia se estabelece independentemente da colônia mãe (AIDAR, 1996).
Um comportamento importante nas colmeias de Melipona é que a rainha
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fisogástrica possui o abdome muito desenvolvido, o que a torna muito pesada para
voar. Esse aspecto gera restrições diretas no padrão de dispersão das populações
(GILLOTT, 1980). Ainda que a distância máxima de voo dessas espécies esteja na
faixa de dois quilômetros de raio ao redor da colônia, a fundação de novos ninhos é
limitada a poucas centenas de metros ao redor da colônia mãe, diferente do
processo de nidificação no gênero Apis, por exemplo, onde a enxameagem é
realizada por um grande número de operárias juntamente com a rainha antiga e
pode se deslocar por muitos quilômetros (ARAÚJO, 1997).
Diversos autores consideram M. quadrifasciata uma espécie generalista.
Antonini et al. (2006), em pesquisa realizada em uma área preservada no Estado de
Minas Gerais, verificaram a coleta de pólen por M. quadrifasciata em 19 espécies de
planta, dados que concordam com Absy et al. (1984) que analisaram o pólen
coletado em diversos ninhos de Melipona, tendo constatado a utilização de mais de
10 espécies de plantas.
Os meliponíneos por serem espécies generalistas exercem bastante
influencia no sucesso reprodutível das árvores da Mata Atlântica, desempenhando
um papel relevante na regeneração natural da floresta (RAMALHO, 2004). Segundo
Kerr (1994), de 40 a 90% das árvores das florestas tropicais são polinizadas por
meliponíneos. Essas espécies desempenham um importante papel como agentes
polinizadores em diversos ecossistemas brasileiros (KERR, 1987; NOGUEIRA-
NETO, 1997; TAVARES et al., 1999; SILVEIRA et al., 2002 ).
Em função da grande fragmentação florestal, algumas populações de
meliponíneos estão isoladas devido a grande distância entre estes fragmentos,
comprometendo a diversidade gênica das abelhas e reduzindo a disponibilidade dos
recursos tróficos, o que pode levar à perda de colônias naturais (CARVALHO et al.,
2003). Segundo Araujo et al. (2004) algumas espécies de Melipona encontram-se
ameaçadas de extinção, especialmente pela perda de pequenas populações locais
por efeito de deriva genética, quase sempre relacionada a pressões antrópicas.
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Ao longo de várias gerações as frequências alélicas populacionais flutuam
de uma geração para outra por efeito de deriva genética, um efeito estocástico
relacionado diretamente ao tamanho efetivo das populações, ocasionando nos
demes a perda da diversidade genética e fixação de alelos dentro da população e,
consequentemente, redução do potencial evolutivo. Além da deriva genética, a
endogamia – cruzamento de indivíduos aparentados – também é um fator que
contribui para a diminuição da variabilidade genética em pequenas populações
locais, o que provoca o aumento de similaridade dos indivíduos de uma população,
elevando a homozigozidade (FRANKHAM et al., 2008).
Efeitos da seleção natural sobre populações locais também devem ser
considerados em estudos que avaliam a estrutura genética populacional. Em
populações fechadas as frequências alélicas mudam predominantemente através da
seleção e deriva genética. Em populações pequenas a deriva genética é a força
dominante que causa mudanças na frequência alélica, mesmo sujeitos à seleção
natural (FRANKHAM et al., 2008).
Na estrutura genética dos meliponíneos, assim como nos demais
himenópteros, os machos são geralmente haplóides e as fêmeas diplóides,
fenômeno denominado haplodiploidia, em que os machos são originados
partenogeneticamente pela fêmea (partenogênese arrenótoca) (KERR, 1950). No
entanto, uma exceção a essa regra é determinada por conta de um locus
denominado Xo que, quando em homozigose (xo¹xo¹, por exemplo), induz ao
desenvolvimento de machos diploides. Então se uma rainha de Melipona com alelos
sexuais xo¹xo² acasalar com um macho xo¹ ou xo², terá 50% de sua prole diploide
composta por machos (KERR, 1987; NASCIMENTO, 1996). De tal modo que estes
machos inviáveis para a colônia são eliminados pelas operárias e, em alguns casos
com grande produção de machos diploides, as rainhas também são sacrificadas
(Kerr et al., 1996).
Em Meliponini, a deriva genética é um fator importante na perda de
populações locais, uma vez que as populações de Melipona são sensíveis à deriva
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genética especificamente pela homozigose no locus Xo de determinação sexual
(CARVALHO et al., 1995; ARAÚJO, 2002; 2004). A perda de alelos e extinção de
populações locais foi documentada por Kerr e Vencovsky (1982), que concluíram
que uma população de Melipona deveria conter no mínimo 44 colônias para reverter
o risco de uma rápida extinção.
A avaliação da variabilidade genética da espécie é um importante
parâmetro para a definição de programas de manejo e conservação de espécies,
principalmente para aquelas sob forte pressão antrópica. Além disso, a baixa
diversidade genética geralmente leva ao aumento dos níveis de endogamia, o que
pode reduzir a aptidão de indivíduos e populações. Uma avaliação da diversidade
genética é, portanto, central para a genética de populações e tem muito importantes
aplicações em biologia da conservação (FREELAND, 2005).
1.2 – Técnicas Moleculares
Os grandes avanços na biologia molecular nas últimas décadas
permitiram o desenvolvimento de uma variedade de métodos que auxiliam as
pesquisas em genética da conservação. Dentre as técnicas moleculares com base
na reação de cadeia de polimerase (PCR), a técnica RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism) atualmente vem sendo empregada em estudos genéticos
pela detecção de polimorfismo de tamanho de fragmentos utilizando enzimas de
restrição. De acordo com Ferreira e Grattapaglia (1998) os marcadores obtidos com
base em RFLP possuem expressão co-dominante, ou seja, em cada loco estudado
é possível identificar genótipos heterozigóticos e homozigoticos.
A técnica PCR consiste, fundamentalmente, na amplificação de
fragmentos de DNA. Para este procedimento, utiliza-se um equipamento conhecido
como termociclador, que submete a amostra e reagente a ciclos subsequentes de
temperatura variáveis, que permitem a desnaturação da molécula de DNA, o
anelamento dos primers e a extensão da síntese de uma nova fita catalisada por
16
uma enzima DNA Polimerase termoresistente (TORRES et al., 2004).
Francisco et al (2001) utilizaram 17 enzimas de restrição para
caracterizar, cinco espécies de Plebeia, utilizando marcadores PCR/RFLP, sendo
identificados 30 sítios específicos de restrição, demonstrando alta variabilidade
genética entre as espécies analisadas. Souza et al (2008) utilizaram o método de
PCR/RFLP com cinco enzimas de restrição (Bgl II, Dra I, Mbo I, Taq I and Vsp I)
para identificar um marcador genético para subespécies e detecção de colônias
hibridas de Melipona quadrifasciata. Estes autores concluíram que apenas a enzima
Vsp I apresentou padrão de restrição capaz de diferenciar M. q. quadrifasciata de
M. q. anthidioides. No entanto, Morreto e Arias (2005) conseguiram identificar
padrões de restrição diferentes entre as duas subespécies com a enzima Bgl II.
1.3 – A morfometria Geométrica
A análise morfométrica é utilizada para avaliar os padrões de variação
geográfica e diferenciação intraespecífica em abelhas (RUTTNER, 1988). A
definição da forma de uma estrutura biológica é regida por processos que operam
em diferentes escalas e níveis organizacionais de complexidade. O aspecto
fenotípico macroscópico de uma estrutura biológica é, portanto, o resultado das
interações entre regras morfogenéticas e os mecanismos extrínsecos relacionados
aos fenômenos ecológicos e às forças evolutivas estocásticas e/ou determinísticas
(LEVIN, 1992).
Os ecólogos discutem que a forma e o tamanho de um organismo, devem
caracterizar os aspectos como alimentação, microhabitat, pressão seletiva,
competição e predação, visto que a forma e o tamanho de um organismo é o
resultado de sua evolução. Os geneticistas estimam a hereditariedade de caracteres
morfométricos, pois podem quantificar e separar as influências genotípicas das
ambientais sob o fenótipo de uma população (PERES et al., 1995).
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Estimativas de herdabilidade para caracteres morfológicos, utilizando
diversas metodologias, têm se mostrado elevados, especialmente para os caracteres
de tamanho (h2>0,6) o que demonstra que tais caracteres são bons indicadores de
processos evolutivos atuando nas populações de abelhas (DINIZ-FILHO e BINI,
1994), e que possuem elevado componente genético para avaliar as estruturas
populacionais (DINIZ-FILHO e PIGINATA ,1994). As asas dos insetos são estruturas
laminares ótimas para análise morfométrica bidimensional, uma vez que são planas,
possibilitando a obtenção de grande parte das informações (NUNES et al., 2007).
Outro fator bastante positivo, do ponto de vista analítico, é a presença de diversos
marcos anatômicos presentes, principalmente, nas interseções entre as nervuras.
Pouco se sabe, no entanto, sobre as implicações funcionais da variação morfológica
das asas nos insetos (GRODNITSKY, 2000).
Nos meliponíneos a maior parte da variação morfológica ocorre de forma
independente, já que em abelhas sociais o tamanho do corpo das operárias é
explicado pela adaptação relacionada a atividade de forrageio e exploração de
recursos florais (BAUMGARTNER e ROUBIK, 1989).
Durante o rápido desenvolvimento da morfometria geométrica, nas três
últimas décadas, tornou-se mais consistente teórica e tecnicamente. Questões como
“qual seria o melhor método para a remoção do efeito do tamanho generalizado”
passaram a ser problemas do passado, uma vez que as técnicas de morfometria
geométrica removem instantaneamente os efeitos de tamanho. Inicialmente um dos
problemas em se utilizar estas novas técnicas eram as dificuldades matemáticas e
computacionais subjacentes (ROHLF e BOOKSTEIN, 1987). No entanto, nos últimos
anos, diversos programas para microcomputadores foram desenvolvidos e são
disponibilizados gratuitamente. Além disso, o volume de informações bibliográficas
sobre morfometria geométrica vem aumentando gradativamente, expondo de forma
adequada a teoria, métodos e aplicações em investigações biológicas (MONTEIRO
e REIS, 1999).
Entre os métodos diretos utilizados, se destaca a utilização de marcos
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anatômicos para representar as formas de uma maneira compreensiva por meio
dados numéricos médios. Os dados podem ser obtidos através de coordenadas
médias de marcos distribuídos perifericamente, ou dentro das estruturas
analisadas, ou ainda por meio das distâncias entre marcos anatômicos escolhidos
diretamente para cada espécie (DI MARÉ e CORSEUIL, 2004). Estas coordenadas
possibilitam a utilização de várias ferramentas estatísticas, como análise de
componentes principais, de variáveis canônicas, ANOVA (analysis of variance –
análise de variância), MANOVA dentre outros, e a escolha vai depender dos
objetivos do estudo.
Para detectar padrões entre indivíduos ou conjunto de variáveis a ACP
(análise de componentes principais) transforma o conjunto de variáveis originais em
um novo conjunto de dados, os quais são deduzidos em ordem decrescente de
importância, sendo que o primeiro componente contém o máximo possível de
variação dos dados originais (MONTEIRO e REIS, 1999). No caso da análise de
variáveis canônicas (AVC) os dados são trabalhados com a delimitação de grupos.
Dessa forma segundo Monteiro e Reis (1999) a AVC constrói uma matriz que
quantifica a variação dentro do grupo e entre os grupos, objetivando maximizar a
variação entre os grupos relativa à variação dentro dos grupos.
Em análises realizadas por Silva (2006) para o gênero Plebeia,
estudando seis espécies diferentes, foi observada uma grande divergência dentro
dos grupos, sendo possível a diferenciação de 93,4% dos indivíduos corretamente
nos testes de validação cruzada. A técnica morfométrica também demonstrou ser
eficiente na discriminação de indivíduos de diferentes populações de Nannotrigona
testaceicornis (MENDES et al., 2007).
Nunes et al. (2008), por meio de análise morfométrica, estudaram
populações de Melipona quadrifasciata da região semiárida da Bahia, identificando
três grupos distintos de acordo com a distribuição geografica. Os autores ainda
concluíram que não existia divergência genética significativa entre estas
populações.
19
O crescente interesse de pesquisadores na utilização de técnicas
moleculares tem provocado uma redução no número de pesquisadores na área de
morfometria. No entanto, a morfometria geométrica exige menor investimento
laboratorial, baixo custo de análise, especialmente pelo desenvolvimento de vários
softwares gratuitos, usados na identificação de espécimes, em estudos de variação
populacional, biogeografia, evolução, assimetria flutuante, além do crescente
número de estudos associando dados moleculares com morfometria geométrica
(ARAUJO, 2010).
1.4 – A região da foz do Rio São Francisco
A região da foz do Rio São Francisco corresponde à região dos
municípios de Brejo Grande e Pacatuba no Estado de Sergipe e Piaçabuçu no
Estado de Alagoas. O litoral norte do Estado de Sergipe é caracterizado por
ecossistemas de dunas, restingas, manguezais, ilhas e lagoas; além de possuir
remanescentes de Mata Atlântica, especialmente na APA (área de proteção
ambiental) Litoral Norte, área de conservação que faz sobreposição com a área da
Rebio (Reserva Biológica Santa Isabel) e compreende um trecho de 10Km de
largura delimitados pelos Rios Japaratuba e São Francisco (SILVA e SOUZA, 2010).
No município de Brejo Grande a vegetação está representada por
espécies pertencentes às formações pioneiras, apresentando recursos florísticos
com espécies típicas, características dos ambientes de Áreas de Influência Marinha
(Restinga), de Influência Fluviomarinha (Mangue) e de Influência Fluvial (ALVES et
al., 2007). A predominância de monocultura de coco e pecuária, além do grande
cultivo de arroz, vem alterando a paisagem da região. Projetos em tecnologias
sociais estão possibilitando na região de Brejo Grande a inserção de trabalhos com
meliponíneos (meliponicultura), visto que membros da comunidade local já possuem
conhecimentos de apicultura, com a produção de mel e pólen apícola.
Piaçabuçu, município alagoano também pertencente à região da foz do
Rio São Francisco, e Brejo Grande –SE, possuem áreas fitoecológicas similares,
20
com uma floresta estacional decidual. Sua área de cobertura encontra-se bastante
descaracterizada em sua originalidade, seja no total desmatamento para o cultivo de
coqueirais, fazendas e currais privativos do gado bovino. Caracteriza-se também por
uma sucessão de interflúvios alinhados pelo Nordeste/Sudeste, e ligeiramente em
forma de “S”, mantendo-se a 3m acima do nível do mar, com decaimento no sentido
interior/litoral. Tanto esse suave declínio quanto a sucessão de interflúvios (cordões),
indicam o recuo paulatino do nível do mar, na sua última fase regressiva ocorrida no
quaternário (SOUZA, 2000). Em Piaçabuçu encontra-se a APA de Piaçabuçu, área
de conservação ambiental de importante relevância para a Região.
O fato de todos os ninhos de mandaçaia encontrados na região da foz do
rio São Francisco por Souza et al (2006) estarem localizados em troncos de coqueiro
gera grande preocupação em termos de conservação, em função dos seguintes
aspectos: 1 – coqueiros antigos são geralmente substituídos por novos, visando o
aumento da produtividade mediante o controle da broca do coqueiro e doenças por
eles transmitida, reduzindo dessa forma os locais de nidificação das abelhas
mandaçaia; 2 – a existência de número populacional expressivo de abelhas
mandaçaia na região evidenciada pela detecção de 13 ninhos em 90 coqueiros
investigados; 3 – apesar dessas abelhas terem sido identificadas como M. q.
quadrifasciata, o padrão de bandas tergais não coincide totalmente com o padrão
esperado para essa subespécie; 4 – em se tratando de uma região delimitada por
um rio de grande porte e por nenhum estudo ter sido realizado com abelhas
mandaçaia na região da foz do rio São Francisco em sua margem pertencente ao
Estado de Alagoas, não se sabe se o rio representaria uma barreira geográfica para
essa espécie; 5 – ações de conservação e uso racional para essas abelhas ainda
não foram empreendidos na região e só poderiam ser realizados de forma
sustentável com o conhecimento das populações de abelhas e das demais variáveis
relacionadas a sua conservação, incluindo as populações humanas e uso do solo da
região.
21
2 – OBJETIVOS
2.1 – Geral
Avaliar a identidade das populações de abelhas mandaçaia (Melipona
spp.) do litoral norte do Estado de Sergipe por meio de técnicas moleculares e
morfométricas, e verificar a possível barreira geográfica representada pelo Rio São
Francisco; como subsidio para a conservação e ampliação do conhecimento sobre o
grupo no Estado de Sergipe.
2.2– Específicos
i - Avaliar a identidade das abelhas, com base em critérios morfológicos
(morfometria geométrica) e moleculares(PCR/RFLP);
ii - Avaliar a ocorrência e a distribuição espacial dos ninhos de Melipona spp.
em uma área de 30 hectares;
iii - Verificar, a possível barreira geográfica representada pelo Rio São
Francisco para as espécies desse gênero;
22
3 – MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Área de Estudo
O primeiro local de estudo está localizado no povoado Cabeço, no
município Brejo Grande (Latitude: S 10°28’471”, Longitude: O 36°26’212”), localizado
à margem do Rio São Francisco em Sergipe, numa região típica de restinga e
coqueirais (Cocos nucifera L.).
O segundo ponto de coleta está localizado no município de Piaçabuçu -
AL (Latitude: S 10°26’960”, Longitude: O 36º24’806”), e um ponto intermediário
formado pela Ilha da Criminosa (Latitude: S 10°28’470”, Longitude: O 36º24’687”)
localizada entre Brejo Grande e Piaçabuçu, ainda no território de Sergipe. Os pontos
localizados na ilha apresentam fisionomia distinta da região de Brejo Grande e
Piaçabuçu, sendo formados principalmente por terrenos alagados caracterizados
como várzeas, utilizadas pelos moradores locais atualmente para o plantio de
coqueiros (nas regiões elevadas) e cobertas por aningas (Montrichardia arborescens
L.) nas regiões mais baixas, sendo também historicamente utilizadas para o plantio
de arroz com técnicas de represamento.
Figura 2: Região da Foz do Rio São Francisco evidenciando os três pontos de coleta: Brejo
Grande - SE, Ilha da Criminosa - SE e Piaçabuçu - AL.
23
3.2 – Coleta de material
A busca por ninhos foi feita em uma área total de aproximadamente 30
hectares distribuídos nas três localidades mencionadas. O procedimento de
rastreamento foi percorrendo os troncos de coqueiro e outros potenciais locais de
nidificação ao longo da área delimitada previamente, utilizando o mesmo esforço
amostral (03 rastreadores). Cada colônia foi georreferenciada e 10 espécimes foram
coletadas com o auxilio de rede entomológica e registrado as características de
atividade, morfologia e altura dos ninhos.
Foram capturadas 10 operárias de cada ninho. As abelhas capturadas
foram colocadas em recipientes numerados, para representar cada colônia,
contendo álcool 70% para a conservação do material. No retorno ao laboratório
todos os recipientes foram refrigerados a -20ºC em freezer e mantidos assim até a
extração de DNA.
3.3 - Análises moleculares
3.3.1 - Extração de DNA
Para as análises moleculares da população da foz do Rio São Francisco
foram utilizados 10 indivíduos de cada colônia. Para efeito de comparação foram
obtidos 10 espécimes de M. mandacaia, M. q. quadrifasciata e M. quadrifasciata
anthidioides, junto a Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, em Cruz das
Almas - BA.
Com base no protocolo de Waldschmidt et al (1997) para procedimento de
extração de DNA utilizou-se uma operária adulta conservada em microtubo com 1,5
mL em álcool 70% e acondicionada em freezer –20oC, posteriormente foi extraído o
abdome e asas, em seguida o material foi macerado com pistilos e homogeneizado
com tampão de extração (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, contendo 2% CTAB, 1,4 M
NaCl, 20 mM EDTA e 100 µg/ml proteinase K). As amostras foram desproteinizadas
24
duas vezes com fenol-clorofórmio (proporção 1:1). Após a desproteinização as
amostras foram centrifugadas a 12000 rpm por 5 minutos. O ácido nucléico foi
precipitado pela adição de um volume de isopropanol frio (proporção 1:1) e incubado
a -20°C por 30 minutos. Em seguida centrifugou-se a 12.000 rpm por 30 minutos,
formando o pelet no fundo do tubo, o qual foi lavado com álcool 70% e ressuspenso
em 25 µL de TE (10 nM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA PH-8); e armazenado a -20°C.
Para verificar da integridade do DNA extraído (Figura 3) foi utilizado 1µL
da solução de DNA, 9µL de água ultra pura e 2µL de corante BlueOrange para cada
amostra, submetidos a eletroforese com TBE 1X (89mM Tris-base, 89mM ácido
bórico e 2mM EDTA dissódico) em gel de Agarose (0,8%) juntamente com o padrão
de peso molecular LowRanger 100bp (Norgen®).
Figura 3: Ilustração do gel de agarose (0,8%) para verificação da integridade de DNA com Marcador
de peso molecular e sentido da corrente elétrica.
A quantificação do DNA foi feita por meio de método colorimétrico usando
o nanocolorímetro Qubit (Invitrogen ®) utilizando 1µL de solução com DNA extraído
diluída em 199 µL de mix preparado com Buffers BrodRanger que acompanham o kit
do Qubit. Após quantificação a solução de DNA de cada amostra foi padronizada a
25
concentração de aproximadamente 35 ng/µL.
3.3.2 - Identificação Genética das espécies pelo método PCR/RFLP
A partir do DNA purificado e quantificado foi realizada uma reação de
amplificação por PCR específica para a região mitocondrial do gene citocromo b
usando os primers 5'-TATGTACTACCATGAGGACAAATATC-3'(forward) e 5'-
ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT-3' (reverse) descritos por Crozier et al.
(1991). As reações foram desenvolvidas em um volume final de 30µL contendo
1,5µL de cada primer (concentração 5µM), 15 μL de Taq Master Mix RED com
1,5mM MgCl2 (Amplicon ®), 10,5µL de água ultra pura e 1,5µL de DNA extraído a
concentração de 35ng/µL. Os ciclos de amplificação foram repetidos 45 vezes
seguindo o protocolo básico de 15 segundos a 94°C para desnaturação, 30
segundos a 37°C para anelamento dos primers e 1 minuto a 72°C para extensão,
precedido de um estágio de dois minutos a 94ºC e finalizado a um estágio de 5
minutos a 72°C. A digestão dos produtos de amplificação do mtDNA do gene
citocromo b foi realizada utilizando 20µL para o volume total da reação, utilizando
4µL do produto de PCR e 6 unidades das enzimas de restrição em tampão
apropriado. A digestão enzimática ocorreu durante 2 horas a 37°C com duas
enzimas de restrição (Mbo II, e Vsp I) e 2 horas a 65°C com a enzima Taq I. Os
fragmentos foram submetidos a eletroforese em Tampão TBE (Tris-borato 89mM,
EDTA 2mM, pH 8,0) e em gel de agarose a 2%, a 100V . Em seguida, o gel foi
corado em solução de TBE 1X com brometo de etídio e revelados em transluminador
(sob luz UV) e fotografados por sistema de foto-documentação.
A seleção das bandas e identificação do peso molecular foi realizada no
softwate GelAnalizer versão 2010 (LAZAR, 2010).
26
3.4 - Análises morfométricas
Para as análises morfométricas também foram utilizados10 indivíduos de
cada colônia; foi isolada a asa esquerda anterior de cada espécime (Figura 4),
utilizando tesoura e pinças entomológicas. Sob estereomicroscópio essas asas
foram montadas em lâminas identificadas com os dados referentes às amostras. As
fotomicrografias digitais das asas anteriores foram organizadas no software TpsUtil e
mensuradas utilizando o programa TpsDig2 versão 2.10 (ROHLF, 2006). A escolha
das estruturas anatômicas para esta análise foi realizada levando-se em conta a
forma geométrica da estrutura que pudesse ser bem apresentada num plano
bidimensional (Figura 5).
Figura 4: Asa anterior esquerda de Melipona coletada em Brejo Grande - SE
Figura 5 - Morfologia da asa esquerda anterior com os marcos anatômicos utilizados nas análises
morfométricas.
27
Os marcos anatômicos foram transformados em coordenadas cartesianas
e analisados pelo método de superposição ortogonal pelos quadrados mínimos. As
coordenadas cartesianas dos marcos anatômicos de cada conjunto amostral foram
adquiridas e salvas, usando-se o programa TpsDig2 (ROHLF, 2006).
Estas coordenadas foram reajustadas por superposição ortogonal por
meio de configurações de critério dos quadrados mínimos utilizando o programa
MorphoJ (KLINGENBERG, 2008). A técnica utilizada para superposição minimiza a
soma do quadrado das distâncias entre os marcos anatômicos homólogos, por
parâmetros que rotacionam, transladam e proporcionalizam as configurações. A
partir das coordenadas resultantes foram obtidas as formas médias para cada
unidade amostral.
Após os ajustes de tamanho, posição e orientação realizados, e geração
de uma matriz de Covariância foi realizada a análise de Componentes Principais e
uma Análise de Variáveis Canônicas para identificação de grupos com base na
utilização de dez espécimes de M. mandacaia, M. q. quadrifasciata e M.
quadrifasciata anthidioides, fornecidas pela Universidade Federal do Recôncavo da
Bahia, em Cruz das Almas – BA comparadas às melíponas da região da foz do Rio
São Francisco. Além da constituição de grupos, o grau de diversidade populacional
foi observado pela Análise de variáveis canônicas. Para identificar a existência de
diferença entre os grupos, para o tamanho e forma dos indivíduos, foram realizadas
análises de variância (ANOVA) de Procrustes.
Uma análise de validação cruzada entre os scores de Componentes
principais e Variáveis canônicas, foi realizada com software Estatística R (R
DEVELOPMENT CORE TEAM, 2008) possibilitando verificar a correlação de
indivíduos com seus respectivos ninhos.
Utilizando o programa NTSYSpc (ROHLF, 2000), foi aplicado o teste de
Mantel para correlação, utilizando-se as matrizes de distâncias de forma de
Procrustes, e as distâncias geográficas entre as colônias. As matrizes de distâncias
28
de Procrustes entre as colônias foram também analisadas pelo método de
agrupamento UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean), que
resultou em arranjos a partir das distâncias de forma das asas entre as colônias, e
foi considerado nas análises desde que atinja coeficiente de correlação cofenética
igual ou superior a 0,7.
3.5 - Padrão de distribuição espacial dos ninhos
Após o completo rastreamento de cada área e marcação dos ninhos,
foram tomadas as distância entre ninhos e criada uma matriz triangular das
distâncias. A qual foi utilizada para análise de correlação de Mantel.
O padrão de agregação dos ninhos de mandaçaia foi determinado
calculando-se o índice de agregação (R) por meio do método do vizinho mais
próximo para testar a variação do Índice de Agregação (R) de Clark e Evans (1954),
que mede o desvio entre o afastamento real dos pontos com relação à expectativa
r(E) de distribuição aleatória, dada por
pEr
1
2
1)(
.
O cálculo da distância entre os pontos na distribuição observada a partir
dos dados de distância dos vizinhos mais próximos resulta na média r(A), em que
n
riAr )(
onde n é o número de ninhos observados. O padrão de distribuição então
é dado por
)(
)(
Er
ArR
29
sendo a sua variação 149,20 R .
Portanto, quando R= 0, existe uma situação extrema de agregação;
quando R= 2,149 a distribuição é completamente uniforme (reticulado hexagonal) e
quando R= 1, o padrão de distribuição é aleatório. Além de serem analisadas as
distâncias mínimas entre ninhos, também foram medidas a distância entre o local
em que o ninho estava alojado e o coqueiro mais próximo, independente desse ter
ou não ninho; para que possa ser realizada a comparação entre o padrão de
agregação dos ninhos e o padrão de agregação dos coqueiros.
30
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 – Identidade e estrutura populacional
A análise morfométrica foi realizada utilizando as abelhas mandaçaia
coletadas na foz do rio São Francisco (representada nesse trabalho pela sigla FOZ).
Estas foram comparadas com espécimes identificadas de M. q. anthidioides
(ANTHIDIOIDES), M. q. quadrifasciata (QUADRIFASCIATA) e M. mandacaia
(MANDACAIA).
A análise de componentes principais (Figura 6) reduziu os dados em duas
variáveis mais representativas a partir da eliminação de sobreposição, gerando
novos componentes, em que o primeiro componente explica a maior variação
existente, o segundo a segunda maior variação, e assim sucessivamente. Assim
observamos a formação de dois grupos bem definidos. O primeiro em pontos
vermelhos composto pelos espécimes de M. mandacaia e um segundo grupo
composto por M. q. quadrifasciata (pontos azuis), M. q. anthidioides (pontos verdes)
e os espécimes coletados na Foz do Rio São Francisco (pontos pretos). Dessa
forma, esta análise exploratória separa claramente a Melipona mandacaia das
demais.
A Análise de Componentes Principais (ACP) não requer um agrupamento
a priori, pois é uma técnica de ordenação exploratória, possibilitando verificar a
presença de grupos distintos em um conjunto de dados (CAVALCANTE e LOPES,
1998).
A análise de variável canônica (AVC) foi utilizada para distinguir as
variações dentro do grupo, que é semelhante a Analise dos Componentes
Principais, exceto pela delimitação dos dados por grupo; permitindo, assim,
identificar a variação entre e dentro dos grupos e formar agrupamento a priori
(CAVALCANTE e LOPES, 1998). O resultado da análise de variáveis canônicas
permitiu definir nitidamente o grupo a que pertence as melíponas coletadas. Na
figura 7 pode-se verificar a separação entre os três grupos utilizados como
31
parâmetro, com o grupo das abelhas da FOZ sobreposto ao formado pelas abelhas
M. q. quadrifasciata.
Figura 6: Análise de Componentes Principais comparando as colônias da Foz do São Francisco (em
preto), M. q. anthidioides(Verde), M. q. quadrifascita (Azul) e M. mandacaia(Vermelho).
32
Figura 7: Análise das Variáveis Canônicas comparando os grupos de abelhas, Foz do São Francisco, M. q. anthidioides, M. q. quadrifasciata e M. mandacaia.
O dendograma gerado pela análise de agrupamento UPGMA mostra as
relações multidimensionais para o conjunto de observações. A análise resultou na
confirmação de que a população de melíponas da foz do Rio São Francisco é M. q.
quadrifasciata, obtendo um índice de correlação cofenética de 0,99 (figura 8).
33
Figura 8: Dendograma dos grupos de abelhas com índice de correlação cofenética 0,99, identificando o grupo em que as abelhas da FOZ estão inseridas.
A definição de subespécies entre M. q. quadrifascita e M. q. anthidioides
com base nos caracteres morfológicos está no padrão de bandas tergais, em que
são contínuas em M. q. quadrifascita e interrompidas em M. q. anthidioides. Porém,
Moure (1975) identificou abelhas com padrões fenotípicos intermediários,
caracterizando indivíduos híbridos. Este fato gerou duvida quanto a identidade da
mandaçaia encontrada na foz do Rio São Francisco (SOUSA et al., 2006), pois as
primeiras listras tergais aparentavam ser interrompidas (Figura 9). No entanto
Batalha-Filho et al. (2009) relatou a ocorrência de M. q. quadrifasciata no estado de
Sergipe. O que corrobora com a confirmação da identidade da abelha Mandaçaia da
foz, como M. q. quadrifasciata, evidenciada na análise UPGMA e análise de
variáveis canônicas.
34
Figura 9: Padrão de bandas tergais da abelha Mandaçaia encontra na foz do Rio São Francisco
A análise multivariada de um conjunto de caracteres fenotípicos pode ser
considerada como um conjunto de métodos apropriados para esclarecer relações
morfológicas de diferentes populações de diferentes espécies e para detectar
semelhanças intraespecíficas, apesar do uso de caracteres morfológicos em
estudos taxonômicos possa apresentar algumas desvantagens devido a sua
herança poligênica e a considerável influência do ambiente (THORPE, 1976, 1987).
A análise de superposição ortogonal pelos quadrados mínimos (ANOVA
Procrustes) demonstrou que comparação é significativa a diferença entre os grupos
de abelhas quanto ao tamanho do centroide (p=0,0008) e quanto a forma
(p<0,0001).
Tabela 1: ANOVA de Procrustes para o tamanho das asas entre os grupos analisados. Efeito SS MS df F P
Individual 2073669,39 691223,1299 3 5,9 0,0008
Residual 17588213,56 117254,7571 150
Tabela 2: ANOVA de Procrustes para a forma das asas entre os grupos analisados.
Efeito SS MS df F P
Individual 0,42547639 0,006446612 66 140,22 <0.0001
Residual 0,15171554 4,59744E‐05 3300
35
Para avaliar a identidade dos ninhos das M. q. quadrifasciata coletadas
na foz foi realizada a análise de validação cruzada entre os scores de Componentes
Principais e Variáveis Canônicas da população de M. q. quadrifasciata. A análise
correlacionou os indivíduos com seus respectivos ninhos, identificando corretamente
apenas 7% das abelhas às suas respectivas colônias. Esse resultado indica uma
alta similaridade entre as abelhas dos diferentes ninhos, não existindo, portanto,
variação morfométrica significativa entre as abelhas dos diferentes ninhos. O estudo
realizado por Francoy et al. (2008), com abelhas africanizadas conseguiu identificar,
aproximadamente 98%, os grupos de abelhas entre 394 colônias utilizando a análise
de validação cruzada, evidenciando a acurácia desta análise. Em estudos realizados
com o gênero Schwarziana por Silva (2010), testes por indivíduos de validação
cruzada identificaram de forma correta 70% das amostras de um total de 10
localidades,
Considerando que os caracteres morfológicos possuem alta herdabilidade
e elevado componente genético (DINIZ-FILHO e PIGNATA ,1994), os indivíduos da
população de Melipona, com base nas análises morfométricas, possuem um alto
grau de parentesco e baixa variabilidade genética, o que poderia explicar a difícil
ligação entre as abelhas e seus respetivos ninhos pela análise de validação
cruzada..
A endogamia é o primeiro fato a ser observado em uma população
pequena e com alto índice de similaridade. Em estudo feito Campos (1998) em
pequenas populações locais de Melipona rufiventris e Melipona modury verificou que
a redução populacional poderia estar levando a uma diminuição na variabilidade
genética por endogamia e deriva genética.
A análise de PCR/RFLP foi realizada com 17 indívíduos, sendo 14
abelhas da região da foz do Rio São Francisco, um espécime de M. q. anthidioides,
M. q. quadrifasciata e M. mandacaia. Após amplificação do DNA (Figura 10), foram
selecionadas as amplificações com melhor definição de bandas, assim, onze
indivíduos (indivíduos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12 e 13) foram escolhidos, sendo um de
36
cada colônia. O peso molecular das bandas visualizadas corresponde ao intervalo
de 485 a 510 pares de base o que confirma a amplificação do gene citocromo b por
Souza et al. (2008).
Figura 10: Gel em agarose (0,8%) da amplificação de DNA , visualizando as bandas de DNA de cada colônia (1 até 14) e as abelhas utilizadas como parâmetro (M – Melipona mandacaia, A – Melipona quadrifasciata anthidioides e Q – Melipona quadrifasciata quadrifasciata).
Os fragmentos amplificados digeridos pela enzima de restrição Vsp I
(Figura 11) gerou um padrão de haplótipos comum entre as abelhas da Foz do Rio
São Francisco, sendo perceptível o corte do DNA em um único ponto, gerando
assim dois fragmentos (350bp e 145bp) compatível com um dos haplótipos
identificados por Souza et al., (2008) para M. q. quadrifasciata.
Observando o padrão de restrição encontrado em M. mandacaia foi
possível detectar que, apesar de ter ocorrido um único corte com a enzima Vsp I,
assim como ocorreu as amostras de M. quadrifasciata de Brejo Grande, foram
geradas três bandas nítidas (410bp, 305bp e 145bp), chamando atenção para a
banda de maior peso molecular, que representa fragmentos não cortados pela
enzima e que devem ser desconsiderados na análise. Em M. q. anthidioides o corte
também foi definido em um único ponto, porém formando fragmento com pesos
moleculares de 305bp e 163bp, enquanto em M. q. quadrifasciata a enzima Vsp I
cortou em dois pontos gerando 3 bandas com pesos de 190bp, 175 bp e 130bp.
M
37
Figura 11: PCR-RFLP com enzima de restrição VSP I, visualizado em agarose (2%), observando as bandas de DNA de cada colônia(1 até 13) e as abelhas utilizadas como parâmetro (M – Melipona mandacaia, A – Melipona quadrifasciata anthidioides e Q – Melipona quadrifasciata quadrifasciata).
O experimento com a enzima Mbo II (Figura 12) não gerou cortes no
fragmento de DNA em todas as amostras de Melipona da região da foz do Rio São
Francisco, assim as bandas mantiveram o peso molecular equivalente ao produto
amplificado (485bp a 510bp). Situação diferente dos resultados obtidos por Souza et
al (2008), que identificou dois haplótipos, um com bandas de 122 bp, 143 bp e 220
bp e outro com bandas 31 bp, 91 bp, 143 bp and 220 bp. Entretanto, o fragmento de
DNA de Melipona mandacaia foi dividido em duas partes uma com peso molecular
de 260bp e outra de 242bp; enquanto M. q. anthidioides e M. q. quadrifasciata
também obtiveram um único corte dividindo em bandas de 320bp e 260bp.
38
Figura 12: PCR-RFLP com enzima de restrição Mbo II, visualizado em agarose (2%), sendo
observadas as bandas de DNA de cada colônia (1 até 13) e as abelhas utilizadas como parâmetro (M
– M. mandacaia, A – M. q. anthidioides e Q – M. q. quadrifasciata).
A reação com a enzima de restrição Taq I não apresentou cortes em
nenhum dos produtos de amplificação.
O fato de serem observadas divergências entre os haplótipos das M.
quadrifasciata da foz e os espécimes padrão utilizados para comparação pode ser
analisado sob dois aspectos, o primeiro é que M. q. quadrifasciata apresenta mais
de dois haplótipos para esse marcador molecular, uma vez que o haplótipo de M. q.
quadrifasciata utilizado para comparação é diferente dos apresentados pelos
espécimes encontrados na região da foz do Rio São Francisco, porém similar a um
dos haplótipos de M. q. quadrifasciata encontrados por Souza et al. (2008). Outro
aspecto importante é o que todos os espécimes da região da foz do Rio São
Francisco apresentam perfil de restrição idêntico para todas as enzimas utilizadas, o
que confirma a grande similaridade genética também encontrada nas análises
morfométricas, perfil que pode estar relacionado à ação da perda e/ou fixação de
alelos ao longo das gerações por efeitos de seleção, deriva ou efeito fundador nessa
população.
A deriva genética faz com que alelos passem de uma geração para outra
em maior ou menor frequência, que são perdidos ou fixados ao acaso. Diferente da
seleção natural a deriva genética atua sobre os alelos não interferindo
39
necessariamente na sobrevivência ou reprodução, sendo geralmente neutros quanto
ao valor adaptativo. De acordo com Araújo et al (2000) a fixação de um alelo por
deriva depende de sua frequência inicial na população, e esse processo ocorre em
toda população finita, mas é tanto mais rápido quanto menor for a população. Logo,
tratando-se de uma população isolada de melíponas e o fluxo gênico está ocorrendo
somente entre as colônias que se encontram naquela região, enfatizando a
necessidade de ações de conservação para esta espécie na região da Foz do Rio
São Francisco.
Esses resultados dão margem a três possíveis hipóteses para as
características encontradas nessa população, umas delas é de que colônias podem
ter sido trazidas por meliponicultores e posteriormente expandido em número ao
longo do tempo, o que explicaria a presença de um único perfil genético e grande
similaridade morfológica entre as colônias encontradas. Outra explicação seria um
evento natural de efeito fundador em que as colônias originais teriam sido originadas
de populações de mandaçaia que ocorrem em regiões de Caatinga encontradas
atualmente nos estados da Bahia e Sergipe que migraram para essa região, porém,
o perfil genético encontrado na amostra de M. q. quadrifasciata proveniente de Cruz
das Almas – BA, não corrobora essa hipótese, mas o baixo número amostral
também não permite sua exclusão. A terceira possibilidade seria a de que a
população dessa região é um remanescente de populações que ocorriam
naturalmente em região de Mata Atlântica e que foram afetadas por efeitos de perda
do habitat natural e em função da fragmentação, tendo restado apenas uma
população altamente homogênea remanescente.
A compreensão da estrutura da população desta espécie, nesta região, é
extremamente importante para a construção de programas de manejo e
conservação. A espécie sendo geneticamente homogênea dentro de uma pequena
área a estratégia de conservação pode se concentrar na recolonização de outras
áreas por estes indivíduos e no manejo de outros ninhos para a região homogênea
(Lopes, 2004). Segundo Kerr e Vencovsky (1982) são necessárias ao menos 44
colônias de Melipona para que o efeito de deriva genética não seja prejudicial à
40
conservação dessa população. Provavelmente o número de colônias encontradas
nessa região seja muitíssimo maior, uma vez que as 14 colônias encontradas
ocupavam uma área de apenas 10 hectares. No entanto, é importante ressaltar que
o número de colônias indicado por Kerr e Vencovsky (1982) diz respeito ao número
necessário de diferentes linhagens genéticas e que na região da foz do Rio São
Francisco foi encontrada apenas uma linhagem genética, o que indicaria altíssimo
risco de extinção.
4.2 – Distribuição espacial dos ninhos.
A busca por ninhos resultou na marcação de 14 colônias na área
delimitada no município de Brejo Grande – SE, observando aproximadamente 200
coqueiros, todos estes possuíam cavidades decorrente, possivelmente, da broca do
tronco do coqueiro (Rhinostomus barbirostris). Na Ilha da Criminosa – SE e
Piaçabuçu – AL não foi registrado nenhum ninho de mandaçaia, apesar da
intensificação do esforço amostral, sendo analisados 280 coqueiros em cada região.
A ausência de ninhos, na Ilha da Criminosa e na região de Piaçabuçu,
enfatiza a hipótese da possível barreira geográfica representada pelo Rio São
Francisco. No entanto, apesar de ARAUJO et al. (2004), afirmar que grandes
abelhas sem ferrão – como a Melipona quadrifasciata – só estariam efetivamente
isoladas de outra população a uma distância maior que 2 quilômetros, é necessário
considerar que a distância de voo é utilizada nesse caso principalmente para tratar
de questões associadas ao forrageamento, no entanto a formação de novos ninhos
não pode ocorrer numa distância tão grande do ninho materno, uma vez que existe
uma grande dependência do novo ninho em relação ao ninho materno durante a
fase de estabelecimento inicial, o que inviabiliza que os dois possam estar muito
distantes um do outro. Aspecto que de acordo com Gillote (1980) gera restrições
diretas na dispersão das populações. É importante ressaltar também que ambas as
áreas analisadas possuem território de várzea com áreas alagadas. Dessa forma,
apesar de Antonini et al. (2006) ter caracterizado a Melipona quadrifasciata como
41
generalista, a região da Ilha da Criminosa possui provavelmente uma quantidade
insuficiente de recursos alimentares como pólen e néctar para o estabelecimento de
colônias naquela área.
Figura 13: Região de Brejo Grande – SE. Marcação dos ninhos encontrados, identificados de 1 a 14;
e marcação de todos os coqueiros visitados (pontos em azul).
A distribuição espacial dos ninhos, calculada pelo método do vizinho mais
próximo, resultou em um R=0,9 definindo a distribuição dos ninhos como aleatória,
levando em consideração a área de 10 hectares. Essa aleatoriedade dos ninhos de
Brejo Grande não acompanha a distribuição dos coqueiros, os quais que, por trata-
se de um plantio, possui distribuição uniforme.
0Agregado
1Aleatório
2,15Uniforme
0,9
Figura 14: Esquema de visualização do resultado da distribuição espacial dos ninhos. R=0,9 considerado aleatório.
42
Segundo Serra et al (2009), em pesquisa realizada no Estado do
Maranhão sobre a distribuição espacial de meliponíneos, duas das três regiões
visitadas, a distribuição foi identificada como aleatória (R=0,81 e R=0,89), sendo
41,9 e 29,6 hectares as áreas das regiões. O padrão de distribuição espacial em
meliponíneos é pouco conhecido. Ainda segundo esses autores a organização dos
ninhos está relacionada a distribuição e densidade de substratos adequados à
construção destes, além dos aspectos ecológicos de ocupação das cavidades onde
serão estabelecidas as colônias, e também está diretamente relacionado aos
aspectos intrínsecos de cada espécie.
Em Brejo Grande, pode-se afirma que a distribuição dos ninhos não sofre
influencia da atividade de enxameação, pois a M. quadrifasciata, segundo Araujo et
al. (2004), possui um voo máximo de 2 quilômetros, assim existindo a possibilidade
de nidificação em qualquer ponto da área delimitada no município de Brejo Grande.
Apesar de todos os coqueiros possuírem, aparentemente, orifícios em seus troncos,
possivelmente nem todas as cavidades sejam adequadas a nidificação.
Sendo assim, a dispersão aleatória dos ninhos deve estar relacionada a
uma boa disponibilidade de recursos, visto que a área está próxima a um pequeno
fragmento florestal e uma lagoa. E também pode estar sendo influenciada pela
dispersão da Broca do tronco do Coqueiro (R. barbirostris), que cria as cavidades na
estirpe do coqueiro.
O fato da ocorrência de ninhos está restrita a coqueiros na região da foz
do Rio São Francisco, justifica a grande necessidade de intensificar os esforços de
conservação desta espécie. Visto que os únicos locais propícios à nidificação são os
coqueiros brocados. E, segundo a Embrapa (2007), o controle padrão utilizado para
esta “praga” é a erradicação das plantas quebradas pela ação do vento, e queima ou
enterramento dos coqueiros erradicados (partes infestadas), visando redução dos
focos de multiplicação da broca. Ou seja, o produtor que seguir efetivamente essa
recomendação exterminaria, junto com a praga, os ninhos de M. quadrifasciata.
A análise da possível associação entre as distâncias geográficas entre os
43
ninhos e os dados morfométricos foi realizado pela correlação entre matrizes,
utilizando-se a estatística de Mantel, utilizando 5000 permutações aleatórias. O
índice de correlação não foi significativo (p=0,97), esse resultado corrobora as
análises anteriores que apontaram similaridade genética e morfométrica entre os
ninhos, ou seja, uma vez que as abelhas são muito parecidas entre si não existe
uma relação direta entre a distância dos ninhos e a diferenças morfométricas entre
as abelhas, especialmente considerando que a escala utilizada, de 10ha seria, de
fato muito pequena para a existência de algum padrão espacial.
Morfometria Distância Geográfica
r = 0,21
p = 0.97
Figura 15: Representação da correlação de matrizes triangulares, entre distância morfométrica e distância geográfica dos ninhos; evidenciando a baixa significância (r=0,21 3 p=0,97).
Estudo similar realizado por Diniz-Filho et al. (1998), verificou que em
populações de Tetragonisca angustula angustula também não apresentou uma
estruturação geográfica. Nunes et al (2008), também identificou que a forma das
asas em Melipona quadrifasciata tem pouca correlação com distribuição geográfica.
No entanto a falta de correlação destas matrizes está sendo influenciada pelo alto
grau de semelhança dos caracteres morfológicos, visto que não houve a distinção
de grupos entre as colônias com base nos caracteres morfológicos.
44
5 – CONCLUSÃO
Todos os ninhos identificados foram registrados na região do município de
Brejo Grande – SE, apesar do maior esforço de coleta, nenhum ninho foi encontrado
na Ilha da Criminosa ou no município de Piaçabuçu - AL, o que reforça a hipótese de
que o Rio São Francisco nessa região representa uma barreira geográfica efetiva
para a dispersão das colônias dessa espécie.
A identificação da abelha mandaçaia encontrada na foz do Rio São
Francisco foi definida com M. q. quadrifasciata com base nas análises
morfométricas. No entanto o padrão molecular encontrado é diferente de todos os
espécimes de M. q. quadrifasciata, M. q. anthidioides e M. mandacaia, utilizadas
para comparação, mas compatível com um padrão de M. q. quadrifasciata
encontrado na literatura.
Uma análise de validação cruzada intrapopulacional para verificar a
associação entre indivíduo e colônias demonstrou que não existe associação
significativa, denotando grande similaridade intrapopulacional,
A M. q. quadrifasciata da Foz do Rio São Francisco apresenta um alto
nível de homogeneidade, possivelmente decorrente do isolamento populacional e do
fluxo gênico dentro desta população. Estando de acordo com a análise de
correlação de matrizes realizada pelo teste de Mantel que demonstrou não existir
associação entre as distâncias geográficas dos ninhos e os dados morfométricos.
Assim evidenciando a necessidade de intensificação dos esforços para conservação
desta espécie nesta região.
A distribuição espacial dos ninhos foi identificada como aleatória, não
existindo correlação com a estruturação morfológica da população. Decorrente da
grande similaridade morfológica (forma e tamanho) das asas das abelhas e a micro
escala também pode está influenciando na aleatoriedade, além da distribuição
espacial da broca do tronco do coqueiro.
45
Seja qual for a explicação para as características populacionais
encontradas para as abelhas dessa região, é importante ressaltar que todos os
ninhos encontrados estavam localizados em coqueiros que seriam condenados pela
baixa produção ocasionada pela broca-do-tronco-do-coqueiro e pela baixíssima
oferta de locais de nidificação para abelhas nessa região, o que configura altíssimo
risco de extinção populacional.
46
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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