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Universidade Federal de Sergipe Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária Avaliação da Resposta Imune Humoral Anti-Pvs48/45 em Infecções Naturais por Plasmodium vivax da Amazônia Brasileira Tatiana Maria Silva Cisne Pessoa São Cristóvão – Sergipe 2017

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Universidade Federal de Sergipe Centro de Ciências Biológicas e da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

Avaliação da Resposta Imune Humoral Anti-Pvs48/45 em

Infecções Naturais por Plasmodium vivax da Amazônia

Brasileira

Tatiana Maria Silva Cisne Pessoa

São Cristóvão – Sergipe 2017

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Tatiana Maria Silva Cisne Pessoa

Avaliação da Resposta Imune Humoral Anti-Pvs48/45 em

Infecções Naturais por Plasmodium vivax da Amazônia

Brasileira

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária.

Orientadora: Profa. Dra. Luciane Moreno Storti de Melo

São Cristóvão – Sergipe 2017

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TATIANA MARIA SILVA CISNE PESSOA

Avaliação da resposta imune humoral anti-Pvs48/45 em infecções naturais por

Plasmodium vivax da Amazônia brasileira

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe.

BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Luciane Moreno Storti de Melo Universidade Federal de Sergipe Orientadora Profa. Dra. Roseli La Corte dos Santos Universidade Federal de Sergipe Laboratório de Parasitologia Membro Titular Interno Profa. Dra. Priscila Lima dos Santos Universidade Federal de Sergipe – Campus Lagarto Membro Titular Externo Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza Universidade Federal de Sergipe Membro Suplente Interno Prof. Dr. Rodrigo Anselmo Cazzaniga Universidade Federal de Sergipe - CCBS Membro Suplente Externo

São Cristóvão, 22/02/2017

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Dedico este trabalho aos meus pais

Antonio Francisco e Margareth, a base da

minha vida, por não medirem esforços para que

isso fosse possível. A meus irmãos, pelo

companheirismo de sempre e a meu namorado

pela confiança depositada em mim.

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Agradecimentos

À Profa. Dra. Luciane Moreno Storti de Melo, pela confiança depositada em

mim e por me proporcionar tantas oportunidades, incentivando e melhorando meu

crescimento profissional e desenvolvimento acadêmico. Por todos os

aprendizados e conhecimentos compartilhados e por sempre exigir, me fazendo

acreditar em meu potencial. Pelas palavras de conforto e incentivo nos momentos

difíceis e, principalmente, por sua dedicação pela pesquisa, despertando em mim

o gosto pela Malária. Foi uma honra trabalhar ao seu lado e é com imenso

orgulho que concluo esse metrado sob sua orientação.

Aos colaboradores Dr. Sócrates Herrera e Dra. Myriam Arévalo-Herrera –

Centro de Investigação Científica Caucaseco, Cali-Colômbia, pelo apoio e suporte

com as análises, abrindo as portas para que eu pudesse realizar meu trabalho.

Ao Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado – Instituto Evandro Chagas, pelo

apoio com a pesquisa, disponibilizando as amostras para que eu pudesse realizar

as análises.

À Angela Valencia – Centro de Investigação Científica Caucaseco, Cali-

Colômbia, pelo carinho, dedicação e por todo apoio dentro do laboratório.

À Juliana Diaz, pela carinhosa receptividade e acolhida em sua casa.

À Myrela, por sua prestatividade e apoio com a pesquisa.

Às amigas Juci e Vanessa, minhas companheiras de jornada, por estarem

sempre ao meu lado, compartilhando alegrias, confidências, inseguranças, me

incentivando e trazendo confiança sempre. Obrigada pela amizade de vocês,

meninas! Vocês tornaram esse período um tanto mais leve.

À Coordenação do Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária da

Universidade Federal de Sergipe e professores, pelo carinho e dedicação.

À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.

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Aos que não participaram diretamente dessa história, mas que foram

indispensáveis para que ela se concretizasse de maneira mais leve,

meus sinceros e especiais agradecimentos.

A Deus, por me permitir realizar mais essa etapa da minha vida, iluminando meu

caminho, me dando serenidade e sabedoria para seguir em frente. Sem Ele nada

disso seria possível.

Aos meus dedicados e incansáveis pais, Antonio Francisco e Margareth, pelo

amor incondicional, e por estarem sempre presentes, buscando meu melhor, me

dando forças e incentivando a persistir nesse caminho. Obrigada por tudo! Amo

vocês!

Aos meus irmãos, verdadeiros companheiros, Chiquinho e Karina, que

mesmo de longe se fazem sempre tão presentes nos meus dias, pelo apoio,

incentivo, pelas conversas e confidências trocadas. Vocês são os melhores!

Ao meu amor, Adam, pelo apoio, carinho e paciência em todos os momentos (sei

que foi um período de muitas mudanças para nós). Obrigada por todo o incentivo,

me mostrando que sou capaz e por acreditar sempre em mim. Sou grata a Deus

por te ter em minha vida. Te amo!

Aos meus cunhados Hermano e Marília, por todo carinho, atenção e por estarem

sempre torcendo por mim.

Aos meus avós maternos Rita e Rivaldo, por todo carinho e cuidado que sempre

tiveram comigo e por todas as orações a mim direcionadas. Aos meus avós

paternos Creuza e Quincas, vocês são meus anjos e sei que estão olhando por

mim e me guiando de onde estiverem.

Aos meus tios, tias e primos, em especial à tia Magaly, minha segunda mãe, que

sempre acolhedora, se fez tão presente em minha vida.

Enfim, o meu muito obrigada a todos que fizeram parte dessa conquista.

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“Se você procurar bem, você acaba encontrando.

Não a explicação (duvidosa) da vida,

Mas a poesia (inexplicável) da vida.”

Carlos Drummond de Andrade

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Resumo

PESSOA, Tatiana Maria Silva Cisne. Avaliação da resposta imune humoral anti-Pvs48/45 em infecções naturais por Plasmodium vivax da Amazônia brasileira. Sergipe: UFS, 2017. 64p. (Dissertação – Mestrado em Biologia Parasitária).

A malária continua sendo responsável por grande morbidade e mortalidade em muitos países tropicais e subtropicais. Diante de várias tentativas de controle dessa protozoose, as vacinas têm sido alvo de intensa pesquisa, uma vez que esse parece ser o caminho promissor para o controle efetivo da malária. Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito, por habitarem áreas endêmicas desenvolvem respostas imunes específicas, levando a uma redução da carga parasitária e das manifestações clínicas. Além disso, o soro desses indivíduos pode impossibilitar a fertilização dos gametas nos mosquitos, bloqueando a transmissão desse parasito para o vetor. A proteína Pvs48/45 é encontrada na superfície dos gametócitos e utilizada como alvo dos anticorpos viabilizando essa estratégia de uma vacina de bloqueio de transmissão. O objetivo desse estudo é avaliar a resposta de anticorpos naturalmente adquirida em infecções por Plasmodium vivax contra a proteína Pvs48/45. A pesquisa de anticorpos IgG anti-Pvs48/45 foi realizada por ELISA no soro de 281 amostras de pacientes maláricos residentes na região amazônica brasileira. O ponto de corte foi estabelecido utilizando soro de voluntários que nunca tiveram contato com o plasmódio, estabelecendo a média da densidade óptica (DO) mais três desvios padrão. As amostras foram analisadas em duplicatas e a média da DO foi dividida pelo ponto de corte para estabelecer o índice de reatividade (IR), sendo que amostras com IR ≥ 1 são consideradas positivas. Dos 281soros analisados, em 22,4% foram encontradas respostas de anticorpos específicos anti-Pvs48/45 e os índices de parasitemia e os gametócitos não influenciaram o reconhecimento antigênico desta proteína. Na análise dos subfragmentos, obteve-se que a região C-Terminal + Central da Pvs48/45 foi a que apresentou maior reconhecimento antigênico na amostra em estudo (32%). Diante disso, estudos com a utilização dessa região da proteína podem facilitar o entendimento do potencial imunogênico desse antígeno. Esse estudo visa contribuir para o desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão eficiente contra a proteína Pvs48/45 em ensaios futuros.

Palavras-chave: Pvs48/45; vacina; resposta imune; Malária.

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Abstract

PESSOA, Tatiana Maria Silva Cisne. Evaluation of the anti-Pvs48/45 humoral immune response in natural infections by Plasmodium vivax from the Brazilian Amazon. Sergipe: UFS, 2017. 64p. (Dissertation – Master’s degree in Parasite Biology).

Malaria remains a major responsible factor for morbidity and mortality in many tropical and subtropical countries. Due to the several attempts to control this protozoan infection, vaccines have been subject of intensive research, since this seems to be a promising way for the effective control of malaria. Individuals, who are frequently exposed to the parasite by living in endemic areas, develop specific immune responses, leading to a reduction of parasite load and clinical manifestations. Moreover, the serum of such individuals may impair fertilization of gametes in the mosquito, blocking the transmission of this parasite into the vector. The Pvs48/45 protein is found on the surface of gametocytes and used as a target of antibodies enabling this strategy a transmission blocking vaccine. The aim of this study is to evaluate the antibody response in naturally acquired infections by Plasmodium vivax against Pvs48/45 protein. The research of antibodies IgG anti-Pvs48/45 was performed by ELISA in sera from 281 samples of malarial patients living in the Brazilian Amazon. The cutoff point was established using serum from volunteers who never had contact with the plasmodium, establishing the mean optical density (OD) plus three standard deviations. Samples were analyzed in duplicate and the mean OD was divided by cutting point to establish the reactivity index (RI), while samples with IR ≥ 1 are considered positive. Of 281 sera analyzed, in 22.4% were found specific antibody response anti-Pvs48/45 and indices of parasitemia and gametocyte did not influence the antigenic recognition of this protein. With the analysis of the subgroups was obtained that the C-Terminal + Central region of Pvs48/45 was the one with the highest antigenic recognition in the study sample. Therefore, studies using this region of the protein may facilitate the understanding of the immunogenic potential of this antigen. This study aims to contribute to the development of an efficient transmission blocking vaccine against Pvs48/45 protein in future trials.

Keywords: Pvs48/45; vaccine; immune response; Malaria.

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LISTA DE ABREVIATURAS

AMA-1 do Inglês Apical Membrane Antigen 1 - Proteína de Membrana Apical

AS01 Sistema Adjuvante Lipossomal

C Região Carboxi-terminal

CSP Proteína Circunsporozoítica

DARC Receptor do Antígeno Duffy para Quimiocinas

DBP do Inglês Duffy Binding Protein - Proteína de Ligação ao Antígeno Duffy

ELISA do Inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - Ensaio Imunoenzimático

IFNy Interferon-gamma

KDa Quilodalton

HBcsAg Antígeno Associado ao Vírus da Hepatite B

Montanide ISA 51 Sistema Adjuvante 51

Montanide ISA 720 Sistema Adjuvante 720

MSP do inglês Merozoite Surface Protein - Proteína de Superfície do Merozoíto

N Região Amino-terminal

PfAMA1-FVO Antígeno de Membrana Apical do P. falciparum

PvDBP Proteína de Ligação ao Antígeno Duffy do P. vivax

PvMSP1 Proteína 1 de Superfície do Merozoíto do P. vivax

PvRMC-MSP1 do Inglês P. vivax Recombinant Modular Chimera Based on MSP1 - Quimera Modular Recombinante de P. vivax baseada em MSP1

R Região de Repetição

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RTS,S/AS01 Proteína de Superfície do Esporozoíto do P. falciparum

TBV do Inglês Transmission Blocking Vaccine - Vacina de Bloqueio de Transmissão

THP-1 Células T Auxiliares do tipo 1

TRX Tiorredoxina

VK210 Cepa de P. vivax 210

VK247 Cepa de P. vivax 247

VMP001 Proteína 1 de Malária vivax

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Sumário

1 INTRODUÇÃO ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 13

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS DA MALÁRIA ----------------------------------------------------------------------- 13

1.2 EPIDEMIOLOGIA ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 14

1.3 CICLO BIOLÓGICO -------------------------------------------------------------------------------------------------- 15

1.4 MATURAÇÃO E INFECTIVIDADE DOS GAMETÓCITOS ------------------------------------------------------ 17

1.5 ASPECTOS DA VACINA ANTI-MALÁRICA ---------------------------------------------------------------------- 18

1.5.1 Bloqueio da infecção ------------------------------------------------------------------------------------ 20

1.5.2 Bloqueio da doença (MSP, AMA-1, DBP) ------------------------------------------------------- 23

1.5.3 Bloqueio da transmissão ------------------------------------------------------------------------------- 26

2 JUSTIFICATIVA --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 28

3 OBJETIVOS --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29

3.1 OBJETIVO GERAL -------------------------------------------------------------------------------------------------- 29

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------- 29

4 MATERIAIS E MÉTODOS ------------------------------------------------------------------------------------------- 30

4.1 OBJETOS DE ESTUDO --------------------------------------------------------------------------------------------- 30

4.2 ASPECTOS ÉTICOS ------------------------------------------------------------------------------------------------- 31

4.3 ANÁLISES LABORATORIAIS -------------------------------------------------------------------------------------- 32

4.3.1 Avaliação da resposta de anticorpos ------------------------------------------------------------- 32

4.3.2 Produção da Pvs48/45 --------------------------------------------------------------------------------- 33

4.3.3 Titulação das amostras --------------------------------------------------------------------------------- 33

4.3.4 Interpretação dos Resultados ------------------------------------------------------------------------ 34

4.3.5 Análises Estatísticas ------------------------------------------------------------------------------------- 34

5 RESULTADOS ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34

5.1 ANTIGENICIDADE DA PROTEÍNA PVS48/45 NA AMAZÔNIA BRASILEIRA ----------------------------- 34

5.2 ÍNDICES DE PARASITEMIA E PRESENÇA DE GAMETÓCITOS---------------------------------------------- 36

5.3 REATIVIDADE DAS AMOSTRAS AOS SUBFRAGMENTOS DA PVS48/45 -------------------------------- 38

6 DISCUSSÃO -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 39

7 CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS --------------------------------------------------------------- 42

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ---------------------------------------------------------------------------- 44

ANEXO A -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 54

DECLARAÇÃO DE DOAÇÃO DAS AMOSTRAS -------------------------------------------------------------------------------- 54

ANEXO B -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55

PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP ----------------------------------------------------------------------------------- 55

APÊNDICE A --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 56

ARTIGO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO ACTA TROPICA, ISSN: 0001-706X -------------------------------- 56

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Considerações gerais da malária

A malária é uma doença parasitária transmitida ao homem por fêmeas

infectadas de mosquitos do gênero Anopheles. É caracterizada por quadros de

febre intermitente, cefaleia, mialgia, cansaço, sudorese, tontura e náuseas.

Apesar da tríade clássica malárica (febre, calafrio e dor de cabeça), sua fase

inicial é bastante inespecífica por seus sintomas serem comuns à maioria das

síndromes febris agudas, o que pode retardar o seu diagnóstico (COSTA et al.,

2010; FRANÇA et al., 2008).

Essa nosologia protozoária é uma das mais importantes em todo o mundo.

Ainda que seja uma doença parasitária que pode ser prevenida e tratada,

continua sendo uma das maiores causas de morbidade e mortalidade em muitos

países tropicais e subtropicais, impactando, dessa forma, a saúde pública dessas

áreas (WHO, 2011). A malária é causada por parasitos do gênero Plasmodium,

sendo cinco espécies reconhecidas por infectar o homem: P. falciparum, P. vivax,

P. malariae, P. ovale e, recentemente, o P. knowlesi, parasito originalmente dos

símios, foi detectado em algumas regiões da Ásia infectando humanos

(LUCHAVEZ et al., 2008). Dentre esses, os dois primeiros estão associados

respectivamente ao maior número de mortalidade/virulência e disseminação

(WHO, 2011). O P. falciparum é o responsável por causar a forma mais grave da

malária, a cerebral, podendo evoluir a óbito (FERREIRA et al., 2012).

Historicamente, casos de infecção complicada por P. vivax são raros. Todavia,

infecções causadas por essa espécie de Plasmodium são mais difíceis de serem

tratadas e ter sua transmissão controlada devido à presença de hipnozoítos

dormentes no fígado, característicos de P. vivax, sendo responsáveis pelas

recaídas. (JAIN, AGRAWAL e SINGH, 2013).

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1.2 Epidemiologia

A malária está dentro do grupo de doenças negligenciadas, aquelas que

acometem milhares de pessoas, a maioria de baixa renda e em países

subdesenvolvidos (FERREIRA et al., 2012). É uma das doenças mais prevalentes

em países tropicais e, embora a grande maioria dos casos ocorra no continente

africano, a doença encontra-se amplamente distribuída na América Latina,

Sudeste Asiático e Oceania, (WHO, 2008). Essa protozoose afetou cerca de 212

milhões de pessoas pelo mundo em 2015, sendo que, a região africana foi a

responsável pela maioria dos casos (90%) e nas Américas, foram registrados 800

mil casos. Dos casos de malária estimados mundialmente, cerca de 4% são de P.

vivax. Entretanto, fora do continente Africano, e especificamente nas Américas, as

infecções causadas por P. vivax representam cerca de 70% (WHO, 2016).

Estima-se que a malária tenha sido responsável por 429 mil mortes de

indivíduos em todo o mundo durante o ano de 2015, sendo que a maioria ocorreu

no continente Africano (92%). O agente causador do maior número de mortes foi

o P. falciparum, enquanto que o P. vivax, estima-se que tenha sido responsável

por 3100 mortes em 2015, com 86% dos casos ocorrendo fora do continente

Africano. Do total de mortes por malária em 2015, 303 mil foram de crianças

menores de 05 anos, o que equivale a 70% do total global. Embora a mortalidade

global por malária em crianças teve uma redução de 29% desde 2010, ainda é

considerada uma das maiores responsáveis pela morte de crianças, uma vez que

a cada 2 minutos uma criança perde a vida devido a essa parasitose. Na região

das Américas, a redução da mortalidade foi de 37% no período de 2010 a 2015,

embora ainda tenham sido registradas 490 mortes em 2015, sendo que destas,

110 tiveram o P. vivax como agente etiológico (WHO, 2016).

No Brasil, aproximadamente 99% da transmissão da malária concentra-se

na região amazônica, sendo que o P. vivax tem sido a espécie mais prevalente,

responsável por aproximadamente 86% dos casos de malária nesta região, com

taxas ≥ 100 casos para cada 1000 habitantes. Nos últimos 12 anos, foram

notificados em média 423 mil casos por ano, o que representa mais de 50% dos

casos de malária registrados nas Américas (WHO, 2016). Historicamente, entre

os anos de 2000 a 2002, houve redução do número de notificações, mas no

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período de 2002 a 2005 o número de casos aumentou consideravelmente em

73,7% em relação ao número de casos de 2002. Esse aumento tem sido atribuído

principalmente, à ocupação desordenada das periferias das grandes cidades da

região amazônica (BRAZ, DUARTE E TAUIL, 2013; OLIVEIRA-FERREIRA et al.,

2010; SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2013). Na ultima década,

eventos de redução no número de casos têm sido observados no país. Em 2014,

foram registrados 143.552 casos de malária na região amazônica. Destes casos

notificados, cerca de 4.500 foram importados de países que fazem fronteira com o

Brasil. Em relação ao ano anterior (2013), houve uma redução de 19% dos casos

e ao fazer uma análise comparativa de cada mês, nota-se que essa redução

ocorreu em todos os meses do ano de 2014. Quanto ao agente causador,

Rondônia foi o único estado que apresentou um aumento no número de casos de

malária por P. falciparum (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2015).

Esses indicadores epidemiológicos destacam a efetividade dos programas de

controle da malária empregados no Brasil nos últimos anos. Entretanto, em 2014

ainda foram registrados 23 óbitos na região amazônica, destes, 11 foram pelo P.

vivax. Fora da região amazônica, ocorreu o registro de 15 óbitos, sendo que 06

tiveram como agente causador o P. falciparum (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA

EM SAÚDE, 2015).

1.3 Ciclo Biológico

Parasitos do gênero Plasmodium têm um ciclo de vida que é considerado

um dos mais complicados e fascinantes dentre outros organismos, uma vez que

envolve diferentes estágios de vida desse protozoário (ALY, VAUGHAN e KAPPE,

2009). Esse ciclo é dividido em duas fases, envolvendo dois tipos de hospedeiros.

Uma sexuada ou esporogônica, durante a qual ocorre a multiplicação dos

parasitos no vetor, que é o hospedeiro definitivo e a outra, fase assexuada ou

esquizogônica, na qual ocorre a multiplicação no homem, que é o hospedeiro

intermediário (CDC, 2016).

O ciclo se inicia quando os esporozoítos infectantes são inoculados

diretamente na circulação sanguínea humana pela fêmea infectada do mosquito

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Anopheles. Esses esporozoítos migram para o fígado, onde invadem os

hepatócitos e se diferenciam em merozoítos hepáticos (fase pré-eritrocítica)

(CORNEJO e ESCALANTE, 2006; RÉNIA E GOH, 2016). A fase hepática é

assintomática e dura em média seis dias, com cada esporozoíto produzindo

milhares de merozoítos que penetram e desenvolvem-se dentro dos eritrócitos

(ARAVIND et al., 2003).

Em P. vivax e P. ovale, os esporozoítos inoculados pelo Anopheles

possuem características genéticas distintas, existindo dois tipos de populações.

Enquanto uma desenvolve-se assim que é inoculada na circulação sanguínea, a

outra se desenvolve lentamente, permanecendo dormente no hepatócito. Essas

formas são denominadas hipnozoítos, os quais permanecem por cerca de seis

meses nesse estado de latência, quando se tornam ativos e completa-se o ciclo

pré-eritrocítico. Essa é uma das características mais marcantes que diferem o P.

vivax do P. falciparum, o desenvolvimento de hipnozoítos dormentes no fígado,

causando infecções tardias, conhecidas como recaídas em P. vivax (MUELLER et

al., 2009). Essa característica de ativação dos hipnozoítos latentes

proporcionados por infecções anteriores pode ser a explicação para a

periodicidade dos surtos de malária por P. vivax (WHITE, 2011). Apesar de o

ponto de gatilho para ativação dos hipnozoítos não estar bem compreendido,

supõe-se que o stress esteja envolvido nessa ativação (MUELLER et al., 2009).

Após o término da primeira fase do ciclo, os merozoítos rompem os

hepatócitos, caindo na corrente sanguínea, onde se ligam e invadem as

hemácias, dando origem ao ciclo eritrocítico (CORNEJO e ESCALANTE, 2006),

fase de estágio sanguíneo (OCAÑA-MORGNER et al., 2003). Neste ciclo, os

merozoítos se diferenciam em trofozoítos, os quais fazem sucessivas divisões

celulares, originando os esquizontes eritrocitários. Após a maturação dos

esquizontes dentro das hemácias, estas células se rompem, liberando os

esquizontes na corrente sanguínea (ARAVIND et al., 2003).

Após o rompimento do eritrócito parasitado, novos merozoítos são

liberados na corrente sanguínea, dando início a um novo ciclo de invasão de

eritrócitos, que resultará nos sintomas clínicos da doença. Esse ciclo eritrocítico

varia de acordo com as espécies. P. falciparum, P. vivax e P. ovale possuem um

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ciclo de 48h enquanto que o ciclo eritrocítico de P. malariae dura cerca de 72h.

Merozoítos de P. vivax têm preferência ou até mesmo uma exigência por

reticulócitos como células hospedeiras. (MUELLER et al., 2009).

Nem todos os merozoítos evoluem para a forma de esquizonte, sendo

estes capazes de se diferenciar nas formas sexuadas do parasito, que são os

gametócitos (ARAVIND et al., 2003; MUELLER et al., 2009). Os gametócitos, em

fase de maturação, se ingeridos pela fêmea do Anopheles durante o repasto

sanguíneo, desenvolvem-se em seu estômago e dão origem a macro e

microgametas, que sofrem mudanças morfológicas, levando à fertilização

(CIRIMOTICH et al., 2010). Após várias divisões mitóticas, o oocisto gera uma

grande quantidade de esporozoítos, que migram para a glândula salivar do

mosquito, estando aptos para infectar um novo hospedeiro vertebrado reiniciando

o ciclo (KOYAMA, 2012).

1.4 Maturação e infectividade dos gametócitos

A transmissão dos estágios de vida do Plasmodium entre o vetor e o

hospedeiro humano é bastante eficaz. Apesar disso, existem alguns fatores que

influenciam a infectividade e transmissibilidade dos gametócitos inoculados na

corrente sanguínea do hospedeiro durante o repasto sanguíneo. Dentre esses

fatores estão a idade e o sistema imune do hospedeiro humano. Em crianças e

jovens, a prevalência e densidade dos gametócitos são altas. Esse número de

gametócitos e, consequentemente, sua infectividade e potencial de transmissão,

decrescem com o aumento da idade do paciente e a imunidade adquirida com a

exposição frequente à infecção malárica. (STONE et al., 2015).

A transmissibilidade dos gametócitos se diferencia, também, de acordo

com a espécie do Plasmodium. Em P. vivax, a transmissibilidade passa a ser

maior por ocorrer uma produção significativamente mais rápida de gametócitos

maduros, uma vez que o ciclo de vida dessa espécie é mais curto em

comparação com o P. falciparum (VALLEJO et al., 2016). Entretanto, a duração

do transporte dos gametócitos de P. vivax é curta quando comparada ao P.

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falciparum, circulando pelo organismo do hospedeiro por no máximo 03 dias

(OLLIARO, et al., 2016).

Para que uma transmissão seja bem sucedida, alguns fatores podem ter

influência, tais como a proporção de gametócitos machos, a duração da infecção

e o nível de maturação do gametócito (BOUSEMA e DRAKELEY, 2011). Em

estudos realizados por Vallejo e colaboradores (2016), verificou-se que a

ocorrência de gametócitos maduros prevalece em pacientes assintomáticos

quando comparados a pacientes que apresentam infecções agudas e recentes,

indicando que nestas infecções, as agudas e recentes, há a prevalência do

desenvolvimento e replicação das formas assexuais do parasito. Além disso, o

período infeccioso dessa forma parasitária é determinado pela cepa do P. vivax e,

também, por fatores relacionados ao hospedeiro humano e, possivelmente, ao

mosquito vetor.

1.5 Aspectos da Vacina Anti-malárica

Há décadas, uma busca incessante pela vacina contra a malária, vem

sendo realizada. As vacinas são alvo de intensa pesquisa e de investimento em

seu desenvolvimento, uma vez que esse parece ser o caminho promissor para o

controle da malária futuramente. Existem várias proteínas que têm sido alvo de

pesquisa para serem utilizadas como antígenos vacinais e, a depender da

proteína, a estratégia de ação utilizada se modifica. Entretanto, apesar de

décadas de estudo e muitos resultados aparentemente promissores, ainda não

temos uma vacina efetiva. Uma das razões para essa dificuldade no

desenvolvimento de uma vacina eficaz é justamente a enorme complexidade do

parasito, seu ciclo biológico envolve diferentes formas de vida que possuem

diferentes células alvo e uma ampla diversidade genética com antígenos de

superfície altamente polimórficos de P. falciparum e P. vivax nas diferentes

regiões do mundo (VERSIANI et al., 2013). A falta de correlatos imunológicos de

proteção e um modelo experimental animal também são considerados obstáculos

para o desenvolvimento da vacina (GIRARD et al., 2007).

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19

De início, o foco de desenvolvimento de vacinas foi direcionado para a

espécie mais virulenta de malária, o P. falciparum. Hoje, P. vivax, apesar de não

ser o mais virulento, é responsável por um grande número de casos, com um

valor estimado de 8.500.000 casos por ano em todo o mundo e, no Brasil, 86%

dos casos de malária são pelo P. vivax, o que reforça a necessidade de estudos

vacinais para ambas a espécies (VERSIANI et al., 2013; SECRETARIA DE

VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2013; WHO, 2016).

Uma vacina para o P. vivax será necessária, não só em populações

endêmicas, mas principalmente naquelas populações onde as taxas de

transmissão são baixas e toda a população é não imune à doença, sendo mais

susceptível a adquiri-la. A vacina ideal é aquela que garante 90% de prevenção

de malária e também impede a sua transmissão. Desenvolver essa vacina ideal é

algo um pouco distante da realidade, mas uma vacina que previna 80% dos

indivíduos de se contaminarem com o plasmódio ou até mesmo uma que não

impeça o indivíduo de ficar doente, mas que corte a transmissão já é uma meta

que pode ser minimamente aceitável (MUELLER et al., 2015).

O desenvolvimento de vacinas para a malária concentra-se principalmente

nos esporozoítos da fase hepática e nos estágios sanguíneos, pois é justamente

com a interrupção desses estágios que ocorrerá a proteção do indivíduo

hospedeiro contra a doença e, consequentemente, impedirá a propagação do

parasito pelo sangue. (SAUERWEIN, 2007; TSUBOI et al., 2003). As vacinas que

focam nesses estágios de vida do parasito baseiam-se nas de estratégias de

bloqueio da infecção e invasão (MAZUMDAR et al., 2010).

Outra e mais nova vertente de estratégia de vacina é a de bloqueio de

transmissão que tem como objetivo impedir a transmissão do parasito entre os

mosquitos vetores. Essa vacina não impede que o indivíduo adquira a doença,

mas corta o ciclo de transmissão para o mosquito, impedindo que haja

transmissão de indivíduos infectados para indivíduos não infectados (ARÉVALO-

HERRERA et al., 2011), como também prevenindo o surgimento de uma re-

emergência de transmissão em áreas onde a completa eliminação já tinha sido

alcançada (MUELLER et al., 2015).

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20

Para que uma vacina contra malária seja eficaz, é de extrema importância

que estejam incluídos nela vários tipos de antígenos e, também, alvos para

diferentes estágios de vida do parasito (GIRARD et al., 2007).

1.5.1 Bloqueio da infecção

Por gerarem uma resposta ao anticorpo capaz de neutralizar os

esporozoítos e impedindo-os de invadir os hepatócitos, as vacinas que focam nos

esporozoítos são conhecidas como vacinas de estratégia pré-eritrocítica ou de

bloqueio de infecção. Além dessa neutralização, esse tipo de vacina se propõe a

induzir uma resposta imune mediada por células, que é capaz de interferir na

multiplicação intra-hepática do parasito (GIRARD et al., 2007).

O primeiro estudo de eficácia da vacina contra P. vivax em humanos foi

feito com a proteína 1 de malária vivax (VMP001), uma nova proteína que

incorpora as regiões amino e carboxi terminais da proteína circunsporozoíta

(CSP) e uma região de repetição que contém sequências de repetição das

variantes de P. vivax VK 210 (tipo 1) e VK 247 (tipo 2). De acordo com os

resultados obtidos, essa vacina foi bem tolerada e imunogênica, uma vez que

todos os voluntários geraram satisfatórias respostas imunes humorais e celulares

para o antígeno da vacina. Entretanto, essa vacina não foi capaz de induzir

proteção estéril. Houve apenas um retardo no período pré-patente em 59% dos

indivíduos vacinados e uma associação entre os níveis de anticorpos anti-tipo 1 e

o período pré-patente (BENNETT et al., 2016).

Peptídeos sintéticos derivados da CSP de P. vivax, N (região amino-

terminal), R (região de repetição), C (região carboxi-terminal), tiveram sua

imunogenicidade testada e obteve-se que todas as formulações dos três

peptídeos foram imunogênicas e induziram produção de anticorpos específicos e

de Interferon - gamma (IFN-γ). O peptídeo N induziu uma resposta mais rápida e

consistente que os outros dois e o C foi o que induziu resposta de forma mais

lenta. Quanto à produção de IFN-γ, células de 94% dos indivíduos demonstraram

resposta do IFN-γ em algum ponto durante o estudo, independentemente do

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21

peptídeo ou da dose, indicando que a vacina foi capaz de induzir uma resposta

específica mediada por células T na maioria dos participantes (HERRERA et al.,

2005). Estudo realizado com a mistura desses três peptídeos sintéticos formulada

em dois diferentes sistemas adjuvantes lipossomais: Montanide ISA 720 e

Montanide ISA 51 (emulsões de água em óleo) constitui uma vacina imunogênica,

segura, bem tolerada e que não apresentou nenhum relato de reação adversa

severa. Na fase I do teste dessa vacina, foi relatado que houve mais de 90% de

soroconversão e reconhecimento da proteína do esporozoíto pelos anticorpos e

que as regiões R foram mais bem reconhecidas por indivíduos de áreas

endêmicas do que as regiões N e C. Os peptídeos formulados em Montanide ISA

51 produziram um maior reconhecimento das proteínas do esporozoíto e

produção de IFN-γ quando comparadas às formuladas em Montanide ISA 720,

sugerindo que a escolha do adjuvante para a formulação dessa vacina é uma

variável que deve ser levada em conta (HERRERA et al., 2011).

Das vacinas que focam no bloqueio da infecção, a vacina candidata contra

a malária que está em estágio de desenvolvimento mais avançado (fase III) é

contra o P.falciparum. Essa vacina, a RTS,S/AS01, conhecida comercialmente

como MosquirixTM tem como alvo de ação a fase pré-eritrocítica do ciclo do

plasmódio e se baseia nos componentes antigênicos da proteína de superfície do

esporozoíto do P. falciparum (CSP). A RTS,S/AS01 é um antígeno candidato a

uma vacina recombinante, a qual é baseada em uma pseudopartícula, que

consiste em antígenos de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) e um

fragmento grande de CSP, envolvendo a região central de repetição (R) e a

região C-Terminal da proteína CSP, que contém epítopos T, fundido com o

antígeno de superfície (S) do vírus da hepatite B. A fim de alcançar uma melhor

reatividade celular, essa proteína é formulada em AS01 (sistema adjuvante

lipossomal) (SOUZA, MACHADO e VENTURA, 2015).

Os estudos de eficácia com a vacina RTS,S/AS01 estão em andamento há

mais de cinco anos e embora ainda não seja considerada uma vacina altamente

eficaz, uma vez que não tenha sido observado nenhum resultado com taxas

elevadas de eficácia, os resultados são bastante promissores. Ensaios clínicos da

função biológica dos anticorpos induzidos pelo antígeno RTS,S/AS01, através de

um método que mede a atividade fagocítica mediada por anticorpos anti-CSP em

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células T auxiliares do tipo 1 (THP-1), demonstraram que houve uma atividade

fagocítica bem robusta e repetitiva. Essa atividade fagocítica teve correlação com

o fragmento inteiro e com a região C-terminal do peptídeo CSP. Esta atividade

fagocítica, expressa como índice de opsonização, foi identificada como um

marcador de proteção induzido pela vacina RTS,S/AS01 e que a especificidade

do anticorpo está ligada a esse índice de opsonização (CHAUDHURY et al.,

2016).

Os primeiros resultados sobre a eficácia e segurança da fase III da

RTS,S/AS01, foram conduzidos durante 18 meses com 6.537 crianças de 6-11

semanas e 8.923 crianças de 5-17 meses em 11 locais de sete países do

continente africano (Burkina Faso, Gabão, Gana, Quênia, Malawi, Moçambique e

Tanzânia), onde há variação da intensidade de transmissão da malária. Foi

observado que a taxa de maior eficácia da vacina ocorreu nas áreas de menor

incidência da malária, o que pode indicar que a imunidade induzida por essa

vacina seja de curta duração (THE RTS,S CLINICAL TRIALS PARTNERSHIP,

2014). Com a primeira etapa desse estudo, pode-se concluir que a vacina em

teste proporcionou proteção contra a malária clínica e grave em crianças

africanas, uma vez que, nos 14 meses após a primeira dose de vacina, a

incidência de primeiros episódios de malária clínica nas primeiras 6000 crianças

de faixa etária mais avançada foi de 0,32 episódios/pessoa, apresentando uma

eficácia de 50,4%. Já a eficácia apresentada pela vacina contra a malária grave

foi de 45,1% (THE RTS,S CLINICAL TRIALS PARTNERSHIP, 2011). Em 2012,

foram publicados resultados da eficácia dessa candidata à vacina contra a malária

em crianças de 6 a 12 semanas. A vacinação foi realizada em conjunto com o

Programa de Imunização Expandido (PIE) em um esquema mensal de três doses.

Observou-se que a vacina RTS,S/AS01 co-administrada com vacinas do PIE

forneceu proteção modesta contra a malária clínica e grave em lactentes jovens

(THE RTS,S CLINICAL TRIALS PARTNERSHIP, 2012).

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1.5.2 Bloqueio da doença (MSP, AMA-1, DBP)

As vacinas que têm como foco o estágio sanguíneo do parasito, além de

reduzirem essas formas de vida parasitárias, são capazes, também de reduzir a

transmissão. O foco desse tipo de vacina está nos antígenos de estágio

sanguíneo, que podem ser encontrados na superfície dos merozoítos e agem

induzindo respostas imunes que bloqueiam a invasão dos eritrócitos, prevenindo

ou reduzindo episódios clínicos (BOES et al., 2016). As primeiras tentativas de

desenvolvimento de vacina foram a partir da proteína de superfície do merozoíto

(MSP). A maioria dos estudos com proteínas em P. falciparum está voltada para a

MSP-1. Essa proteína de superfície é um importante alvo para o desenvolvimento

da vacina, pois faz uma ligação entre o hospedeiro e o agente patogênico.

Entretanto, outras proteínas de merozoíto são elencadas como potenciais

antígenos candidatos à vacina dentre elas as que fazem parte do processo de

invasão dos eritrócitos (MAZUMDAR et al., 2010).

A Proteína de ligação do antígeno Duffy (PvDBP) liga-se com o receptor de

antígeno Duffy de quimiocinas (DARC) presente em reticulócitos humanos,

facilitando a invasão dessas células por merozoítos do P. vivax. Essa ligação é

propiciada pela região II (PvDBPII) dessa proteína, que é uma região conservada

de 130 kDa e é onde se localiza o recepetor DARC (MUELLER et al., 2015;

SAMPATH et al., 2013). Anticorpos contra a PvDBPII seriam promissores

candidatos a vacinas de estágio sanguíneo, uma vez que o bloqueio do receptor

que promove essa interação oferece um potencial mecanismo de bloqueio de

invasão e, consequentemente, previne o desenvolvimento da malária vivax

(MUELLER et al., 2015).

O plasmódio, uma vez que faz parte do grupo Apicomplexa, possui uma

estrutura denominada complexo apical em determinadas fases da vida, a qual tem

função de fixar e penetrar nas células do hospedeiro, caracterizando o grupo. O

antígeno 1 de membrana apical (AMA-1), proteína de superfície bastante

polimórfica, é expressa durante o estágio assexual sanguíneo do ciclo de vida do

plasmódio, sendo encontrado na membrana do complexo apical do esquizonte de

estágio tardio. (THERA et al., 2016). Esse antígeno tem sido utilizado como alvo

para vacinas contra a malária com o intuito de prevenir que os indivíduos

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desenvolvam a doença e até mesmo cheguem a óbito, induzindo anticorpos que

são capazes de bloquear a invasão parasitária na célula do hospedeiro. Existem

algumas vacinas que utilizam o AMA-1 como base e que estão em fase clínica de

desenvolvimento. Para o desenvolvimento destas vacinas, foram utilizadas duas

diferentes cepas do P. falciparum, a 3D7 e a FVO (TAKALA et al., 2009).

A PfAMA1-FVO, candidata à vacina contra a malária e que utiliza a cepa

FVO do P. falciparum, testada por Thera e colaboradores (2016), levou à

produção de altos níveis de anticorpos, que foram se elevando gradualmente até

atingir o limiar máximo no 84º após a vacinação. Entretanto, as repostas dos

anticorpos a essa vacina, não se mantiveram e retornaram aos níveis basais após

12 meses de aplicação da vacina. O teste foi realizado em indivíduos adultos que

habitam uma região africana em uma época de intensa transmissão de malária e

apesar de os níveis de anticorpos não terem sido mantidos, essa vacina foi

considerada segura e bem tolerada pelos indivíduos expostos à malária. Um

estudo realizado para verificar a segurança, imunogenicidade e reatogenicidade

da vacina baseada no AMA-1 do clone 3D7 em adultos expostos à malária

sazonal em Mali na África Ocidental, demonstrou que a vacina foi bem tolerada e

altamente imunogênica nestes indivíduos, uma vez que houve uma elevação

significativa de anticorpos anti-AMA-1 com um aumento de 6,4 vezes de

anticorpos nos indivíduos após três imunizações (THERA et al., 2008). Spring e

colaboradores (2009) realizaram a fase I do estudo para avaliar a

imunogenicidade e eficácia da vacina a partir do antígeno recombinante AMA-1,

utilizando a cepa 3D7 do P. falciparum e obtiveram que a vacina em teste reduziu

significativamente a carga parasitária e gerou uma forte imunogenicidade,

permanecendo uma candidata viável à vacina.

Dos antígenos de estágio sanguíneo de Plasmodium candidatos à vacina

de estágio eritrocítico, o MSP1 é um dos mais bem caracterizados, sendo que o

fragmento de 19 kDa da proteína de superfície do merozoíto do P. vivax

(PvMSP1) é considerado um dos mais promissores. A proteína PvMSP-1 contém

seis domínios polimórficos que são envoltos por sequências conservadas inter e

intra-específicas (SEPÚLVEDA et., 2016). Em Fonseca et al (2016), foi descrita

uma proteína recombinante baseada na MSP1, a PvRMC-MSP1. Essa proteína, a

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qual é uma promissora candidata à vacina de estágio pré-eritrocítico, preservou

os elementos estruturais da PvMSP119 e levou a uma produção de respostas de

anticorpos, células T CD4+ e CD8+ capazes de reconhecer a PvMSP119. O

fragmento MSP119 é produzido a partir da divisão do fragmento C-terminal MSP1-

42kDa em MSP133 e MSP119, quando se inicia a invasão dos eritrócitos pelo

parasito. Uma vez que a função do fragmento MSP119 é permanecer na superfície

da célula enviando sinais ao parasito para que se inicie o desenvolvimento

intracelular, anticorpos contra o MSP1 e em particular contra o fragmento de

19kDa, podem ser capazes de bloquear a invasão do eritrócito e replicação,

protegendo o indivíduo contra a parasitemia (FONSECA et al., 2016). A proteína

quimérica PvRMC-MSP1 é capaz de induzir anticorpos que reconhecem a vacina

recombinante PvMSP19 e, também, a proteína nativa em eritrócitos infectados

pelo P. vivax (FONSECA et al., 2016). Em Sepúlveda et al (2016), foi observada

uma alta soro-prevalência de pacientes, diagnosticados com malária vivax, com

anticorpos contra a PvMSP119 (87,9%), contrastando com a baixa soro

prevalência dos antígenos restantes, os quais representam a região variável da

molécula. A MSP-1 tem sido considerada umas das moléculas mais promissoras

devido aos resultados apresentados, tendo grandes chances de ser incluída numa

vacina contra malária, mas sua grande diversidade alélica é um dos principais

fatores que contribuem para que os resultados não sejam satisfatórios

(SEPÚLVEDA et al., 2016).

Outro estudo com a proteína MSP-1 realizado por Storti-Melo (2011) em

regiões endêmicas maláricas no Brasil para avaliar a resposta imune do anticorpo

naturalmente adquirido ao fragmento N-terminal do P. vivax MSP-1 (Pv200L),

confirmou-se a alta prevalência de indivíduos maláricos da região amazônica

brasileira que desenvolvem anticorpos específicos ao Pv 200L do P. vivax MSP-1,

sendo o Pv200L um fragmento imunogênico da região N-terminal do P. vivax

MSP-1 em indivíduos naturalmente expostos.

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1.5.3 Bloqueio da transmissão

As estratégias utilizadas para o bloqueio da transmissão têm como objetivo

eliminar o Plasmodium ainda dentro do intestino médio do mosquito ou até

mesmo prevenir a invasão do intestino médio e do epitélio da glândula salivar do

vetor, impedindo, dessa forma, que os mosquitos vetores se infectem e assim

prevenindo a propagação da doença (LAVAZEC e BOURGOUIN, 2008). Para que

o processo de bloqueio de transmissão seja bem sucedido, é necessário que uma

série de fatores tais como os antígenos utilizados como alvo, o tempo de

expressão do antígeno, a concentração do anticorpo e a ativação do

complemento em alguns casos, estejam todos bem determinados (ARÉVALO-

HERRERA et al., 2015).

Essa estratégia de imunidade é realizada através de anticorpos contra

proteínas de superfície dos gametócitos, os quais agem dentro do intestino do

mosquito ao realizar o repasto sanguíneo. É durante esse processo, cerca de 5 a

10 minutos após a ingestão, que os anticorpos agem, levando a não fertilização

ou até mesmo a destruição dos gametas. Em P. falciparum, esses antígenos são

divididos em duas classes. Os antígenos conhecidos como sendo de pré-

fertilização abrangem as maiores proteínas encontradas na superfície dos

gametas. Duas importantes proteínas que fazem parte da família das cisteínas

são Pfs48/45 e Pfs230. Os domínios de cisteína na Pfs48/45 estão relacionados

com a fertilidade do gameta masculino, sendo que essa proteína possui três

desses domínios e a Pfs230 possui 14 domínios de cisteína. Outros antígenos

candidatos para a vacina de bloqueio de transmissão são proteínas de superfície

expressas em zigotos e oocinetos, que são conhecidos como antígenos de pós-

fertilização. As principais proteínas desse grupo são a P25 e P28, que são

responsáveis pela sobrevivência do oocineto no intestino do vetor, pela

penetração no epitélio do inseto e sua transformação em oocisto (TSUBOI et al.,

2003).

Para proteína Pfs48/45 de P. falciparum, o modelo de expressão tem sido

baseado no sistema de Escherichia coli com caudas de histidina utilizadas para a

purificação da mesma (CHOWDHURY et al., 2009; OUTCHKOUROV et al., 2008)

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e resultados promissores tem sido obtidos nos estudos com a proteína desta

espécie de plasmódio. Entretanto, o elevado número de casos de malária pelo P.

vivax nas Américas e a necessidade de encontrar formas de controle dessa

espécie, tem direcionado esforços para o desenvolvimento de antígenos de

gametócito homólogos no P. vivax. Diante disso, em 2015, Arévalo-Herrera e

colaboradores, descreveram a síntese da proteína Pvs48/45, que está localizada

na superfície do gametócito do P. vivax. Esse antígeno de superfície atua na

fecundação do parasito, representando um alvo potencial para o bloqueio de

transmissão e atividade antiparasitária. Uma avaliação preliminar da

antigenicidade e imunogenicidade mostrou o potencial deste antígeno, uma vez

que 63,3% dos soros humanos testados apresentavam anticorpos naturais anti-

Pvs48/45 (ARÉVALO-HERRERA et al., 2015). A Pvs48/45 foi expressa utilizando

um modelo baseado na tiorredoxina (TRX). O sistema TRX está presente em

todos os organismos, sendo responsável por regular vários processos

bioquímicos dentro da célula, como por exemplo, a manutenção do ambiente

redox celular. A TRX, proteína termoestável, de 12 kDa, que possui duas

cisteínas ativas (NAKAMATSU, 2012), representa uma pequena porção de

qualquer proteína de fusão e que tem tanto a região N, quanto a C-terminal na

superfície molecular, o que significa que estão localizadas em pontos estratégicos

para que a fusão de outras proteínas seja facilitada. A TRX é bastante utilizada

para a purificação de proteínas devido a algumas de suas características. A

estabilidade térmica da molécula de TRX permite que as etapas de tratamento

térmico da purificação ocorram sem que haja prejuízo da proteína. Outra

vantagem do uso da TRX na purificação de proteínas é a sua localização nas

zonas de adesão entre as membranas do envelope celular da E. coli, facilitando a

sua liberação para o exterior da célula, que pode ocorrer com apenas um choque

osmótico ou um passo de congelamento/descongelamento (LAVALLIE, 1993).

A vacina de bloqueio de transmissão (TBV) possui muitas vantagens

quando comparada às vacinas que focam em outros estágios do ciclo de vida do

parasito. O grande problema das vacinas de bloqueio de infecção e invasão, por

exemplo, é o polimorfismo de antígeno ligado à pressão de seleção imune do

hospedeiro humano. O que não acontece na TBV, pois os antígenos utilizados

como alvos têm pouca diversidade na sequência, o que pode ser explicado pelo

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fato de as proteínas da fase esporogônica não serem sujeitas à pressão seletiva

no hospedeiro humano, como ocorre nos estágios sanguíneos (LAVAZEC e

BOURGOUIN, 2008).

2 JUSTIFICATIVA

Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito, tem a

capacidade de desenvolver respostas imunes específicas, protegendo-os de

evoluir a uma infecção malárica grave. Além disso, o soro desses indivíduos pode

impossibilitar a fertilização dos gametas, impedindo o desenvolvimento parasitário

e, consequentemente, bloqueando a transmissão desse parasito de pacientes

infectados para os mosquitos. Essa exposição à endemicidade viabiliza uma

vacina de bloqueio de transmissão (ARÉVALO-HERRERA, 2011). Já foi

demonstrado experimentalmente que anticorpos específicos contra antígenos de

Plasmodium expressos em gametócitos podem bloquear a transmissão do

plasmódio do hospedeiro vertebrado para o mosquito vetor (ARÉVALO-

HERRERA, et al., 2005). Apesar de não impedir que o indivíduo adquira a

doença, essa estratégia vacinal interrompe a transmissão de indivíduos infectados

para indivíduos não infectados (ARÉVALO-HERRERA et al., 2011), como também

previne o surgimento de uma re-emergência de transmissão em áreas onde a

completa eliminação já tenha sido alcançada (MUELLER et al., 2015).

Diante disso, a avaliação de potenciais antígenos de gametócitos faz se

necessária para subsidiar os estudos de desenvolvimento de vacinas de bloqueio

de transmissão. A avaliação preliminar da antigenicidade, imunogenicidade e

atividade de bloqueio de transmissão da Pvs48/45 foi previamente realizada em

amostras da Colômbia. Os resultados dessa avaliação mostraram potencial

promissor deste antígeno, uma vez que 63,3% dos soros humanos testados

apresentavam anticorpos naturais anti-Pvs48/45. Entretanto, esta avaliação foi

feita com um número amostral reduzido (30 indivíduos colombianos) e aponta a

necessidade do desenvolvimento de um estudo mais amplo sobre a prevalência

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de anticorpos naturalmente induzidos em áreas endêmicas para malária, para que

a eficácia dessa proteína no bloqueio da transmissão seja verificada.

Dessa forma, a avaliação da resposta de anticorpos adquiridos contra a

proteína Pvs48/45 em infecções naturais por P. vivax, em área endêmica para a

malária no Brasil, pode fornecer resultados que acrescentem e esclareçam ainda

mais o papel desses anticorpos e a relevância desse antígeno para o

desenvolvimento de vacinas.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar a resposta de anticorpos contra a proteína Pvs48/45 adquiridos em

infecções naturais por Plasmodium vivax.

3.2 Objetivos Específicos

Verificar a antigenicidade da proteína Pvs48/45 em indivíduos naturalmente

expostos ao Plasmodium vivax na região amazônica brasileira.

Avaliar a presença de gametócitos e o nível de parasitemia em relação à

resposta imune humoral anti-Pvs48/45.

Determinar a antigenicidadede de 05 subfragmentos (C-Terminal, N-

Terminal, Central, C-Terminal + Central e N-Terminal + Central) da proteína

Pvs48/45.

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30

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Objetos de Estudo

Para este estudo, foram incluídas 281 amostras coletadas em sete

diferentes cidades da região amazônica brasileira com intuito de ampliar a

abrangência de amostras para um estudo descritivo de antigenicidade. As

amostras são provenientes de Rio Branco/ Estado do Acre (n= 26, coletadas em

2003), Porto Velho/ Estado de Rondônia (n=26, coletadas em 2003), Belém (n=

25, coletadas em 2003), Goianésia do Pará (n= 20, coletadas em 2012) e Itaituba

(n= 19, coletadas em 2016) no Estado do Pará e nos municípios de Macapá (n=

16, coletadas em 2003) e Oiapoque (n= 150, coletadas em 2015), no Estado do

Amapá (Figura1). Em todos os pontos e esforços de coleta das amostras

utilizadas neste estudo, os pacientes foram selecionados de maneira aleatória

entre os que procuravam espontaneamente um centro de saúde público com

sintomas sugestivos de malária e que apresentaram resultado positivo para gota

espessa (CASSIANO et al., 2016; GOMES et al., 2015; STORTI-MELO et al.,

2011). Os indivíduos diagnosticados por meio da gota espessa foram confirmados

por PCR (reação em cadeia polimerase) (SNOUNOU et al., 1993). A confirmação

diagnóstica foi realizada na Seção de Parasitologia do Instituto Evandro Chagas.

O plasma foi separado e armazenado a -20ºC até o envio para Universidade

Federal de Sergipe.

Foram excluídos indivíduos com infecção concomitante crônica e

infecciosa. Doentes com infecção mista, malária severa ou complicada e

pacientes com relatos de reações a drogas, mulheres grávidas e os indivíduos

que não concordaram com o TCLE.

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31

Figura 1: Cidades da região amazônica brasileira onde foram realizadas as coletas. Fontes: Geomapas e IBGE

4.2 Aspectos éticos

As amostras analisadas nesse projeto foram gentilmente cedidas pelo Dr.

Ricardo Luiz Dantas Machado da seção de Parasitologia do Instituto Evandro

Chagas (Anexo A). Este projeto foi submetido para apreciação do Comitê de Ética

da Universidade Federal de Sergipe para solicitar reutilização das amostras e

aprovado sob número 1.774.182. (Anexo B)

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32

4.3 Análises Laboratoriais

4.3.1 Avaliação da resposta de anticorpos

As amostras de plasma sanguíneo foram analisadas em parceria com o Dr.

Sócrates Herrera e a Dra. Myrian Arévalo-Herrera do Centro de Investigação

Científica Caucaseco, em Cali, Colômbia. A avaliação de anticorpos naturais foi

realizada por Ensaio de absorção imunoenzimático (ELISA) como descrito em

Arévalo-Herrera et al. (2015), para verificar a presença de anticorpos

naturalmente adquiridos contra a proteína Pvs48/45 e seus cinco sub-fragmentos

(N-Terminal, C-Terminal, Central, N-Terminal + Central e C-Terminal + Central).

Todas as amostras foram analisadas em duplicata. Uma vez que a purificação da

proteína utilizou o sistema de Tiorredoxina, todas as amostras foram também

avaliadas por ELISA quanto à reatividade à tiorredoxina, sendo essa avaliação

realizada em paralelo com a proteína e os subfragmentos. Foram utilizadas

microplacas de 96 poços de fundo plano (Nunc-Immuno Plate, Maxisorp,

Roskilde, Denmark), revestidas com 50µL/poço da proteína recombinante

Pvs48/45 a 1,0µg/ml e incubadas a 4ºC durante a noite. As microplacas foram

lavadas 03 vezes e bloqueadas com 200µL por poço com PBS 1X, contendo

0,05% de Tween20 (PBS-T) e 5% de leite desnatado, durante duas horas à

temperatura ambiente. As amostras de soros foram pré-adsorvidas em 01 mg de

Acetona Powder de E.coli, em uma diluição de 1:10 em PBS1X, Tween 20 0,05%,

leite desnatado 2,5%, com agitação constante durante 30 min e ao final do tempo

de adsorção foram centrifugados a 1300 rpm durante 5 min. Uma alíquota do soro

adsorvido foi retirada para ser diluída a 1:200 em PBS1X, Tween 20 0,05%, leite

desnatado 2,5%. As placas foram lavadas 04 vezes com PBS1X, Tween 20

0,05% e incubadas por uma hora a temperatura ambiente com os soros a serem

avaliados (diluição 1:200), com prévia adsorção em Acetona Powder de E.coli.

Depois do tempo de incubação, as placas foram lavadas 05 vezes com solução

de lavado e adicionados 50µL/poço de conjugado anti-human IgG marcado com

fosfatase alcalina a uma diluição de 1:1000 preparada em solução (PBS1X,

Tween 20 0.05%, leite 2.5%) e incubada novamente por 1h. Por fim, as placas

foram lavadas 06 vezes e reveladas com substrato p-nitrofenil fosfato (p-NPP)

(Sigma, St. Louis, MO) durante 30 min e analisadas em um Espectrofotómetro a

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uma longitude de onda de 405 nm (ELX800NB Biotek). O ponto de corte foi

estabelecido como sendo três desvios-padrão acima do valor médio de

absorbância dos controles negativos.

4.3.2 Produção da Pvs48/45

Arévalo-Herrera et al. (2015), realizaram primeiramente um alinhamento de

sequência, seguido da harmonização do códon, clonagem, expressão e, por fim, a

purificação para a obtenção da proteína Pvs48/45. Para o alinhamento de

sequência, foi utilizado o site PlasmoDB, que serviu como base de dados para a

obtenção da sequência genética da proteína e os perfis de expressão do genes e

sequências homólogas de P. falciparum (PF3D7_1346700), P. knowlesi

(PKH_120750), P. berghei (PBANKA_135960), P. chabaudi (PCHAS_136420) e

P. yoelii (PYYM_1361700), para a determinação da similaridade entre as

espécies. O passo seguinte, de harmonização do códon, serviu para que a

proteína pudesse ser produzida em E. coli e foi realizado com o auxílio de uma

ferramenta algorítmica no EuGene software v0.92. Os genes sintéticos foram

digeridos por AluI e BamHI e separados por eletroforese em gel de agarose. As

bandas que corresponderam à Pvs48/45 foram inseridas no plasmídeo pET32a e,

em seguida, o vetor de expressão foi purificado. O produto obtido foi transformado

em células de E. coli e plaqueado para que os controles positivos fossem

selecionados.

4.3.3 Titulação das amostras

As amostras que apresentaram uma resposta imune humoral contra a

Pvs48/45 foram tituladas. A titulação foi realizada em diluições seriadas de 1:200,

1:400, 1:800, 1:1600.

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34

4.3.4 Interpretação dos Resultados

O resultado de cada amostra foi expresso pelo índice de reatividade (IR).

Este índice foi calculado pela divisão da média dos valores de absorbância de

cada amostra pelo valor do ponto de corte dos controles negativos utilizados

como referência em cada placa. O ponto de corte foi calculado pela soma da

média dos controles negativos com três vezes o desvio-padrão obtido. Dessa

forma as amostras positivas seriam aquelas que apresentaram um IR ≥ 1,0 e

negativas as que apresentarem um IR < 1,0. As amostras que apresentarem um

IR > 10 são consideradas de alta reatividade. As amostras que apresentaram

resultado positivo para a tiorredoxina foram consideradas falso-positivas, por a

mesma estar presente nos organismos, inclusive na E.coli, onde a proteína foi

expressa.

4.3.5 Análises Estatísticas

Foi aplicado o Teste Exato de Fisher no programa Bioestat 5.3 com nível

de significância de 95% para comparação dos índices de parasitemia e presença

de gametócitos com a frequência de resposta imune humoral e verificação da

antigenicidade da proteína Pvs48/45 e de seus subfragmentos.

5 RESULTADOS

5.1 Antigenicidade da proteína Pvs48/45 na Amazônia Brasileira

Das amostras analisadas para a resposta imune humoral contra a proteína

Pvs48/45, 63 (22,42%) amostras apresentaram uma resposta imune humoral

positiva e 20,28% das amostras reagiram também para a tiorredoxina além da

Pvs48/45. Os resultados obtidos para a prevalência das respostas de anticorpos

específicos anti-Pvs48/45, distribuídas por município, estão expressos na figura 2.

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35

Os resultados mostram que o perfil de resposta de anticorpos contra o

antígeno Pvs48/45 é variável de uma região para outra. As amostras oriundas do

município de Rio Branco apresentaram o maior percentual de resposta imune

(38,5%) e em nenhuma amostra de indivíduos provenientes de Macapá a proteína

Pvs48/45 apresentou antigenicidade. Os pacientes com malária vivax de Itaituba,

Belém e Goianésia do Pará apresentaram percentuais semelhantes de amostras

com respostas imunes positivas (15,8%; 12,5% e 10,0%, respectivamente).

Figura 2: Distribuição da frequência de resposta imune humoral contra a Pvs48/45 de acordo com o município.

Dentre as 63 amostras positivas para a Pvs48/45, o valor máximo obtido

em índice de reatividade (IR) foi de 5,5 e o mínimo de 1,0 (limiar de reatividade

estimado). Como observado na figura 3, a dispersão dos índices de reatividade

mostra que os mesmos estão distribuídos próximos ao limiar de reatividade entre

1-2, com uma mediana de 1,3 (Média=1,5; SD=0,605).

Apenas uma amostra apresentou um IR > 5 e três apresentaram IR ≥ 2.

Como o IR é um valor que expressa quantas vezes a densidade óptica (DO) da

amostra é maior que o ponto de corte, a maioria apresentou-se pouco reativa.

0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% 35.0% 40.0%

Rio Branco

Porto Velho

Belém

Goianésia

Itaituba

Macapá

Oiapoque

Frequência

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Figura 3: Dispersão dos índices de reatividade das amostras em que foram encontradas respostas de anticorpos específicos anti-Pvs48/45.

As amostras que apresentaram uma resposta imune positiva foram tituladas

e a diluição máxima em que continuava sendo obtida uma resposta imune positiva

foi de 1:1600.

5.2 Índices de parasitemia e presença de gametócitos

Para avaliar a relação entre os índices de parasitemia e a presença de

gametócitos frente à resposta de anticorpos contra a Pvs48/45, foi utilizado um

subgrupo de amostras do município do Oiapoque, totalizando 96 amostras, nas

quais foram mensurados os gametócitos na gota espessa e os dados

epidemiológicos estavam completos.

Na tabela 1, pode-se observar que a média de idade dos pacientes era de

27 anos, com uma maior porcentagem de homens com 66,67%. Dentre as 96

amostras analisadas a presença de gametócitos foi observada em 88,3%. Os

dados de parasitemia revelaram uma média de 3.056 V/mm3. As amostras foram

classificadas como sendo presente ou ausente em relação aos gametócitos e a

parasitemia foi avaliada de acordo com o preconizado pelo Ministério da Saúde

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 50 100 150 200 250 300

Índ

ice

de

Re

ati

vid

ad

e

Amostras

Cut off

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37

no Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária (2015), que considera baixa

parasitemia valores menores que 10.000 parasitos/mm³.

Tabela 1: Dados epidemiológicos das amostras do Oiapoque.

Gênero (%)

Idade (anos)

Parasitemia (V/mm3)

Presença de gametócitos

Feminino Masculino Mínima Média Máxima Mínima Média Máxima

88,3%

33,33 66,67 07 27 79 35 3.056 30.000

Em relação à parasitemia, 28,7% das amostras com baixos índices

parasitêmicos apresentaram resposta imune humoral positiva. Já nas amostras

que apresentaram um índice parasitêmico alto, o percentual de amostras com

resposta de anticorpos positiva foi de 22,2%, (p=0,5099). Esta diferença não foi

significativa, como se pode observar na tabela 2.

Tabela 2: Relação entre a resposta imune humoral e o índice de parasitemia.

RESPOSTA

IMUNE POSITVA

(%)

RESPOSTA

IMUNE

NEGATIVA (%) TOTAL

VALOR DE

P**

ALTA*

PARASITEMIA 2 (22,2%) 7 (77,8%) 9(10,5%)

0,5099 BAIXA*

PARASITEMIA 25 (28,7%) 62 (71,3%) 87 (90,6%)

TOTAL 27 69 96 *Alta parasitemia: ≥ 10.000parasitos/mm³; baixa parasitemia: < 10.000parasitos/mm³. ** Teste Exato de Fisher.

A resposta imune humoral foi avaliada em relação à presença de

gametócitos, sendo que em 25,3% das amostras com presença de gametócitos

apresentaram resposta imune humoral positiva para Pvs48/45. Já nas amostras

em que não foram encontrados gametócitos, o percentual de resposta imune

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positiva foi de 46,2%, não sendo estatisticamente significativa esta diferença

(p=0,1128) (Tabela 3).

Tabela 3: Relação entre a resposta imune humoral e a presença de gametócitos.

RESPOSTA

IMUNE POSITVA

(%)

RESPOSTA IMUNE NEGATIVA

(%) TOTAL VALOR DE P*

PRESENÇA DE

GAMETÓCITOS 21 (25,3%) 62 (74,7%) 83 (86,5%)

0,1128 AUSÊNCIA DE

GAMETÓCITOS 6 (46,2%) 7 (53,8%) 13 (13,5%)

TOTAL 27 69 96 (100%) * Teste Exato de Fisher

5.3 Reatividade das amostras aos subfragmentos da Pvs48/45

Além da proteína inteira, foram expressos 05 subfragmentos

correspondentes às regiões: N-Terminal, C-Terminal, Central, N-Terminal +

Central e C-Terminal + Central. Um subgrupo da amostra investigado (n= 169),

distribuídas entre as sete áreas endêmicas, foi utilizado para avaliar a prevalência

de anticorpos contra essas regiões específicas da proteína e assim estimar

possíveis localizações de epítopos.

Na tabela 4, pode-se observar que o subfragmento recombinante C-

Terminal + Central foi o que apresentou maior percentual de reatividade (32%;

p=0,0565), apesar de estatisticamente não significativo. A região do peptídeo que

apresentou uma reatividade mais baixa foi a Central, com 17% (p=0,1645) das

amostras.

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Tabela 4: Percentual de amostras processadas por peptídeo

PEPTÍDEO N RI POSITIVA

N (%) VALOR DE P*

Pvs48/45 281 63 (22,4%)

N-terminal 169 40 (23,7%) 0,4465

C-terminal 169 35 (20,7%) 0,4128

Central 169 29 (17,2%) 0,1645

N-terminal + Central 169 45 (26,6%) 0,2478

C-terminal + Central 169 54 (32,0%) 0,0565

* Teste Exato de Fisher

6 DISCUSSÃO

Diferentes estratégias vacinais que protegem o indivíduo de adquirir e

desenvolver a infecção malárica, utilizando diferentes antígenos do parasito, tem

sido avaliadas (BENNETT et al., 2016; YADAVA & WATERS, 2017). Entretanto,

resultados efetivos ainda não foram alcançados. A estratégia de bloqueio de

transmissão, apesar de não impedir que o indivíduo desenvolva a doença, tem a

capacidade de permitir que indivíduos contaminados, uma vez vacinados, não a

transmitam (ARÉVALO-HERRERA et al., 2015).

Neste estudo foram analisadas 281 amostras de soro de pacientes

maláricos naturalmente expostos da Amazônia brasileira. Destas, 63 (22,42%)

apresentaram uma resposta imune ao antígeno Pvs48/45. Embora a

soroprevalência tenha sido baixa, a confirmação dessa antigenicidade mostra

que há a produção de anticorpos anti-Pvs48/45 pelos indivíduos, após serem

expostos à infecção natural por P.vivax. O fato de esses anticorpos naturais

reconhecerem a proteína recombinante Pvs48/45 evidencia que pelo menos um

epítopo estava presente na proteína recombinante testada. Entretanto, a baixa

prevalência pode ser devido ao sistema de expressão utilizado, o qual se baseia

no modelo da tiorredoxina. O alto percentual de amostras que reagiram também

para a tiorredoxina além da Pvs48/45 (20,28%), fez com que uma considerável

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parte das amostras tenha sido classificada como falso-positivo, levando a essa

baixa soroprevalência. Por outro lado, deve-se considerar o variável nível de

endemicidade destas regiões (MOURÃO et al., 2014), diferindo do perfil de

transmissão malárica em regiões colombianas (ARÉVALO-HERRERA et al.,

2015). Ademais, o passado malárico destes pacientes investigados na Amazônia

brasileira mostra que 34% eram primo-infectados, comprometendo na resposta a

esta proteína investigada. Por último, a população brasileira é bastante

miscigenada, devido à influência da colonização pelos portugueses, onde houve

cruzamentos que envolveram principalmente os europeus, africanos e americanos

nativos (FURINI et al., 2016), onde polimorfismos de moléculas do sistema imune

podem comprometer sua eficiência (CASSIANO et al., 2015).

De fato, indivíduos que habitam áreas endêmicas estão continuamente

expostos ao Plasmodium, e por manter um contato direto com o parasito, estão

mais propensos a desenvolver uma imunidade clínica, protegendo-os contra o

desenvolvimento de uma malária grave. Esses indivíduos não desenvolvem uma

imunidade estéril, uma vez que essa imunidade não é alcançada sob condições

naturais. Em uma infecção natural, indivíduos podem não apresentar altos títulos

de gametócitos, e embora, os gametócitos de P. vivax sejam encontrados na

maioria das infecções antes do aparecimento das manifestações clínicas

(MUELLER et al.,2015), a proporção em relação aos estágios assexuais não

alcança 10%. Além disso, esses gametócitos permanecem circulando na corrente

sanguínea durante 03 dias no máximo (OLLIARO et al., 2016). Essa talvez seja

outra explicação para o baixo percentual de resposta ao antígeno Pvs48/45

utilizado neste estudo. Nesse sentido, não se pode descartar a possibilidade de

que o antígeno testado seja pouco reconhecido por indivíduos que estão

naturalmente expostos ao plasmódio na região amazônica brasileira. Não

obstante, fica reforçada a importância de avaliar a efetividade dos anticorpos que

estão sendo produzidos por esses indivíduos, com a realização de testes de

imunogenicidade e de bloqueio de transmissão para verificar se essa proteína tem

a capacidade de bloquear o ciclo de vida do plasmódio.

Os resultados evidenciam que a presença ou ausência de gametócitos não

está relacionada com o desenvolvimento de resposta de anticorpos contra a

Pvs48/45 (tabela 3). Isso pode ser devido ao fato de que os gametócitos podem

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não ter sido encontrados no exame de gota espessa, por estarem presentes em

baixas concentrações (OLLIARO et al., 2016), mas suficientes para garantir o

contato dos indivíduos com essas formas parasitárias. Esses resultados reforçam

a necessidade de maiores investimentos e estudos com o antígeno Pvs48/45

como candidato a uma vacina de bloqueio de transmissão, uma vez que os

anticorpos podem se desenvolver independentemente da presença elevada de

gametócitos na corrente sanguínea. Indivíduos que sofreram mais episódios de

malária apresentam parasitemia mais baixa que aqueles que reportaram menos

episódios maláricos (VÁSQUEZ-JIMÉNEZ et al., 2016). No presente estudo, tanto

os indivíduos com alta e baixa parasitemias, tiveram perfil de resposta de

anticorpos anti-Pvs 48/45 semelhante. Esses resultados podem indicar que a

proteína Pvs48/45 é antigênica em populações naturalmente expostas

independentemente dos baixos índices de parasitemia, comumente observados

em áreas endêmicas. Fato que talvez possa ser sustentado pela presença de

gametócitos logo nos estágio iniciais da infecção por P. vivax, mesmo que em

baixas parasitemias (OLLIARO, et al. 2016).

Ao analisar a antigenicidade do peptídeo recombinante C-terminal acrescido

da porção Central, verificou-se que essa região apresentou maior percentual de

antigenicidade, embora estatisticamente não significativo (32%), quando

comparado com a antigenicidade obtida com o antígeno completo (22,42%).

Estudos com a proteína homóloga Pfs48/45 de P. falciparum tem revelado que os

fragmentos amino-terminal (N-terminal) e carboxi-terminal (C-terminal) podem

induzir respostas de anticorpos capazes de bloquear a transmissão

(OUTCHKOUROV et al., 2008). Estudo com a proteína Pfs48/45 de P. falciparum

tem obtido progressos na identificação de epítopos conformacionais capazes de

induzir anticorpos bloqueadores. Foram identificados dois epítopos (I e II),

localizados na região C-terminal dessa proteína, como alvos altamente eficientes

por conterem domínios cruciais para o desenvolvimento de uma vacina de

bloqueio de transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2007). A Pvs48/45 assim como

sua homóloga Pfs48/45 se enquadram no grupo das proteínas que possuem

domínio ricos em cisteína. Como mostrado previamente, os resíduos de cisteína

localizados nas regiões Central e C-terminal da Pfs48/45 são cruciais para a

apresentação dos epítopos que induzem anticorpos bloqueadores. Essa é uma

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característica essencial para a efetividade de uma vacina de bloqueio de

transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2007). Embora a expressão dessas

proteínas, que fazem parte da classe das cisteínas, na sua conformação

adequada tenha sido de extrema complexidade, alguns estudos alcançaram a

expressão de um fragmento da proteína em sua estrutura conformacional correta,

de maneira que o reconhecimento da proteína seja feito de maneira facilitada. O

fragmento C-terminal da proteína Pfs48/45 foi fundido a quatro catalisadores

(DsbA, DsbC, FkpA, e SurA) para a sua expressão e, com isso, foi sintetizada

uma proteína corretamente dobrada, gerando altos títulos de anticorpos

(OUTCHKOUROV et al., 2008). Essa pode representar uma estratégia para novos

estudos de expressão com a Pvs48/45, ou especificamente seu subfragmento C-

terminal, para futuros ensaios experimentais de imunogenicidade.

Finalmente, é de extrema importância conduzir estudos de eficácia adicionais

para determinar se os resultados obtidos até agora estão no caminho certo ou se

uma correção de curso é necessária. O sucesso de uma vacina contra P. vivax

pode ainda demorar, mas investimentos são necessários, visto que este parasito

da malária ainda negligenciado está difundido nas Américas e relatos de maiores

complicações clínicas começam a surgir (ALHO et al., 2017; DEMISSIE e

KETEMA, 2016; GELETA e KETEMA, 2016; GUPTA et al., 2016).

7 CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS

A proteína recombinante Pvs48/45 apresentou uma baixa resposta de

anticorpos naturalmente induzidos em indivíduos da Amazônia brasileira.

Apesar disso, os baixos índices de parasitemia observados na área endêmica

estudada não influenciaram o reconhecimento antigênico desta proteína.

A ausência de gametócitos circulantes identificados por microscopia também

não representa um fator limitante ao desenvolvimento de resposta de anticorpos

contra a Pvs48/45.

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A otimização de estudos com utilização de um fragmento isolado pode gerar

resultados mais efetivos para o entendimento do potencial imunogênico deste

antígeno e do potencial dos epítopos localizados nessas regiões em induzir

anticorpos bloqueadores.

E, por fim, os modelos utilizados na expressão e purificação da proteína

devem ser levados em consideração, uma vez que essa parte do processo possa

estar interferindo nos dados de antigenicidade obtidos. Espera-se que os

resultados desse estudo possam ter contribuições significativas para o

desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão eficiente contra a

proteína Pvs48/45 em ensaios futuros.

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8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO A

Declaração de doação das amostras

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ANEXO B

Parecer Consubstanciado do CEP

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APÊNDICE A

Artigo a ser submetido ao periódico Acta Tropica, ISSN: 0001-706X

Avaliação da Resposta Imune Humoral Anti-Pvs48/45 em Infecções Naturais por Plasmodium vivax da Amazônia

Brasileira

Tatiana M. S. Cisne Pessoa1; Myrela C. Santos de Jesus1 Rubens Alex de Oliveira Menezes2; Ricardo L. D. Machado3; Sócrates Herrera4; Luciane M.

Storti-Melo1

1Programa de Pós Graduação em Biologia Parasitária, Universidade Federal de Sergipe (UFS),

49100-000, São Cristóvão, SE, Brasil. 2Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários da Universidade Federal do Pará; 3

Instituto Evandro Chagas/Serviço de

Vigilância em Saúde/Ministério da Saúde (IEC), Belém, PA, Brasil. 4Centro de Investigação

Científica Caucaseco, Cali, Colômbia

Resumo

A malária continua sendo responsável por grande morbidade e mortalidade em muitos países tropicais e subtropicais. Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito da malária em áreas endêmicas desenvolvem respostas imunes específicas, levando a uma redução da carga parasitária e das manifestações clínicas. O soro desses indivíduos pode impossibilitar a fertilização dos gametas nos mosquitos, bloqueando a transmissão desse parasito para o vetor. A proteína Pvs48/45 é encontrada na superfície dos gametócitos e utilizada como alvo dos anticorpos viabilizando essa estratégia de uma vacina de bloqueio de transmissão. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta de anticorpos naturalmente adquirida em infecções por Plasmodium vivax contra a proteína Pvs48/45. A pesquisa de anticorpos IgG anti-Pvs48/45 foi realizada por ELISA no soro de 281 amostras de pacientes maláricos residentes na região amazônica brasileira. O ponto de corte foi estabelecido utilizando soro de voluntários que nunca tiveram contato com o plasmódio, estabelecendo a média da densidade óptica (DO) mais três desvios padrão. Dos 281soros analisados, em 22,4% foram encontradas respostas de anticorpos específicos anti-Pvs48/45 e os índices de parasitemia e a presença de gametócitos não influenciaram o reconhecimento antigênico desta proteína. Dentre os cinco subfragmentos analisados, a região recombinante C-Terminal + Central da Pvs48/45 foi a que apresentou maior reconhecimento antigênico na amostra em estudo (32%), apesar de não ser estatisticamente significativo. Estudos com a utilização de uma região isolada da proteína podem facilitar o entendimento do potencial imunogênico desse

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antígeno. Esse estudo visa contribuir para o desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão eficiente contra a proteína Pvs48/45 em ensaios futuros.

Palavras-chave: Pvs48/45; vacina; resposta imune; Malária.

Introdução

O Plasmodium vivax e os vetores envolvidos no ciclo biológico da malária têm várias características distintas que permitem a transmissão deste parasito, tanto em climas temperados como em áreas tropicais (VALLEJO et al., 2016). No entanto, nenhuma delas é tão particular como a capacidade desta espécie de plasmódio formar hipnozoítos, os quais reativam periodicamente e podem causar múltiplos episódios de malária e, que pode ser responsável por até 80% dos episódios clínicos (HOWES et al., 2016). Do número de casos de malária nas Américas, a América do Sul é responsável pela grande parte dos casos. Destes, 70% são do Brasil, onde aproximadamente 99% da transmissão da malária concentra-se na Região Amazônica, sendo que o P. vivax tem sido a espécie mais prevalente, responsável por aproximadamente 84% dos casos nesta região (GOMES et al., 2016; DOTRÁRIO et al., 2016). A manutenção do número de casos de malária, juntamente com o rápido desenvolvimento do P. vivax nos mosquitos vetores (OLLIARO et al., 2016) e o controle dificultado por métodos tradicionais em regiões endêmicas, tem mostrado a importância da identificação de técnicas efetivas e economicamente viáveis, que possam interromper a transmissão de malária em regiões endêmicas (MUELLER et al., 2015).

Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito, tem a capacidade de desenvolver respostas imunes específicas, protegendo-os de evoluir a uma infecção malárica grave. Além disso, o soro desses indivíduos pode impossibilitar a fertilização dos gametas, impedindo o desenvolvimento parasitário e, consequentemente, bloqueando a transmissão desse parasito de pacientes infectados para os mosquitos (GREENWOD, et al., 2008). Essa exposição à endemicidade viabiliza uma vacina de bloqueio de transmissão (ARÉVALO-HERRERA, 2011). Já foi demonstrado experimentalmente que anticorpos específicos contra antígenos de Plasmodium expressos em gametócitos podem bloquear a transmissão do plasmódio do hospedeiro vertebrado para o mosquito vetor (ARÉVALO-HERRERA, et al., 2005). Apesar de não impedir que o indivíduo adquira a doença, essa estratégia vacinal interrompe a transmissão de indivíduos infectados para indivíduos não infectados (ARÉVALO-HERRERA et al., 2011; TSUBOI et al., 2003), como também previne o surgimento de uma re-emergência de transmissão em áreas onde a completa eliminação já tenha sido alcançada (MUELLER et al., 2015).

A proteína Pvs48/45 está localizada na superfície do gametócito do P.

vivax e atua na fecundação do parasito, representando um alvo potencial para o

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bloqueio de transmissão e atividade anti-parasitária (ARÉVALO-HERRERA et al.,2015). Sua síntese foi descrita recentemente e a avaliação preliminar das suas propriedades imunológicas, como antigenicidade, imunogenicidade e atividade de bloqueio de transmissão foi realizada pela primeira vez em amostras de pacientes com malária vivax da Colômbia. Entretanto, esta investigação aponta a necessidade de avaliação mais ampla em áreas endêmicas para malária, para que a eficácia dessa proteína no bloqueio da transmissão seja verificada. Dessa forma, a estimativa da resposta de anticorpos adquiridos contra a proteína Pvs48/45 em infecções naturais por P. vivax, em área endêmica no Brasil, pode fornecer resultados que acrescentem e esclareçam ainda mais o papel desses anticorpos e a relevância desse antígeno para o desenvolvimento de vacinas.

Esta proteína, juntamente com os antígenos de pós-fertilização Pvs25 e Pvs28, apresentam uma sequência de polimorfismos altamente limitada e uma baixa diversidade de nucleotídeos, quando comparados aos antígenos de estágio sanguíneo (KANG et al., 2013). Essas características dão suporte ao potencial promissor desse antígeno no desenvolvimento de uma nova estratégia de vacina. Apresentamos aqui, pela primeira vez, a resposta imune humoral à proteína Pvs48/45, em amostras de pacientes maláricos da região Amazônica brasileira.

Materiais e métodos

Objetos de Estudo

Para este estudo, foram incluídas 281 amostras coletadas em sete diferentes cidades da região amazônica brasileira com intuito de ampliar a abrangência de amostras para um estudo descritivo de antigenicidade. As amostras são provenientes de Rio Branco/ Estado do Acre (n= 26, coletadas em 2003), Porto Velho/ Estado de Rondônia (n=26, coletadas em 2003), Belém (n= 25, coletadas em 2003), Goianésia do Pará (n= 20, coletadas em 2012) e Itaituba (n= 19, coletadas em 2016) no Estado do Pará e nos municípios de Macapá (n= 16, coletadas em 2003) e Oiapoque (n= 150, coletadas em 2015), no Estado do Amapá (Figura1). Em todos os pontos e esforços de coleta das amostras utilizadas neste estudo, os pacientes foram selecionados de maneira aleatória entre os que procuravam espontaneamente um centro de saúde público com sintomas sugestivos de malária e que apresentaram resultado positivo para gota espessa e confirmados como malária vivax por diagnóstico molecular (CASSIANO et al., 2016; GOMES et al., 2015; STORTI-MELO et al., 2011).

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Figura 1: Cidades da região amazônica brasileira onde foram realizadas as coletas. Fonte: Geomapas e IBGE

Aspectos Éticos

Este projeto foi submetido para apreciação do Comitê de Ética da Universidade Federal de Sergipe para solicitar reutilização das amostras e aprovado sob número 1.774.182.

Análises Laboratoriais

As amostras de plasma sanguíneo foram analisadas no Centro de Investigação Científica Caucaseco, em Cali, Colômbia. A avaliação de anticorpos naturalmente adquiridos contra a proteína Pvs48/45 e seus cinco sub-fragmentos (N-Terminal, C-Terminal, Central, N-Terminal + Central e C-Terminal + Central) foi realizada por Ensaio de absorção imunoenzimático (ELISA) como descrito em Arévalo-Herrera et al. (2015). Todas as amostras foram analisadas em duplicata. Uma vez que a purificação da proteína utilizou o sistema de Tiorredoxina, todas as amostras foram também avaliadas por ELISA quanto à reatividade à

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tiorredoxina, sendo essa avaliação realizada em paralelo com a proteína e os subfragmentos.

Titulação das amostras

As amostras que apresentaram uma resposta imune humoral contra a Pvs48/45 foram tituladas. A titulação foi realizada em diluições seriadas de 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600.

Interpretação dos Resultados

O resultado de cada amostra foi expresso pelo índice de reatividade (IR). Este índice foi calculado pela divisão da média dos valores de absorbância de cada amostra pelo valor do ponto de corte dos controles negativos utilizados como referência em cada placa. O ponto de corte foi calculado pela soma da média dos controles negativos com três vezes o desvio-padrão obtido. Dessa forma as amostras positivas seriam aquelas que apresentaram um IR ≥ 1,0 e negativas as que apresentarem um IR < 1,0. As amostras que apresentaram resultado positivo para a tiorredoxina foram consideradas falso-positivas, por a mesma estar presente nos organismos, inclusive na E.coli, onde a proteína foi expressa, como descrito em Arévalo-Herrera (2015).

Análises Estatísticas

Foi aplicado o Teste Exato de Fisher no programa Bioestat 5.3 com nível de significância de 95% para comparação dos índices de parasitemia e presença de gametócitos com a frequência de resposta imune humoral e verificação da antigenicidade da proteína Pvs48/45 e de seus subfragmentos.

Resultados

Antigenicidade da proteína Pvs48/45 na Amazônia brasileira

Das amostras analisadas para a resposta imune humoral contra a proteína Pvs48/45, 63 (22,42%) amostras apresentaram uma resposta imune humoral positiva (Figura 2) e 20,28% das amostras reagiram também para a tiorredoxina além da Pvs48/45.

Os resultados mostram que o perfil de resposta de anticorpos contra o antígeno Pvs48/45 é variável de uma região para outra. As amostras provenientes

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do município de Rio Branco apresentaram um maior percentual de resposta imune positiva (38,5%) e em nenhuma amostra de indivíduos provenientes de Macapá a proteína Pvs48/45 apresentou antigenicidade. Os pacientes com malária vivax de Itaituba, Belém e Goianésia do Pará apresentaram percentuais semelhantes de amostras com respostas imunes positivas (15,8%; 12,5% e 10,0%, respectivamente).

Figura 2: Distribuição da frequência de resposta imune humoral contra a Pvs48/45 de acordo com o município.

Dentre as 63 amostras positivas para a Pvs48/45, o valor máximo obtido em índice de reatividade (IR) foi de 5,5 e o mínimo de 1,0 (limiar de reatividade estimado). A dispersão dos índices de reatividade (Figura 3) mostra que os mesmos estão distribuídos próximos ao limiar de reatividade entre 1-2, com uma mediana de 1,3 (Média=1,5; SD=0,605).

Apenas uma amostra apresentou um IR > 5 e três apresentaram IR ≥ 2. Como o IR é um valor que expressa quantas vezes a densidade óptica (DO) da amostra é maior que o ponto de corte, a maioria apresentou-se pouco reativa.

As amostras que apresentaram uma resposta imune positiva foram tituladas e a diluição máxima em que continuava sendo obtida uma resposta imune positiva foi de 1:1600.

0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% 35.0% 40.0%

Rio Branco

Porto Velho

Belém

Goianésia

Itaituba

Macapá

Oiapoque

Frequência

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Figura 3: Dispersão dos índices de reatividade das amostras em que foram encontradas respostas de anticorpos específicos anti-Pvs48/45.

Índices de parasitemia e presença de gametócitos

Para avaliar a relação entre os índices de parasitemia e a presença de gametócitos frente à resposta de anticorpos contra a Pvs48/45, foram utilizadas somente as amostras do município do Oiapoque, pois foram mensurados os gametócitos na gota espessa.

Os dados de parasitemia revelaram uma média de 3.056 parasitos/mm3. As amostras foram classificadas como sendo presente ou ausente em relação aos gametócitos e a parasitemia foi avaliada de acordo com o preconizado pelo Ministério da Saúde no Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária (2015), que considera baixa parasitemia valores menores que 10.000 parasitos/mm³. As amostras apresentaram 28,7% com baixa parasitemia e resposta imune humoral positiva. Já nas amostras que apresentaram altas parasitemias, a resposta de anticorpos positiva foi de 22,2%, (p=0,5099). Esta diferença não foi significativa (Tabela 1). Os resultados mostram que em 25,3% das amostras com presença de gametócitos a resposta imune humoral positiva para Pvs48/45. Já nas amostras em que não foram encontrados gametócitos, o percentual de resposta imune positiva foi de 46,2%, não sendo estatisticamente significativa esta diferença (p=0,1128) (Tabela 1).

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 50 100 150 200 250 300

Índ

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Re

ati

vid

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e

Amostras

Cut off

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Tabela 1: Relação entre a resposta imune humoral e o índice de parasitemia.

RESPOSTA

IMUNE POSITVA

(%)

RESPOSTA

IMUNE

NEGATIVA (%) TOTAL

VALOR

DE P**

ALTA*

PARASITEMIA 2 (22,2%) 7 (77,8%) 9(10,5%)

0,5099 BAIXA*

PARASITEMIA 25 (28,7%) 62 (71,3%) 87 (90,6%)

TOTAL 27 69 96

PRESENÇA DE

GAMETÓCITOS 21 (25,3%) 62 (74,7%) 83 (86,5%)

0,1128 AUSÊNCIA DE

GAMETÓCITOS 6 (46,2%) 7 (53,8%) 13 (13,5%)

TOTAL 27 69 96 (100%) *Alta parasitemia: ≥ 10.000 parasitos/mm³; baixa parasitemia: < 10.000 parasitos/mm³. ** Teste Exato de Fisher.

Reatividade das amostras aos subfragmentos da Pvs48/45

Além da proteína inteira, foram expressos 05 subfragmentos correspondentes às regiões: N-Terminal, C-Terminal, Central, N-Terminal + Central e C-Terminal + Central. Um subgrupo da amostra investigado (n= 169), distribuídas entre as sete áreas endêmicas, foi utilizado para avaliar a prevalência de anticorpos contra essas regiões específicas da proteína e assim estimar possíveis localizações de epítopos.

Na tabela 2, pode-se observar que o subfragmento recombinante C-Terminal + Central foi o que apresentou um maior percentual de reatividade (32%; p=0,0565), embora não significativo estatisticamente. A região do peptídeo que apresentou uma reatividade mais baixa foi a Central, com 17% (p=0,1645) das amostras.

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Tabela 2: Percentual de amostras processadas por peptídeo

PEPTÍDEO N RI POSITIVA

N (%) VALOR DE P*

Pvs48/45 281 63 (22,4%)

N-terminal 169 40 (23,7%) 0,4465

C-terminal 169 35 (20,7%) 0,4128

Central 169 29 (17,2%) 0,1645

N-terminal + Central 169 45 (26,6%) 0,2478

C-terminal + Central 169 54 (32,0%) 0,0565

* Teste Exato de Fisher

Discussão

Diferentes estratégias vacinais que protegem o indivíduo de adquirir e desenvolver a infecção malárica, utilizando diferentes antígenos do parasito, tem sido avaliadas (BENNETT et al., 2016; YADAVA & WATERS, 2017). Entretanto, resultados efetivos ainda não foram alcançados. A estratégia de bloqueio de transmissão, apesar de não impedir que o indivíduo desenvolva a doença, tem a capacidade de permitir que indivíduos infectados, uma vez vacinados, não a transmitam (ARÉVALO-HERRERA et al., 2015).

Neste estudo foram analisadas 281 amostras de soro de pacientes maláricos naturalmente expostos da Amazônia brasileira. Destas, 63 (22,42%) apresentaram uma resposta imune ao antígeno Pvs48/45. Embora a soroprevalência tenha sido baixa, a confirmação dessa antigenicidade mostra que há a produção de anticorpos anti-Pvs48/45 pelos indivíduos, após serem expostos à infecção natural por P.vivax. O fato de esses anticorpos naturais reconhecerem a proteína recombinante Pvs48/45 evidencia que pelo menos um epítopo estava presente na proteína recombinante testada. Entretanto, a baixa prevalência pode ser devido ao sistema de expressão utilizado, o qual se baseia no modelo da tiorredoxina. O alto percentual de amostras que reagiram também para a tiorredoxina além da Pvs48/45 (20,28%), fez com que uma considerável parte das amostras tenha sido classificada como falso-positivo, levando a essa baixa soroprevalência. Por outro lado, deve-se considerar o variável nível de endemicidade destas regiões (MOURÃO et al., 2014), diferindo do perfil de transmissão malárica em regiões colombianas (ARÉVALO-HERRERA et al., 2015). Ademais, o passado malárico destes pacientes investigados na Amazônia brasileira mostra que 34% eram primo-infectados, comprometendo na resposta a esta proteína investigada. Por último, a população brasileira é bastante miscigenada, devido à influência da colonização pelos portugueses, onde houve

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cruzamentos que envolveram principalmente os europeus, africanos e americanos nativos (FURINI et al., 2016), onde polimorfismos de moléculas do sistema imune podem comprometer sua eficiência (CASSIANO et al., 2015). A baixa titulação obtida é mais uma comprovação da baixa reatividade da Pvs48/45 em amostras de indivíduos infectados da Amazônia brasileira. Em estudo realizado na região Amazônica brasileira por Storti-Melo e colaboradores (2011), com outra proteína de P. vivax (Pv 200L – fragmento da P. vivax MSP- 1), obteve-se que dentre as cidades que estavam em estudo, Macapá foi a que mostrou a frequência e níveis de anticorpos mais baixos, o que se assemelha com o presente estudo, uma vez que nenhuma amostra proveniente de Macapá apresentou resposta imune contra a Pvs48/45. Isso possivelmente pode ser explicado pelo fato de que Macapá apresentou um baixo índice de parasitemia anual (6.0 em 2009), justificando essa ausência de resposta imune.

De fato, indivíduos que habitam áreas endêmicas estão continuamente expostos ao Plasmodium, e por manter um contato direto com o parasito, estão mais propensos a desenvolver uma imunidade clínica, protegendo-os contra o desenvolvimento de uma malária grave. Esses indivíduos não desenvolvem uma imunidade estéril, uma vez que essa imunidade não é alcançada sob condições naturais. Em uma infecção natural, indivíduos podem não apresentar altos títulos de gametócitos, e embora, os gametócitos de P. vivax sejam encontrados na maioria das infecções antes do aparecimento das manifestações clínicas (MUELLER et al.,2015), a proporção em relação aos estágios assexuais não alcança 10%. Além disso, esses gametócitos permanecem circulando na corrente sanguínea durante 03 dias no máximo (OLLIARO et al., 2016). Essa talvez seja outra explicação para o baixo percentual de resposta ao antígeno Pvs48/45 utilizado neste estudo. Nesse sentido, não se pode descartar a possibilidade de que o antígeno testado seja pouco reconhecido por indivíduos que estão naturalmente expostos ao plasmódio na região amazônica brasileira. Não obstante, fica reforçada a importância de avaliar a efetividade dos anticorpos que estão sendo produzidos por esses indivíduos, com a realização de testes de imunogenicidade e de bloqueio de transmissão para verificar se esse antígeno tem a capacidade de bloquear o ciclo de vida do plasmódio.

Os resultados evidenciam que a presença ou ausência de gametócitos não está relacionada com o desenvolvimento de resposta de anticorpos contra a Pvs48/45 (tabela 3). Isso pode ser devido ao fato de que os gametócitos podem não ter sido encontrados no exame de gota espessa, por estarem presentes em baixas concentrações (OLLIARO et al., 2016), mas suficientes para garantir o contato dos indivíduos com essas formas parasitárias. Esses resultados reforçam a necessidade de maiores investimentos e estudos com o antígeno Pvs48/45 como candidato a uma vacina de bloqueio de transmissão, uma vez que os anticorpos podem se desenvolver independentemente da presença elevada de gametócitos na corrente sanguínea. Indivíduos que sofreram mais episódios de

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malária apresentam parasitemia mais baixa que aqueles que reportaram menos episódios maláricos (VÁSQUEZ-JIMÉNEZ et al., 2016). No presente estudo, tanto os indivíduos com alta e baixa parasitemias, tiveram perfil de resposta de anticorpos anti-Pvs 48/45 semelhante. Esses resultados podem indicar que a proteína Pvs48/45 é antigênica em populações naturalmente expostas independentemente dos baixos índices de parasitemia, comumente observados em áreas endêmicas. Fato que talvez possa ser sustentado pela presença de gametócitos logo nos estágio iniciais da infecção por P. vivax, mesmo que em baixas parasitemias (OLLIARO et al., 2016).

Ao analisar a antigenicidade do peptídeo recombinante C-terminal acrescido da porção Central, verificou-se que essa região apresentou maior percentual de antigenicidade, embora estatisticamente não significativo (32%), quando comparado com a antigenicidade obtida com o antígeno completo (22,42%). Estudos com a proteína homóloga Pfs48/45 de P. falciparum tem revelado que os fragmentos amino-terminal (N-terminal) e carboxi-terminal (C-terminal) podem induzir respostas de anticorpos capazes de bloquear a transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2008). Estudo com a proteína Pfs48/45 de P. falciparum tem obtido progressos na identificação de epítopos conformacionais capazes de induzir anticorpos bloqueadores. Foram identificados dois epítopos (I e II), localizados na região C-terminal dessa proteína, como alvos altamente eficientes por conterem domínios cruciais para o desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2007). A Pvs48/45 assim como sua homóloga Pfs48/45 se enquadram no grupo das proteínas que possuem domínio ricos em cisteína. Como mostrado previamente, os resíduos de cisteína localizados nas regiões Central e C-terminal da Pfs48/45 são cruciais para a apresentação dos epítopos que induzem anticorpos bloqueadores. Essa é uma característica essencial para a efetividade de uma vacina de bloqueio de transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2007). Embora a expressão dessas proteínas, que fazem parte da classe das cisteínas, na sua conformação adequada tenha sido de extrema complexidade, alguns estudos alcançaram a expressão de um fragmento da proteína em sua estrutura conformacional correta, de maneira que o reconhecimento da proteína seja feito de maneira facilitada. O fragmento C-terminal da proteína Pfs48/45 foi fundido a quatro catalisadores (DsbA, DsbC, FkpA, e SurA) para a sua expressão e, com isso, foi sintetizada uma proteína corretamente dobrada, gerando altos títulos de anticorpos (OUTCHKOUROV et al., 2008). Essa pode representar uma estratégia para novos estudos de expressão com a Pvs48/45, ou especificamente seu subfragmento C-terminal, para futuros ensaios experimentais de imunogenicidade.

Finalmente, é de extrema importância conduzir estudos de eficácia adicionais para determinar se os resultados obtidos até agora estão no caminho certo ou se uma correção de curso é necessária. O sucesso de uma vacina contra P. vivax pode ainda demorar, mas investimentos são necessários, visto que este

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parasito da malária ainda negligenciado está difundido nas Américas e relatos de maiores complicações clínicas começam a surgir (ALHO et al., 2017; DEMISSIE e KETEMA, 2016; GELETA e KETEMA, 2016; GUPTA et al., 2016).

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