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Universidade Federal de Santa Catarina

Cinética EnzimáticaCinética Enzimática

Estágio de DocênciaJuliana Ribeiro Mariotto

ObjetivosObjetivos

Medir velocidade das transformações;

Estudar a influência das condições de trabalho;

Correlacionar: velocidades fatores;

Otimização do processo;

Critérios para o controle;

Projetar o reator mais adequado.

Influência do SubstratoInfluência do Substrato

Concentração de substrato [S]: afeta a velocidade da reação;

Efeito de [S]: varia durante o curso de uma reação S P;

Velocidade inicial (V0): [S] >> [E] tempo muito curto [S] = constante.


[E] = cte

[S] = V0 linear

[S] = V0

V0 = Vmáx


Alguns casos a V0 não pode ser medida

• Não existe técnica experimental;• Equação química não representa a

transformação;

Velocidade da reação:• Velocidade média de consumo ou produção;• Variação de uma propriedade no sistema.


Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para formar ES passo obrigatório;

Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)• E combina-se reversivelmente com S ES

k1

E + S ES k-1

• ES se rompe E e P k2

ES E + P


Qualquer instante da reação: E e ES;

[S] = velocidade da reação [S];

Vmáx = todas as moléculas de E estiverem na forma ES enzima “saturada”;

[S]: estado pré-estacionário ES;• Estado estacionário [ES] = cte;• V0 estado estacionário.

Equação Michaelis-MentenEquação Michaelis-Menten

Curva: possui a mesma forma para a maioria das enzimas;

Expressa pela Equação de Michaelis e Menten;

Hipótese: limitante quebra de ES E + P.


Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato;

Relação quantitativa entre a V0, a Vmáx e a [S] inicial relacionadas através de Km.

SK

SVV

m

máx

0


Relação numérica: V0

é metade de Vmáx;

km = “afinidade” pelo substrato;

KKmm afinidade afinidade

máxVV 2

10

Vmáx é proporcional à [E].

Significado de KSignificado de Km m e Ve Vmáxmáx

Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica;

Mecanismos de reação diferentes catalisam reações com 6 ou 8 passos;

Significado e magnitude de Vmáx e Km varia;

Km: depende de aspectos específicos do mecanismo de reação.


K2 << K-1 afinidade da enzima;

K2 >> K-1;

K2 e K-1 são comparáveis a Km função complexa;

Vmáx: número de passos da reação e identidade dos passos limitantes.

1

12

k

kkKm


Enzima na saturação: EP e Vmáx = k3.[Et];

Kcat = velocidade limitante de qualquer reação enzimas saturadas;

Kcat e Km = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação.

E + S ES EP E + PK1 K2 K3

K-1 K-2

Reação de 1ª OrdemReação de 1ª Ordem

[S] << Km

k = constante de velocidade de 1ª ordem (min-1)

m

máx

K

SVV 0 SkV 0

[S] V0

Fração constante de S P dtS

Sdk

1


Determinar S utilizado ou P formado durante qualquer intervalo de tempo Equação integrada de 1ª ordem.

0

0log3,2 ttkS

S


t1/2 = tempo de “meia vida” tempo necessário para converter em P metade do S presente.

kt

693,02

1

Reação de Ordem ZeroReação de Ordem Zero

[S] >> Km

SSV

V máx0

máxVV 0

Parâmetros CinéticosParâmetros Cinéticos

Lineweaver-Burk máxmáx

m

VSV

K

V

111


Método de Hanes S

VV

K

V

S

máxmáx

m 1


Método de Eadie-Scatchard SV

KVV mmáx


Forma integrada

t

SS

KK

V

S

S

t mm

máx 00 1

log3,2


Exemplo:

[S] (g/L) Vo (g/L.h)

0,25 0,78

0,51 1,25

1,03 1,66

2,52 2,19

4,33 2,35

7,25 2,57

0,0

1,0

2,0

3,0

0 2 4 6 8

[S] (g/L)

Vo

(g/L

.h)


Exemplo: Lineweaver-Burk

y = 0,228x + 0,3668

R2 = 0,9991

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 1 2 3 4 5

1/[S] (L/g)

1/V

o (

L.h

/g)

L

gK

V

K

hL

gV

V

SV

VSV

K

V

mmáx

m

máxmáx

máxmáx

m

622,0228,0

73,23668,01

Portanto,

3668,01

228,01

111

0

0


Exemplo: Método de Hanes

y = 0,3595x + 0,2419

R2 = 0,9993

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 2 4 6 8

[S] (g/L)

[S]/

Vo

(h

)

L

gK

V

K

hL

gV

V

SV

S

SVV

K

V

S

mmáx

m

máxmáx

máxmáx

m

672,02419,0

78,23595,01

Portanto,

3595,02419,0

1

0

0

Inibidores CompetitivosInibidores Competitivos

Forma estrutural = substrato competição;

Porcentual de inibição concentrações e afinidade pela enzima.


[S] Vmáx =

Km Experimento • 1º [E], [S] = cte• 2º [E], [I] = cte

1/V0 x 1/[S]


Equação de Michaelis e Menten

Lineweaver-Burk

SKIK

SVV

Im

máx

1

SV

KIK

VV máx

Im

máx

11

11


ISKK

K

V

V

mI

m

I

10

Relação entre as velocidades com e sem inibidor

[S] = influência do [I] desprezível.

Inibidores Não-CompetitivosInibidores Não-Competitivos

Ocupa outro sítio ES, EI e EIS;

[S] = não leva todas as E produtiva;

Vmáx e Km normal.

Inibidores Não-CompetitivosInibidores Não-Competitivos

Equação da velocidade:

Lineweaver-Burk

IIm

máx

K

IS

K

IK

SVV

11

ImáxImáx

m

K

I

VSK

I

V

K

V1

111

1

Inibidores IncompetitivosInibidores Incompetitivos

Bloqueio de ES;

2 sítios ativos I se fixa no complexo ES;

ESI = não forma P;

Vmáx e Km


Equação da velocidade:

Lineweaver-Burk:

SK

IK

S

KIV

V

I

m

I

máx

1

1

Imáxmáx

m

K

I

VSV

K

V1

111

Inibidores IrreversíveisInibidores Irreversíveis

Combinam-se com um grupo funcional destruição;

União covalente inibidor e enzima.

Vmáx e Km =


Equação de Michaelis e Menten:

SK

SEIkVV

mmáxI

][3


Lineweaver-Burk: SEIKV

K

EIKVV máx

m

máxI

111

33

Influência do pHInfluência do pH

Valor de pH ótimo = atividade máxima;

Velocidade da reação: pH afasta do ótimo;

Influência do pH: análise dos grupos dissociáveis;

Ácidos (Brönsted): compostos capazes de dissociar-se, liberando H+.

bHNHCHCHCHCHNHCHCHCHCH

aHCOOCHCOOHCH

2222232222

22


HA A + H+

pH HA A

Aminoácidos:

pH -COO- captam prótons = -COOH; pH -NH3

+ são dissociados = NH2;

Ligação eletrostática = -COO- -- NH3+.

Influência do pHInfluência do pH pH ótimo depende do número e tipo de

grupos ionizáveis estrutura primária;

Variações do pH afeta substrato com grupos ionizáveis;

Estabilidade da enzima: temperatura, força iônica, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima, entre outros.


pH 5 e 8 = não afeta a atividade;

Declínio entre pH 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada;

5 > pH > 8 = inativação irreversível.

Influência da TemperaturaInfluência da Temperatura

T velocidade de reação = energia cinética;

T muito elevadas = desnaturação da enzima• Rompidas as pontes de hidrogênio

alterações estruturas = nova conformação;• T desnaturação pouco acima da T ótima.


Enzimas PM 1 cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor;

Efeito da T = pH, força iônica e a presença ou ausência de ligantes;

Substratos protegem a enzima da desnaturação.


K é função da T Lei de Arrhenius

RTekk

0


Enzimas são termolábeis reação enzimática = inativação términa

Efeito da T na velocidade das reações coeficiente de temperatura

• Velocidade quando a T 10ºC.

10

log3,2 1012 QTTREa

RTekk

'0

'

Regulação da AtividadeRegulação da Atividade

Sistema enzimático: produto da reação da 1ª enzima substrato da enzima subseqüente;

Enzimas reguladoras determina a velocidade da seqüência;

• Atividade catalítica ou sinais;

Moléculas sinalizadoras pequenos metabólitos ou cofatores.

Enzimas AlostéricasEnzimas Alostéricas

Ligação não-covalente e reversível modulador;

Inibição por retroalimentação• Enzima reguladora inibida pelo P final da

via reequilibra as necessidades celulares;

Moduladores: inibidores ou estimuladores.


Modulador = substrato homotrópicas; Modulador substrato heterotrópicas;

Sítio alostérico específico para o modulador;

Curva de saturação sigmóide subunidades múltiplas.


curvas de variação de atividade moduladores inibidores, ativadores ou os dois tipos.

Modificação CovalenteModificação Covalente

Ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura;

Metabolismo alterado aciona vias inativas e inibem vias ativas.

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