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Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Agrárias
Curso de Agronomia
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
ESTABELECIMENTO DO MEIO DE CULTURA PARA O
DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE ÁPICES CAULINARES DA VARIEDADE
CÍTRICA ‘BAÍA-CATARINA’ VISANDO A LIMPEZA DE VÍRUS
Eduardo Lemos da Costa Aranha
Florianópolis / SC
2010/2
2
Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Agrárias
Curso de Agronomia
ESTABELECIMENTO DO MEIO DE CULTURA PARA O
DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE ÁPICES CAULINARES DA VARIEDADE
CÍTRICA ‘BAÍA-CATARINA’ VISANDO A LIMPEZA DE VÍRUS
Trabalho de Conclusão do Curso de Agronomia
Eduardo Lemos da Costa Aranha
Orientadora: Profª/Drª Rosete Pescador
Supervisor de Estágio: Prof./Dr. Gilmar Roberto Zaffari
EMPRESA: EPAGRI – Itajaí/SC
Florianópolis / SC
2010/2
3
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que fizeram este trabalho possível:
A mim, pela persistência, dedicação e perseverança;
Aos meus pais (Antonio Carlos Vieira da Costa Aranha e Zuleika Lemos
da Costa Aranha), por sempre terem valorizado a educação de seus filhos;
A todos os mestres que contribuíram para minha formação como
engenheiro agrônomo, em especial ao Prof./Dr. Renato Irgang;
A toda a equipe do laboratório de biotecnologia da EPAGRI (Eliseu
Emanoel dos Santos, Larissa Stadler Arruda Cantarotti, Bárbara Penno Braga e
Dilnei Souza Medeiros), em especial ao supervisor de estágio Dr. Gilmar
Roberto Zaffari, pela paciência e esforço em me ensinar as técnicas por eles
conhecidas;
A minha orientadora, Profª/Drª Rosete Pescador, pelo carisma e
disponibilidade em prontamente esclarecer minhas dúvidas;
A minha grande companheira Narah, por sempre estar presente, com
palavras de apoio;
E a Deus, por ter me concedido saúde e força para a realização deste
trabalho.
4
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01 – Frutos contaminados com o vírus da xiloporose ....................... 14
FIGURA 02 – Fruto contaminado com o vírus da tristeza ............................... 15
FIGURA 03 – Variedade cítrica Baía ............................................................... 19
FIGURA 04 – Variedade Baía-Catarina ........................................................... 19
FIGURA 05 – Principais métodos de micropropagação e as rotas de
crescimento vegetal dos explantes .................................................................. 23
FIGURA 06 - Secção longitudinal do meristema apical do caule de
Coleus sp ......................................................................................................... 27
FIGURA 07 – Ápices caulinares – microscopia e figura ilustrativa .................. 28
FIGURA 08 - Portão principal da EEI .............................................................. 48
FIGURA 09 – Lab. de Biotecnologia da EEI..................................................... 48
FIGURA 10 - Técnicos do laboratório realizando assepsia do material vegetal
sob a CFL ........................................................................................................ 51
FIGURA 11 - Avaliação aos 14 dias dos ápices caulinares cítricos inoculados
pela equipe do laboratório de biotecnologia .................................................... 52
FIGURA 12 - Coleção de plantas cítricas da EEI ............................................ 54
FIGURA 13 - Cerca viva da variedade Flying Dragon (coleção da
EEI)................................................................................................................... 54
FIGURA 14 - Estagiário regulando o pH do meio de cultura ........................... 56
FIGURA 15 – Regulagem do pH do meio de cultura 40 .................................. 56
FIGURA 16 - Material utilizado no preparo dos meios de cultura .................... 56
FIGURA 17 - Soluções utilizadas no meio MS ................................................ 57
FIGURA 18 – Reguladores de crescimento utilizados ..................................... 57
FIGURA 19 - Laranjeiras da variedade Baía-Catarina .................................... 57
FIGURA 20 - Ápices caulinares em brotações novas ...................................... 57
FIGURA 21 - Ápices caulinares da variedade cítrica Baía-Catarina ............... 57
FIGURA 22 – Sala de crescimento (organogênese direta) ............................. 58
FIGURA 23 - Sala de crescimento (organogênese indireta) ........................... 58
FIGURA 24 - Ápice caulinar ............................................................................. 59
FIGURA 25 - Ápice caulinar com 2 mm isolado à lupa .................................... 59
FIGURA 26 - Acadêmico isolando ápices caulinares à lupa ........................... 59
FIGURA 27 - Inoculação dos ápices caulinares sob a CFL ............................. 59
5
FIGURA 28 - Ápices caulinares mantidos em peneira esterilizada sob
a CFL ............................................................................................................... 59
FIGURA 29 - Frascos apresentando meios de cultura contaminados por
fungos............................................................................................................... 60
FIGURA 30 - Contaminação por fungos .......................................................... 60
FIGURA 31 - Avaliação do material aos 15 dias ............................................. 60
FIGURA 32 - Ápice caulinar em desenvolvimento ........................................... 60
FIGURA 33 – Ápice caulinar em desenvolvimento no meio de cultura n°14 ... 63
FIGURA 34 – Ápice caulinar em desenvolvimento no meio de
cultura n°15 ...................................................................................................... 63
FIGURA 35 – Ápice caulinar oxidado no meio de cultura n°12 ....................... 64
6
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 – Meios de cultura preparados e seus respectivos
constituintes ..................................................................................................... 55
Tabela 02 – Material avaliado aos 15 dias após a inoculação ........................ 61
Tabela 03 – Material avaliado aos 20-30 dias após a inoculação (organogênese
direta) ............................................................................................................... 62
Tabela 04 – Avaliação aos 15 dias para organogênese indireta ..................... 62
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LISTA DE ABREVIATURAS
°C – graus célsius
2,4-D – 2,4-diclorofenoxiacético
ABA – Ácido abscísico
ACARESC – Associação de Crédito e Assistência Rural de Santa Catarina
ACARPESC - Associação de Crédito e Assistência Pesqueira de Santa
Catarina
AIA – ácido 3-indolacético
AIB – Ácido indol-3-butírico
ANA – Ácido naftalenoacético
APEX – Associação Brasileira de Promoção de Exportações e Investimentos
atm - atmosfera
BAP - Benzilaminopurina
CEPC - Campo Experimental de Piscicultura
CETREI – Centro de Treinamento da EPAGRI – Itajaí
CFL – Câmara de Fluxo Laminar
cm - centímetro
EDTA - Ethylenediamine tetra-acetic acid
EEI – Estação Experimental de Itajaí
ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EMPASC – Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuária
EPAGRI - Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa
Catarina
FAPESC – Fundação de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica do Estado
de Santa Catarina
Fe - Ferro
g – grama
GA₃ - Ácido giberélico
HCl – Ácido clorídrico
IASC – Instituto de Apicultura de Santa Catarina
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
KIN - Cinetina
8
l - litro
M - molar
MAPA – Ministério da Agropecuária
mg - miligrama
mm - milímetro
MS – Meio de Cultura Murashige & Skoog (1962)
NaOH – Hidróxido de sódio
nm – nanômetro
PADFIN – Programa de Apoio ao Desenvolvimento da Fruticultura Irrigada do
Nordeste
pH – potencial hidrogeniônico
RENASEM – Registro Nacional de Sementes e Mudas
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina
USDA – United States Department of Agriculture
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RESUMO
O Estágio de Conclusão do Curso de Agronomia corresponde à última fase do
curso, no qual se espera que o acadêmico, até então inserido em um ambiente
distinto daquele encontrado na vida profissional, tenha contato direto com as
atividades desenvolvidas pelo profissional da Agronomia e se prepare para o
mercado de trabalho que encontrará logo após sua graduação. As doenças de
natureza vegetal são causadas por fungos, bactérias e vírus (ou ainda por
nematóides). Medidas efetivas de controle químico são aplicadas para a maior
parte das doenças, exceto para aquelas causadas por vírus. Em geral, esses
patógenos não são transmitidos pela semente, mas tendem a se acumular nas
plantas propagadas vegetativamente. Diante da falta de um produto químico
capaz de erradicar vírus de plantas infectadas, a cultura de ápices caulinares
vem sendo utilizada a fim de obter material de multiplicação com alta qualidade
fitossanitária. Durante o período de estágio foram acompanhadas as atividades
realizadas pelos técnicos do Laboratório de Biotecnologia da EPAGRI de Itajaí-
SC com vistas à ambientação e conhecimento sobre os procedimentos e
protocolos padrões. Logo em seguida, sucedeu-se a implantação de um
experimento com ápices caulinares visando à definição do meio de cultura que
favoreceria o desenvolvimento dos ápices caulinares para posterior limpeza
viral. Houve a coleta, isolamento à lupa, assepsia e inoculação dos ápices
caulinares da variedade copa cítrica ‘Baía-Catarina’, seguida de avaliação aos
15 e aos 20-30 dias após a inoculação. Deduziu-se que os meios de cultura
contendo os três reguladores de crescimento (BAP, ANA e GA₃) favorecem o
desenvolvimento dos ápices caulinares, mantendo-os com coloração verde e
grande potencial de desenvolvimento.
Palavras-chave: Ápices caulinares, micropropagação, organogênese, limpeza
de vírus, Citrus.
10
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 12
2 OBJETIVOS .................................................................................................. 13
2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................... 13
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 13
3 JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 13
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................... 17
4.1 A Citricultura no Brasil ..................................................................... 17
4.2 A Variedade Cítrica ‘Baía-Catarina’ ................................................ 18
4.3 Histórico da Cultura de Tecidos ...................................................... 19
4.4 Cultura de Tecidos .......................................................................... 21
4.5 Totipotência ..................................................................................... 24
4.6 Competência e Determinação Celular ............................................ 25
4.7 Cultura de Meristemas e de Ápices Caulinares .............................. 26
4.8 Estabilidade dos Meristemas Apicais .............................................. 29
4.9 Meios Nutritivos ............................................................................... 30
4.10 Componentes de Meios Nutritivos ................................................ 31
4.10.1 Água ........................................................................................... 31
4.10.2 Macronutrientes .......................................................................... 31
4.10.3 Micronutrientes ........................................................................... 33
4.10.4 Carboidratos ............................................................................... 33
4.10.5 Vitaminas .................................................................................... 33
4.10.6 Mio-Inositol ................................................................................. 33
4.10.7 Ágar-ágar ................................................................................... 34
4.10.8 O pH e Outras Características dos Meios .................................. 34
4.11 Fitormônios e Reguladores de Crescimento ................................. 34
4.11.1 Auxinas ....................................................................................... 36
4.11.2 Citocininas .................................................................................. 38
4.11.3 Giberelinas ................................................................................. 39
4.11.4 Ácido Abscísico .......................................................................... 40
4.12 Recuperação de Plantas Livres de Vírus ...................................... 40
4.13 Microenxertia ................................................................................. 44
11
5 FORMULAÇÃO DO PROBLEMA ................................................................. 46
6 HIPÓTESE .................................................................................................... 46
7 DESCRIÇÃO DA EMPRESA ....................................................................... 47
8. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ................................................................ 50
8.1 ATIVIDADES INICIAIS .................................................................... 50
8.2 INOCULAÇÃO SOB A CÂMARA DE FLUXO LAMINAR ................ 53
8.3 PLANEJAMENTO DO EXPERIMENTO .......................................... 53
8.4 PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA ......................................... 55
8.5 COLETA, ISOLAMENTO, ASSEPSIA E INOCULAÇÃO DOS
ÁPICES CAULINARES ......................................................................... 57
8.6 AVALIAÇÃO DO MATERIAL INOCULADO .................................... 59
9. RESULTADOS ............................................................................................. 60
10. DISCUSSÃO .............................................................................................. 63
11. CONSIDERAÇÕES FINAIS ....................................................................... 64
12. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................... 66
13. ANÁLISE CRÍTICA DO ESTÁGIO – CONCLUSÃO .................................. 68
ANEXOS .......................................................................................................... 69
12
1. INTRODUÇÃO
O Estágio de Conclusão do Curso de Agronomia corresponde à última
fase do curso, no qual se espera que o acadêmico, até então inserido em um
ambiente distinto daquele encontrado na vida profissional, tenha contato direto
com as atividades desenvolvidas pelo profissional da Agronomia e se prepare
para o mercado de trabalho que encontrará logo após sua graduação.
O presente trabalho é referente ao estágio realizado no período de 01 de
setembro de 2010 a 17 de dezembro de 2010 em período integral na Estação
Experimental de Itajaí (situada na Rodovia Antonio Heil Km 6, s/n, Caixa Postal
277, Cep.: 88301-970 - Itajaí - Santa Catarina – Brasil) da Empresa de
Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina, com duração total
de 360 horas. O trabalho contou com a orientação da Profª/Drª Rosete
Pescador do Departamento de Fitotecnia do Centro de Ciências Agrárias da
UFSC e foi supervisionado pelo Eng. Agr./Dr. Gilmar Roberto Zaffari, com
experiência particular em Biotecnologia.
O presente estava inserido em trabalhos realizados pela equipe do
Laboratório de Biotecnologia da EEI, onde foi possível aprender técnicas da
Cultura de Tecidos e Propagação de Plantas In vitro, bem como realizar parte
de um experimento sendo executado também pela equipe do laboratório, como
Trabalho de Conclusão de Curso.
O estágio foi de vital importância, pois permitiu ampliar as perspectivas
quanto à profissão de Engenheiro Agrônomo, descobrindo uma nova área pela
qual já possuía afinidade e sequer estava ciente desse fato. Também permitiu
que se relacionasse o conteúdo interdisciplinar visto no decorrer de quatro
anos e meio do Curso de Agronomia com o que de fato ocorre na prática, tanto
nas atividades de pesquisa quanto na rotina a campo de um Engenheiro
Agrônomo.
13
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar qual(is) o(s) meio(s) de cultura favorece(m) o desenvolvimento
dos ápices caulinares da variedade copa cítrica ‘Baía Catarina’ visando o
desenvolvimento de protocolo para a limpeza de vírus através da
micropropagação.
2.2 Objetivos Específicos
§ Definir as composições e as concentrações dos reguladores de
crescimento que serão utilizados em cada meio de cultura;
§ Preparar e esterilizar os meios de cultura;
§ Coletar, isolar, realizar a assepsia e inocular os ápices caulinares da
variedade cítrica ‘Baía Catarina’ nos meios de cultura preparados;
§ Armazenar (em sala de crescimento) o material inoculado, sendo os
meios de cultura destinados à organogênese direta armazenados no
claro e os meios destinados à organogênese indireta armazenados no
escuro.
§ Avaliar aos quinze e aos vinte-trinta dias o desenvolvimento do material
e registrar os dados;
§ Observar o resultado e gerar dados para o futuro desenvolvimento de
protocolo para limpeza viral em Citrus sp.
3 JUSTIFICATIVA
Segundo levantamento coordenado por KOLLER (2001), as frutas
cítricas ultrapassam o volume de consumo anual per capita, comparativamente
à banana, situando-se bem mais distante, em terceiro lugar, a maçã.
Das 39 milhões de toneladas de frutas produzidas, aproximadamente
45% são de laranja (18,3 milhões de toneladas). Em segundo lugar, tem-se a
banana, que alcança a marca de 6,5 milhões de toneladas. A produção de
laranja e banana atinge, 24 milhões de toneladas, correspondente a
praticamente 60% da produção brasileira de frutas (IBGE, 2006).
14
A baixa qualidade das mudas cítricas, juntamente com o pouco
conhecimento técnico de viveiristas, agricultores e agentes de difusão
tecnológica, representam os principais fatores responsáveis pelos insucessos
ocorridos na citricultura, resultando no fato de que 70% dos frutos consumidos
in natura continuem sendo importados (IBGE, 2006).
Figura 01 – Frutos contaminados com o vírus da xiloporose.
Fonte: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/tangerina/imagens/tangerina-20.jpg
Mudas cítricas produzidas de acordo com as normas do RENASEM -
Registro Nacional de Sementes e Mudas - para produção de mudas
certificadas são isentas de: viroses como sorose, exocorte, estirpes fortes de
tristeza (figura 02) e xiloporose (figura 01), que ainda estão presentes em
alguns clones cítricos cultivados; doenças causadas por bactérias, como
clorose variegada dos citros, cancro cítrico e greening; doenças causadas por
fungos, como a gomose causada por Phytophthora, um dos mais sérios
problemas nos pomares na atualidade; plantas invasoras como tiririca e grama
seda; um grande número de pragas e outras doenças de menor importância.
Os prejuízos originados por doenças causadas por vírus na citricultura são
muito significativos, necessitando-se de soluções práticas e viáveis para a
eliminação dessas doenças dos pomares comerciais, como o manejo integrado
de pragas e as técnicas aplicadas através da biotecnologia e do melhoramento
genético vegetal (IBGE, 2006). O uso de material de multiplicação livre de
doenças representa a forma mais econômica de controle dessas doenças na
citricultura (ROISTACHER, 1994).
15
Figura 02 – Fruto contaminado com o vírus da tristeza. Fonte: http://www.agnet.org/images/library/bc52009f5.jpg
As leis de números 10.711 (05/08/2003) e 5.153 (23/07/2004) e
respectivas atualizações, instituem e regulamentam o RENASEM, submetem e
atribuem aos produtores de sementes, mudas e materiais de multiplicação
(sementes, enxertos, estacas etc) a uma série de exigências e
responsabilidades, não apenas quanto ao registro em si, mas, principalmente
quanto à responsabilidade sobre a qualidade genética e sanitária (MAPA,
2009). Assim, a EPAGRI tem, por força das leis específicas, a obrigação de
aperfeiçoar e melhorar cada vez mais a qualidade dos materiais de
multiplicação vegetal fornecidos aos agricultores (ZAFFARI, 2009).
As variedades cítricas são propagadas tanto sexuada quanto
assexuadamente. Em geral, os porta-enxertos (rootstocks) são obtidos a partir
de sementes, enquanto que a maioria das cultivares copa de interesse
comercial é propagada por vários métodos assexuados. Com o emprego da
multiplicação vegetativa a ocorrência de doenças causadas por vírus tem se
agravado. No caso dos Citrus sabe-se há anos da existência de ao menos
quinze espécies de vírus afetando as plantas (USDA, 1968), número este que
vem aumentando com o passar dos anos (ZAFFARI, 2009).
A micropropagação é um importante método de propagação assexuada
que pode ser utilizada para a produção de plantas livres de vírus. O uso dessa
técnica na produção de mudas livres de vírus constitui-se em estratégia
importante para a multiplicação vegetativa de plantas matrizes. Durante os
últimos anos, a limpeza clonal pela micropropagação tem sido utilizada para
diversas espécies de plantas. A microenxertia em Citrus, técnica descrita por
16
NAVARRO et al. (1975), tem sido a alternativa utilizada há décadas pelos
laboratórios de cultura de tecidos de plantas, como método para a limpeza de
vírus. Embora a técnica tenha sofrido constantes aperfeiçoamentos ao longo do
tempo, o processo é meticuloso e de baixo rendimento, devido a problemas de
pegamento do microenxerto (ZAFFARI, 2009).
Uma alternativa para aumentar o rendimento da produção de mudas
livres de vírus em laboratório (objetivo final do presente trabalho, que apresenta
a etapa inicial do projeto) é a técnica de regeneração de plantas pela
organogênese direta ou indireta. Essa técnica consiste em utilizar o meristema
apical caulinar para produzir plantas sem o processo de microenxertia. Os
meristemas apicais têm a capacidade genética e fisiológica de manter a divisão
e diferenciação celular gerando novos tecidos, órgãos e formar um indivíduo
completo com as mesmas características. Quando a obtenção de plantas se dá
pela organogênese direta, cada meristema produz apenas uma planta. Porém,
quando esse meristema produz calo, pode-se gerar muitas plantas a partir de
um único meristema (GEORGE et al., 2008). Dessa forma, a micropropagação
de plantas cítricas livres de vírus através da organogênese indireta pode
contribuir de forma significativa na produção de mudas cítricas de elevada
qualidade genética e fitossanitária, estimulando novamente o desenvolvimento
da cadeia produtiva (ZAFFARI, 2009).
Além de produzir e fornecer material de multiplicação livre de vírus e
outras doenças há necessidade de ampliar as informações disponíveis sobre o
comportamento de diferentes variedades e clones nas condições
edafoclimáticas locais, procurando-se também variedades mais precoces e
mais tardias quanto à época de maturação dos frutos, para que se possa
atender ao mercado por um maior número de meses durante o ano. Esse
conhecimento permitirá priorizar a produção de mudas de cultivares que melhor
atendam a essas necessidades, podendo, portanto, essas serem consideradas
de melhor qualidade (ZAFFARI, 2009).
Os agricultores e os agentes de extensão, quando conhecedores do que
é e da importância de uma boa muda, qualidade genética, qualidade sanitária
etc, passarão a exigir dos viveiristas essa melhor qualidade. Essa exigência por
parte dos consumidores será o maior impulsionador para que os viveiristas
venham a melhorar a qualidade das mudas que produzem (ZAFFARI, 2009).
17
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 A Citricultura no Brasil
A história da citricultura brasileira está intimamente ligada à própria
história do país. Poucos anos após a descoberta do Brasil, entre 1530 e 1540,
os portugueses introduziram as primeiras sementes de laranja doce nos
estados da Bahia e São Paulo. Dadas às condições edafoclimáticas favoráveis,
as plantas produziram satisfatoriamente, a ponto de os frutos da laranja ‘Baía’
serem reconhecidos ainda no Brasil colonial como maiores, mais sucosos e de
excelente qualidade do que os produzidos em Portugal. Mas, somente a partir
dos anos 30 do século passado, a citricultura começou a ser implantada
comercialmente nos Estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Bahia, tendo
apresentado maiores índices de crescimento nos estados do Sudeste e Sul
(EMBRAPA, 2003).
A citricultura brasileira apresenta números expressivos que traduzem a
grande importância econômica e social que a atividade tem para a economia
do país. Alguns desses números são mostrados concisamente: a área plantada
está ao redor de um milhão de hectares e a produção de frutas supera
dezenove milhões de toneladas, a maior no mundo há alguns anos. O país é o
maior exportador de suco concentrado congelado de laranja cujo valor das
exportações, juntamente com as de outros derivados, tem gerado cerca de 1,5
bilhão de dólares anuais. O setor citrícola brasileiro somente no Estado de São
Paulo gera mais de 500 mil empregos diretos e indiretos (EMBRAPA, 2003).
A Região Nordeste responde por 9% da produção nacional, constituindo-
se na segunda maior região produtora do país, com mais de 110.000 hectares
cultivados e mais de 1,5 milhão de tonelada produzida. Dentre os estados
produtores, o destaque fica com os estados Bahia e Sergipe, respectivamente
segundo e terceiro produtores nacionais, que representam juntos 90% de toda
área plantada no nordeste. A citricultura nordestina tem grande potencial para
implementar seu crescimento sobretudo em função da ausência de doenças e
pragas de grande importância que se encontram distribuídas no Sudeste, maior
centro produtor. No que diz respeito ao incremento e geração de empregos,
percebe-se que devido à instalação de muitas casas de embalagens (packing-
houses) e aumento da exportação do limão tahiti para o Mercado Europeu,
18
muitos empregos diretos e indiretos têm sido oferecidos, na ordem de 100 mil
(EMBRAPA, 2003).
A grande meta do setor brasileiro é consolidar-se no mercado
internacional não apenas como produtor de frutas tropicais, mas também de
outras frutas de destaque econômico. Para isso é preciso capacitar o setor e
expandir, significativamente, suas fronteiras agrícolas em valores absolutos e
comparativamente aos grandes supridores internacionais, sem deixar de lado a
imagem de confiabilidade, continuidade e diversidade de frutas para todo o
mundo (PADFIN, 2006).
As ações promocionais têm como alvo tanto os clientes/compradores em
potencial como o consumidor final, estreitando o relacionamento com os
agentes de mercado internacional e levando ao consumidor as informações
corretas da fruticultura brasileira e seus produtos (PADFIN, 2006).
O número de expositores brasileiros em eventos internacionais tem
crescido a cada ano, assim como o volume de negócios realizados. Procura-se
participar de eventos que possam gerar resultados. As feiras são importantes
para rever clientes, consolidar contatos, conquistar novos mercados e conhecer
as tendências mercadológicas atuais para tornar as marcas brasileiras mais
competitivas (PADFIN, 2006).
4.2 A Variedade Cítrica Baía-Catarina
Trata-se de uma variedade peculiar obtida pela EPAGRI com
cruzamentos envolvendo a variedade comercial ‘Baía’. É também conhecida
como laranja-de-umbigo por ter uma saliência na face inferior do fruto. Possui
sabor adocicado, polpa muito suculenta e casca amarelo-gema. Fornece
bastante suco, podendo ser consumida ao natural, em refrescos ou como
ingrediente de pratos especiais. Por ser pouco ácida, seu suco pode ser
misturado ao de outras variedades (como laranja-pêra e laranja-barão) com
bons resultados. É o tipo de laranja que contém a maior quantidade de vitamina
C (SIMÃO, 1971).
Em geral a variedade ‘Baía’ (figura 03) apresenta excelentes qualidades,
boa consistência, maturação média, não apresentam sementes (mas pode
haver polinização cruzada), resistência ao frio, porém sensíveis à seca
(SIMÃO, 1971).
19
Figura 03 – Variedade cítrica Baía. Figura 04 – Variedade Baía-Catarina. Fonte: http://frutaslurdes.com.sapo.pt/DSC03108.JPG
A flor desse grupo caracteriza-se por possuir um segundo verticilo
carpelar além do principal, que ao se desenvolver, origina um segundo fruto,
incluso na região estilar do principal, à semelhança de umbigo. Além dessa
característica, os grãos de pólen se desintegram, ocorrendo a degradação do
saco embrionário e, conseqüentemente, os frutos que se formam são
partenocárpicos (SIMÃO, 1971).
4.3 Histórico da Cultura de Tecidos
A propagação de plantas in vitro tem atraído a atenção dos
pesquisadores desde o início do século XIX, mas evoluiu gradativamente a
partir do século XX (TORRES et al., 1998).
O botânico alemão VOCHTING, em 1878, ao pesquisar os fatores que
tornam parte na formação de órgãos e na diferenciação em plantas, notou que
em cada fragmento de planta permanecem os elementos a partir dos quais
após seu isolamento e em condições apropriadas, pôde-se reconstruir todo o
organismo. Em 1902 HABERLANDT confirmou tal premissa e previu que seria
ainda possível o cultivo de embriões artificiais a partir de células vegetativas.
Ele foi o primeiro a cultivar células de tecidos somáticos de várias espécies de
plantas em soluções nutritivas. Naquele mesmo período, avanços também
ocorriam na cultura de tecidos animais. Em 1922, KOTTE foi capaz de cultivar
fragmentos de pontas de raiz de ervilha e milho utilizando um meio de cultura
20
baseado em matéria-prima de origem animal (extrato de carne de LIEBIG).
Pouco mais tarde, demonstrou-se que o crescimento de fragmentos de raiz de
milho podia ser mantido até por vinte semanas, em meio contendo extrato de
levedura (MANTELL et al., 1994).
Em 1904, HANNING foi o primeiro a cultivar in vitro embriões imaturos
de crucíferas. Ele observou a necessidade de suplementação do meio mineral
de diferentes fontes de nitrogênio sobre a sua morfologia. Posteriormente,
KNUDSON (1922) cultivou embriões de orquídeas na ausência de micorrizas e
observou que a sacarose era importante para o crescimento e desenvolvimento
de embriões in vitro (TORRES et al., 1998).
O marco histórico para o estabelecimento da cultura de tecidos de
plantas aconteceu quando WHITE (1934) conseguiu cultivar indefinidamente
raízes de tomate em um meio de cultura por ele definido. Simultaneamente
HAUTHERET (1934) foi capaz de estabelecer cultura de calos a partir de
regiões do câmbio (meristema) de três espécies de árvores (MANTELL et al.,
1994).
Entre 1935 e 1940, NOBECOURT passou a utilizar a auxina AIA nos
meios de cultura e em 1939 GAUTHERET diagnosticou a importância da
vitamina B₁ no desenvolvimento dos explantes. Em 1948, SKOOG descobriu
que a adenina derivada dos ácidos nucléicos aumenta a proliferação celular e a
formação de gemas nas culturas de calos. Já no ano de 1955, MILLER et al.
descobriram que a citocinina promove a divisão celular (descoberta essencial
no desenvolvimento vegetal in vitro). Como complemento de suas pesquisas,
SKOOG & MILLER, em 1957, estabeleceram as funções da auxina e da
citocinina na indução de brotos e raízes em culturas de calos de tabaco. Em
1958 REINERT desvendou a embriogênese somática para culturas de calos
(MANTELL et al., 1994).
De acordo com TORRES et al., 1998:
A regeneração de plantas de Lupinus e Tropaeolum a partir de
ápices caulinares começou com os trabalhos de BALL (1946).
Posteriormente, SKOOG & TSUI (1948) observaram que a
formação de parte aérea e raiz em calo de fumo era um
processo regulado por fatores múltiplos: a adição de auxina ao
meio inibia a formação de brotações, enquanto a inclusão de
21
adenina e alto nível de fosfato promovia a diferenciação de
parte aérea mesmo em presença de ácido indolacético (AIA).
A aplicação prática de cultura de tecidos iniciou-se quando MOREL &
MARTIN (1952) recuperaram plantas de Dahlia sp. livres de vírus através da
cultura de ápices caulinares. Posteriormente, MOREL (1960) utilizou essa
metodologia para obtenção de plantas de orquídea livres de vírus. TORRES et
al., 1998 ressaltam que MOREL empregou erroneamente a palavra ‘meristema’
para se referir ao ápice caulinar e que mesmo atualmente pesquisadores
confundem o uso desse termo (TORRES et al., 1998).
MURASHIGE & SKOOG (1962) observaram que, ao adicionar extrato de
folhas de fumo ao meio de cultura de calo, o crescimento desse tecido tornava-
se bastante avantajado ao ser comparado com o calo mantido em meio de
WHITE. Eles comprovaram que a fração ativa do extrato era a inorgânica. Esse
foi o ponto de partida para a elaboração do consagrado meio de cultura MS,
atualmente o mais utilizado em trabalhos de cultura de tecidos (TORRES et al.,
1998).
Na década de noventa iniciou-se a comercialização de plantas obtidas
através da engenharia genética. Naquela década, cerca de quinze produtos
foram colocados no mercado para comercialização em larga escala (dentre
eles Lycopersicon esculentum, espécies de Brassica, Solanum tuberosum,
Glycine max e Gossypium hirsutum). Atualmente, as técnicas de biologia
celular são amplamente estudadas e difundidas na engenharia genética de
plantas (TORRES et al., 1998).
4.4 Cultura de Tecidos
Não restam dúvidas de que atualmente (e futuramente), o
desenvolvimento de técnicas de cultura de tecidos será uma das maiores
contribuições científico-sociais dos cientistas contemporâneos. Através de
pequenos fragmentos de tecido vivo (ditos explantes), isolados de um
organismo e cultivados assepticamente por períodos indefinidos em um meio
nutritivo semi-definido, pôde-se atingir objetivos dos mais diversos. O conceito
de explantes envolve uma grande diversidade de material vegetal, tão
pequenos quanto células isoladas e protoplastos ou tão maiores como
22
plântulas e órgãos (como ocorre nas culturas de óvulo ou de embrião). Os
avanços nessa área têm aumentado as perspectivas de operações possíveis
de serem utilizadas, em diversos campos da biotecnologia de plantas
(MANTELL et al., 1994).
Para MANTELL et al., (1994), “o desenvolvimento de células individuais
em complexos órgãos e tecidos multicelulares é um processo comum a todas
as formas superiores de vida”. Ou seja, o processo de diferenciação se
constitui em uma série de processos coordenados e determinados
geneticamente através dos quais os explantes, derivados de células individuais
se desenvolvem em plantas inteiras. O genótipo da planta determina as vias de
diferenciação envolvidas em sua maturação e a expressão dos genes é
modulada por interações celulares e ambientais (MANTELL et al., 1994).
Ainda de acordo com MANTELL et al., (1994), “os padrões de
desenvolvimento da planta são razoavelmente consistentes dentro de limites
definíveis de genótipo, ou seja, grupos taxonômicos, de maneira que os
constituintes genéticos da célula germinativa original, teoricamente, contém
todos os elementos determinantes dos padrões de diferenciação”. A partir
dessa premissa, surgiu o conceito de totipotência, pois os tecidos somáticos de
uma planta são os produtos de divisões mitóticas, onde cada célula do
organismo é capaz de regenerar réplicas desse mesmo organismo, desde que
condições apropriadas sejam fornecidas (MANTELL et al., 1994).
Para WAREING (1982) apud MANTELL et al., (1994): “Nas plantas, a
maioria das divisões celulares coordenadas ocorrem em áreas concentradas
conhecidas como meristemas e, esses estão distribuídos em vários pontos do
organismo, durante o seu desenvolvimento. O funcionamento dos meristemas
pode ser ativado ou suprimido, de acordo com os padrões de diferenciação
ditados por mecanismos de controle genéticos e/ou ambientais”.
As células ditas “indeterminadas” (como as células meristemáticas) são
aquelas capazes de mudar para diferentes vias metabólicas do
desenvolvimento, dependendo das condições ambientais impostas a elas.
Essas mesmas células também são capazes de se desdiferenciar rapidamente
e se proliferar massivamente em um curto intervalo de tempo, produzindo
massas celulares conhecidas como calos (MANTELL et al., 1994).
23
Figura 05 – Principais métodos de micropropagação e as rotas de crescimento vegetal dos
explantes. (Adaptado de MANTELL et al., 1994).
Os métodos disponíveis para propagação de plantas in vitro são, na
verdade, uma extensão daqueles desenvolvidos para a propagação
convencional. Entretanto, a propagação in vitro apresenta diversas vantagens
em relação à convencional, tais como (GEORGE et al., 2008):
§ As culturas são iniciadas com segmentos bastante diminutos de plantas
(ditos explantes). Com isso, o espaço físico necessário para a
manutenção das plantas é diminuído e seu aproveitamento maximizado.
§ A assepsia do material diminui perdas e, uma vez iniciada a cultura in
vitro, as perdas ocasionadas por doenças são mínimas.
§ Os métodos disponíveis são capazes de limpar plantas de vírus
específicos que, após os testes de indexação, podem gerar mudas
certificadas (livres dos vírus para os quais foram testadas).
§ Maior número de variáveis que influenciam a regeneração vegetativa
pode ser controlado, tais como: nutrientes e reguladores de crescimento,
24
luz e temperatura. A taxa de propagação é muito maior do que na
macropropagação e um número muito maior de plantas pode ser
produzido em um período. Isso viabiliza a seleção de novas variedades
em um tempo reduzido.
§ Clones de certas espécies vegetais, que de outra maneira seria um
processo lento e difícil ou até mesmo impossível, podem ser produzidos.
§ A produção pode ser contínua ao longo do ano, sendo assim mais
independente das variações sazonais.
§ O material vegetal, quando armazenado nas sub-culturas, demandam
pouca mão-de-obra.
Como desvantagens, os mesmos autores citam: mão-de-obra
especializada, custo na aquisição dos reguladores de crescimento e outros
componentes dos meios de cultura e a delicada aclimatação das plantas in vitro
para ex vitro (sobretudo quanto à elevada perda de água e à insuficiência
fotossintética, necessitando assim que o processo seja gradativo).
4.5 Totipotência
Toda célula vegetal viva e nucleada tem o potencial de regenerar
plantas, desde que submetidas a tratamentos adequados (reguladores de
crescimento). Isso significa que as células são autônomas e totipotentes.
Contudo, ainda há muitas espécies cuja capacidade regenerativa não foi ainda
evidenciada na prática, permitindo concluir que o dogma da totipotencialidade
não pode ser generalizado. “As substâncias reguladoras de crescimento podem
induzir uma considerável gama de respostas nos diferentes tecidos de uma
planta, mas é preciso considerar as diferenças na ocorrência de diferenças na
competência das células-alvo” (WAREING, 1982 apud TORRES et al. 1999).
Mesmo considerando-se que toda célula vegetal viva e nucleada é por si
só totipotente, sabe-se que certos tecidos são mais favoráveis a regeneração
de gemas, raízes e embriões somáticos do que outros. “As diferenças celulares
seriam estabelecidas e mantidas pelas influências mútuas das células e dos
tecidos entre si” (WAREING, 1982 apud TORRES et al. 1999).
25
4.6 Competência e Determinação Celular
Nas últimas décadas, grandes avanços nas áreas de Fisiologia,
Bioquímica e Genética foram possíveis devido à capacidade dos tecidos
vegetais cultivados in vitro para formar gemas, raízes ou, até mesmo, embriões
somáticos. No processo de diferenciação celular, há de se considerar: o fator
genético estabelecido na fertilização, que incorpora as potencialidades que
podem ser expressas durante o desenvolvimento e as características cuja
expressão depende apenas do ambiente (TORRES et al., 1999).
Durante o desenvolvimento de um organismo, o processo de
diferenciação celular reflete o efeito de três grupos de fatores: o fator genético,
as características originadas durante a ontogênese e as características cuja
expressão depende apenas do ambiente. Por meio de técnicas imunológicas
em Citrus, a presença de maiores concentrações de dada proteína foi
detectada nos tecidos maduros (TORRES et al., 1999).
A desdiferenciação inicial dos explantes resultava na formação de calos
com células competentes (com capacidade de responder aos efeitos
estimulatórios do meio de cultura para a formação de gemas). A transferência
dessas células agora competentes para meios indutores de gemas tornava-as
determinadas (comprometidas com uma nova rota específica de
desenvolvimento). As células, a partir daí, diferenciavam-se em primórdios de
gemas, mesmo se transferidas para meios não indutores. Além disso, nesse
modelo experimental, a diferenciação das células determinadas levaria à
formação de primórdios de gemas ou raízes, cuja estabilidade estrutural e
funcional pode ser mantida durante a vida da planta (TORRES et al., 1999).
Embora não se conheça ainda por que certos eventos regenerativos in
vitro são mais facilmente induzidos em alguns tecidos do que em outros,
admite-se que essas diferentes expressões morfogenéticas se reflitam na
natureza e no grau de diferenciação desses tecidos. Assim, entende-se por
diferenciação o processo através do qual as células tornam-se
progressivamente especializadas tanto do ponto de vista estrutural quanto
funcional, Além destes dois importantes aspectos do desenvolvimento, nessa
definição, fica implícito que ocorre a maturação, a qual envolve também
diferenças na estrutura e função celulares (TORRES et al., 1999).
26
Em relação ao indivíduo as caracterísitcas mais persistentes, mas não
necessariamente permanentes, são mais rapidamente discerníveis e também
mais fáceis de serem investigadas em plantas do que em animais. Um exemplo
dessa situação é a mudança do estado juvenil vegetativo de uma planta
arbórea para o estado maduro (mudança de fase) (BRINK, 1962 apud
TORRES et al., 1999).
Comparativamente aos animais, a maior facilidade de estudos oferecida
pelas plantas decorre do fato de essas apresentarem um sistema de
desenvolvimento aberto, ou seja, os órgãos são formados continuamente
durante toda a vida, devido à atividade dos meristemas apicais. O termo
determinação tem sido empregado para designar essa canalização
progressiva, observada durante toda a organogênese em direção às vias
particulares de desenvolvimento (TORRES et al., 1999).
Apesar de as plantas apresentarem o padrão aberto de
desenvolvimento, certos órgãos apresentam padrão fechado (como folhas,
flores e frutos) sendo mais próximas às analogias com o desenvolvimento
animal (TORRES et al., 1999).
4.7 Cultura de Meristemas e de Ápices Caulinares
Há certa divergência quanto aos termos “meristema” e “ápice caulinar”.
A título de esclarecimento, de acordo com TORRES et al., 1998:
Considera-se meristema apical caulinar o tecido que se
encontra distal ao mais novo primórdio foliar, tendo o aspecto
de uma cúpula proeminente ou plataforma achatada, estando,
algumas vezes embutido numa depressão (CUTTER, 1971).
Seu tamanho não deve exceder a 0,1 mm.
As células desse tecido têm a propriedade única de permanecerem na
condição embrionária e, por meio de atividades morfogenéticas complexas,
darão origem ao eixo vascular, folhas, gemas, órgãos reprodutivos e outras
estruturas laterais. A capacidade de formação de órgão do meristema caulinar
ocorre mediante dois processos fundamentais: a manutenção de um grupo de
células indiferenciadas sem as quais a formação de novos órgãos não seria
possível e o direcionamento apropriado das células não diferenciadas para a
27
formação de órgãos e eventual diferenciação (CLARK, 1997 apud TORRES et
al., 1998). Desse modo, o meristema apical é uma estrutura dinâmica,
constantemente em crescimento, com divisões celulares e formação de órgãos
(TORRES et al., 1998).
Figura 06 - Secção longitudinal do meristema apical do caule de Coleus sp. Seta grossa =
gema axilar; seta fina = protoderme; cabeça de seta = procâmbio; MF = meristema fundamental; PM = promeristema. Barra = 500 mm. (APEZZATO, 2003).
Por outro lado, o ápice caulinar consiste do meristema apical com dois
primórdios foliares subjacentes. Seu tamanho pode varia de 0,2 a 20 mm,
dependendo da espécie (TORRES et al., 1998).
Nota-se que a cultura de ápices caulinares, erroneamente chamada
cultura de meristemas, é utilizada para propagação de plantas in vitro,
recuperação de plantas livres de vírus e conservação de germoplasma. Uma
notável vantagem desse sistema é, na maioria dos casos, a manutenção do
genótipo regenerado, em virtude de as células meristemáticas manterem de
modo uniforme a sua estabilidade genética. O ápice caulinar é uma estrutura
organizada, que pode desenvolver-se diretamente em parte aérea, em meio de
cultura adequado, havendo a opção de não passar pela fase de calo (TORRES
et al., 1998).
28
Analisando experimentos anteriores, realizados por diversos cientistas,
TORRES et al. (1998) constataram:
Esta técnica foi utilizada pela primeira vez por BALL (1946),
para regenerar plantas de T. majus e L. albus a partir da cultura
de ápice com 2 ou 3 primórdios foliares. As exigências de meio
de cultura para ápices caulinares são mais simples que
aquelas para meristemas isolados. BALL (1960) mostrou que
meristemas de L. albus, em cultura, apenas desenvolviam
algumas folhas e o caule apresentava pequeno alongamento.
Entretanto, meristemas de T. majus e Lycopersicon esculentum
não se desenvolviam in vitro, sugerindo que esses explantes
tinham perdido a habilidade de sintetizar compostos
necessários ao seu crescimento.
Hoje se sabe que os primórdios foliares em desenvolvimento são fontes
de substâncias orgânicas essenciais que favorecem o crescimento dos ápices
caulinares em cultura (TORRES et al., 1998).
Figura 07 – Ápices caulinares – microscopia e figura ilustrativa.
Fonte: http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/caule/imagens/caule82.jpg
Para TERMIGNONI, R. R. (2005): “Os meristemas e os ápices
caulinares são escolhidos por terem características superiores e/ou quando há
dificuldade na propagação vegetativa pelos métodos convencionais (como
estaquia e enxertia)”. Contrariando as definições de TORRES et al. (1998),
para HU & WANG (1983) apud TERMIGNONI, R. R. (2005), “meristemas são
as estruturas apicais, incluindo o domo apical e os dois primórdios foliares que
29
se situam neste extremo ápice da planta”, ao passo que “ápices são os dois
últimos centímetros do eixo caulinar e segmentos caulinares, incluindo o ápice
caulinar com as gemas axilares que se situam junto às folhas”.
Uma importante característica acerca dos meristemas é que “nesse
tecido ainda não estão formados os feixes vasculares, portanto são utilizados
na obtenção de indivíduos livres de viroses” (TERMIGNONI, R. R., 2005).
O uso de ápices caulinares tem sido bastante difundido entre os
micropropagadores pela facilidade de obtenção, pelo número inicial de
explantes isolados da planta-mãe, pela viabilidade in vitro e pelo rápido
crescimento (TERMIGNONI, R. R., 2005).
4.8 Estabilidade dos Meristemas Apicais
A divisão das plantas superiores em caule e raiz representa um dos
aspectos mais notáveis da diferenciação celular, a qual é mantida com grande
estabilidade durante toda a vida. Essa separação começa no embrião, com
estabelecimento da polaridade e a iniciação dos meristemas apicais da raiz e
do caule (TERMIGNONI, R. R., 2005).
A estabilidade de ambos os ápices pode ser considerada sob duas
hipóteses alternativas. Segundo uma delas, os ápices meristemáticos -
caulinares e radiculares - seriam constituídos por células não comprometidas
com rotas específicas de desenvolvimento, sendo o controle realizado por
células maduras, parcial ou completamente diferenciadas. Contrariamente a
essa hipótese, a outra interpretação é de que as células meristemáticas seriam
hereditariamente programadas como células de caules ou raízes, em
conseqüência de serem consideradas células comprometidas. De acordo com
esse ponto de vista, os ápices meristemáticos seriam constituídos por células
verdadeiramente especializadas. Não há até o momento evidências
consistentes que permitam comprovar essas duas hipóteses (TERMIGNONI, R.
R., 2005).
Aparentemente, a maneira mais direta de se verificar se células dos
meristemas serão intrinsecamente determinadas ou não, seria mediante o
emprego da cultura in vitro de promeristemas de ápices caulinares e
radiculares. Em certas orquídeas, segmentos de ápices radiculares, medindo
entre 0,2 e 2,0 cm de comprimento quando cultivados em meios relativamente
30
simples, originaram diretamente embriões somáticos. Esse parece ser um dos
poucos exemplos de conversão verdadeira de ápices radiculares
(TERMIGNONI, R. R., 2005).
4.9 Meios Nutritivos
Para que se obtenha êxito na cultura de células, tecidos e órgãos de
plantas, os meios nutritivos utilizados são de vital importância, fornecendo as
substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlando o padrão
de desenvolvimento in vitro (TORRES et al., 1998).
Para TORRES et al., (1998):
As mesmas vias bioquímicas e metabólicas básicas que
funcionam nas plantas são conservadas nas células cultivadas,
embora alguns processos, como fotossíntese, possam ser
inativados pelas condições de cultivo e pelo estado de
diferenciação das células. Por isso, os meios nutritivos se
baseiam nas exigências das plantas quanto aos nutrientes
minerais, com algumas modificações para atender às
necessidades específicas in vitro. Complementando as
substâncias biossintetizadas pelas células, vários compostos
orgânicos são adicionados ao meio para suprirem as
necessidades metabólicas, energéticas e estruturais das
células.
Com o passar dos anos, passos importantes foram dados, no
desenvolvimento de formulações nutritivas e nos estudos de nutrição mineral
de plantas que, há tempos, culminaram na solução nutritiva de KNOP. Nessa
solução, GAUTHERET (1934) se baseou para formular os macronutrientes de
seu meio nutritivo. WHITE, na década de 1930 desenvolveu diversas soluções
nutritivas, baseado no trabalho de pesquisadores anteriores. Os primeiros
meios apresentavam em sua composição metais exóticos (como níquel, titânio
e berílio). Os minerais incluídos na maior parte dos meios atualmente utilizados
foram definidos por WHITE, na década de 1940. Seu meio continha ainda
vitaminas e sacarose como suplementos orgânicos. Dos reguladores de
crescimento, apenas o ácido 3-indolacético (uma auxina) era conhecido. A
ênfase desses primeiros trabalhos era a identificação dos compostos
essenciais para o crescimento de células ou órgãos isolados das demais partes
da planta (TORRES et al., 1998).
31
O meio de WHITE foi utilizado como meio básico em diversas espécies e
a mudança de padrão de meio ocorreu na tentativa de otimizar o crescimento
de calo in vitro. Tais modificações envolveram o aumento das concentrações
dos sais em geral, uma diminuição na concentração de sódio e o acréscimo de
nitrogênio na forma de amônio para complementar o nitrato (MURASHIGE &
SKOOG, 1962 apud TORRES et al., 1998).
Atualmente, o meio MS (as letras iniciais de MURASHIGE & SKOOG) é
utilizado na cultura de tecidos da grande maioria das espécies. Algumas
alterações na composição desse meio são executadas, em casos específicos.
4.10 Componentes de Meios Nutritivos
4.10.1 Água
Trata-se do componente mais abundante nos meios de cultura. Portanto,
é uma potencial fonte de impurezas que podem afetar o desenvolvimento
vegetal in vitro. Em geral, a água destilada (e às vezes também deionizada) é
utilizada. Caso a água seja obtida de poços, alguns contaminantes e minerais
podem permanecer em sua composição mesmo após a destilação. Para
contornar esse problema, recomenda-se a purificação desse componente com
um sistema de filtração por filtros de carvão ativado, colunas de troca iônica e
filtros de acetato de celulose (TORRES et al., 1998).
4.10.2 Macronutrientes
De acordo com TORRES et al., (1998): “Os elementos minerais exigidos
em maiores quantidades para o crescimento de plantas inteiras são incluídos
nos meios nutritivos na forma de sais inorgânicos, podendo o nitrogênio e o
enxofre ser adicionados também como componentes de suplementos
orgânicos”.
Diferentemente dos demais macronutrientes, o nitrogênio se apresenta
na forma de cátion (amônio) e ânion (nitrito e nitrato). Essa diferença química é
marcante no crescimento de culturas de tecidos. O nitrato sustenta uma boa
taxa de crescimento em diversas espécies. Por outro lado, há espécies que
não crescem bem com nitrato no meio. A enzima redutase do nitrato (que o
reduz a nitrito e em seguida à amônia através da redutase do nitrito) determina
sua utilização pelas células. A concentração de sacarose no meio de cultura
32
pode ser um fator limitante para a atividade da redutase de nitrato (TORRES et
al., 1998).
O macronutriente fósforo é absorvido pelas plantas na forma do íon
H₂PO₄, sendo desse modo acrescentado aos meios de cultura. O meio MS, por
exemplo, utiliza o fosfato de potássio monobásico (KH₂PO₄) como fonte de
fósforo, na concentração de 1,25 µM. Para algumas espécies essa
concentração é considerada baixa, exigindo ajustes na composição do meio de
cultura (TORRES et al., 1998).
O potássio é absorvido como íon acompanhante do nitrato (KNO₃ no
meio MS), fosfato ou cloreto. “O íon exerce suas funções metabólicas e
bioquímicas na planta, e nas células in vitro como íon livre, sem incorporação
em compostos orgânicos, tornando seu metabolismo muito simples” (TORRES
et al., 1998).
Quanto ao cálcio, para que ocorra sua translocação pela planta, é
preciso que a planta transpire para que ocorra seu transporte no xilema. As
condições de alta umidade do ar (como no cultivo in vitro) podem induzir
deficiência de cálcio em partes aéreas em micropropagação. Contudo, esse
não é o caso na cultura de ápices caulinares, tecidos bastante diminutos
(TORRES et al., 1998).
O magnésio é um componente importante de vias metabólicas que
utilizam ATP. De acordo com HELLER (1965) apud TORRES et al. (1998),
“ocorrem interações entre alguns componentes dos meios, especificamente um
antagonismo entre o magnésio e o cálcio”. Geralmente o magnésio é
adicionado na forma de sulfato de magnésio (MgSO₄), como ocorre no meio
MS, fornecendo também o enxofre.
Para TORRES et al. (1998):
O ferro pertence a uma faixa intermediária entre os
macronutrientes e os micronutrientes, pois normalmente é
exigido em concentrações menores que as dos
macronutrientes, mas superiores as dos micronutrientes. Sofre
uma distinção também: é o único elemento mineral essencial
que não é absorvido como íon livre do meio.
33
4.10.3 Micronutrientes
Todos os elementos minerais aceitos atualmente como essenciais para
as plantas fazem parte da composição do meio MS (1962), tais como:
manganês, zinco, boro, cobre, cloro e molibdênio, cobalto e iodo (TORRES et
al., 1998).
Outros elementos, como o sódio, podem fazer parte da composição de
meios nutritivos, em concentrações das mais diversas, dependendo da espécie
e do explante em estudo (TORRES et al., 1998).
4.10.4 Carboidratos
Um aspecto fundamental a ressaltar é o fato de as células cultivadas in
vitro não encontrarem condições adequadas de iluminação e concentração de
CO₂, não apresentando teores de clorofila suficientes para realizar fotossíntese
que sustente o crescimento. Dessa forma, os meios de cultura necessitam de
uma fonte de carbono em sua composição para suprir as necessidades
vegetais (TORRES et al., 1998).
A sacarose é o carboidrato mais utilizado nos meios, sendo que esse
açúcar suporta as mais altas taxas de crescimento na maior parte das
espécies, sendo adicionada ao meio MS na concentração de 30 mg/l (TORRES
et al., 1998).
4.10.5 Vitaminas
Os primeiros estudos realizados com cultura de raízes (BONNER, 1937)
definiram a mistura básica de vitaminas utilizadas atualmente. Tal mistura
consiste de tiamina (vitamina B₁), ácido nicotínico (niacina) e piridoxina
(vitamina B₆), à qual normalmente se adiciona o aminoácido glicina. As
concentrações de vitaminas no meio MS são muitas vezes alteradas,
dependendo da espécie em estudo (TORRES et al., 1998).
4.10.6 Mio-Inositol
Esta substância, um hexitol ou composto cíclico com grupos –OH em
todos os seus seis carbonos, é outro componente testado desde o início dos
estudos com a cultura de tecidos de plantas. Possui um efeito estimulador no
34
crescimento de calo em fumo e outras espécies e está presente tanto no meio
MS quanto na maioria dos meios de cultura (TORRES et al., 1998).
De acordo com TORRES et al. (1998): “Sabe-se hoje, que o inositol é
incorporado às moléculas de fosfolipídios que compõem a estrutura da
membrana plasmática de outras membranas celulares”.
4.10.7 Ágar-ágar
Utilizado nos meios nutritivos sólidos, o ágar-ágar (ou simplesmente
ágar) é um polissacarídeo extraído de algas marinhas. O ágar é dissolvido em
água fervente e gelificado na presença de cátions quando esfriado. Caso seja
esterilizado num pH abaixo de 4,5, ocorre a hidrólise do ágar que o impede de
polimerizar-se ao esfriar. A concentração de ágar utilizada definirá a
consistência do meio. Altas concentrações de ágar (resultando em meios muito
consistentes) podem limitar a difusão de nutrientes até o explante
(ROMBERGER & TABOR, 1971 apud TORRES et al., 1998).
4.10.8 O pH e Outras Características dos Meios
O ácido clorídrico (HCl) e o hidróxido de sódio (NaOH) são comumente
utilizados na correção do pH dos meios de cultura. Em geral, o pH é ajustado
para valores entre 5 e 6. Os efeitos do pH podem ser diretos ou indiretos. Ele
influi na utilização do amônio como fonte de nitrogênio nas células vegetais,
onde valores de pH mais baixos (ácidos) dificultam a utilização do amônio ao
passo que valores mais altos de pH diminuem a utilização do nitrato. Durante o
crescimento das células, o pH do meio se altera à medida que diferentes íons
são absorvidos pelas células e os produtos metabólicos são excretados para o
meio. O processo de esterilização em autoclave em si altera o pH dos meios
nutritivos, fazendo-o baixar ligeiramente (TORRES et al., 1998).
4.11 Fitormônios e Reguladores de Crescimento
Os fitormônios são sintetizados em partes específicas da planta e então
translocados para outras partes, onde, em pequenas concentrações causam
resposta fisiológica que pode ser tanto de promoção quanto de inibição dos
processos de crescimento e diferenciação. Por outro lado, os reguladores de
crescimento são substâncias sintéticas que ao serem aplicados nas plantas,
35
produzem efeitos semelhantes aos dos hormônios. Desse modo, os
reguladores de crescimento podem ou não serem análogos químicos dos
fitormônios (TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M. M., 1998).
De acordo com TERMIGNONI, R. R., 2005:
Como fitormônios caracterizam-se todos os compostos
sintetizados em pequenas quantidades (nanogramas) em um
determinado tecido da planta, que atuarão nas células-alvo,
onde será exercida sua atividade biológica, causando resposta
fisiológica que alterará os padrões de desenvolvimento da
planta.
Os hormônios são uma classe de compostos químicos endógenos
facilmente transportados pelas células responsivas, onde estão diretamente
envolvidos com o controle da atividade gênica na transcrição e na tradução em
um grande número de processos. Supõe-se que as células responsivas
possuam receptores (a maior parte de origem protéica) que ao ligarem-se aos
hormônios iniciam a resposta na célula resultando em eventos bioquímicos e
fisiológicos (TORRES et al., 1999).
De acordo com TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M. M., 1998, o
efeito de cada hormônio no processo de crescimento e desenvolvimento da
planta depende da espécie de planta utilizada, da parte da planta em que é
aplicado, do estágio de desenvolvimento da planta, do estágio de
desenvolvimento do tecido, da concentração hormonal utilizada, da interação
entre os hormônios e de diversos fatores ambientais.
A sensibilidade diferencial do tecido e a concentração hormonal utilizada
interferem diretamente no mecanismo de ação do hormônio. Para que ocorra,
de fato, alguma resposta fisiológica, o hormônio deve estar presente na célula
correta, além de reconhecer e se ligar ao grupo de células que respondem ao
mesmo (receptores protéicos) e ainda tal ligação (hormônio-receptor protéico)
deve desencadear mudanças metabólicas que amplifiquem o sinal do
hormônio. Desse modo, diferentes partes das plantas podem responder
diferentemente a um determinado hormônio (TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA,
A. M. M., 1998).
36
Nos meios de cultura utilizados nos cultivos in vitro, os componentes
fundamentais, na maioria dos casos, são os reguladores de crescimento. O
tecido utilizado como explante e a espécie em estudo definirão a concentração
e o(s) tipo(s) de regulador(es) de crescimento a ser(em) utilizado(s). É preciso
ressaltar que em cada etapa do cultivo in vitro (explante, calo, broto ou raiz), é
necessário um meio de cultura com concentração hormonal diferenciada
(TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M. M., 1998).
Para TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M. M., 1998:
A atividade do fitormônio vai depender da sua concentração e
estabilidade no meio de cultura durante a preparação e
esterilização do meio e, também, da translocação e
metabolismo dos fitormônios nos tecidos durante o período de
cultivo. In vitro, o balanço hormonal do meio de cultura é
determinante para o sucesso no processo de regeneração de
plantas.
Os reguladores de crescimento, portanto, são análogos sintéticos dos
fitormônios (ou seja, possuem a mesma função), entretanto, são sintetizados
em laboratório e não pela planta (TERMIGNONI, R. R., 2005).
“A composição e concentração de hormônios no meio são fatores
determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento na maioria dos
sistemas de cultura de tecidos” (TORRES et al., 1999).
YEOMAN (1970) apud TORRES et al. (1999) considerou que o
crescimento de calo em diferentes espécies pode ser independente de auxina e
citocinina, dependente de auxina ou de citocinina ou ainda dependente de
ambas. Desse modo, certos tecidos mostram uma dependência total da
presença de reguladores exógenos no meio, enquanto outros sintetizam as
quantidades que necessitam.
4.11.1 Auxinas
As auxinas promovem, geralmente em combinação com as citocininas, o
crescimento de calos, suspensões celulares e órgãos além de regular a
morfogênese. A palavra ‘auxina’ tem origem grega e significa alargamento ou
crescimento. A nível celular, as auxinas controlam processos básicos como a
divisão e o alongamento celulares. Como são capazes de iniciar a divisão e o
alongamento celulares, estão envolvidas na formação do tecido meristemático.
37
Também estão envolvidas, em tecidos organizados, no estabelecimento e na
manutenção da polaridade e na maioria das espécies na manutenção da
dominância apical. A escolha da concentração de auxina a ser utilizada
depende: do tipo de crescimento e/ou desenvolvimento desejado, do transporte
da auxina utilizada até o tecido alvo, da taxa de inativação da auxina no meio
de cultura e no explante, do nível natural de auxina presente no explante, da
sensibilidade do explante à auxina e da interação entre as auxinas e os demais
hormônios vegetais presentes no meio de cultura (GEORGE et al., 2008).
Trata-se de um grupo hormonal sintetizado nas plantas em regiões de
crescimento ativo (como o meristema apical, as gemas axilares e as folhas
jovens), sendo, posteriormente, translocado para diferentes órgãos, onde
atuam no mecanismo interno que controla o crescimento. As auxinas
promovem crescimento do caule, folhas e raízes, além de serem responsáveis
pela dominância apical, importante condição a ser considerada nos cultivos in
vitro. Esse grupo hormonal também promove o desenvolvimento de raízes
adventícias no caule. Por isso são utilizadas na prática de reprodução
assexuada de muitas espécies, pois desse modo as características genéticas
de interesse comercial são mantidas. Para estimular a multiplicação em meio
de cultura, a auxina mais utilizada é o ácido alfa-naftaleno acético (ANA),
seguido do AIB (ácido indol-3-butírico) e do AIA (ácido 3-indol acético). As
concentrações utilizadas de ANA e AIB são geralmente abaixo de 0,5 mg/l (em
relação ao volume do meio de cultura) ao passo que as concentrações de AIA,
por ser menos estável em cultura tendem a ser superiores. Concentrações
altas de auxina podem estimular o enraizamento e a formação de calos em
detrimento da multiplicação (TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M. M., 1998).
O 2,4-D (2,4-diclorofenoxiacético) é uma auxina comumente utilizada
para a indução de calos. Em muitas espécies, a expressão da totipotência das
células competentes inicia-se ao se cultivar o explante em meios de cultura
com concentrações relativamente elevadas de 2,4-D (TORRES et al., 1999).
As várias auxinas utilizadas nos cultivos in vitro (tais como AIA, AIB, 2,4-
D, dentre outras) resultam em respostas diferentes. O AIA, por exemplo, é
considerado uma auxina instável, que se degrada facilmente pela luz ou pela
atividade microbiana, que o transforma em triptofano. Essa instabilidade o torna
uma auxina relativamente fraca quando comparada ao 2,4-D (TORRES et al.,
38
1999). REINERT & WHITE (1956) apud TORRES et al. (1999) observaram
maior crescimento de calo normal e tumoroso em meio suplementado com 2,4-
D (na concentração de 0,05 mg/l) do que com ANA (na mesma concentração).
4.11.2 Citocininas
Este grupo hormonal é formado por substâncias reguladoras de
crescimento que causam divisão celular nas plantas. As citocininas promovem
divisão, alongamento e diferenciação celular, retardam a senescência das
plantas, promovem a quebra da dominância apical (enquanto as auxinas
induzem à dominância apical) e causam a proliferação de gemas axilares. As
citocininas são fundamentais para a multiplicação da parte aérea e para a
indução de gemas adventícias. A concentração e o tipo de citocinina são os
fatores que mais influenciam a multiplicação in vitro. A benzilaminopurina,
conhecida como BAP, é a citocinina mais utilizada, seguida da cinetina (KIN).
Essas citocininas têm sido empregadas na maioria dos experimentos, mas para
determinadas espécies de plantas, outras citocininas podem ser mais
eficientes. Para multiplicação em meio de cultura, as concentrações utilizadas
variam, geralmente, de 0,1 a 5,0 mg/l (TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M.
M., 1998).
Um fator de vital importância quando se trata do cultivo in vitro é o
balanço hormonal entre citocinina e auxina no controle da morfogênese e
formação de órgãos. Na ausência de raízes adventícias, por exemplo, deve-se
aumentar a concentração de auxina e diminuir a de citocinina. Por outro lado,
se o objetivo for aumentar a formação de parte aérea, deve-se aumentar a
concentração de citocinina e diminuir a de auxina. Entretanto, se o objetivo for
a formação de parte aérea e de raízes, deve-se investigar o melhor balanço
entre esses dois hormônios. Tal balanço varia de acordo com a espécie e para
seu conhecimento, experimentos são necessários para o desenvolvimento do
protocolo correto. Contudo, deve-se estar atento às concentrações utilizadas,
pois o excesso de citocinina pode causar vitrificação nas plantas cultivadas in
vitro. Concentrações iguais promovem, em geral, a produção de calos
(TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M. M., 1998).
39
4.11.3 Giberelinas
Tratam-se de substâncias promotoras de crescimento, cujos efeitos
podem ou não ser semelhantes aos da auxina. Contudo, uma das principais
diferenças entre esses dois grupos de hormônios é que as giberelinas possuem
maior efeito quando aplicadas em plantas intactas ao passo que as auxinas
têm efeito maior quando aplicadas em segmentos de plantas. Além dos fatores
citados, as giberelinas promovem a germinação e a quebra de dormência de
diversas espécies. O GA₃ (ácido giberélico) tem sido utilizado in vitro para
estimular o alongamento da parte aérea da planta, contudo sua eficiência tem
sido baixa. A concentração hormonal utilizada, nesse caso, é em torno de 0,1
mg/l. Dezenas de tipos de giberelinas são conhecidas atualmente, havendo
uma grande especificidade entre o hormônio utilizado e a espécie vegetal em
estudo. Dessa forma, é necessário conhecer a efetividade de cada tipo de
giberelina para cada espécie de planta (TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A.
M. M., 1998).
São conhecidos mais de cem tipos de giberelinas e aparentemente
nenhuma planta possui todos esses tipos. As giberelinas estão envolvidas em
diversas respostas de crescimento, dentre elas: promoção do alongamento
celular e da atividade meristemática. Em algumas plantas, os hormônios desse
grupo controlam o processo germinativo, a determinação sexual, o
desenvolvimento dos frutos e o controle juvenil. O ácido giberélico (em baixas
concentrações) pode se tornar um ingrediente indispensável nos meios de
cultura, dependendo da espécie vegetal em estudo. Quando adicionado a um
meio de cultura, freqüentemente produz efeitos similares aos das auxinas.
Embora o GA₃ iniba a formação de raízes adventícias e de meristemas a partir
de calos, pode favorecer o crescimento e desenvolvimento de tecidos
meristemáticos previamente formados. Uma baixa concentração de GA₃ é
geralmente adicionada aos meios de cultura destinados ao desenvolvimento
meristemático. Pode nem sempre ser benéfico e há resultados contraditórios
(GEORGE et al., 2008).
40
4.11.4 Ácido Abscísico
O Ácido Abscísico (ABA) é o fitormônio que freqüentemente promove
respostas fisiológicas que ajudam a proteger as plantas de condições de
estresse (seja ele hídrico, salino ou devido a baixas temperaturas). Também
inibe o crescimento, estando associado à dormência de gemas e órgãos
subterrâneos. Induz o fechamento estomático, conferindo proteção contra o
déficit hídrico. Possui ainda efeito indireto na abscisão de folhas, flores e frutos
(TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M. M., 1998).
4.12 Recuperação de Plantas Livres de Vírus
As doenças de natureza vegetal são causadas por fungos, bactérias e
vírus (ou ainda por nematóides). Medidas efetivas de controle químico são
aplicadas para a maior parte das doenças, exceto para aquelas causadas por
vírus. Em geral, esses patógenos não são transmitidos pela semente, mas
tendem a se acumular nas plantas propagadas vegetativamente. Diante da
falta de um produto químico (defensivo) capas de erradicar vírus de plantas
infectadas, a cultura de ápices caulinares vem sendo utilizada desde 1952 a fim
de obter material de multiplicação com alta qualidade fitossanitária (MOREL &
MARTIN, 1952 apud TORRES et al., 1998).
De acordo com KARTHA (1984) apud TORRES et al. (1998): “O sucesso
na eliminação de vírus por meio da cultura de ápices caulinares depende do
tipo de vírus, da relação vírus-hospedeira e, principalmente, do tamanho do
ápice excisado”. Em trabalho realizado por KARTHA & GAMBORG (1975) apud
TORRES et al. (1998), foi verificado que 60% dos explantes de mandioca
(Manihot esculenta) menores que 0,4 mm produziram plantas sadias, mas
nenhuma planta sadia foi obtida quando os explantes tinham tamanho superior
a 0,4 mm.
Há ainda a possibilidade de, paralelamente à cultura de meristemas,
realizar a termoterapia (tratamento por calor), aumentando a possibilidade de
eliminação de vírus (TORRES et al., 1998).
Alguns autores, como QUAK (1961) apud TORRES et al. (1998)
sugerem que as citocininas (como o BAP) e outros reguladores de crescimento
podem suprimir vírus de tecidos cultivados in vitro. Por outro lado, MILO &
SRIVASTAVA (1969) apud TORRES et al. (1998) notaram estímulo a
41
multiplicação viral na presença das citocininas, de modo que diversos estudos
envolvendo espécies vegetais de interesse comercial são necessários para a
obtenção de conclusões precisas.
Conforme afirmação de TERMIGNONI, R. R. (2005), nos meristemas os
feixes vasculares ainda não estão formados e por conta disso, os vírus não
conseguem chegar a esses tecidos.
Sabe-se que para ocorrer uma infecção viral sistêmica, os vírus têm que
ter acesso livre ao sistema vascular da planta. Há várias evidências a favor da
hipótese de que o floema funciona como o veículo de transporte do vírus
através da planta, ao passo que o transporte intercelular ocorre via microcanais
com cerca de 3 nm de diâmetro, conhecidos como plasmodesmatas (NONO-
WOMDIM et al., 1993 apud TORRES et al., 1998). Desse modo, o ácido
nucléico do vírus é demasiadamente grande para passar por esses
microcanais, consistindo uma barreira física para a infestação. Contudo, hoje
se sabe que muitos vírus de plantas desenvolveram mecanismos para
contornar essa situação visando atingir o sistema vascular da planta. Tais vírus
codificam proteínas de movimento com a capacidade de aumentar o tamanho
molecular dos plasmodesmatas (GILBERTSON & LUCAS, 1996 apud TORRES
et al., 1998).
Para QUAK (1997) apud TORRES et al. (1998): “Provavelmente todas
as espécies propagadas vegetativamente estão infectadas com um ou mais
vírus, principalmente os latentes que são difíceis de serem detectados pela
sintomatologia visual. O controle químico desses agentes de infecção é
praticamente impossível”.
Assim, a cultura de ápices caulinares é uma estratégia para o
estabelecimento de estoques de plantas matrizes livres de vírus, considerando-
se que a concentração desse patógeno distribui-se de modo desuniforme na
planta infectada e é mínima ou nula nos meristemas e ápices caulinares
(TORRES et al., 1998). A estratégia consiste em reproduzir, in vitro, plantas a
partir de tecidos supostamente livres de vírus (MURASHIGE, 1974 apud
TORRES et al., 1998).
De acordo com STONE (1978) apud TORRES et al. (1998):
42
Basicamente, a metodologia consiste na excisão da cúpula
meristemática apical com um ou dois primórdios foliares (onde
ainda não se observa conexão vascular com os tecidos da
planta), podendo ser cultivada em meio nutritivo adequado para
diferenciação e desenvolvimento dos sistemas caulinar e
radicular. Várias hipóteses foram utilizadas para explicar a
eliminação de vírus via cultura de ápices caulinares.
Provavelmente, há um ou mais mecanismos de inativação
operando nas células meristemáticas em cultura, os quais
eliminam vírus dos tecidos infectados.
Também tem sido sugerido que eliminação do vírus é decorrente da
modificação metabólica que ocorre diante da injúria causada aos tecidos no
processo de excisão do explante (MELLOR & STACE-SMITH, 1977 apud
TORRES et al., 1998).
Dentre os fatores importantes na recuperação de plantas livres de vírus,
destacam-se: as condições de desenvolvimento da planta-matriz, o tipo e o
tamanho do explante, o estiolamento (ocorre quando a planta desenvolvida no
escuro não forma clorofila, permanecendo as folhas pequenas e rudimentares,
com grande alongamento do ápice, de modo que a replicação ou
movimentação viral não acompanha tal alongamento), a quebra da dominância
apical (a dominância apical inibe o crescimento de gemas laterais e sua
remoção favorece o desenvolvimento de tais gemas que, ao serem utilizadas
como explantes, conferem maior probabilidade de se obter propágulos livres de
vírus), a influência sazonal, a execução ou não de tratamentos físicos ou
químicos (tais como a termoterapia ou a quimioterapia), o meio de cultura e as
condições de cultura (TORRES et al., 1998).
Na tentativa de obter plantas livres de patógenos (sobretudo os vírus), a
micropropagação especializou-se e adaptou os procedimentos gerais de
cultura com assepsia e técnicas de cultura de meristema apical e broto apical.
Não há dúvidas de que plantas cultivadas infectadas por patógenos diversos
apresentam menor produção, qualidade e vigor quando comparadas a plantas
sadias. Os vírus são patógenos peculiares porque sua grande maioria infecta
as plantas de maneira sistêmica. Desse modo, métodos mais especializados
para se conseguir a eliminação das infecções virais são necessários. Tais
43
métodos constituem-se na regeneração de plantas a partir de culturas de
pequenos brotos apicais em desenvolvimento, como os meristemas apicais,
menores ou iguais a 0,2 mm contendo de um a três primórdios foliares
(MANTELL et al., 1994).
Depois de realizadas as etapas iniciais, o teste de patogenicidade é um
componente essencial para a produção de plantas livres de vírus. Como esses
patógenos são observáveis apenas à microscopia eletrônica, o
aperfeiçoamento de técnicas, como o teste ELISA, tornaram possível a
detecção precoce e sensível de infecções causadas por vírus. Plantas
indexadoras (que respondem fisiologicamente quando infectadas com vírus de
plantas de interesse comercial) também vêm sendo utilizadas, mas o alto grau
de especificidade exigido reduz o uso dessa técnica (MANTELL et al., 1994).
De acordo com WALKEY (1978) apud MANTELL et al., (1994): “A
cultura de meristema apical, com ou sem tratamento pelo calor, foi usada para
a eliminação de vírus para cerca de trinta espécies e os benefícios da mesma
são bem reconhecidos”.
Para PINTO & LAMEIRA (2001): “Os meristemas formam a única parte
da planta não infectada por vírus. Assim sendo a cultura do meristema
propriamente dito, acompanhado de dois primórdios foliares, permite a
regeneração de plantas isentas de viroses”. Por conta desse aspecto, a cultura
de meristemas é a principal aplicação da cultura de tecidos em plantas, no
caso daquelas que se propagam vegetativamente e, que a cada geração de
propagação vegetativa há um agravamento das viroses, culminando em
acentuada redução na produtividade. O morango e a batata são os exemplos
mais notáveis do uso da cultura de meristemas, onde o morango apresentou
uma produtividade de quatro a sete vezes maior, apenas com o uso dessa
técnica, que também viabilizou tubérculos de batata isentos de viroses. No
caso específico de Citrus, algumas viroses têm sido eliminadas procedendo-se
à microenxertia (PINTO & LAMEIRA, 2001).
De acordo com QUAK (1961) apud TORRES et al., 1998: “Desde que os
hormônios vegetais começaram a fazer parte dos meios nutritivos, tem sido
sugerido que citocininas e outros reguladores de crescimento podem suprimir
vírus de tecidos cultivados in vitro”. Por outro lado, outros estudos verificaram
44
estímulo à multiplicação virótica na presença dos reguladores de crescimento
utilizados no cultivo in vitro (TORRES et al., 1998).
Na citricultura, especificamente, a microenxertia tem sido utilizada para
eliminação de alguns vírus. Essa técnica combina o método padrão de enxertia
com a cultura de meristemas e tem eliminado diversos vírus como exocorte,
tristeza, sorose e xiliporose de plantas cítricas contaminadas (NAVARRO et al.,
1975 apud TORRES et al., 1998).
O sucesso da cultura de meristema apical depende de vários fatores.
Um dos mais importantes é a distribuição relativa dos vírus no ápice em
desenvolvimento das plantas doadoras. O fato de alguns vírus serem mais
resistentes do que outros remete às suas taxas relativas de duplicação em
tecidos com atividades de crescimento e nos quais ocorre uma alta atividade
meristemática. Alguns vírus encontram-se presentes na extremidade de um
broto em crescimento, dificultando ou impedindo seu isolamento. Portanto, o
tipo de infecção viral determinará o tamanho do meristema que deve ser usado,
antes que uma erradicação completa do vírus seja possível (MANTELL et al.,
1994).
4.13 Microenxertia
A técnica da microenxertia consiste em microenxertar (em condições
assépticas) um ápice caulinar, contendo de dois a três primórdios foliares,
excisado de uma planta matriz, sobre um porta-enxerto estabelecido in vitro (a
partir da semente da planta-mãe). Em seguida, decapta-se o porta-enxerto e
faz-se uma excisão em ‘T’ invertido em seu topo, onde é introduzido o
microenxerto (TORRES et al., 1998).
Trata-se de uma técnica descrita pela primeira vez por MURASHIGE et
al. (1972), recuperando plantas cítricas livres de exocorte e mantendo as suas
características adultas, fator essencial do ponto de vista comercial. Através de
inúmeros experimentos, essa técnica foi aperfeiçoada e tornou-se eficiente na
obtenção de plantas cítricas livres de vírus (NAVARRO et al., 1975 apud
TORRES et al., 1998). Todavia, diversos profissionais da área consideram
essa técnica inviável na produção em ampla escala de mudas cítricas, pois
consideram o índice de “pega” da enxertia demasiadamente baixo.
45
A microenxertia envolve quatro etapas principais, sendo essas: a
obtenção do porta-enxerto, a preparação e a obtenção do enxerto, a
microenxertia propriamente dita e o transplante da plântula microenxertada
(TORRES et al., 1998).
Os pesquisadores têm obtido grande sucesso na utilização da técnica da
microenxertia em diversas espécies herbáceas. Contudo, no caso das frutíferas
essa metodologia possui limitações, pois geralmente essas espécies
apresentam dificuldade de regeneração a partir de ápices caulinares. (HUANG
et al., 1990 apud TORRES et al., 1998).
De acordo com TORRES et al., 1998:
O sucesso na utilização da microenxertia para obtenção de
material propagativo livre de doenças depende de uma série de
fatores, dentre os quais os mais importantes são: Condições de
incubação do microporta-enxerto – A incubação no escuro é
indispensável para obtenção do tecido tenro e estiolado, de
modo que facilite as etapas subseqüentes; Idade do
microporta-enxerto – Com quinze dias de idade os microporta-
enxertos propiciam uma taxa de pegamento de 50%.
Outro fator essencial no sucesso da microenxertia (bem como na cultura
de meristemas) é o tamanho do explante. Para TORRES et al., 1998:
O sucesso da microenxertia é altamente dependente do
tamanho do explante. O ápice caulinar excisado com o
tamanho de 0,05 mm apresenta uma taxa de sucesso
relativamente baixa, cerca de 2%, ao passo que o ápice
caulinar, com seis primórdios foliares, apresenta uma taxa de
sucesso mais elevada, em torno de 50%. Contudo, quanto
maior o tamanho do explante, menor será a taxa de obtenção
de plântulas livres de vírus. Dessa forma, o ápice caulinar
acompanhado de dois primórdios foliares, medindo
aproximadamente 0,15 mm, é o ideal para a obtenção de
plantas microenxertadas livres de vírus.
46
Ressalta-se ainda que a habilidade manual do profissional que realiza
tanto a excisão em ‘T’ invertido quanto o corte do ápice caulinar (em geral sob
lupa ou microscópio) deve ser precisa e ágil, para facilitar a aderência e evitar o
ressecamento dos tecidos (TORRES et al., 1998).
Depois de realizada a microenxertia e obtida a planta dela resultante, é
necessário que seja implementado um sistema de indexação que permita
identificar os vírus presentes na planta matriz através do uso de plantas
indicadoras (TORRES et al., 1998).
5 FORMULAÇÃO DO PROBLEMA
O presente trabalho é parte de um projeto maior que envolve desde a
coleta, isolamento, assepsia e inoculação dos ápices caulinares em diversos
meios de cultura para que enfim se obtenha a limpeza de vírus em plantas
cítricas e que investiga e questiona se:
A taxa de sobrevivência e o desenvolvimento dos ápices caulinares são
os mesmos para os diferentes meios de cultura (com reguladores de
crescimento distintos e em concentrações diversas)?
Considerando-se a etapa que envolve a organogênese indireta, o
desenvolvimento de calo é igual dentre os diferentes meios de cultura?
6 HIPÓTESE
Acredita-se, com base na revisão bibliográfica realizada que os ápices
caulinares responderão de maneira distinta, de acordo com os reguladores de
crescimento utilizados. A interação entre os fito-reguladores e a concentração
dos mesmos nos meios de cultura pode prejudicar, favorecer ou até mesmo
não interferir no desenvolvimento e na sobrevivência dos explantes (ápices
caulinares).
Da mesma maneira, acredita-se que o desenvolvimento de calos deverá
apresentar diferentes respostas morfogenéticas, conforme a composição do
meio de cultura.
47
7. DESCRIÇÃO DA EMPRESA
A EPAGRI - Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de
Santa Catarina S/A – foi criada em 1991, no bojo de uma profunda reforma
administrativa promovida pelo governo estadual no Serviço Público Agrícola,
que fundiu e incorporou numa só instituição os serviços de pesquisa
agropecuária até então desenvolvidos pela EMPASC – Empresa Catarinense
de Pesquisa Agropecuária S.A., de extensão rural pela ACARESC –
Associação de Crédito e Assistência Rural de Santa Catarina, de extensão
pesqueira pela ACARPESC - Associação de Crédito e Assistência Pesqueira
de Santa Catarina, além do serviço de fomento apícola, à cargo do IASC –
Instituto de Apicultura de Santa Catarina. Em 22 de junho de 2005, a EPAGRI
incorporou o Instituto de Planejamento e Economia Agrícola de Santa Catarina
- Instituto Cepa/SC. Na mesma data, a Assembléia de Acionistas aprovou a
transformação da EPAGRI em empresa pública.
A empresa tem como missão “difundir o conhecimento, a tecnologia e a
extensão para o desenvolvimento sustentável do meio rural, em benefício da
sociedade”. Procura ainda “promover a preservação, recuperação,
conservação e utilização sustentável dos recursos naturais, buscar a
competitividade da agricultura catarinense frente a mercados globalizados,
adequando os produtos às exigências dos consumidores e promover a
melhoria da qualidade de vida do meio rural e pesqueiro”.
Quanto à Estação Experimental de Itajaí – EEI (figuras 08 e 09), local
onde foi realizado o estágio de conclusão de curso, suas bases foram lançadas
em 1975, antes mesmo de ser oficialmente criada a EMPASC. Em 16 de maio
de 1975, o Eng. Agr. José Oscar Kurtz, representando a EMBRAPA, nomeou a
comissão que se encarregaria de estudar e propor possíveis áreas (na Região
do Vale do Itajaí) para a “instalação de uma Unidade Executiva de Pesquisa de
Âmbito Estadual, destinada ao estudo das culturas de arroz, cana-de-açúcar,
mandioca, forrageiras e fruticultura de clima tropical“.
48
Fig. 08 – Portão principal da EEI. Fig. 09 – Lab. de Biotecnologia da EEI.
Após a aquisição de uma área de 121,57 ha, as margens da Rodovia
Antônio Heil km 6 (Latitude 26° 57‘ 57s Sul, Longitude 48° 48‘ 01s, altitude 2m),
foi nomeado como primeiro chefe da Estação o Eng. Agr. Sylvio Ferraz de
Araujo (Portaria EMPASC n° 5A de 1/4/1976).
Em 1976, a chefia e administração da EEI localizavam-se numa casa na
Rua Lauro Müller 1067, em Itajaí (SC), enquanto as atividades de pesquisa
eram desenvolvidas já na área da EEI.
Em 16/11/1979 deu-se início as atividades de construção da atual sede
da EEI, que seria concluída em Fevereiro de 1981, comportando
administração, escritórios dos pesquisadores, biblioteca, laboratórios e
auditório. Em 1991, após a incorporação da ACARESC, EMPASC, ACARPESC
e IASC pela EMPASC, a EEI manteve suas funções de pesquisa e geração de
tecnologia na nova instituição (EPAGRI), porém suas dependências passaram
também doravante a abrigar técnicos e pessoal administrativo ligado à
extensão rural.
Atualmente a EEI conta com um corpo técnico composto por 35
pesquisadores (17 doutores, 17 mestres e 01 graduado), 46 funcionários de
apoio operacional e 12 funcionários de apoio técnico. As atividades de
pesquisa da EEI têm gerado centenas de publicações técnicas e científicas,
sendo reconhecida nacional e internacionalmente a excelência desta unidade
da EPAGRI.
Desenvolvem-se na EEI atividades de pesquisa, difusão de tecnologia, e
formação de recursos humanos. Atualmente a estação executa um terço das
atividades de pesquisa científica da EPAGRI.
49
As atividades da estação não se limitam às circunvizinhanças do Vale do
Itajaí, mas estendem-se principalmente desde o sul do Estado, até o litoral
Norte e Alto Vale do Itajaí. Vinculado à EEI existe também o CEPC (Campo
Experimental de Piscicultura – Camboriú - SC), que desenvolve trabalhos de
pesquisa com piscicultura.
Ressalta-se que além do aspecto inerente à Pesquisa Agropecuária, o
corpo técnico da EEI tem se empenhado na difusão de tecnologia, ministrando
cursos profissionalizantes e palestras a agricultores e estudantes. Importante
papel também é desempenhado pelos técnicos da estação no ensino
(formação de estudantes do ensino fundamental, médio e superior), seja pela
visita de mais de mil alunos anualmente, seja por propiciar ambiente altamente
favorável ao desenvolvimento de estágios e trabalhos de pesquisa para
acadêmicos de diversos cursos superiores.
A EEI mantém estreito vínculo de trabalho com diversas instituições,
empresas e universidades do setor público e privado com as quais desenvolve
projetos e trabalhos conjuntos.
A Estação Experimental de Itajaí possui uma série de laboratórios que
servem de apoio à pesquisa e também atual na prestação de serviços:
• Laboratório de biologia molecular
• Laboratório de Beauveria
• Laboratório de plantas bioativas
• Laboratório de biotecnologia
• Laboratório de análise de água
• Laboratório de cultura de tecidos vegetais (LCTV)
• Laboratório de entomologia
• Laboratório de fitopatologia
• Laboratório de sementes florestais
• Laboratório de piscicultura
50
8. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
As atividades desenvolvidas sob a supervisão do Dr. Gilmar Roberto
Zaffari foram:
§ Apresentação da EEI ao estagiário;
§ Palestra sobre cultura de tecidos vegetais com o supervisor do estágio;
§ Preparo de meio de cultura;
§ Coleta - preparo e assepsia dos explantes de espécies de interesse
econômico;
§ Técnicas de cultivo in vitro de meristemas, ápices caulinares, gemas,
segmentos nodais, raízes e folhas;
§ Repicagem de material in vitro;
§ Instalação de experimento e avaliação – Melhoria genética e sanitária
das mudas cítricas produzidas em Santa Catarina - limpeza de vírus em
cultivar cítrica de interesse comercial (Baía-Catarina);
§ Conservação de germoplasma in vitro;
§ Limpeza clonal de material vegetal (viroses);
§ Aclimatização - transferência de plântulas in vitro para ex vitro (solo);
§ Preparo de substrato e cuidados com as mudas em telado;
§ Discussão geral sobre cultura de tecidos vegetais e sobre o estágio;
§ Revisão de literatura.
8.1 ATIVIDADES INICIAIS
Durante o período de estágio foram acompanhadas as atividades
realizadas pelos técnicos do Laboratório de Biotecnologia com vistas à
ambientação e conhecimento sobre os procedimentos e protocolos padrões.
No dia 01/09/2010 pôde-se acompanhar a obtenção de explantes de
Anthurium sp., bem como a assepsia do material, lavado com água e
detergente (Tween®), seguido de assepsia com etanol e hipoclorito de sódio
0,5%. O objetivo desse experimento era o de estabelecer o protocolo ideal para
assepsia do material. Para isso, diferentes concentrações de hipoclorito de
sódio foram utilizadas e o tempo no qual o material foi mantido nessas
soluções de hipoclorito também foi uma das variáveis avaliadas.
51
Sob câmara de fluxo laminar (CFL) o material foi inoculado em meio de
cultura MS, respeitando-se a polaridade na qual o explante foliar encontrava-se
originalmente. Um procedimento notável adotado pelo laboratório é a utilização,
como base para preparo do material a ser inoculado, de papéis reaproveitados
e esterilizados na autoclave dentro de placas metálicas, ao passo que a maior
parte dos laboratórios utiliza placas de petri esterilizadas ou esteriliza uma
superfície de vidro com o auxílio de etanol e fogo. Esse procedimento mostrou-
se bastante prático e eficiente.
Fig. 10 – Técnicos do laboratório de biotecnologia da EPAGRI realizando assepsia do
material vegetal sob a câmara de fluxo laminar.
Nesse mesmo dia foi observada a reciclagem do álcool 90% para álcool
70% e o correto descarte do material, sendo o álcool e o mercúrio
armazenados em recipientes distintos e em seguida levados a uma
universidade local para correto descarte. Foi observada a maneira com que os
técnicos repicaram Manihot esculenta, espécie com grande capacidade de
multiplicação, cultivadas via organogênese direta. Também houve repicagem
de capim-limão e de Dyckia encholirioides. Pôde-se ainda acompanhar os
técnicos do laboratório realizando a avaliação das espécies mantidas na sala
de crescimento. Os frascos contendo o material vegetal são fotografados e os
resultados observados anotados em uma planilha.
52
No dia 03/09/2010 houve continuação na repicagem de Anthurium e
foram acompanhados procedimentos rotineiros do laboratório de biotecnologia,
tais como: lavagem da vidraria e esterilização do material a ser utilizado sob a
CFL. Um procedimento importante acompanhado nesse dia foi o preparo
inicial de Raphis (gênero de palmeira ornamental), onde o material vegetal foi
coletado a campo e foram realizados diversos tratamentos, pois o objetivo era
definir a assepsia mais eficiente a ser aplicada nos propágulos coletados
(figura 10). Foram no total cinco tratamentos, com variação no tempo de
exposição aos seguintes agentes químicos: etanol, hipoclorito de sódio e
cloreto de mercúrio. Em seguida o material foi inoculado em meio de cultura
MS. Também foi preparado nesse dia o meio de cultura Knudson com carvão
ativado. Meios de cultura com carvão ativado favorecem o enraizamento de
certas espécies devido à coloração escura.
Fig. 11 – Avaliação aos 14 dias dos ápices caulinares cítricos inoculados
pela equipe do laboratório de biotecnologia.
No dia 08/09/2010, após o feriado prolongado de 07/09/2010 foi
assistida uma palestra ministrada pelo supervisor de estágio, Professor/Doutor
Gilmar Roberto Zaffari, na qual abordou assuntos pertinentes à Cultura de
Tecidos, Cultivo in vitro e fisiologia vegetal. No dia seguinte, ocorreu a
avaliação dos ápices caulinares de Citrus (figura 11), inoculados pela equipe do
laboratório na semana anterior. Além disso, foi acompanhado o preparo do
meio de cultura Pierik 3 e manipulado material vegetal sob a CFL pela primeira
53
vez naquele laboratório, efetuando-se a repicagem de uma espécie de
samambaia (mantida em meio de cultura sólido) e de Aechmea ornata (mantida
em meio de cultura líquido). No dia 10/09/2010 a equipe do laboratório
mobilizou-se a preparar meio de cultura MS 50% em grande quantidade,
destinado a um projeto do setor de fruticultura da EPAGRI e em seguida
dedicou-se à leitura de diversos artigos científicos fornecidos pelo supervisor
de estágio.
8.2 INOCULAÇÃO SOB A CÂMARA DE FLUXO LAMINAR
Na semana seguinte, do dia 13/09/2010 ao dia 17/09/2010 foi
acompanhada a forma com que os técnicos efetuam a repicagem de Musa sp.
(cultivar Grand Naine) sob a CFL e em seguida passou-se a efetuar a
repicagem diariamente, orientado pelos técnicos e pelo supervisor de estágio.
Todo o material repicado foi inoculado no meio de cultura MS 50% preparado
na semana anterior. Já nos dias 20 e 21/09/2010 houve continuidade na
repicagem de Musa sp., porém da cultivar IAC 2001. No dia seguinte houve o
preparo do meio de cultura Knudson para inoculação da planta ornamental
Alstroemeria spp. Na ausência dos rizomas da planta, utilizados como
explantes, o laboratório visa induzir calos nas flores e folhas da planta para
então induzir à formação dos rizomas.
8.3 PLANEJAMENTO DO EXPERIMENTO
No dia 24/09/2010, a campo, na coleção de plantas cítricas da EEI
(figura 12), buscou-se indivíduos que estivessem emitindo brotações foliares
para isolamento dos ápices caulinares a fim de aprimorar suas técnicas para
futuro isolamento do material a ser utilizado no experimento do Trabalho de
Conclusão de Curso. Como nenhuma variedade comercial estava, naquele
momento, emitindo brotações foliares, o estagiário coletou ápices caulinares da
cerca viva do banco de germoplasma da EEI, a cultivar cítrica “Flying Dragon”
(figura 13).
54
Fig. 12 – Coleção de plantas cítricas da EEI.
Fig. 13 – Cerca viva da variedade Flying Dragon (coleção da EEI).
Diversos ápices caulinares foram isolados à lupa com o auxílio de um
bisturi com lâmina fina e de uma pinça.
Na semana seguinte, precisamente no dia 27/09/2010, houve uma
reunião com o Dr. Zaffari para planejar detalhadamente o experimento a ser
realizado. Decidiu-se que o primeiro passo seria a definição dos meios de
cultura a serem preparados e em seguida o preparo em si desses meios de
cultura, pelo acadêmico. O supervisor de estágio definiu as seguintes
concentrações (em mg/l) hormonais para os meios destinados à organogênese
direta: BAP [0,0], [0,5], [1,0]; ANA [0,0], [0,5], [1,0] e GA₃ [0,0], [0,25], [0,5].
Para a organogênese indireta foram definidos os seguintes hormônios e
55
concentrações: 2,4-D [0,0], [0,5], [1,0], [2,0]; ANA [0,0], [1,0], [2,0] e BAP [1,0],
[2,0]. Após uma análise combinatória, foram definidos 27 tipos de meio de
cultura destinados à organogênese direta e 24 tipos de meio de cultura
destinados à organogênese indireta (tabela 01). A base de todos os meios de
cultura foi o meio MS.
Tabela 01 – Meios de cultura preparados e seus respectivos constituintes.
Código Código1 28 MS + [1,00] BAP2 29 MS + [2,00] BAP3 30 MS + [1,00] ANA + [1,00] BAP4 31 MS + [1,00] ANA + [2,00] BAP5 32 MS + [2,00] ANA + [1,00] BAP6 33 MS + [2,00] ANA + [2,00] BAP7 34 MS + [0,5] 2,4-D + [1,00] BAP8 35 MS + [0,5] 2,4-D + [2,00] BAP9 36 MS + [0,5] 2,4-D + [1,00] ANA + [1,00] BAP
10 37 MS + [0,5] 2,4-D + [1,00] ANA + [2,00] BAP11 38 MS + [0,5] 2,4-D + [2,00] ANA + [1,00] BAP12 39 MS + [0,5] 2,4-D + [2,00] ANA + [2,00] BAP13 40 MS + [1,00] 2,4-D + [1,00] BAP14 41 MS + [1,00] 2,4-D + [2,00] BAP15 42 MS + [1,00] 2,4-D + [1,00] ANA + [1,00] BAP16 43 MS + [1,00] 2,4-D + [1,00] ANA + [2,00] BAP17 44 MS + [1,00] 2,4-D + [2,00] ANA + [1,00] BAP18 45 MS + [1,00] 2,4-D + [2,00] ANA + [2,00] BAP19 46 MS + [2,00] 2,4-D + [1,00] BAP20 47 MS + [2,00] 2,4-D + [2,00] BAP21 48 MS + [2,00] 2,4-D + [1,00] ANA + [1,00] BAP22 49 MS + [2,00] 2,4-D + [1,00] ANA + [2,00] BAP23 50 MS + [2,00] 2,4-D + [2,00] ANA + [1,00] BAP24 51 MS + [2,00] 2,4-D + [2,00] ANA + [2,00] BAP252627
COMPOSIÇÃO DO MEIO (mg/l)ORGANOGÊNESE INDIRETA
MS + [0,50] BAP + [0,50] ANA
MS + [1,00] BAPMS + [1,00] BAP + [0,25] GA3
MS + [0,50] ANAMS + [0,50] ANA + [0,25] GA3MS + [0,50] ANA + [0,50] GA3MS + [1,00] ANA
MS + [1,00] BAP + [1,00] ANA
MS + [0,50] BAP + [1,00] ANA
MS + [0,50] BAP + [0,50] ANA + [0,25] GA3
MS + [1,00] ANA + [0,25] GA3
MS + [1,00] BAP + [1,00] ANA + [0,50] GA3
MS + [1,00] BAP + [0,50] ANA + [0,25] GA3MS + [1,00] BAP + [0,50] ANA + [0,50] GA3
MS + [1,00] BAP + [1,00] ANA + [0,25] GA3
MS + [0,50] BAP + [0,50] ANA + [0,50] GA3
MS + [0,50] BAP + [1,00] ANA + [0,25] GA3
MS + [1,00] BAP + [0,50] GA3MS + [1,00] BAP + [0,50] ANA
MS + [0,50] BAP + [1,00] ANA + [0,50] GA3
ORGANOGÊNESE DIRETACOMPOSIÇÃO DO MEIO (mg/l)
MSMS + [0,25] GA3MS + [0,50] GA3
MS + [1,00] ANA + [0,50] GA3MS + [0,50] BAPMS + [0,50] BAP + [0,25] GA3MS + [0,50] BAP + [0,50] GA3
8.4 PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA
No dia 28/09/2010 iniciou-se o preparo dos meios de cultura (figuras 14
a 18) para o experimento realizado, procedimento realizado até o dia
04/10/2010. No dia 06/10/2010 houve o planejamento da segunda etapa do
experimento juntamente ao Dr. Zaffari e ao Engº Quím. do laboratório, Dilnei
Souza Medeiros. Entretanto, apenas no dia 08/10/2010, a campo com o Dr.
Zaffari, o Engº Quím. Dilnei Souza Medeiros e o Dr. Osvino Leonardo Koller
56
(responsável pela citricultura da EEI) verificou-se que as plantas encontravam-
se no estádio fenológico de floração/frutificação, não emitindo brotações
foliares, portanto. Diante disso, três procedimentos foram adotados na tentativa
de forçar as plantas de interesse comercial a emitirem brotações foliares:
adubação nitrogenada (com 600 g de uréia por planta), poda de ramos, raleio
químico com a pulverização de uma solução contendo ANA (ácido
naftalenoacético) na concentração de 0,5 mg/l, dissolvido em água com o
auxílio de NaOH (1 M).
Fig. 14 – Estagiário regulando o pH do meio de cultura.
Fig. 15 – Regulagem do pH do Fig. 16 – Material utilizado no meio de cultura 40. preparo dos meios de cultura.
57
Fig. 17 – Soluções utilizadas no meio MS. Fig. 18 – Reguladores de crescimento utilizados.
8.5 COLETA, ISOLAMENTO, ASSEPSIA E INOCULAÇÃO DOS ÁPICES
CAULINARES
Fig. 19 – Laranjeiras da variedade Fig. 20 – Ápices caulinares
Baía-Catarina. em brotações novas.
Fig. 21 – Ápices caulinares da variedade cítrica Baía-Catarina.
58
Após os procedimentos acima mencionados, somente no dia 18/10/2010
as três plantas cítricas da variedade ‘Baía-Catarina’ responderam à poda
emitindo diversas brotações foliares, sendo que o raleio químico não
apresentou resultados e a adubação nitrogenada provavelmente foi pouco
significativa, pois a maior parte do nitrogênio contido na uréia tende a evaporar,
devido à sua volatilidade. Desse modo, nesse mesmo dia ocorreu a coleta, o
isolamento à lupa, a assepsia sob a CFL e a inoculação (também sob a CFL)
dos ápices caulinares (com tamanho médio de 0,2 mm) daquela variedade nos
meios de cultura 01, 02 e 03. Até o dia 03/11/2010 houve continuidade na
coleta, isolamento, assepsia e inoculação dos ápices caulinares da variedade
‘Baía-Catarina’ em todos os tipos de meio de cultura preparados (tanto para a
organogênese direta quanto para a indireta).
Os ápices caulinares inoculados nos meios de cultura destinados à
organogênese direta foram mantidos em sala de crescimento à temperatura de
28°C, umidade relativa do ar de 60% e expostos à luz branca de intensidade de
50 µmol.m²/s. Por sua vez, os ápices caulinares destinados à organogênese
indireta foram mantidos na mesma sala de crescimento, porém sob ausência
de luz (figuras 22 e 23).
Fig. 22 – Sala de crescimento Fig. 23 – Sala de crescimento. (organogênese direta) (organogênese indireta)
59
Fig. 24 – Ápice caulinar. Fig. 25 – Ápice caulinar com 2 mm isolado à lupa.
Fig. 26 – Acadêmico isolando ápices caulinares à lupa.
Fig. 27 – Inoculação dos ápices Fig. 28 – Ápices caulinares mantidos em caulinares sob a CFL. peneira esterilizada sob a CFL.
8.6 AVALIAÇÃO DO MATERIAL INOCULADO
Depois de concluída a montagem do experimento em si, passou-se a
avaliar o material inoculado - com 15 dias e com 20-30 dias após a inoculação
– (figuras 29 a 32). Nos três primeiros meios de cultura onde houve a
60
inoculação dos ápices caulinares houve alta taxa de contaminação por fungos
dentro dos frascos (figuras 29 e 30), o que não ocorreu nas inoculações
seguintes.
Fig. 29 – Frascos apresentando meios de Fig. 30 – Contaminação por fungos. cultura contaminados por fungos.
Fig. 31 – Frascos contendo cultura Fig. 32 – Ápice caulinar em aos 15 dias. desenvolvimento.
Posteriormente houve o acompanhamento e a auxílio aos laboratoristas
nos projetos em andamento no laboratório de biotecnologia. Dentre esses
projetos, o próprio Projeto Citrus, aprovado pela FAPESC, o qual o presente
realizou apenas uma das etapas iniciais, com uma variedade cítrica ao passo
que o projeto em sua forma integral envolve seis variedades cítricas de
interesse comercial, um número maior de repetições e um grande volume de
meio de cultura a ser preparado.
9. RESULTADOS
Houve a avaliação completa (aos 15 e aos 20-30 dias após a
inoculação) dos ápices caulinares inoculados nos meios de cultura destinados
à organogênese direta (tabelas 02 e 03) e a avaliação aos 15 dias dos ápices
caulinares inoculados nos meios de cultura destinados à organogênese
61
indireta. A avaliação foi qualitativa, observando-se os ápices caulinares que se
mantiveram verdes, com potencial de desenvolvimento (tabelas 02, 03 e 04).
Tabela 02 – Material avaliado aos 15 dias após a inoculação (organogênese direta). Data de
Inoculação Id. do Meio de
Cultura Ápices viáveis Ápices vivos Aspecto
18/10/2010 1 3 3 Oxidados 18/10/2010 2 4 4 Oxidados 18/10/2010 3 3 3 Oxidados 20/10/2010 4 4 4 Oxidados 20/10/2010 5 6 6 Oxidados 20/10/2010 6 5 5 Oxidados 20/10/2010 7 5 5 Oxidados 20/10/2010 8 5 5 Oxidados 22/10/2010 9 6 6 Oxidados 22/10/2010 10 5 5 Oxidados 22/10/2010 11 6 6 Oxidados 22/10/2010 12 5 5 Oxidados 22/10/2010 13 5 5 Oxidados 22/10/2010 14 6 6 Verdes* 22/10/2010 15 6 6 Verdes* 22/10/2010 16 5 5 Oxidados 27/10/2010 17 6 6 Oxidados 27/10/2010 18 6 6 Oxidados 27/10/2010 19 6 6 Oxidados 27/10/2010 20 6 6 Oxidados 27/10/2010 21 6 6 Oxidados 27/10/2010 22 6 6 Oxidados 27/10/2010 23 6 6 Oxidados 27/10/2010 24 6 6 Oxidados 27/10/2010 25 6 6 Oxidados 27/10/2010 26 6 6 Oxidados 27/10/2010 27 6 6 Oxidados
62
Tabela 03 – Material avaliado aos 20-30 dias após a inoculação (organogênese direta). Data de
Inoculação Id. do Meio de
Cultura Ápices viáveis Ápices vivos Aspecto
18/10/2010 1 3 3 Oxidados 18/10/2010 2 4 4 Oxidados 18/10/2010 3 3 3 Oxidados 20/10/2010 4 4 4 Oxidados 20/10/2010 5 6 6 Oxidados 20/10/2010 6 5 5 Oxidados 20/10/2010 7 5 5 Oxidados 20/10/2010 8 5 5 Oxidados 22/10/2010 9 6 6 Oxidados 22/10/2010 10 5 5 Oxidados 22/10/2010 11 6 6 Oxidados 22/10/2010 12 5 5 Oxidados 22/10/2010 13 5 5 Oxidados 22/10/2010 14 6 6 Verdes* 22/10/2010 15 6 6 Verdes* 22/10/2010 16 5 5 Oxidados 27/10/2010 17 6 6 Oxidados 27/10/2010 18 6 6 Oxidados 27/10/2010 19 6 6 Oxidados 27/10/2010 20 6 6 Oxidados 27/10/2010 21 6 6 Oxidados 27/10/2010 22 6 6 Oxidados 27/10/2010 23 6 6 Oxidados 27/10/2010 24 6 6 Oxidados 27/10/2010 25 6 6 Oxidados 27/10/2010 26 6 6 Oxidados 27/10/2010 27 6 6 Oxidados
Tabela 04 – Avaliação aos 15 dias para organogênese indireta. Inoculação Meio Nº explantes 1ª avaliação (15 dias) 1ª avaliação (vivos): 1ª avaliação (aspecto):
27/10/2010 28 6 11/11/2010 5 vivos, oxidados (sem calo)28/10/2010 29 6 12/11/2010 6 vivos, oxidados (1)/vivos, verdes (5)28/10/2010 30 6 12/11/2010 6 vivos, oxidados (1)/vivos, verdes (5)28/10/2010 31 6 12/11/2010 6 vivos, oxidados (2)/vivos, verdes (4)28/10/2010 32 6 12/11/2010 6 vivos, verdes28/10/2010 33 6 12/11/2010 6 vivos, verdes28/10/2010 34 6 12/11/2010 5 vivos, verdes, sem calo28/10/2010 35 4 12/11/2010 4 vivos, verdes, sem calo03/11/2010 36 6 18/11/2010 6 vivos, verdes, sem calo03/11/2010 37 6 18/11/2010 6 vivos, verdes, sem calo03/11/2010 38 6 18/11/2010 6 vivos, verdes, sem calo03/11/2010 39 6 18/11/2010 6 vivos, verdes, sem calo03/11/2010 40 6 18/11/2010 6 vivos, verdes, sem calo03/11/2010 41 6 18/11/2010 6 vivos, verdes, sem calo03/11/2010 42 6 18/11/2010 6 vivos, verdes, sem calo03/11/2010 43 6 18/11/2010 5 vivos, verdes, sem calo04/11/2010 44 6 19/11/2010 6 vivos, verdes, sem calo04/11/2010 45 6 19/11/2010 6 vivos, verdes, sem calo04/11/2010 46 6 19/11/2010 6 vivos, oxidados (1)/vivos, verdes (5)04/11/2010 47 6 19/11/2010 5 vivos, oxidados04/11/2010 48 6 19/11/2010 6 vivos, oxidados (1)/vivos, verdes (5)04/11/2010 49 6 19/11/2010 6 vivos, oxidados (1)/vivos, verdes (5)04/11/2010 50 6 19/11/2010 6 vivos, oxidados (1)/vivos, verdes (5)04/11/2010 51 6 19/11/2010 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)
63
10. DISCUSSÃO
Observando-se as tabelas 01, 02 e 03, pode-se notar, com base na
revisão bibliográfica, que – para a organogênese direta - os meios de cultura
contendo os três reguladores de crescimento (BAP, ANA e GA₃) em baixas
concentrações favorecem a sobrevivência e o desenvolvimento dos ápices
caulinares. Isso pode ser inferido porque nos meios 14 e 15, onde os três
reguladores estão presentes, todos os ápices inoculados sobreviveram e
mantiveram-se verdes, com elevado potencial de desenvolvimento (figuras 33 e
34), ao passo que o material inoculado nos outros meios ou oxidaram-se por
completo ou apenas metade manteve-se verde e ainda havendo casos em que
a maior parte do material oxidou-se (ver anexos 01 e 02).
Fig.33 – Ápice caulinar em desenvolvimento no meio de cultura n°14.
Fig. 34 – Ápice caulinar em desenvolvimento no meio de cultura n°15.
64
Fig. 35 – Ápice caulinar oxidado no meio de cultura n°12.
Já para a organogênese indireta, não se pode concluir qual(is) meio(s)
favorece(m) o desenvolvimento dos ápices caulinares, pois os resultados
observados foram semelhantes e não houve a formação de calos, nem mesmo
nos meios contendo o regulador de crescimento 2,4-D, que induz o
desenvolvimento dessas estruturas. A análise aos trinta dias será necessária,
pois poderá ocorrer o desenvolvimento de calos nos ápices caulinares
inoculados. Nota-se firmemente que o material vegetal mantido no escuro
(característica da organogênse indireta) tem sua oxidação retardada, pela
ausência de luz.
11. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com base na revisão bibliográfica e no conteúdo aprendido na prática
durante o estágio de conclusão de curso no laboratório de biotecnologia da
EPAGRI-Itajaí, pode-se concluir que a cultura de ápices caulinares, sobretudo
via organogênese indireta, onde várias plantas podem ser obtidas através de
um único ápice, corresponde a um conjunto de técnicas promissoras na
obtenção de plantas matrizes livres de viroses. Trata-se ainda de uma maneira
mais eficaz de se obter tais plantas matrizes do que a microenxertia, onde o
pegamento dos microenxertos é baixo. Entretanto, a cultura de ápices
caulinares envolve técnicas que precisam ser aprimoradas, exigindo mão-de-
obra altamente qualificada e recursos por parte dos fundos de pesquisa.
65
A alta especificidade exigida pelas diversas espécies vegetais (e ainda
pelas variedades das mesmas espécies) exige o desenvolvimento de
protocolos também específicos. Para isso, experimentos como o presente são
necessários: para o desenvolvimento de protocolos, contribuindo com o
progresso científico.
Com base na revisão bibliográfica e no experimento conduzido, conclui-
se que:
§ Para a organogênese direta, os meios de cultura contendo os três
reguladores de crescimento (BAP, ANA e GA₃), em baixas
concentrações, favorecem a sobrevivência e o desenvolvimento dos
ápices caulinares.
§ O meio de cultura recomendado para o desenvolvimento de ápices
caulinares da variedade cítrica ‘Baía-Catarina’ destinados à
organogênese direta possui a seguinte composição: MS + [0,50] BAP +
[0,50] ANA + [0,25] GA₃.
§ Para a organogênese indireta, é necessária a análise aos trinta dias
após a inoculação, permitindo o desenvolvimento de calos.
§ Para a organogênese indireta, aos quinze dias após a inoculação, nem
mesmo altas concentrações de 2,4-D favorecem o desenvolvimento de
calos.
§ Os ápices caulinares mantidos sob ausência de luz têm sua oxidação
diminuída.
66
12. BIBLIOGRAFIA A Indústria Brasileira das Frutas Disponível em: <www.redetec.org.br/.../A%20Indústria%20Brasileira%20de%20Frutas%20%202006.doc>. Acesso em 01 novembro 2010. EPAGRI Disponível em: <http://www.epagri.sc.gov.br>. Acesso em 02 novembro 2010. GEORGE, E. F.; HALL, M. A.; DE KLERK, GEERT-JAN. Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd edition, V.01, The Netherlands, 501 p. 2008. Informação Nutricional Disponível em: <http://www.informacaonutricional.net/nutricao/laranja-da-baia/>. Acesso em 06 novembro 2010. KOLLER, O. L. Citricultura Catarinense – Seus números e suas necessidades. Agropecuária Catarinense, Florianópolis, v.14, n.1, p. 54-61, 2001. MANTELL, S. H.; MATTHEWS, J. A.; McKEE, R. A. Princípios de biotecnologia em plantas: uma introdução à engenharia genética em plantas. Ribeirão Preto. Sociedade Brasileira de Genética, 1994, 344 p. PINTO, José Eduardo Brasil Pereira; LAMEIRA, Osmar Alves. Micropropagação e Metabólitos Secundários In Vitro de Plantas Medicinais. Lavras. UFLA/FAEPE, 2001, 102 p. ROISTACHER, C. N. Razões para a criação de um programa obrigatório de certificação de citros. Laranja, Cordeirópolis, v.15, n.2, p.179-211, 1994. SIMÃO, S. Manual de Fruticultura. Agronômica Ceres. São Paulo, 1971, 530 p. TERMIGNONI, Regina Ramos. Cultura de Tecidos Vegetais. Porto Alegre, Editora da UFRGS, 2005, 182 p. TOMBOLATO, Antonio Fernando Caetano; COSTA, Ana Maria Molini. Micropropagação de plantas ornamentais. Campinas, Instituto Agronômico, 1998, Boletim Técnico n°174, 72 p. TORRES, Carlos Antonio; CALDAS, Linda Styler; BUSO, José Amauri. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Editado por Antonio Carlos Torres, Linda Styler Caldas e José Amauri Buso. Brasília, Embrapa-CNPH, v. 1, 1998, 509 p.
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TORRES, Carlos Antonio; CALDAS, Linda Styler; BUSO, José Amauri. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Editado por Antonio Carlos Torres, Linda Styler Caldas e José Amauri Buso. Brasília, Embrapa-CNPH, v. 2, 1999, 347 p. ZAFFARI. G. R. Melhoria genética e sanitária das mudas cítricas produzidas em Santa Catarina - limpeza de vírus em seis cultivares cítricas de interesse comercial para Santa Catarina. Epagri, 2009 – Projeto não publicado.
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13. ANÁLISE CRÍTICA DO ESTÁGIO – CONCLUSÃO
Considera-se o estágio de conclusão de curso uma atividade
fundamental na formação do futuro profissional da Agronomia. A duração do
estágio, que deve ocorrer dentro de um semestre letivo é ideal, pois permite
que tanto o acadêmico quanto a empresa que o recebe possam se programar e
realizar atividades das mais diversas, podendo iniciá-las e concluí-las
(fundamental na formação profissional).
O estágio realizado na EEI da EPAGRI foi bastante satisfatório e fonte
de grande aprendizado. Também permitiu que o mesmo descobrisse vocações
que sequer sabia possuir, dentro das áreas da fisiologia vegetal e da
biotecnologia.
Durante o estágio de conclusão de curso, pôde-se notar firmemente a
importância de todas as disciplinas teóricas e teórico-práticas do curso de
Agronomia, desde as disciplinas do nível básico do curso (como biologia
celular, fisiologia vegetal e bioquímica) até as disciplinas de nível
profissionalizante do curso (como fruticultura, olericultura e plantas de lavoura).
Fez-se uso do conhecimento adquirido em praticamente todas as disciplinas do
curso durante o estágio e pôde-se notar que o conteúdo aprendido de fato
corresponde ao que se pratica na rotina do Engenheiro Agrônomo.
Apesar de ter realizado o estágio de conclusão de curso em um
laboratório, envolvendo atividades de pesquisa, houve o privilégio de ter sido
supervisionado por um engenheiro agrônomo, o que permitiu que supervisor e
estagiário se comunicassem fluentemente. Além disso, o futuro profissional
pôde acompanhar outras atividades realizadas na EEI, nas áreas de
fruticultura, olericultura, mecanização agrícola e plantas de lavoura, o que de
fato foi de grande utilidade.
Por fim, o estagiário agradece a todos os profissionais que fizeram com
que o estágio de finalização do curso de Agronomia fosse não apenas possível,
mas também um grande sucesso, ao menos do ponto de vista do acadêmico.
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Anexo 01 – Primeira avaliação para organogênese direta. Inoculação Meio Nº explantes Frascos Contaminados Frascos Restantes 1ª avaliação (15 dias) 1ª avaliação (vivos): 1ª avaliação (aspecto):
18/10/2010 1 12 9 3 03/11/2010 3 vivos, oxidados18/10/2010 2 12 8 4 03/11/2010 4 vivos, oxidados18/10/2010 3 6 3 3 03/11/2010 3 vivos, oxidados20/10/2010 4 6 2 4 05/11/2010 4 vivos, oxidados (3)/vivo, verde (1)20/10/2010 5 6 0 6 05/11/2010 6 vivos, oxidados (3)/vivos, verdes (3)20/10/2010 6 6 1 5 05/11/2010 5 vivos, oxidados (5)20/10/2010 7 6 1 5 05/11/2010 5 vivos, oxidados (1)/vivos, verdes (4)20/10/2010 8 6 1 5 05/11/2010 5 vivos, oxidados (2)/vivos, verdes (3)22/10/2010 9 6 0 6 08/11/2010 6 vivos, oxidados (5)/vivos, verdes (1)22/10/2010 10 6 1 5 08/11/2010 5 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (1)22/10/2010 11 6 0 6 08/11/2010 6 vivos, oxidados (5)/vivos, verdes (1)22/10/2010 12 6 1 5 08/11/2010 5 vivos, oxidados22/10/2010 13 6 1 5 08/11/2010 5 vivos, oxidados (2)/vivos, verdes (3)22/10/2010 14 6 0 6 08/11/2010 6 vivos, verdes (6)*22/10/2010 15 6 0 6 08/11/2010 6 vivos, verdes (6)*22/10/2010 16 5 0 5 08/11/2010 5 vivos, oxidados (2)/vivos, verdes (3)27/10/2010 17 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (1)/vivos, verdes (5)27/10/2010 18 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (2)/vivos, verdes (4)27/10/2010 19 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)27/10/2010 20 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (2)/vivos, verdes (4)27/10/2010 21 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)27/10/2010 22 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (3)/vivos, verdes (3)27/10/2010 23 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (1)/vivos, verdes (5)27/10/2010 24 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)27/10/2010 25 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (5)/vivos, verdes (1)27/10/2010 26 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)27/10/2010 27 6 0 6 11/11/2010 6 vivos, oxidados
Anexo 02 – Segunda avaliação para organogênese direta. 2ª avaliação (20-30 dias) 2ª avaliação (vivos): 2ª avaliação (aspecto):
17/11/2010 3 vivos, oxidados17/11/2010 3 vivos, oxidados17/11/2010 3 vivos, oxidados19/11/2010 4 vivos, oxidados19/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)19/11/2010 5 vivos, oxidados19/11/2010 5 vivos, oxidados19/11/2010 5 vivos, oxidados (3)/vivos, verdes (2)22/11/2010 6 vivos, oxidados (5)/vivos, verdes (1)22/11/2010 5 vivos, oxidados22/11/2010 6 vivos, oxidados22/11/2010 5 vivos, oxidados22/11/2010 5 vivos, oxidados (3)/vivos, verdes (2)22/11/2010 6 vivos, verdes (6)*22/11/2010 6 vivos, verdes (6)*22/11/2010 5 vivos, oxidados (3)/vivos, verdes (2)26/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)26/11/2010 6 vivos, oxidados (3)/vivos, verdes (3)26/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)26/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)26/11/2010 6 vivos, oxidados (5)/vivos, verdes (1)26/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)26/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)26/11/2010 6 vivos, oxidados (4)/vivos, verdes (2)26/11/2010 6 vivos, oxidados (5)/vivos, verdes (1)26/11/2010 6 vivos, oxidados (5)/vivos, verdes (1)26/11/2010 6 vivos, oxidados
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Anexo 03 - Meio Murashige & Skoog (1962). Reagentes/Soluções Quantidade Solução Estoque de Macronutrientes
50 ml
Solução Estoque de Micronutrientes
5 ml
Solução Estoque de Vitaminas 5 ml Solução de Fe/EDTA 10 ml Solução de Inositol 12,5 ml Sacarose 30 g Ágar 6,5 g
Método de Preparo:
§ Preparar a bancada de trabalho com todos os reagentes e soluções estoques da formulação e as vidrarias necessárias para seu preparo.
§ Pesar a sacarose e o ágar em recipientes separados, utilizando balança semi-analítica com precisão mínima de duas casas decimais.
§ Em um becker de 1000 ml adicionar 500 ml de água destilada e dissolver a sacarose.
§ Em um balão volumétrico de 1000 ml, contendo 200 ml de água destilada, adicionar as soluções estoque de micronutrientes, macronutrientes, vitaminas, inositol e Fe/EDTA, promovendo uma prévia agitação.
§ Transferir a solução de sacarose preparada previamente para o balão volumétrico de forma quantitativa, em seguida completar o volume com água destilada e homogeneizar.
§ Transferir o meio para um becker de 1000 ml e regular o pH do meio para 5,8 +/- 0,01 com o auxílio de HCL 0,1 M ou NaOH 0,1 M.
§ Adicionar lentamente e sob agitação o ágar. § Aquecer a solução até fervura. § Distribuir 15 ml do meio de cultura para frascos de 100 ml, fechá-los e
autoclavar a 121°C e 1,2 atm por 20 minutos. § Identificar informando: nome do meio de cultura e data do preparo. § Estocar o material por até seis meses em armário de estocagem ou sala
de armazenamento de meios de cultura
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Anexo 04 – pH final de cada meio de cultura preparado. Meio de Cultura
pH Meio de Cultura
pH
1 5,71 28 5,77 2 5,74 29 5,80 3 5,74 30 5,78 4 5,74 31 5,79 5 5,76 32 5,78 6 5,77 33 5,80 7 5,76 34 5,76 8 5,74 35 5,75 9 5,77 36 5,77 10 5,77 37 5,77 11 5,78 38 5,76 12 5,78 39 5,72 13 5,79 40 5,80 14 5,77 41 5,75 15 5,79 42 5,76 16 5,76 43 5,80 17 5,78 44 5,73 18 5,77 45 5,80 19 5,78 46 5,80 20 5,80 47 5,79 21 5,80 48 5,80 22 5,80 49 5,72 23 5,77 50 5,74 24 5,79 51 5,75 25 5,80 26 5,80 27 5,75
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Anexo 05 – Composição do meio Murashige & Skoog (1962). Componentes Concentração dos
Componentes (mg/l) Macronutrientes
NH₄NO₃ 1,650 KNO₃ 1,900
CaCl₂.2H₂O 440 MgSO₄.7H₂O 370 KH₂PO₄ 170
Micronutrientes MnSO₄.4H₂O 22,3 ZnSO₄.7H₂O 8,6 H₃BO₃ 6,2 KI 0,83
Na₂MoO₄.2H₂O 0,25 CuSO₄.5H₂O 0,025 CoCl₂.6H₂O 0,025
FeEDTA Na₂EDTA. 2H₂O
37,3
FeSO₄.7H₂O 27,8 Vitaminas e aminoácidos
Ácido nicotínico 0,5 Piridoxina.HCl 0,5 Tiamina.HCl 0,1 Glicina 2,0
Mio-inositol 100 Sacarose 30,000
Fonte: TORRES et al., 1998.