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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Tipagem molecular de genes de resistência e virulência associado à expressão
gênica em isolados de Acinetobacter baumannii submetidos a antimicrobianos
CARMELITA DE LIMA BEZERRA CAVALCANTI
Recife
2017
CARMELITA DE LIMA BEZERRA CAVALCANTI
Tipagem molecular de genes de resistência e virulência associado à expressão
gênica em isolados de Acinetobacter baumannii submetidos a antimicrobianos
Tese apresentada a Banca Examinadora do
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Pernambuco, como parte
dos requisitos para a obtenção do Título de
Doutor em Medicina Tropical.
Orientador: Prof. Dr. Fábio André Brayner dos Santos
Co-orientadora: Profa. Dra. Dyana Leal Veras
Recife
2017
CARMELITA DELIMA BEZERRA CAVALCANTI
Tipagem molecular de genes de resistência e virulência associado à expressão
gênica em isolados de Acinetobacter baumannii submetidos a antimicrobianos
Tese apresentada a Banca Examinadora do
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical
do Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos
para a obtenção do Título de Doutor em Medicina
Tropical.
Aprovada em: 21 de fevereiro de 2017
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Profº. Dr. Fábio André Brayner dos Santos
Universidade Federal de Pernambuco
_________________________________________ Profº. Dra. Ana Catarina de Souza Lopes
Universidade Federal de Pernambuco
_________________________________________ Profº. Dra. Maria Amélia Vieira Maciel
Universidade Federal de Pernambuco
_________________________________________ Profº. Dra. Ana Paula Sampaio Feitosa
LIKA/ Universidade Federal de Pernambuco
_________________________________________ Profº. Dr. Wagner Luís Mendes de Oliveira
LINAT/Universidade Federal de Pernambuco
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL REITOR
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Ernani Rodrigues de Carvalho Neto
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Nicodemos Teles Pontes Filho
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINATROPICAL
Valdênia Maria Oliveira de Souza
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Maria Amélia Vieira Maciel
CORPO DOCENTE
Ana Catarina de Souza Lopes
Ana Lúcia Coutinho Domingues
Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Celina Maria Turchi Martelli
Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto
Fabio André Brayner dos Santos
Heloísa Ramos Lacerda de Melo
Líbia Cristina Rocha Vilela Moura
Maria Amélia Vieira Maciel
Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho
Marli Tenório Cordeiro
Rejane Pereira Neves
Ricardo Arraes de Alencar Ximenes
Valdênia Maria Oliveira de Souza
Vera Magalhães de Silveira
Virgínia Maria Barros de Lorena
Vláudia Maria Assis Costa
Dedico este trabalho às pessoas que são o amor, a compreensão e a alegria que preciso para ser feliz, Fernanda, Mariana, Paula e Emanuel.
“O triunfo não é completo desfrutado solitariamente.”
Teo Cortés
AGRADECIMENTOS
A Deus, por toda paz e harmonia que encontro na fé;
Aos meus orientadores, Fabio Brayner e Luiz Carlos Alves, pela inestimada
acolhida, apoio, ensinamentos, confiança nessa jornada e nossa longa
amizade familiar;
À minha Co-orientadora Dyana Leal Veras por todos os ensinamentos,
dedicação desde a elaboração do projeto até a sua conclusão, e pela
consolidação de uma amizade verdadeira;
A todos que compõem o programa de Medicina Tropical pelo suporte e pela
oportunidade de aprendizado;
Ao prof. José Luiz de Lima Filho, por todo o apoio e incentivo no
desenvolvimento deste trabalho;
A todos que compõem os laboratórios parceiros: Laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami – LIKA, ao ProspeqMol - LIKA, ao Laboratório de
Biologia Molecular - LIKA, ao Laboratório Microbiologia do Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães, ao Núcleo de Plataformas Tecnológicas do
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – CpqAM/Fiocruz, em especial à Dra
Cássia Docena pelo suporte técnico e disponibilidade, ao Laboratório de
Genética da Universidade Federal de Pernambuco e ao laboratório ALERTA,
São Paulo-SP pela imensurável contribuição na execução do trabalho e na
parceria;
A Ana Carolina Ramos, do Laboratório Alerta, pelos ensinamentos de
técnicas de tipagem e carinhosa acolhida;
A Ana Paula Sampaio, pela eterna disposição e generosidade nos
ensinamentos, pelo exemplo de profissional e pela amizade que construímos;
A Eduarda Mangueira, pelo companheirismo em todas as horas, pelo apoio
incondicional e por fazer parte da minha vida pra sempre;
A Wagner Oliveira, pela bondade de contribuir com ensinamentos e
dedicação de forma tão altruísta;
A toda família do LBCM: Alberon Araújo, Amanda Aliança, Amanda
Vasconcelos, Anntonio Sérgio, Camila Queiroz, Catarina Fernandes, Cristiane
Brito, Elverson Melo, Everton Morais, Fernanda Lima, Gabriel Gazzoni, Iany
França, Jefferson Albuquerque, Jana Sandes, Jorge Belém, Josenil Soares,
Josué Araújo, Karla Ribeiro, Marina Cartaxo, Nairomberg Portela, Olavio
Campos, Paula Roberta, Rafael Padilha, Renata, Rubens Rocha, Sophia
Dantas, Thaynara Millena, Tibério César, pela companhia sempre agradável,
pelas deliciosas gargalhadas, pela divisão das tarefas e por todo carinho e
dedicação recebidos;
A Alisson Rocha, meu primeiro estagiário, muito dedicado e aplicado em
suas tarefas;
A toda turma do LIKA, pela convivência de todos esses anos com muito
carinho e amizade;
Ao Sr. Nelson, Rita e Edson, do setor de Esterilização do CPqAM, pelo apoio
na etapa de preparação dos experimentos;
A Rodrigo Costa, por estar sempre presente com todo seu carinho;
A todos os meus tios e tias por serem exemplo na minha formação e pela
generosidade e atenção sempre;
Aos meus primos: Carlinhos e Jorge, pela amizade sincera e apoio
incondicional;
Ao meu irmão, Paulo, e sua família, por todo o apoio e a presença de sempre
com muito amor e carinho;
À minha mãe, Ione, por todo amor e orações diárias;
Às minhas filhas: Fernanda, Mariana e Paula pela oportunidade de conviver
com seres lindos, cheios de amor e minhas companheiras sempre;
Ao meu esposo, Emanuel, por estar sempre ao meu lado, ser meu porto
seguro e minha inspiração.
RESUMO
Apesar do grande envolvimento de isolados de Acinetobacter baumannii em Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) e do seu alto índice de multidroga-resistência, levando a poucas opções terapêuticas em casos de infecções causadas por esta espécie bacteriana, há muito a ser descoberto sobre os mecanismos de virulência e resistência desta espécie. Portanto, este trabalho teve como objetivo estabelecer o perfil clonal, de resistência e virulência de isolados multidroga-resistentes (MDRs) de A. baumannii obtidos em hospitais de Recife-PE, determinando a prevalência de genes de resistência e virulência e a capacidade de expressão de genes de virulência após submissão dos isolados a diferentes antimicrobianos utilizados na prática clínica. Para determinar a prevalência dos genes de resistência e virulência foram utilizados 37 isolados do complexo A. baumannii provenientes de dois hospitais públicos de Recife – PE. A análise da expressão dos genes de virulência foi realizada utilizando três isolados MDR selecionados, além da ATCC 19606 de A. baumannii submetidos in vitro a colistina, meropenem e associação destes antimicrobianos. Os isolados foram avaliados quanto à confirmação da espécie através da detecção do gene blaOXA-51-like e da técnica de MALDI-TOF. A tipagem molecular desses isolados foi realizada através da técnica de PFGE utilizando a enzima de restrição Apa1. A detecção e sequência dos genes de resistência, blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, blaOXA-143-like, blaIMP, blaVIM, blaKPC, o elemento de inserção, ISAba1, e dos genes de virulência, basC, ompA, pilA e csuE foi realizada através de PCR e sequenciamento gênico. Todos os isolados pertenciam à espécie A. baumannii, distribuídos em 07 padrões de PFGE, com três isolados apresentando 100% de similaridade, os quais foram obtidos nos dois hospitais públicos do estudo, sugerindo uma disseminação inter-hospitalar. Todos os isolados apresentaram o gene de resistência blaOXA-51-like e a maioria possuía o gene ISAba1, além desses, também apresentavam o gene blaOXA-143-like ou blaOXA-23-ike. Estes resultados demonstram uma ampla resistência dos isolados aos carbapenêmicos, além de outras classes de antimicrobianos. Os dados são preocupantes quanto à disseminação clonal desses genes entre os isolados obtidos nos hospitais analisados. Todos os isolados do estudo apresentaram os genes de virulência basC, ompA, pilA e csuE, com exceção de um isolado que não apresentou o gene csuE. Também pode-se demonstrar uma tendência ao aumento da expressão dos genes de virulência csuE, bfmS e baeS após tratamento in vitro com meropenem, colistina e associação destes antimicrobianos, reforçando a necessidade de vigilância quanto ao tratamento de IRAS causadas por A. baumannii MDR, mesmo em uso associado de antimicrobianos. Palavras-chave: Acinetobacter baumannii. Virulência. Expressão gênica.
ABSTRACT Due to the increasing resistance of clinical isolates of A. baumannii to antimicrobial and the consequent decrease of effective therapeutic options, this study aimed to establish the clonal profile, resistance and virulence of A. baumannii multidrug-resistant isolates (MDRs) obtained in hospitals in Recife-PE, determining the prevalence of resistance and virulence genes and the in vitro influence of different antibiotics used in clinical practice, alone and in combination, on bacterial growth and expression of these genes. To perform the first stage of this study 37 isolates of A. baumannii complex, most of them MDR. Analysis of virulence gene expression was performed using three MDR isolates beyond ATCC 19606 from A. baumannii submitted in vitro to colistin, meropenem and association of these antimicrobials. The isolates were evaluated for confirmation of the species through detection of the gene for intrinsic β-lactamase, blaOXA-51-like, and the Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI-TOF) technique. The clonal profile of these isolates was determined by Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) using Apa1 enzyme. Detection and sequence of blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, blaOXA-143-like, blaIMP, blaVIM and blaKPC genes the insertion element, ISAba1, and the virulence genes, basC, ompA, pilA and csuE were performed using Polymerase Chain Reaction (PCR) and sequencing. All isolates belonged to the A. baumannii species, distributed in 07 PFGE patterns, three isolates showed 100% similarity, which were obtained in two different hospitals of the study, suggesting an interhospital spread. Most isolates had the blaOXA-51-like and ISAba1 resistance genes, and either blaOXA-
143-like or blaOXA-23-like gene. These results demonstrated high level resistance to carbapenems and other classes of antimicrobials, corroborating the MDR profile. This data alert for the spread of these genes among isolates in this hospitals. All isolates showed basC, ompA, pilA and csuE virulence genes, except for one isolate that did not show the csuE gene. Expression of csuE, bfmS e baeS virulence genes increased after in vitro submission to meropenem, colistin and the associated use may be demonstrated, reinforcing the need for surveillance for treating infections caused by MDR A. baumannii infections, even in associated antimicrobial use.
Keywords: Acinetobacter baumannii. Virulence. Genetic expression.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
TESE
Figura 1 - Principais mecanismos de resistência a carbapenêmicos em
bactérias gram-negativas.
32
Figura 2 - Principais mecanismos de resistência a polimixinas em bactérias
gram-negativas.
34
ARTIGO 1
Figura 1 - Polimorfismo genético de isolados de A. baumannii de pacientes
atendidos em 2 hospitais de Recife - PE, detectado através de
eletroforese em campo pulsado (PFGE) após digestão do DNA
cromossômico com endonuclease de restrição ApaI.
63
ARTIGO 2
Figura 1 - Expressão relativa do gene bfmS após submissão aos
antimicrobianos meropenem, colistina e associação de
meropenem e colistina
83
Figura 2 - Expressão relativa do gene baeS após submissão aos
antimicrobianos meropenem, colistina e associação de
meropenem e colistina
84
Figura 3 - Expressão relativa do gene csuE após submissão aos
antimicrobianos meropenem, colistina e associação de
meropenem e colistina.
85
LISTA DE TABELAS
TESE
Tabela 1 - Espécies com nomes válidos que pertencem ao gênero
Acinetobacter spp.
24
Tabela 2 - Origem e características fenotípicas de resistência dos isolados
de Acinetobacter baumannii utilizados neste estudo.
43
Tabela 3 - Descrição dos primers utilizados neste estudo para determinar
por PCR a presença dos genes de resistência e virulência
presentes em isolados de A. baumannii.
47
Tabela 4 - CIM dos isolados de Acinetobacter baumannii frente ao
meropenem e colistina, e suc-CIMs utilizados para análise de
tempo de morte e RT-qPCR.
52
Tabela 5 - Primers utilizados nas reações de RT-qPCR para análise de
expressão dos genes de virulência csuE, bfmS, baeS, e do gene
normalizador gyrB.
53
ARTIGO 1
Tabela 1 - Isolados de Acinetobacter baumannii utilizados neste estudo 58
Tabela 2 - Primers utilizados neste estudo para determinar por PCR
presença dos genes de resistência e virulência presentes em
isolados de A. baumannii.
60
Tabela 3 - Perfil de resistência e virulência dos isolados de Acinetobacter
baumannii inclusos neste estudo.
65
ARTIGO 2
Tabela 1 - Perfil de resistência e virulência dos isolados de A. baumannii
analisados deste estudo.
79
Tabela 2 – CIM, Sub-CIM e expressão dos genes de virulência, csuE, bfmS 80
e baeS em isolados de Acinetobacter baumannii
Tabela 3 - Oligonucleotídeos utilizados nas reações de RT-qPCR para
análise de expressão dos genes de virulência csuE, bfmS, baeS
e do gene normalizador gyrB.
81
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Medida da intensidade de corrente elétrica
ACD Acinetobacter Cephalosporinases Derivative
AIM-1 Australian Imipenemase
ATCC American Type Culture Collection
BHI Brain Heart Infusion
BSA Bovine Serum Albumin
CCS Centro de Ciências da Saúde
cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar
CEP Comitê de ética em pesquisa
CHCA α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
CHEF-TE Solução tampão de EDTA/TRIS
CIM Concentração inibitória mínima
Clin. Vasc. Clínica Vascular
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
CTX-M Cefotaximase, primeiramente isolada em Munich
DEPC Dietilpirocarbonato
DIM-1 Dutch Imipenemase
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNS Trisma base/Cloreto de magnésio
dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfato
DP Desvio padrão
EC EDTA/Tris base/NaCl/N-lauril sarcosil
EDTA Ácido etileno-diamino-tetracético
Enf. Enfermaria
EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
ES EDTA/N-lauril sarcosil
ESBL Extended Spectrum -Lactamase
ESKAPE Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,
Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter
FDA Food and Drug Administration
GIM German Imipenemase
IMP Imipenemase
IDSA Infectious Diseases Society of America
IRAS Infecções Relacionadas à Assistência a saúde
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
kDa Kilodalton
KHM Kyorin University Hospital
KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase
LCR Líquido Cefalorraquidiano
LIKA Laboratório de Imunologia Keizo Asami
MALDI-
TOF
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight
MBLs Metalo-β-lactamases
mg Miligrama
MgCl2 Cloreto de magnésio
mL Mililitro
mM MilliMolar
NaCl Cloreto de sódio
ND Não Determinado
NDM-1 New Delhi MBL
NE Não Especificado
NCBI National Center for Biotechnology Information
NPT Núcleo de Plataformas Tecnológicas
OXA Oxacilinase
pb Pares de base
pH Potencial hidrogeniônico
PBPs Penicillin-binding proteins
PCR Polimerase Chain Reaction
PFGE Pulsed field gel eletrophoresis
R Resistente
rDNA Ácido desoxirribonucleico ribossomal
RT-qPCR Reverse Transcription qPCR
rpm Rotação por minuto
RNA Ácido ribonucleico
RNAm Ácido ribonucléico mensageiro
S Sensível
SDC Sistema de Dois Componentes
Sec Secreção
SIM-1 Seul Imipenemase
SPM-1 São Paulo MBL
STB Secreção Traqueobrônquica
Sub- CIMs Concentrações Sub- inibitórias Mínimas
TBE Solução tampão de Tris/Borato/EDTA
TEN Solução tampão de Tris/ EDTA/NaCL
TFP Type IV pili/pili tipo IV
TMB Tripoli MBL
UFC Unidade Formadora de Colônia
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
UPGMA Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages
USAN Unidade de Suporte Avançado em Neurocirurgia
UTI Unidade de terapia intensiva
UTQ Unidade de Terapia de Queimados
UV Ultra Violeta
V Unidade de tensão elétrica
VIM Verona Imipenemase
W Unidade de potência
µg Micrograma
µL Microlitro
µM Micromolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 20
2 REVISÃO DE LITERATURA 23
2.1 O Gênero Acinetobacter spp. 23
2.1.1 Acinetobacter baumannii 26
2.2 Estrutura e ação dos antibióticos β-lactâmicos 29
2.2.1 Carbapenêmicos 31
2.2.2 Polimixinas 32
2.3 Mecanismos de Resistência aos antibióticos β-
lactâmicos
34
2.3.1 β-lactamases 35
2.4 Mecanismos de Virulência 38
2.4.1 Fatores de virulência 38
3 OBJETIVOS 42
3.1 Objetivo Geral 42
3.2 Objetivos Específicos 42
4 METODOLOGIA 43
4.1 Isolados bacterianos 43
4.2 MALDI-TOF MS 45
4.3 Extração do DNA total 45
4.4 Determinação da presença dos genes de virulência 46
4.5 Determinação da presença e sequência dos genes de
resistência
47
4.6 Eletroforese em gel de agarose 48
4.7 Sequenciamento de DNA 48
4.8 Eletroforese em Campo Pulsátil (PFGE) 49
4.9 Critérios para seleção dos isolados para etapa de
análise de expressão
50
4.10 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) 51
4.11 Extração de RNA e síntese de cDNA 51
4.12 Determinação da expressão dos genes de virulência
pela técnica de RT-qPCR
52
5 ASPECTOS ÉTICOS 53
6 RESULTADOS 54
ARTIGO 1 - Disseminação clonal e de genes resistência e
virulência em isolados de Acinetobacter baumannii obtidos
em hospitais de Recife – PE, Brasil
54
ARTIGO 2 – Expressão de genes de virulência em isolados
multidroga-resistentes de Acinetobacter baumannii
submetidos à colistina e meropenem
77
7 CONCLUSÕES 89
REFERÊNCIAS 90
APÊNDICE A – Artigo 1 submetido a Microbial Drug
Resistance
103
APÊNDICE B – Artigo 2 submetido a Journal of Medical
Microbiology article
105
ANEXO A – Comprovante de submissão à revista Microbial
Drug Resistance
107
ANEXO B – Comprovante de submissão à revista Journal of
Medical Microbiology article
108
20
1 INTRODUÇÃO
Acinetobacter baumannii é um cocobacilo gram-negativo pertencente ao
gênero Acinetobacter spp. e surgiu como um dos mais importantes patógenos para
as instituições de saúde mundiais (PELEG; SEIFERT; PATERSON, 2008; KROGER
et al., 2017). Considerado pela Sociedade Americana de Doenças Infecciosas como
um dos seis patógenos mais graves, relacionado à preocupação com a ausência de
progresso no desenvolvimento de novas linhas terapêuticas para o tratamento de
infecções por isolados Multidroga Resistente (MDR). Isso ocorre devido à redução
drástica no número de antimicrobianos efetivos que podem ser usados no
tratamento de infecções causadas por A. baumannii em consequência a ampla
resistência encontrada em isolados desta espécie bacteriana (BOUCHER et al.,
2013; HENRY et al., 2015; QI et al., 2016).
Os genes de resistência intrínsecos para produção de -lactamases são
encontrados na maioria dos isolados de A. baumannii, como as cefalosporinases
tipo AmpC, expressadas em nível basal (POIREL; NORDMAN, 2006). As
cefalosporinases tipo AmpC quando superexpressas devido ao elemento de
inserção ISAba1 são a principal razão dos elevados níveis de resistência em A.
baumannii às penicilinas e cefalosporinas (EVANS; HAMOUDA; AMYES, 2013). As
carbapenemases do tipo OXA são as mais prevalentes em A. baumannii e as
principais responsáveis pela resistência aos carbapenêmicos em todo o mundo
(OPAZO et al., 2012; KOBS et al, 2016).
A produção de -lactamases em isolados de A. baumannii inclui também as
metallo--lactamases (MBLs) (VIM, IMP e SIM), as quais conferem ampla resistência
aos carbapenêmicos e a outros antibióticos -lactâmicos, excluindo-se o aztreonam
(POIREL; NORDMAN, 2006; ZARRILLI et al., 2009; EVANS; HAMOUDA; AMYES,
2013). Vários outros genes de resistência a antibióticos -lactâmicos são
amplamente disseminados entre outras espécies bacterianas, como os genes blaSHV,
blaTEM, blaCTX-M e blaKPC os quais são amplamente encontrados em isolados MDR de
Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli (LIVERMORE et al., 2007), podendo ser
facilmente transferidos a outras espécies bacterianas naturalmente competentes
para a aquisição, como A. baumannii (EIJKELKAMP et al., 2011a). No Brasil, altas
taxas de resistência à carbapenêmicos tem sido relatadas em isolados de A.
21
baumannii, mas pouco é conhecido sobre os seus mecanismos de resistência
(TAKAGI et al., 2009).
Os carbapenêmicos eram os mais eficientes agentes antimicrobianos
utilizados em infecções causadas por A. baumannii. No entanto, o uso excessivo
dessa fármaco desencadeou a seleção de isolados resistentes a carbapenêmicos
durante a década passada. Neste contexto, a colistina tem reaparecido como o
último recurso terapêutico para o tratamento de infecções causadas por isolados de
A. baumannii MDR, em razão das altas taxas de resistência à carbapenêmicos
(CHEAH et al., 2016; MONTERO et al., 2016). Atualmente, menos de 2% dos
isolados apresentam resistência à colistina, no entanto, novos relatos demonstram o
aumento desse índice de resistência e consequente insucesso no tratamento clínico
(HENRY et al., 2015). Alguns trabalhos têm sugerido, portanto, a associação de
antimicrobianos para potencializar seu efeito bactericida (MENDES; BURDMANN,
2009).
Terapias de combinações com as polimixinas e carbapenêmicos foram
propostas como boas opções para o tratamento de infecções causadas por A.
baumannii MDR para otimizar e aumentar o poder bactericida da colistina e assim o
sucesso do tratamento clínico, restringindo o aparecimento de resistência (NI et al.,
2015). No entanto, pouco é conhecido sobre o impacto do uso da colistina na
virulência bacteriana, associada ou não a antimicrobianos como os carbapenêmicos.
Apesar de ser considerado um patógeno com virulência limitada, infecções
invasivas causadas por isolados de A. baumannii MDR estão associadas com o
aumento da morbi-mortalidade em pacientes predispostos (MONTERRO et al.,
2016). Alguns destes fatores de virulência potencializam ainda mais a ação
patogênica desta bactéria, tais como: sideróforos, sistemas de captação de ferro no
qual o gene basC codifica uma proteína envolvida na primeira etapa da biossíntese
do sideróforo acinetobactina; presença de fimbrias tipo 4, as quais são relacionadas
com a motilidade bacteriana; e a capacidade de formação de biofilme, envolvida com
a presença de vários genes, entre eles os genes ompA, csuE e pilA que contribuem
para a adesão celular a superfícies bióticas e abióticas (EIJELKAMP et al., 2011b;
HASAN, CHOI, OH, 2015; SELASI et al., 2016). Estudos recentes demonstram a
contribuição desses fatores de virulência na patogênese de A. baumannii, sugerindo
que esses mecanismos poderiam ser possíveis alvos de novos agentes
22
antimicrobianos, bloqueadores de fatores de virulência (LÓPEZ-ROJAS; SMANI;
PACHÓN; 2013).
Apesar do grande envolvimento de isolados de A. baumannii em infecções
hospitalares e do seu alto índice MDR, levando a poucas opções terapêuticas em
casos de infecções causadas por esta espécie bacteriana, pouco é conhecido sobre
a virulência e os mecanismos de resistência desta espécie (FOURNIER; RICHET,
2006). Atualmente, novos esforços para desenvolvimento de antimicrobianos se
concentram na caracterização de fatores de virulência, como pili e biofilme, baseado
na observação de uma correlação entre virulência e resistência aos medicamentos
(DHABAAN et al., 2016). Um importante passo neste cenário envolve determinar
qual o impacto do uso de antimicrobianos de última linha e combinações, utilizados
na prática clínica, e a repercussão na expressão de genes de virulência encontrados
em A. baumannii (KROGER et al., 2017). Portanto, o objetivo deste trabalho foi
determinar a relação clonal e os genes de resistência e virulência em isolados MDR
de A. baumannii obtidos em dois hospitais públicos de Recife-PE, e a capacidade de
expressão dos fatores de virulência após submissão dos isolados aos
antimicrobianos utilizados na prática clínica, meropenem, colistina e associação.
23
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O gênero Acinetobacter spp.
No início do século 20, em 1911, o microbiologista holandês Beijerinck isolou
e descreveu pela primeira vez um microrganismo que na ocasião o denominou de
Micrococcus calcoaceticus, atualmente conhecido como Acinetobacter spp. No
entanto, membros deste gênero foram classificados anteriormente sobre uma
variedade de nomes, incluindo Bacterium anitratum, Herellea vaginicola, Mima
polymorpha, Moraxella lwoffi, o que resultou no retardo no estabelecimento da
epidemiologia e da importância clínica do gênero Acinetobacter spp. (PELEG;
SEIFERT; PATERSON, 2008; TOWNER, 2009). A denominação atual do gênero
Acinetobacter vem da palavra grega “akineto” que significa não móvel, tendo sido
proposta por Brisou e Prévot em 1954 para diferenciar dos microrganismos móveis
que pertencem ao gênero Achromobacter (BRISOU; PRÉVOT, 1954; PELEG;
SEIFERT; PATERSON, 2008). Apenas em 1968 essa denominação tornou-se
amplamente aceita, levando ao reconhecimento do gênero Acinetobacter pelo
Subcomitê de Taxonomia de Moraxella e Bactérias Relacionadas, em 1971
(BAUMANN; DOUDOROFF; STANIER, 1968).
O gênero Acinetobacter spp. é formado por cocobacilos gram-negativos, com
DNA contendo de 39 a 47 mol% de G + C, sendo aeróbios, não fermentadores de
carboidratos, sem capacidade de locomoção, catalase positiva, oxidase negativa e
com bom crescimento em meio complexo entre 20 e 30°C sem requerer fatores de
crescimento. Usualmente arranjam-se em diplobacilos ou em cadeias de
comprimentos variados (BERGOGNE-BEREZIN; TOWNER, 1996).
As espécies bacterianas classificadas como membros do gênero
Acinetobacter tem um longo histórico de variação taxonômica, desde a família
Neisseriaceae à família Moraxellaceae (FOURNIER; RICHET, 2006). Em 1986 uma
nova taxonomia foi estabelecida para o gênero Acinetobacter, sendo a espécie A.
baumannii a mais encontrada em amostras clínicas obtidas de infecções clínicas e
surtos hospitalares (CISNEROS; RODRÍGUES-BAÑO, 2002; GUNDI et al., 2009). O
Gênero Acinetobacter apresenta 33 genoespécies diferentes, das quais as espécies
genômicas 1 (Acinetobacter calcoaceticus ), 2 (Acinetobacter baumannii), 3 e 13TU
são muitas vezes tão semelhantes que não podem ser diferenciadas por testes
24
fenotípicos e são referidas como o complexo Acinetobacter calcoaceticus -
Acinetobacter baumannii (BERGOGNE-BEREZIN; TOWNER, 1996). Essas quatro
espécies genômicas são fenotipicamente semelhantes e intimamente relacionados
em comparação a outras espécies do gênero baseada no processo de hibridização
DNA-DNA (MACCONNELL; ACTIS; PACHÒN, 2013).
Devido a disponibilidade de vários métodos genotípicos para identificação do
complexo A. calcoaceticus - A. baumannii, as genoespécies 3 e 13TU, passaram a
se chamar Acinetobacter pittii e Acinetobacter nosocomialis, respectivamente
(MACCONNELL; ACTIS; PACHÒN, 2013). Acinetobacter pittii e Acinetobacter
nosocomialis apresentaram maior importância clínica no cenário nosocomial na
última década, no entanto, as infecções causadas por Acinetobacter baumannii
ainda têm a maior relevância clínica, devido sua capacidade de persistir no ambiente
hospitalar e pelo alto índice de isolamento de isolados multidroga-resistêntes (MDR),
extensamente resistente a drogas (XDR) ou pandroga resistente (PDR). Atualmente
o gênero compreende 49 espécies com nomes válidos
(www.bacterio.cict.fr/a/acinetobacter.html), conforme descrito na tabela abaixo
(Tabela 1).
Tabela 1. Espécies com nomes válidos que pertencem ao gênero Acinetobacter spp.
Espécie de Acinetobacter Referência
1 Acinetobacter albensis Krisova et al. 2015
2 Acinetobacter apis Kim et al. 2014
3 Acinetobacter baumannii Bouvet and Grimont 1986
4 Acinetobacter baylyi Carr et al. 2003
5 Acinetobacter beijerinckii Nemec et al. 2009
6 Acinetobacter bereziniae Nemec et al. 2010
7 Acinetobacter bohemicus Krizova et al. 2015
8 Acinetobacter boissieri Álvarez-Pérez et al. 2013
9 Acinetobacter bouvetii Carr et al. 2003
10 Acinetobacter brisouii Anandham et al. 2011
11
12
13
14
Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter courvalinii
Acinetobacter dispersus
Acinetobacter equi
(Beijerinck 1911) Baumann et al. 1968
Nemec et al. 2016
Nemec et al. 2016
Poppel et al. 2016
15 Acinetobacter gandensis Smet et al. 2014
16 Acinetobacter gerneri Carr et al. 2003
17 Acinetobacter grimontii Carr et al. 2003
18 Acinetobacter guangdongensis Feng et al. 2014
25
19 Acinetobacter guillouiae Nemec et al. 2010
20 Acinetobacter gyllenbergii Nemec et al. 2009
21 Acinetobacter haemolyticus (ex Stenzel and Mannheim 1963) Bouvet and Grimont 1986
22 Acinetobacter harbinensis Li et al. 2014
23 Acinetobacter indicus Malhotra et al. 2012
24 Acinetobacter johnsonii Bouvet and Grimont 1986
25 Acinetobacter junii Bouvet and Grimont 1986
26 Acinetobacter kookii Choi et al. 2013
27
28
Acinetobacter lwoffii
Acinetobacter modestus
(Audureau 1940) Brisou and Prévot 1954
Nemec et al. 2016
29 Acinetobacter nectaris Álvarez-Pérez et al. 2013
30 Acinetobacter nosocomialis Nemec et al. 2011
31 Acinetobacter pakistanensis Abbas et al. 2015
32 Acinetobacter parvus Nemec et al. 2003
33 Acinetobacter pittii Nemec et al. 2011
34
35
Acinetobacter Populi
Acinetobacter proteolyticus
Li et al. 2015
Nemec et al. 2016
36 cinetobacter puyangensis Li et al. 2013
37 Acinetobacter qingfengensis Li et al. 2014
38 Acinetobacter radioresistens Nishimura et al. 1988
39 Acinetobacter rudis Vaz-Moreira et al. 2011
40 Acinetobacter schindleri Nemec et al. 2001
41 Acinetobacter seifertii Nemec et al. 2015
42 Acinetobacter soli Kim et al. 2009
43 Acinetobacter tandoii Carr et al. 2003
44 Acinetobacter tjernbergiae Carr et al. 2003
45 Acinetobacter towneri Carr et al. 2003
46 Acinetobacter ursingii Nemec et al. 2001
47 Acinetobacter variabilis Krizova et al. 2015
48
49
Acinetobacter venetianus
Acinetobacter vivianii
Vaneechoutte et al. 2009 ex Di Cello et al. 1997
Nemec et al. 2016
Fonte: www.bacterio.cict.fr/a/acinetobacter.html
Comparado a outros bacilos gram-negativos, espécies do gênero
Acinetobacter tem maior capacidade de sobrevivência na região das pontas dos
dedos e em superfícies secas quando testadas em condições ambientais similares
ao ambiente hospitalar. Adicionalmente, a contaminação da pele de pacientes e
profissionais de saúde pode estar relacionada a transmissão dos isolados e surtos
(JAWAD et al., 1998; HARDING et al., 2013). Outra rota de transmissão para os
pacientes inclui os equipamentos reutilizáveis, tais como: tubo de ventilação,
respirômetro e dispositivo para monitoramento da pressão arterial utilizados em
pacientes graves, além de objetos como colchões, travesseiros, TV e ventiladores,
26
os quais podem servir de reservatório durante surtos de IRAS, em razão da
capacidade desses patógenos de resistir à dessecação (JAWAD et al., 1998;
HARDING et al., 2013).
De um modo geral, os membros do gênero Acinetobacter spp. são
considerados ubíquos, no entanto, as espécies de importância clínica, incluindo A.
baumannii não são microrganismos ubíquos, nem possuem habitat natural
conhecido fora do hospital, sendo isolados em pacientes e em ambientes hospitales
durante surtos (JOLY-GUILLOU, 2005; TOWNER, 2009; HARDING et al., 2013).
2.1.1 Acinetobacter baumannii
A. baumnannii desempenha papel importante na colonização e infecção de
pacientes hospitalizados com altas taxas de morbi-mortalidade, sendo um
importante patógeno oportunista envolvido numa variedade de IRAS, incluindo
bacteremias, infecções do trato urinário, meningites secundárias e infecções de
feridas cirúrgicas. No entanto, seu papel predominante é como agente causador de
pneumonia associada à ventilação mecânica em pacientes internados em UTI
(BERGOGNE-BEREZIN; TOWNER, 1996; MA et al., 2015; SAFARI et al., 2015).
A espécie A. baumannii é responsável por 2 – 10% das IRAS causadas por
bactérias gram-negativas (JOLY-GUILLOU, 2005; ANTUNES, VISCA, TOWNER,
2014). Está entre os quatro patógenos que mais causam infecções da corrente
sanguínea relacionadas a catéter em pacientes adultos em UTIs brasileiras
(GIRARDELLO et al., 2016). Além das infecções causadas por A. baumannii em
ambiente hospitalar, esse patógeno também pode causar infecções na comunidade,
incluindo pneumonia, bacteremia, infecções de pele, tecidos moles, meningite
secundária e endocardites (CHANG, et al., 2000; FALAGAS et al., 2007). Acomete
mais o sexo masculino e está relacionado geralmente a idosos, pacientes etilistas,
fumantes e portadores de comorbidades como diabetes mellitus, doença obstrutiva
pulmonar crônica e doenças renais (FALAGAS, RAFAILIDIS, 2007; ANTUNES,
VISCA, TOWNER, 2014). A pneumonia desenvolvida na comunidade por esse
patógeno pode ser mais severa em relação à desenvolvida em ambiente hospitalar
(ANTUNES; VISCA; TOWNER, 2014).
Desde a identificação de A. baumannii como um patógeno emergente existe
um grande interesse no rápido desenvolvimento de resistência antimicrobiana e na
27
disseminação em ambiente hospitalar de isolados desta espécie bacteriana (SAHL
et al., 2011).
O controle e o tratamento de infecções causadas por isolados MDR de A.
baumannii está entre os mais difíceis comparado às infecções causadas por outros
bacilos gram-negativos resistentes a antimicrobianos (MARAGAKIS, PERL, 2008).
A. baumannii ganhou notoriedade e integra o grupo de bactérias patogênicas
responsáveis por causar a maior proporção de infecções por isolados multidroga-
resistentes (MDR) adquiridas nos hospitais, são os patógenos “ESKAPE”,
representados por Enterococcus faecium (E), Staphylococcus aureus (S), Klebsiella
pneumoniae (K), Acinetobacter baumannii (A), Pseudomonas aeruginosa (P) e
Enterobacter (E) (LANNAN et al., 2016).
Os antimicrobianos potencialmente efetivos contra infecções causadas por
esta espécie bacteriana incluem os carbapenêmicos, aminoglicosídeos (amicacina
ou gentamicina), tetraciclinas (minociclina ou doxiciclina) e sulbactâmicos
(KARAGEORGOPOULOS et al., 2008). A resistência a esses agentes
antimicrobianos tem aumentado, resultando na utilização de agentes potencialmente
mais tóxicos como as polimixinas (TAKAGI et al.,2009).
A extensa resistência de isolados de A. baumannii a diferentes classes de
antimicrobianos pode comprometer o tratamento de infecções causadas por este
microrganismo (VILA; PACHÓN, 2012). Trabalhos recentes revelaram que isolados
de Acinetobacter spp.resistente a carbapenêmicos são mais predominantes na
Amélica Latina, Oriente Médio e Ásia-Pacífico do que na América do Norte e Europa
(ADIBHESAMI et al., 2016).
A espécie A. baumannii pode apresentar uma ampla variedade de β-
lactamases que hidrolisam e conferem resistência às penicilinas, cefalosporinas e
carbapenêmicos, além de resistência intrínseca e baixa permeabilidade da
membrana externa a certos antimicrobianos, bem como a expressão constitutiva de
diferentes bombas de efluxo (MARAGAKIS; PERL, 2008; ZHAO et al., 2015).
A ampla resistência desta espécie bacteriana a múltiplos antimicrobianos está
relacionada ainda à capacidade de adquirir e incorporar facilmente elementos
genéticos móveis tais como plasmídeos, transposons e integrons (NEONAKIS;
SPANDIDOS; PETINAKI, 2011; ATROUNI et al., 2016) ou até por mutações que
levam a modificação do alvo do antibiótico, da expressão de bombas de efluxo ou da
permeabilidade de membrana, o que favorece a prevalência de isolados MDR. Nas
28
últimas décadas a disseminação de resistência entre isolados de A. baumannii vem
aumentando no mundo inteiro dificultando o tratamento de infecções até mesmo
com medicamentos clinicamente disponíveis como tigeciclina, colistina e
carbapenêmicos (ATROUNI et al., 2016). A identificação dos mecanismos de
resistência em isolados de A. baumannii trará melhoras no resultado de infecções
causadas por esse patógeno.
Surtos causados por A. baumannii MDR tem sido relatados em vários países,
com sucesso terapêutico usando aminoglicosideos, carbapenêmicos, inibidores de
β-lactamases, tigeciclina, rifampicina e colistina. Embora carbapenêmicos intra-
venosos e inibidores de β-lactamases atinjam níveis aceitáveis no sistema nervoso
central (SNC), doses mais altas do que a regular de carbapenêmicos em
combinação com inibidores de β-lactamases, aminoglicosidases ou rifampicinas
podem não ser eficazes para infecção no SNC por A. baumannii pandroga-resistente
(KHAWCHAROENPORN; APISARNTHANARAK; MUNDY, 2010).
Quando o tratamento com carbapenêmicos e aminoglicosídeos não são
eficazes, as polimixinas são a opção terapêutica indicada, incluindo a polimixina B e
a colistina, apesar do aparecimento de relatos de isolados clínicos de A. baumannii
apresentando resistência à polimixinas (NATION, VELKOV, LI, 2014; CHEAH et al.,
2016). A modificação do lipídio A com fosfoetanolamina e/ou galactosamina, e a
perda completa de lipopolissacarídeo da membrana externa são dois mecanismos
de resistência às polimixinas conhecidos em isolados de A. baumannii até o
momento (MOFFATTI et al., 2010; CHEAH et al., 2016).
29
2.2 Estrutura e ação dos antibióticos β-lactâmicos
Os antibióticos β-lactâmicos são os antibióticos mais prescritos mundialmente,
devido a sua boa atividade e baixa toxicidade (HAEGGMAN et al., 2004; EVANS;
HAMOUDA; AMYES, 2013). Neste grupo estão incluídas as penicilinas, as
cefalosporinas, os carbapenêmicos e os monobactâmicos, sendo todos portadores
de um anel β-lactâmico, formado de três átomos de carbono e um de nitrogênio
(TRABULSI et al., 2002). A entrada do antimicrobiano nas células bacterianas se dá
por proteínas denominadas “porinas” as quais se comportam como canais iônicos e
que se localizam na membrana externa de bactérias gram-negativas, possuindo
afinidade específica pelos diferentes antimicrobianos (KONEMAN et al., 2012;
TRIPATHI., 2006).
Esta classe de drogas interfere na síntese da parede celular bacteriana,
afetando o crescimento e desenvolvimento normal das células bacterianas. Nos
microrganismos gram-positivos a parede celular tem uma espessura constituída por
50 a 100 moléculas, enquanto nos gram-negativos tem uma espessura constituída
por apenas 1 a 2 moléculas (GOODMAN; GILMAN, 2006). A biossíntese do
peptideoglicano envolve cerca de trinta enzimas bacterianas, incluindo as
transpeptidases e as glicosiltransferases, podendo ser dividida em três estágios. No
primeiro estágio as bactérias sintetizam um pentapeptídeo do UDP-ácido-N-
acetilmurâmico e UDP-N-acetilglicosamina. No segundo ocorre a ligação dos dois
aminoaçúcares, onde os radicais de peptideoglicano são unidos entre si formando
longos filamentos e o UDP é clivado. Na terceira e última etapa ocorre o término da
formação de ligação cruzada que consiste na clivagem da D-alanina terminal das
cadeias peptídicas por transpeptidases com liberação da energia liberada e
subseqüente utilização no estabelecimento de ligações cruzadas entre as cadeias
peptídicas dos filamentos vizinhos, fornecendo estabilidade e rigidez à parede
celular (TRIPATHI, 2006; GOODMAN; GILMAN, 2006). Os antibióticos β-lactâmicos
inibem as transpeptidases, não ocorrendo a ligação cruzada, diminuindo a estrutura
entrelaçada e rígida da parede celular. Estas proteínas relacionadas à síntese final
do peptideoglicano constituem as proteínas fixadoras de penicilina (PBPs - protein
binding penicilin) que se localizam na parte externa da membrana celular das
bactérias e que podem ser classificadas em três classes baseado na presença do
domínio funcional conservado (TRABULSI et al., 2002; McPHERSON; POPHAM,
30
2002; TRIPATHI, 2006; CAIÔ et al., 2011). Apenas a classe A de PBPs tem um
domínio N-terminal que contém seqüências de aminoácidos conservados,
encontrados em todas as glicosiltransferases responsáveis pela polimerização do
peptideoglicano (McPHERSON; POPHAM, 2002).
As PBPs variam em suas afinidades pelos diferentes antibióticos β-
lactâmicos, embora as ligações se tornem covalentes. Algumas PBPs de bactérias
gram-negativas são responsáveis pela síntese do peptideoglicano, outras são
necessárias para a manutenção da forma de bastonetes da bactéria e na formação
de septos durante a divisão bacteriana. A inibição de algumas transpeptidases leva
a formação de esferoblastos e a uma rápida lise. Entretanto, a inibição das
atividades de outras PBPs pode causar lise tardia (PBP2) ou a produção de longas
formas filamentosas da bactéria (PBP3) (GOODMAN; GILMAN, 2006; KONEMAN et
al., 2012).
Quando as bactérias se dividem na presença de um antibiótico β-lactâmico
são produzidas formas deficientes de parede celular e como o meio interno da
bactéria é mais hiper osmótico, as células intumescem e sofrem ruptura. Em certas
condições e no caso de alguns microrganismos são produzidas formas filamentosas
ou de morfologia indefinida, incapazes de se multiplicar. O efeito lítico destas
substâncias também pode se dever a não repressão de algumas autolisinas
bacterianas que normalmente funcionam na divisão celular (TRABULSI et al., 2002;
TRIPATHI, 2006).
A grande utilização dos β-lactâmicos possibilitou a seleção de isolados
resistentes a esta classe de antimicrobianos, levando a elaborações mais recentes
de antibióticos, visando a maior eficiência frente a estes isolados bacterianos
portadores de resistência. Na maioria dos casos a resistência a este grupo de
antimicrobianos é conferida pela produção de enzimas chamadas de β-lactamases,
capazes de degradar o anel β-lactâmico dos antibióticos, transformando-os em
produtos inativos (BUSH; JACOBY; MEDEIROS, 1995; TRABULSI et al., 2002;
HAEGGMAN et al., 2004; OPAZO et al, 2012). Estas enzimas tem sido grandes
alvos de estudos microbiológicos, bioquímicos e genéticos no mundo inteiro.
Diversas investigações têm descrito mais de 190 proteínas bacterianas com a
habilidade de interagir com uma variedade de moléculas descritas como substratos
ou inibidores. Devido a esta diversidade de características enzimáticas das β-
31
lactamases, muitas tentativas foram realizadas para categorizar estas enzimas pelo
uso de seus atributos bioquímicos (BUSH; JACOBY; MEDEIROS, 1995).
2.2.1 Carbapenêmicos
Nas últimas décadas, o rápido acúmulo de mecanismos de resistência a
muitas classes de antimicrobianos resultou na eliminação de penicilinas,
cefaslosporinas, aminoglicosídeos, quinolonas e tetraciclinas como opção de
tratamento para casos de infecções por isolados de A. baumannii, resultando na
indicação dos carbapenêmicos para terapia de infecções causadas por A.
baumannii, devido sua boa atividade e baixa toxicidade (EVANS; HAMOUDA;
AMYES, 2013). Os carbapenêmicos imipenem, meropenem, doripenem, com
exceção do ertapenem, são os escolhidos para tratamento de infecções causadas
por A. baumannii, quando outros antimicrobianos não são eficazes (VILA; PACHÒN,
2012). Essa classe de antimicrobianos foi utilizada como último recurso no
tratamento de infecções por A. baumannii até 1991, quando surgiram os primeiros
relatos de isolados de A. baumannii resistentes a carbapenêmicos (ADIBDESAMI et
al., 2016). A tendência de aumento de resistência ao meropenem foi observada em
isolados de A. baumannii em várias regiões geográficas (EVANS et al. 2013).
A maioria dos isolados de A. baumannii resistentes a carbapenêmicos não
são resistentes apenas a esta classe de antimicrobianos mas também a quase todas
as classes comumente utilizadas clinicamente, levando a denominação destes
isolados a A. baumannii extensivamente resistente a drogas (XDR-AB)
(MAGIORAKOS et al., 2012; FAN et al., 2016). Os mecanismos de resistência a
carbapenêmicos presentes em Acinetobacter spp. incluem alterações de
permeabilidade em proteínas de membrana externa e em proteínas de ligação a
penicilina, ativação de bombas de efluxo e hidrólise por β-lactamases (PELEG et al.,
2008). Na maioria dos isolados de A. baumannii resistentes a carbapenêmicos, a
produção de carbapenemases está relacionada a presença de β-lactamases de
classe D que hidrolisam carbapenêmicos, as carbapenemases do tipo OXA,
classificadas em cinco subgrupos. Quatro dos subgrupos são carbapenemases
adquiridas, que incluem OXA-23, OXA-24, OXA-58 e OXA-143. O subgrupo OXA-51
é intrínseco a espécie A. baumannii (OPAZO et al., 2012; BIGLARI et al., 2015).
32
Quando o tratamento com carbapenêmicos e aminoglicosídeos não são
eficazes, as polimixinas são a opção terapêutica indicada, a polimixina B e a
colistina, apesar do aparecimento de relatos de isolados clínicos de A. baumannii
apresentando resistência à polimixinas (NATION, VELKOV, LI, 2014; CHEAH et al.,
2016).
Figura 1: Principais mecanismos de resistência a carbapenêmicos em bactérias gram-negativas.
Fonte: MARTINEZ-MARTINEZ, L et al., 1999.
2.2.2 Polimixinas
As polimixinas compõem um grupo de antimicrobianos ativos contra várias
bactérias gram-negativas. São compostos anfipáticos catiônicos, constituídos de
decapeptídeos policatiônicos cíclicos caracterizados por um anel heptapeptídeo
entre o grupo amino da cadeia lateral de ácido 2,4-diaminobutírico (Dab) na posição
4 e o grupo carboxila do resíduo de treonina C-terminal na posição 10 e um ácido
graxo ligado ao peptídeo através de uma ligação amida (MENDES; BURDMANN,
2009; VELKOV et al., 2013). Essa classe de antimicrobianos possui um grupo de
cinco substâncias intimamente relacionadas, as polimixinas A, B, C, D e E, sendo
esta última chamada de colistina, isolada pela primeira vez no Japão em 1949 do
Bacillus polymyxa var. Colistinus, tornando-se disponível para o uso clínico em 1959
(KARAISKOS et al., 2015). Somente as polimixinas B e E são utilizadas
clinicamente, em virtude da grande toxicidade das demais (FALAGAS; KASIAKOU,
2005; MENDES; BURDMANN, 2009). A colistina possui ação bactericida contra
33
bactérias gram-negativas, interagindo com a porção lipídica A do lipopolissacárido
(LPS) causando assim a desorganização da membrana externa. No entanto, em
razão de relatos de nefro e neurotoxicidade e do surgimento de antibióticos menos
tóxicos como os aminoglicosídeos, a colistina foi quase abandonada para o uso
clínico no ano de 1970 (CAI et al., 2012; HENRY et al., 2015). A polimixina B e a
colistina clinicamente utilizadas apresentam uma farmacocinética clínica
marcadamente diferente e são administradas de formas distintas, sendo a polimixina
B como sal de sulfato e a colistina como um sal de sódio (NATION; VELKOV; LI,
2014).
A polimixina E é constituída por dois componentes principais, colistina A
(polimixina E1) e colistina B (polimixina E2). É administrado na forma de um pró-
fármaco, metanossulfonato de colistina (CMS), que é menos tóxico e que é
hidrolisado a várias espécies intermediárias tanto in vitro como in vivo antes de
formar a colistina (KARAISKOS et al., 2015).
A colistina tem reaparecido como o último recurso terapêutico para o
tratamento de infecções causadas por isolados de A. baumannii MDR, em razão das
altas taxas de resistência à carbapenêmicos e a outras alternativas terapêuticas
anteriores (CHEAH et al., 2016; MONTERO et al., 2016). Atualmente, menos de 2%
dos isolados apresentam resistência à colistina, no entanto, novos relatos
demonstram o aumento desse índice de resistência e consequente insucesso no
tratamento clínico (HENRY et al., 2015), apesar do aparecimento de trabalhos
sugerindo a associação de antibióticos para potencializar seu efeito bactericida
(MENDES; BURDMANN, 2009).
Internacionalmente, a colistina parenteral é muito mais utilizada, embora a
polimixina B injetável esteja disponível em vários países, como Brasil, Singapura e
Estados Unidos; ambos antimicrobianos estão disponíveis nestes três países
(VELKOV et al., 2013).
A modificação do lipídio A com fosfoetanolamina e/ou galactosamina, e a
perda completa de lipopolissacarídeo (LPS) da membrana externa são dois
mecanismos de resistência às polimixinas conhecidos em isolados de A. baumannii
até o momento (MOFFATT et al., 2010; CHEAH et al., 2016).
Na espera de novos antibióticos, temos que otimizar o uso clínico de
polimixinas através da aplicação de princípios farmacocinéticos/farmacodinâmicos,
minimizando assim o desenvolvimento de resistência (VELKOV et al., 2013).
34
Contudo, observações de crescimento rápido após o tratamento com colistina in
vitro, heteroresistência e baixas concentrações plasmáticas colocaram em dúvida a
eficácia da colistina em monoterapia (FAN et al., 2016). Por essa razão, muitos
profissionais médicos preferem prescrever terapêutica de associação de fármacos
para tratar infecções por A. baumannii XDR, especialmente considerando os efeitos
sinérgicos observados entre a colistina e outros antimicrobianos, comprovados em
vários estudos in vitro (NI et al., 2015; FAN et al., 2016).
Figura 2: Principais mecanismos de resistência a polimixinas em bactérias gram-negativas.
Fonte: VELKOV et al., 2013. O sombreado rosa indica determinantes moleculares de resistência à polimixinas. LPS: Lipopolissaccarídeo; NAG: N-acetilglucosamina; NAM: ácido N-acetilmuramico; OMP: Proteína da membrana externa.
2.3 Mecanismos de Resistência aos antibióticos β-lactâmicos
A resistência adquirida aos β-lactâmicos pode ocorrer basicamente por três
mecanismos: alteração de proteínas alvo (PBPs), reduzindo assim a atividade do
antibiótico; impermeabilidade da célula bacteriana ao antibiótico, impedindo a
chegada do mesmo ao local de ação; e produção de β–lactamases que inativam o
antibiótico utilizado. O mecanismo mais comum de resistência das enterobactérias
aos β-lactâmicos é a produção de β-lactamases (BUSH, 2001).
35
Os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em A. baumannii incluem
a produção de β-lactamases como as -lactamases de classe D, metalo-β-
lactamases e mais raramente às carbapenemases de classe A. Além da produção
de β-lactamases outros mecanismos podem estar envolvidos na resistência de
isolados de A. baumannii, incluindo a diminuição da permeabilidade da membrana
externa, associada à perda ou diminuição da expressão de proteínas porinas e
provavelmente a superexpressão de bombas de efluxo (CAIÔ et al., 2011).
Existe grande interesse na identificação dos mecanismos de resistência
encontrados em isolados de A. baumannii, necessários para otimizar o resultado dos
tratamentos de infecções causadas por esse patógeno. A. baumannii apresenta
mecanismos de resistência complexos, incluindo ativação ou produção de enzimas,
captação de integrons, permeabilidade de membrana externa, mecanismos de
expulsão de drogas, entre outros (ZHAO et al., 2015).
2.3.1 β-lactamases
A produção de β-lactamases é um dos mais efetivos mecanismos de
resistência bacteriana conhecidos. São enzimas que catalisam a hidrólise do anel
beta-lactâmico, inativando o antimicrobiano e impedindo a síntese da parede celular
bacteriana (BERTONCHELI; HÖRNER, 2008). Isolados de A. baumannii resistentes
a carbapenêmicos presentes em unidades de saúde estão frequentemente
associados, na maioria das vezes, à aquisição de carbapenemases do tipo OXA,
incluindo os genes blaOXA-58-like, blaOXA-24-like e blaOXA-23-like. A disseminação inter e
intra hospitalar de isolados abrigando esses genes de resistência tem aparecido em
relatos no mundo todo (ALIRAMEZANI et al., 2016).
As β-lactamases de classe A de Ambler, hidrolisam penicilinas e
cefalosporinas e são, geralmente, susceptíveis a inibidores de β-lactamases. A
maioria das β-lactamases de amplo espectro (ESBLs) pertencem a esse grupo de
enzimas, onde encontramos as famílias de enzimas TEM, SHV e CTX-M, já
relatadas em isolados de A. baumannii (BUSH, JACOBY, 2010; EVANS,
HAMOUDA, AMYES, 2013; http://www.lahey.org/studies/). A presença de mutações
nos genes que codificam as enzimas TEM e SHV propiciam o desenvolvimento de
36
ESBLs com perfil de substrato expandido, o que permite a hidrólise de todas as
cefalosporinas, penicilinas e aztreonam. A detecção fenotípica e molecular de genes
ESBL, como SHV e TEM, pode fornecer dados adequados sobre a epidemiologia e
os fatores de risco gerados por bactérias que produzem ESBL (LATIFPOUR;
GHOLIPOUR; DAMAVANDI, 2016).
A primeira confirmação de ESBLs no Brasil foi realizada em 1997, quando
pesquisadores documentaram a presença dessas enzimas em isolados clínicos de
Klebsiella pneumoniae de hospitais privados e públicos do Rio de Janeiro e São
Paulo (SAMPAIO; GALES, 2016). As ESBLs mais prevalentes estão inclusas nos
grupos TEM, SHV e CTX-M sendo principalmente encontradas em isolados de
Klebsiella spp. Escherichia coli e em outras espécies de Enterobacteriaceae. As
ESBLs do tipo CTX-M vem se tornando as ESBLs mais predominantes nos últimos
anos em relação as convencionais do tipo TEM e SHV, no mundo (KHOSRAVI;
HOVEIZAVI; MEHDINEJAD, 2013), e são mais predominantes na Europa e América
do Sul, incluindo o Brasil (ROCHA; PINTO; BARBOSA, 2016). Recentemente, mais
de 170 variantes de CTX-M têm sido identificadas no mundo todo, e são divididas
em 5 grupos de acordo com suas similaridades de sequência de aminoácidos: CTX-
M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 e CTX-M-25. No Brasil, as CTX-M são as ESBLs
mais prevalentes, particularmente em Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli
(ROCHA; PINTO; BARBOSA, 2016).
Dentre as carbapenemases serina-dependentes da classe molecular A inclui-
se as enzimas SME, IMI, GES, NMC e KPC (BUSH; JACOB, 2010). A primeira
publicação de KPC no Brasil foi em 2009, através do relato da detecção de KPC-2
em isolados obtidos de quatro pacientes da cidade de Recife - PE, nordeste do
Brasil (SAMPAIO; GALES, 2016). Até o momento, 22 variantes de -lactamase KPC
foram identificadas. As -lactamases KPC podem hidrolisar todos os -lactâmicos,
incluindo carbapenêmicos, cefalosporinas, cefamicinas, monobactâmicos e ácido
clavulânico. São encontradas em muitas espécies gram-negativas, incluindo
Enterobacteriacea e espécies não fermentadoras (incluindo Pseudomonas
aeruginosa e Acinetobacter baumannii), no entanto, são mais predominantes em
isolados de Klebsiella pneumoniae (CHEN et al., 2015).
As β-lactamases de classe B de Ambler, as metallo-β-lactamases, são
capazes de hidrolisar uma variedade de antibióticos β-lactâmicos, exceto aztreonam,
não sofrendo ação de inibidores de β-lactamases. As enzimas da família IMP e VIM
37
são mais frequentemente encontradas em A. baumannii, comumente carreadas por
integrons, o que causa grande preocupação devido a habilidade de hidrolisar
carbapenêmicos colocar em risco o êxito do tratamento de infecções (EVANS,
HAMOUDA, AMYES, 2013). Dentre as metalo-β-lactamases (MBL), atualmente dez
subclasses são conhecidas, incluindo: IMP (Imipenemase), VIM (Verona
Imipenemase), SPM-1 (São Paulo MBL), GIM (German Imipenemase), SIM-1 (Seul
Imipenemase), AIM-1 (Australian Imipenemase), KHM (Kyorin University Hospital),
NDM-1 (New Delhi MBL), DIM-1 (Dutch Imipenemase), and TMB (Tripoli MBL). No
Brasil, as mais prevalentes são as subclasses IMP-1 e SPM-1 (GONÇALVES et al.,
2016).
As β-lactamases de classe C de Ambler (conhecidas como enzimas AmpC)
são frequentemente encontradas nos cromossomos ou também plasmídeos de
microrganismos gram-negativos. Em Acinetobacter spp. são referidas como enzimas
ADC (Acinetobacter Cephalosporinases Derivative -Cefalosporinases Derivadas de
Acinetobacter), que podem hidrolisar penicilinas e cefalosporinas de espectro
restrito, no entanto, quando são super expressas podem conferir resistência a
cefalosporinas de amplo espectro, exceto as de quarta geração. Em A. baumannii, a
super expressão e a resistência a cefalosporinas de amplo espectro está
diretamente relacionada à presença do elemento de inserção ISAba1, que atua
como promotor e favorece a expressão dos genes blaADC (HOWARD et AL., 2012;
EVANS, HAMOUDA, AMYES, 2013; WRIGHT et al., 2014).
As carbapenemases do tipo oxacilinases (OXA) da classe D de Ambler são as
principais responsáveis pela resistência aos antimicrobianos carbapenêmicos no
mundo em isolados de A. baumannii. Existem 150 variantes descritas até o
momento, onde 45 mostram atividade para hidrolisar carbapenêmicos. As enzimas
OXAs são geneticamente divididas em 6 subgrupos, amplamente encontradas em A.
baumannii adquiridos por elementos genéticos móveis, os exemplos mais
mencionados são blaOXA-23-like (OXA-23, OXA-27, and OXA-49), blaOXA-24-like (OXA-24,
OXA-25, OXA-26, OXA-40, and OXA-72), blaOXA-58-like, blaOXA-143-like (OXA-143, OXA-
231, and OXA-253), blaOXA-235, and blaOXA-51-like, este último subgrupo presente a
nível cromossomal na espécie A. baumannii , mas que não proporciona um nível de
resistência clinicamente efetiva a carbapenêmicos, a não ser com a presença do
elemento de inserção ISAba1. (EVANS, HAMOUDA, AMYES, 2013; NIGRO, HALL,
2016; KOBS et al., 2016). LEE et al. em 2012, encontraram plasmídeos carreando a
38
estrutura genética ISAba1-blaOXA-51-like, certamente via transposição e também em
isolados de Acinetobacter nosocomialis, elevando o nível de resistência a
carbapenêmicos e colocando em dúvida a utilização da detecção desse gene para
diferenciar A. baumannii de outras espécies de Acinetobacter spp.
Isolados de A. baumannii resistentes a carbapenêmicos são uma ameaça a
saúde e estão frequentemente associados a aquisição de carbapenemases do tipo
OXA, carreando, na maioria das vezes, os genes blaOXA-58, blaOXA-24 e blaOXA-23
(ALIRAMEZANI et al., 2016).
Bactérias gram-negativas e gram-positivas são afetadas pelo aparecimento e
aumento de resistência antimicrobiana, um problema que continua a crescer,
fazendo-se necessário à descrição e classificação das bactérias que são resistentes
a múltiplos antimicrobianos, sendo importante a coleta e compartilhamento de dados
de vigilância e epidemiologia entre unidades de saúde da região e do mundo inteiro
(MAGIORAKOS et al., 2011).
2.4 Mecanismos de Virulência
2.4.1 Fatores de virulência
A virulência é o grau de patogenicidade dentro de um grupo ou espécies de
organismos, não sendo atribuída a um só fator, mas a vários parâmetros
relacionados ao microrganismo, ao hospedeiro e à interação entre ambos
(KONEMAN, 2012).
Usualmente, um dos fatores relacionado à virulência bacteriana é formado por
uma estrutura de superfície da célula bacteriana, conhecida como adesina e
receptores complementares na superfície das células suscetíveis. As adesinas
bacterianas incluem fímbrias, componentes da cápsula e ácidos lipoteicóicos que se
projetam para o exterior do glicopeptídeo da parede celular das bactérias gram-
positivas ou outros antígenos de superfície celular. Adicionalmente, as estruturas
capsulares de algumas bactérias possibilitam aos microrganismos escaparem da
fagocitose, impedindo a interação entre a superfície da célula bacteriana e a célula
fagocitária ou ocultando componentes da superfície celular bacteriana que de outro
modo poderiam interagir com as células fagocitárias e levar à ingestão do
microrganismo (KONEMAN, 2012).
39
Pouco se conhece sobre os genes e fatores envolvidos em propriedades de
virulência, além disso, as atividades de sideróforos e propriedades de aderência
desempenham um papel na fase inicial da colonização e na manutenção da infecção
(FOURNIER; RICHET, 2006).
Embora A. baumannii seja considerado um patógeno relativamente pouco
invasivo, algumas características desta espécie bacteriana podem aumentar a
virulência dos isolados envolvidos em IRAS. Entre os fatores de virulência relatados
nesta espécie bacteriana, estão inclusos: adesão a células epiteliais humanas e
superfícies abióticas pela produção de fimbrias e/ou cápsula polissacarídica,
formação de biofilme, produção de cápsula polissacarídica e sistemas de aquisição
de ferro (BRAUN; VIDOTTO, 2004; ZIMBLER et al., 2009).
A patogênese de A. baumannii depende inicialmente da captação e utilização
de ferro, elemento essencial envolvido nas funções celulares básicas. As bactérias
patógenas respondem a limitação de ferro através da expressão de diferentes
sistemas de captação de ferro dependentes ou não de sideróforos (PENWELL et al.,
2012). O sistema de aquisição de ferro mais bem caracterizado em A. baumannii é o
sideróforo acinetobactina, um mecanismo de alta afinidade, sofisticado e
desenvolvido para a obtenção de ferro, suprindo a pouca disponibilidade de ferro e a
disputa com as células do hospedeiro. São necessários três sistemas para compor
o sideróforo acinetobactina; o primeiro, onde a biossíntese da acinetobactina é
realizada por proteínas codificadas pelos genes basA, basB, basC, basD, basF,
basG, basH, basI, and basJ. No segundo sistema a acinetobactina é secretada
através de um sistema de efluxo da superfamília ABC, consistindo nas proteínas
codificadas por barA e barB. Por último a terceira etapa, na qual os complexos de
acinetobactina-ferro movem-se para células bacterianas através de um receptor para
complexos de ferro-acinetobactina, formados pelas proteínas codificadas por bauA,
bauB, bauC, bauD, bauE e bauF (HASAN, CHOI, OH, 2015). A acinetobactina é um
sideróforo catecol-hidroxamato não cíclico derivado do ácido 2,3-dihidroxibenzóico
ligado a treonina e N-hidroxihistamina (PENWELL et al., 2012).
Entre os determinantes de virulência presentes em isolados de A. baumannii
que conferem maior patogenicidade a esses patógenos estão a membrana externa,
vesículas de membrana externa, fosfolipases D e biofilme (NOWAK,
PALUCHOWSKA, 2016). A proteína A de membrana externa de A. baumannii é uma
porina trimérica e está comprometida com o transporte do soluto e virulência da
40
bactéria, além de participar da patogenicidade induzindo a apoptose,
imunomodulação, aderência e invasão celular às células do hospedeiro e a
formação de biofilme (LIN, 2015).
Um dos fatores de virulência diretamente relacionados com a permanência do
paciente hospitalizado é a formação de biofilme. A habilidade dos isolados de A.
baumannii em permanecer na ponta dos dedos, plásticos, vidros, utensílios médicos,
no ambiente e em superfícies secas, até mesmo sob condições adversas como
dessecação e desinfecção, facilitam a preservação da bactéria no ambiente
hospitalar facilitando o desenvolvimento de IRAS e, consequentemente, o
aparecimento de surtos (ESPINAL, MARTI, VILA, 2012; RYU, BAEK, KIM, 2016;
SELASI et al., 2016). Nas etapas de formação de biofilme participam diversos
genes, entre eles o ompA, principal proteína de membrana externa, e o csuE,
envolvido na formação do sistema pili, de forma que a inativação desse gene elimina
a produção de pili e a formação de biofilme (SELASI et al., 2016). O biofilme
formado por isolados de A. baumannii possibilita a resistência aos mecanismos de
defesa do hospedeiro e às terapias antimicrobianas (CHEN, 2015), considerado um
dos mais importantes e frequentes fatores de virulência em isolados clínicos de A.
baumannii (LONGO, VUOTTO, DONELLI, 2014). A resistência a antibióticos das
células de biofilme pode ser atribuída a alterações fisiológicas na permeabilidade da
membrana e atividade metabólica (HE et al., 2015).
Embora descrito como um patógeno sem mobilidade, por não possuir flagelo,
isolados clínicos de A. baumannii tem apresentado capacidade de motilidade
envolvida com a capacidade de espalhamento (swarming) e contração (twitching)
(EIJKELKAMP et al., 2011, VIJAYKUMAR, BALAJI, BISWASB, 2015). O sistema de
pili tipo IV (TFP), no qual o gene pilA codifica a subunidade principal pilina A,
intercede na mobilidade espasmo (twitching), iniciando com a montagem do TFP e a
ligação e retração do pilus, facilitando assim a translocação da célula na direção do
ponto de ligação (EIJKELKAMP et al., 2011b, HARDING et AL., 2013). O TFP
participa de outros processos como: transferência horizontal, adesão à célula do
hospedeiro e formação de biofilme (PIEPENBRINK et AL., 2016).
O envelope bacteriano é exposto a mudanças e estresses ambientais, como
variação de temperatura, pH, exposição a compostos tóxicos e estresse oxidativo.
Como resposta a tais variações, as bactérias desenvolveram um sistema de
resposta, geralmente regulando a expressão gênica (LEBLANC et al., 2011).
41
Normalmente, um sistema de dois componentes (SDC) é composto de um sensor
proteína quinase associado à membrana plasmática que responde a estímulos
extracelulares e / ou intracelulares, transmitindo um sinal através da fosforilação de
um regulador de resposta (KROGER et al., 2017). O SDC bacteriano é um sistema
que facilita a modificação de expressão de genes em resposta à estímulos
ambientais.
O SDC BaeSR regula positivamente genes de bombas de efluxo em isolados
de A. baumannii, incluindo a expressão das bombas AdeIJK e MacAB-TolC,
resultando num aumento de susceptibilidade à tigeciclina (LIN; LIN; LAN; 2015;
KROGER et al., 2017). Outro SDC, o BfmSR participa da formação de biofilme em
isolados de A. baumannii quando regula a expressão das chaperonas
csuA/BABCDE, estabilizando a expressão do operon csu e a expressão dos genes
csuC e csuE, responsáveis pela formação de pili necessários para a aderência e
formação de biofilme bacteriano (LUO et al., 2015; KROGER et al, 2017).
É de grande relevância o entendimento das estruturas presentes na superfície
celular e as que se estendem além da superfície, para a compreensão da
patogênese de um microrganismo visto que determinantes de virulência bacteriana,
poderiam ser alvos futuros de novos antibióticos e vacinas (WEBER; HARDING;
FELDMANB, 2016).
O aumento e a importância crescente de surtos causados por isolados
patogênicos de A. baumannii, tem levado a comunidade científica e médica a tentar
compreender os mecanismos causadores de doenças desses microrganismos, com
grande interesse em novas estratégias de tratamento visto a escassez de novos
recursos para o combate desse patógeno que vem se tornando intratável (WEBER;
HARDING; FELDMANB, 2016; KROGER et al., 2017).
42
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Determinar a relação clonal, a ocorrência e sequência de genes de
resistência, do elemento de inserção ISAba1 e de genes de virulência em isolados
MDR de A. baumannii obtidos em dois hospitais públicos do Recife-PE, além de
determinar a expressão de genes de virulência em isolados submetidos aos
antimicrobianos meropenem, colistina e associação.
3.2 Objetivos Específicos
a) Determinar a relação clonal de isolados MDR de A. baumannii;
b) Verificar a ocorrência e a sequência dos genes de resistência aos β-lactâmicos
blaKPC blaVIM, blaIMP, blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, blaOXA-58-like e blaOXA-143-like e do
elemento de inserção ISAba1 em isolados MDR de A. baumannii;
c) Verificar a ocorrência dos genes de virulência basC, csuE, ompA, pilA, bfmS e
baeS em isolados MDR de A. baumannii;
d) Verificar a expressão dos genes de virulência bfmS, baeS e csuE em isolados
MDR de A. baumannii com ou sem meropenem, colistina e a associação destes
antimicrobianos.
43
4 METODOLOGIA
4.1 Desenho do estudo
Para o desenvolvimento deste estudo foi utilizado o desenho experimental.
Este tipo de estudo foi o que se adequou ao objetivo do corrente trabalho, que se
destina a analisar os efeitos causados por antibióticos β-lactâmicos, colistina e
meropenem na expressão de diferentes fatores de virulência, assim como
determinar a relação clonal e quais genes estão envolvidos na resistência e
virulência de isolados de A. baumannii obtido em dois hospitais públicos de Recife-
PE.
4.1 Isolados bacterianos
Para a realização deste estudo foram utilizados 37 isolados MDR de A.
baumannii, obtidos de IRAS e por pesquisa de vigilância a partir de pacientes
internados em dois hospitais públicos da cidade do Recife-PE. Foram utilizados 27
isolados obtidos do Hospital A nos anos de 2013 e 2014 e 10 a partir do Hospital B
no ano de 2014 (tabela 2). A determinação da espécie e o perfil de susceptibilidade
destes isolados a diferentes antimicrobianos foi determinado no hospital de origem
utilizando o sistema automatizado VITEK 2 (Biomérieux). As colônias foram
transferidas para caldo BHI acrescidos de 20% de glicerol e estocados a -80°C. Para
realização das análises foram cultivados em caldo BHI por 18 horas a 37°C.
Tabela 2. Origem e características fenotípicas de resistência dos isolados de Acinetobacter
baumannii utilizados neste estudo.
Isolado
Hosp.
Isolamento
Setor do hospital
Perfil de Resistência
45 A Ponta de cateter UTI CTX, CPM, CAZ, CIP, GM, IMI, MEM, PRL
113 A Ponta de cateter UTI CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI,MEM, PRL 119 A Sec. Traqueal UTI CFX, CFX/AX, MEM 123 A Ponta de cateter Enf. 7° andar CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP,
IMI, MEM 136 A Sec. Traqueal UTI SAM, CPM, CAZ, CRO, CFX,
CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM, PRL 165 A Escara UTI AMO/AC, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI,
MEM, PRL 248 A Sec. Traqueal UTI CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL,
MEM, PRL
44
253 A Swab nasal UTI CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM,
281 A Swab nasal/pesq. vig. UTI SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL
322 A LCR USAN CTX, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL, LEV, NFT
325 A Sec. Traqueal USAN CTX, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL, LEV, NFT
349 A Sec. Traqueal UTI SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, GM, IMI, MEM, PRL
390 A Líquor USAN SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL
468 A Swab retal/pesq. vig. UTI SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL
486 A Ferida operatória Enf. 5° andar CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL 513 A Hemocultura UTI CTX, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL,
LEV, NFT 516 A Swab nasal/pesq. vig. UTI AK, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM,
PRL 563 A Sec. Traqueal UTI CTX, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP,
COL, IMI, LEV, NFT 578 A Hemocultura UTI pediátrica CTX 781 A Swab nasal/pesq. vig. UTI CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP,
GM, IMI, MEM 799 A Sec. Traqueal UTI SAM, CPM, CAZ, CRO, CFX,
CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM 808 A LCR UTI pediátrica SAM, CPM, CAZ, CRO, CFX,
XFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM 829 A Sec. Região tórax UTQ Adulto CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL,
IMI, LEV, NFT 931 A Swab nasal/pesq. vig. UTI AK, SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP,
MEM, PRL 1000 A Líquor Enf. 5° andar SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI,
MEM, PRL 1188 A Ponta de cateter UTI SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI,
MEM, PRL 4076 A NE NE AK, CTX, CPM, CRO, CIP, GM, IMI,
LEV, MEM, PRL, TN, TS 24 B Partes moles Ambulatório CPM, CAZ, CRO, CIP, GM, IMI, MEM 54 B Catéter UTI AK, SAM, CPM, CAZ, CRO, CIP,
COL, GM, IMI, MEM 55 B Catéter UTI CPM, CAZ, CRO, CIP, GM, IMI, MEM 60 B STB UTI CPM, CAZ, CRO, CIP, IMI, MEM
298 B Sangue UTI CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM
307 B Urina UTI CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, IMI, MEM
338 B Sec. Traqueobrônquica UTI CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, IMI, MEM
379 B Líq. cav.abdominal UTI AK, CPM, CAZ, CRO, CIP, GM, IMI, MEM
412 B STB UTI CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, IMI, MEM
570 B Sangue UTI SAM, CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM
Sec: secreção; LCR: Líquido Cefalorraquidiano; USAN: Unidade de Suporte Avançado em
Neurocirurgia; UTI: Unidade de Terapia Intensiva; UTQ: Unidade de Terapia de Queimados; Enf:
enfermaria; Clín Vasc: clínica vascular; STB: Secreção traqueobrônquica; R: Resistente; S: Sensível;
ND: não determinado; NE: não especificado; CTX: Cefotaxima; CPM: Cefepima; CAZ: Ceftazidima;
CIP: Ciprofloxacina; GM: Gentamicina; IMI: Imipenem; MEM: Meropenem; PRL: Piperaciclina;
CFX/AX: Cefuroxima Axetil; SAM: Ampicilina; CRO: Ceftriaxona; AMO/AC: Amoxicilina/Ácido
Clavulânico; COL: Colistina; LEV: Levofloxacina; NFT: Nitrofurantoína; AK: Amicacina; TN:
Tobramicina; TS: Trimetoprim-Sulfametoxazol; CFX: Cefuroxima.
45
4.2 MALDI-TOF MS
A confirmação da identificação bacteriana dos isolados de A. baumannii foi
realizada através da técnica de Ionização/Dessorção de Matriz Assistida por Laser –
Tempo de Vôo/Espectômetro de Massa (MALDI-TOF MS). A extração das proteínas
ribossomais foi realizada após cultivo bacteriano em ágar MacConkey (Oxoid,
Basingstoke, Inglaterra), segundo as recomendações do fabricante (MALDI
Biotyper® Protocol Guide, BRUKER). As colônias bacterianas foram inoculadas com
alça bacteriológica de 1 µL, ressuspensas em 300 µL de água destilada estéril em
microtubos de 1,5 mL e misturadas vigorosamente. Foram adicionados 900 µL de
etanol absoluto (Carlo Erba, Rodano, Milao, Italia) e centrifugados por 2 minutos a
13.000 rpm. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o sedimento
ressuspenso em 50 µL de ácido fórmico 70 % (Sigma Aldrich, St. Loius, Missouri,
EUA). A este sedimento foi adicionado ainda 50 µL de acetonitrila 100% (Merck
KGaA, Darmstadt, Alemanha), misturado vigorosamente em vortex e então
centrifugados novamente por 2 minutos a 13.000 rpm. Posteriormente, 1 µL do
sobrenadante de cada amostra extraída foi pipetado em triplicata em uma placa de
aço inox com 96 spots, assim como 1 µL do calibrante para peptídeos de baixo peso
molecular (Bruker Daltonics, Alemanha). Após completa secagem do extrato das
proteínas ribossomais, 1 µL da matriz CHCA foi dispensado sobre as amostras (10
mg/mL - α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid) (Sigma Aldrich, St. Loius, Missouri, EUA).
Logo após a secagem, a placa de aço foi introduzida no espectrômetro de massas
Microflex LT (Bruker Daltonics, Alemanha) para identificação das amostras pelo
MALDI Biotyper RTC3. 3 (Bruker Daltonics, Alemanha). As análises foram realizadas
no laboratório ALERTA da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), sob a
colaboração da Profa. Dra. Ana Cristina Gales.
4.3 Extração do DNA total
Todos os 37 isolados de A. baumannii foram plaqueados em caldo BHI (Brain
Heart Infusion - Infusão de Cérebro e Coração) e Ágar Bacteriológico a 1,5% para
crescimento a 37°C por 18 horas. As colônias isoladas foram repicadas e crescidas
em BHI por 18 horas a 37°C para a extração do DNA total, utilizando o Kit Wizard
Genomic DNA purification (Promega), segundo instruções do fabricante. Um ml da
46
cultura foi utilizado para realização da extração após centrifugação a 14000 rpm por
4 minutos. Após retirada do sobrenadante e adição de 600 μL de solução de lise
nuclear a amostra foi ressuspendida e incubada a 80°C por 5 minutos para posterior
resfriamento a temperatura ambiente. Posteriormente, 3 μL de solução de RNase foi
adicionada à amostra, para incubação a 37°C por 60 minutos e resfriamento a
temperatura ambiente. Após adição de 200 μL de solução precipitadora de proteína
a amostra foi homogeneizada em vórtex por 20 segundos, resfriada em gelo por 5
minutos para posterior centrifugação a 14000 rpm por 3 minutos. O sobrenadante
contendo o DNA foi transferido para outro recipiente contendo 600 μL de isopropanol
para centrifugação a 14000 rpm por 2 minutos, em seguida o sobrenadante foi
descartado cuidadosamente com posterior adição de 600μL de etanol a 70% para
lavagem do DNA. Após a lavagem, a solução foi centrifugada a 14000 rpm por 2
minutos para retirada do etanol. Todo o resquício de etanol foi retirado em centrifuga
de secagem por 5 minutos para posterior adição de 50 μL da solução reidratante de
DNA e armazenamento a - 20°C. O DNA obtido foi quantificado e analisado quanto
ao grau de pureza utilizando NanoDrop 2000 (NPT 3 – Núcleo de Plataforma
Tecnológicas/CPqAM).
4.4 Determinação da presença dos genes de virulência
A presença dos genes de virulência pilA, csuE, ompA e basC foi determinada
em todos os isolados de A. baumnannii através da técnica de Reação em Cadeia de
Polimerase (PCR) utilizando os primers descritos na tabela 3.
As reações de PCR foram realizadas individualmente para cada gene utilizando
um volume total de 25μl por tubo, compreendendo: 1μl de DNA genômico a 20ng/μl,
1U da enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen), 0,5μl de cada
desoxirribonucleotídeo trifosfato a 200 μM (GeHealthcare), 0,75 μl de MgCl2 a 1,5
mM, 1μl de cada primer a 15 pmol/μl, além de 2,5 μl de tampão (10x). As
amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra) do Laboratório de
Biologia Celular e Molecular do Departamento de Parasitologia (CPqAM/FIOCRUZ),
utilizando a seguinte ciclagem: 5 minutos a 96ºC para desnaturação, seguido de 35
ciclos consistindo cada ciclo de 1 minuto a 96ºC para desnaturação, um minuto a
59ºC (gene pilA), 57ºC (gene csuE e ompA) e 58ºC (gene basC) para anelamento
dos primers, acrescido de um minuto a 72ºC para extensão. Após os 35 ciclos foi
47
realizada uma etapa de alongamento final de 10 minutos a 72ºC.
4.5 Determinação da presença e sequência dos genes de resistência
A determinação dos genes de resistência foi realizada através de PCR
utilizando os primers descritos na tabela 2. A reação de PCR e ciclagem foi a mesma
utilizada nas amplificações dos genes de virulência, alterando apenas a temperatura
de anelamento referente a cada gene analisado, incluindo 59ºC para o gene blaOXA-
51 like, 56ºC para o blaOXA-23 like, 58 ºC para blaOXA-143 like, 54 ºC para blaIMP, 63ºC para
o blaVIM, 66ºC para o blaKPC, 63ºC para blaCTX-M e 62ºC para o ISAba1.
Tabela 3. Descrição dos primers utilizados neste estudo para determinar por PCR a presença dos genes de
resistência e virulência presentes em isolados de A. baumannii.
Gene Primer Sequência (5'- 3') Amplicon
(pb) Referências
basC
basC F
basC R
CATTCAGCGGAGTTTGCA
CGATTCAACTTCGCAGCT 405 DORSEY et al., (2004)
ompA
OmpAF
OmpAR
CAATTGTTATCTCTGGAG
ACCTTGAGTAGACAAACGA 952 TURTON et al. (2007)
pilA
pilAF
pilAR
GGCAATTGCGATTCCTGCTT
TGCAGCTGAACCATTAGCGA 138 Proposto neste estudo
csuE
CsuEF
CsuER
ATGCATGTTCTCTGGACTGATGTTGAC
CGACTTGTACCGTGACCGTATCTTGATAAG 580 TURTON et al. (2007)
blaOXA-51 like
OXA-51-like F
OXA-51-like R
TAATGCTTTGATCGGCCTTG TGGATTGCACTTCATCTTGG
353 WOODFORD et al.(2006)
blaOXA-23 like
OXA-23-like F
OXA-23-like R
GATCGGATTGGAGAACCAGA ATTTCTGACCGCATTTCCAT
501 WOODFORD et al.(2006)
blaOXA-143 like
OXA-143-like F
OXA-143-like R
TGGCACTTTCAGCAGTTCCT TAATCTTGAGGGGGCCAACC
149 HIGGINS, LEHMANN, SEIFERT,
(2010)
ISAba1
ISAba1a
ISAba1b
ATGCAGCGCTTCTTTGCAGG ATGATTGGTGACAATGAAG
389 MUGNIER et al., 2009
blaKPC
KPC 1F KPC R
GCTACACCTAGCTCCACCTTC TATTTTTCCGAGATGGGTGAC
371 MOLAND ( 2003); YIGIT et al.
(2001)
blaIMP
IMP-DIA-F IMP-DIA-R
GGAATAGAGTGGCTTAATTCTC GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT
364 DONG et al. (2008)
blaVIM
VIM-DIA-F VIM-DIA-R
CAGATTGCCGATGGTGTTTGG AGGTGGGCCATTCAGCCAGA
523 DONG et al. (2008)
blaCTX-M
CTX - MA1 CTX – MA2
SCSATGTGCAGYACCAGTAA CCGCRATATGRTTGGTGGTG
543 SALADIN et al., 2002
48
4.6 Eletroforese em gel de agarose
Para a visualização dos resultados 6 μl dos amplicons foram submetidos a
eletroforese em gel de agarose a 1,5% e corados com 2μl de Blue green (LGC
Biotecnology) utilizando tampão TBE 0,5x em cuba de eletroforese horizontal por 45
minutos, sob as seguintes condições: 100V, 190mA, 150W. Os produtos da
amplificação foram visualizados sob luz ultravioleta em transiluminador
(Transiluminator LOCCUS biotecnologia – L. PIX) e fotododumentados no Núcleo de
Plataformas Tecnológicas – NPT3 do CPqAM/FIOCRUZ.
4.7 Sequenciamento de DNA
Os genes de resistência e virulência dos isolados 119, 113, 338, 570 e 808
foram sequenciados, utilizando os iniciadores descritos na tabela 3.
Para seqüenciamento os amplicons foram purificados utilizando o PureLink
PCR Micro Kit (Invitrogen), conforme instruções do fabricante. Resumidamente, 200
μl de tampão de ligação foi adicionado a 50 μl do amplicon para homogeneização,
transferido para a coluna fornecida pelo fabricante e centrifugado a 10.000xg por 1
min. Em seguida, foi adicionado 650 μl de tampão de lavagem. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi descartado e a coluna foi re-inserida dentro do
tubo de coleta. Após a secagem do material por centrifugação o sobrenadante foi
descartado e o DNA foi recuperado pela adição de 10 μl tampão de eluição.
O sequenciamento dos produtos de PCR foi realizado com amostras de DNA
fita dupla, através do método de terminação de cadeia de desoxirribonucleotídeo
(SANGER; NICKLEN; COULSON, 1992), na subunidade do Núcleo de Plataformas
Tecnológicas I do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães-CPqAM/FIOCRUZ. A
análise das sequências de DNA e o alinhamento múltiplo foi realizada utilizando os
programas DNAstar e BLAST no National Center for Biotechnology Information
website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
As sequências dos genes blaOXA-51 like, blaOXA-23 like, blaOXA-143 like, ISAba1, csuE,
ompA e BasC foram depositadas no Genbank database.
49
4.8 Eletroforese em Campo Pulsátil (PFGE)
A avaliação da similaridade genética de todos os isolados de A. baumannii
deste estudo foi realizada pela técnica de PFGE, objetivando analisar e comparar o
perfil genético de cada isolado. As amostras selecionadas foram cultivadas em Ágar
MacConkey (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), das quais, 3 colônias foram incubadas
em 3 mL de caldo BHI (infusão de cérebro e coração) (bioméRieux, França). Após
18 horas de incubação em agitação a 37°C, as culturas líquidas foram centrifugadas
por 15 minutos a 3.000 rpm, e os sobrenadantes foram descartados. O sedimento foi
ressuspenso em 1 mL de solução salina, transferidos para tubos de microcentrífuga
previamente pesados e centrifugados por 1 minuto a 12.000 rpm. O sobrenadante
de cada microtubo foi desprezado, o sedimento pesado com a finalidade de subtrair
o peso do microtubo, e então ressuspensos em solução salina na proporção 1:1
entre o volume do diluente e o sedimento pesado. Após a homogeneização dessa
suspensão de células em vórtex, 7 μL da suspensão bacteriana foi transferida para
tubos de microcentrífuga contendo 300 μL de tampão TEN (EDTA 0,5 M, pH 7,0;
EDTA 0,5 M, pH 8,0; Tris base 1 M, pH 7,0; Tris base 1 M, pH 7,0; NaCL 4,0 M; e
água destilada), e homogeneizadas rapidamente com 340 μL de agarose ultrapura
com baixo ponto de fusão a 2% (Invitrogen, Carlsbad, EUA). Essa mistura foi
transferida cuidadosamente para moldes de plugs (Bio Rad Laboratories Inc.,
Hercules, EUA) impedindo a formação de bolhas.
Os blocos de géis permaneceram por aproximadamente 30 minutos em
temperatura ambiente até completa solidificação. Depois de solidificados os plugs
foram transferidos para uma placa de microdiluição de 12 poços contendo 2 mL de
tampão EC (EDTA 0,5 M, pH 7,0; EDTA 0,5 M, pH 8,0; Tris base 1 M, pH 7,0; Tris
base 1 M, pH 8,0; NaCl; N-lauril sarcosil (Sigma Aldrich, St. Loius, Missouri, EUA);
Brij 58 (Sigma Aldrich, St. Loius, Missouri, EUA); deoxicolato de sódio (Sigma
Aldrich, St. Loius, Missouri, EUA); e água destilada). Após a incubação dos plugs por
aproximadamente 12 horas a 37°C, o tampão EC foi removido, e os blocos de gel
lavados com 2 mL de tampão CHEF-TE (EDTA 0,5 M, pH 7,0; EDTA 0,5 M, pH 8,0;
Tris base 1 M, pH 7,0; Tris base 1 M, pH 8,0; e água destilada) por 2 vezes com
intervalos de 30 minutos entre as lavagens. Em seguida, incubados a 50°C por
aproximadamente 12 horas com 2 mL de tampão ES (EDTA 625 mM, pH 9,3; N-
lauril sarcosil 5% (Sigma Aldrich, St. Loius, Missouri, EUA) contendo 100 μL de
50
proteinase K (20 mg/mL; Invitrogen, Carlsbad, EUA). Após essa etapa de lise da
parede celular, os blocos de géis foram lavados 4 vezes com intervalo de 1 hora
entre as lavagens com o tampão CHEF-TE, até completa remoção dos reagentes
anteriores. Os plugs foram mantidos a 5°C até a etapa de digestão do DNA. A
digestão do DNA bacteriano foi realizada em placa de microdiluição de 96 poços,
onde somente 1/3 do bloco de gel foi utilizado para essa etapa. Os plugs cortados
foram lavados 4 vezes com intervalos de 1 hora entre as lavagens com 200 μL de
DNS (Trisma base 1 M, pH 8,0; cloreto de magnésio 1 M (Sigma Aldrich, St. Loius,
Missouri, EUA) e água destilada) em temperatura ambiente. Após a última lavagem
e remoção do DNS, os blocos de géis foram incubados por 1 hora a 4°C com o
tampão de enzima de restrição sem a enzima (5 μL do tampão “NEBuffer” (New
England Biolabs, Ipswich, EUA), 0,5 μL de BSA (New England Biolabs, Ipswich,
EUA) e 44,5 μL de água destilada). Após esse período, a placa com os blocos de
géis foram incubados novamente a 5°C com o tampão de enzima de restrição
contendo 10 unidades da enzima de restrição ApaI (New England Biolabs, Ipswich,
EUA). Essa etapa de clivagem do DNA bacteriano ocorreu a 37°C entre 12 a 20
horas. A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1% em TBE 0,5 X (Tris base
0,089 M, Ácido bórico 0,089 M e EDTA 0,002 M) no sistema CHEF-DR II (BioRad
Laboratories Inc., Hercules, EUA) à temperatura de 14°C e uma corrente elétrica de
6.0 Volts/cm com um “Switch” Time Inicial - Final 5,0 - 60 durante 19 horas. O gel foi
corado com brometo de etídio 10 mg/mL e fotografado sob luz ultravioleta. A
comparação foi realizada utilizando-se o coeficiente de similaridade de Dice e o
dendrograma formado pelo método UPGMA (“Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean”) com tolerência de 1,0% no programa Bio Numerics (versão 6.6,
Applied Maths).
4.9 Critérios para seleção dos isolados para etapa de análise de expressão de
virulência
Foram selecionados três isolados de A. baumannii. para a análise de
expressão dos genes csuE, bfmS e baeS. Os critérios dessa seleção foram:
a) Isolados pertencentes a grupos filogenéticos diferentes;
b) Isolados apresentando resistencia fenotípa ao meropenem, detectada pelo
aparelho automatizado VITEK® 2;
51
c) Todos os isolados selecionados serem portadores dos genes de virulência
pesquisados no estudo;
d) Todos os isolados selecionados portadores do gene blaOXA-51-like e ISAba1.
4.10 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
As CIM dos agentes antimicrobianos meropenem e colistina foram
determinadas pelo teste de macrodiluição em caldo Mueller-Hinton (KASVI),
utilizando a cepa ATCC 25922 de Escherichia coli como controle, segundo
recomendações do CLSI, 2013. Os três isolados bacterianos selecionados e a ATCC
19606 foram incubados por 18 horas em caldo Brain Heart Infusion (BHI) a 37 ºC. O
inóculo foi comparado e ajustado à escala 0,5 de MacFarland, correspondente a 1,5
x 108 UFC/ml. Posteriomente os isolados foram inoculados em caldo Mueller-Hinton
contendo as concentrações de 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1 e 0,5 µg/ml de cada
antimicrobiano. Os isolados foram então incubados para crescimento por 18 horas
em estufa a 37 ºC. Os resultados para meropenem e colistina foram interpretados
segundo o CLSI 2013.
4.11 Extração de RNA e síntese de cDNA
Os três isolados e a ATCC 19606 de A. baumannii selecionados (54, 113, 808
e ATCC 19606) foram submetidos por 6 horas a concentrações sub-inibitórias (sub-
CIM) dos antibióticos isoladamente e em associação (Tabela 4). Foi incluído um
controle de cada isolado nas mesmas condições sem a presença do antimicrobiano.
A extração do RNA total foi realizada segundo protocolo descrito por Sambrook et al.
(2001), modificado. Brevemente, 2 mL da cultura crescida a 37°C por 6 horas em
caldo Mueller Hinton cátion ajustado (Sigma Aldrich), foi centrifugado e o sedimento
ressuspenso em Tiocianato de Guanidina. O RNA foi precipitado com isopropanol e
ressuspenso em H2O ultra pura livre de RNases. Posteriormente foi realizada a
purificação com DNAse (DNAse I – Sigma Aldrich) segundo normas do fabricante. O
RNA obtido foi quantificado em NanoDrop 2000 e a pureza e integridade conferida
em gel de agarose 1% preparado em água DEPC (Água Milli-Q tratada com
dietilpirocarbonato). A partir do RNA obtido foi realizada a síntese do cDNA para
52
utilização nos ensaios de RT-qPCR utilizando os primers descritos na tabela 5. A
elaboração do cDNA foi realizada utilizando a Enzima Transcriptase Reversa M-
MLVRT (200 U/uL) (Promega) e Randon Primer (0,5 ug/uL) (Promega), segundo
recomendações do fabricante.
Tabela 4. CIM dos isolados de Acinetobacter baumannii frente ao meropenem e colistina, e suc-CIMs utilizados para análise de tempo de morte e RT-qPCR.
Isolado MEROPENEM (µg/ml) COLISTINA (µg/ml)
CIM Sub-CIM CIM Sub-CIM
54 64 8 4 1 113 2 0,25 2 0,25 808 64 8 16 1
ATCC 19606 0,125 0,0625 2 0,5
Fonte: Autor, 2016; CIM: Concentração Inibitória Mínima; sub-CIM: Concentração Sub-inibitória mínima.
4.12 Determinação da expressão dos genes de virulência pela técnica de RT-
qPCR
Para a realização da RT-qPCR primers específicos para cada gene analisado
foram utilizados (tabela 5). Foram testados os genes gyrB e rpoB para ser utilizado
como gene de referência, no entanto o gene gyrB foi escolhido como gene de
referência para todas as reações de RT-qPCR uma vez que apresentou a menor
variabilidade entre as condições testadas. Reações sem Transcriptase Reversa
foram utilizadas como controles negativos, sendo consideradas negativas as
reações com dez ciclos de diferença das reações contendo a transcriptase. Curvas
de melting foram utilizadas para verificar a amplificação de um fragmento único. As
reações foram realizadas em triplicatas técnicas e duplicatas biológicas. O método
de expressão relativa foi utilizado para determinar os níveis de expressão do genes
e a análise dos dados foi realizada a partir do programa Applied Byossistem e a
análise estatística com o One Way ANOVA, seguido de teste de Dunnett, p < 0.05.
Os testes foram realizados utilizando o software GraphPad Prism 5.0.
53
Tabela 5. Primers utilizados nas reações de RT-qPCR para análise de expressão dos genes de
virulência csuE, bfmS, baeS, e do gene normalizador gyrB.
Gene Primer Sequência de primers (5’→ 3’) Amplicon (pb) Referências
csuE csuE_F
csuE_R
GCTTGGCTTTAGCAAACATGACC
ATTGCCATCAGGCCCGCTA
194 Luo et al., 2015
bfmS bfmS F
bfm_R
ACCGCCCGTAATCCGAAC
TGAACTTATTCCACCGCCTTTA
127 Luo et al., 2015
baeS baeS F
baeS R
CATTCTTTCGATGAACACACTCTCA
CTTCAAATGGTTGATATTCCGAAGG
133 Henry et al., 2015
gyrB gyrB_F gyrB_R
CGAGGGTGACTCAGCGGGTG
GCGCACGCTCAACGTTCAGG
101 Henry et al., 2015
rpoB rpoB F rpoB R
AGTCACGCGAAGTTGAAGGT AGCACGCTCAACACGAACTA
188 Henry et al., 2015
5 ASPECTOS ÉTICOS
Este projeto não necessitou ser submetido à análise pelo Comitê de Ética em
Pesquisas Envolvendo Seres Humanos do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Pernambuco – CEP/CCS/UFPE, uma vez que os isolados
utilizados neste estudo foram obtidos de ambiente hospitalar a partir demanda
espontânea de IRAS diretamente do laboratório de microbiologia, dos hospitais
fontes, sem nenhum contato com os pacientes ou prontuários médicos.
54
6 RESULTADOS
ARTIGO 1 –Submetido a Microbial Drug Resistance
Disseminação clonal e de genes de resistência e virulência em isolados de
Acinetobacter baumannii obtidos em hospitais de Recife – PE, Brasil
Introdução
Acinetobacter baumannii é um dos mais importantes patógenos
oportunistas, com uma alta incidência de infecções em pacientes
imunocomprometidos e responsável por surtos hospitalares, principalmente em
unidades de terapia intensivas (UTI) (HOWARD et al., 2012). A. baumannii é
classificado pela Sociedade Americana de Doenças Infecciosas (IDSA) como um
dos seis mais importantes patógenos multidroga-resistentes (MDR) distribuídos
em hospitais ao redor do mundo responsáveis por significativas taxas de
mortalidade e morbidade (TALBOT et al, 2006; BOUCHER et al., 2013,
ANTUNES, VISCA, TOWNER, 2014).
A capacidade em adquirir genes de resistência e permanecer em
ambientes inanimados são as principais características desse patógeno
nosocomial (VALI et al., 2015), colocando em risco procedimentos médicos como:
cirurgias, transplantes, e o tratamento de pacientes imunocomprometidos e
hematológicos (POTRON, POIREL, NORDMANN, 2015).
Isolados de A. baumannii com perfil MDR estão relacionados à grande
variedade de infecções nosocomiais (Infecções Relacionadas à Assistência a
Saúde (IRAS), incluindo bacteremias, infecção do trato urinário, meningite
secundária, infecções em queimaduras e feridas, infecções na pele e tecidos
moles, osteomielite, endocardite e pneumonia associada à ventilação mecânica.
Estas infecções são frequentemente relacionadas à dificuldade de tratamento,
devido a grande resistência dessa bactéria aos principais grupos de
antimicrobianos, tornando-se um desafio aos tratamentos antibióticos atuais
(BERGOGNE-BEREZIN, TOWNER, 1996; PELEG, SEIFERT, PATERSON, 2008;
ANTUNES, VISCA, TONER, 2014; BISWAS, 2015). A escassez de novas drogas
para tratamento de infecções por bactérias gram-negativas é um desafio para a
medicina moderna, onde Acinetobacter spp. apresenta-se como o microrganismo
mais evidente no paradigma da pan-resistência, particularmente A. baumannii
(EVANS, HAMOUDA, AMYES, 2013).
55
As terapias antimicrobianas indicadas para o tratamento de infecções por
isolados MDR de A. baumannii compreendem cefalosporinas de amplo espectro,
sulbactam inibidor de β-lactamase, quinolonas, carbapenêmicos, amicacina,
doxiciclina e minociclina; tigeciclina e colistina de forma isolada ou associada, no
entanto, existem relatos de resistência a todos os antimicrobianos disponíveis,
inclusive à colistina (VALI et al., 2015; MA et al., 2015; GALES et al., 2001). O
desafio no tratamento das infecções causadas por Acinetobacter spp. está
amplamente relacionado à produção de enzimas modificadoras de
aminoglicosídeos, ESBLs, carbapenemases, ou por mudanças nas proteínas de
membrana externa e proteínas ligadoras de penicilina (GALES et al., 2001).
Dentre os mecanismos de resistência mais comuns está a produção de β-
lactamases, principalmente as de classe D de Ambler (conhecidas como
oxacillinases ou β-lactamases do tipo OXA) nas espécies de Acinetobacter spp,
em particular em A. baumannii, causando resistência a carbapenêmicos que são
a primeira opção de tratamento em infecções causadas por isolados MDR desta
espécie bacteriana (LEE et al., 2012; NIGRO, HALL, 2016). A β-lactamase OXA-
51-like é uma enzima codificada cromossomicamente e intrínseca à espécie, com
mais 70 variantes já identificadas, mas que não proporciona um nível de
resistência clinicamente efetiva a carbapenêmicos, a não ser com a presença do
elemento de inserção ISAba1. (NIGRO, HALL, 2016).
Outras quatro famílias são amplamente encontradas em A. baumannii,
incluindo a OXA-23-like, OXA-40-like, OXA-58-like, OXA-143-like e OXA-235-like
adquiridos por elementos genéticos móveis (EVANS, HAMOUDA, AMYES, 2013;
NIGRO, HALL, 2016). A disseminação de resistência a antimicrobianos e sua
capacidade de permanecer em ambientes bióticos e abióticos por longo períodos
são problemas de grande importância em IRAS causadas por isolados de A.
baumannii (EIJKELKAMP et al., 2011; LONGO, VUOTTO, DONELLI, 2014; VALI
et al., 2015).
Além de diversos mecanismos de resistência encontrados em A. baumannii
vários fatores de virulência podem contribuir para evolução de infecções por esta
espécie bacteriana. A proteína A de membrana externa codificada pelo gene
ompA é uma porina trimérica relacionada ao transporte do soluto e virulência
bacteriana, além de participar da patogenicidade induzindo a apoptose,
56
imunomodulação, aderência e invasão celular das células do hospedeiro e
formação de biofilme (LIN, 2015).
A patogênese de A. baumannii é relacionada também à utilização de ferro,
um elemento essencial envolvido nas funções celulares básicas. A captação de
ferro é facilitada pela produção de sideróforos, como a acinetobactina, suprindo a
pouca disponibilidade de ferro e a disputa com as células do hospedeiro. O gene
basC codifica uma proteína envolvida na primeira etapa na biossíntese de
acinetobactina (HASAN, CHOI, OH, 2015).
Embora descrito como um patógeno sem mobilidade por não possuir
flagelo, isolados clínicos de A. baumannii tem apresentado um sistema de pili tipo
IV (TFP) o qual intercede na mobilidade espasmo (twitching), iniciando com a
montagem do TFP, ligação do pilus e retração do pilus, facilitando assim a
translocação da célula na direção do ponto de ligação (HARDING et al., 2013;
EIJKELKAMP et al., 2011, VIJAYKUMAR, BALAJI, BISWAS, 2015). O TFP
participa também de outros processos como: transferência horizontal, adesão à
célula do hospedeiro e formação de biofilme (PIEPENBRINK et AL., 2016).
Um dos fatores de virulência diretamente relacionados com a habilidade de
A. baumannii em permanecer em superfícies abióticas do ambiente hospitalar é a
formação de biofilme, facilitando a preservação da bactéria neste ambiente,
tornando-se assim uma ameaça para novos surtos por serem mais resistentes
aos mecanismos de defesa do hospedeiro e às terapias antimicrobianas
(ESPINAL, MARTI, VILA, 2012; RYU, BAEK, KIM, 2016; CHEN, 2015). Nas
etapas de formação de biofilme participam diversos genes, entre eles ompA, csuE
e pilA, envolvidos na formação do sistema pili (SELASI et al., 2016).
Isolados MDR de A. baumannii envolvidos em IRAS, continuam a
representar um grave problema de saúde pública, demandando pesquisas de
vigilância para o controle de surtos (BLANCO-LOBO et al., 2016). O aumento de
infecções nosocomiais causados por isolados MDR de A. baumannii e sua
resistência aos principais antimicrobianos torna imprescindível a rápida
identificação e controle de surtos. A técnica de PFGE é considerada “padrão ouro”
na tipagem epidemiológica (SEIFERT et al., 2005), auxiliando os dados
epidemiológicos (MAGALHÃES et al., 2005). Uma ferramenta poderosa para
discriminar subtipos de isolados bacterianos e na investigação epidemiológica em
infecções causadas por A. baumannii (CHANG et al., 2013).
57
O desafio encontrado no tratamento de infecções causadas por isolados
MDR de A. baumannii e o grande envolvimento desta espécie em casos de IRAS
em Recife-PE, Brasil, assim como em vários locais do mundo, demonstra a
importância na determinação da presença dos principais genes de resistência e
virulência encontrados em isolados de A. baumannii obtidos em hospitais públicos
de Recife. Este estudo visa a compreensão dos fatores que estão associados à
capacidade de A. baumannii em permanecer em ambiente hospitalar,
favorecendo sua disseminação e a epidemia causada por esse patógeno
oportunista, contribuindo para um melhor entendimento do controle de surtos
hospitalares.
Metodologia
Isolados bacterianos.
Neste estudo foram utilizados 37 isolados de A. baumannii com perfil
multidroga-resistente, obtidos de IRAS e por pesquisa de vigilância a partir de
pacientes internados em dois hospitais públicos da cidade do Recife-PE. Foram
utilizados 27 isolados obtidos do Hospital A nos anos de 2013 e 2014 e 10 a partir
do Hospital B no ano de 2014 (tabela 1). A determinação da espécie e o perfil de
susceptibilidade destes isolados a diferentes antimicrobianos foi determinado no
hospital de origem utilizando o sistema automatizado VITEK 2 (Biomérieux).
58
Tabela 1. Isolados de Acinetobacter baumannii utilizados neste estudo.
Isolado
Hosp.
Espécie
(VITEK®)
Isolamento
Setor do hospital
CIM (µg/mL) – VITEK®
MERO COL
45 A Comp. A. baumannii Ponta de cateter UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S)
113 A Comp. A. baumannii Ponta de cateter UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 119 A Comp. A. baumannii Sec. Traqueal UTI <0,25 (S) ≤0,5 (S) 123 A Comp. A. baumannii Ponta de cateter Enf. 7° andar ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 136 A Comp. A. baumannii Sec. Traqueal UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 165 A Comp. A. baumannii Escara UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 248 A Comp. A. baumannii Sec. Traqueal UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 253 A Comp. A. baumannii Swab nasal UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 281 A Comp. A. baumannii Swab nasal/pesq. vig. UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 322 A Comp. A. baumannii LCR USAN ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 325 A Comp. A. baumannii Sec. Traqueal USAN ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 349 A Comp. A. baumannii Sec. Traqueal UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 390 A Comp. A. baumannii Líquor USAN ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 468 A Comp. A. baumannii Swab retal/pesq. vig. UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 486 A Comp. A. baumannii Ferida operatória Enf. 5° andar ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 513 A Comp. A. baumannii Hemocultura UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 516 A Comp. A. baumannii Swab nasal/pesq. vig. UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 563 A Comp. A. baumannii Sec. Traqueal UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 578 A Comp. A. baumannii Hemocultura UTI pediátrica 0,5 (S) ≤0,5 (S) 781 A Comp. A. baumannii Swab nasal/pesq. vig. UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 799 A Comp. A. baumannii Sec. Traqueal UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 808 A Comp. A. baumannii LCR UTI pediátrica ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 829 A Comp. A. baumannii Sec. Região tórax UTQ Adulto ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 931 A Comp. A. baumannii Swab nasal/pesq. vig. UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 1000 A Comp. A. baumannii Líquor Enf. 5° andar ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 1188 A Comp. A. baumannii Ponta de cateter UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 4076 A Comp. A. baumannii NE NE >8 ND 24 B Comp. A. baumannii Partes moles Ambulatório ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 54 B Comp. A. baumannii Catéter UTI ≥ 16 (R) ≥ 16 (R) 55 B Comp. A. baumannii Catéter UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 60 B Comp. A. baumannii STB UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 298 B Comp. A. baumannii Sangue UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 307 B Comp. A. baumannii Urina UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 338 B Comp. A. baumannii Sec.
Traqueobrônquica UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S)
379 B Comp. A. baumannii Líq. cav.abdominal UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 412 B Comp. A. baumannii STB UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S) 570 B Comp. A. baumannii Sangue UTI ≥ 16 (R) ≤0,5 (S)
Sec: secreção; LCR: Líquido Cefalorraquidiano; USAN: Unidade de Suporte Avançado em
Neurocirurgia; UTI: Unidade de Terapia Intensiva; UTQ: Unidade de Terapia de Queimados; Enf:
enfermaria; Clín Vasc: clínica vascular; STB: Secreção traqueobrônquica; R: Resistente; S: Sensível;
ND: não determinado; NE: não especificado.
MALDI-TOF MS
A confirmação da identificação bacteriana dos isolados de A. baumannii foi
realizada através da técnica de Ionização/Dessorção de Matriz Assistida por
Laser – Tempo de Vôo/Espectrômetro de Massa (MALDI-TOF MS). A extração
59
das proteínas ribossomais foi realizada após cultivo bacteriano em ágar
MacConkey (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), segundo as recomendações do
fabricante (MALDI Biotyper® Protocol Guide Edition 2, 2014 BRUKER). Após o
processamento as amostras foram introduzidas no espectrômetro de massas
Microflex LT (Bruker Daltonics, Alemanha), e identificadas pelo MALDI Biotyper
RTC3. 3 (Bruker Daltonics, Alemanha).
Extração do DNA total
O DNA total dos isolados de A. baumannii foi obtido utilizando o Kit Wizard
Genomic DNA purification (Promega), segundo instruções do fabricante. O DNA
obtido foi quantificado e analisado quanto ao grau de pureza utilizando o
NanoDrop 2000.
Determinação da presença dos genes de virulência
A presença dos genes de virulência pilA, csuE, ompA e basC foi determinada
através da técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) utilizando os
primers descritos na tabela 2. As reações de PCR foram realizadas
individualmente para cada gene utilizando um volume total de 25μl por tubo,
compreendendo: 1μl de DNA genômico a 20ng/μl, 1U da enzima Taq DNA
polimerase (INVITROGEN), 0,5μl de cada desoxirribonucleotídeo trifosfato a 200
μM (GeHealthcare), 0,75 μl de MgCl2 a 1,5 mM, 1μl de cada primer a 15 pmol/μl,
além de 2,5 μl de tampão (10x). As amplificações foram realizadas em
termociclador (Biometra), utilizando a seguinte ciclagem: 5 minutos a 96ºC para
desnaturação, seguido de 35 ciclos consistindo cada ciclo de 1 minuto a 96ºC
para desnaturação, um minuto a 59ºC (gene pilA), 57ºC(gene csuE e ompA) e
58ºC (gene basC) para anelamento dos primers, acrescido de um minuto a 72ºC
para extensão. Após os 35 ciclos foi realizada uma etapa de alongamento final de
10 minutos a 72ºC.
60
Determinação da presença dos genes de resistência
A determinação dos genes de resistência foi realizada através de PCR
utilizando os primers descritos na tabela 2. A metodologia empregada nas
amplificações dos genes de resistência foi a mesma utilizada nas amplificações
dos genes de virulência, alterando apenas a temperatura de anelamento referente
a cada gene analisado, incluindo 59ºC para o gene blaOXA-51 like, 56ºC para o
blaOXA-23 like, 58 ºC para blaOXA-143 like, 54 ºC para blaIMP, 63ºC para o blaVIM, 66ºC
para o blaKPC, 63ºC para blaCTX-M e 62ºC para o ISAba1).
Tabela 2. Primers utilizados neste estudo para determinar por PCR a presença dos genes de resistência
e virulência presentes em isolados de A. baumannii.
Gene Nome do
Primer Sequência (5'- 3') Amplicon
(pb) Referências
basC
basC F
basC R
CATTCAGCGGAGTTTGCA
CGATTCAACTTCGCAGCT 405 DORSEY et al., (2004)
ompA
OmpAF
OmpAR
CAATTGTTATCTCTGGAG
ACCTTGAGTAGACAAACGA 952 TURTON et al. (2007)
pilA
pilAF
pilAR
GGCAATTGCGATTCCTGCTT
TGCAGCTGAACCATTAGCGA 138 Proposto neste estudo
csuE
CsuEF
CsuER
ATGCATGTTCTCTGGACTGATGTTGAC
CGACTTGTACCGTGACCGTATCTTGATAAG 580 TURTON et al. (2007)
blaOXA-51 like
OXA-51-like F
OXA-51-like R
TAATGCTTTGATCGGCCTTG TGGATTGCACTTCATCTTGG
353 WOODFORD et al.(2006)
blaOXA-23 like
OXA-23-like F
OXA-23-like R
GATCGGATTGGAGAACCAGA ATTTCTGACCGCATTTCCAT
501 WOODFORD et al.(2006)
blaOXA-143 like
OXA-143-like F
OXA-143-like R
TGGCACTTTCAGCAGTTCCT TAATCTTGAGGGGGCCAACC
149 HIGGINS, LEHMANN, SEIFERT,
(2010)
ISAba1
ISAba1a
ISAba1b
ATGCAGCGCTTCTTTGCAGG ATGATTGGTGACAATGAAG
389 MUGNIER et al., 2009
blaKPC
KPC 1F KPC R
GCTACACCTAGCTCCACCTTC TATTTTTCCGAGATGGGTGAC
371 MOLAND ( 2003); YIGIT et al.
(2001)
blaIMP
IMP-DIA-F IMP-DIA-R
GGAATAGAGTGGCTTAATTCTC GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT
364 DONG et al. (2008)
blaVIM
VIM-DIA-F VIM-DIA-R
CAGATTGCCGATGGTGTTTGG AGGTGGGCCATTCAGCCAGA
523 DONG et al. (2008)
blaCTX-M
CTX - MA1 CTX – MA2
SCSATGTGCAGYACCAGTAA CCGCRATATGRTTGGTGGTG
543 SALADIN et al., 2002
61
Eletroforese em gel de agarose
Para a visualização os amplicons foram submetidos a eletroforese em gel de
agarose a 1,5% e corados com 2μl de Blue green (LGC Biotecnology).
Sequenciamento de DNA
Os genes de resistência e virulência de isolados representativos foram
sequenciados (119, 113, 338, 570 e 808), utilizando os iniciadores descritos na
tabela 2. Para seqüenciamento os amplicons foram purificados utilizando o
PureLink PCR Micro Kit (Invitrogen), conforme instruções do fabricante.
O seqüenciamento dos produtos de PCR foi realizado com amostras de
DNA fita dupla, através do método de terminação de cadeia de
desoxirribonucleotídeo (SANGER; NICKLEN; COULSON, 1977). A análise das
seqüências de DNA e o alinhamento múltiplo foi realizada utilizando os programas
DNAstar e BLAST no National Center for Biotechnology Information website
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
As seqüências dos genes blaOXA-51 like, blaOXA-23 like, blaOXA-143 like, ISAba1,
csuE, ompA e BasC estão disponíveis no Genbank database.
Eletroforese em Campo Pulsátil (PFGE)
Os 37 isolados de A. baumannii foram submetidos à avaliação do
polimorfismo genético por PFGE, segundo o protocolo descrito Seifert et al., 2005,
utilizando a enzima de restrição ApaI (New England Biolabs, Inc). Os padrões do
gel de PFGE foram comparados visualmente de acordo com critérios
estabelecidos por Tenover et al. (1995). A comparação foi realizada utilizando-se
o coeficiente de similaridade de Dice e dendograma formado pelo método
UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean), com o software
BioNumerics versão 6.6, Applied Maths. Otimização: 0,8%, Tolerância 1,5%.
62
Resultados
Isolados Bacterianos
Todos os isolados do complexo A. baumannii utilizados neste trabalho
tiveram sua identificação confirmada em sua totalidade como pertencentes à
espécie A. baumannii através da técnica do Maldi-TOF e da verificação da
presença do gene blaOXA-51-like, gene intrínseco e naturalmente encontrado no
cromossomo dessa espécie bacteriana.
Eletroforese em Campo Pulsátil (PFGE)
A análise da similaridade genética dos isolados de A. baumannii inclusos
neste estudo foi realizada a partir da construção de um dendograma que permitiu
agrupá-los em 7 genótipos distintos, apresentando similaridade genética > 80%
aproximadamente, sendo denominados A (n=7), B (n=15), C (n=1), D (n=4), E
(n=2), F (n=7) e G (n=1) (Figura 1), onde os clusters A, B, D, E e F apresentaram
distintos subtipos.
Foi possivel observar que o subtipo B3, considerado como indistinguivel, foi
encontrado disperso no hospital A (duas amostras, isoladas em setores distintos)
e hospital B (um isolado).
63
Figura 1. Polimorfismo genético de isolados de A. baumannii de pacientes atendidos em 2 hospitais de Recife - PE, detectado através de eletroforese em campo pulsado (PFGE) após digestão do DNA cromossômico com endonuclease de restrição ApaI.
64
Determinação da presença e sequencia dos genes de resistência e
virulência
Todos os isolados de A. baumannii analisados apresentaram o gene de
resistência blaOXA-51-like. O gene blaOXA-23-like foi encontrado em apenas cinco
isolados (13,51%), obtidos em apenas um hospital estudado, a partir de sítios
corporais e setores hospitalares diferentes, tanto de IRAS como de colonização.
Particularmente, o gene blaOXA-143-like apresentou grande disseminação entre os
isolados analisados, estando presente em aproximadamente 73% dos isolados
obtidos em ambos hospitais, a partir de sítios corporais e setores hospitalares
diferentes, tanto de IRAS como de colonização. O elemento de inserção ISAba1
estava presente em aproximadamente 92% dos isolados obtidos nos dois
hospitais analisados. Os genes blaIMP, blaVIM, blaKPC e blaCTX-M não foram
detectados em nenhum isolado de A. baumannii. Todos os isolados apresentaram
os quatro genes de virulência pesquisados, incluindo pilA, csuE, ompA e basC,
com exceção do isolado 829 que não apresenta o gene csuE (Tabela 3). O
sequenciamento dos genes analisados nos isolados representativos confirmou a
amplificação de todos os genes de resistência e virulência analisados neste
estudo.
65
Tabela 3. Perfil de resistência e virulência dos isolados de Acinetobacter baumannii inclusos neste estudo.
Hospital Isolados Perfil de Resistência PFGE
β-lactamases Classe D e A
Metalo-β-lactamases
Genes de Virulência
blaOXA-51 blaOXA-
143 blaOXA-
23 blaKPC ISAba1 blaVIM blaIMP csuE ompA basC pilA
A 45 CTX, CPM, CAZ, CIP, GM, IMI, MEM, PRL B11 + + - - + - - + + + +
A 113 CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI,MEM, PRL B5 + - - - + - - + + + +
A 119 CFX, CFX/AX, MEM C + - - - - - - + + + +
A 123 CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, IMI, MEM B1 + - - - + - - + + + +
A 136 SAM, CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM, PRL
D2 + - + - + - - + + + +
A 165 AMO/AC, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL A + + - - + - - + + + +
A 248 CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL, MEM, PRL B9 + + - - + - - + + + +
A 253 CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM,
A1 + + - - + - - + + + +
A 281 SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL B2 + + - - + - - + + + +
A 322 CTX, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL, LEV, NFT
B6 + - - - + - - + + + +
A 325 CTX, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL, LEV, NFT
B6 + + - - + - - + + + +
A 349 SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, GM, IMI, MEM, PRL E + + + - + - - + + + +
A 390 SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL B3 + + - - + - - + + + +
A 468 SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL F + + - - + - - + + + +
A 486 CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL F2 + + - - + - - + + + +
A 513 CTX, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL, LEV, NFT F2 + - - - + - - + + + +
A 516 AK, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL B4 + + - - + - - + + + +
A 563 CTX, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL, IMI, LEV, NFT
F + + - - + - - + + + +
A 578 CTX B8 + - - - - - - + + + +
A 781 CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM
D + - + - + - - + + + +
A 799 SAM, CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM
D1 + - + - + - - + + + +
A 808 SAM, CPM, CAZ, CRO, CFX, XFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM
D2 + - + - + - - + + + +
66
A 829 CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, COL, IMI, LEV, NFT G + + - - + - - - + + +
A 931 AK, SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, MEM, PRL B10 + - - - - - - + + + +
A 1000 SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL B3 + + - - + - - + + + +
A 1188 SAM, CTX, CPM, CAZ, CIP, IMI, MEM, PRL F + + - - + - - + + + +
A 4076 AK, CTX, CPM, CRO, CIP, GM, IMI, LEV, MEM, PRL, TN, TS
A + + - - + - - + + + +
B 24 CPM, CAZ, CRO, CIP, GM, IMI, MEM A3 + + - - + - - + + + +
B 54 AK, SAM, CPM, CAZ, CRO, CIP, COL, GM, IMI, MEM
A3 + + - - + - - + + + +
B 55 CPM, CAZ, CRO, CIP, GM, IMI, MEM A2 + + - - + - - + + + +
B 60 CPM, CAZ, CRO, CIP, IMI, MEM B7 + + - - + - - + + + +
B 298 CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM
A3 + + - - + - - + + + +
B 307 CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, IMI, MEM F1 + + - - + - - + + + +
B 338 CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, IMI, MEM F1 + + - - + - - + + + +
B 379 AK, CPM, CAZ, CRO, CIP, GM, IMI, MEM E1 + + - - + - - + + + +
B 412 CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, IMI, MEM B + + - - + - - + + + +
B 570 SAM, CPM, CAZ, CRO, CFX, CFX/AX, CIP, GM, IMI, MEM
B3 + + - - + - - + + + +
IMI, Imipenem; MEM, Meropenem; CPM, Cefepima; CAZ, Ceftazidima; CTX, Cefotaxima; CRO, Ceftriaxona; AK, Amicacina; GM, Gentamicina; TN, Tobramicina; TS,
Trimetoprim-Sulfametoxazol; COL, Colistina; PRL, Piperaciclina; SAM, Ampicilina-Sulbactam; CIP, Ciprofloxacino; LEV, Levofloxacino; AMO/AC, Amoxicilina/Ácido
Clavulânico; CFX, Cefuroxima; CFX/AX, Cefuroxima/Axetil; NFT, Nitrofurantoína.
67
Discussão
O reconhecimento de A. baumannii como patógeno MDR capaz de sobreviver
em ambientes hostis por ser resistente à dessecação, vem sendo cada vez mais
consolidado cientificamente. Esta característica é ainda agravada pela habilidade
desta espécie bacteriana em acumular determinantes genéticos de resistência e
virulência, devido sua competência natural para aquisição de material genético,
possibilitando a permanência desse patógeno no ambiente hospitalar,
particularmente em UTIs, por serem ambientes favoráveis à surtos (EIJKELKAMP et
al., 2011; AGODI et al., 2014).
A dificuldade no controle da transmissão de isolados de A. baumannii MDR,
dentro e entre hospitais, tem se tornado um fardo para o monitoramento das
infecções causadas por esse patógeno (CHANG et al., 2013). Neste estudo, foi
possível detectar isolados, pertencentes a um mesmo genótipo, em setores
diferentes de um mesmo hospital, assim como, isolados indistinguíveis
geneticamente obtidos em estabelecimentos de saúde distintos, independente a que
sítio de infecção foram obtidos. Estes dados sugerem disseminação intra e inter-
hospitalar de isolados de A. baumannii com o mesmo padrão genético em Recife-
PE.
A disseminação inter-hospitalar de isolados de A. baumanni tem sido relatada
em outros estudos. No trabalho de Atrouni et al. (2016) isolados de A. baumannii
com padrão genetico indistinguível foram obtidos de unidades de saúde distintas,
indicando uma possível transmissão inter-hospitalar. Mahamat et al. (2016),
realizaram o primeiro estudo com dados clínicos e moleculares de isolados de A.
baumannii num hospital da Guiana Francesa, onde seis perfis de PFGE foram
encontrados, sugerindo uma disseminação clonal e possivelmente uma endemia de
A. baumannii resistente a carbapenêmicos na UTI desta instituição hospitalar.
O desafio no tratamento de infecções por A. baumannii é atribuído
principalmente à classe de enzimas oxacilinases, que possuem habilidade de
hidrolisar carbapenêmicos, com a transferência desses genes através de
transposons, possibilitando a predominância deste mecanismo de resistência em
isolados de A. baumannii assim como de Enterobacteriaceae (EVANS, AMYES,
2014). As enzimas OXA quando super expressas devido a presença do elemento de
inserção, ISAba1, um forte promotor transcricional, adquirem um potencial de
68
resistência a carbapenêmicos aumentado (TURTON et al., 2006; HOWARD et al.,
2012; VALI et al., 2015). No presente trabalho 94% dos isolados de A. baumannii
apresentaram o elemento de inserção ISAba1, encontrados tanto em isolados que
possuíam um único gene codificante de oxacilinase (blaOXA-51-like), como nos que
apresentavam também outros genes (blaOXA-143-like e/ou blaOXA-23-like).
Em nossos estudos, todos os isolados de A. baumannii apresentaram o gene
blaOXA-51-like, corroborando com a realização da detecção desse gene como
ferramenta auxiliar para a confirmação desta espécie bacteriana (HOWARD et al.,
2012, ELABD et al., 2015, AHMED et al., 2016). No entanto, o aparecimento de
plasmídeos carreando os genes ISAba1-blaOXA-51-like em Acinetobacter nosocomialis
colocam em dúvida a utilização da detecção do gene blaOXA-51-like como ferramenta
para diferenciar A. baumannii de outras espécies do complexo Acinetobacter
calcoaceticus-baumannii (LEE et al., 2012).
As β-lactamases de classe D (CHDLs) como OXA-23, OXA-24, OXA-58,
OXA-143 e OXA-235 estão relacionadas à resistência a carbapenêmicos, além das
carbapenemases de classe B e A (ATROUNI et al.,2016). Neste estudo, detectamos
a presença dos genes blaOXA-23-like e blaOXA-143-like, entre os isolados analisados, com o
gene blaOXA-143-like particularmente presente em mais de 70% dos isolados, obtidos
em ambos hospitais analisados, sendo encontrado também associado a mais um
gene codificante de oxacilinases com atividade carbapenemase, o blaOXA-23-like. Estes
dados demonstram uma grande disseminação de genes de resistencia entre os
isolados analisados, obtidos de diferentes setores e unidades hospitalares,
envolvidos com IRAS ou obtidos a partir de colonização.
Um dos principais fatores de virulência presentes na maioria dos isolados de
A. baumannii, é relacionado a capacidade de formar biofilme proporcionando uma
maior permanência dessa bactéria em ambientes hospitalares e resistência a
antibióticos, exigindo uma variedade de determinantes de virulência para sua
formação (LONGO, VUOTTO, DONELLI, 2014; THUMMEEPAK et al., 2016). A
presença dos genes csuC e csuE, que pertencem a loci bacteriano relacionado com
a secreção e montagem de pili, estão envolvidos no processo inicial que leva a
formação de biofilme em cepas ATCC 19606 de A. baumannii (TOMARAS et al.,
2003). No trabalho de Gurung et al. (2013), isolados de A. baumannii que
produziram biofilmes foram mais resistentes a antimicrobianos do que isolados não
produtores. No entanto, nos estudos de Espinal, Marti e Vila (2012), cepas
69
formadoras de biofilme foram menos resistentes a quase todos os antimicrobianos
do que as cepas que não formaram biofilme, sendo estas últimas resistentes à
piperacilina, ceftazidima, cefepima, ciprofloxacino, gentamicina e tobramicina. Os
isolados de A. baumannii deste trabalho, com exceção do isolado 829 apresentaram
o gene csuE, podendo serem envolvidos na constituição do sistema pili e
consequente na formação de biofilme, uma vez que a inativação do gene csuE
incapacita isolados bacterianos quanto a produção de pili, por conseguinte,
aderência celular e formação de biofilme (ESPINAL, MARTÍ, VILA, 2012).
A expressão de pili junto com a mobilidade “twitching” favorece a aderência
de A. baumannii a superfícies abióticas e na formação de biofilme mais
precocemente (LUO et al., 2015). O sistema de pili tipo IV é constituído por muitas
proteínas sendo rearranjadas como apêndices nas superfícies de muitas bactérias
gram-negativas. Inclui-se também o composto subunidade de pilina principal, pilA, e
de pilinas menores abundantes dentro do pilus (HARDING et al., 2013). Neste
estudo, todos os isolados de A. baumannii, apresentam o gene pilA, aumentando a
probabilidade de mobilidade deste patógeno, um fator adicional à patogenicidade
dessa espécie. Harding et al. (2013) observaram que a motilidade de superfície não
depende, necessariamente, dos produtos do genes envolvidos na formação do pili
tipo IV. Clemmer et al. (2012), observaram que a inativação de alguns genes
diminuíram a motilidade e, esses genes não faziam parte do sistema de pili tipo IV,
questionando a existência de um outro mecanismo.
Um dos fatores de virulência mais bem caracterizados em isolados de A.
baumannii é a proteína OmpA, a proteína de superfície mais abundante neste
patógeno estando envolvida em vários processos, incluindo indução a apoptose
celular, aderência e invasão à células epiteliais, auxilio à permanência e crescimento
do isolado em soro humano alem de contribuição para sobrevivência dos isolados de
A. baumannii através da formação de biofilme, podendo servir como alvo estratégico
para o combate à patogênese de A. baumannii (HOWARD et al., 2012;
MCCONNELL et al., 2013). Neste estudo todos os isolados de A. baumannii
apresentam o gene ompA.
A competência de isolados de A. baumannii para colonizar e invadir
hospedeiros humanos indicam que esses isolados conseguem adquirir elementos
essenciais, como o ferro, durante o processo de infecção (DORSEY et al., 2004). Na
escassez de ferro, as bactérias produzem e secretam quelantes altamente
70
específicos para o íon ferro, os sideróforos. Um dos sideróforos produzidos por A.
baumannii é a acinetobactina (MIHARA et al.,2004). Bactérias patogênicas,
geralmente, abrigam em seu genoma genes envolvidos na biossíntese e captação
de sideróforos, onde seus produtos são diretamente relacionados a virulência
dessas bactérias. No sistema de aquisição de ferro, a primeira etapa é a biossíntese
da acinetobactina, realizado pelas proteínas codificadas pelos genes basA, basB,
basC, basD, basF, basG, basH, basI, and basJ (EIJKELKAMP et al., 2011, HASAN,
CHOI, OH, 2015). Neste estudo, todos os isolados de A. baumannii possuem o gene
basC.
A grande maioria dos isolados apresentaram todos os genes de virulência
pesquisados com pelo menos dois genes de resistência relacionados à produção de
oxacilinases, além do elemento de inserção ISAba1. Apesar da similaridade genética
quantos aos genes de resistência e virulência analisados neste estudo, os isolados
obtidos em setores de isolamento diferentes a partir de colonização e sítios de
infecção diversos, puderam ser agrupados em sete clusters a partir dos padrões de
PFGE obtidos. Adicionalmente, foi possível identificar isolados geneticamente
indistinguíveis em diferentes setores do mesmo hospital, assim como em unidades
hospitalares diferentes, demonstrando uma ampla disseminação tanto de genes de
resistência e virulência entre ambientes e unidades hospitalares diferentes, como
também de isolados geneticamente indistinguíveis, carreando importantes genes de
resistência e virulência.
O controle de IRAS causadas por isolados de A. baumannii MDR é
relacionado a vigilância molecular local visando estabelecer conhecimento que
permita evitar a transferência de material genético entre patógenos endêmicos
(ELABD et al., 2015). Os resultados obtidos no presente estudo demonstram uma
ampla disseminação de genes de resistência e virulência entre isolados de A.
baumannii em Recife-PE, além de uma grande dispersão clonal destes isolados em
ambos hospitais analisados e em seus diferentes setores. Este trabalho ressalta a
importância do estudo epidemiológico de isolados de A. baumannii que são
responsáveis por IRAS, permitindo a avaliação quanto a disseminação desses
patógenos em unidades distintas, além do conhecimento dos mecanismos de
resistência e virulência presentes nesses isolados, possibilitando melhoria no
direcionamento da escolha terapêutica no combate à infecções causadas por A.
71
baumannii e do alerta aos setores de vigilância hospitalar para futuras políticas de
controle de infecções hospitalares mais rigorosas
Agradecimentos
Agradecemos a equipe do Laboratório ALERTA/UNIFESP pelo suporte na
execução das técnicas de MALDI-TOF MS e PFGE, além de ceder a cepa de
referência de Acinetobacter baumannii ATCC 19606. Agradecemos também ao
Núcleo de Plataformas Tecnológicas do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães –
CPqAM/Fiocruz pelo suporte na execução da técnica de sequenciamento.
Conflito de Interesses
Os autores declaram não ter conflito de interesses na execução do corrente
trabalho.
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77
ARTIGO 2 – Submetido a Journal of medical microbiology
Expressão de genes de virulência em isolados multidroga-resistentes de
Acinetobacter baumannii submetidos à colistina e meropenem
Introdução
Isolados de Acinetobacter baumannii possuem resistência intrínseca a várias
classes de antimicrobianos, com notável habilidade em adquirir vários determinantes
de resistência a antibióticos, tornando esta espécie um dos maiores desafios para o
êxito das terapias atuais (HENRY et al., 2015; DOI, MURRAY, PELEG, 2015). Com
a escassez de novas drogas para o tratamento de infecções causadas por bactérias
gram-negativas, as infecções causadas por A. baumannii multidroga resistente
(MDR) são de grande preocupação pela dificuldade no tratamento, além da
existência de relatos do crescimento de resistência em isolados de A. baumannii
extensamente resistentes a drogas (XDR) e pan-resistentes, principalmente em
unidades de terapia intensiva (LÓPEZ-ROJAS et al., 2011; HENRY et al., 2015;
LAISHRAM et al., 2016).
Com o passar dos anos o aumento da aquisição de mecanismos de
resistência à várias classes de antibióticos disponíveis por isolados de A. baumannii,
resultou na eliminação dos β-lactâmicos, fluoroquinolonas, tetraciclinas e
aminoglicosídeos, acarretando escassez de opções terapêuticas eficazes para o
tratamento de infecções causadas por A. baumannii. (BUSH, 2012; CAI et al., 2012;
EVANS, HAMOUDA, AMYES, 2013; LANNAN et al., 2016). Quando o tratamento
com carbapenêmicos e aminoglicosídeos não são eficazes, as polimixinas são a
opção terapêutica indicada, incluindo a polimixina B e a colistina (ZAVASCKI et al.,
2007; NATION, LIN, 2009; CHEAH et al., 2016 ), permanecendo como último
recurso para tratamento de infecções causadas por A. baumannii MDR (BISWAS et
al, 2012; OLAITAN, MORAND, MARCROLAIN, 2014). No entanto, a monoterapia
utilizando colistina pode levar ao rápido surgimento de resistência em patógenos
gram-negativos, incluindo A. baumannii (TAN; LI; NATION, 2007; HENRY et al.,
2015). Dentre várias recomendações e diretrizes mundiais quanto a esta situação,
vem sendo proposto o uso de combinações efetivas de antimicrobianos (BUSH et
al., 2011), possibilitando o uso associado de diferentes classes de antimicrobianos
incluindo meropenem e colistina (ZUSMAN et al., 2013; PAUL et al., 2014;
78
LENHARD et al., 2016). A recomendação do tratamento dessas infecções consiste
na utilização de uma dose farmacocineticamente otimizada de colistina com ou sem
uma segunda droga, geralmente um carbapenêmico, tigeciclina ou sulbactam (DOI,
MURRAY, PELEG, 2015).
Devido ao escasso número de antimicrobianos em última etapa de
desenvolvimento clínico, brevemente nenhuma opção terapêutica para tratamento
de infecções reincidivantes por diversos patógenos MDR, incluindo A. baumannii,
estará disponível (CHEAH et al., 2016).
Além da resistência a múltiplas classes de antimicrobianos isolados
bacterianos MDR podem apresentar fatores de virulência que possibilitam a sua
sobrevivência mesmo quando submetidas ao tratamento com antimicrobianos. Já
tem sido descrito na literatura vários fatores de virulência em isolados de A.
baumannii, entre eles, aumento da capacidade de formação de biofilme em
superfícies abióticas, motilidade, captação de elementos genéticos móveis,
tolerância à dessecação, sobrevivência por longos períodos de tempo em
superfícies e equipamentos hospitalares e proteção ao estresse à cápsula
polissacarídica (EIJKELKAMP et al., 2011; ESPINAL, MARTÌ, VILA, 2012; EVANS,
HAMOUDA, AMYES, 2013; ALIRAMEZANI et al., 2016).
A formação de biofilme é um dos mais importantes fatores de virulência para
as bactérias. O biofilme é constituído por uma matrix polimérica que envolve as
bactérias e está associado com a sobrevivência, virulência e comunicação
bacteriana, contribuindo para sua proteção em ambientes hostis durante infecção ao
hospedeiro e também possibilitando sua permanência em superfícies abióticas
(ESPINAL, MARTÌ, VILA, 2012; LUO et al., 2015). Funciona também como um
mecanismo de evasão das bactérias à resposta imune do hospedeiro (BREIJ et al.,
2009). Em A. baumannii, o estágio inicial para a formação de biofilme em superfícies
abióticas depende da formação do pili, codificado pelo complexo de proteínas
chaperonas csuA/BABCDE, controlado pelo sistema regulatório de dois
componentes codificados pelos genes bfmS e bfmR, onde a expressão do operon
csu e a expressão dos genes csuC e csuE estão envolvidos na aderência inicial à
superfícies durante a formação de biofilme (LUO et al., 2015; LANNAN et al, 2016).
O estudo de Liou et al. (2014) foi o primeiro a demonstrar que a inativação do gene
bfmS na cepa ATCC 17978 de A. baumannii resultou na formação deficiente de
79
biofilme em superfícies abióticas, na redução de aderência à células eucarióticas e
na sensibilização à morte sérica.
Com habilidade para se proteger dos fatores de agressão externos como:
variações de temperatura, pH, osmolaridade, exposição a compostos tóxicos e
estresse oxidativo, as bactérias gram-negativas impulsionam o desenvolvimento de
mecanismos de resposta a esses estímulos através do sistema de regulação
BaeSR, facilitando mudanças na expressão gênica (LEBLANC et al., 2011). Sua
principal função é a super expressão da bomba de efluxo em resposta a agentes
que danificam o envelope bacteriano (LEBLANC et al., 2011; LIN et al., 2015).
Considerando que a eficácia de um ou de uma combinação de agentes
antimicrobianos é relacionada não só a sua atividade bactericida ou bacteriostática
mas também ao impacto na expressão da virulência bacteriana e assim na fase
inicial e de manutenção da infecção, o presente estudo verificou a expressão dos
genes baeS, bfmS e csuE quando submetidos ao tratamento in vitro com
meropenem e colistina isoladamente e em combinação.
METODOLOGIA
Isolados bacterianos
Os isolados de A. baumannii analisados neste estudo foram selecionados
quanto aos seguintes critérios: pertencerem a perfis genéticos distintos (PFGE),
presença de um ou mais genes de resistência para β-lactamases; presença do
elemento de inserção ISAba1; e presença dos genes de virulência csuE, baeS e
bfmS. Três isolados foram então selecionados, os quais foram obtidos por demanda
espontânea de dois hospitais públicos da cidade de Recife/PE, nos anos de 2013 e
2014 (Dados não publicados).
Tabela 1. Perfil de resistência e virulência dos isolados de A. baumannii analisados deste estudo.
Isolado Hospital PFGE Virulência Resistência
54 B A3 csuE, ompA, basC, pilA, baeS, bfmS blaOXA-51-like, blaOXA-143-like, ISAba1
113 A B5 csuE, ompA, basC, pilA, baeS, bfmS blaOXA-51-like, ISAba1
80
808 A D2 csuE, ompA, basC, pilA, baeS, bfmS blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, ISAba1
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
As concentrações inibitórias mínimas (CIM) dos isolados bacterianos de A.
baumannii para o meropenem e a colistina foram determinadas pelo teste de
microdiluição em caldo, utilizando caldo Mueller-Hinton cátion ajustado, utilizando a
cepa de referencia ATCC 25922 de Escherichia coli como controle de qualidade,
segundo recomendações e critérios interpretativos do CLSI, 2013.
Extração de RNA e síntese de cDNA
Três isolados selvagens e a cepa ATCC 19606 de A. baumannii foram
submetidos a sub-CIMs de meropenem e colistina, isoladamente e em associação,
por 6 horas, de acordo com a CIM apresentado por cada isolado bacteriano (tabela
2). Cada experimento tinha um controle de cada isolado nas mesmas condições sem
a presença dos antimicrobianos. O RNA total foi extraído segundo protocolo descrito
por Sambrook; Russell, 2001. A concentração do RNA foi determinada em Nanodrop
2000 e a integridade e pureza por eletroforese em gel de agarose 1%. O RNA
extraído foi tratado com DNAse (SIGMA ALDRICH) segundo instruções do
fabricante. A síntese do cDNA foi realizada utilizando a enzima Transcriptase
Reversa M-MLVRT (200 U/µl) (PROMEGA) e Randon Primer (0,5 ug/µl)
(PROMEGA), segundo instruções do fabricante.
Tabela 2 – CIM, Sub-CIM e expressão dos genes de virulência, csuE, bfmS e baeS em isolados de Acinetobacter baumannii
Isolados
Meropenem Colistina Associação
CIM SC Expressão
MIC SM Expressão Expressão
csuE bfmS baeS csuE bfmS baeS csuE bfmS baeS
808 64 8 -0,6 NI 1,27 16 1 NI NI 6,9 3,7 NI 2,14
54 64 8 NI NI NI 4 1 0,75 5,33 3,1 NI NI 1,96
113 2 0,25 -1,3 4,4 NI 2 0,25 NI 9,6 NI NI 2,6 0,9
ATCC 19606 0,125 0,0625 -0,59 NI NI 2 0,5 NI NI NI 3,2 4,13 NI
Fonte: Autor, 2016; CIM: Concentração Inibitória Mínima; SC: Sub-CIM; NI: Não interferiu
siginficativamente.
81
Determinação da expressão dos genes de virulência pela técnica de RT-qPCR
As reações de RT-qPCR foram realizadas utilizando o SYBR Green RT-PCR
Kit (Applied Biosystems) utilizando primers específicos para cada gene alvo
analisado, incluindo o csuE, bfmS e baeS (tabela 3). O gene gyrB foi escolhido como
gene de referência para todas as reações de RT-qPCR uma vez que apresentou a
menor variabilidade entre as condições testadas. Reações sem Transcriptase
Reversa foram utilizadas como controles negativos, sendo consideradas negativas
as reações com dez ciclos de diferença das reações contendo a Transcriptase. As
curvas de melting foram utilizadas para verificar a amplificação de um fragmento
único. As reações foram realizadas em triplicatas técnicas e duplicatas biológicas. O
método de expressão relativa foi utilizado para determinar os níveis de expressão do
genes e a análise dos dados foi realizada a partir do programa Series Rotorgene Q.
software 1.7 e a análise estatística com o One Way ANOVA, seguido de teste de
Dunnett com p < 0.05. Os testes foram realizados utilizando o software GraphPad
Prism 5.0.
Tabela 3. Primers utilizados nas reações de RT-qPCR para análise de expressão dos genes de
virulência csuE, bfmS, baeS, e do gene normalizador gyrB.
Gene Primer Sequência de primers (5’→ 3’) Amplicon (pb) Referências
csuE csuE_F
csuE_R
GCTTGGCTTTAGCAAACATGACC
ATTGCCATCAGGCCCGCTA
194 Luo et al., 2015
bfmS bfmS F
bfm_R
ACCGCCCGTAATCCGAAC
TGAACTTATTCCACCGCCTTTA
127 Luo et al., 2015
baeS baeS F
baeS R
CATTCTTTCGATGAACACACTCTCA
CTTCAAATGGTTGATATTCCGAAGG
133 Henry et al., 2015
gyrB gyrB_F gyrB_R
CGAGGGTGACTCAGCGGGTG
GCGCACGCTCAACGTTCAGG
101 Henry et al., 2015
rpoB rpoB F rpoB R
AGTCACGCGAAGTTGAAGGT AGCACGCTCAACACGAACTA
188 Henry et al., 2015
82
RESULTADOS
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Os isolados analisados 54 e 808 apresentaram resistência ao meropenem,
enquanto o isolado 113 foi sensível a este antimicrobiano. Em relação à colistina, o
isolado 113 apresentou-se sensível, no entanto, os isolados 54 e 808
apresentaram-se resistentes. A cepa de referência ATCC 19606 de A. baumannii
apresentou sensibilidade ao meropenem e a colistina com MIC correspondente ao
intervalo proposto pelo CLSI, 2016 (tabela 3).
83
Efeito dos antimicrobianos na expressão do gene bfmS
O meropenem não interferiu na expressão do gene bfmS nos dois isolados
resistentes (54 e 808) e na cepa ATCC 19606 sensível a este antimicrobiano. No
entanto, no isolado sensível (113) aumentou 4,4 vezes a expressão deste gene de
virulência em relação ao controle (Figura 1). A colistina aumentou em 5,33 e 9,6
vezes a expressão do gene bfmS nos isolados 54 (resistente) e 113 (sensível) de A.
baumannii, respectivamente. A colistina não interferiu na expressão do gene bfmS
na cepa ATCC 19606 e no isolado 808 resistente à colistina.
A associação do meropenem e colistina aumentou a expressão do gene bfmS
nos isolados sensíveis 113 e ATCC 19606, em 2,6 e 4,13 vezes, respectivamente.
Este tratamento, no entanto, não interferiu na expressão do gene bfmS nos isolados
resistentes 808 e 54.
Figura 1. Expressão relativa do gene bfmS após submissão aos antimicrobianos
meropenem, colistina e associação de meropenem e colistina.
Fonte: Autor, 2017. Nota: Associação: meropenem + colistina. A expressão relativa foi normalizada com o gene gyr B. As barras representam Média ± DP. Asterisco representa significância estatística
de p < 0.05.
84
Efeito dos antimicrobianos na expressão do gene baeS
O tratamento com meropenem não interferiu na expressão do gene baeS nos
isolados sensíveis e em um dos isolados resistentes a este antimicrobiano (54). No
entanto, o aumento de 1,27 vezes na expressão do gene baeS foi observado no
isolado resistente 808. O tratamento com a colistina induziu um aumento na
expressão do gene baeS nos isolados resistentes a esse antimicrobiano, ocorrendo
aumento de 6,9 vezes no isolado 808 e 3,1 vezes no isolado 54 em relação ao
grupo controle, não sendo, no entanto, observada alteração na expressão deste
gene nos isolados sensíveis a esse antimicrobiano (isolado 113 e cepa ATCC
19606). Quando submetidos à associação dos antimicrobianos meropenem e
colistina os isolados 808, 54 e a ATCC 19606 apresentaram aumento da expressão
do gene baeS, de 2,14, 1,96 e 0,9 vezes em relação ao grupo controle,
respectivamente. A associação dos antimicrobianos não alterou a expressão do
gene baeS em apenas um isolado analisado (113).
Figura 2. Expressão relativa do gene baeS após submissão aos antimicrobianos
meropenem, colistina e associação de meropenem e colistina.
Fonte: Autor, 2017. Nota: Associação: meropenem + colistina. A expressão relativa foi normalizada com o gene gyr B. As barras representam Média ± DP. Asterisco representa significância estatística de p < 0.05.
85
Efeito dos antimicrobianos na expressão do gene csuE
A submissão dos isolados ao meropenem diminuiu a expressão do gene csuE
em 0,6, 1,3 e 0,59 vezes nos isolados 808, 113 e ATCC 19606, respectivamente,
não interferindo no entanto, em um dos isolados resistentes (54). A colistina induziu
um aumento na expressão do gene csuE de 0,75 vezes em um dos isolados
resistentes a este antimicrobiano (54), não alterando significativamente, no entanto,
a expressão deste gene de virulência nos demais isolados analisados. Quando
submetidos ao tratamento com associação (mero+col), observou-se um aumento de
3,7 vezes na expressão do gene csuE no isolado 808 e 3,2 vezes na cepa ATCC
19606, mantendo-se inalterada a expressão deste gene de virulência nos demais
isolados analisados.
Figura 3. Expressão relativa do gene csuE após submissão aos antimicrobianos
meropenem, colistina e associação de meropenem e colistina.
Fonte: Autor, 2017. Nota: Associação: meropenem + colistina. A expressão relativa foi normalizada com o gene gyrB. As barras representam Média ± DP. Asterisco representa significância estatística de p < 0.05.
86
DISCUSSÃO
As infecções bacterianas são uma das principais causas de morte em todo o
mundo e a diminuição de opções terapêuticas aumenta os riscos associados aos
cuidados de saúde básicos e cirurgias (KROGER et al., 2017). A emergência
contínua de microrganismos fenotipicamente resistentes a múltiplos antimicrobianos
traz um fardo econômico importante, levando a necessidade da introdução de novos
antimicrobianos no mercado ou de novas estratégias terapêuticas, incluindo o uso
associado de antimicrobianos.
A eficácia clínica de um agente antimicrobiano é, no entanto, relacionada não
só a atividade antimicrobiana, mas também ao impacto de seu uso na expressão da
virulência bacteriana (STEVENS et al., 2007). Vários trabalhos vem demonstrando
alterações na expressão de genes de virulência importantes em espécies
bacterianas gram-positivas e gram-negativas de importância médica, incluindo
isolados de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium e
Acinetobacter baumannii, quando submetidos a diferentes antimicrobianos utilizados
clinicamente (YUHAN et al., 2016; CARDOSO et al., 2016; REITER; LAMAS et al.,
2016; SAN’ANNA; D’AZEVEDO, 2014; OTTO et al., 2013), o que pode resultar na
alteração da patogênese bacteriana e consequentemente no agravamento ou
atenuação do processo infeccioso (CARDOSO et al., 2016; STEVENS et al., 2007).
Neste estudo três isolados clínicos e a ATCC 19606 de A. baumannii foram
analisados quanto à expressão dos genes de virulência csuE, bfmS e baeS, quando
submetidos a antimicrobianos de última escolha para tratamento de IRAS causadas
por isolados MDR, incluindo meropenem, colistina e a associação destes
antimicrobianos. Em nossas análises apenas o tratamento com meropenem foi
capaz de diminuir a expressão de apenas um dos genes de virulência analisados, o
csuE. A família de genes csuA/BABCDE codificam proteínas chaperonas envolvidas
no sistema de secreção para produção e montagem do pili bacteriano, o que
contribui para aumento de adesão bacteriana em superfícies bióticas e abióticas e
também nas etapas iniciais da formação de biofilme (EIJKELKAMP et al., 2011;
AZIZI et al., 2016). A diminuição da expressão do gene csuE, devido o tratamento
único com meropenem em isolados de A. baumannii, sugere modulação deste gene
de virulência nos isolados analisados, o que poderia contribuir diminuindo o poder de
87
adesão bacteriana, e consequentemente, nas etapas iniciais do processo infeccioso
e formação de biofilme. No entanto, a modulação deste gene de virulência não foi
observada no uso associado do meropenem e colistina.
O tratamento de IRAS causadas por isolados MDR de A. baumannii
resistentes a carbapenêmicos é comumente conduzido pelo uso associado de
agentes antimicrobianos, incluindo um carbapenêmico e uma polimixina. O uso do
meropenem e da colistina vem sendo recomendado em alguns estudos, devido à
evidencias de sinergia na atividade antimicrobiana dos agentes utilizados
associadamente (CAI et al., 2012; ZUSMAN et al., 2013; LENHARD; NATION;
TSUJI, 2016). Neste estudo a submissão dos isolados à colistina, meropenem e a
associação destes agentes antimicrobianos foi capaz de modificar a expressão dos
três genes de virulência estudados em relação ao controle, apresentando uma
tendência ao aumento da expressão dos genes estudados.
O sistema de dois componentes é um sistema de transdução de sinal muito
importante para adaptação a mudanças drásticas e imediatas em condições
ambientais externas ou internas bacterianas (SUN et al., 2012). O BfmRS é um
sistema de dois componentes (TCS) encontrado em isolados de A. baumannii que
controla a formação de biofilme e a morfologia celular. Através da regulação de
transcrição, ativa a expressão do sistema de montagem das chaperonas
responsáveis pela produção de pili necessários para a formação de biofilme (LUO et
al., 2015). Além de contribuir para a virulência bacteriana, o sistema BfmRS parece
também estar envolvido com a resistência bacteriana, onde a inativação do bfmS
poderia alterar os MICs para diferentes antimicrobianos, incluindo a ciprofloxacina e
o imipenem (LIOU et al., 2014). Neste estudo, o tratamento com colistina,
meropenem e sua associação foi relacionada ao aumento da expressão do gene
bfmS na maioria dos isolados analisados, o que pode estar relacionado a
modificações bacterianas resultantes das alterações ambientais promovidas pela
presença dos antimicrobianos, podendo alterar a resistência e a virulência
bacteriana.
Semelhante ao BfmRS, o TCS BaeSR pode detectar sinais ambientais e
assim responder alterando o envoltório bacteriano respondendo não só ao estresse
osmótico elevado mas também influenciando a susceptibilidade à antimicrobianos,
como a tigeciclina em isolados de A. baumannii, através da regulação positiva dos
genes da bomba de efluxo RND adeA e adeB, contribuindo também na eliminação
88
de outros produtos químicos (LIN;LIN;LAN, 2015). A expressão do gene baeS foi
significativamente aumentada na maioria dos isolados analisados quando
submetidos à colistina e à associação dos antimicrobianos. O aumento da expressão
do gene baeS foi anteriormente relatado em estudo recente, realizado por Henry et
al., 2015, onde os autores puderam relacionar ao aumento da expressão deste gene
de virulência ao tratamento com a colistina, o que estaria relacionado ao aumento
simultâneo da expressão de bombas de efluxo MacAB-TolC, MexB e AdeIJK, as
quais provavelmente estão sob controle e regulação do sistema BaeSR.
A colistina é o antimicrobiano mais eficiente no tratamento de A. baumannii
MDR in vivo, tem sido reintroduzido para tratamento de A. baumannii resistente a
carbapenêmico (CAI et al., 2012; VELKOV et al., 2013; GIRARDELLO et al., 2017).
Apesar da atividade sinérgica de carbapenêmicos e polimixinas ter sido
demonstrada em diferentes estudos in vitro (CAI et al., 2012; NI et al., 2015; VOURLI
et al., 2015; FAN et al., 2016), a associação do meropenem e colistina neste estudo
não foi relacionada à diminuição de expressão dos genes de virulência analisados
em isolados resistentes ou sensíveis a estes antimicrobianos.
Com a realização deste estudo pode-se demonstrar uma tendência ao
aumento da expressão dos genes de virulência csuE, bfmS e baeS após tratamento
in vitro com o meropenem, colistina e associação em isolados resistentes e
sensíveis a estes antimicrobianos, reforçando a necessidade de vigilância quanto ao
tratamento de IRAS causados por A. baumnannii MDR mesmo em uso associado de
antimicrobianos.
89
7 CONCLUSÕES
Todos os isolados bacterianos do estudo foram identificados como A.
baumannii, distribuídos em sete padrões genéticos distintos. Ainda,
constatou-se que três isolados foram geneticamente relacionados
apresentando similaridade de 100%. Estes isolados pertenciam a hospitais
diferentes, sugerindo a existência de disseminação inter-hospitalar.
A grande maioria do isolados de A. baumannii apresentaram os gene de
resistência blaOXA-51-like, blaOXA-143-like e o elemento de inserção ISAba1. Além
desses, o blaOXA-23-like foi encontrado em apenas cinco isolados. Também
pode-se observar na grande maioria dos isolados a presença dos genes de
virulência basC, csuE, ompA e pilA. Dessa forma, pode-se constatar uma
grande disseminação de genes de resistência e virulência nos isolados de A.
baumannii oriundos de dois públicos do Recife/PE.
O tratamento in vitro com meropenem, colistina e associação destes
antimicrobianos foi relacionado à modificação da expressão dos genes de
virulência csuE, bfmS e baeS, com tendencia ao aumento da expressão dos
mesmos, reforçando a necessidade de vigilância quanto ao tratamento de
Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde causadas por A. baumannii
multidroga-resistente, mesmo em uso associado de antimicrobianos.
90
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103
APÊNDICE A – Artigo 1 submetido a Microbial Drug Resistance
Clonal dissemination of resistance and virulence genes in isolates of Acinetobacter
baumannii from hospitals in Recife, Pernambuco, Brazil
Carmelita de Lima Bezerra Cavalcanti1,2, Dyana Leal Veras3, Ana Paula Sampaio
Feitosa1,3, Eduarda Vanessa Cavalcante Mangueira4, Wagner Luís Mendes de
Oliveira5, Fernanda Cristina Gomes de Lima2, Ana Carolina Ramos7, Ana Cristina
Gales7, Luiz Carlos Alves1,3,6, Fábio André Brayner1,2,3
1Laboratory of Immunopathology Keizo Asami - UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, 1235,
City University, Recife-PE, Brazil.
2Program of Graduate in Tropical Medicine – UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, 1235,
City University, Recife-PE, Brazil.
3Aggeu Magalhães Research Center - FIOCRUZ, Av. Prof. Moraes Rego, City
University, Recife-PE, Brazil.
4Central Laboratory of Public Health - LACEN PE, Street João Fernandes Viêira -
Boa Vista, Recife-PE, Brazil.
5Laboratory of Immunomodulation and New Therapeutic Approaches - UFPE, City
University, Recife-PE, Brazil.
6Universidade de Pernambuco - UPE, Av. Governador Agamenon Magalhães, Santo
Amaro, Recife-PE, Brazil.
7Laboratory Alert - Division of Infectious Diseases - Federal University of São Paulo –
UNIFESP, São Paulo-SP, Brazil.
Corresponding author: Carmelita de Lima Bezerra Cavalcanti;
Address: Av. Professor Morais Rego S/N, Cidade Universitária, Recife-PE, Phone:
+55 81 2101-2643 / +55 81 2101-2687.
Abstract
The aim of this study was to investigate clonal dissemination of resistance and
virulence genes in isolates of A. baumannii from two public hospitals in Recife,
Pernambuco, Brazil. For this, 37 multidrug-resistant (MDR) isolates of the A.
baumannii complex were obtained in these hospitals, from healthcare-associated
104
infection (HAI) and through colonization. Molecular typing was done through PFGE.
The resistance genes (blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, blaOXA-143-like, blaIMP, blaVIM, blaKPC and
blaCTX-M), the insertion element ISAba1 and the virulence genes (basC, ompA, pilA
and csuE) were detected using the PCR and were confirmed through sequencing.
Seven PFGE patterns were identified among the A. baumannii isolates analyzed, and
three isolates found in both hospitals presented 100% similarity. The majority of the
isolates presented all of the virulence genes investigated, with at least two resistance
genes relating to β-lactamase production, along with the insertion element ISAba1.
The gene blaOXA-143-like was particularly present, in more than 70% of the isolates from
both of the hospitals. The results from this study showed that resistance and
virulence genes were widely disseminated in isolates of A. baumannii from these
hospitals, with clonal dispersion at both hospitals and in their different sectors.
105
APÊNDICE B – Artigo 2 submetido a Journal of Medical Microbiology article
Expression of virulence genes in multidrug-resistant isolates of Acinetobacter
baumannii subjected to colistin and meropenem
Carmelita L. B. Cavalcanti1,2,3, Dyana L. Veras3, Ana Paula S. Feitosa1,3, Eduarda V.
C. Mangueira4, Fernanda C. G. Lima2,3, Catarina F. Freitas2,3, Luiz C. Alves1,3,5,
Fábio A. Brayner1,2,3
1Laboratory of Immunopathology Keizo Asami - UFPE, Morais Rego Avenue,
University City, Recife – PE, Brazil.
2Program of Graduate in Tropical Medicine - UFPE, Morais Rego Avenue, University
City, Recife – PE, Brazil.
3Aggeu Magalhães Research Center - FIOCRUZ, Morais Rego Avenue, University
City, Recife – PE, Brazil.
4Central Laboratory of Public Health - LACEN PE, João Fernandes Vieira Street,
Recife – PE, Brazil.
5University of Pernambuco – UPE, Arnóbio Marques, Santo Amaro, Recife – PE,
Brazil.
Correspondence address
Carmelita L. B. Cavalcanti
+ 55 81 2101- 2643/2101-2687
Abstract
The challenge in treating infections caused by isolates of Acinetobacter
baumannii is partly due to their capacity to express different virulence factors and to
acquire mechanisms for resistance to various classes of antimicrobial agents. This
has led to a search for new treatments, including combined use of these agents.
Because combined use of colistin and meropenem has been indicated as an option
for treating infections caused by multidrug-resistant isolates of A. baumannii, the
objective of this study was to determine the in vitro influence of colistin and
106
meropenem separately and in combination, on the expression of the virulence genes
baeS, bfmS and csuE in A. baumannii isolates. Three multidrug-resistant clinical
isolates and the ATCC 19606 isolate of A. baumannii were used. Only meropenem
was capable of diminishing the expression of one of the virulence genes (csuE).
However, when meropenem was used in association with colistin, there was no
modulation of the expression of this virulence gene. Our results showed a tendency
towards increased expression of the virulence genes csuE, bfmS and baeS after in
vitro treatment of both resistant and sensitive A. baumannii isolates, with colistin and
meropenem separately and in combination. These results emphasize the need for
vigilance regarding treatment of healthcare-associated infection caused by multidrug-
resistant A. baumannii, even when these two antimicrobial agents are used in
combination.
107
ANEXO A – Comprovante de submissão à revista Microbial Drug Resistance
108
APÊNDICE B – Artigo 2 submetido a Journal of Medical Microbiology article