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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Dissertação
TRANSPOSONS E RETROTRANSPOSONS COMO MARCADORES MOLECULARES EM PLANTAS
Gabriela Guerra dos Santos
Pelotas, 2013
Gabriela Guerra dos Santos
TRANSPOSONS E RETROTRANSPOSONS COMO MARCADORES MOLECULARES EM PLANTAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento: Biotecnologia Vegetal).
Orientador: Antônio Costa de Oliveira, PhD.
Co-orientador: Luciano Carlos da Maia, Dr.
Pelotas, 2013
Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901 Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
S237t Santos, Gabriela Guerra dos
Transposons e retrotransposons como marcadores mole-culares em plantas / Gabriela Guerra dos Santos. – 61f. – Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Bi-otecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Centro de De-senvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2013. – Orientador An-tônio Costa de Oliveira. Co-orientador Luciano Carlos da Mai-a.
1.Biotecnologia. 2.Elementos transponivéis. 3.Arroz. 4.Oryza sativa L. 5.Tos 17. 6.Marcador molecular. I.Oliveira, Antônio Costa de. II Maia, Luciano Carlos da. III Título.
CDD: 633.18
Banca examinadora:
Antônio Costa de Oliveira, Ph.D. – FAEM/UFPel – ORIENTADOR (PRESIDENTE)
Beatriz Helena Gomes Rocha, Dr. – DEZG/IB/UFPel
Naciele Marini, Dra.- FAEM/UFPel
Juliana Castelo Branco Villela, Dra.- Embrapa Clima Temperado
Á m inha avó Iracem a (in m em oriam ), a quem dedicou sua vida por m im ,
DDDD edicoedicoedicoedico
AGRADECIMENTOS
Á Deus agradeço pelo dom da vida e pela saúde para poder trabalhar e estudar,
Aos meus professores Antônio e Luciano, pela confiança, pela oportunidade, pelo aprendizado e amizade. Serei sempre grata á vocês dois por tudo que me proporcionaram nestes dois anos de mestrado,
Aos meus pais Mariluci e Wladimyr, e meu irmão Rodrigo, que do jeitinho deles, sempre me apoiaram e compartilharam momentos tão importantes na minha vida, obrigada por terem me dado essa oportunidade de estudar e de ter uma vida melhor,
Ao meu amado Xandi, por ser meu grande parceiro na vida, pelo amor, respeito e confiança em mim, por me aguentar falando de tranposons quase todos os dias e por me acalmar e ajudar quando foi necessário,
Á minha querida avó, que ano passado me deixou nesse plano, porém sei que ganhei mais uma estrela no céu iluminando meu caminho,
Ás minhas tias, pelo carinho e por sempre acreditarem em mim e me amar, independente das nossas controvérsias,
Á Juliana Castelo Branco Villela, pela carta de recomendação, pela confiança, pelas palavras e pela amizade, além do conhecimento científico. Obrigada Ju!!
Á minha amiga Carla Sigales, que conheci nesta jornada, com certeza é uma amizade que quero perpetuar, obrigada Carla pelas conversas, parceria e apoio,
Ás minhas amigas e colegas de sala, Tati e Glacy, agradeço por tudo, pelos
ensinamentos científicos, pelas conversas, pelas risadas, abraços em bons
momentos e nos difíceis também,
Ás minhas amigas Naciele, Fabi, Bianca, Raíssa, Franciele, Viviane, Renata e
Adriana. Obrigada pela amizade, carinho e pelos ensinamentos e disponibilidade
para me auxiliar nesse trabalho.
Ao colega William Pacheco, por me auxiliar na análise dos dados,
Aos demais amigos e colegas do Centro de Genômica e Fitomelhoramento, pela
colaboração nos trabalhos, convívio e amizade.
A instituição de pesquisa CAPES, pelo financiamento da bolsa de pesquisa.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de
Pelotas, por oportunizar o aprimoramento de minha formação profissional.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
Meu muito obrigada!!!!!!!!!
Resumo
‘‘Um experimento conduzido em torno de meados da década de 40 (século XX) me preparou para aceitar respostas inesperadas do genoma frente a situações de choque, para as quais o genoma não está preparado para enfrentar de forma ordenada e programada.’’
(McClintock, abertura do discurso ao receber o Prêmio Nobel de Medicina 08/12/1983).
Resumo
DOS SANTOS, Gabriela Guerra, Transposons e retrotransposons como marcadores moleculares em plantas. 2013. 62f. Dissertação (Mestrado)- Programa de Pós Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Orientador: Antônio Costa de Oliveira (Ph.D)
Os programas de melhoramento genético têm contribuído para a obtenção de
genótipos mais produtivos. Estudos em Biotecnologia vegetal tem sido uma das
ferramentas de auxílio para o melhoramento genético vegetal, assim como a
utilização dos marcadores moleculares. Transposons e Retrotransposons são
onipresentes no genoma das plantas e são cada vez mais estudados. Esse trabalho
teve como objetivo avaliar a similaridade genética entre diferentes cultivares de arroz
utilizando as técnicas de IRAP e REMAP utilizando a presença de retrotransposons.
Para verificar essa similaridade, foi realizada em 20 genótipos de arroz (brasileiros,
japoneses e filipinos) a extração de DNA, para posterior amplificação por PCR
utilizando as técnicas IRAP e REMAP. A análise dos produtos da amplificação foi
feita classificando os fragmentos independentemente conforme presença e ausência
de cada fragmento amplificado em diferentes alturas do gel de poliacrilamida para
que os dados fossem utilizados na construção de uma matriz binária. Os dados
gerados foram utilizados para o cálculo de similaridade genética entre todos os
pares de indivíduos, com o auxílio do programa computacional NTSYS pc 2.1. Para
descrever os padrões de similaridade foi adotado o coeficiente de Dice e foi
construído um dendrograma por meio do método não-ponderado de agrupamento
aos pares UPGMA. Além disso, foi estimado o coeficiente de correlação cofenética
(r), de acordo com o teste de Mantel e a estabilidade estatística do agrupamento foi
estimada por meio da análise de bootstraping com 1000 replicações, através do
programa computacional WINBOOT. Os resultados obtidos neste trabalho mostram
que é possível avaliar a variabilidade genética em genótipos de arroz utilizando as
técnicas IRAP e REMAP através do uso dos retrotransposons como marcadores
moleculares.
Palavras chaves: Oryza sativa, Tos 17, elementos transponíveis.
Abstract
DOS SANTOS, Gabriela Guerra, Transposons and retrotransposons as molecular markers in plants . 2013. 62F. Thesis (MA) - Graduate Program in Biotechnology. Federal University of Pelotas, Pelotas. Professor: Antônio Costa de Oliveira (Ph.D).
The breeding programs have made significant contributions to obtain more productive genotypes. Studies in Plant biotechnology has been one of the tools to aid plant breeding, as well as the use of molecular markers. Transposons and Retrotransposons are ubiquitous in plant genomes and are increasingly studied. This study aimed to evaluate the genetic similarity among different rice cultivars using the techniques of IRAP and REMAP using the presence of retrotransposons. To verify this similarity was performed in 20 rice genotypes (Brazilian, Japanese and Filipinos) a DNA extraction for subsequent PCR amplification using the techniques IRAP and REMAP. Analysis of amplification products was made by classifying the fragments as independently presence and absence of amplification at different heights polyacrylamide gel for data were used to construct a binary matrix. The data generated were used for the calculation of genetic similarity between all pairs of individuals with the aid of the computer program NTSYS pc 2.1. To describe the patterns of similarity was adopted Dice coefficient and a dendrogram was constructed by the method of unweighted UPGMA grouping in pairs. Furthermore, was estimated cophenetic correlation coefficient (r), according to the Mantel test and statistical stability of the grouping was estimated by analysis of bootstrapping with 1000 replicates through the computer program WinBoot 1.0. The results of this work show that it is possible to assess the genetic variability in rice genotypes using IRAP and REMAP techniques through the use of retrotransposons as molecular markers.
Key words: Oryza sativa, Tos 17, transposable elements.
Lista de Figuras
Capítulo I- Transposons e retrotransposons como marcadores moleculares em plantas
Figura 1: Estrutura e organização dos retrotransposons (Regiões LTRs e não LTRs) em plantas ..................................................................................................... 21
Figura 2. Esquema básico de um processo de transposição .......................... 23
Figura 3. Organização de vários retrotransposons em arroz ........................... 30
Figura 4. Marcadores moleculares baseados em retrotransposons ............... 32
Capítulo II- Análise dos retrotransposons para a avaliação da variabilidade genética em diferentes cultivares de arroz
Figura 1. Esquema representando a técnica de IRAP-REMAP ...................... 47
Figura 2 A. Perfil das bandas em gel de agarose (3%) com genótipos de arroz com combinação Tos 17 com primers ISSR ........................................................... 53
Figura 2 B. Perfil do padrão de bandas obtido, em gel de acrilamida (6%), referente às combinações de primers que foram selecionadas em gel de agarose. ...... 54
Figura 3 : Dendograma de 20 genótipos de arroz obtido através da análise IRAP e REMAP, utilizando o índice de similaridade de Dice (1945) e o método de agrupamento UPGMA. Os valores encontrados nos grupos indicam o valor percentual de vezes que os genótipos agruparam em 1000 ciclos de análise de boostraping utilizando o programa Winboot. O valor do coeficiente de correlação cofenética (r) é de 0,81. .................................................................................. 54
Lista de tabelas
Capítulo II- Análise dos retrotransposons para a avaliação da variabilidade genética em diferentes cultivares de arroz
Tabela 1. Genótipos utilizados para análise de similaridade genética ............. 48
Tabela 2. Primers dos elementos transponíveis para análise de similaridade genética. ........................................................................................................... 50
Tabela 3. Primers ISSR utilizados no trabalho. .............................................. 50
Tabela 4. Combinações utilizadas dos primers dos elementos transponíveis com primers ISSR, para análise de similaridade genética ....................................... 51
Tabela 5. Combinações de Primers selecionadas para a análise dos dados .. 53
Lista de Abreviaturas e siglas
DNA- Ácido Desoxirribonucléico
FISH - Hibridação in situ fluorescente
Int- Integrase
IRAP- Inter - Retrotransposon Amplified Polymorphism
ISSR- Intersimple Sequence Repeats
LINEs - Elementos nucleares dispersos longos
LTRs- Longas repetições terminais (Long Terminal repeats)
MITEs - Miniatura de elementos transponíveis com repetições invertidas (Miniature inverted repeat transposable elements)
NSF- National Science Foundation
ORFs – Módulos de Leitura aberta (Open Reading Frames)
PCR- Reação em cadeia de polimerase
Pr- Protease
REMAP- Retrotransposon - Microsatellite Amplified Polymorphism
RNA- Ácido Ribonucléico
RTNs- Retrotransposons
SINEs -Elementos nucleares dispersos curtos
TEs - Elementos transponíveis (Transposable Elements )
TR- Transcriptase reversa
TUSC- Trait Utility System
UPGMA- Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean
Sumário
1 Introdução Geral ...................................................................................................15
2 CAPÍTULO I .........................................................................................................17
Uso de transposons e retrotransposons como marcadores moleculares em plantas ................................................................................................................................18
2.1 Revisão Bibliográfica .....................................................................................18
2.1.1 Elementos Transponíveis ....................................................................18
2.1.2 Classificação dos ETs ..........................................................................19
Elementos Classe I ................................................................................20
Retrotransposons com LTRs ........................................................................20
Retrotransposons sem LTRs ........................................................................20
Elementos Classe II ......................................................................................21
Elementos Classe III ......................................................................................22
2.1.3 Mecanismos de ação dos Transposons .....................................................22
2.1.4 Localização genômica dos Retrotransposons ............................................22
2.1.5 Ativação dos Retrotransposons em plantas por estresses bióticos e abióticos ............................................................................................................................25
2.1.6 Estudos diversos sobre retrotransposons em plantas ................................26
2.1.7 Elementos Transponíveis em gramíneas ...................................................28
2.1.8 Uso de retrotransposons como marcadores moleculares em plantas ........30
2.2 Considerações Finais ........................................................................................33
2.3 Referências Bibliográficas .................................................................................34
3. CAPÍTULO II ......................................................................................................44
Análise dos retrotransposons para a avaliação da variabilidade genética em diferentes cultivares de arroz ..................................................................................44
3.1 Introdução .....................................................................................................45
3.2 Objetivo .........................................................................................................47
3.3 Metodologia ...................................................................................................48
3.3.1 Material Vegetal .........................................................................................48
3.3.2 Extração de DNA .................................................................................49
3.3.3 Reação de IRAP e REMAP .................................................................49
3.3.4 Amplificação por PCR ..........................................................................51
3.3.5 Visualização em gel de poliacrilamida ................................................52
3.4 Análise dos dados .........................................................................................52
3.5 Resultados e Discussão ................................................................................53
3.6 Conclusões ...................................................................................................56
3.7 Referências Bibliográficas .............................................................................57
Vita .....................................................................................................................62
Introdução Geral
Os elementos transponíveis (TEs - Transposable Elements) são fragmentos
de DNA que possuem a capacidade de se mover entre regiões de um genoma. A
grande maioria dos genomas investigados até hoje apresentaram elementos
transponíveis (BIÉMONT E VIEIRA, 2006).
Na década de 40, Bárbara McClintok descobriu esses elementos no genoma
de milho, nomeando-os como elementos controladores, pois estes aparentemente
controlavam a coloração dos grãos de milho. Nos anos seguintes, a idéia de que
sequências de DNA podiam se mover dentro dos genomas não foi aceita pela
comunidade científica. Somente na década de 80 os elementos controladores, foram
chamados de elementos transponíveis, redescobertos, gerando várias mutações em
milho (KAZAZIAN, 1998).
Esses elementos transponíveis são constituintes de grande parte dos
eucariotos, sendo maior que 70% em algumas plantas e anfíbios, e 45% em
humanos (VENNER et al., 2009). Diversos estudos foram realizados, tentando
elucidar a importância e o impacto desses elementos na evolução dos genomas,
devido as suas inserções e/ou deleções, em diferentes locais do genoma, causando
algumas alterações, podendo ser por transferência vertical ou transferência
horizontal (SCHAACK et al., 2010).
Devido à grande diversidade de elementos de transposição existente nos
diferentes genomas e às diferenças de sequências nucleotídicas encontradas e,
consequentemente, proteínas produzidas por esses elementos móveis, foi
necessária a construção de uma classificação que facilitasse os estudos destas
sequências.
Primeiramente os TEs podem ser classificados em duas grandes classes de
acordo com o mecanismo pelo qual ocorre a transposição: por meio de DNA (classe
II) ou através de um intermediário de RNA (classe I). A classe II são os que se
deslocam como sequência de DNA (comumente conhecidos como transposons) e
para tal codificam uma transposase (enzima que catalisa sua inserção em novos
sítios). A classe I refere-se aos que se movem via RNA e, para tanto, codificam
transcriptases reversas (chamado, mais especificamente, de Retrotransposons)
15
(RANGNER, 1996). Esses elementos transponíveis podem ser agrupados
hierarquicamente em: classes, subclasses, ordens, superfamílias, famílias e
subfamílias, de acordo com algumas características (WICKER et al., 2007).
Entre os elementos transponíveis, os retrotransposons, são um dos
principais componentes do genoma das plantas (FESCHOTTE et al., 2002). Por
exemplo, 80% do genoma do milho e pelo menos 40% do genoma do feijão são
ocupados por retrotransposons. Pelo menos 17% do genoma do arroz, que é
relativamente pequeno, estimado em retrotransposons (MCCARTHY et al., 2002).
Os estudos recentes têm como base a identificação da presença desses
elementos transponíveis, sendo por sequenciamento, ou por utilização de
marcadores moleculares desenvolvidos com base em sequências LTRs dos
retrotransposons. Eles podem revelar a evolução dos genomas, tanto no aumento
do seu tamanho, como em alterações moleculares. Além disso, a variabilidade
gerada pelas transposições pode auxiliar na identificação de diferenças entre
genótipos, sejam eles indivíduos, linhagens e cultivares. Este estudo teve como
objetivo avaliar a similaridade genética entre diferentes cultivares de arroz através
das técnicas de IRAP e REMAP utilizando a presença de retrotransposons.
16
2. Capítulo I
Revisão bibliográfica
Transposons e retrotransposons como marcadores mole culares em plantas
2.1 Revisão Bibliográfica
2.1.1 Elementos Transponíveis
A mobilidade das sequências do DNA foi primeiramente sugerida no final
dos anos 40, antes da descoberta da estrutura molecular do DNA, quando Bárbara
McClintock revelou os “elementos controladores”. Neste período um dos dogmas da
ciência era o princípio estático do genoma e a única mudança aceitável relacionava-
se àquela proporcionada pelos processos evolutivos (KIDWEL; LISCH, 2001).
A instabilidade do genoma vem sido estudada pela comunidade científica e
sabe-se que este está sujeito a vários fatores que proporcionam sua variabilidade
como as mutações, inserções e deleções. Outro fator que gera instabilidade são os
elementos de transposição (TEs) descobertos por McClintock em 1931, em um
estudo de mutações no genoma do milho (MCCLINTOCK, 1931). Nos anos de 1945
e 1946, durante um estudo utilizando sementes de milho, esta pesquisadora
verificou um padrão incomum na expressão e segregação dos determinantes da
coloração da aleurona dos grãos. Tal acontecimento só poderia ser explicado por
“partículas móveis” presentes neste genoma. Desde então, estes elementos móveis
foram encontrados em todas as espécies onde já foram pesquisados (CRAIG, 2002;
CAPY, et. al.,1994).
Os TEs são sequências de DNA que têm a capacidade de mudar de posição
no genoma, independente de homologias entre as regiões. Esta transposição pode
ocorrer de forma autônoma, quando os elementos produzem suas próprias enzimas
que promovem sua mobilização; ou podem ser não autônomos, os quais dependem
das enzimas produzidas pelos elementos autônomos. Um dos maiores impactos no
genoma hospedeiro causado pela presença e movimentação desses elementos
transponíveis está relacionado com o aumento da variabilidade genética (CAPY et
al., 1998; KIDWELL, LISCH, 1997).
Devido à grande diversidade de elementos de transposição existentes nos
diferentes genomas foi necessária a construção de uma classificação que facilitasse
os estudos destas sequências. Os TEs podem ser agrupados hierarquicamente em:
classes, subclasses, ordens, superfamílias, famílias e subfamílias, de acordo com
algumas características (WICKER et al., 2007).
18
Os TEs podem ser classificados em duas classes, dependendo do
mecanismo de transposição (GOODIE; KAZAZIAN, 2008); que pode ser por meio de
DNA (classe II) ou através de um intermediário de RNA (classe I). Os TEs classe II, são
conhecidos como trasposons, e se deslocam a partir de sequências de DNA e
codificam uma proteína chamada transposase (enzima que catalisa sua saída do sítio
original e a sua inserção em novos sítios). Ainda na classe II, temos os helitrons, eles
foram encontrado e caracterizado em eucariotos, sendo denominados de helitrons
(Plantas) e Heletron (Vertebrados) (POULTER et al., 2003 ; KAPITONOV E JURKA,
2001). Eles apresentam um mecanismo de transposição chamado ‘rolling circle’ (PILAR
et. al., 2001). Estão presentes na maioria das espécies de plantas e animais e são
particularmente abundantes em plantas com flores (YANG E BENNETZEN, 2009). Os
TEs da classe I, denominados como retrotransposons, movem-se via RNA e codificam
transcriptases reversas que utilizam sua sequência como molde para fazer uma fita de
RNA que serve como molde para posteriormente dar origem a uma fita de DNA que
será inserida numa outra região do genoma ( RANGNER, 1996).
Há ainda uma classe intermediária onde estão agrupados os elementos
que não se adequam às características dos elementos das duas classes anteriores. A
princípio, esta classe é dividida em duas superfamílias: MITEs (miniatura de
elementos transponíveis com repetições invertidas), que possuem curtas repetições
terminais e os elementos Foldback, com longas repetições terminais. Os elementos
MITEs possuem uma estrutura interna comparável com a dos elementos da classe II,
mas o seu alto número de cópias no genoma e sua inserção preferencial em regiões
de genes os classificam como elementos da classe I (CAPY et al.,1998).
2.1.2 Classificação dos elementos Transponíveis
Segundo Wicker et. al. (2007), podemos melhor descrever cada classe dos TEs nas categorias a seguir:
19
Elementos de Classe I
Os elementos desta classe são conhecidos por Retrotransposons. Eles se
movimentam através de um intermediário de RNA que é codificado para DNA por
uma transcriptase reversa, produzida por eles mesmos, antes da sua nova inserção.
Esta ainda se subdivide em retrotransposons com LTRs (Ty1-copia e Gypsy-Ty3),
que são semelhantes ao retrovírus, e os retrotransposons sem LTRs (LINEs e
SINEs) do inglês long interspersed elements e short interspersed elements,
respectivamente.
Retrotransposons com LTRs
São elementos estruturalmente similares aos retrovírus. Possuem longas
repetições nucleotídicas nas extremidades 5’ e 3’. De uma maneira geral, estas
repetições terminais flanqueiam uma região central que contém três módulos
abertos de leitura conhecidos por ORFs, do inglês Open Reading Frames (Figura 1).
A sequência das ORFs pode variar entre os elementos deste grupo. A primeira ORF
refere-se ao gene gag que produz uma poliproteína que é processada em três
proteínas maduras: a matriz, o capsídeo e o nucleocapsídeo. A outra ORF constitui-
se do gene pol que codifica as enzimas necessárias à transposição do elemento:
protease (Pr), transcriptase reversa (TR), RNAseH e integrase (Int). A última ORF
está presente em algumas famílias desta classe, podendo ou não produzir uma
proteína funcional: ela corresponde ao gene env, que codifica a proteína do
envelope viral nos retrovírus.
Retrotransposons sem LTRs
Esta subclasse é dividida em duas superfamílias, LINEs (elementos
nucleares dispersos longos) do inglês long interspersed elements e SINEs
(elementos nucleares dispersos curtos) do inglês shorts interspersed elements, a
diferença entre eles é a presença, nos LINEs, ou ausência, nos SINEs da enzima
transcriptase reversa. A superfamília LINEs compreende elementos com tamanhos
que variam entre 5 e 8kb, e possuem uma sequência rica em adeninas no
término 3’, muito semelhantes às caudas poli A presente em RNAs mensageiros.
20
Esses elementos possuem ORFs que codificam algumas enzimas necessárias para
a transposição.
Figura 1: Estrutura e organização dos retrotransposons (Regiões LTRs e não LTRs) em plantas, adaptado. (KUMAR E BENNETZEN, 1999).
Elementos de Classe II
A classe II constitui os elementos chamados de Transposons. Essas
sequências se movimentam através de um intermediário de DNA por um mecanismo
de excisão do sítio original e reinserção em outro sítio no genoma. Todos os
elementos possuem repetições terminais invertidas (TIR) do inglês terminal invert
repeats. Os transposons são caracterizados pela mobilização dos elementos através
de um processo de excisão do sítio doador e reinserção em outro sítio em qualquer
posição no genoma hospedeiro. Ainda nesta classe, temos os elementos chamados
de Helitrons, que faz o processo de replicação “rolling circle”.
Foram descobertos pela análise computacional das sequências genômicas
de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e Caenorhabditis elegans (KAPITONOV E
JURKA, 2001). Não apresentam as estruturas típicas que são características dos
Retrotransposons com LTRs
Retrotransposons sem LTRs
21
TEs tradicionais de classe de DNAA. Se inserem preferencialmente entre os
nucleotídeos de adenina e timidina (KAPITONOV E JURKA, 2007). São
onipresentes em todos os eucariotos, como Arabidopsis thaliana, Drosophila
melanogaster, Oryza sativa e Zea mays (LANGDON et al.,2009; LAL et al., 2009;
KAPITONOV E JURKA, 2003; KAPITONOV E JURKA, 2001).
Elementos de Classe III
São chamados de MITEs (Miniatura de elementos transponíveis com
repetições invertidas) do inglês Miniature inverted-repeat transposable element. É um
grupo considerado heterogêneo de elementos não autônomos, são pequenos, variam
entre dezenas e centenas de pares de bases. Flanqueiam uma região de repetições
terminais invertidas e são frequentemente achados próximos dos genes.
2.1.3 Mecanismos de Ação dos Transposons
Segundo Griffiths et. al. (2008) os transposons podem ser reconhecidos por
sequências de DNA curtas nas extremidades, que são iguais entre si, mas estão em
orientação invertida, denominadas de repetições terminais. O mecanismo de
transposição é realizado pela enzima transposase, a qual, na maioria dos casos é
codificada pelo próprio transposon (Figura 2). São capazes de codificar sua própria
enzima transposase e, por isso, capazes de iniciar seu próprio movimento de
transposição, portanto são denominados autônomos. Por exemplo, o elemento de
transposição Ac, encontrado no milho, é autônomo, enquanto o elemento Ds,
também encontrado no milho, não o é considerado autônomo. Entretanto, a
transposase codificada por Ac pode realizar a transposição de um elemento Ds, bem
como de seu próprio elemento. Os elementos Ds, neste caso, são ditos não-
autônomos.
Como os transposons não se movem com muita frequência, a sua presença
em uma determinada região do genoma pode ser inferida pela presença de
repetições invertidas nas extremidades do elemento. A transposição é iniciada
quando um gene que codifica uma transposase é expresso e o seu RNA mensageiro
é traduzido no citoplasma. A transposase, então, entra no núcleo e liga-se às
repetições terminais invertidas do elemento. De maneira geral, existem dois tipos de
mecanismos de transposição. No primeiro, o transposon move-se sem que haja a
replicação (transposição conservativa). No outro tipo, denominado de transposição
22
replicativa, o transposon movimenta-se através de sua replicação e posterior
inserção em outro local do genoma (SANGLARD et al., 2012).
Figura 2. Esquema básico de um processo de transposição. (1) Sequência contendo um gene para uma transposase (cor roxa), sequências terminais do transposon (cor amarela), outro gene (cor verde) e outras sequências de DNA não expressas (íntrons). (2) Ação da transposase. (3) Resultado da ação da transposase: um transposon é inserido na sequência de outro gene, de modo a posicionar-se interrompendo a sequência original do mesmo. Adaptado, ARCHIVE FOR THE TRANSPOSONS (2011).
2.1.4 Localização genômica de retrotransposons
Os retrotransposons são presentes no reino vegetal, detectando-se a sua
presença principalmente em algas unicelulares, briófitas, gimnospermas e
angiospermas (FLAVELL et al., 1992). O número de cópias existente por genoma é
variável, sendo frequente a existência de um elevado número de cópias em plantas
23
com genomas de grande dimensão. Exemplos clássicos envolvem o caso do milho,
em que 50-80% do genoma nuclear é atribuído a estes elementos (SANMIGUEL E
BENNETZEN, 1998) e mais de 50% do genoma de cevada (VICIENT et al., 1999).
Em cevada, a principal família de retrotransposons, é a família BARE-1 que
representa 5% do seu genoma (VICIENT et al. 1999).
Um dos principais responsáveis por estes valores é o próprio mecanismo de
transposição destes elementos, capaz de originar um elevado número de cópias em
pouco tempo. Este mecanismo parece estar na base do paradoxo do valor de DNA
C, isto é, a falta de correlação existente entre o tamanho do genoma e a
complexidade de um organismo. Segundo Sanmiguel e Bennetzen (1998)
verificaram que a diferença abrupta nos valores de C dentro da família das
gramíneas era devida a uma amplificação diferencial dos retrotransposons. Por
exemplo, o arroz e a cevada têm aproximadamente o mesmo número de genes, mas
a diferença entre o tamanho dos seus genomas é atribuída, em parte, à amplificação
destes elementos (VICIENT et al., 1999). Nesta perspectiva, a diferença que se
observa em genomas de grande dimensão, como o da fava e do milho (cerca de
14.000Mbp e 2500Mbp respectivamente) pode resultar de uma amplificação bem
sucedida de retrotransposons (BENNETT E LEITCH, 2005; PEARCE et al., 1996;
SANMIGUEL et al., 1996) enquanto que genomas de pequenas dimensões, como o
de Arabidopsis (130Mbp), podem resultar em poucas transposição (WRIGH et al.,
1996). Paralelamente, foi demonstrada a preferência que alguns elementos exibem
pela amplificação em certas espécies: elementos copia-like proliferaram em espécies
com genomas menores enquanto que elementos gypsy-like proliferaram em
genomas de maiores dimensões, como em Gossypium (HAWKINS et al., 2006).
Foram feitos inúmeros estudos sobre a localização dos retrotransposons
LTRs no genoma de plantas com o objetivo de conhecer a sua diversidade e assim
poder clarificar a sua função na evolução destes genomas. Dados resultantes de
hibridação in situ fluorescente (FISH) do inglês Fluorescent in situ hybridization, em
diversas espécies vegetais permitiu concluir que, de uma forma geral, parece haver
diferença no padrão de distribuição de elementos Ty1-copia e Ty3-gypsy. Elementos
Ty1-copia parecem não ter preferência por domínios genômicos específicos uma vez
que foram detectados tanto em zonas eucromáticas, isto é, zonas ricas nas bases G
e C, nas quais se localiza a maioria dos genes e que estão associadas à atividade
24
transcricional (PEARCE et al. 1996a; PEARCE et al., 1996b; PRICE et al., 2002)
como também em zonas heterocromáticas, ricas em A-T e associadas á inativação
transcricional, nomeadamente zonas teloméricas achados em Allium cepa (PEARCE
et al., 1996b) e paracentroméricas achados em Arabidopsis thaliana (BRANDES et
al., 1997).
Em outras gramíneas foi detectada a presença de retrotransposons LTR em
“clusters”, num tipo de arranjo designado “nested”, ou seja, elementos inseridos uns
dentro dos outros. Estes podem ser da mesma família, como é o caso de BARE-1,
em cevada (SHIRASU et al., 2000) ou de famílias diferentes, em milho (SANMIGUEL
et al., 1998). Ainda em milho, 49-78% do seu genoma é composto de
retrotransposons (SANMIGUEL E BENNETZEN, 1998). Em trigo, cerca de 90% do
genoma consiste de sequências repetidas e, destas, 68% corresponde a elementos
transponíveis (LI et al., 2004).
Elementos Ty3-gypsy são abundantes em cereais, em regiões eucromáticas,
mas também heterocromáticas, especialmente em zonas centroméricas, como se
verificou em milho, centeio, trigo, arroz e cevada, mas também em Arabidopsis
thaliana (SANMIGUEL et al., 1996). Em milho, uma sequência de 240kb localiza-se
essencialmente em zonas eucromáticas intergénicas enquanto que em arroz uma
família de retrotransposons LTR não-autónomos – Dasheng - com um elevado
número de cópias, parece exibir uma preferência pela inserção em zonas de
microssatélites para além de outros elementos transponíveis, que se localizam em
zonas pericentroméricas (JIANG et al., 2002).
2.1.5 Ativação de retrotransposons em plantas por estresses bióticos e
abióticos
Muitos dos retrotransposons de plantas estudadas até o momento são
transcricionalmente ativados por vários fatores de estresse biótico e abiótico
(GRANBASTIEN et al., 1998). A expressão e ativação dos retrotransposons Tnt 1 e
Tto 1 em tabaco pode ser através de vários estresses abióticos, incluindo o
isolamento de protoplastos, culturas de células, ferimento, jasmonato de metila e
ácido salicílico, mexendo no padrão de metilação (POUTEAU et al., 1991;
HIROCHIKA, 1993; POUTEAU et al., 1994; MOREAU-MHIRI et al., 1996; MHIRI et
al., 1997; TAKEDA et al, 1999).
25
Do mesmo modo, o stress biótico, traz vários fatores, tais como extratos
fúngicos de Trichoderma viride (POUTEAU et al., 1994, TAKEDA et al., 1999) ou
inoculação com vários agentes patogénicos virais, bacterianos, fúngicos ou
(POUTEAU et al., 1994) têm sido mostrados para ativar a transcrição desses
retrotransposons. Em contraste com Tnt 1 e Tto 1, transcrição de Tos 17 é induzida
apenas por cultura de tecidos. O retrotransposon Tto 5 de tabaco foi isolado pelo
método de RT-PCR, induzindo ácido salicílico (POUTEAU et al., 1994).
Em recentes estudos, Butelli et al. (2012), sugere que as laranjas sicilianas
(Citrus sinensis), boas para a saúde cardiovascular e diminuição de gordura, são
sensíveis ao frio, o que atrapalha na coloração. Associaram que um retrotranposon é
reponsável pela formação de cor no fruto. Ele é ativado pelo estresse ao frio. Os
resultados demosntram que a transposição e recombinação de retroelementos são
fontes importantes de variação provável em Citrus.
2.1.6 Estudos diversos sobre Retrotransposons em Pl antas
Estudos com retrotransposons em plantas são bem variados. O uso de
técnicas de biologia molecular é bem diverso, como a transformação genética,
como no caso do desenvolvimento de um sistema de vetor de transformação
baseado no retrotransposon Tnt 1 em tabaco. O elemento chamado de Mini-Tnt 1,
também oferece um sistema facilmente manipulável para estudar mecanismos de
retrotransposição em plantas (HOU et al., 2010).
Relatos da utilização de retrotranposons em plantas como Arabidopsis
thaliana, demostra a existência da família de retrotransposon chamada Ta 1-10, a
qual constitui 0,1% do genoma da planta. O genoma do fumo contém o
retrotransposon Tnt 1, o qual foi isolado após a sua transposição e inativação do
gene que codifica a enzima nitrato redutase. Plantas pertencentes á família
Liliaceae, possuem o retrotransposon demonimado Del, existindo mais de 13.000
cópias no genoma de Lilium longiflorum. Em arroz, existem três famílias principais
de retrotransposons, a doTos, a do RIRE3, e p- SINE 1 (KUMAR E BENNETZEN,
1999).
Estudos em Oryza australiensis mostraram que a família RIRE-1 é mais
abundante na zona pericentromérica que na zona distal de ambos os braços
26
cromossômicos uma característica partilhada com outras famílias LTR no genoma
de O. sativa (JIANG et al., 2002). Outro estudo aponta os retrotransposons LTR
como responsáveis pela modificações no genoma no gênero Eleocharis. Os dados
sugerem fortemente que Ty1-copia /Helos1 desempenhou um papel importante na
evolução, tanto no tamanho do genoma quanto no cariótipo em Eleocharis (ZEDEK
et al., 2010).
Em Vitis sp., estudos com elementos transponíveis desempenharam um
papel importante na domesticação da videira e sua evolução. A publicação do
genoma completo da videira abre a possibilidade para uma análise profunda do
conteúdo de transposons em seu genoma para entender sua evolução (BENJAK et
al., 2008).
Na ativação da transcrição do trigo, os retrotransposons alteram a expressão
de genes adjacentes, e leitura através dessa transcrição é a partir dos
retrotransposons que estão associados na ativação ou silenciamento desses genes
(KASHKUSH et al., 2003). Assim, elementos transponíveis, incluindo
retrotransposons, contribuíram mais significativamente para a evolução de genes e
genomas do que se pensava anteriormente. Durante a transposição,
retrotransposons são transcritos reversamente por uma transcriptase reversa, e os
cDNAs resultantes são integrados no genoma. Este modo de "copiar-e-colar"
contribui para a expansão do tamanho do genoma. Estudos mostram que as
sequências de retrotransposon não são eliminadas facilmente do genoma e são
mantidas em uma forma inativa. É reconhecido que elementos transponíveis
influenciam na evolução, aumentando tamanho de genomas e na indução de
diversos tipos de alterações dos genomas eucarióticos superiores (KIDWELL E
LISCH, 1997).
Em Arabidopsis thaliana, como se considera uma espécie modelo das
dicotiledôneas e de estudos moleculares, tem contribuído muito para a compreensão
dos sistemas de prevenção de invasão genoma por elementos transponíveis, os
avanços recentes sugerem que A. thaliana pode ser mais eficiente do que a A.
lyrata, pelo o controle da expressão e proliferação dos elementos transponíveis. A
análise comparativa da transcrição em de elementos transponíveis em A. thaliana e
A. lyrata, que diferem em 40% no tamanho do genoma, pode ajudar a compreender
27
como mecanismos de silenciamento contribuiram para a evolução, um importante
fator de variação de tamanho nos genomas de plantas e animais (MEAUX;
PECINKA, 2012). Retrotransposons LTRs também teve sua história evolucionária
estudada recentemente, através dos domínios protéicos, nas plantas do gênero
Selaginella, em análises comparativas e filogenéticas (NOVIKOV et al., 2012).
2.1.7 Elementos Transponíveis em gramíneas
Barbara McClintok iniciou alguns experimentos para gerar deleções em
alguns marcadores ao longo do cromossomo 9 de milho. Os genes que se
localizavam próximos ao centrômero eram C (cor), sh (shrunken) e wx (endosperma
waxy). Ela esperava que as deleções fossem abolir a atividade dos marcadores mais
afastados do centrômero, ou seja, que a progênie perderia C, e as sementes
ficariam descoloridas. Ela estava trabalhando com uma linhagem de milho cujo
cromossomo tipicamente se quebrava entre wx e o centrômero, resultando na perda
dos três marcadores ao mesmo tempo. Porém havia algo mais frágil para que a
quebra ocorresse nessa região. McClintock designou um marcador, que chamou de
Ds para dissociação. Observações posteriores mostraram que o Ds nesta posição
não era estável, e que em algumas linhagens ele parecia pular do sítio entre wx e o
centrômero para a posição entre o gene C, fazendo com que os grãos ficassem
descoloridos. Em alguns raros casos, porém, o Ds pulava de volta durante o
desenvolvimento da semente, assim sendo, as sementes ficavam descoloridas,
porém com alguns pontos coloridos, tendo sua atividade gênica restaurada. Por
causa destas plantas instáveis, McClintock propôs que estas linhagens continham
um ativador (Ac) e que tanto o Ds quanto o Ac eram necessários para que a
transposição Ds acontecesse. Análises genéticas de McClintock e subsequentes
estudos moleculares mostraram que o sistema de transposição Ac/Ds é uma
complexa estrutura que consiste de dois tipos de elementos, o elemento autônomo
(Ac) e o não autônomo (Ds). O primeiro codifica todos os produtos de que necessita
para transpor e o segundo é uma família de elementos que são reconhecidos para
transposases codificadas por Ac (BUCHANAN et al., 2000).
Os elementos Ac e Ds tendem a transpor no local, por esta razão, eles
podem ser efetivamente utilizados para saturar uma região cromossômica com
inserções, proporcionando uma marca de clonagem molecular de genes próximos
28
(VAN SCHAIK; BRINK, 1959; DOONER; BELACHEW, 1989; COWPERTHWAITE et
al., 2002). Estudos prévios demonstraram que o Ac e o Ds inserem,
preferencialmente em genes, uma propriedade que é explorada para os tornar um
recurso útil para genética reversa.
O transposon Mu (Mutator) foi utilizado pela primeira vez em milho pela
Pioneer Hi-Bred Co, e a tecnologia foi denominada Trait Utility System (TUSC), um
projeto usando transposon Mu foi financiado pela National Science Foundation
(NSF). O referido projeto teve como objetivo demonstrar a funcionalidade de genes
de milho usando o sequenciamento do DNA genômico flanqueando as inserções do
transposon Mu e caracterizar os indivíduos mutantes contendo esses transposons.
Para uma ampla utilização do material genético resultante desse projeto, foi criado
um banco de mutantes onde são armazenados os estoques de sementes mutadas,
o Maize Genetics Cooperative Stock Center. Os pesquisadores poderão utilizar a
técnica de PCR para seleção de uma coleção de plasmídeos contendo genes de
interesse flanqueados pelo transposon Mu. (MELAKE-BERHAN et al.,1996).
Como Ac, os elementos Mu tendem a se inserir preferencialmente nos
genes, ou perto deles (RAIZADA et al., 2001), mas ao contrário de Ac, se transpõem
para sítios desvinculados. Além disso, os elementos transponíveis Ac, estão
presentes no genoma do milho em maior número de cópias, o que os torna uma
excelente ferramenta para triagem direcionada.
A cana é uma cultura importante para a produção de açúcar em todo o
mundo e cada vez mais, como uma fonte de energia renovável. Retrotransposons
LTRs como são os componentes principais da maioria dos genomas de plantas e
podem influenciar substancialmente o genoma de muitas maneiras, um estudo foi
feito para ver famílias individuais de Retrotransposons com LTRs em cana, pois têm
estruturas distintas. Os resultados indicam que essas famílias têm comportamentos
distintos e pode potencialmente impactar o genoma de diversas maneiras. Por
exemplo, estes elementos transponíveis podem afetar genes próximos através da
geração de mecanismos que desencadeiam o silenciamento de genes. Há também
algumas evidências que os genomas ancestrais contribuíram significativamente em
elementos diferentes a partir de determinadas linhagens de retrotransposons com
LTRs para o genoma da cultivar moderna de cana. (DOMINGUES et al., 2012).
29
Em arroz, devido ao seu genoma de tamanho pequeno, o menor entre as
gramíneas e cereais (ARUMUGANATHAN EARLE, 1991), várias famílias de
retrotransposons foram bem identificadas no seu genoma. Estes incluem Ty1 copia
tipo (por exemplo, 1-20 Tos) (HIROCHIKA et al., 1992), tipo Ty3 gypsy (p. ex RIRE3,
RIRE7) (KUMEKAWA et al., 1999, 2001), e SINE (por exemplo, p-SINE1)
(MOCHIZUKI et al., 1992; MOTOHASHI et al., 1996). Estudos anteriores que
utilizam pesquisas de similaridade de sequências revelou a predominância de
elementos MITEs em arroz (BUREAU, WESSLER, 1994; BUREAU et al., 1996;.
MAO et al., 2000, TURCOTTE et al., 2001). A figura 3 mostra a organização dos
diversos retrotransposons em arroz, segundo um estudo feito por Chao et al. (2003).
Figura 3: Organização de vários retrotransposons em arroz. O comprimento total dos elementos e do comprimento dos LTRs está indicado à esquerda. Os genes que codificam a proteína gag e poliproteína são representados por gag e pol, respectivamente, segundo Chao et al. (2003), adaptado.
2.1.8 Uso de retrotransposons como marcadores mole culares em plantas
Retrotransposons são muito estudados, a fim de descobrir marcadores
moleculares para incrementar programas de melhoramento vegetal. Sistemas de
marcadores que exploram métodos diversos podem ser facilmente desenvolvidos e
são de baixo custo. Também oferecem acesso à parte dinâmica e polimórfica do
genoma estudado (SCHULMAN et. al., 2012). De modo geral, marcadores
moleculares são mais eficientes que os marcadores morfológicos para medir a
variabilidade genética existente entre os genótipos.
30
Marcadores moleculares baseados em retrotransposons com regiões LTRs
são muito estudados. Pesquisas utilizando esse sistema são eficazes e aplicados
em uma gama de cereais e gramíneas, além de caju e coco, tomate e pimenta,
várias espécies leguminosas, fungos, pássaros e insetos. As aplicações vão desde
investigações de ativação dos retrotransposons, sua mobilidade para estudos de
biodiversidade e evolução do genoma, para o mapeamento de genes e estimativa
de distância genética (KALENDAR et al., 2011).
O conhecimento de várias sequências de elementos de transposição tem
possibilitado o desenvolvimento de novas técnicas para estudar a dinâmica dos
genomas. Marcadores baseados em Retrotransposons é um grupo de marcadores
moleculares utilizados para a identificação e descrição de genótipos, pois os
retrotransposons geralmente mostram dispersão cromossômica, número de cópias
variável e distribuição aleatória no genoma (KALENDAR et al., 1999). A dispersão
(KATSIOTIS et al., 1996), ubiquidade (FLAVELL et al., 1992) e prevalência
(PEARCE et al., 1996, 1997) de elementos retrotransponíveis em genomas de
plantas pode ser explorada para “DNA fingerprinting” (identidade molecular),
servindo como uma ferramenta para futuros estudos de biologia de plantas.
Os sistemas de marcadores moleculares baseados em retrotransposons
com LTRs exploram os polimorfismos do DNA genômico resultantes de fenômenos
de inserção entre dois retrotransposons muito próximos ou entre um
retrotransposons e um SSR, no caso dos marcadores IRAP (Inter Retrotransposon
Amplified Polymorphism) e REMAP (Retrotransposon Microsatellite Amplified
Polymorphism), respectivamente, conforme a figura 4 (KALENDAR et al., 1999;
PROVAN et al., 1999; SCHULMAN et al., 2004).
Os primers utilizados são geralmente desenhados para domínios
conservados nas LTRs e/ou regiões SSR conservadas. Contudo, as regiões LTR
conservadas podem diferir dentro da mesma família e entre famílias. Os métodos
IRAP e REMAP originam, em cada amplificação, dezenas a centenas de produtos,
dependendo da prevalência da família de retrotransposons e da organização do
genoma da planta em estudo (SCHULMAN, 2007).
31
Resumindo, muitas características dos retrotransposons, como o fato de
serem ubíquos do genoma, abundantes e dispersos, tornam-nos eficientes para a
sua utilização como sistemas de marcadores moleculares. Simultaneamente, a sua
atividade leva à diversificação do genoma e fornece meios para a sua detecção. Os
retrotransposons produzem grandes alterações genéticas no local de inserção,
promovendo assim sequências conservadas que podem ser utilizadas na detecção
da sua própria inserção (SCHULMAN, 2007).
Figura 4: Marcadores moleculares baseados em retrotransposons: A) Marcadores IRAP originam-se pela proximidade de dois LTRs usando “primers outward-facing” que hibridam com sequências LTR alvo. B) Na técnica REMAP utilizam-se “primers” que ligam a microssatélites “outward-facing” de LTRs próximos, segundo Agarwal et al. (2008), adaptado.
A aplicação da técnica IRAP (Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism)
combinada com a técnica REMAP (Retrotransposon Microsatellite Amplified
Polymorphism) tem se apresentado como excelente marcador molecular para a
identificação de variedades (KALENDAR et al., 1999), o mapeamento de genes de
resistência em cereais e estudos de filogenia e na detecção de diversidade e
variabilidade genética dentro de vários gêneros de plantas como por exemplo, em
Hordeum (KALENDAR et al., 1999) e Oryza sativa L. (CASTELO BRANCO et al.,
2007; MARINI, 2012).
32
2.2 Considerações Finais
Estudos feitos com elementos transponíveis são bem variados e
apresentam-se constantes, não somente em plantas, mas também em humanos,
como no caso de analisar o progresso recente na compreensão dos
retrotransposons e fornecer uma perspectiva sobre a relação entre eles e a variação
genômica em células-tronco pluripotentes (TANAKA et al.,2012). Em animais, como
em Locusta migratoria, é um inseto com um tamanho de genoma grande, e o seu
genoma apresenta muitos retroelementos, foi feita uma análise dos dados de
sequênciamento para elucidar as características de diversidade, estrutura e
expressão de retroelementos (JIANG et al., 2012).
Em plantas, análises de sequências são feitas para investigar os elementos
transponíveis para entender a evolução de genomas, em recente estudo, foi
demonstrado que o uso de uma pequena sequência a partir de um genoma de
planta permite a descoberta e descrição da sua dinâmica para estudos filogenéticos
(ESTEP et al., 2013). Estes estudos devem ser prosseguidos através de linhagens
de plantas com a seleção filogenética apropriada, para ajudar entender a atividade e
comportamento dos elementos transponíveis, cujos tem sido responsáveis pela
variação do genoma através da evolução.
Em estudos utilizando retrotransposons como marcadores moleculares, além
dos já citados, um recente estudo mostra em pêra japônes (Pyrus pyrifolia), foi
desenvolvido através da técnica baseado em polimorfismo de inserção (RBIP)
marcadores com base nos regiões LTRs (KIM et al., 2012).
Baseando-se no que foi exposto nesta revisão, fica evidente que estudos de
transposons e retrotransposons são muito importantes para a compreensão dos
genomas e sua evolução, além é claro de sua grande importância como marcadores
moleculares para a distinção de genótipos.
33
2.3 Referências Bibliográficas
AGARWAL, M.; SHRIVASTAVA, N.; PADH, H. Advances in molecular marker
techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Reports . v. 27, p.
617-631, 2008.
ARCHIVE FOR THE TRANSPOSONS. “Nômades desoxirribonucléicos em alta”.
Disponível em: http://divulgarciencia.com/categoria/transposons/. Acessado em
Novembro de 2012.
ARUMUGANATHAN, K.; EARLE ,E.D. Nuclear DNA content of some important plant
species. Plant Molecular Biology Reporter . v.9, p. 208-219, 1991.
BENJAK, A.; FORNECK , A.; CASACUBERTA, J.M. Genome-Wide Analysis of the
‘‘Cut-and-Paste’’ Transposons of Grapevine. PLoS ONE v.3, p.9, 2008.
BENNETT, M.D.;LEITCH, I.J. Genome size evolution in plants. In The Evolution of
the Genome , editado por Gregory. San Diego: Elsevier. Pages 89–162, 2005.
BIÉMONT, C.; VIEIRA, C. Junk DNA as an evolutionary force. Nature . v. 443, p.
521- 524. 2006.
BUCHANAN, B. B.; GRUISSEM, W.; JONES, R. L. Biochemistry & molecular biology
of plants. Rockville: American Society of Plant Physiologists , p. 1408, 2000.
BUREAU, T.E.; RONALD, P.C.; WESSLER, S.R. A computer-based systematic
survey reveals the predominance of small inverted-repeat elements in wild-type rice
genes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA , v. 93, p.
8524-8529, 1996.
BUREAU, T.E. AND S.R. WESSLER. Mobile inverted-repeat elements of the Tourist
family are associated with the genes of many cereal grasses. Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, v .91, p. 1411-1415, 1994.
34
BUTELLI, E.; LICCIARDELLO, C.; ZHANG, Y.; LIU, J.; MACKAY, S.; BAILEY,
P.; REFORGIATO-RECUPERO, G.; MARTIN, C. Retrotransposons control fruit-
specific, cold-dependent accumulation of anthocyanins in blood oranges. Plant Cell ,
v.3, p.1242-55, 2012.
BRANDES, A.; HESLOP-HARRISON, J.S.; KAMM, A.; S. KUBIS, R.L.; SCHMIDT, T.
Comparative analysis of the chromosomal and genomic organization of Ty1-copia-
like retrotransposons in pteridophytes, gymnosperms and angiosperms. Plant
Molecular Biology, v.33, p. 11-21, 1997.
CAPY, P.; BAZIN, C.; HIGUET, D.; LANGIN, T. Dynamics and evolution of
transposable elements. Austin, Texas: Landes Bioscience , p .197, 1998.
CAPY, P.; ANXOLABÉHÈRE, D.; LANGIN, T. The strange phylogenies of
transposable elements: are horizontal transfers the only explanation? Trends
Genetics, v. 10, p. 7– 12. 1994.
CASTELO BRANCO, J. S.; VIEIRA, E.A.; MALONE, G.; MAURICIO, M.K.; MALONE, E.; BERNARDES, A.; MISTURA, C.C.; CARVALHO, F.I.F.; OLIVEIRA, A.C. IRAP and REMAP assessments of genetic similarity in rice. Journal of Applied Genetics, v.48, n.2, p.107–113, 2007.
CHAO, Y.T; SU, C.L.; CHOW, T.Y.; LEE, P.F.; CHUNG, C.; HUANG, J.J; LIU, S.M.;
HSING, Y.I. A new rice transposable element, Botanical Bulletin of Academia
Sinica, v. 44, p. 1-11, 2003.
CORDEIRO, J. Investigação sobre a presença de retrotransposons em populações
naturais do grupo cardini do gênero drosophila (diptera: drosophilidae) do sul do
Brasil. Dissertação de Mestrado , Universidade Federal de Santa Maria, 2005.
COWPERTHWAITE, M.; PARKA, W.; XU, Z.; YAN, X.; MAURAISA, S. C.; DOONER,
H. K. Use of the transposon Ac as a gene-searching engine in the maize genome.
Plant Cell, v. 14, p. 713-726, 2002.
CRAIG, N. L. Mobile DNA: an introduction. In: CRAIG, N. L.; CRAIGIE, R.;
GELLERT, M.; LAMBOWITZ, A. M. (eds.). Mobile DNA II . Washington, DC: ASM
Press, p. 03-11, 2002.
35
DOMINGUES, D.S; CRUZ, G.M.Q., METCALFE, C.J, NOGUEIRA, F.T. S,
VICENTINI, R., ALVES, C. S, SLUYS, M-A. V., Analysis of plant LTR-
retrotransposons at the finescale family level reveals individual molecular patterns,
BMC Genomics , v.13, p. 137, 2012.
DOONER, H. K.; BELACHEW, A. Transposition pattern of the maize element Ac from
the Bz-M2(Ac) allele. Genetics , Austin, v. 122, p.447-457, 1989.
ESTEP, M.C.; DEBARRY, J.D.; BENNETZEN, J.L. The dynamics of LTR
retrotransposon accumulation across 25 million years of panicoid grass evolution.
Heredity , v.110, p.194–204, 2013.
FLAVELL, A.J., E. DUNBAR, R. ANDERSON, S.R. PEARCE, R. HARTLEY, AND A.
KUMAR. Ty1-copia group retrotransposons are ubiquitous and heterogeneous in
higher plants. Nucleic Acids Research , v.20, p.3639-3644,1992.
FESCHOTTE, C., JIANG, N., AND WESSLER, S.R, Plant transposable elements:
Where genetics meets genomics. Nature Reviews Genetics , v. 3, p. 329–341,
2002.
GRANDBASTIEN, M.A. Activation of plant retrotransposon under stress conditions.
Trends Plant Science , v.3, p. 181-187, 1998.
GRIFFITHS, A. J. F.; MILLER, J. H.; SUZUKI, D. T.; LEWONTIN, R. C.; GELBART,
W. M. Introdução à Genética. 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan . 2008.
HAWKINS, J.A.; KIM, H.; NASON, J.D.; WING, R.A. Differential lineage-specific
amplification of transposable elements is responsable for genome size variation in
Gossypium. Genome Research , v. 16, p. 1252-1261, 2006.
HIROCHIKA, H. Activation of tobacco retrotransposons during tissue-culture. The
Embo Journal . v.12, p. 2521-28, 1993.
HIROCHIKA, H.; FUKUCHI, A.; KIKUCHI, F. Retrotransposon families in rice.
Molecular and General Genetics , v.233, p. 209-216, 1992.
HOU, Y.; RAJAGOPA, J.; IRWIN, P.; VOYTAS,D. Retrotransposon vectors for gene
delivery in plants, Mobile DNA; v.1, p. 19, 2010.
36
KALENDAR, R.; FLAVELL, A.J; ELLIS, T.H.N; SJAKSTE, T.; MOISY, C.;
SCHULMAN, A.H. Analysis of plant diversity with retrotransposon-based molecular
markers, Heredity , v. 106, p. 520–530, 2011.
KALENDAR, R.; GROB, T.; REGINA, M.; SUONIEMI, A.; SCHULMAN, A. H. IRAP
and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques.
Theorical and Applied Genetics, v. 98, p. 704-711,1999.
KAPITONOV, V.V.; JURKA, J. Rolling-circle transposons in eukaryotes.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA , v. 98(15), p. 8714-8719,
2001.
KAPITONOV, V.V.; JURKA, J. Helitrons on a roll: eukaryotic rolling-circle
transposons. Trends Genetics , v. 23(10), p.521-529, 2007.
KAPITONOV, V.V.; JURKA, J. Molecular paleontology of transposable elements in
the Drosophila melanogaster genome. Proceedings of the National Academy of
Sciences USA , v.100 (11), p. 6569-6574. 2003.
KASHKUSH K.; FELDMAN, M.; LEVY, A.A. Transcriptional activation of
retrotransposons alters the expression of adjacent gens in wheat. Nature
Genetics ., v.33, p. 102-106, 2003.
KATSIOTIS, A.; SCHMIDT, T.; HESLOP-HARRISON, J.S. Chromosomal and
genomic organization of Ty1-copia-like retrotransposon sequences in the genus
Avena. Genome, v.39, p. 410–417, 1996.
KAZAZIAN, JR. H.H. Mobile elements and disease. Current Opinion in Genetics
Development , v. 8, p.343-350. 1998.
KIDWELL, M.G; LISCH, D.R. Transposable elements as source of variation in
animals and plants. Proceedings of the National Academy of Sciences US A, v.
94, n. 15, p. 7704-7711, 1997.
KIDWELL, M.G; LISCH, D.R. Transposable elements, parasitic DNA, and genome
evolution. Evolution, v. 55, p. 1-24, 2001.
KIM, H.; TERAKAMI, S.; NISHITANI, C.; KURITA, K.; KANAMORI, H.; KATAYOSE,
Y.; SAWAMURA, Y.; SAITO, T.; YAMAMOTO, T. Development of cultivar-specific
37
DNA markers based on retrotransposon-based insertional polymorphism in Japanese
pear, Breeding Science v. 62, p. 53–62, 2012.
KUMAR, A.; PEARCE, S.R.; MCLEAN K.; HARRISON, G.; HESLOP-HARRISON,
J.S.; WAUGH, R.; FLAVELL, A.J. The Ty1-copia group of retrotransposon in plants:
genomic organization, evolution, and use as molecular markers. Genetics , v.100,
p.205 – 217, 1997.
KUMAR, A.; BENNETZEN; J.L. Plant retrotransposons. Annual Review of
Genetics, v.33 p. 479-532, 1999.
KUMEKAWA, N.; OHMIDO, N.; FUKUI, K.; OHTSUBO, E.; OHTSUBO, H. A new
gypsy-type retrotransposon, RIRE7: preferential insertion into the tandem repeat
sequence TrsD in pericentromeric heterochromatin regions of rice chromosomes.
Molecular Genetics e Genomics, v.265, p.480-488, 2001.
KUMEKAWA, N.; OHTSUBO, H.; HORIUCHI, T.; OHTSUBO E. Identification and
characterisation of novel retrotransposons of the gypsy type in rice. Molecular
Genetics and Genomics ., v.260, p.593-602, 1999.
JIANG, N.; BAO, Z.; TEMNYKH, S.; CHENG, Z.; JIANG, J.; WING, R.A.;
MCCOUCH, S.R.; WESSLER, S.R. Dasheng: A Recently Amplified Nonautonomous
Long Terminal Repeat Element That Is a Major Component of Pericentromeric
Regions in Rice. Genetics , v.161, p.1293–1305, 2002.
JIANG, F.; YANG, M.; GUO, W.; WANG, X.; KANG, L. Large-Scale Transcriptome
Analysis of Retroelements in the Migratory Locust, Locusta migratoria. PLoS ONE
v.7(7): p. 1-15, 2012.
LAL, SK.; GIROUX, MJ.; BRENDEL, V.; VALLEJOS, CE.; HANNAH, LC. The maize
genome contains a helitron insertion. Plant Cell , v.15(2), p.381-391, 2003.
LANGDON, T.; THOMAS, A.; HUANG, L.; FARRA, K.; KING, J.; ARMSTEAD, I.
Fragments of the key flowering gene GIGANTEA are associated with helitron-type
sequences in the Pooideae grass Lolium perenne. BMC Plant Biology , v. 9, p. 70,
2009.
38
LI, W., ZHANG, P., FELLERS, J.P., FRIEBE, B., GILL, B.S. Sequence composition,
organization, and evolution of the core Triticeae genome. Plant Journal , v.40, p.
500-511, 2004.
MAO, L., T.C. WOOD, Y. YU, M.A. BUDIMAN, J. TOMKINS, S. WOO, M.
SASINOWSKI, G. PRESTING, D. FRISCH, S. GOFF, R.A. DEAN, WING, R.A. Rice
transposable elements: a survey of 73,000 sequence-tagged-connectors. Genome
Research ., v.10, p. 982-990. 2000.
MANNINEN, O.; KALENDAR, R.; ROBINSON, J.; SCHULMAN, A.H. Application of
BARE-1 retrotransposon markers to the mapping of a major resistance gene for net
blotch in barley. Molecular Genetics and Genomics , v.264, p. 325–334, 2000.
MARINI, N. Estudos fenotípicos e moleculares sobre variabilida de genética,
qualidade de grãos e tolerância ao estresse por fer ro em arroz. 126F. Tese
(Tese em Fitomelhoramento) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia.
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas,
2012.
MCCARTHY, E.M., LIU, J., LIZHI, G., MCDONALD, J.F. Long terminal repeat
retrotransposons of Oryza sativa. Genome Biology , v.3, p.1–11, 2002
MOCHIZUKI, K., M. UMEDA, H. OHTSUBO, AND E. OHTSUBO. Characterization of
a plant SINE, p-SINE1, in rice genomes. Journal of Genetics , v.67, p.155-166,1992.
MOTOHASHI, R., OHTSUBO, E., OHTSUBO, H. Identification of Tnr3, a suppressor-
mutator/enhancer-like transposable element from rice. Molecular Genomics and
Genetics , v.250, p.148-152. 1996.
MCCLINTOCK, M. The Order of the Genes C, Sh and Wx in Zea Mays with
Reference to a Cytologically Known Point in the Chromosome. Proceedings of the
National Academy of Sciences USA , v.17, p. 485–491, 1931.
MEAUX, J. ; PECINKA, A. The Arabidopsis genus An emerging model to elucidate
the molecular basis of interspecific differences in transposable element activity,
Mobile Genetic Elements , v.2:3, p. 142-144; 2012.
39
MELAKE-BERHAN, A.; SPRINGER, P.S.; EDWARDS, K.J.; LEE, M.; AVRAMOVA,
Z.; BENNETZEN, J.L. Nested retrotransposons in the intergenic regions of the maize
genome. Science , v.274, p.765-768; 1996.
MHIRI, C.; MOREL, J.B; VERNHETTES, S.; CASACUBERTA, J.M.; LUCAS, H.;
GRANDBASTIEN, M.A. The promoter of the tobacco Tnt1 retrotransposon is induced
by wounding and by abiotic stress. Plant Molecular Biology , v.33, p. 257-266, 1997.
MOREAU-MHIRI, C., MOREL, J.B, AUDEON, C., FERAULT, M., GRANDBASTIEN,
M.A, LUCAS, H. Regulation of expression of the tobacco Tnt1 retrotransposon in
heterologous species following pathogen-related stresses. Plant Journal , v.9, p.
409–419, 1996.
NOVIKOV, A.; SMYSHLYAEV, G.; NOVIKOVA, O. Evolutionary History of LTR
Retrotransposon Chromodomains in Plants, International Journal of Plant
Genomics , v.2012, p. 17, 2012.
PEARCE, S.R.; HARRISON, G. D.; LI, J.; KUMAR, A.; FLAVELL, A.J. The Ty1- copia
group retrotransposons in Vicia species: copy number, sequence heterogeneity and
chromosomal localisation. Molecular Genomics Genetics , v. 250, p.305-315.
1996a.
PEARCE, S.R.; PICH, U.; HARRISON, G.; FLAVELL, A.J.; HESLOP-HARRISON,
J.S.; SCHUBERT, I.; KUMAR, A. The Ty1-copia group retrotransposons of Allium
cepa are distributed throughout the chromosomes but are enriched in the terminal
heterochromatin. Chromosome Research , v. 4, p. 357-364, 1996b.
PILAR, G.B; BERNALLES, M.; MENDIOLA, M.V; La CRUZ, F. Single-stranded DNA
intermediates in IS91 rolling- circle transposit. Molecular Microbiology, v.39, p.494-
501, 2001.
POULTER, R.M.; GOODWIN, T.J.D.; BUTTER, M.I. Vertebrete helitrons and other
novel helitrons. Gene, v.313, p. 201-212, 2003.
POUTEAU, S.; GRANDBASTIEN, M.A; BOCCARA, M. Microbial elicitors of plant
defense response activate transcription of a retrotransposon. Plant Journal , v.5,
p.535-542, 1994.
40
POUTEAU, S., HUTTNER, E., GRANDBASTIEN, M.A, CABOCHE, M. Specific
expression of the tobacco tnt1 retrotransposon in protoplasts. The Embo Journal ,
v.10, p.1911-1918, 1991.
PRICE, Z., F. DUMORTIER, D.W. MACDONALD, AND S. MAYES. Characterisation
of copia-like retrotransposons in oil palm ( Elaeis guineensis Jacq.). Theoretical and
Applied Genetics , 104: 860-867, 2002.
PROVAN, J.; THOMAS, W. T. B.; FORESTER, B. P.; POWELL, W. Copia -SSR: A
simple marker technique which can be used on total genomic DNA. Genome , v. 42,
p.363-366; 1999.
RAIZADA, M. N.; NAN, G. L.; WALBOT, V. Somatic and germinal mobility of the
Rescue Mu transposon in transgenic maize. Plant Cell , Rockville, v. 13, p. 1587-
1608, 2001.
RANGNER, L.P. Transposons. In ZAHA A. (ed.) Biologia Molecular Básica . Porto
Alegre, Editora Mercado Aberto, 159p. 1996.
SANGLARD, D.A.; FERREIRA, J.V.; BRAZ. C. C. Transposons ou Elementos
Genéticos Móveis: Um dos Mais Peculiares Mecanismos de Recombinação
Gênica,disponível em
http://www.cdsa.ufcg.edu.br/portal/index.php?option =com_content&view=articl
e&id=1141:transposons-ou-elementos-geneticos-moveis -um-dos-mais-
peculiares-mecanismos-de-recombinacao-
genica&catid=92:artigos&Itemid=460 , acessado em dezembro de 2012.
SANMIGUEL, P.; A. TIKHONOV, Y.K. JIN, N. MOTCHOULSKAIA, D. ZAKHAROV,
A. MELAKE-BERHAN, P.S. SPRINGER, K.J. EDWARDS, M. LEE, Z. AVRAMOVA,
BENNETZEN, J.L. Nested retrotransposons in the intergenic regions of the maize
genome. Science , v. 274, p.765-768,1996.
SANMIGUEL, P.; BENNETZEN, J.L. Evidence that a recent increase in maize
genome size was caused by the massive amplification of intergene retrotransposons.
Annals of Botany, v. 82, p.37-44, 1998.
41
SCHAACK, S.; GILBERT, C.; FESCHOTTE, C. Promiscuous DNA: horizontal
transfer of transposable elements and why it matters for eukaryotic evolution. Trends
in Ecology and Evolution, vol. 25, p. 537–546, 2010.
SCHMIDT; T. LINEs, SINEs and repetitive DNA: non-LTR retrotransposons in plant;
Plant Molecular Biology , v. 40,p. 903–910, 1999.
SCHULMAN, A.H.; FLAVELL, A.J; PAUX, E.; ELLIS, T.H. The application of LTR
retrotransposons as molecular markers in plants. Methods Molecular Biology. , v.
859, p.115-53 ; 2012.
SCHULMAN, A. H. Molecular markers to assess genetic diversity. Euphytica. 158:
313-321; 2007.
SCHULMAN, A.H.; FLAVELL, A. J.; ELLIS, T. H. N. The application of LTR
retrotransposons as molecular markers in plants. Methods Molecular Biology , v.
260, p.145-173; 2004.
SHIRASU, K.; SCHULMAN, A.H.; LAHAYE, T.; SHULZE-LEFERT, P. A Contiguous
66-kb Barley DNA Sequence Provides Evidence for Reversible Genome Expension.
Genome Research , v. 10, p. 908-915, 2000.
SUONIEMI, A.; NARVANTO, A.; SCHULMAN, A.H. The BARE-1 retrotransposon is
transcribed in barley from an LTR promoter active in transient assays. Plant
Molecular Biology , v.31, p. 295–306, 1996.
TAKEDA, S., SUGIMOTO, K. , OTSUKI, H., HIROCHIKA, H. 13–bp cis-regulatory
element in the LTR promoter of tobacco retrotransposon Tto1 is involved in
responsiveness to tissue culture, wounding, methyl jasmonate and fungal elicitors.
Plant Journal , v.18, p.1–11, 1999.
TANAKA, Y.; CHUNG, L.; PARK, I. H. Impact of retrotransposons in pluripotent stem
cells, Molecules and Cells , v. 34, p. 509-516, 2012.
TURCOTTE, K.; SRINIVASAN, S.; BUREAU, T. Survey of transposable elements
from rice genomic sequences. Plant Journal. v.25, p.169-179, 2001.
42
VAN SCHAIK, N. W.; BRINK, R. A. Transpositions of modulator, a component of the
variegated pericarp allele in maize. Genetics , v. 44, p. 725-738, 1959.
VENNER, S.; FESCHOTTE, C.; BIÉMONT, C. Dynamics of transpos a community
ecology of the genome. Trends in Genetics . v.25, p. 317-323, 2009.
VICIENT, C.M.; KALENDAR, R.; ANAMTHAWAT-JONSSON, K.; SCHULMAN, A.H.
Structure, functionality, and evolution of the BARE -1 retrotransposon of barley.
Genetica, v.107, p. 53-63, 1999.
VOYTAS, D.F.; CUMMINGS, M.P.; KONIECZNY, A.; AUSUBEL, F.M.; RODEEMAL
S.R. Copia-like retrotransposons are ubiquitous among plants. Proceedings of the
National Academy of Science of the United States of America, v.89, p.7124 –
7128, 1992.
WICKER, T.; SABOT, F.; HUA-VAN, A.; BENNETZEN, J.L.; CAPY, P.; CHALHOUB,
B.; FLAVELL, A.; LEROY, P.; MORGANTE, M.; PANAUD, O.; PAUX, E.;
SANMIGUEL, P.; SCHULMAN, A.H. A unified classification system for eukaryotic
transposable elements. Nature Reviews Genetic, v.8, p.973-982. 2007.
WRIGHT, D.A., N. KE, J. SMALLE, B.M. HAUGE, H.M. GOODMANT, AND D.F.
VOYTAS. Multiple non- LTR retrotransposons in the genome of Arabidopsis thaliana.
Genetics , v. 142: 569-578, 1996.
YANG, L.; BENNETZEN, J. L. Structure-Based Discovery and Description of Plant
and Animal "Helitrons". Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, v. 106, p. 12832-12837, 2009.
ZEDEK, F.; SMARDA, J.; SMARDA, P.; BURES, P. Correlated evolution of LTR
retrotransposons and genome size in the genus Eleocharis, BMC Plant Biology,
v.10, p.265, 2010.
43
3. Capítulo II
Análise de retrotransposons para a avaliação da var iabilidade genética
em diferentes cultivares de arroz
3.1 Introdução
O arroz (Oryza sativa L.) é um dos alimentos mais importantes para a
nutrição humana, sendo o principal alimento para mais da metade da população
mundial, além de desempenhar um importante papel tanto no âmbito social e
econômico quanto cultural. Atualmente é o segundo cereal mais produzido no
mundo (FAO, 2012). O Estado do Rio Grande do Sul é responsável pela maior
produção de arroz no Brasil, contribuindo com cerca de 70% na safra de 2011/2012.
Além disso, o Rio Grande do Sul produz arroz no sistema de cultivo irrigado, que
representa à principal forma de produção (CONAB, 2012).
Além de sua importância social e econômica, o arroz é uma planta modelo
entre as monocotiledôneas, pois apresenta um genoma pequeno (cerca de 430
Mbp) que foi completamente sequenciado (cultivar Nipponbare subespécie japonica
(~ 380 Mbp) (IRGSP, 2005). Outros aspectos que a fazem como uma planta modelo
é a ampla coleção de germoplasma e o vasto repertório de recursos genéticos e
moleculares (PATERSON et al., 2005).
Além disso, seu genoma apresenta diversos elementos de transposição,
muitos desses elementos ocorrem em regiões diferentes e em números diversos,
alterando a variabilidade do genoma, aumentando seu tamanho e produzindo
mutações dentro dos genes e entre os genes (AGRAWAL et al., 2001).
Em arroz, existem 3 famílias principais de retrotransposons, o Tos, RIRE3,
p- SINE 1 (KUMAR; BENNETZEN, 1999). A família mais estudada de elementos
transponíveis em arroz é a do Tos. Entre o retrotransposon mais estudado, está o
Tos 17. Estudos de análise funcional do genoma utilizam esse elemento para
localizar, identificar e determinar funções de genes. A clonagem por ‘’gene tagging’’
tem sido utilizada com sucesso em Tos 17. Uma cópia do Tos 17 pode causar uma
mutação, podendo ser identificada em gel de agarose e o gene mutado pode ser
caracterizado em reação em cadeia de polimerase (PCR) (KUMAR; HIROCHIKA,
2001). Outros estudos baseiam-se em genética reversa onde, ocorre uma seleção
de inserções utilizando combinações de oligonucleotídeos iniciadores baseados em
genes de interesse e outra no retrotransposon Tos 17 (OCHMAN et al, 1998).
45
O tamanho do Tos 17 é de 4114 pares de bases e, em contraste com outros
retrotransposons vegetais (por exemplo, BARE-1, tem > 50.000 cópias no genoma
da cevada (VICIENT et al., 1999), o número de cópias no genoma do arroz é
considerado muito baixo:1-5 cópias dependendo da cultivar , em Nipponbare, que
foi selecionado como uma cultivar padrão para a IRGSP (International rice genome
sequencing project: the effort to completely sequence the rice genome), apresenta
apenas duas cópias no genoma haplóide (HIROCHIKA, 2001).
Um estudo mostra que uma cópia do retrotransposon chamado de like Tos 17
é inativada em condições normais, é ativada por cultura de tecido e inativada
novamente em plantas regeneradas (HIROCHIKA et al., 1996)
Os locais de inserção da distribuição de Tos 17 no genoma do arroz foram
pesquisados com o programa BLASTN contra as sequências genômicas de arroz.
Um total de 20.458 loci foram mapeados em 521 Mbp de sequência genômica, e o
intervalo de inserção média foi estimada para ser de 22 kb (MIYAO et al., 2003)
Ainda no mesmo estudo os resultados, mostraram que o Tos 17 preferiu regiões
mais densas de gene (regiões de heterocromatina) se anelando em sequência
consenso palíndrômica ANGTT-TSD-AACNT.
Além do retrotransposon Tos 17, há outros elementos transponíveis
conhecidos em arroz e usados como marcadores moleculares. Um transposon que
apresenta muitas das características desejadas é o mPing (JIANG et al., 2003). É
um elemento transponível de repetição invertida que se movimenta em uma alta
frequência e atingiu um número alto de cópias em alguns cultivares de arroz (NAITO
et al., 2006). Também, descoberto em Arabidopsis thaliana o elemento mPong
(YANG et al., 2007).
Segundo Castelo Branco et al. (2007) e Marini (2012), já existem técnicas
eficientes e comprovadas que utilizam retrotransposons como marcadores
moleculares em diferentes cultivares de arroz, essas técnicas são IRAP (Inter
Retrotransposon Amplified Polymorphism) e REMAP (Retrotransposon Microsatellite
Amplified Polymorphism)
A técnica IRAP (Inter Retrotransposon Amplified Polymorphism) revela o
polimorfismo existente entre dois elementos transponíveis (TEs) dispostos em
46
diferentes orientações (KALENDAR et al., 1999, PRICE et al., 2003), pois a
orientação do retrotransposon no genoma acontece ao acaso, podendo ocorrer em
sentidos opostos (3’ – 5” ou 5’ – 3’), isso tem possibilitado estudar a distância genética
de genótipos de arroz, pois constitui uma ferramenta de “DNA fingerprinting”. Além
disso, essa técnica ainda permite a identificação da proximidade entre
retrotransposons utilizando primers específicos que amplificam regiões entre as
extremidades repetidas dos TEs (LTR – Long Terminal Repeats).
Diante disto, a técnica IRAP-REMAP (Figura 1) surgiu visando o uso de uma
metodologia diferente das técnicas de marcadores moleculares utilizadas
anteriormente. Ao invés de utilizar enzimas de restrição, que muitas vezes são
sensíveis e não cortam o DNA, essa técnica utiliza iniciadores que amplificam regiões
entre retrotransposons e entre retrotransposons e microssatélites, gerando um alto
padrão polimórfico de fragmentos de DNA (KALENDAR et al., 1999; PRICE et al.,
2003).
Figura 1: Esquema representando a técnica de IRAP-REMAP, segundo KALENDAR et al.(1999) ,adaptado.
3.2 Objetivo do Trabalho
Assim, tendo exposto a importância dos retrotransposons como marcadores
moleculares em plantas, este estudo teve como objetivo avaliar a similaridade
genética entre diferentes cultivares de arroz baseada nas técnicas de IRAP e
PCR com oligonucletídeos para regiões conservadas do transposon
Produto Amplificado
Visualização em gel de agarose dos fragmentos de DNA amplificados
PCR com oligonucletídeos para regiões conservadas do transposon
Produto Amplificado
PCR com oligonucletídeos para regiões conservadas do Transposon e Microssatéites
Visualização em gel de agarose dos fragmentos de DNA amplificados
47
REMAP utilizando a presença de retrotransposons. E como hipótese, há
variabilidade genética entre as cultivares de arroz quanto ao número e posição das
inserções dos elementos transponíveis.
3.3 Metodologia
3.3.1 Material Vegetal
O trabalho foi realizado no Laboratório de Genômica do centro de Genômica
e Fitomelhoramento (LGF), pertencente ao Departamento de Fitotecnia, da
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da Universidade Federal de Pelotas,
localizado no município do Capão do Leão/RS. Foram utilizados 20 genótipos de
arroz (Tabela 1). Os genótipos pertencem á coleção de trabalho de arroz da
Embrapa Clima Temperado e outros pertencem á coleção de trabalho do
CGF/FAEM/ UFPel.
Tabela 1: Genótipos utilizados para análise de similaridade genética. CGF/ FAEM/UFPel, Pelotas-RS, 2013.
Número Nome do Genótipo Gênero/ Origem
1 Daw Dam Filipino
2 Sole You Filipino
3 BRS Bojuru Japonica
4 Saiban Japonês
5 Nipponbare Japonica
6 CGF-Z-M9-22P Indica
7 BRS Firmeza Japonica
8 BRS Atalanta Indica
9 BRS 7 Taim Indica
10 BRS Pampa Indica
48
11 BR IRGA 409 Indica
12 IRGA 424 Indica
13 BR IRGA 410 Indica
14 IRGA 426 Indica
15 Epagri 106 Indica
16 Epagri 108 Indica
17 Puitá Inta CL Indica
18 Primavera Indica
19 Sinuelo Indica
20 Tokiwanishiki Japonês
3.3.2 Extração de DNA
O DNA foi extraído a partir de amostras foliares jovens de cada genótipo, por
meio do método de extração CTAB modificado (SAGHAI-MAROOF, 1984). A
quantificação do DNA foi realizada por eletroforese em gel de agarose (1%) corado
com brometo de etídeo, onde a concentração de DNA foi estimada através do
padrão de comparação conhecido do marcador molecular Low DNA Mass Ladder
(Invitrogen – Life Technologies), e as respectivas diluições foram realizadas para
padronizar a concentração final em aproximadamente 50 ng µ-1.
3.3.3 Reação de IRAP-REMAP (Inter Retrtransposon Amplified Polymorfism –
Retrotransposon Microssatélite Amplified Polimorfis m)
As reações de amplificação foram realizadas de acordo com a técnica IRAP-
REMAP, segundo protocolo proposto por KALENDAR et al. (1999), utilizando dois
primers do elemento transponível Tos 17, que foram sintetizados a partir da
descrição de suas sequências (HIROCHIKA et al., 1996) e oito primers do elemento
transponível ping pong, todos combinados com 12 primers específicos - ISSR.
(Tabela 2 e 3). Foram feitas 20 combinações dos primers dos elementos
49
transponíveis com os primers específicos de ISSR (Tabela 4).
Tabela 2. Primers dos elementos transponíveis para análise de similaridade genética. CGF/ FAEM/UFPel, Pelotas-RS, 2013.
Elemento Transponível Sequência (5’ – 3’)
TOS17_F GCTTTTCTTCATGGTGA
TOS17_R CACGGGAGGAAGTATGA
PING1_F GTCACAATGGGGGTTTCACT
PING1_R GGCCAGTCACAATGGCTAGT
PING2_F CTACGGAGTACACCGCAACC
PING2_R AATGGATTGCCTACTGCTGACT
PONG1_F AACGAGGCTTCTGACCATCG
PONG1_R CAGGTTCCTGAACGGTTGAT
PONG2_F GGGGTGAAACAGCATTGAGA
PONG2_R TGTGGTTGCAAAGACCA
Tabela 3. Primers ISSR utilizados no trabalho. CGF/ FAEM/UFPel, Pelotas-RS, 2013
CombinaçõesISSR
(CT) 23 G
(CT) 25 T
(GA) 23 A
(GA) 23 T
(GA) 23 C
(GA)23 G
(CGC) 16 T
(CGC) 16 A
(CGG) 16 G
(CGG) 16 T
(CGG) 16 A
CGG) 16 C
50
Tabela 4. Combinações utilizadas dos primers dos elementos transponíveis com primers ISSR, para análise de similaridade genética. CGF/ FAEM/ UFPel, Pelotas-RS, 2013.
Número da Combinação
Combinação Número da Combinação
Combinação
1 PING 2R+ CGC (A)
11 TOS 17 F+ CGC (A)
2 PING 2R+ CT (G) 12 TOS 17 F+ CGC (T)
3 PING 1F + CT (T) 13 TOS 17 R+ CT (G)
4 PONG 2R+ CT (G)
14 TOS 17 F+ GA (A)
5 PONG 1F+ CT (G)
15 TOS 17 F+ CGG (A)
6 PING 2F+ CGC (T)
16 TOS 17 F+ CGG(T)
7 PONG 2R+ CGC (A)
17 TOS 17 F+ CGG(C)
8 PONG 1F+ GA (C)
18 TOS 17 F+ CGG(G)
9 PING 1F+ GA (C) 19 TOS 17 R+ CT (T)
10 TOS 17 F+CT (A)
20 TOS 17F + CT(T)
3.3.4 Amplicações por PCR
As amplificações de PCR foram realizadas numa reação contendo
GoTaq® Green Master Mix (Promega) a partir do protocolo indicado pelo fabricante.
Foram utilizados na reação de PCR, 3 ul de água, 2ul de DNA, 1,5 ul de cada primer
e 6 ul de GoTaq® Green Master Mix, totalizando um volume final da reação de 14 ul.
O programa de amplificação utilizado foi chamado de “touchdown”, que consistiu de
uma desnaturação inicial de 94ºC por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos compostos
de 94 ºC por 1 minuto de desnaturação, o anelamento onde ocorreu um decréscimo
51
de 1 ºC na temperatura a cada ciclo (no intervalo de 62 ºC até 55 ºC) e da extensão
de 72 ºC por 1 minuto. Após a amplificação, foi feito a extensão final de 72ºC por 10
minutos. Os produtos da reação foram separados através de eletroforese em gel de
agarose 3% e visualizados mediante coloração com Blue Green, contendo tampão
TBE 0,5X (Tris 0,045M, ácido bórico 0,045M e EDTA 0,001M, pH 8,0).
3.3.5 Visualização em gel de poliacrilamida 6%
As combinações escolhidas foram testadas em gel de poliacrilamida 6% e
visualizadas mediante coloração com nitrato de prata (CRESTE et al., 2001), com o
objetivo de obter marcadores e que estes fossem eficientes para explicar a
variabilidade existente entre os genótipos analisados.
3.4 Análise dos dados
A análise dos produtos da amplificação foi feita classificando os fragmentos
independentemente conforme presença (1) e ausência (0) de cada fragmento
amplificado em diferentes alturas do gel de poliacrilamida para que os dados fossem
utilizados na construção de uma matriz binária. Os dados gerados foram utilizados
para o cálculo de similaridade genética entre todos os pares de indivíduos, com o
auxílio do programa computacional NTSYS pc 2.1 (ROHLF, 2000). Para descrever
os padrões de similaridade foi adotado o coeficiente de Dice. Com base na matriz de
similaridade gerada, foi construído um dendrograma por meio do método não-
ponderado de agrupamento aos pares UPGMA (Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean) (SNEATH; SOKALI, 1973). Para a verificação do ajuste entre a
matriz de similaridade e o respectivo dendrograma, ou seja, para avaliar o grau de
concordância entre a matriz e o dendograma, foi estimado o coeficiente de
correlação cofenética (r), de acordo com o teste de Mantel (MANTEL, 1962)
utilizando 1000 permutações, realizados no programa NTSYS v 2.1. (SOKAL;
ROHLF, 1962). A estabilidade estatística do agrupamento foi estimada por meio da
análise de bootstraping com 1000 replicações, através do programa computacional
WINBOOT 1.0 (YAP; NELSON, 1996).
52
3.5 Resultados e Discussão
Foram testadas 20 combinações de primers dos elementos transponíveis
com os primers de ISSR, onde apenas 10 foram consideradas melhores para a
análise dos dados e interpretação dos resultados (Tabela 5).
Tabela 5. Combinações de Primers selecionadas para a análise dos dados.
CGF/ FAEM/ UFPel, Pelotas-RS, 2013.
N° das Combinações Combinações
Combinação 11 TOS 17 F+ CGC (A)
Combinação 13 TOS 17 R+ CT (G)
Combinação 14 TOS 17 F+ GA (A)
Combinação 15 TOS 17 F+ CGG (A)
Combinação 16 TOS 17 F+ CGG(T)
Combinação 17 TOS 17 F+ CGG(C)
Combinação 18 TOS 17 F+ CGG(G)
Combinação 19 TOS 17 R+ CT (T)
Combinação 20 TOS 17F + CT(T)
A partir das análises que foram realizadas, foi obtido um total de 65
fragmentos de DNA , sendo 39 monomórficos e 26 polimórficos (Figura 2 A e B).
Figura 2A . Perfil das bandas em gel de agarose (3%) com genótipos de arroz com combinação Tos 17 com primers ISSR. 1. MARCADOR 1KB Plus Invitrogen, 2. Genótipo 1 ao 11. CGF/FAEM/UFPel, 2013.
1 2
53
Figura 2B. Perfil do padrão de bandas obtido, em gel de acrilamida (6%), referente às combinações de primers que foram selecionadas em gel de agarose . CGF/FAEM/UFPel, 2013.
No presente trabalho, pelo método de agrupamento UPGMA foi construído
um dendrograma (Figura 2). Com um bom ajuste entre as distâncias apresentadas
graficamente e a matriz original de distâncias (correlação cofenética (r) de 0,81,
atribuindo confiabilidade à análise. Valores superiores a 0,70 podem ser
considerados eficientes na representação gráfica de distâncias genéticas (ROHLF
2000; MEYER 2002; VIEIRA et al., 2007). Os melhores valores mostrados e
considerados do boostraping (acima de 0.60) (YAP; NELSON, 1996).
Figura 3 : Dendograma de 20 genótipos de arroz obtido através da análise IRAP e REMAP, utilizando o índice de similaridade de Dice (1945) e o método de agrupamento UPGMA. Os valores encontrados nos grupos indicam o valor percentual de vezes que os genótipos agruparam em 1000 ciclos de análise de boostraping utilizando o programa Winboot. O valor do coeficiente de correlação cofenética (r) é de 0,81. CGF / FAEM/ UFPel, 2013.
Similaridade média entre os genótipos
(0,41)
I
II
III
IV
54
A similaridade média entre os genótipos obteve o valor de 0,41, resultando
em 4 grupos. Os genótipos Puitá Inta CL e Primavera, apresentaram uma alta
similaridade (98,4%) no grupo II, assim como IRGA 424 e IRGA 426 (98,8%), no
grupo III, e no grupo 4 , os genótipos BRS Bojuru e Nipponbare, assim como os
filipinos DAW DAM e SOLE YOU, apresentaram 100% de similaridade.
O grupo I é composto pelo genótipo, de origem Japonesa Tokiwanshiki.
Segundo Castelo Branco et al., 2007, seus resultados mostram seus genótipos
japoneses com valores maiores de bootstraping (93,4%), evidenciando que os
grupos japoneses representam um grupo homogêno e diferente dos demais. O
grupo II é representado pelos genótipos Puitá Inta CL, Primavera e EPAGRI 108.
São cultivares que se destacam pela boa qualidade dos grãos e com excelente
qualidade culinária. No grupo III agruparam-se os genótipos IRGA 424 e IRGA 426,
porque são linhagens irmãs.
No grupo IV, houve a formação de um agrupamento de 14 cultivares, sendo a
maioria destas pertencentes a subespécie indica. Apesar da estreita base genética
do arroz, vários trabalhos citam que há maior variabilidade genética dentro da
subespécie índica (GHAREYAZIE et al., 1995; MACKILL, 1995; ZHANG et al., 1996;
CAO et al., 1997; ZHU et al., 1998; SUN et al., 2001; LOPES, 2002).
A similaridade genética detectada entre os genótipos do Brasil e genótipos
filipinos no grupo IV é, provavelmente, devido ao fato de que variedades de arroz
cultivadas no Brasil têm sua constituição genética composta tanto subespecies
indica e japonica, sendo estes traços adquiridos a partir de cruzamentos entre
cultivares tradicionais de arroz de terras altas (japonica) e cultivares de arroz de
terras baixas (indica), mostra uma relação genética com os genótipos restantes,
sendo em estudos anteriores, genótipos brasileiros e filipinos agruparam-se juntos
(MALONE et al., 2006).
Ainda no grupo IV, os genótipos japonêses Saiban e Nipponbare foram
agrupados com os outros genótipos brasileiros e filipinos. O único genótipo a se
mostrar distinto foi o TOKIWANISHIKI. Este possivelmente não é aparentado com os
genótipos utilizados pelos melhoristas no Brasil e Filipinas. Em trabalhos recentes,
foi mostrado que os genótipos BRS 7 TAIM e BR IRGA 409 se agruparam no
mesmo grupo, porque são aparentados (MARINI, 2012).
55
Segundo Bohn et. al. (1999) a precisão das estimativas de similaridade
genética, baseada em marcadores moleculares depende da localização e do número
de marcadores utilizados. Mesmo assim, diante dos resultados apresentados foi
possível identificar a eficácia dos retrotransposons como marcadores moleculares
em arroz, através da técnica IRAP-REMAP em termos de variabilidade genética,
como foi anteriormente estabelecido em cevada (KALENDAR et al., 1999), ervilha
(FLAVELL et al. 1998) e vários gêneros Triticeae (KALENDAR et al., 2004) e no
arroz (CASTELO BRANCO et. al., 2007; MARINI, 2012).
3.6 Conclusões
Os resultados obtidos neste trabalho mostram que é possível avaliar a
variabilidade genética em genótipos de arroz usando técnicas de marcadores
moleculares baseados em retrotransposons. Os genótipos mais similares, de
acordo com as técnicas de IRAP e REMAP, foram os genótipos Nipponbare e Bojuru
e os genótipos IRGA 424 e 426. Os genótipos mais dissimilares entre os analisados
foram EPAGRI-108, Puitá, Primavera e Tokiwanishiki.
56
3.7 Referências Bibliográficas
AGRAWAL, G.K.; YAMAZAKI, M.; KOBAYASHI, M.; HIROCHIKA, R.; MIYAO, A.;
HIROCHIKA, H. Screening of the rice viviparous mutants generated by endogenous
retrotransposon Tos17 insertion. Tagging of a zeaxanthin epoxidase gene and a
novel ostatc gene. Plant Physiology , v.125, p.1248-1257, 2001.
BOHN, M.; UTZ, H.F ; MELCHINGER, A.E. Genetic similarities among winter wheat
cultivars determined on basis of RFLPs, AFLPs and SSRs and their use for prediting
progeny variance. Crop Science , v. 39, p.228-237, 1999.
CAO, D. et al. Pedigree and RAPD-based DNA analysis of commercial U.S. rice
cultivars. Crop Science , v. 37, n. 5, p. 1630-1635, 1997.
CASTELO BRANCO, J. S.; VIEIRA, E.A.; MALONE, G.; MAURICIO, M.K.; MALONE,
E.; BERNARDES, A.; MISTURA, C.C.; CARVALHO, F.I.F.; OLIVEIRA, A.C. IRAP
and REMAP assessments of genetic similarity in rice. Journal of Applied Genetics,
v.48, n.2, p.107–113, 2007.
CRESTE, S.; TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A. Detection of single sequence
repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver
staining. Plant Molecular Biology, v.19, p.1-8, 2001.
CONAB. Companhia Nacional de Abastecimento . Disponivel em:
http://www.conab.gov.br. Acesso em 19 de Dezembro de 2012.
FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations.Statistical
databases . Disponível em: http://www.fao.org, 2012.
DICE, L.R. Measures of the amount of ecologic association between
species. Ecology, v.26, p. 297–302, 1945.
FLAVELL, A.J.; KNOX, M.R.; PEARCE, S.R.; ELLIS, T.H.N. Retrotransposon-based
insertion polymorphisms (RBIP) for high throughput marker analysis. Plant Journal,
v.16, n.5, p. 643- 650, 1998.
GHAREYAZIE, B. et al. Classification of rice germplasm. I. Analysis using AFLP and
PCR-based RFLP. Theoretical and Applied Genetics , Heidelberg, v. 91,n. 2, p.
218-227, 1995.
57
HIROCHIKA; H. The Tos17 retrotransposon and rice functional genomics, Plant
Biology 4:118–122, 2001.
HIROCHIKA, H.K.; SUGIMOTO, Y.; OTSUKI, H.; TSUGAWA, A.; KANDA, M.
Retrotransposon of rice involved in mutation by culture. Proceedings of the
National Academy Sciences, USA, v.93, p. 7783-7788, 1996.
JIANG, N.; BAO, ZR.; ZHANG, X.Y; HIROCHIKA, H.; EDDY, S.R.; MCCOUCH, S.R.;
WESSLER, S.R. An active DNA transposon family in rice. Nature ., v. 421, p. 163–
167, 2003.
KALENDAR, R.; GROB, T.; REGINA, M.; SUONIEMI, A.; SCHULMAN, H. IRAP and
REMAP: two new retrotransposon based DNA fingerprinting techniques. Theoretical
and Applied Genetics, v. 98, p. 704 – 711, 1999.
KALENDAR, R.; VICIENT, C.M.; PELEG, O.; ANAMTHAWAT-JONSSON, K.;
BOLSHOY, A.; SCHULMAN, H. Large retrotransposon derivatives: abundant,
conserved but nonautonomous retroelements of barley and related genomes.
Genetics, v.166, p.1437–1450, 2004.
KALENDAR, R.; SCHULMAN, A.H. IRAP and REMAP for retrotransposon-based
genotyping and fingerprinting. Nature Protocols, v.1, p. 2478–2484, 2004.
KUMAR, A.; BENNETZEN; J.L. Plant retrotransposons. Annual Review of
Genetics, v.33 p. 479-532, 1999.
KUMAR, A.; HIROCHIKA, H. Applications of retrotransposons as genetic tools in
plant biology. Trends Plant Science, v.6, p. 127-134, 2001.
LOPES, M. C. B. Caracterização fenotípica e molecular de genótipos d e arroz
irrigado . 2002. 80 f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em
Fitotecnia, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, 2002.
MARINI, N. Estudos fenotípicos e moleculares sobre variabilida de genética,
qualidade de grãos e tolerância ao estresse por fer ro em arroz .126F. Tese
(Tese em Fitomelhoramento) – Programa de Pós-Graduação em Agronomia.
58
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas,
2012.
MACKILL, D. J. Classifying japonica rice cultivars with RAPD markers. Crop
Science , Madison, v. 35, n. 3, p. 889-894, 1995.
MALONE,G.; ZIMMER, P.D. ; KOPP, M.M. ; MATTOS, L.A. ; CARVALHO, F.I.F. ;
OLIVEIRA, A,C. Assessment of the genetic variability among rice cultivars revealed
by amplified fragment length polymorphism (AFLP). Revista Brasileira de
Agrociências , Pelotas, v. 12, n. 1, p. 21-25, 2006.
MANTEL, N.A. The detection of disease clustering and a generalized regression
approach. Cancer Research , v. 27, p. 209-220. 1962.
MEYER, A.S. Comparação de coeficientes de similaridade usados em análises
de agrupamento com dados de marcadores moleculares dominantes. Piraciaba,
Dissertação de Mestrado. Escola Superior de Agronomia “Luiz de Queiroz” /
Universidade de São Paulo, 2002, 118f.
MIYAO, A.; KATSUYUKI,T.; MURATA, K.; SAWAKI, H.; TAKEDA, S.; ABE, K.;
SHINOZUKA, Y.; ONOSATO, K.; HIROCHIKA,H. Target Site Specificity of the Tos17
Retrotransposon Shows a Preference for Insertion within Genes and against
Insertion in Retrotransposon-Rich Regions of the Genome, The Plant Cell , Vol. 15,
1771–1780; 2003.
NAITO, K.; ZHANG, F.; TSUKIYAMA, T.; SAITO, H.; HANCOCK, C.N;
RICHARDSON, A.O; OKUMOTO, Y.; TANISAKA, T.; WESSLER, S.R. Unexpected
consequences of a sudden and massive transposon amplification on rice gene
expression. Nature., v. 461, p. 1130–1134, 2009.
OCHMAN, H.; GERBER, A.S;HARTL, D. Genetic applications of an inverse
polymerase chain reation. Genetics , Austin, v.120, p.621-623,1988.
PATERSON, A.H.; FREELING, M.; SASAKI, T. Grains of knowledge: genomics of
model cereals. Genome Research, v.15, p. 1643–1650, 2005.
PRICE, Z.; SCHULMAN, A.H.; MAYES, S. Development of new marker methods –
an example from oil palm. Plant Genetics Research, v.1, p. 103–113, 2003.
59
ROHLF, F.J NTSYS-pc, Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis
System, Version 2.1. Exeter Publications, New York, USA. 2000.
SAGHAI-MARROF, M.A. Ribosomal DNA spacer length polymorphism in barley:
Mendelian inheritance, chromosome location and population dynamics. Proceedings
of the national academy of sciences of the USA, v.89, n.2, p.1477-1481, 1984.
SNEATH, P.H.A.; SOKAL, R.R. Numeric Taxonomy: the principles and practice
of numerical classification. San Francisco: W. H. Freeman, 573p. 1973.
SASAKI T, BURR B: International rice genome sequencing project:the effort to
completely sequence the rice genome. Current Opinion Plant Biol 2000, 3:138-141
SOKAL, R.R.; ROHLF, F.J. The comparison of dendrograms by objective
methods. Taxonomy, Berlin, v.11, p. 130-40, 1962.
SUN, C. Q. et al. Comparison of the genetic diversity of common wild rice (Oryza
rufipogon Griff.) and cultivated rice (Oryza sativa L.) using RFLP markers.
Theoretical and Applied Genetics , Heidelberg, v. 102, n. 1, p. 157-162, 2001.
VICIENT CM, SUONIEMI A, ANAMTHAWAT-JONSSON K, TANSKANEN J,
BEHARAV A, NEVO E, SCHULMAN AH: Retrotransposon BARE-1 and its role in
genome evolution in the genus Hordeum, Plant Cell. 11:1769-1784, 1999.
VIEIRA, E.A.; CARVALHO, F.I.F.; BERTAN, I., KOOP, M.M.; ZIMMER, P.D.; BENIN,
G.; SILVA, J.A.G.; HARTWIG, I.; MALONE, G.; OLIVEIRA, A.C. Association between
genetic distances in wheat (Triticum aestivum L.) as estimated by AFLP and
morphological markers. Genetics and Molecular Biology , v.30, n.2, 392-399, 2007.
YANG, G.J.; ZHANG, F.; HANCOCK, C.N.; WESSLER, S.R. Transposition of the rice
miniature inverted repeat transposable element mPing in Arabidopsis thaliana.
Proceedings of the National Academy Sciences USA., v. 104, p. 10962–10967,
2007.
YAP, I.V.; NELSON, R.J. WinBoot: A program for performing bootstrap analysis of
binary data to determine the confidence limits of UPGMA-based dendograms. 1996.
60
ZHANG, Q. et al. Molecular marker heterozigosity and hybrid performance in indica
and japonica rice. Theoretical and Applied Genetics , Heidelberg, v. 93, n. 8, p.
1218-1224, 1996.
ZHU, J. et al. AFLP markers for the study of rice biodiversity. Theoretical and
Applied Genetics , Heidelberg, v. 96, n. 5, p. 602-611, 1998.
61
Vita
Gabriela Guerra dos Santos nasceu em 03 de maio de 1986, em Pelotas-RS, filha de Wladimyr Ferraz dos Santos e Mariluci Guerra dos Santos, natural de Pelotas – RS. Completou o Ensino Fundamental (1° grau) e Ensino Médio (2° grau) no Colégio Municipal Pelotense, em Pelotas (RS), Em março de 2004 ingressou, no curso de Ciências Biológicas na Universidade Federal de Pelotas (UFPel), obtendo o título de Biológa no ano de 2010. Do ano de 2007 ao ano de 2009, estagiou no Ambulatório de Genética Humana da UFPel, sob orientação do médico geneticista Gilberto de Lima Garcias. Em fevereiro de 2010 iniciou sua trajetória profissional inicialmente como estagiária voluntária no Laboratório de Vacinas sob a coordenação do Professor Odir Dellagostin, e cursando disciplinas como aluna especial no curso de Pós-graduação em Biotecnologia. Em Julho de 2010, foi bolsista de apoio técnico no projeto Xisto Agrícola da Embrapa Clima Temperado. Em março de 2011 ingressou no mestrado pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGB/UFPEL), sob orientação do professor Antônio Costa de Oliveira, no Centro de Genômica e Fitomelhoramento (CGF) na FAEM/UFPEL, atuando em projetos e participando no desenvolvimento de trabalhos relacionados ao melhoramento genético de arroz onde participou de vários congressos. Em novembro de 2012, foi aprovada no curso de Doutorado em Agronomia, sob futura orientação da Pesquisadora Doutora Caroline de Castro Marques.