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Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento Tecnológico - CDTec

Núcleo de Biotecnologia

Marcelo MendonçaMédico Veterinário

Doutor em BiotecnologiaPós-doutorando em Biotecnologia

Produção de Anticorpos Monoclonais contra Listeria monocytogenes para Utilização em

Métodos Rápidos de Diagnóstico em Alimentos

Encontro de Inovação Tecnológica em Defesa Agropecuária – LeiteBelo Horizonte - 21/03/2013

Definição do Problema

Listeria spp. – 8 espécies Listeria monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi L. marthii, L. rocourtiae (Graves et al., 2010; Leclercq et al., 2010)

Características

Causador da ListerioseL. monocytogenes – Humanos e Animais

L. ivanovii – Animais, casos esporádicos em Humanos (Guillet et al., 2010)

Bacilo Gram-positivo Anaeróbico facultativo Multiplicação (1°C a 45°C) Ubiquitário

Todar, 2009

Presença de L. monocytogenes nos Alimentos• Leite e seus derivados• Produtos cárneos• Vegetais e frutas (minimamente processados) • Peixes e frutos do mar

Orgãos de fiscalização - deteminam “Zero Tolerance” Prontos para consumo - Ready-to-eat (RTE) foods


• 123 pessoas

• 25 mortes(CDC, 2011)

Metodologia convencional utilizada para detecção em alimentos

LEB FRASER

OXFORD

PALCAMTSA-YE

30ºC / 24h37ºC / 48h

Fermentação de carboidratos

CatalaseMotilidade

-hemólise

Farber e Daley, 1995

Pré-enriquecimentoenriquecimento

37ºC / 24 a 48h 37ºC / 24h

7 dias24 – 48h

24h

Método de Diagnóstico para L. monocytogenes

5 – 10 dias Mais dias!


Métodos rápidos de diagnóstico de L. monocytogenes - Desejáveis

Técnicas de Imunoensaios

Alta sensibilidade, Especificidade e Reprodutíveis

Anticorpos Monoclonais (MAbs)

MAbs são imunoglobulinas secretadas por clones de células (hibridomas) que são obtidas através da fusão in vitro de linfócitos B

produtores de anticorpos com células de mieloma (Linfócitos B tumorais)

Solução do Problema e Diferencial

4 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria spp.• MAb anti-proteína p30 - 3F8 Reconhece exclusivamente o gênero Listeria

• MAbs anti-InlA - 2D12, 3B7 e 4E4 Maior reatividade com Internalina A nativa

7 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria monocytogenes

Após 6 Fusões Celulares – Listeria MAbs

Estágio de desenvolvimento da tecnologia


ELISA indireto

Estágio de desenvolvimento da tecnologiaWestern blot MAb 2D12 anti-InlA de Listeria monocytogenes

1. L. monocytogenes F42442. L. marthii3. Staphylococcus aureus 4. Bacillus subtilis5. Salmonella typhimurium6. Bacillus thuringiensis7. E. coli O157:H78. Lactococcus lactis9. Enterococcus aerogenes10. Lactobacillus paracasei 11. Klebsiella pneumoniae12. Enterococcus faecalis

Western blot

Revelado com DAB

MAb-3F8 anti-Listeria spp. – Proteína de 30 kDa (p30)Reação com L. monocytogenes e L. marthii


35

27

Separação Imunomagnética Immunomagnetic Separation (IMS)

Separação e concentração do microrganismo alvo

Ligação dos anticorpos em esferas magnetizadas

Fonte: Bhunia, 2008



MAb-2D12 (InlA)

MAb-3F8 (p30 - gênero Listeria)

Dynabeads anti-Listeria (Invitrogen)

MAb-2D12 (InlA)

108 a 103 UFC/mL

Diferença na captura entre anticorpos

Eficiência de captura com diferentes [ ] em PBS

Separação Imunomagnética (IMS)Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos

Queijo de Cabra - artificialmente contaminado

L. monocytogenes 4bL. innocua

~ 1 UFC/g

16 h a 37oC

10 g de Alimento + 90 mL Caldo Fraser

10 mL

IMSContagem em Placa


Biossensor de Fibra Óptica Formato Sanduíche Captura e Detecção

Fibras de poliestireno - 5 cm

Sinal em tempo real


Imunoseparação Magnética seguido por Sensor de Fibra Óptica

MAb-2D12 marcado Cy-5InlA de L. monocytogenes

Tempo Total da IMS + Fibra Óptica Aproximadamente 21 horas

Queijo de Cabra - artificialmente contaminado

Co-cultivo L.monocytogenes e L. innocua IMS seguido de ensaio com Fibra Óptica


Potencial de mercado

Potencial de mercadoDiferenciais propostos em nossos estudos em comparação aos outros: Brasil gastou mais de 1 bilhão de reais entre 2008 e 2010 com importação de

anticorpos monoclonais (Reis et al. 2011)

A produção de uma tecnologia 100% nacional, com custos mais baratos

Os MAbs produzidos pelo Lab. de Imunologia Aplicada - UFPel demonstraram-se altamente específicos para L. monocytogenes e Listeria spp., nenhum grupo de pesquisa no Brasil obtiveram MAbs específicos para este gênero bacteriano

Utilização de MAbs para a produção de ensaios e/ou kits, o tempo de identificação de L. monocytogenes pode ser reduzidos para 48h ou menos

Desenvolvimento e implementação de plataformas de testes rápidos para detecção de L. monocytogenes e/ou Listeria spp. utilizando MAbs e antígenos recombinantes previamente produzidos e caracterizados na UFPel

Os testes propostos servirão de base tecnológica para criar outras plataformas, que poderão ser empregadas no desenvolvimento de métodos rápidos de diagnóstico para outras enfermidades importantes

Equipe de colaboradores – Listeria MAbs

Primeira e Segunda Parte do Projeto – Produção dos anticorpos e plataformas

• Prof. José Antonio Guimarães Aleixo (Imunologia e Microbiologia de Alimentos)

• Prof. Wladimir Padilha da Silva (Microbiologia de Alimentos)

• Prof. Arun K. Bhunia - Purdue University/USA (Imunologia e Biologia Molecular)

• Prof. Fabricio Rochedo Conceição (Imunologia e Biologia Molecular)

• Profa. Ângela Nunes Moreira (Imunologia e Microbiologia de Alimentos)

Segunda Parte do Projeto – Produção das plataformas

• Prof. Odir Antonio Dellagostin (Biologia Molecular e Bioinformática)

• Prof. Alan John Alexander McBride (Biologia Molecular e Proteômica)

• Mestrando Gustavo Schmidt Garcia Moreira (Imunologia e Bioinformática )

• Doutoranda Karla Sequeira Mendonça (Microbiologia e Biologia Molecular)

Marcelo Mendonç[email protected]

(53) 3725.7583 / 8134.0811

Obrigado!

mailto:[email protected]

Slides Extras

Fusão CelularEstágio de desenvolvimento da tecnologia

Extrato totalproteínas de L. monocytogenes


Listeria monocytogenes expressando GFPMAb-2D12 anti-rInlA

Mendonça et al. 2012 – BMC Microbiology

Modified Oxford

MAb- 2D12

BHI Plates

Dynabeads

MAb-3F8

MAb-2D12 Dynabeads

IMS Queijo

MAb-3F8> 105 UFC.mL-1

Fibra Óptica – 103 UFC.mL

MAb-2D12 MAb-3F8 Dynal0

1

2

3

4

5

BHI

MOX

cap

ture

(%

)

Imunoseparação Magnética Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos

Queijo de cabra artificialmente contaminado

PCR quantitativo em tempo real Amplificação do gene hly de L. monocytogenes

L. monocytogenes + L. innocua

Revelado com DAB

2D12 - InlA

100

75

37

25

3F8 - p30

L.m

on

oc

yto

ge

ne

s

F4

24

4

L.

inn

oc

ua

F4

24

8

L.

ma

rth

ii

L.

we

lsh

ime

ri

7.5% SDS-PAGE

E.

co

li O

15

7:H

7

Dois MAbs juntosIdentificação específica Gênero e espécie

Western blot


Imunofluorescência MAb 2D12Anti-InlA

L. monocytogenes 4b (F4244)

L. monocytogenes 4b (F4244)

L. monocytogenes 4d (19117) L. monocytogenes

4d (19117)

L. innocua 6a L. innocua 6a


1/2a

(V

7)

1/2b

(F

4260

)

1/2c

(76

44)

3a (

1911

3)

3b (

2540

)

3c (

2479

)

4a (

1911

4)

4b (

F42

44)

4c (

1911

6)

4d (

1911

7)

4ab

(mur

ray)

7 (1

323)

4e (

1911

8)

SDS-PAGE 10% - Western blot PVDF

35

27

MAb-3F8 anti-Listeria spp. Reação com todos os sorotipos de L. monocytogenes

Revelado com DAB (3,3'-Diaminobenzidine)

Estágio de desenvolvimento da tecnologiaWestern blot

Imunoseparação Magnética Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos

Salsichas tipo hotdog artificialmente contaminado

L. monocytogenes 4b e/ou L. innocua

PCR quantitativo em tempo real Amplificação do gene hly de L. monocytogenes

10 g de hotdog + 90 mL Fraser

Plaqueado em agar BHI

Após IMS

Após entrar no organismo e vencer a barreira intestinal

FígadoBaço

Cérebro

Placenta

Baixa morbidade - Alta mortalidade

Taxa de mortalidade: 30% da população suscetível

População de risco:

Indivíduos imunocomprometidos

Mulheres grávidas

Idosos e crianças

Adultos saudáveis (imunocompetentes)

LISTERIOSE

Septicemia, Meningite, Meningoencefalite

Aborto Natimorto Nascimento criança doente

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