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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE NUTRIÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E NUTRIÇÃO
BIOQUÍMICA E FISIOPATOLOGIA DA NUTRIÇÃO
Dissertação
ATIVIDADE ANTI-QUORUM SENSING DE EXTRATOS DE GRUMIXAMA
(EUGENIA BRASILIENSIS) E PITANGA (EUGENIA UNIFLORA L.)
Adeline Conceição Rodrigues
OURO PRETO – MG
2015
ADELINE CONCEIÇÃO RODRIGUES
ATIVIDADE ANTI-QUORUM SENSING DE EXTRATOS DE GRUMIXAMA
(EUGENIA BRASILIENSIS) E PITANGA (EUGENIA UNIFLORA L.)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Saúde e Nutrição, como parte
integrante dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Saúde e Nutrição, área de concentração:
Bioquímica e Fisiopatologia da Nutrição.
Orientador: Prof. Dr. Uelinton Manoel Pinto
OURO PRETO – MG
2015
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr.Uelinton Manoel Pinto pela orientação, disponibilidade, sabedoria,
dedicação, empenho, motivação e ensinamentos que levarei por toda a vida. Sou grata a você
por ter me dado à oportunidade de desenvolver este trabalho, pelo exemplo de profissional
que é e que foi durantes esses anos.
AGRADECIMENTOS
A Deus.
A Universidade Federal de Ouro Preto, ao Programa de Pós Graduação em Saúde e Nutrição
pela oportunidade. A CAPES pela concessão da bolsa.
Ao CNPq pelo financiamento do projeto.
Aos meus pais e minha irmã Aline por serem a melhor parte da minha vida.
A minha família de Ouro Preto, Juliana, Vanessa, Eric, Poly, Carla, Angélica, Décio, pela
amizade e aconchego familiar.
As minhas queridas Anitas, Camila, Karem, Karol e Poly pela amizade.
A Michele Cristina Vieira e Caetano, pela paciência e conhecimento.
Aos colegas de laboratório pela ajuda, amizade e companhia.
A Brígida, Elis, Nayara, Ana Luisa, Bárbara e Flávia pela grande contribuição nos trabalhos.
A Profa Michele Bertoldi pela contribuição ao trabalho.
A Professora Maria Cristina Dantas Vanetti e o Professor Maurílio Lopes Martins por
participarem da banca de defesa e pelas contribuições.
A todos que contribuíram com esse trabalho, meus agradecimentos.
RESUMO
Muitas bactérias regulam a expressão gênica em resposta a sinais difusíveis produzidos de
forma dependente da densidade celular, em um processo denominado quorum sensing. Esse
processo ocorre por meio da produção, liberação e detecção de moléculas sinalizadoras. Os
fenótipos regulados pelo quorum sensing estão envolvidos nos processos de virulência,
esporulação, motilidade, produção de enzimas, bioluminescência, produção de pigmentos,
entre outros. A interrupção de qualquer das etapas do sistema quorum sensing pode provocar
consequências prejudiciais à virulência bacteriana. Alguns trabalhos evidenciam que extratos
à base de plantas apresentam ação anti-quorum sensing, com possíveis aplicações no controle
de infecções. Grumixama (Eugenia brasiliensis) e pitanga (Eugenia uniflora L.) são frutas da
família das mirtáceas, nativas do Brasil, ricas em compostos fenólicos e apresentam atividade
antioxidante e antimicrobiana. Foi objetivo do estudo detectar a atividade anti-quorum
sensing dos extratos bruto e fenólico obtidos das frutas grumixama e pitanga em
concentrações que não inibem o crescimento microbiano. Os compostos fenólicos das polpas
foram extraídos e purificados utilizando extração em fase sólida (mini-coluna C18) e
quantificados por espectrofotometria. A atividade anti-quorum sensing dos extratos bruto e
fenólico foi avaliada empregando diferentes bactérias e a detecção de diferentes fenótipos.
Chromobacterium violaceum foi avaliado pelo ensaio qualitativo de difusão em ágar e pelo
teste de quantificação da inibição da produção de violaceína. Em Aeromonas hydrophila e
Serratia marcescens foram avaliadas a motilidade tipo swarming e swimming e em C.
violaceum, S. marcescens, A. hydrophila e Escherichia coli foi avaliada a formação de
biofilme. Os extratos de ambas as frutas apresentaram inibição significativa na produção de
violaceína por C. violaceum. Houve também inibição da motilidade bacteriana do tipo
swarming e swimming em A. hydrophila e S. marcescens. Os extratos de ambas as frutas
aumentaram a formação de biofilme em C. violaceum, A. hydrophila, S. marcescens e E. coli.
Esses resultados indicam que os extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga apresentam
atividade anti-quorum sensing sugerindo potenciais aplicabilidades nas indústrias alimentícia
e farmacêutica, inibindo fenótipos regulados pelo quorum sensing.
Palavras-chave: Quorum sensing. Anti-quorum sensing Extratos fenólicos. Grumixama.
Pitanga.
ABSTRACT
Many bacteria regulate gene expression in response to diffusible signals produced
dependently on cell density, in a process called quorum sensing. This process occurs by
means of producing, releasing and detecting signaling molecules. The phenotypes regulated
by quorum sensing are involved in processes related to virulence, sporulation, motility,
production of enzymes, bioluminescence, production of pigments, among others. Interrupting
any stage of the quorum sensing system can cause detrimental effects to bacterial virulence.
Some studies have shown that plant based extracts have quorum quenching effects, with
possible applications in infection control. Grumixama (Eugenia brasiliensis) and pitanga
(Eugenia uniflora L.) are fruits that belong to the family Myrtaceae, native to Brazil, rich in
phenolic compounds and have antioxidant and antimicrobial activity. The purpose of this
study was to evaluate the quorum quenching activity of crude and phenolic extracts obtained
from grumixama (Eugenia brasiliensis) and pitanga (Eugenia uniflora L.) in concentrations
that do not inhibit microbial growth. Phenolic compounds from the pulps were extracted and
purified using solid-phase extraction (C18 mini-column) and quantified by using
spectrophotometry. Quorum quenching activity of crude and phenolic extracts was evaluated
using different bacteria and the detection of different phenotypes. For instance,
Chromobacterium violaceum was evaluated in agar diffusion assay as well as through the
quantification of violacein production; for A. hidropyla and Serratia marcescens, swarming
and swimming motilities were tested and for C. violaceum, S. marcescens, A. hydrophila and
Escherichia coli biofilm formation was assayed. Extracts from both fruits showed significant
inhibition of violacein production by C. violaceum. There was also inhibition of bacterial
swarming and swimming motilities for A. hydrophila and S. marcescens. The extracts of both
fruits increased biofilm formation in C. violaceum, A. hydrophila, S. marcescens, and E. coli.
These results indicate that crude and phenolic extracts from grumixama and pitanga present
quorum quenching activity suggesting a potential aplication in the food and pharmaceutical
industries inhibiting phenotypes regulated by quorum sensing.
Keywords: Quorum sensing. Quorum quenching. Phenolic extracts. Grumixama. Pitanga.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Estrutura química da AHL, que consiste em um anel homoserina-lactona, ―n‖
representa as cadeias laterais com variação acila, podendo ir de dois a dezoito carbonos. ―R‖
indica moléculas de H, OH ou O. ............................................................................................ 20
Figura 2 – A) e B) Grumixama vermelha e amarela. C) Grumixama vermelha. D) Grumixama
amarela. E) Sementes de grumixama. ...................................................................................... 34
Figura 3 – A) Grumixameira. B) Grumixameira vermelha florida. C) Grumixameira amarela
florida. ...................................................................................................................................... 34
Figura 4 – A) Pitangas em diferentes estágios de maturação. B) e C) Sementes de pitanga. .. 35
Figura 5 – A) Pitangueira. B) Florescência da pitangueira e pitangueira com frutos. ............. 36
Figura 6 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. Violaceum com extrato
bruto de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por
pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle
negativo - Água destilada estéril, D) 2520,5 mg AGE/L, E) 504,10 mg AGE/L, F) 252,05 mg
AGE/L, G) 168,03 mg AGE/L e H) 126,02 mg AGE/L de extrato bruto de grumixama....... 43
Figura 7 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. Violaceum com extrato
fenólico de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por
pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle
negativo - Água destilada estéril, D) 2998,5 mg AGE/L, E) 599,70 mg AGE/L, F) 299,85 mg
AGE/L, G) 199,9 mg AGE/L e H) 149,92 mg AGE/L de extrato fenólico de grumixama. ... 43
Figura 8 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. Violaceum com extrato
bruto de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por
pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle
negativo - Água destilada estéril, D) 1472,3 mg AGE/L, E) 294,46 mg AGE/L, F) 147,23 mg
AGE/L, G) 98,15 mg AGE/L e H) 58,98 AGE/L de extrato bruto de pitanga. ...................... 44
Figura 9 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. Violaceum com extrato
fenólico de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por
pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da Inibição do crescimento, C) Controle
negativo - Água destilada estéril, D) 2315,2 mg AGE/L, E) 463,04 mg AGE/L, F) 231,15 mg
AGE/L, G) 154,35 e H) 115,76 mg AGE/L de extrato fenólico de pitanga. .......................... 44
Figura 10 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama
em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml-1
) após 24
horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de
200 µl de água destilada esterilizalada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem
estatisticamente entre si (p<0,05). ........................................................................................... 48
Figura 11 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama. A) Controle,
B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato bruto de grumixama na concentração de
100,82 mg AGE/L, D) Extrato bruto de grumixama na concentração 50,41 mg AGE/L, E)
Extrato bruto de grumixamana concentração 33,61 mg AGE/L e F) Extrato bruto de
grumixama na concentração de 25,21 mg AGE/L. .................................................................. 49
Figura 12 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de
grumixama em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC
ml-1
) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB
adicionado de 200 µl de água destilada esterilizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não
diferem estatisticamente (p<0,05). ........................................................................................... 50
Figura 13 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de grumixama. A)
Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato fenólico de grumixama na
concentração de 119,94 mg AGE/L, D) Extrato fenólico de grumixama na concentração 59,97
mg AGE/L, E) Extrato fenólico de grumixama na concentração 39,98 mg AGE/L e F) Extrato
fenólico de grumixama na concentração de 29,99 mg AGE/L. ............................................... 50
Figura 14 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga em
diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1
) após 24
horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de
200 µl de água destilada esterelizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem
estatisticamente (p<0,05). ........................................................................................................ 51
Figura 15 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga. A) Controle, B)
Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89
mg AGE/L, D) Extrato bruto de pitanga na concentração de 29,44 mg AGE/L, E) Extrato
bruto de pitanga na concentração de 19,66 mg AGE/L e F) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 14,72 mg AGE/L. .......................................................................................... 52
Figura 16 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga
em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1
) após 24
horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de
200 µl de água destilada esterelizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem
estatisticamente (p<0,05). ........................................................................................................ 52
Figura 17 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga. A) Controle,
B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de
92,61 mg AGE/L, D) Extrato fenólico na concentração de 46,30 mg AGE/L, E) Extrato
fenólico de pitanga na concentração de 30,87 mg AGE/L e F) Extrato fenólico de pitanga na
concentração de 23,15 mg AGE/L. .......................................................................................... 52
Figura 18 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swimming em S.
Marcescens e A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes
com A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de
grumixama na concentração de 101,02 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de grumixama na
concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato
bruto de grumixama na concentração de 252,05 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de
grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L. ................................................................ 56
Figura 19 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swarming em S.
Marcescens e A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes
com A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de
grumixama na concentração de 101,02 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de grumixama na
concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato
bruto de grumixama na concentração de 252,05 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de
grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L. ................................................................ 56
Figura 20 - Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swimming em S. Marcescens e
A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes com A.
Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 58,89 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61
mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 58,82 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 213,52
mg AGE/L. ............................................................................................................................... 57
Figura 21- Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swarming em S. Marcescens e
A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes com A.
Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 58,89 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61
mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36. E) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 58,82 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 213,52
mg AGE/L. ............................................................................................................................... 58
Figura 22 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de grumixama. A) C.
Violaceum ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110. E) E. Coli
ATCC10536. ............................................................................................................................ 60
Figura 23 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de grumixama. A) C.
Violaceum ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110. E) E. Coli
ATCC10536. ............................................................................................................................ 61
Figura 24 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de pitanga. A) C. Violaceum
ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110 E) E. Coli ATCC10536. ... 62
Figura 25 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de pitanga. A) C.
Violaceum ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110. E) E. Coli
ATCC10536. ............................................................................................................................ 63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Exemplos de moléculas sinalizadoras e fenótipos regulados pelo sistema quorum
sensing em bactérias................................................................................................................. 24
Tabela 2 - Quorum sensing em bactérias deterioradoras de alimentos. ................................... 26
Tabela 3 - Compostos naturais com atividade anti-quorum sensing. ...................................... 29
Tabela 4 - Concentração Inibitória Mínima expressa em quantidade de compostos fenólicos
totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de grumixama. ............................... 45
Tabela 5 - Concentração Inibitória Mínima expressa em quantidade de compostos fenólicos
totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de pitanga. ...................................... 45
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AGE/L - Ácido Gálico Equivalente/Litro
AHL -Acil Homoserina Lactona
AI-1 -Autoindutor 1; Acil Homoserina Lactona
AI-2 - Autoindutor-2
AI-3 - Autoindutor-3
AIP - Peptídeos autoindutores
CV026 - Estirpe mutante de Chromobacterium violaceum biossensora de AHL
DFS - Fator de sinal difusível
DMSO - Dimethylsulfoxide, diluente ou solvente
LB - Luria Bertani, meio de cultura bacteriano
MIC - Concentração inibitória Mínima
PQS - Heptil-3-hidroxi-4-quinolona, sinalizador encontrado em Pseudomonas aeruginosa
RPM - Rotações por minuto
UFC -Unidades Formadoras de Colônia
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 17
2 – REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 18
2.1 - Quorum sensing ........................................................................................................... 18
2.1.1 - Mecanismo de comunicação ................................................................................. 18
2.1.2 – Principais fenótipos regulados pelo sistema quorum sensing ............................... 22
2.1.3 - Sistema quorum sensing e sua relação com a deterioração dos alimentos ............ 26
2.1.4 - Mecanismo de inibição do sistema quorum sensing ............................................. 27
2.2 - Produtos naturais inibidores do quorum sensing ......................................................... 28
2.3 - Compostos fenólicos .................................................................................................... 31
2.3.1 - Definição, formação e função ............................................................................... 31
2.4 - Grumixama (Eugenia brasiliensis) .............................................................................. 33
2.5 - Pitanga (Eugenia uniflora L.) ...................................................................................... 35
3 – OBJETIVOS ..................................................................................................................... 37
3.1 - Objetivos ...................................................................................................................... 37
4 – MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 37
4.1 - Material vegetal............................................................................................................ 37
4.1.2. Preparo do material vegetal .................................................................................... 37
4.2 - Extração e purificação de compostos fenólico ............................................................. 38
4.3 - Compostos fenólicos totais .......................................................................................... 38
4.4. - Estirpes bacterianas utilizadas .................................................................................... 38
4.5 - Determinação in vitro da atividade anti-quorum sensing dos extratos brutos e fenólicos
.............................................................................................................................................. 39
4.5.1 - Teste qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum ...................... 39
4.5.2- Teste da concentração inibitória mínima (MIC) .................................................... 39
4.5.3 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum ............... 40
4.5.4 - Efeito anti-quorum sensing na motilidade tipo swimming e swarming em A.
hydrophila e S. marcescens .............................................................................................. 40
4.5.5- Determinação in vitro da inibição da formação de biofilme em C. violaceum, S.
marcescens, A. hydrophila e E. coli ................................................................................. 41
4.6 - Análises estatísticas...................................................................................................... 41
5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 42
5.1 - Compostos fenólicos totais .......................................................................................... 42
5.2 - Teste qualitativo de inibição do quorum sensing em C. violaceum ............................. 43
5.3 - Concentração Inibitória Mínima (MIC) ....................................................................... 45
5.4 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum ATCC 6357 . 47
5.4.1 - Quantificação da inibição da produção de violaceína pelos extratos obtidos de
grumixama ........................................................................................................................ 47
5.4.2 - Quantificação da inibição da produção de violaceína pelos extratos obtidos de
pitanga ............................................................................................................................... 50
5.5 - Efeito dos extratos de grumixama sobre a motilidade tipo swimming e swarming em S.
marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36 ..................................................................... 55
5.6 – Efeito dos extratos sobre a formação de biofilme em C. violaceum ATCC6357, S.
marcescens, A. hydrophila IOC/FDA110-36 e E. coli ATCC10536 ................................... 59
6 - CONCLUSÃO ................................................................................................................... 65
7 - REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 66
17
1 – INTRODUÇÃO
Com o objetivo de trazer benefícios à comunidade microbiana, as bactérias possuem um
comportamento individual e também cooperativo. O comportamento cooperativo envolve a
comunicação dependente da densidade celular denominada quorum sensing. Esse sistema
envolve a produção, a detecção de moléculas sinalizadoras e a ativação de genes específicos.
Moléculas sinalizadoras são produzidas pelas bactérias, normalmente se difundem livremente
pela membrana e acumulam no ambiente circulante. O aumento da população microbiana leva
ao acúmulo dessas moléculas sinalizadoras até atingirem um limiar basal, necessário para a
sua detecção por receptores específicos. O complexo sinalizador/receptor regula a expressão
de genes modulando fenótipos bacterianos. Este sistema normalmente atua na forma de um
feedback positivo para a produção de moléculas sinalizadoras, por isso, essas moléculas são
comumente denominadas de autoindutores. Os fenótipos regulados pelo quorum sensing
envolvem motilidade, formação de biofilme, resistência a antibióticos, melhora na absorção
de nutrientes, bioluminescência, produção de pigmentos, funções de virulência e deterioração
de alimentos.
O sistema quorum sensing opera principalmente por sinalizadores denominados Acil
Homoserina Lactonas (AHLs) em bactérias Gram-negativas, oligopeptídeos em bactérias
Gram-positivas e Autoindutor 2 (AI-2) que pode ser usado por ambos grupos bacterianos. A
comunicação pode ocorrer entre a mesma espécie e entre espécies distintas, dependendo do
tipo de sinalizador utilizado. O AI-2 é responsável pela sinalização interespecífica. Existe
também a comunicação mediada pelo Autoindutor 3 (AI-3) utilizada no mecanismo de
comunicação de Escherichia coli entero-hemorragica e Salmonella enterica sorotipo
Typhimurium.
A interferência no sistema quorum sensing pode impedir as células de expressassem
fenótipos como fatores de virulência, entre outros regulados por esse sistema. O controle da
ativação dessas características é de grande interesse para saúde pública e indústria de
alimentos, considerando o aumento da resistência bacteriana a antibióticos e o uso excessivo
de conservantes de alimentos. Os inibidores do quorum sensing podem ter sua ação na
produção de moléculas sinalizadoras, na sua inativação ou interferência na ligação de seus
respectivos receptores. Alguns estudos têm mostrado que os inibidores do sistema quorum
sensing podem ser sintéticos ou naturais.
18
Existem várias espécies de plantas com comprovadas propriedades terapêuticas, incluindo
atividade antimicrobiana. Os fitoquímicos presentes nas plantas também podem apresentar
atividade anti-quorum sensing, conforme mostram alguns trabalhos. Os inibidores naturais do
sistema quorum sensing podem ser uma alternativa para o uso de antibióticos no tratamento
de infecções e aos conservantes sintéticos em alimentos. É conhecida uma vasta gama de
plantas brasileiras que apresentam atividade antimicrobiana, porém, pouco se sabe sobre a
inibição do sistema de comunicação quorum sensing por essas plantas, reforçando a
necessidade de pesquisas nessa área.
Grumixama (Eugenia brasiliensis) e pitanga (Eugenia uniflora L.) são frutos da
grumixameira e pitangueira, árvores nativas do Brasil. A atividade antimicrobiana de folhas
de grumixameira e da pitangueira, assim como de frutos da pitangueira já foi demonstrada em
alguns estudos. Embora trabalhos envolvendo atividade antimicrobiana dos frutos de pitanga
(Eugenia uniflora L.) tenham sido demonstrados, conhecer a atividade antimicrobiana
especialmente sobre a inibição do sistema quorum sensing desses frutos poderia gerar
alternativas ao controle microbiano pelo uso de agentes naturais de frutos nativos brasileiros e
aumentar o conhecimento científico relacionado ao assunto.
2 – REVISÃO DE LITERATURA
2.1 - Quorum sensing
2.1.1 - Mecanismo de comunicação
As bactérias podem apresentar um comportamento cooperativo, tendo suas atividades
realizadas de forma mais eficiente quando em uma população suficientemente grande. Esses
micro-organismos monitoram sua densidade populacional pela detecção de moléculas
sinalizadoras e regulam a expressão gênica em função da densidade celular em um
mecanismo denominado quorum sensing (FUQUA, WINANS e GREENBERG, 1994;
FUQUA e GREENBERG, 1996; FUQUA e GREENBERG, 2003; TAGA e BASSLER, 2003;
PLATT e FUQUA, 2010).
O sistema quorum sensing foi primeiramente descrito por Nealson e Hastings (1979) para a
bactéria Vibrio fischeri, uma bactéria marinha que pode viver de forma simbiótica
colonizando órgãos luminosos de peixes e lulas e em vida livre na água do mar. Em alta
19
densidade celular, Vibrio fischeri produz luz pela ativação do sistema quorum sensing que
regula positivamente os genes responsáveis pela bioluminescência (BOSGELMEZ-TINAZ,
2002; FUQUA e GREENBERG, 2003; MARCH e BENTLEY, 2004). Em baixas densidades
populacionais, o sinal produzido por V. fischeri não se acumula e a bioluminescência não é
induzida (BOSGELMEZ-TINAZ, 2002; FUQUA e GREENBERG, 2003).
A coordenação da expressão gênica mediada pela comunicação quorum sensing ocorre
através da produção, liberação e detecção de moléculas sinalizadoras (RUMJANEK,
FONSECA, e XAVIER, 2004; GONZALEZ e KESHAVA, 2006). Os sinalizadores, também
denominados autoindutores, são moléculas produzidas por bactérias, compostos difusíveis de
baixo peso molecular, empregados na regulação quorum sensing (TAGA e BASSLER, 2003;
PLATT e FUQUA, 2010). Eles podem ser classificados em três grupos principais: O
autoindutor-1 (AI-1) que engloba as moléculas de acil homoserina lactona (AHL) usadas por
bactérias Gram-negativas, os peptídeos autoindutores (AIP) que são usados por bactérias
Gram-positivas e o autoindutor-2 (AI-2) que engloba as moléculas usadas por ambos os
grupos bacterianos (RUMJANEK, FONSECA, e XAVIER, 2004; NAZZARO, FRATIANNI,
e COPPOLA, 2013). Além destas moléculas, diversas outras já foram descritas na literatura
com função de sinalização no sistema quorum sensing (TSAI e WINANS, 2010), como o AI-
3 utilizado por S. enterica sorotipo Typhimurium e E. coli entero-hemorrágica (MOREIRA,
WEINSHENKER e SPERANDIO, 2010).
O mecanismo de comunicação quorum sensing por bactérias Gram-negativas se faz
principalmente por meio de moléculas autoindutoras conhecidas como AHL ou AI-1
(RUMJANEK, FONSECA, e XAVIER, 2004; WATERS e BASSLER, 2005; NAZZARO,
FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). As AHLs contêm em sua estrutura um anel lactona com
uma cadeia acila lateral variável (Figura 1). Com base no comprimento da cadeia acila, as
AHLs podem ser classificadas como moléculas de cadeia curta ou longa (GONZALEZ e
KESHAVA, 2006).
20
Figura 1- Estrutura química da AHL, que consiste em um anel homoserina-lactona, ―n‖
representa as cadeias laterais com variação acila, podendo ir de dois a dezoito carbonos. ―R‖
indica moléculas de H, OH ou O. Fonte: Pinto (2005).
O mecanismo de comunicação envolve primariamente as proteínas LuxI e LuxR e suas
homólogas. A proteína LuxI ou suas homólogas sintetiza as AHLs, catalisando uma ligação
amida entre o S –adenosilmetionina (SAM) e o grupamento acila (GONZALEZ e
KESHAVA, 2006). A proteína LuxR ou suas homólogas funciona como receptores
citoplasmáticos de AHLs (WATERS e BASSLER, 2005), e normalmente são ativadores
transcricionais. LuxR apresenta dois domínios: um conjunto de resíduos conservados no
domínio amino-terminal compreende a região de ligação a AHL, além de mediar dimerização,
e um domínio carboxi-terminal responsável pela ligação a sítios específicos no DNA alvo. A
interação da AHL com o domínio amino-terminal provoca mudanças conformacionais que
modula a expressão gênica (ZHU e WINANS, 1999; FUQUA e GREENBERG, 2003;
WATERS e BASSLER, 2005; GONZALEZ e KESHAVA, 2006; PINTO e WINANS, 2009).
As moléculas de AHL sintetizadas pela LuxI se difundem livremente pela membrana
citoplasmática aumentando sua concentração, de acordo com o aumento da densidade celular.
Ao atingir uma concentração limiar crítica, essas moléculas são capazes de voltar ao
citoplasma da célula e se ligarem ao receptor LuxR. O complexo LuxR-AHL ativa ou mais
esporadicamente reprime a transcrição de genes e em alguns casos ativa a expressão do
próprio gene luxI por um sistema de feedback positivo (RUMJANEK, FONSECA e XAVIER,
2004; WATERS e BASSLER, 2005). Cada proteína LuxI produz o sinal de alta
especificidade para o seu receptor LuxR e essas proteínas receptoras também possuem sítio de
ligação específico, permitindo que LuxR seja ativado somente por seu ligante cognato. Dessa
forma, cada espécie pode responder primariamente ao acúmulo de seu próprio sinal, em um
ambiente que contenha várias espécies (WATERS e BASSLER, 2005).
Alguns mecanismos podem evitar a ativação prematura do sistema quorum sensing e a
ligação de AHL a proteína receptora LuxR. Um dos mecanismos está relacionado a
estabilidade da proteína LuxR que é dependente da presença do autoindutor, onde na ausência
desse, a proteína receptora tem meia-vida de poucos minutos, enquanto que essa meia-vida
21
aumenta para mais de 200 minutos na presença de AHL (ZHU e WINANS, 1999; PINTO e
WINANS, 2009). O segundo mecanismo é a difusão de AHL para o meio extracelular.
Somente quando uma concentração significativa de sinal se acumula, indicando elevada
densidade celular, a concentração intracelular é capaz de ativar o circuito quorum sensing
(WATERS e BASSLER, 2005).
As bactérias Gram-negativas também podem se comunicar utilizando diversas outras
moléculas sinalizadoras como, por exemplo, as dicetopiperazinas (DKPS), fator de sinal
difusível (DFS); 2-heptil-3-hidroxi-4-quinolona (PQS), AI-3, entre outros (TSAI e WINANS
2010).
As bactérias Gram-positivas utilizam oligopeptídeos modificados como autoindutores,
conhecidos como AIP (autoinducer peptides), no processo de comunicação célula-célula.
Esses autoindutores são ativamente exportados para fora da célula, por meio de
transportadores do tipo ABC. Quando sua concentração aumenta a um limiar, estes
oligopeptídeos se ligam a um sensor de membrana denominado histidina quinase, pertencente
a um sistema de sinalização de dois componentes. Essa ligação provoca uma cascata de
fosforilação onde um ativador transcricional atua diretamente no DNA, influenciando a
transcrição de genes específicos (FUQUA, STEPHEN e GREENBERG, 1994; TAGA e
BASSLER, 2003; WATERS e BASSLER, 2005; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA,
2013; YARWOOD et al., 2004; BALABAN et al., 2007; RUMJANEK, FONSECA e
XAVIER, 2004).
Moléculas denominadas AI-2, também conhecidas como furanosil borato diéster, são
sinalizadores utilizados por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas para comunicação
intra e interespécies. A combinação da utilização destes sinalizadores permite a bactéria fazer
censo de sua densidade populacional e de outras espécies presentes na vizinhança
(NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA, 2013).
Outro sinalizador utilizado na comunicação quorum sensing é o AI-3, de estrutura ainda
desconhecida, utilizado no mecanismo de comunicação de E. coli O157:H7 e S. enterica
sorotipo Typhimurium. Esse sinalizador está envolvido na comunicação cruzada entre essas
bactérias e o hormônio epinefrina e norepinefrina demostrando semelhança a esses devido ao
seu reconhecimento pelo receptor QseC (SPERANDIO et al., 2003; MOREIRA,
WEINSHENKER e SPERANDIO, 2010).
22
2.1.2 – Principais fenótipos regulados pelo sistema quorum sensing
Em função do sistema quorum sensing, as bactérias são capazes de coordenar diversas
funções coletivas como a migração para ambientes favoráveis, busca de nutrientes e a
proteção pela formação de biofilmes (SKANDAMIS e NYCHAS, 2012). Esse sistema
também está envolvido nos processos de virulência, competência, esporulação, conjugação,
produção de bacteriocinas, síntese de antibióticos, enzimas, bioluminescência, produção de
pigmentos, entre outros (MARCH e BENTLEY, 2004; SKANDAMIS e NYCHAS, 2012;
NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). Além desses fatores, as bactérias podem
controlar pelo sistema quorum sensing, a manipulação da resposta imune do hospedeiro
durante a fase da infecção, tendo esse sistema papel importante na proteção contra a ação
antimicrobiana do sistema imune humano (BJARNSHOLT et al., 2005).
O biofilme bacteriano é um dos fenótipos importantes regulados pelo mecanismo quorum
sensing e é caracterizado como sendo um crescimento agregado de micro-organismos sobre
uma superfície. O biofilme é um mecanismo que as bactérias desenvolveram para aderir a
superfícies formando comunidades, como estratégia de sobrevivência em ambientes adversos
como a mudanças de temperatura, dessecação, raios ultravioletas e no estabelecimento de
infecções. Suas células mais expostas podem formar uma barreira física que impede ou
diminui o contato dos agentes antimicrobianos com suas células mais profundas. Dessa forma,
são altamente tolerantes a antibióticos, podendo levar a seleção de estirpes resistentes
(HOIBY et al., 2010; SREY, JAHID e HÁ, 2013).
No biofilme, podem estar presente uma ou várias espécies, gêneros e estirpes microbianas
podendo ser formado em superfície biótica e abiótica (O’TOOLE, KAPLAN e KOLTER,
2000). Sua formação é um processo dinâmico envolvendo cinco etapas, incluindo fixação
reversível, fixação irreversível, formação de microcolônias, maturação e dispersão (SREY,
JAHID e HÁ, 2013; GU e REN, 2014).
Na primeira fase, fixação reversível, as bactérias livres são apresentadas a uma superfície
sólida por fluídos ou pela motilidade bacteriana. Estruturas extracelulares, como flagelos,
curli, fímbrias ou pili e proteínas de membrana ajudam as bactérias a interagirem com as
superfícies (FERREIRA, PEREIRA e MELO, 2010). Este processo é influenciado pelas
propriedades das células bacterianas e a superfície, como a carga, hidrofobicidade e rigidez
23
(PALMER, FLIN e BROOKS, 2007) e as células bacterianas ainda podem ser removidas pela
força de cisalhamento (STOODLEY et al., 2002).
Na fase de fixação irreversível, as células aderidas iniciam a produção de substâncias
poliméricas extracelulars (EPS) que consistem em polissacáridos, DNA, proteínas e lipídeos,
promovendo a transição de fixação bacteriana reversível para irreversível (RENNER e
WEIBEL, 2011). As células se multiplicando, acumulam EPS e crescem em estruturas
tridimensionais (3D) formando biofilmes maduros. Em um biofilme maduro, o EPS adere às
células bacterianas para apoiarem a estrutura 3D, permitindo o transporte de nutrientes e
remoção de resíduos.
A maturação é uma etapa em que o biofilme se desenvolve em uma estrutura organizada
podendo ser plana ou em forma de cogumelo. Células de alguns biofilmes maduros podem ser
liberadas na fase de dispersão aderindo a uma nova superfície e formando um novo biofilme
(GU e REN, 2014; SOLANO, ECHEVERZ e LASA, 2014). O quorum sensing está
envolvido na regulação das fases de crescimento do biofilme, principalmente na fase de
maturação, regulando a densidade populacional (SKANDAMIS e NYCHAS, 2012), a
produção de EPS, a motilidade e a produção de metabólitos secundários (GU e REN, 2014).
Várias espécies bacterianas também podem crescer sobre superfícies em meio semi-sólido,
utilizando o mecanismo de motilidade celular (LINDUM et al., 1998; (KEARNS, 2010).
Trata-se de uma forma de adaptação bacteriana às mudanças adversas nutricionais e físicas
garantindo vantagem de sobrevivência sob uma variedade de ambientes, possibilitando
migração para locais favoráveis a sua colonização (AN et al., 2006). Esse mecanismo é
considerado um importante fator de virulência (KIM et al., 2003; LAI, TREMBLAY e
DÉZIEL, 2009), sendo essencial para a patogenicidade bacteriana nas fases iniciais de adesão
aos tecidos do hospedeiro (MCCARTER, 2001).
Henrichsen (1972) descreveu os vários tipos de motilidade bacteriana, entre eles, as do tipo
swarming e swimming. A motilidade tipo swarming foi definida como sendo a translocação
em superfície pela ação de flagelos, apresentando padrão micromorfológico organizado em
giros e bandas, caracterizando-se como um rápido movimento bacteriano organizado,
contínuo e regular ao longo do eixo das células agregadas em feixes. Já a motilidade do tipo
swimming ocorre por meio da translocação de flagelos rotativos, porém com padrão
24
micromorfológico desorganizado onde as células se movem individualmente e de forma
aleatória em meio líquido (HENRICHSEN, 1972; KEARNS, 2010).
Muitas bactérias que apresentam motilidade secretam surfactantes, moléculas anfipáticas
que agem reduzindo a tensão superficial entre o substrato e a célula bacteriana para permitir o
espalhamento sobre a superfície (KEARNS, 2010). A produção de surfactante por algumas
bactéria é um mecanismo regulado pelo sistema quorum sensing (LINDUM et al., 1998;
EBERL et al, 1996). Além da produção de surfactante, o quorum sensing regula o sistema
flagelar, onde a expressão hierárquica de cerca de 50 genes (MACNAB, 2004; MCCARTER,
2006) e sua cascata de regulação é controlada por esse sistema, que regula a transdução de
genes envolvidos nesta característica (LINDUM et al.,1998; MCCARTER, 2006; YANG e
DEFOIRDT, 2014).
A Tabela 1 apresenta os fenótipos regulados pelo quorum sensing e as moléculas
sinalizadoras empregadas nesse processo.
Tabela 1 – Exemplos de moléculas sinalizadoras e fenótipos regulados pelo sistema quorum
sensing em bactérias.
Bactéria Sinalizador Fenótipo Referências
Aeromonas
hydrophila
N-butanoil-L-
homoserina
lactona
N-hexanoil-L-
homoserina
lactona
Protease extracelular,
formação de biofilme
Bosgelmez-
tinaz (2002)
Chromobacteri
um violaceum
N-hexanoil-L-
homoserina
lactona
Antibiótico,
exoenzimas, cianeto,
violaceína
Rumjanek,
Fonseca e
Xavier (2004),
2004;
Bosgelmez-
tinaz (2002)
E. coli AI-2, AI-3 Divisão celular
Gonzalez e
Keshava
(2006);
Bosgelmez-
tinaz (2002)
Erwinia
carotovora
N-3-
(oxohexanoil)-L-
homoserina
lactona
Antibiótico,
fatores de virulência:
proteases, celulases,
pectinases, síntese de
exopolissacarídeo,
Bosgelmez-
tinaz (2002)
25
carbapenem
Pseudomonas
fluorescens*
Ciclo(L-Phe-
L-Pro),
Ciclo(L-Tyr-
L-Pro)
DKPS
Antibiótico
fenazina
Gonzalez e
Keshava
(2006)
Pseudomonas
aeruginosa
C4-HLS;
3-oxo-C12-
HLS;
N-butanoil-L-
homoserina
lactona
N-3-
(oxododecanoil)-
L-homoserina
lactona
Fatores de
virulência,
exoenzimas, cianeto,
RpoS, lecitina,
piocianina,
ramnolipídeo, pili,
Xcp, formação de
Biofilme, RhIR,
Rumjanek,
Fonseca e
Xavier (2004)
Bosgelmez-
tinaz (2002)
Serratia
liquefaciens
N-butanoil-L-
homoserina
lactona
Antibiótico
carbapenem,
pigmento
(prodigiosina),
protease
Bosgelmez-
tinaz (2002)
Serratia
marcescens spp.
ATCC 39006
N-butanoil-L-
homoserina
lactona
N-hexanoil-L-
homoserina
lactona
Motilidade tipo
Swarming
Bosgelmez-
tinaz (2002)
Yersinia
N-hexanoyl-
L- homoserina
lactona
N-3-
(oxohexanoil)-L-
homoserina
lactona
3-oxo-C6-Acil
homoserina
lactona
Motilidade,
aglomeração
Bosgelmez-
tinaz (2002)
S.aureus AIP Virulência Rumjanek,
Fonseca e
26
Xavier (2004)
Bacillus
subtilis AIP
Competência para
aquisição de DNA,
esporulação
Rumjanek,
Fonseca e
Xavier (2004)
* Algumas estirpes de P. fluorescens não produzem AI-1 (Pinto et al., 2010; Martins et al., 2014).
2.1.3 - Sistema quorum sensing e sua relação com a deterioração dos alimentos
O sistema quorum sensing regula comportamentos bacterianos em ecossistemas
alimentares e sua compreensão é importante podendo ser usada para criar novas alternativas
para preservação de alimentos (PINTO et al., 2007). Esse sistema regula várias enzimas com
atividade na deterioração de alimentos (SKANDAMIS e NYCHAS, 2012; BAI e RAI, 2012).
Compostos de sinalização quorum sensing foram identificados em alimentos deteriorados
como leites, carnes, frutas e legumes (BAI e RAI, 2012) e em carnes armazenadas a vácuo e
aerobiamente (BLANA e NYCHAS, 2013). Também foram identificadas diferentes
moléculas sinalizadoras de quorum sensing, como as AHLs produzidas por estirpes
proteolíticas psicrotróficas isoladas de leite cru (PINTO et al., 2007). A Tabela 2 apresenta
bactérias deterioradoras de alimentos, os principais alimentos acometidos por elas, os
fenótipos de deterioração regulados pelo quorum sensing e os sinalizadores envolvidos.
Tabela 2 - Quorum sensing em bactérias deterioradoras de alimentos.
Bactéria Produto Fenótipo Molécula de
Sinalização Referências
Pseudomonas
fluorescens 395 Leite
Deterioração
proteolítica do leite
C4-HSL and
3OC8-HSL
Liu et al.,
(2007)
S. marcescens
proteamaculans
strain B5a
Leite
Deterioração
proteolítica e
lipolítica do leite
3-oxo-C6-
HSL
Christensen et
al., (2003)
Pseudomonas
fluorescens Leite
Deterioração
proteolítica do leite
L-HSL α-
amino-γ -
butyrolactones
Dunstall et
al., (2005)
Pseudomonas
phosphoreum e
Aeromonas
spp.
Filetes
de bacalhau
Atividade
quitinolítica
3-hydroxy-
C8-HSL
Flodgaard et
al., (2005)
Erwinia
carotovora Vegetais
Deterioração
celulolítica e
proteolítica
3-oxo-C6-
HSL
Jones et al.,
(1993)
Pectobacterium Brotos Deterioração 3-oxo-C6- Rasch et al.,
27
ssp. A2JM de feijão pectinolítica
eproteolítica
HSL (2005)
S. marcescens
plymuthica RVH1 Vegetais
Atividade
quitinase e protease
3-oxo-C6-
HSL e C6-HSL
Van Houdt et
al., (2007)
Hafnia alvei
Serratia
marcecens spp.
Embalag
ens a vácuo
Deterioração
proteolítica
3-
oxohexanoyl
HSL
Bruhn et al.,
(2004)
Pseudomonas
spp. Carne
Formação de
biofilme em carnes AHLs
Jay et al.,
(2003)
Photobacteriu
m phosphoreum e
Aeromonas
spp.
Filetes
de bacalhau
Deterioração
quitinolítica
3-hydroxy-
C8-HSL
Flodgaard et
al., (2005)
Fonte: Bai e Rai (2012), modificado.
2.1.4 - Mecanismo de inibição do sistema quorum sensing
A estratégia de controle de micro-organismos por meio da interferência no sistema quorum
sensing é ampla (RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004) onde a capacidade de perturbar
o sistema quorum sensing pode conferir a uma determinada espécie bacteriana, vantagens
sobre outra (BASSLER, 2005). A interrupção de qualquer um dos passos da comunicação
quorum sensing pode ter consequências prejudiciais na sobrevivência e patogenia microbiana
(PAN e REN, 2009). Os mecanismos de inibição podem ser vários, como a inibição da
síntese, transporte ou secreção de AHL e da proteína receptora de AHL (LuxR) (KALIA,
2012; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013).
Os inibidores quorum sensing podem bloquear a expressão de virulência sem afetar o
crescimento microbiano (PAN e REN, 2009; YEO e THAM, 2012; KALIA, 2012; BAI e
RAI, 2012; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013) diminuindo o risco de
desenvolvimento de resistência bacteriana (KALIA, 2012; NAZZARO, FRATIANNI e
COPPOLA, 2013). Podem atuar causando enfraquecimento dos biofilmes para a exposição a
antibióticos e o sistema imunológico (GIVSKOV, 2012). Sua administração juntamente com
medicamentos pode impedir a formação de biofilmes resistentes sobre dispositivos médicos,
aumentando a sensibilidade desses a tratamentos antimicrobianos melhorando a atividade dos
antibióticos. Tem sido mostrado também que biofilmes tratados com inibidores quorum
sensing ficam mais susceptíveis a ação do sistema imune (BJARNSHOLT et al., 2005).
28
Para ser eficaz, um inibidor quorum sensing deve ser uma molécula pequena, com
capacidade de redução na expressão de genes regulados por quorum sensing, além de não
apresentar nenhum efeito adverso sobre as bactérias ou o hospedeiro e ser quimicamente
estável e resistente à degradação pelos sistemas metabólicos dos hospedeiros (PAN e REN,
2009).
2.2 - Produtos naturais inibidores do quorum sensing
A atividade anti-quorum sensing de produtos naturais é mais presente do que se imagina e
sua inibição pode ser tão importante quanto ao efeito antibacteriano, podendo contribuir ao
uso tradicional de medicamentos (ADONIZIO, KONG, MATHEE, 2009; SULTANBAWA,
2011). As substâncias inibidoras são ferramentas promissoras para a redução de doenças, pois
a disposição de antibióticos eficazes pode não ser garantida (DEFOIRDT, BRACKMAN e
COENYE, 2013). Além da atividade sobre a saúde humana, o uso de inibidores quorum
sensing presentes em compostos naturais pode melhorar a segurança de alimentos
proporcionando regulação negativa da atividade de deterioração, alterando a atividade e
sobrevivência microbiana (NAZARRO et al., 2013). A combinação desses inibidores e outros
agentes antimicrobianos pode gerar efeitos sinérgicos sobre a redução bacteriana (GIVSKOV,
2012), sendo uma estratégia eficaz para controle de infecções causadas por bactérias
patogênicas em plantas, animais e seres humanos.
Compostos presentes em produtos naturais apresentaram inibição do sistema quorum
sensing por possuírem compostos com semelhança estrutural a moléculas sinalizadoras, pela
capacidade de interferir com a atividade de AHL, modulando sua síntese, e pela interferência
com a produção de AI-2 (NOVAK e FRATAMICO, 2004; CHOO, RUKAYADI e HWANG,
2006; VATTEM et al., 2007; YEO e THAM, 2012; GANIN et al., 2012; TRUCHADO et al.,
2012; BLANA E NYCHAS, 2013; ALVAREZ, MOREIRA E PONCE, 2013; TAN E YIN,
2013; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). Alguns estudos também mostraram
que polifenóis são capazes de estimular a expressão da enzima AHL lactonase e interferirem
na sinalização mediada por AHL, bloqueando a comunicação celular e inibindo os
sinalizadores AI-1 e AI-2 e a formação de biofilme (NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA,
2013; KALIA, 2012). A Tabela 3 apresenta alguns compostos naturais com atividade anti-
quorum sensing.
29
Tabela 3 - Compostos naturais com atividade anti-quorum sensing.
Fonte Natural Antagonista Bactérias Inibidas
Extrato de plantas
Melicope lunu-ankenda
(folhas)
Syzygium aromaticum (broto)
E. coli [pSB401]
E. coli [pSB1075]
C. violaceum CV026
P. aeruginosa PA01
P. aeruginosa lecA::lux
Alho (bulbos) P. aeruginosa
Vanilla planifolia (feijões) C. violaceum CV026
Tremella fuciformis (inteira) C. violaceum CV026
Panax notoginseng (flores e
raízes)
Areca catechu (sementes)
Prunus armeniaca (kernel de
sementes)
Prunella vulgaris (inteira)
Nelumbo nucifera (folhas)
Punica granatum (casca)
Imperata cylindrical (haste)
P. ginseng (raízes)
C. violaceum CV026
P. aeruginosa PA01
Moringa oleifera (folhas e
frutos)
Capparis spinosa (fruits)
C. violaceum ATCC
12472
C. violaceum CV026
P. aeruginosa
E. coli
Proteus mirabilis
S. marcescens
Laurus nobilis (frutos, flores,
folhas, cascas)
C. violaceum ATCC
12427
Acacia nilotica (vagens
verdes)
C. violaceum ATCC
12472
Quercus virginiana (folhas)
Chamaesyce hypericifolia
(aereas)
Tetrazygia bicolor (folhas)
Conocarpus erectus (folhas)
Bucida burceras (folhas)
Callistemon viminalis (folhas,
inflorescencia)
C. violaceum ATCC
12472
C. violaceum CV026
Agrobacterium
tumefaciens
NTL4
Vaccinium macrocarpon
V. angustifolium
Rubus idaeus
C. violaceum CV026
C. violaceum 31532
P. aeruginosa PA01
30
R. eubatus
Fragaria sp.
Vitis sp.
Origanum vulgare
Rosemarinus officinalis
Ocimum basilicum
Thymus sp.
Brassica oleracea
Curcuma longa
Zingiber officinale
E. coli O157:H7
Lonicera alpigena
Castanea sativa
Juglans regia
Ballota nigra
R.officinalis
Leopoldia comosa
Malva sylvestris
Cyclamen hederifolium
Rosa canina
R. ulmifolius
S. aureus
Ananas comosus
Musa paradiciaca
Manilkara zapota
Ocimum sanctum
C. violaceum ATCC
12472
C. violaceum CV026
P. aeruginosa PA01
Scutellaria baicalensis C. violaceum CV026
Scorzonera sandrasica
C. violaceum ATCC
12472
C. violaceum CV026
Laranja Yersinia enterocolitica
Óleos essenciais
Árvore do chá
Alecrim
C. violaceum CV026
Lippia alba
Ocotea sp.
Elettaria cardamomum
Swinglea glutinosa
Myntotachys mollis
Zingiber officinale
P. putida [pRK-C12)
E. coli [pJBA132]
Piper bredemeyeri (folhas)
P. brachypodom (folhas)
P. bogotence (inteiro)
C. violaceum CV026
Metabólitos
Bioativos
Phellinus igniarius C. violaceum CV026
Exudatos de pea (Pisum
sativum)
S. marcecens
liquefaciens MG44
S. faciens MG44
Sulforafano
Erucin P. aeruginosa
Malabaricone C
Catechin
P. aeruginosa PA01
C. violaceum CV026
31
Fonte: KOH et al., 2013.
2.3 - Compostos fenólicos
2.3.1 - Definição, formação e função
Compostos fenólicos são fitoquímicos presentes em vegetais que apresentam atividade
biológica (TIVERON et al., 2012). São metabólitos secundários encontrados em plantas, úteis
na ação defensiva contra patógenos, radiação e envolvidos na função antioxidante (COWAN,
1999; MANACH et al., 2004; TIVERON et al., 2012), estando presentes em folhas, tecidos
floridos, caules e casca de plantas (KAHKONEN et al., 1999). Os compostos fenólicos foram
identificados em plantas superiores e comestíveis e podem estar envolvidos na resposta das
plantas ao estresse contribuindo para a cura por lignificação de áreas danificadas. Possuem
propriedades antimicrobianas e suas concentrações podem aumentar após a infecção da planta
(KAHKONEN et al., 1999; COWAN, 1999). Uma molécula fenólica pode ser característica
de uma planta ou mesmo de uma espécie, órgão ou tecido da planta a qual pertence
(SCALBERT e WILLIAMSON, 2000).
Os compostos fenólicos são agentes redutores que atuam para proteger os tecidos do corpo
contra estresse oxidativo. Têm sua atividade atribuída às propriedades redox, doadores de
hidrogênio e supressores de oxigênio, além de apresentarem potencial de quelação de metais
(KAHKONEN et al., 1999; SCALBERT e WILLIAMSON, 2000). Além da atividade
antioxidante e antimicrobiana, os compostos fenólicos podem apresentar atividade
anticarcinogênica e antiproliferativa (KAHKONEN et al., 1999), contudo apresentam ações
biológicas específicas que ainda não foram bem compreendidas (MANACH et al., 2004). Os
mecanismos responsáveis pela inibição microbiana dos compostos fenólicos incluem a
inibição da atividade enzimática, na alteração da solubilidade lipídica da membrana celular ou
por meio de interações com proteínas não específicas de micro-organismos (KAHKONEN et
al., 1999; MANACH et al., 2004).
As principais fontes de compostos fenólicos são frutas, chás e vinho tinto. As frutas
contêm uma grande variedade de flavonóides e ácidos fenólicos que apresentam atividade
antioxidante (KAHKONEN et al., 1999). Em vários produtos vegetais, a composição de
fenólicos é pouco conhecida ou limitada a algumas variedades ou não está localizada as partes
comestíveis desses vegetais. Alguns alimentos, principalmente frutas exóticas e alguns
32
cereais, ainda não foram analisados quanto ao perfil e teor de compostos fenólicos (COWAN,
1999).
Fatores como sazonalidade, disponibilidade de água, radiação UV, nutrientes do solo,
poluição, ataque de patógenos, maturação no momento da colheita, processamento industrial,
armazenamento e exposição à luz podem alterar a concentração de polifenóis em plantas
(TIVERON, 2012). Métodos de preparação culinária também podem afetar os teores de
compostos fenólicos dos alimentos que podem ser eliminados com a retirada da casca dos
frutos e vegetais, pois estas substâncias estão em concentrações mais elevadas nas partes
exteriores dos frutos do que na parte interna (MANACH et al., 2004).
Os compostos fenólicos podem ser classificados em diferentes grupos, em função do
número de anéis de fenol e do tipo de elementos que ligam esses anéis uns aos outros. Podem
também estar associados a hidratos de carbono e ácidos orgânicos (KAHKONEN et al.,
1999). Sua estrutura química afeta propriedades como disponibilidade, atividade antioxidante,
interações específicas com receptores celulares, enzimas e outras (SCALBERT e
WILLIAMSON, 2000). As principais classes de compostos fenólicos são: ácidos fenólicos,
flavonóides, estilbenos e lignanas (MANACH et al., 2004; SCALBERT e WILLIAMSON,
2000).
Os ácidos fenólicos são divididos em dois grupos derivados do ácido benzóico e do ácido
cinâmico. A concentração de ácido hidroxibenzóico em plantas comestíveis é baixa e este
pode ser encontrado em frutos vermelhos, rabanete preto e cebola (MANACH et al., 2004).
Ácidos hidroxicinâmicos são mais comuns que ácidos hidroxibenzóicos e consistem
principalmente de ácido p-cumárico, caféico, ferúlico e sinápico. O ácido caféico se combina
para formar o ácido clorogênico, encontrado em muitos tipos de frutas e em concentrações
elevadas no café. As frutas com o maior teor de ácido clorogênico são amoras, kiwis,
ameixas, cerejas e maçãs. O ácido caféico é o ácido fenólico mais abundante nas frutas
representando 75% a 100% do ácido hidroxicinâmico (MANACH et al., 2004, KAHKONEN
et al., 1999; COWAN, 1999). Ácidos hidroxicinâmicos são encontrados em todas as partes do
fruto, porém as concentrações mais elevadas estão na parte exterior do fruto. Suas quantidades
diminuem com o amadurecimento e aumentam com o tamanho do fruto (MANACH et al.,
2004).
33
Os flavonóides são compostos fenólicos hidroxilados nas unidades C6- C3 ligado a um
anel aromático. São os compostos fenólicos com maior frequência em alimentos e são
representados pelos grupos das flavonas, flavononas, catequinas e antocianinas (VOLP et al.,
2008). Suas fontes mais ricas são cebola, couve encaracolada, alho poró, brócolis e mirtilos e
também se encontram presentes em vinhos tintos e chás. As concentrações de flavonóides são
maiores na parte externa das plantas e frutos que mais recebem luz solar (COWAN, 1999). Os
componentes principais do grupo das flavonas são apigenina, chrisina, kaempferol, luteolina,
miricetina, rutina, sibelina e a quercetina e suas fontes alimentares são cascas de maçãs,
cerejas, brócolis, peles de frutas, frutas como cranberries, uvas, alfaces, oliva e alho. As
flavonas têm como componentes fisetina, hesperetina, narigina, naringenina e taxifolina e
suas fontes principais são frutas cítricas e peles de frutas cítricas. Os componentes das
catequinas são catequinas, epicatequina e epigalocatequinagalato e a fonte alimentar são os
vinhos e chás. As antocianinas, pertencentes ao grupo dos flavonóides, são o grupo de
pigmentos naturais tendo como principais componentes a cianidina, delfinidina, malvidina,
pelargonidina, peonidina e petunidina e suas fontes alimentares são cerejas, uvas, franboesas,
morangos, chá e peles de frutas com pigmentos escuros.
Lignanas são formadas por duas unidades de fenilpropanos, sendo a linhaça sua fonte mais
rica. São metabolizados em enterodiol e enterolactona pela microbiota intestinal. A classe dos
estilbenos, encontrados em baixas concentrações em dietas humanas, é representada pelo
resveratrol presentes em vinhos, apresentando um efeito anticancerígeno (MANACH et al.,
2004).
2.4 - Grumixama (Eugenia brasiliensis)
Grumixama (Eugenia brasiliensis) é uma fruta da família das Mirtáceas, ainda pouco
conhecida. No Brasil, a grumixameira ocorre nas regiões da mata litorânea do sul da Bahia até
Santa Catarina. Floresce no final do mês de setembro até novembro, com amadurecimento dos
frutos em novembro e dezembro (THITILERTDECHA, TEERAWUTGULRAG e
RAKARIYATHAM, 2008).
Foram identificadas três variedades de grumixameira, de acordo com as cores de seus
frutos: roxa, mais comum; vermelhas e brancas ou amarelas (MORENO et al., 2007). Seus
frutos são saborosos, com bom potencial para consumo in natura quanto para a
industrialização (KOHAMA et al., 2006). A grumixama é também conhecida como cereja
34
brasileira e pode apresentar atividade antidiarréica, antipirético, antirreumática e seus óleos
essenciais revelaram potencial antibacteriano (MAGINA, 2007) e anti-inflamatório
(DONATO e MORRETES, 2007). As Figuras 2 e 3 apresentam grumixamas e sua árvore
frutífera.
Figura 2 – A) e B) Grumixama vermelha e amarela. C) Grumixama vermelha. D)
Grumixama amarela. E) Sementes de grumixama. Fonte: próprio autor.
Figura 3 – A) Grumixameira. B) Grumixameira vermelha florida. C) Grumixameira
amarela florida. Fonte: próprio autor.
As variedades de cores de frutas têm uma distinta regulação bioquímica. A via fenólica
parece ser diferente nas duas variedades, onde na variedade roxa está presente uma via
bioquímica que leva ao acúmulo de antocianidinas, notado pela cor roxo escuro do fruto, e no
fruto amarelo, esses metabolitos não estão aparentemente presentes (MORENO et al., 2007).
Um estudo feito por Reynertson em 2007 analisou os componentes fitoquímicos e
bioativos de 14 frutas da família das Mirtáceas. Foram quantificados os compostos fenólicos
35
totais (24,80 ± 1,06 mg equivalentes de ácido gálico/g de peso seco) na grumixama, assim
como compostos antociânicos totais (8,37 ± 0,23 mg equivalentes de cianidina 3-glicosídeo/g
de peso seco). Também foram identificados seus compostos fenólicos mais importante sendo
eles as antocianinas cianidina 3-glicosídeo (10,24 ± 0,42 mg/g da matéria seca) e delfinidina
3-glicosídeo (2,58 ± 0,13 mg/g da matéria seca), além de pequenas concentrações de ácido
elágico, miricetina, quercetina e rutina. Em outro estudo Abe, Lajolo e Genovese (2011)
identificaram frutos da família das Myrtaceas contendo ácido elágico, onde os maiores teores
foram encontrados em grumixama, jabuticaba e cambuci. Na fruta de grumixama foram
identificados derivados de quercetina na quantidade de 0,20g kg-1
da amostra, elevado teor de
antocianinas 1,69 g kg -1
da amostra e flavonóides 1,91g kg -1
da amostra.
Poucos estudos sobre os efeitos biológicos e antimicrobianos da polpa de grumixama
foram reportados na literatura até o momento. Alguns estudos, porém, com plantas ricas em
antocianinas comumente encontradas na grumixama, identificaram capacidade antimicrobiana
dos extratos antociânicos contra Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus e Candida
albicans.
2.5 - Pitanga (Eugenia uniflora L.)
A pitanga (Eugenia uniflora L.), também pertencente à família das Mirtáceas, é nativa da
Mata Atlântica. Pode ser usada na alimentação in natura, para fazer sucos e doces, e também
na medicina popular, pelo uso de chás de suas folhas. As pitangueiras frutificam de outubro a
janeiro, e podem ser encontradas variações em sua coloração, desde o laranja, vermelhas e
roxas (PIO et al., 2005). As Figuras 4 e 5 apresentam pitangas em seus estágios de maturação
e sua árvore frutífera, pitangueira.
Figura 4 – A) Pitangas em diferentes estágios de maturação. B) e C) Sementes de pitanga.
Fonte: Lira Junior et al. (2007).
36
Figura 5 – A) Pitangueira. B) Florescência da pitangueira e pitangueira com frutos.
Fonte: Lira Junior et al. (2007).
A pitanga é uma fonte rica em compostos fenólicos, tendo a fruta roxa maior capacidade
antioxidante quando comparada às frutas de outras cores, principalmente devido à maior
presença de antocianinas (BAGETTI et al., 2011). Os compostos fenólicos presentes na
pitanga foram identificados por Karwowski (2012), sendo eles o ácido gálico, ácido
clorogênico, ácido caféico, ácido ferúlico e ácido p-cumárico, além de flavonóides totais
como rutina, miricetina e quercetina.
Vendruscolo (2005) identificou espécies de plantas utilizadas na medicina tradicional
popular, entre elas E. uniflora L. (Myrtaceae). Foi verificado que as folhas são ricas em
taninos, glicosídeos de flavonóides e óleo volátil. Entre várias funções foi descrito atividade
antimicrobiana do óleo volátil.
Estudos sobre potencial antimicrobiano da pitanga, encontrados na literatura, avaliaram os
extratos de frutos e partes não comestíveis, como folhas e hastes. Holetz et al. (2002) testaram
treze extratos hidroalcoólicos de plantas, incluindo o extrato de folhas de pitanga,
encontrando atividade antimicrobiana moderada contra S. aureus e E. coli no extrato de
pitanga. Outro estudo verificou atividade inibitória dos frutos de E. uniflora L. sobre E. coli,
Streptococcus pyogenes, Providencia spp, Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staphylococcus
aureus, Staphylococcus spp. coagulase - (GONÇALVES, ALVES FILHO, MENEZES,
2005). Também foram encontrados efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de E. uniflora
L. contra S. aureus, Salmonella Choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans,
37
sugerindo que os componentes do extrato responsáveis pela atividade antimicrobiana
poderiam ter sido os compostos fenólico, particularmente os taninos (AURICCHIO et al.,
2007).
Os estudos apresentados acima fornecem um indicativo do potencial antimicrobiano dos
frutos e folhas da pitanga (Eugenia uniflora L.). Reconhecer a atividade anti-quorum sensing
desses frutos poderia trazer uma alternativa para seu uso como agente antimicrobiano natural.
3 – OBJETIVOS
3.1 - Objetivos
Detectar a atividade de inibição do quorum sensing bacteriano pelos extratos bruto e
fenólico das frutas tropicais brasileiras grumixama e pitanga.
4 – MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 - Material vegetal
As frutas grumixama e pitanga foram colhidas na região de Ouro Preto – MG na época de
suas respectivas frutificações. Grumixama e pitanga foram colhidas entre setembro a
novembro de 2013 e outubro de 2013 a janeiro de 2014, respectivamente. As espécies foram
coletadas, herborizadas e depositadas no Herbário Professor José Badini, da Universidade
Federal de Ouro Preto, com a seguinte identificação: (OUPR). Eugenia brasiliensis Lam.,
M.C.T.B.Messias & F.G. Zola, 2481 e Eugenia uniflora L.M.C.T.B.Messias & F.G. Zola,
2482.
4.1.2. Preparo do material vegetal
As frutas foram colhidas e armazenadas a -20°C até atingirem a quantidade suficiente para
extração da polpa. As frutas foram posteriormente lavadas em água corrente, folhas e talos
foram removidos e foram sanitizadas com solução de hipoclorito de sódio a 50mg/L por 15
minutos. Após sanitização, as sementes foram removidas manualmente e a polpa separada e
homogeneizada em multiprocessador doméstico e congelada a -20°C.
38
4.2 - Extração e purificação de compostos fenólicos
Os compostos fenólicos foram extraídos com solvente e purificados utilizando extração em
fase sólida (SPE), conforme Bertoldi (2009) com adaptações. As polpas das frutas foram
descongeladas e misturadas com solução de etanol: metanol: acetona 1:1:1 (v/v/v), seguida de
filtração em papel Whatman n° 1. Posteriormente, os solventes foram evaporados em rota-
vapor a 40°C (Büchi, Switzerland) e o extrato aquoso, chamado de extrato bruto foi eluído em
minicoluna C18 Sep-Pak Vac 35cc 10g 20 cm3 (Waters Corporation, Milford, MA) para
purificação dos compostos fenólicos. Os compostos fenólicos adsorvidos no cartucho foram
eluídos com metanol (fração adsorvida) e a fração aquosa não adsorvida foi descartada. O
metanol foi completamente evaporado em rota-vapor a 40° C e água destilada foi adicionada
até volume conhecido para obter o extrato fenólico.
4.3 - Compostos fenólicos totais
O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo ensaio do reagente Folin-
Ciocalteu (SHAHIDI e NACZK, 1996). Uma alíquota de 0,6 ml do extrato fenólico foi
diluída em 3,0 ml de reagente Folin-Ciocalteu diluído em água destilada (1:10; v/v). Depois
de 3 minutos de repouso na ausência de luz, foram adicionados 2,4 ml de solução saturada de
Na2CO3 (7,5 %; m/v). A absorbância foi determinada a 760 nm por espectrofotometria de
absorção (UV-1601 PC Shimadzu, Tokyo, Japão), após 2 horas de repouso em ausência de
luz. O índice de compostos fenólicos totais (IPT) foi determinado utilizando-se a curva padrão
de ácido gálico (0-200 mg/L) e os resultados foram expressos em mg de ácido gálico
equivalente por litro de extrato (AGE/L).
4.4. - Estirpes bacterianas utilizadas
As estirpes bacterianas utilizadas neste trabalho foram C. violaceum ATCC 6357, A.
hydrophila IOC/FDA 110-36, S. marcescens (parte da coleção de culturas do Laboratório de
Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal de Ouro Preto) e E. coli ATCC 10536. C.
violaceum ATCC 6357 foi cultivada a uma temperatura de 28 a 30 °C, A hydrophila
IOC/FDA 110-36 e E. coli ATCC 10536 a 37 °C e S. marcescens a 30 °C. As estirpes foram
cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) contendo peptona 1 %, extrato de levedura 0,5 %,
NaCl 0,5 %, ao invés de 1.0 % (RAVN et al., 2001).
39
4.5 - Determinação in vitro da atividade anti-quorum sensing dos extratos brutos e
fenólicos
4.5.1 - Teste qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum
O teste foi realizado conforme Tan, Yin e Chan (2012), com modificações. As culturas de
C. violaceum foram crescidas em caldo LB por, aproximadamente, 18 horas (overnight) a 30
°C e uma alíquota de 1 ml dessa cultura foi misturada a 20 ml de ágar LB fundido em placa de
Petri estéril. O ágar foi deixado em repouso por 30 minutos e, posteriormente, poços
equidistantes de 5 mm de diâmetro foram feitos em cada placa, com o auxílio de ponteiras
estériladas. A cada poço, foram adicionados 20 µl dos extratos bruto e fenólico de grumixama
e pitanga em diferentes concentrações. O teste foi realizado com cinco concentrações dos
extratos das duas frutas. As placas foram incubadas a 30 °C por 24 horas. Água destilada
esterilizalada e o antibiótico Canamicina (100 µg/ml - Sigma Aldrich) foram utilizada como
controles. A atividade de inibição do sistema quorum sensing em C. violaceum foi verificada
pela formação de um halo turvo, indicativo de crescimento bacteriano, porém sem
pigmentação, em fundo roxo, ao redor do poço contendo extrato.
4.5.2- Teste da concentração inibitória mínima (MIC)
O teste para determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) foi realizado pelo
método de diluição em ágar, segundo a metodologia sugerida por Wiegand, Hilpert e Hancock
(2008) com modificações. O teste MIC é usado para determinar a susceptibilidade das
bactérias a uma droga alvo ou avaliar a atividade de novos agentes antimicrobianos. O teste
em ágar determina a concentração mais baixa do agente antimicrobiano, definida nas
condições de teste, que causa inibição visível do crescimento bacteriano. Uma população de
104 UFC de cada micro-organismo foi inoculada em forma de microgotas de 5 microlitros
(spot) em ágar Mueller-Hinton, adicionado de diferentes concentrações dos extratos bruto ou
fenólico de cada fruta. As placas foram incubadas por 24 horas a temperatura ótima de
crescimento de cada micro-organismo e a MIC foi determinada como sendo a concentração
mínima em que não foi observado crescimento microbiano.
A atividade anti-quorum sensing é evidenciada por uma inibição da comunicação, não
havendo morte bacteriana. Dessa forma, testes feitos com os extratos de grumixama e pitanga
40
utilizam valores sub-MIC determinados previamente, garantindo que os resultados não
fossem devidos a morte microbiana.
4.5.3 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum
O teste foi feito segundo Tan, Yin e Chan (2012) com modificações. C. violaceum foi
cultivada por 18 h a 30 °C e inoculada a uma densidade óptica de 0,1 a 600 nm
(aproximadamente 108 UFC/ml) em tubos de ensaio contendo caldo LB e caldo LB
suplementado com extratos de ambas as frutas nas concentrações testadas. Os tubos foram
incubados por 24 horas a 28 °C em incubadora de agitação a 150 rotações por minuto (rpm).
A quantificação de violaceína foi obtida utilizando 1 ml de cultura de cada tubo, centrifugada
a 13.000 rpm durante 10 minutos para precipitar a violaceína insolúvel. Em seguida, o
sobrenadante da cultura foi descartado e o pellet solubilizado em 1 ml de Dimetilsulfóxido
(DMSO), que foi agitado vigorosamente em um agitador de tubos e centrifugado novamente a
13.000 rpm durante 10 minutos para remover as células. A absorbância foi medida em
espectrofotômetro de luz vizível a 585 nm. O controle negativo foi feito com caldo LB sem
adição dos extratos e o controle positivo para inibição do sistema quorum sensing foi feito
com a adição de furanona ((Z-)-4-Bromo-5(bromomethylene-2(5h)-furanone) adquiridos da
Sigma Aldrich a uma concentração de 39,4 µM. Após o período de incubação de 24 horas,
foram realizados plaqueamentos e contagem de C. violaceum (UFC ml-1
) em culturas
contendo cada concentração dos extratos testados para comprovar que tais concentrações não
influenciaram o crescimento microbiano.
Os testes foram realizados em triplicata, e o controle negativo sem adição do extrato, foi
considerado como 100% para produção de violaceína. O percentual de inibição da produção
de violaceína foi calculado usando a seguinte fórmula:
% de inibição de violaceína = (Densidade Ótica do Controle 585 nm – Densidade Ótica do
teste 585 nm/ Densidade Ótica do Controle 585 nm)×100
4.5.4 - Efeito anti-quorum sensing na motilidade tipo swimming e swarming em A.
hydrophila e S. marcescens
Para o teste de avaliação da motilidade, ágar LB foi preparado contendo 0,3% de ágar-ágar
para testar o movimento tipo swimming e 0,4% para testar a motilidade tipo swarming
41
(HUBER et al., 2003). Alíquotas de extrato foram adicionadas ao ágar e vertidas em placas de
Petri esteriladas. As placas foram deixadas em repouso por 30 minutos e alíquotas de 2 µL de
cada micro-organismo, crescido overnight, foram inoculadas em forma de ponto (spot), no
centro do ágar. As placas foram incubadas a temperatura ótima para cada micro-organismo
por 24 horas. Os resultados de efeito dos extratos bruto e fenólico na motilidade tipo
swimming e swarming foram observados por meio da comparação visual com controle. O
controle negativo foi realizado com ágar, sem adição dos extratos.
4.5.5- Determinação in vitro da inibição da formação de biofilme em C. violaceum, S.
marcescens, A. hydrophila e E. coli
Para a avaliação do efeito dos extratos fenólicos sobre a formação de biofilmes, alíquotas
de 20 μL (2% da cultura ajustada para DO 0,1 a 600nm) da suspensão de células em estudo,
contendo cerca de 107 UFC/ml
-1, foram inoculadas em 180 μL de meio LB em microplacas de
poliestireno de 96 poços. Concentrações previamente determinadas dos extratos bruto e
fenólico de ambas as frutas foram adicionados aos poços. A incubação foi feita a temperatura
ótima de crescimento de cada micro-organismo por 72 horas. Após esse período, o meio de
cultura foi removido, invertendo-se a microplaca sobre papel absorvente. As células aderidas
às microplacas foram coradas por 30 minutos com 200 μL de cristal violeta a 0,1 % (p/v) em
água. Em seguida, o corante foi descartado e os poços das microplacas foram lavados, por três
vezes consecutivas, com 200 μL de água destilada. As placas foram secas em estufa a 40ºC,
por 15 minutos. O cristal violeta retido pelas células aderidas foi dissolvido em 200 μL de
etanol (95 %) e a absorbância medida a 630 nm em leitor de microplacas (CONWAY, 2012).
Os testes foram feitos em triplicata.
4.6 - Análises estatísticas
As análises foram feitos em triplicata, obtendo-se a média e desvio padrão. A significância
dos dados foi avaliada pelo teste ANOVA, empregando-se o teste de Tukey, utilizado o
software GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (San Diego, Califórnia, USA). As
diferenças foram consideradas significativas para p < 0,05.
42
5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 - Compostos fenólicos totais
A quantidade de compostos fenólicos do extrato bruto se grumixama foi de 2520,5 mg
AGE/L e do extrato fenólico foi obtidos de 2998,5 mg AGE/L. Em relação à pitanga, o
conteúdo de compostos fenólicos totais do extrato bruto foi de 1472,3 mg AGE/L, enquanto
que do extrato fenólico foi de 2315,2 mg AGE/L.
Guedes (2012), Mercadante (2012), Infante (2013) e Abe, Lajolo e Genovese (2012)
encontraram valores de compostos fenólicos totais da grumixama variando entre 10,40 a
26,69 mg AGE/g da matéria seca. Os trabalhos citados acima mostram a composição de
compostos fenólicos expressos em mg AGE/g da matéria seca, já os resultados desse trabalho
são expressos em mg AGE/L, dessa forma não sendo possível comparar os os resultados, mas
de observar sua identificação na grumixama. Silva et al. (2014) identificaram na polpa de
grumixama uma maior quantidade das antocianinas delfinidina 3-glicosídeo e cianidina 3-
glicosídeo. Também foram identificadas cianidina 3-galactosídeo e cianidina 3-acetil-
hexosídeo, quercetina glicuronídeo, quercetina galoil-hexosídeo, quercetina desoxi-hexosídeo,
quercetina hexosídeo, quercetina pentosídeo, eriodictiol hexosídeo, quercetina desoxihexosil-
hexosídeo, quercetina, ácido sinápico dihexosídeo hidroxi benzoil, ácido gálico dihexosídeo
sinapoil e ácido sinápico dihexosídeo benzoil.
Infarte (2013) caracterizou os principais compostos fenólicos encontrados nos extratos
vegetais de grumixama, sendo eles as catequina, epicatequina e ácido gálico e Guedes (2012)
identificou flavonoides e antocianinas. Reynertson (2007) identificou as antocianinas
cianidina 3-glicosídeo e delfinidina 3-glicosídeo, além de ácido elágico, miricetina, quercetina
e rutina presentes na grumixama.
Na pitanga, a concentração de compostos fenólicos totais foi quantificada por Bagetti et al.
(2011), Jacques et al., (2009); Abe, Lajolo e Genovese (2012) que obtiveram resultados
variando entre 95,0 e 201,8 mg AGE/100 g de polpa fresca. Os resultados obtidos no presente
estudo quando expressos em mg AGE/100 g de polpa fresca de pitanga foram 126,1 mg AGE
no extrato bruto e 104,6 mg AGE/100g de fruta no extrato fenólico e estes valores se
encontram próximos aos encontrados por esses autores. O composto fenólico predominante
determinado por Prado (2009) foi acido gálico, enquanto Karwowski (2012) identificou ácido
43
gálico, ácido clorogênico, ácido caféico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, rutina, miricetina e
quercetina na pitanga. A quantificação e determinação dos compostos fenólicos é importante
na classificação da fruta quanto ao teor desses e na elucidação de quais os compostos que
poderiam estar desempenhando as atividades.
5.2 - Teste qualitativo de inibição do quorum sensing em C. violaceum
As Figuras 6, 7, 8 e 9 apresentam os resultados de inibição qualitativa do quorum sensing
em C. violaceum pelos extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga, em diferentes
concentrações. Ambos os extratos de grumixama e pitanga apresentaram atividade anti-
quorum-sensing contra C. violaceum. Esta atividade pode ser observada pela formação de
uma zona clara e turva, em fundo roxo ao redor do poço, resultante da inibição da produção
de violaceína. O teste qualitativo demostrou o potencial de ambos os extratos em interferirem
com a comunicação quorum sensing nesta bactéria.
Figura 6 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato
bruto de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por
pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle
negativo - Água destilada estéril, D) 2520,5 mg AGE/L, E) 504,10 mg AGE/L, F) 252,05 mg
AGE/L, G) 168,03 mg AGE/L e H) 126,02 mg AGE/L de extrato bruto de grumixama.
Figura 7 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato
fenólico de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por
pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle
44
negativo - Água destilada estéril, D) 2998,5 mg AGE/L, E) 599,70 mg AGE/L, F) 299,85 mg
AGE/L, G) 199,9 mg AGE/L e H) 149,92 mg AGE/L de extrato fenólico de grumixama.
Figura 8 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato
bruto de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por
pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle
negativo - Água destilada estéril, D) 1472,3 mg AGE/L, E) 294,46 mg AGE/L, F) 147,23 mg
AGE/L, G) 98,15 mg AGE/L e H) 58,98 AGE/L de extrato bruto de pitanga.
Figura 9 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato
fenólico de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por
pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da Inibição do crescimento, C) Controle
negativo - Água destilada estéril, D) 2315,2 mg AGE/L, E) 463,04 mg AGE/L, F) 231,15 mg
AGE/L, G) 154,35 e H) 115,76 mg AGE/L de extrato fenólico de pitanga.
Segundo Adonizio et al. (2009) a inibição do sistema quorum sensing pode ser evidenciada
pela perda do pigmento roxo, sem alteração no crescimento em C. violaceum. Como pode ser
observado nas Figuras 6-9, o antibiótico inibiu o crescimento microbiano, visualizada pela
formação de um halo transparente ao redor do poço contendo o mesmo. No caso dos extratos,
houve uma leve inibição do crescimento em algumas concentrações, porém halos
visivelmente turvos, com expressiva redução do pigmento violaceína são vistos na maioria
dos pocinhos, indicando inibição do sistema quorum sensing, especialmente para o extrato
fenólico de pitanga.
45
5.3 - Concentração Inibitória Mínima (MIC)
As concentrações inibitórias mínimas em C. violaceum ATCC 6357, A. hydrophila
IOC/FDA 110-36, E. coli ATCC 10536 e S. marcescens estão apresentadas nas Tabelas 4 e 5,
em valores de diluição do extrato e em concentração de compostos fenólicos totais expressos
em mg AGE/L, presentes nos extratos de grumixama e pitanga.
Os inibidores quorum sensing não causam a morte de micro-organismos, agem bloqueando
a expressão de fenótipos, sem afetar o crescimento microbiano (PAN e REN, 2009; YEO e
THAM, 2012; KALIA, 2012; BAI e RAI, 2012; NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA,
2013). Determinar a MIC dos extratos para as bactérias utilizadas nos testes garante que os
resultados obtidos para os ensaios anti-quorum sensing sejam devidos à inibição da
comunicação bacteriana e não causados pela morte microbiana.
Tabela 4 - Concentração Inibitória Mínima expressa em quantidade de compostos fenólicos
totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de grumixama.
Extrato de
grumixama Bactérias
mg
AGE/L
Equivalência
ao extrato puro
*
Bruto
A. hydrophila
IOC/FDA110-36 420,08 1:6
C. violaceum ATCC6357 100,82 1:20
E. coli ATCC10536 100,82 1:20
S. marcescens >100,82 <1:20
Fenólico
A. hydrophila
IOC/FDA110-36 499,75 1:6
C. violaceum ATCC6357 214,18 1:14
E. coli ATCC10536 749,63 1:4
S. marcescens >149.93 <1:20
*Esse valor representa o quanto o extrato foi diluído comparado ao extrato puro.
Tabela 5 - Concentração Inibitória Mínima expressa em quantidade de compostos fenólicos
totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de pitanga.
Extrato de
pitanga Bactérias
mg
AGE/L
Equivalência
ao extrato puro
*
Bruto
A. hydrophila
IOC/FDA110-36 98,15 1:15
C. violaceum ATCC6357 92,02 1:16
46
E. coli ATCC10536 73,61 1:20
S. marcescens >73,61 <1:20
Fenólico
A. hydrophila
IOC/FDA110-36 115,76 1:20
C. violaceum ATCC6357 115,76 1:20
E. coli ATCC10536 165,37 1:14
S. marcescens >115,76 <1:20 *Esse valor representa o quanto o extrato foi diluído comparado ao extrato puro.
Os valores das MICs do extrato bruto de grumixama obtidos para as bactérias testadas
variaram de 100,82 mg AGE/L a 420, 08 mg AGE/L e para o extrato fenólico a variação foi
de 149,93 mg AGE/L a 499,75 mg AGE/L. As bactérias mais sensíveis ao extrato bruto de
grumixama foram C. violaceum ATCC6357 e E. coli ATCC10536, já para o extrato fenólico,
C. violaceum ATCC6357 foi a bactéria mais sensível (Tabela 4).
Os valores da MICs do extrato bruto de pitanga variaram de 73,61 mg AGE/L a 98,15 mg
AGE/L. As MICs do extrato fenólico variaram de 115,76 mg AGE/L a 165,37 mg AGE/L. E.
coli ATCC 10536 foi a bactéria que apresentou a menor MIC, valor de 73,61 mg AGE/L para
o extrato bruto de pitanga e C. violaceum ATCC 6357 e A. hydrophila IOC/FDA 110-36
foram as que apresentaram as menores MICs para extrato fenólico de pitanga (Tabela 5).
A comparação dos valores da MIC obtidos neste estudo permite constatar que as bactérias
testadas apresentaram maior sensibilidade aos extratos de pitanga e que a sensibilidade foi
semelhante entre o extrato bruto e o fenólico desta fruta.
Não existe uma forma padronizada para expressão dos resultados dos testes
antimicrobianos por produtos naturais. Dessa maneira, existem variações na determinação da
MIC que impedem uma devida comparação entre diferentes agentes antimicrobianos naturais.
Tais variações podem ser atribuídas a vários fatores, como a variação na técnica aplicada (em
caldo ou meio sólido), a origem e época da colheita da planta, se são utilizadas plantas frescas
ou secas, os tipos de solventes utilizados no preparo dos extratos, o próprio micro-organismo
avaliado, entre outros (OSTROSKY et al., 2008; FENNEL et al., 2004).
Os resultados constatados neste trabalho indicaram sensibilidade antimicrobiana aos
extratos brutos e fenólicos de grumixama e pitanga, indicando que mesmo em concentrações
aproximadamente 20 vezes diluídas, os extratos apresentaram atividade antimicrobiana e que
possivelmente estando na forma diluída terão pouca influencia no aspecto sensorial do
47
alimento. Entre as características para escolha de um agente antimicrobiano, deve ser
considerada sua compatibilidade química e sensorial com o alimento alvo e sua efetividade
contra micro-organismos indesejáveis (SETTANNI; CORSETTI, 2008). Alguns extratos
naturais, quando testados como agentes antimicrobianos, apresentaram resultados
satisfatórios, porém as características sensoriais dos alimentos não foram avaliadas
(ALMEIDA et al., 2014) ou quando analisadas, tornaram sua utilização inviável (SILVA,
2007).
Em trabalho realizado por Zola (2014), foram obtidos valores da MICs para extratos de
grumixama e pitanga efetivos contra algumas bactérias de importância na área de
microbiologia de alimentos. Os valores da MIC determinados para o extrato fenólico de
grumixama foram menores que 260 mg AGE/L contra S. aureus e B. cereus, 520 mg AGE/L
contra P. aeruginosa e 1,040 mg AGE/L contra E. coli e Listeria monocytogenes. Já o extrato
fenólico de pitanga apresentou valor da MIC menor que 490 mg AGE/L contra S. aureus, E.
coli, P. aeruginosa, L. monocytogenes e B. cereus (ZOLA, 2014). Os resultados da MIC de
grumixama e pitanga obtidos no presente trabalho foram menores que os encontrados por
Zola (2014). As bactérias testadas se mostraram mais sensíveis que as bactérias usadas por
esse autor, apresentando MIC consideravelmente menor.
A atividade antimicrobiana de extratos ricos em compostos fenólicos é bem conhecida
(ALVARENGA et al, 2007). Esses compostos atuam causando danos a membrana celular ou
ruptura da camada de peptideoglicano, causando a fuga de componentes citoplasmáticos
como proteínas ou glutamato de potássio e fosfato. Causam também inibição do transporte
ativo e o desacoplamento da fosforilação oxidativa. A presença do grupo hidroxila no
composto fenólico pode influenciar na sua atividade antimicrobiana por meio da ligação ao
local ativo de enzimas, formando ligações de hidrogênio e alterando o metabolismo celular
(SALAWU et al., 2011; LIU, 2003; HAIDARI et al., 2009).
5.4 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum ATCC 6357
5.4.1 - Quantificação da inibição da produção de violaceína pelos extratos obtidos de
grumixama
Os extratos bruto e fenólico de grumixama, em todas as concentrações testadas,
apresentaram reduções significativas no percentual de inibição da produção de violaceína,
48
comparadas ao controle (p<0,05) (Figuras 10 a 13). As contagens de UFC ml-1
após 24 horas
de incubação na presença dos extratos, em suas diferentes concentrações, ou dos controles,
não apresentaram diferença estatisticamente significativa, demonstrando que os mesmos
tiveram apenas propriedades de inibição do quorum sensing, sem afetar o crescimento
microbiano (Figura 10 a 13).
Figura 10 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de
grumixama em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC
ml-1
) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB
adicionado de 200 µl de água destilada esterilizalada. Médias seguidas pelas mesmas letras
não diferem estatisticamente entre si (p<0,05).
Os resultados revelaram ainda que todos os extratos, em suas maiores concentrações
avaliadas, tiveram uma inibição no percentual de violaceína maior ou igual ao da furanona,
composto de comprovada inibição do sistema quorum sensing (PAN e REN, 2009; GRAM et
al., 1996; MANEFIELD et al., 2000; KALIA, 2012), que inibiu 79% quando usada na
concentração de 39,4 µM. O extrato bruto de grumixama apresentou inibição da produção de
violaceína que variou entre 84 a 50 %, de acordo com a concentração avaliada (Figura 10). Os
percentuais de inibição da produção de violaceína pela furanona e pelo extrato bruto de
grumixama na concentração de 100,82 mg AGE/L não diferiram estatisticamente (p<0,05).
As duas menores concentrações avaliadas apresentaram menor eficácia na capacidade de
49
inibição do sistema quorum sensing em C. violaceum (Figura 10). A redução na produção de
violaceína pode ser observada na Figura 11.
Figura 11 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama. A)
Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato bruto de grumixama na
concentração de 100,82 mg AGE/L, D) Extrato bruto de grumixama na concentração 50,41
mg AGE/L, E) Extrato bruto de grumixamana concentração 33,61 mg AGE/L e F) Extrato
bruto de grumixama na concentração de 25,21 mg AGE/L.
Nas Figuras 12 e 13 estão apresentados os resultados de inibição da produção de violaceína
pelo extrato fenólico de grumixama, em diferentes concentrações. Constatou-se que o extrato
fenólico na concentração 119,94 mg AGE/L apresentou elevada eficiência na inibição (90%),
alcançando valores superiores aquele obtido com furanona (79%). Também houve inibição da
produção de pigmento quando C. violaceum cresceu na presença dos extratos em
concentrações inferiores, porém com menor eficiência, sendo que as concentrações 59,97 mg
AGE/L e 39,98 mg AGE/L não diferiram significativamente entre si. Os resultados obtidos na
contagem de células viáveis não revelaram diferenças estatísticas entre os tratamentos,
indicando que os extratos, nas concentrações testadas, não inibiram o crescimento de C.
violaceum.
50
Figura 12 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de
grumixama em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC
ml-1
) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB
adicionado de 200 µl de água destilada esterilizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não
diferem estatisticamente (p<0,05).
Figura 13 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de grumixama. A)
Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato fenólico de grumixama na
concentração de 119,94 mg AGE/L, D) Extrato fenólico de grumixama na concentração 59,97
mg AGE/L, E) Extrato fenólico de grumixama na concentração 39,98 mg AGE/L e F) Extrato
fenólico de grumixama na concentração de 29,99 mg AGE/L.
5.4.2 - Quantificação da inibição da produção de violaceína pelos extratos obtidos de
pitanga
Os extratos bruto e fenólico de pitanga, em todas as concentrações testadas, apresentaram
reduções significativas no percentual de inibição da produção de violaceína, comparadas ao
controle (p<0,05) (Figuras 14 - 17). As contagens de UFC ml-1
, após 24 horas de incubação
51
na presença dos extratos em suas diferentes concentrações ou dos controles, não apresentaram
diferenças significativas, demonstrando haver apenas propriedades de inibição do sistema
quorum sensing pelos extratos nas concentrações avaliadas (Figura 14 - 17).
Constatou-se que o extrato bruto de pitanga, na concentração de 58,89 mg AGE/L, reduziu
96,8 % a produção de violaceína em comparação ao controle, (Figura 14). Não houve
diferença significativa no percentual de inibição da produção de violaceína entre furanona e
os extratos de pitanga nas concentrações de 46,30 mg AGE/L, em 30,87 mg AGE/L e 23,15
mg AGE/L.
A Figura 15 mostra a diferença observada na produção do pigmento violaceína nas
diferentes concentrações do extrato bruto de pitanga e a Figura 17 pelo extrato fenólico da
mesma fruta.
Figura 14 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga em
diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1
) após 24
horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de
200 µl de água destilada esterelizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem
estatisticamente (p<0,05).
52
Figura 15 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga. A) Controle, B)
Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89
mg AGE/L, D) Extrato bruto de pitanga na concentração de 29,44 mg AGE/L, E) Extrato
bruto de pitanga na concentração de 19,66 mg AGE/L e F) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 14,72 mg AGE/L.
Figura 16 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga
em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1
) após 24
horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de
200 µl de água destilada esterelizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem
estatisticamente (p<0,05).
Figura 17 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga. A) Controle,
B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de
53
92,61 mg AGE/L, D) Extrato fenólico na concentração de 46,30 mg AGE/L, E) Extrato
fenólico de pitanga na concentração de 30,87 mg AGE/L e F) Extrato fenólico de pitanga na
concentração de 23,15 mg AGE/L.
Os resultados obtidos evidenciam que os extratos das duas frutas avaliadas, grumixama e
pitanga apresentaram-se como potenciais inibidores do sistema quorum sensing em C.
violaceum. Todos os extratos testados foram capazes de inibir a produção de violaceína,
chegando até uma redução máxima de 96,8%, em comparação ao controle. Até mesmo na
concentração 100 vezes diluída, os extratos se mostraram eficazes na redução da produção de
violaceína e, portanto na inibição do quorum sensing.
Em conformidade com o presente trabalho, vários estudos demonstraram a eficácia de
extratos naturais, contendo compostos fenólicos, em inibir a produção de violaceína por C.
violaceum. Vattem et al. (2007) demonstraram atividade anti-quorum sensing por frutas como
framboesa, mirtilo e uva, onde estas apresentaram redução na produção de violaceína que
variou de 20 a 60%. Nesse mesmo estudo, ervas e especiarias também foram testadas
apresentando redução de 78% na produção de violaceína em manjericão, 60% em tomilho e
brassica e 40% em alecrim, gengibre e açafrão. Assim, os resultados do presente estudo foram
consideravelmente maiores do que os encontrados no estudo de Vattem et al. (2007).
Kigelia africana, da família Bignoniaceae, produz uma fruta conhecida por sua forte
atividade terapêutica atribuída à presença de compostos fenólicos. O extrato obtido dessa fruta
apresentou grande potencial para atividade anti-quorum sensing com redução da produção de
violaceína em até 99,76% (CHENIA, 2011). O estudo de Borges et al. (2014) avaliou a
atividade de compostos fenólicos isolados sobre a produção de violaceína e foi constatada
redução de 59% na presença de ácido gálico, 72% no de ácido ferúlico, 75% no de caféico,
48% no de floridizina, 33% em epicatequina e 51% para glicosídeo olieuropeína, todos na
concentração de 1000 µg/ml. Outro estudo, feito por Huber et al. (2003), demostrou o efeito
na inibição do quorum sensing por compostos fenólicos como epigalocatecolamina (EGCG),
ácido elágico e ácido tâmico, que reduziram a bioluminescência em E. coli MT102 pSB403, a
fluorescência em Pseudomonas putida pKR-C12, a formação de biofilme e a motilidade
Burkholderia cepacia.
Alguns trabalhos identificaram os compostos fenólicos majoritários presentes na
grumixama e pitanga. Na grumixama foram identificados os compostos fenólicos como
antocianidinas (MORENO, 2007), cianidinas, quercetinas, ácido sinápico e ácido gálico
54
(SILVA et al., 2014). Também foram identificados catequina e epicatequina (INFARTE,
2013), flavonóides (GUEDES, 2012), ácido elágico, miricetina e rutina (REYNERTSON,
2007). Na pitanga, os principais compostos fenólicos identificados foram ácido gálico
(PRADO, 2009), ácido clorogênico, ácido caféico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, rutina,
miricetina e quercetina (KARWOWSKI, 2012). Como grumixama e pitanga são frutas ricas
em compostos fenólicos, a atividade anti-quorum sensing evidenciada neste trabalho pode
estar relacionada à presença desses compostos identificados como já relatado (VATTEM et
al., 2007; CHENIA, 2011; BORGES et al., 2014; HUBER et al., 2003). Porém, a atividade
anti-quorum sensing também pode estar relacionada a outros compostos presentes nessas
frutas. Esse fato pode ser observado devido a ambos os extratos, bruto e fenólico,
apresentarem um efeito anti-quorum sensing considerável. O extrato bruto contêm todas as
substâncias presentes nas frutas que podem ser extraídas pelos solventes utilizados na
extração (etanol, metanol e acetona). Já o extrato fenólico, contêm apenas os compostos
fenólicos dessas frutas, sendo o método de extração específico para estes compostos (extração
em fase sólida – C18). Gilber e Alves (2003) e Asoanaivo et al. (2001) afirmaram que
extratos vegetais podem ser mais eficazes do que os constituintes isolados de uma planta. Este
fato pode ser atribuído pelas interações positivas entre os componentes presentes no extrato.
O beneficio do extrato pode estar na proteção do componente ativo da planta a uma
degradação enzimática, ou até mesmo por facilitar o transporte através de barreiras,
resultando em uma maior eficácia quando comparado ao composto purificado, dessa forma
sendo mais eficaz sua utilização.
Na literatura, até o momento, são escassos os estudos que avaliaram a atividade anti-
quorum sensing de frutas. Entretanto, é crescente o número de estudos que avaliam essa
atividade em plantas, incluindo ervas medicinais (ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2012).
Um estudo com 20 ervas da medicina tradicional chinesa demonstrou que 40% dessas inibiam
a atividade de quorum sensing, indicada pela inibição da produção de violaceína. Esse estudo
demonstrou que a atividade anti-quorum sensing pode ser mais presente do que se imagina e
esse potencial poderia oferecer um modo alternativo de ação contra bactérias patogênicas que
utilizam o sistema quorum sensing para regular virulência. Além disso, as ervas estudadas
pertenciam a diferentes famílias de plantas sugerindo que os inibidores de quorum sensing
não são exclusivos de um grupo de plantas (YEO e THAM, 2011).
55
Plantas medicinais tradicionalmente usadas em todo o mundo apresentaram inibição da
produção de violaceína, e Syzygiumcumini L. e Pimenta dioica L inibiram a produção desse
pigmento em 80% (VASAVI, ARUN e REKHA, 2013). Centella asiatica L. (VASAVI e
REKHA, 2014) e Adenanthera pavonina L (VASAVI ARUN e REKHA, 2015) reduziram
completamente a produção de violaceína, sendo os flavonóides sugeridos como os
responsáveis por essa ação. Além dessas plantas, o extrato de Rhizophora
annamalayanacasca, uma planta do mangue, apresentou atividade anti-quorum sensing por
meio de inibição da violaceína e da bioluminescência em V. harveyi demonstrando o potencial
dos frutos de manguezais como agentes anti-quorum sensing (MUSTHAFA et al., 2013).
Sementes de Cuminum cyminum, conhecido pelo nome popular de cominho, apresentaram
atividade como potentes inibidores do quorum sensing inibindo em 86% a produção de
violaceína por C. violaceum (PACKIAVATHY et al., 2011). Além desses, cafeína se mostrou
um potente inibidor do quorum sensing reduzinho significativamente a produção de
violaceína, mostrando atuar na inibição da produção de AHL (NORIZAN, YIN e CHAN,
2013).
Além da atividade anti-quorum sensing ser evidenciada em produtos vegetais também foi
comprovada por produtos como o mel (TRUCHADO et al., 2009) e a própolis (ALVAREZ,
MOREIRA e PONCE, 2012). Méis uniflorais reduziram a produção de violaceína em até
95%, sendo essa capacidade atribuída à inibição da síntese de AHL (TRUCHADO et al.,
2009). Já a própolis apresentou redução no percentual de violaceína de, aproximadamente
60%, onde foi sugerida que essa atividade poderia ser devida a presença de compostos
fenólicos (ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2012).
5.5 - Efeito dos extratos de grumixama e pitanga sobre a motilidade tipo swimming e
swarming em S. marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36
Os extratos de grumixama e pitanga atuaram reduzindo a motilidade tipo swimming e
swarming em ambas as bactérias avaliadas. As Figuras 18, 19, 20 e 21 apresentam os
resultados para motilidade tipo swimming e swarming.
56
Figura 18 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swimming em S.
marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes
com A. hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de
grumixama na concentração de 101,02 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de grumixama na
concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato
bruto de grumixama na concentração de 252,05 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de
grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L.
Figura 19 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swarming em S.
marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes
com A. hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de
grumixama na concentração de 101,02 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de grumixama na
57
concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato
bruto de grumixama na concentração de 252,05 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de
grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L.
Figura 20 - Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swimming em S. marcescens
e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes com A.
hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 58,89 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61
mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 58,82 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 213,52
mg AGE/L.
58
Figura 21- Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swarming em S. marcescens e
A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes com A.
hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 58,89 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61
mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36. E) Extrato bruto de pitanga na
concentração de 58,82 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 213,52
mg AGE/L.
O sistema quorum sensing controla a formação de biofilme, motilidade tipo swarming, a
produção de biossurfactantes, de nucleases e do pigmento vermelho chamado prodigiosina em
S. marcescens (BAKKIYARAJ et al., 2012). Como podem ser observados nas Figuras 19-22,
os extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga foram capazes de reduzir a motilidade
tipo swimming e swarming, atuando como inibidores do sistema quorum sensing. Vale
ressaltar que as concentrações utilizadas não inibiram a multiplicação deste micro-organismo
(Tabela 4 e Tabela 5). Os dados da motilidade de S. marcescens ainda apontaram uma
inibição na produção de prodigiosina, pigmento vermelho cuja produção é controlada pelo
quorum sensing (THOMSON, N. R. et al, 2000; FINERAN, P. C. et al, 2005; FINERAN, P.
C. et al, 2013). Estudos semelhantes também encontraram redução na motilidade bacteriana
por produtos naturais. Nove isolados de bactérias associadas a coral, entre 19 testados por
Bakkiyaraj et al. (2012), atuaram inibindo a motilidade tipo swarming em S. marcescens.
Epigalocatequina galato (EGCG), um composto extraído do chá verde, provocou reduções na
motilidade em Campylobacter jejuni em até 75% (CASILLO et al., 2014). Já Packiavathy et
al. (2011) testaram extratos de Cuminum cyminum na motilidade em Proteus mirabilis, P.
59
aeruginosa PAO1 e S. marcescens, encontrando resultados de diminuição da motilidade tipo
swarming proporcionais as concentrações do extrato.
A cafeína atuou também inibindo de motilidade swarming em P. aeroginosas PA01 tendo
sua atividade atribuída a inibição da produção de AHL (NORIZAN, YIN e CHAN, 2013). As
plantas Centella asiatica L. (VASAVI e REKHA, 2014) e Adenanthera pavonina L (VASAVI
ARUN e REKHA, 2015) inibiram completamente esse tipo de motilidade nessa bactéria.
A motilidade é uma característica de A. hydrophila regulada pelo quorum sensing,
envolvendo sinalizadores AI-1 e AI-2 (DANIELS, VANDERLEYDEN e MICHIELS, 2004;
KOZLOVA et al., 2008). Esse mecanismo controla a expressão de vários fatores em A.
hydrophila (SWIFT et al, 1997) pelo sistema quorum sensing, por meio dos homólogos
LuxRI chamados de AhyRI neste micro-organismo (GARDE et al., 2010). Os resultados
descritos acima evidenciaram uma inibição da motilidade tipo swimming e swarming em A.
hydrophila, possivelmente envolvendo mecanismo de inibição do quorum sensing.
Uma modificação na motilidade celular pode ter consequências profundas sobre a
patogenicidade do organismo, pois alguns genes de virulência são normalmente co-regulados
com a motilidade (MCCARTER, 2006). Os extratos de grumixama e pitanga se mostraram
efetivos na regulação da motilidade em S. marcescens e A. hydrophyla, indicando seus
potenciais em controlar processos de virulência regulados por este mecanismo.
5.6 – Efeito dos extratos sobre a formação de biofilme em C. violaceum ATCC6357, S.
marcescens, A. hydrophila IOC/FDA110-36 e E. coli ATCC10536
Os efeitos de ambos os extratos de grumixama e pitanga sobre a formação de biofilme
foram semelhantes para todos os micro-organismos estudados. Porém, C. vioulaceum foi o
micro-organismo mais influenciado na presença dos mesmos, com um aumento na biomassa
de até 240 %. Esses resultados sugerem que a substância envolvida na regulação do biofilme
pode estar presente tanto no extrato bruto como no extrato fenólico da fruta. Os resultados
para formação de biofilme para os extratos brutos e fenólicos de pitanga e grumixama estão
apresentados nas Figuras 22, 23, 24 e 25.
60
Figura 22 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de grumixama. A) C.
violaceum ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110. E) E. coli
ATCC10536.
61
Figura 23 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de grumixama. A) C.
violaceum ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110. E) E. coli
ATCC10536.
62
Figura 24 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de pitanga. A) C. violaceum
ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110 E) E. coli ATCC10536.
63
Figura 25 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de pitanga. A) C.
violaceum ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110. E) E. coli
ATCC10536.
Os resultados obtidos para a formação de biofilme contradizem os anteriormente descritos
neste trabalho, onde os extratos de ambas as frutas tiveram ação de inibição do sistema
quorum sensing, atuando negativamente sobre a expressão de fenótipos como produção de
pigmento em C. violaceum e motilidade em A. hydrophila e S. marcenscens. Um estudo feito
por Viana et al., 2009 apresentou resultados semelhantes a este, onde a furanona em
concentração de 1 ml L-1 não afetou o crescimento e formação de biofilme em H. alvei em
teste de microplaca utilizando cristal violeta. Além desse, um estudo feito por Ponce et al.,
2012, com Enterobacter cloacae mostrou que o sistema quorum sensing regulou de forma
negativa a atividade proteolítica nessa bactéria e na síntese de enzimas hidrolíticas mediadas
por AHLs. Ta et al., (2014) em trabalho com várias espécies de plantas encontraram que 40%
das mesmas não apresentaram nenhuma inibição ou até mesmo aumentaram a formação da
massa do biofilme, quando comparados ao controle. Em estudo feito por Ghosh et al. (2014),
64
os resultados revelaram que o extrato regulou a expressão de genes responsáveis pela
virulência e motilidade celular e reprimiu genes relacionados a formação do biofilme. A
atividade anti-quorum sensing do extrato da casca de goiaba e os resultados indicaram uma
inibição de 19% dos genes expressos em C. violaceum, envolvendo genes relacionados a
motilidade, biogênese celular, membrana externa, mecanismo de transdução e transporte e
metabolismo de aminoácido.
Os extratos de grumixama e pitanga tiveram atividade inibindo a expressão de fenótipos
regulados pelo quorum sensing e aumentando a expressão de outros, sugerindo que os
extratos contêm substâncias que desempenham atividades distintas sobre o quorum sensing.
Teplitski, Robinson e Bauer (2000) sugeriram que as plantas podem produzir substâncias que
imitam as AHLs, podendo agir positivamente em certas espécies bacterianas, ou atuar de
forma negativa em algumas outras. Naquele trabalho, feito com exsudatos de mudas de
ervilha, foi evidenciado a secreção de substâncias semelhantes a AHL com atividade inibitória
sobre a estirpe de C. violaceum CV026, porém várias outros compostos estimularam outras
estirpes repórteres do sistema quorum sensing. Esses autores sugeriram que as plantas podem
produzir falsos compostos que imitam os sinalizadores quorum sensing, interferindo com a
síntese ou transporte de AHL e também interagindo diretamente com a proteína receptora de
AHL (homóloga a LuxR).
Ahmad, Viljoen, e Chenia (2014) estudaram 22 compostos contidos em óleos essenciais e
encontraram resultados variáveis na inibição da produção de violaceína; onde foi observado
uma redução máxima de 90% em um dos compostos e um aumento por 7 dos 22 óleos
essenciais testados. Os autores sugeriram que muitos óleos essenciais têm estruturas
semelhantes às AHLs e que estas poderiam competir com a AHL relacionada à produção de
violaceína (C6-AHL). A diversidade estrutural dos compostos dos óleos essenciais permitiria
que eles tivessem um amplo espectro de atividade. De forma geral, vários compostos
presentes em fontes naturais podem possuir substâncias semelhantes às moléculas
sinalizadoras do quorum sensing (NOVAK e FRATAMICO, 2004; CHOO, RUKAYADI e
HWANG, 2006; VATTEM et al., 2007; TRUCHADO et al., 2012; YEO e THAM, 2012;
GANIN et al., 2012; BLANA e NYCHAS, 2013; ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2013;
TAN e YIN, 2013; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013).
Estudos descritos na literatura demonstram que produtos naturais apresentaram uma
atividade na inibição do biofilme, como naringenina, um flavonóide presente em frutas
65
cítricas, atuando em biofilmes de V. harveyi e E. coli (VIKRAM et al, 2010). Além desse,
também foram demonstradas atividades de inibição de biofilme pelos extratos fenólicos de
cloudberries selvagens finlandeses (Rubus chamaemorus) e framboesas selvagens (Rubus
idaeus) (PRILHA et al., 2014). Produtos naturais a partir de Centratherum punctatum, como
lactonas de sesquiterpeno, também inibiram a produção de biofilme em P. aeruginosa,
reduzindo a produção de AHL (AMARA, et al., 2012). Epigalocatequina galato (EGCG),
extraído do chá verde, provocou reduções de até 75% na formação do biofilme em
Campylobacter jejuni (CASILLO, HEREDIA e GARCÍA, 2014). Loughlin et al. (2013)
demonstraram a eficácia de meta-bromo-tiolactona (mBTL), um análogo do auto indutor de
P. aeroginosa, em inibir o quorum sensing impedindo a formação de biofilme neste micro-
organismo.
Diferentes mecanismos foram propostos para explicar a inibição do sistema quorum
sensing por produtos naturais. Esses mecanismos incluem a inibição da síntese da molécula
sinalizadora ou receptora, inativação enzimática do sinalizador e pela semelhança das
estruturas químicas dos produtos naturais aos sinalizadores do quorum sensing, agindo por
competição junto aos receptores. Além desses, à ligação a proteína receptora pode provocar
uma mudança na sua conformação prejudicando sua capacidade de interagir com a RNA
polimerase, reduzindo seu potencial de transcrição manifestando, assim, sua atividade como
antagonismo (Loughlin et al., 2013).
Os compostos presentes nos extratos de grumixama e pitanga podem possuir semelhança
estrutural aos sinalizadores utilizados no sistema quorum sensing ou interferir na síntese
desses, inibindo fenótipos regulados pelo quorum sensing e em outros estimulando, como foi
evidenciado também por Teplitski, Robinson e Bauer (2000). Mais estudos devem ser
conduzidos para a identificação dos compostos presentes nos extratos das frutas testadas, bem
como a elucidação do modo de ação dos mesmos sobre o sistema quorum sensing dos micro-
organismos avaliados.
6 - CONCLUSÃO
Os resultados encontrados neste trabalho são importantes, pois ainda são escassos os
estudos sobre atividade anti-quorum sensing de frutas, principalmente frutas nativas
brasileiras. Com esse trabalho, há um incremento nas alternativas de produtos naturais com
potenciais para controlar a atividade antimicrobiana e valorização de frutas nativas brasileiras.
66
Este estudo também indica o potencial dos extratos de ambas as frutas para aplicações nas
indústrias alimentícias e farmacêuticas, inibindo fenótipos de deterioração e de virulência
regulados pelo quorum sensing.
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