UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

CÂMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP

Programa de Pós-graduação em Ciências Ambientais

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMUTAGÊNICA E CITOTÓXICA DOS

VENENOS DE Rhinella marina E Rhaebo guttatus

ANGELLICA FERNANDES DE OLIVEIRA

Sinop, Mato Grosso

Fevereiro, 2018

I

ANGELLICA FERNANDES DE OLIVEIRA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMUTAGÊNICA E CITOTÓXICA DOS

VENENOS DE Rhinella marina E Rhaebo guttatus

Orientadora: Profª. Dra. Marina Mariko Sugui

Co-orientadora: Profª. Dra. Lindsey Castoldi

Sinop, Mato Grosso

Fevereiro, 2018

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Ambientais da

Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus

Universitário de Sinop, como parte das

exigências para a obtenção do título de Mestre em

Ciências Ambientais.

Área de concentração: Bioprospecção

II

Ficha Catalográfica

III

IV

Sinopse:

Estudou-se a atividade antimutagênica e citotóxica dos venenos de Rhinella marina e

Rhaebo guttatus, além de indicadores preliminares de dano hepático e renal.

Palavras-chave:

Quimioprevenção, genotoxicidade, bufadienolídeos.

V

Agradecimentos

A Deus que sempre me deu forças e persistência para conquistar os meus objetivos;

A Nossa Senhora Aparecida por sempre me acompanhar e interceder por mim em todos

os momentos da minha vida;

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais, Universidade Federal de

Mato Grosso, Câmpus Sinop/MT pela oportunidade de realização do Mestrado;

A minha orientadora e coorientadora, Professora Dra. Marina Mariko Sugui e

Professora Dra. Lindsey Castoldi pelo apoio, dedicação e pelo exemplo de docente e

pesquisadoras que representam;

Ao meu esposo Pablo de Oliveira Vieira pelo amor, carinho, amizade, companheirismo

e, por sempre me apoiar e acreditar na minha vitória;

Aos meus pais, Luiz Fernandes Pereira e Neusa Rosa de Oliveira Pereira pelo apoio,

ensinamentos e pela confiança em mim depositada;

A minha cunhada Livia Deice Raasch Fernandes pelo apoio e amizade;

Aos técnicos, Morenna e Cleberson, pelo apoio e assistência;

Aos alunos de graduação, Wemerson Aparecido da Silva Ferreira e Carla Alexandra de

Souza Santos, pela colaboração na parte experimental;

Ao Professor Dr. Gerardo Magela Vieira Junior pelo processamento dos extratos que

proporcionaram a realização da pesquisa;

Ao Professor Ednaldo Andrade pela assistência prestada na análise estatística;

Aos colegas e amigos do mestrado, pela parceria e trocas de experiências, em especial à

Michelle Rimoli, Patrícia Zanco, Tatiane Cordeiro e Juliana Riffel;

A todos os professores do Programa de Pós-graduação que compartilharam e dividiram

conosco seus conhecimentos e experiências.

VI

“É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do

que alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem

numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota”.

Theodore Roosevelt

VII

RESUMO

Os sapos Bufonídeos possuem bufadienolídeos com atividades biológicas no tratamento de

patologias cardíacas, dores e câncer. Apesar dos efeitos tóxicos, os venenos possuem grande

potencial para produção de novos medicamentos. O estudo proposto teve como objetivo

avaliar a atividade antimutagênica e citotóxica dos venenos de Rhinella marina e Rhaebo

guttatus, através de ensaios in vitro e in vivo, bem como análise bioquímica das enzimas

alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) e creatinina (CRT)

séricas para dano hepático e renal, respectivamente. Para a avaliação da atividade citotóxica in

vitro foi utilizado o método colorimétrico baseado no MTT (3-[4, 5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,

5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide), sendo os extratos nas concentrações de 7,81; 15,62;

31,25; 62,5 e 125 µg/mL adicionados as culturas com células do Tumor de Walker 256 ou

células esplênicas de rato e camundongo. Para o ensaio in vivo foi realizado o teste do

micronúcleo em células de medula óssea de camundongos machos Swiss (7 animais/grupo),

sendo que os grupos tratados receberam durante 15 dias consecutivos, via gavagem, o extrato

dos venenos de R. marina e R. guttatus na dose de 7 µg/mL. No 15º dia receberam

intraperitonealmente N-etil-N-nitrosuréia (ENU, 50 mg/Kg), sendo sacrificados 24 horas após

o tratamento para avaliação da frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados

(PCEMNs). Os extratos de R. marina e R. guttatus apresentaram ação citotóxica para as

células esplênicas de rato e camundongo e para o Tumor de Walker 256. No teste do

micronúcleo foi observado atividade antimutagênica dos extratos dos venenos com uma

redução significativa na frequência de PCEMNs em relação ao grupo controle positivo (R.

marina=56% e R. guttatus=75%, p<0,001). Ao mesmo tempo, os grupos tratados somente

com os extratos apresentaram um aumento na frequência de PCEMNs quando comparados

com o controle negativo, com uma diferença significativa (p<0,01), o que mostra um

potencial mutagênico dos venenos. Nas análises bioquímicas de AST, ALT e CRT séricas não

foi observado diferença significativa entre os tratamentos (p>0,05). Diante dos resultados

obtidos os extratos de R. marina e R. guttatus apresentaram atividades citotóxica,

antimutagênica e mutagênica, porém não foram observadas alterações hepáticas e renais, nas

condições realizadas.

Palavras-chave: Quimioprevenção, genotoxicidade, bufadienolídeos, bioprospecção.

VIII

ABSTRACT

Bufonidae toads have bufadienolides with biological activities in the treatment of cardiac

pathologies, pain and cancer. Although toxic effects, venom have a high potential for the

production of new medicine. The propused sutudy had the objective to evaluate the

antimutagenic and cytotoxic activity of Rhinella marina and Rhaebo guttatus venom through

in vitro and in vivo assays. In vitro and in vivo assays, as well as biochemical analysis of the

serum enzymes alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and

creatinine (CRT) for hepatic and renal damage respectively. For the evaluation of cytotoxic

activity in vitro was used the colorimetric method based on MTT (3- [4,5-dimethyl-2-

thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) the extracts were made in the

concentrations of 7.81; 15.62; 31.25; 62.5 and 125 μg / ml and were added to cultures with

Walker 256 Tumor cells or splenic cells from Swiss mouse and rat. For the in vivo assay the

micronucleus test was performed on bone marrow cells of Swiss male mice (7 animals /

group), and the treated groups received for 15 consecutive days, via oral gavage, the extract of

R. marina and R. guttatus at a dose of 7 μg / mL. On the 15th day they received an

intraperitoneal injection of N-ethyl-N-nitrosurea (ENU, 50 mg / Kg), being sacrificed 24

hours after the treatment to evaluate the frequency of micronucleated polychromatic

erythrocytes (PCEMNs). The extracts of R. marina and R. guttatus presented cytotoxic action

for rat and Swiss mouse splenic cells and for Walker 256 Tumor. In the micronucleus test it

was observed an antimutagenic activity of venom extracts with a significant reduction in the

frequency of PCEMNs in relation to the positive control group (R. marina = 56% and R.

guttatus = 75%, p <0.001). At the same time, the groups treated only with the extracts

presented an increase in the frequency of PCEMNs when compared to the negative control,

with a significant difference (p <0.01), which exposes a mutagenic potential of the venom. In

the biochemical analyzes of serum AST, ALT and CRT, no significant difference was

observed between treatments (p> 0.05). Analyzing the results obtained, the extracts of R.

marina and R. guttatus presented cytotoxic, antimutagenic and mutagenic activities, but no

hepatic and renal changes were observed under the conditions that the experiment was

realized.

Key words: Chemoprevention, genotoxicity, bufadienolides, bioprospecting.

VIII

SUMÁRIO

Capítulo 1..................................................................................................................................09

1. Introdução.......................................................................................................................10

2. Material e métodos..........................................................................................................12

2.1 Produtos químicos...................................................................................................12

2.2 Extratos brutos de R. marina e R. guttatus.............................................................12

2.3 Material biológico...................................................................................................12

2.4 Animais....................................................................................................................13

2.5 Protocolo experimental...........................................................................................13

2.6 Ensaio de citotoxicidade in vitro............................................................................13

2.7 Ensaio do micronúcleo in vivo................................................................................14

2.8 Análise bioquímica.................................................................................................15

2.9 Análise estatística................................................................................................. .15

3. Resultados.......................................................................................................................16

4. Discussão........................................................................................................................18

5. Conclusão........................................................................................................................21

Referências..........................................................................................................................22

Anexo 1.....................................................................................................................................26

Anexo 2.....................................................................................................................................27

9

Capítulo 1*

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMUTAGÊNICA E CITOTÓXICA DOS

VENENOS DE Rhinella marina E Rhaebo guttatus

*Artigo redigido de acordo com as normas da revista Environmental Toxicology and

Pharmacology, a qual será submetido para publicação. Nomas em anexo na página 27.

10

Avaliação da atividade antimutagênica e citotóxica dos venenos de Rhinella marina e

Rhaebo guttatus

Angellica Fernandes de Oliveira1, Lindsey Castoldi2, Gerardo Magela Vieira Júnior3,

Domingos de Jesus Rodrigues1, Marina Mariko Sugui1,2

¹Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais (PPGCAM), Instituto de Ciências Naturais, Humanas e

Sociais, Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus Universitário de Sinop, Sinop, Mato Grosso, Brasil.

² Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus Universitário Sinop, Sinop,

Mato Grosso, Brasil. 3Departamento de Química, Universidade Federal do Piauí, Câmpus Ministro Petrônio Portela, Teresina, Piauí,

Brasil.

Correspondência do autor: Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus

Universitário de Sinop, Avenida Alexandre Ferronato, 1200, CEP: 78.550-728, Sinop, Mato Grosso, Brasil. Tel:

+55 (66) 99608-5285.

Endereço de e-mail: angellferoli@hotmail.com (A.F. Oliveira), lindseycastoldi@gmail.com (L.Castoldi),

magela@ufpi.edu.br (G.M.Vieira Júnior), djmingo23@gmail.com (D.J. Rodrigues), masugui@hotmail.com

(M.M. Sugui).

Resumo

O estudo avaliou a atividade citotóxica e antimutagênica de Rhinella marina e Rhaebo

guttatus e análise bioquímica das enzimas alanina aminotransferase e aspartato

aminotransferase e creatinina séricas. A avaliação citotóxica pelo método colorimétrico MTT

apresentou efeito tóxico dos extratos brutos nas concentrações de 7,81; 15,62; 31,25; 62,5 e

125 µg/mL em células do Tumor de Walker ou células esplênicas de roedores. No teste do

micronúcleo, o pré-tratamento com R. marina e R. guttatus na dose de 7 µg/mL e N-etil-N-

nitrosoureia (50 mg/Kg, i.p), mostrou uma redução significativa na frequência de eritrócitos

policromáticos micronucleados (PCEMNs) (R. marina=56% e R. guttatus=75%, p<0,001). Os

grupos tratados somente com os extratos apresentaram um aumento na frequência de

PCEMNs (p<0,01) em relação ao controle. As análises dos marcadores bioquímicos não

apresentaram diferença significativa entre os tratamentos (p>0,05). Assim, R. marina e R.

guttatus apresentaram potencial quimiopreventivo e atividades citotóxica e mutagênica, nas

condições realizadas.

Palavras-chave: Rhinella marina, Rhaebo guttatus, Citotoxicidade, Micronúcleos,

Quimioprevenção.

1. Introdução

A busca por novos medicamentos contra o câncer é uma das áreas de pesquisa mais

proeminentes dos produtos naturais (Cragg e Newman, 2012). Atualmente, numerosos

compostos ativos de animais em diferentes filos já foram estudados com resultados

promissores, como os cordados e artrópodes (Calvete, 2009). Os venenos de origem animal

representam uma rica fonte de compostos bioativos como peptídeos e proteínas (Favreau et

al., 2006), colaborando cada vez mais como ferramentas farmacológicas e como protótipos

para o desenvolvimento de medicamentos (Calvete, 2009).

11

Bufonidae é uma família de sapos composta por aproximadamente 471 espécies em 33

gêneros (Pramuk, 2006). Nesta família são encontrados os sapos verdadeiros, mais

conhecidos no Brasil como sapos cururus, dentro os quais se destacam o gênero Rhinella (86

espécies) (Frost, 2015). A espécie Rhinella marina (Linnaeus, 1758) distribui-se naturalmente

do extremo sul do Texas, na América do Norte, até o centro da América do Sul, na Amazônia

Brasileira (Frost, 2015). Rhaebo guttatus (Schneider, 1799) é outro sapo comumente

encontrado na Amazônia Meridional brasileira, sua distribuição geográfica se estende desde a

região amazônica do Equador, Colômbia, Venezuela, Peru, Bolívia, Guianas, chegando até a

Amazônia central do Brasil (Amphibiaweb, 2016).

Os bufadienolídeos (glicosídeos cardíacos) são os principais compostos ativos de

sapos da família Bufonidae (Bagrov et al., 2009). Estes compostos apresentam atividade

cardiotônica (Emam et al., 2017), antiviral (Wang, et al., 2011), antibacteriano (Cunha-filho et

al., 2005), antiparasitário (Tempone et al., 2008; Banfi et al., 2016) e citotóxico e/ou

antitumoral (Cunha-filho et al., 2010; Gao et al., 2011; Sciani et al., 2013; Ferreira et al.,

2013; Zhang et al., 2013; Banfi et al., 2016).

Apesar dos bufadienolideos serem os principais componentes ativos com atividade

antitumoral, seus efeitos anticancerígenos ainda são pouco esclarecidos (Chen et al., 2017). A

presença de quatro bufadienolídeos (telocinobufagina, marinobufagina, bufalina e

resibufogenina) no veneno de Rhinella marina e, um destes compostos, a marinobufagina,

presente no veneno de Rhaebo guttatus apresentaram efeitos citotóxicos contra diferentes

linhagens tumorais, destacando as secreções de glândulas parotóides de sapo como

promissora fonte de novos compostos anticancerígenos (Ferreira et al., 2013). O veneno dos

Bufonídeos possui também β-sitosterol responsável pela imunidade inata desses animais

contra células tumorais (Cunha-filho et al., 2010).

O tratamento do câncer ainda é considerado como um dos problemas mais

desafiadores da medicina e as pesquisas relacionadas acontecem mundialmente (Fukumasu et

al., 2008). Desta forma, tais pesquisas, tanto básicas como aplicadas, são fundamentais e

devem ser estimuladas, para que medicamentos antineoplásicos mais eficazes e seguros,

sejam descobertos, tanto para tratamento como para prevenção (Fukumasu et al., 2008).

Atualmente, como estratégia de prevenção do câncer tem-se a quimioprevenção, onde se

utiliza produtos naturais e químicos ou suas combinações, para reduzir o risco ou atrasar o

aparecimento dessa doença (Singh et al., 2014; Amereh et al., 2017).

O uso de extratos na forma bruta em testes experimentais possui como vantagem a

economia, a simplicidade e, geralmente, o tempo de vida superior, não necessitando de

12

cofatores adicionais para a reação enzimática desses analitos (Fatibello-Filho e Vieira, 2003).

Neste contexto, o presente estudo avaliou o potencial citotóxico e quimioprotetor do extrato

bruto de veneno de R. marina e R. guttatus, uma vez que a identificação do potencial

biológico de novos compostos é relevante para a identificação de novos agentes com

significativa atividade antineoplásica e que sejam, preferencialmente, tóxicos às células

tumorais.

2. Material e métodos

2.1. Produtos químicos

No ensaio in vitro foi utilizado RPMI 1640 19% SBF como meio de cultura. Para o

ensaio in vivo, o agente químico N-etil-N-nitrosureia (ENU, CAS 759-73-9, Sigma Aldrich,

Saint Louis, USA) que foi diluído tampão fosfato (pH 6,0), administrado aos animais

intraperitonealmente, na concentração de 50 mg/Kg p.c.

2.2. Extratos brutos de R. marina e R. guttatus

O veneno de sapo foi coletado da secreção de R. marina e R. guttatus no estado de

Mato Grosso, Brasil (D. J. Rodrigues - IBAMA, SISBIO: número 30034-1). Os espécimes (R.

marina - ABAM-H 1262 e R. guttatus - ABAM-H 1538) foram depositados no Acervo

Biológico da Amazônia Meridional (Sinop, Mato Grosso, Brasil). As amostras (10 mg cada)

de veneno de sapo de R. marina e R. guttatus foram secas e extraídas três vezes (5 mL) com

CHCl3 / MeOH (3: 1) (clorofórmio/ metanol) por ultrassom durante 10 min à temperatura

ambiente (Kerkhoff et al., 2016).

2.3. Material biológico

No ensaio in vitro foram utilizadas células do Tumor de Walker 256, células

esplênicas de rato e camundongo. As células tumorais foram gentilmente cedidas pela Profa.

Dra. Eveline Aparecida Isquierdo Fonseca de Queiroz, da Universidade Federal de Mato

Grosso, Câmpus Universitário de Sinop. Sua obtenção se deu através da inoculação dessas

células na cavidade peritoneal de ratos em laboratório, onde se desenvolveu o tumor que foi

posteriormente retirado para semeadura nas microplacas.

13

2.4. Animais

No ensaio in vivo foram utilizados camundongos machos Swiss, com 6 semanas de

idade, peso médio de 30g, provenientes do Biotério Central da UFMT/Cuiabá. Durante o

período experimental, 7 camundongos por grupo, por 15 dias, foram mantidos em gaiolas

coletivas no Biotério do CAIC/UFMT/Sinop, sob condições controladas de temperatura (22 ±

2º C), umidade relativa (55 ± 10%), ciclo de luz (12 horas claro/escuro), recebendo ração

comercial peletizada e água filtrada ad libitum. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de

Ética no Uso de Animais (CEUA) – UFMT/Cuiabá, pelo número de protocolo

23108.720739/2016-12.

2.5. Protocolo experimental

Grupo 1: Grupo controle negativo. Os animais foram tratados com água, via gavagem,

durante todo período experimental. No 15º dia os animais foram tratados, por via

intraperitoneal, com NaCl 0,9% (0,1ml/10g p.c.) e sacrificados 24 horas após o tratamento

para obtenção de células de medula óssea.

Grupo 2: Grupo controle positivo. Os animais foram tratados com água, via gavagem,

durante todo período experimental. No 15º dia os animais foram tratados, por via

intraperitoneal, com ENU (50 mg/Kg p.c) e sacrificados 24 horas após o tratamento para

obtenção de células de medula óssea.

Grupo 3 e 4: Os animais foram tratados com extratos de Rhinella marina e Rhaebo

guttatus, respectivamente, via gavagem, durante todo período experimental. No 15º dia os

animais receberam tratamento intraperitoneal com ENU (50 mg/Kg p.c.) e foram sacrificados

24 horas após o tratamento obtenção de células da medula óssea.

Grupo 5 e 6: Os animais foram tratados com extratos de Rhinella marina e Rhaebo

guttatus, respectivamente, via gavagem, durante todo período experimental. No 15º dia os

animais receberam tratamento intraperitoneal com NaCl 0,9% (0,1ml/10g p.c.) e foram

sacrificados 24 horas após o tratamento obtenção de células da medula óssea.

2.6. Ensaio de citotoxicidade in vitro

Para análise da atividade citotóxica foi utilizado o método colorimétrico baseado no

MTT (3-[4, 5-dimethyl-2-thiazolyl]-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium, Cell Growth

Determination Kit MTT Based, Sigma Aldrich, Saint Louis, USA), de acordo com as

14

recomendações do fabricante. O MTT é o sal tetrazolium, que se torna insolúvel em água pela

formação de cristais de formazan e solúveis em solventes orgânicos, após clivagem por

desidrogenases mitocondriais de células, sendo que apenas as enzimas de células vivas

causam esta conversão (Mosmann, 1983). Em meio de cultura com células, o MTT convertido

em formanzan, é solubilizado e pode ser lido por espectrofotometria (Mosmann, 1983). Esta

reação pode ser expressa em percentual de células vivas de acordo com a absorvância

obtendo-se o percentual da viabilidade celular. A leitura dos valores de absorbância (abs) foi

realizada no Espectrofotômetro Thermo Plate, leitora de microplaca, TP READER. A

porcentagem de inibição celular foi calculada através da equação: % IC = {[(abs controle) –

(abs amostra)]/(abs controle)}x100.

As células do Tumor de Walker 256 (1x106 cel/mL) (Colquhoun e Schumacher, 2001)

e as células esplênicas de ratos (2x106 cel/mL) (Spinardi-Barbisan et al., 2004) e camundongo

(4x106 cel/mL) (Albiero et al., 2016) foram semeadas, em triplicata, em placas de 96 poços

com 100µL de meio RPMI 1640 19% SBF (Cultilab, Campinas – SP, Brasil) (Spinardi-

Barbisan et al., 2004; Samarghandian et al., 2016) e 100µL dos compostos testados nas

concentrações de 7,81; 15,62; 31,25; 62,5 e 125 µg/mL, diluídos em RPMI 1640 19% SBF.

Como controle da viabilidade celular foi utilizado 100µL do RPMI 1640 19% SBF com as

concentrações celulares correspondentes. As microplacas foram mantidas em cultura por 24

horas em estufa incubadora com atmosfera umidificada a 5% CO2, 37˚C. Foram realizadas

triplicatas independentes para cada tipo celular, representativos da porcentagem da inibição

celular e do IC50 (concentração do composto capaz de causar a morte de 50% das células em

relação à cultura controle) apresentados. O cálculo IC50 foi realizado através da análise de

regressão linear (GraphPad InStat 3.06).

2.7. Ensaio do micronúcleo in vivo

O teste do micronúcleo em eritrócitos de medula óssea de roedores é utilizado para

detectar e quantificar os efeitos mutagênicos/antimutagênicos de determinados compostos

sobre o ciclo de vida celular. A obtenção e preparo das lâminas de eritrócitos de medula óssea

para avaliação da frequência de micronúcleo (MN) seguiu a metodologia proposta por

MacGregor et al. (1987). Foram analisadas 1000 células por animal em microscópio de luz,

com aumento de 1000 vezes (imersão). O material foi analisado em teste cego e as lâminas

foram decodificadas ao final das análises.

15

A porcentagem de redução na frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados

(PCEMNs) foi calculada através da equação (Manoharan e Banerjee, 1985; Waters et al.,

1990):

% redução = (frequência de MN em A) - (frequência de MN em B)

(frequência de MN em B) - (frequência de MN em C)

Onde A corresponde ao grupo tratado com ENU (controle positivo), B corresponde ao

grupo tratado com R. marina ou R. guttatus mais ENU e C corresponde ao grupo tratado com

NaCl 0,9% (controle negativo).

2.8. Análise bioquímica

Os níveis séricos das atividades hepáticas das enzimas alanina aminotransferase

(ALT) e aspartato aminotransferase (AST), assim como a análise de creatinina (CRT) foram

utilizados como indicadores de dano hepático e renal, respectivamente. Amostras de sangue

total de cada animal foram coletadas em microtubos livres de anticoagulante e centrifugados a

3500 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi separado e estocado a -20ºC para posteriores

determinações dos biomarcadores séricos. As amostras foram mensuradas através do

analisador COBAS INTEGRA® 400 Plus Roche®, através do método da

quimioluminescência.

2.9. Análise estatística

A frequência de células micronucleadas nos diferentes grupos experimentais foi

comparada pelo teste do qui-quadrado (Pereira e Rabello-Gay, 1991). Na análise das dosagens

bioquímicas, consumo de ração e peso foi usado à análise de variância (ANOVA),

complementada pelo teste de Tukey e Scott-Knott, através do programa SISVAR 5.6

(p<0,05). O cálculo IC50 foi realizado através da análise de regressão linear (GraphPad InStat

3.06).

x 100

16

3. Resultados

Na Tabela 1 estão apresentados os resultados da porcentagem (%) da inibição celular

(IC) dos venenos de R. marina e R. guttatus, nas concentrações de 7,81; 15,62; 31,25; 62,5 e

125 µg/mL, sobre as células esplênicas de ratos e camundongos e do Tumor de Walker 256.

De acordo com os resultados, observamos que o veneno de R. marina e R. guttatus

apresentaram citotoxicidade para as células estudadas em todas as concentrações avaliadas.

Na concentração de 7,81 µg/mL, os venenos apresentaram menor efeito tóxico para as células

esplênicas de rato (R. marina: 10,98%) e camundongo (R marina: 1,96%; R. guttatus: 0,33%).

Em contrapartida, a concentração de 125 µg/mL apresentou as maiores taxas de inibição para

todas as células testadas. Outro aspecto importante é que o efeito inibitório do veneno de R.

guttatus sobre as células esplênicas foi mais pronunciado que o efeito do veneno de R.

marina. Dessa forma, a concentração de 7 µg/mL foi escolhida para o experimento in vivo.

Tabela 1– Porcentagem (%) da inibição celular (IC) das células esplênicas (rato e camundongo) e células do

Tumor de Walker 256 cultivadas com extrato do veneno de R. marina e R. guttatus durante 24 horas à 37C e

5% CO2.

Concentração

(µg/mL)

Rhinella marina Rhaebo guttatus

Baço Camundongo Baço

Rato

Tumor de

Walker

Baço

Camundongo

Baço

Rato

Tumor de

Walker

125 21,47 29,02 47,91 66,40 62,67 42,21

62,5 2,88 20,26 25,45 56,53 41,59 36,43

31,25 -1,37 18,04 30,82 43,07 43,10 40,70

15,62 1,70 24,51 32,80 17,16 37,33 40,70

7,81 1,96 10,98 31,81 0,33 30,04 33,42

IC50*(µg/mL) 306,46 330,95 179,24 74,92 77.60 340,78

*Concentração necessária para causar morte no crescimento de 50% das células. % de inibição celular.

A Tabela 2 mostra o efeito do pré-tratamento dos camundongos machos Swiss com os

venenos de R. marina e R. guttatus sobre os danos no DNA, induzidos quimicamente pelo

composto N-etil-N-nitrosuréia (ENU, 50 mg/Kg p.c). Os resultados mostram que os grupos

tratados com os extratos de R. marina + ENU e R. gutttatus + ENU, na concentração de 7

µg/mL, apresentaram redução na frequência de PCEMNs em relação ao grupo controle

positivo (p<0,001) de 56% e 75%, respectivamente. Ao mesmo tempo os grupos tratados

somente com os extratos e NaCl apresentaram um aumento na frequência de PCEMNs

17

quando comparados com o controle negativo, obtendo uma diferença significativa (p<0,01), o

que mostra um potencial mutagênico dos venenos de R. marina e R. guttatus. Ambos os

extratos de venenos apresentaram atividades antimutagênica e mutagênica, nas condições

realizadas.

Tabela 2 - Frequência de micronúcleos em eritrócito policromático (PCEMNs) de medula óssea de

camundongos após pré-tratamento com os extratos do veneno de R. marina (RM) e R. guttatus (RG).

Tratamento

Número de PCEs

analisados

PCEMNs

% de redução

No. %

Água + NaCl 0,9% a 6000c 217 3,61

Água + ENU b 6000c 398 6,63

Extrato RM + ENU 7000 296** 4,22 56%

Extrato RG + ENU 7000 262** 3,74 75%

Extrato RM + NaCl 0,9% 7000 323* 4,61

Extrato RG + NaCl 0,9% 7000 324* 4,62

a Controle negativo; b Controle positivo; c morreu animal; * p< 0,01 ; ** p< 0,001. Teste do qui-quadrado

A Tabela 3 mostra os valores da média e desvio padrão das enzimas hepáticas AST e

ALT, e CRT após o pré-tratamento dos camundongos com os extratos de R. marina e R.

guttatus. Os grupos tratados com os extratos do veneno de R. marina e R. guttatus não

apresentaram diferença significativa em relação aos grupos controles positivo e negativo para

as concentrações plasmáticas de AST, ALT e CRT (p>0,05). Os resultados indicam que não

houve efeito tóxico dos extratos no fígado e rins dos animais tratados durante o período

experimental.

18

Tabela 3 - Valores da média e desvio padrão dos analitos AST, ALT e creatinina após o pré-tratamento por 15

dias com os extratos do veneno de R. marina (RM) e R. guttatus (RG).

Tratamento Número de

animais

AST

ALT

CRT

Água + NaCl 0,9% a 6c 248,07 ± 70,29 60,8 ± 13,84 0,24 ± 0,08

Água + ENU b 6c 262,15 ± 59,75 58,08 ± 10,28 0,21 ± 0,03

Extrato RM + ENU 7 260,73 ± 73,89 49,47 ± 7,35 0,3 ± 0,27

Extrato RG + ENU 7 223,43 ± 61,80 60,53 ± 40,94 0,29 ± 0,22

Extrato RM + NaCl 0,9% 7 195,9 ± 42,52 55,05 ± 10,04 0,28 ± 0,11

Extrato RG + NaCl 0,9% 7 181,53 ± 4,42 58,49 ± 9,87 0,21 ± 0,02

*p-valor p>0,05 p>0,05 p>0,05

a Controle negativo; b Controle positivo; c morreu animal. Os valores estão expressos em média ± desvio padrão.

ANOVA/ Tukey, *p≤ 0,05. Para análise de variância foi utilizada a opção de transformação raiz quadrada de Y +

1.0 - SQRT (Y + 1.0). SISVAR.

A Tabela 4 mostra o consumo médio de ração dos camundongos durante o período

experimental e apresentou diferença significativa entre os grupos (p<0,05), tendo como

destaque o grupo tratado com o extrato de R. guttatus + ENU (87,29 g/sem), seguido do grupo

R. marina + NaCl (84,29 g/sem) e do grupo R. guttatus + NaCl (81,71 g/sem).

Tabela 4 - Consumo médio de ração dos camundongos após pré-tratamento por 15 dias com os extratos do

veneno de R. marina (RM) e R. guttatus (RG).

Tratamento

Número de

animais

Consumo médio de ração

(g/semana/grupo)

X±SD

Peso corpóreo(g)

X±SD

Água + NaCl 0,9% a 6c 70,43 ± 10,21 34,91 ± 2,24

Água + ENU b 6c 66,29 ± 7,87 35,58 ± 1,53

Extrato RM + ENU 7 79,14 ± 5,08 35,14 ± 2,02

Extrato RG + ENU 7 87,29 ± 7,63 37,07 ± 3,73

Extrato RM + NaCl 0,9% 7 84,29 ± 6,78 35,57 ± 3,63

Extrato RG + NaCl 0,9% 7 81,71 ± 8,83 36,78 ± 3,13

*p-valor p<0,05 p<0,05

a Controle negativo; b Controle positivo; c morreu animal; X (média); SD (Desvio padrão). Os valores estão

expressos em média ± desvio padrão. ANOVA/ Scott-Knott, *p≤ 0,05/ SISVAR.

4. Discussão

Atualmente, os estudos com anfíbios, em especial os sapos, tem despertado o interesse

dos pesquisadores na avaliação das atividades biológicas dos extratos brutos e das moléculas

isoladas obtidos a partir de suas secreções, identificando os bufadienolídeos como moléculas

19

promissoras contra o câncer (Terness et al., 2001). Recentes estudos mostram que os

bufadienolídeos apresentam atividade citotóxica e/ou antitumoral (Kuo et al., 2008; Wang et

al., 2011; Li et al., 2012; Ferreira et al., 2013; Zhang et al., 2013; Banuls et al., 2013;

Schmeda-Hirschmann et al., 2014).

No presente estudo foi realizada análise de citotoxicidade em células do tumor de

Walker 256, pois apresentam um crescimento rápido e confiável e características que o

tornam adequado para estudos citotóxicos de curto prazo (Silva et al., 2004). Os resultados

mostram um efeito citotóxico dos venenos de R. marina e R. guttatus em todas as

concentrações testadas para a linhagem tumoral e células esplênicas normais de camundongos

e ratos. Neste caso é importante ressaltar que o veneno de R. guttatus, apresentou um efeito

tóxico mais pronunciado nas células esplênicas normais, com IC50 menor que o observado

para as células do tumor de Walker.

Ferreira et al., (2013), estudaram a composição química dos extratos de veneno de R.

marina e R. guttatus e sua atividade antiproliferativa em células transformadas e normais. Os

bufadienolídeos identificados foram diferentes em tipos e em quantidades presentes nos

venenos de R. marina e R. guttatus, mas apresentaram efeitos letais potentes sobre as células

tumorais HL-60, HCT-116, OVCAR-8 e SF-295 humanas, especialmente aqueles presentes

no R. marina. Em células mononucleares de sangue periférico foi observado atividade

hemolítica para R. guttatus ao contrário do R. marina que não apresentou esse efeito (Ferreira

et al., 2013).

Sciani et al. (2013) estudaram oito espécies de anfibios, entre elas R. marina e R.

guttatus e observaram uma inibição celular através do ensaio MTT em células tumorais

humana de mama MCF-7 (IC50 de 50 µg/mL para R. guttatus e R. marina) e MDA-MB-

231(IC50 de 40 µg/mL para R. guttatus). Além disso, o R. guttatus foi mais efetivo em relação

a quantificação de células mortas por alterações na viabilidade celular, apresentando atividade

citotóxica em ambas linhagens tumorais. No teste de hemólise em eritrócitos humanos não

observaram atividade hemolítica em ambos os venenos.

Schmeda-Hirschmann et al. (2016) observaram um efeito antiproliferativo do veneno

de R. marina em linhagens tumorais MRC-5 (IC50 de 0,063 – 0,227 µg/mL), AGS (IC50 de

0,076 – 0,272 µg/mL), SK-MES-1 (IC50 de 0,154 – 0,296 µg/mL), J82 (IC50 de 0,169 – 0,212

µg/mL), HL-60 (IC50 de 0,071 – 0,283 µg/mL) através do ensaio MTT e determinaram que o

provável mecanismo envolvido seja a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) que

possam interferir na replicação do DNA e inibir a duplicação de células tumorais.

20

Apesar do efeito citotóxico mostrado por bufadienolídeos contra células tumorais, o

mecanismo de ação permanece desconhecido em muitos casos (Gao et al., 2011). Em estudo

realizado com a mesma família Bufonidae, em relação à atividade biológica dos

bufadienolídeos e seu mecanismo de ação, Giri et al. (2006) observaram citotoxicidade nas

células não tumorais U937 (IC50 de 55000-66200 µg/mL) e células leucêmicas K562 (IC50 de

8100-92200 µg/mL), ação antiproliferativa e indução de apoptose, com parada na fase G1 do

ciclo celular.

Em relação às moléculas isoladas presentes nos bufadienolídeos, a bufalina

demonstrou efeito antiangiogênico, inibindo de forma potente a proliferação e formação das

células endoteliais vasculares como resultado da parada da fase G2/M do ciclo celular (Lee et

al., 1997); induziu apoptose (Watabe et al., 1998; Han et al., 2007); disfunção mitocondrial e

aumento da radiossensibilidade em células do glioblastoma (Zhang et al., 2017); reversão a

resistência adquirida aos antineoplásicos (Sun et al., 2017).

A molécula marinobufagina apresentou atividade citotóxica pelo método do MTT

contra quatro linhagens de células tumorais, leucemia (HL-60), carcinoma do cólon (HCT-

116), carcinoma do ovário (OVCAR-8) e glioblastoma (SF-295). Além de toxicidade,

citotoxicidade e genotoxicidade da marinobufagina em meristemas de raízes de Allium cepa

pelas alterações de crescimento de raízes, inibição do índice mitótico e aberrações

cromossômicas (Machado et al., 2018).

Assim, considerando as diferenças morfológicas quanto aos tipos tumorais utilizados

em outros estudos (Sciani et al., 2013; Ferreira et al., 2013), inclusive sobre a variação dos

valores de IC50 observados (Silva et al., 2004; Sciani et al., 2013; Ferreira et al., 2013;

Schmeda-Hirschmann et al., 2014, 2016), o efeito citotóxico in vitro dos venenos de R.

marina e R. guttatus sobre os tipos celulares testados corroboram com os diversos trabalhos já

descritos na literatura.

Quanto a avaliação antimutagênica, os venenos mostraram uma redução significativa

contra os danos induzidos pelo ENU nos grupos tratados com os extratos R.marina (56%) e

R.guttatus (75%) em relação ao grupo controle positivo. Devido à ausência na literatura de

estudos de antigenotoxicidade envolvendo esses extratos, ressalta-se que os resultados

observados são de grande valia e representa um estudo inédito na área de mutagênese. Assim,

nas condições realizadas, os resultados mostram um efeito protetor do extrato de R. marina e

R. guttatus contra danos induzidos quimicamente ao DNA.

Por outro lado, obsevou-se um potencial mutagênico do extrato de R. marina e R.

guttatus em relação ao aumento de eritrócitos policromáticos micronucleados nos grupos

21

tratados somente com os extratos dos venenos. Lee et al. (2017), avaliaram o efeito

genotóxico de Bufo Bufo gargarizans (Chan Su), Bufonidae, em células tumorais (MCF-7,

A-549 e Jurkat T) e células mononucleadas de sangue periférico (PBMCs) através de ensaio

cometa e micronúcleo in vitro, observando aumento em danos cromossômicos e formação de

micronúcleos nas células tumorais e não em PBMCs, mostrando que os compostos ativos do

Chan Su possuem efeitos genotóxicos in vitro.

Assim, os efeitos antimutagênico e mutagênico observados neste estudo podem estar

relacionados ao uso do extrato bruto dessas espécies. Segundo Ferreira et al. (2013), o perfil

químico dos venenos de sapo (R. marina e R. guttatus) em termos de número e tipo de

compostos presentes é determinado principalmente pelas espécies de origem. De acordo com

Gao et al. (2010), há uma série de razões potenciais para esta variação na composição do

veneno, como diferenças específicas de espécies, a dieta de cada espécie e os fatores

ambientais.

Em contraste com os resultados de toxicidade in vitro e o potencial genotóxico in vivo,

as análises bioquímicas de AST, ALT e CRT séricas, não demonstraram danos hepáticos e

renais nos animais tratados. Além disso, o tratamento oral por 15 dias consecutivos com o

extrato de R. marina e R. guttatus não apresentou alteração no comportamento alimentar dos

animais, demonstrando que não houve efeito tóxico direto na dose utilizada. Dessa forma, os

animais não apresentaram sinais relacionados a uma possível toxicidade dos venenos, durante

todo o período de tratamento. Neste contexto, os resultados observados mostram a

necessidade da continuidade do estudo com compostos isolados desses extratos a fim de

identificar quais moléculas atuam como possíveis agentes quimioprotetores na prevenção da

carcinogênese.

5. Conclusão

Os extratos brutos de R. marina e R. guttatus apresentaram efeitos tóxicos

pronunciados nas células do Tumor de Walker 256 e em células esplênicas de rato e

camundongo, independente da dose utilizada. Através do teste do micronúcleo constatou-se

efeito antimutagênico e mutagênico desses dois extratos. Por análise bioquímica de AST,

ALT e CRT séricas, não houve dano hepático e renal nos animais tratados.

Divulgação de conflitos de interesse

Nenhum conflito potencial de interesse foi divulgado.

22

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26

ANEXO 1

27

ANEXO 2

28

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