universidade federal de goiÁs programa de pÓs … · 2014-06-17 · recém-nascidos para...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

Juliana Boaventura Avelar

Toxoplasmose crônica em gestantes. Avaliação da prevalência, fatores de risco e acompanhamento de um

grupo de recém-nascidos em Goiânia – Goiás

Goiânia 2013

ii

Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas

(TEDE) na Biblioteca Digital da UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG

a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG,

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da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [x ] Tese

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Autor(a): Juliana Boaventura Avelar

CPF: 779.942.645-49 E-mail: [email protected]

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gatício do autor

Agência de fomento: Sigla:

País: UF: CNPJ:

Título: Toxoplasmose crônica em gestantes. Avaliação da prevalência, fatores de risco e acompanhamento de um

grupo de recém-nascidos em Goiânia – Goiás

Palavras-chave: Toxoplasmose, recém-nascidos, acompanhamento e diagnóstico.

Título em outra língua:

Palavras-chave em outra língua:

Área de concentração: Parasitologia

Data defesa: (07/03/2013)

Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical

Orientadora: Ana Maria de Castro

CPF: E-mail: [email protected]

Co-orientador(a):

CPF: E-mail:

3. Informações de acesso ao documento:

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Data: 26 /09 /2013

Assinatura do(a) autor(a)

1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão

deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão

sempre disponibilizados.

iii


Toxoplasmose crônica em gestantes. Avaliação da

prevalência, fatores de risco e acompanhamento de um grupo de recém-nascidos em Goiânia – Goiás

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública. Área de concentração em Parasitologia.

Orientadora: Profª. Drª. Ana Maria de Castro

Goiânia 2013

iii

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO

Aluna: Juliana Boaventura Avelar

Orientadora: Profª. Drª. Ana Maria de Castro

Membros da banca de defesa:

1. Mariza Martins Avelino FM/UFG

2. Joana Darc’A. C. Herzog Soares IPTSP/UFG

3. Waldemar Naves do Amaral FM/UFG

4. Rosemar Macedo de Sousa Rahal FM/UFG

4. Adelair Helena dos Santos (Suplente) IPTSP/UFG

5. Alverne Passos Barbosa (Suplente) IPTSP/UFG

6. Marina Clare Vinaud (Suplente) IPTSP/UFG

7. Wilson de Melo Cruvinel (Suplente) PUC GOIÁS

Data: 07/03/2013

iv

DEDICATÓRIA

Dedico a minha família.

v

AGRADECIMENTOS

A minha orientadora Ana Maria de Castro.

A minha mãe Belirana Boaventura Avelar.

As minhas irmãs Fabiana Boaventura Avelar Nogueira e Graciana A.

Boaventura Avelar.

Ao meu companheiro para todos os momentos Eduardo Farias Rebelo,

por todo amor e dedicação.

Ao meu filho Vicente Boaventura Rebelo que eu amo imensamente.

A toda a minha família, Tios, Tias, primos e primas.

Ao meu sogro Raimundo Rebelo e minha sogra Saras Farias.

Aos colaboradores da pesquisa que se dispuseram em realizar a coleta

de sangue e de realizar todas as técnicas laboratoriais utilizadas na execução da

tese, Hânstter Hálisson Alves Rezende, Roberta Rassan de Lima Candido,

Heloisa Ribeiro Storchilo e Suelen Alves Ferreira.

A direção do Hospital das Clínicas e da Maternidade Nossa Senhora de

Lourdes, pela permissão de fazer a pesquisa em suas maternidades.

A todas as pacientes que concordaram em participar da pesquisa.

A todas as amigas e amigos do Instituto de Patologia Tropical e Saúde

Pública.

Aos membros da banca por aceitarem participar e dar suas contribuições

para um melhor aperfeiçoamento dessa tese.

Ao programa de pós-graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da

Universidade Federal de Goiás.

As agencias financiadoras Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal

de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.

vi

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO/REVISÃO DA LITERATURA 01

1.1- Introdução

1.1.2- Toxoplasmose

1.1.3- Ciclo Biológico

1.1.4- Epidemiologia

01

01

01

04

1.2- Revisão da literatura 05

1.3-Toxoplasmose congênita 06

1.4- Transmissão vertical da toxoplasmose 06

1.5- Reagudização pelo Toxoplasma gondii 07

1.6- Reinfcção pelo Toxoplasma gondii 08

1.7- Epidemiologia da transmissão vertical 09

1.8- Diagnóstico da Toxoplasmose 09

1.9- Tratamento 11

1.10- Caracterização molecular do Toxoplasma gondii 12

1.11- Vacinas 14

2- JUSTIFICATIVA 16

3- OBJETIVOS 18

3.1- Objetivo geral 18

3.2- Objetivos específicos 18

vii

4- MÉTODOS

4.1- População estudada

19

20

4.2- Dados dos questionários socioeconômicos 21

4.3- Métodos laboratoriais utilizados na pesquisa 21

4.3.1-Diagnóstico sorológico 21

4.4- Diagnóstico parasitológico 22

4.5- Amplificação específica do T. gondii 22

4.5.1- Extração do DNA T. gondii 22

4.5.2- Detecção T. gondii por PCR 22

4.5.3- Acompanhamento das crianças IgG positivas 23

5- RESULTADOS 24

5.1- Artigo 1: Toxoplasmose crônica em gestantes. Avaliação da

prevalência, fatores de risco e acompanhamento de um grupo de

recém-nascidos em Goiânia – Goiás.

25

5.2- Artigo 2: Toxoplasmose - Reativação em gestante de oito

meses caso inédito em Goiás- Brasil

47

6- CONSIDERAÇÕES GERAIS 65

7- CONCLUSÕES GERAIS 66

8- RECOMENDAÇÕES 68

9- REFERÊNCIAS GERAIS 69

10- APÊNDICE 84

viii

11- ANEXOS 87

ANEXO 1- Parecer do comitê de Ética

ANEXO 2- Termo de consentimento livre e esclarecido

87

88

xv

FIGURAS, TABELAS, APENDICES E ANEXOS

Figura 1: Ciclo biológico do Toxoplasma gondii. Ilustração retirada do

livro Parasitologia Humana, David Pereira Neves, capítulo 18 da 11ª

edição.

02

Tabela 1: Perfil sócio-demográfico das maiores frequências

encontradas na análise dos questionários das 188 mulheres

gestantes atendidas nas maternidades do Hospital das Clínicas e

Maternidade Nossa Senhora de Lourdes em Goiânia-GO, nos anos

de 2010 e 2011.

32

Tabela 2: Antecedentes obstétricos das maiores frequências

encontradas na análise dos questionários das 188 mulheres gestantes

atendidas nas maternidades do Hospital das Clínicas e Maternidade

Nossa Senhora de Lourdes em Goiânia-GO, nos anos de 2010 e 2011.

34

Tabela-3: Fatores de risco para a infecção toxoplásmica das maiores

frequências encontradas na análise dos questionários das 188

mulheres gestantes atendidas nas maternidades do Hospital das

Clínicas e Maternidade Nossa Senhora de Lourdes em Goiânia-GO,

nos anos de 2010 e 2011.

35

x

Figura 2: sorologia para IgG realizada nas amostras de sangue

coletadas nas mães e RN nas maternidades do Hospital das Clínicas

nos anos de 2010 e 2011 e na Maternidade Nossa Senhora de

Lourdes no ano de 2011. N: número absoluto de pacientes.

36

Figura 3: Frequência dos títulos de anticorpos anti-Toxoplasma gondii

(IgG) detectados pela reação de Imunofluorescência Indireta, em 188

amostras de sangue coletados dessas mães cronicamente infectadas

pelo Toxoplasma gondii e seus respectivos recém-nascidos, feita a

partir das amostras de sangue coletadas nas maternidades do Hospital

das Clínicas nos anos de 2010 e 2011 e na Maternidade Nossa

Senhora de Lourdes no ano de 2011.

37

Apêndice 1: Questionário utilizado para coleta dos dados sócio

demográficos e sorológicos das pacientes.

84

Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética 87

Anexo 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 88

xi

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

AIDS- Acquired immunodeficiency syndrome

DNA- Deoxyribonucleic acid

ELISA- Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

IFI- Imunofluorescência Indireta

mg- miligrama

mL- mililitro

PCR- polymerase chain reaction

RN- recém-nascido

UFG- Universidade Federal de Goiás

UI- unidades internacionais IgA- Imunoglobulina A IgG- Imunoglobulina G IgM- Imunoglobulina G IgE- Imunoglobulina E LCR- Líquido cefalorraquidiano

HC- Hospital das clínicas

MNSL- Maternidade Nossa Senhora de Lourdes

µL- microlitro

xii

RESUMO

O Toxoplasma gondii causa uma parasitose com ampla distribuição na natureza e alta prevalência na população humana, sob a forma de infecção assintomática. Quando uma gestante se infecta, pode ocorrer a passagem dos parasitos através da placenta, causando uma infecção que varia em gravidade, dependendo da época em que ocorreu o acometimento fetal. O feto pode morrer em função do processo infeccioso, ou ficar com sequelas graves (oculares ou cerebrais), mas pode ser assintomático ao nascer, o que não implica em evolução benigna da doença, pois as alterações podem aparecer ao longo do seu desenvolvimento. O objetivo desse estudo foi fazer uma avaliação soroepidemiológica de mães cronicamente infectadas e de seus respectivos recém-nascidos para verificar a possibilidade da ocorrência de toxoplasmose congênita. Foram coletadas amostras de sangue de 230 mães e seus respectivos recém-nascidos, oriundas de duas maternidades públicas de Goiânia (GO), no período de 2010 a 2011. As amostras foram submetidas a técnicas de IFI e ELISA para identificação de anticorpos específicos anti- T. gondii. Além do teste de Avidez da IgG em 133 dessas amostras. Em 32 amostras de soros dos RN foi realizada a pesquisa de anticorpos da classe IgA e 42 amostras de sangue do RN foram submetidas a técnica de PCR para identificação do parasito por terem seus títulos sorológicos maiores do que de suas mães ou apresentam baixa avidez da IgG. Encontrou-se que 68,1% (188/230) das amostras tinham anticorpos específicos da classe IgG o que corresponde a 51,9% entre as gestantes atendidas no Hospital das Clínicas (HC) em 2010 e, 42,3% entre as gestantes da Maternidade Nossa Senhora de Lourdes em 2011. Não se identificou anticorpos da classe IgM e IgA no sangue de nenhum dos RN estudados e também não foi possível o encontro do parasito entre os RN pela PCR. 14,8% (34/230) das mulheres examinadas tiveram os seus resultados de IgG negativo apesar de ter resultado positivo no teste de screening sorológico do pré-natal, constituindo assim, o falso-positivo do teste. Apesar dos resultados neste grupo de gestantes e recém-nascidos não terem mostrado que a toxoplasmose congênita possa acontecer de forma importante nas gestantes cronicamente infectadas, durante o projeto, foi diagnosticado um caso de uma gestante cronicamente infectada pelo T. gondii, com oito meses de gestação que teve seu feto infectado congenitamente, ocasionando o óbito fetal. Foram detectados altos títulos de anticorpos da classe IgG, presença de IgM e alta avidez da IgG, sugerindo se tratar de reagudização da infecção protozoária. Esse achado aponta a importância do aconselhamento das medidas de prevenção primária para todas as gestantes, independente de seu estado imune contra o parasito.

xiii

ABSTRACT

Toxoplasma gondii causes a parasitosis with wide distribution in nature and high prevalence in the human population, in the form of asymptomatic infection. When a pregnant woman if infects, can occur the passage of parasites through the placenta, causing an infection that varies in severity, depending on the season in which occurred the fetal disease. The fetus may die in function of the infectious process, or staying with serious sequelae (ocular or brain), but may be asymptomatic at birth, which does not necessarily imply in benign progression of the disease, because the changes may appear throughout their development. The objective of this study was to make an evaluation of serological survey on chronically infected mothers and their newborns to check the possibility of the occurrence of congenital toxoplasmosis. Blood samples were collected from 230 mothers and their newborns, originated from two public hospitals of Goiânia (GO), in the period from 2010 to 2011. The samples were submitted to techniques of IFAT and ELISA for identification of specific antibody anti- T. gondii. In addition to the testing of Avidity of IgG in 133 of these samples. In 32 samples of sera of RN was performed to search for antibodies of the IgA class and 42 blood samples from newborns were submitted to the technique of PCR for identification of the parasite by having their serologic titers higher than their mothers or have low avidity of IgG. It was found that 68.1% (188/230) of the samples had specific antibodies of the IgG class which corresponds to 51.9% among pregnant women treated at the Hospital das Clinicas (HC) in 2010, and 42.3% among pregnant women of Maternidade Nossa Senhora de Lourdes in 2011. Not if identified antibodies of the IgM and IgA in the blood of any of RN studied and it was also not possible the encounter of the parasite between RN by PCR. 14.8% (34/230) of women examined had their results of IgG negative despite having positive result in serological screening test, thus constituting the false-positive test. Despite of the results in this group of pregnant women and newborns have not shown that the congenital toxoplasmosis can happen so important in pregnant women chronically infected, during the project, was diagnosed with a case of a pregnant woman chronically infected by T.gondii, with eight months of pregnancy that had its fetus infected congenitally, causing fetal death. Were detected high titers of antibodies of the IgG class, presence of IgM and high avidity of IgG, suggesting that treat of resurgence of protozoal infection. This finding points to the importance of the advice of primary prevention measures for all pregnant women, regardless of their immune status against the parasite.

Introdução / Revisão da Literatura

1

Tese de Juliana Boaventura Avelar

1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

1.1- Introdução

1.1.2- Toxoplasmose

A toxoplasmose é causada pelo protozoário, T. gondii, um parasito

intracelular obrigatório de células nucleares do filo Apicomplexa, ordem

Eucoccidia, capaz de infectar tanto aves como mamíferos, inclusive o homem.

Apresenta três formas distintas: taquizoítos (forma de vida livre presente nos

líquidos orgânicos), bradizoítos forma de resistência do parasito presente nos

cistos e oocistos (forma liberada pelos felídeos juntamente com as fezes no

meio ambiente) (Amendoeira 1995).

1.1.3- Ciclo biológico

O T. gondii apresenta um ciclo heteroxênico (fase assexuada ou extra

intestinal e sexuada ou enteroepitelial). A fase sexuada ocorre no gato que é o

hospedeiro definitivo, portador e excretor do oocisto no meio ambiente

juntamente com as fezes (Dubey 1993, Dubey et al.1998, Cimerman 1999, Black

& Boothroyd 2000).

Nos felídeos a contaminação ocorre por ingestão de oocistos contendo

esporozoítos, presentes em material fecal ou por carnivorismo de cistos

contendo bradizoítos. Logo em seguida ocorre a digestão dos cistos ou oocisto e

liberação dos bradizoítos ou esporozoítos. A partir de então se dá a penetração

nas células epiteliais podendo seguir dois caminhos, o primeiro deles é a

reprodução assexuada ou extra-intestinal que resulta na formação de

taquizoítos. Os enterócitos se degeneram e liberam os taquizoítos que

penetrarão em novas células, que asseguram a difusão e manutenção da

parasitose. Portanto, o gato se comporta nesta fase como hospedeiro

intermediário. O segundo caminho é a reprodução sexuada, onde os taquizoítos

se transformam no interior dos enterócitos em gametócitos masculinos e

femininos seguidos de fecundação e formação do oocisto imaturo que será


2


eliminado para o exterior com as fezes. A eliminação geralmente ocorre em

média de 10 a 12 dias após a ingestão de oocisto com esporozoítos e de três a

sete dias após a ingestão de cistos com bradizoítos. Os hospedeiros

intermediários se contaminam quer seja a partir de oocistos esporulados, quer

seja por carnivorismo (cistos com bradizoítos) (Dubey 1993, Dubey et al. 1996,

Dubey et al. 1998).

A fase de parasitemia dura de 8 a 10 dias. Os esporozoítos ou bradizoítos

livres se transformam em taquizoítos e passam para a circulação geral,

invadindo mucosa intestinal e macrófagos. Segue-se uma fase mesenquimatosa

(multiplicação por endodiogenia) e posterior fase parenquimatosa (bradizoítos no

interior de cistos se multiplicando lentamente) (Black & Boothroyd 2000). Todas

as fases descritas acima podem ser observadas na figura1.

Figura 1: Ciclo biológico do Toxoplasma gondii. Ilustração retirada do livro

Parasitologia Humana, David Pereira Neves, capítulo 18 da 11ª edição.


3


O parasito por via hematogênica pode causar uma doença materna clínica,

subclínica ou assintomática. Já as infecções fetais ocorrem por via ascendente,

através do canal endocervical, ou por via hematogênica, através do sangue

materno (Lana 2000).

A melhor forma para a prevenção da toxoplasmose congênita é utilizar

medidas de prevenção primária com orientações das gestantes soronegativas

(IgG e IgM não reagentes) para evitar a exposição dessas mulheres ao parasito.

Mesmo sendo incapaz de impedir a mulher de se infectar, a prevenção primária

diminui a taxa de soroconversão durante a gestação (Foulon et al. 1994).

A educação em saúde, ou prevenção primária, envolve a promoção do

conhecimento sobre os meios de evitar a infecção pelo T. gondii. As gestantes

devem evitar o consumo de carne crua ou mal cozida, devem lavar as mãos ao

manipular carne crua, evitar o consumo de água não filtrada e de leite não

pasteurizado, assim como de alimentos expostos à moscas, ratos, baratas,

formigas e outros insetos. Deve lavar bem as frutas e legumes e evitar contato

com gatos ou com o solo ou, pelo menos, usar luvas apropriadas durante a

jardinagem, ou ao lidar com materiais potencialmente contaminados com fezes

de gatos ou ao manusear caixas de areia dos gatos. Essas medidas devem ser

continuamente enfatizadas durante a gestação, especialmente para as

gestantes com sorologia negativa, levando também em consideração seus

hábitos e costumes. Estas informações podem ser mais eficazes quando dadas

pelo próprio médico, individualmente ou em grupos, e repetidas no decorrer do

acompanhamento pré-natal, do que por meio de material escrito (Cook et al.

2000).

A resposta imunológica do hospedeiro imunocompetente contra o T. gondii

é a responsável pelo encistamento do parasito preferencialmente no cérebro, na

musculatura esquelética, e em demais órgãos, onde esses cistos podem

permanecer viáveis no hospedeiro por toda a vida (Frenkel 2002).

Os taquizoítas da infecção aguda assumem a forma de bradizoítos, a qual

pode permanecer latente por toda a vida do indivíduo sem causar-lhe dano ou

morte, caracterizando a fase crônica da doença. Apesar da elevada frequência

de infecção inaparente, essa zoonose pode manifestar-se como doença

sistêmica severa em algum momento de deficiência imunológica, como em

imunodeprimidos por quimioterapia, pacientes com Síndrome da


4


Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e durante a gestação (Frenkel et al. 1975,

Ruskin & Remington 1976; Bachmeyer et al. 2006).

Sempre deve-se investigar os hábitos culturais e os títulos de anticorpos

das gestantes contra o T. gondii, tal fato é importante para definir as estratégias

de prevenção da infecção congênita (Amendoeira & Camillo-Coura 2010).

1.1.4- Epidemiologia

Dados epidemiológicos demonstram que 50-90% da população mundial

apresenta anticorpos sanguíneos contra T. gondii, demonstrando prévia

imunidade (Remington et al. 1995, Remington et al. 2001).

Estima-se que 80% a 90% das infecções sejam assintomáticas (Kravetz &

Federman 2005), porém a infecção pelo T. gondii é a principal causa de

morbidade e mortalidade em crianças infectadas congenitamente e em

pacientes imunocomprometidos, incluindo pacientes infectados pelo vírus da

imunodeficiência humana (HIV), (Luft & Remington 1992, Dubey 1996, Hill &

Dubey 2002). Em pacientes HIV soropositivos foi possível verificar

recentemente, em Pelotas no Rio Grnade do Sul, a prevalência de 80%, com

histórico de neurotoxoplasmose em 4,8% e de toxoplasmose ocular em 1,6%

(Xavier et al. 2013).

A grande extensão territorial e a diversidade sociocultural de nosso país

justificam a observação de taxas diferentes de prevalência da toxoplasmose,

mesmo em uma determinada região.

Estudos em diversos estados brasileiros demonstram essa variabilidade

nas gestantes previamente expostas ao parasito (IgG anti-T. gondii reagente),

como no município de Divinópolis, Minas Gerais foi encontrado 49,5% (Fonseca

et al. 2012), no Rio Grande do Sul onde 59,8% (Varella et al. 2003) encontraram

74,5%. (Spalding et al. 2005), na Bahia 64,9% (Nascimento et al. 2002), no

Paraná 67% (Reiche et al. 2000) em Mato Grosso do Sul 91,4% (Figueiró-Filho

et al. 2005), Pernambuco 69,4% (Nobrega et al. 1998) e 74,7% (Porto et al.

2008), Rio de Janeiro 77,1% (Meireles 1985), Mato Grosso 70,7% (Leão et al.

2004), Espirito Santo 73,5% (Areal & Miranda 2008). Em Goiás os dados de

Sartori et al. 2011 demonstram que 67,7% das gestantes já tiveram contato com

o parasito, valores semelhantes também foram descritos por Avelino em 2000


5


de 65,8% mostrando que em onze anos não houve grande alteração nessa

prevalência.

1.2- Revisão da Literatura

Doenças infecciosas durante a gravidez são relativamente frequentes,

afetando especialmente populações menos favorecidas. Tal situação cria

desafios à saúde pública, para planejar estratégias de triagem dessas doenças

de modo prático e abrangente, facilitando o manejo clínico das gestantes com o

diagnóstico positivo para doenças infecto contagiosas. Infecções maternas por

Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Citomegalovírus (CMV), Herpes

simples, Treponema pallidum, entre outras, que podem ser transmitidas via

transplacentária durante a gestação, no momento do parto ou durante o

aleitamento materno, também têm sido implicadas como causa de aborto

(Figueiró-Filho et al. 2005). O diagnóstico precoce de tais infecções contribui na

redução da morbi-mortalidade materno-fetal e consequente melhora dos

indicadores de saúde de uma determinada região (Reiche et al. 2000, Duarte

2003).

Nos indivíduos imunocompetentes a infecção pelo T. gondii geralmente se

apresenta na forma assintomática, ou leve sem gravidade. Nos pacientes

imunossuprimidos pode ocorrer formas graves com o comprometimento ocular,

cerebral entre outros. No feto cujo sistema imune é imaturo, a gravidade da

infecção fetal dependerá da época da gestação em que ocorreu o processo

infeccioso, sendo que as formas mais graves ocorrem na primeira metade da

gestação.


6


1.3- Toxoplasmose congênita

A forma mais importante da doença é a toxoplasmose congênita em que a

transmissão do parasito ao feto ocorre a nível transplacentário, durante a primo

infecção materna ou em mulheres que já tiveram a infecção antes da concepção

e reagudizam durante a gestação. Possui consequências variadas que

dependem do grau de exposição do feto ao parasito, da virulência da cepa, do

genótipo do parasito, do período de gestação e do tratamento pré-natal (Guo et

al. 1997, Mack et al. 1999).

A taxa de transmissão materno-fetal varia principalmente de acordo com a

idade gestacional no momento da infecção materna. Quando esta ocorre até a

13ª semana de gestação é de 6%, aumentando para 40% e 72% na 25ª e 36ª

semanas de gestação (Dunn et al. 1999). Valores semelhantes foram

observados em outro estudo que também estimou a taxa de transmissão de

acordo com a semana da soroconversão materna, sendo de 9% até a 12ª

semana gestacional e 82% na 40ª semana (Gilbert & Gras 2003).

As complicações mais graves são descritas quando a transmissão vertical

ocorre no início da gestação, pois o parasito nesse período pode afetar o

processo de organogênese. O risco de desenvolvimento de complicações

estimado foi de 61% quando a gestante foi infectada até a 13ª semana,

diminuindo para 25% até a 26ª semana e 9% na 36ª semana gestacional (Dunn

et al. 1999).

O espectro clínico da infecção congênita pelo T. gondii varia amplamente

desde alterações aparentes ao nascimento com mortalidade perinatal elevada

(microcefalia, crescimento intra-uterino retardado, hidrocefalia). As formas

assintomáticas ou oligossintomáticas no terceiro trimestre da gestação. Pode

ocorrer uma infecção subclínica no feto com possibilidade do desenvolvimento

de coriorretinite e/ou complicações tardias na vida da criança (Engstrom et al.

1991, Ajzenberg et al. 2002, Spalding et al. 2003, Leão et al. 2004).

1.4- Transmissão vertical da toxoplasmose

A partir do momento em que a mulher descobre que esta gestante é

solicitado a ela que faça uma investigação sorológica para detectar a presença

de anticorpos para diversas doenças que podem acometer gravemente seu filho,

dentre essas, a toxoplasmose. A transmissão vertical do T. gondii pode


7


ocasionar no concepto diversas consequências irreversíveis como a

corrioretinite e complicações neurológicas. Portanto é de fundamental

importância determinar o momento em que ocorreu essa infecção a partir de

testes sorológicos (Remington et al. 2005).

A mulher com uma infecção aguda tem possibilidade de 20 a 50% de

transmitir a infecção ao seu feto (Jones et al. 2001). Vários fatores influenciam

na infecção congênita, sendo eles o tipo da cepa, a quantidade de parasitos

transmitidos, a via de infecção e o estado imunológico da gestante (Remington

et al. 2005).

Em função da variedade fisiopatológica e clínica da infecção

toxoplásmica, as modalidades de diagnóstico na transmissão vertical são

diferenciadas, podendo estar relacionadas a uma reativação em indivíduos

imunodeprimidos, a uma infecção neonatal ou a uma infecção primária (Guerina

1994, Hartup et al. 1997, Hezard et al. 1997, Hill & Dubey 2002, Novotna et al

2005).

A infecção fetal pode acontecer quando a mãe tem uma soroconversão

durante a gestação (Minkoff et al. 1997). Ou mesmo quando ela tem uma

reativação ou reinfecção da doença.

1.5- Reagudização pelo Toxoplasma gondii

Casos de reagudização são descritos na literatura demonstrando que

esse processo pode levar a morte fetal, como descrito por Garcia (1968). Vários

autores relatam que pacientes imunocompetentes, com uma gestação saudável,

podem ter uma baixa de sua imunidade e ter um processo de reativação da

toxoplasmose (Remington et al. 2006). Garweg et al. (2005) relatam um caso de

paciente com reativação ocular durante a gestação.

Existem na literatura diversos relatos de mulheres cronicamente

infectadas pelo T. gondii que tiveram reativação da infecção durante a gestação

e transmitiram o parasito aos seus filhos (Pons et al. 1995, Vogel et al. 1996,

Silveira et al. 2003, Kodjikian et al. 2004, Garweg et al. 2005, Bachmeyer et al.

2006, Fernandes et al. 2009, Andrade et al. 2010).

A reagudização durante a gestação leva a consequências variadas que

dependem do grau de exposição do feto ao toxoplasma, da virulência da cepa,

do período de gestação em que ocorreu a reagudização, da capacidade imune


8


da grávida, da placenta e do feto e da intensidade da resposta inflamatória fetal

(Kawazoe 2002). Não menos frequentes também encontramos relatos de

abortos pela reativação da toxoplasmose (Fortier et al. 1991).

1.6- Reinfecção pelo Toxoplasma gondii

A gestante pode ter também uma reinfecção por uma cepa diferente do T.

gondii podendo causar sérios danos a seus conceptos, essa situação já foi

descrita por alguns autores (Gavinet et al. 1997, Elbez-Rubinstein et al. 2009).

Na toxoplasmose humana ocorre a persistência de linfócitos T de

memória, que provavelmente é mantida pela ruptura regular de cistos

intracelulares e talvez por infecções recorrentes através da alimentação. Além

disso, anticorpos anti-T. gondii podem permaner detectáveis durante toda a vida

do hospedeiro (fase crônica) (Filisetti & Candolfi 2004). Todos os fatores

imunológicos juntos seriam importantes para proteger o indivíduo primo-

infectado de um futuro evento de reinfecção (Buzoni-Gatel et al. 2006).

Fortier et al. (1991) relataram um caso de aborto espontâneo causado

pela reinfecção pelo T. gondii durante a gravidez.

Hennequin et al. (1997) descreveram o caso de um recém-nascido com

lesões oculares e altos títulos de IgG anti- T. gondii associado com IgM e IgA

específicos. A mãe apresentava, com quatro e 10 semanas de gestação,

sorologia anti-T. gondii consistente com infecção crônica antiga: títulos

moderados e estáveis de IgG e ausência de IgM e IgA específicos. Após o

nascimento da criança a mãe apresentava um aumento nos títulos de IgG além

de anticorpos IgA específicos. A mãe não apresentou qualquer evento de

imunossupressão e, portanto, a hipótese de reinfecção foi a mais consistente.

Kodjikian et al. (2004) registraram um caso de toxoplasmose congênita

em recém-nascido de mãe imunocompetente com infecção crônica antiga pelo

T. gondii.

Um caso de reinfecção foi descrito por Elbez-Rubinstein et al. (2009) em

um estudo realizado na França, de uma forma disseminada em um recém-

nascido de uma mãe imunocompetente que apresentava infecção prévia pelo T.

gondii antes da gravidez.

Uma das hipóteses para este evento raro é a reinfecção com uma cepa

atípica do T. gondii com parasitos altamente virulentos (Lindsay & Dubey 2011).


9


1.7- Epidemiologia da transmissão vertical

São descritas na literatura taxas de infecção congênita que variam de

1/1000 a 17/1000 nascidos vivos em vários países do mundo (Desmonts et al.

1985, Thuliez 1992, Jacquier et al. 1995). Na França encontram-se valores de

1/1000 a 8/1000 nascidos vivos. No Brasil temos valores de 5/1000 em São

Paulo (Castilo 1976), sendo que em Minas Gerais, constatou-se uma incidência

de toxoplasmose congênita de 5/1000 (Silva et al. 2004), no Rio Grande do Sul

de 8/1000 (Mozzatto & Procianoy 2003), em Goiânia Rodrigues (2006)

encontrou 6/1000 entre os recém-nascidos.

1.8- Diagnóstico da Toxoplasmose

No Brasil, o Ministério da Saúde preconiza a realização de exames

laboratoriais em todas as gestantes logo depois da primeira consulta de pré-

natal, os quais se constituem de suma importância para orientar os profissionais

de saúde no planejamento de uma assistência de qualidade (Brasil 2000). Os

exames são: dosagem de hemoglobina e hematócrito, grupo sanguíneo e fator

Rh, glicemia em jejum, exame sumário de urinas e sorologias anti-HIV, para

sífilis, hepatite B e toxoplasmose.

O diagnóstico precoce da infecção na gestante, associado ao tratamento

específico adequado, pode melhorar o prognóstico da infecção fetal, diminuindo

as sequelas nas crianças (Wallon et al. 1997).

O diagnóstico precoce da toxoplasmose congênita continua sendo um

desafio aos profissionais de saúde, principalmente porque a doença pode ser

clinicamente silenciosa e em muitos casos não há detecção de IgM devido a

falsas reações negativas, e pela ausência de técnicas laboratoriais com alta

sensibilidade e especificidade (Remington et al. 2001, Rodrigues et al. 2009).

O diagnóstico fetal se baseia na sorologia materna seguido da coleta de

líquido amniótico (amniocentese), para avaliar a presença de anticorpos

específicos e para avaliar a presença de parasitos (Filisetti et al. 2003, Chabbert

et al. 2004). Por cordocentese (que pode ser feita a partir da 18ª semanas, para

obtenção de amostras de sangue fetal). Nesse material se processa a

identificação do parasito. No entanto, a sua pesquisa pelo exame direto é difícil,

e deve frequentemente ser complementada por métodos indiretos tais como

inoculação em animais de laboratório, cultura celular ou técnicas sorológicas


10


(Derouin et al. 1987, Daffos et al. 1988, Camargo 1995, Dubey et al. 1998,

Uchoa et al. 1999, Robert- Gagneux et al. 1999).

A pesquisa dos anticorpos IgA, IgG e IgM são muito importantes para se

determinar o momento de infecção pelo protozoário. A pesquisa dos anticorpos

IgA podem ser um bom marcador de infecção aguda em gestantes. Eles podem

permanecer na circulação sanguinea de alguns meses até um ano, mas nunca

por um período maior que dois anos. O desaparecimento dessas IgA são mais

frequentes após os sete meses de infecção (Remington et al. 2005, Sáfadi &

Farhat 1999, Stepick-Biek et al. 1990).

A toxoplasmose é normalmente diagnosticada com base na detecção de

anticorpos IgG e IgM específicos, no entanto, a inclusão de outros parâmetros

tais como o teste da avidez de IgG, testes de IgE e IgA, e da reação em cadeia

da polimerase é fundamental para o diagnóstico conclusivo da toxoplasmose

durante a gravidez (Jones et al. 2001).

Os anticorpos da classe IgM podem persistir positivos até por 18 meses e

por isso é importante a realização do teste de avidez para IgG para tentar definir

o momento da infecção na gestante. Na fase aguda da infecção os anticorpos da

classe IgG ligam-se fracamente ao antígeno (baixa avidez), na fase crônica (> 4

meses) a avidez é alta. A presença de IgM com anticorpos IgG de alta avidez

indica que a infecção foi adquirida há mais de quatro meses. E se foi realizado

antes dos quarto meses de gestação, significa que a infecção da gestante

ocorreu antes da gravidez, quando a probabilidade de transmissão vertical é

menor.

O teste de avidez para IgG é um bom marcador de infecção aguda em

pacientes gestantes se realizado no primeiro trimestre pois, permite identificar se

a infecção pelo T. gondii é antiga ou recente. Esse teste é baseado no aumento

da afinidade funcional entre antígeno e anticorpo anti-T. gondii. Gestantes com

alta avidez são consideradas como tendo adquirido a infecção há cerca de

quatro ou mais meses atrás. Os anticorpos IgG apresentam baixa avidez

durante a fase aguda da infecção, aumentando com o tempo e facilitando a

interpretação dos casos considerados agudos e crônicos (Isabel et al. 2007).

Reis et al. (2006) analisaram a avidez de IgG anti-toxoplasma em

gestantes com sorologias positivas para IgG e IgM: quando a avidez foi alta


11


nenhum RN estava infectado, enquanto os que tiveram avidez baixa estavam

infectados, e um foi natimorto.

1.9- Tratamento

Durante a gestação o tratamento para toxoplasmose reduz o risco da

forma sintomática da toxoplasmose congênita e o surgimento de lesões graves

na criança (Foulon et al. 1999). Os principais medicamentos utilizados para esse

tratamento em gestantes são: inibidores do ácido fólico (inibidores da

dihidrofolato redutase e sulfonamidas) e macrolídeos (Derouin & Bessières

2005).

A pirimetamina é o inibidor da enzima dihidrofolato redutase (DHFR) mais

ativo. Sua administração em altas doses no início da gestação apresenta efeito

teratogênico, logo não se recomenda seu uso no primeiro trimestre de gestação.

Entre as sulfanamidas, a mais utilizada é a sulfadiazina. Ambas são capazes de

atravessar a barreira placentária e administradas em combinação podem

apresentar melhores resultados do que se fossem utilizadas em monoterapia,

pois são capazes de inibir a síntese de ácido fólico do parasito, e por sua vez, a

do hospedeiro, sendo, portanto, indicada a administração de ácido folínico

sintético (Derouin & Bessières 2005, Diniz & Vaz 2003), para diminuir esse efeito

no organismo infectado.

Os macrolídeos são antibióticos ativos no combate a infecção pelo T.

gondii. No entanto, concentrações ativas não são alcançadas em alguns tecidos

como cérebro e olhos, dificultando o tratamento de sequelas nesses órgãos.

Como é incapaz de atravessar a barreira placentária e atingir o feto, deve ser

administrado no início da fase aguda, antes do comprometimento placentário, a

fim de prevenir a transmissão vertical (Derouin & Bessières 2005). A

espiramicina é o principal antibiótico usado no tratamento da toxoplasmose

gestacional desta classe. Segundo Desmonts & Couvreur (1974) a presença de

sinais clínicos em crianças de mães tratadas com espiramicina foi de 23%,

enquanto para o grupo de mulheres não tratadas foi de 51%.

Em gestantes com perfil sorológico compatível com infecção aguda, o

tratamento deve ser iniciado visando a redução da frequência e da gravidade

das sequelas da toxoplasmose congênita (Foulon et al. 1999), mesmo que ainda


12


não existam evidências de seu benefício em reduzir a transmissão vertical

(Peyron et al. 2000, Foulon et al. 2000). A precocidade do tratamento está

associada com menor incidência de sequelas (Foulon et al. 1999). O risco

estimado para o surgimento de complicações oculares até os três anos de idade

em crianças infectadas de mulheres soroconvertidas até a 24ª semana

gestacional foi 15,8% quando tratadas com espiramicina e 17,7% com

pirimetamina e sulfadiazina (Gras et al. 2005).

No Brasil, o Ministério da Saúde (Brasil 2000) indica a administração de 3

g/dia de 8/8 horas por via oral de espiramicina para o tratamento quando

constatado anticorpos IgM. Todavia, é necessário um período de três semanas

para que concentrações eficazes desse antibiótico sejam alcançadas na

placenta (Kieffer et al. 2009).

A infecção congênita deve ser investigada e caso seja confirmada, o

tratamento tríplice é iniciado. Esse esquema consiste na associação de 25 mg

de 12/12 horas por via oral de pirimetamina, 3 g/dia de 12/12 horas por via oral

de sulfadiazina e 10 mg/dia de ácido folínico, sendo alternado de 3 em 3

semanas com espiramicina, e interrompido o uso da sulfadiazina duas semanas

antes do parto, ou esquema contínuo até o parto. No Brasil, o tratamento

profilático é fornecido pela rede pública de saúde, porém, Castilho-Pelloso et al.

em 2007 relatam que em alguns casos este foi adquirido por familiares ou pela

comunidade.

1.10- Caracterização molecular do Toxoplasma gondii

As cepas de T. gondii foram primeiramente isoladas de acordo com suas

características comportamentais em camundongos, sendo estas geralmente

classificadas como virulentas ou avirulentas, com base na sua patogenicidade

e/ou antigenicidade para o modelo experimental, que por sua vez foram

resistente ou susceptível (Bohne et al. 1993).

Com base na utilização da técnica de polimorfismo do comprimento dos

fragmentos de restrição (RFLP) Howe e Sibley (1995) classificam o T. gondii em

3 tipos (Tipos I, II, III) e virulência nos camundongos estavam relacionadas ao

tipo genético. Eles propuseram que os isolados Tipo I foram 100% letal para

camundongos, independentemente da dose, e que Tipos II e III geralmente

foram avirulentos para esses animais.


13


Outro fator que altera a virulência do parasita seria a sua passagem

contínua numa mesma espécie animal (Jacobs 1964). Indivíduos

imunocompetentes infectados com T. gondii podem ser assintomáticos,

enquanto que em pacientes imunocomprometidos existem altas taxas de

mortalidade (Ho-Yen 1992).

A progressão e a severidade da doença dependem de fatores genéticos

relacionados ao hospedeiro e ao parasito (Gross 1996, Suzuki et al. 1996,

Dubey 2010).

A literatura mostra que a virulência do T. gondii em diferentes animais

depende do tipo de cepa (Jhonson 1997). A identificação de uma possível

correlação entre a severidade ou o tipo de doença com a genotipagem da cepa

pode ser muito importante para um tratamento correto e uma avaliação

prognóstica da doença em diversos casos (Suzuki et al. 1996, Dubey et al.

2012).

Howe & Sibley (1995) determinaram a estrutura genética populacional do

T. gondii e demonstraram a existência de três tipos clonais predominantes: tipo I,

II e III indicando que sua propagação na natureza ocorra e principalmente pela

replicação assexuada ou por cruzamentos uniparenterais. A clonalidade do T.

gondii foi evidenciada pelos isolamentos de cepas com genótipos idênticos de

diferentes hospedeiros provenientes de áreas geográficas distintas. A

divergência genômica entre as cepas é de 1% (Ajioka et al. 2001).

As três linhagens clonais do T. gondii têm ampla distribuição geográfica e

podem infectar diferentes espécies animais, inclusive o homem. Cepas do tipo I

estão relacionadas à toxoplasmose humana congênita e á virulência aguda em

camundongos, cepas do tipo II relacionam-se aos casos de reativação da

infecção crônica em humanos e as cepas do tipo III estão associadas às

infecções animais (Howe & Sibley 1995, Dubey et al. 2002a).

Dardé et al. (2007) descrevem que uma população com estrutura

fortemente clonal que determina características biológicas, por exemplo a

virulência, poderia ser atribuída a subgrupos geneticamente bem definidos da

população de parasitos.

Casos graves de lesões oculares resistentes à terapêutica estão

associados às cepas do tipo I (Lehmann et al. 2000, Grigg et al 2001). Por outro

lado, cepas do tipo II têm sido prevalentes em pacientes aidéticos, enquanto


14


maiores ocorrências das linhagens I e II têm sido encontradas em casos de

infecção congênita (Howe et al. 1997, Fuentes et al. 2001, Aizenberg et al.

2002). As cepas do tipo II levam à infecção crônica e produção de cistos

teciduais em camundongos e têm um crescimento lento in vitro, enquanto que as

cepas de tipo I apresentam alta taxa de multiplicação in vitro (Maubon et al.

2008).

No Brasil, Dubey et al. 2002b estudando 25 isolados de T. gondii de

galinhas provenientes de áreas rurais de São Paulo, mostraram a predominância

da linhagem I, mas também encontraram em menor frequência a linhagem III.

Resultados similares (linhagens I e III) foram encontrados em isolados de gatos

no estado do Pará (Dubey et al. 2004) levando a crer que estas duas cepas

sejam as mais frequentes no Brasil.

Classificar as diferentes cepas de T. gondii é de suma importância para a

caracterização epidemiológica, pois permitirá a investigação da distribuição e da

virulência de diferentes cepas de parasitos isoladas de populações animais e

humanos (Silva 2001, Dubey et al. 2012).

Howe et al. (1997) estudou 13 casos de toxoplasmose congênita e

evidenciou que todos eram do tipo II. Fuentes et al. (2001) demonstraram uma

frequência de 40% de cepa tipo I, 40% tipo II e 20% tipo III. Em outros trabalhos

o genótipo tipo II é o mais prevalente em humanos com toxoplasmose, com

valores entre 70 a 80% (Dardé et al. 1992, Gross 1996, Howe et al. 1997, Howe

& Sibley 1995, Sibley & Boothroyd 1992, Djurkovick-Djakovic et al 2006).

Howe e Sibley (1995) acreditam que a frequência das cepas de T. gondii

do tipo III é maior em animais que em casos humanos, devendo-se considerar

que em geral, as amostras de T. gondii provenientes de humanos causam

doença clínica, enquanto que a maioria das amostras provenientes de animais

representam infecções crônicas e subclínicas. Dardé et al. (2007) acreditam que

existe um viés de amostragem porque é mais comum o isolamento do parasito

em casos clínicos humanos que em animais cronicamente infectados.

1.11- Vacinas

Segundo estudos recentes feitos na Turquia com duas cepas do T. gondii

a vacina produzida e testada não conferiu imunidade no grupo de cobaias

testadas (Polat et al. 2013).


15


Este estudo teve a intenção de obter dados da prevalência da

toxoplasmose congênita entre recém-nascidos de mães cronicamente infectadas

IgG positivas para anticorpos anti-T. gondii, em duas maternidades públicas de

Goiânia-Goiás.

Justificativa


16

2- JUSTIFICATIVA

Em Goiânia, iniciou-se a partir de setembro de 2003, uma ação conjunta

entre a Universidade Federal de Goiás (UFG) e as Secretarias Estadual e

Municipal de Saúde, para a execução de um projeto intitulado “Controle da

transmissão vertical da toxoplasmose” que passou a incluir a sorologia para

toxoplasmose nos exames do pré-natal. Este programa tem sido extremamente

valioso na triagem das mulheres com gravidez de risco para doenças

infectocontagiosas. E tem possibilitado o estudo de diferentes aspectos da

transmissão vertical da toxoplasmose em nosso meio

A linha de pesquisa desenvolvida no LAERPH tem estudado o T. gondii

em materiais biológicos como placenta, restos ovulares, sangue fetal, líquido

amniótico de mulheres em idade procriativa, provenientes de gestação de risco.

Os resultados demonstram que o diagnóstico de infecção aguda na

gestante é difícil porque muitas realizam o teste de avidez da IgG com idade

gestacional maior de quatro meses, quando a sua interpretação para essa

gestação fica prejudicada. E também é difícil o diagnóstico do RN quando o

mesmo não apresenta marcadores laboratoriais ou clínicos de infecção

congênita, necessitando de tratamento até que o acompanhamento permita

concluir o caso.

Avelino et al. (2003) demonstraram que 34,2% das mulheres em idade

procriativa estavam sob risco de adquirirem a toxoplasmose aguda durante a

gestação, e que a taxa de soroconversão em gestantes em Goiânia era de

8,6%, um dos maiores índices do mundo. Esse dado chamou a atenção pela

alta possibilidade de transmissão vertical do T. gondii em Goiás.

Ainda em Goiânia Gontijo-Silva (2006), estudando mulheres com

gravidez de risco para toxoplasmose, conseguiu detectar o parasito em 33% de

suas amostras.

Dando continuidade aos estudos, Costa (2007) demonstrou a eficácia do

tratamento sobre o parasitismo do T. gondii, pois de 32 amostras de recém-

Justificativa


17

nascidos de mulheres que receberam o tratamento profilático, durante a

gestação, em nenhum recém-nascido foi possível detectar o parasito.

Lourenço (2009), estudando 32 placentas de mulheres com gravidez de

risco para infecções pertencentes à síndrome de STORCHS (Sífilis,

toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus e herpes simples), confirmou a

presença T. gondii em 79% (25/32) de suas amostras.

Estudos realizados em nosso meio demonstraram as dificuldades

diagnósticas na gestante com infecção aguda (Alvarenga 2009). E também no

feto e no RN pela baixa sensibilidade dos marcadores diagnósticos (Amaral

2006, Rodrigues 2006 e Gomes 2006).

Essas pesquisas demonstram também que algumas gestantes com

diagnóstico duvidoso de infecção aguda durante a gestação tiveram filhos

contaminados com o T. gondii e este fato nos mobilizou a pesquisa da

toxoplasmose congênita em mães cronicamente infectadas.

Objetivos


18

3 OBJETIVOS

3.1- Objetivo Geral

Avaliar a presença da toxoplasmose congênita em filhos de mulheres

cronicamente infectadas pelo Toxoplasma gondii.

3.2- Objetivos específicos

- Avaliar a prevalência de mulheres gestantes soropositivas para T. gondii

(IgG) no serviço de ginecologia e obstetrícia do Hospital das Clínicas- HC/UFG,

no período de dois anos (01/2010 e 12/2011) e na Maternidade Nossa Senhora

de Lourdes (MNSL), no período de quatro meses (03/2011 e 07/2011).

- Descrever o perfil sócio-economico das mulheres selecionadas para o

estudo atendidas nas duas maternidades públicas de Goiânia-GO.

- Confirmar a sorologia IgG específica anti-T. gondii pelas técnicas de IFI

e ELISA, no soro das mulheres selecionadas para o estudo atendidas nas duas

maternidades públicas de Goiânia-GO.

- Comparar os títulos de IgG específica anti-T. gondii nas mães e seus

respectivos recém-nascidos, pela técnica de imunofluorescência indireta (IFI);

- Investigar as imunoglobulinas IgM e IgA nos RN quando a sorologia

deles forem maiores do que a titulação de 1.280 ou ter sua concentração de

anticorpos maior do que as de suas mães.

- Avaliar a avidez da IgG nos soros das mães e seus RN, que tiveram

discordâncias nas concentrações de anticorpos quando foi realizada a

comparação entre os pares.

- Investigar o T. gondii no sangue periférico dos RN por meio da técnica

de PCR quando sua concentração de anticorpos estiverem maiores do que os

de sua mãe, ou apresntarem uma baixa avidez da IgG.

- Identificar a infecção congênita entre os filhos de mães congenitamente

infectados.

Métodos


19

4- MÉTODOS

Fluxograma: Esquema da metodologia utilizada no projeto.

Sorologia anti-T. gondii IgM/IgG

Recém-nascidos IgG +

Análise dos prontuários de 1.541 gestantes

com sorologia positiva para

T. gondii– 2010 e 2011

com doença de Chagas100 gestantes com

Toxoplasmose

Abordagem das mães na maternidade –

assinatura do TCLE- Questionário

Coleta de sangue periférico de 230 pares (mães e RN)

39 Pares Mãe e RN’s com

títulos de IgG >1:1.280

PCR Teste de avidez

42 RN com títulos de IgG >

que os títulos da mãe

Acompanhamento sorológico IgA

Métodos

20

4.1- População estuda

O projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética do

Hospital das Clínicas - UFG com o número de protocolo 142/2009 (Anexo I).

Esta tese trata-se de um estudo de coorte em recém-nascidos de

mulheres cronicamente infectadas pelo Toxoplasma gondii, para avaliar a

transmissão vertical da toxoplasmose nesse grupo de mulheres.

Foram escolhidas duas maternidades públicas de Goiânia, uma que é

referência para gestação de risco (Hospital das Clínicas da UFG) e outra que é

referência para as gestações normais (Maternidade Nossa Senhora de Lourdes),

todas essas mulheres fizeram o pré-natal na rede pública de saúde do município

de Goiânia-GO.

Inicialmente foi realizada uma revisão dos prontuários das mulheres cujos

partos foram realizados nas duas maternidades no período de 24/02/2010 a

11/07/2011 no HC e de 29/03/2011 a 06/07/2011 na MNSL. Essa revisão

permitiu encontrar as mulheres que foram identificadas como cronicamente

infectadas pelo teste de screening sorológico realizado na primeira consulta do

pré-natal. Essas pacientes foram buscadas de forma ativa, informadas sobre a

finalidade desse estudo e após assinatura do termo de consentimento livre e

esclarecido, foi coletado o sangue da mãe e seu respectivo recém-nascido (RN),

para confirmação da presença da infecção crônica na puérpera e para

acompanhamento sorológico do RN, na busca de possível infecção congênita.

Os exames sorológicos realizados nos pares (mãe e filho) permitiu

confirmar a infecção crônica na mãe (IgG positiva e IgM negativa) e possibilitou

comparar os títulos de anticorpos da mãe com os do seu RN. Isso levou à

identificação de 39 pares com sorologia considerada elevada pelo método de

Imunofluorescência indireta (IFI) que foi utilizado como ponto de corte o título ≥

1.280 para títulos de IgG específica anti- T. gondii. Esses títulos elevados

levantaram a possibilidade de que a infecção materna pudesse ser recente. Por

isso, realizou-se o teste de avidez da IgG nos pares com a finalidade de

determinar o tempo de duração da infecção materna. Em um grupo de 32 RN foi

realizado o teste de ELISA para pesquisa de anticorpos IgA, marcadores de fase

aguda da infecção. Além disso, 42 RN estavam com títulos maiores do que os

de suas mães, e foram submetidos a pesquisa do parasito através da PCR, no

Métodos

21

seu sangue periférico, para afastar a possibilidade de infecção congênita.

Fizemos o acompanhamento sorológico dos lactentes até o momento que se

pudesse afastar a possibilidade de infecção congênita.

4.2- Dados dos questionários socioeconômicos

Por meio da análise dos questionários (Apêndice I) de 188 mulheres,

considerando apenas as que apresentaram resultados positivos confirmados

para sorologia de IgG para T. gondii e excluindo as que apresentam resultados

negativos e material insuficiente do RN, foi possível analisar os dados sócio-

demográficos e fatores de risco para a toxoplasmose em puérperas em idade

fértil que tiveram seus filhos nas duas maternidades públicas já mencionadas.

4.3- Métodos laboratoriais utilizados na pesquisa:

4.3.1-Diagnóstico sorológico

Imunofluorescência Indireta (IFI)

A metodologia de IFI foi utilizada tanto para confirmação da presença ou

ausência de anticorpos anti- T. gondii quanto para obtenção da titulação final

dos títulos sorológicos encontrados nos pacientes.

O método utilizado foi segundo Camargo 1964 para 460 testes dos pares

mãe e RN para pesquisa as imunoglobulinas IgM e IgG anti- T. gondii.

Elisa

A metodologia de ensaio imunoenzimático (ELISA) foi utilizada para

confirmação da presença ou ausência dos anticorpos anti- T. gondii em 460

amostras provenientes de (mães e RN) coletados nas maternidades.

Foi utilizado o kit Katal® para a realização de todos os testes dos pares mãe

e RN para pesquisa as imunoglobulinas IgM e IgG.

Para a pesquisa de anticorpos IgA anti- T. gondii foi utilizado o kit IBL-

America® para realização de 32 testes no soro dos RN com titulações da IgG

maior do que de suas mães.

Teste de Avidez da IgG

Métodos

22

Selecionou-se para realizar o teste de avidez da IgG 133 amostras.

Dessas totalizaram 65 pares (mãe e RN) e três amostras foram apenas das

mães, todas essas amostras apresentaram pela técnica de IFI altas titulações

sorológicas maiores ou iguais a 1.280 ou os RN apresentaram títulos

sorológiocos maiores do que os de suas mães.

Os testes foram realizados no aparelho ARCHITECT® do laboratório de

Imunologia do HC. O ensaio ARCHITECT TOXO IgG AVIDEZ (ABBOTT

Laboratórios do Brasil LTDA) usado para a determinação da avidez de

anticorpos IgG anti-T.gondii é um imunoensaio quimioluminescente por

micropartículas (CMIA).

A interpretação desses resultados foi de acordo com o indicado na bula do

kit, sendo resultados <50% considerados de baixa avidez, entre 50 – 59,9%

considerados na zona cinza e > 60%, de alta avidez.

4.4-Diagnóstico parasitológico

Foi realizado nos 42 RN que tinham títulos de IgG específica anti- T.

gondii maiores do que de suas mães, ou que apresentaram baixa avidez da IgG.

4.5- Amplificação específica do T. gondii

4.5.1- Extração do DNA do T. gondii

Foi realizada a extração do DNA do sangue de 42 RN utilizando o Kit

comercial Bio Pur®.

4.5.2 – Detecção do T. gondii por PCR

As reações em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas em um

volume final de 25μL contendo 10mM TRIS HCl (pH 9,0), 3,5mM MgCl2, 0,2U de

Taq DNA Polimerase (Invitrogen®), 0,5mM de cada desoxinucleotídeos (dATP/

dTTP/ dGTP/ dCTP, Sigma Chemical Co®., USA), 50 pmoles de cada iniciador

da reação (Invitrogen®) e 2μL de DNA molde, à mistura da reação foram

acrescentados 40μL de óleo mineral (Sigma Chemical Co®. USA). As reações

foram realizadas no termociclador MasterCycler Personal®. O programa de

amplificação foi constituído de uma desnaturação inicial a 94ºC (5 min), 35 ciclos

de desnaturação a 94ºC (1 min), anelamento a 62ºC (1 min) e extensão a 72ºC

(1 min) seguida de extensão final a 72ºC por 10 minutos. Os pares de primers

Métodos

23

utilizados foram: Toxo-T1 (5’-ATG GTC CGC CCG GTG TAT GAT ATG CGA T -

3’), Toxo-T2 (5’-TCC CTA CGT GGT GCC GCA GTT CCT -3’) e Toxo-B5 (5’-

TGA AGA GAG GAA ACA GGT GGT CG-3’), Toxo-B6 (5’-CCG CCT CCT TCG

TCC GTC GTA-3’) (Burg et al. 1989, Cristina et al. 1991). Líquido peritoneal,

sangue e tecidos de camundongos infectados com a cepa RH (Sabin 1941),

foram utilizados como controle positivo e para controle negativo foi utilizado o

sangue de um camundongo jovem não infectado proveniente do biotério do

IPTSP. Os produtos amplificados pela PCR com o tamanho de 110pb foram

visualizados por eletroforese em géis de poliacrilamida a 6% revelados pela

prata (Santos et al.1993).

4.5.3- Acompanhamento das crianças IgG positivas

Entre as 42 crianças que apresentaram títulos de anticorpos da classe

IgG específicos anti- T. gondii maiores que os de suas mães, ou obtiveram baixa

avidez ao teste de avidez da IgG, entre os 188 pares, foi possível o

acompanhamento sorológico de 27.

Resultados


24

5- RESULTADOS

Os resultados serão apresentados na forma de manuscrito.

Foram produtos dessa tese de doutorado dois manuscritos apresentados

a seguir.

ARTIGO 1:

Toxoplasmose crônica em gestantes. Avaliação da prevalência, fatores de

risco e acompanhamento de um grupo de recém-nascidos em Goiânia –

Goiás

ARTIGO 2:

Toxoplasmose - Reativação em gestante de oito meses caso inédito em

Goiás- Brasil

Resultados


25

Artigo 1-

Toxoplasmose crônica em gestantes. Avaliação da prevalência, fatores de

risco e acompanhamento de um grupo de recém-nascidos em Goiânia –

Goiás.

Juliana Boaventura Avelar1 [email protected]

Hânstter Hállison Alves Rezende1 [email protected]

Heloisa Ribeiro Storchilo1 [email protected]

Waldemar Naves do Amaral2 [email protected]

Isolina Rodrigues Xavier3 [email protected]

Mariza Martins Avelino4 [email protected]

Ana Maria de Castro1 [email protected]

1Laboratório de Estudos da Relação Parasito Hospedeiro, Instituto de

Patologia Tropical e Saúde pública, Universidade Federal de Goiás (GO),

Goiânia, Goiás, Brasil.

2Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas,

Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás (GO), Brasil.

3Laboratório clínico do Hospital das Clínicas, Universidade Federal de

Goiás, Goiânia, Goiás (GO), Brasil.

4Departamento de Pediatria e Puericultura da FM/UFG e da Pós-

graduação do Instituto de Patologia Tropical e Saúde pública, Universidade

Federal de Goiás (GO), Goiânia, Goiás, Brasil.

Financiamento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq).

Local onde o trabalho foi desenvolvido: Laboratório de Estudos da Relação

Parasito Hospedeiro, localizado no Instituto de Patologia Tropical e Saúde

Pública da Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil.

Resultados


26

Endereço: Rua 235 - s/n - Setor Universitário - CEP: 74605050 - Goiânia - Goiás

- Brasil Telefones: (62) 3209 6109 - FAX: (62) 3209 6363.

Resumo

Foram estudados 188 pares de RN e suas mães confirmadas como tendo

anticorpos da classe IgG específicos anti- T. gondii em seus componentes

sanguíneos. Desses, 65 pares se mostraram com anticorpos detectados por

Imunofluorescência indireta em títulos ≥ 1.280 dentre esses, 42 tinham títulos de

anticorpos classe IgG maiores do que os de suas mães em uma a cinco

diluições. Nesses RN realizou-se a pesquisa de IgM e IgA específicas anti-T.

gondii e PCR para identificação do DNA do parasito além de testar a avidez da

IgG. Os testes específicos se mostraram negativos a identificação da

toxoplasmose, não tendo sido possível aidentificação da toxoplasmose

congênita em nenhum dos RN. Também o acompanhamento de 27 crianças

mostram que o IgG específico anti-T. gondii identificado em suas correntes

sanguíneas se devem à transmissão transplacentária do anticorpo materno. No

entando, o teste da avidez da IgG mostrou-se baixo em quatro RN (5,8%), mas

não foi possível fazer o controle sorológico tardio dessas crianças.

Palavras-chaves: toxoplasmose, gestação e sorologia.

INTRODUÇÃO

A maioria das infecções causadas pelo T. gondii em humanos são

devidas a ingestão de cistos teciduais em carne crua ou mal cozida, ou através

da ingestão da água ou alimentos contaminados com oocistos esporulados

derivadas do ambiente ou, menos frequentemente, por meio de contato direto

com fezes de felinos presentes no solo. A grande importância das transmissões

por meio de cistos encontrados em tecidos contra oocistos em uma dada

população é desconhecida, exceto no caso de focos com uma fonte de infecção

bem definida (Cook et al. 2000, Jones et al. 2009).

A infecção aguda da toxoplasmose na gestante pode, acarretar o

acometimento fetal, provocando sérias consequências como o abortamento,

retardo de crescimento intra utero, morte fetal, prematuridade e a síndrome da

toxoplasmose congênita – tétrade clássica de Sabin composta por, calcificações

Resultados


27

cerebrais, microcefalia ou hidrocefalia e coriorretinite bilateral (macular ou peri

macular e simétrica) (Sabimn 1941).

Várias alterações clínicas como crises convulsivas só aparecem após a

segunda ou terceira décadas de vida e estudos prévios mostram que 80% das

crianças com infecção subclínica apresentam sequela ocular em algum

momento de sua vida. O fato de nascer sem sintomas não significa, portanto,

que o prognóstico seja melhor (Couvreur et al. 1994, Neves et al. 1994, Mombro

et al. 2003). A severidade do acometimento fetal vai depender da intensidade da

resposta inflamatória que, por sua vez, depende da idade do organismo

invadido, grau de maturidade do sistema imune, da virulência da cepa, do

número de organismos transmitidos da mãe para o filho e do momento da

gestação em que a infecção ocorreu no feto (Meenkel et al. 1995)

Porem quando se trata de mulheres cronicamente infectadas, o

acompanhamento tanto da gestante durante a gravidez como de seu recém

nascido não é valorizado. É importante aperfeiçoar e integrar os serviços

oferecidos às mulheres gestantes por diferentes profissionais de saúde. A falta

de um consenso entre os próprios profissionais que prestam serviços a saúde

dificultam a caracterização dos riscos durante a gestação e o acompanhamento

de exames de pré-natal. Isso influencia, acima de tudo, na capacidade de

monitorar o estado de saúde da criança exposta a uma possível transmissão

vertical da doença (Castilho-Pelloso et al. 2005, Jones et al. 2010).

Nosso objetivo foi avaliar a presença da toxoplasmose congênita em

filhos de mulheres cronicamente infectadas pelo T. gondii.

METODOLOGIA

Seleção da população do estudo

Foram selecionadas mulheres que apresentavam em seus exames de

pré-natal, sorologia positiva para anticorpos anti-T. gondii da classe IgG sem a

presença de IgM. Todas as pacientes foram convidadas a ler e assinar o termo

de consentimento livre e esclarecido (TCLE) do projeto de pesquisa que foi

previamente apreciado e aprovado pelo comitê de Ética do Hospital das Clínicas

da Universidade Federal de Goiás com o número de protocolo 142/2009.

Resultados


28

Foram incluídas na pesquisa 188 pares (mãe e RN) por terem

confirmados a presença de IgG no sangue periférico da puérpera e RN com

ausência de IgM, características da infecção crônica.

Foram excluídas 42 pares: porque a sorologia (+) do teste da APAE para

anticorpos da classe IgG não foi confirmado pelo teste de Imunofluorescência e

ELISA realizadas na mãe após o parto ou também porque a quantidade de

sangue coletada nos RN não foi significante para processar os testes

laboratoriais propostos.

Questionário sócio-demográfico: Após assinatura do TCLE, foi realizado um

questionário com o objetivo de coletar informações sobre as condições de vida

das mulheres e dos fatores de riscos da toxoplasmose que elas estiverem

expostas no dia a dia.

Dados dos questionários socioeconômicos: Foram aplicados questionários

sócio-demográficos para todas as 230 mães que concordaram em participar da

pesquisa. Destes, foram analisados 188, sendo excluídas 34 mães cujo

resultado de IgG foi negativo e 8 cujo material coletado do RN foi insuficiente.

Foi possível analisar os dados sócio-demográficos e fatores de risco para a

toxoplasmose em puérperas em idade fértil que tiveram seus filhos nas duas

maternidades.

Variáveis analisadas: Local de nascimento e residência , idade, coloração da

pele, chefe de família, renda familiar, frequência a assistência pré-natal, doenças

antes da gestação, número de gestações, presença de aborto, paridade,

realização de controle sorológicos em gestações prévias, contato com cão e

gato, ingestão de água filtrada e carne crua e análise do resultado sorológico

para toxoplasmose nessa gestação (screenig pré-natal).

Coleta das amostras: Foi coletado via intravenosa 5 ml de sangue periférico

dos pares mãe e RN para a realização da sorologia, essa coleta foi realizada na

maternidade no mesmo dia do parto.

Sorologia: Os exames sorológicos foram realizados no Laboratório de Estudos

da Relação Parasito Hospedeiro (LAERPH) do Instituto de Patologia Tropical e

saúde Pública (IPTSP) da UFG. Foram realizadas as técnicas sorológicas de

Imunofluorescência Indireta (IFI) e ELISA em todas as amostras coletadas para

confirmação da presença dos anticorpos anti-Toxoplasma gondii da classe IgG:

Resultados


29

foi realizada a técnica de ELISA para pesquisa de anticorpos anti-Toxoplasma

gondii da classe IgA e IgM para confirmação e/ou exclusão de infecção aguda.

Das 230 amostras coletas das mães com resultados positivos registrados

nos prontuários a IgG foi confirmada em 188 (81,7%) e 34 (14,8%) foram IgG

negativas, pelas técnicas sorológicas de IFI e ELISA não foi possível realizar a

sorologia em 8 amostras de RN, pois o material coletado foi insuficiente para a

realização das técnicas sorológicas propostas. A presença de anticorpos IgG foi

confirmada nos 188 RN dessas mães.

Após a finalização das titulações sorológicas, o teste de avidez da IgG foi

realizado em 133 amostras, sendo 65 pares (mãe e RN), e três mães, cujo soros

dos seus RN foi insuficiente As amostras foram divididas em dois grupos,

baseado nos resultados da sorologia para IgG.

Grupo 1: Amostras de 31 pares cujo RN apresentou titulação p IgG >

1.280.

Grupo 2: Amostras de 34 pares cujo RN apresentou titulação p IgG maior

que o de sua mãe.

Teste de Avidez da IgG: Os testes foram realizados no aparelho ARCHITECT®

do laboratório de Imunologia do HC. O ensaio ARCHITECT TOXO IgG AVIDEZ

(ABBOTT Laboratórios do Brasil LTDA) usado para a determinação da avidez de

anticorpos IgG anti-T.gondii é um imunoensaio quimioluminescente por

micropartículas (CMIA).

A interpretação desses resultados foi de acordo com o indicado pelo

fabricante do kit, sendo resultados <50,00% considerados de baixa avidez,

entre 50,00 – 59,90% considerados na zona cinza e > 60,00%, de alta avidez.

Diagnóstico parasitológico: A técnica de escolha para os exames

parasitológicos foi a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A

pesquisa do DNA do parasito foi realizado na camada leucocitária do sangue

dos RN que tinham títulos de IgG específica anti- T. gondii maiores do que de

suas mães.

Foi realizada a técnica de PCR no material de sangue periférico de 42

(22,34%) recém-nascidos oriundos, das duas maternidades, que apresentavam

títulos sorológicos maiores do que os de sua mãe, ou que apresentaram baixa

avidez da IgG no momento do nascimento.

Resultados


30

Amplificação específica do T. gondii

Extração do DNA do T. gondii

A extração do DNA do T. gondii nas amostras de sangue foi realizada

utilizando o Kit comercial Bio Pur®.

Detecção do T. gondii por PCR

As reações em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas em um

volume final de 25μL contendo 10mM TRIS HCl (pH 9,0), 3,5mM MgCl2, 0,2U de

Taq DNA Polimerase (Invitrogen®), 0,5mM de cada desoxinucleotídeos (dATP/

dTTP/ dGTP/ dCTP, Sigma Chemical Co., USA), 50 pmoles de cada iniciador da

reação (Invitrogen®) e 2μL de DNA molde. À mistura da reação foram

acrescentados 40μL de óleo mineral (Sigma Chemical Co®. USA). As reações

foram realizadas no termociclador MasterCycler Personal®. O programa de

amplificação foi constituído de uma desnaturação inicial a 94ºC (5 min), 35 ciclos

de desnaturação a 94ºC (1 min), anelamento a 62ºC (1 min) e extensão a 72ºC

(1 min) seguida de extensão final a 72ºC por 10 minutos. Os pares de primers

utilizados foram: Toxo-T1 (5’-ATG GTC CGC CCG GTG TAT GAT ATG CGA T -

3’), Toxo-T2 (5’-TCC CTA CGT GGT GCC GCA GTT CCT -3’) e Toxo-B5 (5’-

TGA AGA GAG GAA ACA GGT GGT CG-3’), Toxo-B6 (5’-CCG CCT CCT TCG

TCC GTC GTA-3’) (Burg et al. 1989, Cristina et al. 1991). Líquido peritoneal,

sangue e tecidos de camundongos infectados com a cepa RH (Sabin 1941),

foram utilizados como controle positivo e para controle negativo foi utilizado o

sangue de um camundongo jovem não infectado proveniente do biotério do

IPTSP. Os produtos amplificados pela PCR com o tamanho de 110pb foram

visualizados por eletroforese em géis de poliacrilamida a 6% revelados pela

prata (Santos et al.1993).

Acompanhamento das crianças IgG positivas

Após a realização e análise dos resultados dos exames 42/188 (22,3%)

RN foram selecionados para acompanhamento sorológico. Esses RN

apressentaram títulos de IgG maior que o de suas mães ou baixa avidez da IgG.

Entretanto só foi possível realizar a segunda coleta em 27 desses RN.

RESULTADOS:

Coleta das amostras de sangue

230 mulheres aceitaram participar dessa pesquisa e assinaram o TCLE.

Resultados


31

Foram coletadas 104 amostras de sangue periférico das mães e seus RN,

totalizando 208 amostras no período de 24/02/2010 a 11/07/2011 no serviço de

ginecologia e obstétrica do HC e 126 amostras de sangue periférico das mães e

seus respectivos RN, no período de 29/03/2011 a 06/07/2011 na MNSL,

totalizando 460 amostras.

Dessas, 42 amostras foram excluídas, por que a sorologia não foi

confirmada positiva na triagem realizada no LAERPH para T. gondii ou pelo fato

do material do RN ser insuficiente para a realização das técnicas propostas no

projeto.

Perfil sócio demográfico da população

Tabela 1: Perfil sócio-demográfico das maiores frequências encontradas na

análise dos questionários das 188 mulheres gestantes atendidas nas

maternidades do Hospital das Clínicas e Maternidade Nossa Senhora de

Lourdes em Goiânia-GO, nos anos de 2010 e 2011.

HC (85) MNSL (103)

Características Maior Frequencia Nº % Nº %

Naturalidade Goiás 36 42,3 40 38,8

Residência Goiânia 57 67,1 92 89,3

Faixa etária 18 a 25 anos 22 24,4 34 33

26 a 30 anos 29 34,1 31 28,8

Cor Parda 40 47,1 40 38,8

Escolaridade

Ensino fundamental incompleto

30 35,3 37 34,2

Ensino médio completo 26 29 40 38,8

Renda familiar 1 a 2 salários mínimos 65 76,5 71 68,9

Responsável pela renda

Não 60 70,6 66 64,4

Legenda: HC- Hospital das Clínicas, MNSL- Maternidade Nossa Senhora

Lourdes, N- número de pacientes.

Não se observou diferenças entre as mulheresatendidas nas duas

maternidades no tocante a naturalidade, cor da pele, residência em Goiânia,

trabalho fora e renda família. No entanto, as mulheres atendidas na MNSL

tinham menor idade e maior grau de escolaridade.

Observou-se que aproximadamente 40% das pacientes eram naturais de

Goiânia-Goiás, enquanto (60%) nasceram em outros estados do Brasil.

Resultados


32

As mulheres atendidas na maternidade do HC apresentaram a média de

idade de 28 anos, 47,1% eram pardas, 35,3% estudaram apenas o ensino

fundamental, 67,1% viviam em Goiânia, 76,5% viviam com renda familiar de 1 a

2 salários mínimos, 76,5 % não trabalhavam para sustentar a sua casa. Em

relação aos antecedentes obstétricos 37,6% possuiam dois filhos. 80% fizeram

todas as etapas do pré-natal, 30,6% disseram estar em sua primeira ou segunda

gestação, 75% nunca tiveram abortos espontâneos e 81% nunca fizeram

curetagem, 75,3% fizeram exames sorológicos nas gestações anteriores.

Quanto aos aspectos epidemiológicos 75,3% tiveram contato com cães, 58,8%

não tiveram contato com gatos. 65,8% consumiam água filtrada e 64,7% das

pacientes não consumiam carne crua, de espécie alguma.

As mulheres atendidas na maternidade MNSL apresentaram a média de

idade de 22 anos, 38,8% eram pardas, 38,8% tinham o ensino médio completo,

89,3% viviam em Goiânia, 71% viviam com uma renda familiar de 1 a 2 salários

mínimos, 64% não trabalham para sustentar a sua casa. Em relação aos

antecedentes obstétricos 32% possuem um filho. 91,2% fizeram todas as etapas

do pré-natal, 28,1% disseram estar em sua primeira ou segunda gestação,

75,7% nunca tiveram abortos espontâneos e 76% nunca fizeram curetagem,

56,3% fizeram exames sorológicos nas gestações anteriores. Quanto aos

aspectos epidemiológicos 54,4% disseram ter contato com cães e 65,0%,

disseram não ter contato com gatos. 65,0% consumiam água filtrada e 79,6%

não consumiam carne crua. Em relação ao conhecimento especifico sobre

toxoplasmose 79,6% alegaram não ter conhecimento nenhum sobre essa

enfermidade e 80% de todas as mulheres disseram não ter sofrido aborto

causado por parasitos.

A escolaridade das mães com gestação de risco foi menor que as

mulheres com gestação não complicada, e em 65% das mulheres que pariram

no HC, a renda familiar era variável de um a dois salários, o mesmo

acontecendo com 71% das mulheres na MNSL.

Resultados


33

Tabela 2: Antecedentes obstétricos das maiores frequências encontradas na

análise dos questionários das 188 mulheres gestantes atendidas nas

maternidades do Hospital das Clínicas e Maternidade Nossa Senhora de

Lourdes em Goiânia-GO nos anos de 2010 e 2011.

HC (85) MNSL (103)

Características Maior

Frequencia Nº % Nº %

Nº gestações 1 ou 2 26 30,6 29 28,1

Nº partos 1 ou 2 28 32,9 33 32

Nº abortos Nenhum 67 78 78 75,7

Nº curetagens Nenhum 69 81,2 76 73,8

Pré-natal

Gestações anteriores

64 75,3 58 56,3

Gestação atual 68 80 94 91,2

Doença durante a gestação

Atual 44 51,7 56 54,3

Anterior 49 54,5 43 39,9



Observou-se que 91% das mulheres atendidas na MNSL realizaram o

pré-natal, mas apenas 56,3% fizeram sorologias em gestações anteriores. Já no

HC, 20% das mulheres não fizeram pré-natal, mas 75,3%fizeram controle

sorológicoem gestações anteriores. As mulheres tinham tido entre um e dois

filhos, aproximadamente 50% tiveram alguma intercorrência durante a gestação.

51,7% (44/85) das mulheres atendidas no HC não referiram

intercorrências na gestação, embora tenham sido triadas para uma maternidade

de atenção terciária e 54,3% (56/103) das mulheres atendidas na MNSL tiveram

de baixo risco. 1/3 das mulheres tinham tido entre uma e duas gestações. A

maioria (78%) não relatou aborto em gestações anteriores e 75,3% das

mulheres atendidas no HC realizaram sorologia em gestações anteriores.

Resultados


34

Tabela 3: Fatores de risco para a infecção toxoplásmica das maiores

frequências encontradas na análise dos questionários das 188 mulheres

gestantes atendidas nas maternidades do Hospital das Clínicas e Maternidade

Nossa Senhora de Lourdes em Goiânia-GO, nos anos de 2010 e 2011.

HC (85) MNSL (105)

Características Maior frequência

N % N %

Contato com animais

Gatos 50 58,8 67 65

Cães 64 75,3 56 54,4

Alimentação Consumo de carne crua

55 64,7 82 79,6

Consumo de água filtrada

56 65,8 67 65

Conhecimento prévio

Toxoplasmose 73 85,8 82 79,6

Aborto causado por parasitos

73 85,8 74 71,8



Quanto ao contato com os fatores de risco de tranmissão do T. gondii

observou-se que: 75,3% das mulheres atendidas na maternidade de referência

(HC) tiveram contato com cães; 58,8% não tiveram contato com gatos, 65,8%

consumiam carne crua. Já as mulheres atendidas na maternidade de baixo risco

(MNSL) tiveram menos contato com cães 54,4%, 65% não conviviam com gatos,

65% consumiam água filtrada e 79,6% não consumiam carne crua.

A maioria das mulheres não referiu contato com animais, bebia água

filtrada e não comiam carne crua. Porém, 77,5% das mulheres questinadas não

haviam tido qualquer informação sobre a toxoplasmose durante o pré-natal.

Comparação sorológica dos pares

Foi possível indentificar a presença dos anticorpos anti- T. gondii entre os

188 pares pode ser observado na figura 2. A partir da confirmação da presença

dos anticorpos IgG anti -T. gondii realizou-se a técnica de IFI para cada amostra

até a titulação final, sendo as maiores frequências encontradas nas titulações de

320 e 640. As concentrações estão dispostas na figura 3.

Resultados


35

Figura 2: sorologia para IgG realizada nas amostras de sangue coletadas nas

mães e RN nas maternidades do Hospital das Clínicas nos anos de 2010 e 2011

e na Maternidade Nossa Senhora de Lourdes no ano de 2011. N: número

absoluto de pacientes.

Resultados


36

Figura 3: Frequência dos títulos de anticorpos anti-Toxoplasma gondii (IgG)

detectados pela reação de Imunofluorescência Indireta, em 188 amostras de

sangue coletados de mães cronicamente infectadas pelo Toxoplasma gondii e

seus respectivos recém-nascidos, oriundas da maternidades do Hospital das

Clínicas nos anos de 2010 e 2011 e na Maternidade Nossa Senhora de Lourdes

no ano de 2011.

Teste da IgA

Não foi possível encontrar nenhuma amostra com sorológia positiva para

os anticorpos anti -T. gondii da classe IgA.

Teste de avidez da IgG

Dos 34 pares cujo RN apresentaram os títulos de IgG maiores do que de

suas mães, as diferenças sorológicas foram de 1 a 5 títulos a mais, sendo 22/34

(64,7%) com um título sorológico maior do que de sua mãe,

8/34 (23,5%) com dois títulos sorológicos maior do que de sua mãe, 4/34

(11,8%) com três ou mais títulos sorológicos maior do que de sua mãe.

Em apenas quatro amostras (5,88%) foi possível detectar a baixa avidez,

ou seja, com valores inferiores a 50,00%, mas não foi possível o

acompanhamento dos suspeitos e identificação do T. gondii.

Técnica de PCR

Não foi possível detectar a presença de fragmentos do DNA do parasito

em nenhuma das amostras analisadas.

Acompanhamento das crianças IgG positivas

Resultados


37

Foi realizada busca ativa das crianças IgG positivas, em suas residências

em 27 crianças com idade entre 8 a 11 meses. Do material coletado foi

realizada, pela técnica de IFI, uma nova sorologia. Nessa nova sorologia não foi

possível detectar a presença de anticorpos anti- T. gondii, ou seja, o resultado

sorológico foi negativo para todos os RN.

DISCUSSÕES

Entre as gestantes atendidas nas duas maternidades 65,6% tiveram

contato com cães e 61,9% não tiveram contato com gatos durante a gestação.

Uma pesquisa recente em Divinópolis MG demonstrou que o contato direto com

roedores e felinos apresentam uma correção significativa com a presença de

imunoglobulinas IgG em mulheres em idade fértil, sendo que 77% dessas

mulheres eram responsáveis pela limpeza diária das caixas de areia de seus

animais (Fonseca et al. 2012). Em um estudo realizado nos Estados Unidos

Wong & Remington (1994) entrevistando-se mães com seus recém-nascidos

acometidos por toxoplasmosecongênita, 52% referiam exposição a fezes de

gato.

As mulheres atendidas na maternidade de baixo risco tinham menor

idade, mais escolaridade e 91,2% realizaram a assistência pré-natal. No entanto,

apenas 56,3% fizeram controle sorológico nas gestações prévias. Já entre as

gestantes atendidas na maternidade de referência para as gestações de risco,

20% não fizeram pré-natal, mas 75,3% fizeram controle sorológico em

gestações anteriores.

Quando foram analisados os hábitos de vida das entrevistadas 72,15%

das mulheres não consumiam carne crua, de espécie alguma. Alguns estudos

apontam os hábitos alimentares como fator de risco para aquisição do T. gondii

(Amato-Neto et al. 1995). Remington et al. 1995 referem que a toxoplasmose

pode ser transmitida pela ingestão de carne crua ou mal cozida, principalmente

de porco ou carneiro. As gestantes devem evitar comer carne mal cozida,

precisam lavar as mãos depois de manipular a carne crua, evitar beber água não

filtrada e leite não pasteurizado, bem como alimentos expostos a moscas,

baratas, formigas e outros insetos. Frutas e legumes devem ser sempre bem

lavados. O contato com gatos e solo deve ser evitado no período gestacional, ou

pelo menos, devem ser usadas luvas no manuseio de materiais de jardinagem,

Resultados


38

potencialmente contaminados com fezes de gatos (Tenter 2009, Fonseca et al.

2012).

Chama atenção no estudo, o fato de 53,2% das mulheres terem relatado

doença durante a gestação, independente da complexidade da atenção ao parto

nas mães.

Apesar de vários artigos relatarem casos esporádicos da transmissão

congênita em mulheres cronicamente infectadas pelo T. gondii (Pons et al. 1995,

Vogel et al. 1996, Silveira et al. 2003, Kodjikian et al. 2004, Garweg et al. 2005,

Bachmeyer et al. 2006, Fernandes et al. 2009, Andrade et al. 2010, Gavinet et

al. 1997, Elbez-Rubinstein et al. 2009). Não foram identificados estudos em

mulheres IgG positivas, o que incentivou o estudo prospectivo em um grupo de

mulhers cronicamente infectadas e seus recém-nascidos, em duas maternidades

publicas da cidade de Goiânia no Estado de Goiás.

O materiall coletado e utilizado na pesquisa foi possível constatar a

presença da IgG específica anti -T. gondii (sem IgM) em 51,9% das amostras

oriundas do HC e de 42,3% das mulheres oriundas da MNSL. Esses dados

diferem dos encontrados por Philocreon em 1976 que encontrou em Goiânia

uma prevalência de 63,5% e Avelino et al. (2003) e Satori et al (2011) que

encontraram prevalências de 65,8% e 63,5%, respectivamente.

Outros estudos realizados no Brasil mostraram valores bastantes

variáveis dependendo da região geográfica como 67,4% na região metropolitana

de São Paulo-SP (Vaz et al. 1990), 58,8% no Hospital das Clínicas em São

Paulo-SP (Pedreira 1995), 69,4% em Recife-PE (Nóbrega 1998), 55%em

Bragança Paulista-SP (Brisighelli 1998), 59% em Porto Alegre-RS (Varella et al.

2003), 60,4% em Campinas- SP (Stella 2004), 69,3% em Sergipe (Inagaki et al.

2009) e 43,9% em Alagoas (Pinheiro et al. 2009).

A média de idade das pacientes desse estudo foi de 22 anos. Em relação

à idade, a prevalência de anticorpos anti- T. gondii é diretamente proporcional à

idade da população, indicando que a infecção é adquirida ao longo da vida.

Assim, a frequência de soropositividade é maior em faixas etárias mais elevadas

(Wong & Remington 1994, Inagaki et al. 2009). Os dados desse estudo mostram

que a maior prevalência de anticorpos anti -T. gondii foi encontrada na faixa

etária de 25 a 30 anos nas pacientes oriundas do HC (34,1%) e 18 a 25 anos

(33%) nas pacientes oriundas da MNSL.

Resultados


39

Observou-se que 14,8% das mulheres que foram consideradas como

imunes ao T. gondii no momento do screening no pré-natal, não tiveram

confirmação pelas tecnicas utilizadas, sendo consideradas soronegativas. Essas

mulheres não foram conscientizadas sobre a possibilidade de adquirirem

toxoplasmose durante a gestação. Avelino (2003) salienta que a genstante tem

8,6% de probabilidade de soroconverter durante a gestação. De acordo com os

dados apresentados neste trabalho em torno de 50% das gestantes estão sob

este risco. Esse fato, aliado à possibilidade de reativação da infecção

protozoária durante a gestação (em função da deficiência imune própria da

gestação), reforçam a necessidade de ampliação das medidas de prevenção

primária para todas as mulheres, independente de seu estado imune contra a

toxoplasmose durante a gestação, uma vez que a mesma pode ser

acompanhada de redução considerável da infecção aguda na gestante (Foulon

1992).

A comparação dos títulos sorológicos da mãe com seu RN pela técnica de

imunofluorescência indireta permitiram segregar um grupo de crianças com

títulos sorológicos de IgG maiores do que de suas mães. Essas crianças foram

acompanhadas ao longo de seu desenvolvimento, até que se pudesse afastar a

toxoplasmose congênita. Esse acompanhamento foi conseguido em 27 crianças

e todas apresentaram negativação dos títulos de anticorpos, provando que sua

presença era devida à transmissão placentária de anticorpos maternos. Quando

o diagnóstico da toxoplasmose congênita tiver que ser definido com base em

dados sorológicos, é necessário analisar ao menos duas amostras de soro de

gestantes coletadas com intervalo de duas a três semanas e, do RN ao

nascimento. Os títulos de anticorpos da mãe e do RN devem ser comparados,

além do acompanhamento clínico, oftalmológico, dessa criança por no mínimo

12 meses (Remington et al. 2001). Na ausência de sinais clínicos, o caso de

toxoplasmose congênita pode ser definido quando evidenciado persistência de

títulos de IgG detectáveis por mais de 12 meses (Gilbert & Gras 2003).

A detecção de anticorpos IgM ou IgA para o T. gondii no feto ou RN, nos

primeiros dias de vida, geralmente é compatível com o diagnóstico de infecção,

na ausência de contaminação do sangue fetal ou do bebê com o sangue

materno. Este resultado deve ser repetido após três a quatro dias (Remington et

al 2005). Foi realizada a pesquisa de IgA no soro das crianças que pareciam

Resultados


40

suspeitas de terem adquirido a infecção por apresentarem seus títulos

sorológicos maiores do que de suas mães, porém não foi possível detectar essa

imunoglobulina em nenhum soro desses recém-nascidos.

A avaliação do tempo de infecção das gestantes e dos RN pela técnica de

Avidez da IgG, foi realizada em um grupo de 65 pares (Mãe e RN). Nesse grupo

foi possível verificar baixa avidez da IgG em apenas quatro pares (5,88%),

indicativo de infecção recente com o T. gondii. Esses anticorpos IgG de baixa

afinidade são produzidos no início da resposta imune primária e, ao longo do

tempo, são selecionados os clones de linfócitos B produtores de IgG de elevada

afinidade. Uma avidez em níveis baixos significa infecção aguda, num período

inferior a quatro meses (Ashburn et al. 1998, De Carli 2001, Liesenfeld et al.

2001, Spalding et al. 2003, Varella et al. 2003). Não foi possível fazer uma

segunda coleta das mães e dos RN que apresentaram a baixa avidez pelo fato

de não ter sido possível localizá-los.

O método parasitológico da PCR para pesquisa do T. gondii foi usado em

42 amostras de RN com titulação maior ou igual 1.280 ou com titulações de IgG

maiores do que os de suas mães. Mas não foi possível encontrar o DNA do

parasito em nenhuma das amostras. A PCR é uma técnica que apresenta uma

boa sensibilidade e especificidade. Apresenta vantagens por utilizar diversos

materiais biológicos, requerendo pouca quantidade de amostra (Foulon et al.

1990).

Um estudo realizado na Bélgica propôs-se que a realização ou não de

exames sorológicos para a toxoplasmose deve ser sempre ser acompanhada da

prevenção primária, dependendo da importância da toxoplasmose congênita

como problema de saúde pública, de acordo com a realidade da região (Foulon

1992). Foi possível verificar claramente que mais de 80% das pacientes

participantes da pesquisa não conhecia a doença em questão e não tiveram

informações por parte de profissionais da saúde sobre como prevenir o seu

contágio. Tal fato já foi observado em outras pesquisas realizadas no Brasil

(Fonseca et al. 2012, Carrellos et al. 2008).

CONCLUSÕES

A prevalência da IgG para toxoplasmose entre as gestantes atendidas no HC

foi de 51,9% e na MNSL foi de 42,3%.

Resultados


41

Não foi encontrado IgM específica anti- T. gondii (indicador de fase aguda,

reativação e/ou reinfecção) nas mulheres cronicamente infectadas e em seus

RN, atendidas nas duas maternidades públicas de Goiânia.

Não foi encontrado IgA específica anti- T. gondii (indicador de fase aguda da

infecção) nos RN das mulheres cronicamente infectadas, atendidas nas duas

maternidades públicas de Goiânia.

Pela técnica de Avidez da IgG foi possível idenficar um grupo de quatro

pares (mãe e RN), porém não foi possível fazer o acompanhamento sorológico

nesses oito pacientes por dificulades em localizá-los.

Não se detectou o T. gondii por PCR nas amostras sanguíneas dos RN

suspeitos de toxoplasmose congênita.

Os títulos de anticorpos da classe IgG nos suspeitos de toxoplasmose

congênita tornaram-se negativos antes de um ano de vida, provando-se tratar de

transmissão de anticorpos maternos.

De acordo com os dados coletados nos questionários, nos chama atenção o

fato de que a população que faz e recebe atendimento pré-natal na cidade de

Goiânia-GO esta sendo pouco informada sobre as formas de prevenção da

toxoplasmose, favorecendo assim o contato dessa paciente com o agente

etiológico.

Não foi confirmado caso de toxoplasmose congênita entre os filhos das

gestantes cronicamente infectadas pelo T. gondii.

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Resultados


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Artigo 2:

Toxoplasmose - Reativação em gestante de oito meses caso inédito

em Goiás- Brasil

Reactivation of toxoplasmosis during the eighth month of gestation:

an unprecedented case from Goiás, Brazil

Juliana Boaventura Avelar1 [email protected]

Hânstter Hállison Alves Rezende1 [email protected]

Heloisa Ribeiro Storchilo1 [email protected]

Roberta Rassan de Lima Candido1 [email protected]

Waldemar Naves do Amaral2 [email protected]

Mariza Martins Avelino3 [email protected]

Ana Maria de Castro1 [email protected]

1Laboratório de Estudos da Relação Parasito Hospedeiro, Instituto de

Patologia Tropical e Saúde pública, Universidade Federal de Goiás (GO),

Goiânia, Goiás, Brasil.

2Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas,

Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás (GO), Brasil.

3Departamento de Pediatria e Puericultura da FM/UFG e da Pós-

graduação do Instituto de Patologia Tropical e Saúde pública, Universidade

Federal de Goiás (GO), Goiânia, Goiás, Brasil.

Financiamento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq).

Local onde o trabalho foi desenvolvido: Laboratório de Estudos da Relação

Parasito Hospedeiro, localizado no Instituto de Patologia Tropical e Saúde

Pública da Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil.

Resultados


48

Endereço: Rua 235 - s/n - Setor Universitário - CEP: 74605050 - Goiânia - Goiás

- Brasil Telefones: (62) 3209 6109 - FAX: (62) 3209 6363.

ABSTRACT

PURPOSE: This is an unprecedented case of congenital toxoplasmosis with

evolution to fetal death during the eighth month of gestation. METHODS: a case

from a pregnant woman followed-up in the Hospital das Clinicas, Federal

University of Goiás, Brazil. RESULTS: By the seventh month of the patient’s

pregnancy all results from prenatal tests were normal. However, in the 33rd

week, during ultrasound, fetal impairment with hydrocephaly and heart disease

were disclosed. Amniocentesis was then performed and from the amniotic fluid,

serological tests, PCR and experimental inoculation into mice were carried out.

Inoculated mice exhibited clinical signs consistent with T. gondii infection on the

9th day post-infection and parasite presence was confirmed by PCR both in the

amniotic fluid of the patient and in the peritoneal exudate of infected mice. At

approximately 36 weeks of gestation the patient underwent ultrasound and fetal

death was detected. Besides traditional serology, an IgG avidity test from the

mother’s peripheral blood yielded a result of 69.7%, demonstrating high avidity.

CONCLUSIONS: The occurrence of this case draws attention to the need for

monitoring chronically infected pregnant women because reactivation can occur

at any gestational age, causing serious damage to the fetus, and/or fetal death,

even after the second trimester of pregnancy.

KEYWORDS: Congenital toxoplasmosis, amniotic fluid, diagnosis, reactivation

and pregnancy.

Resultados


49

RESUMO

OBJETIVO: Apresentar um caso inédito de toxoplasmose congênita com

evolução a óbito fetal no oitavo mês de gravidez. MÉTODOS: a paciente foi

acompanhada no Ambulatório de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das

Clínicas da Universidade Federal de Goiás em Goiânia-Goiás. RESULTADOS:

Até o sétimo mês todos os exames do pré-natal foram considerados normais.

Na 33a semana, durante ultrassonografia foi observado acometimento fetal,

com hidrocefalia e cardiopatia, sendo realizado amniocentese. Do líquido

amniótico foi realizado exames sorológicos, PCR e inoculação experimental. Os

camundongos apresentaram sinais clínicos compatíveis com a infecção pelo T.

gondii no 9° dia pós-infecção, a presença do T. gondii foi confirmada no Líquido

amniótico da paciente e no exsudato peritoneal do camundongo infectado,

detectada pela PCR. Aproximadamente com 36 semanas de gestação a

paciente realizou nova ultrassonografia e foi detectado óbito fetal. Além da

sorologia tradicional, foi realizado o teste de Avidez da IgG do sangue periférico

da mãe revelou-se com 69,7%, caracterizando alta avidez, infecção crônica

tardia. CONCLUSÃO: A ocorrência desse caso chama a atenção para

necessidade de acompanhamento das gestantes cronicamente infectadas, pois

a reativação pode acontecer em qualquer idade gestacional, causando sérios

danos ao concepto, e/ou óbito fetal, mesmo após o segundo trimestre da

gestação.

PALAVRAS- CHAVE: Toxoplasmose congênita, líquido amniótico, diagnóstico,

reativação e gestação.

Resultados


50

INTRODUCTION

Toxoplasmosis is an infection caused by the protozoan parasite

Toxoplasma gondii, which is generally asymptomatic and self-limited. However,

it can cause serious damage to the fetus, such as mental retardation,

chorioretinitis and even death, when it occurs during pregnancy1,2,3.

Prenatal care is mainly associated to prevention, since during pregnancy, it

becomes possible to detect pathologies that may interfere with the physical and

psychological well-being of both mother and baby. Consequently, steps can be

taken to avoid forthcoming problems for the baby. It is well established that good

quality prenatal care efforts are critical to both maternal and newborn health4.

Verbal or written orientations in public health centers about prenatal preventive

measures and routine serologic monitoring are important measures of

prevention, and allow identifying cases of acute infection in pregnant women. If

such measures are standardized, there can be a reduction in cases of

congenital infection and the possibility of early treatment with a better prognosis

for newborns5,6.

The congenital form of toxoplasmosis is usually a consequence of acute

infection in pregnant women with subsequent fetal infection via transplacental

transmission. The risk of transmission increases as pregnancy progresses, but

the disease is more severe when transmission occurs during the first trimester.

In this case, the infection can cause miscarriage, stillbirth, prematurity or severe

fetal disease at birth. After the second quarter, toxoplasmosis tends to manifest

with late sequelae, especially with ocular injuries7,8,9.

Resultados


51

There are several reports in the literature of women chronically infected

with T. gondii that had reactivation of infection during pregnancy and the

parasite transmitted to their children10,17.

The acute relapse during pregnancy leads to different consequences

depending on the degree of exposure of the fetus to Toxoplasma, the virulence

of the strain, the gestation period of occurrence of the acute relapse, the

immunity of the pregnant woman, the placenta, the fetus and the intensity of

fetal inflammatory response18. Abortions by reactivation of toxoplasmosis are

also frequent19. Additionally, patient reinfection with a different strain of T.

gondii, with serious harm to the fetus has also been described20,21.

The prevalence and incidence of toxoplasmosis in pregnant women vary

greatly from one country to another, and between regions within the same

country22. In Brazil, epidemiological surveys have shown a high prevalence,

ranging between 40 and 90%23,24,4. In Goiânia, a prevalence of 48.6% was

reported in the general population25 and 67.7% of pregnant women had contact

with the parasite26.

The prevention of congenital toxoplasmosis will depend on primary

prophylaxis of seronegative pregnant women and early diagnosis of maternal

infection. Consequently, serological screening for anti-T. gondii antibodies

should always be part of all prenatal exams because it may provide important

clues about the immunological condition of the mother and/or her infection

status27,13,28.

The aim of this paper is to report a novel case of congenital toxoplasmosis

with unusual fetal development, accompanied at the Clinic of Obstetrics and

Resultados


52

Gynecology, Hospital das Clinicas (HC), Federal University of Goiás in Goiânia-

GO.

METHODS

Case description

SCS (coded), 33, female, black, resident in Rio Pires in the state of

Goiás. She studied until the 7th year of elementary school, she is married, with a

family income between one and two minimum wages, with three previous

pregnancies, three deliveries and no cases of abortion (G3P3A0) (all of her

deliveries occurred through cesarean section), the latter being a stillborn birth

caused by a contagious infectious disease, probably toxoplasmosis.

The patient reports that during the third pregnancy she had no direct

contact with cats, but that her next door neighbor had several. Furthermore, she

had contact with dogs, drank filtered water and denied having eaten raw or

undercooked meat. During all prenatal care visits in the Public Health System,

the patient stated she did not receive any information about toxoplasmosis

prophylaxis.

In the first serological test, at around the 5th week of gestation, the patient

underwent blood collection on filter paper for carrying out of “Mommy Test” in her

home town. In the State of Goiás, practitioners in primary public health care have

a routine whereby in the first prenatal consultation, an identification card is filled

and peripheral blood samples are collected on filter paper (S & S 903). The

sample is later sent to a state laboratory, where it is processed and evaluated for

the presence of anti-IgG and anti-IgM T. gondii antibodies using the commercial

kits Q-Preven Toxo IgG - DBS-Q® and Preven Toxo IgM - DBS® 26. The

reference values adopted for interpretation of results are of IgG> 10.0 IU / ml for

Resultados


53

reactivity and of <10.0 IU / ml for both non-reactive IgG and IgM. At that time she

was shown to have IgG antibodies for toxoplasmosis, rubella and

cytomegalovirus infection and tested negative for other diseases, including HIV.

The first, second and third uterine ultrasound were performed at approximately

15, 18 and 22 weeks pregnancy, respectively, with normal results.

However, results of the fourth test taken at ± 33 weeks displayed signs of

hydrocephaly and fetal heart disease, and consequently, the patient was moved

to a ward in the “Hospital das Clinicas” (HC) in Goiânia where high risk

pregnancies are monitored. After consultation with the medical staff of HC,

amniocentesis was carried out and amniotic fluid was referred for serology and

parasitological analyzes in the Laboratory for the Study of Host-Parasite

Relationships (LAERPH) at the Institute of Tropical Pathology and Public Health

(IPTSP) of the Federal University of Goiás (UFG).

The patient received no specific treatment at first because clinicians

awaited test results from the amniotic fluid. In the following week the patient felt

sick and was taken to the municipal hospital of her home town, Pires do Rio,

where a uterine ultrasound disclosed fetal death. The patient then underwent

cesarean delivery for withdrawal of the stillbirth child. We did not have access to

either the child’s biological material or the placenta, for histological and

serological analyzes. After this, the patient returned to Goiânia were medical

consultation was carried out and blood was collected for new serological tests

for detection of anti-T. gondii antibodies and an IgG avidity test, because the

latter had not been performed during the prenatal period.

Resultados


54

Laboratory data:

An aliquot of 20 ml of amniotic fluid (AF) was withdrawn by amniocentesis

by team doctors at HC and sent in a sterile syringe to the LAERPH IPTSP UFG,

where it was analyzed by parasitological and immunological diagnostic

techniques. This study is part of a research project that was approved by the

Ethics Committee of the HC- UFG, with protocol number 142/2009.

An Indirect Immunofluorescence Assay29, was performed for detection of

anti- T. gondii antibodies, with T. gondii tachyzoites being maintained through

periodic replication in the RH mice strain30. The AF was added to the test plate

at a dilution of 9% in saline solution under a 1:10 proportion, and subsequently

the material was serially diluted at a ratio of two. After incubation at 36 °C, the

conjugate was added at a dilution of 1:200 for IgM and 1:400 for IgG-fluorescent

antibodies specific for human immunoglobulin (IgG and anti-IgM, Biomerieux ®)

and the plate was again incubated at 36 °C. The presence of antibodies to AF

was observed by fluorescence microscopy. The endpoint titer was determined

by the AF of the last dilution where fluorescence was still detected, with

reference values of IgG >1:10 and IgM >1:5.

The avidity test was performed in the patient’s serum after the baby’s loss

in order to assess whether the infection was recent or old. The test was

performed using the ARCHITECT instrumentation. The TOXO IgG GREED

(ABBOTT Laboratories LTDA Brazil) ARCHITECT assay was used for the

determination IgG antibody avidity to T. gondii is a chemiluminescent

immunoassay for microparticles (CMIA). Results were interpreted as indicated

by the manufacturer, whereby results of <50% are considered low avidity, results

Resultados


55

between 50.0% to 59.9% are considered in the gray zone and results above

60% are considered high avidity.

The experimental inoculation of AF was done in order to confirm or

discard the presence of T. gondii and to isolate the strain. The sample was

inoculated intraperitoneally into a group of three isogenic BALB/c female mice

from the animal colony of UFG-IPTSP, with approximately 30 days of age. After

Inoculation (AI), the animals were monitored daily. On the ninth day, evidence of

clinical symptoms, such as lethargy and chills, was observed. Peritoneal

washing was then performed with 0.9% saline solution in order to search for T.

gondii tachyzoites. The animals were killed by cervical dislocation and both

peripheral blood and brains were collected for confirmation or exclusion of

infection by a serological technique and PCR. The peritoneal exudates and

macerated brain were diluted in 0.9% saline solution and freshly examined

under a light microscope for detecting tachyzoites or cysts, respectively.

DNA extraction: DNA was extracted from 200µl of mouse peritoneal

exudate, using the commercial kit Biopur®, with extraction always done in

duplicate and in parallel with positive controls (peritoneal washing of BALB/c

mice with tachyzoites of the RH strain) and negative controls (peritoneal fluid of

uninfected BALB/c mice).

Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed in a final volume of

25μL, containing for each reaction: 17.3 µl of H2O, 1.0 µl MgCl2, 2.5 µl buffer,

0.5 µl MIX, 10mM dNTP's (Promega®), 0.5µl of primers B5 and B6 to 25 pmol,

0.2µl Taq DNA Polymerase (Invitrogen) and 2.5µl of DNA. The reactions were

run in a Mastercycler personal thermocycler Eppendorf®. The amplification

program was as follows: initial denaturation at 94 °C (5 min), 94 °C (1 min),

Resultados


56

annealing at 55 °C (1 min) and extension at 72 °C (1 min), repeated for 35

cycles, followed by a final extension step at 72 °C for 10 minutes. The primer

pair used was: Toxo-B5 (5'-TGA AGA GAG GAA ACA GGT GGT CG-3 ') and

Toxo-B6 (5'-CCG GCT CCT CCT TCC GTA GTC-3'). The amplified PCR

products were separated by electrophoresis in 6% polyacrylamide gels and

visualized after silver staining31.

Etchical considerations

The Ethical Committee of Hospital das Clínicas, granted ethical approval

for this study. Written informed consent was obtained from this patient.

RESULTS

The patient presented with a positive IgG result greater than 200 IU / ml

and non-reactive IgM (this serology was performed in the first trimester). The

clinician responsible for monitoring the patient during the prenatal period did not

solicit new serological tests for toxoplasmosis during pregnancy, following the

guidance of the Ministry of Health for routine prenatal care.

Early in the third quarter, routine ultrasound examination identified fetal

abnormalities (heart disease and hydrocephalus).

In the amniotic fluid collected by amniocentesis, the presence of anti-T.

gondii IgG with an end titration of 1:2.560 and non-reactive IgM <1:5 were

detected. PCR from amniotic fluid DNA was performed and produced a positive

result represented by a gel band of approximately 110 bp.

High IgG avidity (69.7%) was detected in the patient’s peripheral blood.

In mice inoculated with amniotic fluid, clinical signs consistent with

infection by T. gondii were observed on the 9th day post-infection, when the

animal presented with chills and lethargic movements. Peritoneal washing was

Resultados


57

performed, revealing multiple T. gondii tachyzoites, a result which was

subsequently confirmed by PCR. In addition, in different mice of the same

experimental group inoculated with amniotic fluid, blood was harvested by

cardiac puncture and the serum was separated for examination by IFA, revealing

positive for IgM and IgG. PCR on the peritoneal washing also produced positive

results.

DISCUSSION

Reported cases of congenital transmission of toxoplasmosis resulting

from reactivation of chronic infection in immunocompetent pregnant women have

been linked to a possible reduction of the host cell response during pregnancy32.

A disturbance in the immunological balance might interfere with parasite control

and thereby have an impact on the clinical course and on the risk of disease

transmission to the fetus13.

Congenital transmission is rare in chronically infected immunocompetent

individuals, but it is known that under a congenital infection scenario, the

possibility of toxoplasmosis cannot be excluded on the basis of data from prior

maternal immunity and should be investigated rapidly, given the urgency of

appropriate treatment33. This is because pregnancy is already manifested as a

natural state of immunosuppression, facilitating reactivation, as was probably the

case of the present study21,17.

The avidity test from patient’s blood collected in the third trimester of

pregnancy revealed that she had high IgG avidity, characteristic of an old

infection. The IgG avidity test is a good marker of acute T. gondii infection in

pregnant women and allows telling whether an infection is old or new when

carried out in the first quarter. This test is based on the increase in the functional

Resultados


58

affinity between antigen and anti-T. gondii antibody. Pregnant women with high

avidity are deemed to have acquired the infection for about four months prior or

more. IgG antibodies present low avidity during the acute phase of infection,

increasing along time, and thus facilitating the identification of both acute and

chronic cases34.

Congenital infection due to reactivation of retinochoroiditis during

pregnancy took place in an immunocompetent mother with chronic T. gondii

infection17.

Some authors report that IgG-positive pregnant women do not transmit

toxoplasmosis, even when re-exposed to it during gestation12, except in rare

cases of acute relapse immunodeficiency15. Events like these are considered

rare or unknown35, and many clinicians give greater attention to pregnant

women at risk. However, this case has shown that there is a risk of vertical

transmission by chronically infected mothers36.

The case patient reported she had not received instructions on how to

prevent T. gondii infection during her prenatal appointments even after detection

of anti-T. gondii IgG. Therefore, we suggest that primary prophylaxis should be

extended to all pregnant women, not just to those who are seronegative.

Among the risk factors for acquiring toxoplasmosis, this particular patient

only had indirect contact with cats that belonged to her neighbor, but that she

reported were sometimes found inside her house. Women who had daily contact

with cats were more likely to become infected in Norway37.

According to several authors, the main risk factor for infection in pregnant

women is the consumption of raw or undercooked meat, contributing to 30% to

63% of all cases, but the present patient denied having consumed inadequately

Resultados


59

prepared meat. Also, 6% to 17% of infections have been attributed to contact

with contaminated soil40,41. In this particular case, although there was only

indirect contact with cats, there may have been direct contact with soil

contaminated by them.

Toxoplasmosis is thought to be more harmful to the fetus when the

mother acquires the infection in the first two quarters40. However, despite the

importance of this information there is still negligence in relation to chronically

infected pregnant women, a fact which was proven by this case, where the

patient had a premature delivery of a stillbirth in the third trimester (34 weeks).

This is in contrast to previous reports in the literature where according to some

authors the disease should manifest as subclinical in this period41,33,42,43.

ACKNOWLEDGEMENTS

We wish to thank Prof. Pedro Cravo for his help regarding English writing.

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Considerações gerais

65

6- CONSIDERAÇÕES GERAIS

Os resultados apresentados nesse estudo apontam que a toxoplasmose é

uma infecção com uma taxa de prevalência importante na população das duas

maternidades públicas de Goiânia, refletindo o risco que o grande percentual de

gestantes suscetíveis possui de contrair a toxoplasmose. Estes dados reafirmam

que programas de educação podem prevenir a aquisição da infecção e orientam

os clínicos sobre a necessidade de medidas preventivas, com educação

apropriada para gestantes sobre como evitar a infecção.

Coclusões gerais

66

7- CONCLUSÕES GERAIS

A prevalência da toxoplasmose entre as gestantes atendidas no HC foi de

51,85% e na MNSL foi de 42,27%.

De acordo com os dados coletados nos questionários, nos chama atenção o

fato de que a população que faz e recebe atendimento pré-natal na cidade de

Goiânia-GO esta sendo pouco informada sobre as formas de prevenção da

toxoplasmose, favorecendo assim o contato das pacientes com o agente

etiológico.

A sorologia foi confirmada na maioria das pacientes, porém, verificamos que

em 27,5% dessas que eram consideradas IgG positivas na sua primeira triagem

no pré-natal eram soronegativas.

A partir da comparação das titulações sorológicas entre os pares mãe e RN

foi possível selecionar um grupo de crianças para acompanhamento sorológico.

Não foi confirmada presença de IgM e IgA em nenhum dos filhos das

gestantes cronicamente infectadas pelo T. gondii.

Pela técnica de Avidez da IgG foi possível idenficar um grupo de quatro

pares (mãe e RN), porém não foi possível fazer o acompanhamento sorológico

nesses oito pacientes por dificulades em localizá-los.

Não se detectou o T. gondii por PCR nas amostras sanguíneas dos RN

suspeitos de toxoplasmose congênita.

Os títulos de anticorpos da classe IgG nos suspeitos de toxoplasmose

congênita tornaram-se negativos antes de um ano de vida, provando tratar-se de

transmissão de anticorpos maternos.

Foi encontrada um percentual de 14,8% mulheres com sorologia negativa

após confirmação sorológica. Essas foram consideradas positivas na análise dos

prontuários.

A busca ativa das pacientes em suas residências foi muito complexa pelo

fato das mesmas mudarem com frequência de residência e número telefônico.

Coclusões gerais

66

Durante as visitas nas maternidades foi constatado que os próprios

profissionais de saúde necessitam de receber informações sobre as formas de

prevenção da toxoplasmose. Observou-se a necessidade da implantação e

implementação de programas visando a atenção primária, campanhas de

esclarecimento tanto para a equipe multiprofissional que trabalha com as

gestantes, como para as próprias gentantes são necessárias.

67

Recomendações

68

8 RECOMENDAÇÕES

Seria ideal que todas as mulheres em idade fértil fossem submetidas a

sorologia para toxoplasmose, para que tivessem as devidas orientações sobre a

doença, quando engravidassem.

Cuidados ampliados com relação à prevenção primária para todas as

gestantes, bem como a realização de uma nova sorologia a cada trimestre,

independente do estado imunológico da gestante.

Controle sorológico estabelecendo o padrão imunológico da mulher em

relação à infecção e eventual risco de adquiri-lá durante uma futura gestação.

A alta susceptibilidade das pacientes em adquirirem a toxoplasmose

durante o período gestacional deve ser avaliada criteriosamente e o clínico

precisa transmitir para as pacientes, durante o pré-natal, todas as formas de

prevenção, para a gestante diminuindo assim as formas de contágio desse

parasito.

A possibilidade de recaída da infecção protozoária ou reinfecção na

gestação faz com que seja necessário a ampliação das medidas de prevenção

primária para todas as gestantes, independente de seu estado imune contra o T.

gondii. Ressaltamos que todas as mulheres em idade procriativa devem receber

informações sobre a prevenção primária da toxoplasmose, visto que se elas

conhecerem sobre a doença elas praticarão as medidas profilaticas.

A ocorrência de reativação da toxoplasmose durane a gestação e morte fetal

relatado no artigo 2, chama a atenção para necessidade de acompanhamento

das gestantes cronicamente infectadas, pois a reativação pode acontecer em

qualquer idade gestacional, causando sérios danos ao concepto, e/ou óbito

fetal, mesmo após o segundo trimestre da gestação.

68

Referências gerais

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83

Apêndices

83

10- APENDICES

APÊNDICE I: Questionário utilizado para coleta dos dados sócio-demográficos e sorológicos das pacientes. QUESTIONÁRIO N°____ DATA: ____ /____ /_____.

Nome:___________________________________________________________

Avaliação da prevalência da transmissão congênita do Toxoplasma gondii e Caracterização Molecular dos estoques isolados em recém nascidos em

Goiânia – Goiás

Secção 1 – Características sócio - demográfica das mulheres

1.1 Onde você nasceu?

_____________________________________________________________

1.2 Mora em Goiânia (1) sim (2) não

Onde e há quanto

tempo?__________________________________________________________

__

1.3 Você morou em outra cidade antes?

Onde?___________________________________________________________

___________________________________________

1.4 Data de nascimento ____________________

1.5 Qual a sua raça: branca, negra, parda, amarela, indígena, outras?

(1) branca (2) negra (3) parda (4) amarela (5) indígena (6) outras:

1.6 Qual a sua escolaridade?

____________________________________________________

Secção 2 – Classificação de status socioeconômico

Agora gostaria de fazer-lhe algumas perguntas sobre sua casa e família.

2.1 Quem é o chefe da família na sua casa?

(1) a própria entrevistada

84

Apêndices

84

(2) outra pessoa. Quem? _________________________________

2.2 Renda Familiar

Salário Mínimo: (1) 1-2 (2) 3-4 (3) 5-6 (4) ≥7

Secção 3 – Características reprodutivas das mulheres

3.1 Você fez consulta do pré-natal em todas as gestações? ( ) sim ( ) não

3.2 Já teve alguma doença antes da gestação?

(1) sim (2)não

Qual?___________________________________________________

3.3 Quantas vezes ficou grávida?

(1) 1 (2) 2 (3) 3 (4) 4 (5) 5 (6) ≥6

3.4 Qual o número de filhos?

__________________________________________________

3.5 Quantos partos teve?

(1) 0 (2) 1 (3) 2 (4) 3 (5) 4 (6) ≥5

3.6 Quantos abortos já teve?

(1) 0 (2) 1 (3) 2 (4) 3 (5) 4 (6) ≥5

3.7 Quantas vezes a senhora realizou curetagem por aborto?

(1) 0 (2) 1 (3) 2 (4) 3 (5) 4 (6) ≥5

3.8 Já fez exames sorológicos nas gestações anteriores? (Pré-natal)

(1) sim (2) não

3.9 Você lembra do resultado dos exames que fez? (Qual e o resultado)

________________________________________________________________

______

Secção 4 – Fatores de risco associado à Toxoplasmose

4.1 Já teve algum tipo de aborto causado por parasitos?

(1) sim. Qual?________________ (2) não

4.2 Você já teve contato com gato? ( ) sim ( ) não

4.3 Você teve contato com cão? ( ) sim ( ) não

4.4 Você consome água filtrada? ( ) sim ( ) não

4.5 Você consome carne crua? ( ) sim ( ) não

4.6- Durante o pré-natal seu médico te falou sobre a doença chamada

toxoplasmose?

85

Apêndices

85

( ) sim ( )não

OBS: Exame Laboratorial – Dados obtidos na analise dos prontuários

5.1 No teste sorológico qual foi o(s) agente(s) infeccioso(s) que deu positivo?

(1) Toxoplasma gondii ( ) IgG____________________ ( ) IgM

___________________

IgG Avidez ___________( ) IgM Avidez ____________________

(2) Doença de Chagas

__________________________________________________

(3)

Sífilis____________________________________________________________

__

(4) Rubéola ( ) IgG____________________ ( ) IgM

____________________

(5)Herpes Simples_________________________________________________

(6) Citomegalovírus ( ) IgG____________________ ( ) IgM ________________

DADOS DO RECÉM-NASCIDOS: DN: / / Peso:________________ Tamanho:____________ Obs:______________________________________________________________________________

86

78

Anexos

86


11- ANEXOS Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética

87

Anexos

87


Anexo 2:

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Você está sendo convidado(a) para participar, como voluntário(a), em uma

pesquisa.

Meu nome é Juliana Boaventura Avelar, sou a biomédica responsável

sob orientação da Profª Dr. Ana Maria de Castro, de desenvolver esta pesquisa,

sendo a área de atuação a Biomedicina. Após ler com atenção este documento e

ser esclarecido(a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte

do estudo, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é

sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de dúvidas sobre a

pesquisa, você poderá entrar em contato com, os pesquisadores responsáveis,

Juliana Boaventura Avelar, nos telefones: (62) 81180764 e 96872979. Em caso

de dúvidas sobre os seus direitos como participantes nesta pesquisa, você poderá

entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa, do Hospital das Clínicas

da Universidade Federal de Goiás –UFG, nos telefones:(62) 3269-8338 ou 3269-

8426.

INFORMAÇÕES IMPORTANTES SOBRE A PESQUISA

O título da pesquisa é “Avaliação da prevalência da transmissão

congênita do Trypanosoma cruzi e Toxoplasma gondii e Caracterização

Molecular dos estoques isolados em recém-nascidos em Goiânia – Goiás”.

Este trabalho será desenvolvido pela por uma equipe técnica, a qual eu pertenço

sob a coordenação da Profa. Dra. Ana Maria de Castro; o material biológico

(sangue) será coletado por mim, no ambulatório de Ginecologia e obstetrícia do

Hospital das Clínicas /UFG e será levado para o Laboratório de Biologia,

Imunologia e Fisiologia de Protozoários de Interesse Humano - Setor de

Parasitologia DMIPP/IPTSP/UFG, onde serão armazenados e realizados os

testes propostos neste projeto. A paciente responderá um questionário onde os

dados serão utilizados para análise epidemiológica (fatores de risco para

contaminação/transmissão) dos agentes T. gondii e T. cruzi.

88

Anexos

88


Esta pesquisa tem o objetivo: Avaliar a prevalência de recém-nascidos

de mães soropositivas para Tripanossomíase Americana e toxoplasmose, que se

infectaram durante a gravidez e/ou no momento do parto e o estudo biológico e

molecular dos estoques isolados dos recém-nascidos infectados congenitamente.

Para tal serão coletadas na mulher grávida 1 amostras de sangue venoso

heparinizado (10 ml da amostra) e do recém-nascido será coletado 1-4 mL, de

acordo com seu peso.

Os prováveis riscos podem ocorrer pela compressão inadequada do local

da punção venosa após a retirada da agulha pelo (a) participante com posterior

formação de inchaço, pela saída de sangue ou ainda lipotímia (queda de

pressão), fatos consequentes da coleta sanguínea.

A opção de participação é totalmente voluntária, caso não queira, não

sofrerá nenhuma restrição aos exames que foram solicitados. Não haverá nenhum

tipo de pagamento ou gratificação financeira pela sua participação. Todos os

dados coletados serão utilizados para esta pesquisa e armazenados para estudos

futuros, mas sempre com objetivo cientifico e respeitando todos os seus

direitos.Sua participação será importante, pois poderá contribuir para o

conhecimento da influência dos parasitos T. cruzi e do T. gondii no

desenvolvimento patológico da doença de Chagas e toxoplasmose

respectivamente, assim como possibilitar ao clínico uma melhor avaliação clínica

minimizando as possíveis consequências da infecção destes parasitos em seus

filhos.

89

Anexos

89


CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO

DA PESSOA NESTA PESQUISA

Eu, _______________________________________________________, RG______________CPF ____________, abaixo assinado, concordo em participar do estudo “Avaliação da prevalência da transmissão congênita do Trypanosoma cruzi e Toxoplasma gondii e Caracterização Molecular dos estoques isolados em recém-nascidos em Goiânia – Goiás”, como sujeito. Fui devidamente informado e esclarecido pela Biomédica Juliana Boaventura Avelar sobre a pesquisa, os procedimentos nela envolvidos, assim como os possíveis riscos e benefícios decorrentes de minha participação. Foi-me garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem que isto leve a qualquer penalidade ou interrupção de meu acompanhamento/assistência/tratamento. Serão garantidos o sigilo e privacidade de meus dados pessoais.

Goiânia,........./ ........... / 20...... .

__________________________________________________________

Nome e Assinatura do sujeito ou responsável:

Assinatura Dactiloscópica:

Nome e Assinatura do Pesquisador Responsável:

Presenciamos a solicitação de consentimento, esclarecimentos sobre a

pesquisa e aceite do sujeito em participar.

Testemunhas (não ligadas à equipe de pesquisadores):

Nome: _________________________________________________

Nome: _________________________________________________

Observações complementares

Os responsáveis por deste projeto se comprometem a não divulgação

e/ou identificação de dados pessoais dos indivíduos participantes.

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