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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS

DE FUNGOS DO GÊNERO RHIZOCTONIA RECUPERADOS DO

CERRADO AGRÍCOLA DO BRASIL

ANGEL JOSÉ VIEIRA BLANCO

GOIÂNIA-GO

2016





Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas do

Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Goiás, como

requisito parcial para obtenção do título de

Doutor em Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Bioquímica e Genética

Orientador: Prof. Dr. Cirano José Ulhoa Co-orientador: Dr. Murillo Lobo Jr.

GOIÂNIA-GO

2016





BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________

Orientador: Prof. Dr. Cirano José Ulhoa Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular– ICB-II

Universidade Federal de Goiás

_____________________________________________ Co-Orientador: Dr. Murillo Lobo Júnior

Embrapa Arroz e Feijão

_____________________________________________

Prof. Dr. Adalberto Café Filho Departamento de Fitopatologia – Instituto de Biologia

Universidade de Brasília

_____________________________________________

Profa. Dra Silvana Petrofeza da Silva Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular– ICB-II


_____________________________________________

Prof. Dr Marcos Gomes da Cunha Departamento de Fitopatologia – Escola de Agronomia e de Engenharia de Alimentos


_____________________________________________

Dra. Marta Cristina Corsi de Felippi Embrapa Arroz e feijão

Aprovada em: ____/____/________

SUMÁRIO

RESUMO ................................................................................................................................................. i

ABSTRACT ............................................................................................................................................ ii

Introdução .............................................................................................................................................. 9

Objetivos .............................................................................................................................................. 17

Metodologia ......................................................................................................................................... 18

Coleta de amostras e isolamento dos Fungos .......................................................................... 18

Isolamento e quantificação do DNA Genômico ......................................................................... 22

Amplificação da região ITS e sequenciamento ......................................................................... 23

Morfologia de Colônia e Condição nuclear ................................................................................ 23

Determinação de AGs e inferência filogenética dos isolados ................................................. 23

Testes de patogenicidade em feijão e milho .............................................................................. 24

Resultados ........................................................................................................................................... 26

Identificação molecular, morfologia de colônias e condição nuclear ..................................... 26

Determinação de AG e Análises filogenéticas ........................................................................... 26

Testes de patogenicidade em Feijão e Milho ............................................................................ 32

Discussão ............................................................................................................................................ 35

Conclusões .......................................................................................................................................... 44

Referências Bibliográficas ................................................................................................................. 45

Anexos ................................................................................................................................................. 55

Artigo em formatado para submissão à revista Plant Disease. .................................................. 56

LISTA DE FIGURAS

Fig. 1. Distribuição espacial dos locais de amostragem dos isolados de Rhizoctonia

identificados neste estudo. Esses locais de amostragem abrangem as cinco principais

regiões brasileiras sob domínio do bioma Cerrado (área destacada em cinza). ............. 18

Fig. 2. Padrões culturais das colônias de AGs/variedades identificados neste trabalho. A-F:

Ceratobasidium (AGA, AGF, AGFa, AGG, AGP e AGR); G-L: T. cucumeris (AG1-IA,

AG1-IB, AG1-ID, AG1-IE, AG4-HGII e AG4-HGIII); M-O: W. circinata (var. circinata, var.

oryzae, var. zeae). ...................................................................................................................... 27

Fig. 3. Arvore filogenética contendo as sequências de isolados de W. circinata, identificados

neste estudo. Em verde: var. zeae; em azul: var. oryzae e em vermelho: var. circinata.30

Fig. 4. Árvore filogenética contendo as sequências de isolados de Ceratobasidium

identificados neste estudo. Em vermelho: AG-A; Em azul: AG-F; Em azul claro: AG-Fa;

Em púrpura: AG-G; Em verde escuro: AG-P; Em verde claro: AG-R. ............................... 31

Fig. 5. Árvore filogenética contendo as sequências de isolados de T. Cucumeris identificados

neste estudo. Em vermelho: isolados de AG1 (ISGs IA, IB, ID e IE); em azul: isolados

AG4 (ISGs HGI e HGIII). ........................................................................................................... 32

Fig. 6. Severidade média de podridão radicular em plantas de feijão e de milho, causada por

isolados dos gêneros Ceratobasidium, Thanatephorus e Waitea. Severidade da doença

estimada através da escala proposta por Schoonhoven e Pastor-Corrales (1987). ....... 33

Fig. 7. Severidade média de podridão radicular em plantas de feijão e de milho, causada por

diferentes Grupos de Anastomose identificados neste estudo. Severidade da doença

estimada através da escala proposta por Schoonhoven e Pastor-Corrales (1987). ....... 34

Fig. 8. Distribuição geográfica da severidade da doença (podridão de raiz) no feijão,

considerando os diferentes AGs/variedades identificados. AGs não patogênicos não são

mostrados. A área da savana brasileira é destacada em cinza. ........................................ 42

Fig. 9. Distribuição geográfica da severidade da doença (podridão de raiz) no milho,

considerando os diferentes AGs/variedades identificados. AGs não patogênicos não são

mostrados. A área da savana brasileira é destacada em cinza. ........................................ 43

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Relação de isolados de Rhizoctonia spp. caracterizados neste trabalho com seus

respectivos números de identificação, condição nuclear, sequência mais similar (best hit

Blast para cada sequência), número de registro das sequências depositadas no

Genbank, substrato ou histórico recente de cultivo e região de coleta. ............................ 19

Tabela 2. Número e frequências absolutas e relativas de isolados do gênero Rhizoctonia

identificados em nível de espécie, identificados em solos do Cerrado brasileiro e áreas

adjacentes. .................................................................................................................................. 28

i

RESUMO

Fungos do gênero Rhizoctonia constituem um complexo grupo taxonômico de

fitopatógenos. Espécies multinucleadas como Thanatephorus cucumeris

(Rhizoctonia solani), Waitea circinata var. oryzae (Rhizoctonia oryzae), Waitea

circinata var. zeae (Rhizoctonia zeae), Waitea circinata var. circinata (anamorfo não

definido) e espécies de Rhizoctonia binucleadas estão associados a muitas doenças

em diversas plantas economicamente importantes, incluindo as principais espécies

utilizadas na alimentação humana, como feijão, arroz, milho e trigo. Com o objetivo

principal de avaliar a distribuição de espécies e grupos intraespecíficos do gênero

Rhizoctonia no Cerrado agrícola brasileiro e áreas de transição, 81 isolados foram

identificados através de métodos moleculares e de coloração de núcleos após serem

recuperados de amostras de solo. Além da caracterização morfológica e cultural dos

isolados, análises filogenéticas utilizando a região ITS1-5.8S-ITS2 confirmaram a

identificação de quase todos os isolados realizada através do algoritmo Blast do

Genebank – NCBI. Aproximadamente 40 % dos isolados recuperados pertencem a

anamorfos de W. circinata (variedades zeae, oryzae e circinata); 37,04% à grupos

de anastomose (AG) do teleomorfo T. cucumeris (AG1-IA, AG1-IB, AG1-ID, AG1-IE,

AG4-HGI e AG4-HGIII) e 23,46% a AGs de Ceratobasidium (AG-A, AG-F, AG-Fa,

AG-G, AG-P e AG-R). Aparentemente é o primeiro relato sobre a ocorrência da

variedade circinata no Brasil. AG1 foi identificado entre o Centro e o Norte do Brasil;

AG3 entre o Centro e o Sul; R. zeae em regiões de grande produção de Milho e AG-

F e AG-Fa em áreas de produção de Feijão Os resultados sugerem que a cultura

adotada e as características ambientais podem ter sido determinantes na

distribuição geográfica dos AGs/variedades encontrados. Testes de patogenicidade

mostraram que parte significativa dos isolados estudados são patogênicos a milho e

feijão e que os AGs/variedades identificados apresentaram diferenças significativas

na agressividade a essas duas plantas.

Palavras-Chave: Genética de Microrganismos; Rhizoctonia; Cerrado agrícola;

Fitopatógen

ii

ABSTRACT

Fungi from Rhizoctonia genus constitute a complex taxonomic group of

phytopathogens. Multinucleated species such as Thanatephorus cucumeris

(Rhizoctonia solani), Waitea circinata var. oryzae (Rhizoctonia oryzae), Waitea

circinata var. Zeae (Rhizoctonia zeae), Waitea circinata var. Circinata (anamorph not

defined) and binucleate Rhizoctonia species, are associated with many diseases in

several economically important crops, including species used in human nutrition,

such as beans, rice, corn and wheat. In order to evaluate the species distribution and

intraspecific groups of Rhizoctonia in Brazilian agricultural Cerrado and transitional

areas, 81 isolates were identified through molecular methods and nucleate coloring

after being recovered from soil samples. In addition to the morphological and cultural

characterization of the isolates, phylogenetic analyzes using the ITS1-5.8S-ITS2

region confirmed the identification of almost all isolates using the Genebank-NCBI

Blast algorithm. Approximately 40% of the recovered isolates belong to W. circinata

anamorphs (zeae, oryzae and circinata varieties); 37.04% of total isolates were

assigned to different T. cucumeris AGs (AG1-IA, AG1-IB, AG1-ID, AG1-IE, AG4-HGI

and AG4-HGIII) and 23.46% to different Ceratobasidium AGs (AG-A, AG-F, AG-Fa,

AG-G, AG-P and AG-R). Apparently, it is the first report of the circinata variety in

Brazil. AG1 was identified between the Center and the North of Brazil; AG3 between

Central and South; R. zeae in regions of high production of maize and AG-F and AG-

Fa in Bean production areas. The results suggests that cultivation mechanisms and

environmental characteristics are determinant on geographical distribution of AGs

varieties used in this study. Pathogenicity tests showed that a significant part of the

isolates studied are pathogenic and presented a significant variation of

aggressiveness in maize and beans.

Keywords: Genetics of Microorganisms; Rhizoctonia; agricultural Cerrado;

Phytopathogens

9

Introdução

Os fungos são considerados importantes constituintes de ecossistemas

naturais e podem interagir de modo positivo ou negativo com outros organismos

(Sha et al. 2008), exercendo várias atividades ecológicas funcionais, sob influência

de diferentes parâmetros ambientais (Branco et al. 2013). Embora sejam vistos por

grande parte da população leiga como organismos prejudiciais, pois, de fato, alguns

deles são perigosos à saúde de plantas e animais, incluindo a espécie humana, a

maioria é benéfica, podendo-se admitir que sem os fungos dificilmente outras

espécies poderiam existir (Azevedo e Pizzirani-Kleiner 2002).

Bruns et al. (1991) destacam uma série de razões que enfatizam a grande

importância dos fungos: a) são decompositores primários em todos os ecossistemas

terrestres, b) formam importantes associações simbióticas, envolvendo mutualismo

ou parasitismo, com plantas vasculares, c) constituem a esmagadora maioria de

patógenos de plantas e por isso provocam impacto econômico significativo (vários

patógenos humanos importantes também são fungos), d) oferecem vários modelos

genéticos para biologia molecular (ex: Saccharomyces cerevisiae, Neurospora

crassa, Aspergillus nidulans), e e) são cruciais na indústria de fermentação e

biotecnologia.

De fato, a literatura especializada mostra que os fungos possuem aplicações

diversas, quase sempre associadas de maneira estreita ao cotidiano dos seres

humanos, como por exemplo, a confecção de produtos e serviços. Alimentos e

bebidas, ácidos orgânicos, enzimas, aromas e fragrâncias, agentes cardiovasculares

e esteroides (Melo 2002), representam exemplos de produtos oriundos da ação

direta ou indireta de fungos. Além disso, estes microrganismos encontram-se

também relacionados a segmentos considerados estrategicamente importantes para

o desenvolvimento de qualquer país, como meio ambiente e energia (Azevedo e

Pizzirani-Kleiner 2002).

Diversas indústrias têm utilizado a capacidade bioquímica dos fungos para

produzir substâncias orgânicas: há alguns anos leveduras começaram a ser

utilizadas na produção de proteínas para enriquecimento de ração animal (Raven e

Johnson 2002); e espécies do gênero Aspergillus na produção em larga-escala de

ácido cítrico e enzimas de aplicação industrial como amilases, proteases e lipases

(May e Adams 1997). Muitos antibióticos, inclusive o primeiro utilizado em larga

10

escala (penicilina) são derivados de fungos. Há fungos também sendo utilizados na

recuperação de ambientes contaminados, onde atuam convertendo moléculas

orgânicas complexas em outras, desintoxicando o meio (Raven e Johnson 2002) e

diminuindo a emissão de gases de efeito estufa (Lange 2014).

Alguns fungos estão direta ou indiretamente relacionados com a ocorrência e

o controle de doenças em lavouras. Avanços atuais neste campo têm permitido o

trabalho conjunto entre melhoristas, microbiologistas e produtores na busca de

plantas mais resistentes e de soluções alternativas para minimizar as perdas

recorrentes no setor agrícola. Nesse sentido, é uma premissa básica conhecer a

variabilidade dos fungos fitopatógenos, principalmente aqueles de maior importância

econômica e social, como é o caso do gênero Rhizoctonia.

As Rhizoctonias são um importante gênero de fitopatógenos que podem se

associar a diversos órgãos de plantas (Basseto et al. 2008; González 2013;

Kuramae et al. 2007; Youssef et al. 2012). São organismos cosmopolitas, que

podem ser encontradas em solos utilizados para a agricultura ou mantidos sob

vegetação nativa (González-Garcia et al. 2006). Suas espécies se destacam pela

capacidade de parasitar e causar doenças importantes em diversas espécies de

plantas (Sneh et al. 1991). As espécies do gênero Rhizoctonia são altamente

diversificadas, apresentando ciclo de vida com dois estágios sexuais (sexuado ou

teleomórfico e assexuado ou anamórfico).

Além de parasitas de plantas economicamente importantes, o gênero

Rhizoctonia apresenta ainda espécies saprófitos e simbiontes (González-Garcia et

al. 2006). Há também no grupo espécies mutualísticas (Otero et al. 2002) e com

potencial para ser explorado no controle biológico (Sneh et al. 1991). Dessa forma,

observa-se que estes fungos assumem importância em diversos contextos, sendo

organismos particularmente interessantes do ponto de vista agronômico, econômico

e também ecológico.

A primeira descrição de espécies de Rhizoctonia foi realizada por De Candolle

em 1815 (Sneh et al. 1991) e, desde então, muitas espécies foram identificadas e

incluídas no gênero conforme revisado por González-Garcia et al. (2006). No

passado, isolados de Rhizoctonia eram classificados de acordo com características

culturais (morfologia de colônia e coloração de micélio) e quanto ao número de

núcleos, (Sneh et al. 1991). Entretanto, a taxonomia de Rhizoctonia utilizando

apenas análise morfológica de colônias sempre foi incerta, uma vez que a ausência

11

de conídios e condição imperfeita do fungo complicam o processo de identificação.

Além disso, Rhizoctonia representa uma mistura complexa de fungos filamentosos

que compartilham características em seu estado anamórfico (González-Garcia et al.

2006), o que também dificulta a escolha de caracteres úteis para descrever e

diferenciar espécies dentro do gênero.

Atualmente, além da análise morfológica, coloração de núcleos e grupos de

anastomose (AG), o sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA é um dos

principais métodos utilizados para organizar (e reorganizar também) a taxonomia de

Rhizoctonia. Dados sobre a ultraestrutura do fungo, patogenicidade e distribuição

geográfica, são levantados para se caracterizar isolados e definir sua posição

sistemática dentro do gênero (Carling et al. 2002a; Fang et al. 2013; González 2013;

González et al. 2006; Kuninaga et al. 2000; Kuramae et al. 2007; Mathew et al. 2012;

Sharon et al. 2008; 2006; Vilgays e Cubeta 1994), Além disso, o avanço dos

métodos de bioestatística tem permitido também a caracterização de genes e da

diversidade genética das espécies e populações de Rhizoctonia (Ceresini et al.

2003; Ciampi et al. 2005), disponibilizando assim informações cada vez mais

refinadas para identificar e classificar de maneira acurada, isolados coletados nos

mais diferentes tipos de solo ou hospedeiros.

Muitos estudos têm descrito a diversidade genética de Rhizoctonia em uma

série de plantas cultivadas, tais como: alface (Youssef et al. 2012); arroz

(Chaijuckam e Davis 2010; Ciampi et al. 2009; Taheri et al. 2007); batata (Ceresini et

al. 2003; Kuninaga et al. 2000); couve (Kuramae et al. 2007); ervilha (Mathew et al.

2012), feijão (Godoy-Lutz et al. 2003); melancia (Aiello et al. 2012); morango (Fang

et al. 2013); seringueira (Ceresini et al. 2010; Youssef et al. 2012); soja (Ciampi et al.

2009; Ciampi et al. 2005; Fenille et al. 2003; González 2013); tabaco (Kuninaga et al.

2000) e milho (Summer e Minton 1989).

Também já foram observados ataques de Rhizoctonia spp. a espécies

florestais como a teca (Poltronieri et al. 2008), e o ipê (Costa et al. 2013); em plantas

ornamentais como azaleia (Rinehart et al. 2007) e bastão-do-imperador (Verginassi

et al. 2008) e, até mesmo, em gramíneas invasoras (Chen et al. 2009).

Existem três principais grupos de espécies de Rhizoctonia associados a

doenças de plantas: Thanatephorus cucumeris, espécie multinucleada (anamorfo =

Rhizoctonia solani); Ceratobasidium sp, (compreende espécies binucleadas e são

ocasionalmente classificadas no gênero anamorfo Ceratorhiza), e Waitea circinata,

12

espécie multinucleada que tem cinco anamorfos: Rhizoctonia zeae, Rhizoctonia

oryzae, Waitea circinata var. circinata (Gunnell 1986; Leiner e Carling 1994; Roberts

1999, Vilgays e Cubeta 1994), além de dois outros anamorfos recentemente

relacionados a W. circinata: var. prodigus e var. agrostis (Kammerer et al. 2011;

Toda et al. 2007), cujo epíteto “Rhizoctonia” ainda não foi adotado.

Das espécies anteriormente descritas, T.cucumeris é reconhecidamente a

mais importante, causando doenças em mais de 200 espécies de plantas, incluindo

Arroz, Milho, Trigo, Soja, Algodão, além de espécies florestais, frutíferas, gramíneas

e plantas ornamentais (Gonzalez et al. 2006). Talvez por isso haja tanto interesse

em estudar este fungo, que foi inicialmente descrito por Julius Kühn, em batata, em

1858 (Kareen e Hassan, 2013). Estudos já realizados no Brasil relataram a

ocorrência de R. Solani em culturas importantes como: feijão (Ceresini e Souza

1997; Godoy-Lutz et al. 2003; Kuramae et al. 2002); arroz (Souza et al. 2007); e soja

(Yorinori 1998; Meyer e Yorinori 1999).

De acordo com os critérios utilizados tradicionalmente para reações de

anastomose de hifas, isolados de T. cucumeris são divididos em 14 grupos de

anastomose (AG): AG 1-13, além AG-BI (Sneh et al. 1991; Carling et al. 2002b;

Guillemaut et al., 2014). Além disso, muitos AGs agrupam indivíduos que diferem

por uma ou mais características, sendo por isso subdivididos em subgrupos (grupos

intraespecíficos – ISG). Essa subdivisão considera variações em características

genéticas, bioquímicas, morfológicas e de patogenicidade, entre outras, observadas

entre isolados dentro de um mesmo AG (Ogoshi 1987), permitindo a diferenciação

de 23 ISGs, dentro dos 14 AGs de R. solani (Carling 2000).

O acúmulo de informações geradas pelos diferentes métodos de

caracterização de isolados, incluindo as mais diversas técnicas e modelos

matemáticos utilizados nas análises de agrupamentos, faz com que o sistema de

classificação de T. cucumeris esteja em constante atualização. Exemplo disso são

as evidências filogenéticas obtidas por Carling et al. (2002-b), nas quais observou-se

o agrupamento de isolados de AG-BI num cluster de AG-2, o que fez com que estes

autores propusessem a inclusão de AG-BI como um subgrupo de AG-2, com a

denominação de AG2-BI, o que reduziria o número de AGs de T. Cucumeris para

13, (Lübeck, 2004). Informações detalhadas sobre os hospedeiros e a

sintomatologia provocada por cada um dos AGs e seus respectivos ISGs em T.

13

cucumeris podem ser encontradas em diversas revisões sobre a espécie (González-

Garcia et al. 2006; Nakatani 2006; Genhua e Chengyum 2012).

O gênero teleomorfo Ceratobasidium é bastante diversificado,

compreendendo patógenos, saprófitas e formadores de micorrizas (Ogoshi 1987).

Como patógeno, Ceratobasidium spp podem causar o tombamento (damping off em

inglês), cujos sintomas são podridão das raízes, talos e sementes. Outras

consequências da ação desses patógenos incluem a queima da bainha em milho,

deterioração dos frutos e a mela em uma significativa variedade de plantas

importantes para agricultura (Li 1998; Nechet e Half-Vieira, 2006; Sneh et al. 1991;

Yan, 1984). Entre seus hospedeiros estão o feijão (Cardoso e Echandi, 1987); a

batata (Escandi e Echandi, 1991); o pepino (Villajuan-Abgona et al. 1996); o repolho

(Ross et al., 1998); e o Arroz (Taheri, et al., 2007).

Assim como acontece com T. cucumeris, a classificação das formas de

Ceratobasidium, leva em consideração a anastomose de hifas. O sistema de

classificação dos anamorfos de Ceratobasidium também é muito dinâmico e como

discutido por Sharon et al. (2008), o número de grupos de anastomose, que chegou

a 21, já foi reduzido para 16. Na realidade, na década de 1980 existiam dois

sistemas de classificação para as formas de Ceratobasidium, que acabaram se

fundindo, prevalecendo a nomenclatura do sistema japonês (Anastomosis Groups -

AGs) em detrimento ao sistema americano (Ceratobasidium Anastomosis Groups -

CAGs). Como era menos abrangente e todos os isolados de seus diferentes CAGs

estavam também presentes no sistema japonês, o sistema americano, proposto por

Burpee et al. (1980), deixou de ser utilizado e os seus sete CAGs foram

subsequentemente incorporados ao sistema japonês de AGs desenvolvido por

Ogoshi et al. (1983).

Na década de 80, a espécie W. circinata era classificada em três variedades,

circinata, oryzae e zeae, com base na morfologia de colônias no estado anamorfo,

incluindo coloração e diâmetro de escleródios (Gunnell 1986). Posteriormente,

Leiner e Carling (1994) assumiram W. circinata var. oryzae e Waitea circinata var.

zeae, como os teleomorfos de Rhizoctonia zeae e Rhizoctonia oryzae,

respectivamente, embora, tivessem afirmado que a nomenclatura para o anamorfo

de W. circinata var. circinata ainda não estava plenamente estabelecida.

Atualmente, existem designações para cinco variedades dentro de Waitea

circinata, com base na biologia molecular e na análise de diferenças genéticas:

14

oryzae, zeae, circinata, agrostis e prodigus (Leiner e Carling 1994; Sharon et al.

2006; De la Cerda et al. 2007; Toda et al. 2007), entretanto, não é comum encontrar

na literatura, designações correspondentes para os anamorfos das variedades

circinata, agrostis e prodigus como acontece em R. oryzae e R. zeae.

As variedades de Waitea circinata anteriormente descritas causam uma série

de diferentes doenças em gramíneas (Kammerer 2011). Nesse sentido, esse mesmo

autor propôs o reconhecimento da variedade prodigus, com base em características

morfológicas e análise de dados de sequências de DNA, após isolar o fungo de

grama em campos de golfe nos EUA. Trabalhos envolvendo a variedade prodigus

ainda são escassos na literatura, assim como dados moleculares no GenBank.

A variedade zeae parece ser a mais importante dentro do gênero Waitea, não

só pela quantidade de diferentes hospedeiros: arroz (Oniki et al. 1985); milho

(Sumner e Bell 1982); cebola (Erper et al. 2006); beterraba (Kuznia e Windels 1994);

trigo e cevada (Ogoshi et al. 1990), mas também pela quantidade de estudos

disponíveis na literatura. Esta espécie é mundialmente distribuída e já foi isolada em

países como China (Li et al. 1998); Brasil (Poltronieri et al. 2008); Argentina

(Gutiérrez et al. 2007) e Irã (Telmadarrehei et al. 2011), entre outros.

O método de identificação de Rhizoctonia baseado na anastomose de hifas

foi proposto por Matsumoto e colaboradores há aproximadamente 90 anos, e implica

que isolados que possuem a habilidade de se fundir são geneticamente relacionados

(González 2013). Embora ainda seja válido e de nos últimos anos ter sido

corroborado por dados genéticos (Carling et al. 2002b; González-Garcia et al. 2006;

Sharon et al. 2008), as reações de anastomose nem sempre são bem definidas, pois

há isolados que geneticamente se posicionam de maneira intermediária entre dois

AGs, podendo assim fundir suas hifas com ambos. Além disso, alguns isolados

podem, inclusive, perder a capacidade relacionada à fusão de suas hifas (Sharon et

al. 2008), e assim dificultar a definição de sua posição sistemática.

A distinção de espécies em meio de cultura é difícil na maioria das vezes,

principalmente devido à ausência de características morfológicas estáveis para

suportar a classificação do gênero Rhizoctonia (Nakatani, 2006). Nesse sentido, nos

últimos anos, métodos moleculares vêm sendo amplamente utilizados para confirmar

a identidade de espécies, variedades e AGs de Rhizoctonia, com destaque para a

análise da região intergênica do DNA ribossomal (ITS-rDNA), que vem se

15

consolidando como uma importante ferramenta na elucidação da sistemática do

gênero (Kuninaga et al. 1997; Sharon et al. 2006, 2008; White et al. 1990;).

Identificar isolados de Rhizoctonia é uma ação importante para fins de manejo

dos sistemas de produção agrícola, pois a gama de hospedeiras, a capacidade

saprofítica e a ausência de cultivares resistentes dificultam o controle desses fungos

através de resistência genética e práticas culturais. Isto porque muitos AGs são

patógenos de diferentes hospedeiros, normalmente utilizados em sistemas de

rotação de cultura por critérios econômicos ou sociais, contribuindo assim para o

aumento anual do inóculo no solo, que pode levar a perdas consideráveis de

produtividade (Lanoiselet 2005; Paulitz e Okubara 2006). Em especial, é importante

considerar que a aplicação de fungicidas pode ser uma estratégia de controle pouco

efetiva uma vez que a eficácia desses compostos em Rhizoctonia varia entre

diferentes espécies e AGs (Amaradasa et al. 2014; Carling et al. 1990; Kataria et al.

1991).

Apesar de já haver uma grande quantidade de estudos sobre a diversidade de

Rhizoctonia no Brasil (Ceresini et al. 2010; Ciampi et al. 2009; 2005) pouco se sabe

sobre a distribuição de suas espécies no Cerrado agrícola e em áreas de transição

com outros biomas, uma vez que a maioria dos estudos sobre a diversidade de

Rhizoctonia no Brasil é geralmente direcionada para uma cultura específica ou para

algum grupo de anastomose relacionado a uma cultura de interesse (Basseto et al.

2008; Ceresini et al. 2010; Ciampi et al. 2005, 2009; Fenille et al. 2003; Goulart et al.

2011; Kuramae et al. 2007; Souza et al. 2007).

Com exceção do trabalho realizado por Bolkan e Ribeiro (1985), pouco se

sabe sobre a distribuição de espécies de Rhizoctonia em maior escala geográfica. A

escassez de informações sobre a distribuição e diversidade de espécies de

Rhizoctonia limita a compreensão sobre os mecanismos que favorecem a dispersão

e o estabelecimento destes fitopatógenos em regiões produtivas do Cerrado agrícola

e em áreas de transição com outros biomas.

O Cerrado é o segundo maior Bioma brasileiro, distribuindo-se por

aproximadamente dois milhões de Km2, equivalentes a 23,92% do território nacional,

(IBGE, 2004). Considerando a extensão territorial deste bioma, a possibilidade de

obtenção de duas a três safras anuais e a preferência de produtores por poucas

espécies cultivadas (ex: milho, soja, feijão comum e hortaliças, hospedeiras de

Rhizoctonias), é provável que as práticas culturais prevalentes e os fatores

16

ambientais ajudam a regular a distribuição de espécies e AGs de Rhizoctonia nos

solos do Cerrado agrícola e áreas de transição.

17

Objetivos

Este trabalho teve como objetivos:

i. Identificar espécies e grupos intraespecíficos do gênero Rhizoctonia,

recuperados de solos de áreas agrícolas do Cerrado brasileiro e áreas

de transição;

ii. Estimar possíveis relações entre a distribuição de espécies, práticas

agrícolas e a diversidade climática na região-alvo;

iii. Verificar a patogenicidade dos isolados em milho e feijão, devido à

importância econômica e social destas espécies.

18

Metodologia

Coleta de amostras e isolamento dos Fungos

Os isolados utilizados neste estudo foram obtidos em diferentes áreas

agrícolas e vegetação nativa do Cerrado e áreas de transição com este bioma,

distribuídas pelas cinco regiões brasileiras. Assim, a distribuição espacial das

amostras se deu da seguinte forma: Norte (Roraima e Tocantins); Nordeste (Bahia);

Centro-Oeste (Goiás e Mato Grosso); Sudeste (Minas Gerais e São Paulo); Sul

(Paraná). As amostras compostas de solos foram coletadas na camada 0-10 cm,

armazenadas em sacos plásticos, sendo posteriormente armazenadas em câmara

fria a 4 + 1ºC. A distribuição espacial dos locais de coleta no território brasileiro está

apresentada na Figura 1. A relação contendo os municípios sede, as quais

pertencem as áreas de coleta e suas coordenadas geográficas podem ser

observadas na Tabela 1.

Fig. 1. Distribuição espacial dos locais de amostragem dos isolados de Rhizoctonia identificados neste estudo. Esses locais de amostragem abrangem as cinco principais regiões brasileiras sob domínio do bioma Cerrado (área destacada em cinza).

19

Tabela 1. Relação de isolados de Rhizoctonia spp. caracterizados neste trabalho com seus respectivos números de identificação, condição nuclear, sequência mais similar (best hit Blast para cada sequência), número de registro das sequências depositadas no Genbank, substrato ou histórico recente de cultivo e região de coleta.

Identificação em coleção de culturas da Embrapa

Condição nuclear

Blast NCBI Acesso NCBI

Substrato/histórico de cultivo

Região de coleta

Município Estado

CNPAF_0003 Multinucleado Var. Zeae KX468789 Solo Patrocínio MG

CNPAF_0028 Multinucleado Var. Zeae KM065536 Solo Iraí de Minas MG

CNPAF_0033 Binucleado Ceratobasidium AG-A KM065539 Solo Cristalina GO

CNPAF_0036 Multinucleado Ceratobasidium AG-Fa KM065540 Feijão Jataí GO

CNPAF_0038 Multinucleado Var. Circinata KX468791 Cenoura Rio Paranaíba MG

CNPAF_0039 Multinucleado Var. Circinata KM065541 Soja Rio Paranaíba MG

CNPAF_0042 Multinucleado Var. Circinata KM065544 Batata-Cebola Uberaba MG

CNPAF_0043 Multinucleado Var. Circinata KM065545 Batata-Cebola Uberaba MG

CNPAF_0044 Multinucleado T. cucumeris AG4-HGIII KM065546 Cenoura Campos Altos MG

CNPAF_0045 Multinucleado Var. Circinata KM065548 Batata-Milho Perdizes MG

CNPAF_0046 Multinucleado Var. Circinata KX468793 Batata-Milho Perdizes MG

CNPAF_0047 Multinucleado Var. Circinata KX468794 Batata-Milho Perdizes MG

CNPAF_0049 Binucleado Ceratobasidium AG-A KM065549 Café Carmo do Paranaíba MG

CNPAF_0053 Multinucleado T. cucumeris AG4-HGIII KM065550 Soja Ipameri GO



CNPAF_0056 Multinucleado Var. Zeae KM065553 Soja Sacramento MG

CNPAF_0058 Binucleado Ceratobasidium AG-A KM065554 Cenoura São Gotardo MG

CNPAF_0061 Multinucleado T. cucumeris AG1-1B KM065555 Soja Uruaçu GO

CNPAF_0062 Multinucleado T. cucumerisAG4-HG1 KM065556 Feijão Santo Antônio de Goiás GO

CNPAF_0067 Multinucleado T. cucumeris AG4-HGIII KM065557 Cenoura Rio Paranaíba MG

CNPAF_0076 Multinucleado T. cucumeris AG4-HG1 KM065559 Soja Catiara MG

CNPAF_0080 Multinucleado Var. Zeae KM065560 Café Patos de Minas MG

CNPAF_0081 Multinucleado T. cucumeris AG1-1B KX468795 Café Guarda Mor MG

20

CNPAF_0082 Multinucleado T. cucumeris AG1-1B KX468796 Café Guarda Mor MG

CNPAF_0088 Binucleado Ceratobasidium AG-R KX468797 Cebola Ibiá MG

CNPAF_0093 Binucleado Ceratobasidium AG-Fa KM065561 Milho-Feijão Gurupi TO

CNPAF_0095 Multinucleado Var. Zeae KM065562 Solo Gurupi TO

CNPAF_0102 Multinucleado Var. Zeae KX468798 Feijão Paracatu MG

CNPAF_0105 Multinucleado Var. Zeae KX468799 Feijão Paracatu MG

CNPAF_0108 Multinucleado Var. Circinata KX468800 Milho-Feijão Paracatu MG

CNPAF_0113 Binucleado Ceratobasidium AG-G KM065563 Cenoura Campos Altos MG

CNPAF_0117 Binucleado Ceratobasidium AG-A KX468801 Feijão-Aveia Guamiranga PR

CNPAF_0119 Multinucleado T. cucumeris AG4-HG1 KX468802 Feijão-Aveia Guamiranga PR

CNPAF_0120 Binucleado Ceratobasidium AG-A KX468803 Feijão-Aveia preta Wenceslau Braz PR

CNPAF_0125 Multinucleado T. cucumeris AG4-HG1 KX468804 Feijão Guamiranga PR

CNPAF_0129 Binucleado Ceratobasidium AG-A KX468805 Feijão-Aveia preta Wenceslau Braz PR

CNPAF_0138 Multinucleado Var. Zeae KM065564 Feijão-Milho Imbituva PR

CNPAF_0139 Binucleado Ceratobasidium AG-F KX468806 Feijão Paulo de Frontin PR

CNPAF_0141 Multinucleado Var. Circinata KM065565 Solo Cristalina GO

CNPAF_0142 Multinucleado Var. Circinata KX468807 Canela Jaguariaíva PR

CNPAF_0143 Multinucleado Var. Circinata KM065566 Feijão-Sorgo Wenceslau Braz PR

CNPAF_0144 Multinucleado T. cucumeris AG4-HG1 KX468808 Feijão Guamiranga PR

CNPAF_0146 Multinucleado Var. Circinata KX468809 Feijão Ipiranga PR

CNPAF_0148 Multinucleado Var. Zeae KX468810 Soja Jataí GO

CNPAF_0149 Multinucleado Var. Zeae KM065567 Solo Montes Claros GO

CNPAF_0151 Binucleado Ceratobasidium AG-F KX468811 Feijão-Soja Guamiranga PR

CNPAF_0152 Multinucleado T. cucumeris AG4-HG1 KM065568 Feijão Guamiranga PR

CNPAF_0154 Multinucleado Var. Zeae KX468812 Solo São Gotardo MG

CNPAF_0162 Multinucleado Var. Circinata KX468813 Feijão São João da Aliança GO

CNPAF_0178 Multinucleado Var. Zeae KX468814 Feijão-Aveia preta Wenceslau Braz PR

CNPAF_0180 Multinucleado T. cucumeris AG4-HG1 KX468815 Feijão Paranapanema SP

CNPAF_0187 Binucleado Ceratobasidium AG-A KX468816 Feijão-Aveia Guamiranga PR

CNPAF_0189 Binucleado Ceratobasidium AG-F KX468817 Feijão Paulo Frontin PR

21

CNPAF_0190 Multinucleado Var. Circinata KX468818 Solo Araucária PR

CNPAF_0191 Multinucleado Var. Zeae KX468819 Cebola Paracatu MG

CNPAF_0193 Multinucleado T. cucumeris AG4-HG1 KX468820 Feijão-Aveia Guamiranga PR

CNPAF_0211 Multinucleado Var. Oryzae KM065569 Arroz Santo Antônio de Goiás GO

CNPAF_0212 Multinucleado Var. Circinata KM065570 Arroz Santo Antônio de Goiás GO

CNPAF_0214 Multinucleado T. cucumeris AG1-1E KX468821 Feijão Sorriso MT

CNPAF_0215 Multinucleado T. cucumeris AG1-1A KX468822 Feijão Sorriso MT

CNPAF_0224 Multinucleado T. cucumeris AG1-1E KX468823 Feijão Sorriso MT

CNPAF_0236 Multinucleado T. cucumeris AG1-1E KX468824 Mata Mucajaí RR

CNPAF_0237 Multinucleado T. cucumeris AG1-1A KX468825 Mata Mucajaí RR

CNPAF_0238 Multinucleado T. cucumeris AG1-1E KX468826 Mata Cantá RR



CNPAF_0241 Multinucleado T. cucumeris AG1-1D KX468829 Cerrado Boa Vista RR

CNPAF_0242 Multinucleado T. cucumeris AG1-1E KX468830 Cerrado Boa Vista RR

CNPAF_0244 Multinucleado T. cucumeris AG1-1A KX468831 Cerrado Boa Vista RR

CNPAF_0246 Multinucleado T. cucumeris AG1-1D KX468832 Cerrado Boa Vista RR

CNPAF_0248 Multinucleado T. cucumeris AG1-1E KX468833 Mata Cantá RR

CNPAF_0249 Multinucleado T. cucumeris AG1-1A KX468834 Mata Cantá RR

CNPAF_0255 Multinucleado Ceratobasidium AG-Fa KX468835 Solo Unaí MG

CNPAF_0256 Multinucleado Var. Zeae KX468836 Solo Unaí MG

CNPAF_0258 Multinucleado Ceratobasidium AG-P KX468837 Solo Unaí MG

CNPAF_0261 Binucleado Ceratobasidium AG-F KX468838 Solo Unaí MG

CNPAF_0263 Binucleado Ceratobasidium AG-P KX468839 Solo Unaí MG

CNPAF_0269 Binucleado Ceratobasidium AG-F KX468840 Solo Luís E. Magalhães BA

CNPAF_0274 Multinucleado Var. Zeae KX468841 Solo Luís E. Magalhães BA

CNPAF_0276 Multinucleado Var. Zeae KX468842 Solo Luís E. Magalhães BA

22

O isolamento das cepas foi realizado adaptando-se os protocolos de

Weinhold (1977) e de Paulitz e Schroeder (2005). Pelo método de Weinhold, obtém-

se os isolados de Rhizoctonia spp. originados de fragmentos de matéria orgânica

distribuídos em placas de Petri com meio ágar-água + cloranfenicol 200 ppm, após

incubação a 25 + 1°C por cinco dias. No protocolo de Paulitz e Schroeder (2005),

resumidamente, seis palitos de dente autoclavados foram inseridos em 200g de solo

disposto em potes de polipropileno identificados e incubados durante cinco dias a 25

+ 1°C. Após esse período, os palitos colonizados foram transferidos para placas de

Petri contendo meio de cultura ágar-ágar com cloranfenicol a 200 ppm.

Após cinco dias, as colônias com características morfológicas típicas do

gênero Rhizoctonia (hifas com septos “doliporo”, com espessura acima de 5mm e

ramificações com ângulo de 90º, além de crescimento geralmente rápido a 25º C,

sem produção de esporos nesta fase anamórfica, conforme observações ao

microscópio óptico a 100x foram repicadas para placas de Petri contendo meio BDA

+ Cloranfenicol 200 ppm, sendo incubadas também por cinco dias, a 25 + 1°C. Os

isolados obtidos passaram por crescimento em meio líquido enriquecido PD (potato,

dextrose) sendo cultivados em shaker a 180 rpm e 28°C por 72h para a obtenção de

micélio. Decorrido este tempo, o micélio foi filtrado através de um funil de “Buchner”.

Isolamento e quantificação do DNA Genômico

O micélio foi macerado em almofariz com nitrogênio líquido até se tornar pó.

Ao micélio em pó foi acrescentado 0,8 ml do tampão de extração de DNA (Tris-HCl

100mM, NaCl 1,4 M, 0,02% β-mercaptoetanol, 10µl de RNAse A e EDTA 5mM pH

8,0), pré-aquecidos a 65ºC em banho-maria (Lopes et al. 2012). Esta solução foi

mantida em banho-maria a 65 °C, sob suave agitação, durante 20 minutos e

centrifugada a 12000 x g durante 10 minutos. Após a centrifugação, foi coletado o

sobrenadante e acrescentado 0,4 ml de fenol equilibrado em tampão Tris-HCl, pH

8,0 e 0,4 ml de clorofórmio e álcool isoamílico (49:1) e centrifugado a 12000 x g por

10 minutos. Novamente 0,4 ml de clorofórmio e álcool isoamílico (49:1) foi

adicionada ao sobrenadante coletado e em seguida centrifugado a 12000 x g

durante 15 minutos. Após a extração do sobrenadante, foi adicionado 0,8 ml de

isopropanol e em seguida centrifugado a 12000 x g por 15 minutos. O pellet de DNA

foi lavado em solução de etanol 70% (v/v) e ressuspendido 100 µl de água estéril. As

23

amostras de DNA foram então quantificadas e avaliadas quanto à sua qualidade por

espectrofotometria ultravioleta nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm.

Amplificação da região ITS e sequenciamento

A região ITS1-5.8S-ITS2 foi amplificada por reação em cadeia da polimerase

(PCR) usando a combinação dos primers ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')

e ITS4 (5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') (White et al., 1990). Após amplificação,

os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,2 % e

purificados utilizando o protocolo baseado em precipitação por polietileno glicol

(PEG) - 20% PEG, 2,5 M NaCl, 80% etanol e etanol puro. Os produtos da

purificação foram usados na reação de sequenciamento utilizando DYEnamicTM ET

Terminator Cycle Sequencing kit (GE Healthcare, USA) O sequenciamento foi

realizado no sequenciador ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).

Morfologia de Colônia e Condição nuclear

Os isolados foram analisados através de inspeção visual para observação da

morfologia de colônias (coloração de micélio e presença/ausência de escleródios). O

procedimento para a avaliação da condição nuclear envolveu a retirada um disco de

5mm de diâmetro contendo meio BDA e micélio, transferindo-o para uma lâmina de

vidro para microcultura. A coloração de núcleos foi realizada utilizando-se o corante

Safranina-O, como descrito por (Bandoni 1979). A contagem de núcleos foi realizada

observando-se dez células por lâmina. Para cada isolado foram feitas dez lâminas.

Determinação de AGs e inferência filogenética dos isolados

As sequências obtidas foram identificadas através do algoritmo BLAST

(Altschul et al. 1997), comparando-as com as sequências depositadas no banco de

dados não redundante do National Center for Biotechnology Information, disponível

em (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). A identificação das sequências foi procedida

utilizando-se o melhor resultado BLAST (best hit) de cada comparação. O banco de

dados do NCBI para Rhizoctonia apresenta muitas sequências parcialmente

identificadas e assim, nos casos em que o best hit não permitiu a identificação direta

das sequências utilizadas neste estudo, a identificação foi procedida a partir do

melhor score, cujas informações do banco de dados permitissem chegar ao nível de

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

24

espécie. Nesses casos, a observação de descritores importantes, como coloração

de micélio e condição nuclear auxiliou na identificação dos isolados.

Após identificação, as sequências foram alinhadas utilizando-se o programa

Clustal X – v2.1.0.0 (Thompson et al. 1997). O alinhamento foi ajustado

manualmente, tendo as extremidades sido podadas através do programa Bioedit –

v7.1.7.0 (Hall 1999). Todas as sequências foram depositadas no Genbank, e as

culturas dos isolados em estudo foram depositadas na Coleção de Fungos e

Microrganismos Funcionais da Embrapa Arroz e Feijão (Santo Antônio de Goiás,

GO).

As sequências mais similares e que serviram para identificação dos isolados

foram utilizadas para a análise de agrupamentos filogenéticos. Objetivando uma

melhor descrição dos agrupamentos, foram construídas três árvores filogenéticas:

uma contendo as sequências dos isolados do gênero teleomorfo Thanatephorus

(R. solani), outra com as sequências de Ceratobasidium (Rhizoctonias binucleadas)

e uma última contendo sequências dos isolados pertencentes ao gênero Waitea. O

software Mega (Molecular Evolution Genetics Analyses), versão 6.06 (Tamura et al.

2013), foi utilizado para a escolha do modelo evolutivo melhor adaptado a homologia

da sequência de nucleotídeos, de cada conjunto de dados, e para produzir as

topologias de árvores filogenéticas com base no menor valor do critério de

informação Bayesiana (BIC). Para Thanatephorus e Waitea o modelo sugerido foi

GTR + I (General Time Reversible + Invariant Sites), enquanto para Ceratobasidium

o modelo sugerido foi Jukes-Cantor (JC) (Jukes e Cantor 1969). Todas as árvores

filogenéticas foram construídas utilizando-se o método estatístico máxima

verossimilhança, com base em 1000 bootstraps.

Testes de patogenicidade em feijão e milho

A avaliação da patogenicidade dos isolados foi conduzida de acordo com o

método da “camada única de inóculo” descrito por Chaudhary et al. (2006).

Recipientes de polipropileno de 500 mL foram utilizados para plantio em vermiculita

na presença dos isolados testados. Cada recipiente foi preparado na seguinte

ordem: 6cm de vermiculita autoclavada; uma colônia de 9 cm de diâmetro do isolado

cultivado em BDA, cuidadosamente removida de placa de Petri; outra camada

vermiculita, agora de 1,0; e finalmente, cinco sementes de feijão cv. Pérola

25

previamente desinfestadas em NaClO 0,5% e enxaguadas por três vezes em água

destilada autoclavada.

As sementes foram cobertas com mais uma camada de 2,0 cm de vermiculita,

e incubadas a 20+ 2ºC por 21 dias em câmara de crescimento sob fotoperíodo de 12

horas, e irrigadas três vezes por semana. O mesmo procedimento foi utilizado para

sementes de milho. Os experimentos foram montados utilizando-se o delineamento

inteiramente casualizado, com duas repetições e cinco plantas por parcela

experimental, utilizando-se também testemunhas não infestadas.

Após o período de incubação, as plantas foram lavadas em água corrente

para a retirada de resíduos de vermiculita e posterior avaliação da severidade da

doença. Para a avaliação da severidade da doença em raízes de feijão comum e de

milho, utilizou-se a escala de notas de 1 a 9, conforme protocolo desenvolvido por

Schoonhoven e Pastor-Corrales (1987), sendo considerados patogênicos os

isolados que apresentaram índice de severidade maior ou igual a 2. Os resultados

obtidos para a severidade da doença foram então submetidos ao teste de Kruskal-

Wallis (KW) com nível de significância de 5% (α= 0,05). O teste de KW é um teste

não paramétrico utilizado na comparação de três ou mais amostras independentes e

é análogo ao teste F usado na análise de variância (ANOVA). O teste KW foi

utilizado para a realização de duas análises: uma delas considerando os índices de

severidade da doença obtidos pelos isolados dentro de cada um dos gêneros e outra

considerando os índices de severidade da doença obtidos pelos isolados dentro de

seus respectivos AGs/variedade, individualmente. Todas as análises estatísticas

foram realizados no software Statistica (StatSoft Inc., 2007).

Análises de distribuição espacial associando a identificação dos isolados e os

resultados de testes de patogenicidade ao ponto geográfico em que os isolados

foram coletados foram conduzidas utilizando-se o software ArcGIS (ESRI 2011).

26

Resultados

Identificação molecular, morfologia de colônias e condição nuclear

Todos os 81 isolados avaliados pertencem ao gênero Rhizoctonia de acordo

com descritores morfológicos e sequências avaliadas com o Blast-NCBI. Os isolados

identificados como W. circinata apresentaram-se multinucleados e com micélio de

coloração alaranjada, salmão ou marrom claro. Após 40 dias de cultivo em BDA,

isolados da var. zeae e var. circinata formaram escleródios. Não foram observados

escleródios no isolado identificado como var. oryzae. Os isolados identificados como

T. cucumeris também apresentaram vários núcleos por célula, com a coloração do

micélio variando entre o marrom claro e o marrom escuro. Isolados de AG1 e AG4

apresentaram formação de escleródios, cujas dimensões, quantidades e coloração

variaram em função dos ISGs. Quase todos os isolados identificados como

Ceratobasidium apresentaram dois núcleos por célula, com exceção dos isolados

CNPAF_0036, CNPAF_0255, CNPAF_0258, que foram multinucleados. A maior

parte dos isolados de Ceratobasidium apresentaram micélio branco-amarelado, de

aspecto pulverulento, com anéis concêntricos e número variável de escleródios,

também branco-amarelados (Tabela 1) (Figura 2).

Determinação de AG e Análises filogenéticas

A maior parte dos isolados estudados foi identificada como W. circinata,

aproximadamente 40% do total, sendo var. zeae a espécie mais representativa do

gênero (var. zeae = 19,75%, var. circinata = 18,5%, var. oryzae = 1,23%). Isolados

identificados como pertencentes à AGs de T. cucumeris corresponderam a 37% do

total. AG1-1E e AG4-HGI foram os grupos mais frequentes (AG1-IA = 4,94%, AG1-

1B = 3,70%, AG1-ID = 2,47%, AG1-1E = 9,88%, AG4-HGI = 9,88% e AG4-HGIII =

6,17%). O gênero Ceratobasidium correspondeu a 23% do total de isolados, com

maior ocorrência para AG-A (AG-A = 8,64%, AG-F = 6,17%, AG-Fa = 3,70%, AG-P =

2,47 %, e AG-G e AG-R ambos com 1,23% dos isolados)

De acordo com a distribuição geográfica e a frequência dos isolados

amostrados (Tabelas 1 e 2) observa-se que isolados de W. circinata foram

concentrados em Goiás, Minas Gerais, Paraná e Tocantins. Apenas dois grupos de

anastomose de T. cucumeris foram identificados: AG1 e AG4. O grupo AG1 se

27

Fig. 2. Padrões culturais das colônias de AGs/variedades identificados neste trabalho. A-F: Ceratobasidium (AGA, AGF, AGFa, AGG, AGP e AGR); G-L: T. cucumeris (AG1-IA, AG1-IB, AG1-ID, AG1-IE, AG4-HGII e AG4-HGIII); M-O: W. circinata (var. circinata, var. oryzae, var. zeae).

28

Tabela 2. Número e frequências absolutas e relativas de isolados do gênero Rhizoctonia identificados em nível de espécie, identificados em solos do Cerrado brasileiro e áreas adjacentes.

Teleomorfo Anamorfo Variedade/AG Número

de isolados

Frequência (%)

Waitea circinata

R. zeae Zeae 16 19,75

39,51 R. oryzae Oryzae 1 1,23

- Circinata 15 18,52

Ceratobasidium Ceratorhiza

AG-A 7 8,64

23,46

AG-F 5 6,17

AG-Fa 3 3,7

AG-G 1 1,23

AG-P 2 2,47

AG-R 1 1,23

Thanatephorus cucumeris Rhizoctonia solani

AG1-IA 4 4,94

37,04

AG1-IE 8 9,88

AG1-IB 3 3,7

AG1-ID 2 2,47

AG4-HGI 8 9,88

AG4-HGIII 5 6,17

Total de isolados 81 100 100

29

apresentou em quatro ISGs: IA, IB, ID e IE, enquanto os isolados de AG4 se

distribuíram nos ISGs HGI e HGIII. Todos os isolados de AG4 foram provenientes de

áreas agrícolas. Já os isolados de AG1 foram oriundos de áreas de cultivo e também

de regiões de mata e cerrado. Isolados de AG1 foram distribuídos entre o centro e o

norte do Brasil, enquanto isolados de AG4 entre o centro e o sul do país. Em

Ceratobasidium, a maior parte dos isolados identificados como AG-A foi oriunda de

áreas de produção de feijão, assim como AG-F e AG-Fa. Os grupos AG-G e AG-R

foram isolados de solos provenientes de áreas de produção de cenoura e cebola,

respectivamente.

Nas análises filogenéticas, os agrupamentos formados entre as sequências

dos isolados estudados e aquelas obtidas no NCBI confirmaram a identificação de

quase todos os isolados, obtida através do algoritmo Blast. Em geral, os

agrupamentos ocorreram entre isolados de um mesmo AG/variedade, mas isolados

de AG1-IA e AG1-IE ocuparam um mesmo clado. Var. zeae, AG4-HGI e AG4-HGIII

dividiram-se em dois clados cada, localizados separadamente em suas respectivas

árvores. É possível observar que em alguns casos houve estruturação geográfica,

com agrupamentos de isolados ocorrendo preferencialmente por estado, como em

Roraima, Mato Grosso, Paraná e Minas Gerais (Tabela 1; Figuras 3, 4, 5).

30

Fig. 3. Arvore filogenética contendo as sequências de isolados de W. circinata, identificados neste estudo. Em verde: var. zeae; em azul: var. oryzae e em vermelho: var. circinata.

31

Fig. 4. Árvore filogenética contendo as sequências de isolados de Ceratobasidium identificados neste estudo. Em vermelho: AG-A; Em azul: AG-F; Em azul claro: AG-Fa; Em púrpura: AG-G; Em verde escuro: AG-P; Em verde claro: AG-R.

32

Fig. 5. Árvore filogenética contendo as sequências de isolados de T. Cucumeris identificados neste estudo. Em vermelho: isolados de AG1 (ISGs IA, IB, ID e IE); em azul: isolados AG4 (ISGs HGI e HGIII).

Testes de patogenicidade em Feijão e Milho

Os testes de patogenicidade em milho e feijão revelaram que 53,1% dos

isolados infectam feijão e 45,7% infectam milho. Vinte e dois isolados (27,1% do

total) atacam raízes das duas culturas. Destes, 12 pertencem a T. Cucumeris

(CNPAF - 0076, CNPAF-0119, CNPAF - 0144, CNPAF - 0152, CNPAF - 0180,

CNPAF - 0189, CNPAF - 0193, CNPAF - 0215, CNPAF - 0238, CNPAF - 0240,

CNPAF - 0246, CNPAF – 0248); seis a Ceratobasidium (CNPAF - 0088, CNPAF -

0093, CNPAF - 0117, CNPAF - 0129, CNPAF - 0255, CNPAF – 0258) e quatro a

33

variedades de W. circinata (CNPAF - 0138, CNPAF - 0148, CNPAF - 0178, CNPAF –

0211).

Quando os índices de severidade da doença foram agrupados e analisados

por gênero, o teste KW revelou diferenças significativas em relação a

patogenicidade em feijão (KW=19.05949 - p = 0.0001), mas não em milho

(KW=0.8705978 - p = 0.6471). Em ambos os casos, Thanatephorus e

Ceratobasidium provocaram maior severidade média de doença em milho e feijão,

quando comparados a Waitea (Figura 5). Quando os índices de severidade da

doença foram analisados agrupando os isolados através de seus respectivos

AGs/variedades identificados, os resultados mostraram diferenças estatisticamente

significativas entre as atividades dos diferentes AGs/variedades, tanto para a

patogenicidade em feijão (KW=142.3447 - p = 0.000) quanto para a patogenicidade

em milho (KW=96.53016 - p = 0.0000), com destaque para AG4-HGI

(Thanatephorus) e AG-R (Ceratobasidium) (Figura 6).

Fig. 6. Severidade média de podridão radicular em plantas de feijão e de milho, causada por isolados dos gêneros Ceratobasidium, Thanatephorus e Waitea. Severidade da doença estimada através da escala proposta por Schoonhoven e Pastor-Corrales (1987).

34

Fig. 7. Severidade média de podridão radicular em plantas de feijão e de milho, causada por diferentes Grupos de Anastomose identificados neste estudo. Severidade da doença estimada através da escala proposta por Schoonhoven e Pastor-Corrales (1987).

35

Discussão

Os padrões morfológicos observados nos isolados foram compatíveis com a

descrição na literatura atualmente válida para Waitea, Ceratobasidium e

Thanatephorus (Demirci 1998; Leiner e Carling 1994; Kammerer et al. 2011; Muzhinji

et al. 2015; Sneh 1991). Especialmente em W. Circinata, a comparação de

morfologia de colônias tem sido considerada um importante instrumento para

diferenciar variedades (Toda et al., 2007). Entretanto, algumas descrições

observadas na literatura apresentam divergências, principalmente relacionadas à

coloração do micélio (Demicri 1998; De la Cerda et al. 2007; Toda et al. 2005; 2007).

Tais discrepâncias podem ser resultado do processo de adaptação do fungo aos

diferentes hospedeiros ou aos diferentes ambientes ocupados por fungos e

hospedeiros. Por outro lado, podem também ser resultado da avaliação fenotípica

em diferentes tempos de vida dos isolados. Toda et al. (2007) enfatizam que são

necessários 30 dias, ou mais, para comparação de morfologia de colônia, já que

durante este período, isolados trabalhados por ele passaram por modificações

fenotípicas.

O conflito existente entre a condição multinuclear dos isolados de

Ceratobasidium CNPAF_0036, CNPAF_0255, CNPAF_0258 e suas respectivas

identificações no Genebank não é um fato novo, e pode ser explicado pela sua

proximidade genética com o gênero Thanatephorus (anamorfo = R.solani). Esses

gêneros parecem ainda não ter passado por separação evolutiva completa (Ceresini

2014), o que pode ocasionar instabilidade na sistemática do grupo. Segundo Lübeck

(2004), existem relatos que colocam em dúvida a posição taxonômica de

determinados AGs dentro destes dois gêneros. Ainda de acordo com esta autora, já

foi observado, por exemplo, isolados de AG-6 (Thanatephorus) fundindo hifas com

AG-F (Ceratobasidium). Análises filogenéticas envolvendo rDNA, com forte suporte

estatístico, sugerem que alguns isolados classificados como Ceratobasidium, com

base na condição nuclear e reação de anastomose de hifas, podem ser mais

corretamente classificados dentro do gênero Thanatephorus (Gonzalez et al. 2001).

A ocorrência de determinadas espécies, AGs, subgrupos ou variedades de

Rhizoctonia em regiões geográficas distintas no Brasil pode estar relacionada não só

ao tipo de planta cultivada no momento da amostragem, mas também à

susceptibilidade da cultura precedente a estes fungos. Este efeito já foi observado

36

em Rhizoctonias associadas a batatas na África do Sul (Muzhinji et al. 2015). A

rotação de culturas é uma prática comum adotada por produtores rurais e é definida

regionalmente conforme critérios econômicos, sociais e climáticos. Juntamente com

a facilidade de sobrevivência de Rhizoctonias nos solos, o perfil de plantas

hospedeiras prevalentes em cada região pode ter influenciado na incidência e na

composição de AGs/variedades de Rhizoctonia identificados no presente trabalho,

em suas respectivas áreas de origem.

O histórico de cultivo das áreas amostradas, apresentado na Tabela 1 e a

análise da relação de hospedeiros de Rhizoctonia, descritos por Genhua e

Chengyum (2012) e Lakshman e Amaradasa (2014) sugerem que a distribuição

geográfica da maior parte dos isolados identificados neste trabalho pode mesmo ter

sido influenciada pela escolha das espécies cultivadas nestas áreas. A identificação

das variedades de W. circinata em cinco dos oito estados amostrados neste estudo

(Tabela 1), ilustra bem o aspecto acima descrito. Estes organismos causam uma

série de doenças em diferentes tipos de gramíneas (Kammerer et al. 2011), inclusive

milho e arroz (Lakshman e Amaradasa, 2014). Nesse sentido, é importante destacar

que Paraná, Goiás, Bahia, Minas Gerais (32, 492 mil toneladas de milho) e

Tocantins (600 mil toneladas de arroz), são grandes produtores destas duas

importantes culturas de grãos no Brasil (BRASIL 2015), podendo assim ter

colaborado para a fixação do patógeno nessas regiões, ao longo do tempo.

A espécie var. zeae foi a mais abundante entre os 81 isolados estudados,

tendo sido identificada em áreas agrícolas da Bahia, Goiás, Minas Gerais, Paraná e

Tocantins, apresentando-se, portanto, amplamente distribuída no Brasil (Tabelas 1 e

2). Esta espécie também já foi isolada por Poltronieri et al. (2002), que a descreveu

como causadora da podridão do milho no estado do Pará, o que aumenta mais

ainda a amplitude geográfica de sua distribuição. Dessa forma, sua ocorrência

parece não estar necessariamente associada a fatores ambientais ou climáticos, o

que pode ser constatado a partir da observação de trabalhos envolvendo isolados

dessa espécie nos mais variados climas e ambientes, de países como Turquia,

Estados Unidos, Argentina, China e Irã (Demirci 1998; Gutiérrez et al. 2007; Li et al.

1998; Telmadarrehei et al. 2011).

A var. oryzae teve baixa representatividade nas áreas amostradas, sendo

identificado apenas um isolado, em amostra de Santo Antônio de Goiás (Tabela 1).

Estudos sobre a ocorrência e distribuição da var. oryzae no Brasil ainda são

37

escassos, embora Prabhu et al. (2002) tenham isolado essa espécie em lavouras de

arroz irrigado, no Estado do Tocantins. Diferentemente das variedades oryzae e

zeae, W. circinata var. circinata é uma espécie descrita há relativamente pouco

tempo e tem sido relacionada a doenças em espécies de gramas pertencentes a

família Poaceae (Chen, et al. 2009). Os isolados brasileiros desta espécie foram

identificados em sua maior parte em Minas Gerais, formando o segundo maior

percentual de isolados amostrados (Tabelas 1 e 2). Aparentemente, este é o

primeiro relato sobre a ocorrência dessa variedade no Brasil.

A composição da diversidade dentro de Ceratobasidium no Cerrado agrícola

também parece ter sofrido influência das espécies de plantas escolhidas para cultivo

nas regiões de onde os fungos foram isolados. Dos seis grupos de anastomose

identificados neste trabalho, pelo menos cinco estão diretamente relacionados ao

feijoeiro comum: AG-A, AG-F, AG-G, AG-R e AG-P (Cardenas et al. 2015; Genhua e

Chengyum 2012) e um está indiretamente associado a esta cultura, já que

evidências filogenéticas sugerem que AG-Fa é um subgrupo de AG-F (Gurkanli e

Ozkoc 2011; Sharon et al. 2008). Com exceção de Tocantins, os demais estados em

que AGs de Ceratobasidium foram identificados são grandes produtores de feijão.

Juntos, Paraná, Minas Gerais, Bahia e Goiás produziram quase dois milhões de

toneladas na safra 2014/2015 (BRASIL 2015). A hipótese de que a diversidade de

Ceratobasidium pode ter sido influenciada pelo histórico de cultivos adotados nas

diferentes regiões agrícolas amostradas pode ser melhor analisada a partir da

observação conjunta das informações apresentadas na Tabela 1. Isolados

identificados como AG-A e AG-F no Paraná foram amostrados em áreas onde

tradicionalmente há produção de feijão. Em Minas Gerais, AG-A também foi

identificado em área de produção de feijão, assim como AG-Fa em Goiás e

Tocantins. Há ainda outras situações em que se pode observar uma provável

correlação entre grupos de anastomose identificados nas amostras de solo e a

cultura implantada na área de coleta. AG-P foi encontrado em Minas Gerais e

embora não tenha sido proveniente diretamente de áreas de plantio de feijão, a

região de origem das amostras (Unaí) é produtora de diferentes variedades desta

cultura (Barbosa 2009). Também em Minas Gerais, identificou-se o grupo de

anastomose AG-R em área de produção de cebola. A associação de AG-R a

doenças em cebola já foi observada por Burpe et al. (1980).

38

A ocorrência de AG-G (isolado CNPAF - 0113) em área de produção de

Cenoura (Campos Altos – MG) não indica necessariamente que já exista uma

associação específica entre esta cultura e o respectivo AG. Entretanto, AG-G já foi

identificado no Brasil causando podridão de raiz em Yacon (Fenile et al. 2005). Além

disso, cenoura e yacon pertencem a um mesmo táxon vegetal (Asterales) e

compartilham sinapomorfias morfológicas e moleculares (Judd et al. 2007). Esses

resultados sugerem a necessidade de estudos com maior representatividade,

envolvendo amostragem maior dentro de áreas geograficamente menores, além de

testes de patogenicidade para investigar possível associação entre AG-G e cenoura.

A análise da distribuição geográfica dos AGs de T. cucumeris revelou

semelhanças com os resultados obtidos para W. circinata e Ceratobasidium sp.,

acima discutidos. Observou-se uma estreita associação entre os grupos de

anastomose identificados e o histórico recente de cultivo das áreas amostradas,

para a maioria dos isolados. Em áreas de produção de feijão foram identificados os

grupos de anastomose AG1-IA e AG1-IE (Mato Grosso), AG4-HGI (Goiás, Paraná e

São Paulo) e AG4-HGIII (Goiás). AG4-HGI e AG4-HGIII também foram identificados

em áreas de soja (Goiás e Minas Gerais), também hospedeira destes grupos. AG1-

1B foi identificado em áreas de soja (Goiás) e Café (Minas Gerais) (Tabela 1). AG1-

IA e AG1-IE já foram descritos como patógenos de feijoeiro (González et al. 2012;

Mora-Umaña et al. 2013; Youssef et al. 2012), assim como AG4-HGI e AG4-HGIII

(Çebi Kılıçoğlu e Özkoç 2013; Ceresini 2014; Genhua e Chengyum 2012; Lakshman

e Amaradasa 2014). AG4-HGI e AG4-HGIII também já foram associados a doenças

em soja (Ceresini 2014; Fenile et al. 2002, 2003). A soja também é hospedeira de

AG1-1B (Lakshman; Amaradasa 2014; Youssef et al. 2012). AG1-IB já foi descrito

por Gaino et al. (2010) como patógeno de café.

Apesar dos resultados indicarem que a maior parte dos AGs de T. cucumeris

pode ter sido influenciada pelo histórico de cultivo para se estabelecer nas regiões

produtivas analisadas, é importante considerar, entretanto, que AG1-IA, AG1-ID e

AG1-1E também foram identificados em amostras de solo de mata e Cerrado

(Tabela 1). A identificação desses ISGs de AG1 em solos não cultivados no extremo

norte do Brasil (Roraima) sugere a existência de Rhizoctonias nativas, bem

adaptadas ao clima equatorial, onde prevalecem elevadas temperaturas e alta

pluviosidade.

39

Em países da América Central e Caribe, onde as condições climáticas são

semelhantes às de Roraima, a ocorrência e a associação do grupo AG1 e seus

respectivos ISGs ao feijoeiro estão descritas na literatura (Godoy-Lutz et al. 2008;

González et al. 2012; Mora-Umaña et al. 2013). Os grupos AG1-IA e AG1-IE, por

exemplo, estão entre os causadores da “mela” do feijoeiro (Godoy-Lutz et al. 2008),

doença severa que ataca a parte aérea, diminuindo o valor comercial dos grãos,

acarretando perdas econômicas importantes, e em muitos casos causando a morte

das plantas (Godoy-Lutz et al. 1996).

Por outro lado, apesar da distribuição geográfica dos AGs de T. cucumeris

identificados neste trabalho estar aparentemente correlacionada com as

especificidades culturais estabelecidas nas áreas estudadas, deve-se considerar

que os efeitos do ambiente podem ser igualmente determinantes na ocorrência de

AG1 no Brasil. O mesmo acontece com AG4. De fato, quando se compara a

distribuição dos isolados de AG1 e AG4 neste estudo, independente de seus

respectivos ISGs, observa-se que enquanto AG1 foi encontrado em áreas de

latitudes mais ao norte, AG4 ficou restrito a latitudes mais ao sul do país. O impacto

das condições climáticas e ambientais na distribuição desses respectivos AGs já foi

anteriormente detectado por Fenille et al. (2002) em áreas de produção de soja no

Brasil. Esses autores observaram em seu trabalho que enquanto isolados

provenientes de áreas agrícolas do Mato Grosso foram identificados como AG1 e

provocaram sintomas da “mela”, isolados identificados como AG4 e provenientes de

áreas agrícolas de Minas Gerais, Paraná e São Paulo foram associados com a

podridão de hipocótilo e raiz.

Analisando-se as árvores filogenéticas dos três gêneros identificados neste

estudo, é possível observar que isolados de uma mesma variedade ou AG tenderam

a se agrupar de acordo com a proximidade de suas origens, na maioria dos ramos,

sugerindo que dentro de uma mesma variedade ou AG pode haver correlação entre

distância genética e distância geográfica e restrição ao fluxo gênico nas áreas

estudadas.

Ainda que sejam levadas em consideração as diversas possibilidades para

dispersão das Rhizoctonias (sementes, compartilhamento de máquinas e utensílios

agrícolas entre diferentes lavouras, etc), os resultados sugerem que a distribuição

geográfica dos AGs/variedades nas áreas estudadas está, muito provavelmente,

mais relacionada com o histórico recente dos cultivos e às condições climáticas

40

locais do que com o mecanismo de fluxo gênico entre diferentes populações desses

fungos. Entretanto, estudos populacionais utilizando marcadores moleculares

específicos são necessários para investigar melhor essas questões.

Isolados de AG1-IA e AG1-IE ocuparam um mesmo clado, não apresentando

padrão de agrupamentos tipicamente esperado para grupos que já se separaram

evolutivamente. É importante considerar, entretanto, que ambos ISGs pertencem ao

mesmo AG e assim, o isolamento reprodutivo pode ainda não ter acontecido

totalmente na região onde foram coletados. Alternativamente, deve-se observar a

que a existência de múltiplas cópias da região gênica analisada, decorrente da

condição multinuclear desses fungos, pode significar uma limitação na reconstrução

das relações filogenéticas destes organismos. Novos estudos que contemple a

adição de mais regiões gênicas à ITS-rDNA nas análises deve esclarecer de

maneira definitiva as relações filogenéticas entre isolados brasileiros desses dois

grupos.

Analisando-se a Figura 2, é possível observar que os isolados AG1-IA e AG1-

IE são muito semelhantes, morfologicamente. Principalmente em relação ao número,

tamanho e disposição dos escleródios. É preciso considerar também que estudos

relatando a presença de AG1-IE no Brasil não são comuns, enquanto AG1-IA já foi

identificado nos estados do Acre, Maranhão, Norte do Mato Grosso, Rondônia, Sul

do Pará e Tocantins (Ceresini 2014; Poltronieri 2008; Youssef 2012), cujos territórios

pertencem à mesma região climática dos isolados AG1-IA - AG1-IE analisados

nesse estudo. Assim, é possível que todos os isolados localizados neste clado

sejam na realidade pertencentes apenas à AG1-IA.

Não é difícil supor também que tal semelhança morfológica possa conduzir a

equívocos de descrição de isolados, no momento de assinar as sequências durante

o depósito no NCBI. Como discutido por Sharon et al. (2006, 2008), muitas

sequências de Rhizoctonia são erroneamente assinadas no Genebank, o que pode

ocasionar equívocos durante processo de identificação. Nesse caso, porém, se

houve equívoco no processo de assinatura das sequências que serviram de base

para a identificação de AG1-IA e AG1-IE, obtidas no Norte do Brasil, está claro que o

equívoco se resume ao ISG (IA ou IE) e não à AG1, que é tipicamente encontrado

em zonas equatoriais (Godoy-Lutz et al. 2008; González et al. 2012; Mora-Umaña et

al. 2013). Estudos envolvendo reações de anastomose são indicados para

solucionar esta dúvida.

41

Os resultados dos testes de patogenicidade mostraram que parte significativa

dos isolados apresentou atividade fitopatogênica, com diferentes graus de

severidade entre os diferentes gêneros, entre diferentes AGs e entre isolados dentro

de um mesmo AG, em milho e feijão (Figuras 5 e 6). Essas diferenças se devem,

provavelmente, muito mais à variabilidade genética dos isolados do que às

especificidades dos AG identificados. É possível observar nas Figuras 7 e 8, por

exemplo, que isolados de AG1-1A e AG1-IB apresentaram-se hipovirulentos às

raízes de milho e feijão, respectivamente, apesar dessas plantas serem

reconhecidamente descritas com hospedeiras dessas duas espécies de plantas

(Ceresini 2014). Nesse caso, conclui-se que a variação genética presente nesses

isolados não foi suficientemente eficaz para desenvolver sintomas de sua atividade

fitopatogênica em milho e feijão.

42

Fig. 8. Distribuição geográfica da severidade da doença (podridão de raiz) no feijão, considerando os diferentes AGs/variedades identificados. AGs não patogênicos não são mostrados. A área do Cerrado brasileiro é destacada em cinza.

43

Fig. 9. Distribuição geográfica da severidade da doença (podridão de raiz) no milho, considerando os diferentes AGs/variedades identificados. AGs não patogênicos não são mostrados. A área do Ceraado brasileiro é destacada em cinza.

44

Conclusões

Nesse estudo foi possível observar que o gênero Rhizoctonia encontra-se

bastante diversificado em áreas agrícolas brasileiras, tendo sido identificados seus

principais grupos de fitopatógenos. Observou-se também que as suas espécies,

grupos de anastomose e variedades tendem a se distribuir preferencialmente

seguindo um gradiente latitudinal e de acordo com disposição geográfica das

culturas que utilizam como respectivas hospedeiras.

Os resultados aqui apresentados reafirmam a importância do gênero

Rhizoctonia no contexto da produção agrícola brasileira, sugerindo que mais estudos

com maior representatividade de amostras por área e com um conjunto mais

abrangente e diversificado de análises irão contribuir de maneira significativa para a

compreensão de aspectos importantes para o manejo e controle deste importante

grupo de fitopatógenos.

45

Referências Bibliográficas Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D. J., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402. Aiello, D., Vitale, A., Hyakumachi, M., Polizzi, G. 2012. Molecular characterization and pathogenicity of binucleate Rhizoctonia AG-F associated to the watermelon vine decline in Italy. European Journal of Plant Pathology 134, 1: 161-165. Amaradasa, B. S., Lakshman, D.K., McCall, D. Horvath, B. J. 2014. In Vitro Fungicide Sensitivity of Rhizoctonia and Waitea Isolates Collected from Turfgrasses. J. Environ. Hort. 32: 126-132. Azevedo, J. L., Pizzirani-Kleiner, A. A. 2002. Melhoramento de fungos de importância na agricultura. In: Melo, I. S., Valadares-Inglis, M. C., Nass, L. L., Valois, A. C. C. (orgs.) Recursos Genéticos e Melhoramento: microorganismos. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente. Bandoni, R. J. Safranin O as a rapid nuclear stain for fungi. Mycologia 71:873-874. 1979. Barbosa, F. R., Silva, C. C. Da., Gonzaga, A. C. De O., Silveira, P. M. Da., Quintela, E. D., Lobo Júnior, M., Cobucci, T., Del Peloso, M. J., Junqueira, R. B. M. Sistema de produção integrada do feijoeiro comum na região central brasileira. Santo Antônio de Goiás: Embrapa Arroz e Feijão, 2009. 28 p. (Embrapa Arroz e Feijão. Circular técnica, 86). Basseto, M. A., Filho, W. V. V., Filho, W. V. V. F., Souza, E. C., Ceresini, P. C. 2008. O papel de Rhizoctonia spp. binucleadas na indução de resistência a mela da soja. Acta Scientiarum. Agronomy, 30, 2: 183-189. Bolkan, H. A., Ribeiro, W. R. C. 1985. Anastomosis groups and pathogenicity of Rhizoctonia solani isolates from Brazil. Plant Disease 69:599-601. Branco, S., Bruns, T. D., Singleton, I. 2013. Fungi at a small scale: spatial zonation of fungal assemblages around single trees. PLoS One, 8: 10, e78295. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Projeções do agronegócio: Brasil 2014/15 a 20124/25: projeções de longo prazo. 6. ed. Brasília: AGE/Mapa, 2015. Disponível em: <http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/PROJECOES_DO_AGRONEGOCIO_2025_WEB.pdf>. Acesso em 15 jun. 2016. Bruns, T. D., White, T. J., Taylor, J.W. 1991. Fungal molecular systematics. Annual Review of Ecology and Systematics 22: 525-564. Burpee, L. L., Sunders, P. L., Cole, H. Jr., Sherwood, R. T. 1980. Anastomosis groups among isolates of Ceratobasidium cornigerum and related fungi. Mycologia, 72: 689–701

46

Cardenas, G. E. M., Galvan, M. Z., Barrera, V. A., Rodriguero, M. S., Carmona, M. A., March, G. J., Ramallo, A. C., Shew, H. D. 2015. Molecular identification and pathogenicity of Rhizoctonia spp. from tobacco growing areas in northwestern Argentina. Tropical Plant Pathology, 40(3), 160-168. Cardoso, J. E., Echandi, E. 1987. Biological control of Rhizoctonia root rot of snap bean with binucleate Rhizoctonia-like fungi. Plant Disease, 71:167-170. Carling, D. E., Helm, D. J., Leiner. R. H. 1990. In vitro sensitivity of Rhizoctonia solani and other multinucleate and binucleate Rhizoctonia to selected fungicides. Plant Disease, 74: 860–863. Carling, D. E. 2000. Anastomosis group and subets of anastomosis group of Rhizoctonia solani. In: International Symposium on Rhizoctonia 3, Taichung, Abstract Taichung, ISR, p. 14, 2000. Carling, D. E., Baird, R. E., Gitaitis, R. D., Brainard, K. A., Kuniaga, S. 2002a. Characterization of AG-13, a Newly Reported Anastomosis Group of Rhizoctonia solani. Phytopathology 92: 893-899. Carling, D. E., Kuninaga, S., Brainard, K. A. 2002b. Hyphal Anastomosis Reactions, rDNA-Internal Transcribed Spacer Sequences, and Virulence Levels Among Subsets of Rhizoctonia solani Anastomosis Group-2 (AG-2) and AG-BI. Phytopathology, 92, 1: 43-50. Çebi Kılıçoğlu, M., Özkoç, İ. 2010. Molecular characterization of Rhizoctonia solani AG4 using PCR-RFLP of the rDNA-ITS region. Turk. J. Biol, 34: 261–269. Ceresini, P. C. 2014. Rhizoctonia como fitopatógeno: biologia e diversidade de Rhizoctonia solani em agroecosistemas tropicais e perspectivas do manejo da rhizoctoniose usando resistência de plantas. Pages 177 – 190 in: Sanidade de Raízes. 1ed. NEFIT – Núcleo de Estudos em Fitopatologia, São Carlos, SP. Ceresini, P. C., Gaino, A. P. S. C., Basseto, M. A., Gasparotto, L., Poltronieri, L. S 2010. Inferência filogenética revela a complexa etiologia das manchas areolada e foliar em seringueira e em outras espécies cultivadas na Amazônia. Acta Scientiarum. Agronomy 32, 3: 385-395. Ceresini, P. C., Shew, P. C., Vilgays, R. J., Gale, L. R., Cubeta, M. A. 2003. Detecting Migrants in Populations of Rhizoctonia solani Anastamosis Group 3 from potato in North Carolina Using Multilocus Genotype Probabilities. Phytopathology 93, 5: 610-615. Ceresini, P.C., Souza, N. L. 1997. Associação de Rhizoctonia spp. binucleadas e R. solani Kühn AG4 HGI e AG 2-2 IIIB ao feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) no Estado de São Paulo. Summa Phytopathologica, 23: 14-24. Chaijuckam, P., Davis, R. M. 2010. Characterization of Diversity Among Isolates of Rhizoctonia oryzae-sativae from California Rice Fields. Plant Disease 946: 690-696.

47

Chaudhary, T. T., Anderson, T. T., Park, S. J., Yu, K. 2006. Comparison of screening methods for resistance to Fusarium root rot in common beans (Phaseolus vulgaris L.). Journal of Phytopathology, 154: 303- 308. Chen, C-M., de la Cerda, K. A., Kaminski, J. E., Douhan, G. W., Wong, F. P. 2009. Geographic Distribution and rDNA-ITS Region Sequence Diversity of Waitea circinata var. circinata Isolated from Annual Bluegrass in the United States. Plant Disease 93: 906-11. Ciampi, M. B., Gale, L. R., Lemos, E. G. de M., Ceresini, P. C. 2009. Distinctively variable sequence-based nuclear DNA markers for multilocus phylogeography of the soybean-and rice-infecting fungal pathogen Rhizoctonia solani AG-1 IA. Genetics and Molecular Biology. 32: 840-846. Ciampi, M. B., Kuramae, E. E., Fenille., R. C. Meyer, M. C., Souza, N. L., Ceresini, P. C. 2005. Intraspecific Evolution of Rhizoctonia solani AG-1 IA Associated with Soybean and Rice in Brazil based on Polymorphisms at the ITS-5.8S rDNA Operon. European Journal of Plant Pathology 1132: 183-196. Costa, R. C., Verzignassi, J. R., Poltronieri, T. P. S., Poltronieri, L. S., Monteiro, L. C. 2013. Novos hospedeiros de Ceratobasidium ochroleucum, agente causal da queima-do-fio no Pará. Summa Phytopathologica, 39, 1: 62. De la Cerda, K., Douhan, G., Wong, F. 2007. Discovery and characterization of Waitea circinatavar. circinataaffecting annual bluegrass from the Western United States. Plant Disease, 91: 791-797. Demirci, E. 1998. Rhizoctonia species and anastomosis groups isolated from barley and wheat in Erzurum, Turkey. Plant Pathology, 47, 1: 10-15. ESRI. 2011. ArcGIS Desktop: Release 10. Redlands, CA: Environmental Systems Research Institute. Erper, I. Karaca, G. H. Turkkan, M.; Ozkoc, I. 2006. Characterization and pathogenicity of Rhizoctonia spp. from onion in amasya. Journal of Phytopathology, 154: 75-79. Escandi, A. R., Echandi, E. 1991. Protection of potato from Rhizoctonia canker with binucleate Rhizoctoniafungi. Plant Pathology, 40: 197-202. Fang, X., Finnegan, P. M., Barbetti, M. J. 2013. Wide variation in virulence and genetic diversity of binucleate Rhizoctonia isolates associated with root rot of strawberry in Western Australia. PLoS One, 8, 2: 1-14. Fenille, R. C., Ciampi, M. B., Souza, N. L., Nakataniand, A. K., Kuramae, E. E. 2005 Binucleate Rhizoctonia sp. AG-G causing rot rot in yacon (Smallanyhussonchifolius) in Brazail. Plant Pathology, 54,325-330.

http://lattes.cnpq.br/9653651998570946

48

Fenille, R. C., Kuramae, E. E., Souza, N. L. 2003. Identification of Rhizoctonia solani Associated with Soybean in Brazil by rDNA-ITS Sequences. Fitopatologia Brasileira, 28, 4: 413-419. Fenille, R. C., Souza, N. L., Kuramae, E. E. 2002. Characterization of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil. European Journal of Plant Pathology, 108, 8: 783-792. Gaino, A. P. S. C., Basseto, M. A., Gasparotto, l., Poltronieiri, l. S., Ceresini, P. C. 2010. Inferência filogenética revela a complexa etiologia das manchas areolada e foliar em seringueira e em outras espécies cultivadas na Amazônia. Acta Scientiarum. Agronomy, 32: 385-395. Genhua, Y., Chengyun, L. 2012. General Description of Rhizoctonia Species Complex, Plant Pathology, Dr. Christian Joseph Cumagun (Ed), InTech, DOI: 10.5772/39026. Disponível em: http://www.intechopen.com/books/plant-pathology/general-description-of-rhizocotonia-species-complex. Acesso: 20/12/14. Godoy-Lutz, G., Arias. J., Steadman, J. R., Eskridge, K. M. 1996. Role of natural seed infection by the web blight pathogen in common bean seed damage, seedling emergence, and early disease development. Plant Disease, 80: 887–890. Godoy – Lutz, G., Steadman, J. R., Higgins, B., Powers, K. 2003. Genetic Variation Among Isolates of the Web Blight Pathogen of common bean. Plant Disease, 87, 7: 766-771. Godoy-Lutz, G., Kuninaga, S., Steadman, J. R., Powers, K. 2008. Phylogenetic analysis of Rhizoctonia solani subgroups associated with web blight symptoms on common bean based on ITS-5.8S rDNA. Journal of General Plant Pathology, 74: 32–40. González-García, V., Portal-Onco, M. A., Rubio-Susan, V. 2006. Review: Biology and Systematics of the form genus Rhizoctonia. Span. J. Agric. Res. 4: 55-79. González, M. D. 2013. Identification, molecular characterization, and evolution of group I introns at the expansion segment D11 of 28S rDNA in Rhizoctonia species. Fungal Biology 117: 623-637. González, M. D., Carling, D. E., Kuninaga, S., Vilgalys, R., Cubeta, M. A. 2001. Ribosomal DNA systematics of Ceratobasidium and Thanatephorus with Rhizoctonia anamorphs. Mycologia, 93: 1138-1150. González, M. D., Cubeta, M. A., Vilgalys, R. 2006. Phylogenetic utility of indels within ribosomal DNA and beta-tubulin sequences from fungi in the Rhizoctonia solani species complex. Molecular Phylogenetic Evolution, 40, 2: 459-470. González, N., Godoy-Lutz, G., Steadman, J. R., Higgins, R., Eskridge, K. M. 2012. Assessing genetic diversity in the web blight pathogen Thanatephorus cucumeris (anamorph = Rhizoctonia solani) subgroups AG 1-IE and AG 1-IF with molecular markers. Journal of General Plant Pathology, 78: 85-98.

http://www.intechopen.com/books/plant-pathology/general-description-of-rhizocotonia-species-complex


49

Goulart, A. C. P., Assis, J. B., Ciampi, M. B., Ceresini, P. C. 2011. Ocorrência de mela causada por Rhizoctonia solani AG4-HGI em plântulas de algodoeiro no brasil. Summa Phytopathologica 37, 1: 68-69. Gunnell, P. S. 1986. Characterization of the teleomorphs of Rhizoctonia oryzae-sativae, Rhizoctonia oryzae, and Rhizoctonia zeae, an the effect of cultural practices on aggregate sheath spot of rice, caused by R. oryzae sativae. Ph.D. thesis. University of California, Davis. Guillemaut, C., Edel-Herman, V., Camporota, P., Alabouvette, C., Richard-Molard, M., Steinberg, C., 2003. Typing of anastomosis groups of Rhizoctonia solani by restriction analysis of ribosomal DNA. Canadian Journal of Microbiology, 49: 556–568.

Gutiérrez, S. A., Cúndom, M. A., Barrera, V., Gasoni, L. 2007. First record of Rhizoctonia Zeae on corn in Argentina. Australasian Plant Disease Notes, 2, 137-138. Gurkanli, C. T., Ozkoc, I. 2011. First report of B. N. Rhizoctonia from Tobacco (Nicotiana tabacum L.) in Samsum, Turkey. Pakistan Journal of Botany, 43: 51–57. Hall, T. 2014. BioEdit v7.0.9: Biological sequence alignment editor for Win95/98/2K/XP/7. Disponível em: http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/page2.html. Acesso em: Julho de 2015. IBGE. Mapas de biomas e de Vegetação. 2004. Disponível em: http://www.ibge.gov.br/home/presidencia/noticias/21052004biomashtml.shtm. Acesso em: 29 de setembro de 2016. Judd, W. S., Campbell, C. S., Kellogg, E. A., Stevens, P. F., Donoghue, M.G. 2007. Sistemática Vegetal: um enfoque filogenético. Porto Alegre: Artmed. 3ª ed. Jukes, T. H; Cantor, C. R . Evolution of protein molecules. In: Munro, H. N. (Ed.). Mammalian Protein Metabolism, New York: Academic Press,1969, p. 21-132. Kammerer, S. J., Burpee, L. L., Harmon, P. F. 2011. Identification of a New Waitea circinata Variety Causing Basal Leaf Blight of Seashore Paspalum. Plant Disease, 95, 5: 515-522. Kareem, T. A., Hassan, M. S. 2013. Molecular Characterization of Rhizoctonia solani. Diyala Agricultural Sciences Journal, 5, 2: 45-54. Kataria, H. R., Hugelshofer, U., Gisi, U. 1991. Sensitivity of Rhizoctonia species to different fungicides. Plant Pathol. 40:2 03–211. Kuninaga, S., Carling, D. E., Takeuchi, T., Yokosawa, R. 2000. Comparison of rDNA-ITS Sequences between Potato and Tobacco Strains in Rhizoctonia solani AG-3. Journal of General Plant Pathology, 66: 2-11.

http://www.ibge.gov.br/home/presidencia/noticias/21052004biomashtml.shtm

50

Kuninaga, S., Natsuaki, T., Takeuchi, T., Yokosawa, R. 1997. Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani. Current Genetics, 32: 237-243. Kuramae, E. E., Nozaki, D.N., Fenille, R. C., Ceresini, P. C., Souza, N. L. 2002. Elemento extracromossomal dsRNA em Rhizoctonia AG4 HGI e AG2-2 IIIB e Rhizoctonia spp. binucleada associados às culturas de feijão e amendoim. Summa Phytopatholgica, 28: 52-57. Kuramae E. E., Buzeto, A. L., Nakatani, A. K., Souza, N. L. 2007. rDNA-based characterization of a new binucleate Rhizoctonia spp. causing root rot on kale in Brazil. European Journal of Plant Pathology, 119: 469–475. Kuznia, R. A.; Windels, C. E. 1994. Rhizoctonia zeae pathogenic to spring wheat and sugarbeet seedlings. Phytopathology, 84: 1159. Lange, L. The importance of fungi and mycology for addressing major global challenges. 2014. Ima Fungus. 5, 2: 463-471. Lanoiselet, V. M., Cother, E. J., Ash, G. J., Harper, J. D. I. 2005. Yield loss in rice caused by Rhizoctonia oryzae and R. oryzae-sativae in Australia. Australasian Plant Pathology, 4: 175-179. Lakshman, D. K., Amaradasa, B. S. 2014. The pathogen biology, identification and management of Rhizoctonia species with emphasis on isolates infecting turfgrasses. Indian Phytopathology, 67 (4): 327-345. Leiner, R. H., Carling, D. E. 1994. Characterization of Waitea circinata (Rhizoctonia) isolated from agricultural soils in Alaska. Plant Disease, 78: 385-388. Li, H. R., Wu, B. C., Yan, S. Q., 1998. Aetiology of Rhizoctonia in sheath blight of maize in Sichuan. Plant Pathology, 47: 16-21. Lübeck, M. 2004. Molecular Characterization of rhizoctonia. Applied Mycology & Biotechnology, 4. Fungal Genomes, 205-224. Mathew, F. M., Lamppa, R. S., Chittem, K., Chang, Y. W., Botschner, M., Kinzer, K., Goswami, R. S., Markell, S. G. 2012. Characterization and Pathogenicity of Rhizoctonia solani Isolates Affecting Pisum sativum in North Dakota. Plant Disease, 96, 5: 666-672. May, G. S., Adams, T. H. 1997. The Importance of Fungi to Man. Genome Research, 7 (11): 1041-1044. Melo, I. S. Recursos genéticos microbianos. 2002. In: Melo, I. S., Valadares-inglis, M. C., Nass, L. L., Valois, A. C. C. (orgs.). Recursos Genéticos e Melhoramento: Microorganismos. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente.

51

Meyer, M. C., Yorinori, J. T. 1999. Incidência de doenças da soja em regiões tropicais. In: Congresso Brasileiro de Soja, Londrina. Anais. Londrina, Embrapa Soja, 1999, p. 457. (Embrapa Soja. Documentos, 124). Mora-Umaña, F., Barboza, N., Alvarado, R., Vásquez, M., Godoy-Lutz, G., Stedman, J.R., Ramírez, P. 2013. Virulence and Molecular Characterization of Costa Rican Isolates of Rhizoctonia solani from Common Bean. Tropical Plant Pathology, 38: 461-471. Muzhinji, N., Truter, M., Woodhall, J. W., van der Waals, J. E. 2015. Anastomosis Groups and Pathogenicity of Rhizoctonia solani and Binucleate Rhizoctonia from Potato in South Africa. Plant Disease, 99, 12: 1790 – 1802. Nakatani, A. K. 2006. Diversidade genética de Rhizoctonia spp. e análise de seqüências multilocos 2006. Tese. Universidade Estadual Paulista – UNESP. 98 f. Nechet, K. L., Halfeld-Vieira, B. A. 2006. Caracterização de isolados de Rhizoctonia spp., associados à mela do feijão caupi (Vigna unguiculata), coletados em Roraima. Fitopatologia Brasileira 31:505-508. Ogoshi, A., Oniki, M., Araki, T., Ui, T. 1983. Anastomosis groups of binucleate Rhizoctoniain Japan and North America and their perfect states. Trans Mycol Soc Jpn, 24: 79–87. Ogoshi, A. 1987. Ecology and pathogenicity of anastomosis and intraspecific groups of Rhizoctonia solani Kühn. Annual Review of Phytopathology 25, 1: 125-143. Ogoshi, A.; Cook, R. J.; Bassett, E. N. 1990. Rhizoctonia species and anastomosis groups causing root rot of wheat and barley in the Pacific Northwest. Phytopathology, 80: 784-788. Oniki, M.; Ogoshi, A.; Araki, T.; Sakai, R.; Tanaka, S. 1985. The perfect state of Rhizoctonia oryzae and R. zeae and anastomosis groups of Waitea circinata. Trans. Mycol. Soc. Jpn, 26: 189-198. Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. 2002. Diversity and Host Specificity of Endophytic. American Journal of Botany 89, 11: 1852–1858. Paulitz, T. C., Okubara, P. A. 2006. First report of damping-off of canola caused by Rhizoctonia solani AG2–1 in Washington State. Plant Disease, 90, 6: 829.

Paulitz, T. C., Schroeder, K. L. 2005. A New Method for the Quantification of Rhizoctonia Solani and R. oryzae from Soil. Plant Disease, 89, 7: 767-772. Poltronieri, L. S., Trindade, D. R., Albuquerque, F. C. 2002. Rhizoctonia zeae Causando Podridão em Milho no Estado do Pará. Fitopatologia. Brasileira, 27, 4: 423-423 Poltronieri, L. S., Verzignassi, J. R., Benchimol, R. L. 2008. Tectonia grandis, nova hospedeira de Rhizoctonia solani no Pará. Summa Phytopathologica, 34, 2: 291.

52

Prabhu, A. S., Filippi, M. C., Silva, G. B., Santos, G. R. Resistência de cultivares de arroz a Rhizoctonia solani e Rhizoctonia oryzae. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, 37, 5: 589-595, 2002. Raven, P. H., Johnson, G. B. Biology. 5ª (Ed), Boston, MA. McGraw-Hill, 2002. 1344pp. Rinehart, T. A., Copes, W. E., Toda, T., Cubeta, M. A. 2007. Genetic Characterization of Binucleate Rhizoctonia Species Causing Web Blight on Azalea in Mississippi and Alabama. Plant Disease, 91, 5: 616-623. Roberts, P. 1999. Rhizoctonia-forming Fungi. A Taxonomic Guide. Royal Botanic Gardens, Kew, London, UK. Ross, R. E., Keinath, A. P., Cubeta, M. A. 1998. Biological control of wirestem on cabbage using binucleate Rhizoctonia spp. Crop Prot, 17: 99-104. Schoonhoven, A. V., Pastor-Corrales, M. A. Standard system for the evaluation of bean germplasm. Cali: CIAT - Centro Internacional de Agricultura Tropical, 1987, 53p. Sha, T., Xu, J., Palanichamy, M. G., Zhang, T. L., Zhao, Z., Zhang, Y. 2008. Genetic diversity of the endemic gourmet mushroom Thelephora ganbajun from south-western China. Microbiology, 154: 3460-3468. Sharon, M., Sneh, B., Kuninaga, S., Hyakumachi, M. 2006. The advancing identification and classification of Rhizoctonia spp. using molecular and biotechnological methods compared with the classical anastomosis grouping. Mycoscience, 47: 299-316. Sharon, M., Sneh, B., Kuninaga, S., Hyakumachi, M., Naito, S. 2008. Classification of Rhizoctonia spp. using rDNA-ITS sequence analysis supports the genetic basis of the classical anastomosis grouping. Mycoscience, 49, 2: 93-114. Sneh B., Burpee L., Ogoshi, A. 1991. Identification of Rhizoctonia species. APS Press, St. Paul, Minnesota, USA. Souza, E. C., Kuramae, E. E., Nakatani, A. K., Basseto, M. A., Prabhu, A. S., Ceresini, P. C. 2007. Caracterização citomorfológica, cultural, molecular e patogênica de Rhizoctonia solani Kühn associado ao arroz em Tocantins, Brasil. Summa Phytopathologica, 33, 2: 129-136. StatSoft, Inc. 2007. STATISTICA (Data Analysis Software System), Version 8. http://www.statsoft.com. Summer, D. R., Minton, N. A. 1989. Crop Losses in Corn Induced by Rhizoctonia solani AG-2-2 and Nematodes. Phytopathology, 79: 934-931.

53

Sumner, D. R., Bell, D. K. 1982. Root diseases induced in corn by Rhizoctonia solani and Rhizoctonia zeae. Phytopathology, 72: 86-91. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski., A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis, Version 6.0. Molecular Biology Evolution, 30, 12: 2725-2729, 2013. Taheri, P., Gnanamanickam, S., Hofte, M. 2007. Characterization, Genetic Structure, and Pathogenicity of Rhizoctonia spp. Associated with Rice Sheath Diseases in India. Phytopathology, 97: 3, 373-383. Telmadarrehei, T., Tajick Ghanbary, M. A., Rahimian, H., Rezazadeh, A., Javadi, M. A. 2011. Isolation and some pathologic properties of Rhizoctonia zeae from cultural soils of Golestan and Mazandaran Provinces, Iran. World Applied Sciences Journal, 14, 3: 374-377. Thompson, J. D., Gibson T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins. D. G. 1997. The Clustal-X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 25: 4876-4882. Toda, T., Mushika, T., Hayakawa, T., Tanaka, A., Tani, T., Hyakumachi, M. 2005. Brown Ring Patch: A New Disease on Bentgrass Caused by Waitea circinata var. circinata. Plant Disease, 89, 6: 536-542. Toda, T., Hyakawa, T., Mwafaida Mghalu, J., Yaguchi, S., Hyakumachi, M. 2007. A new Rhizoctonia sp. closely related to Waitea circinata causes a new disease of creeping bentgrass. Journal of General Plant Pathology, 73: 379-387. Verignassi, J. R., Poltronieri, L. S., Benchimol, R. L. 2008. Ocorrência de Rhizoctonia solani AG1 em bastão-do-imperador no Estado do Pará. Summa Phytopathologica, 34, 3: 290. Vilgalys, R., Cubeta, M. A. 1994. Molecular systematics and population biology of Rhizoctonia, Annual Review of Phytopathology, 32: 135-155. Villajuan-Abgona, R., Kageyama, K., Hyakumachi, M. 1996. Biocontrol of Rhizoctonia damping-off of cucumber by nonpathogenic binucleate Rhizoctonia damping-off of cucumber by non pathogenic binucleate Rhizoctonia. European Journal Plant Pathology, 102, 227-235. Weinhold, A. R. 1977. Population of Rhizoctonia solani in agricultural soils determined by a screening procedure. Phytopathology, 67: 566-569. White, T. J., Bruns, S. Lee., Taylor, J. W. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Pp. 315-322 In: PCR Protocols: A Guide to A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White. Academic Press, Inc., New York.

54

Yan, S. Q., Wu, B. C., Tang, X. F., Liu, Z. J., Jiang, L. 1984. Sheath blight of cereal crops: I. On the relation between sheath blight of rice, maize and wheat as well as soreshin of cotton. Acta Phytopathol Sin, 14: 25–31. (in Chinese with English abstract) Yorinori, J. T. 1998. Estratégias de controle das doenças da soja. Correio Agrícola, 2, 8-12. Youssef, D. R., Souza, G. R., Nechet, K. L., Halfed-Vieira, B. A. 2012. Caracterização de isolados de Rhizoctonia associados à queima foliar em Roraima. Revista Agro@mbiente On-line, 6, 2: 158-165.

55

Anexos

56

Artigo em formatado para submissão à revista Plant Disease.

Plant Disease

IDENTIFICATION, DIVERSITY AND PATHOGENICITY OF Rhizoctonia-1

LIKE PATHOGENS FROM THE BRAZILIAN SAVANNA 2

3

Angel José Vieira Blanco and Marília Oliveira Costa, Goiás Federal Institute 4

of Education, Science and Technology - Campus Inhúmas, Inhúmas, GO, Brazil, 5

75400-000; Roberto do Nascimento Silva, Department of Biochemistry and 6

Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, SP, 7

Brazil, 14049-900; Fábio Suzart de Albuquerque, Science and Mathematics 8

Faculty, College of Integrative Sciences and Arts, Arizona State University; 9

Arthur Tavares de Oliveira Melo, Department of Biological Sciences, College 10

of Life Sciences and Agriculture, University of New Hampshire, Durham, NH, 11

USA, 03824; Fabyano Alvares Cardoso Lopes, Institute of Biology, Federal 12

University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 21941-599; Andrei 13

Stecca Steindorff, Department of Cell Biology, Biological Sciences Institute, 14

Brasília University Campus Darcy Ribeiro, Brasília, DF, Brazil, 70910-900; 15

Cirano José Ulhoa, Biological Sciences Institute, Biochemistry and Molecular 16

Biology Department, Goiás Federal University, Campus Samambaia, Goiânia, 17

GO, Brazil, 74690-900; Elder Tadeu Barbosa and Murillo Lobo Junior, 18

Brazilian Corporation for Agricultural Research, Embrapa Rice and Beans, 19

Santo Antônio de Goiás, GO, Brazil, 75375-000. 20

21

Corresponding author: C. J. Ulhoa; E-mail: [email protected] 22

mailto:[email protected]

Abstract 23

Blanco, A. J. V., Costa, M. O., Silva, R. N., Albuquerque, F. S., Melo, A. T. O., 24

Lopes, F. A. C., Steindorff, A. S., Ulhoa, C. J, Barbosa, E. T. and Lobo Junior, M. 25

Identification, diversity and pathogenicity of Rhizoctonia-like pathogens from 26

the Brazilian Savanna. 27

28

Eighty-one Rhizoctonia-like isolates from natural and agricultural soils 29

from the Brazilian Savanna were identified by genetic-based, morphology and 30

nuclei-coloring methods. The nucleotide similarity analysis of ITS2-ITS1-31

5.8S region identified 15 different taxa, with 39.5% of isolates assigned to 32

Waitea circinata (zeae, oryzae and circinata varieties), while 37.0% belonged to 33

Thanatephorus cucumeris AG1-IA, AG1-IB, AG1-ID, AG1-IE, AG4-HGI and AG4-34

HGIII. Ceratobasidium spp. AG-A, AG-F, AG-Fa, AG-P and AG-R summed 35

23.5%. Rhizoctonia zeae (19.75%), R. solani, AG1-IE (9.88%), R. solani AG1-IA 36

(8.64%) and binucleate Rhizoctonia AG-A (8.64%) were the most frequent 37

anamorphic states found. Root rot severity caused by the different taxa varied 38

from low to high on common beans, and tended to be low to average in maize. 39

The results indicate that cropping history and environmental characteristics 40

affect the geographical arrangement of AGs, with group AG1 identified in the 41

tropical zone from Center to North of Brazil while the AG4 group was found in 42

opposite direction, from Center towards the subtropical South. Waitea circinata 43

var. zeae was found predominantly in soil underneath corn production and the 44

Blanco, AJV – Plant Disease 3

AG-F and AG-Fa were found in areas of common bean production. Apparently, 45

this is the first report on the occurrence of W. circinata var. circinata in Brazil. 46

47

Keywords: Rhizoctonia diversity; ITS sequencing; Brazilian savanna; Root rot. 48

49

Introduction 50

51

The Rhizoctonias are an important gender of phytopathogenic fungi 52

associated with various plant tissues (Basseto et al. 2008; González 2013; 53

Kuramae et al. 2007; Youssef et al. 2012). They are cosmopolitan organisms 54

found in both soils used for agriculture or under native vegetation (Gonzalez-55

Garcia et al. 2006) and survive saprophytically or remain dormant as sclerotium 56

(Bruehl 1987). The species of this genus are highly diversified, showing life 57

cycle with teleomorphic or anamorphic sexual stages, which can cause 58

important diseases in several plant species (Sneh et al. 1991). 59

There are three main species of Rhizoctonias associated with plant 60

diseases: Thanatephorus cucumeris, a multinucleated species (Rhizoctonia solani 61

in anamorphic state), Ceratobasidium spp., a binucleate species often classified 62

like Ceratorhiza (anamorphic gender of Ceratobasidium) and Waitea circinata, a 63

multinucleated species with five known varieties: zeae, oryzae, circinata, 64

prodigus and agrostis (Kammerer et al. 2011; Leiner and Carling 1994; Roberts 65

1999; Toda et al. 2007; Vilgays and Cubeta 1994). 66


Thanatephorus cucumeris is regarded as the most important plant 67

pathogen within this group, causing diseases in over 200 hosts, including major 68

crops such as rice, maize, wheat, soybean and cotton, along with vegetables, 69

fruits, trees, weeds and ornamental species (Gonzalez et al. 2006). This species 70

causes either root or foliar diseases and, according to hyphal fusion between 71

compatible isolates, it is divided in 13 Anastomosis Groups (AG1 – AG13). 72

Some Ags may be subdivided into intraspecific groups (ISGs), based on 73

phenotypic traits like colony morphology, nutritional requirements, growth 74

temperature, host range and pathogenicity (Carling et al. 2002; Guillemaut et 75

al. 2003). 76

The teleomorphic genus Ceratobasidium is quite diverse, comprising 77

pathogens, saprophytes and mycorrhizal formers (Ogoshi 1987). 78

Ceratobasidium spp. infects common bean (Cardoso and Echandi 1987); potato 79

(Escandi and Echandi 1991); cucumber (Villajuan-Abgona et al., 1996); 80

Cabbage (Ross et al., 1998); and rice (Taheri et al., 2006). There are also some 81

reports about sheath blight (Li 1998), web blight (Nechet and Half-Vieira 2006) 82

(normally attributed to T. cucumeris) and fruit decay in a variety of hosts (Sneh 83

et al. 1991; Yan 1984). The classification system of Ceratobasidium is also 84

based on hyphal anastomosis, currently organized in 16 Gas, as discussed by 85

Sharon et al. (2008). 86

The five varieties oryzae, zeae, circinata, agrostis and prodigus of W. 87

circinata were stablished with the support of molecular biology and genetic 88


dissimilarity analysis (De la Cerda et al. 2007; Sharon et al. 2006; Toda et al. 89

2007). The epithet “Rhizoctonia” was not yet adopted for the agrostis and 90

prodigus varieties and, in general, and only the varieties oryzae and zeae have 91

been reported with relevancy. Waitea circinata var. zeae is the most common 92

variety due to its host range, which includes widespread crops such as maize 93

(Sumner and Bell 1982), rice (Oniki et al. 1985), onions (Erper et al. 2006), 94

sugar-beet (Kuznia and Windels 1994) and wheat and barley (Ogoshi et al. 95

1990). 96

The identification of Rhizoctonia species and their ISGs is a key measure 97

for the management of agricultural areas. The huge number of hosts, the 98

saprophytic capacity, the absence of resistant plant cultivars and the low 99

efficacy of fungicide applications (Amaradasa et al. 2014; Carling et al. 1990; 100

Kataria et al. 1991) makes disease management through genetic resistance and 101

cultural practices a challenge for growers and the rural extension service. 102

Without efficient management, there is an increase of the inoculum density on 103

soil, causing significant yield losses (Lanoiselet et al. 2005; Paulitz and 104

Okubara 2006). 105

The identification of Rhizoctonias still considers morphological, nuclei-106

staining and cultural aspects, but relies mostly in genetic-based methods to 107

confirm the identity of species, varieties and AG's. Out of these molecular-108

based methods, the genetic nucleotide analysis of the intergenic ITS region of 109

ribosomal DNA (rDNA) has been consolidated as an important tool to support 110


the Rhizoctonia species classification (White et al. 1990; Kuninaga et al. 1997; 111

Sharon et al. 2006, 2008). 112

The majority of the morphological and genetic diversity studies of 113

Rhizoctonias in Brazil is generally specific either for a single crop or an specific 114

AG (Basseto et al. 2008; Ceresini et al. 2010; Ciampi et al. 2005, 2009; Fenille et 115

al. 2003; Goulart et al, 2011; Kuramae et al. 2007, Souza et al. 2007), accounting 116

on lack of information about the geographic distribution and genetic diversity 117

of Rhizoctonia species across the Brazilian territory. 118

Hypothetically, cultural practices and environmental factors affect the 119

distribution of Rhizoctonia species and AGs in the country’s wide territory. 120

Thus, it’s also pertinent to associate species distribution to mechanisms linked 121

to the spread and establishment of these pathogens in relevant agricultural 122

regions such as the Cerrado (Brazilian Savanna), where intensive agriculture 123

and the achievement of 2-3 yields per year facilitate the establishment of soil 124

borne pathogens. 125

So, the objectives of this study are: i) identify species and ISGs of 126

Rhizoctonia spp. recovered from soils under native vegetation or agricultural 127

areas from the Brazilian Cerrado, ii) verify the pathogenicity of isolates in 128

maize and common beans roots and iii) estimate the relationship between 129

species distribution, farming practices and climate conditions in the studied 130

regions. 131

132


Material and Methods 133

Sampling sites and strain isolation 134

Eighty-one Rhizoctonia and Rhizoctonia-like isolates retrieved from 135

soils samples in different agricultural and native vegetation areas from the 136

Brazilian Savanna were investigated. The samples within this biome were 137

spatially distributed through the five Brazilian political regions (North, 138

Northeast, Midwest, Southeast and South) (Figure 1). Seventy samples come 139

from agricultural areas, with 37 under monoculture, 17 from soils that a crop 140

rotation was reported and 16 from soils where no information about the 141

cropping history was available (Table 1). The other 11 samples were recovered 142

from native vegetation areas. All soil samples were retrieved from the 0-10 cm 143

top soil, stored in plastic bags for transport and then preserved at 4°C in the 144

laboratory, until use. 145

The isolates were obtained using either the Weinhold (1977) method or 146

the Paulitz and Schroeder (2005) protocol and then, grown in agar-water with 147

chloramphenicol 200 ppm at 25ºC for five days. After checking morphological 148

traits typical of Rhizoctonia-like species at 100x, isolates were preserved in 149

sterilized paper stripes at -20ºC or -80ºC, and stored at the Fungal and 150

Functional Microorganisms Culture Collection from the Brazilian Company of 151

Agricultural Research (EMBRAPA), at the National Research Center for Rice 152

and Beans. 153


154

Nuclei staining and colony morphology 155

Isolates were evaluated for typical Rhizoctonia morphological traits, 156

such as 90º mycelial branches, absence of spores, lack of connection clamps, 157

number of nuclei per cell, mycelium color and presence of sclerotia in culture 158

media. For morphological analysis, a 5 mm diameter mycelial disc was 159

transferred to a glass slide for microculture. Fungal nuclei were colored with 160

Safranin-O (Bandoni 1979) and counted observing ten cells per glass slide, in 161

ten replicates. When necessary, microculture procedures were repeated three 162

times. 163

164

Genomic DNA extraction and sequencing of ribosomal DNA 165

The genomic DNA (gDNA) of each isolate was extracted according to 166

Lopes et al. (2012), with quality and amount checked with ultraviolet 167

spectrophotometry at 260 and 280 nm. Therefore, high quality gDNA samples 168

were amplified using the ITS1-5.8S-ITS2 region through the polymerase chain 169

reaction employing the pair of primers ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 170

') and ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3 ') (White et al. 1990). The PCR 171

products were submitted to agarose gel electrophoresis (1.2%) and then 172

purified using polyethylene glycol (PEG) 20%, 2.5 M NaCl and ethanol). The 173

purified products were sequenced following the DYEnamicTM ET Terminator 174


Cycle Sequencing kit (GE Healthcare, USA) procedures, in a ABI Prism 3100 175

(Applied Biosystems). 176

177

Species, varieties and AGs identification and phylogenetic analysis 178

To identify the 81 Rhizoctonia-like isolates at a synapormophic level, a 179

nucleotide similarity analysis through the BLASTn v.2.2.30 algorithm (Altschul 180

et al. 1997) was performed using the rDNA sequences as query sequences and 181

the non-redundant nucleotide database of NCBI as a reference. The best-hit 182

sequences with lower e-value that maximized the coverage of query sequences 183

were chosen as homologous copies, used to classify the samples at species, 184

variety and AG level. Eventually, to avoid misidentification due to presence of 185

GenBank sequences partially characterized, the next best-hits and the 186

morphological traits were used to ensure isolate classification. 187

Subsequently, the nucleotide rDNA sequences were submitted to local 188

alignment using Clustal X v.2.1 (Thompson et al. 1997) software and then 189

manually edited with Bioedit v.7.1.7 software (Hall 1999). All rDNA nucleotide 190

sequences were deposited at the GenBank database, and identified as on Table 191

1. A phylogenetic analysis was carried out with the maximum likelihood 192

method and 1,000 bootstraps to test the consistency of tree nodes. Three 193

distinct specific (Ceratobasidium spp., Thanatephorus spp. and Waitea spp.) 194

phylogenetic trees were constructed separately for group description with a 195

better resolution. The most appropriate evolutionary model for each of the 196


three datasets to reconstruct the phylogenetic tree topologies was chosen 197

based on the lowest value of the Bayesian information criterion (BIC) were 198

achieved using MEGA v.6.06 (Tamura et al. 2013). 199

200

Pathogenicity tests 201

Pathogenicity tests were conducted with the single inoculum layer 202

method (Chaudhary et al. 2006). Five seeds of common bean (var. Pérola) and 203

maize (MCP10 genotype), previously disinfested, were tested separately, in 500 204

ml polyethylene containers filled with vermiculite and a PDA layer with a 5-day 205

colony of the testing isolate. Pathogenicity tests were carried out at 20°C for 21 206

days in a growth chamber with 12-h photoperiod and irrigation three times a 207

week. The experiments were performed under a completely randomized design 208

with two replications and five plants per experimental unit, with non-infested 209

containers as control plots. 210

After harvest, plant roots were washed in tap water and checked for 211

pathogenicity and disease severity assessment using 1-9 scale from 212

Schoonhoven and Pastor-Corrales (1987). Isolates were compared for disease 213

severity with the Kruskal-Wallis (KW) non-parametric test at 5% significance, 214

considering severity among the different genders (inter-gender test), and in 215

intra-gender tests regarding the different species, variety and AGs. Statistical 216

procedures were performed on Statistica software (StatSoft Inc. 2007). The 217

spatial distribution analysis gathering results from isolate identification, their 218


geographical origin and pathogenicity tests were supported by ArcGis software 219

(ESRI 2011). 220

221

Results 222

Species, varieties and AG identification 223

All the 81 isolates collected across the Brazilian Cerrado were 224

successfully classified within the Rhizoctonia gender, in 15 different taxa. While 225

39.5% of the isolates were assigned to W.circinata varieties zeae, oryzae and 226

circinata, 37.0% belonged to T. cucumeris (AG1-IA, AG1-IB, AG1-ID, AG1-IE, 227

AG4-HGI and AG4-HGIII), while 23.5% were characterized as Ceratobasidium 228

(AG-A, AG-F, AG-Fa, AG-G, AG-P and AG-R). 229

All W. circinata isolates were multinucleated with mycelial color ranging 230

from orange to salmon or light brown (Figure 2 M-O). The W. circinata var. zeae 231

and W. circinata var. circinata isolates formed sclerotia after 40 days of growth, 232

in contrast to W. circinata var. oryzae. Waitea circinata was the most 233

representative “Rhizoctonia” species across the Brazilian Savanna, identified in 234

32 out of the 81 sampling sites. Zeae and circinata were the main W. circinata 235

varieties representing, respectively, 19.75% and 18.52% of total assignments 236

(Table 2). According to the geographical distribution and the relative and 237

absolute frequencies of the isolates, W. circinata had a higher incidence in 238

States of Goiás, Minas Gerais and Paraná (Table 1). 239


The T. cucumeris accounted for 37% of the total and were all 240

multinucleated, with the mycelium color ranging from light brown to dark 241

brown (Figure 2 G-L). The only two T. cucumeris AGs identified were AG1 and 242

AG4. Isolates belonging to AG1 were labeled in four ISGs: IA, IB, ID and IE, 243

while the AG4 were from the HGI and HGIII subgroups. All T. cucumeris AG4 244

isolates were sampled from agricultural areas between the center and the south 245

of Brazil, while the AG1 isolates were found in both agricultural soils or under 246

native vegetation located between the center and the north of Brazil (Table 1). 247

Isolates classified as AG1 and AG4 presented sclerotia formation, whose 248

dimensions, amounts and staining apparently varied according to the ISG. The 249

T. cucumeris isolates classified as AG1-1E and AG4-HGI were the most frequent, 250

with 9.88% each. The isolates labeled as AG1-IA, AG1-1B, AG1-ID and AG4-251

HGIII corresponded respectively to 4.94%, 3.70%, 2.47% and 6.17% of the 252

relative frequency within this group (Table 2). 253

Almost all isolates classified as Ceratobasidium presented two nuclei per 254

cell, except for isolates CNPAF_0036, CNPAF_0255 and CNPAF_0258, which 255

were multinucleate. All Ceratobasidium isolates also showed a yellowish-white 256

mycelium with powdery texture and variable number of light-colored sclerotia 257

(Figure 2 A-F). This gender also showed the lowest rate of isolates (only 23% of 258

the total), with AG-A and AG-F accounting respectively in 8.64% and 6.17% of 259

isolates within this gender. The other Ceratobasidium AGs were AG-Fa, AG-P, 260

AG-G and AG-R, and resulted together in lower than 10% of assignments (Table 261


2). The Ceratobasidium AG-A group showed a high occurrence in soils under 262

common bean cultivation, along with AG-F and AG-Fa. Furthermore, 263

Ceratobasidium AG-G and AG-R were isolated mainly from soils under carrot 264

and onion cultivation, respectively. 265

266

Pathogenicity and disease severity tests in common bean and maize 267

The pathogenicity tests on common bean and maize showed a different 268

response between isolates. First, in the inter-gender tests, there were no 269

differences in disease severity in maize roots (KW = 0.87; p-value = 0.6471). In 270

contrast, differences were found on root rot severity in common beans (KW = 271

19.05; p-value = 0.0001), with the highest average of disease severity caused by 272

T. cucumeris and Ceratobasidium spp. With regard to the intra-gender analysis, 273

there were significant differences between for both plant species, with KW = 274

142.34 (p-value = 0.000) for common bean and KW = 96.53 (p-value = 0.0000) 275

maize (Figure 3). 276

277

Phylogenetic analysis 278

The evolutionary model suggested to best fit the nucleotide sequence 279

homology and produce the phylogenetic tree topologies for both T. cucumeris 280

and Waitea spp. was the GTR + I (General Time Reversible + Invariant sites). 281

The Jukes-Cantor (JC) (Jukes and Cantor 1969) was the best model for 282

Ceratobasidium spp. Respectively, 81.46% and 69.43% nucleotide sites were 283


considered polymorphic and parsimoniously informative and, on average, 284

60.95% of bootstraps values supported monophyletic groups between the 285

isolates and their best hit sequences from NCBI. 286

In general, the clusterization occurred among isolates of the same AG 287

and/or variety, except for T. cucumeris isolates AG1-IA and AG1-IE that formed 288

a monophyletic group. The W. circinata var. zeae and the AGs from T. cucumeris 289

AG4-HGI and AG4-HGIII were clustered in two different groups each, and in 290

some cases, a geographic structure was observed with some isolates grouping 291

preferably by area, as for the Brazilian States of Roraima, Mato Grosso, Paraná 292

and Minas Gerais (Figures 4, 5, 6). 293

294

Discussion 295

296

Species, varieties and AG identification 297

The morphological patterns observed for Waitea, Ceratobasidium and 298

Thanatephorus isolates were consistent with the current descriptions for these 299

three genders by several authors (Demirci 1998; Kammerer et al. 2011; Leiner 300

and Carling 1994; Muzhinji et al. 2015; Sneh 1991). However, some 301

inconsistencies were not solved even with the support of the molecular 302

approach. Specifically, there was a conflict between the identification of the 303

multinuclear isolates CNPAF_0036, CNPAF_0255 and CNPAF_0258 that were 304

labeled as Ceratobasidium (supposedly binucleate), according to their 305


identification based on NCBI database. This mismatch is not a new report, and 306

can be explained by the genetic similarity between Ceratobasidium and 307

Thanatephorus, which is a multinucleated gender. 308

Probably, an evolutionary complete separation have not occurred yet for 309

these two genus (Ceresini 2014), causing a phylogenetic instability for the 310

group. In addition, according to Lubeck (2004), the taxonomic position of some 311

AGs within these two genus is not clear, because isolates from AG-6 312

(Thanatephorus) can merge hyphae with AG-F (Ceratobasidium), for example. 313

The phylogenetic analyzes also suggest that some isolates classified as 314

Ceratobasidium, based on a nuclei number and hyphae anastomosis can be 315

assigned to Thanatephorus genus (Gonzalez et al. 2001). 316

317

Disease severity evaluation for bean and maize 318

The pathogenicity tests revealed the prevalence of phytopathogenic 319

Rhizoctonia and Rhizoctonia-like isolates in a wide geographic area formed by 320

the Brazilian Savanna biome. These isolates differ in terms of disease severity 321

when compared within the same AG or between AGs, for the three species 322

found – T. cucumeris, W. circinata and Ceratobasidium spp. These differences 323

were attributed to the genetic variability of the isolates and specific traits of 324

their respective AGs. Although common bean and maize are known hosts of 325

both AG1-1A and AG1-1B (Ceresini, 2014), there were isolates causing low or 326

high disease severity in common bean, and most of them were hypovirulent on 327


maize roots. Therefore, their importance as root pathogens deserves a careful 328

look. 329

330

Geographic Distribution of Rhizoctonias in the Brazilian savanna. 331

The distribution of species, varieties and AGs of Rhizoctonia in such a 332

wide geographical region should not be related not only with the presence of 333

susceptible hosts at the sampling moment (Muzhinji et al. 2015). The 334

distribution of Rhizoctonia AGs on the sampling sites is also influenced by 335

climate variables, a combination of host plants sequentially cropped in the 336

field, cultural practices and the capacity of isolates to compete with other 337

microorganisms and persist in soil over sequential cropping seasons. 338

Despite the differences in time (years) of anthropic interference, not 339

assessed here, the cropping history of the sampling sites is formed by a narrow 340

range of crops, where soybean-maize-common bean is the main cropping 341

sequence. Even though some other hosts such as rice or vegetables may be 342

locally relevant, nevertheless, specialized agriculture is a trend in all 343

agricultural regions investigated, which probably favors the establishment of 344

specialized forms of Rhizoctonia. (Genhua and Chengyum 2012; Lakshman and 345

Amaradasa 2014). 346

347

The W. circinata distribution 348


The identification of W. circinata varieties and their distribution across 349

the five major Brazilian follows the same rationalization described above for 350

Rhizoctonias. The Waitea species attack different grass species (Kammerer et 351

al, 2011.) such as maize (Lakshman and Amaradasa, 2014), commonly found 352

and the Brazilian States of Paraná, Goiás, Bahia, Minas Gerais. The W. circinata 353

presence in the Tocantins state was reported in a relevant cropping region of 354

tropical rice (Brasil 2015) and, in both maize and rice cases, the cropping 355

history seems to contribute for to the establishment of W. circinata varieties in 356

these regions. 357

Specifically, the W. circinata var. zeae was the most abundant W. 358

circinata variety among the 81 isolate collection and was identified in 359

agricultural regions across the sampling sites. This variety was found in 360

agricultural sites and not identified in soils under native vegetation areas at the 361

Roraima State. Despite the popularity of maize crops in all sampling regions, 362

there are few reports in Brazil about root rots caused by the zeae variety of W. 363

circinata (Poltronieri et al. 2002), and it’s not clear if the pathogen represents 364

an underrated threat to maize in the country. Its occurrence seems not being 365

necessarily associated with environmental or climatic factors, which also can 366

be supported by studies that have found this variety in several climates and 367

environments from different countries around the world (Demirci 1998; 368

Gutiérrez et al. 2007; Li et al. 1998; Telmadarrehei et al. 2011). 369


In contrast, the W. circinata var. oryzae had a very low representation 370

across the sampling sites, found in a single location in the Goiás State. Studies 371

reporting the occurrence and distribution of this variety in Brazil are scarce, 372

although Prabhu et al. (2002) reported this species in rice fields at Tocantins 373

State (North region). 374

Contrasting with the former two W. circinata varieties discussed above, 375

the circinata variety has a recent taxonomical characterization, and it’s also 376

related to diseases Poaceae family hosts (Chen et al. 2009). Most of W. circinata 377

var. circinata isolates were found at Southeast region, mainly at Minas Gerais 378

State, forming the second largest group of isolates. Apparently, this is the first 379

report of this variety in Brazil. 380

381

The Ceratobasidium spp. distribution 382

The diversity of Ceratobasidium isolates also seems to be influenced by 383

the plant species cultivated over the Brazilian Cerrado. Five Ceratobasidium 384

AGs (AG-A, AG-F, AG-G, AG-R and AG-P) were previously related to areas 385

where common bean have been cultivated (Cardenas et al. 2015; Genhua and 386

Chengyum 2012). The “Fa” AG is not directly associated to common bean areas, 387

mainly because this AG have been considered a subgroup of AG-F (Gurkanli and 388

Ozkoc 2011; Sharon et al. 2008). With exception for the Tocantins State, our 389

results match the reports described above, with the record of Ceratobasidium 390

AGs in Paraná, Minas Gerais, Bahia and Goiás States that are important 391


common bean producers, with nearly two million tons of common bean yielded 392

in the 2014/2015 crop season (Brasil 2015). Although the AG-P found in Minas 393

Gerais was not isolated directly from common bean areas, the sampling site 394

(city of Unaí) is the largest producer of common bean in Brazil and an 395

important grower of maize and soybean. 396

In regard with minor crops, the identification of Ceratobasidium AG-R in 397

soils under onion cropping is consistent with the report of Burpe et al. (1980) 398

that linked AG-R with onions diseases. Also, the occurrence of AG-G in soils 399

cropped with carrot in a single site (Campos Altos - MG) does not necessarily 400

indicate a host x pathogen association, even though AG-G causes root rots in 401

yacon (Fenile et al. 2005), which shares morphologic and molecular 402

synapomorphies with carrot (Judd et al. 2007). 403

404

The T. cucumeris distribution 405

The geographic distribution of T. cucumeris followed the same 406

assumptions described for W. circinata and Ceratobasidium spp., especially for 407

the association between AGs and the recent cultivation history of their 408

respective sampling sites. In areas with common bean cultivation we found 409

AG1-IA and AG1-IE (Mato Grosso State), AG4-HGI (Goiás, Paraná and São 410

Paulo) and AG4-HGIII (Goiás). The AG4-HGI and AG4-HGIII were identified in 411

soils under soybean production in Goiás and Minas Gerais states, while The 412


AG1-1B was also identified in soybean areas in Goiás and in coffee-growing 413

areas in Minas Gerais (Table 1). 414

The AG1-IA and AG1-IE are known common bean pathogens, causing 415

web blight (AG1 subgroups) and root rots (AG4) (Gonzalez et al. 2012; Mora-416

Umaña et al. 2013; Youssef et al. 2012), AG4-HGI and AG4-HGIII (Çebi et al. 417

2010; Ceresini 2014; Genhua and Chengyum 2012; Lakshman and Amaradasa 418

2014). The AG4-HGI and AG4-HGIII (Ceresini 2014; Fenile et al. 2002; 2003) 419

and the AG1-1B (Lakshman and Amaradasa 2014; Youssef et al. 2012) also 420

infect soybeans. Although the results can indicate that establishment of most 421

T. cucumeris AGs was influenced by local crop management, it is also 422

significant that AG1-IA, AG1-ID and AG1-1E were present in areas under 423

native vegetation. 424

The identification of AG1 ISGs in non-agricultural soils on Northern 425

Brazil (Roraima State) confirms the existence of native Rhizoctonias, well 426

adapted to the equatorial environment, in the presence of high temperature 427

and rainfall through the year. In Central America and Caribbean countries, with 428

environmental conditions similar to Northern Brazil, AG1 and their ISGs have 429

been reported (Godoy-Lutz et al. 2008; González et al. 2012; Mora-Umaña et al. 430

2013), mainly as important common bean pathogens, causing web blight and 431

major economic losses (Godoy-Lutz et al. 1996; 2008). 432

Despite the geographical distribution of T. cucumeris AGs apparently 433

correlates with mainstream agricultural crops, the environmental traits are also 434


considered an important causes to explain the distribution of AG1 and AG4 in 435

the Brazilian Savanna, with AG1 found in Northern areas, while AG4 was 436

restricted to Southern regions. These results are consistent with Fenille et al. 437

(2002) who identified AG1 isolates causing web blight in soybeans grown in 438

Mato Grosso State, while AG4 was found in isolates from Minas Gerais, Paraná 439

and São Paulo, causing root rots. 440

441

Phylogenetic-based clustering 442

The phylogenetic analysis was effective to differentiate the taxa showing 443

that isolates belonging to the same variety or AGs generally are clustered, 444

based on the geographic distance among the sampling sites. It suggests that 445

within the same variety or AGs an important correlation between genetic 446

dissimilarity and geographic distance can be found. Furthermore, this 447

correlation also indicates a limited gene flow among the sampling sites. 448

Differently from what is expected for divergent groups, a monophyletic 449

grouping between AG1-IA and AG1-IE was found and, even both isolates are 450

from the same AGs, it seems that their reproductive separation may not have 451

completed. 452

The multinucleated pattern found for this AG could skew the 453

phylogenetic analysis once multiple copies of the ITS2-ITS1-5.8S region can be 454

sequenced. In addition, AG1-IA and AG1-IE are morphologically very similar, 455

especially regarding the number, size and disposition of sclerotia, not assessed 456


here (Figure 2 G-L). There are scarce reports of AG1-IE in Brazil, while AG1-IA 457

has been identified in several Brazilian regions (Ceresini 2014; Poltronieri, 458

2008; Youssef 2012), and so it is possible that all AG1-IE isolates could actually 459

belong to AG1-IA (Figure 5). 460

The morphological similarity among the Waitea, Ceratobasidium and 461

Thanatephorus colonies is obviously not enough for species identification, but 462

the molecular characterization of Rhizoctonias also requires attention (Sharon 463

et al. 2006; 2008), to avoid mistakes during the sequence assignment at the 464

NCBI database. Assuming that reference sequences support correctly our 465

results and that there are still some gaps to clarify all phylogenetic 466

relationships within Rhizoctonia-related genus, our results endorse previous 467

reports for AG1 distribution typically in the equatorial zones (Godoy-Lutz et al. 468

2008; Gonzalez et al. 2012; Mora-Umaña et al 2013), even tough some 469

misunderstanding is possible to differentiate closely-related ISGs (IA or IE). 470

In conclusion, the Rhizoctonias diversity in the Brazilian Cerrado is 471

formed by different species, which are divided in varieties and AGs. Their 472

geographic distribution varies in a latitudinal gradient and is influenced by 473

environmental variables and presence of host crops, forming a pattern of 474

distribution across this biome. The gene flow between distant regions seems to 475

be limited. These results reiterate the phytopathogenic importance of the 476

Rhizoctonia gender concerning the Brazilian agriculture, mostly with common 477

beans, suggesting that further studies with more representative, larger number 478


of samples by narrower areas can add new relevant information, to support the 479

disease management. 480

481

Acknowledgments 482

The authors would like to thanks the Federal Institute of Education, Science 483

and Technology of Goiás (IFG), the Brazilian Company for Agricultural 484

Research (EMBRAPA Rice and Beans), the Federal University of Goiás (UFG) 485

and the Brazilian National Council for Scientific and Technological 486

Development (CNPq) that have been supported the execution of this study with 487

both financial resources and infrastructure. 488

489

Literature Cited 490

491

Altschul, S. F., Madden, T. L., Scha ffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., 492

Lipman, D. J., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein 493

database search programs, Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402. 494

495

Amaradasa, B. S., Lakshman, D. K., McCall, D. Horvath, B. J. 2014. In Vitro 496

Fungicide Sensitivity of Rhizoctonia and Waitea Isolates Collected from 497

Turfgrasses. J. Environ. Hort. 32: 126-132. 498

499

Bandoni, R. J. Safranin O as a rapid nuclear stain for fungi. Mycologia 71:873-500

874. 1979. 501

502

Basseto, M. A., Filho, W. V. V., Filho, W. V. V. F., Souza, E. C., Ceresini, P. C. 503

2008. O papel de Rhizoctonia spp. binucleadas na indução de resistência a mela 504

da soja. Acta Scientiarum. Agronomy, 30, 2: 183-189. 505


506

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Projeções do 507

agronegócio: Brasil 2014/15 a 20124/25: projeções de longo prazo. 6. ed. 508

Brasília: AGE/Mapa, 2015. Disponível em: 509

<http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/PROJECOES_DO_AGRONEGOCIO_2510

025_WEB.pdf>. Acesso em 15 jun. 2016. 511

512

Bruehl, G.W. Soilborne plant pathogens. New York NY. Mac Millan Publishing 513

Company. 1987. 514

515

Burpee, L. L., Sunders, P. L., Cole, H. Jr., Sherwood, R. T. 1980. Anastomosis 516

groups among isolates of Ceratobasidium cornigerum and related fungi. 517

Mycologia, 72: 689–701. 518

519

Cardenas, G. E. M., Galvan, M. Z., Barrera, V. A., Rodriguero, M. S., Carmona, 520

M. A., March, G. J., Ramallo, A. C., Shew, H. D. 2015. Molecular identification 521

and pathogenicity of Rhizoctonia spp. from tobacco growing areas in 522

northwestern Argentina. Tropical Plant Pathology, 40(3), 160-168. 523

524

Cardoso, J. E., Echandi, E. 1987. Biological control of Rhizoctonia root rot of 525

snap bean with binucleate Rhizoctonia-like fungi. Plant Disease, 71: 167-170. 526

527

Carling, D. E., Helm, D. J., Leiner. R. H. 1990. In vitro sensitivity of Rhizoctonia 528

solani and other multinucleate and binucleate Rhizoctonia to selected 529

fungicides. Plant Disease, 74: 860–863. 530

531

Carling, D. E., Kuninaga, S., Brainard, K. A. 2002. Hyphal Anastomosis 532

Reactions, rDNA-Internal Transcribed Spacer Sequences, and Virulence Levels 533

Among Subsets of Rhizoctonia solani Anastomosis Group-2 (AG-2) and AG-BI. 534

Phytopathology, 92, 1: 43–50. 535

536

Çebi Kılıçoğlu, M., Özkoç, İ. 2010. Molecular characterization of Rhizoctonia 537

solani AG4 using PCR-RFLP of the rDNA-ITS region. Turk. J. Biol, 34: 261–269. 538

539

Ceresini, P. C. 2014. Rhizoctonia como fitopatógeno: biologia e diversidade de 540

Rhizoctonia solani em agroecosistemas tropicais e perspectivas do manejo da 541

rhizoctoniose usando resistência de plantas. Pages 177 – 190 in: Sanidade de 542

Raízes. 1ed. NEFIT – Núcleo de Estudos em Fitopatologia, São Carlos, SP. 543

544

Ceresini, P. C., Gaino, A. P. S. C., Basseto, M. A., Gasparotto, L., Poltronieri, L. 545

S. 2010. Inferência filogenética revela a complexa etiologia das manchas 546

areolada e foliar em seringueira e em outras espécies cultivadas na Amazônia. 547

Acta Scientiarum. Agronomy, 32, 3: 385-395. 548

549

http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/PROJECOES_DO_AGRONEGOCIO_2025_WEB.pdf

http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/PROJECOES_DO_AGRONEGOCIO_2025_WEB.pdf


Chaudhary, T. T., Anderson, T. T., Park, S. J., Yu, K. 2006. Comparison of 550

screening methods for resistance to Fusarium root rot in common beans 551

(Phaseolus vulgaris L.). Journal of Phytopathology, 154: 303- 308. 552

553

Chen, C-M., de la Cerda, K. A., Kaminski, J. E., Douhan, G. W., Wong, F. P. 2009. 554

Geographic Distribution and rDNA-ITS Region Sequence Diversity of Waitea 555

circinata var. circinata Isolated from Annual Bluegrass in the United States. 556

Plant Disease, 93: 906-911. 557

558

Ciampi, M. B., Gale, L. R., Lemos, E. G. de M., Ceresini, P. C. 2009. Distinctively 559

variable sequence-based nuclear DNA markers for multilocus phylogeography 560

of the soybean-and rice-infecting fungal pathogen Rhizoctonia solani AG-1 IA. 561

Genetics and Molecular Biology, 32: 840-846. 562

563

Ciampi, M. B., Kuramae, E. E., Fenille, R. C., Meyer, M. C., Souza, N. L., 564

Ceresini, P. C. 2005. Intraspecific Evolution of Rhizoctonia solani AG-1 IA 565

Associated with Soybean and Rice in Brazil based on Polymorphisms at the ITS-566

5.8S rDNA Operon. European Journal of Plant Pathology, 1132: 183-196. 567

568

De la Cerda, K., Douhan, G., Wong, F. 2007. Discovery and characterization of 569

Waitea circinata var. circinata affecting annual bluegrass from the Western 570

United States. Plant Disease, 91: 791-797. 571

572

Demirci, E. 1998. Rhizoctonia species and anastomosis groups isolated from 573

barley and wheat in Erzurum, Turkey. Plant Pathology, 47, 1: 10-15. 574

575

Elliott, M. L. 1999. Comparison of Rhizoctonia zeae Isolates from Florida and 576

Ohio Turfgrasses. HortScience, 34: 298-300. 577

578

Erper, I. Karaca, G. H. Turkkan, M.; Ozkoc, I. 2006. Characterization and 579

pathogenicity of Rhizoctonia spp. from onion in Amasya, Turkey. Journal of 580

Phytopathology, 154: 75-79. 581

582

Escandi, A. R., Echandi, E. 1991. Protection of potato from Rhizoctonia canker 583

with binucleate Rhizoctonia fungi. Plant Pathology, 40: 197-202. 584

585

ESRI 2011. ArcGIS Desktop: Release 10. Redlands, CA: Environmental Systems 586

Research Institute. 587

588

Fenille, R. C., Ciampi, M. B., Souza, N. L., Nakataniand, A. K., Kuramae, E. E. 589

2005 Binucleate Rhizoctonia sp. AG-G causing root rot in yacon (Smallanyhus 590

sonchifolius) in Brazil. Plant Pathology, 54,325-330. 591

592

http://lattes.cnpq.br/9653651998570946


Fenille, R. C., Kuramae, E. E., Souza, N. L. 2003. Identification of Rhizoctonia 593

solani Associated with Soybean in Brazil by rDNA-ITS Sequences. Fitopatologia 594

Brasileira, 28, 4: 413-419. 595

596

Fenille, R. C., Souza, N. L., Kuramae, E. E. 2002. Characterization of Rhizoctonia 597

solani associated with soybean in Brazil. European Journal of Plant Pathology, 598

108, 8: 783-792. 599

600

Genhua, Y., Chengyun, L. 2012. General Description of Rhizoctonia Species 601

Complex, Plant Pathology, Dr. Christian Joseph Cumagun (Ed), InTech, DOI: 602

10.5772/39026. Disponível em: http://www.intechopen.com/books/plant-603

pathology/general-description-of-rhizocotonia-species-complex. Acesso: 604

20/12/14. 605

606

Godoy-Lutz, G., Arias. J., Steadman, J. R., Eskridge, K. M. 1996. Role of natural 607

seed infection by the web blight pathogen in common bean seed damage, 608

seedling emergence, and early disease development. Plant Disease, 80: 887–609

890. 610

611

Godoy-Lutz, G., Kuninaga, S., Steadman, J. R., Powers, K. 2008. Phylogenetic 612

analysis of Rhizoctonia solani subgroups associated with web blight symptoms 613

on common bean based on ITS-5.8S rDNA. Journal of General Plant Pathology, 614

74: 32–40. 615

616

González-García, V., Portal-Onco, M. A., Rubio-Susan, V. 2006. Review: 617

Biology and Systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish Journal of 618

Agricultural Research, 4: 55-79. 619

620

González, M. D. 2013. Identification, molecular characterization, and evolution 621

of group I introns at the expansion segment D11 of 28S rDNA in Rhizoctonia 622

species. Fungal Biology, 117: 623-637. 623

624

González, M. D., Carling, D. E., Kuninaga, S., Vilgalys, R., Cubeta, M. A. 2001. 625

Ribosomal DNA systematics of Ceratobasidium and Thanatephorus with 626

Rhizoctonia anamorphs. Mycologia, 93: 1138-1150. 627

628

González, M. D., Cubeta, M. A., Vilgalys, R. 2006. Phylogenetic utility of indels 629

within ribosomal DNA and beta-tubulin sequences from fungi in the 630

Rhizoctonia solani species complex. Molecular Phylogenetic Evolution, 40, 2: 631

459-470. 632

633

González, N., Godoy-Lutz, G., Steadman, J. R., Higgins, R., Eskridge, K. M. 2012. 634

Assessing genetic diversity in the web blight pathogen Thanatephorus cucumeris 635




(anamorph = Rhizoctonia solani) subgroups AG 1-IE and AG 1-IF with molecular 636

markers. Journal of General Plant Pathology, 78: 85-98. 637

638

Goulart, A. C. P., Assis, J. B., Ciampi, M. B., Ceresini, P. C. 2011. Ocorrência de 639

mela causada por Rhizoctonia solani AG4-HGI em plântulas de algodoeiro no 640

brasil. Summa Phytopathologica, 37, 1: 68-69. 641

642

Guillemaut, C., Edel-Herman, V., Camporota, P., Alabouvette, C., Richard-643

Molard, M., Steinberg, C., 2003. Typing of anastomosis groups of Rhizoctonia 644

solani by restriction analysis of ribosomal DNA. Canadian Journal of 645

Microbiology, 49: 556–568. 646

Gurkanli, C. T., Ozkoc, I. 2011. First report of B. N. Rhizoctonia from Tobacco 647

(Nicotiana tabacum L.) in Samsum, Turkey. Pakistan Journal of Botany, 43: 51–648

57. 649

650

Gutiérrez, S. A., Cúndom, M. A., Barrera, V., Gasoni, L. 2007. First record of 651

Rhizoctonia Zeae on corn in Argentina. Australasian Plant Disease Notes, 2: 652

137-138. 653

654

Hall, T. 2014. BioEdit v7.0.9: Biological sequence alignment editor for 655

Win95/98/2K/XP/7. Disponível em: 656

http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/page2.html. Acesso em: Julho de 2013. 657

658

Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor 659

and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 660

41: 95-98. 661

662

Judd, W. S., Campbell, C. S., Kellogg, E. A., Stevens, P. F., Donoghue, M.G. 2007. 663

Sistemática Vegetal: um enfoque filogenético. Porto Alegre: Artmed. 3ª ed. 664

665

Jukes, T. H; Cantor, C. R . Evolution of protein molecules. In: Munro, H. N. 666

(Ed.). Mammalian Protein Metabolism, New York: Academic Press, 1969, p. 21-667

132. 668

669

Kammerer, S. J., Burpee, L. L., Harmon, P. F. 2011. Identification of a New 670

Waitea circinata Variety Causing Basal Leaf Blight of Seashore paspalum. Plant 671

Disease, 95, 5: 515-522. 672

673

Kareem, T. A., Hassan, M. S. 2013. Molecular characterization of Rhizoctonia 674

solani. Diyala Agricultural Sciences Journal, 5, 2: 45-54. 675

676

Kataria, H. R., Hugelshofer, U., Gisi, U. 1991. Sensitivity of Rhizoctonia species 677

to different fungicides. Plant Pathology, 40:2 03–211. 678


679

Kuninaga, S., Natsuaki, T., Takeuchi, T., Yokosawa, R. 1997. Sequence variation 680

of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia 681

solani. Current Genetics, 32: 237-243. 682

683

Kuramae E. E., Buzeto, A. L., Nakatani, A. K., Souza, N. L. 2007. rDNA-based 684

characterization of a new binucleate Rhizoctonia spp. causing root rot on kale in 685

Brazil. European Journal of Plant Pathology, 119: 469–475. 686

687

Kuznia, R. A.; Windels, C. E. 1994. Rhizoctonia zeae pathogenic to spring wheat 688

and sugar beet seedlings. Phytopathology, 84: 1159. 689

690

Lanoiselet, V. M., Cother, E. J., Ash, G. J., Harper, J. D. I. 2005. Yield loss in rice 691

caused by Rhizoctonia oryzae and R. oryzae-sativae in Australia. Australasian 692

Plant Pathology, 4: 175-179. 693

694

Lakshman, D. K., Amaradasa, B. S. 2014. The pathogen biology, identification 695

and management of Rhizoctonia species with emphasis on isolates infecting 696

turfgrasses. Indian Phytopathology, 67 (4): 327-345. 697

Leiner, R. H., Carling, D. E. 1994. Characterization of Waitea circinata 698

(Rhizoctonia) isolated from agricultural soils in Alaska. Plant Disease, 78: 385-699

388. 700

701

Li, H. R., Wu, B. C., Yan, S. Q. 1998. Aetiology of Rhizoctonia in sheath blight of 702

maize in Sichuan. Plant Pathology, 47: 16-21. 703

704

Lopes, F. A. C., Steindorff, A. S., Geraldine, A. M. Brandão, R. S., Monteiro, V. 705

N., Lobo-Junior, M., Coelho, A. S. G., Ulhoa, C. J., Silva, R. N. 2012. Biochemical 706

and metabolic profiles of Trichoderma strains isolated from common bean 707

crops in the Brazilian Cerrado, and potential antagonism against Sclerotinia 708

sclerotiorum. Fungal Biology, 116: 815-824. 709

710

Lübeck, M. 2004. Molecular Characterization of Rhizoctonia. Applied Mycology 711

& Biotechnology, 4. Fungal Genomes, 205-224. 712

713

Mora-Umaña, F., Barboza, N., Alvarado, R., Vásquez, M., Godoy-Lutz, G., 714

Steadman, J.R., Ramírez, P. 2013. Virulence and Molecular Characterization of 715

Costa Rican Isolates of Rhizoctonia solani from Common Bean. Tropical Plant 716

Pathology, 38: 461-471. 717

718


Muzhinji, N., Truter, M., Woodhall, J. W., van der Waals, J. E. 2015. 719

Anastomosis Groups and Pathogenicity of Rhizoctonia solani and Binucleate 720

Rhizoctonia from Potato in South Africa. Plant Disease, 99, 12: 1790 – 1802. 721

722

Nechet, K. L., Halfeld-Vieira, B. A. 2006. Caracterização de isolados de 723

Rhizoctonia spp., associados à mela do feijão caupi (Vigna unguiculata), 724

coletados em Roraima. Fitopatologia Brasileira, 31: 505-508. 725

726

Ogoshi, A., Cook, R. J., Bassett, E. N. 1990. Rhizoctonia species and 727

anastomosis groups causing root rot of wheat and barley in the Pacific 728

Northwest. Phytopathology, 80: 784-788. 729

730

Ogoshi, A. 1987. Ecology and pathogenicity of anastomosis and intraspecific 731

groups of Rhizoctonia solani Kühn. Annual Review of Phytopathology, 25:125-732

143. 733

734

Oniki, M., Ogoshi, A., Araki, T., Sakai, R., Tanaka, S. 1985. The perfect state of 735

Rhizoctonia oryzae and R. zeae and anastomosis groups of Waitea circinata. 736

Transactions of the Mycological Society of Japan, 26: 189-198. 737

738

Prabhu, A. S., Filippi, M. C., Silva, G. B., Santos, G. R. Resistência de cultivares 739

de arroz a Rhizoctonia solani e Rhizoctonia oryzae. Pesquisa Agropecuária 740

Brasileira, Brasília, 37, 5: 589-595, 2002. 741

742

Paulitz, T. C., Okubara, P. A. 2006. First report of damping-off of canola caused 743

by Rhizoctonia solani AG2–1 in Washington State. Plant Disease, 90, 6: 829. 744

745

Paulitz, T. C., Schroeder, K. L. 2005. A New Method for the Quantification of 746

Rhizoctonia Solani and R. oryzae from Soil. Plant Disease, 89, 7: 767-772. 747

748

Poltronieri, L. S., Trindade, D. R., Albuquerque, F. C. 2002. Rhizoctonia zeae 749

Causando Podridão em Milho no Estado do Pará. Fitopatologia. Brasileira, 27, 750

4: 423-423 751

752

Poltronieri, L. S., Verzignassi, J. R., Benchimol, R. L. 2008. Tectonia grandis, 753

nova hospedeira de Rhizoctonia solani no Pará. Summa Phytopathologica, 34, 2: 754

291. 755

756

Roberts, P. 1999. Rhizoctonia-forming Fungi. A Taxonomic Guide. Royal 757

Botanic Gardens, Kew, London, UK. 758

759

Ross, R. E., Keinath, A. P., Cubeta, M. A. 1998. Biological control of wirestem on 760

cabbage using binucleate Rhizoctonia spp. Crop Protection, 17: 99-104. 761

762


Schoonhoven, A. V., Pastor-Corrales, M. A. Standard system for the evaluation 763

of bean germplasm. Cali: CIAT - Centro Internacional de Agricultura Tropical, 764

1987, 53p. 765

766

Sharon, M., Sneh, B., Kuninaga, S., Hyakumachi, M. 2006. The advancing 767

identification and classification of Rhizoctonia spp. using molecular and 768

biotechnological methods compared with the classical anastomosis grouping. 769

Mycoscience, 47: 299-316. 770

771

Sharon, M., Sneh, B., Kuninaga, S., Hyakumachi, M., Naito, S. 2008. 772

Classification of Rhizoctonia spp. using rDNA-ITS sequence analysis supports 773

the genetic basis of the classical anastomosis grouping. Mycoscience, 49, 2: 93-774

114. 775

776

Sneh B., Burpee L., Ogoshi, A. 1991. Identification of Rhizoctonia species. APS 777

Press, St. Paul, Minnesota, USA. 778

779

Souza, E. C., Kuramae, E. E., Nakatani, A. K., Basseto, M. A., Prabhu, A. S., 780

Ceresini, P. C. 2007. Caracterização citomorfológica, cultural, molecular e 781

patogênica de Rhizoctonia solani Kühn associado ao arroz em Tocantins, Brasil. 782

Summa Phytopathologica, 33, 2: 129-136. 783

784

StatSoft, Inc. 2007. STATISTICA (Data Analysis Software System), Version 8. 785

http://www.statsoft.com. 786

787

Sumner, D. R., Bell, D. K. 1982. Root diseases induced in corn by Rhizoctonia 788

solani and Rhizoctonia zeae. Phytopathology, 72: 86-91. 789

790

Taheri, P., Gnanamanickam, S., Höfte, M. 2007. Characterization, Genetic 791

Structure, and Pathogenicity of Rhizoctonia spp. Associated with rice Sheath 792

Diseases in India. Phytopathology, 97, 3: 373-383. 793

794

Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular 795

evolutionary genetics analysis, Version 6.0. Molecular Biology Evolution, 30, 796

12: 2725-2729, 2013. 797

798

Telmadarrehei, T., Tajick Ghanbary, M. A., Rahimian, H., Rezazadeh, A., Javadi, 799

M. A. 2011. Isolation and some pathologic properties of Rhizoctonia zeae from 800

cultural soils of Golestan and Mazandaran Provinces, Iran. World Applied 801

Sciences Journal, 14, 3: 374-377. 802

803

Thompson, J. D., Gibson T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins. D. G. 1997. 804

The Clustal-X windows interface: flexible strategies for multiple sequence 805


alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 25: 4876-806

4882. 807

808

Toda, T., Hyakawa, T., Mwafaida Mghalu, J., Yaguchi, S., Hyakumachi, M. 2007. 809

A new Rhizoctonia sp. closely related to Waitea circinata causes a new disease 810

of creeping bentgrass. Journal of General Plant Pathology, 73: 379-387. 811

812

Vilgalys, R., Cubeta, M. A. 1994. Molecular systematics and population biology 813

of Rhizoctonia, Annual Review of Phytopathology, 32: 135-155. 814

815

Villajuan-Abgona, R., Kageyama, K., Hyakumachi, M. 1996. Biocontrol of 816

Rhizoctonia damping-off of cucumber by nonpathogenic binucleate 817

Rhizoctonia damping-off of cucumber by non-pathogenic binucleate 818

Rhizoctonia. European Journal Plant Pathology, 102: 227-235. 819

820

Weinhold, A. R. 1977. Population of Rhizoctonia solani in agricultural soils 821

determined by a screening procedure. Phytopathology, 67: 566-569. 822

823

White, T. J., Bruns, S. Lee., Taylor, J. W. 1990. Amplification and direct 824

sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Pp. 315-322 In: 825

PCR Protocols: A Guide to A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, M. 826

A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White. Academic Press, Inc., New York. 827

828

Yan, S. Q., Wu, B. C., Tang, X. F., Liu, Z. J., Jiang, L. 1984. Sheath blight of 829

cereal crops: I. On the relation between sheath blight of rice, maize and wheat 830

as well as soreshin of cotton. Acta Phytopathol Sin, 14: 25–31. (in Chinese with 831

English abstract). 832

833

Youssef, D. R., Souza, G. R., Nechet, K. L., Halfeld-Vieira, B. A. 2012. 834

Caracterização de isolados de Rhizoctonia associados à queima foliar em 835

Roraima. Revista Agro@mbiente On-line, 6, 2: 158-165. 836

837

838

839

840

841

842

843


844

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846

Fig. 1. Spatial distribution of the sampling sites where the 81 Rhizoctonia-like 847

isolates were isolated. These sampling sites cover the five main Brazilian 848

regions over the Cerrado (Brailian Savanna) biome (area highlighted in gray). 849

850

851

852


853

854

Fig. 2. The colony patterns of Rhizoctonia-like isolates identified across the 855

Brazilian Cerrado. A-F: Ceratobasidium spp. (AGA, AGF, AGFA, AGG, AGP and 856

AGR); G-L: Thanatephorus cucumeris (AG1-IA, AG1-IB, AG1-ID, AG1-IE, AG4-857

HGII and AG4-HGIII). M-O: Waitea circinata (var. circinata, var. oryzae and var. 858

zeae). 859


860

Fig 3. Root rot severity averages caused by 15 different taxa of Rhizoctonia-like 861

isolates, identified as Ceratobasidium, Thanatephorus and Waitea in maize and 862

common bean. The disease severity was assessed through the scale by 863

Schoonhoven and Pastor-Corrales (1987). 864

865


866

Fig. 4. The Waitea circinata phylogenetic tree. In green: var. zeae; in blue: var. 867

oryzae and in red: var. circinata. 868

869

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871

872

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875

876

Fig. 5. The Ceratobasidium spp. phylogenetic tree. In red: AG-A; in blue: AG-F; 877

in light blue: AG-Fa; in purple: AG-G; in dark green: AG-P; in light green: AG-878

R. 879

880

881


882

883

884

Fig. 6. The Thanatephorus cucumeris phylogenetic tree. In red: AG1 isolates 885

(ISGs IA, IB, ID and IE); in blue: AG4 isolates (ISGs HGI and HGIII). 886

887

888


Table 1. Identification of 81 Rhizoctonia-like isolates retrieved from Cerrado biome soils at the species level, with their varieties or

anastomosis groups, and respective sampling sites, in five different Brazilian regions.

Sample IDa Nuclei number Gender/species Variety/AG Soil use

Recent cropping history

Region State NCBI Accessionb

CNPAF_0033 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-A Agricultural No record Midwest GO KM065539 CNPAF_0117 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-A Agricultural Bean/Oat South PR KX468801 CNPAF_0120 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-A Agricultural Bean/Oat South PR KX468803 CNPAF_0129 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-A Agricultural Bean/Oat South PR KX468805 CNPAF_0187 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-A Agricultural Bean/Oat South PR KX468816 CNPAF_0049 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-A Agricultural Coffee Southeast MG KM065549 CNPAF_0058 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-A Agricultural Carrot Southeast MG KM065554 CNPAF_0269 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-F Agricultural No record Northeast BA KX468840 CNPAF_0139 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-F Agricultural Bean South PR KX468806 CNPAF_0151 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-F Agricultural Bean/Soybean South PR KX468811 CNPAF_0189 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-F Agricultural Bean South PR KX468817 CNPAF_0261 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-F Agricultural No record Southeast MG KX468838

CNPAF_0036 Multinucleate

d Ceratobasidium spp. AG-Fa Agricultural Bean Midwest GO KM065540 CNPAF_0093 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-Fa Agricultural Maize/Bean North TO KM065561


d Ceratobasidium spp. AG-Fa Agricultural No record Southeast MG KX468835


CNPAF_0113 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-G Agricultural Carrot Southeast MG KM065563


d Ceratobasidium spp. AG-P Agricultural No record Southeast MG KX468837 CNPAF_0263 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-P Agricultural No record Southeast MG KX468839 CNPAF_0088 Binucleated Ceratobasidium spp. AG-R Agricultural Onion Southeast MG KX468797


d Ceratobasidium spp. AG4-HG1 Agricultural Bean South PR KX468808


d Thanatephorus cucumeris AG1-1A Agricultural Bean Midwest MT KX468822


d Thanatephorus cucumeris AG1-1A Native

Vegetation Florestal area North RR KX468825



Vegetation Savannic area North RR KX468831





d Thanatephorus cucumeris AG1-1B Agricultural Soybean Midwest GO KM065555


d Thanatephorus cucumeris AG1-1B Agricultural Coffee Southeast MG KX468795


d Thanatephorus cucumeris AG1-1B Agricultural Coffee Southeast MG KX468796


d Thanatephorus cucumeris AG1-1D Native



d Thanatephorus cucumeris AG1-1D Native

Vegetation Savannic area North RR KX468832 CNPAF_0214 Multinucleate Thanatephorus cucumeris AG1-1E Agricultural Bean Midwest MT KX468821


d


d Thanatephorus cucumeris AG1-1E Agricultural Bean Midwest MT KX468823


d Thanatephorus cucumeris AG1-1E Native


















d Thanatephorus cucumeris AG4-HG1 Agricultural Bean/Oat South PR KX468802


d Thanatephorus cucumeris AG4-HG1 Agricultural Bean South PR KX468804


d Thanatephorus cucumeris AG4-HG1 Agricultural Bean South PR KM065568


d Thanatephorus cucumeris AG4-HG1 Agricultural Bean/Oat South PR KX468820


d Thanatephorus cucumeris AG4-HG1 Agricultural Soybean Southeast MG KM065559 CNPAF_0180 Multinucleate Thanatephorus cucumeris AG4-HG1 Agricultural Bean Southeast SP KX468815


d


d Thanatephorus cucumeris AG4-HGIII Agricultural Soybean Midwest GO KM065550






d Thanatephorus cucumeris AG4-HGIII Agricultural Carrot Southeast MG KM065546


d Thanatephorus cucumeris AG4-HGIII Agricultural Carrot Southeast MG KM065557


d Thanatephorus cucumeris AG4-HG1 Agricultural Bean Midwest GO KM065556


d Waitea circinata var. circinata Agricultural No record Midwest GO KM065565


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Bean Midwest GO KX468813


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Rice Midwest GO KM065570


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Cinnamon South PR KX468807


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Bean/Sorgo South PR KM065566


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Bean South PR KX468809 CNPAF_0190 Multinucleate Waitea circinata var. circinata Agricultural No record South PR KX468818


d


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Carrot Southeast MG KX468791


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Soybean Southeast MG KM065541


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Potato/Onion Southeast MG KM065544


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Potato/Onion Southeast MG KM065545


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Potato/Maize Southeast MG KM065548


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Potato/Maize Southeast MG KX468793


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Potato/Maize Southeast MG KX468794


d Waitea circinata var. circinata Agricultural Maize/Bean Southeast MG KX468800


d Waitea circinata var. oryzae Agricultural Rice Midwest GO KM065569


d Waitea circinata var. zeae Agricultural Soybean Midwest GO KX468810


d Waitea circinata var. zeae Agricultural No record Midwest GO KM065567


d Waitea circinata var. zeae Agricultural No record North TO KM065562 CNPAF_0274 Multinucleate Waitea circinata var. zeae Agricultural No record Northeast BA KX468841


d


d Waitea circinata var. zeae Agricultural No record Northeast BA KX468842


d Waitea circinata var. zeae Agricultural Maize/Bean South PR KM065564


d Waitea circinata var. zeae Agricultural Bean/Oat South PR KX468814


d Waitea circinata var. zeae Agricultural No record Southeast MG KX468789


d Waitea circinata var. zeae Agricultural No record Southeast MG KM065536


d Waitea circinata var. zeae Agricultural Soybean Southeast MG KM065553


d Waitea circinata var. zeae Agricultural Coffee Southeast MG KM065560


d Waitea circinata var. zeae Agricultural Bean Southeast MG KX468798


d Waitea circinata var. zeae Agricultural Bean Southeast MG KX468799


d Waitea circinata var. zeae Agricultural No record Southeast MG KX468812


d Waitea circinata var. zeae Agricultural Onion Southeast MG KX468819


d Waitea circinata var. zeae Agricultural No record Southeast MG KX468836 a Sample identification at culture collection.


b The NCBI accession ID of the ribossomal DNA sequenced from those 81 isolates.


Table 2. Identification, number and both relative and absolute frequencies of varieties and anastomosis groups, from 81

Rhizoctonia-like isolates recovered from soils of the Brazilian Cerrado. The amount of isolates within each gender was 19, 30 and

32 respectively for Ceratobasidium spp., Thanatephorus cucumeris and Waitea circinata.

Gender Anamorphic state Varieties/AGa Number of isolates Relative Freq. (%)a Absolute Freq.

(%)b

Ceratobasidium spp. Ceratorhiza

AG-A 7 8.64

23.46

AG-F 5 6.17 AG-Fa 3 3.70 AG-G 1 1.23 AG-P 2 2.47 AG-R 1 1.23

Thanatephorus cucumeris Rhizoctonia solani

AG1-IA 4 4.94

37.04

AG1-IE 8 9.88 AG1-IB 3 3.70 AG1-ID 2 2.47

AG4-HGI 8 9.88 AG4-HGIII 5 6.17

Waitea circinata Rhizoctonia zeae var. zeae 16 19.75

39.51 Rhizoctonia oryzae var. oryzae 1 1.23 Not identified var. circinata 15 18.52 Total 81 100 100

a Relative frequency is the frequency of each isolate identified related with the total number of isolates.


b Absolute frequency is the frequency of each of those three genders.

universidade federal de goiÁs instituto de …1).pdfassigned to different t. cucumeris ags (ag1-ia,...

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