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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLOGICAS

ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DE 4-((1-

FENIL-1H-PIRAZOL-4-IL) METIL) PIPERAZINA-1-CARBOXILATO: UM

NOVO DERIVADO PIPERAZÍNICO

DAIANY PRISCILLA BUENO DA SILVA

GOIÂNIA-GO

2015

I

DAIANY PRISCILLA BUENO DA SILVA

ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA DE 4-((1-

FENIL-1H-PIRAZOL-4-IL) METIL) PIPERAZINA-1-CARBOXILATO: UM

NOVO DERIVADO PIPERAZÍNICO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Biológicas do

Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Goiás, como

requisito parcial para obtenção do título de

Mestre em Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Farmacologia e Fisiologia

Orientador: Prof. Dr. Elson Alves Costa

GOIÂNIA-GO

2015

II

Dedicatória

Aos meus pais, Lianeide dos Santos Bueno e Paulo Sérgio da Silva, pelo amor incondicional, confiança e incentivo.

Aos meus avós, Nelita Francisca Bueno e João

Barbosa da Silva, por todo amor, carinho e

cuidado.

III

Agradecimentos

A Deus pelas inúmeras bênçãos concedidas a mim e por estar sempre ao meu lado,

guiando meus passos.

Ao professor Xico por ter aceitado me orientar, pela confiança em mim depositada,

pelos valiosos ensinamentos, pela paciência e, acima de tudo, pelo carinho e

amizade.

Ao professor Ricardo Menegatti por sintetizar e fornecer o composto LQFM-008,

pela constante disposição em ajudar e por todo conhecimento oferecido para o

desenvolvimento desta pesquisa.

As doutorandas Iziara Ferreira Florentino e Pablinny Moreira Galdino pela amizade,

conselhos, incentivo e pela boa vontade em transmitir seus conhecimentos a mim,

os quais foram extremamente importantes para a minha formação científica e para o

desenvolvimento deste estudo.

A mestre Lanussy Porfiro de Oliveira pela amizade, conselhos, conhecimentos

compartilhados e pela contribuição na execução dos experimentos.

Aos demais amigos do Laboratório de Farmacologia de Produtos Naturais (LFPN)

Danillo Oliveira, Dayane Moreira, James O. Fajemiroye, José Luís Rodrigues

Martins, Oscar Romero, Patrícia Vasconcelos, Roberta Campos pelos bons

momentos vividos em equipe, pelos conhecimentos compartilhados, pela paciência,

alegrias e conquistas.

A todos os professores e colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas que contribuíram para minha formação científica.

Aos meus pais, Lianeide dos Santos Bueno e Paulo Sérgio da Silva, pelo amor

incondicional, conselhos, sacrifícios e por sempre me incentivarem a correr atrás dos

meus objetivos. Amo muito vocês.

IV

Aos meus avós Nelita Francisca Bueno e João Barbosa da Silva pelo amor, carinho,

cuidados e por sempre estarem dispostos a me ajudar no que for preciso.

Aos meus irmãos Sérgio Augusto Bueno da Silva, Kamila Bueno Silva e Paula

Fernandes da Silva pelo amor, carinho e paciência.

A toda minha família linda pelo amor, incentivo e boas vibrações a cada conquista

alcançada.

As minhas queridas amigas Allana Souza, Amanda Menezes, Ariane Borges, Juliana

Alves Lillia Rose e Nathanne Ciriaco, pelos conselhos, carinho e por estarem

sempre ao me lado me incentivando e me ensinando a ser uma pessoa melhor.

A Dra. Ekaterina A. F. B. Rivera e Lucas B. Nascimento pela assistência ética e

técnica.

Aos animais do laboratório, pois sem eles não seria possível desenvolver esta

pesquisa.

V

“Cada sonho que você deixa pra trás é um pedaço do seu futuro que deixa de existir”.

Steve Jobs

VI

SUMÁRIO

Lista de Abreviaturas e Siglas...................................................................... IX

Lista de Figuras.............................................................................................. XIV

Lista de Tabelas............................................................................................. XVI

Resumo........................................................................................................... XVII

Abstract........................................................................................................... XVIII

1. Introdução................................................................................................... 1

1.1 Inflamação.................................................................................................. 2

1.1. Dor............................................................................................................ 9

2. Justificativa................................................................................................ 20

3. Objetivos..................................................................................................... 23

3.1. Objetivo geral................................................................................................ 24

3.2. Objetivos específicos.................................................................................... 24

4. Materiais e Métodos....................................................................................... 25

4.1. Síntese do LQFM-008............................................................................... 26

4.2. Animais..................................................................................................... 26

4.3. Fármacos e Reagentes................................................................................ 26

4.4. Métodos farmacológicos usados para avaliar o composto LQFM-008..... 27

4.4.1. Avaliação da atividade antinociceptiva.................................................. 27

4.4.1.1. Teste da dor Induzida pela Formalina................................................. 27

4.4.2. Avaliação da atividade anti-inflamatória 27

VII

4.4.2.1. Edema de pata induzido por carragenina 27

4.4.2.2. Pleurisia induzida por carragenina...................................................... 28

4.4.3. Testes para avaliar o efeito antinociceptivo central ............................. 28

4.4.3.1. Teste da Flexão de cauda................................................................... 28

4.4.3.2. Teste da Placa Quente........................................................................ 29

4.4.4. Testes para avaliação dos mecanismos de ação envolvidos na

atividade antinociceptiva de LQFM-008........................................................... 29

4.4.4.1. Avaliação do envolvimento dos receptores opióides no efeito de

LQFM-008........................................................................................................ 29

4.4.4.2. Avaliação do envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no

efeito do LQFM-008......................................................................................... 30

4.4.4.3. Avaliação do envolvimento da serotonina endógena no efeito do

LQFM-008........................................................................................................ 31

4.5. Análise estatística..................................................................................... 31

5. Resultados.................................................................................................. 32

5.1. Atividade antinoceptiva do LQFM-008...................................................... 33

5.1.1. Efeito do LQFM-008 no teste da dor Induzida pela Formalina.............. 33

5.2. Atividade anti-inflamatória do LQFM-008..................................................... 34

5.2.1. Efeito de LQFM-008 no teste do edema de pata induzido por

carragenina.......................................................................................................... 34

5.2.2. Efeito de LQFM-008 nos teste da pleurisia induzida por carragenina... 35

VIII

5.3. Efeito de LQFM-008 nos testes para avaliação da atividade

antinociceptiva central.......................................................................................... 36

5.3.1. Efeito de LQFM008 no teste da flexão de cauda....................................... 36

5.3.2. Efeito de LQFM008 no teste da placa quente........................................ 37

5.4. Mecanismos de ação envolvidos na atividade antinociceptiva de LQFM-

008....................................................................................................................... 38

5.4.1. Envolvimento dos receptores opióides no efeito de LQFM-008................. 38

5.4.2. Envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no efeito de LQFM-

008....................................................................................................................... 40

5.4.3. Envolvimento da serotonina endógena no efeito de LQFM-008................ 41

6. Discussão................................................................................................... 42

7. Conclusão e Perspectivas......................................................................... 50

Referências Bibliográficas................................................................................ 53

IX

Lista de abreviaturas e sigla

5-HPETE 5-Hidroperoxieicosatetraenóico

12-HETE 12-hidroxieicosatetraenóico

5-HT 5-hidroxitriptamina (Serotonina)

5-HT1A 5-hidroxitriptamina 1A

5-HT1B 5-hidroxitriptamina 1B

5-HT2C 5-hidroxitriptamina 2C

5-HT3 5-hidroxitriptamina 3

5-LOX 5-lipoxigenase

AA Ácido Araquidônico

AMPA Ácido α-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazole-propiônico

(Receptor glutamatérgico)

AMPc 3',5'-adenosina monofosfato cíclico

ATP Adenosine triphosphate / Adenosina trifosfato

B1 Receptor para bradicinina tipo 1

B2 Receptor para bradicinina tipo 2

BAX Bcl-2 associada a proteína X / Regulador da apoptose

CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais

CGRP Calcitonin generelated peptide / Peptídeo relacionado

ao gene da calcitonina

COX Ciclooxigenase

COX-1 Cicloxigenase - 1

X

COX-2 Cicloxigenase - 2

COX-3 Cicloxigenase – 3

cyPGs Cyclopentenone prostaglandins / Prostaglandinas

ciclopentenônicas

DHA Docosahexaenoic Acid / Ácido docosahexaenóico

DRG Ganglio da raiz dorsal

ENK Enkephalin / Encefalinas

EPA Eicosapentaenoic acid / Ácido eicosapentenóico

FLAP Five-lipoxygenase activating protein / Enzima de

ativação 5-LOX

FTCβ Fator transformador de crescimento β

GABA Gamma-AminoButyric Acid / Ácido gama aminobutírico

GMPc Guanosine monophosphate cyclic / Monofosfato cíclico

de guanosina

GRD Gânglio da Raiz Dorsal

H1 Receptor de histamina 1




HETE Ácido hidroxieicosatetraenóico

IASP International Association for the Study of Pain /

Associação Internacional para o Estudo da Dor

IFN Intérferon

IL Interleucina

XI

IL-1 Interleucina 1

IL-1 β Interleucina 1 beta

IL-1ra Antagonista dos receptores de interleucina 1

IL-4 Interleucina 4

IL-6 Interleucina 6

IL-8 KC Interleucin 8 - Key Chemokine / Interleucina 8 –

Quimiocina chave

IL-10 Interleucina 10

IL-13 Interleucina 13

LOX Lipoxigenase

i.p. Intraperitoneal

IP3 Inositol trifosfato

LT Leucotrieno

LTA4 Leucotrieno A4

LTB4 Leucotrieno B4

LTC4 Leucotrieno cisteínico C4

LTD4 Leucotrieno cisteínico D4

LTE4 Leucotrieno cisteínico E4

LXs Lipoxinas

MCP1 Monocyte chemotactic protein 1 / Monócito

quimiotático – Proteína 1

mg Miligrama (s)

NaCl Cloreto de sódio

XII

Nal Naloxona

NAN-190 1- (2-metoxifenil) -4- [4- (2-ftalimido) butil] piperazina

hidrobrometo

NMDA N-metil-D-aspartato / Receptor glutamatérgico

NK Neurokinin / Receptor de neurocininas

ORL-1 Receptor do tipo opioide-1

p53 Proteína plasmática de massa molecular de 53 kDa

PAF Platelet-activating factor / Fator de agregação

plaquetária

PAF (Figura 5 e 6) Fibra aferente primária

PAG Periaqueductal gray / Substância cinzenta

periaquedutal

PCPA p- clorofenilalanina

PGA2 Prostaglandina A2

PGD2 Prostaglandina D2

PGE2 Prostaglandina E2

PGF2 Prostaglandina F2

PGG2 Prostaglandina G2

PGJ2 Prostaglandina J2

PGH2 Prostaglandina H2

PGI2 Prostaciclina

PLA2 Fosfolipase A2

PN Neurônio de projeção

XIII

RvE Resolvinas da série E

RvD Resolvinas da série D

RVs Resolvinas

Sal Salina

s.c. Via subcutânea

SP Substância P

SRS-A Somatostatin receptor scintigraphy / Receptor de

somatostatina substância de reação lenta da anafilaxia

TGF-β1 Transforming growth factor beta 1 / Fator de

transformação do crescimento beta 1

TNF-α Tumor necrosis factor alpha / Fator de necrose tumoral

alfa

TNFR1 Receptor de fator de necrose tumoral 1

TNFR2 Receptor de fator de necrose tumoral 2

TPH1 Triptofano hidroxilase 1

TXA2 Tromboxano A2

v.o. Via oral

v/v Volume/volume

μ, κ, δ Receptores opiódes mu, kappa e delta

XIV

Lista de Figuras

Figura 1. Cascata do ácido araquidônico e formação de mediadores

lipídicos............................................................................................................ 5

Figura 2. Caracterização temporal da resposta inflamatória aguda a partir

da ação dos mediadores associados............................................................... 8

Figura 3. Transmissão de estímulos nociceptivos.......................................... 12

Figura 4. Via descendente inibitória 16

Figura 5. Modulação da dor em nível espinal pelas fibras serotoninérgicas 17

Figura 6. Modulação da dor em nível espinal pelas fibras noradrenérgicas 18

Figura 7. Estrutura do composto LQFM-008: etil 4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il)

metil) piperazina-1-carboxilato......................................................................... 26

Figura 8. Efeito do LQFM-008, no teste da dor induzida por formalina,

primeira fase (0-5 min) e segunda fase (15-30 min)........................................ 33

Figura 9. Efeito do LQFM-008 no edema de pata induzida por carragenina. 34

Figura 10. Efeito do LQFM-008 na migração celular...................................... 35

Figura 11. Efeito do LQFM-008 na exsudação de proteínas.......................... 36

Figura 12. Efeito do LQFM-008 sobre a latência ao estímulo térmico no

teste de flexão de cauda.................................................................................. 37

Figura 13. Efeito do LQFM-008 sobre a latência ao estímulo térmico no teste

da placa quente.................................................................................................... 38

Figura 14. Envolvimento dos receptores opióides no efeito do LQFM-008......... 39

XV

Figura 15. Envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no efeito do

LQFM-008........................................................................................................... 40

Figura 16. Envolvimento da serotonina endógena no efeito do LQFM-008.... 41

XVI

Lista de Tabelas

Tabela 1. Grupos experimentais e tratamentos utilizados no estudo do

envolvimento da via opióide............................................................................. 30


envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A............................................ 30


envolvimento da serotonina endógena ........................................................... 31

XVII

Resumo

Os derivados piperazínicos constituem uma importante classe de compostos

químicos com largo espectro de atividades biológicas, tais como atividade anti-

infecciosa, anti-cancerígena, antinociceptiva, anti-hipertensiva, vasorrelaxante e

ansiolítica, tornando-se candidatos atrativos para desenvolvimento de novos

fármacos analgésicos e anti-inflamatórios. O objetivo do presente trabalho foi avaliar

os efeitos do composto piperazínico LQFM-008 (4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil)

piperazina-1-carboxilato) em testes agudos de nocicepção e inflamação, buscando

caracterizar quais os mecanismos de ação estariam envolvidos no efeito

antinociceptivo. Para este estudo foram utilizados camundongos machos, pesando

entre 25 e 35g. No teste da formalina os tratamentos com LQFM-008 nas doses de

48 e 96 µmol/kg (v.o.) reduziram o tempo de reatividade à dor tanto na fase

neurogênica quanto na fase inflamatória do teste. A atividade anti-inflamatória foi

confirmada, uma vez que LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg (v.o.) reduziu a

formação do edema de pata induzido por carragenina em todas as horas deste teste

e no teste de pleurisia LQFM-008 na dose de 96 µmol/kg também reduziu a

migração de leucócitos e a exsudação proteica. Nos testes de flexão de cauda e da

placa quente, o tratamento com LQFM-008 48 e 96 µmol/kg (v.o.) aumentou a

latência ao estímulo térmico, sugerindo o envolvimento de mecanismos centrais no

efeito antinociceptivo de LQFM-008. O pré-tratamento dos animais com naloxona

(7,5 µmol/kg s.c.) reverteu o efeito antinociceptivo de LQFM-008 apenas na primeira

fase do teste da formalina, no entanto, os pré-tratamentos com NAN-190 (1,3

µmol/kg i.p.) e PCPA (500 µmol/kg i.p.) reverteram o efeito antinociceptivo de LQFM-

008 em ambas as fases do teste. Assim o derivado piperazínico LQFM-008

apresenta atividade antinoceptiva e anti-inflamatória em testes agudos, sendo efeito

antinociceptivo decorrente de uma ação central com envolvimento dos receptores

opióides e da via serotoninérgica.

Palavras-chave: Efeito antinociceptivo, Efeito anti-inflamatório, Derivados

piperazínicos, LQFM-008, Via serotoninérgica.

XVIII

Abstract

The piperazines derivatives are an important class of chemical compounds with a

broad spectrum of biological activities such as anti-infectious activity, anti-

carcinogenic, anti-nociceptive, anti-hypertensive, anxiolytic and vasorelaxant and are

attractive candidates for development of new analgesics and anti-inflammatories

drugs. The aim of this study was evaluate the effects of piperazine compound LQFM-

008 (4-[(1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl) methyl]1-piperazine carboxylic acid ethyl ester) in

acute tests of nociception and inflammation and characterize that the mechanisms

are involved in the antinociceptive effect. For this study were used male mice

weighing between 25 and 35g. In the formalin test, the treatments with LQFM-008 at

doses of 48 and 96 µmol/kg (p.o.) reduced the licking time at both neurogenic and

inflammatory phases of this test. The anti-inflammatory activity was confirmed, since

LQFM-008 at doses of 48 and 96 µmol/kg (p.o.) reduced the formation of paw edema

induced by carrageenan at all hours of the test and LQFM-008 in pleurisy test at

dose of 96 µmol/kg (p.o.) also reduced leukocyte migration and protein exudation. In

the tail-flick and the hot plate tests, the treatment with LQFM-008 at doses of 48 and

96 µmol/kg (p.o.) increased the latency to thermal stimulus, suggesting the

involvement of central mechanisms in the antinociceptive effect LQFM-008. The pre-

treatment of animals with naloxone (7.5 µmol/kg s.c.) reversed the antinociceptive

effect of LQFM-008 only in the first phase of the formalin test, however, the pre-

treatment with NAN-190 (1.3 µmol/kg i.p.) and PCPA (500 µmol/kg i.p.) reversed the

antinociceptive effect of LQFM-008 in both phases of the test. Thus, the piperazine

derivative LQFM-008 exhibit antinociceptive and anti-inflammatory activities in acute

test and the antinociceptive effect is resulting from a central action with involvement

of opioid receptors and the serotonin pathway.

Key words: Antinociceptive effect, Anti-inflammatory effect, Piperazines derivatives,

LQFM-008, pathway serotonergic.

1

Introdução

2

1.1 Inflamação

Em resposta a lesões teciduais provocadas por diferentes tipos de estímulos

agressivos que podem ser físicos, químicos ou biológicos desencadeia uma cascata

de eventos fisiológicos, imunológicos e bioquímicos denominada inflamação que tem

como propósito proteger, restringir e reparar danos teciduais (1, 2).

A resposta inflamatória pode ser classificada quanto ao seu tempo de duração

em inflamação aguda, que é uma resposta ativa e auto-limitada, resultando no

reparo tecidual e retorno à homeostase; e inflamação crônica, que surge a partir da

desregulação dos mecanismos de restauração dos tecidos e estímulos inflamatórios

persistentes, tornando-se fatores importantes na progressão de doenças crônicas de

origem inflamatória, como por exemplo, artrite e aterosclerose (3, 4, 5, 6).

Durante o processo inflamatório há a participação de vários mediadores e

células que promovem importantes alterações, levando ao aparecimento dos

primeiros sinais clássicos da inflamação aguda, chamados de sinais cardinais (7, 8).

Os sinais cardinais foram descritos um século depois de Cristo (I d.C.) pelo escritor

romano Aulus Cornelius Celsus que relatou quatro sinais da inflamação, sendo estes

o tumor (inchaço), rubor (vermelhidão), calor e dor. Posteriormente, no século XIX,

Rudolph Virchow, um médico polonês considerado o pai da patologia moderna,

adicionou o quinto sinal cardinal da inflamação, a “perda da função” que acontece

quando não há resolução adequada do processo inflamatório (9).

Por serem mediadores pré-formados que estão armazenados nas células, a

histamina e serotonina são os primeiros a serem liberados durante o processo

inflamatório, sendo responsáveis pela vasodilatação e aumento da permeabilidade

membranar (10).

A histamina é uma amina biogênica cuja síntese é realizada a partir do

aminoácido L-histidina pela ação da enzima histidina descarboxilase. Esta amina é

sintetizada e armazenada principalmente em mastócitos e basófilos, os quais, em

resposta a qualquer estímulo agressivo, sofrem degranulação e a liberam. A

histamina exerce seus efeitos mediante a interação com quatro tipos de receptores

histaminérgicos H1, H2, H3 e H4. Ao se ligar nos receptores H1 ela promove

contração da musculatura lisa de vários órgãos e aumento da permeabilidade

capilar, nos receptores H2 promove aumento da secreção de ácido gástrico e

relaxamento da musculatura lisa. H3 está envolvido no feedback negativo da

3

liberação de histamina e H4, expressos principalmente em células do sistema

hematopoiético como eosinófilos e mastócitos, promove a liberação de citocinas

quimiotáticas (11, 12, 13).

Já a serotonina (5-hidroxitriptamina) é sintetizada nas células enterocromafins

a partir do triptofano, por meio da enzima Triptofano hidroxilase 1 (TPH1). A maior

parte do armazenamento da 5-HT é feita nestas células, porém a 5-HT circulante é

captada e armazenada pelas plaquetas, que ao entrar em contato com o endotélio

lesado, liberam essa amina que é responsável pelo aceleramento da aglutinação

plaquetária, vasodilatação via estimulação da produção e liberação de óxido nítrico e

vasoconstrição em casos de lesões endoteliais mais profundas, através da ativação

de receptores 5HT2 presentes no músculo liso (14).

Outro importante mediador que participa do processo inflamatório é a

bradicinina que é produzida a partir do cininogênio. Quando se liga aos receptores

constitutivos do tipo B2 a bradicinina promove aumento da permeabilidade vascular

e aumento do fluxo sanguíneo, além da estimulação de fibras nociceptivas. Os

receptores do tipo B1 são poucos expressos em condições normais, no entanto, em

condições patológicas são rapidamente induzidos e quando ativados são

responsáveis por induzir uma série de efeitos pró-inflamatórios como migração de

leucócitos, liberação de prostaglandinas, citocinas, quimiocinas e leucotrienos,

contribuindo consequentemente para quadros de hiperalgesia (11, 15, 16).

Outros mediadores liberados no processo inflamatório são neuropeptídios,

neurocinina A, somatostatinas, encefalinas, CGRP (calcitonin gene related peptide)

e substância P, sendo estes dois últimos, mediadores pró-inflamatórios responsáveis

pela inflamação neurogênica (11).

Uma importante classe de mediadores lipídicos, os eicosanoides, é formada

durante a inflamação a partir do ácido araquidônico (AA), um precursor endógeno

formado por 20 carbonos contendo quatro duplas ligações. Na presença de

qualquer tipo de estímulo agressor, a enzima fosfolipase A2 é ativada e então

catalisa a hidrólise dos fosfolipídeos presentes nas membranas celulares, liberando

o ácido araquidônico que é rapidamente metabolizado por duas grandes vias

enzimáticas: a via das cicloxigenases (COX) e a via das lipoxigenases (LOX) (9, 17).

A COX, também conhecida como prostaglandina endoperóxido sintetase,

promove a oxidação e ciclização do ácido araquidônico levando à formação de

prostaglandinas instáveis (PGG2) que por sua vez recebe quatro moléculas de O2

4

após uma redução de dois elétrons, resultando na formação de uma prostaglandina

altamente instável, a PGH2, que sofre isomerização originando os eicosanóides

(PGE2, PGD2, PGF2), prostaciclina (PGI2) e tromboxano A2 (TXA2). Especificamente,

a prostaglandina E2 é formada por meio da ação da enzima prostaglandina E sintase

em leucócitos, enquanto que a prostaciclina é formada através da ação da

prostaciclina sintase em células endoteliais e os tromboxanos são formados nas

plaquetas por meio da ação enzimática da tromboxano sintase (18, 19, 20, 21).

Atualmente já foram descobertos três tipos de cicloxigenases. A COX-1,

constitutivamente expressa e amplamente distribuída, é responsável pelos níveis

basais de prostaglandinas. Já a COX-2 é induzida durante o processo inflamatório,

sendo responsável pela formação dos mediadores lipídicos pró-inflamatórios, no

entanto, esta enzima também é expressa constitutivamente em alguns tecidos como

rins e cérebro. A COX-3 foi descrita como uma variação da COX-1, esta compartilha

todas as características catalíticas das COX-1 e COX-2 sendo encontrada no córtex

canino e no sistema nervoso central e coração de humanos (22). Há a hipótese de

que esta terceira isoforma possui atividade anti-inflamatória podendo induzir a

formação de prostaglandinas ciclopentenônicas e resolvinas e, além disso, tem sido

constatada sua expressão em períodos de remissão de doenças inflamatórias

crônicas (23).

Os eicosanoides, em especial as prostaglandinas, estão intimamente

associados à evolução da resposta inflamatória. As PGD2, PGE2 e PGI contribuem

consideravelmente para a formação do edema e chegada das células de defesa ao

tecido lesionado. Em relação ao envolvimento das prostaglandinas com a dor

inflamatória, tem sido relatado que as PGI2 e PGE2 estão relacionadas com a

hiperalgesia de curta e longa duração, respectivamente, por meio da sensibilização

de nociceptores, que se tornam mais responsivos a agentes álgicos endógenos

como a bradicinina. Além disto, o aumento da produção de prostaglandinas no local

da lesão e no sistema nervoso central durante o processo inflamatório contribui para

o surgimento de quadros febris (24, 25, 26).

Em contrapartida, algumas prostaglandinas, chamadas de ciclopentenônicas,

são responsáveis por promoverem efeitos anti-inflamatórios. A PGA2 é formada a

partir da PGE2 por meio de uma reação de desidratação não-enzimátia e está

relacionada com a inibição de citocinas pró-inflamatórias e inibição da produção de

quimiocinas. Da mesma forma, a prostaglandina 15d-PGJ2, derivada da PGJ2 que foi

5

descoberta na década de 1960 a partir da desidratação de PGD2, também é capaz

de desenvolver atividade anti-inflamatória a partir da redução da migração de

leucócitos e inibição das IL6, IL1β, IL12 e TNFα (27, 28, 29).

O ácido araquidônico pode seguir também a via das lipoxigenases, onde as

mesmas catalisam a formação dos ácidos hidroxieicosatetranóicos (HETE) e

consequentemente à formação dos leucotrienos, lipoxinas e outros compostos

biologicamente ativos. Existem três tipos de lipoxigenases: 5-lipoxigenase presente

em células mielóides; 12-lipoxigenases presentes nas plaquetas e a 15-lipoxigenase

presente nas células epiteliais/endoteliais. A 5-lipoxigenase com a ajuda da enzima

de ativação FLAP, converte o ácido araquidônico em leucotrieno A4 (LTA4) que, por

vias distintas, origina o leucotrieno B4 (LTB4) e os chamados cisteinil leucotrienos

(LTC4, LTD4, e LTE4), anteriormente conhecidos como substância de reação lenta da

anafilaxia (SRS-A). O LTB4 é um potente regulador da quimiotaxia e da adesão de

leucócitos nas células endoteliais, além de estimular a produção de várias citocinas

pró-inflamatórias. Os produtos finais da 12-lipoxigenase e 15-lipoxigenase são o

ácido 12-hidroxieicosatetraenóico e as lipoxinas (A e B), respectivamente, sendo as

lipoxinas mediadores anti-inflamatórios que contribuem para a resolução do

processo (Figura 1) (9, 30, 31, 32).

Figura 2. Cascata do ácido araquidônico e formação de mediadores lipídicos, adaptado de

TAVARES, 2012 (33).

6

As citocinas são glicoproteínas ou polipeptídeos, hidrossolúveis com peso

molecular entre 8 e 20 kDa. São produzidas por vários tipos de células no local

lesionado, inclusive por células imunológicas e atuam por mecanismos parácrino,

quando agem em células vizinhas ou autócrino, quando agem na própria célula

produtora. Uma mesma citocina pode ter várias ações em contextos biológicos

diferentes, algumas podem exercer a mesma ação ou podem cooperar para uma

ação final comum e, em contrapartida, pode acontecer de a ação de uma citocina

ser anulado pelo efeito de outra (34, 35).

Através do controle da expressão gênica, as citocinas são capazes de

influenciar nas funções celulares, diferenciação, proliferação e sobrevida de células

do sistema imunológico, além de regular a produção e atividade de outras citocinas,

modulando assim o destino do processo inflamatório. Existem cinco grupos distintos

de citocinas: as interleucinas (IL, numeradas sequencialmente de IL-1 a IL-35),

fatores de necrose tumoral (TNF – Tumor Necrosis Factor), quimiocinas (citocinas

quimiotáticas), interferons (IFN) e fatores de crescimento mesenquimal. Algumas

citocinas podem ter ações pró-inflamatórias ou anti-inflamatória, dependendo do

microambiente onde estão localizadas (35).

Dentre as pró-inflamatórias as principais são as IL-1β, IL-6 e TNF-α. A IL-1β é

produzida por macrófagos, monócitos e células gliais, sendo responsável por

produzir inflamação sistêmica através da indução da ciclooxigenase-2, com a

formação de PGE2 no hipotálamo, e consequente aparecimento de quadros febris.

Além disso, esta citocina induz a produção de substância P, PGE2, moléculas de

adesão endotelial e óxido nítrico a partir da ativação da enzima óxido nítrico sintase

(34, 35).

A IL-6 é produzida e secretada por diversos tipos de células, incluindo

monócitos, macrófagos, eosinófilos, hepatócitos e células da glia a partir da ação de

outras citocinas, principalmente pela TNF-α e IL-1. Essa citocina é responsável por

desencadear febre a partir da ativação da região termorreguladora do hipotálamo e,

além disso, possui ações pró-inflamatórias que envolvem a maturação e ativação de

neutrófilos, maturação de macrófagos e diferenciação/manutenção de linfócitos T

citotóxicos. Em contrapartida, esta interleucina contribui para a regeneração de

lesão neuronal através da regulação da expressão de neuropeptídios e promove

efeitos anti-inflamatórios de acordo com a sua concentração sérica, inibindo IL-1 e

7

TNF-α e estimulando a síntese de IL-1ra, a qual apresenta efeitos anti-inflamatórios

(35, 36, 37).

O Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α), também conhecido como

caquetina, é um dos primeiros e mais potentes mediadores liberados durante o

processo inflamatório e possui como fontes primárias de síntese os monócitos,

macrófagos e linfócitos T. Esta citocina atua principalmente através de dois

receptores de superfície celular, TNFR1 expresso em células epiteliais e neurônios e

TNFR2 expresso principalmente em macrófagos e monócitos do gânglio da raiz

dorsal, sendo o primeiro responsável por respostas inflamatórias e apoptose celular

e o segundo pela estimulação da proliferação de linfócitos-T, fibroblastos e células

natural killer. TNF-α é também um importante indutor de catabolismo muscular e

caquexia, além de possui funções adicionais como estimulação da

expressão/liberação de moléculas de adesão, citocinas e fatores de crescimento (34,

36, 37).

Um dos grupos de citocinas que merece destaque é o das quimiocinas que

reúne mais de 50 citocinas com funções quimioatraentes. As quimiocinas são

pequenos polipeptídeos, com cerca de 90 a 130 resíduos de aminoácidos, que

possuem como funções a quimiotaxia, ativação e adesão de diferentes tipos de

leucócitos, desempenhando um papel fundamental no processo inflamatório com o

recrutamento de células do sistema imune para o local da lesão, entretanto, tem sido

atribuídas novas funções às quimiocinas, tais como angiogênese, modulação da

inflamação e febre (38, 39).

A ação das quimiocinas é mediada por receptores transmembranais

acoplados à proteína G, que quando ativados desencadeiam uma cascata de

transduções de sinais com a formação de segundos mensageiros como o AMPc, IP3

e cálcio, promovendo a expressão de moléculas de adesão como integrinas, L-

selectinas e ligantes de carboidratos para selectina P e E na membrana dos

leucócitos (38). Em paralelo, os macrófagos ativados pelo agente agressor

produzem as citocinas TNF-α e IL-1β que estimulam as células endoteliais a

produzirem P-selectina e E-selectina bem como ligantes de integrina para que

ocorra a adesão dos leucócitos ao endotélio. As interações selectina-ligante de

selectina são de baixa afinidade facilitando assim o rolamento dos leucócitos na

superfície do endotélio, em contrapartida as interações integrina - ligantes de

integrina medeiam uma ligação firme promovendo a adesão dos leucócitos ao

8

endotélio. As quimiocinas então atuam sobre os leucócitos aderentes e os estimulam

a migrar através dos espaços interendoteliais obedecendo ao gradiente de

concentração químico em direção ao local da inflamação (11, 40).

Desta maneira, os leucócitos polimorfonucleares são as primeiras células de

defesa a chegarem ao local da inflamação, onde se acumulam para neutralizar o

patógeno e/ou eliminar detritos celulares por fagocitose. À medida que os neutrófilos

se acumulam no tecido inflamado, ocorre uma segunda onda de infiltração celular

com a chegada dos monócitos, os quais se diferenciam em macrófagos e, além de

tentarem remover o agente agressor, promovem a remoção restos celulares de

neutrófilos que morreram por apoptose (Figura 2). Após terem completado suas

tarefas, os macrófagos são removidos do tecido inflamado via sistema linfático ou

por apoptose. A ativação contínua das etapas deste processo ou a falha na

capacidade de resolver a resposta inflamatória mesma tornam a lesão crônica,

sendo prejudicial para o tecido (9).

Figura 2. Caracterização temporal da resposta inflamatória aguda a partir da ação dos mediadores

associados, adaptado de Lawrence, Willoughby e Gilroy, 2002 (41).

A resposta inflamatória é estreitamente regulada tanto por mediadores pró-

inflamatórios responsáveis pela resposta inicial contra os estímulos nocivos, quanto

por mediadores anti-inflamatórios que contribuem para o fim da inflamação e retorno

9

à homeostase. As citocinas IL-4, IL-10, IL-13 e fator transformador de crescimento β

(FTCβ) são as principais citocinas anti-inflamatórias liberadas na fase de resolução

da inflamação, atuando sobre linfócitos T e B, mastócitos, monócitos e macrófagos,

promovendo principalmente a inibição de citocinas pró-inflamatórias. (35, 42).

Durante a fase de resolução da inflamação são biossintetizados mediadores

lipídicos, tais como resolvinas, protectinas, lipoxinas e maresinas que estimulam e

aceleram a resolução através de diferentes mecanismos no tecido lesionado,

evitando assim a evolução do processo inflamatório agudo para crônico. As

lipoxinas (A4 e B4) são derivados de ácidos graxos endógenos como, por exemplo,

o ácido araquidônico, e são responsáveis por inibir a infiltração de neutrófilos

polimorfonucleares além de estimular o recrutamento de macrófagos para o tecido

lesado (9).

As resolvinas, protectinas e maresina são mediadores lipídicos induzidos

endogenamente durante o processo de resolução da inflamação. São

biossintetizados a partir de ácidos graxos poli-insaturados essenciais derivados da

dieta como, por exemplo, o ômega-3. Estes mediadores possuem como tarefas a

redução da infiltração de neutrófilos, a limpeza da lesão por meio da fagocitose de

neutrófilos apoptóticos, além de contribuirem para a regeneração do tecido. Existem

dois principais grupos da família das resolvinas com estruturas químicas distintas,

sendo o grupo E (RvE1 e RvE2) derivado do ácido eicosapentaenoico (EPA) e o

grupo D (RvD), derivado de ácido docosahexaenóico (DHA). Ambos os grupos

também estão intimamente envolvidos no processo de resolução da inflamação (9,

42, 43).

1.2 Dor

Etimologicamente, a palavra “dor” na língua portuguesa vem do latim: dolore,

que significa sofrimento; e “pain” na língua inglesa provém do grego: poiné, que

significa pena. Ao longo da história da humanidade, vários indivíduos tentaram

definir a dor. Homero acreditava que ela era resultado de “flechadas atiradas por

deuses”, como uma forma de punição para os humanos. Aristóteles definiu a dor

como uma “paixão da alma”, caracterizada como um sentimento de sofrimento e

“padecimento”. Já Platão considerava que a dor além de se originar de uma

10

estimulação periférica, também envolvia a experiência emocional originada no

espírito. Por fim, o filósofo francês René Descartes propôs que o sistema nervoso

periférico era responsável por veicular informações sensitivas do meio ambiente

para o encéfalo, que processaria o sítio das sensações e motricidade, sendo a alma

capaz de perceber qualquer estímulo sobre o corpo ou no seu interior (44, 45, 46).

Nos dias atuais a Associação Internacional para Estudo da Dor (IASP) define

a mesma como uma “experiência sensorial e emocional desagradável associada a

uma lesão tecidual real ou potencial”. Portanto, a dor apresenta dois componentes: a

experiência sensorial denominada nocicepção e a experiência emocional conhecida

como percepção. A nocicepção, ou sensação nociceptiva, resulta da detecção de

estímulos capazes de comprometer a integridade física de um organismo. A

percepção é uma função integrativa modulada pela emoção e condição psicológica

(47). Sendo assim, dor seria o termo mais adequado quando se refere ao ser

humano, enquanto nocicepção seria mais indicado para animais experimentais, uma

vez que não se entende a percepção nos mesmos (45, 48).

A dor pode ser classificação de acordo com a duração, topografia,

intensidade, dentre outros critérios. Em relação ao tempo ela pode ser transitória,

aguda ou crônica. Do ponto de vista fisiológico ela pode ser nociceptiva, inflamatória

ou neuropática (49).

A dor transitória é provocada pela ativação de nociceptores em determinado

tecido, porém sem o acompanhamento de lesão, possuindo como função a proteção

contra futuras lesões físicas que possam ser provocadas por agentes do ambiente

ou apenas informar sobre deformações de tecidos corporais que poderiam originar

uma lesão. Já a “dor aguda” é provocada pela estimulação dos nociceptores em

resposta à lesão de algum tecido corporal. Se a dor aguda persistir mesmo após a

recuperação da lesão, o que pode demorar alguns dias ou semanas, ela já não é

mais classificada como aguda, mas sim como “dor crônica” (50, 51).

A dor nociceptiva é proveniente da ativação de receptores nociceptivos e está

relacionada à lesão de tecidos ósseos, musculares ou ligamentares, já a dor

neuropática ocorre em áreas ou órgãos envolvidos em lesões ou doenças

neurológicas (52, 53, 54). Mais recentemente, devido à possível ocorrência desses

dois tipos de dor ao mesmo tempo e das dificuldades em diagnosticá-las, alguns

autores recomendam o uso do termo “dor predominantemente neuropática” ou “dor

predominantemente nociceptiva”, dependendo do padrão clínico de apresentação

11

(52, 53). A dor de origem inflamatória resulta da interação entre o tecido lesionado e

os neurônios sensoriais nociceptivos periféricos por meio da participação de

mediadores inflamatórios. Existem mediadores inflamatórios que apenas

sensibilizam os nociceptores e mediadores e estímulos que desencadeiam a

resposta nociceptiva (45).

Os nociceptores são terminações nervosas livres de neurônios pseudo-

unipolares primários, possuindo um ramo axonal distal, que se dirige à periferia, e

outro ramo axonal proximal, que se dirige ao corno dorsal da medula espinal ou ao

tronco cerebral. Estes nociceptores são capazes de detectar e transduzir estímulos

físicos, sejam eles mecânicos ou térmicos, e estímulos químicos como, por exemplo,

à bradicinina, capsaicina, serotonina, prótons etc. Eles podem ser classificados

como nociceptores térmicos que são ativados por estímulos térmicos extremos,

normalmente maiores que 45°C ou menores que 5°C; receptores mecânicos que são

ativados por estímulos mecânicos intensos; e os receptores polimodais que

respondem tanto a estímulos térmicos quanto químicos ou mecânicos de alta

intensidade (44, 45, 55).

As fibras nociceptivas primárias inervam amplamente pele, mucosas,

músculos, articulações e vísceras. Estas fibras possuem o seu corpo celular

presente no gânglio da raiz dorsal de onde sai um prolongamento axônico que se

divide em dois, um se dirigindo para os tecidos periféricos e o outro para a medula

espinhal ou para o tronco encefálico (45, 56, 57, 58).

Estas fibras primárias são classificadas de acordo com seu diâmetro

(pequeno ou médio), seu grau de mielinização e sua velocidade de condução do

potencial de ação. As fibras A-delta são de médio diâmetro (2 a 6 µm), finamente

mielinizadas e possui velocidade de condução do potencial de ação de 12 a 30 m/s,

sendo responsáveis pela dor aguda, respondendo principalmente a estímulos

mecânicos e térmicos. As fibras C são de pequeno diâmetro (0,4 a 1,2 µm), não

mielinizadas e de velocidade de condução do potencial de ação mais lenta (0,5 a 2

m/s), responsáveis pela dor difusa e de longa duração e são chamadas de

polimodais, pois respondem a estímulos mecânicos, térmicos e químicos (Figura 3)

(47, 59, 60).

Existem também as fibras A-beta, de grande diâmetro (maior que 10 µm),

altamente mielinizadas e com alto limiar de ativação, sendo responsáveis por

detectarem estímulos táteis (Figura 3). Em situações normais estas fibras não

12

respondem a estímulos térmicos ou mecânicos, porém, durante um processo

inflamatório seu limiar de ativação diminui e as mesmas passam a responder a tais

estímulos. Quando ocorre algum tipo de plasticidade neuronal proveniente de

processos patológicos essas fibras passam a interpretar estímulos táteis inócuos

como estímulos nociceptivos, originando o fenômeno chamado de alodinia, onde

estímulos não dolorosos passam a promover dor (45, 61, 62).

Figura 3. Transmissão de estímulos nociceptivos. As fibras nociceptivas primárias (A-beta, A-delta e

C) são responsáveis por detectar e transmitir informações sobre a lesão tecidual. Estas se propagam

para o corno dorsal da medula espinal e transmitem a informação para os neurônios de segunda

ordem que conduzem as informações nociceptivas até o cérebro, onde essas informações serão

interpretadas de acordo com experiências de percepção de cada indivíduo. Projeções descendentes

originadas no tronco encefálico funcionam como um mecanismo intrínseco de controle da dor.

Adaptado de OAKLANDER, 2013 (63).

A função básica dos nociceptores é transmitir informações sobre a lesão

tecidual aos neurônios de ordem superior. Sendo assim, as fibras aferentes

primárias se propagam para o corno dorsal da medula espinal em regiões

13

específicas, onde fazem sinapses com os neurônios secundários. O corno dorsal da

medula espinal é subdividido em uma série camadas, chamadas de lâminas,

baseando-se em características citoarquitetônicas, como diferença de tamanho e

densidade dos neurônios. As lâminas I e II, região conhecida como substância

gelatinosa, são comumente chamadas de superficiais e são os principais alvos dos

neurônios aferentes primários, sendo que a maioria dos neurônios da lâmina I

respondem exclusivamente a estímulos nociceptivos e a lâmina II é formada quase

que exclusivamente por interneurônios excitatórios e inibitórios. Mais profundamente

existem também as lâminas V, VI, VII e X. As fibras A-delta fazem sinapses com

neurônios secundários presentes nas lâminas I, II e também na V, e as fibras C,

principalmente, com neurônios da lâmina II. As lâminas III, IV e V contêm neurônios

que recebem aferências de fibras A-beta, respondendo predominantemente a

estímulos táteis que, em condições fisiológicas normais, não produzem dor. A lâmina

V recebe aferências de fibras A-beta, A-delta, C e também de estruturas viscerais

(56, 57, 64, 65, 66).

A transmissão sináptica entre as fibras aferentes primárias e os neurônios

secundários no corno dorsal da medula espinal é mediada pela liberação de

diversos neurotransmissores, dentre eles o ATP (67), glutamato (68) (69), SP (70;

71; 72), peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) (71).

O glutamato é considerado um dos principais neurotransmissores envolvidos

na transmissão de sinapses excitatórias no corno dorsal da medula espinal. Suas

ações são promovidas a partir da ativação de dois grupos de receptores, os

metabotrópicos e os ionotrópicos, sendo este último dividido em três grupos distintos

que incluem os receptores N-metil-D-aspartato (NMDA), o ácido α-amino-3-hidroxi-5-

metilisoxazol-4-propiônico (AMPA) e o cainato (73, 74).

Ocorre em algumas sinapses liberação concomitante de glutamato e

substância P (SP). A SP é um peptídeo da família das taquicininas que, além de

prolongar as ações do glutamato, promove também a sensibilização de

nociceptores, bem como a redução do limiar de excitabilidade das sinapses e,

consequentemente a ativação de nociceptores silenciosos. Está envolvida

principalmente na transmissão de estímulos nociceptivos de fibras aferentes

primárias do tipo C, agindo por meio da ativação dos receptores de neurocininas

(NK1 e NK2). Quando ocorre algum tipo de lesão tecidual, esta substância

14

produzirá ações vasculares pró-inflamatórias que contribuirão para o processo de

hiperalgesia e alodinia (75, 76).

O CGRP é responsável por modular a transmissão nervosa tanto no nível de

sistema nervoso central quanto na inflamação periférica, sendo sintetizado e

liberado principalmente pelas fibras do tipo C. Na medula espinal ele é capaz de

aumentar a excitação neuronal, retardar o metabolismo da SP e aumentar a

liberação de SP e de glutamato (35, 59).

No corno dorsal da medula espinal existem três populações de neurônios com

os quais as fibras aferentes primárias fazem conexões: os interneurônios

subdivididos em excitatórios e inibitórios; os neurônios que estão envolvidos na

atividade reflexa e os neurônios de projeção que conduzem as informações

nociceptivas até os centros supra-espinais por meio de tratos neuronais específicos

(47).

Existem basicamente duas vias ascendentes para a condução da dor da

medula até o cérebro: a via neoespinotalâmica e a via palioespinotalâmica. A

primeira conduz à dor somática e bem-localizada; já a segunda conduz à dor

visceral, de localização difusa. No cérebro, nas regiões como o bulbo, a ponte, o

mesencéfalo, o tálamo e o hipotálamo, existem os neurônios de terceira ordem que

levam os estímulos nociceptivos para as áreas sensoriais do córtex cerebral, onde

os mesmos serão interpretados de acordo com experiências de percepção (46, 77).

Como mecanismos intrínsecos de controle da dor, há uma série de sistemas

neuroniais distintos que modulam os eventos que ocorrem durante o processamento

da informação nociceptiva em nível espinal. Um exemplo são os interneurônios

inibitórios que se projetam para outras regiões do corno dorsal, constituindo um

importante mecanismo de regulação da transmissão nociceptiva. Outro mecanismo

neuronal de controle da dor acontece por meio de projeções descendentes

originadas no tronco encefálico, onde ocorrem sinapses excitatórias com neurônios

serotoninérgicos e noradrenérgicos, que por sua vez descem até o corno dorsal da

medula e realizam conexões inibitórias com neurônios aferentes primários reduzindo

a liberação de glutamato, aspartato e CGRP e consequentemente a descarga de

estímulos nociceptivos. A transmissão da informação nociceptiva na medula

espinhal também pode ser regulada por inibição de interneurônios excitatórios ou

por estimulação de interneurônios inibitórios que fazem sinapses na substância

15

gelatinosa, onde liberam neurotransmissores e neuromoduladores tais como o ácido

gama aminobutírico (GABA), opióides endógenos e glicina, entre outros (45, 47, 78).

O sistema inibitório descendente possui quatro principais regiões do sistema

nervoso central que estão interligadas: 1) sistemas corticais e diencefálicos; 2)

substância cinzenta periaquedutal (PAG) e periventricular que são ricas em

encefalinas e receptores opióides; 3) partes do bulbo rostroventral, especialmente o

núcleo magno da rafe e núcleos adjacentes que recebem impulsos excitatórios da

PAG; 4) o corno dorsal bulbar e medular que recebe terminais de axônios do núcleo

magno da rafe e núcleos adjacentes (79, 80, 81, 82, 83).

De forma geral a via descendente inibitória funciona da seguinte forma: os

centros corticais e diencefálicos enviam projeções neuronais para a PAG que por

sua vez envia projeções descendentes para o núcleo rostroventromedial (RVM) da

medula, o qual é definido funcionalmente como a linha média ponto-medular em que

a estimulação eléctrica ou micro-injeção opióide produz antinocicepção

comportamental (84, 85). Os neurônios desse núcleo, por sua vez, se projetam para

o corno dorsal da medula espinal, onde formam conexões sinápticas com terminais

aferentes primários, neurônios de segunda ordem e interneurônios modulando a

transmissão do estímulo nociceptivo (Figura 4) (86, 87). Porém, vale ressaltar que

cada via que compões o sistema descendente inibitório possui algumas

particularidades.

A via descendente conta com o sistema opióide endógeno, fibras

serotoninérgicas, noradrenérgicas e colinérgicas, os quais contribuem para a

modulação da transmissão do estímulo doloroso (88, 89, 90, 91, 92, 93).

Os opióides agem por meio da ativação de quatro tipos de receptores, µ, δ, κ

e receptor do tipo opioide-1 - ORL-1, os quais são amplamente distribuídos pelo

sistema nervoso central, podendo ser encontrados dentro do corno posterior da

medula espinal e em núcleos cerebrais específicos como córtex insular, amídala,

hipotálamo, região PAG e RVM, sendo os receptores µ responsáveis pela maioria

dos efeitos analgésicos dos opióides e por alguns efeitos colaterais como, por

exemplo, sedação, euforia, depressão respiratória e dependência (94, 95, 59).

16

.

Figura 4. Via descendente inibitória. Os centros corticais superiores enviam projeções neuronais para

a região cinzenta periaquedutal (PAG) que por sua vez envia projeções descendentes para o núcleo

rostroventromedial (RVM) da medula. Os neurônios do RMV projetam-se para o corno dorsal da

medula espinal, onde formam conexões sinápticas com interneurônios e fibras nociceptivas,

modulando a transmissão do estímulo doloroso. A= Amígdala; IC= Córtex insular; H= Hipotálamo

(59).

Há evidências que relatam a liberação de opióides endógenos, conhecidos

como endorfinas, tanto em nível espinal quanto supra-espinal, os quais se ligam aos

receptores opióides promovendo efeito analgésico. Em nível espinal os opióides

podem atuar de forma pré-sináptica inibindo a liberação de diferentes

neurotransmissores nas terminações aferentes primárias no corno posterior e/ou

podem atuar de forma pós-sináptica para reduzir a excitabilidade dos neurônios no

corno dorsal da medula espinal. Agonistas destes receptores como a morfina,

podem produzir analgesia através de ambos os mecanismos pré e pós-sinápticos

em vários locais do sistema nervoso central (94, 59, 96).

Em adição ao sistema opióide, as fibras serotoninérgicas originadas no núcleo

magno da rafe também participam da modulação da dor em nível espinal. No corno

dorsal da medula espinal essas fibras liberam serotonina que irá interagir com

receptores específicos presentes em neurônios aferentes primários, interneurônios e

neurônios aferentes secundários, resultando no bloqueio da transmissão do estímulo

nociceptivo aos centros superiores (Figura 5) (87, 97, 78). Foi observado que a

17

estimulação elétrica do núcleo magno da rafe aumenta a liberação de 5-HT no corno

dorsal da medula promovendo analgesia, podendo este efeito ser bloqueado pelo

pré-tratamento com PCPA (80, 98, 99, 100). No entanto, a 5-HT pode produzir

efeitos antinociceptivos e pró-nociceptivos, dependendo do receptor em que atua,

sendo identificados atualmente mais de 15 subtipos de receptores para 5-HT (97).

Figura 5. Modulação da dor em nível espinal pelas fibras serotoninérgicas. Fibras serotoninérgicas

originadas no núcleo magno da rafe se projetam até o corno dorsal da medula espinal onde liberam

5-HT que ativa receptores 5-HT3 presentes em interneurônios inibitório, os quais ao serem

estimulados, liberam GABA e encefalinas que ativam receptores GABAérgicos e opióides presentes

em fibras aferentes secundárias, causando hiperpolarização nas mesmas e consequentemente

impedindo a transmissão do estímulo nociceptivo aos centros supra-espinais. A serotonina pode se

ligar também em receptores 5-HT1B/1D e 5-HT1A , presentes em fibras aferentes primárias e

secundárias, respectivamente, contribuindo para a inibição da transmissão do estímulo nociceptivo

(78)

A ação moduladora de fibras noradrenérgicas também tem contribuído

bastante para o controle intrínseco da dor. O locus coeruleus, localizado no tronco

encefálico especificamente na ponte, é o maior grupo de neurônios noradrenérgicos

existentes no cérebro. Estes neurônios são capazes de influenciar no

comportamento relacionado com a dor a partir de conexões realizadas com várias

outras regiões do sistema nervoso central (101, 102).

18

Foi mostrado que a estimulação elétrica da PAG ou RVM pode promover

antinocicepção correlacionado ao aumento dos níveis de noradrenalina no líquido

cefalorraquidiano, sendo este efeito bloqueado por antagonistas adrenérgicos (87,

88, 103, 104, 105). Ambas as regiões enviam projeções para o locus coeruleus que

por sua vez envia fibras noradrenérgicas diretamente para o corno dorsal da medula

espinal liberando noradrenalina que irá interagir especificamente com receptores α2A

α2B/2C presentes em neurônios secundários e primários, respectivamente, e em

receptores α1A presentes em interneurônios inibitórios, inibindo a transmissão

nociceptiva de neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos, bem como inibindo a

liberação de neurotransmissores excitatórios (Figura 6) (104, 106, 107, 108, 109,

78). Vários estudos tem mostrado que a ativação destes receptores na medula

exerce um forte efeito antinociceptivo (107, 110, 111).

Figura 6. Modulação da dor em nível espinal pelas fibras noradrénergicas. Fibras noradrenérgicas

originadas no locus coeruleus projetam-se para o corno dorsal da medula espinal liberando

noradrenalina que irá interagir especificamente com receptores adrenérgicos α1A presentes em

interneurônios inibitórios, os quais liberam GABA e endorfinas que ativam receptores GABAérgicos e

opióides presentes em neurônios secundários, causando hiperpolarização nas mesmas e

consequentemente impedindo a transmissão do estímulo nociceptivo aos centros superiores. A

noradrenalina pode também se ligar a receptores adrenérgicos α2A α2B/2C presentes em neurônios

secundários e primários, respectivamente, inibindo a transmissão nociceptiva (78).

19

Além dos receptores α 2-adrenérgicos, foi demonstrada uma elevada

densidade de receptores muscarínicos no corno dorsal da medula espinal, os quais

também podem contribuir para a modulação da transmissão nociceptiva. Foi

observado que o bloqueio destes receptores com atropina promove diminuição do

limiar nociceptivo em ratos (95, 112, 113) e que a administração intratecal de

agonistas muscarínicos ou inibidores da enzima acetilcolinesterase produz um

potente efeito analgésico em camundongos, ratos e seres humanos (112, 114, 115,

116, 117). Estes receptores também podem mediar efeitos antinociceptivos de

opióides (118) e de agonista α 2-adrenérgico (119) favorecendo assim a via

descendente inibitória da dor (95).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2965406/#R200



20

Justificativa

21

2. Justificativa

Dentre as diferentes formas de controle da dor e também da inflamação

temos o uso de medicamentos incluindo analgésicos opióides e não-opióides, anti-

inflamatórios não esteroidais (AINE) e analgésicos adjuvantes como, por exemplo,

antidepressivos, anticonvulsivantes e anestésicos (120).

Os analgésicos opióides são medicamentos psicoativos prescritos para o

alívio da dor e cuidados paliativos, os quais exercem seus efeitos por meio da

interação com diferentes tipos de receptores, sendo os princípais μ, κ e δ que estão

presentes no hipotálamo, substância cinzenta periaquedutal, corno dorsal da medula

e nos nervos aferentes periféricos. Como se sabe, o uso de opióides gera uma

grande variedade de efeitos colaterais, incluindo sedação, tolerância a drogas,

dependência física e psíquica, entre outros, sendo necessárias medidas de controle

referente à prescrições para evitar o mau uso e dependência (120, 121, 122). Já os

AINEs são constantemente utilizados por apresentarem efeitos anti-inflamatórios,

antitérmicos e analgésicos, porém possuem seu uso limitado por apresentarem

efeitos colaterais no trato gastrointestinal, juntamente com a inibição da agregação

de plaquetas e a toxicidade renal (120, 123).

A busca por novos agentes analgésicos e/ou anti-inflamatórios que causem o

mínimo possível de efeitos colaterais tornou-se um grande desafio para os

pesquisadores desta área, visto que a dor pode influenciar fortemente no estilo de

vida de milhões de pessoas que sofrem com dores persistentes, levando à

ocorrência de sérias consequências negativas como a falta de apetite, padrões

anormais de sono e comprometimento das atividades diárias. Além disto, as terapias

atualmente disponíveis para o tratamento da dor e de doenças inflamatórias nem

sempre são eficazes e apresentam diversos efeitos secundários, que muitas vezes

limitam o tratamento (124).

Nesse contexto, os compostos piperazínicos surgem como candidatos

atrativos para desenvolvimento de novos analgésicos e anti-inflamatórios, uma vez

que, constituem uma importante classe de compostos químicos com um largo

espectro de atividades biológicas como, por exemplo, atividade anti-infecciosa, anti-

cancerígena e antinociceptiva (125). Pesquisas relatam que alguns derivados

piperazínicos possuem capacidade de atuarem em receptores histaminérgicos e

22

serotoninérgicos e por isso podem desempenhar importante papel no controle da dor

e da inflamação (115, 126).

LQFM-008 é um derivado piperazínico originalmente desenhado a partir da

clozapina através da estratégia de simplificação molecular. Segundo estudos

realizados por BRITO et al., 2012, o derivado piperazínico LQFM-008 além de

apresentar alguns efeitos neurotóxicos em doses superiores a 600 µmol/kg,

demonstrou ter atividade do tipo ansiolítica associada à participação de receptores

serotoninérgicos 5-HT1A (127). Outros estudos envolvendo este mesmo composto

revelaram que o mesmo também possui propriedade hipotensiva, anti-hipertensiva e

vasorrelaxante envolvendo vias serotoninérgicas, colinérgicas e do óxido nítrico

(128).

Com base nestes resultados e visando complementar os dados sobre o

composto LQFM-008, buscamos neste estudo avaliar as possíveis atividades anti-

inflamatórias e antinociceptiva do mesmo, bem como a elucidação dos seus

mecaninos de ação, a fim de contribuir para o futuro desenvolvimento de novos

fármacos mais eficazes, seguros e com menores riscos de efeitos adversos.

23

Objetivos

24

3. Objetivos

3.1. Objetivos gerais

O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos anti-inflamatório e

antinociceptivo de LQFM-008 (etil 4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil) piperazina-1-

carboxilato), a partir de testes agudos de nocicepção e inflamação, buscando

caracterizar quais os mecanismos de ação estariam envolvidos em tais efeitos.

3.2. Objetivos específicos

Investigar o efeito antinociceptivo de LQFM-008 por meio de modelos agudos

de nocicepção: dor induzida pela formalina; dor induzida por estímulo térmico:

flexão de cauda e placa quente;

Investigar a atividade anti-inflamatória de LQFM-008 nos testes de edema de

pata induzido por carragenina e pleurisia induzida por carragenina;

Investigar a participação do sistema opíoide nos mecanismos de ação

envolvidos no efeito antinociceptivo de LQFM-008;

Investigar a participação do sistema serotoninérgico nos mecanismos de ação

envolvidos no efeito antinociceptivo de LQFM-008.

25

Materiais e métodos

26

4. Materiais e métodos

4.1 Síntese do LQFM-008

O composto etil 4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil) piperazina-1-carboxilato

(LQFM-008) como peso molecular de 314,17 foi sintetizado no Laboratório de

Química Farmacêutica Medicinal (LQFM) na Faculdade de Farmácia (FF) da

Universidade Federal de Goiás (UFG) sob a orientação do Prof. Dr. Ricado

Menegatti, segundo a rota sintética descrita por BRITO et al., 2012 (127).

Figura 7. Estrutura do composto LQFM-008: etil 4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil) piperazina-1-

carboxilato.

4.2 Animais

Foram utilizados camundongos albinos Swiss machos adultos pesando entre

25 e 35 g e com idade entre 9 e 12 semanas, fornecidos pelo biotério central da

UFG e mantidos em condições controladas de temperatura e iluminação (ciclo

claro/escuro normal de 12 h), ração e água ad libitum. O manuseio dos animais em

todos os modelos experimentais foi executado de acordo com os protocolos

experimentais aprovados pelo comitê de Ética em pesquisa da CEUA/UFG, sob n°

047/14.

4.3 Fármacos e reagentes

Os reagentes e fármacos usados foram: Carragenina (Sigma Chemical, EUA);

Dimorf® (Cristália-Ltda, Brasil); Formaldeído (Synth, Brasil); Indometacina (Sigma

Chemical, EUA); Naloxona (Sigma, St. Louis, USA); NAN-190, Hidrobrometo de 1-(2-

metoxifenil)-4-[4-(2-phthalimido)-butil]-piperazina (Sigma Chemical, EUA); PCPA, p-

27

clorofenilalanina (Sigma-Aldrich, Brasil);LQFM008, sintetizada no laboratório de

Química Farmacêutica Medicinal da Faculdade de Farmácia –UFG. LQFM-008 foi

dissolvido e solubilizado em 2% de Tween-80 em água destilada, já o PCPA foi

dissolvido e solubilizado em 2% de Tween-80 em solução salina. Todos os outros

fármacos foram solubilizados em solução salina 0,9%, com exceção da morfina e da

indometacina, as quais foram solubilizadas apenas em água destilada.

4.4 Métodos farmacológicos usados para avaliar o composto LQFM-008

4.4.1 Avaliação da atividade antinociceptiva

4.4.1.1 Teste da dor Induzida por Formalina

Foram utilizados grupos experimentais de camundongos (n = 8) tratados pela via

oral com veículo (10 mL/kg), LQFM-008 (24, 48 e 96 µmol/kg), indometacina (28

µmol/kg), ou pela via subcutânea com morfina (17,5 µmol/kg). Uma hora após os

tratamentos por v.o. ou 30 minutos após o tratamento pela via s.c, foram injetados

20 μL de formalina 3% v/v (formaldeído 1,2% v/v) na pata posterior direita dos

animais. Após a injeção do agente flogístico os animais foram observados

individualmente durante 30 minutos em caixa de acrílico com fundo especular para

auxiliar a visualização e foi cronometrado o tempo em que os mesmos lambiam ou

mordiam a pata lesionada, permitindo avaliar dois tipos de dor, a de origem

neurogênica que ocorre durante os primeiros 5 minutos devido à estimulação direta

nas terminações nociceptivas, e a de origem inflamatória que ocorre no período de

15 a 30 minutos, sendo produzida pela liberação de mediadores inflamatórios (129).

4.4.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória

4.4.2.1 Edema de pata induzido por carragenina

Inicialmente os grupos de camundongos (n=8) foram tratados com veículo 10

mL/kg v.o, ou LQFM-008 (24, 48 e 96 µmol/kg), ou indometacina 28 µmol/kg v.o.

Uma hora após o tratamento foi injetado 50 µL de carragenina (1%) intraplantar na

28

pata posterior direita. A pata posterior esquerda (contra lateral) foi utilizada como

controle, e recebeu uma injeção contendo o mesmo volume (50 µL) de solução

salina (NaCl 0,9 %). O volume basal de ambas as patas foi medido com o uso do

aparelho Pletismômetro e após a injeção de carragenina o edema foi avaliado nos

intervalos de tempo de 1, 2, 3 e 4 horas. A formação do edema foi avaliada pela

diferença de volume entre as patas (130).

4.4.2.2 Pleurisia induzida por carragenina

Os grupos de camundongos (n=8) receberam pelo plexo orbital, 200 μL da uma

solução de azul de Evans a 2,5% duas horas antes dos tratamentos via oral com

veículo (10 mL/kg), LQFM-008 (96 µmol/kg) ou dexametasona (5 µmol/kg). 60

minutos após os tratamentos os animais receberam uma injeção de 100μL de

carragenina 1% na cavidade pleural a fim de promover a formação processo

inflamatório ou 100μL de salina 0,9% como controle do teste. Quatro horas após a

indução do processo inflamatório foi feita a coleta do exsudato pleural e uma

alíquota foi usada para fazer a contagem do número de leucócitos totais e outra

alíquota foi utilizada para a determinação da concentração do azul de Evans (131).

4.4.3 Testes para avaliar o efeito antinociceptivo central

4.4.3.1 Teste da flexão de cauda

Os grupos de animais (n= 8) foram tratados pela via oral com veículo (10

mL/kg), LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg ou pela via subcutânea com

morfina (17,5 µmol/kg). O terço distal da cauda dos animais foi exposto a uma fonte

de calor como estímulo nociceptivo, utilizando um analgesímetro térmico (Modelo

Tail Flick EFF300L Insight®). O tempo até a retirada da cauda, também chamado

de período de latência, foi utilizado como índice de nocicepção. O tempo máximo

permitido de exposição ao estímulo foi de 20 s. As latências foram medidas em

segundos nos tempos: -30, 0, 30, 60, 90, 120 e 150 minutos dos tratamentos (132).

29

4.4.3.2 Teste da placa quente

Foram utilizados grupos experimentais de camundongos (n = 8) tratados com

veículo (10 mL/kg), LQFM-008 48 e 96 µmol/kg v.o. ou morfina (17,5 µmol/kg s.c.),

os quais foram colocados sobre a superfície de uma placa de metal previamente

aquecida a 55,5 + 0,5ºC. Foi cronometrado o tempo em segundos que o animal

levou para lamber, abanar ou levantar uma das patas traseiras, sendo este

comportamento nociceptivo considerado como indicativo da latência a dor (133). O

tempo máximo permitido de permanência dos animais na placa quente foi de 20

segundos, para não causar danos teciduais aos mesmos. O tempo para a

reatividade a dor foi medido em segundos nos tempos -30, 0, 30, 60, 90, 120, 150 e

180 dos tratamentos.

4.4.4 Testes para avaliação dos mecanismos de ação envolvidos na atividade

antinociceptiva de LQFM-008

4.4.4.1 Avaliação do envolvimento dos receptores opióides no efeito de LQFM-

008

Com o objetivo de verificar a participação do sistema opióide no efeito

analgésico da LQFM-008, foi utilizando o teste da dor induzida pela formalina. Os

grupos foram pré-tratados, pela via subcutânea, com salina 10 mL/kg ou com

naloxona 7,5 µmol/kg (antagonista opióide) e foram subdivididos em grupos (n=8)

que receberam os seguintes tratamentos, após 15 min., veículo 10 mL/kg (v.o.),

LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.) ou Morfina 17,5 µmol/kg (s.c.), tabela 1. Sessenta

minutos depois do tratamento oral ou trinta minutos após o tratamento subcutâneo,

os animais receberam formalina (3%, v/v) na pata direita e foram observadas,

conforme descrito no item 4.4.1.1.

30

Tabela 1. Grupos experimentais e tratamentos utilizados no estudo do envolvimento

dos receptores opióides.

Grupos Experimentais (n=8) Pré-tratamento (s.c.) Tratamentos

Sal + Veículo Salina 10 mL/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)

Nal + Veículo Naloxona 7,5 µmol/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)

Sal + LQFM-008 Salina 10 mL/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)

Nal + LQFM-008 Naloxona 7,5 µmol/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)

Sal + Morfina Salina 10 mL/kg Morfina 17,5 µmol/kg (s.c.)

Nal + Morfina Naloxona 7,5 µmol/kg Morfina 17,5 µmol/kg (s.c.)

4.4.4.2 Avaliação do envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no efeito do

LQFM-008

Com o objetivo de avaliar a possível participação dos receptores 5HT1A no

efeito antinociceptivo de LQFM-008, foi feito o teste da dor induzida pela formalina

utilizando NAN-190, antagonista 5HT1A. Os grupos foram pré-tratados, pela via

intraperitoneal, com salina 10 mL/kg ou com NAN-190 1,3 µmol/kg e foram

subdivididos em grupos (n=8) que receberam os seguintes tratamentos, após 15

min., veículo 10 mL/kg (v.o.) ou LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.). Tabela 2. Sessenta

minutos depois do tratamento oral os animais receberam formalina (3%, v/v) na pata

direita e foram observadas, conforme descrito no item 4.4.1.1.


dos receptores 5HT1A.

Grupos Experimentais (n=8) Pré-tratamento (i.p.) Tratamentos


NAN + Veículo NAN-190 1,3 µmol/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)


NAN + LQFM-008 NAN-190 1,3 µmol/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)

31

4.4.4.3 Avaliação do envolvimento da serotonina endógena no efeito do LQFM-

008

Para pesquisar uma possível ação indireta de LQFM-008 sobre os receptores

serotoninérgicos os animais foram pré-tratados, pela via intraperitoneal, com salina

10 mL/kg ou com PCPA 500 µmol/kg, uma vez por dia, durante 4 dias consecutivos.

Em seguida, 1h após a ultima injeção de PCPA ou Salina, os animais foram tratados

com veículo 10 mL/kg (v.o.) ou LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.). e, sessenta minutos

após este tratamento, foram submetidos ao teste da formalina, conforme descrito no

item 4.4.1.1. Tabela 3.


da setoronina endógena

Grupos Experimentais (n=8) Pré-tratamento (i.p.) Tratamentos


PCPA + Veículo PCPA 500 µmol/kg Veículo 10 mL/kg (v.o.)


PCPA + LQFM-008 PCPA 500 µmol/kg LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.)

4.4.5 Análise estatística

Os dados foram analisados como médias ± erro padrão das médias. As

diferenças entre dois grupos foram detectadas pelo teste t de Student e entre três ou

mais grupos pela análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de

Newman-keuls ou ANOVA de duas vias seguida do pós teste Bonferroni. As

diferenças foram consideradas significativas quando p ≤ 0,05 (134). A análise

estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism 5.0®.

32

Resultados

33

5. Resultados

5.1 Efeito antinociceptivo de LQFM-008

5.1.1 Efeito do LQFM-008 no teste da dor Induzida pela Formalina

Na primeira fase do teste de dor induzida pela formalina (0-5 min.) os

tratamentos com LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg ou morfina (17,6

µmol/kg) reduziram significativamente o tempo de reatividade à dor em 16, 34 e

90%, respectivamente, quando comparados com o grupo controle, tratado com

veículo 10 mL/kg. Na segunda fase (15-30 min.), os tratamentos com LQFM-008 nas

doses de 48 e 96 µmol/kg reduziram o tempo de reatividade à dor em 26 e 40%,

respectivamente, e conforme esperado, os controles positivos indometacina (28

µmol/kg) e morfina também reduziram o tempo de reatividade a dor em 40 e 96%,

respectivamente, em relação ao grupo controle (veículo 10 mL/kg), (Figura 8). A

partir deste teste foi possível estabelecer uma ID50 para LQFM-008 que foi de 44,19

mg/kg na primeira fase do teste e 37,21 mg/kg na segunda fase.

1ª Fase

0

20

40

60

80

100

*

***

***

Tem

po

de r

eati

vid

ad

e (

s)

2ª Fase

0

50

100

150

200

250Veículo 10 mL/kg v.o.

LQFM-008 24 µmol/kg v.o.



Indometacina 28 µmol/kg v.o.

Morfine 17,5 µmol/kg s.c.

******

***

***

* p 0,05

*** p 0,001

Tem

po

de r

eati

vid

ad

e (

s)

Figura 8. Efeito do LQFM-008, no teste da dor induzida por formalina, primeira fase (0-5 min) e

segunda fase (15-30 min.). As barras verticais representam as médias ± erro padrão das médias, do

tempo de reatividade a dor dos animais expresso em segundos (n=8). Indometacina e morfina foram

utilizadas como controles positivos. * p ≤ 0,05 *** p ≤ 0,001 indicam os níveis de significância das

diferenças entre os grupos tratados e o grupo controle (tratado com veículo) na primeira fase e na

segunda fase, segundo análise de variância seguido do pós-teste Newman-Keuls.

34

5.2 Efeito anti-inflamatório de LQFM-008

5.2.1 Efeito do LQFM-008 no teste do edema de pata induzido por carragenina

No edema de pata induzido por carragenina, os tratamentos com LQFM-008

nas doses de 24, 48 e 96 µmol/kg (v.o.) ou indometacina 28 µmol/kg (v.o.) reduziram

o edema na 1° hora em 14, 29, 26, e 35%, respectivamente. A partir da 2° hora em

diante apenas os tratamentos com LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg (v.o.)

ou indomentacina 28 µmol/kg (v.o.) foram capazes de reduzir significamente o

edema. Sendo assim, na 2ª hora foi observada uma redução de 28, 26 e 44 %,

respectivamente. Já na 3ª hora a redução do edema foi de 35, 29, e 53 %,

respectivamente, e por fim, na 4ª foi observada uma redução de 31, 28 e 52 %,

respectivamente. (Figura 9).

0 1 2 3 40

30

60

90

120

150

180Veículo 10 mL/kg v.o.




Indometacina 28 µmol/kg v.o.******

***

*** ****** ***

*

* p < 0.05*** p < 0.001

Tempo (Horas)

Dif

ere

nça e

ntr

e a

s p

ata

s (

µL

)

Figura 9. Efeito do LQFM-008 no edema de pata induzida por carragenina. Os símbolos e barras

verticais indicam média ± erro padrão das médias das diferenças de volume (µL) entre as patas em

diferentes tempos após a aplicação da carragenina na pata direita e salina na esquerda. Os grupos

de animais (n=8) foram tratados com veículo 10 mL/kg ou LQFM008 (24; 48 e 96 µmol/kg) ou

indometacina 10 mg/kg. * p ≤ 0,05 e *** p ≤ 0,001. Indicam o nível de significância das diferenças

entre os grupos tratados e o controle, segundo análise de variância de duas vias seguida do pós-teste

de Bonferroni.

35

5.2.2 Efeito do LQFM-008 no teste da pleurisia induzida por carragenina

No teste da pleurisia induzida por carragenina, os tratamentos com LQFM-008

96 µmol/kg ou dexametasona 5 µmol/kg foram capazes de reduzir significamente a

migração celular em 26 e 58% respectivamente, quando comparado ao grupo

controle (7,790 ± 0,1991 Leucócitos x 106/mL) (Figura 10). Estes mesmos

tratamentos também reduziram significamente a exsudação proteica em 24 e 44%

em relação ao grupo controle (3,417 ± 0,2306 µg/mL - Concentração do Azul de

Evans) (Figura 11).

0

2

4

6

8

_______

Veículo

10 mL/kg

_______

Veículo

10 mL/kg

_______

LQFM-008

96 µmol/kg

_______

Dex

5 µmol/kg

______ _________________Salina Carragenina 1%

Leu

có

cit

os x

10

6/m

L

***

***

#

*** p 0,001

# p 0,05

Figura 10. Efeito do LQFM-008 na migração celular. As barras verticais representam as médias

± erro padrão das médias, do número de leucócitos (leucócitos x 106/mL) na pleurisia induzida

por carragenina (n=8). Dexametasona foi utilizada como controle positivo. *** p ≤ 0,001 indica o

nível de significância da diferença entre os grupos tratados com LQFM-008 ou Dexamentasona

e o grupo controle (tratado com veículo) e # p ≤ 0,05 indica o nível de significância da diferença

entre o grupo tratado com salina e o grupo controle, segundo análise de variância seguido do

pós-teste Newman-Keuls.

36

0

1

2

3

4

***

#

_______

Veículo

10 mL/kg

_______

Veículo

10 mL/kg

_______

LQFM-008

96 µmol/kg

_______

Dex

5 µmol/kg

______ _________________Salina Carragenina 1%

**

** p 0,01

*** p 0,001

# p 0,05[A

zu

l d

e E

van

s]

(µg

/mL

)

Figura 11. Efeito do LQFM-008 na exsudação de proteínas. As barras verticais representam as

médias ± erro padrão das médias, da concentração de corante azul de Evans na pleurisia induzida

por carragenina (n=8). Dexametasona foi utilizada como controle positivo. ** p ≤ 0,05 e *** p ≤ 0,001

indicam o nível de significância das diferenças entre os grupos tratados com LQFM008 ou

Dexamentasona e o grupo controle (tratado com veículo) e # p ≤ 0,05 indica o nível de significância

da diferença entre o grupo tratado com salina e o grupo controle, segundo análise de variância

seguido do pós-teste Newman-Keuls.

5.3 Efeito de LQFM-008 nos testes para avaliação da atividade antinociceptiva

central

5.3.1 Efeito do LQFM-008 no teste de flexão de cauda

Os tratamentos via oral com ambas as doses de LQFM-008, 48 e 96 µmol/kg,

foram capazes de aumentar a latência ao estímulo térmico. LQFM-008 na dose de

48 µmol/kg demonstrou ter uma significativa atividade antinociceptiva nos tempos de

60 e 90 minutos, onde foi capaz de aumentar o tempo de latência ao estímulo

térmico em 77 e 94%, respectivamente. A dose de 96 µmol/kg de LQFM-008

também foi capaz de aumentar significamente a latência ao estímulo térmico nos

tempos de 30, 60 e 90 minutos, em 82, 116 e 92%, respectivamente. Como

esperado, o tratamento com o controle positivo do teste, morfina 17,5 µmol/kg (s.c.),

aumentou a latência ao estímulo térmico de 30 a 180 minutos do tratamento em 82;

37

236, 235, 237, 127 e 69%, respectivamente, em relação ao grupo controle (veículo

10 mL/kg) (Figura 12).

-30 0 30 60 90 120 150 1800

3

6

9

12

15

18 Veículo 10 mL/kg v.o.



******

***

***

***

***

***

***

*** p 0,001

Morfina 17,5 µmol/kg s.c.

***

Tempo (min)

Latê

ncia

(s)

Figura 12. Efeito do LQFM-008 sobre a latência ao estímulo térmico no teste de flexão de cauda. Nas

ordenadas estão representados os tempos de latência ao estímulo térmico expressos em segundos.

Os símbolos indicam as médias ± erro padrão das médias dos tempos para reação dos animais (n=8)

ao estímulo térmico nos diferentes tempos do tratamento. ***p ≤ 0,001 indica o nível de significância

das diferenças entre os grupos tratados e o veículo, segundo análise de variância de duas vias

seguida do pós-teste Bonferroni.

5.3.2 Efeito do LQFM-008 no teste de placa quente

No teste da placa quente os tratamentos com o LQFM-008 tanto na dose de

48 µmol/kg quanto na dose de 96 µmol/kg foram capazes de aumentar

significamente a latência ao estímulo térmico. O tratamento com LQFM-008 na dose

de 48 µmol/kg aumentou a latência ao estímulo térmico nos tempos de 60, 90, 120,

150 e 180 minutos em 61, 100, 92, 51, 55%. Já o tratamento com LQFM008 na dose

de 96 µmol/kg apresentou atividade antinociceptiva nos tempo de 30 a 180 minutos,

aumentando significamente a latência ao estímulo térmico em 63, 84, 121, 122, 95,

96%. O controle positivo morfina 17,5 µmol/kg (s.c.) também aumentou o tempo de

reatividade ao estímulo térmico de 30 a 180 minutos do tratamento em 255, 335,

354, 271, 186, 111%, respectivamente, em relação ao grupo controle (veículo 10

mL/kg) (Figura 13).

38

-30 0 30 60 90 120 150 1800

3

6

9

12

15

18

21Veículo 10mL/kg v.o.



Morfina 17,5 µmol/kg s.c.

***

*** ***

***

***

******

****** ******

****** ***

** **** ** p 0,01

*** p 0,001

Tempo (min)

Latê

ncia

(s)

Figura 13. Efeito do LQFM-008 sobre a latência ao estímulo térmico no teste da placa quente. Nas

ordenadas estão representados os tempos de latência ao estímulo térmico expressos em segundos.

Os símbolos indicam as médias ± erro padrão das médias dos tempos para reação dos animais (n=8)

ao estímulo térmico nos diferentes tempos do tratamento. ** p ≤ 0,01 e *** p ≤ 0,001 indicam os níveis

de significância das diferenças entre os grupos tratados e o controle, segundo análise de variância de

duas vias seguida do pós-teste Bonferroni.

5.4 Mecanismos de ação envolvidos na atividade antinociceptiva de LQFM-008

5.4.1 Envolvimento dos receptores opióides no efeito de LQFM-008

O pré-tratamento dos animais com naloxona 7,5 µmol/kg (antagonista dos

receptores opióides) reverteu completamente o efeito antinoceptivo de LQFM-008 96

µmol/kg (v.o.) e da morfina 17,5 µmol/kg (s.c.) na primeira fase do teste da

formalina. Já na segunda fase, a naloxona não foi capaz de reverter o efeito de

39

LQFM-008, porém reverteu completamente o efeito da morfina (Figura 14).

1ª Fase

0

20

40

60

80

100

Sal Nal Sal Nal Sal Nal___________

Veículo

10 mL/kg v.o.

__________

LQFM-008

96 µmol/kg v.o.

__________

Morfina

17,5 µmol/kg s.c.

***

***

# # #

# # #

*** p 0,001

# # # p 0,001

Tem

po

de r

eati

vid

ad

e (

s)

0

50

100

150

200

250

2ª Fase

Sal Nal Sal NalSal Nal___________

Veículo

10 mL/kg v.o.

__________

LQFM-008

96 µmol/kg v.o.

__________

Morfina

17,5 µmol/kg s .c.

***

***

# # #

***

*** p 0,001

# # # p 0,001

Tem

po

de r

eati

vid

ad

e (

s)

Figura 14. Envolvimento da via opióide no efeito do LQFM-008 no teste da dor induzida pela

formalina. Primeira fase (0-5 min) e segunda fase (15-30 min) da aplicação da formalina. As barras

verticais representam as médias ± erro padrão das médias, do tempo de reatividade a dor dos

animais expresso em segundos. Os grupos de animais (n=8) foram pré-tratados com salina ou

naloxona e tratados com veículo 10 mL/kg ou LQFM-008 96 µmol/kg. *** p ≤ 0,001 indicam o nível de

significância das diferenças em relação ao grupo salina + veículo, na primeira e segunda fase, e # #

# p ≤ 0,001 em relação ao pré-tratamento anterior, segundo análise de variância seguido do pós-teste

Newman-Keuls.

40

5.4.2 Envolvimento do receptor serotoninérgico 5HT1A no efeito de LQFM-008

O pré-tratamento dos animais com NAN-190 1,3 µmol/kg foi capaz de reverter

completamente o efeito antinoceptivo da LQFM-008 96 µmol/kg (v.o.) na primeira

fase e parcialmente na segunda fase do teste da formalina. (Figura 15).

1ª Fase

0

20

40

60

80

Salina NAN

10 mL/kg 1,3 µmol/kg_________________

Veículo

10 mL/kg v.o.

_________________

LQFM

96 µmol/kg v.o.

***

# # #

*** p 0,001

# # # p 0,001

Salina NAN

10 mL/kg 1,3 µmol/kg

Tem

po

de r

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e (

s)

2ª Fase

0

50

100

150

200

250

_________________

Veículo

10 mL/kg v.o.

Salina NAN

10 mL/kg 1,3 µmol/kg_________________

LQFM

96 µmol/kg v.o.

***

# #

*** p 0,001

# # p 0,01

Salina NAN

10 mL/kg 1,3 µmol/kg

Tem

po

de r

eati

vid

ad

e (

s)

Figura 15. Envolvimento da via serotoninérgica no efeito do LQFM-008 no teste da dor induzida pela

formalina. Primeira fase (0-5 min) e segunda fase (15-30 min) da aplicação da formalina. As barras

verticais representam as médias ± erro padrão das médias, do tempo de reatividade a dor dos

animais expresso em segundos.Os grupos de animais (n=8) foram pré-tratados com salina ou NAN-

190 e tratados com veículo 10 mL/kg ou LQFM-008 96 µmol/kg. *** p ≤ 0,001 indicam o nível de


# p ≤ 0,001 em relação ao pré-tratamento anterior, segundo análise de variância seguido do pós-teste

Newman-Keuls.

41

5.4.3 Envolvimento da serotonina endógena no efeito de LQFM-008

O pré-tratamento dos animais com PCPA 500 µmol/kg durante quatro dias foi

capaz de reverter completamente o efeito antinoceptivo da LQFM-008 96 µmol/kg

(v.o.) na primeira fase e parcialmente na segunda fase do teste da formalina. (Figura

16)

1ª Fase

0

20

40

60

80

100

Salina PCPA

10 mL/kg 500 µmol/kg Salina PCPA

10 mL/kg 500 µmol/kg_________________

Veículo

10 mL/kg v.o.

_________________

LQFM-008

96 µmol/kg v.o.

*** p 0,001

# # # p 0,001

***

# # #

Tem

po

de r

eati

vid

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e (

s)

2ª Fase

0

50

100

150

200

250

_________________

Veículo

10 mL/kg v.o.

_________________

LQFM-008

96 µmol/kg v.o.

Salina PCPA

10 mL/kg 500 µmol/kg

Salina PCPA

10 mL/kg 500 µmol/kg

*** *** p 0,001

# # p 0,01

# #

Tem

po

de r

eati

vid

ad

e (

s)

Figura 16. Envolvimento da serotonina endógena no efeito do LQFM-008 no teste da dor induzida

pela formalina. Primeira fase (0-5 min) e segunda fase (15-30 min) da aplicação da formalina. As

barras verticais representam as médias ± erro padrão das médias, do tempo de reatividade a dor dos

animais expresso em segundos. Os grupos de animais (n=8) foram pré-tratados com salina ou PCPA

e tratados com veículo 10 mL/kg ou LQFM-008 96 µmol/kg. *** p ≤ 0,001 indicam o nível de


p ≤ 0,01; # # # p ≤ 0,001 em relação ao pré-tratamento anterior, segundo análise de variância

seguido do pós-teste Newman-Keuls.

42

Discussão

43

6. Discussão

A crescente busca e necessidade por substâncias inovadoras para obtenção

de tratamentos eficazes, seguros e com menos efeitos colaterais contribuiu de forma

significativa para a sofisticação da química farmacêutica medicinal, ciência que visa

o planejamento e desenvolvimento de novos fármacos a partir da descoberta,

inovação, síntese, modificação molecular, extração, identificação e isolamento de

substâncias bioativas, bem como suas respectivas relações entre estrutura química

e atividades biológicas (135).

A química medicinal dispõe de diversos métodos eficientes para otimização

de parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos de diversos compostos. A

descoberta de novos fármacos a partir da modificação estrutural de compostos

conhecidos leva à identificação de novos compostos-protótipos que atuam pelo

mesmo mecanismo farmacológico do composto original. Esta estratégia é

largamente empregada na indústria farmacêutica que pesquisa novos fármacos a

partir da síntese de compostos cada vez mais ativos, com biodisponibilidade

satisfatória, baixa toxicidade e com poucos efeitos colaterais (135, 136).

Levando em conta estes princípios, foi desenvolvido o composto LQFM-008,

um derivado piperazínico originalmente desenhado a partir da clozapina através da

estratégia de simplificações moleculares. O primeiro estudo feito com este composto

em relação aos seus possíveis efeitos farmacológicos foi realizado por BRITO et al.,

2012 (127), onde foi observada uma atividade do tipo ansiolítica envolvendo a via

serotoninérgica. Além disto, foi realizado um estudo para avaliação geral da

atividade farmacológica de LQFM-008, mostrando que efeitos neurotóxicos são

observados somente com doses superiores a 600 µmol/kg. Outra pesquisa

envolvendo este mesmo composto revelou que o mesmo também possui

propriedades hipotensiva, anti-hipertensiva e vasorrelaxante, envolvendo vias

serotoninérgicas, colinérgicas e do óxido nítrico (128).

Os derivados piperazínicos representam uma importante classe de compostos

químicos com unidades estruturais privilegiadas favorecendo um amplo espectro de

atividades biológicas e presentes em fármacos de diferentes classes terapêuticas

como, por exemplo, antipsicóticos, antidepressivos, anti-histamínicos, entre outras.

Alguns estudos mostraram que derivados piperazínicos também apresentam

atividades anti-cancerígenas (137), anti-infecciosa (138) e antinociceptiva (125, 139).

44

Com o objetivo de avaliar uma possível atividade antinociceptiva e/ou anti-

inflamatória do composto LQFM-008, o primeiro teste empregado foi o teste da dor

induzida pela formalina. Este teste possui duas fases distintas que permitem avaliar

dois tipos de dor: a dor neurogênica que corresponde à primeira fase do teste e

ocorre nos 5 primeiros minutos após a aplicação da formalina, bem como a dor

inflamatória que corresponde à segunda fase do teste e ocorre entre 15-30 minutos

após a injeção de formalina. A dor neurogênica observada neste teste acontece

devido à estimulação química direta dos nociceptores pela formalina além da

participação de mediadores periféricos pré-formados. Já a dor inflamatória está

relacionada com o envolvimento de vários mediadores pró-inflamatórios como

histamina, bradicinina, serotonina, prostaglandinas, taquicininas e glutamato

responsáveis pela estimulação de nociceptores (130, 140, 141, 142, 143).

Os resultados obtidos no presente estudo mostraram que o tratamento dos

animais com o composto LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg reduziu o tempo

de reatividade à dor em ambas as fases, sendo que, com a maior dose testada

houve uma redução de 34% na primeira fase e de 40% na segunda fase. Ademais,

com a menor dose (24 µmol/kg) não foi visto efeito em nenhuma das fases. Com

estes resultados, foi possível observar uma ação sugestiva de atividade

antinociceptiva central do LQFM-008 devido à redução da dor nas duas fases do

teste, não sendo possível diferenciar este efeito de uma atividade anti-inflamatória

que é determinada quando há redução significativa apenas na segunda fase do

teste, fazendo-se necessário avaliar o composto em modelos mais específicos de

dor e inflamação.

Para investigação de uma possível atividade anti-inflamatória do composto

LQFM-008 foi realizado o teste de edema de pata induzido por carragenina, o qual

permite avaliar a ação de fármacos com propriedades anti-inflamatórias sobre a

formação do edema, bem como sobre o aparecimento de outros parâmetros

envolvidos no processo inflamatório, uma vez que sinais cardinais da inflamação

como o edema, hiperalgesia e vermelhidão são observados imediatamente após a

injeção subcutânea de carragenina, resultantes da ação de agentes pró-

inflamatórios como bradicinina, histamina, taquicininas e espécies reativas de

oxigênio (144).

Durante a formação do edema ocorrem vários eventos sobre a

microcirculação, começando com uma leve vasoconstrição, seguida de dilatação,

45

aumento do fluxo local e da permeabilidade vascular que leva ao extravasamento de

líquidos e proteínas para o interstício (145, 146). A injeção sub-plantar de

carragenina na pata dos animais provoca um processo inflamatório agudo, não

imune, onde há a formação do edema que é constituído de três fases. Na primeira

hora, logo após a injeção da carragenina, há aumento da permeabilidade vascular

mediada principalmente por histamina e serotonina. Na segunda hora, o aumento da

permeabilidade é ocasionado predominantemente por cininas e na terceira hora pela

ação das prostaglandinas (144, 147, 148, 149).

Os resultados mostram que o tratamento dos animais com LQFM-008 na

dose de 24 µmol/kg no teste do edema de pata induzido por carragenina, reduziu a

formação do edema apenas na primeira hora, porém, com as doses de 48 e 96

µmol/kg houve redução do edema em todas as horas do teste, mostrando assim,

que este composto possui atividade anti-edematogênica semelhante ao controle

positivo indometacina, e um provável efeito anti-inflamatório que pode estar

contribuindo para o efeito antinociceptivo visto na segunda fase do teste da

formalina.

Outro teste realizado para confirmar o efeito anti-inflamatório do LQFM-008 foi

o da pleurisia induzida por carragenina. Este modelo caracteriza-se pelo acúmulo de

exsudato na cavidade pleural além do influxo rápido de células polimorfonucleares,

seguido de infiltração de células mononucleares. A pleurisia induzida por

carragenina é um modelo de inflamação aguda usualmente utilizado para se avaliar

os efeitos anti-inflamatórios de novos compostos candidatos a fármacos, bem como

a importância de mediadores inflamatórios (131, 150, 151). Partindo do princípio que

em um processo inflamatório agudo ocorre aumento da permeabilidade vascular e

consequentemente extravasamento de líquidos e proteínas para o interstício, foi feita

uma adaptação no teste da pleurisia induzida por carragenina com o objetivo de

quantificar o volume da exsudação proteica para a cavidade pleural utilizando o

corante Azul de Evans, o qual possui a capacidade de se ligar a proteínas

plasmáticas. Este corante é bastante utilizado em diversos estudos experimentais de

processos inflamatórios induzidos em animais a fim de se determinar as respostas

vasculares frente a diferentes agentes farmacológicos, ressaltando a vantagem

sobre outros marcadores protéicos por não ser tóxico, ter alta solubilidade em água

e ser mensurável através da espectrofotometria (146, 152, 153).

46

O tratamento com LQFM-008 na dose de 96 µmol/kg no teste da pleurisia

induzida por carragenina utilizando Azul de Evans reduziu a migração celular e a

exsudação proteica em 26 e 24%, respectivamente, confirmando a atividade anti-

inflamatória do composto LQFM-008 observada na segunda fase da formalina e no

teste do edema de pata induzido por carragenina.

Com intuito de se investigar o mecanismo de ação envolvido no efeito

antinociceptivo de LQFM-008 visto no teste de dor induzida por formalina, foram

realizados os testes de flexão de cauda que mostra uma ação central-espinhal e o

teste da placa quente que mostra uma ação supra-espinhal. Ambos os testes usam

o estímulo térmico para avaliar a atividade antinociceptiva mediada por mecanismos

centrais. O teste de flexão de cauda é realizado utilizando uma fonte de calor que é

emitida no terço distal da cauda do animal promovendo um movimento reflexo de

retirada devido à alta temperatura. Já o teste da placa quente é feito utilizando a

superfície de uma placa de metal previamente aquecida, onde os animais são

colocados e então é cronometrado o tempo em que o animal leva para reagir ao

estímulo térmico, sendo esta uma resposta supra-espinal. Vale ressaltar que

temperaturas muito elevadas em ambos os testes não são adequadas devido ao

risco de queimaduras (132, 133, 140).

Os tratamentos dos animais com LQFM-008 nas doses de 48 e 96 µmol/kg

foram capazes de aumentar a latência ao estímulo térmico nos testes de flexão de

cauda e placa quente, porém ao comparar o efeito observado em ambos os teste

pode-se notar uma diferença temporal que mostra um efeito mais prolongado nas

respostas moduladas pelas vias supra-espinais à nocicepção. Sendo assim, o efeito

antinoceptivo do composto LQFM-008 verificado no teste de dor induzida por

formalina pode ser decorrente de uma ação analgésica envolvendo mecanismos

centrais.

Devido às suas características lipofílicas e o tamanho das moléculas, alguns

derivados piperazínicos possuem a capacidade de atravessar a barreira hemato-

encefálica e atuar no sistema nervoso central e por isso alguns deles são utilizados

no tratamento de perturbações mentais, tais como ansiedade e depressão (154,

155). Em estudos anteriores LQFM-008 demonstrou ter atividade ansiolítica

envolvendo a participação de receptores de serotonina 5-HT1A e, além disso, parece

ter potencial para ser um composto com propriedades antidepressivas (127).

47

Evidências relatam que fármacos antidepressivos possuem propriedades

analgésicas que são promovidas por uma série de possíveis mecanismos de ação,

podendo ser ocasionada através da ativação do sistema opióide endógeno ou pela

interação com a via descendente serotoninérgica e/ou adrenérgica do sistema de

controle da dor (156, 157, 158).

Objetivando investigar alguns dos mecanismos envolvidos na resposta

antinociceptiva produzida por LQFM-008, foi realizado o teste da formalina, a fim de

estudar o envolvimento dos receptores opióides com tal efeito. Os resultados

demonstram que os receptores opióides podem estar envolvidos no efeito

antinociceptivo de LQFM-008, uma vez que a naloxona, antagonista não-seletivo de

receptores opióides, não somente antagonizou o efeito antinociceptivo da morfina,

agonista não-seletivo de receptores opióides, como também reverteu o efeito

antinociceptivo promovido pela LQFM-008 na primeira fase do teste da formalina.

As vias descendentes inibitórias no sistema nervoso central constitui um dos

principais mecanismos de controle da dor e um dos locais de ação de analgésicos

opiódes. Os opióides são capazes de ativar indiretamente (através da inibição de

neurônios GABAérgicos no núcleo da rafe magna) os neurônios da via descendente

que por sua vez inibem os estímulos nociceptivos no corno dorsal da medula

espinal, por meio da liberação de 5-HT, o principal neurotransmissor desta via (159,

160, 161). No corno dorsal da medula os opióides ainda podem agir inibindo a

transmissão de neurotransmissores excitatórios pelos neurônios aferentes primários,

ou ainda hiperpolarizar o neurônio de segunda ordem, impedindo a transmissão do

estímulo nociceptivo para os tratos supra-espinais (159).

Foi evidenciado que o sistema descendente 5-HT desempenha um papel

importante na analgesia de morfina, agonista dos receptores opióides, visto que a

sua ação analgésica pode ser diminuída por uma depleção de 5-HT (162, 163).

De acordo com Millan, 2002 (78), os neurônios da via descendente inibitória,

originados no núcleo da rafe magna, projetam-se até o corno dorsal da medula

espinal, onde liberam 5-HT que ativa os receptores 5-HT3 presentes em

interneurônios inibitórios. Ao serem estimulados, via ativação de 5-HT3, os

interneurônios inibitórios liberam GABA e encefalinas que se ligam a receptores

GABAérgicos e receptores opiódes, respectivamente, presentes nos neurônios de

segunda ordem impedindo a transmissão do estímulo nociceptivo. A serotonina

liberada no corno dorsal da medula espinal pode também se ligar em receptores 5-

48

HT1B/1D e 5-HT1A, presentes em fibras aferentes primárias e em fibras aferentes

secundárias, respectivamente, contribuindo para a inibição da transmissão

nociceptiva(Figura 5).

Com o objetivo de confirmar a ação do LQFM-008 sobre a via

serotoninérgica foi utilizado o NAN-190, um antagonista do receptor 5-HT1A no teste

de dor induzida por formalina. Os resultados mostraram que o pré-tratamento com

NAN-190 (1,3 µmol/kg) conseguiu reverter completamente o efeito de LQFM-008 (48

µmol/kg) na primeira fase do teste de formalina e parcialmente na segunda fase do

teste, sugerindo a participação da via serotoninérgica no efeito antinociceptivo

central de LQFM-008.

A presença de receptores 5-HT1A na medula espinal e em áreas do cérebro

envolvidas nos processos de transmissão nociceptiva sugere um possível

envolvimento destes receptores em efeitos antinociceptivos. Muitos destes efeitos

foram obtidos usando testes de nocicepção que envolviam estímulos térmicos de

alta intensidade e duração curta, tais como os testes de movimento de cauda e em

placa quente. No modelo de dor induzida por formalina, foi visto que o composto 8-

OH-DPAT (8-hidroxi-2- [di-N-propilamino] tetralina), agonista 5-HT1A, administrado

sistemicamente foi capaz de produzir efeitos analgésicos (163).

AIRA et al., 2010 (164) relataram que agonistas 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT2C ou 5-

HT3 podem diminuir os potenciais evocados por fibras-C na medula espinal de ratos

com dor neuropática induzida por ligação do nervo espinal. No mesmo ano, HUO et

al., (165) também sugeriram que o receptor 5-HT1A presentes no córtex orbital

ventrolateral estão envolvidos na mediação do efeito antinociceptivo descendente

na nocicepção inflamatória persistente.

Para verificar se LQFM-008 estava desempenhando uma ação indireta sobre

os receptores serotoninérgicos foi utilizado o PCPA, inibidor da síntese de

serotonina, no teste de dor induzida por formalina. Os resultados mostraram que o

pré-tratamento com PCPA (500 µmol/kg) conseguiu reverter completamente o efeito

de LQFM-008 (96 µmol/kg) na primeira fase do teste de formalina e parcialmente na

segunda fase do teste, sugerindo uma possível atividade indireta de LQFM-008,

dependente dos estoques endógenos de serotonina, que pode estar atuando

inibindo a recaptação de serotonina ou promovendo sua liberação (166, 167).

O efeito anti-inflamatório periférico de LQFM-008 observado nos testes de

pleurisia e edema de pata pode ser explicado por sua ação sobre as vias

49

serotoninérgicas que controlam funções neuroendócrinas, uma vez LQFM-008 pode

induzir um aumento deste neurotransmissor. Estudos mostraram que, após a

estimulação dos receptores da serotonina pode ocorrer um aumento do hormônio de

libertação de corticotropina (CRH) e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), no

hipotálamo, glândula pituitária e, possivelmente, também na glândula supra-renal,

levando a um aumento no cortisol do plasma e, consequentemente causando efeitos

anti-inflamatórios (168).

Assim o derivado piperazínico LQFM-008 (4-((1-fenil-1H-pirazol-4-il) metil)

piperazina-1-carboxilato) pode ser um prótotipo de fármaco analgésico, visto que, os

resultados obtidos no presente estudo indicam que o mesmo apresenta atividade

antinoceptiva e anti-inflamatória em testes agudos. Também constatamos que, este

efeito antinociceptivo é decorrente de uma ação central, com o envolvimento dos

receptores opióides e da via serotoninérgica.

50

Conclusão e Perspectivas

51

7. Conclusão e Perspectivas

Com base nos resultados obtidos do composto LQFM-008 neste estudo, conclui-se

que:

• O composto LQFM-008 apresentou atividade antinociceptiva. Sendo que no

teste da dor induzida pela formalina reduziu o tempo de reatividade à dor em

ambas as fases do teste, não permitindo descriminar um efeito anti-

inflamatório independente de um efeito analgésico central;

• A atividade anti-inflamatória de LQFM-008 foi confirmada nos testes de

pleurisia e edema de pata induzidos por carragenina, corroborando com o

efeito encontrado na fase inflamatória do teste da formalina;

• Nos testes de flexão de cauda e placa quente, foi observado que LQFM-008

foi capaz de aumentar à latência ao estímulo térmico, mostrando que o efeito

observado é decorrente de uma ação analgésica central;

• O pré-tratamento com naloxona foi capaz de reverter completamente o efeito

do composto na primeira fase do teste da formalina, porém não alterou o

efeito de LQFM-008 na segunda fase do teste, mostrando que parte do efeito

analgésico envolve uma ação opióide;

• O pré-tratamento com NAN-190 foi capaz de reverter completamente o efeito

do composto na primeira fase do teste e parcialmente na segunda fase

mostrando que o efeito analgésico envolve uma ação serotoninérgica central;

• O pré-tratamento com PCPA foi capaz de reverter completamente o efeito do

composto na primeira fase do teste e parcialmente na segunda fase

mostrando que o efeito analgésico central de LQFM-008 envolve uma ação

indireta sobre os receptores serotoninérgicos, dependente dos estoques

endógenos de serotonina.

52

Como perspectivas, esperamos conseguir esclarecer os mecanismos de ação

envolvidos no efeito anti-inflamatório de LQFM-008 a partir de testes in vivo e in vitro

específicos na inflamação que nos permite avaliar parâmetros como a atividade das

enzimas COX1, COX-2, LOX, fosfolipase A2 e mieoloperoxidase, as quais possuem

importante papel no processo inflamatório. Além disso, temos como objetivo futuro

analisar um possível envolvimento da via serotoninérgica com o efeito anti-

inflamatório de LQFM-008, utilizando modelos experimentais específicos de

inflamação concomitantemente com inibidores ou bloqueadores da via

serotoninérgica bem como fazer a dosagem de corticosterona em ratos ou

camundongos tratados com LQFM-008 para analisar uma possível ação

neuroendócrina exercida por este composto em animais normais ou submetidos a

tratamento com antagonistas de receptores 5-HT ou inibidores da síntese desta

monoamina.

Em relação ao efeito antinociceptivo de LQFM-008, desejamos realizar testes

de nocicepção em modelos animais, fazendo uso de diferentes vias de

administração, bem como de antagonistas específicos de subtipo de receptores

envolvidos na via descendente inibitória da dor, a fim de esclarecer melhor os

mecanismos de ação deste composto.

53

Referências Bibliográficas

54

Referências Bibliográficas

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