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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
RENAN NUNES LELES
Isolamento e avaliação de patogenicidade de fungos em Aedes aegypti
Goiânia
2013
Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas
(TEDE) na Biblioteca Digital da UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG a
disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [ x ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor(a): RENAN NUNES LELES CPF: 002.539.981-07 E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Não Vínculo Empregatício do autor
Aluno discente do Programa de Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – IPTSP/UFG
Agência de fomento: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Goiás Sigla: FAPEG País: Brasil UF: Go CNPJ: Título: Novas propostas de meio seletivo para isolamento e avaliação da patogenicidade de
fungos em Aedes aegypti Palavras-chave: Fungos entomopatogênicos; Metarhizium anisopliae; Leptolegnia chapmanii Título em outra língua: New propose of selective media for isolation and avaliation of the
pathogenicity of fungi for Aedes aegypti Palavras-chave em outra língua: Entomopathogenic fungi; Metarhizium anisopliae; Leptolegnia
chapmanii Área de concentração: Parasitologia Data defesa: (dd/mm/aaaa) 27/02/2013 Programa de Pós-Graduação: Doutorado em Medicina Tropical e Saúde Pública – IPTSP/UFG Orientador(a): Dr. Wolf Christian Luz CPF: E-mail: [email protected] Co-orientador(a): Nada Consta CPF: Nada Consta E-mail: Nada Consta
3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [ x ] total [ ] parcial Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões: [ ] Capítulos. Especifique: __________________________________________________ [ ] Outras restrições: _____________________________________________________
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RENAN NUNES LELES
Isolamento e avaliação de patogenicidade de fungos em Aedes aegypti
Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do
título de doutor em Medicina Tropical
e Saúde Pública.
Orientador PROF. DR. WOLF CHRISTIAN LUZ
Goiânia
2013
ii
Dedicado a meus familiares, em
especial minha mãe Lúcia, meu pai
Ginaldo, meus irmãos Rodrigo e
Raphael e minha querida esposa
Clarissa
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Wolf Christian Luz pela orientação na
pesquisa e no meu desenvolvimento acadêmico.
À República Federativa do Brasil que, por meio da Universidade Federal de
Goiás/ Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, proporcionaram a mim o
presente estudo.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG) pela concessão
da bolsa de doutorado; à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) e Secretaria Municipal de Saúde de Goiânia pelo financiamento
do programa de doutorado sanduíche.
À “Universidad Nacional de La Plata”, docentes, técnicos e administrativos,
especialmente a Profa. Dra. Claudia López Lastra e do Prof. Dr. Juan Jose Garcia,
pela contribuição para a realização dos estudos na Argentina.
À toda a equipe do Laboratório de Patologia de Invertebrados, em especial ao
Prof. Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes e ao companheiro de anos Walmirton
Bezerra D’Alessandro.
Ao “Agricultural Research Service Collection of Entomopathogenic Fungi”
(ARSEF), Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia e, a Profa. Dra. Lara
Stefania Netto de Oliveira Leão pelo fornecimento de fungos e bactérias para
bioensaios.
Ao Dr. Richard Humber pelo auxílio na identificação de fungos e revisão crítica
dos manuscritos e a Profa. Dra. Adelair Helena dos Santos pela contribuição em
experimentos.
À equipe do Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical, professores,
diretoria e técnicos-administrativos, especialmente aos servidores José Clementino
de Oliveira Neto e Kariny Vieira Soares e Silva pela presteza nos trâmites
administrativos.
À equipe do Departamento de Vigilância em Saúde Ambiental da Secretaria
Municipal de Saúde de Goiânia, especialmente aos servidores Welington Tristão da
Rocha, Daniel e Donizete, pelo auxílio nas coletas de campo.
Aos integrantes do Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos e
Xenodiagnóstico, nas pessoas do Prof. Dr. Ionizete Garcia da Silva e Profa. Dra.
Heloísa Helena Garcia da Silva, pelo fornecimento de mosquitos para a realização de
experimentos.
iv
SUMÁRIO
TABELAS E FIGURAS.................................................................................................... vi
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS .................................................................... xi
RESUMO ......................................................................................................................... xii
ABSTRACT .................................................................................................................... xiii
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................................... 2
2.1 Aedes aegypti ............................................................................................................. 2
2.1.1 Morfobiologia ................................................................................................... 2
2.1.2 Importância ....................................................................................................... 6
2.1.3 Principais métodos de controle .......................................................................... 8
2.2 Controle biológico de vetores .................................................................................. 10
2.2.1 Fungos e oomycetos entomopatogênicos...................................................... ....12
2.2.1.1 Mecanismos gerais de infecção ........................................................... 12
2.2.1.2 Métodos de isolamento ....................................................................... 14
2.2.1.3 Ocorrência e patogenicidade de fungos e oomycetos entomopatogênicos
em vetores ......................................................................................... 16
3 JUSTIFICATIVA ......................................................................................................... 19
4 OBJETIVOS ................................................................................................................. 20
4.1 Objetivo geral ........................................................................................................... 20
4.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 20
5 MANUSCRITOS........................................................................................................... 21
5.1 Manuscrito 1:Patogenicidade de alguns fungos da ordem Hypocreales sobre adultos de
Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) ..................................................... 22
5.1.1 Abstract ........................................................................................................... 23
5.1.2 Introdução ....................................................................................................... 24
5.1.3 Material e métodos .......................................................................................... 24
5.1.4 Resultados e discussão ..................................................................................... 26
5.1.5 Agradecimentos ............................................................................................... 27
5.1.6 Referências bibliográficas ................................................................................ 27
v
5.2 Manuscrito 2:Efeitos de conídios de Metarhizium anisopliae misturados em solo
contra ovos de Aedes aegypti.............................................................. 31
5.2.1 Abstract ........................................................................................................... 32
5.2.2 Introdução ....................................................................................................... 33
5.2.3 Material e métodos .......................................................................................... 34
5.2.4 Resultados ....................................................................................................... 35
5.2.5 Discussão ........................................................................................................ 36
5.2.6 Agradecimentos ............................................................................................... 37
5.2.7 Referências bibliográficas ................................................................................ 38
5.3 Manuscrito 3:Desenvolvimento de um método para detecção de Metarhizium sp em
mosquitos infectados .......................................................................... 43
5.3.1 Abstract ........................................................................................................... 44
5.3.2 Introdução ....................................................................................................... 45
5.3.3 Material e métodos .......................................................................................... 46
5.3.4 Resultados ....................................................................................................... 51
5.3.5 Discussão ........................................................................................................ 52
5.3.6 Agradecimentos ............................................................................................... 54
5.3.7 Referências bibliográficas ................................................................................ 54
5.4 Manuscrito 4: Um método simples para detecção de Leptolegnia chapmanii em larvas
infectadas de Aedes aegypti ................................................................ 65
5.4.1 Abstract ........................................................................................................... 66
5.4.2 Introdução ....................................................................................................... 67
5.4.3 Material e métodos .......................................................................................... 69
5.4.4 Resultados ....................................................................................................... 71
5.4.5 Discussão ........................................................................................................ 72
5.4.6 Agradecimentos ............................................................................................... 74
5.4.7 Referências bibliográficas ................................................................................ 74
6 DISCUSSÃO ................................................................................................................. 81
7 CONCLUSÕES ............................................................................................................. 84
8 REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 85
vi
TABELAS E FIGURAS
Tabelas Título Página
Tabela 1 Sorotipos circulantes, características, áreas mais
acometidas e incidência de dengue nas epidemias
mais importantes da última década
7
Manuscrito
(Ms) 1
Tabela 1
Detalhes sobre os fungos entomopatogênicos
utilizados nos testes de patogenicidade em
adultos de Aedes aegypti
29
Ms. 1
Tabela 2
Atividade de fungos em adultos de Aedes aegypti
e o desenvolvimento dos fungos sobre os
mosquitos mortos.
30
Ms 2
Tabela 1
Dias até a emergência de micélio ou novos
conídios de Metarhizium anisopliae IP 46 sobre
ovos de Aedes aegypti ou solo, e dias até a
eclosão de larvas em solo após exposição de ovos
em solo tratado com conídios de IP 46 em
diferentes concentrações.
40
Ms 3
Tabela 1
Isolamento de fungos em larvas e adultos de
mosquitos, coletados na cidade de Goiânia e
mantidos em meio Leles por até 15 dias (25 ±
1°C; UR 70 ± 10%). Identificação das amostras,
bem como a data (DD/MM/AA), local de coleta e
tipo do criadouro, estágio do material coletado,
identificação do mosquito e do fungo isolado.
61
vii
Ms 4
Tabela 1
Infecção de larvas de Aedes aegypti (L4) por
Leptolegnia chapmanii, e o desenvolvimento do
patógeno em L4 mantidas em meio ágar–água
acrescido de aditivos ou, após a transferência, em
água, e subsequente infecção de novas L4 e
desenvolvimento em larvas mortas após
exposição a mesma água.
77
Figuras Título Página
Figura 01
Cabeça de culicídeo em vista superior: A: fêmea
de Culicinae, com destaque a antena pilosa e o
palpo menor que a probóscida; B: Culicinae,
macho, destacando a antena plumosa e o palpo
maior do que o aparelho bucal. a: Antena; Pa:
Palpo maxilar; Pr: Probóscida (Fonte: Eiras,
2005).
2
Figura 02
Esquema da probóscida de um Culicídeo (A, B e
C). lb: Labro; md: Mandíbulas; hf: Hipofaringe;
mx: Maxilas; l: Lábio; f: Palpo; ca: Canal
alimentar. D: Arranjo do aparelho bucal durante a
hematofagia, com destaque ao processo de
retração do lábio (l) e a penetração das demais
estruturas (a) no capilar (b) (Fonte: Eiras, 2005).
3
Figura 03 a: Culicídeo em vista lateral com destaque ao
escudo (Es) e ao escutelo (E); b: Mesonoto com
evidência do escudo e escutelo (Fonte: Consoli &
Oliveira, 1998); c: Aedes aegypti, com destaque
para a disposição das escamas prateadas, em forma
de lira, sobre o escudo.
4
viii
Figura 04 Esquema das fases evolutivas do Aedes aegypti
(http://www.prefeitura.unicamp.br/prefeitura/ca/DE
NGUE/3dengue_unicamp.html. Acessado em 12 de
Novembro de 2012)
5
Figura 05 Mapa de risco da transmissão de dengue no Brasil
em 2011 (www.dengue.org.br/dengue_mapas.
html. Acessado em 20/06/2012)
6
Figura 06 Distribuição de Aedes aegypti nas Américas em
1970 (esquerda) e em 2002 (direita) (http://www.
cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/index.htm. Acessa
do em 20/06/2012 ).
9
Figura 07 Aedes aegypti, adulto (A) e larva (B), mortos,
com o corpo colonizado externamente por
conídios do fungo Metarhizium anisopliae (A) e
zoosporângios do oomyceto Leptolegnia
chapmanii (B), repletos (seta 1) ou sem
zoosporângios (seta 2).
13
Ms 2
Figura 1
Número relativo de ovos de Aedes aegypti com
conídios após a exposição de ovos sobre solo
tratado com Metarhizium anisopliae IP 46 em
diferentes concentrações de conídios e incubação
a 25°C e umidade relativa >98% por 25 dias.
41
Ms 2
Figura 2
Eclosão relativa de larvas de Aedes aegypti após a
submersão de ovos previamente expostos em solo
tratado com Metarhizium anisopliae IP 46 em
diferentes concentrações de conídios e incubação
a 25°C por 5 dias.
42
ix
Ms 3
Figura 1
Esquema da preparação do meio Sabouraud
dextrose ágar com extrato de levedura (SDAL)
com diferentes ajustes de pH ou diferentes
concentrações de cristal violeta(CV), deltametrina
(D), cloranfenicol(Cl) e tiabendazol(T).
57
Ms 3
Figura 2
Quantidade relativa de unidades formadoras de
colônia (UFC) de Metarhizium anisopliae IP 46
em meio SDAL modificado, em função do
número de UFC em SDAL com pH ajustado em
7, após 10 d a 25 ± 1°C e umidade relativa de 70
± 10%. O efeito da concentração foi avaliado para
cada químico por ANOVA (α ≤ 5%), seguido de
teste de Student Newman Keuls, letras diferentes
(A,B) evidenciam o efeito.
58
Ms 3
Figura 3
Adultos de Aedes aegypti mortos por
Metarhizium anisopliae IP 46 e posteriormente
expostos a outros fungos contaminantes,
destacando-se a porcetagem de mosquitos mortos
com conídios de M. anisopliae isoladamente, do
contaminante ou de ambos no mesmo mosquito,
após 10 dias de incubação a 25° ±1°C e umidade
próxima de saturação.
59
Ms 3
Figura 4
Adultos de Aedes aegypti mortos somente com
conídios de Metarhizium anisopliae sobre o corpo
(A), com conídios de M. anisopliae e Aspergillus
flavus (B), M. anisopliae e Mortierella isabellina
(C), Mucor plumbeus associado a M. anisopliae
(D e E) e, mosquitos mortos somente com
conídios de Rhizopus arrhizus (F).
60
x
Ms 4
Figura 1
Avalição do desenvolvimento de Leptolegnia
chapmanii e manutenção da virulência dos
zoósporos após a passagem das larvas, infectadas
(+) ou larvas controle (-), pelos meios: Ágar –
água (AA+ e AA-); AA + tiabendazol (AT+ e
AT-) AA + cloranfenicol (AC 1,0-0,1 g/l + e AC
1,0 - 0,1 g/l ); AA + deltametrina (AD+ e AD-) e
AA + tiabendadol e cloranfenicol (MR + e MR-).
78
Ms 4
Figura 2
Zoosporângios de Leptolegnia chapmanii repletos
de zoósporos (A seta 1) ou vazios (A seta 2) e
liberando zoósporos (B) após 48 h de incubação
de larva de quarto estádio de Aedes aegypti em
meio ágar- água (25 ± 1°C) seguido de exposição
em água destilada por 48 h a 25 ± 1°C. A: 100x;
B: 200x; Detalhe ampliado em B: 400x.
79
Ms 4
Figura 3
Oogônios (seta 1) e zoosporângios (seta 2) de
Leptolegnia chapmanii em larva de quarto estádio
de Aedes aegypti, 48 h após a incubação em meio
ágar-água acrescido de cloranfenicol (1000 mg/L)
e subsequente imersão em água destilada por 48 h
a 25 ± 1°C. Ampliação em 200x.
80
xi
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
AA Ágar–água
AC Ágar cloranfenicol
ACV Ágar cristal violeta
AD Ágar deltametrina
AT Ágar tiabendazol
BDA Batata, dextrose e ágar
BTI Bacillus thuringiensis var. israelensis
CDC Centers for Disease Controle and Prevention
Cl Cloranfenicol
CV Cristal violeta
D Deltametrina
DDT Dicloro – Difenil- Tricloroetano
DENV Dengue virus
EPA US Evironmental Protection Agency
FAS Febre amarela silvestre
FAU Febre amarela urbana
L4 Larva de quarto estádio
MS Ministério da Saúde do Brasil
TL50 Tempo Letal 50%
TL90 Tempo Letal 90%
PNCD Programa Nacional de Controle de Dengue
RPM Rotações por minuto
SDAL Sabouraud, Dextrose, Ágar com extrato de levedura
SES-Goiás Secretaria Estadual de Saúde de Goiás
T Tiabendazol
UBV Ultra Baixo Volume
UFC Unidade Formadora de Colônia
UR Umidade Relativa
WHO World Health Organization
xii
RESUMO
Aedes aegypti é o principal vetor da dengue em países de clima tropical e
subtropical. Em vista da ausência de vacina contra a dengue, o combate ao vetor é
fundamental para o controle da doença. A necessidade de políticas de controle
integrado de A. aegypti é cada vez mais evidente em vista do aumento da população
de mosquitos resistentes a inseticidas químicos comumente utilizados. Os Fungos
entomopatogênicos têm grande potencial para controle biológico de A. aegypti, no
entanto, apenas duas espécies, Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana, têm
sido estudadas para esse fim. Embora M. anisopliae tenha grande potencial para
combate de A. aegypti, é necessário conhecer qual o real impacto desse fungo em
ambiente natural e se existem outros fungos que são inimigos naturais desse
mosquito. Em vista disso, o presente estudo avalia a patogenicidade de dezenove
fungos da ordem Hypocreales em adultos de A. aegypti, novas formas de aplicação
de propágulos fúngicos para controle do mosquito e novas metodologias para
detecção e isolamento de fungos e oomycetos em larvas e adultos desse mosquito. Os
resultados obtidos evidenciaram o potencial de fungos, isolados de outros insetos e
de amostras de solo, especialmente do gênero Metarhizium, para combate de adultos
e de ovos do mosquito vetor da dengue. O presente trabalho também propõe uma
metodologia prática para detecção e isolamento de fungos entomopatogênicos a
partir de mosquitos potencialmente infectados, coletados em campo.
xiii
ABSTRACT
Aedes aegypti is the main vector of dengue fever in tropical and subtropical
countries in the world. Due to the absence of a vaccine for dengue fever, the vector’s
combat is fundamental for the disease control. The spread of mosquito populations
resistant to chemical insecticides shows the necessity to establish integrate vector
control programs. Entomopathogenic fungi have potential for biological control of A.
aegypti; however, only two fungal species, Metarhizium anisopliae and Beauveria
bassiana, have been studied more intensely for this purpose. The present study
evaluated the pathogenicity of nineteen fungal species of the Hypocreales order
against A. aegypti adults, and investigated new methods for fungal application to
control these mosquitoes and for detection and isolation of fungi and oomycetes from
A. aegypti larvae and adults. The results clearly showed the potential of fungi,
especially from the Metarhizium genus, for the combat of eggs and adult mosquitoes.
The present study proposes a new practical method for the detection and isolation of
entomopathogenic fungi from infected mosquitoes collected in the field.
1
1 INTRODUÇÃO
Aedes aegypti é um mosquito, considerado principal vetor da dengue em países de
clima tropical e subtropical (WHO 2009). A prevenção da doença até o momento
depende inteiramente do controle do vetor, visto que não há vacinas eficientes contra a
dengue (WHO 2009). O combate a A. aegypti, conforme preconizado pelo Ministério da
Saúde (MS), baseia-se na destruição dos criadouros do mosquito e uso de inseticidas para
combate de adultos e larvas (MS 2002, 2009; WHO 2009). Contudo, devido a grande
gama de potenciais criadouros, naturais ou artificiais, existe uma grande dificuldade para
a destruição destes (MS 2001, 2009; WHO 2009). Além disso, há uma crescente
preocupação por parte das autoridades de saúde frente ao aumento da população de A.
aegypti resistentes aos principais larvicidas e adulticidas utilizados no combate (Braga et
al. 2004; Braga & Valle 2007; Eisen et al. 2009). Embora existam propostas de controle
biológico, estas ainda são restritas ao uso de peixes, microcrustáceos predadores e, de
bactérias, especialmente BTI (MS 2009; WHO 2009).
Fungos entomopatogênicos são candidatos promissores a agentes de controle
biológico de mosquitos. Contudo, o conhecimento se mantém restrito a praticamente
duas espécies de fungos, Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana, ambos ativos
contra A. aegypti em condições de laboratório (Luz et al. 2007b; Scholte et al. 2007;
Paula et al. 2008). Entende-se que, fungos isolados de mosquitos, tendem a ter maior
virulência contra A. aegypti. Entretanto, apesar da grande biodiversidade de fungos
entomopatogênicos, inclusive em países da América Latina (Sosa-Gómez et al. 2010),
pouco se conhece sobre isolamento de fungos à partir de mosquitos naturalmente
infectados (Mohanty et al. 2008; Luz et al. 2010). Um fungo altamente virulento, bem
adaptado ao ambiente de uso e aplicado da maneira correta seria capaz de contornar
limitações encontradas nos métodos clássicos de controle de A. aegypti.
2
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Aedes aegypti
2.1.1 Morfobiologia
Aedes aegypti é um artrópode pertencente à ordem Diptera, família Culicidae. Como
todos os dípteros, apresenta um par de asas funcionais e um par de asas reduzido,
chamadas balancins, importantes no equilíbrio do inseto durante o voo. Tem o corpo
delgado e pernas longas. As antenas têm 15 artículos cada, divididos em um escapo, um
pedicelo e o flagelo segmentado. O flagelo nos machos apresenta-se piloso e nas fêmeas,
plumoso.
A cabeça de A. aegypti (Figura 01), além das antenas, apresenta outras estruturas
importantes como os olhos compostos, a probóscida ou aparelho bucal e um par de
palpos maxilares. Os olhos são grandes e ocupam grande parte da porção ântero-lateral
da cabeça e são constituídos de pequenos omatídeos (unidades ópticas responsáveis pela
captação de luz). A probóscida é constituída por estruturas diversas (maxilas,
mandíbulas, labro, hipofaringe) recobertas pelo lábio que permite a formação de um
canal pungitivo sugador (Figura 02). Os palpos maxilares são estruturas penta-articuladas
que se situam lateralmente ao aparelho bucal dos mosquitos, sendo que nas fêmeas são
mais curtos do que a probóscida e nos machos são mais longos (Consoli & Oliverira,
1998).
Figura 01: Cabeça de culicídeo em vista superior: A: fêmea de Culicinae, com destaque a
antena pilosa e o palpo menor que a probóscida; B: Culicinae, macho, destacando a
antena plumosa e o palpo maior do que o aparelho bucal. a: Antena; Pa: Palpo maxilar;
Pr: Probóscida (Fonte: Eiras, 2005).
3
Figura 02: Esquema da probóscida de um Culicídeo (A, B e C). lb: Labro; md:
Mandíbulas; hf: Hipofaringe; mx: Maxilas; l: Lábio; f: Palpo; ca: Canal alimentar. D:
Arranjo do aparelho bucal durante a hematofagia, com destaque ao processo de retração
do lábio (l) e a penetração das demais estruturas (a) no capilar (b) (Fonte: Eiras, 2005).
O tórax é dividido em protórax, mesotórax e metatórax, sendo grande parte tomada
pelo mesotórax, onde estão inseridas as asas funcionais. Os balancins encontram-se
inseridos no metatórax. O escudo é característico, apresenta um conjunto de escamas
prateadas em forma semelhante a uma lira, e juntamente com o escutelo compreendem o
mesonoto (Figura 03). O abdome é composto por oito segmentos evidentes e dois
segmentos modificados em ânus e genitália.
4
Figura 03: a: Culicídeo em vista lateral com destaque ao escudo (Es) e ao escutelo (E); b:
Mesonoto com evidência do escudo e escutelo (Fonte: Consoli & Oliveira 1998); c:
Aedes aegypti, com destaque para a disposição das escamas prateadas, em forma de lira,
sobre o escudo.
A. aegypti tem desenvolvimento holometabólico, apresentando as fases de ovo,
larva, pupa e adulto. Os ovos são eliptiformes e recobertos por uma camada impermeável
chamada cório. São postos de forma isolada em superfícies próximas a localidades com
água represada. Mesmo necessitando de água para a eclosão, parte dos ovos de A.
aegypti permanece viável por mais de 450 dias em ambiente ressecado (Silva & Silva
1999; Luz et al. 2008). Esse fato contribui com o sucesso adaptativo do vetor, pois além
de permitir superação de condições climáticas adversas ainda auxilia na dispersão
passiva desses ovos para outras regiões através do transporte de criadouros contaminados
(Silva & Silva 1999).
Os criadouros de A. aegypti estão fortemente relacionados à ambientes urbanos.
Destacam-se materiais recicláveis capazes de armazenar água de chuvas como: latas,
vasos de plantas, pneus, garrafas, entre outros, bem como em solo ou vegetações
próximos à superfície de água (Kay et al. 2000; Reiter 2007; Luciana S Lobo & Christian
Luz, dados não publicados). Outros criadouros encontram-se ainda em locais de estoque
de água, por exemplo, as caixas d’água e cisternas. Estes, capazes de manter a população
dos mosquitos nas cidades mesmo em períodos de menor umidade.
O tempo médio de incubação dos ovos (período compreendido entre a postura e a
eclosão das larvas) de A. aegypti apresenta grande variação. Cepas goianas do mosquito,
criadas em laboratório, tiveram esse período variando entre 1 e 85 dias (Silva & Silva
1999). As larvas eclodem em blocos, contribuindo para a manutenção da população,
5
mesmo que em diferente densidade populacional, durante todo o ano (Camargo et al.,
1994; Rios-Velasquez et al. 2007) .
Após a eclosão, as larvas passam por quatro estádios e um período pupal, todos eles
aquáticos, para enfim chegarem à fase de adulto (Figura 04). A proporção de sexo dos
adultos emergidos é de cerca de um macho para cada fêmea. A longevidade desses
mosquitos foi considerada maior para as fêmeas quando comparado aos machos,
podendo chegar, em condições de laboratório, a até mais de 50 dias para as fêmeas (Silva
& Silva 1999). Estudos realizados em Singapura evidenciaram a capacidade de dispersão
ativa desse mosquito, chegando até cerca de 320 metros (Liew & Curtis 2004),
entretanto, no Rio de Janeiro, essa capacidade ultrapassou 800 metros (Honorio et al.
2003).
Machos e fêmeas alimentam-se de seiva, entretanto, a fêmea necessita de repastos
sanguíneos para a maturação dos ovos, sendo apenas as fêmeas hematófagas. A. aegypti
apresenta hábitos diurnos. A hematofagia, as atividades de cópula e a alimentação dos
machos ocorrem durante o dia. Embora a fêmea não se alimente em um animal
específico, a principal vítima do ectoparasitismo é o homem. As picadas geralmente são
rápidas e consecutivas, e a mesma fêmea alimenta-se diversas vezes no mesmo
hospedeiro ou em hospedeiros diferentes, em especial nas regiões baixas do corpo como
os pés e a parte baixa das pernas.
Figura 04: Esquema das fases evolutivas do mosquito Aedes aegypti (Disponível em:
http://www.prefeitura.unicamp.br/prefeitura/ca/DENGUE/3dengue_unicamp.html.
Acessado em 12 de Novembro de 2012).
6
2.1.2 Importância
Além dos incômodos gerados pela picada, A. aegypti é o principal vetor da febre
amarela em seu ciclo urbano e também dos quatro sorotipos distintos dos vírus dengue.
A transmissão de ambas as doenças para os humanos se dá a partir da picada do
mosquito infectado. O vetor pode se infectar via repasto em um indivíduo previamente
infectado ou ainda por transmissão transovariana (Consoli & Oliveira 1998).
A dengue é caracterizada como uma das principais arboviroses de repercussão
mundial. Casos da doença já foram notificados em mais de 100 países (CDC, 2008). Nos
anos de 2001 e 2002, o número de casos de dengue foi de cerca de 50 milhões por ano
em todo o mundo, sendo pelo menos 500 mil casos de dengue hemorrágica e mais de 12
mil mortes, principalmente entre crianças (WHO, 2002).
O primeiro caso de dengue, confirmado por exames laboratoriais, ocorrido no Brasil
foi no ano de 1981 no estado de Roraima. A partir desse momento até o ano de 1993 a
doença seguiu em ondas epidêmicas em áreas isoladas do país. De 1994 em diante o
dengue vírus passou a gerar epidemías e endemias em praticamente todo o Brasil, com
exceção dos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Siqueira et al. 2005) e assim
vem se mantendo (Figura 05).
Figura 05: Mapa de risco da transmissão de dengue no Brasil em 2011
(Disponível em: www.dengue.org.br/dengue_mapas.html. Acessado em 20/06/2012)
7
Os primeiros casos de dengue hemorrágica confirmados no Brasil datam do ano de
1990, após a introdução do sorotipo 2 (DENV 2) no país. Estima-se em quatro milhões o
número de casos suspeitos de dengue entre os anos de 2002 e 2010, no Brasil. Dentre
esses casos, cerca de 2383 óbitos por dengue com complicações e por febre hemorrágica,
foram registrados (Siqueira et al. 2011). Até o ano de 2009, no Brasil, havia a circulação
de três sorotipos virais, DENV-1, DENV-2 e DENV-3. O histórico de epidemias
relacionadas a esses três sorotipos na última década, iniciou-se em 2002 com uma
epidemia provocada pela introdução de DENV-3 no Brasil. Essa epidemia caracterizou-
se basicamente pelo aumento no número de formas graves. O ano de 2008 foi marcado
pela recirculação do sorotipo 2 do dengue vírus e o aumento no número de casos graves
entre crianças e jovens com menos de 15 anos de idade. Em 2010, uma nova epidemia
com predomínio de DENV-1 foi a de maior proporção, com mais de um milhão de
prováveis casos e com o maior número de óbitos por dengue em um único ano (Tabela
1).
Tabela 1: Sorotipos circulantes, características, áreas mais acometidas e incidência de
dengue nas epidemias mais importante da última década (Extraído de: Siqueira et al.
2011)
Até o ano de 2010, o sorotipo 4 do dengue vírus esteve considerado fora de
circulação do Brasil desde 1981, ano em que foi notificado o último caso autóctone por
DENV-4 no país. Porém, no segundo semestre de 2010 foi identificado DENV-4 no
estado de Roraima e em dezembro do mesmo ano, confirmados casos autóctones no
estado do Amazonas, seguido dos estados do Pará, Piauí, Ceará, Bahia, Rio de Janeiro e
São Paulo já no primeiro semestre de 2011 e no estado de Goiás em 2013 (SES-Goiás
2011, 2013; Siqueira et al. 2011)
A febre amarela é considerada uma das doenças viróticas febris de maior gravidade,
isso devido às complicações hepáticas características da doença, o que gera altos índices
8
de mortalidade. A doença é dividida epidemiologicamente em Febre Amarela Urbana
(FAU) e Febre Amarela Silvestre (FAS). Embora se trate da mesma doença, a
transmissão ocorre em locais distintos e por mosquitos de espécies diferentes.
Casos de FAU não são descritos no Brasil desde o ano de 1942. Entretanto, casos de
FAS são de difícil erradicação devido à dificuldade de controle dos vetores em ambientes
silvestres. Além disso, há à manutenção do ciclo por macacos infectados presentes nesse
meio e a falta de cobertura vacinal nesses locais. No ano de 2007 e início de 2008 foram
confirmados 226 casos de macacos mortos por febre amarela, sendo 138 desses casos no
estado de Goiás (MS 2008). Vinte casos da doença em humanos foram notificados no
mesmo período no Brasil, dentre os quais, 15 desses casos ocorreram no estado de Goiás.
Neste período foram notificados 10 casos de óbito por febre amarela, todos no estado de
Goiás (MS 2008). À partir da preocupante epidemia de 2007/2008, foi intensificado o
monitoramento de FAS no Brasil durante os anos de 2008 e 2009, verificando-se a
circulação viral, em macacos, em 67 municípios diferentes do estado do Rio Grande do
Sul e a confirmação de 20 casos (45% de letalidade) da doença em humanos neste
estado. No mesmo período, no estado de São Paulo, foram confirmados 28 casos em
humanos (34% de letalidade) (MS 2009).
Acredita-se que a presença de ciclos epidêmicos de dengue associados aos casos
constantes de febre amarela silvestre em municípios brasileiros e ao descuido da
população em relação à vacinação contra a febre amarela, tornam real o risco de novos
casos de FAU, já que ambas (febre amarela e dengue) são vetoriadas pela mesma espécie
de mosquito (Massad et al. 2001).
2.1.3 Principais métodos de controle.
No Brasil, A. aegypti tem sido alvo de campanhas de combate populacional desde
meados de 1900 através de políticas sanitaristas idealizadas por Oswaldo Cruz para
erradicação da febre amarela no Rio de Janeiro. Foi erradicado no Brasil e em mais 17
países do continente americano entre as décadas de 1950 e 1960. Eram políticas
verticalizadas de ataque aos focos do mosquito baseadas em rígidas estruturas militares e
hierárquicas e que não contavam com a participação voluntária da população (Tauil
2002). Entretanto, devido ao crescimento desordenado das cidades, essas políticas
tornaram-se ineficazes, sendo que em 1976 houve a reintrodução definitiva de A. aegypti
no país, inicialmente no estado do Pará (Tauil 2002) (Figura 06).
9
Figura 06: Distribuição de Aedes aegypti nas Américas em 1970 (esquerda) e em
2002 (direita) (Disponível em: http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/index.htm
Acessado em 20/06/2012 ).
Atualmente o controle de A. aegypti no Brasil encontra-se vinculado às “Diretrizes
Nacionais para a Prevenção e Controle de Epidemias de Dengue” e ao “Programa
Nacional de Controle de Dengue” (PNCD). Ambos têm como principais medidas a
redução dos danos gerados pela dengue baseados em quatro frentes de ação. A primeira
delas é a assistência ao paciente, a fim de reduzir a mortalidade e a quantidade de casos
graves de dengue. As outras três medidas estão associadas à prevenção de epidemias por
meio da vigilância epidemiológica, conscientização e mobilização da população e
controle do mosquito transmissor (MS 2009).
Dentre as medidas propostas para controle vetorial pelo PNCD, destacam-se
medidas de controle físico, químico e em casos de resistências aos inseticidas químicos,
controle biológico. O controle físico se baseia em evitar a formação de novos criadouros
e a destruição de criadouros existentes, quando possível. O controle químico e o controle
biológico, quando utilizado, tem por base normas técnicas e operacionais propostas pela
Organização Mundial de Saúde. Para o combate de larvas propõe-se o organofosforado
temefós (Abate®). Em municípios ou estados com populações resistentes a esse
organofosforado, propõe-se a substituição por inibidores de síntese de quitina
(Diflubenzuron® ou Novaluron®) ou análogos sintéticos de hormônio juvenis
(Pyriproxifen®). Tais compostos impedem a muda da larva para adulto. Porém, a
aplicação de inibidores de síntese de quitina não é permitida em água potável (MS 2005).
O controle biológico proposto pelo PNCD é restrito ao uso de larvicidas à base de
Bacillus thuringiensis israelensis (BTI), na maioria das vezes em forma de rodízio com
10
temefós a fim de evitar a seleção de populações resistentes (MS, 2001; 2002; 2009). O
controle de adultos é realizado somente em períodos epidêmicos com piretróides,
aplicados por ultra baixo volume (UBV) (MS 2009; Braga & Valle 2007). Entretanto,
segundo estudos realizados na cidade de Salvador, a prática proposta pelo PNCD, além
de muito onerosa, tem se mostrado ineficaz para a minimização dos casos de dengue
nesta cidade (Teixeira et al. 2002) e acredita-se que o mesmo quadro se repita no restante
do país.
Diversas são as dificuldades para a erradicação de A. aegypti, dentre elas a queda da
susceptibilidade do mosquito aos inseticidas propostos pelo PNCD. Resistência de A.
aegypti ao temefós já foi notificada nos Estados da Paraíba (Beserra et al. 2007), Sergipe
(Braga et al. 2004), Alagoas (Braga et al. 2004), Ceará (Lima et al. 2006), São Paulo
(Macoris et al. 2003), Espírito Santo (Lima et al. 2003), Rio de Janeiro (Braga et al.
2004; Lima et al. 2003) e no Distrito Federal (Carvalho et al. 2004). Quanto à
cipermetrina já foram notificados casos de resistência nos estados do Rio de Janeiro,
Alagoas (Cunha et al. 2005) e no Paraná (Luna et al. 2004). O mesmo quadro de
resistência a piretróides e organofosforados também se repete em outros países da
América Latina como em Cuba (Rodriguez et al. 2002) e também no Peru (Chávez et al.
2005).
2.2 Controle biológico de vetores
O controle biológico de insetos baseia-se na manipulação de predadores ou
patógenos naturais de determinado inseto a fim de controlar e manter a população do
mesmo abaixo dos níveis geradores de prejuízos para a saúde (Pedigo 2002).
O ideal seria o alcance de uma relação de equilíbrio entre o inseto e
patógeno/predador, portanto duradoura (auto-sustentável) e de ação específica ao inseto
alvo.
A observação do potencial uso de seres vivos para controle de pragas agrícolas já é
antigo. Desde o ano 300 a.C. os chineses já utilizavam formigas a fim de diminuir a
infestação de pragas nos laranjais (Pedigo 2002). Tal conhecimento, entretanto, foi
negligenciado durante muitos anos devido ao uso do controle químico. Inicialmente, o
emprego do enxofre e arsênico seguido pelo uso de plantas inseticidas e finalmente, com
o advento do DDT, os inseticidas químicos sintéticos passaram a ser amplamente
utilizados. O lançamento do livro “Silent Spring” no ano de 1962 (Carson 1962) foi um
11
marco sobre o questionamento do uso indiscriminado do DDT. O livro contribuiu para o
surgimento de novas teorias acerca da necessidade de formas alternativas, mais eficazes,
específicas e menos poluentes para o controle de artrópodes (Pedigo 2002). Neste
contexto, o controle biológico torna-se uma ferramenta indispensável devido à
sustentabilidade, especificidade e aos baixos danos ambientais que pode apresentar.
Um pequeno vilarejo no Vietnã conseguiu alcançar a erradicação de A. aegypti com
base na união de políticas de controle biológico e de conscientização populacional. Nesse
vilarejo, com cerca de 400 habitações, foram utilizados microcrustáceos do gênero
Mesocyclops nos principais poços e locais de armazenamento de água. A população era
responsável pela manutenção do microcrustáceo nesses locais e ainda pela eliminação
dos criadouros nos quais o uso do Mesocyclops era inviável (garrafas, pneus, etc). Ainda
no mesmo programa de ação, a população de A. aegypti no vilarejo foi monitorada
durante dois anos após a eliminação do mosquito. Neste período não apareceram mais
larvas ou adultos de A. aegypti (Vu et al. 1998).
Larvas de A. aegypti apresentaram grande letalidade quando expostos ao
microsporídeo Edhazardia aedis, um patógeno específico de A. aegypti. O contágio se dá
através da ingestão de esporos pela larva e pode ser mantida também por via
transovariana, caso a larva sobreviva à infecção. O patógeno matou 100% das larvas em
aplicação inundativa. Contudo, as altas letalidades não foram mantidas sem uma nova
aplicação inundativa, provavelmente devido ao baixo tempo de sobrevivência dos
esporos na água (Becnel & Johson, 2000).
Estados como o Rio de Janeiro e Rio Grande do Norte empregaram o BTI como
forma de controle de larvas de A. aegypti em substituição ao temefós no ano de 2001,
sem resultados claros para o controle do vetor (Braga & Valle 2007). Esporos de BTI
apresentam em sua estrutura, proteínas tóxicas para os mosquitos, recobertas por corpos
paraesporais, semelhantes a cristais. Esses cristais, ao serem ingeridos pelas larvas,
provocam o rompimento dos corpos paraesporais, devido ao meio ácido no intestino
médio do inseto, liberando as protoxinas. Essas, em contato com as proteases intestinais,
formam proteínas menores e tóxicas que se ligam à matriz peritrófica da larva por meio
de receptores específicos. Após a ligação das proteínas, formam-se poros na matriz, a
evolução do processo gera a lise do epitélio do mesêntero e à morte da larva. A bactéria,
em condições de laboratório, matou mais de 95% de larvas de A. aegypti e permaneceu
com essa mesma atividade larvicida por 100 dias. No entanto, em condições de campo,
com exposição à luz solar, a eficácia do produto foi mantida por apenas 13 dias e o efeito
12
residual (mortalidade > 70%) foi de duas a cinco semanas. A ação das toxinas
bacterianas variaram de acordo com os criadouros artificiais utilizados. Em recipientes
de ferro, a mortalidade não ultrapassou 80% a partir do sétimo dia pós-aplicação.
Acredita-se que a oxidação desses recipientes pode ter minimizado a eficácia das toxinas
(Lima et al. 2005). Outro estudo, também realizado no Rio de Janeiro, demonstrou que,
em condições de sombra, o efeito residual variou entre 45 e 50 dias e sob luz solar
perdurou por 13 a 35 dias (Melo-Santos et al. 2001).
2.2.1 Fungos e oomycetos entomopatogênicos
2.2.1.1 Mecanismos gerais de infecção
Os primeiros estudos sobre fungos patogênicos em insetos foram feitos a partir de
1834 quando o cientista italiano Agostino Bassi infectou lagartas de Bombyx mori com
um fungo, hoje conhecido por Beauveria bassiana (Alves 1998).
O principal mecanismo de infecção de insetos por esse e muitos outros fungos e
oomycetos é através da cutícula e, quando infectam ovos, do cório. Diferentemente de
outros patógenos que têm o mecanismo de infecção por via oral (Alves 1998), a invasão
parenteral garante a esse grupo de entomopatógenos a possibilidade de infectar diversos
estágios dos insetos que não são mastigadores e não se infectam com patógenos por via
oral, como ovos e pupas, ou infectar larvas e adultos somente por contato.
Além dos fungos propriamente ditos um outro grupo destaca-se com mecanismo de
infecção em insetos muito similar. Os oomycetos, por muitos anos também foram
considerados fungos, porém devido diferenças da parede celular, não quitinosa nos
oomycetos e pela produção de esporos biflagelados móveis por reprodução assexuada,
foram retirados do Reino Fungi (Dick 2001). Os oomycetos têm esporos móveis,
chamados zoósporos, produzidos por um prolongamento terminal das hifas, chamado
zoosporângio. Os zoósporos são liberados e rapidamente se encistam. Em seguida
produzem zoósporos secudários capazes de nadar ativamente até um hospedeiro, que
pode ser uma larva de mosquito (Zattau & McInnis 1987).
Os processos de invasão do inseto pelo patógeno se dão basicamente em quatro
etapas, seja por conídios fúngicos ou por zoósporos de oomycetos: adesão, germinação,
penetração e colonização. A adesão dos conídios ou zoósporos à cutícula é fundamental
para o sucesso da infecção. De forma geral, conídios presentes no habitat dos insetos
fixam-se passivamente à cutícula. Alguns fungos têm uma camada de muco sobre os
13
conídios, que protege contra a dessecação e reforça a adesão sobre a cutícula (Alves
1998). No caso dos oomycetos o contato entre inseto e patógeno se dá de forma ativa,
pelo nado dos zoósporos (Zattau & McInnis 1987). Em condições favoráveis,
principalmente umidade alta, os conídios aderidos começam a germinar; desenvolvem
um tubo germinativo e, em alguns fungos, um apressório, que auxilia a penetração das
hifas pela cutícula. A penetração acontece por mecanismos distintos de acordo com a
espécie do fungo, do inseto hospedeiro, das condições ambientais e da presença de
nutrientes, bem como da microbiota presente sobre a cutícula. Esse processo envolve
fatores físicos de pressão da hifa terminal sobre a cutícula associado a mecanismos
enzimáticos de degradação da quitina (Arruda et al. 2005; Zattau & McInnis 1987). Os
principais locais para penetração são as membranas intersegmentares, e além dessas, o
aparelho bucal, espiráculos, ânus, sifão respiratório e tarsos. A invasão pode também
ocorrer por via oral, nesse caso a infecção inicia-se no mesêntero do inseto (Zattau &
McInnis 1987).
Hifas que chegam à hemocele colonizam o inseto inteiro ramificando-se e
produzindo brotamento de corpos hifais. A morte do inseto ao final da infecção está
relacionada, dentre outros fatores, com a ação de micotoxinas, atividades histolíticas e
bloqueios mecânicos no canal digestivo e espiráculos por hifas fúngicas. Após a morte,
hifas começam a emergir sobre o corpo e conídios são formados. Esses podem infectar
outros insetos dando continuidade ao ciclo de vida do patógeno (Figura 07)
Figura 07: Aedes aegypti, adulto (A) e larva (B), mortos, com o corpo colonizado
externamente por conídios do fungo Metarhizium anisopliae (A) e zoosporângios do
oomyceto Leptolegnia chapmanii (B), com (seta 1) ou sem zoósporos (seta 2).
14
2.2.1.2 Métodos de isolamento
Conídios de fungos e esporos de oomycetos entomopatogênicos, em ambiente
natural, extra-hospedeiro, estão misturados, no solo ou na água, à matéria orgânica e
expostos à uma grande gama de outros microrganismos, como bactérias, outros fungos
não entomopatogênicos e nematódeos, que podem sobrepor-se ao fungo patogênico
sobre o corpo de um inseto morto (Tsao 1970). Os ciclos naturais de infecção e
esporulação de fungos entomopatogênicos são dificilmente visíveis, devido à competição
com os microrganismos não patogênicos, presentes no mesmo habitat, bem como às
condições de umidade ou exposição à radiação ultravioleta que dificultam o processo de
esporulação dos entomopatógenos (Roy & Pell 2000; Arthurs & Thomas 2001).
Diante da dificuldade em encontrar insetos mortos em campo, sobretudo com fungo
esporulado, estudos de diversidade e distribuição de fungos entomopatogênicos são
realizados, normalmente, a partir da coleta de insetos ou substratos como solo ou água.
Existem basicamente duas técnicas descritas para o isolamento de fungos/oomycetos a
partir de substratos: o uso de insetos como “iscas” para patógenos ou cultivo em meios
nutritivos seletivos, enriquecidos com antibióticos e antifúngicos que reduzem o
crescimento de bactérias e fungos não patogênicos.
Um método de “isca” foi descrito por Zimmermann (1986). O autor detectou os
fungos Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana e Isaria fumosorosea, a partir de
amostras de solo utilizando como “isca” a lagarta Galleria mellonella e propôs esse
método para detecção e isolamento de fungos entomopatogênicos. Como sugere o nome
da metodologia, o inseto é mantido em contato com o substrato coletado e serve como
uma “isca”. Na presença de conídios, no substrato, será infectado e morrerá. O inseto
morto é colocado em câmara úmida para que ocorra a conidiogênese, possibilitando o
isolamento e posterior identificação do fungo. A seletividade é determinada pelo próprio
inseto que naturalmente indica a presença de fungos que sejam entomopatogênicos.
Medidas como a esterilização externa do corpo da isca com hipoclorito de sódio (1%) em
determinados casos é recomendada, a fim de evitar a proliferação de outros fungos
contaminantes ou bactérias, presentes na superfície corporal da isca e que eventualmente
podem crescer de maneira saprobiótica (Meyling 2007). Embora G. mellonella seja mais
utilizada como isca por sua facilidade de criação e por ser altamente susceptível a fungos
entomopatogênicos, outras iscas que sejam mais adaptadas ao substrato devem ser
15
testadas, já que o isolamento de fungos presente na amostra pode depender da espécie de
artrópode utilizada como isca (Klingen et al. 2002; Luz et al. 2003; Meyling 2007).
Meios semi-seletivos para isolamento de fungos entomopatogênicos são meios de
cultivo padronizados, acrescido de produtos que permitam o desenvolvimento de fungos
ou oomycetos entomopatogênicos e excluam ou minimizam o crescimento de outros
microrganismos que estejam presentes no substrato coletado. Os produtos mais comuns
são antibióticos e fungicidas, utilizados para a inibição de bactérias e fungos não
entomopatogênicos. Esses produtos devem interferir o mínimo possível no
desenvolvimento dos fungos a serem isolados (Tsao 1970). Diferentes fungos, ou mesmo
diferentes linhagens de uma mesma espécie, podem apresentar suscetibilidade distinta a
antibióticos e antifúngicos em um determinado meio seletivo (Tsao 1970; Rocha & Luz
2009; Fernandes et al. 2010; Rangel et al. 2010), o que deve ser considerado para a
escolha do meio. Trabalhos de levantamento de espécies devem avaliar a possibilidade
de inibição de determinados fungos, ou grupo de fungos, pelos componente do meio que
são utilizados para isolamento (Fernandes et al. 2010).
Muitos são os meios seletivos para isolamento de fungos entomopatogênicos, e
grande parte deles desenvolvidos para isolamento de espécies do gênero Metarhizium e
Beauveria. Veen & Ferron (1966) desenvolveram um meio seletivo que utiliza bile
bovina, cloranfenicol e ciclohexamida para isolamento de Beauveria brongniartii e M.
anisopliae, sendo, a bile desidratada, inibidor de bactérias Gram positivas. O
cloranfenicol, é um antimicrobiano termoestável de largo espectro, ativo contra bactérias
Gram positivas e negativas e a ciclohexamida um antimicrobiano que inibe a síntese
proteica em indivíduos eucariotos, sendo tóxico tanto para bactérias como para fungos
(Tsao 1970).
No ano de 1982, Beilharz introduziu o antifúngico dodine ao meio proposto por
Veen e Ferron para isolamento de M. anisopliae em amostras de solo (Beilharz et al.
1982). Outros meios, inclusive o meio Chase, largamente utilizado para isolamento de
fungos entomopatogênicos de solo, têm sido propostos com algumas adaptações,
contudo, mantendo o dodine para a inibição de fungos saprobiontes contaminantes
(Chase et al. 1986; Liu et al. 1993; Keller et al. 2003; Hughes et al. 2004; Luz et al.
2004; Rangel et al. 2010). No entanto, dodine tem se mostrado um antifúngico de acesso
restrito e produção limitada, além de ter toxicidade aguda de intensidade moderada pelas
vias oral, inalatória e dérmica para mamíferos (EPA 2005).
16
Outros meios semi–seletivos, livres de dodine, têm sido desenvolvidos para o
isolamento de Culicinomyces clavisporus (Panter & Frances 2003) e também para
Beauveria spp. e Metarhizium spp. (Luz et al. 2007a; Fernandes et al. 2010), utilizando
tiabendazol para inibição de fungos saprobiontes. Tiabendazol é um fungicida de fácil
obtenção, com baixa toxicidade oral, dérmica e inalatória (EPA 2002) e tem potencial de
inibição para fungos saprobiontes maior do que para fungos entomopatogênicos dos
gêneros Metarhizium, Beauveria, Isaria, Paecilomyces, Tolypocladium e Evlachovaea
(Luz et al. 2007a; Rocha & Luz 2009; Fernandes et al. 2010).
Em um estudo de levantamento de fungos entomopatogênicos, a partir de amostras
de solo, realizado na Suiça, foi feito uma comparação entre duas metodologias. O
isolamento de fungos foi realizado pela metodologia de isca com G. mellonella ou com
meio seletivo enriquecido com estreptomicina, tetraciclina, ciclohexamida e dodine
(Keller et al. 2003), sendo que ambas as metodologias mostraram alta positividade para
M. anisopliae. (Keller et al. 2003).
2.2.1.3 Ocorrência e patogenicidade de fungos e oomycetos entomopatogênicos
em vetores
A ocorrência e patogenicidade de fungos têm sido estudadas para diversos tipos de
artrópodes, vetores e veiculadores, de patógenos causadores de doenças em humanos.
Aspergillus flavus e Penicillium corylophilum, apesar de não serem largamente estudados
como entomopatogênicos, mataram adultos de Musca domestica (Senna-Nunes et al.
2002). Outros fungos, especialmente relacionados ao gênero Metarhizium, são
patogênicos também contra ootecas, ninfas e adultos da barata Periplaneta americana,
veiculador sinantrópico e comumente relacionado a esgoto, ambiente doméstico e
hospitalar (Hubner–Campos et al. 2010, 2011a, 2011b).
Muitos isolados de fungos já foram obtidos a partir de carrapatos, especialmente
Rhipicephalus (Boophilus) microplus e Amblyomma cajennense. O primeiro deles, de
grande importância veterinária, é comumente encontrado em bovinos e o segundo,
menos específico, sobretudo na forma larvária, é considerado principal vetor da febre
maculosa no Brasil (Battesti et al. 2006). Mais de 40 isolados de B. bassiana e de 20
isolados de M. anisopliae foram encontrados em R. microplus coletados em zona rural do
estado do Rio de Janeiro (Costa et al. 2002; Fernandes & Bittencourt 2008) e em A.
cajennense no estado de Goiás (D'Alessandro et al. 2012). Ainda em A. cajennense
17
também foi isolado Purpureocillium lilacinum (D'Alessandro et al. 2012). Estudos em
laboratório e de campo confirmaram a patogenicidade de B. bassiana e M. anisopliae por
meio da mortalidade de adultos, redução de eclosão e taxa de ecdise de larvas, nos
carrapatos R. microplus, Rhipicephalus sanguineus, A. cajennense e Dermacentor nitens
(Fernandes & Bittencourt 2008).
Os fungos Evlachovaea sp. e P. lilacinum foram isolados a partir de Triatoma
sordida e Triatoma infestans, respectivamente, encontrados em Goiás, Brasil e Santiago
del Estero, Argentina (Luz et al. 2003; Marti et al. 2006). T. infestans e outros
triatomíneos do gênero Rhodnius foram altamente suscetíveis a infecção por diversos
isolados de B. bassiana, M. anisopliae, Lecanicillium psalliotae, P. lilacinum e Pochonia
chlamydosporia, em condições de laboratório; algumas linhagens com alta virulência
inclusive em baixa umidade relativa (Luz et al. 1998; Rocha et al. 2011). Em estudos de
campo e semi-campo, B. bassiana, em formulação oleosa e formulação seca, apresentou
potencial no controle de T. sordida e T. infestans no Brasil e na Argentina (Luz et al.
2004; Pedrini et al. 2009).
Mudanças na formulação de conídios ou no meio de cultivo podem aumentar a
virulência de fungos. O uso de terra diatomácea, que incita maior irritabilidade e
transpiração aos triatomíneos, combinado com conídios de M. anisopliae e óleo vegetal,
maximiza a virulência do fungo contra T. infestans (Luz et al. 2012). Outro exemplo é o
cultivo de B. bassiana em meio completo modificado, incluindo fontes de carbono
derivadas de hidrocarbonetos extraídos da cutícula de T. infestans, que igualmente
potencializou a virulência fúngica contra T. infestans (Pedrini et al. 2009).
Fungos entomopatogênicos têm sido estudados e demonstram potencial para o
controle de mosquitos (Scholte et al. 2004a). Podem causar a morte de larvas (Alves et
al., 2002; Silva et al., 2004), bem como de adultos (Blanford et al. 2005; Scholte et al.
2005, 2007) e ainda dos ovos desses insetos (Luz et al. 2007b, 2008).
Perspectivas para o manejo de adultos de Anopheles gambiae foram apresentadas
com B. bassiana (Blanford et al. 2005) e M. anisopliae (Scholte et al. 2003; 2005). Os
resultados indicaram que o impacto gerado pelo uso desses fungos seria de mais de 80%
de redução nos níveis de transmissão vetorial da malária por esse mosquito. Estudos
apontam ainda a possibilidade de transmissão de conídios de M. anisopliae da fêmea
para o macho de A. gambiae durante a cópula, evidenciando uma forma de disseminação
do patógeno entre os mosquitos dessa espécie e a possibilidade de ocorrência de
epizootias do fungo (Scholte et al. 2004b). M. anisopliae também causou altas taxas de
18
mortalidade de larvas e adultos de Culex quinquefasciatus em ensaios laboratoriais
(Alves et al. 2002; Scholte et al. 2003).
Isolados de M. anisopliae, originados do cerrado brasileiro causaram até 100% de
mortalidade de larvas de segundo estádio de A. aegypti, em laboratório (Silva et al.,
2004). Adultos de A. aegypti e Aedes albopictus foram expostos a conídios de M.
anisopliae e tiveram mais de 80% dos seus indivíduos infectados pelo fungo. Os
mosquitos infectados sofreram redução significativa no tempo de sobrevivência (TL50)
quando comparados aos do grupo controle (Scholte et al. 2007).
Diversos fungos hifomicetos foram capazes de matar larvas de A. aegypti ainda
dentro dos ovos após 25 dias de incubação dos ovos contaminados em estufa com
umidade saturada (Luz et al. 2007b). Esse fato é muito significativo, já que, os químicos
mais utilizados para controle do vetor não são eficazes contra ovos de aedíneos (Perez et
al. 2007). A redução da eclodibilidade das larvas de A. aegypti com fungos variou de
acordo com a espécie do patógeno. Em tratamentos com B. bassiana a redução da
eclodibilidade foi maior que 60% enquanto Paecilomyces marquandii causou redução
acima de 70% e Isaria farinosa; Isaria fumosorosea; M. anisopliae; Paecilomyces
carneus; Purporeocillium lilacinum e Penicillium sp determinaram uma redução de mais
de 80% (Luz et al. 2007b).
19
3 JUSTIFICATIVA
A dificuldade de controle de A. aegypti é notória, seja pela adaptação do mosquito às
diferentes situações urbanas, seja pela redução da eficiência dos químicos mais utilizados
nos programas de controle. Embora haja estudos no sentido de desenvolver novas
tecnologias com o uso de fungos para combate de A. aegypti, pouco se conhece sobre
quais fungos infectam naturalmente esse vetor e de que maneira o controle com fungos
poderia ser utilizado. O presente estudo se justifica pela necessidade da busca por fungos
mais virulentos ao mosquito; de desenvolvimento de metodologias que tornem o
isolamento de fungos em mosquitos mais simples e eficientes e, de novos métodos de
aplicação desses entomopatógenos para controle de A. aegypti.
20
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Ampliar o conhecimento referente as possibilidades de controle de A. aegypti,
principalmente às formas alternativas, ainda pouco utilizadas, como o controle biológico.
4.2 Objetivos específicos
1. Testar a patogenicidade de fungos isolados de outros insetos para A. aegypti
2. Avaliar um método de aplicação de conídios que se relacione mais diretamente com os hábitos e habitats de ovipostura A. aegypti
3. Desenvolvimento de um método que torne a detecção e isolamento de fungos entomopatogênicos em larvas e adultos mais simples e sensível;
4. Procurar por fungos associados a A. aegypti em ambiente natural na cidade de Goiânia
21
5 MANUSCRITOS
Manuscrito 1: Patogenicidade de alguns fungos da ordem Hypocreales sobre adultos de
Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)
Autores: Renan Nunes Leles; Nathalia Almeida Sousa, Luiz Fernando Nunes Rocha,
Adelair Helena Santos, Heloisa Helena Garcia Silva, Christian Luz
“Leles RN, Sousa NA, Rocha LF, Santos AH, Luz C 2010. Pathogenicity of some
hypocrealean fungi to adult Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Parasitol Res
107 (5):1271-1274. doi: 10.1007/s00436-010-1991-y.”
Manuscrito 2: Efeitos de conídios de Metarhizium anisopliae misturados em solo contra
ovos de Aedes aegypti
Autores: Renan Nunes Leles; Walmirton Bezerra D’Alessandro, Wolf Christian Luz
“Leles RN, D’Alessandro WB, Luz C 2012. Effects of Metarhizium anisopliae conidia
mixed with soil against the eggs of Aedes aegypti. Parasitol Res 110 (4):
1579-1582. doi: 10.1007/s00436-011-2666-z.”
Manuscrito 3: Desenvolvimento de um método para detecção de Metarhizium sp em
mosquitos infectados
Autores: Renan Nunes Leles; Wolf Christian Luz
Manuscrito 4: Um método simples para detecção de Leptolegnia chapmanii em larvas
infectadas de Aedes aegypti
Autores: Renan Nunes Leles, Wolf Christian Luz
22
Manuscrito 1
Título resumido: Patogenicidade de fungos em Aedes aegypti
Título: Patogenicidade de alguns fungos da ordem Hypocreales sobre adultos de Aedes
aegypti (Diptera: Culicidae)
23
Abstract
The pathogenicity of 19 hypocrealean entomopathogenic fungi from seven different
genera in adult Aedes aegypti was tested. All fungi proved to be pathogenic, and Isaria
fumosorosea, Lecanicillium muscarium, Lecanicillium psalliotae, Metarhizium
anisopliae, Metarhizium lepidiotae, Metarhizium majus, Metarhizium frigidum,
Paecilomyces carneus, and Purpureocillium lilacinum caused total mortality within 15
days of exposure of mosquitoes to the fungal culture. All fungi developed on dead
individuals. The high susceptibility of adults to most tested strains underlines the interest
of entomopathogenic fungi — especially those of the genera Metarhizium, Isaria,
Paecilomyces and Lecanicillium — for biological control of A. aegypti.
Key words: Hypocrealen fungi; Metarhizium anisopliae; Biological control;
Entomopathogenic fungi
24
1 Introdução
Epidemias de dengue que assolam países tropicais e subtropicais evidenciam que o
controle de vetores continua sendo uma necessidade primária em saúde pública.
Autoridades de saúde estão em consenso em relação à importância do aumento na
população de Aedes aegypti resistentes a inseticidas químicos sintéticos (Eisen et al.
2009).
Fungos entomopatogênicos são candidatos promissores para controle biológico de
mosquitos. Contudo, o conhecimento sobre o potencial contra A. aegypti esta restrito
basicamente a duas espécies de fungos, Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana.
Ambos fungos foram ativos contra A. aegypti em condições de laboratório (Luz et al.
2007; Scholte et al. 2007; Paula et al. 2008). Apesar da grande diversidade de fungos
entomopatogênicos já identificados em países da América do Sul (Sosa-Gómez et al.
2010), tem-se pouca informação sobre a ocorrência de mosquitos adultos naturalmente
infectados por fungos (Mohanty et al. 2008; Luz et al. 2010), e nenhum inseticida à base
de fungos se encontra disponível comercialmente contra A. aegypti ou outros mosquitos
(Scholte et al. 2004; Alves & Lopes 2008). Fungos patogênicos podem ajudar a
ultrapassar algumas das limitações clássicas do controle de vetores do dengue, como a
resistência a inseticidas e o combate a estágios do vetor ainda não alcançadas pelos
químicos, por exemplo ovos (Luz et al. 2007). Foi estudada a patogenicidade de 19
fungos da ordem Hypocreales, particularmente relacionadas ao gênero Metarhizium em
adultos de A. aegypti.
2 Material e Métodos
2.1 Preparo do BDA: Batatas (170 g) foram descascadas, cortadas em pequenos
pedaços e autoclavadas em 1.000 ml de água deionizada. Após resfriamento, a infusão de
batata foi filtrada por peneira e o volume do filtrado foi completado para 1.000 ml. Em
seguida foi novamente aquecido até 60°C e mantido em constante agitação a 500 rpm.
Com o filtrado em agitação foram acrescentadas 20 g de dextrose e 18 g de ágar. O pH
do meio foi ajustado em 7 por adição balanceada de soluções de hidróxido de sódio e/ou
ácido clorídrico. O meio foi então autoclavado por 20 min.
2.2 Origem e manutenção de mosquitos: A criação de mosquitos originou-se a
partir de larvas livres de vírus coletadas em 1991 em Goiânia, Brasil (Silva et al. 1998).
Todo processo ocorreu em câmara biológica devidamente climatizada a 28ºC, umidade
de 80% e fotofase de 12 horas. Papéis filtro branco, úmidos, foram colocados dentro das
gaiolas, sobre um copo de vidro, recobrindo toda a superfície interna do copo, para a
25
oviposição das fêmeas. Os ovos aderidos em papéis filtro, foram incubados em bacias
brancas (30 x 7 cm) contendo 1,5 litros de água de torneira, com temperatura média de
25ºC. As larvas eclodidas foram transferidas para bacias limpas e alimentadas com ração
para gato, triturada (Silva et al. 1998). Em seguida, as pupas foram separadas e colocadas
em tubos com água, outro tubo de igual tamanho foi aderido a “boca” do tubo, para
conter os adultos emergidos. Após a emergência, os adultos foram sexados e colocados
nas gaiolas de cópula e mantidos sobres às mesmas condições de temperatura e umidade.
A alimentação dos adultos foi constante por meio de um absorvente íntimo (Ob®),
encharcado com água açucarada e preso ao teto da gaiola com o auxílio de um clip de
papel. A hematofagia das fêmeas foi realizada em dias alternados, em camundongos
imobilizados, durante um período de 6 horas (Silva et al. 1998).
2.3 Origem e manutenção de fungos: Dezenove isolados fúngicos, sendo oito do
gênero Metarhizium, três Lecanicillium, três Purpureocillium, dois Isaria e um
Beauveria brongniartii, Gliocadium sp e Pochonia chlamydosporia foram utilizados.
Todas as espécies, bem como, detalhes sobre a origem, ano de isolamento e substrato de
origem estão detalhadamente explicitados na tabela 1. Todos os fungos foram repicados
em meio BDA, à partir de coleção própria, mantida (-8°C) no Laboratório de Patologia
de Invertebrados e, incubados a 25 ± 1°C durante 10 a 15 dias.
2.4 Bioensaios: Os bioensaios foram realizados em béqueres de vidro de 400 ml. No
fundo de cada béquer foi fixado, com uma fita adesiva dupla face, um pequeno frasco de
vidro, semelhante a uma ampola de penicilina, contendo 10 ml de solução açucarada (6%
de sacarose). Dentro da ampola, em contato constante com a solução açucarada, foi
colocado um papel filtro circular (diâmetro de 5,5 cm) enrolado, formando um cilindro, e
o orifício superior do cilindro de papel tampado com um pequeno chumaço de algodão.
Foram cuidadosamente colocados 40 ml de meio BDA em cada béquer, evitando a perda
da ampola. Em seguida, o béquer com todo o conteúdo descrito, foi autoclavado e, os
fungos, um em cada béquer, foram semeados. Depois de semeados nos béqueres os
fungos foram mantidos a 25 ± 1°C e UR de 70 ± 10% durante 15 dias. Após esse período
os béqueres, onde estavam os fungos, foram cobertos com duas gazes, presas com uma
liga elástica. Na gaze inferior foi feito um orifício, grande o suficiente para permitir a
passagem da ponta de um capturador de Castro e a segunda gaze foi mantida íntegra.
Dentro de cada béquer foram colocados dez mosquitos adultos, entre 1 e 3 dias de idade,
por meio de um capturador de Castro. Para tal retirava-se a gaze superior e colocava-se o
capturador dentro do béquer passando pela gaze inferior, sendo em seguida recolocada a
26
gaze íntegra por cima de todo o conjunto, evitando o escape dos mosquitos. Os
mosquitos foram mantidos nos béqueres por até 15 dias a 25 ± 1°C e umidade ≥ 98% e a
mortalidade avaliada diariamente. Mosquitos do grupo controle foram mantidos sobre as
mesmas condições, porém em meio BDA sem inoculação de fungos. Mosquitos mortos
foram retirados de cima da cultura fúngica, com o auxílio de uma alça de platina, através
do orifício feito na gaze inferior, colocados em placas de Petri com papel filtro e
mantidos em umidade saturada por até 15 dias. A infecção pelo fungo foi comprovada
pelo surgimento de conídios sobre o mosquito morto e a presença de fungos nos
mosquitos foi avaliada diariamente. Os testes foram realizados em quatro repetições
independentes, cada uma com culturas fúngicas diferentes. A viabilidade dos conídios
(germinação > 95%) após 24 h em meio Sabouraud Dextrose Ágar acrescido de extrato
de levedura foi confirmada para cada fungo e repetição.
2.5 Análises estatísticas: Cálculos referentes a média e erro padrão da média foram
realizados manualmente. Os valores de tempos letais 50 e 90% (TL50 e TL90) foram
calculados por análise de probit com os softwares Mathematica (Wolfram Research® v.
7.0 - 2008) e Throne et al. (1995).
3 Resultados e discussão
Os fungos testados provaram ser patogênicos para adultos de A. aegypti. Os
primeiros mosquitos mortos foram observados 3 – 5 dias após a exposição às culturas de
fungos independentemente da espécie do fungo. M. anisopliae IP 46, Metarhizium
lepidiotae ARSEF 7453 e Metarhizium majus ARSEF 1914 causaram 100% de
mortalidade dos mosquitos depois de 10 dias e outros seis fungos também causaram
mortalidade de todos os adultos em até 15 dias pós-tratamento (Tabela 2). A mortalidade
acumulativa no grupo controle foi menor que 15% no mesmo período de tempo. Os
valores de TL50 variaram entre 4 dias (M. lepidiotae ARSEF 7453) até 17,9 dias
(Metarhizium flavoviride “type E” ARSEF 2948), e os valores de TL90 entre 5,3 dias
(ARSEF 7453) até 28,7 dias (Beauveria brongniartii CG 619) (Tabela 2). Todos os
fungos inoculados se desenvolveram sobre os mosquitos mortos em câmara úmida e 70%
dos fungos testados produziram conídios em mais de 90% dos adultos mortos em até 15
dias.
A alta suscetibilidade dos adultos à maioria dos isolados testados evidenciou o
potencial de fungos entomopatogênicos, especialmente dos gêneros Metarhizium, Isaria,
Purpureocillium e Lecanicillium, para o controle biológico de A. aegypti. Este estudo
descreveu pela primeira vez um efeito adulticida de M. anisopliae IP 46, fungo com ação
27
já conhecida contra ovos e larvas deste mosquito (Silva et al. 2004; Albernaz et al. 2009;
Santos et al. 2009) e contra adultos de anofelínos (Mnyone et al. 2009). Um fungo, capaz
de atacar todos os diferentes estágios de desenvolvimento do mosquito vetor da dengue
se apresenta como forte candidato a integrar um programa sustentável de controle desse
importante vetor.
4 Agradecimentos
Agradecemos ao Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos e Xenodiagnóstico
pela criação de mosquitos, Richard A. Humber pela revisão crítica do manuscrito,
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasilia, DF, Brasil), ao USDA – ARS
(Biological Integrated Pest Management Research Unit, Ithaca, USA) pelo fornecimento
de fungos entomopatogênicos e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq – Brasil) e Fundação De Amparo a Pesquisa do Estado de Goiás
(FAPEG, 201010267000250) pelo financiamento.
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29
Tabela 1: Detalhes sobre os fungos entomopatogênicos utilizados nos testes de patogenicidade em
adultos de Aedes aegypti Fungo Id de Acesso País Ano Substrato
Beauveria brongniartii CG 619ª Brasil 1998 Thelosia camina (Lepdóptera)
Gliocadium sp. IP 290b Brasil 2006 Sedimento
Isaria farinosa CG 195ª Brasil 1983 Chlosynea lacinia (Lepdóptera)
I. fumosorosea ARSEF 2198C Filipinas 1985 Nilaparvata lugens (Hemíptera)
Lecanicillium lecanii ARSEF 2149C Indonésia 1986 Coccus viridis (Hemíptera)
L. muscarium ARSEF 5128C Inglaterra 1979 Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera)
L. psalliotae IP 301b Brasil 2006 Sedimento
Metarhizium acridum ARSEF 3391C Tanzânia 1991 Zonocerus elegans (Orthóptera)
M. album ARSEF 1941C Filipinas 1985 Nephotettix virescens (Hemíptera)
M. anisopliae IP 46b Brasil 2001 Solo
M. lepidiotae ARSEF 7453C Austrália 1994 Dermolepida albohirtum (Coleóptera)
M. majus ARSEF 1914C Filipinas 1985 Oryctes sp (Coleóptera)
M. flavoviride var. pemphigi ARSEF 7491C Inglaterra 1994 Penphigus sp (Hemíptera)
M. flavoviride “type E” ARSEF 2948C Brasil 1989 Hemíptera
M. frigidum ARSEF 4561C Austrália 1989 Solo
Paecilomyces marquandii CG 190ª Brasil 1990 Solo
P. carneus CG 525ª Brasil 1995 Solo
Purpureocillium lilacinum CG 362a Brasil 1991 Solo
Pochonia chlamydosporia IP 315b Brasil 2006 Lama
a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, Brasil
b Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, IPTSP-UFG, Goiânia, Brasil
c USDA – ARS Robert W Holley Center for Agriculture and Healthy, Ithaca, EUA.
30
Tabela 2: Atividade de fungos em adultos de Aedes aegypti e o desenvolvimento dos fungos sobre os mosquitos
mortos. Fungo Mortalidade (% ± EM)a Tempos Letais (días; IC)b Desenvolvimento
de fungo em
mosquitos mortos
(% ± EM)c
10 dias 15 dias TL 50 TL90 Slope ± EM
Beauveria brongniartii 45 ± 36,9 80 ± 14,1 11 (3,4–21,8) 28,7 (14,1-58,7) 0,13 ± 0,02 100
Gliocadium sp. 47,5 ± 14,1 70 ± 14,1 11,3 (6,4-17,5) 21 (15,6-39) 0,13 ± 0,02 30 ± 26,5
Isaria farinosa 66,8 ± 31,6 92,5 ± 9,6 8,7 (4,9-12,3) 13,9 (10,8-23,3) 0,24 ± 0,03 93 ± 5,3
I. fumosorosea 62,5 ± 18,9 100 9,1 (8,1-10,3) 13 (11,5-15,5) 0,33 ± 0,05 88 ± 12,6
Lecanicillium lecanii 45 ± 23,8 87,5 ± 15 9,7 (8,2-11,4) 15,6 (13,7-18,7) 0,22 ± 0,03 32 ± 30
L. muscarium 90 ± 20 100 6,9 (4,5-9,3) 11,7 (9,3-16,8) 0,26 ± 0,03 96 ± 5,8
L. psalliotae 77,5 ± 17 100 8,1 (5,2-11) 12,3 (9,8-19,8) 0,31 ± 0,04 100
Metarhizium acridum 82,5 ± 22,1 95 ± 10 8,2 (2-13,6) 12,9 (9,4-33,4) 0,27 ± 0,04 91 ± 14,4
M. album 27,5 ± 17,1 60 ± 8,2 13,8 (11,8-16,2) 21 (18,2-26,2) 0,17 ± 0,03 38 ± 20,2
M. anisopliae 100 100 4,4 (4,1-4,8) 5,7 (5,4-6,3) 0,99 ± 0,13 93 ± 11,5
M. lepidiotae 100 100 4 (3,6-4,3) 5,3 (4,8-6,0) 0,98 ± 0,15 100
M. majus 100 100 5,8 (3,8-8,4) 7,5 (6,2-16,3) 0,75 ± 0,10 100
M. flavoviride var. pemphigi 87,5 ± 25 97,5 ± 5 8 (0,1-14,8) 13 (9,2-62,4) 0,26 ± 0,04 100
M. flavoviride “type E” 17,5 ± 12,6 40± 8,1 17,9 (14,6-24,2) 28,6 (22,8-43) 0,12 ± 0,02 70 ± 26,5
M. frigidum 89,2 ± 12,5 100 6,4 (3,1-9,3) 9,9 (7,6-18,6) 0,36 ± 0,05 100
Purpureocillium carneu 97,5 ± 5 100 5,7 (1,4-10) 10,9 (7,5-23,7) 0,25 ± 0,03 100
P. lilacinum 92 ± 9,8 100 7,5 (6,8-8,1) 9,9 (9,1-11) 0,52 ± 0,07 93± 5,8
P. marquandii 22,5 ± 26,3 64 ± 4,9 12,9 (11,5-14,6) 18,3 (16,5-22) 0,23 ± 0,03 55 ± 8,6
Pochonia chlamydosporia 40 ± 21,6 85 ± 10 10,7 (9-12,6) 17,5 (15,2-21,2) 0,19 ± 0,02 95 ± 5,7
Fungos foram testados a 25°C, umidade relativa > 98% e fotofase de 12 h. Todos os valores foram baseados em
quatro repetições independentes, cada uma com 10 adultos expostos a culturas de fungos esporulados. As
mortalidades nos grupos controle não foram maiores que 15% durante os testes.
a Mortalidade relativa acumulada ± erro padrão da média (EM)
b Tempo letal para matar 50 ou 90% (TL 50/90 e seus respectivos intervalos de confiança 95% e slopes ± EM)
c Número relativo de mosquitos mortos com desenvolvimento externo de fungo (± EM) após 15 dias de exposição.
31
Manuscrito 2
Título resumido: Efeito ovicida de M. anisopliae em solo
Título: Efeitos de conídios de Metarhizium anisopliae misturados em solo contra ovos
de Aedes aegypti
32
Abstract
The effectiveness of Metarhizium anisopliae IP 46 conidia mixed with soil was
tested against Aedes aegypti eggs. Mycelium and new conidia developed first on eggs
between 4.8 and 15 days respectively after incubation of eggs on fungus-treated soils at
3.3×103 up to 3.3×105 conidia/g soil at 25°C and relative humidities close to saturation.
Fifteen days after incubation 53.3% of the eggs exposed to soil with 3.3×105 conidia/g
showed external development of mycelium and conidia. Fungus-inoculated soils (but not
untreated controls) showed some mycelial growth and sporulation apart from the eggs.
Some eggs on treated soils hatched; those larvae died and eventually showed fungal
development on their bodies. The cumulative relative eclosion of larvae after submersion
of treated eggs in water decreased from 52.2% at 3.3×103 conidia/g to 25.3% at 3.3×105
conidia/g. These findings clearly showed that A. aegypti eggs can be infected by M.
anisopliae when deposited on fungus-contaminated soil. The effectiveness of M.
anisopliae against gravid females, larvae, and also eggs of A. aegypti underscored the
possible usefulness of this fungus as a mycoinsecticide, whether naturally occurring or
artificially applied, in the breeding sites of this mosquito.
Key words: Metarhizium anisopliae; Entomopathogenic fungi; Ovicidal effect; Soil
fungi
33
1. Introdução
Aedes aegypti é um mosquito presente em países tropicais e subtropicais e é o
principal vetor da dengue, considerada a doença viral transmitida por mosquito que tem
se espalhado mais rapidamente pelo mundo (WHO 2009). Esta espécie ovipõe em
substratos como solos ou vegetações próximas à uma superfície de água (Kay et al. 2000;
Reiter 2007; Luciana S Lobo e Christian Luz comunicação pessoal). Os ovos de aedíneos
de maneira geral não são afetados pelos principais inseticidas, químicos ou biológicos,
que são utilizados (Pérez et al. 2007). Metarhizium anisopliae é um fungo
entomopatogênico largamente conhecido que ocorre com frequência em amostras de
solo. M. anisopliae IP 46, isolado de solo do centro–oeste do Brasil, em condições de
laboratório é patogênico para todos os estágios de A. aegypti, inclusive ovos (Silva et al.
2004; Luz et al. 2007; Santos et al. 2009; Leles et al. 2010). Este fungo é um agente
promissor para controle integrado de mosquitos (Mnyone et al. 2009; Leles et al. 2010;
Luz et al. 2011), e é necessário uma maior compreensão de sua efetividade e
aplicabilidade a fim de se desenvolver micoinseticidas específicos para o vetor.
Criadouros, artificiais ou naturais, com grande densidade de fêmeas, ovos e larvas
parecem ser locais adequados para a aplicação de um micoinseticida. Enquanto a
atividade larvicida e adulticida de M. anisopliae é bem conhecida (Scholte et al. 2004a),
ainda pouco se sabe sobre a atividade ovicida deste e de outros fungos contra A. aegypti.
Os ovos deste vetor foram altamente suscetíveis à infecção por IP 46 em condições de
laboratório, quando os conídios foram aplicados diretamente sobre os ovos. Esses ovos
foram colocados sobre papel filtro e incubados em umidade próxima à saturação (Luz et
al. 2007, 2008; Albernaz et al. 2009; Santos et al. 2009). O papel filtro que é utilizado
para oviposição em laboratório tem se mostrado útil como substrato para teste de
atividade ovicida com diversos fungos entomopatogênicos em laboratório (Luz et al.
2007). Contudo, este papel, parece menos adequado para aplicações em condições de
campo, já que por atividade de microrganismos se decompõem rapidamente e podem
comprometer a viabilidade dos conídios mantidos sobre ele. Solo com pouca quantidade
de matéria orgânica, que pode ser um substrato natural para ambos, conídios de M.
anisopliae e ovos de A. aegypti parece mais apropriado e estável para aplicação de
conídios que papéis filtro em campo. Este estudo avaliou a susceptibilidade de ovos de A.
aegypti à mistura de solo e conídios de M. anisopliae IP 46 em condições de laboratório.
34
2 Material e Métodos
2.1 Origem das amostras de solo: Quinhentos gramas de amostras de latossolo
vermelho foram coletadas aleatoriamente, em Terezópolis de Goiás. As amostras foram
misturadas, formando um pool de amostras. A mistura, foi peneirada com peneira de
0,59 mm de diâmetro de poro, a fim de reduzir a quantidade de matéria orgânica e, em
seguida seca em estufa de secagem a 60°C durante 6 h e autoclavada.
2.2 Origem e manutenção de mosquitos e fungos: Ovos de A. aegypti foram
obtidos à partir de criação do mosquito em laboratório segundo descrito por Silva et al.
(1998).
M. anisopliae s.l. IP 46 foi originalmente isolado de amostra de solo coletada na
região central do Brasil em 2001 e foi depositado na coleção de cultura de fungos
entomopatogênicos do IPTSP (Rocha et al. 2012). Teve sua virulência estimulada pela
infecção em adultos de A. aegypti realizada antes dos testes reportados e então reisolado
e cultivado em meio Batata Dextrose Ágar (BDA) a 25 ± 1°C, 75 ± 10% de umidade
relativa (UR) e 12 h de fotofase por 15 dias (cultura estoque). Culturas de IP 46
utilizadas nos testes foram sempre repicadas a partir da cultura estoque, cultura essa que
era renovada a cada seis meses.
2.3 Preparo das suspensões fungicas: Culturas de M. anisopliae IP 46 tiveram a
superfície raspada com o auxílio de uma espátula. O raspado foi colocado em um tubo de
vidro (30 ml), previamente autoclavado, com 10 ml de Tween 80® 0,1% e pérolas de
vidro. O tubo foi mantido em agitação por vórtex durante dois minutos e o conteúdo, em
seguida, filtrado por um chumaço de algodão adaptado em um funil de vidro, para outro
frasco, também estéril, de iguais proporções e sem conteúdo prévio. O filtrado foi diluído
em água destilada nas concentrações de 10-1, 10-2 e 10-3 e quantificado o número de
conídios em câmara de Neubauer.
2.4 Bioensaios: Seis gramas de solo foram separadas em placas de Petri, sendo, em
seguida, inoculadas com suspensão de conídios de M. anisopliae IP 46 e água destilada
nas concentrações de 3,3x103; 104; 3,3x104; 105 ou 3,3x105 conídios/g de solo e com
uma hidratação padronizada de 1,5 ml (25 % do peso seco de solo). Em seguida, o solo
tratado foi colocado em um tubo de vidro, vortexado e vigorosamente homogeneizado,
transferido novamente para uma placa de Petri e compactado com o auxílio de uma
espátula e com o fundo de um béquer de vidro (250 ml), formando uma superfície plana
e compacta. Amostras de solo do grupo controle foram tratadas com 1,5 ml de água
destilada (sem conídios) e igualmente vortexadas e compactadas. Vinte e cinco ovos de
35
A. aegypti, entre 48 – 72 h de idade foram colocados sobre a superfície plana do solo
tratado e mantido a 25 ± 1°C e umidade ≥ 98% durante 25 dias. A presença de micélio
ou de conídios, sobre os ovos ou sobre o solo, bem como a eclosão de larvas sobre o solo
foram avaliadas diariamente durante 25 dias. Após esse período os ovos foram
submersos em 20 ml de água de torneira estéril em copos plásticos descartáveis (50 ml) e
mantidos a 25 ± 1°C e umidade relativa de 70 ± 10% durante 5 dias. Para estimulação da
eclosão, os copos com os ovos foram incubados diariamente em banho maria a 37°C
durante 20 minutos e a eclosão avaliada 2 horas após a exposição dos ovos a essa
temperatura (Luz et al. 2007). As larvas eclodidas foram retiradas dos copos de teste. Em
dias alternados a água dos copos foi reposta e uma pequena porção de ração triturada
para gato (Alisul Alimento S.A., Brasil) foi polvilhada nos copos com ovos.
2.5 Análise estatísticas: Seis repetições independentes, cada uma com uma cultura
de fungo diferente, foram feitas. Dados percentuais foram transformados em arco – seno
e testados com Análise de Variância (ANOVA) seguido de teste de comparação de
Student Newman Keuls. Médias foram consideradas estatisticamente diferentes quando P
< 0,05.
3 Resultados
A emergência de micélio sobre os ovos em amostras de solo tratadas com fungo
variou entre 4,8 dias (105 conídios/g) a 7,3 dias (3,3x103 conídios/g) de incubação
(Tabela 1). A conidiogênese sobre os ovos iniciou após 9,5 dias de incubação em
amostras de solo tratadas com 105 ou 3,3x105 conídios/grama de solo. O grupo de maior
retardo na condiogênese foi o de solo tratado a 104 conídios/g, 15 dias após a incubação
(Tabela 1). O número relativo de ovos com conídios, após 15 dias de incubação, variou
entre 26% (104 conídios/g) e 53,3% (3,3x105 conídios/g). Não houve efeito significativo
da concentração de conídios sobre o número de ovos com novos conídios após 25 dias de
incubação (F4,25=1,5; p=0,24; Figura 1). Não houve desenvolvimento de micélio ou
conídios sobre ovos do grupo controle.
M. anisopliae, em crescimento vegetativo e esporulado, foi encontrado sobre a
superfície das amostras de solo em todas as concentrações, com exceção da concentração
de 104 conídios/ml. O surgimento mais rápido foi em 3,3x104 conídios/g, após 6 dias de
exposição e, o mais tardio na concentração de 3,3x103 conídios/g, após 21 dias (Tabela
1).
Não houve eclosão de larvas sobre a superfície do solo em amostras de solo do
grupo controle em até 25 dias, porém, em solos tratados com fungo, independentemente
36
da concentração, pelo menos 25% das larvas eclodiram ainda sobre o solo. As larvas
moviam sobre a superfície, morriam em algumas horas e, eventualmente, apresentavam
crescimento de conídios sobre seu corpo. Esse tipo de eclosão ocorreu entre 7,2 dias
(3,3x105 conídios/g) e 13,3 dias (3,3x103 conídios/g) (Tabela 1).
Após a submersão dos ovos em água a eclosão iniciou imediatamente, e após 5 dias,
a eclosão acumulativa foi maior no grupo controle (68,6%) e significativamente diferente
da eclosão observada nos grupos tratados com fungo (F4,30= 4,1; p=0,005; Figura 2),
independentemente da concentração de conídios. A eclosão acumulativa para os ovos
mantidos em solos tratados com conídios decresceu de 52,2% (3,3x103 conídios/g) até
25,3% (3,3x105 conídios/g), sem efeito significativo da concentração de conídios na
eclosão quantitativa (F4,25=0,5; p=0,75; Figura 2).
4 Discussão
Os resultados mostraram que os ovos de A. aegypti podem ser infectados por M.
anisopliae IP 46 quando colocados em solo contendo conídios. Solo, principalmente
quando úmido, próximos a criadouros, é um substrato atrativo à oviposição por fêmeas
de A. aegypti e outros mosquitos (Huang et al. 2005; Luciana S Lobo & Christian Luz,
comunicação pessoal). A concentração de conídios no solo parece não interferir no efeito
ovicida, o que possivelmente ocorreu devido a esporulação do fungo sobre o solo, que
aumentou o número de conídios para além do que foi aplicado, especialmente na
superfície, onde os ovos foram colocados. As amostras de solo foram esterilizadas antes
dos testes para eliminar a interferência da microbiota existente sobre o efeito de M.
anisopliae. Este e outros fungos entomopatogênicos são eventualmente afetados por
outros microrganismos que estão no mesmo habitat quando se desenvolvem como
saprobiontes em matéria orgânica. Em condições normais de campo, com toda a
microbiota íntegra, um efeito da concentração de conídios presentes no solo sobre a
redução da eclosão de larvas viáveis de A. aegypti é esperado. O efeito ovicida de M.
anisopliae contra A. aegypti, quando os conídios foram misturados em solo foi
aparentemente menor que o efeitio com tratamento direto de ovos com suspensão de
conídios do mesmo fungo (Luz et al. 2007, 2008; Albernaz et al. 2009; Santos et al.
2009). Como no presente estudo os conídios foram aplicados e uniformemente
misturados em solo, a real dose à qual os ovos foram expostos, de maneira indireta, foi
bem menor do que com a aplicação direta do fungo sobre os ovos, conforme estudos
anteriores avaliaram. A compactação mecânica do solo e o arranjo dos ovos sobre a
superfície lisa provavelmente impediu o desenvolvimento dos conídios que estavam
37
abaixo da linha superficial, possivelmente devido a falta de aeração, que reduziu ainda
mais exposição efetiva dos ovos ao fungo. A ação ovicida de M. anisopliae pode ser
ainda maior quando os ovos forem depositados em solo não compactado.
Não se sabe ao certo como a presença do fungo estimula a eclosão de larvas sobre o
solo tratado, antes da submersão dos ovos na água. É possível que larvas dentro dos ovos
possam ser afetadas pelo desenvolvimento fúngico na superfície dos ovos e, o fungo,
pode de alguma forma adiantar a eclosão das larvas.
M. anisopliae é um fungo que ocorre naturalmente em solo, onde pode
eventualmente contaminar e infectar ovos e adultos de mosquitos em contato com esse
solo (Rocha et al. 2012). Este e outros fungos entomopatogênicos presentes em solo
possivelmente são antagonistas naturais de A. aegypti e outros mosquitos. Ovos com
fungo ou adultos infectados que possam disseminar conídios a locais onde os mesmos
possam eventualmente morrer, irão aumentar o inóculo de conídios em locais que sejam
atrativos às fêmeas. O contato físico com os conídios é essencial para a infecção por
fungo; os ovos que continham larvas viáveis e que eclodiram rapidamente após a
submersão em água provavelmente não foram infectados. Espera-se que maiores
concentrações de conídios no solo aumentem a atividade do fungo. Fêmeas contaminadas
ou infectadas podem ainda disseminar conídios aos machos durante a cópula, conforme
já observado em anofelíneos com M. anisopliae (Scholte et al. 2004b). Testes recentes
corroboram a ideia de que fêmeas de A. aegypti não são repelidas pela presença de
conídios de M. anisopliae, tanto em laboratório quanto em campo (Luciana S Lobo &
Christian Luz, comunicação pessoal).
O presente estudo pode ser considerado o primeiro passo na caracterização da
interação entre ovos de aedíneos e conídios de M. anisopliae nas complexas relações de
campo e sinaliza o potencial de micoinseticidas como agentes de controle integrado de A.
aegypti.
5 Agradecimentos
Os autores agradecem ao Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos e
Xenodiagnóstico pela criação de A. aegypti e Richard Humber (USDA-ARS, Ithaca, NY,
USA) pela revisão crítica do manuscrito. O trabalho foi financiado pela Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG, 201010267000250).
38
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40
Tabela 1: Dias até a emergência de micélio ou novos conídios de Metarhizium anisopliae IP 46 sobre ovos
de Aedes aegypti ou solo, e dias até a eclosão de larvas em solo após exposição de ovos em solo tratado com
conídios de IP 46 em diferentes concentrações.
Inóculo
(conídios/g)
Ovos com novos Solo com novo micélio
ou conídio
Eclosão prematura na
superfície do solo
Micélio Conídios
(Dias de incubação após inoculação)
0 - - - -
3,3x103 7,3±0,8 14,6±1,3 21±4 13,3±5,3
104 7±0,7 15±1,6 - 10
3,3x104 5,5±0,8 11,2±2,3 6±1 9,6±2
105 4,8±0,5 9,5±1,4 6,5±0,5 11,2±1,5
3,3x105 5±0,4 9,5±1,3 11±6 7,2±0,4
Médias baseadas em seis repetições com 25 ovos em cada concentração. Os testes foram realizados a 25° C e
umidade relativa >98%.
41
Figura 1: Número relativo de ovos de Aedes aegypti com conídios
após a exposição de ovos sobre solo tratado com Metarhizium
anisopliae IP 46 em diferentes concentrações de conídios e
incubação a 25°C e umidade relativa >98% por 25 dias.
42
Figura 2: Eclosão relativa de larvas de Aedes aegypti após a submersão
de ovos previamente expostos em solo tratado com Metarhizium
anisopliae IP 46 em diferentes concentrações de conídios e incubação a
25°C por 5 dias.
43
Manuscrito 3
Título resumido: Método para detecção de Metarhizium sp em mosquitos
Título: Desenvolvimento de um método para detecção de Metarhizium sp em mosquitos
infectados
44
Abstract
A method for isolation of Metarhizium sp from infected arthropods is proposed. The
effect of cloramphenicol, thiabendazole, deltamethrin, cristal violet and varied pH
associated with SDAY media in Metarhizium anisopliae development was evaluated.
Thiabendazole and cristal violet, respectively, in concentrations higher than 12 and 15
mg/l had an inhibition in Metarhizium anisopliae colony forming units (CFU) effect. The
medium proposed was named as Leles media and was manufactured by 1% water agar
amended with 1000 mg/l of cloramphenicol, thiabendazole 8 mg/l, deltamethrin 50 mg/l,
violet cristal 10 mg/l and pH adjusted to 5.5. Dead A. aegypti mosquitoes, killed by M.
anisopliae infection, and contaminated with Aspergillus flavus, Mucor plumbeus and
Mortierella isabellina kept on Leles media did not avoid the isolation of the
entomopathogenic fungus, but the presence of Rhizopus arrhizus made the M. anisopliae
isolation impossible, even on the media. There was no bacteria contamination by
Klebsiella pneumonia ATCC 700603; Staphylococcus aureus ATCC 25923 or
Escherichia coli ATCC 25922 and ATCC 35218 in SDAY amended with the same
adjuvants of Leles media in the same concentrations. Fifty nine fungi, including three
isolates of the entomopathogenic fungus Metarhizium sp, were isolated from 212 alive
culicid larvae and adults collected in Goiania, Brazil and kept on Leles media surface.
Besides of the Metarhizium, another 56 saprobiontic fungi, especially from the genera
Mucor, Aspergillus, Penicillium and Cladosporium were isolated as well. There were
only four fungal cultures, isolated from mosquito captured in the field, contaminated by
bacteria.
Key words: Semi selective media; Entomopathogenic fungus isolation; Metarhizium
anisopliae; Contaminant
45
1. Introdução
Aedes aegypti é o principal vetor da dengue em países de clima tropical e subtropical
e, considerado pela Organização Mundial de Saúde como o mosquito vetor de mais
rápida expansão no mundo (WHO 2009). Pela falta de vacina contra a dengue, o combate
à doença é centralizado no controle do vetor. Contudo, a expansão de populações desse
mosquito resistentes aos inseticidas mais usados no combate é notória (Eisen et al. 2009).
Novas formas de controle do vetor são necessárias, e, o uso de fungos
entomopatogênicos tem sido estudado e demonstra potencial (Scholte et al, 2004). Os
fungos podem causar a morte das larvas (Alves et al., 2002; Silva et al., 2004), bem
como dos adultos (Blanford et al., 2005; Scholte et al., 2005, 2007; Leles et al. 2010) e
dos ovos desses insetos (Luz et al., 2007a, 2008; Leles et al. 2012). Espécies ou cepas de
fungos ainda mais virulentas podem estar presentes no meio ambiente, infectando
naturalmente insetos, com propágulos misturados à matéria orgânica ou ao solo, sem
ainda serem isolados e identificados. O isolamento de fungos a partir de amostras do
campo, normalmente é realizado por duas técnicas, meios semi–seletivos (Tsao 1970) ou
o uso de “insetos isca” em laboratório (Zimmermann 1986), ambas com alta detecção
para Metarhizium anisopliae (Keller et al. 2003). Meios semi–seletivos foram descritos
para isolamento de fungos entomopatogênicos a partir de solo, muitos deles com dodine
em sua composição (Chase et al. 1986; Liu et al. 1993; Keller et al. 2003; Hughes et al.
2004; Luz et al. 2004; Rangel et al. 2010) contudo, o dodine é hoje um fungicida de
difícil acesso e de toxicidade aguda elevada (EPA 2005). Outros meios semi–seletivos,
com adição de tiabendazol como fungicida, em substituição ao dodine, têm sido
propostos para o isolamento de Culicinomyces clavisporus (Panter & Frances 2003) e
também para Beauveria spp e Metarhizium spp (Luz et al. 2007b; Fernandes et al. 2010).
O tiabendazol é considerado por Luz et al. (2007b) o fungicida mais indicado para meios
semi-seletivos, com alta inibição de contaminantes e boa tolerância por parte de muitos
fungos entomopatogênicos. Apesar do uso de fungicidas e antibióticos, a inoculação de
amostras de solo, que estão associadas a diversos propágulos de fungos não patogênicos
e de bactérias em geral, associada à presença de nutrientes no meio, leva ao crescimento
de um grande número de contaminantes tornando difícil o isolamento de
entomopatógenos. O presente trabalho propõe o desenvolvimento de um método de
detecção de fungos entomopatogênicos em insetos infectados, mantidos em meio ágar-
água enriquecido com antibiótico, fungicida e inseticida, o que diminue a interferência de
contaminantes e maximiza o isolamento de entomopatógenos.
46
2. Material e métodos
2.1 Origem e obtenção dos microrganismos: O fungo entomopatogênico usado
nos testes para desenvolvimento do meio foi M. anisopliae s.l. IP 46, isolado de solo no
estado de Goiás, Brasil (Rocha et al. 2012), cultivado em meio de batata, dextrose e ágar
(BDA). Outros fungos, considerados não entomopatogênicos, utilizados em testes de
inibição com o meio foram: Aspergillus flavus IP 237; Mortierella isabelina IP248;
Mucor plumbeus IP 250 e Rhizopus arrhizus IP 251, todos isolados a partir de substrato
presente em ocos de árvores, prováveis criadouros de mosquitos em ambiente
extradomiciliar e, mantidos em BDA. Para os testes de inibição de bactérias
contaminantes foram utilizadas as bactérias Klebsiella pneumonia ATCC 700603;
Staphylococcus aureus ATCC 25923 e duas cepas diferentes de Escherichia coli ATCC
25922 e ATCC 35218, todas bacterias de referência internacional e comercialmente
disponíveis (www.atcc.org), mantidas em meio Sabouraud dextrose ágar acrescido de
extrato de levedura (SDAL).
2.2 Origem e obtenção dos mosquitos: A. aegypti adultos, entre 2–3 d de vida,
foram obtidos a partir de criação, com metodologia já descrita e padronizada por Silva et
al. (1998). Amostras coletadas no campo para avaliação do meio em desenvolvimento
foram obtidas a partir da coleta ativa de larvas e adultos de culicídeos em casas e parques
em diferentes localidades urbanizadas da cidade de Goiânia, Brasil.
2.3 Preparo dos meios:
2.3.1 Meio Batata Dextrose Ágar (BDA): Batatas (170 g) foram descascadas,
cortadas em pequenos pedaços e autoclavadas em 1.000 ml de água deionizada. Após
resfriamento, a infusão de batata foi filtrada por peneira e o volume do filtrado foi
completado para 1.000 ml. Em seguida foi novamente aquecido até 60°C e mantido em
constante agitação a 500 rpm. Com o filtrado em agitação foi acrescentado 20 g de
dextrose e 18 g de ágar. O pH do meio foi ajustado em 7 por adição balanceada de
soluções de hidróxido de sódio e/ou ácido clorídrico. O meio foi então autoclavado por
20 min e distribuídos em placas de Petri (90x15 mm).
2.3.2.1 Meio Sabouraud Dextrose Ágar + Extrato de Levedura (SDAL): Um
litro de água destilada foi aquecido até 60°C e mantido em constante agitação em
agitador magnético a 500 rpm. Em seguida, foi adicionada à água 10 g de peptona, 40 g
de dextrose, 2 g de extrato de levedura, 15 g de ágar, e o pH ajustado em 7. O meio foi
autoclavado por 20 min e distribuído em placas de Petri (90 x 15 mm).
47
2.3.2.2 Meio SDAL modificado: Meios SDAL também foram preparados, com
diferentes índices de pH, ou com incremento de cristal violeta, cloranfenicol,
deltametrina ou tiabendazol (Figura 1). Para a variação de pH, o meio foi preparado
exatamente como segue o protocolo acima, aliquotado em 100 ml e diferentes ajustes do
pH foram feitos em cada alíquota, variando entre 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 e 6,5 (Figura 1).
Meios SDAL + cristal violeta ou SDAL + deltametrina foram preparados da mesma
maneira como citado anteriormente, porém, antes do ajuste de pH e da esterilização,
foram aliquotados em 100 ml. Em cada alíquota foi acrescido, separadamente e sob
constante agitação do meio, cristal violeta (Cloreto de Hexametilpararosalina, Cromato
Produtos Químicos, Brasil) até as concentrações de 2,5; 5; 10; 15 e 20 mg/l; ou
deltametrina (k-othrine CE 25, Bayer CropScience, Brasil) até as concentrações de 15;
25; 35; 50 e 75 mg/l. Feito isso o pH de cada alíquota foi ajustado em 7 e o meio
autoclavado (Figura 1).
Para o meio SDAL + cloranfenicol (Oficinal, Brasil), uma solução do antibiótico foi
previamente preparada em etanol absoluto, para melhor diluição. A solução etanólica de
cloranfenicol foi adicionada nas alíquotas de SDAL, em constante agitação, até as
concentrações de 250; 500; 1000; 1500 e 2000 mg/l e em seguida o pH ajustado em 7 e o
meio autoclavado.
O SDAL + tiabendazol (Nortec Química, Brasil), foi preparado semelhante ao de
cloranfenicol, também previamente diluído em etanol, seguido pelo incremento da
solução etanólica de tiabendazol até as concentrações de 8; 10; 12; 14 e 16 mg/l e então
feito o ajuste do pH em 7 e a esterilização (Figura 1).
2.3.3 Ágar–água acrescido de cloranfenicol, cristal violeta, tiabendazol e
deltametrina (meio Leles): O meio Leles foi preparado em água destilada a 60°C
mantida em constante agitação em um agitador magnético a 500 rpm. Foram
acrescentados à água, cristal violeta e deltametrina nas concentrações de 10 mg e 50
mg/l, respectivamente. Soluções etanólicas de tiabendazol e cloranfenicol foram
preparadas separadamente e acrescentadas ao meio em preparo nas concentrações
respectivas de 8 mg e 1000 mg por litro de meio. Em seguida foi acrescentado ágar na
concentração de 10 g/l de meio, o pH foi ajustado em 5,5 e então, o meio, foi
autoclavado e plaqueado.
2.4 Preparo de suspensões fúngicas e bacterianas: Culturas dos fungos utilizados,
independente da espécie, tiveram a superfície raspada com o auxílio de uma espátula. O
raspado foi colocado em um tubo de vidro (30 ml), previamente autoclavado, com 10 ml
48
de Tween 80® 0,1% e pérolas de vidro (5 mm de diâmetro). O tubo foi mantido em
agitação por vórtex durante dois minutos e o conteúdo, em seguida, filtrado por um
chumaço de algodão adaptado em um funil de vidro, para outro frasco, também estéril,
de iguais proporções e sem conteúdo prévio. O filtrado foi diluído em água destilada nas
concentrações de 10-1, 10-2 e 10-3 e quantificado o número de conídios em câmara de
Neubauer.
As suspensões de bactérias foram preparadas de maneira similar a de fungos. Em
uma câmara de fluxo laminar previamente limpa e mantida sob luz ultravioleta por 30
minutos, foi coletado do meio de cultivo um raspado da colônia de cada bactéria.
Separadamente, esses raspados foram colocados em tubos de vidro com 10 ml de solução
fisiológica, previamente autoclavada, e vortexado por dois minutos. Dessas suspensões
foram preparadas três diluições, nas concentrações de 10-1; 10-2 e 10-3 para a
quantificação de bactérias na suspensão. Após quantificado, foi preparado suspensões de
cada bactéria a 2,6x103 bactérias/ml, à partir de diluição da suspensão mãe com solução
salina.
2.5 Teste de susceptibilidade de IP 46 aos aditivos químicos: Cem microlitros de
suspensão de conídios de M. anisopliae IP 46 a 2,6x103 conídios/ml foram aplicados,
com uma micropipeta, sobre a superfície de meios de cultura previamente preparados:
SDAL; SDAL + cloranfenicol (500; 1000; 1500; 2000 e 2500 mg/l); SDAL +
tiabendazol (8; 10; 12; 14 e 16 mg/l); SDAL + cristal violeta (2,5; 5; 10; 15; 20 mg/l);
SDAL + deltametrina (15; 25; 35; 50 e 75 mg/l) todos com pH 7 e SDAL sem aditivos
com pH 4,5; 5; 5,5; 6 e 6,5. Depois de aplicada, a suspensão foi espalhada pela superfície
do meio com o auxílio de uma alça de “Drigalski” seguido de movimentos circulares,
totalizando dez conídios por cm2. As placas foram incubadas a 25 ±1°C; UR 70 ± 10% e
12 h de fotofase e, as “unidades formadoras de colônias” (UFC) quantificadas
diariamente durante 10 dias. O número de UFC’s contadas nos meios SDAL +
cloranfenicol; SDAL + tiabendazol; SDAL + cristal violeta; SDAL + deltametrina e
SDAL com pH variável foi comparado (conforme a fórmula abaixo representada) à
quantidade de UFC’s no meio SDAL sem aditivos e com pH 7 (controle), e expresso de
maneira relativa, podendo inclusive ultrapassar o valor de 100% em caso de um possível
estímulo de desenvolvimento, comparado ao meio de referência. Os testes tiveram seis
repetições independentes, cada um utilizando meios preparados em dias diferentes e com
diferentes culturas de fungo.
49
2.6 Inibição de bactérias sobre o meio SDAL modificado: Cem microlitros de
cada uma dessas suspensões foram aplicados na superfície das placas com meio SDAL
acrescido de 10 mg/l de cristal violeta; 1000 mg/l de cloranfenicol; 8 mg/l de
tiabendazol, 50 mg/l de deltametrina e pH ajustado em 5,5. As suspensões foram
espalhadas homogeneamente, com uma alça de “Drigalski” associado a movimentos
manuais circulares com a placa, atingindo a concentração de 10 bactérias/cm2. O grupo
controle foi realizado com a aplicação de solução fisiológica estéril sobre meio SDAL
modificado, iguais ao preparado para o grupo teste. As placas de referência continham o
meio SDAL sem modificações, inoculados com as suspensões de bactérias. As placas
foram mantidas a 25 ±1°C; UR 70 ± 10% e 12 h de fotofase, o número de UFC’s foi
contado diariamente, durante 10 dias. O resultado foi expresso em valores relativos da
quantidade de UFCs no SDAL modificado em função do número de UFCs em meio de
referência.
2.7 Desenvolvimento de IP 46 sobre larvas e adultos mortos de A. aegypti
infectados, mantidos sobre o meio Leles: Dez larvas de quarto estádio de A. aegypti,
com 24 h de jejum, foram colocadas em 10 ml de suspensão de conídios de IP 46 a 107
conídios/ml, preparada em Tween 80® 0,01%. As larvas foram mantidas em suspensão
até que morressem ou por até 48 h. Cinqüenta adultos do mosquito foram colocados em
copos de polietileno (V= 500 cm3; A =353,3 cm2) previamente tratados com conídios
secos de IP 46 a 107 conídios/ cm2. Os adultos foram mantidos nos copos tratados,
alimentados com água açucarada (6% de sacarose) ad libitum, até a morte ou por até 48
h. Para o grupo controle, as larvas foram mantidas em Tween 80® 0,01% e os adultos em
copos de polietileno sem tratamento e com igual oferta de água açucarada, durante 48 h.
Larvas e adultos após serem submetidos ao tratamento com os conídios, ou oriundos do
grupo controle, foram sacrificados a -4°C e, em seguida, colocados sobre a superfície do
meio Leles e mantidos em câmara úmida a 25 ± 1°C durante 10 d. A observação de
presença de conídios de IP 46 sobre os mosquitos mortos foi realizada visualmente em
microscópio esteroscópico diariamente. Os resultados foram avaliados em quatro
repetições independentes, de maneira relativa, pela porcentagem de mosquitos mortos
com conídios.
2.8 Avaliação na redução de fungos contaminantes em mosquitos infectados
com IP 46, mantidos em meio Leles: Mosquitos foram infectados experimentalmente
50
com M. anisopliae IP 46 e mortos. Para tal, um copo plástico teve sua superfície interna
(353,3 cm2, incluindo a superfície interna da tampa) tratada com 3,6 x 109 conídios secos
de IP 46 (107 conídios/cm2). Pequenos furos foram feitos na parede do copo para
circulação de ar e um orifício maior na tampa. Cinquenta A. aegypti adultos, entre 24 e
48 h de vida, não sexados, foram colocados dentro do copo, com a ajuda de um
capturador de “Castro”, através do orifício feito na tampa. O orificío foi mantido fechado
por um chumaço de algodão umido com solução açucarada (6% de sacarose). O copo
com os mosquitos foi mantido a 25 ± 1°C; UR 70 ± 10% e 12 h de fotoperíodo até a
morte de todos os mosquitos, sendo que o algodão com água açucarada foi trocado
diariamente. Mosquitos do grupo controle foram mantidos em copo de iguais
características, porém sem conídios.
Após a morte de todos os mosquitos tratados com fungo, os mosquitos do grupo
controle foram sacrificados a – 4°C. Os mosquitos foram descontaminados, primeiro
mosquitos do grupo controle e depois os do grupo tratado, por submersão sequencial em
etanol 70°GL, solução de hipoclorito de sódio 1% e em três béqueres, sequencialmente,
com água destilada, 30 segundos em cada. Em seguida, os mosquitos mortos, foram
divididos em 4 grupos, com 25 mosquitos cada. Os grupos foram submersos nas
suspensões de conídios dos fungos: A. flavus (IP 237), ou M. isabellina (IP 248), ou M.
plumbeus (IP 250), ou R. arrhizus (IP 251) nas concentrações de 107; 106; 105; 104 ou
103 conídios/ml. Foram imersos cinco mosquitos mortos em cada concentração, de uma
espécie de fungo, durante 30 segundos. Depois de imersos, os mosquitos foram
transferidos para a superfície do meio Leles. Mosquitos do grupo controle não foram
expostos a nenhum fungo contaminante e foram colocados diretamente sobre o meio
Leles. Todos os mosquitos mortos, tratados com fungo ou controle, foram mantidos a 25
±1°C; UR 70 ± 10% e 12 h de fotoperíodo. O desenvolvimento de fungo sobre os
mosquitos foi avaliado diariamente em microscópio esteroscípico, durante 10 dias. Foi
contado o número relativo de mosquitos mortos que apresentaram desenvolvimento
somente do fungo contaminante ou do fungo infectante (IP 46) ou desenvolvimento de
ambos os fungos, bem como o tempo para o aparecimento dos conídios dos fungos
contaminantes e infectantes.
2.9 Isolamento de fungos entomopatogênicos em larvas e adultos de culicídeos
coletados em campo: Foram coletados semanalmente, entre os meses de fevereiro e
dezembro do ano de 2011, larvas e adultos de culicídeos, totalizando 212 amostras. Os
locais de coleta foram parques, lixões, ferro velho, domicílios e peridomicílios, em
51
diversas regiões da cidade de Goiânia. Os habitats de coleta mais frequentes para larvas
foram água empoçada no chão, latas e plásticos descartáveis, lona, assoalho de carro e
em subsolo de prédios em construção, normalmente misturados com substrato de solo.
Adultos foram coletados em intradomicílios e em campo aberto de ferro velho, lixões,
parques ou em subsolo de construções. Para a coleta de larvas foram utilizadas pipetas
descartáveis ou redes de malha, feitas de uma tela de filó e os adultos foram coletados
com capturador de Castro ou puçá. As amostras foram colocadas em tubos plásticos, tipo
eppendorf, previamente autoclavados, as larvas na água coletada no criadouro e os
adultos individualmente. Em seguida, as larvas foram lavadas em água destilada e os
adultos adormecidos em baixa tempetura (-4°C) por 20 minutos. Foram então colocados,
ainda vivos, sobre a superfície do meio Leles e mantidos, por até 15 d, a 25 ±1 °C e
umidade saturada. A inspeção da presença de fungos sobre os insetos foi feita
diariamente e o repique dos fungos realizados em BDA.
3 Resultados
3.1 Susceptibilidade de IP 46 aos aditivos químicos: M. anisopliae IP 46 teve uma
relação de UFC, comparada ao grupo controle, maior que 80% quando exposto a
cloranfenicol e a deltametrina em qualquer concentração testada, e a SDAL preparado
em qualquer pH entre 4,5 e 6,5 (Figura 2). Houve redução considerável de IP 46 no
número de UFC quando cultivado em meio com tiabendazol, acima de 12 mg/l e a cristal
violeta acima de 15 mg/l (Figura 2).
3.2 Inibição de bactérias sobre o meio SDAL modificado: K. pneumonia; S.
aureus e E. coli desenvolveram colônias em SDAL ajustado em pH 7 contudo, não
tiveram desenvolvimento de nenhuma unidade formadora de colônia em SDAL na
presença de cloranfenicol, tiabendazol, cristal violeta, deltametrina e em pH 5,5.
3.3 Desenvolvimento de IP 46 em larvas e adultos de A. aegypti infectados,
mantidos em meio Leles e avaliação na redução de fungos contaminantes: Todos os
mosquitos, adultos e larvas, que foram tratados com M. anisopliae IP 46, e em seguida
colocados sobre o meio Leles tiveram desenvolvimento de conídios do entomopatógeno
sobre o inseto morto. Mosquitos que foram mortos com conídios de IP 46 e, em seguida
tratados com conídios dos fungos A. flavus IP 237, M. isabellina IP 248, M. plumbeus IP
250 ou R. arrhizus IP 251, tiveram padrões variados de desenvolvimento de IP 46 e de
conídios de não entomopatogênicos (Figura 3). Em tratamento misto de IP 46 e M.
isabellina, em praticamente todas as concentrações 80% ou mais dos mosquitos mortos
tiveram conídios apenas de M. anisopliae sobre o corpo, com exceção do tratamento na
52
concentração de 104 conídios/ml de M. isabellina, na qual cerca de 60% tinham conídios
apenas de M. anisopliae (Figura 4A) e os demais, conídios de ambos fungos IP 46 e IP
248 (Figura 3; Figura 4C). Mais de 80% dos mosquitos mortos por IP 46 tratados em
seguida com A. flavus, na menor concentração tiveram apenas conídios de M. anisopliae.
Nas demais concentrações entre 40 e 50% dos mosquitos mortos apresentaram apenas
conídios de IP 46, entre 30 e 40% tinham condíos dos dois fungos (Figura 4B) e
eventualmente (entre 5 e 15%) apenas conídios de A. flavus (Figura 3). Nos tratamentos
combinados de IP 46 e M. plumbeus, entre 40 e 50% dos mosquitos mortos tinham
conídios de ambos os fungos (Figura 4D e 4E), exceto na concentração mais alta do
tratamento com M. plumbeus (107 conídios/ml) onde cerca de 70% dos mosquitos tinham
apenas conídios do fungo contaminante (Figura 3). Ainda no tratamento combinado de
IP 46 e IP 250 foram observados mosquitos mortos apenas com conídios de M.
anisopliae somente nas três menores concentrações de M. plumbeus, variando
percentualmente entre 60% do total de mosquitos mortos na menor concentração de IP
250 (103 conídios/ml) e 20% do total dos mosquitos mortos, quando tratados a 105
conídios/ml (Figura 3). Os mosquitos mortos por IP 46 e tratados com R. arrhizus,
tiveram entre 40 e 80% dos mosquitos mortos apenas com conídios de R. arrhizus,
crescente de acordo com a concentração do tratamento com contaminante (Figura 3).
Não houve, neste tratamento, mosquitos mortos apenas com conídios de M. anisopliae
(Figura 3), sendo, R. arrhizus, o único dos fungos contaminantes que inviabilizou o
isolamento de M. anisopliae. (Figura 4F).
3.4 Isolamento de fungos em larvas e adultos coletados em campo: Dentre as 212
amostras coletadas, foram isolados 57 fungos, três deles do gênero Metarhizium. Em 8
amostras ocorreram contaminação por bactérias (Tabela 1). Os gêneros de fungos
contaminantes mais encontrados foram Mucor, Penicillium, Aspergillus e Cladosporium
e, eventualmente Rhizopus e Fusarium (Tabela 1). Os três isolados de Metarhizium
foram obtidos de larvas coletadas em amostras de solo alagadiço.
4 Discussão
Dentre os adjuvantes propostos para uso em um ambiente seletivo para isolamento
de fungos entomopatogênicos, conforme já esperado, o tiabendazol foi o de maior
inibição para M. anisopliae em concentrações acima de 12 mg/l. Contudo, de acordo com
estudos anteriores, o tiabendazol na concentração de 4 mg/l é capaz de inibir uma grande
gama de fungos contaminantes em meios semi-seletivos (Luz et al. 2007b). Outro
químico que demonstrou redução no desenvolvimento de IP 46 foi o cristal violeta, que
53
sabidamente tem efeito de redução no crescimento de fungos (Stewart et al. 1977), teve
influência sobre IP 46 principalmente em concentrações acima de 15 mg/l. Já o
antibiótico cloranfenicol, sobretudo em suas mais altas concentrações, não interferiu no
número de UFCs de IP 46, inclusive no grupo tratado foi observado maior quantidade de
unidades formadoras de colônia do que no grupo controle, embora a diferença não tenha
significado estatístico (Figura 2). A presença de deltametrina, bem como diferentes
variações no pH em meio SDAL, não influenciaram de maneira significativa o
desenvolvimento de M. anisopliae. O meio Leles foi proposto com estes adjuvantes em
concentrações que não comprometeram de modo significativo o desenvolvimento de IP
46, embora as dosagens, especialmente de cloranfenicol e tiabendazol, possam ser
ajustadas de acordo com a necessidade da pesquisa. As altas concentrações de
tiabendazol e cloranfenicol se justificam especialmente pela diferença da forma de
exposição dos contaminantes ao meio. No meio proposto pelo presente estudo, a
exposição dos prováveis contaminantes é indireta, visto que não necessariamente
estariam em contato direto com a superfície do meio, exigindo maiores concentrações do
fungicida, antibiótico ou inseticida. A deltametrina seria um adjuvante de escolha que
não se mostrou tóxico a IP 46 e, outros trabalhos evidenciaram ação de sinergismo entre
M. anisopliae e B. bassiana com a deltametrina (Bahiense et al. 2004; Bahiense et al.
2006). O acaricida pode ser utilizado, em meio seletivo ou em meio de cultura para a
inibição de ácaros, que por sua vez, geram grandes danos às coleções de fungos. O meio
se mostrou compatível com o desenvolvimento de M. anisopliae, quando há infecção
pelo fungo, e determinou, em laboratório, a redução de possíveis fungos e bactérias
contaminantes que podem estar presentes nas amostras. Em atividade de campo foi
observado o surgimento de outros fungos não entomopatogênicos nas amostras
coletadas, contudo, todos os mosquitos se encontravam vivos e ativos no momento da
coleta e provavelmente a minoria deles estaria com alguma infecção fúngica e, mesmo
assim foram isoladas amostras de Metarhizium sobre larvas de mosquitos e foi observado
uma baixa taxa de contaminação por bactérias nos isolamentos. Dentre tantos meios
semi–seletivos propostos, o meio Leles vem com a idéia de praticidade e aplicação direta
em campo, com a possibilidade de uso no momento da coleta, sem maiores necessidades
de transporte e acondicionamento das amostras, podendo ser levado ao campo e utilizado
de maneira prática para facilitar o isolamento de fungos entomopatogênicos.
54
5 Agradecimentos
Agradecimentos ao Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos e
Xenodiagnóstico pela criação dos mosquitos, ao Departamento de Vigilância em Saúde
Ambiental da Secretaria Municipal de Saúde de Goiânia por viabilizar as coletas em
campo e ao apoio financeiro proporcionado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do
Estado de Goiás (FAPEG, 201010267000250).
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57
Figura 1: Esquema da preparação do meio Sabouraud dextrose ágar com extrato de
levedura (SDAL) com diferentes ajustes de pH ou diferentes concentrações de cristal
violeta (CV), deltametrina (D), cloranfenicol (Cl) e tiabendazol (T).
58
Figura 2: Quantidade relativa de unidades
formadoras de colônia (UFC) de Metarhizium
anisopliae IP 46 em meio SDAL modificado,
em função do número de UFC em SDAL com
pH ajustado em 7, após 10 d a 25 ± 1°C e
umidade relativa de 70 ± 10%. O efeito da
concentração foi avaliado para cada químico
por ANOVA (α ≤ 5%), seguido de teste de
Student Newman Keuls, letras diferentes (A,B)
evidenciam o efeito.
59
Figura 3: Adultos de Aedes aegypti mortos por Metarhizium anisopliae IP 46 e
posteriormente expostos a fungos contaminantes e examinados em microscópio
estereoscópico, destacando-se a porcentagem de mosquitos mortos com conídios de M.
anisopliae isoladamente, do contaminante ou de ambos no mesmo mosquito, após 10
dias de incubação a 25° ±1°C e umidade próxima de saturação.
60
Figura 4: Adultos de Aedes aegypti mortos somente com conídios de Metarhizium
anisopliae sobre o corpo (A), com conídios de M. anisopliae e Aspergillus flavus (B), M.
anisopliae e Mortierella isabellina (C), Mucor plumbeus associado a M. anisopliae (D e
E) e, mosquitos mortos somente com conídios de Rhizopus arrhizus (F).
61
Tabela 1 Isolamento de fungos em larvas e adultos de mosquitos, coletados na cidade de Goiânia e mantidos em meio Leles* por até 15 dias
(25 ± 1°C; UR 70 ± 10%). Identificação das amostras, bem como a data (DD/MM/AA), local de coleta e tipo do criadouro, estágio do material
coletado, identificação do mosquito e do fungo isolado.
Amostra Data Local – Setor (lat;long) Criadouro Estágio Mosquito Identificação
R 3 18/02/11 Jardim (Jd.) Novo Mundo (-16.675086,-
49.21566)
Água de chuva Larva Culicidae Mucor sp.
R 4 I 18/02/11 Jd. Novo Mundo (-16.675086,-49.21566) Água de chuva Larva Culicidae Penicillium sp
R 4 II 18/02/11 Jd. Novo Mundo (-16.675086,-49.21566) Água de chuva Larva Culicidae Aspergillus sp
R 7 18/02/11 Jd. Novo Mundo (16.675086,-49.21566) Peridomicílio Adulto Aedes sp Aspergillus sp
R 8 18/02/11 Jd. Novo Mundo (-16.675086,-49.21566) Caixa de esgoto Larva Culicidae Mucor sp
R 9 18/02/11 Jd. Novo Mundo (-16.675086,-49.21566) Intradomicílio Adulto Culex sp Mucor sp
R 12 04/03/11 Pq. Industrial (-16.685158,-49.357581) Intradomicílio Adulto Aedes sp Cladosporium sp
R 15 04/03/11 Centro de Zoonoses (-16.728605,-49.160728) Intradomicílio Adulto Aedes sp Aspergillus sp
R 17 04/03/11 Pq. Industrial (-16.685158,-49.357581) Intradomicílio Adulto Aedes sp Penicillium sp
R 26 04/03/11 Pq. Industrial (-16.685158,-49.357581) Intradomicílio Adulto Aedes sp Contaminação bacteriana
R 30 04/03/11 Centro de Zoonoses (-16.728605,-49.160728) Intradomicílio Adulto Aedes sp Aspergillus sp
R 32 04/03/11 Pq. Industrial (-16.685158,-49.357581) Intradomicílio Adulto Aedes sp Contaminação Bacteriana
R 34 11/03/11 Vila Santa Rita (-16.680102,-49.321597) Descartáveis (latas e
plásticos)
Larva Culicidae Metarhizium sp
62
R 36 11/03/11 Vila Santa Rita (-16.680102,-49.321597) Descartáveis Larva Culicidae Mucor sp
R 37 11/03/11 Vila Santa Rita (-16.680102,-49.321597) Descartáveis Larva Culicidae Mucor sp
R 49 11/03/11 Vila Santa Rita (-16.680102,-49.321597) Patio de reciclagem Adulto Aedes sp Aspergillus sp
R 57 18/03/11 Jd. Goiás (-16.685693,-49.233513) Água empoçada com terra Larva Culicidae Contaminação Bacteriana
R 59 18/03/11 Jd. Goiás (-16.685693,-49.233513) Água empoçada com terra Larva Culicidae Aspergillus sp
R 61 18/03/11 Jd. Goiás (-16.685693,-49.233513) Água empoçada com terra Larva Culicidae Fusarium sp
R 63 18/03/11 Jd. Goiás (-16.685693,-49.233513) Água empoçada em lona Larva Culicidae Contaminação Bacteriana
R 64 18/03/11 Jd.Goiás (-16.685693,-49.233513) Ferro velho Adulto Aedes sp Aspergillus sp
R 67 I 25/03/11 Centro de Zoonoses (-16.728605,-49.160728) Lataria - carro enferrujado Larva Culicidae Penicillium sp
R 67 II 25/03/11 Centro de Zoonoses (-16.728605,-49.160728) Lataria - carro enferrujado Larva Culicidae Penicillium sp
R 69 25/03/11 Centro de Zoonoses (-16.728605,-49.160728) Lataria - carro enferrujado Larva Culicidae Cladosporium sp
R 70 25/03/11 Centro de Zoonoses (-16.728605,-49.160728) Lataria - carro enferrujado Larva Culicidae Aspergillus sp
R 75 25/03/11 Centro de Zoonoses (-16.728605,-49.160728) Lataria - carro enferrujado Larva Culicidae Contaminação bacteriana
R 81 25/03/11 Centro de Zoonoses (-16.728605,-49.160728) Lataria - carro enferrujado Larva Culicidae Aspergillus sp
R 91 25/03/11 Centro de Zoonoses (-16.728605,-49.160728) Lataria - carro enferrujado Larva Culicidae Contaminação bacteriana
R 95 31/03/11 Santo Antônio (-16.725975,-49.241581) Água parada em lona Larva Culicidae Contaminação bacteriana
R 96 31/03/11 Santo Antônio (-16.725975,-49.241581) Pátio de garagem Larva Culicidae Contaminação bacteriana
R 99 31/03/11 Santo Antônio (-16.725975,-49.241581) Água parada em lona Larva Culicidae Cladosporium sp
R 100 31/03/11 Santo Antônio (-16.725975,-49.241581) Água parada em lona Larva Culicidae Aspergillus sp
R 101 31/03/11 Santo Antônio (-16.725975,-49.241581) Água parada em lona Larva Culicidae Aspergillus sp
63
R 102 31/03/11 Santo Antônio (-16.725975,-49.241581) Água parada em lona Larva Culicidae Cladosporium sp
R 103 31/03/11 Santo Antônio (-16.725975,-49.241581) Água parada em lona Larva Culicidae Penicillium sp
R 104 07/04/11 Cidade Jd. (-16.673524,-49.307499) Assoalho de carro com
terra e ferrugem
Larva Culicidae Aspergillus sp
R 105 07/04/11 Cidade Jd. (-16.673524,-49.307499) Assoalho de carro com
terra e ferrugem
Larva Culicidae Rhizopus sp
R 106 07/04/11 Cidade Jd. (-16.673524,-49.307499) Campo de ferro velho Adulto Aedes sp Cladosporium sp
R 121 07/04/11 Cidade Jd. (-16.673524,-49.307499) Campo de ferro velho Adulto Aedes sp Cladosporium sp
R 122 07/04/11 Cidade Jd. (-16.673524,-49.307499) Campo de ferro velho Adulto Aedes sp Cladosporium sp
R 131 07/04/11 Cidade Jd. (-16.673524,-49.307499) Campo de ferro velho Adulto Aedes sp Fusarium sp
R 133 07/04/11 Cidade Jd. (-16.673524,-49.307499) Campo de ferro velho Adulto Aedes sp Cladosporium sp
R 141 28/04/11 Parque Flamboyant (-16.703862,-49.237912) Brejo Adulto Culicidae Aspergillus sp
R 143 05/05/11 Zamor Flora, Jd. Goiás (-16.700327,
-49.240723)
Caixa de papel em
floricultura
Adulto Culex sp Penicillium sp
R 144 05/05/11 Rua 115, Setor Sul (-16.698456,-49.248555) Bromélia Pupa Culicidae Rhizopus sp
R 145 I 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Subsolo de obra Larva Culicidae Cladosporium sp
R 145 II 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Subsolo de obra Larva Culicidae Penicillium sp
R 146 I 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Piscina descoberta Larva Culicidae Penicillium sp
R 146 II 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Piscina descoberta Larva Culicidae Penicillium sp
R 147 I 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Subsolo de obra Adulto Aedes sp Cladosporium sp
64
R 147 II 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Subsolo de obra Adulto Aedes sp Cladosporium sp
R 149 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Subsolo de obra Adulto Aedes sp Cladosporium sp
R 150 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Subsolo de obra Adulto Aedes sp Cladosporium sp
R 151 I 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Poça de água em chão
batido (construção)
Larva Culicidae Metarhizium sp
R 151 II 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Poça em chão (construção) Larva Culicidae Aspergillus sp
R 152 I 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Poça em chão (construção) Larva Culicidae Penicillium sp
R 152 II 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Poça em chão (construção) Larva Culicidae Penicillium sp
R 153 I 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Poça em chão (construção) Larva Culicidae Cladosporium sp
R 153 II 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Poça em chão (construção) Larva Culicidae Metarhizium sp
R 155 19/05/11 Rua 74, Jd. Goiás (-16.705958,-49.233491) Subsolo de obra Adulto Culex sp Aspergillus sp
R 157 13/10/11 Marginal Botafogo (-16.660779,-49.252954) Lixão Adulto Culex sp Cladosporium sp
R 175 20/10/11 Parque Mutirama (-16.664397,-49.253168) Poço com chão de cimento Adulto Aedes sp Penicillium sp
R 180 20/10/11 Parque Mutirama (-16.664397,-49.253168) Poço com chão de cimento Adulto Aedes sp Aspergillus sp
R 184 20/10/11 Parque Mutirama (-16.664397,-49.253168) Poço com chão de cimento Adulto Aedes sp Penicillium sp
R 218 01/12/11 Parque Amazônia (-16.73066,-49.279089) Descartáveis Larva Culicidae Mucor sp
*Meio Leles = Meio ágar-água com a adição de cristal violeta (10 mg/l), cloranfenicol (1000 mg/l), tiabendazol (8mg/ml) e deltametrina (50
mg/ml).
65
Manuscrito 4
Título resumido: Detecção de L. chapmanii em A. aegypti
Título: Um método simples para detecção de Leptolegnia chapmanii em larvas
infectadas de Aedes aegypti
66
Abstract
Reliable isolation of Leptolegnia chapmanii from field-collected mosquito larvae is
of high interest for the development of biological control of mosquitoes. Availability of
this entomopathogen for mycoinsecticides is still scarce, and the present study reports a
simple method to detect and isolate this oomycete from infected Aedes aegypti larvae.
Larvae served as selective substrate for specific development of L. chapmanii. Isolation
was most successful when alive previously-treated larvae were exposed to water agar
medium (WA) amended with chloramphenicol (500 - 1000 mg/l WA) and
thiabendazole (4 - 8 mg/l WA) for 48 h, and were then transferred to water for extra 48
h. The method permits processing large amount of A. aegypti and other culicid larvae,
and is useful for the prospection of new strains, but also monitoring effectiveness of L.
chapmanii during field tests.
Key words: Oomycetes; Straminipila; Chromista; Peronosporomycetes; Biological
control; mosquito.
67
1 Introdução
Leptolegnia chapmanii (Peronosoporomycetes: Saprolegniales) é um oomyceto que
infecta especificamente larvas de mosquitos. Por apresentar crescimento vegetativo com
desenvolvimento de hifas e pelas suas estruturas reprodutivas, foram por muito tempo
considerados fungos, contudo atualmente são classificados no Reino Straminipila
(Chromista) (Dick 2001), por apresentar zoósporos, células reprodutivas assexuadas,
móveis em água, com duplo flagelo diametralmente opostos. Além disso, outro fato que
diferencia L. chapmanii dos fungos é a ausência de quitina em sua parede celular.
O processo de infecção desse patógeno se dá pela fixação dos zoósporos na cutícula
e posterior penetração da hifa, de maneira semelhante aos conídios de quase todos os
fungos entomopatogênicos (Zattau & McInnis 1987; Pelizza et al. 2008). Além desse
mecanismo, L. chapmanii pode também infectar larvas pelo intestino médio após a
ingestão de zoósporos encistados (Zattau & McInnis 1987; Pelizza et al. 2008). Nos
dois casos os zoósporos encistados produzem um tubo germinativo, seguido pela
invasão da cavidade celomática por hifas e colonização fatal do corpo da larva (Zattau
& McInnis 1987). A morte da larva é seguida pela extrusão de micélio e formação dos
zoosporângios terminais. Zoósporos primários, com dois flagelos anteriores, são
lançados na água, encistam em algum substrato para então germinar e formar os
zoósporos secundários, com dois flagelos laterais e opostos, que nadam e infectam
larvas (Zattau & McInnis 1987). Além dos zoósporos ocorre a produção de estruturas
sexuadas, oogônios femininos e anterídios masculinos, que ao se fecundarem formam os
oósporos maduros, mais resistentes a condições ambientais adversas ao
desenvolvimento do entomopatógeno, porém, raramente observadas, aparentemente são
abortadas espontaneamente sem razões identificadas (Zattau & McInnis 1987; Pelizza et
al. 2010).
L. chapmanii pode ser facilmente mantido em meios sólidos e líquidos e zoósporos
produzidos em larvas de Aedes aegypti e mantidos em água a 25°C, permaneceram
viáveis por mais de 50 dias (Pelizza et al. 2008, 2011). Larvas sadias, expostas a
zoósporos foram infectadas rapidamente, cerca de dois minutos, e começaram a morrer
24 h após o tratamento (Scholte et al. 2004; Pelizza et al. 2008). A infecção se mostrou
dependente do número de zoósporos e foi inversamente proporcional a área da
superfície de água (Pelizza et al. 2007a). Larvas de A. aegypti e Culex pipiens, em
estádios mais jovens foram mais suscetíveis a infecção por L. chapmanii do que
estádios mais velhos e a temperatura ótima para infecção foi em torno de 25°C com um
68
intervalo permissivo para a infecção de 10 a 35°C para ambos os mosquitos (Pelizza et
al. 2007a). Ajustes de pH entre 4 – 10 e a salinidade da água não foram interferentes
para a infecção em A. aegypti, mas a infectividade foi reduzida em C. pipiens em ajuste
de pH menores ou maiores que 7 e foi inversamente proporcional a salinidade da água
(Pelizza et al. 2007b).
Outras espécies de Leptolegnia patogênicas a mosquitos têm recebido atenção
muito limitada (Scholte et al. 2004) e, muito pouco é sabido sobre a ocorrência dessas
espécies. L. chapmanii foi inicialmente isolado nos Estados Unidos em 1971 em uma
larva de Ochlerotatus triseriatus (Diptera: Culicidae). Até o momento são poucas as
publicações de isolamento natural de L. chapmanii ou de Aphanomyces sp
(Peronosoporomycetes: Saprolegniales) em mosquitos nos Estados Unidos e, apenas um
isolado na Argentina (Seymour 1984; Fukuda et al. 1997; López Lastra et al. 1999;
Scholte et al. 2004). A alta virulência de L. chapmanii (baseado na velocidade com que
morre a larva) faz deste patógeno um candidato atrativo para controle biológico de
importantes mosquitos vetores. Não há descrito nenhum meio seletivo que facilite o
isolamento de espécies de Leptolegnia em larvas de mosquitos infectados. Durante a
infecção e após a morte do hospedeiro os entomopatógenos devem superar dificuldades
impostas por outros microrganismos saprobiontes, como fungos e bactérias e,
eventualmente ácaros, presentes na superfície ou dentro do hospedeiro, que podem
reduzir ou até mesmo inibir a esporulação, se impor sobre o entomopatógeno e, assim
impedir a detecção e o isolamento (Tsao 1970; Roy & Pell 2000; Wraight et al. 2007).
Outras condições inóspitas como a falta de água, baixos índices de umidade relativa,
temperatura e excessiva exposição a raios ultravioleta também afetam o
desenvolvimento do entomopatógeno sobre o corpo do inseto e o isolamento do mesmo
à partir do hospedeiro (Luz & Fargues 1998; Arthurs & Thomas 2001).
Um meio de cultivo acrescido de antibiótico e fungicida que permita o
desenvolvimento de um entomopatógeno e iniba os contaminantes não desejados, é uma
ferramenta importante para o isolamento de um patógeno específico. Diversos meios de
cultura semi–seletivos foram descritos e são bem conhecidos para o isolamento de
fungos entomopatogênicos ou grupo de fungos específicos. Muitos desses meios,
contudo, utilizam o fungicida dodine, atualmente de difícil acesso e com toxicidade
aguda descrita (Chase et al. 1986; Liu et al. 1993; Keller et al. 2003; Hughes et al. 2004;
Luz et al. 2004; Kegley et al. 2010). Rocha & Luz (2009) avaliaram a inibição de
fungos saprobiontes quando expostos a uma série de fungicidas utilizados em meios
69
semi–seletivos e, sugeriram o uso de tiabendazol a 4 mg/l. Outros meios semi–seletivos,
livres de dodine, para isolamento de Culicinomyces clavisporus (Panter & Frances
2003), Beauveria spp e Metarhizium spp (Luz et al. 2007; Fernandes et al. 2010) foram
descritos, mas nenhum meio específico para a detecção de L. chapmanii foi descrito.
Esse patógeno é específico para estágios aquáticos e, a menos que cause eventos de
epizootia, acredita-se que seja mais difícil de ser detectado do que fungos
entomopatogênos terrestres mais comuns, dado a facilidade de contaminação presente
no meio aquático e a falta de meios semi-seletivos compatíveis para sua detecção.
Estudos mais atuais em desenvolvimento em nosso laboratório tem focado em
técnicas para a detecção de Metarhizium anisopliae diretamente em larvas de culicídeos
coletadas em campo, utilizando as amostras capturadas como substratos específicos
(Leles & Luz, dados não publicados). O objetivo desse estudo é propor um método mais
simples e efetivo para a detecção de L. chapmanii a partir de larvas de mosquitos
infectadas.
2. Material e métodos
2.1 Preparação dos meios
2.1.1 Ágar–Água (AA): foi preparado com 1% de ágar, sem a adição de outros
aditivos ou, com a adição de cloranfenicol (AA + C) (Oficinal, Brasil) nas
concentrações de 50, 100, 300, 500 ou 1000 mg/l; tiabendazol (AA + T) (Nortec
Química, Brasil) a 8 mg/l; (AA + Cv) cristal violeta (cloreto de hexametil-
pararosanilina, Cromato Produtos Químicos, Brasil) a 10 mg/l; (AA + D) deltametrina
(k-othrine® CE 25, Bayer CropScience, Brasil) a 50 mg/l ou combinando tiabendazol (8
mg/l) e cloranfenicol (500 mg/l) (AA + C + T). Para AA sem aditivos, a água destilada
foi mantida em agitação constante a 500 rpm e aquecida até 50 °C, com um agitador
magnético térmico, e então acrescido o ágar. O preparo de AA + cristal violeta ou AA +
deltametrina foi feito de maneira semelhante, sendo acrescido, junto com o ágar, o
cristal violeta ou a deltamentrina. Tiabendazol e cloranfenicol foram preparados em
solução etanólica, em 1 ml de etanol absoluto, sendo em seguida acrescido a água
aquecida, conforme descrito anteriormente. O pH do meio foi ajustado em 7 antes de ser
autoclavado e distribuído em placas de Petri (35 x 15 mm).
2.1.2 Emerson’s YPSS Agar: Um litro de água destilada foi aquecido até 50°C e
mantido em agitação constante em um agitador magnético a 500 rpm. Ainda em
agitação foram acrescidos 4 g de extrato de levedura, 1 g de dipotássio hidrogênio
70
fosfato, 0,5 g de sulfato de magnésico, 15 g de amido de milho e 20 g de ágar. Em
seguida o meio foi autoclavado e colocado em placas de Petri (90 x 15 mm).
2.2 Origem e cultura do oomyceto e produção de larvas infectadas: L.
chapmanii ARSEF 5499 foi isolado a partir de uma larva de quarto estádio (L4) de
Aedes albofasciatus na cidade de La Plata, Argentina, no ano de 1996 (López Lastra et
al. 1999). A linhagem foi cultivada em Emerson’s YPSS ágar, e sua virulência mantida
por sucessivas infecções em larvas de quarto estádio de A. aegypti, criadas em
laboratório. O patógeno, quando inoculado em L4, produz em média 105 zoósporos por
larva, 48 h após a inoculação a 25° C (Pelizza et al. 2008). Quinze L4 infectadas e
mortas foram transferidas para um copo plástico (260 cm3) com 100 ml de água
destilada. Em seguida, 50 larvas L4 de A. aegypti sadias obtidas de uma criação mantida
no “Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores” (CEPAVE, La Plata, Argentina)
foram colocadas no mesmo copo e expostas a infecção pelos zoósporos (concentração
final média de 1,5 x 103 zoósporos/ ml) durante 6 h.
2.3 Detecção de L. chapmani em AA: Quatro larvas infectadas, ainda vivas, foram
colocadas sobre a superfície de placas preparadas com meio AA; AA + C (50, 100, 300,
500 ou 1000 mg/l), AA + Cv; AA + T; AA + D e AA + C + T. As larvas foram
mantidas durante 48 h a 25 ±1°C, umidade saturada e 12 h de fotofase. Após esse
período foi avaliada a mortalidade das larvas e o desenvolvimento de micélio de L.
chapmanii sobre os insetos mortos. Em seguida, essas larvas foram individualmente
colocadas em um poço de uma placa de cultura de células, plástica e estéril (Cellstar®-
Greiner Bio-One) com 2 ml de água destilada estéril em cada um dos poços, e mantidas
em condições ambientes por 48 h. Após esse período, as larvas foram inspecionadas por
microscopia óptica com contraste de fase para a visualização de estruturas assexuadas
e/ou sexuadas, produzidas após a submersão em água. Para verificar a viabilidade dos
zoósporos produzidos, as larvas foram retiradas dos poços, porém a água tratada foi
mantida e, em seguida foi colocada uma nova larva saudável em cada um dos poços,
mantidas à temperatura ambiente. A leitura da mortalidade das novas larvas foi feita 48
h após a exposição, bem como a observação da formação de zoosporângios sobre essas
larvas. Grupos controle foram feitos mantendo larvas não infectadas com L. chapmanii
sobre os meios durante 48 h e em seguida fazendo o mesmo procedimento das demais
larvas. Em quatro poços de cada placa de cultivo celular foram colocadas uma larva,
sem infecção prévia, em água destilada, que funcionavam como controle de qualidade
das placas utilizadas (Figura 1).
71
2.4 Análise dos resultados: Quatro repetições independentes com 4 L4 foram
feitas para todos os testes, e para cada teste uma nova cultura de L. chapmanii foi
utilizada. Mortalidades percentuais foram transformadas em arco-seno e analisadas por
análise de variância (ANOVA) seguida de teste de Student-Newman-Keuls para
comparação das médias. As médias foram consideradas estatisticamente diferentes
quando P < 0,05.
3. Resultados
Larvas vivas, expostas ou não a L. chapmanii, quando colocadas sobre a superfície
de AA + deltametrina morreram rapidamente, entre 3 a 5 minutos. Nos demais meios,
quando expostas a L. chapmanii, a mortalidade teve início em até 24 h após o
tratamento. Após 48 h sobre o meio, quando expostas ao oomyceto, a mortalidade das
larvas variou entre 58% (Cristal violeta) até 100% (Cloranfenicol a 100 ou 300 mg/l e
tiabendazol combinado com cloranfenicol) (Tabela 1). Com exceção da deltametrina,
outros aditivos não tiveram efeito sobre a sobrevivência de larvas não infectadas,
pertencentes ao grupo controle, expostas aos diversos meios utilizados (F7,36 = 0,89; P =
0,54). Grande parte das larvas do grupo controle continuaram vivas, após 48 h de
exposição sobre a superfície dos meios sem aditivos (100%) ou dos meios acrescidos de
cristal violeta ou tiabendazol (100%), do meio combinado de tiabendazol e
cloranfenicol (93,8 ± 6,2%) ou apenas do meio com cloranfenicol (87,5 ± 12,5%).
Larvas expostas por 48 h a superfície de AA + cloranfenicol (500 e 1000 mg/l), estavam
mais esbranquiçadas do que as demais, tendo sido expostas a L. chapmanii ou não.
Algumas horas após a morte de larvas tratadas com L. chapmanii, ainda sobre a
superfície do meio AA sem aditivos foram obsevados sobre o corpo das larvas micélio e
zoosporângios do oomyceto. No caso dos meios AA + cloranfenicol, AA + tiabendazol
e AA + tiabendazol + cloranfenicol, essas estruturas e, eventualmente oogônios, só
foram observadas após a transferência das larvas para a água destilada. Foi observado
sobre essas larvas, zoosporângios repletos de zoósporos ou mesmo já vazios (Figura
2a). A figura 2B evidencia a liberação de zoósporos pelos zoosporângios. Larvas que
foram mantidas em AA sem adjuvantes produziram zoosporângios, sem formação de
oogônios. Em AA + cloranfenicol, houve a emergência de zoosporângios, independente
da concentração do cloranfenicol (50 – 1000 mg/l) e a porcentagem de larvas que foram
observados oogônios, 48 h pós tratamento, aumentou proporcionalmente de acordo com
a concentração, alcançando 100% das larvas mantidas sobre o meio de maior
concentração de cloranfenicol (Figura 3). Não houve formação de oogônios em larvas
72
mantidas em AA + cloranfenicol < 100 mg/l; em apenas 6,2% das larvas expostas a AA
+ tiabendazol foi observado oogônios. Todas as larvas mantidas em AA + tiabendazol +
cloranfenicol produziram zoosporângios e 50% tinham oogônios (Tabela 1). Micélio,
zoosporângios ou oogônio não foram produzidos em larvas mantidas em AA + cristal
violeta ou AA + deltametrina (Tabela 1).
Novas larvas L4 expostas a água destilada dos poços, após a retirada das larvas
infectadas, tiveram mortalidade elevada (≥ 66,7%) testando cloranfenicol, tiabendazol,
tiabendazol e cloranfenicol combinados, deltametrina e no AA sem aditivos. Apenas
quando utilizado cristal violeta a mortalidade foi reduzida (16,6%). Enquanto todas as
larvas mortas, com exceção do grupo deltametrina, tiveram desenvolvimento de
zoosporângios e zoósporos após 48 h de exposição das novas larvas, oogônios foram
observados em apenas 0 – 25% dessas larvas (Tabela 1). Larvas do grupo controle,
quando testados AA, AA + tiabendazol, AA + cloranfenicol, AA + cristal violeta e AA
+ tiabendazol + cristal violeta, permaneceram vivas nos poços de água destilada após
48h.
4. Discussão
Essa é a primeira descrição de uma metodologia simples para isolamento de L.
chapmanii a partir de larvas de culicídeos vivos infectados. A técnica acrescenta
condições favoráreis ao patógeno para desenvolver-se sobre larvas vivas potencialmente
infectadas, mantidas parcialmente imobilizadas em meio ágar-água, sem nutrientes mas,
acrescido de aditivos que minimizam o crescimento de bactérias e fungos
contaminantes. O método utiliza o próprio hospedeiro como substrato seletivo e,
permite o processamento individual de grande quantidade de larvas, mesmo em
condições de campo.
O estudo evidencia que a maioria das larvas que não foram expostas a L. chapmanii
(grupo controle), sobrevive por pelo menos 48 h sobre o filme de água mantido sobre a
superfície de um meio de ágar 1%. Cloranfenicol (50 – 1000 mg/l AA), tiabendazol
(8mg/l AA) ou tiabendazol (8 mg/l AA) combinado com cloranfenicol (500 mg/l AA) e
até mesmo cristal violeta (10 mg/l AA) não tiveram efeito tóxico em L4 de A. aegypti.
Deltametrina (50 mg/l AA) foi altamente tóxico para as larvas e, acredita-se que
nenhum inseticida que mate rapidamente as larvas de mosquitos possa ser utilizado em
meio para isolamento de oomycetos entomopatogênicos de larvas. A sobrevivência da
larva sobre a superfície do meio permite o desenvolvimento de L. chapmanii dentro da
larva, sem que tenha que ser imersa em água. O progresso da infecção pode ter sido
73
inclusive favorecido pelo estresse gerado a larva pela reduzida mobilidade sobre a
superfície do meio, diminuindo a resistência a infecção; uma suscetibilidade aumentada
poderia tornar a detecção mais sensível em casos de coletas com baixos índices de
infecção.
A maioria das L4 previamente expostas a L. chapmanii morreu pela infecção nas
primeiras 48 h de incubação no filme de água sobre a superfície do AA e L. chapmanii
produziu zoosporângios e zoósporos após a transferência de larvas infectadas para a
água.
De maneira interessante, a formação de oogônios (embora sem produção
subsequente de oosporângios ou oósporos) foi estimulada e acelerada pelas crescentes
concentrações de cloranfenicol e eventualmente relacionada à ação deste antibiótico
sobre a microbiota larval. O cloranfenicol é um antibiótico de largo espectro,
termoresistente, comumente utilizado em meios semi–seletivos para fungos
entomopatogênicos (Veen & Ferron 1966; Tsao 1970; Fernandes et al. 2010; Rangel et
al. 2010). Embora os fatores relacionados à reprodução sexuada de L. chapmanii ainda
não foram claramente compreendidos (Zattau & McInnis 1987; Pelizza et al. 2010),
Pelizza et al. (2010) descreveram o início da formação de oogônios apenas depois de 5
dias de incubação de larvas de A. aegypti infectadas a 25°C. Em todo o caso, a formação
de estruturas sexuadas não é necessária para a correta identificação ou isolamento deste
patógeno em larvas de culicídeos.
Cristal violeta é normalmente utilizado em meios semi–seletivos tanto pela sua
ação bactericida como pela sua intensa coloração que facilita a visualização de
patógenos em crescimento (Chase et al. 1986), mas como adjuvante inibiu
completamente o desenvolvimento de L. chapmanii.
Placas de Petri com ágar-água (1%) parecem muito adequadas para a acomodação
de amostras coletadas em campo e para a imobilização de grande número de larvas de
mosquitos, sem contudo, matá-las, permitindo a ação de L. chapmanii. Larvas que
permaneçam vivas após 24–48 h sobre o filme de água na superfície de AA,
provavelmente não estariam infectadas por L. chapmanii e poderiam ser excluídas dos
demais procedimentos. Por outro lado, indivíduos mortos, podem ser facilmente
transferidos do meio para a água para a formação das estruturas reprodutivas,
especialmente zooporângios e eventualmente oogônios. Micélio e outras estruturas
reprodutivas podem ser então diretamente repicados em meio de cultivo adequado
74
(Pelizza et al. 2011) ou utililizados para o tratamento de novas larvas saudáveis para
isolamento in vivo.
Baseado nos resultados encontrados, um meio ágar-água (1%) acrescido de
cloranfenicol (até 1000 mg/l) e/ou tiabendazol (até 8 mg/l), de acordo com o quão
contaminado estariam as amostras de campo, se mostrou o mais adequado para a
detecção de novas cepas naturais de L. chapmanii ou ainda para a avaliação da
efetividade em tratamentos de campo com o oomyceto.
5. Agradecimentos
Agradecemos o apoio de Evangelina Muttis e Manuel Enrique Rueda Páramo pelo
auxílio técnico e Richard A. Humber (United States Department of Agriculture,
Agriculture Research Service; Ithaca, NY) pela revisão crítica do manuscrito. A
pesquisa teve financiamento da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES, Brasil, PPCP 016/2011), Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq, Brasil, 473141/2010-8) e a Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG, 201010267000250).
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77
Tabela 1. Infecção de larvas de Aedes aegypti (L4) por Leptolegnia chapmanii, e o desenvolvimento do patógeno
em L4 mantidas em meio ágar – água acrescido de aditivos ou, após a transferência, em água, e subsequente
infecção de novas L4 e desenvolvimento em larvas mortas após exposição a mesma água.
1 Larvas vivas (quatro repetições com 4 L4 em cada) expostas a L. chapmanii (1,5 x 103 zoósporos/ml por 6 h)
foram mantidos sobre o meio e incubado a 25°C, 12 h fotofase e umidade saturada por 48 h e então transferidas
individualmente para dentro de poços com 2 ml de água destilada por mais 48 h 2 Exposição de novas larvas L4 a mesma água após a remoção das primeiras larvas tratadas, vivas ou mortas,
durante 48 h
Mortalidade acumulativa de larvas (% ± Erro padrão
da média (EPM)) com estruturas reprodutivas1
Mortalidade acumulativa de novas larvas (% ±
EPM) com estrturas reprodutivas2
Aditivo mg/l mortalidade zoosporângio zoosporângio e
oogônio
mortalidade zoosporângio zoosporângio e
oogônio
nenhum - 100 100 0 93,7 ± 5,4 93,7 ± 5,4 0
cloranfenicol 1000 87,5 ± 10,8 87,5 ± 10,8 87,5 ± 10,8 81,2 ± 10,4 81,2 ± 10,4 25
500 87,5 ± 6,2 87,5 ± 6,2 50 ± 22,8 87,5 ± 6,3 87,5 ± 6,3 12,5 ± 7,2
300 100 100 33,3 ± 27,2 100 100 16,6 ± 13,6
100 100 91,6 ± 6,8 0 91,7 ± 6,8 91,7 ± 6,8 16,6 ± 13,6
50 91,6 ± 6,7 88,3 ± 9,5 0 66,7 ± 13,6 66,7 ± 13,6 8,3 ± 6,8
tiabendazol 8 75 ± 8,9 75 ± 8,9 6,2 ± 2 87,5 ± 12,5 87,5 ± 12,5 16,6 ± 13,6
tiabendazol +
cloranfenicol
8
500
100 100 50 ± 19,8 93,7 ± 5,5 93,7 ± 5,5 0
cristal violeta 10 58,3 ± 18 0 0 16,6 ± 6,9 0 0
deltametrina 50 100 0 0 100 0 0
78
Figura 1: Avalição do desenvolvimento de Leptolegnia chapmanii e manutenção da
virulência dos zoósporos após a passagem das larvas, infectadas (+) ou larvas controle (-),
pelos meios: Ágar – água (AA+ e AA-); AA + tiabendazol (AT+ e AT-) AA + cloranfenicol
(AC 1,0-0,1 g/l + e AC 1,0 - 0,1 g/l ); AA + deltametrina (AD+ e AD-) e AA + tiabendadol
e cloranfenicol (MR + e MR-).
79
Figura 2: Zoosporângios de Leptolegnia chapmanii repletos de zoósporos
(A seta 1) ou vazios (A seta 2) e liberando zoósporos (B) após 48 h de
incubação de larva de quarto estádio de Aedes aegypti em meio ágar- água
(25 ± 1°C) seguido de exposição em água destilada por 48 h a 25 ± 1°C. A:
100x; B: 200x; Detalhe ampliado em B: 400x.
80
Figura 3: Oogônios (seta 1) e zoosporângios (seta 2) de Leptolegnia chapmanii em larva
de quarto estádio de Aedes aegypti, 48 h após a incubação em meio ágar-água acrescido
de cloranfenicol (1000 mg/L) e subsequente imersão em água destilada por 48 h a 25 ±
1°C. Ampliação em 200x.
81
6 DISCUSSÃO
Embora os fungos tenham grande potencial para o controle de mosquitos e das
doenças transmitidas por eles (Scholte et al. 2004a, 2005, 2007; Blandford et al. 2005;
Mnyone et al. 2009, 2010a, 2010b; 2011, Howard et al. 2010; Luz et al. 2010; Fang et
al. 2011) os estudos sobre controle biológico desses vetores com fungos
entomopatogênicos, especialmente contra mosquitos adultos de A. aegypti, ainda se
encontram restritos a M. anisopliae e B. bassiana. O presente trabalho apresenta uma
gama maior de fungos patogênicos da ordem contra adultos de A. aegypti. Além de M.
anisopliae, outros 5 fungos do gênero Metarhizium, 2 do gênero Isaria, 3 do gênero
Lecanicillium, além de Paecilomyces carneus, Purpureocillium lilacinum e B.
brongniartii.
Grande parte desses fungos testados, inclusive M. anisopliae Ip 46, tiveram
patogenicidade confirmada contra ovos de A. aegypti, com tratamento direto dos ovos
mantidos sobre um papel filtro (Luz et al. 2007b). No presente estudo foi observado
também que o mesmo fungo, IP 46, diminui a eclodibilidade de larvas de primeiro
estádio de A. aegypti, em tratamento indireto, com os ovos mantidos sobre solo umido
tratado com conídios de IP 46. O papel filtro como substrato de aplicação de fungos não
se mostrou muito eficiente para uso em campo, visto que rapidamente se desintegra
exposto a alta umidade e proporciona o desenvolvimento de bactérias que podem
influenciar na viabilidade dos fungos (Lobo & Luz, comunicação pessoal). O uso de
substratos inorgânicos ou mais resistentes em campo, têm sido estudados para o
controle de adultos de Anopheles gambiae, importante vetor de malária, com destaque
ao uso de blocos de tijolo e de panos de algodão para aplicação de conídios de B.
bassiana e M. anisopliae (Mnyone et al. 2010a). Sabe-se que solo, quando úmido, é um
potencial sítio para oviposição de ovos tanto por fêmeas de A. gambiae (Huang et al.
2005) como por fêmeas de A. aegypti (Lobo and Luz, comunicação pessoal). Conforme
demostrado no presente estudo, pode ser utilizado como um sítio de aplicação de M.
anisopliae em políticas para controle de A. aegypti, mais adequadas à campo, sobretudo
próximos a criadouros como bromélias e outros criadouros naturais importantes de A.
aegypti.
Diante da gama de fungos patogênicos que poderiam ser utilizados para controle de
A. aegypti, o conhecimento sobre quais espécies fúngicas infectam naturalmente esse
mosquito poderia sinalizar qual seria o patógeno mais adequado para este fim. Contudo,
82
o isolamento de fungos em mosquitos, ainda é escasso, dificultado pela constituição
física pequena e frágil do inseto, bem como pela facilidade de contaminação, sobretudo
de larvas. Em função dessa dificuldade foi proposto um novo método para isolamento
de fungos em mosquitos. Foi desenvolvido um meio ágar-água (1%) no qual o
mosquito, adulto ou larva, é mantido sobre ele, sem maiores manipulações, até a
extrusão de conídios sobre o corpo do mosquito morto, caso esteja infectado, seguido do
isolamento pelo repique em meio nutritivo. A baixa concentração de ágar no meio
permite a aderência do mosquito adulto e a sobrevivência da larva por mais de 48 horas
sobre a superfície, com um filme de água sobre o meio. Com os mosquitos mantidos
vivos o máximo possível sobre o meio, é possível que o estresse gerado pelo ambiente e
pela imobilização (no caso dos adultos), facilitem a atividade do fungo
entomopatogênico, caso os mosquitos estejam infectados. Foi adicionado ao ágar-água
antibiótico (cloranfenicol), fungicida (tiabendazol), acaricida (deltamentrina), além de
cristal violeta. A adição de todos os adjuvantes proporcionaram redução no nível de
contaminação por bactérias e por fungos não entomopatogênicos, facilitando o
isolamento de fungos entomopatogênicos.
O desenvolvimento dessa técnica teve como fungo modelo M. anisopliae s.l. IP46
durante os testes de laboratório. O meio também foi testado em campo, com coletas de
adultos e larvas na cidade de Goiânia. Dos mosquitos que foram coletados no campo,
foram isolados 3 fungos do gênero Metarhizium, todos isolados de larvas coletadas em
pequenas coleções de água formadas por poças d’água no solo. O fato de M. anisopliae
ter sido utilizado como fungo modelo para o desenvolvimento da técnica pode ter sido
determinante para o isolamento somente desse gênero. Contudo, outros fungos
entomopatogênicos também tolerantes a tiabendazol como I. farinosa, I. fumosorosea,
B. brongniartii, P. marquandii, P. lilacinum, entre outros, (Rocha & Luz 2009)
possivelmente seriam isolados, caso estivessem presentes. A mesma técnica foi testada
para o isolamento do oomyceto L. chapmanii, contudo, a presença de deltametrina e de
cristal violeta claramente inviabilizaram o desenvolvimento do patógeno. A mortalidade
da larva em contato com a deltametrina ocorre em poucos minutos, o que aparentemente
inibe o processo de infecção ou de desenvolvimento de L. chapmanii. O uso do meio
ágar-água com cloranfenicol e tiabendazol se mostrou útil para a detecção de L.
chapmanii em larvas de mosquitos, que carecia de metodologias mais eficientes de
detecção e isolamento. Portanto, para o estudo de isolamento de L. chapamanii a partir
de larvas não se recomenda a adição de deltametrina e de cristal violeta no meio
83
seletivo. O presente trabalho traz avanços na confirmação do potencial de fungos para
controle de A. aegypti, sobretudo do gênero Metarhizium. Evidencia a presença do
gênero nos mosquitos coletados na cidade de Goiânia e, além disso, propõe novas
ferramentas para uso em estudos de levantamento e detecção de fungos e oomycetos
entomopatogênicos em mosquitos.
84
7 CONCLUSÕES
1. A linhagem M. anisopliae IP 46 se mostrou patogênica e virulenta, contra
adultos e ovos de A. aegypti, além de demonstrar potencial para aplicação em
campo e para o uso no desenvolvimento de controle integrado com fungos.
2. Solo umedecido apresentou potencial como substrato para ação de M.
anisopliae em ovos de A. aegypti, porém a microbiota do solo pode interagir com o
desenvolvimento do patógeno, portanto, o solo debe ser previamente autoclavado.
3. Cloranfenicol e tiabendazol reduziram o desenvolvimento de contaminantes
e, acrescidos com cristal violeta e deltametrina a meio ágar – água em pH 5,5,
favoreceram a detecção e o isolamento de M. anisopliae em adultos e larvas de A.
aegypti infectados. Para o isolamento de L. chapmanii cristal violeta e deltametrina
em A. aegypti sobre meio ágar – água não são aditivos adequados.
4. O meio Leles, proposto no presente trabalho, pode ser utilizado para a
detecção e isolamento de M. anisopliae em mosquitos, conforme mostrado em teste
de campo. Contudo, o meio precisa ser adaptado para isolamento de L. chapmanii.
85
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