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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PREVALÊNCIA DA DOENÇA DE CHAGAS EM GESTANTES EM GOIÂNIA-GO
E INTEGRAÇÃO DE MINICÍRCULOS DE KDNA DE Trypanosoma cruzi EM
LACTENTES DE MÃES INFECTADAS
LILIANE DA ROCHA SIRIANO
2013
ii
Termo de Autorização para Publicação de Teses e Dissertações
Eletrônicas (TDE) na Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD)
iii
LILIANE DA ROCHA SIRIANO
PREVALÊNCIA DA DOENÇA DE CHAGAS EM GESTANTES EM GOIÂNIA-GO
E INTEGRAÇÃO DE MINICÍRCULOS DE KDNA DE Trypanosoma cruzi EM
LACTENTES DE MÃES INFECTADAS
Orientadora: Profª Drª. Ana Maria de Castro
Co-orientadora: Drª Mariana Machado Hecht
Colaboradores: Profª Drª Nadjar Nitz Silva Lociks de Araújo
Prof Dr Antonio Lima Cruz Teixeira
Goiânia
2013
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Parasitologia do Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública desenvolvida no Laboratório de Estudos
da Relação Parasito Hospedeiro - LAERPH em colaboração com o Laboratório
Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas - LMPDC da Universidade de
Brasília, a Maternidade e o Laboratório de Chagas do Hospital das Clínicas de
Goiás- Universidade Federal de Goiás como requisito parcial para obtenção do
grau de Doutor em Parasitologia.
iv
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA CENTRAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
UFG
v
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
Aluna: Liliane da Rocha Siriano
Orientadora: Profª Drª Ana Maria de Castro
Co-orientadora: Profª Drª Mariana Machado Hecht
Membros:
1. Profª Drª Nadjar Nitz
2. Prof Dr Ênio Chaves de Oliveira
3. Prof Dr Alejandro Luquetti Ostermayer
4. Prof Dr Alverne Passos Barbosa
Data:05/03/2013
vi
“Comece fazendo o que é necessário, depois
o que é possível, e de repente você estará
fazendo o impossível.”
São Francisco de Assis
“Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a
mim decidir entre rir ou chorar, ir ou ficar,
desistir ou lutar; porque descobri, no
caminho incerto da vida, que o mais
importante, é decidir!”
Cora Coralina
vii
DEDICATÓRIA
Dedico aos meus filhos: Daniel e Júlia, para
que eu seja para vocês a prova que os
estudos podem mudar a vida de alguém e
também aos portadores da doença de
Chagas para que os avanços tecnológicos
possam enfim alcançar a cura para esta
doença.
viii
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, e sempre, está DEUS. Ele é o Senhor de tudo e por isso eu o agradeço:
pela oportunidade de fazer o que gosto; por me dar forças quando preciso e muito mais do
que isso me mostrar o quanto as coisas da vida valem a pena. Só te peço, Senhor: faça
valer a pena a oportunidade que me foi dada, no sentido de produzir frutos, e faça de mim
uma distribuidora dessas sementes do saber, da produção científica e da dedicação.
Portanto, Deus, sei que és o meu pastor e por isso nada em minha vida faltará, muito
obrigada por não me deixar desistir dos meus objetivos, pois sabes melhor do que ninguém
o quanto foi árduo o caminho até aqui.
Muito obrigada a Nossa Senhora por ter me protegido durante todas as viagens que fiz, nas
quais sei que fui abençoada, e por ter me guiado em momentos tensos que vivi, nos quais
senti sua presença.
Nada seria possível sem a compreensão da minha família, pois por diversas vezes fui
bastante ausente, nada diferente de tantos outros que percorrem ou percorrerão este mesmo
traçado. Daniel Siriano de Melo e Júlia Siriano de Melo, o caminho dos estudos, da
dedicação à ciência é árduo, porém, meus filhos é por meio dele que estou conseguindo dar
a vocês a oportunidade de repetir em suas vidas a minha trajetória. Vocês são muito
importantes em minha vida! Essa etapa do doutorado tirou-me momentos muito
importantes entre nós, chorei por muitas vezes, confesso, porém em nenhum momento a
palavra “DESISTIR” fez parte dos meus planos. Muito obrigada a vocês por tentarem
entender o quanto terminar era importante, pois penso que na maioria das vezes a palavra
“PERSISTIR” vale mais a pena do que desistir. Filhos, as dificuldades e os desafios fazem
parte da vida de quem quer crescer, tanto pessoal como profissionalmente, serei uma
pessoa realizada se eu tiver sido para vocês, um exemplo de perseverança e de dedicação.
Mamãe, Rita Saraiva da Rocha Siriano, muito obrigada pelo apoio nos momentos em que
precisei, pois por várias vezes a senhora teve que abrir mão da sua rotina para ficar com
meus filhos para que eu pudesse viajar e poder concluir meus experimentos. Te amo!
Papai, Antonio Siriano Sobrinho “in memorian”, sei que onde o senhor estiver, estarás me
abençoando e com certeza, orgulhoso por mais esse passo tão ímpar em minha vida. E
estar sem o senhor há 11 anos em nada diminui a dor que ainda sinto com sua ausência.
Nunca esqueço o quanto o senhor ensinou que a vida de estudante não era fácil e aqui
estou eu para provar isso!
ix
Leila Maria da Rocha Siriano Bonagura, Carlos Antonio da Rocha Siriano e Fernando da
Rocha Siriano, vocês são o que de melhor uma pessoa pode ter do que chamamos de
irmãos. Amo vocês imensuravelmente, pois meus sentimentos por vocês são tão intensos
que às vezes não consigo nem demonstrá-los, por isso mais uma vez agradeço a Deus por
ter vocês em minha vida e serem tios tão presentes na vida dos meus filhos.
Caroline Siriano Bonagura, Gustavo Siriano Bonagura, Heitor Fantinatti Siriano, Laura
Gigriella Siriano e Guilherme Mendes Siriano ter vocês como meus sobrinhos é algo
indescritível, amo vocês demais. Tenho muito orgulho de tê-los em minha vida.
Aos meus sobrinhos “adotivos”: Alice Araújo de Melo; João, Tomás e Ana Mols. Que bom
que a vida pode nos dar a opção de escolher quem queremos que faça parte de nossa
família, com certeza vocês fazem parte da minha.
As minhas cunhadas: Raquel Mendes e Luanna Gigriella obrigada por somarem o amor na
vida dos meus irmãos.
A um dos meus grandes incentivadores, meu padrinho Waldemar Ribeiro Paes, obrigada
por acreditar no meu potencial e mesmo tendo estudado pouco, sabia o quanto os estudos
são valiosos e o quanto eles engrandecem a vida das pessoas. Muito obrigada também a
minha madrinha Terezinha Saraiva da Rocha Paes.
As minhas primas Maria Ângela Rocha Paes e Maria Aparecida Paes da Rocha muito
obrigada por me receberem tão bem em suas casas. Vou sentir muitas saudades, pois de
alguma forma esse estudo nos deu a oportunidade de nos vermos mais vezes, de jogarmos
conversas fora, de darmos boas risadas juntas. Muito obrigada também a Nara, Douglas e
Matheus Rocha Vasco (filhos da Ângela) e Katiane, Leiriane e Diego Rocha (filhos da
Cida). Sem esquecer a Taíse Galdioli Paes.
Agradeço em particular dona Ereni Ferreira de Melo, desejo à senhora tudo o que de
melhor a vida possa lhe proporcionar. Amor é um sentimento muito verdadeiro, o qual eu,
de maneira recíproca, sinto de uma forma muito intensa pela senhora. Não há mesmo como
nos separar. Muito obrigada por tudo o que a senhora fez e faz por mim e por meus filhos,
seus netos.
Prô Ana Maria de Castro agradeço imensamente a senhora por compreender as minhas
limitações de tempo. Por muitas vezes eu disse, e repito aqui neste momento, que o meu
término de doutorado se deve à sua paciência e ao seu apoio, acreditando sempre que eu
conseguiria concluir esta pesquisa. Muito obrigada pela confiança depositada em mim.
Termino esse doutorado com a certeza da minha eterna gratidão à senhora. MUITO
OBRIGADA!!!
x
Ao professor Dr André Kipnis pela cooperação durante minha pesquisa, por emprestar o
seu laboratório nos momentos em que dele necessitei e a todos os seus colaboradores.
Muito obrigada!
As minhas amigas queridas: Adriana Calaça Guimarães, Ana Cristina Mendes, Andréia
Ferreira de Melo, Antonella Del Buono Guimarães, Candyce Morgado, Denise Gomes da
Costa, Deliziê Sousa Araújo, Flávia Martins Nascente, Jacqueline Aparecida de Moura,
Juliane Sciarreta Fantinatti, Mônica Canedo Maia, Tatiana Moreira da Silva, Tânia
Yoshida Mori e Viviane Aparecida Vasconcelos.
A minha parceira de pós-graduação Juliana Boaventura Avelar, que possamos ter outros
projetos juntas, pois há oito anos compartilhamos alegria, tristezas e conquistas.
Aos meus amigos: Alessandro do Nascimento Liporoni, Christian Douglas, Eduardo
Bonagura, Humberto Ferreira de Melo, Magno Belém Cirqueira, Patric Mols e Vitor
Rachid, obrigada por fazerem parte da minha vida!
Não tenho mais palavras para adjetivá-lo devido a grande admiração e respeito que tenho
pelo meu ídolo Luís Murilo Martins de Araújo. Pra mim, o mestre dos mestres dos
biomédicos. Muito obrigada pelos tantos ensinamentos durante todo o tempo que
trabalhamos juntos.
A Rosiléia Rodrigues dos Santos, minha fiel secretária. São treze anos juntas e graças a
você pude realizar muitos dos meus sonhos, pois foi em você que confiei no momento em
que precisei de apoio para cuidar dos meus filhos! Muito obrigada!!!
Aos colegas dos Laboratórios de Chagas e Clínico do Hospital das Clínicas da
Universidade Federal de Goiás, Laboratório do Hospital de Doenças Tropicais (HDT) e em
especial ao Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas (LMPDC) da
Universidade de Brasília, do qual tive receios por ser um local tão bem referenciado, mas
acabei sendo surpreendida por pessoas tão amorosas e receptivas. O meu muito obrigada a
todos vocês: Marol, Nad, Perla,Adriana, Cássia, Mari, Ester, Lou, Manú, Alessandro,
Adriano, Fernando.
Obrigada Aline Barbaresco Almeida e Marcos Saraiva pela disponibilidade e paciência em
me ajudarem nos momentos em que precisei.
A toda a equipe do LAERPH em especial: Carol Fraga, Carol Aguiar, prof Dr.Clecildo
Bezerra obrigada pelo carinho de vocês.
xi
A contribuição valiosa de Hânstter Hállison Alves Rezende e Heloísa Ribeiro Storchilo no
registro de informações dos prontuários das gestantes.
Meu muito obrigada a toda a equipe de enfermagem da Maternidade do Hospital das
Clínicas que me acolheram tão bem e que me ajudaram tanto. Em especial quero agradecer
as enfermeiras Rubenes Borges Hilário Lima e Dorisday Machado Ribeiro.
Obrigada Neuran Souza de Castro, funcionário do Setor de Internação, e todos os
funcionários do SAMIS que pacientemente pegaram os prontuários, estes que foram uns de
meus objetos de estudo, às vezes sem nem terem noção do quão importante foram para esta
pesquisa.
Eu agradeço as mães que aceitaram participar desta pesquisa tendo em vista que sem elas,
esse estudo não teria saído do papel, por quererem o melhor para seus filhos e entenderem
a importância do seu ato para a ciência. Muito obrigada por realizarem meu sonho de estar
concluindo meu doutorado.
A Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública,
em nome de José Clementino de Oliveira Neto e Kariny Vieira Soares pela dedicação aos
alunos do IPTSP.
Agradeço a Universidade Federal de Goiás por ter me permitido sonhar e concretizar o
sonho de fazer e concluir meu doutorado.
A FAPEG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás) e ao CNPq (Consellho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio financeiro a essa
pesquisa.
xii
SUMÁRIO
Lista de Figuras, Tabelas e Anexos ...................................................................................... xv
Lista de Figuras ................................................................................................................ xv
Lista de Tabelas ............................................................................................................... xvi
Listas de Abreviaturas, Siglas e Símbolos............................................................................ xv
Resumo ............................................................................................................................. xxvii
Abstract ............................................................................................................................... xxii
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 1
1-Introdução ..................................................................... Erro! Indicador não definido.
1.1 – A Doença de Chagas ................................................ Erro! Indicador não definido.
1.2 – Aspectos Epidemiológicos da Doença de Chagas .................................................... 3
1.3 – Ciclo Biológico .......................................................................................................... 6
1.4 – Mecanismos de Transmissão ................................................................................ 8
1.5 – Transmissão Congênita ........................................................................................... 10
1.5.1 –Diagnóstico da Transmissão Congênita ...................................................... 12
1.6 – Fases e Formas Clínicas da Doença de Chagas ...................................................... 13
1.6.1 – Fases e Formas Clínicas da Doença de Chagas Congênita ........................ 16
1.7 – Profilaxia e Tratamento .......................................................................................... 17
1.8 - Estruturas Celulares de Trypanosoma cruzi ............................................................ 18
1.9 – Parasitemia x Polimorfismo ................................................................................... 21
1.10 – Teoria sobre a Patogênese da Doença de Chagas Humana : Persistência do
Parasito x Autoimunidade ................................................................................................ 22
xiii
1.11 – Patogênese da Doença de Chagas e Autoimunidade 2Erro! Indicador não
definido.
1.12 – Elementos Transponíveis ...................................................................................... 26
1.13 – Fatores Relacionados à Transposição ................................................................... 28
1.14 – Transferência Horizontal de DNA Elementos TransponíveisErro! Indicador
não definido.30
1.15 – Transferência de Minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi para o Genoma
da Célula Hospedeira ....................................................................................................... 33
1.16 – Impactos da Retrotransposição ............................................................................. 35
1.17 – Doenças Causadas por Elementos Transponíveis ................................................. 36
2 – Justificativa ................................................................................................................... 37
3 – Objetivos ........................................................................................................................ 39
3.1 – Objetivo Geral: ........................................................................................................ 39
3.2 – Objetivos Específicos: ............................................................................................. 39
4 – Material e Métodos ....................................................................................................... 40
4.1 – Fluxograma: Metodologia Utilizada ........................................................................ 40
4.2 – Seleção de Pacientes ................................................................................................ 41
4.3 – Critérios de Inclusão e Exclusão ............................................................................. 41
4.4 – Realização dos Exames Sorológicos e Parasitológicos ........................................... 42
4.5 - Diagnóstico Sorológico .......................................................................................... 42
4.5.1 – Imunofluorescência Indireta – IFI ................................................................... 42
4.5.2 – Teste Imunoenzimático – ELISA ..................................................................... 43
4.5.3 – Hemaglutinação Indireta – HAI ....................................................................... 43
xiv
4.6 – Diagnóstico Parasitológico ...................................................................................... 44
4.6.1 – Pesquisa Direta do Parasito ................................................................................. 44
4.6.2 – Hemocultura ......................................................................................................... 44
4.7 – Extração de DNA de Células Sanguíneas............................................................... 45
4.8 – Reação de Polimerização em Cadeia (PCR)............................................................ 46
4.9 –Análise Eletroforética dos Produtos de PCR ............................................................ 47
4.10 – Amplificação das Regiões Flanqueadoras do kDNA de Trypanosoma cruzi
Integrado no Genoma Humano......................................................................................... 47
4.11 – Clonagem, Transformação em Escherichia coli Competente e Extração de DNA
Plasmidial ......................................................................................................................... 50
4.12 – Southern Blot ........................................................................................................ 51
4.12.1 - Southern Blot Dos Produtos de PCR ............................................................... 51
4.13-Transferência de Colônias de Bactérias Transformantes para Membrana de Nylon
......................................................................................................................................... 52
4.14 – Marcação de Sondas Radioativas ......................................................................... 53
4.15 – Purificação de Sondas Radioativas ....................................................................... 53
4.16 - Hibridização ........................................................................................................... 53
4.17 – Revelação das Películas ...................................... Erro! Indicador não definido.55
4.18 – Sequenciamento dos Clones e Análise em Banco de Dados ............................... 55
5 – Resultados ..................................................................................................................... 56
5.1 – Manuscrito 1 ............................................................................................................ 57
5.2 – Manuscrito 2 ........................................................................................................... 69
5.3 – Manuscrito 3 ........................................................................................................... 83
6 - Conclusões .................................................................................................................... 109
7 – Considerações Finais .................................................................................................. 110
xv
8 - Referências Bibliográficas .......................................................................................... 111
9 - Anexos ........................................................................... Erro! Indicador não definido.0
xvi
LISTAS DE FIGURAS E TABELAS
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Distribuição da Doença de Chagas nas Américas.
FIGURA 2: Globalização da Doença de Chagas. Potencial número de imigrantes
originários de países infectados por Trypanosoma cruzi.
FIGURA 3: Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi.
FIGURA 4: Fluxograma de acompanhamento de recém-nascido de mãe com doença de
Chagas.
FIGURA 5: Evolução Clínica da doença de Chagas humana.
FIGURA 6: Estruturas celulares de Trypanosoma cruzi.
FIGURA 7: Representação esquemática do minicírculo mostrando a organização das
quatro regiões conservadas.
FIGURA 8: Elementos transponíveis.
FIGURA 9: Movimento do Retrotransposons.
FIGURA 10: A modificação da psTAIL-PCR utilizada para detectar integrações de
minicírculos de Trypanosoma cruzi no genoma humano.
FIGURA 11: Regiões de dedução dos primers utilizados na psTAIL PCR.
xvii
FIGURA 12: Placa demonstrando as colônias azuis e brancas.
FIGURA 13: Corrida do DNA no gel de agarose e a sua transferência para membranas.
FIGURA 14: Repique dos clones das bactérias transformantes e lavagem das membranas.
FIGURA 15: Esquema de hibridização das membranas com sonda radioativa.
MANUSCRITO 3:
FIGURA 1: Integração de sequência de minicírculo de kDNA de Trypanosoma cruzi no
genoma do paciente número 927 RN.
FIGURA 2: Integração de sequência de minicírculo de kDNA de Trypanosoma cruzi no
receptor olfatório OR1-17 no genoma do paciente número 922 RN.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Primers utilizados nas reações de PCR.
MANUSCRITO 1
TABELA 1: Resultados sorológicos e parasitológicos da mãe cronicamente infectada e do
seu recém-nascido com infecção congênita pelo Trypanosoma cruzi.
MANUSCRITO 3
TABELA 1. Resultados Sorológicos das Crianças (recém-nascidos + crianças até um ano
de idade).
TABELA 2. Resultados Moleculares dos Filhos e das Mães.
TABELA 3. Distribuição das integrações dos LINEs nos cromossomos das mães e filhos
xviii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
32
P Isótopo radioativo fósforo-32
ATPases Enzima adenosina trifosfato
BLASTn Basic Local Alignment Search Tool
Ca2+
Cálcio
Carsbs Conserved cytosine/adenine-rich sequence blocks
CCC Cardiopatia Chagásica Crônica
CIUR Crescimento intra-uterino restrito
CSBs Conserved Sequence Blocks
dATP Desoxiadenosina trifosfato
DC Doença de Chagas
DCC Doença de Chagas Congênita
dCTP Desoxicitosina trifosfato
dGTP Desoxiguanosina trifosfato
dTTP Desoxitimidina trifosfato
DNTPs Desoxirribonucleotídeos Fosfatados
DO Densidade Óptica
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EPI Forma epimastigota
FC Forma Cardíaca
FD Forma Digestiva
FI Forma Indeterminada
g Força centrífuga
gRNA Ácido Ribonucléico guia
H2O
2 Peróxido de Hidrogênio
HAI Reação de Hemaglutinação Indireta
HC Hospital das Clínicas
HCl Ácido Clorídrico
H2Odd Água destilada e deionizada
xix
IFI Imunofluorescência Indireta
IFN-ɤ Interferon-gama
IgM Imunoglobulina M
IgG Imunoglobulina G
IL-2 Interleucina-2
IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
kb Quilobase
KCl Cloreto de Potássio
kDNA Ácido desoxirribonucleico do cinetoplasto ou DNA
do cinetoplasto
LAERPH Laboratório de Estudos da Relação Parasito
Hospedeiro
LIT Liver Infusion Tryptose
LINE(L1) Long Interspersed Nucleotide Element
LMPDC Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença
de Chagas
LTR Long Terminal Repeat
ME Mini-exon
Meio LB Meio Luria-Bertani
MgCl2 Cloreto de Magnésio
mL Mililitros
µL Microlitros
Mpb Um milhão de pares de bases
ng Nanograma
mRNA Ácido Ribonucléico Mensageiro
N2 Nitrogênio
NADH desidrogenase Nicotinamida Adenina Dinucleótido Hidreto
desidrogenase
NaOH Hidróxido de sódio
ORF Open Reading Frame
pb Pares de bases
xx
PBS Salina tamponada com fosfato
PCR Reação de Polimerização em Cadeia
PEG Polietileno glicol
pg Picograma
psTAIL PCR Primer Specific Thermal Asymetric Interlaced – PCR
rRNAs Ácido Ribonucléico Ribossômico
SAMIS Serviço de Arquivo Médico e Informações de Saúde
SBF Soro Bovino Fetal
SDS Dodecil sulfato de sódio
SL Spliced leader
SINE Short Interspersed Nucleotide Element
SC Sorologia Convencional
SSC Standard Saline Citrate
SSPE Solução salina-fosfato- EDTA
WHO World Health Organization
X-gal 5- bromo-1-cloro-3-indoil-D-galactosídeo
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TDR Training in Tropical Diseases
TEs Elementos Transponíveis
TGF-β Fator de Crescimento e Transformação beta
TGH Transferência Gênica Horizontal
TGV Transmissão Gênica Vertical
TMB Tetrametilbenzidina
Tm Temperatura média de anelamento em°C.
TAIL PCR Thermal Asymmetric Interlaced – PCR
tRNA Ácido Ribonucléico transportador
TSD Target Site Duplications
UFG Universidade Federal de Goiás
xxi
RESUMO
Após mais de um século da descoberta da doença de Chagas, cujo agente etiológico é o
parasito denominado Trypanosoma cruzi, muito ainda há para ser desvendado sobre essa
doença. O polimorfismo, a forma de reprodução, a correlação entre cepa e forma clínica,
métodos sorológicos e moleculares, transferência gênica e suas consequências clínicas,
tratamento e cura são tópicos que envolvem grandes questionamentos ainda não totalmente
elucidados pelos pesquisadores desta enigmática doença.
O controle de doadores em bancos de sangue e a diminuição nos índices de transmissão
vetorial fizeram com que a transmissão congênita ganhasse uma maior importância. No
presente estudo, o monitoramento das mulheres durante a gestação possibilitou o
acompanhamento do recém-nascido até os nove meses de idade, fase na qual se espera que
os anticorpos maternos tenham desaparecido por completo.
Para se conhecer a população de gestantes infectadas por Trypanosoma cruzi, no serviço da
Maternidade de um Hospital Universitário, 1.979 prontuários foram analisados num
intervalo de três anos (2010 a 2012). Perfis socioeconômicos e demográficos, assim como
as características reprodutivas e sorológicas foram estudados. Tiveram sorologia positiva
para Tripanossomíase Americana 3,1% das mulheres (61/1.979) e poucas relataram aborto.
Estudos sobre o aborto demonstraram que em mães infectadas que não transmitiram sua
infecção ao feto não houve maior frequência de aborto, prematuridade e mortalidade
perinatal, porém, houve uma maior tendência à natimortalidade nas mães que transmitiram
a infecção aos seus filhos.
Trinta e oito gestantes participaram de uma pesquisa para verificar a integração de
minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi em seus filhos. Também fizeram parte da
pesquisa quarenta crianças, incluindo um par de gêmeos.
Para o diagnóstico sorológico as três técnicas convencionais de ELISA, IFI e HAI foram
realizadas em todas as amostras. Todas as mães confirmaram a positividade da doença de
Chagas pela sorologia. Duas crianças tiveram diagnóstico sorológico e molecular positivos
para doença de Chagas, caracterizando a transmissão congênita, além da transferência
gênica horizontal. As reações de polimerização em cadeia (PCR) foram realizadas visando
identificar a presença de DNA nuclear (nDNA) e mitocondrial (kDNA) nas amostras
estudadas. As amplificações foram realizadas em triplicata com cada par de primers, para
xxii
confirmação diagnóstica. A amplificação do material nuclear de T. cruzi ocorreu em 92,1%
das mães e em 10% das crianças (4/40). Cerca de 70% das crianças e 92,1% das mães
tiveram amplificação do DNA do cinetoplasto do parasito. A maior parte dos eventos de
integração de minicírculos de kDNA ocorreu por meio de elementos móveis, sendo a
maioria deles o retrotransposon LINE-1. O cromossomo X foi o local onde se observou
maior número de integrações.
xxiii
ABSTRACT
After more than a century the discovery of Chagas disease, which etiological agent parasite
is called Trypanosoma cruzi, there is still much to be revealed about this disease.
Polymorphism, how to play, the correlation between strain and the clinical, serological and
molecular methods, gene transfer and its clinical consequences, treatment and cure are
topics that involve major issues still not completely understood by researchers of this
enigmatic disease.
The control of donors in blood banks and the reduction of vector transmissions rates
caused the congenital transmission to gain greater importance. In this study, monitoring
women during pregnancy allowed the accompaniment of the newborn to nine months of
age, at which stage it is expected that maternal antibodies have disappeared completely.
To know the population of pregnant women infected by Trypanosoma cruzi, in the service
of a Maternity Hospital, 1979 records were analyzed at an interval of three years (2010 to
2012). Socioeconomic and demographic profiles, as well as reproductive and serological
features were studied. Had positive serology for American trypanosomiasis 3.1% of
women (61/1.979) and a few of them reported abortions. Studies have shown that abortion
in infected mothers who failed to transmit their infection to the fetus had no greater
frequency of miscarriage, prematurity and perinatal mortality, but there was a greater
tendency to stillbirth in mothers who transmitted the infection to their children.
Thirty-eight pregnant women participated in a survey to verify the integration of kDNA
minicircles of Trypanosoma cruzi in their children. Also part of the research forty children,
including a set of twins.
For serological diagnosis three techniques conventional ELISA and IFI e HAI were
performed on all samples. All mothers confirmed the positivity of Chagas disease by
serology. Two children had positive serological and molecular diagnosis of Chagas
disease, congenital transmission featuring, in addition to horizontal gene transfer. The
Polymerase Chain Reactions (PCR) were performed to identify the presence of nuclear
DNA (nDNA) and mitochondrial (kDNA) in the samples studied. The amplifications were
performed in triplicate with each primer pair for diagnostic confirmation. The
amplification of the nuclear material T. cruzi occurred in 92.1% of mothers and 12.5% of
children (5/40). Approximately 70% of children and 92,1% of mothers had exclusive
xxiv
amplification of kinetoplast DNA of the parasite. Most integration events occurred in
kDNA minicircles by means of movable elements, most of which are the retrotransposon
LINE-1. The X chromosome was where there was a greater number of integrations.
1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1-INTRODUÇÃO
1.1 – A DOENÇA DE CHAGAS
A infecção pelo parasito Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é um grande problema de
saúde pública em 21 países endêmicos da América, com uma prevalência estimada de
quase 10 milhões de pessoas infectadas (Dorn e cols 2007, WHO 2010). Descoberta e
descrita por Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas em 1909, essa enfermidade começou a se
expandir no final do século XIX e alcançou o pico de infectividade na primeira metade do
século XX (Prata 2001). Nos países endêmicos, esta doença representa um alto custo
médico e social, pelo absenteísmo laboral, pela necessidade de procedimentos médicos e
utilização de tecnologias diagnósticas e terapêuticas complexas, além de aposentadoria
precoce por invalidez e anos de vida perdidos por incapacidade laboral (Bittencourt 1992).
Os primeiros registros de infecção humana por T. cruzi datam de 9.000 anos,
quando os primeiros humanos povoaram a Costa Andina (Aufderheide e cols 2004). No
Brasil, Lima e colaboradores (2007) também identificaram a infecção por T. cruzi em um
corpo mumificado de 7.000 anos. Os dados da paleoparasitologia mostram que esta
infecção encontrava-se em populações pré-colombianas tanto nas regiões andinas como no
cerrado brasileiro, ou nas planícies desérticas norte-americanas (Aufderheide e cols 2004).
Análises moleculares de tecidos extraídos de múmias humanas do Chile do Norte e no sul
do Peru mostraram a presença de DNA do cinetoplasto do parasito em 41% das amostras
colhidas (Aufderheide e cols 2004). O contato desses grupos humanos com outros
mamíferos infectados com o parasito parece ter sido a principal via de transmissão da
doença. Acredita-se que após a primeira infecção humana, iniciou-se o processo de
domiciliação, o que proporcionou aos vetores, proteção às variações climáticas e
predadores, consolidando, assim a doença humana (Guhl e cols 2000). Acredita-se,
portanto que a expansão principal da doença humana tenha ocorrido no século XVII, com
as migrações dos colonizadores europeus para as regiões do interior da América Latina
(Schofield 1994).
2
O contato próximo entre os vetores, os reservatórios e os seres humanos é
fundamental para a transmissão da doença. De fato, estudos têm mostrado que animais
domésticos infectados são importantes reservatórios para a manutenção da transmissão
natural em áreas endêmicas (Levy e cols 2006, Gurtler e cols 2007). Condições precárias
de moradia oferecem um ambiente adequado para a nidificação de vetores e a proximidade
aos mamíferos, inclusive o homem oferece alimento abundante para esses insetos. Há
presença de T. cruzi tanto em vetores potenciais nos Estados Unidos, quanto em um grande
número de reservatórios animais infectados (Beard e cols 2003, Hancock e cols 2005).
A situação epidemiológica da doença de Chagas no Brasil foi substancialmente
alterada, como resultado das ações de controle e também, em função de mudanças
resultantes de transformações ambientais e de ordem econômica e social (Silveira 2011).
Apesar de a transmissão vetorial ainda ser a forma mais importante de transmissão da
doença na América Latina, outras formas têm agora importância epidemiológica, como a
transmissão transplacentária ou por via oral. Por exemplo, a ingestão de sucos de frutas
contaminados não pasteurizados foi responsável por novos casos da doença de Chagas em
áreas onde casos agudos não tinham sido detectados há mais de 15 anos (Steindel e cols
2008), sugerindo um repovoamento pelos vetores em tais áreas. A infecção por meio de
transfusão de sangue ou transplante de órgãos está presente também em países não
endêmicos, devido à falta de triagem de sangue e órgãos para se verificar a presença do
parasito (Leiby e cols 2002). Em virtude das correntes migratórias cada vez mais frequentes
da América Latina para os Estados Unidos e o Canadá, existe a preocupação de que possa
haver a introdução de números significativos de doadores soropositivos para a infecção,
contribuindo para o estoque de sangue contaminado durante a transfusão sanguínea
(Tarleton e cols 2007). A doença de Chagas está sendo considerada emergente em países
considerados não endêmicos como Japão, Canadá, Alemanha, Romênia, Espanha e Estados
Unidos (Dorn e cols 2007, Tarlenton e cols 2007).
Esta infecção é considerada uma doença negligenciada com deficiências no
tratamento, havendo uma necessidade urgente de desenvolver alternativas de controle para
as principais doenças negligenciadas tropicais (DNT). O Instituto Carlos Slim de la Salud
lançou uma iniciativa conjunta com EUA-México para desenvolver vacinas contra DNT,
iniciando com a doença de Chagas e Leishmaniose cutânea. Seus esforços iniciais estão
3
concentrados no desenvolvimento de uma vacina terapêutica para a doença de Chagas com
ênfase em dois antígenos recombinantes de T. cruzi, Tc24 e TSA-1 (Hotez e cols 2012,
Instituto Carlos Slim de la Salud 2010).
1.2- ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA DOENÇA DE CHAGAS
As características epidemiológicas da infecção chagásica nas Américas podem ser
agrupadas em quatro grupos de países (Figura 1), de acordo com os ciclos de transmissão e
os programas de controles do vetor e dos bancos de sangue (Schmunis 1994, Carlier & cols
2002, Dias & Macedo 2005).
Grupo I, que inclui Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Equador, Honduras, Paraguai,
Peru, Uruguai e Venezuela, é caracterizada por ciclos doméstico e peridoméstico com
zonas de elevada prevalência de infecção humana, uma predominância de cardiopatia
chagásica crônica, a ausência ou raras das formas digestivas, no norte da linha Equatorial;
importantes ciclos silvestres em vários ambientes naturais, incluindo Triatoma infestans (T.
infestans) em áreas restritas, na Bolívia e programas de controle do vetor e de transfusão na
maioria dos países, com perspectivas de eliminação de T. infestans (já atingido no Brasil,
Chile e Uruguai) e Rhodnius prolixus, que são espécies eminentemente domésticos.
Grupo II, o qual inclui Colômbia, Costa Rica e México, caracteriza-se por ciclos
domésticos e peridoméstico com a presença de cardiopatia crônica; a ocorrência de
doadores infectados; a detecção de ciclos silvestre e ausência de programas de controle
incipientes.
Grupo III, que inclui El Salvador, Guatemala, Nicarágua e Panamá, apresenta ciclos
domésticos, peridomiciliar e silvestre com poucas informações clínicas e o início de ações
de controle na Guatemala e Nicarágua.
Grupo IV, que inclui as Antilhas, Bahamas, Belize, Cuba, Estados Unidos, Guiana,
Guiana Francesa, Haiti, Jamaica e Suriname, apresenta ciclos silvestres com raros casos de
casos humanos autóctones e poucas informações clínicas; numerosos imigrantes infectados
nos Estados Unidos e ausência um dos programas de controle onde casos de transmissão
transfusional já foram descritos.
4
Figura 1 - Distribuição da Doença de Chagas nas Américas (*).
(*) Coura JR, Dias JCP 2009. Epidemiology, control and surveillance of Chagas disease: 100 years
after its discovery. Mem Inst Oswaldo Cruz 104(Supl.1): 31-40.
Um novo problema epidemiológico, econômico, social e político tem sido criado
com a internacionalização da doença de Chagas devido à migração legal e ilegal dos países
endêmicos da América Latina para países não endêmicos na América do Norte, Europa,
Ásia e Oceania, em especial os Estados Unidos, Canadá, Espanha, França, Suíça, Japão,
países emergentes da Ásia e Austrália (Schmunis 2007). Essas migrações (Figura 2)
criaram novos problemas epidemiológicos e de saúde pública para os países que receberam
os imigrantes infectados. Esses problemas incluem riscos de transfusão sanguínea, de
transplantes de órgãos e transmissão congênita, bem como uma necessidade de cuidados
médicos para pacientes chagásicos e controles adicionais sobre os bancos de sangue em
países com pouca experiência neste assunto. Por outro lado, para além dos aspectos
médicos, sociais e econômicos, um problema político no controle da migração foi criado,
uma vez que a imigração é muitas vezes necessária para prover mão- de- obra nos países
mais desenvolvidos (Coura & Dias 2009).
5
A transmissão vetorial pode ainda ser responsável por mais de 70% dos casos em
países em que não há nenhum controle sistemático do vetor. Da mesma forma, a
transmissão, por meio de transfusões de sangue pode ocorrer em até 20% dos casos em
locais onde não há controle sobre os bancos de sangue, tais como na Bolívia. A transmissão
congênita apresenta grande variação regional de 0,5-10% dos casos, em lugares como
Chile, Bolívia e Paraguai. Embora a transmissão oral seja acidental, ela pode ser
considerada endêmica na região amazônica (Fraiha & cols 1995, Valente & cols 1999,
Junqueira & cols 2005, Pinto & cols 2008).
Estudos mostram prevalência da infecção humana no Brasil inferior a 0,2%, sendo o
perfil epidemiológico do paciente com doença de Chagas o de um indivíduo adulto, de
origem rural, de baixo nível instrucional e vivendo em centros urbanos no chamado extrato
terciário de trabalho (Dias 2007).
No Brasil, estudos em áreas endêmicas têm evidenciado que a distribuição das
formas clínicas apresenta diferenças regionais. Na Bahia parece predominar as formas
cardíacas, em Goiás, megas esôfago e intestino, em Minas Gerais, formas mistas (cardíaco
e digestivo); no Rio Grande de Sul e no Rio de Janeiro a maioria dos chagásicos é
assintomática (Coura e cols 1983, Teixeira e cols 2006).
Figura 2 - Globalização da Doença de Chagas. Potencial número de imigrantes
originários de países infectados por Trypanosoma cruzi (*).
(*) Adaptação de Schmunis G 2007. The globalization of Chagas disease.
ISBT Science Series 2(1): 6-11.
6
Entre os anos de 2001 a 2008 foi realizado no Brasil, um inquérito de
soroprevalência da doença de Chagas, com exceção do estado do Rio de Janeiro, no qual a
população alvo foram crianças de área rural, com até cinco anos de idade. Foram estudadas
104.954 crianças, das quais 32 (0,03%) foram confirmadas como infectadas, sugerindo
transmissão congênita, pois as respectivas mães foram positivas para doença de Chagas, 11
(0,01%) com positividade apenas nas crianças (indicativo de provável transmissão vetorial)
e uma criança positiva, cuja mãe havia falecido. Estes dados apontam no sentido de uma
alteração relativa na importância dos mecanismos de transmissão no Brasil como um todo
(Ostermayer & cols 2011).
1.3-CICLO BIOLÓGICO
Sendo um parasito heteroxênico, durante o seu ciclo natural, apresenta uma fase
replicativa e intracelular no hospedeiro vertebrado e outra extracelular no inseto vetor
(triatomíneo). Seu ciclo de vida compreende basicamente três formas morfológicas e
funcionais distintas: amastigota, epimastigota (com cinetoplasto justanuclear e anterior ao
núcleo) e tripomastigota (com cinetoplasto posterior ao núcleo) (Brener, 1973).
No inseto vetor, o parasito prolifera-se no lúmen do trato gastrintestinal sob a forma
não infectiva epimastigota e, quando migra para o reto, é exposto ao estresse nutricional,
aderindo à glândula retal. Neste local, transforma-se morfogeneticamente na forma
infectiva tripomastigota metacíclica (Zeledón & cols 1984), por um processo de
transformação celular denominado de metaciclogênese. Os tripomastigotas são eliminados
junto às fezes e urina quando o triatomíneo hematófago se alimenta no hospedeiro
vertebrado. Estas formas infectivas podem entrar em contato com soluções de continuidade
da pele ou mucosas desse hospedeiro e, consequentemente, invadir células adjacentes.
Após a invasão, os tripanossomatídeos aderem à superfície celular, sendo posteriormente
fagocitados. Dentro das células, os tripomastigotas são envoltos por uma membrana,
formando o vacúolo parasitóforo que sofrerá fusão com lisossomos da célula hospedeira. O
vacúolo torna-se então ácido e ocorre o início do processo de diferenciação das formas
tripomastigotas para a forma intracelular amastigota, que se multiplica por divisão binária
(Burleigh & Woolsey 2002). O meio ácido propicia a liberação de enzimas pelo T. cruzi
(Andrews e cols 1990, De Souza 2000), que favorece a lise do vacúolo parasitóforo.
7
Assim, o parasito fica em contato direto com o citoplasma da célula invadida. Após se
replicarem, os amastigotas iniciam um processo inverso de transformação, ou seja,
reestruturam-se para a forma tripomastigota e, posteriormente, com a ruptura da membrana
plasmática da célula hospedeira, alcançam a corrente sanguínea e invadem outras células.
Com replicação em intervalo médio de 15 horas, um ciclo intracelular completo requer
cerca de quatro dias (Engel & cols 1985). Quando o triatomíneo ingere sangue de animais
ou do homem infectado com T. cruzi, o ciclo é reiniciado (Figura 3).
O destino da infecção depende da habilidade de as formas tripomastigotas
virulentas escaparem do ataque das enzimas digestivas no fagolisossoma. Mecanismos de
defesa do hospedeiro são capazes de controlar superinfecções, quando quantidade
moderada ou de baixa densidade de flagelados invadem células fagocíticas (monócitos,
histiócitos e macrófagos) do sistema de defesa do indivíduo (Teixeira 1987). A infecção
por T.cruzi leva à mobilização de múltiplos mecanismos humorais e celulares da resposta
imune adaptativa, assim como mecanismos inespecíficos da imunidade inata, os quais
levam à eliminação dos parasitos da circulação e a diminuição de sua replicação
intracelular. Entretanto, tais mecanismos não eliminam totalmente o parasito e a
persistência da resposta imune pode levar ao surgimento de lesões teciduais que podem
causar alterações morfológicas (Brener & cols 2000). Além disso, os anticorpos líticos
também constituem fatores de proteção, por mediarem a lise das formas tripomastigostas
deste parasito (Ministério da Saúde 2005).
8
Figura 3: Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi. Adaptado de CDC 2011.
1.4 – MECANISMOS DE TRANSMISSÃO
A doença de Chagas é transmitida naturalmente ao homem e a outros animais por
intermédio de hemípteros hematófagos da subfamília Triatominae contaminados com T.
cruzi. A intensa campanha de combate ao inseto transmissor, desencadeada pelos serviços
de saúde do nosso país, diminuiu a transmissão pelo T. infestans, em extensas regiões de
vários estados da Federação, assim como também a extensa cobertura de sorologia pré
transfusional praticamente aboliu a transmissão do parasito em bancos de sangue
brasileiros. Todavia, o parasito permanece sendo transmitido por vias alternativas, como a
transmissão congênita, por transplantes e via oral (Focaccia 2010). O perfil epidemiológico
da doença apresenta um novo cenário com a ocorrência de casos e surtos na Amazônia
Legal por transmissão oral e vetorial (sem colonização e extradomiciliar). Com isso,
evidenciam-se duas áreas geográficas onde os padrões de transmissão são diferenciados: a)
a região originalmente de risco para a transmissão vetorial, onde ações de vigilância
9
epidemiológica, entomológica e ambiental devem ser concentradas, com vistas à
manutenção e sustentabilidade da interrupção da transmissão da doença pelo T.infestans e
por outros vetores passíveis de domiciliação; b) a região da Amazônia Legal, onde a
doença de Chagas não era reconhecida como problema de saúde pública, as ações de
vigilância devem ser estruturadas e executadas de forma extensiva e regular na região por
meio de: detecção de casos febris, apoiada na vigilância da malária; identificação e
mapeamento de marcadores ambientais, a partir do reconhecimento dos ecótopos
preferenciais das diferentes espécies de vetores prevalentes e na investigação de situações
em que há evidências ou suspeita de domiciliação de alguns vetores. Surtos de Doença de
Chagas Agudo (DCA) relacionados à ingestão de alimentos contaminados (caldo de cana,
açaí, bacaba entre outros) e casos isolados por transmissão vetorial extradomiciliar vem
ocorrendo especialmente na Amazônia Legal. No período de 2000 a 2011, foram
registrados no Brasil 1.252 casos de doença de Chagas aguda. Destes, 70% (877/1.252)
foram por transmissão oral, 7% por transmissão vetorial (92/1.252), em 22% (276/1.252)
não foi identificada a forma de transmissão (portal.saude.gov.br).
Acidentes laboratoriais também são possíveis mecanismos de transmissão
chagásica. Nesses casos, a infecção pode ser devida a contato com culturas de T. cruzi,
exposição às fezes infectadas de triatomíneos ou a sangue, de paciente ou animal, contendo
a forma tripomastigota. Apesar de a forma epimastigota ser a predominante em culturas
axênicas, os tripomastigotas podem estar presentes e causar infecção em casos de contato
com mucosas ou micro-lesões de pele. Experimentalmente, já se comprovou a
possibilidade de infecção por meio da mucosa oral e conjuntival (Herwaldt 2001).
Também há relatos de contaminação cirúrgica a partir de pacientes agudos, coleta de
sangue que nesses casos, são por deficiências de segurança no transporte de materiais
infectados (Brener & cols 1997, Luqueti & Rassi 2000, Dias & Macedo 2005). Os fatores
de risco passam por desconhecimento, desatenção, falta ou mal uso de equipamentos de
proteção individual, instalações e equipamentos inadequados, iluminação deficiente, falta
de capacitação etc (Carlier & cols 2002, Dias & Macedo 2005).
10
1.5 – TRANSMISSÃO CONGÊNITA
A melhor maneira de prevenir a transmissão congênita é detectá-la e oferecer
tratamento específico o mais cedo possível (Dias 1997, Moya & Moretti 1997, Amato-
Neto e cols 2000, WHO 2002). Testes em grávidas com doença de Chagas deve idealmente
iniciar na fase pré-natal, a fim de acompanhar os seus filhos a partir do momento de seu
nascimento. Isto também permite um melhor atendimento para a mulher infectada (Luqueti
& Rassi 2000, Carlier e cols 2002). Na prática, para áreas endêmicas e suspeita
epidemiológicas, os recém-nascidos devem ser submetidos a testes sorológicos
convencionais ao nascer (testes anti-T. cruzi IgG) e crianças soropositivas devem ser
acompanhadas até que elas estejam em torno de sete ou oito meses de idade. Nessa idade,
os testes sorológicos devem ser repetidos, e somente aqueles que são positivos, devem ser
tratados (Dias 1997, Carlier e cols 2002). Para todos os casos tratados, seguimentos
clínicos e sorológicos anuais de 3-5 anos são recomendados. A cura é comprovada quando
há uma resposta completa e persistentemente negativa por, pelo menos, dois anos. No final
do período de cinco anos, resultados sorológicos positivos podem significar insucesso
terapêutico, e, por conseguinte, tais crianças teriam de ser tratadas novamente e
acompanhados clinicamente (Dias 1997, Luquetti & Rassi 2000).
A transmissão congênita da doença de Chagas implica em uma mãe soropositiva
para T. cruzi e uma detecção de parasitos no recém-nascido após o parto. Ao analisarem
152 hemoculturas de mulheres infectadas por T. cruzi (101 gestantes e 51 não gestantes),
Siriano e cols 2011 obtiveram positividade em (76 de 152) dessas mulheres. Os resultados
mostraram que a positividade foi de 29,4% (15 de 51) entre mulheres não gestantes e
60,4% (61 de 101) em gestantes (p <0,05). Os resultados obtidos levaram a conclusão que
a gravidez aumenta a parasitemia na doença de Chagas. Em função desses resultados, vale
destacar a importância do acompanhamento de gestantes infectadas por T. cruzi durante o
pré-natal, pela eminente possibilidade da transmissão vertical durante esse período.
No Brasil, a prevalência da infecção por T. cruzi em gestantes se encontra na faixa
de 0,2 a 33% (Gontijo e cols 2009), justificando a pesquisa desta infecção nos exames pré-
natais e em recém-nascidos de mulheres infectadas. Em outros países latinos como na
Argentina a taxa de transmissão congênita é 4% a 6%, no Chile 2% a 3% e 12% na Bolívia
(Bittencourt 2000).
11
Formas menos frequentes de transmissão materna da doença de Chagas podem
ocorrer pela contaminação oral, pelo líquido amniótico e a transmissão hematogênica
durante o trabalho de parto (Sarasúa 1993). Quanto ao aleitamento materno, sua ocorrência
é excepcional e os poucos casos suspeitos envolveram mulheres com sangramento
mamilar. Assim, sugere-se a interrupção da amamentação, por algum tempo, apenas em
mulheres em fase aguda, em estado de reativação dessa doença (alta parasitemia) ou
infectadas crônicas que apresentem rachaduras ou sangramento nos mamilos e aréolas
(Dias & Amato-Neto 2011).
A doença de Chagas congênita é diagnosticada por exame microscópico direto em
amostras de sangue, por PCR ou testes sorológicos convencionais. Estes últimos podem ser
realizados em lactentes, quando espera-se que os anticorpos IgG transferidos pela mãe
tenham sido eliminados oito a nove meses após o nascimento (Fretes e cols 2012).
Portanto, acredita-se que a doença de Chagas congênita é o produto de uma complexa
interação entre o parasito, as respostas imunes maternas e fetais e fatores placentários
(Burgos e cols 2007, Kemmerling e cols 2010). Alguns fatores podem estar relacionados
com a transmissão do protozoário durante a gestação, como a associação do baixo peso e
prematuridade com os recém-nascidos infectados (Sanches-Negrette e cols 2005), relação
da infecção congênita com alta carga parasitária das mães e uma resposta imunológica
deficiente (Herman e cols 2004), além do período de infecção da mãe durante a gestação
(Moretti 2005).
Inúmeros autores têm demonstrado a importância da transmissão congênita desta
doença não só experimentalmente, mas também no homem. A transmissão congênita foi
suspeitada por Carlos Chagas em 1911, mas somente foi confirmada em humanos no ano
de 1949 por Dao, na Venezuela (Dao 1949). Talvez porque a infecção congênita não
apresente sinais clínicos específicos. Os recém-nascidos infectados geralmente são
assintomáticos ou têm manifestações sutis. Os 10% a 40% dos recém-nascidos que são
sintomáticos podem ter baixo peso ao nascer, índice de Apgar baixo,
hepatoesplenomegalia, dificuldade respiratória, anasarca, insuficiência cardíaca, ou
meningoencefalite (Oliveira e cols 2010). Sendo a mãe sabidamente positiva para a
infecção por T. cruzi , o recém-nascido deve ser testado e, se infectados,o tratamento deve
ser imediato (Centers for Disease Control and Prevention 2012).
12
A transmissão congênita do tripanossoma parece depender de fatores como
reinfecções frequentes e/ou infecção com cepas mais virulentas (Hermann e cols 2004). A
alta parasitemia materna está relacionada, em geral, com maior transmissão. A infecção
congênita pode ocorrer em 71% dos recém-nascidos de mães com infecção aguda durante a
gravidez e em 1,6% na fase crônica de doença (Freilij & Altcheh 1995, Torrico e cols
2004). Entretanto são poucas as descrições de grávidas em fase aguda, não havendo
obrigatoriamente relação entre eles e maior probabilidade de transmissão (Moretti 2005).
Na fase crônica, a baixa parasitemia poderia minimizar as chances de transmissão
transplacentária, haja vista a desproporção entre a prevalência de gestantes com sorologia
positiva para Chagas e os recém-nascidos contaminados (Silveira 1994).
A transmissão congênita da doença de Chagas resulta do complexo equilíbrio entre
a resposta imune materna, fatores placentários e fatores associados ao parasito (Carlier
2005). Durante a gravidez, é necessária uma tolerância do sistema imune materno aos
antígenos fetais e um dos mecanismos responsáveis por essa tolerância é o desvio da
resposta imune para o tipo 2, inibindo a resposta do tipo 1. Essa alteração da resposta
imune pode aumentar a susceptibilidade da puérpera às infecções por protozoários, que
normalmente são controladas por uma resposta imune Th1 (Bittencourt 1992, Salas 2007).
1.5.1 – DIAGNÓSTIGO DA TRANSMISSÃO CONGÊNITA
A detecção da persistência de anticorpos anti-T. cruzi após os seis meses de vida
(Figura 4), sugere a existência da infecção, torna-se um procedimento laboratorial de
grande valia, na medida em que a detecção de anticorpos específicos da classe IgM pode
ser passível de inúmeros erros, como a passagem placentária anormal de IgM materna e a
presença de anticorpos tipo fator reumatóide dirigidos contra alótipos da IgM materna,
ocasionando resultados falsos positivos. Falsos negativos também podem ocorrer, havendo
inúmeros relatos descritos na literatura que os comprovam, entre eles um caso de Doença
de Chagas Congênita (DCC) com megaesôfago, em que a detecção de T. cruzi pelo exame
direto do sangue do recém-nato foi positiva, mas anticorpos da classe IgM não foram
detectados pela Imunofluorescência Indireta (IFI), somente por reações imunoenzimáticas
(ELISA); e um outro caso de DCC com predominante envolvimento do sistema nervoso
13
central no qual foram realizados vários testes sorológicos de IFI-IgM anti-T. cruzi, todos
negativos (Vieira 1983, Bittencourt 1984).
Essas reações falsamente negativas podem ocorrer quando anticorpos fetais da
classe IgM formam complexos com presença de excesso de antígeno. A ausência de
anticorpos IgM anti-T.cruzi na IFI também foi verificada em um caso de DCC com
presença de calcificações cranianas no exame da criança após 5 meses de vida (Moya
1983). Anticorpos IgM anti -T.cruzi por IFI não foram observados em dois dos seis soros
de recém-natos com DCC de área não endêmica de DC (Buenos Aires, Argentina), ou seja,
66% de positividade, reforçando que um resultado negativo não exclui a possibilidade da
DCC (Szarfman e cols 1975).
1.6 – FASES E FORMAS CLÍNICAS DA DOENÇA DE CHAGAS
A doença de Chagas apresenta duas fases: aguda e crônica (Figura 5). A porta de
entrada da infecção pode ser aparente ou inaparente. Quando aparente, pode ser ocular
(sinal de Romaña) ou cutânea (Chagoma de inoculação). Durante a fase aguda da doença, o
parasito está se multiplicando e pode ser detectado por exame direto do sangue. Os sinais e
sintomas da fase aguda da doença de Chagas normalmente desaparecem após 4 a 8
semanas. Na maioria dos indivíduos a resposta imune é capaz de controlar a infecção,
resultando numa redução drástica da parasitemia (Prata 1994). Entretanto, na maioria dos
Mãe com doença de Chagas
Pesquisa de Trypanosoma cruzi no recém-nascido (2 amostras no 1º mês, se possível )
Positiva Negativa ou não realizada
Tratamento parasiticida IgG com 6 a 9 meses de vida
Positiva Negativa
Alta
Figura 4- Fluxograma de acompanhamento de recém-nascido de mãe com doença de
Chagas (Adaptado: Consenso Brasileiro em Doença de Chagas). Rev Soc Bras Med
Tropical vol 38 (supl III): 1-29 2005.
14
pacientes (70%), essa fase passa despercebida por causa do não reconhecimento, pela
pobreza ou ausência de manifestações clínicas e apresentam apenas a sorologia positiva
para infecção por T. cruzi, caracterizando a forma clínica crônica indeterminada (Dutra e
cols 1994, Rassi e cols 2000, Prata 2001). Assim, os pacientes indeterminados representam
um exemplo dramático de coadaptação entre o hospedeiro e o parasito na doença de
Chagas e considerando o tempo de coevolução da relação hospedeiro-parasito, neste caso,
faz sentido que a maioria dos indivíduos infectados permaneça assintomática (Rocha e cols
2007). Em torno de 5 a 10% dos pacientes sintomáticos morrem durante esta fase (Andrade
e cols 2011).
Depois desse período ou gradativamente após a fase aguda, os infectados podem
apresentar alterações em vários sistemas e órgãos, acometendo predominantemente o
coração, esôfago, cólon e/ou sistema nervoso, o que vai caracterizar as diferentes formas
clínicas sintomáticas desta fase (Prata 2001). O parasitismo, que em geral é intenso na
primeira fase da doença, parece desempenhar papel importante na patogênese da resposta
inflamatória. À medida que a infecção evolui, o número de parasitos se reduz
acentuadamente e, na fase crônica da doença, há desproporção entre o número de parasitos
nos tecidos e a resposta inflamatória. Em virtude da escassez do parasito nas lesões e das
características morfológicas da resposta inflamatória, levanta-se a suspeita de que a
inflamação possa relacionar-se com mecanismos imunológicos. Deve-se, entretanto, frisar
que mecanismos imunológicos, ao que tudo indica, desempenham papel importante na
patogênese da tripanossomíase desde a fase aguda da doença (Coura 2007).
A variabilidade das manifestações clínicas desta doença depende da cepa do
patógeno. Isso está relacionado à heterogeneidade de T. cruzi, nível de composição
antigênica e conteúdo de DNA (Zingales 2011). Cepas ou isolados são obtidos de vetores
triatomíneos ou hospedeiros mamíferos incluindo humanos. Pacientes em áreas endêmicas
podem estar infectados por múltiplos contatos com diferentes triatomíneos e esses podem
alimentar-se em diferentes indivíduos infectados. Essa diversidade propicia a formação de
populações multiclonais em hospedeiros e vetores, levando ao isolamento de cepas
multiclonais correspondentes quando multiplicadas em cultura. Análises de microssatélites
(Oliveira e cols 1998) demonstraram a multiclonalidade frequente em cepas de T. cruzi.
15
Apesar dos vários anos de pesquisa e discussão, a causa da doença de Chagas na
infecção crônica por T. cruzi permanece no foco de debates constantes. O principal ponto
de discussão é se a patogenia da doença de Chagas tem caráter autoimune, resultante de
uma resposta imune inapropriada a autoantígenos que são induzidos e talvez perpetuados
pela infecção por T. cruzi, ou se a doença é um resultado da inabilidade, de alguns
hospedeiros, em controlar a infecção adequadamente. (Tarleton 2003).
Figura 5. Evolução Clínica da doença de Chagas humana.
Adaptado de Dutra e cols 2009.
A fase crônica da doença de Chagas pode ser clinicamente evidente após anos ou
décadas da infecção inicial (Brener 1987). A natureza das modificações miocárdicas na
fase crônica tem sido considerada por alguns como um fenômeno autoimune
(Michailowsky e cols 2003). Entretanto, a persistência do parasito em tecidos também tem
sido demonstrada (Vago e cols 2000).
Reativações da doença de Chagas foram descritas em pacientes com leucemia e
com transplante de rins e coração. Imunossupressões podem reativar a doença de Chagas,
16
ocasionando proliferação do parasito, lesões necróticas ou tumorais no cérebro (75%), e
intensificação de miocardites (44%) (Prata 1994). Torna-se imperioso no contexto da
pandemia da infeção pelo HIV, que os clínicos não esqueçam que indivíduos com doença
de Chagas crônica, imunossuprimidos por este agente, possam ter um recrudescimento da
infeção por T. cruzi que passa despercebida ou é erradamente diagnosticada como
toxoplasmose cerebral (Tanowitz e cols 2011). A importância da coinfecção T. cruzi/HIV
deve-se ao risco de reativação da DC crônica na vigência de imunodepressão causada pelo
HIV, particularmente naqueles com linfócitos T-CD4+ < 200 céls/mm (Andrade e cols
2011).
1.6.1– FASES E FORMAS CLÍNICAS DA DOENÇA DE CHAGAS
CONGÊNITA
A infecção materna por T. cruzi pode afetar o crescimento e a maturidade dos fetos
infectados, predispondo ao abortamento, prematuridade, crescimento intra-uterino restrito
(CIUR) e malformações fetais (Streiger e cols 1995 , Carlier & Torrico 2003, Rassi e cols
2004).
Não há um perfil clínico único da doença de Chagas congênita, que varia desde
ausência de sintomas em 50 a 90% dos casos até quadros grave (Carlier & Torrico 2003,
Torrico 2004), reforçando a necessidade do diagnóstico laboratorial (Freiliji 1995,Streiger
& cols 1995,Carlier e Torrico 2003, Rassi e cols 2004, Torrico 2004).Portanto, as crianças
acometidas de forma congênita podem ser classificadas em assintomáticas e sintomáticas.
Quando há sintomas, estes podem ser precoces ou tardios, quer ocorram no
primeiro mês de vida ou mais tardiamente. A hepatomegalia é o sinal mais importante do
acometimento neonatal da doença, seguido pela esplenomegalia. Nos casos não tratados,
estas visceromegalias regridem em cerca de 6 a 12 meses. Em recém-nascido de mãe
chagásica, com hepatoesplenomegalia deve-se pensar em transmissão congênita da doença
(Gontijo e cols 1998). Outras manifestações podem ser: taquicardia, insuficiência cardíaca,
alterações eletrocardiográficas (alterações inespecíficas da repolarização ventricular,
complexos QRS de baixa voltagem), encefalite e meningite (Carlier & Torrico 2003).
Resultados de um estudo em 820 recém-nascidos com peso menor que 2500 g ao
nascimento, da Maternidade Percy Boland, Santa Cruz, Bolívia, revelaram a frequência de
17
21 assintomáticos entre os 78 infectados (26,9%), o que pode ser devido a uma transmissão
recente, nos últimos dias de gestação (Azogue & Darras 1991). No entanto, a maioria dos
recém-natos infectados congenitamente não é prematura, apresenta peso normal e sem
sintomas clássicos de fase aguda, sendo difícil detectar a infecção congênita clinicamente a
não ser por estudos longitudinais ou prospectivos (Moya 1983).
1.7 – PROFILAXIA E TRATAMENTO
A profilaxia da aquisição das infecções por T.cruzi ou daquelas infecções já
instaladas nos hospedeiros mamíferos é altamente recomendável. Ela poderia ser obtida
mediante vacina ou com droga antitripanossoma Essas tarefas formidáveis representam um
desafio ainda não decifrado pela ciência. A imunoprofilaxia contra a infecção intracelular
tem sido considerada fora do alcance da ciência, pelo menos nos dias de hoje. Isso porque
a imunidade específica que estabelece barreira evidente contra o parasito circulante no
sangue não elimina as formas do parasito escondidas nas células musculares não
fagocíticas. Sendo assim, o flagelado persiste no corpo de seu hospedeiro ao longo da vida.
Essa observação tem sugerido que a vacinação contra a doença de Chagas com o
conhecimento biotecnológico agora existente não é factível (Teixeira 2007).
A quimioterapia específica contra T. cruzi tem sido altamente recomendável (Rassi
& Luquetti 1992, Zaidenberg & Segovia 1993, Ministério da Saúde 2005, Teixeira 2007)
porque ela diminuiria a carga parasitária dos reservatórios-hospedeiros. Tal diminuição,
consequentemente, evitaria a contaminação dos triatomíneos-vetores que disseminam a
infecção no peridomicílio. Os nitroderivados antitripanossoma, que suprimem o parasito no
sangue, têm alta toxicidade e requerem prescrição com parcimônia. Por esse motivo, os
nitroderivados com atividade antitripanosômica não eliminam o parasito do corpo do
hospedeiro mamífero e, por isso, são considerados insatisfatórios. As infecções por T. cruzi
ocorrem em uma região circunscrita do mundo que representa um mercado relativamente
pequeno. Por isso, as companhias farmacêuticas têm sido parcimoniosas nos investimentos
para o desenvolvimento de drogas para o tratamento efetivo da doença de Chagas (Teixeira
2007).
Há mais de 25 anos não são produzidos novos fármacos com maior eficácia e
menos efeitos colaterais do que as duas únicas drogas (nifurtimox e benznidazol) ainda
18
utilizadas no tratamento etiológico da doença de Chagas (Santos e cols 2004, Guedes e
cols 2006). Um grande volume de trabalhos científicos trata da biologia e genética do T.
cruzi, porém todo esse conhecimento gerado não foi revertido em novos fármacos. A
ausência de medicamentos para esta e outras doenças negligenciadas é o resultado tanto
das insuficientes políticas públicas voltadas para produção e desenvolvimento de
medicamentos, quanto da falha de mercado, provocada pelo baixo interesse econômico que
esses pacientes representam para a indústria farmacêutica (Drugs for Neglected Diseases
initiative 2009).
1.8 – ESTRUTURAS CELULARES DE Trypanosoma cruzi
A organização da cromatina dos tripanossomas difere em vários aspectos daquela
encontrada nos eucariotos complexos e mesmo em outros protistas. Os cromossomos dos
tripanossomas não se condensam durante a divisão celular e a segregação dos mesmos para
as células-filhas, durante a divisão celular, ocorre intranuclearmente, sem a dissolução da
carioteca ou membrana nuclear (endomitose). A divisão celular nos tripanossomas ocorre
através do mecanismo mitótico (Solari 1995).
T. cruzi é uma célula eucariótica, que apresenta membranas nuclear e
citoplasmática, aparato de Golgi e retículo endoplasmático (Figura 6). Apresenta vesículas
compartimentalizadas denominadas glicossomos relacionada com o processo de glicólise
celular. T. cruzi possui dois genomas distintos, situados em dois compartimentos celulares
bem definidos: o núcleo e a mitocôndria. Nos tripanossomatídeos, a mitocôndria apresenta
características peculiares, albergando uma rede complexa de moléculas circulares de DNA
denominada de cinetoplasto ou kDNA. Este é composto por centenas de moléculas de
DNA circulares, denominadas maxi e minicírculos (Silveira 2000).
19
Figura 6: Estruturas celulares de Trypanosoma cruzi
www.fiocruz.com.br
Os maxicírculos possuem cerca de 40.000 pb de tamanho e o número de cópias por
célula varia de 20 a 50. Os genes das proteínas mitocôndriais (citocromo oxidases,
citocromo b, ATPases, NADH desidrogenase) e dos rRNAs mitocondriais estão
localizados no maxicírculo. Portanto, pode-se considerar o maxicírculo como sendo
análogo ao DNA mitocondrial dos demais eucariontes (Silveira 2000).
Os minicírculos possuem cerca de 1.400 pb e estão presentes em 10.000 a 20.000
cópias por células (Figura 7). No cinetoplasto, os minicírculos aparecem entrelaçados entre
si, tal como acontece entre os anéis de uma malha. Os minicírculos possuem quatro regiões
de 120 a 160 pb de sequência bastante conservada entre si. Essas regiões contém a origem
de replicação do DNA e são também conservadas entre diferentes isolados e cepas de T.
cruzi. As regiões variáveis têm cerca de 280 a 320 pb (Silveira 2000) e são intercaladas
com as regiões conservadas, as quais apresentam blocos ricos em citosina/adenina(Carsbs).
20
É pela sequência de microhomologia nos Carsbs que se pensa ocorrer a integração do DNA
exógeno.
As sequências presentes nos minicírculos não codificam peptídeos. Foi
demonstrado que as regiões variáveis são transcritas gerando pequenos RNAs
denominados RNAs guia (gRNAs). Estas moléculas de RNAs estão envolvidas no
processo de editoração dos mRNAs das enzimas mitocôndriais, comum em T. cruzi. Neste
processo, a maioria dos transcritos dos genes provenientes dos maxicírculos só podem ser
traduzidos em proteínas após a adição ou deleção de resíduos de uridina (Stuart e cols
1995, Hajduk & Sabatini 1996). A complexidade da população de minicírculos pode ser
correlacionada diretamente com a proporção do editoramento encontrado em cada espécie
(Teixeira 2007).
O kDNA tem sido usado para identificação de subgrupos de populações de T. cruzi.
Porém, a estrutura complexa do kDNA não é completamente conhecida, e sua forma
intricada de replicação não foi totalmente elucidada. A replicação do kDNA envolve a
duplicação do número de minicírculos e maxicírculos e a distribuição das duas redes
progênies em células filhas idênticas a seu progenitor. Antes da sua replicação,
minicírculos são liberados individualmente da rede na zona citoflagelar situada entre o
disco de kDNA e o corpo basal do flagelo. A perda de uma sequência em uma classe de
minicírculos é minimizada por monitoração do kDNA, que assegura a natureza multicópia
dos genes. As proteínas que iniciam a replicação do minicírculos, incluindo a proteína
universal de ligação ao minicírculo, primase e polimerase, ficam localizadas dentro da
zona flagelar do cinetoplasto (Shapiro & Englund 1995, Hines & Ray 1997,Teixeira 2007).
21
1.9 – PARASITEMIA X POLIMORFISMO
As manifestações patológicas da doença de Chagas, tanto na forma cardíaca
quanto na forma digestiva, estão associadas com a ocorrência de uma reação inflamatória.
Curiosamente, o parasito está presente tanto em pacientes sintomáticos, bem como em
indeterminados e, até o momento, não há nenhuma publicação de evidências em que a
carga parasitária é maior nos grupos sintomáticos em comparação com os grupos
indeterminados. Além disso, as células T de todos os grupos de pacientes,
independentemente da forma clínica, exibiram características de ativação e (Dutra e cols
1994, 1996, Lemos e cols 1998) foram capazes de proliferação in vitro em resposta a
antígenos parasitários (Dutra e cols 2000). Análises moleculares de diferentes isolados de
T. cruzi têm demonstrado que a população de parasitos distintos está associada com
diferentes formas clínicas da doença de Chagas (Vago e cols 2000), sugerindo que as
populações geneticamente distintas exibem tropismo tecidual característico e assim,
influência na evolução da doença. No entanto, a observação de que os isolados de
parasitos geneticamente semelhantes têm sido encontrados em diferentes órgãos sugerem
que a resposta imune do hospedeiro é um fator crítico na determinação do resultado da
infecção (Lages-Silva e cols 2006).
Região
variável
(330 pb)
Minicírculo de T. cruzi
± 1400 pb
Região
conservada
(120 pb)
BSC-1
BSC-2
BSC-3
Figura 7: Representação esquemática do minicírculo mostrando a organização
das quatro regiões conservadas (retângulos em azul), de aproximadamente 120 pb
cada, contendo os blocos de sequências mais conservadas da molécula: BSC-1,
BSC-2 e BSC-3 (retângulos em preto). Os iniciadores para a amplificação pela
PCR, para uso diagnóstico, foram desenhados a partir das sequências desses
blocos conservados. As regiões com sequências hiper-variáveis dos minicírculos
de 330 pb (seta em vermelho) encontram-se intercaladas com as regiões
conservadas.
Modificado de: Sturm e cols 1989.
22
1.10 – TEORIA SOBRE A PATOGÊNESE DA DOENÇA DE CHAGAS
HUMANA: PERSISTÊNCIA DO PARASITO X AUTOIMUNIDADE
Existem duas principais hipóteses que procuram explicar os mecanismos da
patogênese da doença de Chagas humana. A primeira delas defende o papel central da
persistência do parasito no hospedeiro como uma das principais causas de patologia,
enquanto a outra postula que uma resposta imune contra antígenos próprios é responsável
pelo dano tecidual observada em órgãos afetados de chagásicos (Kierszenbaum 2005,
Hyland & Engman 2006, Dutra & Gollob 2008, Teixeira e cols 2011).
Embora as teorias que procuram explicar os mecanismos subjacentes à patogênese
da infecção chagásica sejam controversas, elas não são mutuamente exclusivas. Ambas
devem ser, portanto, consideradas quando se tenta compreender o estabelecimento e
manutenção da patologia da doença de Chagas. Independentemente da origem/fonte de
antígenos que desencadeiam a resposta imune durante a infecção crônica, há um consenso
de que o sistema imune do hospedeiro desempenha um papel central no desenvolvimento
da patologia (Dutra e cols 2009).
A hipótese da persistência do parasito é apoiada por evidências que demonstram
que T. cruzi está presente, perto ou dentro, de áreas danificadas (Fuenmayor e cols 2005).
Embora as técnicas de imuno-histoquímicas/histológica muitas vezes não consigam revelar
parasitos nos locais da lesão, estudos utilizando técnicas sensíveis, tais como reação da
polimerase em cadeia (PCR) e hibridização in situ tem mostrado a persistência de T. cruzi
em órgãos afetados (Jones e cols 1993, Vago e cols 1996). Benvenuti e cols (2005)
detectaram DNA de T. cruzi em biópsias endomiocárdicas após transplante cardíaco
usando PCR. Hibridização in situ usando tecido cardíaco humano forneceram poucas
evidências da presença de T. cruzi intacto nos locais de inflamação marcados. Não
obstante, restos tanto de DNA nuclear e do cinetoplasto de T. cruzi foram detectados (Elias
e cols 2003). Além disso, a transmissão de T.cruzi pela transfusão de sangue de doadores
chagásicos crônicos e a observação de que há reativação da parasitemia nos pacientes
imunossuprimidos sustentam a afirmação de que os parasitos persistem em muitos
hospedeiros (Bocchi e cols 1996, Ferreira e cols 1997).
Por outro lado, o contraste entre a gravidade das lesões observadas durante a fase
crônica da doença de Chagas e a baixa carga parasitária no sangue e tecidos de pacientes
23
chagásicos sugere que a resposta para o parasito por si só é insuficiente para explicar a
patologia observada e que a autorreatividade pode contribuir para o agravamento da
doença. Esta ideia conduziu à hipótese de que as respostas autoimunes têm lugar durante o
desenvolvimento da patologia. O favorecimento desta hipótese é o fato de que os epítopos
de antígenos de parasitos produzem anticorpos que reagiriam de forma cruzada com
epítopos de tecidos do hospedeiro (Gironès e cols 2005, Cunha-Neto e cols 2006). Além
disso, demonstrou-se que os anticorpos antiparasitários derivados do hospedeiro podem
mediar a reatividade celular (Gazzinelli e cols 1990, Reis e cols 1993a, Dutra e cols 2000).
Em muitos estudos, a presença de autoanticorpos reativos demonstrou a existência de
células T autoreativas em pacientes com Chagas (Benoist & Mathis 2001, Cunha-Neto e
cols 2006). Para este fim, o mimetismo molecular tem sido sugerido existir entre os
componentes do hospedeiro e de T. cruzi e, assim, apoia fortemente a participação de
reatividade autoimune na patogênese da doença de Chagas (Cunha-Neto e cols 1996).
1.11-PATOGÊNESE DA DOENÇA DE CHAGAS E
AUTOIMUNIDADE
A infecção humana pode ser muito grave, podendo provocar elevados índices de
mortalidade em crianças na sua fase aguda e severo acometimento cardíaco e/ou digestivo
em adultos crônicos (Dias 2005).
Com relação à etiopatogenia da doença de Chagas, pode-se dizer que muitos
aspectos ainda são desconhecidos e que múltiplos mecanismos têm sido propostos para
explicar a patogênese da doença. No estudo de Bonney & Engman em 2008, os autores
destacaram que apesar de muitos estudos relacionarem a patologia da doença de Chagas à
persistência do parasito no miocárdio e à autoimunidade, fortes evidências têm
demonstrado que outros mecanismos, com efeitos sinérgicos, podem estar ligados à
patogênese da moléstia. Conforme aponta Engman & Leon (2002), a lise da célula
hospedeira provocada pelos parasitos, a destruição neuronal primária (a qual ocorre
durante a fase aguda da doença e que pode levar a lesões na fase crônica), as alterações
microvasculares induzidas pelos parasitos (as quais podem levar à hipoperfusão cardíaca e
à degeneração de miócitos), a ativação de células B policlonais (que ocorre durante a
24
infecção e que pode provocar um descontrole nos mecanismos de imunossupressão e
autoimunidade) e a persistência de antígenos de T. cruzi constituem outras hipóteses
importantes que podem estar relacionadas com a patologia cardíaca chagásica. Para Dutra
& Gollob (2008), a compreensão coerente de todas estas hipóteses envolvendo a
elucidação dos reais mecanismos relacionados à patogênese da doença é crítica para o
desenvolvimento de novas terapias e para intervenções bem sucedidas.
As doenças autoimunes são doenças inflamatórias crônicas em cuja fisiopatologia
se encontra distúrbios da imunidade humoral e celular, dependentes de fatores genéticos,
hormonais, psicológicos e ambientais. O aspecto essencial de uma doença autoimune é a
reação imunológica do organismo contra os seus próprios tecidos, com consequente lesão
tecidual (Kasper e cols 2006).
A dissociação entre o quadro de infecção aguda por T. cruzi, que cursa com
parasitemia e profusa parasitose tecidual, semanas após o contágio, e a cardiopatia
chagásica crônica pobre em formas teciduais do parasito que se manifesta décadas mais
tarde, em vigência de parasitemia indectável, levantou dúvidas sobre a participação direta
de T. cruzi na cardiopatia chagásica crônica. Surgiu a hipótese de que o dano ao miocárdio
seria secundário a um processo de hipersensibilidade tardia dirigida ao próprio tecido
cardíaco, mediada pelo infiltrado inflamatório linfomononuclear universalmente associado
às lesões (Cunha-Neto 1995).
Alguns autores apontam para a existência de reação cruzada entre os componentes
autólogos e antígenos de T. cruzi (Acosta & Santos-Buch 1985, Van Voorhis & Eisen
1989; Kierszenbaum 1986, Cunha-Neto e cols 1995, Cunha-Neto e cols 1996; Bahia-
Oliveira e cols 2000). Além disso, outros autores têm discutido que a resposta autoimune
contra antígenos presentes no tecido cardíaco pode favorecer o desenvolvimento da forma
mais severa da cardiopatia chagásica. (Borda e cols 1984, Borda & Sterin-Borda 1996,
Sterin-Borda e cols 1999).
A partir do final da década de 1970, foram descritos sistemas de reação cruzada
entre proteínas molecularmente definidas de T. cruzi e do hospedeiro mamífero (Ramos
1978, Teixeira 1983). Vários autores contribuíram, portanto, com dados que sugerem a
autoimunidade na doença de Chagas. Santos-Buch e cols (1974) e Teixeira e cols (1975)
procuraram comprovar a hipótese da autoimunidade em coelhos infectados por T. cruzi ou
25
imunizados com frações celulares deste parasito; os animais apresentaram uma intensa
resposta imune mediada por células, sendo que a mesma ocorreu tanto contra o parasito
quanto em antígenos do miocárdio. Mariano Levin, em 1989, mostrou que soros de
portadores de cardiopatia chagásica tinham títulos mais altos que soros de portadores de
doença de Chagas na forma indeterminada de anticorpos contra um epítopo da proteína
ribossomal P de T. cruzi (P0, P1 e P2) muito semelhante à proteína ribossomal humana
correspondente (Levin e cols 1989).
Há três modelos para explicação da autoimunidade: mimetismo molecular, ativação
policlonal e ativação bystander. No primeiro, haveria uma resposta cruzada entre epítopos
do hospedeiro e antígenos do parasito, o que levaria a resposta imune a atuar contra
proteínas do próprio tecido. Leon e cols 2004 imunizaram camundongos com extrato de T.
cruzi e observaram que os anticorpos eram capazes de reconhecer uma miosina cardíaca.
Além disso, Perone e cols (2003) identificaram uma alta identidade entre a proteína
ribossomal L27 de T. cruzi e proteínas. No segundo, a ativação policlonal, defende que
cepas de T. cruzi promovem uma ativação indiscriminada de linfócitos T e B durante a fase
aguda, o que resulta em uma resposta imune inespecífica com a produção de
autoanticorpos (Kierszenbaum 1999), e no terceiro, ativação bystander, acredita-se que o
próprio ambiente inflamatório, rico em citocinas, quimiocinas e óxido nítrico, possam ser
capaz de induzir células T autorrreativas. Adicionalmente, a infecção por T. cruzi também
levaria à liberação de proteínas próprias, as quais, por sua vez, estimulariam a produção
das células autorreativas (Leon & Engman 2001).
Outra resposta que explicaria a origem da autoimunidade na doença de Chagas foi
procurada em amostras de DNA extraído do sangue de pacientes com a doença de Chagas
cardíaca, com diagnóstico confirmado pelos anticorpos específicos contra antígenos de T.
cruzi. Nesses pacientes, todas as amostras foram positivas para o DNA do parasito nos
testes com marcadores moleculares da infecção pelo T. cruzi. De maior interesse, foi
demonstrado que o kDNA de T. cruzi, especificamente de minicírculos, havia sido
transferido para o genoma do paciente chagásico.O ponto de integração foi frequentemente
o retrotransposon LINE-1, cujas cópias inseridas em regiões ricas em A-C incluem
famílias de curtas e repetidas onde se encontram genes associados com as respostas
imunes. As sequências integradas de minicírculos truncados achavam-se ligadas
26
covalentemente ao DNA do hospedeiro (Teixeira e cols 1994, Nitz e cols 2004, Simões-
Barbosa e cols 2006, Teixeira e cols 2007, Hecht e cols 2010, Teixeira e cols 2011).
1.12– ELEMENTOS TRANSPONÍVEIS
Nos genomas mamíferos, grande parte do material genético compõem-se por
segmentos de DNAs repetitivos adquiridos pela integração de vírus, retrovírus e elementos
transponíveis. Essas sequências, quando ativas podem mobilizar segmentos do genoma
tanto para outras células como para outros organismos, não necessariamente da mesma
espécie e isso é que vem contribuindo significativamente para a evolução dos genomas e
variabilidade genética (Lewin 2004, Kim e cols 2004, Casse e cols 2006, Fawcett e cols
2006, Han e cols 2007).
Na década de 40, Bárbara McClintok descobriu os elementos transponíveis (TEs)
no genoma de milho, definindo-os como elementos controladores, pois estes
aparentemente controlavam a coloração dos grãos de milho. Nos anos subsequentes, a ideia
de que DNA podiam se mover dentro dos genomas não foi aceita pela comunidade
científica. Somente na década de 80 os elementos controladores, atualmente chamados de
elementos transponíveis, foram redescobertos, gerando várias mutações em Drosophila
(50% das mutações) e em milho (10% das mutações) (Finnegan 1992, Kazazian 1998). A
partir do reconhecimento dos TEs, muitos estudos mostraram que estes elementos
poderiam influenciar profundamente o processo evolutivo do seu hospedeiro. A
mobilização desses elementos pode promover mudanças estruturais de larga escala, como:
rearranjos cromossômicos, modificações nos padrões epigenéticos de regulação, além da
geração de variabilidade genética, novos genes e, consequentemente, inovações biológicas
(Feschotte & Phrithan 2007).
Os elementos transponíveis são DNAs capazes de se transportar para outros locais
dentro do genoma, sem qualquer obrigatoriedade reconhecida de homologia relacionada
com o sítio-alvo de posicionamento novo. No geral, eles se limitam à mobilização de si
mesmos, mas, às vezes, podem carregar algumas sequências adicionais. De acordo com
suas estruturas e mecanismos de transposição, eles costumam ser agrupados em duas
classes. A classe I engloba os elementos que se movem via uma cópia de RNA e utilizam a
transcriptase reversa. Já na classe II, estão os elementos que utilizam uma transposase para
27
transpor um DNA intermediário (Casse e cols 2006). Os elementos da classe I e II são
chamados, respectivamente, de retrotransposons e transposons (Figura 8).
FIGURA 8: Elementos Transponíveis.
Fonte: Kazazian 2004. Mobile elements: drivers of genome evolution. Science 303 1626–1632.
Dentre eles, há os retroelementos LTR (long terminal repeat), que sofrem
transcrição reversa a partir de intermediários de RNA, duplicam-se e são transpostos como
DNA de fita dupla. Por outro lado, os retroelementos não-LTR consistem de pequenos
(SINE) ou longos (LINE) elementos dispersos que são transpostos por transcrição reversa
de um mRNA diretamente no sítio de integração (FIGURA 9). Os retroelementos LTR são
frequentemente referidos como retrotransposons e os não-LTR como retroposons
(Wickstead cols 2003). Foi sugerido que a maquinaria enzimática de elementos LINE é
responsável pela integração de elementos SINE e de pseudogenes processados (Requena
1996).
28
FIGURA 9: Movimento dos retroelementos. Campbell & Reece 2005.
Os LINEs têm estruturas similares aos dos SINEs e compartilham regiões de
microhomologias dentro do genoma do hospedeiro. A mobilização autônoma de LINEs
pode criar novos genes, pseudogenes e perda de genes, alterar expressões gênicas e estar
associados a doenças (Ogiwara e cols 1999, Fantaccione e cols 2008).
O promotor 5’ inicia a transcrição do LINE-1, que usualmente é confinada a células
da linhagem germinativa, mas a retrotransposição de LINE-1 em células somáticas tem
sido correlacionada com doenças genéticas. Integrações de minicírculos de kDNA de T.
cruzi em um paciente chagásico, ocorrendo em múltiplos loci, poderiam explicar a
variabilidade de manifestações clínicas na doença. A acumulação de mutações induzidas
por integrações de kDNA pode ser uma força desencadeadora da patologia na doença de
Chagas (Teixeira 2007).
1.13 – FATORES RELACIONADOS À TRANSPOSIÇÃO
Retroelementos sofrem a transposição pelo modo replicativo por meio da sua
transcrição em uma molécula de RNA. Em retrotransposons contendo as LTRs, muito do
conhecimento sobre o mecanismo da retrotransposição é baseado em retrotransposons de
29
leveduras (Voytas & Boeke 2002), embora seja assumido que esse mecanismo seja muito
similar entre retrotransposons de diferentes hospedeiros. Primeiro, o RNA é inteiramente
transcrito por uma RNA polimerase II codificada pelo hospedeiro a partir de um promotor
localizado dentro da LTR 5’. Alguns cis-elementos característicos de retrotransposons e
retroviroses são encontrados na LTR 5’ como, por exemplo, sequências CCAAT-like,
sequências TATA-like, sequências ricas em CT e enhancers. Este RNA é então traduzido
no citoplasma dando origem a diferentes proteínas, como a transcriptase reversa e a
integrase (Nakagawachi e cols2003).
O início do processo de transcrição reversa se dá com a ligação de um tRNA em uma
sequência próxima a LTR 5’ (o sítio de ligação do primer) que então funciona como um
primer para a produção de uma pequena molécula de cDNA. Esta pequena molécula de
cDNA é então transferida da LTR 5’ para a LTR 3’ servindo como um oligonucleotídeo
para o início da transcrição reversa, que produz uma cópia completa de cDNA. Finalmente,
a integração do cDNA na molécula de DNA hospedeira é realizada pela enzima integrase
presente na região pol, originando uma nova cópia do retrotransposon no genoma. Essa
integrase é uma enzima multifuncional que deve ser capaz de localizar as extremidades do
elemento, levá-las em conjunto a um complexo sináptico (complexo ternário contendo a
integrase, as extremidades do elemento e o DNA alvo), reconhecer as ligações fosfodiéster
a serem clivadas no sítio alvo, assegurar a incorporação do elemento e se retirar do local
para que as enzimas do hospedeiro façam o processamento pós-transferência completando
as falhas no local da integração. As extremidades N e C-terminais parecem estar
envolvidas na estabilização da interação entre a integrase e os LTRs, permitindo, por
exemplo, uma ligação mais forte do domínio com as sequências terminais. Assim, as
funções da integrase envolvem ligações de DNA específicas e não específicas, catálise,
capacidade de formar multímeros e, em alguns casos, capacidade de interagir com
proteínas acessórias (Haren e cols 1999).
Os elementos da Classe II (transposons) apresentam um mecanismo de transposição
conservativo, onde o elemento é excisado do sítio doador e reinserido em um sítio alvo,
requerendo a clivagem das fitas de DNA na extremidade do elemento e no sítio de
integração e sua junção no alvo para gerar uma inserção simples. A inserção de quase
todos os transposons conhecidos é acompanhada pela duplicação de uma pequena
30
sequencia flanqueadora, e a excisão desses elementos frequentemente gera uma sequência
de DNA alterada no sítio doador que é chamada de footprint. O tamanho e a sequência
deste footprint são diferentes entre as distintas famílias e pode variar de 2 a 17
nucleotídeos. A excisão do transposon gera uma dupla quebra na molécula de DNA que é
potencialmente letal, mas pode ser reparada pelo sistema de reparo do hospedeiro (gap
repair) ou por conversão gênica (Haren e cols 1999). Entretanto, além da inserção do
elemento no novo sítio, um efeito mutagênico adicional pode ser provocado pela excisão,
visto que o mecanismo de gap repair geralmente não restaura completamente a sequência
original. Além disso, o reparo pode resultar na regeneração do elemento utilizando a
cromátide-irmã como molde ou por recombinação gênica (Gray 2000).
Outro fator que deve ser levado em consideração, tanto para elementos da Classe I
como para elementos da Classe II, é que a maioria desses elementos apresenta um
mecanismo de integração que leva a duplicação de uma pequena região de DNA dentro do
sítio de integração. Devido a esse processo, os elementos transponíveis são flanqueados
por duplicações do sítio alvo (target site duplications - TSD) que possuem tamanhos
conservados, sendo que, algumas vezes, a própria sequência do sítio alvo é conservada. As
duplicações estão relacionadas a quebras na molécula de DNA que geram extremidades
coesivas e os pequenos segmentos de fita simples preenchidos pela DNA polimerase após
a inserção do elemento. Diferentes elementos geram duplicações de diferentes tamanhos e,
apesar dos elementos da Classe I induzirem duplicações de tamanho definido (4 ou 8 pb),
elementos da Classe II normalmente geram duplicações de tamanho bem variado (Capy e
cols 1997).
1.14 – TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE DNA
A ideia clássica de evolução propõe que todos os organismos tenham um ancestral
comum e que a diversidade genética encontrada nas espécies seja decorrente das mutações,
recombinações e seleção natural ocorrida ao longo dos milênios. Segundo a teoria
Darwiniana da evolução, uma espécie transfere, verticalmente, a herança genética contida
em seu genoma para a sua progênie e a diversidade e a variabilidade decorreriam
unicamente do acúmulo de mutações e rearranjos nos genomas. Até recentemente,
acreditava-se que uma espécie assim diferenciada teria perdido a capacidade de transmitir
31
horizontalmente de DNA para outras espécies. Entretanto, com o advento da era genômica,
verificou-se que a diversidade genética é em grande parte promovida pela aquisição de
DNAs exógenos, fusão de genomas seguida ou não de rearranjos no material genético
híbrido (Hacker & Kaper 2000, Gogarten e cols 2002, Katz 2002, Kurland e cols 2003,
Grindley e cols 2006, Choi & Kim 2007, Marri e cols 2007, Poptsova & Gogarten 2007).
O processo de transmissão de genes mais conhecido é o da aquisição de alelos
gênicos de uma geração para outra, denominado transmissão gênica vertical ou
germinativa (TGV). Contudo existem inúmeras evidências da atuação de um mecanismo
presente em procariontes e eucariontes, denominada transmissão genética horizontal
(TGH). Essa transmissão se baseia na recombinação sítio-específica, ilegítima e
transposicional ou em elementos transponíveis ativos (Wolf e cols 2001).
Todos os segmentos de DNA são potencialmente capazes de serem transferidos de
um genoma para outro independente da participação de vírus, retrovírus ou outra partícula
carreadora de material genético (Lawrence & Hendrickson 2003, Lewin 2004). Desde que
haja abundância de DNA no ambiente extracelular ou no citoplasma é possível a absorção
de segmentos e sua incorporação ao genoma (Lewin 2004).
Em 1984, Syvanen teorizou que a THG poderia ser a principal força evolucionária.
De fato, múltiplos mecanismos de transferência física de DNA de uma espécie para outra
são conhecidos. Além disso, o conceito de simbiose evolutiva possibilita que genes
pertencentes a um genoma tenham se tornado parte de um outro, aumentando assim sua
complexidade. Syvanen (1994) afirma, ainda, que a transferência horizontal de DNA
poderia ter contribuído no processo de especiação de seres vivos (Syvanen 1984).
Diversos estudos documentaram a transferência horizontal de sequências de
elementos transponíveis entre organismos eucariontes. Sabe-se que muitos genes presentes
em parasitos tiveram origem nos genomas dos seus hospedeiros e vice-versa (Davis &
Wudack 2004, Mower e cols 2004, Choi e cols 2007) e que muitos segmentos de DNAs
tiveram origem nas organelas e em seus endossimbiontes (Rujan & Martin 2001).
A transferência horizontal não se restringe apenas a transferência de fragmentos de
material genético de uma célula para outra. Eventualmente genomas inteiros são
difundidos gerando-se um organismo híbrido que pode ou não ser viável e gerar
descendentes férteis (Ravel e cols 2000). Sabe-se também da troca de retrotransposons
32
LTR entre plantas. Esses achados baseiam-se na descoberta de elementos
retrotransponíveis estreitamente relacionados em espécies hospedeiras filogeneticamente
distantes. Exemplos de transferência horizontal têm sido documentados também em
elementos da classe de retrotransposons não-LTR (Bushman 2002).
O vínculo entre seres vivos pode acarretar transferência de genes levando duas
células a uma unidade de coevolução. No caso de uniões endossimbiónticas, como as
ocorridas na origem dos cloroplastos e mitocôndrias, foram documentados diversos
exemplos de transferência gênica para os cromossomos de células hospedeiras, e isso
também ilustra os processos de trocas genéticas ocorridas na coevolução destes organismos
(Hoffmeister e cols 2003).
A incorporação do DNA exógeno pela célula receptora pode ser definitiva ou
transiente. A estabilidade da transferência dependerá do tipo e da estrutura genética do
material transferido, da capacidade de expressão de produtos tóxicos, dos locais da
inserção no genoma, dos mecanismos de salvaguarda do DNA e da atuação das barreiras
reprodutivas. (Kurland 2003).
A transferência gênica horizontal em procariontes já está claramente demonstrada
em bactérias, mediante estudos de virulência e resistência a antibióticos. Além disso, a
literatura registra vários exemplos de genes procariontes que foram lateralmente
transmitidos para genomas eucariontes (Krishnapillai 1996). Análises preliminares das
sequências contidas no genoma humano mostram que centenas de genes parecem ter sido
adquiridas da aquisição de genes de procariontes. Estes eventos teriam ocorrido em vários
momentos, na evolução dos vertebrados. Algumas dezenas desses genes parecem ter sido
mobilizadas de elementos transponíveis (Lander e cols 2001). Várias teorias tentam
explicar a transferência horizontal de elementos retrotransponíveis e de DNAs transposons.
Evidências sugerem que vírus de eucariontes podem servir como meio de transporte entre
células para estes elementos. O DNA móvel pode ser transportado de duas formas:
integrado no genoma viral ou empacotado pelas proteínas do envelope junto aos
constituintes virais. Relatos de transferência horizontal de genes envolvendo eucariontes se
baseiam na comparação de similaridades entre sequências depositadas em bancos de dados.
As diferenças entre as datas de divergência evolutiva indicam que muitas dessas
sequências teriam sido adquiridas mediante transferências gênicas entre espécies. A
33
identificação da transferência recente de DNA entre organismos eucariontes é muito difícil
de ser demonstrada. Entretanto, é concebível que esses mecanismos de recombinação
gênica oferecem possibilidades de interferência e de remodelamento genômico, podendo
causar grandes impactos nos processos evolutivos dos seres vivos (Shapiro 1999, Kurland
2000, Makalowski 2000).
A transferência horizontal pode ocasionar instabilidade genética na célula
receptora, gerando rearranjos variáveis. Após a integração, são frequentes os relatos de
duplicações, translocações ou deleções, envolvendo pequenos ou grandes segmentos
cromossômicos, gerando novas combinações genômicas (Covarrubias e cols 1986, Wilkie
& Palmiter 1987, Kouprina e cols 2003, Kim e cols 2004, Grindley e cols 2006, Du e cols
2007, Han e cols 2007).
A escolha da doença de Chagas como modelo para a TGH ativa é validada pelas
importantes características intrínsicas parasito- hospedeiro como:
1) Formas intracelulares de T. cruzi deixam o vacúolo parasitóforo da célula
hospedeira e permanecem livres para se dividirem no citoplasma (Andrew 2002, Andrade
& Andrew 2005);
2) Durante a divisão celular os minicírculos são clivados por topoisomerases
(Vanhamme 2008) e podem migrar para o núcleo da célula hospedeira (Hancok & Hadjuk
1990);
3) Minicírculos de T. cruzi, com quatro adeninas e ricas em citosinas (Hines & Ray
2008, Sturm 2009) podem mediar a inserção do kDNA dentro do genoma do hospedeiro.
Todos esses fatores podem influenciar a TGH de T. cruzi para as células hospedeiras
(Teixeira 1991 e 1994, Simões-Barbosa 1999 e 2006).
1.15 – TRANSFERÊNCIA DE MINICÍRCULOS DE kDNA DE
Trypanosoma cruzi PARA O GENOMA DA CÉLULA HOSPEDEIRA
A revelação de que minicírculos poderiam transferir-se para o genoma do
hospedeiro e a correlação desse fato com a patologia da doença de Chagas em aves
renovou o interesse pelo entendimento dessa estrutura de DNA circular e pela sua
composição nos subgrupos conhecidos de T. cruzi. As integrações de minicírculos de
kDNA comportam-se como vetores de mutações no hospedeiro (Teixeira 2007).
34
Após infectar células humanas com cepas de T. cruzi, Simões-Barbosa em 1999
obteve linhagem de macrófagos com segmentos de minicírculos de kDNA integrados ao
genoma. Utilizando sequências de minicírculos como primers, na técnica de PCR, ele
obteve sequências híbridas de minicírculos de kDNA / genoma de mamífero, os quais
foram analisados em um banco de dados e dois eventos de integração foram mostrados por
meio da integração de minicírculos intercalados por um fragmento de elemento
transponível da família LINE-1.
Analisando amostras de coelho e galinhas, Nitz (2004) mostrou a integração de
sequências de kDNA de T. cruzi preferencialmente em regiões do elemento transponível
LINE-1.Tais sequências apresentavam estruturas de kDNA repetidas e rearranjadas,
sugerindo sucessivas integrações ou instabilidade genética da região clonada.
Teixeira e cols (2011) documentaram a integração de minicírculos de kDNA no
genoma de aves e a sua transmissão vertical para sua progênie. As galinhas são refratárias
à infecção por T. cruzi, exceto durante os primeiros oito dias de vida embrionária, antes do
desenvolvimento do seu sistema imunológico. Após o 8º dia de desenvolvimento, a
infecção intra-ovo é eliminada pela imunidade inata do embrião. Após eclodirem os ovos,
os filhotes infectados no período intra-ovo apresentaram sequências de minicírculos na
ausência do DNA nuclear do parasito (nDNA) e tais sequências foram transmitidas
verticalmente para os descendentes. As galinhas cujas reações de amplificação foram
positivas para kDNA desenvolveram sinais típicos da doença de Chagas: lesões teciduais
nos músculos estriados cardíaco e esquelético, músculos lisos e gânglios parassimpáticos
foram documentados.
A análise de pacientes chagásicos e seus descendentes foi documentada por Hecht e
cols em 2010, onde a presença de DNA de T. cruzi no genoma foi demonstrada após
confirmação sorológica. Além disso, a integração de minicírculos por meio dos elementos
transponíveis foi observada na progênie dos genitores, os quais foram transferidos
verticalmente como herança genética. As integrações concentraram-se dentro de LINES e
múltiplos eventos de integração direcionaram-se a vários cromossomos, resultando em
ruptura de regiões de codificação e perda de genes .
A integração de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma de células
germinativas e a transferência vertical dessas mutações para os descendentes também foi
35
demonstrada em estudo de Hecht e cols 2009. Trinta e quatro voluntários participaram da
pesquisa e suas amostras de esperma foram analisadas. Desses, 22 doadores foram
agrupados em cinco famílias, cujos progenitores (F0) eram portadores da doença de
Chagas. Doze amostras de esperma foram obtidas de indivíduos isolados. Foi possível
observar a integração de kDNA de T. cruzi no genoma de todos os 17 chagásicos
estudados. A transferência vertical apenas das sequências de kDNA para as progênies F1 e
F2 pôde ser observada em seis descendentes de chagásicos. As análises das regiões do
genoma humano que flanqueavam as sequências de kDNA mostraram a integração de
minicírculos de kDNA preferencialmente em elementos retrotransponíveis do tipo LINE-1,
em 72,5% das sequências quimeras.
1.16 – IMPACTOS DA RETROTRANSPOSIÇÃO
Os retrotransposons têm uma significante contribuição na evolução dos seres vivos.
A expansão dos genomas causada por esses elementos é observada nos mais diferentes
seres, chegando a corresponder a 15% do genoma de Drosophila, 45% do de humano e a
até 70% de plantas e anfíbios (Biemont & Vieira 2005). Em 1998, SanMiguel e
colaboradores observaram que o aumento do tamanho do genoma do milho deve-se a
amplificações de elementos transponíveis que ocorreram há cerca de 6 milhões de anos.
Estudos comparativos mostram que houve uma expansão de 15-20% do genoma de
humanos em relação ao de chimpanzés e 90% dessa expansão deve-se à inserção de
retrotransposons (Liu e cols 2003). Em relação à variabilidade, sabe-se que o elemento Alu
gera grande instabilidade genômica: eventos de recombinação genética são responsáveis
por deleções, inserções e translocações em grande escala (Callinan e cols 2005). Além
disso, esses SINEs também contribuem para que haja um aumento do conteúdo de
CG(Citosina e Guanina) dos sítios de integração. Isso parece ser interessante, pois muitos
mamíferos, incluindo os primatas, sofreram um aumento unidirecional de mutações C-T
(Hedges & Batzer 2005).
A retrotransposição de LINEs também contribui para a evolução dos genomas ao
promover recombinação ectópica ou alterar a expressão e regulação dos genes. É possível
constatar que esses eventos continuam ocorrendo até os dias atuais: muitos dos elementos
L1 que se inseriram no genoma humano são recentes, permitindo verificar polimorfismo
36
populacional pelo estudo de determinados L1s em algumas regiões cromossomais (Seleme
e cols 2006).
1.17 – DOENÇAS CAUSADAS POR ELEMENTOS TRANSPONÍVEIS
As alterações genéticas resultantes de um evento de retrotransposição podem trazer
sérias consequências para um organismo, não apenas ao gerar novas proteínas, mas
também ao influenciar a expressão de genes vizinhos. Estima-se que 0,5% das desordens
genéticas humanas sejam resultantes da integração ou recombinação homóloga de
elementos transponíveis (Hedges & Batzer 2005). Entretanto, esse número deve ser
consideravelmente maior, pois ainda não se entende muito bem a patogênese de muitas
doenças.
Desde o primeiro relato, sugerindo que a inserção de um elemento L1 no gene do
fator VIII era capaz de causar hemofilia do tipo A (Kazazian e cols 1988), muitos outros
casos de danos causados por elementos retrotransponíveis foram descritos. Chen e
colaboradores (2006) foram capazes de identificar 51 eventos de mutações resultantes da
integração de L1 que estavam associadas a doenças genéticas. Musova e colaboradores
(2006) relataram que a integração de L1 no exon 44 do gene da distrofina promovia a
distrofia muscular de Duchenne. Hurk e cols (2007) demonstraram que L1 é capaz de se
retrotranspor no gene CHM do cromossomo X, causando uma séria doença ocular que
pode ser passada para os descendentes. Várias doenças causadas por elementos Alu
também já foram descritas: associação com leucemia, câncer de ovário e de mama,
deficiência do complemento, neurofibromatose, entre outras (Deininger & Batzer 1999).
A maioria das inserções de L1, que causam doenças, está no cromossomo X (Kazazian
2000). Esse cromossomo tem duas vezes o nível normal de elementos L1 (30% contra
17%) indicando a ocorrência de sítio preferencial (hot spot) de inserções ou a existência de
uma seleção positiva para L1 nesta parte do genoma (Bailey e cols 2000). É possível que
doenças ligadas ao cromossomo X sejam mais visíveis devido a sua única cópia no
indivíduo do sexo masculino. Contudo, o fato de ocorrer poucas inserções Alu neste
cromossomo indica certa preferência indicada pela desproporcionalidade de elementos L1
neste cromossomo (Batzer & Deininger 2002).
37
2 – JUSTIFICATIVA
A linha de pesquisa desenvolvida no Laboratório de Estudos da Relação Parasito
Hospedeiro tem estudado mulheres em idade pró-criativas em materiais biológicos, sendo
necessários estudos mais aprofundados com acompanhamento de seus recém-nascidos,
principalmente quando se tratar de gravidez de risco para doenças infecto-contagiosas.
As consequências clínicas da herança das integrações de sequências de minicírculos
de kDNA em filhos de infectadas, somente serão avaliadas à partir do acompanhamento
clínico dos recém-nascidos.
Dando continuidade à linha de atenção a saúde da gestante, Siriano e cols (2011)
demonstraram que a gravidez induz o aumento da parasitemia em infectadas por T. cruzi na
fase crônica. Durante a gravidez foi possível detectar o parasito T. cruzi em 60% das
amostras, enquanto 29% de positividade foram detectados nas mulheres não grávidas
(grupo controle), verificando-se, portanto que a gravidez é fator de risco para aumento da
parasite
De acordo com o Consenso Brasileiro da Doença de Chagas (2005) faltam
evidências que garantam o sucesso da terapia na fase crônica para adultos em diferentes
circunstâncias, porém o tratamento específico pode ser instituído na forma crônica recente.
Apesar disso, ainda não há uma forma de prevenir a transmissão vertical da doença de
Chagas, fazendo-se necessário o diagnóstico precoce nos nascidos de mães sabidamente
infectadas por T. cruzi, o que inclui o seu tratamento o quanto mais cedo possível. Tal
diagnóstico influenciaria na eficácia da terapia a qual está diretamente relacionada ao
tempo da infecção, sendo efetivo nas fases iniciais e muito pouco benéfico nas formas
crônicas avançadas.
Quando os recém-nascidos infectados são assintomáticos ou oligossintomáticos, o
diagnóstico neonatal somente é possível por meio de uma rotina pré-estabelecida, a qual
deve incluir a seleção materna no pré-natal. Isso é muito importante porque o diagnóstico
nos primeiros dias de vida possibilita estabelecer precocemente o tratamento específico.
Nessa época, há melhor tolerância às drogas usadas, melhor resposta terapêutica e cura, e
evitam-se ou diminuem as sequelas (Muñoz e cols 1992). É bem provável que casos de
38
infecção chagásica crônica cardíaca ou digestiva diagnosticados na infância representem
exemplos de transmissão congênita (Rezende 1979, Bittencout e cols 1990).
Há relatos médicos de casos de suspeita de indivíduos com megacólon ou mesmo
cardiopatia típicas da Tripanossomíase americana, onde a sorologia foi comprovadamente
negativa, levando alguns médicos a questionarem a possibilidade da autoimunidade nesta
doença (dados não publicados). O fato descrito em aves onde foi demonstrada a ausência
do parasito, sorologia negativa e alterações típicas da doença de Chagas hipotetiza a
possibilidade de o mesmo ocorrer em humanos. Para tanto, reforça-se aqui a necessidade do
acompanhamento clínico da progênie de infectadas por T. cruzi com sorologias negativas e
com resultados moleculares positivos para o kDNA .
Esperou-se com este estudo obter dados reais relativos à hipótese da transmissão
genética horizontal do kDNA, no sangue de menores de um ano de idade de mães
cronicamente infectadas por T. cruzi, bem como a prevalência da doença de Chagas em
gestantes e da transmissão vertical em um serviço de referência do Estado de Goiás, como
auxílio no diagnóstico precoce e consequentemente melhora na qualidade de vida das
crianças infectadas.
39
3 – OBJETIVOS
3.1 – OBJETIVO GERAL:
Estudo epidemiológico em um grupo de gestantes infectadas por Trypanosoma cruzi e
pesquisa da presença dos minicírculos de kDNA de T. cruzi em células sanguíneas dos
seus respectivos filhos menores de um ano de idade.
3.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Avaliar a prevalência de grávidas soropositivas para T. cruzi na Matenidade do Hospital
das Clínicas/UFG, no período de três anos (2010 a 2012);
Avaliar a prevalência de crianças soropositivas (IgG e IgM) para T. cruzi nascidas de
mães cronicamente infectadas por T. cruzi, na Maternidade do Hospital das Clínicas -
UFG;
Comparar o diagnóstico parasitológico, sorológico e molecular das crianças nascidas de
mães cronicamente infectadas por T. cruzi, na Maternidade do Hospital das Clínicas -
UFG;
Identificar os sítios de integração das sequências de minicírculos no genoma humano.
40
4 – MATERIAL E MÉTODOS
4.1 – FLUXOGRAMA: METODOLOGIA UTILIZADA
Grávidas soropositivas para
T. cruzi– 2010 a 2012
com com Toxoplasmose
Hemocultura
somente nos filhos
Abordagem – assinatura do TCLE-
Questionário pela mãe
Mães e filhos
Coleta de sangue
Sorologia –T. cruzi
Soropositivos IgG
Mães e Filhos menores de um ano de idade
SANGUE
PCR
kDNA,TCZ
ps-TAIL PCR
41
4.2 – SELEÇÃO DE PACIENTES
Para o estudo da soroprevalência de Chagas em gestantes que deram à luz na
Maternidade do Hospital das Clínicas de Goiás (HC-GO) foi feito primeiramente um
levantamento do número total daquelas mulheres no controle de internação daquele
hospital, onde foram registradas todas aquelas que tinham gravidez de risco ou alto risco e
que foram submetidas à cesariana, parto normal, parto normal e parto cesariano com
gestação de alto risco.
Entre os anos de 2010 a 2012, 2.119 mulheres tiveram seus filhos na maternidade
do HC-GO e os seus respectivos prontuários foram analisados e os dados anotados em uma
planilha a qual continha informações sobre idade, naturalidade, abortos e resultados da
sorologia para Tripanossomíase Americana. Todos os dados coletados foram autorizados
pelos diretores responsáveis do SAMIS e setor de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital
(Em anexo).
Já para o estudo da integração dos minicírculos de kDNA, a população de pacientes
foi constituída por mulheres infectadas por Trypanosoma cruzi e seus respectivos filhos
que nasceram na Maternidade do Hospital das Clínicas de Goiás ou menores de um ano de
idade cujas mães eram pacientes do Ambulatório de Chagas daquele hospital.
Para o sequenciamento foram escolhidas aleatoriamente até o momento, 16
amostras cujas PCRs de kDNA foram positivas, sendo oito pares, ou seja, oito mães com
seus respectivos filhos.
As mulheres envolvidas neste estudo foram esclarecidas quanto aos objetivos do
mesmo e dele participaram somente aquelas que concordaram e assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Esta pesquisa foi submetida e aprovada pelo
Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da UFG, Goiânia-GO sob o registro 142/2009.
4.3 – CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Para serem incluídas na pesquisa da soroprevalência foram incluídas todas as
mulheres que engravidaram no intervalo de tempo de três anos, correspondentes aos anos
de 2010, 2011 e 2012.
Foram excluídas as mulheres que não estavam grávidas e as que geraram seus
filhos em anos diferentes aos de 2010, 2011 e 2012.
42
Foram convidadas a participarem do estudo da integração 38 mulheres e seus
respectivos filhos menores de um ano de idade, totalizando 40 crianças, pois duas mães
tiveram gestações gemelares. Ao realizarem exames para diagnóstico da doença de Chagas
no Laboratório de Chagas do Hospital das Clínicas, duas mães foram excluídas por terem
resultados sorológicos negativos. Aquelas mães, cuja sorologia foi confirmadamente
positiva para Chagas fizeram parte do projeto.
4.4 – REALIZAÇÃO DOS EXAMES SOROLÓGICOS E
PARASITOLÓGICOS
Para a realização dos exames sorológicos e parasitológicos foram coletados de 1-
3mL de sangue total de cada criança e aproximadamente 18 mL da mãe. Os sangues
coletados foram distribuídos em tubos à vácuo que continham como anticoagulante, o
EDTA (Ácido Etilenodiaminotetracético) e também em tubos sem anticoagulante
contendo gel separador . O material coletado com anticoagulante foi utilizado para
realização das técnicas de hemocultura e PCR. O soro advindo do sangue sem
anticoagulante foi utilizado para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas.
4.5 - DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Para confirmar a infecção da mãe e a possível infecção no recém-nascido por T.
cruzi, foram utilizadas três técnicas: Imunofluorescência Indireta - IFI (Camargo 1966),
Hemaglutinação Indireta-HAI (Camargo e cols 1973) e ensaio Imunoenzimático - Enzyme
Linked Immunosorbent Assay – ELISA (Voller e cols 1975) que permitem a detecção de
anticorpos específicos no sangue. Estes exames foram realizados no Laboratório de Chagas
do Hospital das Clínicas de Goiás-UFG.
4.5.1 – IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA – IFI
Consistiu na incubação durante 30 min a 37°C do soro diluído com antígeno de
epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) fixados em lâminas de microscopia convenientemente
demarcada. Após lavagens sucessivas, procedeu-se a incubação com conjugado (FITC-
Biomeriéux®, França) nas mesmas condições anteriormente descritas, seguidas de novas
lavagens em recipientes próprios com tampão PBS. As lâminas secaram a temperatura
43
ambiente e foram montadas com glicerina tamponada e lamínulas. As leituras foram
realizadas em microscópio de fluorescência, cuja luz ultravioleta ativa o isotiocianato de
fluoresceína presente apenas nos parasitos que apresentaram anticorpos ligados à sua
superfície. Os soros das mães e dos seus respectivos filhos foram examinados numa
diluição inicial de 1:160 para verificação do título final, simultaneamente, para afastar a
possibilidade de transmissão vertical. Caso a reação tivesse como resultado um título
menor que 1:160, uma nova diluição à partir de 1:10 era realizada.
4.5.2 – TESTE IMUNOENZIMÁTICO – ELISA
As formas epimastigotas de T. cruzi (antígeno bruto de cepa Y) foram adsorvidas
em microplacas de microtitulação, onde foram adicionados 0,1ml dos soros em diluição
única de 1:100. Após a incubação de 30 minutos em estufa úmida, fez-se a lavagem da
placa na lavadora de placas de ELISA com tampão apropriado. Adicionou-se o conjugado
composto por anticorpos anti-IgG humana conjugada a enzima peroxidase (Bio-
Manguinhos). Após 30 minutos de incubação a 37°C em estufa úmida, a placa foi
novamente levada à lavadora. Adicionou-se o substrato (H2O2) e o cromógeno (TMB),
substância incolor que adquire coloração sob ação do substrato. Essa reação foi
interrompida em até 30 min com adição de ácido sulfúrico. A seguir, procedeu-se à leitura
da intensidade da cor obtida em cada poço da microplaca com auxílio de espectrofotômetro
(Tecam-Espectra Classic®, USA) que, indicou a reatividade de cada cavidade em
densidade óptica (DO) e foram confirmadas como positivas todas as amostras que
possuíram DO maior que o ponto de corte. O valor do ponto de corte (Cut-off) foi
determinado por placa. Este valor foi calculado a partir da média de controles negativos e
positivos de baixa reatividade incluídos no kit. O índice de referência foi calculado pela
divisão da DO pelo cut-off.
4.5.3 – HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA – HAI
Consistiu basicamente na diluição progressiva dos soros em microplacas de
poliestireno de 96 poços de fundo em “U” com capacidade de 0,25ml por poço,
inicialmente, a diluição foi de 1:160 seguida de diluição seriada por aproximadamente 2
poços da placa . A seguir, adicionou-se o antígeno, constituído pelas hemácias de aves
44
sensibilizadas (Kit – Wiener®). Após uma hora em repouso à temperatura ambiente
realizou-se a leitura da imagem obtida em cada poço, quando visualizadas imagens
puntiformes sedimentadas no fundo do poço, as reações foram consideradas negativas e
positivas, quando uma “rede” ou “tapete” de hemácias cobriram todo ou parcialmente o
fundo da placa observada.
4.6 – DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
Para o diagnóstico parasitológico das crianças foi realizada a pesquisa direta do
parasito e a hemocultura. Para ambos (mães e filhos) foram realizadas Reações de
Polimerização em Cadeia - PCR. A hemocultura foi realizada somente nos filhos visando à
detecção do parasito e o seu isolamento. As PCRs foram realizadas tanto no sangue dos
filhos quanto das mulheres infectadas por T. cruzi e suas finalidades foram amplificar
DNA nuclear (nDNA), mitocondrial (kDNA) e a investigação da transferência de
minicírculos de kDNA de T. cruzi para o genoma humano.
4.6.1 – PESQUISA DIRETA DO PARASITO
Para realizar a pesquisa direta, utilizou-se aproximadamente 10µl de sangue total
das crianças entre lâmina e lamínula, levou-se ao microscópio óptico e foram observados
aproximadamente 100 campos com objetiva de 40x.
4.6.2 – HEMOCULTURA
A hemocultura foi realizada no sangue dos filhos de mães com sorologia positiva
para o T. cruzi. A coleta de sangue nos recém-nascidos foi proporcional ao peso do mesmo,
variando de 1 a 3 ml e dos menores de um ano de idade foi coletado volumes que variaram
de 3 a 10 ml aproximadamente. Para a coleta de sangue venoso das crianças foram
utilizadas seringas, cujos volumes variaram de 3 a 10 ml e posteriormente foram
distribuídos em tubos vacutainer contendo EDTA (etilenodiaminatetracético), semeado em
meio LIT e distribuído em tubos plásticos de 15mL (Falcon, USA), volume a volume(v/v).
Os tubos foram mantidos em estufa BOD (General Electric-FANEN-LTDA) a 28°C e
homogeneizados duas vezes por semana para aeração. Alíquotas de 10µl da suspensão de
45
cada tubo serão colocadas entre lâmina e lamínula e examinadas em microscópio com
aumento de 400 X aos 30, 60, 90, 120 e 150 dias após a semeadura. A partir das
hemoculturas positivas foram realizados cultivos em meio LIT e criopreservação em N2
líquido a -196°C.
4.7 – EXTRAÇÃO DE DNA DE CÉLULAS SANGUÍNEAS
A extração do DNA a partir de células sanguíneas foi realizada segundo o
protocolo do kit Biopur. Os reagentes permitem a lise e preservação do DNA à temperatura
ambiente. Após a coleta, as amostras que continham EDTA foram estocadas a 4°C até o
momento da extração. O princípio da extração consistiu na lise das células das amostras
com tampão e enzimas, promoveu-se a ligação do material genômico a uma membrana de
sílica por afinidade de cargas. Lavou-se a membrana com tampões que contém etanol para
retirar interferentes e impurezas e, em seguida, fez-se a eluição do DNA com tampão de
eluição a 56°C.
Foram transferidos 200μl de sangue total com EDTA para um tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml (Eppendorf- USA). Adicionou-se 200 μl de tampão de lise e 20
μl de proteinase K. Essa solução foi agitada durante 5 segundos em vortex e incubada por
20 minutos a 56°C sob agitação. A cada 4 minutos realizou-se uma nova agitação em
vortex, totalizando cinco vezes tal procedimento. Adicionou-se 400 μl de tampão de
ligação e novamente as amostras foram agitadas em vortex. Colocou-se uma coluna de
sílica em um tubo de reação de 2,0 ml e a mistura foi transferida para a coluna, fechou-se o
tubo e o mesmo foi incubado à temperatura ambiente por 1 minuto. Após esse tempo, o
tubo foi centrifugado por 2 minutos a 13.000 rpm, o filtrado foi descartado e a coluna foi
colocada em um novo tubo de reação de 2 ml. O tampão de lavagem I foi adicionado a
cada tubo num volume de 500 μl, centrifugado por 1 minuto a 13.000 rpm e o após esse
procedimento o filtrado foi descartado. Adicionou-se 800 μl de tampão de lavagem II ao
tubo e uma nova centrifugação a 13.000 rpm durante 1 minuto foi feita. Novamente
descartou-se o filtrado e a coluna foi colocado no mesmo tubo e centrifugada por mais 4
minutos a 13.000 rpm, no intuito de eliminar completamente o etanol. A coluna foi
colocada em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Eppendorf- USA), adicionou-se
50 μl de tampão de eluição, previamente incubado a 56°C para que houvesse a
46
ressuspensão do DNA, e esperou-se o tempo de incubação de 1 minuto à temperatura
ambiente para em seguida centrifugar o tubo a 8.000 rpm , descartar a coluna para
posterior armazenagem em freezer.
4.8 – REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR)
A técnica de PCR consiste em fazer cópias de DNA in vitro usando os elementos
básicos de replicação da célula e hoje se constitui o método de rotina para isolar
rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura complexa de sequências
genômicas ou de DNA. Para tanto, utilizam-se oligonucleotídeos complementares a regiões
flanqueadoras do fragmento do gene ou sequência-alvo, os chamados iniciadores (primers),
que na presença ainda de uma DNA polimerase termoestável (Taq DNA polimerase), de
deoxinucleotídeos trifosfatados e de um tampão próprio geram, por meio da alternância de
temperatura, cópias do fragmento do DNA molde compreendido entre os sítios de ligação
dos iniciadores.
Com o objetivo de amplificar o DNA nuclear (nDNA) e o DNA mitocondrial
(kDNA) de T. cruzi no DNA molde extraído das células nucleadas do sangue dos
pacientes, foram ulitizados dois pares de primers diferentes. Os pares TCZ1/2 (Moser e
cols 1989) que amplificam regiões do nDNA do parasito e os primers S36/S35 que
amplificam sequências dos minicírculos de kDNA (Sturm e cols 1989). A Tabela 1 contém
as sequências de cada par de primers. Os primers TCZ1/2 amplificam uma região de
microssatélite, com repetições in tandem, que corresponde a 9% do DNA total de T. cruzi
(Virreira e cols 2003).
Esses primers são específicos de T. cruzi, não amplificando o DNA de outros
tripanossomatídeos ou de humano. Os primers de kDNA foram deduzidos a partir das
regiões conservadas dos minicírculos de kDNA (Figura 9) e abrangem 25% do DNA total
do parasito. As amplificações foram realizadas em triplicatas e seguiram as seguintes
condições, previamente padronizadas: 200 ng de DNA humano foram utilizados como
molde e os reagentes do kit de PCR da INVITROGEN: tampão de reação (50 mM de KCl,
10 mM de Tris-HCl pH 9.0 e 2 mM de MgCl2), 50 M de cada primer, 0,2 mM de dNTPs
e 2,5 unidades de Taq DNA polimerase. Foram incluídos em todas as reações os devidos
controles, negativo e positivo, que consistiram, respectivamente, de DNA de indivíduo não
47
infectado e o branco e de 250 pg de DNA de T. cruzi Berenice mais um DNA de indivíduo
infectado.
Todas as reações de PCR foram realizadas em triplicata e processadas no
termociclador BIO-RAD MyCyclerTM
e seguiram o seguinte programa: O programa de
amplificação constou de uma desnaturação inicial a 95oC (5min) e de 30 ciclos com
desnaturação a 95oC (30 segundos), anelamento a 68
oC (1min) e extensão a 72
oC (1min)
seguida de extensão final de 5 minutos em um termociclador Todas as reações de PCR
foram realizadas no termociclador BIO-RAD MyCyclerTM
.
TABELA 1: Primers utilizados nas reações de PCR.
TCZ 1 nDNA 5’GAGCTCTTGCCCCACACGGGTGCT 3’ 67,6
TCZ 2 nDNA 5’CCTCCAAGCAGCGGATAGTTCACG 3 61,4
S 34 kDNA 5’ACACCAACCCCAATCGAACC 3’ 57,9
S 67 kDNA 5’GGTTTTGGGAGGGG(G/C)(G/C)(T/G)TC 3 60,1
S 35 kDNA 5’ATAATGTACGGG(T/G)GAGATGC 3’ 59,4
S 36 kDNA 5’GGTTCGATTGGGGTTGGTG 3’ 57,9
L1-1 LINE 5’CTCCGGTCTACAGTCCCCA3’ 65,6
L1-2 LINE 5’TCCCAAGACTAAACCAGGA3’ 62,9
L1-3 LINE 5’ ATCACACTCTGGGGACTGTG 3’ 64,7
L1-4 LINE 5’ CACAGTCCCCAGAGTGTGAT 3’ 59,9
L1-5 LINE 5’ TCCTGGTTTAGTCTTGGGAG 3’ 60,1
L1-6 LINE 5’ TGGGAGCTGTACACCGGAG 3’ 63,0
*Tm=Temperatura média de anelamento em°C.
4.9 - ANÁLISE ELETROFORÉTICA DOS PRODUTOS DE PCR
Os produtos das amplificações foram submetidos à corrida eletroforética em gel de
agarose (Invitrogen), em 1% submerso em tampão TAE 1X, contendo 0,5 g/mL de
brometo de etídio. O fracionamento do DNA foi visualizado por meio da fluorescência
emitida pelo brometo de etídio associado ao DNA, quando exposto à radiação ultravioleta
de onda curta (Sambrook e cols 1989 com modificações).
4.10 – AMPLIFICAÇÃO DAS REGIÕES FLANQUEADORAS DO
kDNA DE T. cruzi INTEGRADO NO GENOMA HUMANO
A técnica de TAIL PCR (Thermal Asymmetric Interlaced – PCR) foi modificada na
tentativa de se obter as regiões do genoma humano que flanqueiam o kDNA integrado.
48
Inicialmente descrita por Liu & Whittier (1995), esse procedimento alterna ciclos de baixa
estringência e alta estringência e utiliza primers degenerados combinados com primers
específicos. Dessa forma, enquanto as altas temperaturas favorecem o anelamento apenas
dos primers específicos, as baixas temperaturas permitem o anelamento de ambos
Na psTAIL PCR (target primer Thermal Asymetric Interlaced – PCR), deduziram-se
primers de regiões conservadas de L1 de diversos organismos (Figuras 10 e 11), visando
substituir os primers degenerados de Liu & Whittier 1995 (Hecht 2010). Assim, seguiu-se
a primeira amplificação: utilizando-se 200 ng de DNA genômico em uma reação contendo
1X de tampão de reação (20 mM Tris HCl pH=8,4, 50 mM KCl), 2,5 mM de MgCl2, 0,04
M do primer de kDNA (S34 ou S67), 0,2 mM de dNTPs, 2 unidades de Taq Platinum
FIGURA 10 : A modificação da tpTAIL-PCR utilizada para detectar
integrações de minicírculos de Trypanosoma cruzi no genoma humano.
Fonte: Hecht 2010
49
(Invitrogen), juntamente com 0,04 M de cada um dos primers de L1 usados neste estudo .
O programa utilizado na psTAIL PCR1 foi: 94°C / 4min, 5 ciclos de 94°C / 30 seg, 64°C /
1 min e 72°C / 2 min, 1 ciclo de 94°C / 30 seg, 25°C / 2 min e 72°C / 2 min e 12 ciclos de
94°C / 4 min,94°C / 30 seg ,64°C / 1 min ,72°C / 2 min,94°C / 30 seg, 64°C / 1 min,72°C /
2 min e 72°C / 7 min.
E temperatura final de 4°C.
Figura 11: Regiões de dedução dos primers utilizados na psTAIL PCR. A) Estrutura do minicírculo de
kDNA, composta por 4 regiões conservadas (azul escuro) e 4 regiões variáveis (azul claro). Em destaque,
os primers deduzidos das fitas senso e anti-senso. B) Elemento LINE-1: sequências bastante conservadas
entre os diversos L1 de humano possibilitaram a construção de primers para as regiões 5’-UTR, 3’UTR e
ORF2 (Hecht 2008)
Para a segunda amplificação, foram utilizados 2 µL da diluição de 1:40 da psTAIL PCR 1,
em uma reação contendo 1X de tampão de reação (20 mM Tris HCl pH=8,4, 50 mM KCl),
2,5 mM de MgCl2, 0,04 M do primer de kDNA mais interno (S35 ou S35 reverso), 0,2
mM de dNTPs, 2 unidades de Taq Platinum (Invitrogen), mantendo-se os mesmos primers
de L1 utilizados na primeira amplificação (0,04 M). O programa utilizado na psTAIL
PCR 2 foi : 94°C / 4 min, 12 ciclos de 94°C / 30 seg,64°C / 1 min,72°C / 2 min,94°C / 30
seg, 64°C / 1 min e 72°C / 2 min, posteriormente 94°C / 30 seg,45°C / 1 min,72°C / 2
min,72°C / 7 min e 4°C.
50
Os produtos da psTAIL PCR 2 foram diluídos 1:10 e 2 µL da diluição foram
utilizados como molde para a psTAIL PCR 3. A reação continha 1X de tampão de reação
(20 mM Tris HCl pH 8,4, 50 mM KCl), 2,5 mM de MgCl2, 100 ng do primer de kDNA
mais interno (S67 reverso ou S36), 0,2 mM de dNTPs, 2 unidades de Taq Platinum
(Invitrogen) junto com os mesmos primers de L1. O programa utilizado na psTAIL PCR
3 foi:94°C / 3 min, 20 ciclos de 94°C / 30 seg,45°C / 1 min,72°C / 2 min, seguidos de
72°C / 7 min e 4°C.
4.11 – CLONAGEM, TRANSFORMAÇÃO EM Echerichia coli
COMPETENTE E EXTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL
Os produtos da terceira psTAIL PCR foram clonados no vetor comercial pGEM T-
Easy (PROMEGA) conforme instruções do fabricante. Esse vetor caracteriza-se pela
presença de uma timina em ambas as extremidades 3’. Assim, a ligação dos produtos se
faz possível, pois a Taq polimerase utilizada adiciona uma adenina na extremidade 3’,
permitindo o pareamento.
Para o procedimento de transformação, faz-se necessária a preparação de células
competentes, a qual seguiu o protocolo de cloreto de rubídio descrito no Protocols and
Application Guide da PROMEGA (1996). As células utilizadas foram XL10-Gold
(STRATAGENE).
Após a transformação, foi feita a seleção dos clones que continham o inserto pela
diferença de coloração das colônias. As colônias brancas eram formadas quando o inserto
era adicionado ao plasmídio, havendo, assim, o rompimento do gene da β-galactosidase
que, consequentemente, tornou-se incapaz de processar o substrato X-gal. Quando o
inserto não se insere, o gene da β-galactosidase codifica a enzima que age sobre X-gal,
formando a coloração azul das colônias (Figura 12). Além disso, o vetor pGEM T-Easy
também possui o gene de resistência a ampicilina, o que garante que apenas as bactérias
transformantes consigam crescer em meio contendo este antibiótico.
O DNA plasmidial foi extraído utilizando-se o kit QIAprep Spin Miniprep
(QIAGEN), de acordo com as instruções do fabricante. A análise do tamanho dos insertos
foi feita em gel de agarose 1%, na presença de marcador molecular, após digestão do
DNA plasmidial com a enzima de restrição EcoRI (12 h, 37ºC ).
51
4.12 – SOUTHERN BLOT
4.12.1 - SOUTHERN BLOT DOS PRODUTOS DE PCR
Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% e,
posteriormente, utilizou-se o método de transferência alcalina (Sambrook & Russel,
2001) para transferir o DNA para uma membrana de nylon positivamente carregada
(Hybond-XL – Amersham Pharmacia Biotech). Resumidamente, desnatura-se o DNA em
solução alcalina (NaOH 0,4 M) por 20 min e, então, faz-se a transferência, por
capilaridade, do DNA presente no gel para a membrana, utilizando a mesma solução
alcalina. Após 8 h de transferência, as membranas foram secas em estufas a 37 ºC para a
fixação do DNA (Figura 13).
FIGURA 12: Placa demonstrando as colônias azuis e brancas.
Fotos: Liliane Siriano 2011 (Arquivo Pessoal).
52
4.13-TRANSFERÊNCIA DE COLÔNIAS DE BACTÉRIAS
TRANSFORMANTES PARA MEMBRANA DE NYLON
Os clones de bactérias transformantes foram repicados para uma membrana de
nylon em contato com meio LB sólido contendo 100 µg/mL de ampicilina. Após
incubação a 37ºC por 12 h, as membranas foram retiradas e embebidas em papel de filtro
contendo solução de lise (SDS 10%) por 10 min, seguida de solução de desnaturação (0,4
M NaOH) por 10 min, e, por último, SSC 2X por 10 min. As membranas foram secas em
estufas a 37ºC para a fixação do DNA (Figura 14).
FIGURA 13: Corrida do DNA no gel de agarose e a sua transferência para membranas.
Fotos: Liliane Siriano 2011 (Arquivo Pessoal).
FIGURA 14: Repique dos clones das bactérias transformante e lavagem das membranas.
Fotos: Liliane Siriano 2011 (Arquivo Pessoal).
53
4.14 – MARCAÇÃO DE SONDAS RADIOATIVAS
DNA mitocondrial de T. cruzi ou fragmentos de DNA resultantes da amplificação
do DNA desse parasito com diferentes primers foram marcados radioativamente,
utilizando-se o kit Random Primer Labelling System (Invitrogen). Essa técnica consiste
em inserir um dATP radiomarcado [α- 32P] na sequência da fita de DNA molde,
sintetizada pela enzima Klenow (atividade polimerásica) na presença de primers
randômicos (hexaméricos). A reação foi realizada conforme instruções do fabricante: 30
ng de DNA (em um volume final de 25 µL) foram desnaturados a 100°C por 10 min e
depois colocados no gelo. Foram adicionados 2 µL de dCTP, 2 µL de dGTP e 2 µL de
dTTP; 15 µL de tampão, 3 µL de [α-32P] dATP (3000 µCi) e 1 µL de Klenow. Após um
período de incubação de 3 h a temperatura ambiente, a reação foi paralizada com 5 µL do
tampão de parada.
4.15 – PURIFICAÇÃO DE SONDAS RADIOATIVAS
Após a marcação, as sondas radiomarcadas eram purificadas em coluna Sephadex G-
50 e lã de vidro (Sambrook e cols, 1989), com a finalidade de remover os nucleotídeos
radioativos livres não incorporados e foram centrifugadas por 2 minutos a 2000 rpm.
Recolheu-se o DNA radioativo que passou pela coluna e o radioisótopo livre ficou retido
nas malhas do Sephadex. A sonda foi então desnaturada a 100 ºC por 10 min, antes de ser
adicionada à solução de hibridização.
4.16 - HIBRIDIZAÇÃO
As membranas com o DNA mobilizado foram bloqueadas por 12 h a 65ºC com
solução de pré-hibridização (PEG 800 10%, SSPE 1,5%, SDS 7% e 100 µg/mL de DNA
de esperma de salmão). Ao término desse período, as sondas radiomarcadas foram
desnaturadas a 100°C por 15 min e adicionadas à solução de pré-hibridização, onde as
membranas permaneceram por mais 12 h a 65°C. As lavagens de todas as membranas
(TCZ, kDNA e psTAILs ) foram realizadas com graus crescentes de estringência, visando
a remoção da sonda que não se ligou adequadamente à membrana.
Foram feitas duas lavagens com SSC-2X/0.1% SDS, a 65°C, por 15 min, seguidas
de outras duas com SSC-0.1X/0.1% SDS, a 65°C, por 15 min. As membranas, ainda
54
úmidas, foram revestidas em filme plástico de PVC em um cassete metálico com filme
sensível aos raios X (KODAK T-MAT) e utilizou-se o contador geiger para verificar os
sinais emitidos pelas radiações ionizantes e em função disso fazer um cálculo aproximado
do tempo de incubação à -80°C. O tempo de exposição variou de acordo com o DNA
transferido para a membrana. Assim, aquelas contendo os produtos de PCR ou as
colônias transformantes ficaram expostas entre 12 h e sete dias (Figura 13). Procedeu-se a
revelação dos filmes.
Em algumas ocasiões as membranas foram dehibridadas com três sucessivas lavagens
em água destilada por pelo menos 15 minutos a 65 C e em seguida envolvidas em filme
plástico de PVC e guardadas a -20 C até o momento da hibridização.
carestrem.com pt.wikipedia.org
FIGURA 15: Esquema da hibridização das membranas com sonda radioativa
55
4.17– REVELAÇÃO DAS PELÍCULAS
As revelações das películas autorradiográficas foram realizadas em câmara escura
por imersão do filme em solução reveladora Kodak por um minuto, parando a reação com
água e fixando os filmes por imersão em solução fixadora por cinco minutos. Em seguida,
os filmes foram lavados extensivamente em água corrente e secados à temperatura
ambiente.
4.18 – SEQUENCIAMENTO DOS CLONES E ANÁLISE EM BANCO
DE DADOS
O DNA extraído dos clones selecionados foi enviado para o sequenciamento
automático comercial (Genomic, SP), o qual utilizou os primers T7 e Sp6 para a
amplificação das sequências. Para a análise das sequências de DNA em banco de dados,
foram utilizados software DNAMAN e posteriormente, o algorítmo BLASTn (www.
ncbi. nlm.nih.gov) ou GIRI (Genetic Information Research Institute).
56
5 – RESULTADOS
Os resultados serão apresentados sob a forma de artigo.
Manuscrito 1 – RARO, MAS POSSÍVEL: TRANSMISSÃO CONGÊNITA EM
RECÉM-NASCIDO DE INFECTADA CRONICAMENTE E
IMUNOCOMPETENTE POR Trypanosoma cruzi.
Revista: Parasitology Research (A ser submetido)
Manuscrito 2 – A IMPORTÂNCIA DA TRIAGEM SOROLÓGICA DA DOENÇA
DE CHAGAS NA ATENÇÃO PRIMÁRIA DE SAÚDE EM GESTANTES
Revista: Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical (A ser submetido)
Manuscrito 3– INTEGRAÇÃO DE MINICÍRCULOS DE KDNA DE Trypanosoma
cruzi DE CÉLULAS SANGUÍNEAS DE MENORES DE UM ANO DE IDADE
NASCIDOS DE CHAGÁSICAS CRÔNICAS EM GOIÂNIA-GO.
Revista PLOS(A ser submetido)- Dados preliminares.
57
5.1- Manuscrito 1
RARO, MAS POSSÍVEL: TRANSMISSÃO CONGÊNITA EM RECÉM-
NASCIDO DE INFECTADA CRONICAMENTE E
IMUNOCOMPETENTE POR Trypanosoma cruzi
Autores: Liliane da Rocha Siriano, Ana Maria de Castro, Mariana Machado Hecht, Dayse
Elizabeth Campos, Lindomar Lopes de Sales, Christian Douglas Rodrigues, Fernanda
Alves Bastos, Joyce Ferreira de Sousa, Gabriela Silvério Bazílio, Roberta Rassan de Lima
Candido.
RESUMO:
Uma mulher infectada por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) gerou três crianças, das quais a
última apresentou este parasito em amostra sanguínea. A criança foi levada ao serviço de
urgência pediátrica do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás devido a
uma dor no ombro direito, houve a necessidade de internação hospitalar. Ao realizar
exames laboratoriais solicitados pela equipe médica, foi encontrada no esfregaço
sanguíneo, uma estrutura flagelada contendo cinetoplasto, compatível com a forma
tripomastigota de T. cruzi. Para confirmação diagnóstica, foram realizadas análises
sorológicas e moleculares que confirmaram a doença de chagas congênita, posteriormente,
a criança foi encaminhada para o Ambulatório desta mesma doença para acompanhamento
e tratamento com benznidazol.
PALAVRAS-CHAVE: Doença de Chagas, Transmissão congênita, Parasitemia, Métodos
Parasitológicos e Moleculares.
INTRODUÇÃO:
A frequência da transmissão materna ou vertical da doença de Chagas pode variar, de
acordo com a região e a metodologia utilizada, desde 1% no Brasil até 4% a 12% em
países do Cone Sul (Carlier e cols 2002, Carlier 2005, Consenso Brasileiro em doença de
Chagas 2005). Segundo Rassi e cols 2004, em Goiás a taxa de transmissão congênita é de
0,7%. Poucos são os Serviços de Pré-Natal que incluem, rotineiramente, exame sorológico
58
para DC em gestantes procedentes ou naturais de áreas endêmicas. A DC congênita é
considerada aguda e, portanto, de notificação compulsória imediata, conforme a Portaria nº
104, de 25 de janeiro de 2011, Ministério da Saúde (BRASIL 2005, FILHO e cols 2008,
BRASIL 2011).
A infecção congênita por T. cruzi não tem sinais clínicos específicos. Os recém-nascidos
infectados, muitas vezes são assintomáticos ou apresentam manifestações sutis. Aqueles
sintomáticos, 10 a 40% , podem ter baixo peso ao nascer, índice de Apgar baixo,
hepatoesplenomegalia, dificuldade respiratória, anasarca, insuficiência cardíaca, ou
meningoencefalite (Oliveira 2010).
A doença de Chagas congênita é diagnosticada por exame microscópico direto em
amostras de sangue, por PCR ou testes sorológicos convencionais(ELISA,IFI e HAI). Estes
últimos podem ser realizados em lactentes, quando espera-se que os anticorpos IgG
transferidos pela mãe tenham sido eliminados 8 a 9 meses após o nascimento ( Fretes &
Kemmerling 2012). Assim, acredita-se que a doença de Chagas congênita é o produto de
uma complexa interação entre o parasito, as respostas imunes maternas e fetais / recém-
nascidoe fatores placentários ( Burgos e cols 2007, Kemmerling e cols 2010).
T. cruzi, exibe um alto grau de polimorfismo intraespecífico, incluindo desde aspectos
morfológicos (formas delgadas, largas e intermediárias, já observadas por Carlos Chagas
no começo do século) até refinados marcadores moleculares descritos mais recentemente
(Macedo e cols 2004). Este protozoário foi subdividido em seis linhagens ou DTUs
(Discret Taxonômica Units) I, IIa, IIb, IIc, IId, IIe, sendo o DTU I correspondente à
linhagem T. cruzi I e o DTU IIb correspondente à linhagem T. cruzi II (Zingales e cols
2009), sendo que pelo menos quatro destes estão envolvidos com a patologia humana
(Miles 2009).
O tratamento específico disponível atualmente é realizado com o Benznidazol. Este
medicamento é eficaz, com taxas de cura próximas a 100% quando instituído nos primeiros
anos de vida. Desta forma, quando a mãe é sabidamento positiva para doença de Chagas, o
recém-nascido deve ser sempre investigado e, se infectado,o tratamento deve ser instituído
imediatamente (Centers for Disease Control and Prevention 2012).
Este artigo tem por objetivo relatar um caso de doença de Chagas congênita, ocorrido no
Hospital das Clínicas de Goiânia – UFG. Para comprovar este meio de transmissão e excluir
59
qualquer possibilidade de transmissão transfusional, foram realizadas técnicas sorológicas,
parasitológicas e moleculares que comprovaram este mecanismo. Ressaltamos ainda a
importância da inclusão da sorologia para doença de Chagas nos exames rotineiros realizados
durante o pré-natal e principalmente, o seguimento dos recém-nascidos destas gestantes
infectadas, pela possibilidade da transmissão vertical.
DADOS EPIDEMIOLÓGICOS E CLÍNICOS DO CASO:
G.M.S., sexo masculino, 58 dias, 3o filho de uma prole de três, nascido de parto cesárea
(indicada por sofrimento fetal agudo) com 37 semanas, com 2.300g e 48cm, em Goiânia-
GO em 01/07/12. Permaneceu cinco dias internado na Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
do Hospital Materno Infantil (Goiânia-GO), com alta hospitalar em 07/07/12.
Filho de mãe com sorologia positiva para Tripanossomíase Americana, natural da zona
rural da cidade de Canápolis (Bahia). Ela residiu neste local durante nove anos e
posteriormente mudou-se para a cidade de Goiânia (Goiás). Referiu contato com
triatomíneos, quando residia na zona rural e negou hemotransfusão. Estudou até a oitava
série do ensino fundamental, atualmente com renda familiar de três a quatro salários
mínimos. Realizou o pré-natal regularmente, sem intercorrências. Referiu cinco gestações,
sendo três partos e dois abortos.
A criança foi atendida em 13/08/12 no serviço de urgência pediátrica do Hospital das
Clínicas – UFG em Goiânia-GO, com queixa, referida pela mãe, de choro ao tocar o braço
direito. No exame fisíco apresentava edema em ombro direito, sem sinais flogísticos, sinais
de desnutrição, icterícia +/4+, e hepato-esplenomegalia. Apresentava retração palpebral,
não conseguindo fixar o olhar. A mãe negou trauma. Foram realizados Rx de ombro que
demonstrou aumento de partes moles e USG de ombro D que detectou cisto pararticular em
região da articulação do ombro. Foram realizadas duas drenagens do ombro direito sendo
isolado Staphylococcus aureus no material da cultura. Foi concluído o diagnóstico de
artrite séptica e iniciado antibioticoterapia.
Foram solicitados testes sorológicos para citomegalovírus, rubéola, toxoplasmose e doença
de Chagas, além do hemograma e algumas dosagens bioquímicas. Os exames foram
realizados no laboratório de análises clínica deste hospital.
Durante esta internação foram realizadas duas hemotransfusões: uma antes e outra após o
diagnóstico da doença de Chagas. A primeira bolsa de sangue foi fornecida pelo Hospital
60
Araújo Jorge e a segunda bolsa foi proveniente do banco de sangue do Hospital das
Clínicas de Goiás. Os dois bancos de sangue realizam rotineiramente a triagem para
doenças infecciosas, de possível transmissão sanguínea.
O diagnóstico da tripanossomíase foi determinado pelo achado de um grande número de
formas tripomastigotas durante a realização de um hemograma.
Para ratificar a transmissão vertical, foram realizadas as sorologias da mãe e do filho para
pesquisa de IgG e IgM, pesquisa do parasito pelo exame direto e hemocultura, diagnóstico
molecular para verificar a presença do parasito e a genotipagem das cepas de T. cruzi da
mãe e do filho.Além das análises diretas das amostras sanguíneas da mãe e do filho,
também foi solicitada a pesquisa direta no LCR (Líquido cefalorraquidiano) da criança.
Após confirmação diagnóstica, a criança foi submetida a tratamento específico com
benznidazol (10mg/Kg/dia) e realizadas sorologias para T. Americana nos outros dois
irmãos.
MATERIAL E MÉTODOS
Após dar entrada no serviço do pronto socorro pediátrico do Hospital das Clínicas da UFG
com posterior internação, os exames sorológicos para doença de Chagas foram solicitados,
além de outros como hemograma. Para confirmar a presença do parasito, novos exames
foram solicitados e realizados em laboratórios de apoio. Além das análises diretas das
amostras sanguíneas da mãe e do filho, também foi solicitado pesquisa direta em LCR
(Líquido cefalorraquidiano), hemocultura, ensaios sorológicos e moleculares.
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da UFG, Goiânia-
GO sob o registro 142/2009, esta pesquisa foi esclarecida à mãe que após a assinatura do
TCLE (Termo de Consentimento Livre e Esclarecido) permitiu a realização das coletas.
Para realização dos métodos sorológicos convencionais Enzimaimunoensaio (ELISA),
Imunofluorescência Indireta (IFI) e Hemaglutinação Indireta (HAI) foram coletados
aproximadamente 4 ml e 20 ml de sangue em tubos à vácuo sem e com anticoagulante
EDTA (ácido etilenodiamino tetracético) do filho e da mãe, respectivamente.As amostras
coletadas sem anticoagulante foram centrifugadas em centrífuga da marca Janetzki modelo
T32A por aproximadamente 10 minutos para separação completa do soro para
posteriormente proceder a realização das análises sorológicas e pesquisa do parasito pelo
STROUT. A partir das células sanguíneas coletadas com EDTA da mãe e do filho foi
61
extraído o DNA para a realização do diagnóstico molecular e parte deste material foi
utilizado para hemocultura em meio LIT (Liver Infusion Triptose).
ENSAIOS SOROLÓGICOS: TESTE IMUNOENZIMÁTICO – ELISA:
As formas epimastigotas de T. cruzi (antígeno bruto) foram adsorvidas em microplacas de
microtitulação, onde foram adicionados 0,1ml dos soros em diluição única de 1:100. Após
a incubação de 30 minutos em estufa úmida, fez-se a lavagem da placa na lavadora de
placas de ELISA com tampão apropriado. Adicionou-se o conjugado composto por
anticorpos anti-IgG humana conjugada a enzima peroxidase (Bio-Manguinhos). Após 30
minutos de incubação a 37°C em estufa úmida e a placa foi novamente levada à lavadora.
Adicionou-se o substrato (H2O2) e o cromógeno (TMB), substância incolor que adquire
coloração sob ação do substrato. Essa reação foi interrompida em até 30 minutos com
adição de ácido sulfúrico. A seguir, procedeu-se à leitura da intensidade da cor obtida em
cada poço da microplaca com auxílio de espectrofotômetro (Tecam-Espectra Classic®,
USA) que, indicou a reatividade de cada cavidade em densidade óptica (DO) e foram
confirmadas como positivas todas as amostras que possuíram DO maior que o ponto de
corte. O valor do ponto de corte (Cut-off) foi determinado por placa. Este valor foi
calculado a partir da média de controles negativos e positivos de baixa reatividade. O
índice de referência foi calculado pela divisão da DO pelo cut-off.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI):
Consistiu na incubação durante 30 minutos a 37°C do soro diluído com antígeno de
epimastigotas do T. cruzi (cepa Y) fixados em lâminas de microscopia convenientemente
demarcada. Após lavagens sucessivas, procedeu-se a incubação com conjugado IgG ou
IgM (FITC-Biomeriéux, França) para diagnóstico da fase crônica e aguda, repectivamente,
nas mesmas condições anteriormente descritas, seguidas de novas lavagens em recipientes
próprios com PBS. As lâminas secaram a temperatura ambiente e foram montadas com
lamínulas e glicerina tamponada. As leituras foram realizadas em microscópio de
fluorescência, cuja luz ultravioleta ativa o isotiocianato de fluoresceína presente apenas nos
parasitos que apresentaram anticorpos ligados à sua superfície. Os soros que foram
testados para IgG tiveram diluição inicial de 1:160 e considerados positivos aqueles que
62
apresentaram fluorescência superior a esse título,os que deram fluorescência menor que
aquela diluição,foram triados com duas diluições a partir de 1:10, já para os testados com
IgM a diluição inicial foi de 1:5 e considerados positivos os que apresentaram
fluorescência superior a este título e negativos, os inferiores.
HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA (HAI):
Consistiu basicamente na diluição progressiva dos soros em microplacas de poliestireno de
96 poços de fundo em “V” com capacidade de 0,25ml por poço, inicialmente de 1:160
seguida de diluição seriada por 3 poços da placa. A seguir, adicionou-se o antígeno,
constituído pelas hemácias de aves sensibilizadas (Kit – Wiener). Após uma hora em
repouso à temperatura ambiente realizou-se a leitura da imagem obtida em cada poço,
quando foram visualizadas as imagens puntiformes sedimentadas no fundo do poço, as
reações foram consideradas negativas e positivas, quando uma “rede” ou “tapete” de
hemácias cobriram todo ou parcialmente o fundo da placa observada. Os soros com títulos
inferiores a 1:160 foram triados com duas diluições a partir de 1:40.
ENSAIOS PARASITOLÓGICOS:
Para a pesquisa direta de T. cruzi no sangue foi utilizado o método de concentração Strout,
no qual 2 ml de sangue da criança e 10 ml da mãe em tubos sem anticoagulante foram
centrifugados primeiramente em baixa rotação, após a retração do coágulos e em seguida o
sobrenadante foi centrifugado em alta rotação.Posteriormente o sedimento foi analisado
entre lâmina e lamínula ao microscópio óptico no aumento de 400 x para a observação de
tripomastigotas.Para a pesquisa no LCR, o exame direto foi realizado entre lâmina e
lamínula.
A técnica da hemocultura foi realizada em meio LIT (liver infusion tryptose), onde depois
de centrifugadas, as hemácias foram semeadas v/v(volume a volume) com LIT em tubos
falcon de 15 ml, os quais foram incubados a 28°C em câmara de incubação BOD (modelo
347CD, marca FANEM) e a leitura do material foi feita ao microscópio óptico aos 30, 60,
90 e 120 dias depois do cultivo inicial.
As reações de polimerização em cadeia (PCR) foram realizadas visando identificar a
presença de DNA nuclear (nDNA) e mitocondrial (kDNA) nas amostras estudadas,
63
utilizando-se portanto, dois pares de primers diferentes. Para a demonstração da presença
do DNA mitocondrial (kDNA) foram utilizados os primers S35/S36 (Sturm e cols 1989) e
para o DNA nuclear, os pares TCZ1/2 (Moser e cols 1989).As amplificações foram
realizadas em triplicata com cada par de primers, para confirmação diagnóstica.
GENOTIPAGEM:
Para determinar a que linhagem de T. cruzi pertence os isolados do RN e de sua mãe, foi
utilizada uma técnica conhecida como PCR-RFLP que consiste em uma reação da
polimerase em cadeia (PCR) seguida pela análise enzimática (endonucleases de restrição-
gp72) de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP). Este
procedimento gera uma série de padrões específicos da linhagem de impressões digitais
que podem ser utilizados para genotipagem do parasito (Lewis e cols 2009, Rozas e cols
2007).
RESULTADOS
Os exames laboratoriais solicitados no dia 14 do mês de agosto do decorrido ano, deram
resultados alterados de hematócrito, hemoglobina, leucócitos totais, transaminases,
proteína C reativa, bilirrubinas, fosfatase alcalina e gama-GT, enquanto proteinograma,
uréia e creatinina foram normais.
O encontro do parasito se deu durante a realização de um hemograma. O técnico
responsável notou a presença de T. cruzi, fato este ocorrido provavelmente pela elevada
parasitemia no sangue da criança. Todas as sorologias (citomegalovírus, rubéola,
toxoplasmose) solicitadas na criança foram negativas, exceto para doença de Chagas que
foram reagentes (IgM e IgG).
Os exames comprobatórios foram realizados e o diagnóstico confirmado laboratorialmente.
O exame direto pela técnica do Strout (método de concentração) do sangue da criança foi
positivo e do líquor, negativo.
As hemoculturas, da mãe e do seu concepto foram positivas aos 30 dias de incubação,
cujas alíquotas foram utilizadas para obtenção do DNA para genotipagem. As cepas foram
armazenadas em N2.
64
Todas as três técnicas sorológicas para IgG foram reagentes para mãe e filho, conforme
demonstrado na tabela abaixo. E estes resultados (ELISA, IFI e HAI) foram concordantes
em 100%.
Tabela 1: Resultados sorológicos e parasitológicos da mãe cronicamente infectada e do seu
recém-nascido com infecção congênita pelo Trypanosoma cruzi.
Técnicas Sorológicas (IgG) Técnicas parasitológicas
Amostras
ELISA
Cut-off
IFI
Títulos
HAI
Títulos
Strout
Hemocultura
PCR
(Kdna e TCZ)
PCR-RFLP
Genotipagem
Filho 2.0 1/1280 1/160 Positivo Positiva Positiva TcII
Mãe 4.0 >=1/5120 >1/640 Negativo Positiva Positiva TcII
VALORES DE REFERÊNCIA: (ELISA: <0,9; IFI:<1/20; HAI: <1/40).
Para o diagnóstico da fase aguda foi realizada a IFI utilizando o conjugado IgM que foi
negativo para a mãe (<1/5).Para a criança o título foi maior que 1:160 caracterizando assim
a positividade do exame.
As hemoculturas foram examinadas ao microscópio em intervalos de 30 dias, sendo que as
duas hemoculturas (mãe e filhos) foram positivas no primeiro mês de análise. A
parasitemia foi elevada no exame a fresco. As amostras analisadas por PCR, tanto do filho
quanto da mãe foram positivas nas reações de PCR, tanto para o DNA nuclear (nDNA)
quanto para o mitocondrial (kDNA).
O benznidazol foi prescrito com dosagem de 10mg/Kg/dia, fracionados em 2 tomadas com
previsão para 60 dias de tratamento. O caso foi notificado para a Secretaria Municipal de
Saúde de Goiânia.
A criança será acompanhada clinicamente e laboratorialmente, cerca de dois anos e as
técnicas sorológicas serão realizadas até a sua possível negativação, dado necessário para
confirmação da cura.
Diante do fato da ocorrência desta transmissão vertical, foram solicitados exames para as
outras crianças cujos resultados foram negativos.
DISCUSSÃO
Apesar da sensibilidade dos testes parasitológicos serem reduzidos nos casos de
transmissão vertical devido as baixas parasitemias e o diagnóstico frequentemente ser
65
realizado por sorologia (Pinto e cols 2011), não foi o que ocorreu neste caso, a parasitemia
elevada favoreceu o encontro do parasito no esfregaço sanguíneo e no exame direto.
O quadro clínico da doença de Chagas congênita pode apresentar-se de forma muito
variável. Pode ser observado baixo peso ao nascer, icterícia, hepatoesplenomegalia,
distúrbios neurológicos, meningoencefalite, edema generalizado, hemorragias cutâneas,
cianose, hidrocele, pneumonite, alterações bilaterais de fundo de olho, corioretinite e
opacificação do corpo vítreo, alterações gastrointestinais com intensa destruição neural
originando manifestações digestivas como megacólon e megaesôfago na fase aguda
(Bittencourt 1968, Pehrson e cols 1982, Bittencourt e cols 1984, Almeida e cols 1986).
Neste caso verificou-se retração palpebral, baixo ganho de peso, desnutrição e icterícia
+/4+, hipertrofia ventricular direita com etiologia a esclarecer e esplenomegalia.
As alterações laboratoriais inespecíficas de fase aguda descritas são hipoproteinemia total,
diminuição da albuminemia, aumento da bilirrubina indireta, leucocitose discreta ou
moderada, linfocitose atípica, neutropenia, plasmocitose, aumento da velocidade de
hemossedimentação (VHS), elevação das alfas-2 e gamaglobulinas e presença de Proteína
C Reativa (PCR), sendo que essas manifestações tendem a desaparecer no fim de algumas
semanas ou meses após a infeção.Nesse lactente especificamente, os resultados do
hemograma, proteinograma, da bilirrubina,do VHS e a PCR deram alterados (Rassi e cols
1991).
Para a comprovação do diagnóstico congênito exames parasitológicos como Strout e
hemocultura foram realizados no lactente. Os exames laboratoriais específicos
compreendem a demonstração de T. cruzi em sangue periférico ou líquido
cefalorraquidiano (LCR) por métodos a fresco, com coloração, concentrado de Strout ou
microhematócrito, biópsia de lesão cutânea, conjuntiva, linfonodos, demonstração do
parasita por técnica imunocitoquímicas, xenodiagnóstico e hemocultura (Rassi 1991).
Parasitos circulantes podem estar presentes ao nascimento, mas aparecem entre 10 a 20
dias de vida em todos os casos analisados. A parasitemia aumenta de valores baixos ao
nascimento a números máximos em 1 a 2 meses de vida, para então, lentamente, declinar
nos próximos 5 a 8 meses (Howard 1976). O diagnóstico deste relato foi feito
aproximadamente nos dois meses de vida.
66
Na fase aguda e nas formas crônicas da doença de Chagas o diagnóstico etiológico poderá
ser realizado pela detecção do parasito pelos métodos parasitológicos (diretos ou indiretos)
e pela presença de anticorpos no soro, por testes sorológicos sendo os mais utilizados a
imunofluorescência indireta (IFI), hemaglutinação (HAI) e enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA). Testes de maiores complexidades como o teste molecular, utilizando
polymerase chain reaction (PCR) acoplado à hibridização com sondas moleculares e o
Western blot (WB) têm apresentado resultados promissores e poderão ser utilizados como
teste confirmatório tanto na fase aguda como nas formas crônicas da doença (segundo
Consenso do Ministério da Saúde em 2005). O encontro do parasito no sangue da criança,
o diagnóstico das fases da doença, além do diagnóstico molecular, corroboram com a
literatura.
Os comprimidos de benznidazol têm 100 mg da substância ativa. A dose recomendada é de
10 mg/kg/dia em crianças ou quadros agudos e 5 mg/kg/dia em crônicos, por 60 dias,
dividindo-se em duas tomadas. A dose máxima diária recomendada é de 300 mg. Para
adultos com peso acima de 60 kg, deve ser calculada a dose total esperada, estendendo-se o
tempo de tratamento para além dos 60 dias. O efeito colateral mais frequente é a dermatite
urticariforme, que ocorre em até 30% no final da primeira semana de tratamento, com boa
resposta terapêutica a anti-histamínicos ou corticosteroides (Andrade 2011). A precocidade
do tratamento está relacionada a uma melhor resposta terapêutica. Efeitos colaterais em
crianças são menos intensos que em adultos e 98% dos neonatos tratados resultam em
negativação de sorologia e parasitemia (Apt 2010). Fato ocorrido durante o uso do
medicamento.
O seguimento laboratorial dos pacientes tratados visa avaliar se ainda há parasitos no
organismo e se ainda estão presentes os anticorpos antitripanosoma. Os exames
parasitológicos (xenodiagnóstico, hemocultivo, reação em cadeia da polimerase - PCR)
têm valor apenas quando se encontra T. cruzi, significando falha terapêutica. Em casos
tratados durante a fase aguda, o declínio se observa no primeiro ano e alcança a
negativação em menos de cinco anos. Em crianças (até 12 a 14 anos) ou adultos tratados
nos primeiros anos após a infecção, o declínio é observado nos primeiros cinco anos e a
negativação ocorre, em geral, até 10 anos após. Em adultos tratados mais tardiamente, a
curva só apresenta inflexões após 10 a 20 anos e a negativação pode ocorrer depois de até
67
30 anos (Andrade 2011). Esta criança está sendo acompanhada por uma equipe do
Ambulatório de Chagas.
CONCLUSÃO:
Este relato de caso vem confirmar a necessidade do acompanhamento das gestantes
infectadas por T. cruzi e de seus filhos, já que esta é uma forma comprovada de
transmissão O tratamento específico é mandatório nos casos de transmissão congênita
detectada logo após o nascimento, tendo em vista a probabilidade da cura, de uma doença
de evolução crônica, muitas vezes incapacitante e ainda hoje estigmatizante em nosso
meio.
Agradecimentos: Clemar Pereira da Silva e Eleuza Lourenço.
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70
5.2- Manuscrito 2
A IMPORTÂNCIA DA TRIAGEM SOROLÓGICA DA DOENÇA DE
CHAGAS NA ATENÇÃO PRIMÁRIA DE SAÚDE EM GESTANTES
Autores: Liliane da Rocha Siriano, Ana Maria de Castro, Mariana Machado Hecht, Cléver
Gomes Cardoso, Juliana Boaventura Avelar.
RESUMO:
A prevalência da doença de Chagas em gestantes no Brasil, ainda é pouco estudada e uma
das formas de transmissão da doença de Chagas é a passagem do Trypanosoma cruzi da
mãe para o filho durante a gestação. Durante três anos, 1.979 prontuários de gestantes que
deram à luz na maternidade do Hospital das Clínicas de Goiás foram estudados para que se
conhecesse a prevalência da doença de Chagas neste grupo de mulheres. Esse estudo
retrospectivo é relevante pelo fato do Hospital ter um serviço de referência desta doença,
além de conhecermos os números de infectadas num grupo de mulheres ainda não
conhecidos neste setor do hospital. O acompanhamento dessas mulheres é de suma
importância, por ser uma forma de controle da transmissão congênita, pois caso isso
ocorra, a criança infectada poderá ser tratada e a doença pode ter seus casos diminuídos ao
longo do tempo.
PALAVRAS CHAVE: Doença de Chagas Gestantes Prevalência Controle
INTRODUÇÃO
A doença de Chagas, parasitose causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi)
atinge cerca de 8 a 11 milhões de pessoas. Nas áreas endêmicas do México, América
Central e do Sul, os principais mecanismos de transmissão ocorre por via vetorial,
transfusões sanguínea, transplante de órgãos, via oral e por transmissão congênita (Hotez e
cols 2012, CDC 2012, Bern 2012).
À medida que foram sendo esgotadas as formas de transmissão, até há pouco consideradas
corriqueiras, como a vetorial e a transmissão por transfusão sanguínea, emergiram ou, mais
exatamente, se tornaram mais aparentes aqueles mecanismos que se poderiam designar
como primários ou originais de transmissão de T. cruzi, onde a participação do homem é
acidental, ou em que a infecção humana é, ou deveria ser teoricamente, um evento
71
extraordinário. Ou seja, em certo sentido está se retornando a uma situação anterior ao
processo de domiciliação dos vetores (Silveira 2011).
No Brasil, após os controles dos bancos de sangue e do vetor, Triatoma infestans, principal
espécie de triatomíneo transmissor da doença de Chagas, outra forma de transmissão tem se
sobressaído: a transmissão congênita, onde a mãe infectada por T. cruzi transmite o parasito
ao filho durante a gestação. A transmissão congênita não é evitável. Sendo assim, a
prevenção possível é secundária, pelo diagnóstico precoce da infecção em filhos de
gestantes infectadas por T. cruzi. Em áreas em que se conheça haver o risco de transmissão
(Luquetti e cols 2011) é recomendável a introdução na rotina sorológica do pré-natal o
diagnóstico para a doença de Chagas, com o pronto tratamento dos recém-nascidos que se
comprove infectados. Nos casos de mães positivas, é também recomendável investigar a
infecção nos demais filhos, de gestações anteriores (Silveira 2011).
Em áreas não endêmicas, devido à imigração de pessoas de zonas endêmicas, a
transmissão congênita tem se tornado um problema de saúde pública, fazendo com que as
autoridades de saúde adotem medidas para diagnóstico e prevenção da transmissão
congênita da doença de Chagas (CDC 2012, Ramos e cols 2012, Flores-Chaves e cols
2011, Basile e cols2011).
Conforme o Consenso Brasileiro em Doença de Chagas (CBCD) e o Colóquio
Internacional sobre Infecção Congênita realizados na Bolívia, ambos publicados em 2005,
a ocorrência de transmissão congênita ou vertical é variável nas áreas endêmicas,
dependendo basicamente do número de gestantes infectadas por T. cruzi e de outros fatores
ainda não bem conhecidos (Dias 2011).
A confirmação do diagnóstico da transmissão congênita é feita quando T. cruzi ou
anticorpos específicos (excetuando os de origem materna) são identificados em crianças
que não tiveram contato com o vetor e que não tenham realizado transfusão sanguínea em
áreas endêmicas (Carlier e cols 2011). Segundo a Organização Pan-Americana de Saúde, o
número estimado de casos de infecção congênita por T. cruzi é superior a 15.000 por ano
(Pan American Health Organization 2006).
A prevenção da transmissão congênita é realizada por meio de exames durante o pré-natal
onde a mãe infectada é identificada. No Brasil, os exames do Teste da Mamãe contemplam
sorologias para Toxoplasmose, Rubéola, Citomegalovírus, Sífilis, HIV, Clamídia e somente
72
nos estados de Goiás e Mato Grosso do Sul, houve a inclusão dos testes sorológicos para
doença de Chagas, os quais são realizados pela APAE (Associação de Pais e Amigos dos
Excepcionais). O acompanhamento das gestantes durante o pré-natal e o monitoramento da
transmissão do parasito para seus recém-nascidos permite o diagnóstico precoce como
também, o tratamento dos infectados. Dados demonstram que quando tratados em uma fase
precoce, as chances de cura da doença de Chagas congênita são superiores a 90% (Pinto
2011).
Assim, o objetivo deste estudo foi conhecer a prevalência da doença de Chagas em
gestantes que deram à luz na Maternidade do Hospital das Clínicas de Goiânia-Goiás num
local de referência no diagnóstico, tratamento e controle da doença. A inclusão da sorologia
para doença de Chagas durante o pré-natal é portanto, um requisito importante para o
controle da transmissão dessa doença. A estruturação de centros especializados no
acompanhamento das gestantes e dos seus conceptos, se faz necessário, pois a ineficiência
deste tipo de atendimento pode estar subnotificando os casos de transmissão congênita no
Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS:
Entre o período de três anos (2010 a 2012) foram registrados 2.119 partos na central de
internação do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás em Goiânia, estado
de Goiás. Os partos das gestantes que deram à luz na maternidade deste hospital foram
classificados em quatro tipos: partos normal ou cesariano em gestação de alto risco, parto
normal ou parto cesariano.
Todo o estudo retrospectivo foi realizado por dados obtidos pela análise de prontuários das
parturientes registradas, que geraram uma lista, a qual foi fornecida pelo setor de
internação do hospital. A partir desta, a identificação do prontuário foi feita pelo número e
nome da gestante e a extração dos dados foi realizada.
Os dados sobre idade, naturalidade, número de gestações e de abortos e resultados da
sorologia para Tripanossomíase Americana obtidos dos prontuários foram anotados em
uma planilha do Excel (programa de planilha eletrônica produzida pela Microsoft)
elaborada para esse fim. O acesso aos prontuários foi autorizado pelos diretores
responsáveis do SAMIS (Serviço de Arquivo Médico e Informações de Saúde) e setor de
73
Ginecologia e Obstetrícia, além da autorização do Comitê de Ética do Hospital das
Clínicas da Universidade Federal de Goiás sob o registro 142/09.
A maioria dos exames sorológicos do pré-natal para o diagnóstico da doença de Chagas foi
realizada na APAE, utilizando duas metodologias: ELISA (Enzimaimunoensaio) e IFI
(Imunofluorescência Indireta). Na falta destes resultados, alguns exames foram realizados
no laboratório Clínico do HC, que empregaram as técnicas de ELISA e HAI
(Hemaglutinação Indireta) ou foram encaminhados ao laboratório de Chagas onde tiveram
as três técnicas convencionais realizadas (ELISA, IFI e HAI).
Caso a mãe fosse soropositiva para Chagas, os exames do recém-nascido eram solicitados
no laboratório específico desta doença e realizados de acordo com o pedido médico. Em
geral, os exames realizados no filho eram os exames direto e sorológico. Para a realização
dos exames confirmatórios foram coletados em torno de 4 ml a 20 ml de sangue em tubos à
vácuo sem anticoagulante da mãe e o volume do sangue do recém-nascido era dependente
do seu peso e distribuído em tubos pediátricos sem e com anticoagulante EDTA (ácido
etilenodiaminotetracético). As amostras coletadas foram centrifugadas por
aproximadamente 10 minutos para separação completa do soro para posteriormente
proceder à realização das técnicas sorológicas e pesquisa do parasito pelo Strout ou exame
direto com o material coletado com EDTA.
Quando realizada nos laboratórios do HC, a técnica de ELISA (Voller et al 1975) era
executada utilizando kits comerciais:Chagatest ELISA recombinante da Wiener ou Bio-
Manguinhos ( FIOCRUZ). Esta técnica consiste na detecção de anticorpos anti- T. cruzi, os
quais são revelados por meio de anticorpos anti-imunoglobulina ligados a uma enzima, que
na presença do seu substrato forma um produto colorido. O resultado da reação é definido
pela leitura da absorbância ou densidade óptica (DO) em espectrofotômetro, utilizando um
filtro com comprimento de onda indicado pelo fabricante. Os resultados são obtidos pela
divisão da absorvância pelo “cut-off”(CO), ou seja, o seu ponto de corte ( calculado de
acordo com o kit).São consideradas positivas,as amostras acima do CO, negativas, as
abaixo ou indeterminadas (zona cinza).
A Imunofluorescência Indireta (IFI) consistiu na incubação durante 30 minutos a 37°C do
soro diluído com antígeno de epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) fixados em lâminas de
microscopia convenientemente demarcada. Após lavagens sucessivas, procedeu-se a
74
incubação com conjugado IgG (FITC-Biomeriéux, França) para diagnóstico da fase
crônica, respectivamente, nas mesmas condições anteriormente descritas, seguidas de
novas lavagens em recipientes próprios com PBS. As lâminas secaram a temperatura
ambiente e foram montadas com lamínulas e glicerina tamponada. As leituras foram
realizadas em microscópio de fluorescência, cuja luz ultravioleta ativa o isotiocianato de
fluoresceína presente apenas nos parasitos que apresentaram anticorpos ligados à sua
superfície. Os soros que foram testados para IgG tiveram diluição inicial de 1:160 e
considerados positivos aqueles que apresentaram fluorescência superior a esse título,os que
deram fluorescência menor que aquela diluição,foram triados com duas diluições a partir
de 1:10.
A Hemaglutinação Indireta (HAI) basicamente consistiu na diluição progressiva dos soros
em microplacas de poliestireno de 96 poços de fundo em “V” com capacidade de 0,25ml
por poço, inicialmente de 1:160 seguida de diluição seriada por 3 poços da placa. A seguir,
adicionou-se o antígeno, constituído pelas hemácias de aves sensibilizadas (Kit –
Wiener®). Após uma hora em repouso à temperatura ambiente realizou-se a leitura da
imagem obtida em cada poço, quando foram visualizadas as imagens puntiformes
sedimentadas no fundo do poço, as reações foram consideradas negativas e positivas,
quando uma “rede” ou “tapete” de hemácias cobriram todo ou parcialmente o fundo da
placa observada. Os soros com títulos inferiores a 1:160 foram triados com duas diluições
a partir de 1:40.
Nos exames diretos para pesquisa do parasito no sangue foi utilizado a técnica de sangue
entre lâmina e lamínula ou de concentração (Strout), no qual o sangue da criança coletado
em tubos sem anticoagulante foi centrifugado primeiramente em baixa rotação, após a
retração do coágulo e em seguida o sobrenadante foi centrifugado em alta
rotação.Posteriormente o sedimento foi analisado entre lâmina e lamínula ao microscópio
óptico no aumento de 400 x para a observação de tripomastigotas.
75
RESULTADOS
Para a investigação da prevalência, do total das pacientes atendidas (n=2.119) foram
analisados 1.979 prontuários (93,39%), pois 140 não foram localizados, perfazendo uma
perda de 6,61%.
Durante a análise dos prontuários, um fato que chamou atenção foi a quantidade de
prontuários incompletos ou mal preenchidos. Nos dados sorológicos para doença de
Chagas, 14,6% dos resultados não constavam nos prontuários, ou seja, em 289/1.979
gestantes não havia qualquer registro para esse agravo. Outro fator surpreendente foi a
ausência do registro de naturalidade, sendo preenchido como “Desconhecido ou Não
Consta” (25%, 495/1.979). Tais dados são importantes para a análise epidemiológica
destas mulheres e especificamente para este estudo, salientamos a importância de se ter
prontuários bem prenchidos, pois este fato implica diretamente na condulta médica e
também compromete os estudos epidemiológicos.
Para se conhecer o perfil das mulheres estudadas, os resultados da análise dos 1.979
prontuários das gestantes que deram à luz na Maternidade no período de 2010 a 2012
foram estratificados e demonstrados conforme os dados sociodemográficos, clínicos e
sorológicos:
DADOS SOCIODEMOGRÁFICOS:
Ao analisar a idade deste grupo de mulheres, observou-se que houve uma variação entre 12
e 48 anos, com uma média de 28,62 anos. Um maior percentual para mães com idade
acima dos 29 anos foi observado (47,3 %,936/1979).aMulheres com idade entre 20 e 29
anos tiveram um percentual de 44,2% (875/1979) e 8,5% (168/1979) das mães eram
menores de 20 anos.
A naturalidade das mulheres participantes foi predominantemente da Região Centro-Oeste,
(58%) sendo que deste total, 99% nasceram no Estado de Goiás e 1% no Mato Grosso. Do
estado da Bahia havia 12% de gestantes e de Minas Gerais, 2%. O restante nasceu em
outras unidades federativas do Brasil, sendo que duas delas nasceram num país da costa
Ocidental da África: Guiné-Bissau. Aproximadamente 70% das mulheres do estado de
Goiás eram de Goiânia.
76
DADOS CLÍNICOS:
Mais da metade das mulheres (67,5%) engravidou até duas vezes e 150 mulheres (7,6%)
tiveram entre cinco e onze gestações. A maioria delas (77%, 1522/1979) relatou não ter
sofrido aborto, porém 24/1979(1,2%) delas tiveram entre três e cinco abortos.
DADOS SOROLÓGICOS:
De acordo com os dados sorológicos contidos nos prontuários a quase totalidade das
mulheres foi negativa para doença de Chagas (96,9%), porém 61 gestantes tiveram
sorologia comprovadamente positiva para Tripanossomíase Americana, perfazendo um
total de 3,1%.
Deste grupo de mulheres infectadas por T. cruzi, 51% nasceram em Goiás, 21% na Bahia,
1% no Tocantins e as outras (27%) eram naturais de outros estados brasileiros. A média de
idade foi de 33 anos, sendo a menor idade 19 anos e a maior, 42. Mais da metade delas teve
mais do que três gestações (60%). Quase 80% (1484/1979) relataram não ter sofrido aborto.
Durante os três anos estudados, nenhum caso de doença de Chagas congênito foi
diagnosticado, porém, como no Hospital das Clínicas de Goiás há um ambulatório e um
laboratório de referência para esta doença, dois casos de transmissão vertical foram
diagnosticados: um em uma criança de 42 dias e o outro em uma criança menor de 12
meses. Na primeira criança, o parasito foi encontrado diretamente pelo exame do sangue
entre lâmina e lamínula, por hemocultivo e técnicas sorológicas e na segunda, a persistência
dos anticorpos foi detectada pelas técnicas sorológicas convencionais e posteriormente pelo
encontro do parasito pelo cultivo do sangue em meio LIT. Estes dados servem para ratificar
a importância da inclusão da sorologia para Chagas nos testes realizados durante o pré-
natal, cujo diagnóstico conduzirá o clínico ao monitoramento dos filhos das infectadas por
T. cruzi.
Durante a realização deste estudo alguns fatos inusitados foram notados. Apesar de este
Hospital ter um ambulatório e um laboratório de Doença de Chagas, algumas gestantes não
realizaram a sorologia esta doença. Por algum motivo algumas delas não tiveram seus
resultados do Teste da Mamãe da APAE realizados ou mesmo não tinham levado seus
resultados de exames pré-natais e na falta deles na maioria das vezes o médico atendente
solicitou os exames que fazem parte desta rotina, porém não solicitou a sorologia para
77
doença de Chagas. Fato este que confirma a negligência médica diante desta doença.
Também chamou atenção o número de gestantes usuárias de crack e HIV positivas.
DISCUSSÃO
Prontuários são documentações legais e importantes que revelam procedimentos
realizados, exames radiológicos, laboratoriais, clínicos, ou seja, relatam o histórico do
indivíduo fornecendo informações relevantes, dentro de um centro de saúde,
portanto,quando incompletos ou mal preenchidos, não podem consolidar o que
verdadeiramente foi processado durante um atendimento dentro do hospital. Portanto, neste
estudo parte das informações aqui registradas foram prejudicadas pelo preenchimento
inadequado deste importante documento hospitalar.
A maioria das mulheres estudadas teve até duas gestações (67,5%), confirmando dados do
IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) que verificou uma tendência da
diminuição da família brasileira em que a proporção de casais sem filhos aumentou entre
2000 e 2010, passando de 14,9% para 20,2% do total.
De acordo com os dados divulgados pelo IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística), o Censo 2010 constatou que as mulheres entre 15 e 19 anos tiveram uma
participação de 17,7% na fecundidade das brasileiras em 2010, contra 18,8% dez anos
antes. A participação das mulheres de entre 20 e 24 anos na fecundidade caiu 29,3% em
2000 para 27% em 2010.
O maior número de filhos está associado a implicações sociais como assistência pré-natal
inadequada e maior chance de prática de aborto e risco de sequelas como as malformações
congênitas (Leal e cols 2004, Calvasina e cols 2007, Kac e cols 2007). O pré-natal é um
procedimento destinado a orientar a promoção da saúde e bem-estar, propiciando também
a realização de diagnósticos e tratamento de complicações que afetam as gestantes e seus
filhos, durante e após a gestação (Kilsztajn 2003). Neste estudo verificamos casos de
mulheres com até 11 gestações (2%).
As mulheres deste estudo também enfrentaram grandes dificuldades tanto financeira como
de assistência à saúde. Algumas moram em outros estados ou cidades localizadas a uma
grande distância de Goiânia, dependendo de serviços de transporte municipais, casas de
apoio ou mesmo casa de parentes ou conhecidos.
78
Para analisar a prevalência dos agravos ocorridos em mulheres durante o pré-natal foi
realizado um estudo transversal em 153.857 gestantes acompanhadas pelo Programa
Estadual de Proteção à Gestante de Mato Grosso do Sul no período de 2004 a 2007 e o
resultado de prevalência foi de 3,33% (512/153.857) para a Tripanossomíase Americana
(Botelho 2009). No Hospital das Clínicas de Goiás 1.979 mulheres fizeram parte de um
estudo semelhante, onde a prevalência encontrada foi de 3,1%.
Entre os anos de 2010 e 2011, 4.417 gestantes de cinco departamentos endêmicos da
Colômbia fizeram parte de um estudo transversal, onde testes sorológicos de ELISA e
Imunofluorescência para T. cruzi foram realizados. A prevalência encontrada foi de 2,70%
(119/4.417), prevalência abaixo do valor encontrado neste estudo(3.1%). Vale ressaltar que
durante este mesmo período(2010 a 2011) a prevalência encontrada neste estudo foi de
3,57%.
Estudos epidemiológicos realizados no México, países da América Central e do Sul
demonstram altos índices de soroprevalência em grávidas, elevando a frequência da
transmissão congênita. Inquérito realizado em três cidades do México revelou
soroprevalência de Chagas em 7,32% de grávidas e transmissão congênita de 4,08% (4/98)
em Oaxaca, 9,1% (3/33) e em Jalisco 1,5% (1/65) (Cardoso e cols 2012). No Chile, um
inquérito realizado na província de Choapa indicou que 3,7% das mulheres que tiveram
filho no período de 2005 a 2008 tinham doença de Chagas e 2,5% de suas crianças estavam
infectadas (Apt 2010). Apesar de esse estudo ter sido realizado na Maternidade do Hospital
das Clínicas de Goiás e que nenhum caso foi diagnosticado, foram encontrados dois casos
de transmissão congênita desta doença nesse serviço público de saúde.
O acesso à assistência pré-natal é considerado uma condição sine qua non para que a
gestação transcorra sem problemas tanto para a mãe quanto para o filho ou, pelo menos,
que haja um acompanhamento médico para as situações de risco. Alguns estudos mostram
que a maioria das mortes por causas maternas são evitáveis, se ações que objetivam a
qualidade da assistência perinatal e o acesso aos serviços de saúde da gestante forem
tomadas (Almeida & Barros 2005).
A transmissão congênita de T.cruzi é considerada uma infecção aguda que necessita de
acompanhamento e tratamento da criança com anti-parasitários. Crianças não tratadas
79
podem evoluir para a fase crônica da doença, apresentando as mesmas possibilidades de
desenvolverem alterações cardíacas e digestivas que compõem essa fase (Carlier 2011).
Num estudo prospectivo realizado na Espanha durante um período de cinco anos (2006 a
2010) foi estudada a soroprevalência da doença de Chagas em imigrantes gestantes latino-
americanas infectadas por T. cruzi. Num total de 3.839 grávidas, a prevalência para
Tripanossomíase americana foi de 3,96 %. A taxa de transmissão congênita foi de 2,6%.
Neste estudo houve dois casos de trasmissão congênita, quantitativo acima do esperado, já
que no último estudo de Rassi e cols realizado em Goiânia no ano de 2004, 278 filhos de
145 mães com a doença de Chagas crônica , verificou-se apenas duas veiculações pela
modalidade citada (2/278 = 0,7%).
O Consenso Brasileiro em doença de Chagas recomenda o monitoramento das gestantes
positivas para Chagas e seus respectivos filhos, porém, verifica-se um negligenciamento
nesse sentido, pelo fato de casos congênitos ainda serem diagnosticados tardiamente em
crianças ou até mesmo em adultos.
CONCLUSÕES
Com a melhora nos controles vetorial e dos bancos de sangue, a transmissão congênita da
doença de Chagas vem assumindo papel epidemiológico importante. A inclusão da
sorologia para doença de Chagas nos exames pré-natais, assim como ocorre em alguns
estados da região centro-oeste, poderia diminuir os índices dessa doença. Vê-se nesse
estudo a importância do acompanhamento das gestantes infectadas, pois um diagnóstico e
o tratamento precoce das crianças são condições fundamentais para uma possível
interrupção da doença por esta via de transmissão. A criação de centros de diagnóstico
capacitados para tal acompanhamento, além de auxiliarem no diagnóstico, poderiam
retratar o real quadro desta forma de transmissão. A falta de conhecimento, por alguns
médicos e desta inclusão na rotina do pré-natal pode estar subnotificações os casos de
transmissão congênita da doença de Chagas no Brasil.
80
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83
5.3-Manuscrito 3
INTEGRAÇÃO DE MINICÍRCULOS DE KDNA DE Trypanosoma cruzi DE
CÉLULAS SANGUÍNEAS DE MENORES DE UM ANO DE IDADE NASCIDOS
DE CHAGÁSICAS CRÔNICAS EM GOIÂNIA-GO.
Autores: Liliane da Rocha Siriano, Ana Maria de Castro, Mariana Machado Hecht, Nadjar
Nitz e Antonio Teixeira.
RESUMO:
Relatos sobre a possibilidade de dano ao genoma do hospedeiro por meio de transferência
horizontal ou vertical de DNA do parasito Trypanosoma cruzi instigou a verificar a
integração de minicírculos de kDNA deste protozoário em crianças menores de um ano de
idade nascidos de mães infectadas cronicamente por T. cruzi em uma Maternidade de
Goiânia. Quarenta crianças tiveram seus sangues coletados e através de técnicas
sorológicas, parasitológicas e moleculares pode-se avaliar a possibilidade da transmissão
congênita, de transferência horizontal ou vertical gênica, após a integração de sequências
de minicírculos presentes no DNA de T. cruzi que pudessem ser transmitidas da mãe para o
filho. A idade das mães variou de 19 a 42 anos, com uma média igual a 31,4 anos. A
maioria delas estudou até o ensino fundamental, tiveram até três gestações, não sofreram
aborto, tinham como provedor da renda familiar, o esposo e declararam ter renda familiar
entre um e dois salários mínimos. Apenas duas crianças tiveram diagnóstico sorológico,
parasitológico (hemocultura) e molecular (PCR) positivos para doença de Chagas. Foram
detectadas a presença de minicírculos de kDNA no genoma de 92,1% das mães e 72,5%
dos filhos, respectivamente. As PCRs de nDNA também foram positivas em 92,1% das
mães e em 12,5% das crianças. Foram identificados 47% dos eventos de integração de
minicírculo de kDNA de T. cruzi no locus RP13-444K19 do cromossomo X e LINE 1 em
56% dos clones sequenciados.
PALAVRAS CHAVE: Doença de Chagas – Mãe- kDNA- filho- Integração.
84
INTRODUÇÃO
A doença de Chagas ocorre principalmente nos países da América Latina onde, durante a
década de 80, mais de 20 milhões de pessoas foram infectadas. Desde então países latino-
americanos têm feito enormes esforços para controlar a infecção (OPAS 2007).
Desde 1990, uma série de iniciativas internacionais, com base no controle do vetor, o
rastreio sistemático de doadores de sangue em todos os países endêmicos, e detecção e
tratamento de transmissão congênita foram lançados para o controle e eliminação da doença
de Chagas. Estas estratégias conduziram a uma redução significativa no número de pessoas
infectadas em todo o mundo. De acordo com a informação de 21 países onde a doença é
endêmica, o número de pessoas infectadas hoje é estimada em 7.694.500, a maioria delas
está na fase crônica da doença (WHO 2007). No Brasil, de 2006 a 2010 foram notificados
799 casos de doença de Chagas aguda,com índice de letalidade de 2,25%. No estágio
crônico, onde está a maioria dos chagásicos, 30 a 40% dos casos evoluem para formas
graves de cardiopatia e/ou megaformações digestivas, o que provoca grande impacto nos
sistemas de saúde pública (SVS/MS 2011).
O protozoário causal desta doença é o parasito Trypanosoma cruzi.Transmitida por um
inseto hematófago, o barbeiro, essa doença também pode ser transmistida pela via oral,
transfusional, congênita ou vertical, por transplante de órgãos e ainda por acidentes
laboratoriais (Prata 2001).
A variabilidade de T. cruzi foi melhor explicada por sua caracterização molecular (Macedo
e cols 2004), e pode ser explicado pela constituição genética de populações de T. cruzi, o
qual, em várias linhagens tem evoluído independentemente ao longo do tempo (Tibayrenc e
Ayala 1988).
Teixeira (2007) relatou sobre a possibilidade de dano ao genoma do hospedeiro por meio de
transferência horizontal de DNA do parasito, que pode ser um fator importante na diferente
evolução da doença de Chagas em alguns indivíduos.
O kDNA compreende 15% a 30% do DNA total celular e difere do DNA nuclear, na sua
densidade flutuante, relação de base, e do grau de renaturação (De Souza 2008 e 2009).
Diferentes de quaisquer outros DNAs conhecidos, o kDNA de tripanosomatídeos é
composto por moléculas circulares que são interligados para formar uma única rede. Dois
tipos de anéis de DNA estão presentes no cinetoplasto: minicírculos e maxicírculos.
85
Existem aproximadamente 15.000 minicírculos de T. cruzi, com uma média de 1,4 kb de
tamanho, e algumas dezenas de maxicírculos , variando de 20 a 40 kb de comprimento
(Sturm 2009).
A descoberta que os minicírculos do kDNA em T. cruzi continham segmentos repetidos
(conservados) e abundantes fez com que estas moléculas pudessem se constituir em alvos
ideais para o desenvolvimento de processos moleculares de detecção e tipagem deste
parasito (Degreve e cols 1988 )
O objetivo deste estudo foi avaliar a integração de minicírculos de kDNA em crianças até
um ano de idade, filhos de mães cronicamente infectadas por T. cruzi. Ele é de grande
importância, pois até o presente momento todos os estudos de integração de minicírculos
envolveram animais (coelhos, camundongos, aves) e/ou material humano (células
sanguíneas ou teciduais) de adultos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Para o estudo da integração dos minicírculos de kDNA, a população de pacientes foi
constituída por mulheres infectadas por T. cruzi e seus respectivos filhos que nasceram na
Maternidade do Hospital das Clínicas de Goiás ou menores de um ano de idade cujas mães
eram pacientes do Ambulatório de Chagas do hospital. Duas mães tiveram gestações
gemelares, perfazendo um total de 38 mulheres participantes e 40 crianças.
ASPECTOS ÉTICOS
As mulheres envolvidas neste estudo foram esclarecidas quanto aos objetivos do mesmo e
dele participaram somente aquelas que concordaram e assinaram o termo de consentimento
livre e esclarecido (TCLE). Todas as mães das crianças receberam folha impressa (segunda
via do TCLE) contendo todas as informações a respeito da pesquisa que foram explicadas
na forma escrita e oral. Elas também responderam a um questionário que envolvia
perguntas relacionadas ao número de gestações e abortos, doença prévia, escolaridade,
renda familiar e naturalidade. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética do Hospital
das Clínicas da UFG, Goiânia-GO sob o registro 142/2009.
86
CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Ao realizarem exames para diagnóstico da doença de Chagas no Laboratório de Chagas do
Hospital das Clínicas, duas mães foram excluídas por terem resultados sorológicos
negativos. Aquelas mães, cuja sorologia foi confirmadamente positiva para Chagas fizeram
parte do projeto.
COLETA DO MATERIAL
Após aplicação do questionário, foram realizadas as coletas sanguíneas das mulheres e seus
respectivos filhos. Para a realização dos exames sorológicos e parasitológicos foram
coletados de 1-3 ml de sangue total de cada criança e aproximadamente 18 mL da mãe. Os
sangues coletados foram distribuídos em tubos à vácuo que continham como
anticoagulante, o EDTA (Ácido Etilenodiaminotetracético) e também em tubos sem
anticoagulante contendo gel separador . O material coletado com anticoagulante foi
utilizado para realização das técnicas de hemocultura e PCR. O soro advindo do sangue
sem anticoagulante foi utilizado para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas.
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Para confirmar a infecção da mãe e a possível infecção no recém-nascido por T. cruzi,
foram utilizadas três técnicas sorologicas: Imunofluorescência Indireta - IFI (Camargo
1966), Hemaglutinação Indireta-HAI (Camargo e cols 1973) e ensaio Imunoenzimático -
Enzyme Linked Immunosorbent Assay – ELISA (Voller e cols 1975) que permitem a
detecção de anticorpos específicos no sangue.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA – IFI
Consistiu na incubação durante 30 min a 37°C do soro diluído com antígeno de
epimastigotas de T. cruzi fixados em lâminas de microscopia convenientemente
demarcada. Após lavagens sucessivas, procedeu-se a incubação com conjugado (FITC-
Biomeriéux®, França) nas mesmas condições anteriormente descritas, seguidas de novas
lavagens em recipientes próprios com tampão PBS. As lâminas secaram a temperatura
ambiente e foram montadas com glicerina tamponada e lamínulas. As leituras foram
realizadas em microscópio de fluorescência, cuja luz ultravioleta ativa o isotiocianato de
87
fluoresceína presente apenas nos parasitos que apresentaram anticorpos ligados à sua
superfície. Os soros das mães e dos seus respectivos filhos foram realizados numa diluição
inicial de 1:160 para verificação do título final, simultaneamente, para afastar a
possibilidade de transmissão vertical. Caso a reação tivesse como resultado um título
menor que 1:160, uma nova diluição à partir de 1:10 era realizada.
TESTE IMUNOENZIMÁTICO – ELISA
As formas epimastigotas de T. cruzi (antígeno bruto) foram adsorvidas em microplacas de
microtitulação, onde foram adicionados 0,1ml dos soros em diluição única de 1:100. Após
a incubação de 30 minutos em estufa úmida, fez-se a lavagem da placa na lavadora de
placas de ELISA com tampão apropriado. Adicionou-se o conjugado composto por
anticorpos anti-IgG humana conjugada a enzima peroxidase (Bio-Manguinhos). Após 30
minutos de incubação a 37°C em estufa úmida e a placa foi novamente levada à lavadora.
Adicionou-se o substrato (H2O2) e o cromógeno (TMB), substância incolor que adquire
coloração sob ação do substrato. Essa reação foi interrompida em até 30 min com adição
de ácido sulfúrico. A seguir, procedeu-se à leitura da intensidade da cor obtida em cada
poço da microplaca com auxílio de espectrofotômetro (Tecam-Espectra Classic®, USA)
que, indicou a reatividade de cada cavidade em densidade óptica (DO) e foram
confirmadas como positivas todas as amostras que possuíram DO maior que o ponto de
corte. O valor do ponto de corte (Cut-off) foi determinado por placa. Este valor foi
calculado a partir da média de controles negativos e positivos de baixa reatividade. O
índice de referência foi calculado pela divisão da DO pelo cut-off.
HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA – HAI
Consistiu basicamente na diluição progressiva dos soros em microplacas de poliestireno de
96 poços de fundo em “U” com capacidade de 0,25ml por poço, inicialmente, a diluição foi
de 1:160 seguida de diluição seriada por aproximadamente 2 poços da placa . A seguir,
adicionou-se o antígeno, constituído pelas hemácias de aves sensibilizadas (Kit –
Wiener®). Após uma hora em repouso à temperatura ambiente realizou-se a leitura da
imagem obtida em cada poço, quando visualizadas imagens puntiformes sedimentadas no
88
fundo do poço, as reações foram consideradas negativas e positivas, quando uma “rede” ou
“tapete” de hemácias cobriram todo ou parcialmente o fundo da placa observada.
DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
Para o diagnóstico parasitológico das crianças foi realizada a pesquisa direta do parasito e a
hemocultura. Para ambos (mães e filhos) foram realizadas Reações de Polimerização em
Cadeia – PCR, cuja finalidade foi a amplificação do DNA nuclear (nDNA) e/ou
mitocondrial (kDNA) e a investigação da transferência de minicírculos de kDNA de T.
cruzi para o genoma humano.
PESQUISA DIRETA DO PARASITO
Para realizar a pesquisa direta, utilizou-se aproximadamente 10µl de sangue total das
crianças entre lâmina e lamínula, levou-se ao microscópio óptico e foram observados
aproximadamente 100 campos com objetiva de 40x. A técnica de concentração, STROUT,
também foi utilizada.
HEMOCULTURA
A hemocultura foi realizada somente no sangue das crianças. A coleta de sangue nos
recém-nascidos foi proporcional ao peso do mesmo, variando de 1 a 3 ml e dos menores de
um ano de idade foi coletado volumes que variaram de 3 a 10 ml aproximadamente. Para a
coleta de sangue venoso das crianças foram utilizadas seringas, cujos volumes variaram de
3 a 10 ml e posteriormente foram distribuídos em tubos vacutainer contendo EDTA,
semeado em meio LIT e distribuído em tubos plásticos de 15 ml (Falcon, USA), volume a
volume (v/v). Os tubos foram mantidos em estufa BOD (General Electric-FANEN-LTDA)
a 28°C e homogeneizados duas vezes por semana para aeração. Alíquotas de 10µl da
suspensão de cada tubo serão colocadas entre lâmina e lamínula e examinadas em
microscópio com aumento de 400 x aos 30, 60, 90, 120 e 150 dias após a semeadura.
89
EXTRAÇÃO DE DNA DE CÉLULAS SANGUÍNEAS
Após a coleta, as amostras que continham EDTA foram estocadas a 4°C até o momento da
extração, que foi realizada segundo o protocolo do kit Biopur. Os reagentes permitem a lise
e preservação do DNA à temperatura ambiente.
REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR)
O DNA nuclear (nDNA) de T. cruzi foi identificado com um conjunto de primers (TCZ
1/2) que amplificou sequências microssatélites, altamente repetitivas no genoma do T. cruzi
(MOSER e cols 1989). Os primers TCZ1/2 geraram fragmentos de 188pb e seus catâmeros.
Com a confirmação da especificidade dos produtos de PCR, realizou-se a hibridização com
sondas de TCZ. A ausência do nDNA foi considerada como indicativo da inexistência da
infecção.
Com o objetivo de amplificar o DNA nuclear (nDNA) e o DNA mitocondrial (kDNA) de
T. cruzi no DNA molde extraído das células nucleadas do sangue dos pacientes, foram
utilizados dois pares de primers diferentes. Os pares TCZ1/2 (Moser e cols 1989) que
amplificam regiões do nDNA do parasito e os primers S36/S35 (Sturm e cols 1989) que
amplificam sequências dos minicírculos de kDNA. A Tabela 1 contém as sequências de
cada par de primers. Os primers TCZ1/2 amplificam uma região de microssatélite, com
repetições in tandem, que corresponde a 9% do DNA total de T. cruzi (Virreira e cols
2003).
Esses primers são específicos de T. cruzi, não amplificando o DNA de outros
tripanossomatídeos ou de humano. As amplificações foram realizadas em triplicatas e
seguiram as seguintes condições, previamente padronizadas: 200 ng de DNA humano
foram utilizados como molde e os reagentes do kit de PCR da INVITROGEN. Foram
incluídos em todas as reações os devidos controles, negativo e positivo, que consistiram,
respectivamente, de DNA de indivíduo não infectado e de 250 pg de DNA de T. cruzi
Berenice mais um DNA de indivíduo infectado, além do branco da reação. O programa de
amplificação constou de uma desnaturação inicial a 95oC (5min) e de 30 ciclos com
desnaturação a 95oC (30 segundos), anelamento a 68
oC (1min) e extensão a 72
oC (1min)
seguida de extensão final de 5 minutos em um termociclador Todas as reações de PCR
foram realizadas no termociclador BIO-RAD MyCyclerTM
.
90
ANÁLISE ELETROFORÉTICA DOS PRODUTOS DE PCR
Os produtos das amplificações foram submetidos à corrida eletroforética em gel de agarose
(Invitrogen), em 1% submerso em tampão TAE 1X, contendo 0,5 g/mL de brometo de
etídio. O fracionamento do DNA foi visualizado através da fluorescência emitida pelo
brometo de etídio associado ao DNA, quando exposto à radiação ultravioleta de onda curta
(Sambrook e cols 1989 com modificações).
AMPLIFICAÇÃO DAS REGIÕES FLANQUEADORAS DO kDNA DE T. cruzi
INTEGRADO NO GENOMA HUMANO
A técnica de TAIL PCR (Thermal Asymmetric Interlaced – PCR) foi modificada na
tentativa de se obter as regiões do genoma humano que flanqueiam o kDNA integrado.
Inicialmente descrita por Liu & Whittier (1995), esse procedimento alterna ciclos de baixa
estringência e alta estringência e utiliza primers degenerados combinados com primers
específicos. Dessa forma, enquanto as altas temperaturas favorecem o anelamento apenas
dos primers específicos, as baixas temperaturas permitem o anelamento de ambos.
Na psTAIL PCR (primer specific Thermal Asymetric Interlaced – PCR), deduziu-se
primers de regiões conservadas de L1 de diversos organismos, visando substituir os
primers degenerados de Liu & Whittier, 1995(Hecht e cols 2010). Assim, seguiu-se a
primeira amplificação: utilizando-se 200 ng de DNA genômico em uma reação contendo
1X de tampão de reação (20 mM Tris HCl pH=8,4, 50 mM KCl), 2,5 mM de MgCl2, 0,4
mM do primer de kDNA (S34 ou S67), 0,2 mM de dNTPs, 2 unidades de Taq Platinum
(Invitrogen), juntamente com 0,04 M de cada um dos primers de L1 usados neste estudo .
Para a segunda amplificação, foram utilizados 2 µL da diluição de 1:40 da psTAIL PCR 1,
em uma reação contendo 1X de tampão de reação (20 mM Tris HCl pH=8,4, 50 mM KCl),
2,5 mM de MgCl2, 0,04 M do primer de kDNA mais interno (S35 ou S35 reverso), 0,2
mM de dNTPs, 2 unidades de Taq Platinum (Invitrogen), mantendo-se os mesmos primers
de L1 utilizados na primeira amplificação (0,04 M).
Os produtos da psTAIL PCR 2 foram diluídos 1:10 e 2 µL da diluição foram utilizados
como molde para a psTAIL PCR 3. A reação continha 1X de tampão de reação (20 mM
Tris HCl pH 8,4, 50 mM KCl), 2,5 mM de MgCl2, 0,04 M do primer de kDNA mais
91
interno (S67 reverso ou S36), 0,2 mM de dNTPs, 2 unidades de Taq Platinum (Invitrogen)
junto com os mesmos primers de L1.
CLONAGEM, TRANSFORMAÇÃO EM Echerichia Coli COMPETENTE E
EXTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL
Os produtos da terceira psTAIL PCR foram clonados no vetor comercial pGEM T-Easy
(PROMEGA) conforme instruções do fabricante. Esse vetor caracteriza-se pela presença
de uma timina em ambas as extremidades 3’. Assim, a ligação dos produtos se faz possível,
pois a Taq polimerase utilizada adiciona uma adenina na extremidade 3’, permitindo o
pareamento.
Para o procedimento de transformação, faz-se necessária a preparação de células
competentes, a qual seguiu o protocolo de cloreto de rubídio descrito no Protocols and
Application Guide da PROMEGA (1996). As células utilizadas foram XL10-Gold
(STRATAGENE).
Após a transformação, foi feita a seleção dos clones que continham o inserto através da
diferença de coloração das colônias. As colônias brancas eram formadas quando o inserto
era adicionado ao plasmídio, havendo, assim, o rompimento do gene da β-galactosidase
que, consequentemente, tornou-se incapaz de processar o substrato X-gal. Quando o
inserto não se insere, o gene da β-galactosidase codifica a enzima que age sobre X-gal,
formando a coloração azul das colônias. Além disso, o vetor pGEM T-Easy também possui
o gene de resistência a ampicilina, o que garante que apenas as bactérias transformantes
consigam crescer em meio contendo este antibiótico.
O DNA plasmidial foi extraído utilizando-se o kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN), de
acordo com as instruções do fabricante. A análise do tamanho dos insertos foi feita em gel
de agarose 1%, na presença de marcador molecular, após digestão do DNA plasmidial com
a enzima de restrição EcoRI (12 h, 37ºC ).
SOUTHERN BLOT
Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% e,
posteriormente, utilizou-se o método de transferência alcalina (Sambrook & Russel, 2001)
para transferir o DNA para uma membrana de nylon positivamente carregada (Hybond-XL
92
– Amersham Pharmacia Biotech). Resumidamente, desnatura-se o DNA em solução
alcalina (NAOH 0,4 M) por 20 min e, então, faz-se a transferência, por capilaridade, do
DNA presente no gel para a membrana, utilizando a mesma solução alcalina. Após 8 h de
transferência, as membranas foram secas em estufas a 37 ºC para a fixação do DNA.
TRANSFERÊNCIA DE COLÔNIAS DE BACTÉRIAS TRANSFORMANTES PARA
MEMBRANA DE NYLON
Os clones de bactérias transformantes foram repicados para uma membrana de nylon em
contato com meio LB sólido contendo 100 µg/mL de ampicilina. Após incubação a 37ºC
por 12 h, as membranas serão retiradas e embebidas em papel de filtro contendo solução de
lise (SDS 10%) por 10 min, seguida de solução de desnaturação (0,4 M NaOH) por 10
min, e, por último, SSC 2X por 10 min. As membranas serão secas em estufas a 37ºC para
a fixação do DNA.
HIBRIDIZAÇÃO
As membranas com o DNA mobilizado foram bloqueadas por 12 h a 65ºC com solução de
pré-hibridização (PEG 800 10%, SSPE 1,5%, SDS 7% e 100 µg/mL de DNA de esperma
de salmão). Ao término desse período, as sondas radiomarcadas foram desnaturadas a
100°C por 15 min e adicionadas à solução de pré-hibridização, onde as membranas
permaneceram por mais 12 h a 65°C. As lavagens das membranas foram realizadas com
graus crescentes de estringência, visando a remoção da sonda que não se ligou
adequadamente à membrana.
Foram feitas duas lavagens com SSC-2X/0.1% SDS, a 65°C, por 15 min, seguidas de
outras duas com SSC-0.1X/0.1% SDS, a 65°C, por 15 min. As membranas, ainda úmidas,
foram revestidas em filme plástico de PVC em um cassete metálico com filme sensível aos
raios X (KODAK T-MAT) e utilizou-se o contador geiger para verificar os sinais emitidos
pelas radiações ionizantes e em função disso fazer um cálculo aproximado do tempo de
incubação à -80°C. O tempo de exposição variou de acordo com o DNA transferido para a
membrana. Assim, aquelas contendo os produtos de PCR ou as colônias transformantes
ficaram expostas entre 12 h e sete dias (Figura 13). Procedeu-se a revelação dos filmes.
93
Em algumas ocasiões as membranas foram dehibridadas com três sucessivas lavagens em
água destilada por pelo menos 15 minutos a 65 C e em seguida envolvidas em filme
plástico de PVC e guardadas a -20 C até o momento da hibridização.
REVELAÇÃO DOS FILMES
As revelações das películas autorradiográficas foram realizadas em câmara escura por
imersão do filme em solução reveladora Kodak por um minuto, parando a reação com água
e fixando os filmes por imersão em solução fixadora por cinco minutos. Em seguida, os
filmes foram lavados extensivamente em água corrente e secados à temperatura ambiente.
SEQUENCIAMENTO DOS CLONES E ANÁLISE EM BANCO DE DADOS
O DNA extraído dos clones selecionados foi enviado para o sequenciamento automático
comercial (Genomic, SP), o qual utilizou os primers T7 e Sp6 para a amplificação das
sequências. Para a análise das sequências de DNA em banco de dados, foram utilizados o
programa DNAMAN e posteriormente o algoritmo BLASTn (www.ncbi.nlm.nih.gov) ou
GIRI (Genetic Information Research Institute).
RESULTADOS:
Para se conhecer o perfil das mulheres participantes deste estudo, foram analisados os
dados obtidos pelo questionário como idade, naturalidade, número de gestações e abortos,
escolaridade, renda familiar e doença prévia deste grupo:
IDADE: A idade das mães variou de 19 a 42 anos, com uma média igual a 31,4 anos.
NATURALIDADE: Mais da metade das mulheres era natural da região Nordeste (23/38-
60%), 10/38 da região Centro-oeste (26%), 4/38 da região Norte (10%) e somente uma, era
da região Sudeste (4%). Todas as mulheres que nasceram na região nordeste eram do
estado da Bahia, da região Centro-oeste, nove eram de Goiás (90%) e somente uma era do
estado do Mato Grosso (10%), da região Norte todas eram do estado do Tocantins e da
região sudeste, sua única participante era do estado de Minas Gerais.
94
NÚMERO DE GESTAÇÕES: A maior parte das mulheres teve até três gestações (30/38-
79%), seis delas tiveram entre quatro e seis gestações (16%) e duas mulheres relataram
terem ficado grávidas por oito vezes (5%).
NÚMERO DE ABORTOS: Apenas 16% das mulheres relataram ter sofrido aborto.
Destas, 11% tiveram um aborto e 5%, dois. Do total destas mulheres, 91% delas não
realizaram curetagem, porém 6% realizaram uma e 3% passaram por este procedimento
médico.
NÚMERO DE CONSULTAS DURANTE O PRÉ-NATAL: Entre as 40 mulheres
estudadas, apenas uma informou que não foi em todas as consultas de pré-natal.
ESCOLARIDADE: Entre elas, 63% estudaram até o ensino fundamental, sendo que 40%
não terminaram a primeira etapa de estudos. Frequentaram a escola durante todo o ensino
médio, 20% e 14% desistiram antes do tempo escolar regulamentar. Somente 3%
conseguiram entrar na faculdade, porém, não chegaram a concluir o curso.
RENDA FAMILIAR: Quase todas tinham como provedor da renda familiar, o esposo
(71%), 14% eram elas próprias que sustentavam a família, 11% dividiam as despesas com
o companheiro e 4% declararam ser sustentadas pelo ex-marido. Quanto a renda familiar,
80% declararam ter renda entre um e dois salários mínimos, 14%, ganhavam entre 3 e 4
salários e 6% viviam com menos de 1 salário ao mês.
DOENÇA PRÉVIA: Ao serem questionadas da existência de alguma doença prévia, 17%
declararam tê-las. Doenças como anemia, toxoplasmose, citomegalovirose, rubéola, câncer
de mama e rinite alérgica foram citadas.
Após a exposição das características das mulheres estudadas, seguem os resultados das
análises sorológicas, parasitológicas e moleculares.
RESULTADOS SOROLÓGICOS:
Todas as análises sorológicas aqui apresentadas foram interpretadas a partir dos resultados
das técnicas de ELISA, IFI e HAI, sendo que foram consideradas positivas aquelas em que
houve concordância de resultados em pelo menos duas de três técnicas utilizadas. Todas as
95
mães foram sorologicamente positivas para doença de Chagas. Das 40 crianças estudadas,
14 eram recém-nascidos (RNs). Num primeiro momento todos os RNs foram
sorologicamente positivos para doença de Chagas, porém 12 RNs tiveram seus exames
repetidos após os 9 meses,os quais foram negativos após esse período;os dois o últimos
participantes, ainda não tiveram o seu segundo material coletado por não terem atingido
ainda a idade de 9 meses quando se espera a negativação dos exames sorológicos. Das 26
crianças restantes, 24 foram diagnosticadas como negativas e outras duas, uma de 42 dias e
outra com menos de um ano de idade tiveram sorologia positiva para IgG e IgM para
doença de Chagas, caracterizando assim, a transmissão congênita (Tabela 2). Isto
representa uma positividade de 5% desta forma de transmissão neste grupo estudado.
Tabela 1. Resultados Sorológicos das Crianças (recém-nascidos + crianças até um ano de idade)
FILHOS (Total=40) Resultados Sorológicos
ELISA (IgG)
IFI (IgG)
HAI (IgG)
IFI (IgM)
14 Recém-nascidos Positivo Positivo Positivo Negativo
24 Menores de um ano
de idade Negativo Negativo Negativo Negativo
2 Menores de um ano
de idade Positivo Positivo Positivo Positivo
OBS: Dos 14 recém-nascidos, até o presente momento, 12 realizaram a segunda coleta e obtiveram
resultados negativos.
RESULTADOS PARASITOLÓGICOS:
EXAME DIRETO: O exame direto foi positivo apenas na criança de 42 dias de vida onde
foi constatada uma alta parasitemia, devido ao fácil encontro do parasito entre lâmina e
lamínula.
HEMOCULTURA: Já na cultura de sangue, as duas crianças com diagnóstico sorológico
positivo, também foram positivas por esta técnica após 30 dias de incubação. Todas as
outras crianças tiveram a hemocultura negativa após 180 dias de incubação.
96
RESULTADOS MOLECULARES:
RESULTADOS DE nDNA E DE kDNA DAS MÃES E SUAS PROLES
Das 38 mães e seus respectivos filhos foi obtido um total de 78 amostras contendo DNA. A
partir dos resultados obtidos de amplificações por PCR de kDNA e nDNA do sangue
coletado em mães e filhos foram detectadas a presença de minicírculos de kDNA no
genoma de 92,1% e 72,5% respectivamente. As PCRs de nDNA foram positivas em quase
a totalidade das mães (92,1%) e em 12,5% das crianças(5/40), sendo que duas delas
equivalem as crianças cujas sorologias foram positivas para Tripanossomíase Americana.
Somente em duas crianças todos os parâmetros parasitológicos, sorológicos e moleculares
foram concordantes caracterizando assim infecção congênita, nas outras duas crianças
somente os resultados moleculares inferiram a infecção, sendo necessário o
acompanhamento destas ao longo dos anos.
Em dez crianças (25,0%) e em três mães (7,9%) não se observou amplificação de material
nuclear ou do cinetoplasto, portanto, as duas PCRs foram negativas.
Tabela 2. Resultados Moleculares dos Filhos e das Mães.
FILHOS
(N=40)
MÃES
(N=38)
kDNA TCZ kDNA TCZ
Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo
29
(72,5%)
11
(27,5%)
5
(12,5%)
35
(87,5%)
35
(92,1%)
3
(7,9%)
35
(92,1%)
3
(7,9%)
CONFIRMAÇÃO DOS RESULTADOS DE PCRs DE kDNA E TCZ
Para confirmação da presença ou não dos DNAs mitocondrial (kDNA) e nuclear (TCZ)
30% dos filhos foram convocados para uma nova coleta. Com uma média de 10 meses
após a primeira coleta, todos os procedimentos desde a extração até as reações de
amplificações foram realizadas conforme foi descrito em materiais e métodos.
Das 40 crianças participantes, 12 realizaram duas coletas e todas tiveram seus resultados
reproduzidos (TCZ e kDNA positivos), não havendo nenhuma discrepância entre as
primeiras e as segundas PCRs, os dois últimos recém-nascidos participantes ainda não
97
tivere sua segunda coleta realizada por ter idade inferior a nove meses de idade. Não foi
possível a realização de uma segunda coleta nas 26 crianças restantes.
ANÁLISE DA INTEGRAÇÃO DE MINICÍRCULOS DE KDNA NO GENOMA
HUMANO
Para o sequenciamento das amostras, os produtos da terceira psTAIL PCR que
apresentavam sinais mais intensos no Southern Blot foram os escolhidos. Dos 145 clones
analisados, 46 apresentavam apenas DNA humano, 22 apenas o kDNA e 5 não tiveram
sequenciamento com qualidade satisfatória. Foram obtidos 72 sequências de clones
(originários de oito pares) os quais continham kDNA e regiões flanqueadoras do genoma
hospedeiro totalizando 50% de rendimento.
As análises destas sequências usando o algoritmo BLASTn e GIRI (Genetic Information
Research Institute) revelaram identidades e E-value com valores altamente significativos,
tanto para as regiões de kDNA, quanto para as sequências provenientes do DNA humano.
Dessa maneira, foi possível identificar os loci preferenciais de inserção do kDNA no
genoma das células germinativas. As análises das sequências dos 73 clones identificaram
regiões de minicírculos de kDNA integrados no DNA humano.
Os resultados dos sequenciamentos indicaram que houve integração de kDNA nos
genomas humanos.
CARACTERÍSTICAS DAS SEQUÊNCIAS FLANQUEADORAS DO
HOSPEDEIRO HUMANO
A análise de distribuição dos eventos de integração do kDNA de T. cruzi nos diversos
cromossomos, verificou-se que as regiões que flanqueavam o kDNA integrado em sítios
específicos do genoma humano, ocorreu, predominantemente, em retrotransposons LINE,
em 56,2% dos clones sequenciados (Figura 1). Foi verificado que sequências de
minicírculos de kDNA ligaram-se a outros elementos transponíveis como ERV e MER.
Interessantemente, esses elementos sempre estavam próximos de retrotransposons LINE,
diretamente ligados ou situados numa distância nunca maior que 5 kb. Em quatro clones (6,
8, 31 e 61), o kDNA foi visto associado ao gene de receptor olfatório OR1-17, num total de
50% dos genes identificados (Figura 2). Em 19 dos 73 clones o locus onde o kDNA se
integrou não pode ser caracterizado devido a ausência de informações sobre a região em
98
banco de dados. Não obstante, esses locis apresentavam E-value e identidades significativas
com cromossomos humanos.
Em 19,2% (14/73) dos clones foram encontrados a presença de dois sítios diferentes de
integração, sendo que em algumas análises este fato ocorreu em mais de um cromossomo.
A maioria desses rearranjos (13/14) envolveu a presença de LINEs nos sítios de integração,
perfazendo um total de 92,9%.
Esses achados sugerem a possibilidade de rearranjo das sequências após a integração do
kDNA.
A)
S34
1 ACACCAACCC CAATCGAACC TCCGGTCTAC AGCTCCCATC TCCTTATATT ACACCAACCC
61 CAATCGGACC CCACCTCCCG TAACACACCC CATTTTCGGG CATATAATGT ACGGGGGAGA
121 TGCAAGAATT TCCACCCCAA AAGTAGACCC CAACCCCGAC ACTCCCCGGT CTACAGCTCC
181 ACCTCCTTAT ATTACACCAA CCCCAATCGA ACCACCATTC AGGAGTTTAT CTTCTCCGCT
241 TTCCCTTATT CCTGGTTTAG TCTTGGGAAA GTGTATGTGT ATCAGAGCCT GNNANTGGTC
301 TATTCAGAGA CTCAACTTCC TCCTGGTTTA GTCTTGGGGA G
LINE-5
B)
FM207403.1 Homo sapiens genomic DNA containing Trypanosoma cruzi
kinetoplast minicircle and ORFc574 DNA, patient 1430_82, clone 574
Length=478
AL732374.14 Human DNA sequence from clone RP13-444K19 on chromosome X
Contains a mitochondrial ribosomal protein S18C (MRPS18C) pseudogene,
the 3' end of the PHF8 gene for PHD finger protein 8 and a CpG island,
complete sequence.
Length=224187
FIGURA 1: Integração de sequência de minicírculo de kDNA de Trypanosoma cruzi no genoma do paciente
número 927RN. A) Note que o DNA do parasito (azul) está ligado ao DNA humano (verde) no cromossomo
X. Em amarelo, destaca-se a região compartilhada entre o minicírculo de kDNA e o DNA humano. O kDNA
em azul escuro representa região conservada e, em azul claro, a região variável. Os primers utilizados na
psTAIL-PCR estão em azul escuro e em vermelho o line-5, ambos sublinhados. B) Resultado obtido pela
análise BLASTn. O alinhamento com sequências depositadas em banco de dados está presente no Anexo II.
99
A) 1 ACACCAACCC CAATCGAAAC CCCAAATTTT CGGGCATATA ATGTACGGGT GAGATGCATG
61 AATTTCCACC CCAAAAGTTG ACCTCAACCC CGACACTCTC CGGTCTACAG CTCCCATCTC
121 CTTATATTAC ACCAACCCCA ATCGGACCCC ACCTCCCGTA ACACACCCCA TTTTCGGGCA
181 TATAATGTAC GGGTGAGATG CAAGAATTTC CACCCCAAAA GTTGACCCCA ACCCCGACAC
241 TCCCCGGTCT ACAGCTCCAT CTCCTTATAT TGCACCAACC CCAATCGAAC CACCATTCAG
301 GAGTTTATCT TCTCCGCTTT CCCTTATTCC TGGTTTAGTC TTGGGAGGAA CCCCCCT
B) AL513205.8 Human DNA sequence from clone RP11-432E18 on chromosome 1 Contains the OR6K1P olfactory receptor, family 6, subfamily K,member 1 pseudogene, the
OR6K2 gene for olfactory receptor,family 6, subfamily K, member 2, the OR6K3 gene
for olfactory receptor, family 6, subfamily K, member 3, the OR6K4P olfactory
receptor, family 6, subfamily K, member 4 pseudogene,the OR6K5P olfactory
receptor, family 6, subfamily K, member 5 pseudogene, the OR6K6 gene for
olfactory receptor, family 6, subfamily K, member 6, the OR6N1 gene for olfactory
receptor,family 6, subfamily N, member 1, the OR6N2 gene for olfactory receptor,
family 6, subfamily N, member 2, the OR2AQ1P olfactory receptor, family 2,
subfamily AQ, member 1 pseudogene,the OR10AA1P olfactory receptor, family 10,
subfamily AA, member 1 pseudogene and the MNDA gene for myeloid cell nuclear
differentiation antigen, complete sequence.
Length=180999
FM207196.1 Homo sapiens genomic DNA containing Trypanosoma cruzi
kinetoplast minicircle DNA, patient 1491_34, clone 167E
Length=421
FIGURA 2: Integração de sequência de minicírculo de kDNA de Trypanosoma cruzi no receptor olfatório
OR1-17 no genoma do paciente número 922RN. A) Note que o DNA do parasito (azul) está ligado ao DNA
humano (verde) no cromossomo X. Em amarelo, destaca-se a região compartilhada entre o minicírculo de
kDNA e o DNA humano. O kDNA em azul escuro representa região conservada e, em azul claro, a região
variável. Os primers utilizados na psTAIL-PCR estão em azul escuro e em vermelho o line-5, ambos
sublinhados. B) Resultado obtido pela análise BLASTn. O alinhamento com sequências depositadas em banco
de dados está presente no Anexo II.
Conclui-se, portanto que os resultados dos sequenciamentos indicaram que houve
integração de kDNA nos genomas humanos.
Ao analisar a distribuição das integrações verificou-se que em 50% dos pares (mãe e filho)
houve envolvimento dos mesmos cromossomos.Tais distribuições das integrações dos
LINEs (em porcentagem) e em quais cromossomos elas ocorreram estão mostrados na
tabela 3.
100
Tabela 3. Distribuição das integrações dos LINEs nos cromossomos das mães e filhos
PARES CROMOSSOMO ELEMENTO DE
INTEGRAÇÃO- LINE
Nº 1 Mãe 12, X 50%
Filho 1, 2 0%
Nº 2 Mãe 1, 11, 20, X 75%
Filho 1, 5, 12, 16, X 20%
Nº 3 Mãe 8 100%
Filho 1, 3, 15, X 100%
Nº 4 Mãe 2 0%
Filho 1, 9 0%
Nº 5 Mãe 14,17,20,X 0%
Filho 1, 4, 12, X 100%
Nº 6 Mãe 2, 5, 7, 8, X 60%
Filho 5, 11,16,X 20%
Nº 7 Mãe 18 100%
Filho 2, 4, 16, 21 0%
Nº 8 Mãe X 83%
Filho 6, X 50%
OBS: Em vermelho estão destacados os cromossomos que foram comuns aos pares.
DISCUSSÃO
A maioria das gestantes infectadas deste estudo é natural de estados endêmicos para
doença de Chagas. Estados como Bahia e Goiás também foram predominante no estudo de
gestantes infectadas por T. cruzi de Siriano e cols 2011 onde 56% destas eram provenientes
da Bahia, 36% de Goiás e 8% de outros estados. A idade média no grupo das gestantes
desse mesmo estudo foi de 29,2 anos (de 17 a 44 anos) valores semelhantes a este estudo:
31,45 anos.
Rassi e cols (2004) em estudo retrospectivo envolvendo 145 mulheres chagásicas,
predominantemente de Goiás e Minas Gerais, revelaram história de aborto espontâneo em
21 (14,5%) e de transmissão maternal de T. cruzi em duas (1,4%) portadoras de cardiopatia
crônica. A história de aborto espontâneo também foi registrada em 123 (31,5%) das 390
mulheres soropositivas num estudo de soroprevalência no estado do Piauí em 2002. Mais
da metade das gestantes infectadas aqui estudadas relatou não terem sofrido nenhum
aborto, mas verifica-se um pequeno aumento no número de abortos em mulheres com
idades mais avançadas.
101
Num estudo realizado em Salvador no estado da Bahia envolvendo gestantes durante os
anos de 2009 e 2010, verificou-se que de 376 mulheres, 54% tinham o ensino fundamental
completo ou ensino médio incompleto, 37,9% haviam concluído o ensino médio e 7% a
alfabetização ou tinham o ensino fundamental incompleto e apenas 0,8% ingressaram no
ensino superior (Coelho e cols 2012). Dentre as mulheres desta pesquisa, 63% estudaram
até o ensino fundamental, sendo que 40% não terminaram a primeira etapa de estudos.
Frequentaram a escola durante todo o ensino médio, 20% e 14% desistiram antes do tempo
escolar regulamentar. Somente 3% conseguiram entrar na faculdade, porém, não chegaram
a concluir o curso.
Uma pesquisa realizada no estado do Ceará (Moura 2010) constatou que a renda da maior
parte das famílias das gestantes estudadas (30/40- 75%) era de um a dois salários mínimos
dados que corroboram com este estudo, cujo índice foi de 80%.
A maioria das crianças participantes desse projeto teve sorologia negativa para doença de
Chagas (95%). Houve dois casos agudos de transmissão materna confirmada pelos
diagnósticos sorológicos, parasitológicos e moleculares, totalizando 5% de positividade.
Todas as crianças que apresentam anticorpo IgG positivo ou indeterminado entre seis e dez
meses de idade, deve-se repetir a sorologia em sangue venoso. Quando negativas, estes
dados estão de acordo com a maioria dos trabalhos que mostram que o IgG materno
transferido ao filho durante a gestação, desaparece do soro da criança não infectada entre
seis e doze meses de idade ( Proceeding of the Internacional Colloquium on Congenital
Trypanosoma cruzi Infection 2002, Russomando e cols 2005, Moya e cols 2005). No
Paraguai, autores encontraram 7% das crianças com anticorpos maternos após seis meses
de idade (Russomando e cols 2005).
As doenças emergentes e reemergentes necessitam de diagnósticos mais rápidos, sensíveis
e específicos, e como o diagnóstico convencional apresenta certas falhas, com resultados
inconclusivos e discordantes, o Ministério da Saúde do Brasil, considerando a eficácia de
técnicas moleculares como a PCR, adotou como um dos métodos para confirmação da
doença de Chagas (Brasil 2005).
A literatura mostra que a técnica de PCR apresenta elevadas sensibilidade e especificidade
na detecção de material genético de T. cruzi como observado em outros ensaios
102
convencionais, parasitológico e sorológico (Ávila e cols 1993, Britto e cols 2001, Gomes e
cols 1999, 2000, Junqueira e cols 1996, Portela-Lindoso & Shikanai-Yasuda 2003).
A constatação de integração do kDNA no genoma hospedeiro, subsequentes às infecções
naturais por T. cruzi,sugere que se trata de um evento frequente, superando as expectativas
citadas na literatura (Simonson e cols 2005, Choi & Kim 2007).
Tiveram PCRs positivas para nDNA 92,1% das mães, utilizando primers TCZ1 e TCZ2
neste trabalho. Apesar da intensa plasticidade genética observada entre as diferentes cepas
e isolados de T. cruzi, os pares TCZ1 e TCZ2 apresentam elevada especificidade em
detectar DNA de todas as cepas e clones do parasito. Este dado foi observado por Virreira
e cols (2003), que mostraram resultados positivos de amplificação por PCR em todas as
cepas de T. cruzi testadas, e ausência de amplificação quando foi utilizado DNA de outras
espécies de tripanossomatídeos. Com a quase totalidade de amostras maternas que
amplificaram o DNA nuclear e de grande parte daquela que foram positivas para kDNA a
possibilidade de transferência gênica pode ser estabelecida, ora pela horizontal(TGH) e
vertical (TGV) . Onde, no primeiro caso, a troca de material genético ocorre entre seres
sem parentesco, afetando unicamente o indivíduo que adquiriu o DNA. O segundo está
relacionado com a passagem das sequências integradas para a progênie, passando a ter um
efeito sobre a população (Hetch 2010). Esses dois tipos de herança têm propiciado
diferenciação e crescimento prodigioso de espécies, além de aumento incessante da
diversidade gênica (Teixeira 2011).
Hecht (2010) documentou a transferência horizontal de sequências de minicírculos de
kDNA do T. cruzi em sítios específicos de quase todos cromossomos de células somáticas,
em todos pacientes portadores da doença de Chagas que foram examinados. Neste trabalho
demonstrou que sequências de minicírculos de kDNA integradas no genoma de células
germinativas também integraram-se em quase todos os cromossomos e que podem ser
herdadas pela progênie.
A integração do kDNA ocorreu na maioria dos cromossomos, predominantemente (56,2%
dos casos) em elementos LINE, o que pode ser prontamente explicada pela ampla
distribuição desses elementos retrotransponíveis em todo o genoma humano (Song &
Boissinot 2007). A observação de que a integração do kDNA ocorreu frequentemente no
cromossomo X é consistente com diversos relatos na literatura, que mostram uma maior
103
abundância de elementos L1 neste cromossomo (Graham & Boissinot 2006, Song Grahan
& Boissinot 2007). De interesse, mutações ocorridas em elementos L1 do cromossomo X
têm sido associadas à cardiomiopatia dilatada e outras doenças cuja patogênese passou a
ter uma base genética conhecida (Yoshida e cols 1998).
Já foram mapeados genes responsáveis por mais de 30 formas de distrofias, cuja herança
pode ser autossômica dominante, autossômica recessiva e ligada ao cromossomo X. As
distrofias musculares devem possuir cinco características essenciais, como: miopatia,
definida por critérios clínicos, histológicos e eletromiográficos (EMG), sem sinais de
desenervação ou déficits sensitivos; todos os sintomas são efeitos da fraqueza dos músculos
(Rowland 2002, Marques 2005).
Os LINES-1 são mais abundantes nos cromossomos sexuais do que nos autossômicos. Em
humanos verificou-se que 89% dos 100 kb do cromossomo X são constituídos por LINE-1
(Graham e Boissinot 2006). Foram identificados 53,7% dos eventos de integração de
minicírculo de kDNA de T. cruzi no locus RP13-444K19 do cromossomo X. Outros
achados foram de 71% (Hecht 2010) e 72,5% (Hecht 2011). A observação indica que este
é um sítio preferencial de integração do kDNA em LINE-1 humano no cromossomo X.
CONCLUSÕES
Apesar dos avanços tecnológicos, até o momento a doença de Chagas tem tido alguns
embates vencidos por um ser de proporções microscópicas, T. cruzi.Tida por uma doença
que atinge a camada dos menos favorecidos, podemos ver esse fato comprovado neste
estudo,onde o perfil de um grupo de gestantes foi avaliado num serviço de Ginecologia e
Obstetrícia de um Hospital Universitário de referência nesta doença. A constatação da
transferência horizontal e vertical de DNA exógeno e sua incorporação no genoma das
mães e dos seus filhos foi demonstrada. As crianças comprovadamente positivas estão
sendo tratadas e acompanhadas, porém ainda não se sabe qual o significado dessas
integrações demonstradas nos filhos destas infectadas ao longo do tempo.
104
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AGRADECIMENTOS: Laboratório de Chagas e Maternidade do Hospital das Clínicas
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(LMPDC).
109
6 – CONCLUSÕES
A prevalência de mulheres infectadas por T. cruzi entre os anos de 2010 a 2012 no
Hospital das Clínicas de Goiás foi de 3,1%.
Em duas crianças a infecção congênita foi confirmada por técnicas parasitológicas,
sorológicas e moleculares. E em outras duas crianças, somente as técnicas
moleculares detectaram a presença do DNA de T. cruzi.
As PCRs de nDNA foram positivas em 92,1% das mães e em 12,5% das crianças.
Foram detectadas a presença de minicírculos de kDNA no genoma de 76,3% das
mães e 72,5% dos filhos, respectivamente.
Foram identificados 53,7% dos eventos de integração de minicírculo de kDNA de
T. cruzi no locus RP13-444K19 do cromossomo X.
Os retroelementos LINE-1 estiveram presentes em 56,2% dos clones sequenciados.
110
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com a melhora no controle vetorial e dos bancos de sangue, a transmissão
congênita vem assumindo papel importante na epidemiologia da doença de Chagas. Para
tanto, a investigação sorológica desta infecção em mulheres durante a fase procriativa e
consequentemente na gestação é de suma importância para o controle da transmissão
vertical, já que a avaliação da mãe pode significar a conduta clínica em relação ao filho e
como consequência, um tratamento eficaz quando o diagnóstico da infecção por T. cruzi é
realizado precocemente. A inclusão da sorologia para doença de Chagas nos exames pré-
natais, assim como ocorre em alguns estados da centro-oeste, poderia significar a
diminuição dos índices dessa doença.
Estaria havendo negligência da doença de Chagas durante o pré-natal e
consequentemente um número subestimado de casos congênitos?
A possibilidade de detecção da transmissão vertical e/ou congênita da
Tripanossomíase Americana pelas técnicas de biologia molecular é muito importante tanto
no diagnóstico quanto no acompanhamento clínico das crianças devido ao advento da
integração dos minicírculos de kDNA, pois não se sabe até o presente momento o real
significado destas integrações, sendo necessário um acompanhamento a longo prazo destas
crianças. É sabido da existência de pacientes sorologicamente negativos com alterações
clínicas características da doença de Chagas crônica, seriam eles positivos nas técnicas de
biologia molecular?
As alterações cromossômicas envolveram prioritariamente o cromossomo X, o qual
está relacionado a alterações musculares, tais modificações poderiam estar relacionadas às
alterações musculares presentes na doença de Chagas?
A infecção por T. cruzi, continua sendo prioridade nas pesquisas, pois muitas
perguntas ainda necessitam de resposta.
111
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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130
ANEXOS
ANEXO I
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidada para participar, como voluntária, em uma pesquisa. Meu
nome é Liliane da Rocha Siriano, sou a biomédica responsável sob orientação da Profª Dr.
Ana Maria de Castro, de desenvolver esta pesquisa, sendo a área de atuação a Biomedicina.
Após ler com atenção este documento e ser esclarecida sobre as informações a seguir e caso
aceite fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma
delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de dúvidas sobre a pesquisa, você
poderá entrar em contato com, a pesquisadora responsável, Liliane da Rocha Siriano, nos
telefones: (62) 3565.4719 e 96213281. Em caso de dúvidas sobre os seus direitos como
participantes nesta pesquisa, você poderá entrar em contato com o Comitê de Ética em
Pesquisa, do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás –UFG, nos
telefones:(62) 3269-8338 ou 3269-8426.
INFORMAÇÕES IMPORTANTES SOBRE A PESQUISA
O título da pesquisa é “Detecção do kdna do Trypanosoma cruzi no sangue de
recém-nascidos de mães na fase crônica da doença de Chagas e Caracterização
Molecular dos estoques Isolados em Goiânia - Goiás”. Este trabalho será desenvolvido
por uma equipe técnica, à qual eu pertenço sob a coordenação da Profª. Dra. Ana Maria de
Castro. O material biológico (sangue) será coletado por mim, no ambulatório de
Ginecologia e obstetrícia do Hospital das Clínicas /UFG e será levado para o Laboratório
de Biologia, Imunologia e Fisiologia de Protozoários de Interesse Humano - Setor de
Parasitologia DMIPP/IPTSP/UFG, onde serão armazenados e realizados os testes
propostos neste projeto. A paciente responderá a um questionário onde os dados serão
utilizados para análise epidemiológica do T. cruzi.
131
Esta pesquisa tem o objetivo: Pesquisar a presença do kDNA do T. cruzi no
sangue de recém-nascidos de mães soropositivas (IgG) para Tripanossomíase Americana.
Além do estudo biológico e molecular dos estoques isolados dos recém-nascidos
infectados congenitamente. Para tal serão coletadas na grávida 1 amostra de sangue venoso
heparinizado (10 mL da amostra) e do recém-nascido será coletado 1-4 mL, de acordo com
seu peso.
Os prováveis riscos podem ocorrer pela compressão inadequada do local da punção
venosa após a retirada da agulha pelo (a) participante com posterior formação de inchaço,
pela saída de sangue ou ainda lipotímia (queda de pressão), fatos consequentes da coleta
sanguínea.
A opção de participação é totalmente voluntária, caso não queira, não sofrerá
nenhuma restrição aos exames que forem solicitados. Não haverá nenhum tipo de pagamento
ou gratificação financeira pela sua participação. Todos os dados coletados serão utilizados
para esta pesquisa e armazenados para estudos futuros, mas sempre com objetivo científico e
respeitando todos os seus direitos. Sua participação será importante, pois poderá contribuir
para o conhecimento da influência do parasito T. cruzi no desenvolvimento patológico da
doença de Chagas, assim como possibilitar ao clínico uma melhor avaliação clínica
minimizando as possíveis consequências da infecção destes parasitos em seus filhos.
132
CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO DA PESSOA NESTA PESQUISA
Eu, _______________________________________________________,
RG______________CPF ____________, abaixo assinado, concordo em participar do estudo
“Detecção do kDNA do Trypanosoma cruzi no sangue de recém-nascidos de mães na
fase crônica da doença de Chagas e Caracterização Molecular dos estoques Isolados em
Goiânia – Goiás, como sujeito. Fui devidamente informado e esclarecido pela Biomédica
Liliane da Rocha Siriano sobre a pesquisa, os procedimentos nela envolvidos, assim como os
possíveis riscos e benefícios decorrentes de minha participação. Foi-me garantido que posso
retirar meu consentimento a qualquer momento, sem que isto leve a qualquer penalidade ou
interrupção de meu acompanhamento/assistência/tratamento. Serão garantidos o sigilo e
privacidade de meus dados pessoais.
Goiânia, / / 20 .
__________________________________________________________
Nome e Assinatura do sujeito ou responsável:
Assinatura Dactiloscópica:
Nome e Assinatura do Pesquisador Responsável:
Presenciamos a solicitação de consentimento, esclarecimentos sobre a pesquisa e
aceite do sujeito em participar.
Testemunhas (não ligadas à equipe de pesquisadores):
Nome: _________________________________________________
Nome: _________________________________________________
Observações complementares
Os responsáveis por deste projeto se comprometem a não divulgação e/ou
identificação de dados pessoais dos indivíduos participantes.
133
QUESTIONÁRIO N°____ DATA: ____ /____ /_____.
Nome:________________________________________________________
Detecção do kdna do Trypanosoma cruzi no sangue de recém-nascidos de mães na fase crônica da doença de Chagas e Caracterização Molecular dos estoques Isolados em Goiânia - Goiás
Secção 1 – Características sócio - demográfica das mulheres
1.1 Onde você nasceu?
______________________________________________________
1.2 Mora em Goiânia (1) sim (2) não
Há quanto tempo?__________________________________________
1.3 Você morou em outra cidade antes?
Qual?____________________________________
1.4 Data de nascimento
______________________________________________________
1.5 Qual a sua raça: branca, negra, parda, amarela, indígena, outras?
(1) branca (2) negra (3) parda (4) amarela (5) indígena (6) outras:
1.6 Qual a sua escolaridade?
__________________________________________________
Secção 2 – Classificação de status socioeconômico
Agora gostaria de fazer-lhe algumas perguntas sobre sua casa e família.
2.1. Quem é o chefe da família na sua casa?
(1) a própria entrevistada (2) outra pessoa.
Quem? _________________________________
2.2 Renda Familiar
Salário Mínimo: (1) 1-2 (2) 3-4 (3) 5-6 (4) ≥7
134
Secção 3 – Características reprodutivas das mulheres
3.1. Você fez consulta do pré-natal em todas as gestações? ( ) sim ( ) não
3.2. Já teve alguma doença antes da gestação?
(1) sim (2) não
Qual?___________________________________________________
3.3. Quantas vezes ficou grávida?
(1) 1 (2) 2 (3) 3 (4) 4 (5) 5 (6) ≥6
3.4 Qual o número de filhos?
__________________________________________________
3.5 Quantos partos teve?
(1) 0 (2) 1 (3) 2 (4) 3 (5) 4 (6) ≥5
3.6. Quantos abortos já teve?
(1) 1 (2) 2 (3) 3 (4) ≥4
3.7 Já fez exames sorológicos nas gestações anteriores? (Pré-natal)
(1) sim (2) não
3.8 Você se lembra do resultado dos exames que fez? (Qual o resultado)
_______________________________________________________________________
Secção 4 – Fatores de risco associado à Doença de Chagas
4.1 Já teve algum tipo de aborto causado por parasitos?
(1) sim. Qual?________________ (2) não
4.2 Alguém da família já foi diagnosticado com doença de Chagas?
(1) sim (2) não
4.3 Você sabe qual órgão da pessoa foi acometido?
(1) coração (2) intestino (3) outros (4) não sabe
OBS: Exame Laboratorial – Dados obtidos na análise dos prontuários
5.1 No teste sorológico qual foi o(s) agente(s) infeccioso(s) que deu positivo?
(1) Toxoplasma gondii ( ) IgG Avidez ___________( ) IgM Avidez
(2) Doença de Chagas (3) Sífilis
(4) Rubéola (5) Herpes Simples
(6) Citomegalovírus
135
ANEXO II
Figura 1
AL732374.14 Human DNA sequence from clone RP13-444K19 on chromosome X
Contains a mitochondrial ribosomal protein S18C (MRPS18C) pseudogene, the
3' end of the PHF8 gene for PHD finger protein 8 and a CpG island,
complete sequence
Length=224187
Score = 127 bits (140), Expect = 5e-26
Identities = 84/94 (89%), Gaps = 0/94 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 245 CTTATTCCTGGTTTAGTCTTGGGAAAGTGTATGTGTATCAGAGCCTGNNANTGGTCTATT
304 ||| ||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||| | |||||||||
Sbjct 77460 CTTCTTCCTCGTTTAGTCTTGGGAGGGTGTATGTGTATCAGAGCCTGTTATTGGTCTATT
77401
Query 305 CAGAGACTCAACTTCCTCCTGGTTTAGTCTTGGG 338
|||||| |||||||| || |||||||||||||||
Sbjct 77400 CAGAGATTCAACTTCTTCGTGGTTTAGTCTTGGG 77367
FM207403.1 Homo sapiens genomic DNA containing Trypanosoma cruzi
kinetoplast minicircle and ORFc574 DNA, patient 1430_82, clone 574
Length=478
Score = 428 bits (474), Expect = 1e-116
Identities = 253/261 (97%), Gaps = 2/261 (1%)
Strand=Plus/Plus
Query 10 CCCCGACACTCTCCGGTCTACAGCTCCCATCTCCTTATATTACACCAACCCCAATCGGAC
69 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||
Sbjct 217 CCCCGACACTCTCCGGTCTACAGCTCCCATCTCCTTATATTACACCAACCCCAATCGAAC
276
Query 70 CCCACCTCCCGTAA-CACACCCCATTTTCGGGCATATAATGTACGGGGGAGATGCAAGAA
128 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
Sbjct 277 CCCACCTCCCGTAAACACACCCCATTTTCGGGCATATAATGTACGGGGGAGATGCATGAA
336
Query 129 TTTCCACCCCAAAAGTAGACCCCAACCCCGACACTCCCCGGTCTACAGCTCC-ACCTCCT
187 |||||||||||||||| |||| |||||||||||||| ||||||||||||||| | |||||
Sbjct 337 TTTCCACCCCAAAAGTTGACCTCAACCCCGACACTCTCCGGTCTACAGCTCCTATCTCCT
396
Query 188 TATATTACACCAACCCCAATCGAACCACCATTCAGGAGTTTATCTTCTCCGCTTTCCCTT
247 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 397 TATATTACACCAACCCCAATCGAACCACCATTCAGGAGTTTATCTTCTCCGCTTTCCCTT
456
Query 248 ATTCCTGGTTTAGTCTTGGGA 268
|||||||||||||||||||||
Sbjct 457 ATTCCTGGTTTAGTCTTGGGA 477
136
Figura 2
FM207403.1 Homo sapiens genomic DNA containing Trypanosoma cruzi
kinetoplast minicircle and ORFc574 DNA, patient 1430_82, clone 574
Length=478
Score = 428 bits (474), Expect = 1e-116
Identities = 253/261 (97%), Gaps = 2/261 (1%)
Strand=Plus/Plus
Query 10 CCCCGACACTCTCCGGTCTACAGCTCCCATCTCCTTATATTACACCAACCCCAATCGGAC
69 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||
Sbjct 217 CCCCGACACTCTCCGGTCTACAGCTCCCATCTCCTTATATTACACCAACCCCAATCGAAC
276
Query 70 CCCACCTCCCGTAA-CACACCCCATTTTCGGGCATATAATGTACGGGGGAGATGCAAGAA
128 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
Sbjct 277 CCCACCTCCCGTAAACACACCCCATTTTCGGGCATATAATGTACGGGGGAGATGCATGAA
336
Query 129 TTTCCACCCCAAAAGTAGACCCCAACCCCGACACTCCCCGGTCTACAGCTCC-ACCTCCT
187 |||||||||||||||| |||| |||||||||||||| ||||||||||||||| | |||||
Sbjct 337 TTTCCACCCCAAAAGTTGACCTCAACCCCGACACTCTCCGGTCTACAGCTCCTATCTCCT
396
Query 188 TATATTACACCAACCCCAATCGAACCACCATTCAGGAGTTTATCTTCTCCGCTTTCCCTT
247 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 397 TATATTACACCAACCCCAATCGAACCACCATTCAGGAGTTTATCTTCTCCGCTTTCCCTT
456
Query 248 ATTCCTGGTTTAGTCTTGGGA 268
|||||||||||||||||||||
Sbjct 457 ATTCCTGGTTTAGTCTTGGGA 477
AL513205.8 Human DNA sequence from clone RP11-432E18 on chromosome 1 Contains
the OR6K1P olfactory receptor, family 6, subfamily K,member 1 pseudogene, the
OR6K2 gene for olfactory receptor,family 6, subfamily K, member 2, the OR6K3 gene
for olfactory receptor, family 6, subfamily K, member 3, the OR6K4P olfactory
receptor, family 6, subfamily K, member 4 pseudogene,the OR6K5P olfactory
receptor, family 6, subfamily K, member 5 pseudogene, the OR6K6 gene for
olfactory receptor, family 6, subfamily K, member 6, the OR6N1 gene for olfactory
receptor,family 6, subfamily N, member 1, the OR6N2 gene for olfactory receptor,
family 6, subfamily N, member 2, the OR2AQ1P olfactory receptor, family 2,
subfamily AQ, member 1 pseudogene,the OR10AA1P olfactory receptor, family 10,
subfamily AA, member 1 pseudogene and the MNDA gene for myeloid cell nuclear
differentiation antigen, complete sequence.
Length=180999
Score = 104 bits (114), Expect = 6e-19
Identities = 62/64 (97%), Gaps = 1/64 (2%)
Strand=Plus/Minus
137
Query 275 CCCCAATCGAACCACCATTCAGGAGTTTATCTTCTCCGCTTTCCCTTATTCCT-GGTTTA 333
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| |
Sbjct 6330 CCCCAATCGAACCACCATTCAGGAGTTTATCTTCTCCGCTTTCCCTTATTCCTGGGTTAA 6271
Query 334 GTCT 337
||||
Sbjct 6270 GTCT 6267
FM207196.1 Homo sapiens genomic DNA containing Trypanosoma cruzi
kinetoplast minicircle DNA, patient 1491_34, clone 167E
Length=421
Score = 226 bits (250), Expect = 7e-56
Identities = 142/150 (95%), Gaps = 6/150 (4%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 GAACCCCCCTCCCAAAACCCCATTTTCGGGCATATAATGTACGGGTGAGATGCA
54 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct145 GAACCCCCCTCCCAAAACCCCATTTTCGGGCATATAATGTACGGGGGAGATGCA 204
Query 55 TGAATTTCCACCCCAAAAGTTGACCTCAACCCCGACACTCTCCGGTCTACAGCTCCCATC
114 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 205 TGAATTTCCACCCCAAAAGTTGACCTCAACCCCGACACTCTCCGGTCTACAGCTCCCATC
264
Query 115 TCCTTATATTACACCAACCCCAATCGGACC 144
|||||||||||||||||||||||||| |||
Sbjct 265 TCCTTATATTACACCAACCCCAATCGAACC 294
Score = 217 bits (240), Expect = 4e-53
Identities = 135/142 (95%), Gaps = 2/142 (1%)
Strand=Plus/Plus
Query 148 CCTCCCGTAACACACCCCATTTTCGGGCATATAATGTACGGGTGAGATGCAAGAATTTC
206 ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
Sbjct 8 CCTCCCGTAACACACCCCATTTTCGGGCATATAATGTACGGGTGAGATGCATGAATTTC
67
Query 207 CACCCCAAAAGTTGACCCCAACCCCGACACTCCCCGGTCTACAGCTCCATCTCCTTATA
265 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 68 CACCCCAAAAGTTGACCCCAACCCCGACACTCCCCGGTCTACAGCTCCATCTCCTTATA
127
Query 266 TTGCACCAACCCCAATCGAACC 287
|| |||||||||||||||||||
Sbjct 128 TTACACCAACCCCAATCGAACC 149