universidade federal da bahia ufba programa de pÓs-graduaÇÃo em zootecnia · 2020-03-03 ·...

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA

IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES LEP, GH, IGF1, CAPN1

E CAST E ASSOCIAÇÃO COM CARACTERÍSTICAS DE QUALIDADE DE

CARNE E CARCAÇA EM OVINOS SANTA INÊS

ARIANA NASCIMENTO MEIRA

SALVADOR-BA

ABRIL-2016

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA





Zootecnista

SALVADOR-BA

ABRIL-2016

iii





Tese apresentada ao Programa de pós-graduação em

Zootecnia, da Universidade Federal da Bahia, como

requisito parcial para obtenção do título de Doutor

em Zootecnia.

Área de Concentração: Produção Animal

Orientador: Prof. Dr. Luís Fernando Batista Pinto

Coorientador: Prof. Dr. Luiz Lehmann Coutinho

SALVADOR-BA

ABRIL-2016

vi

“Sua tarefa é descobrir o seu trabalho e,

então, com todo o coração, dedicar-se a ele.”

Buda

Dedico este trabalho a Deus e

aos meus familiares que sempre

me deram apoio em todos os

momentos da minha vida.

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pelas oportunidades que vem me proporcionando. A meus pais

Marilza e Marceliano por me orientarem e fazerem de mim o que sou hoje. Ao meu irmão

Mateus pelo apoio de todos estes anos. Aos meus queridos avós Ismênia e Batista por

todo apoio e carinho.

Agradeço aos grandes amigos que fiz durante estes quatro anos de doutorado, só

gratidão é pouco pelo que vocês representam para mim. Obrigada por todos os momentos

maravilhosos que passamos juntos. Por todos os momentos felizes e por que não os

tristes?

Gostaria de agradecer em especial a meu querido grupo Renew +30 e a Tassinha,

vocês foram meu maior presente neste doutorado, a minha força para levar o último ano,

obrigada por toda paciência, por aguentarem minhas lamentações e por me ajustarem nos

momentos mais difíceis de minha vida. Obrigada por me ajudarem a sorri quando estava

triste e a seguir em frente quando empacava, rsrs.

Agradeço a minha família baiana que fui achar em São Paulo, Tia Rita, Tio Luiz

e Ariane por terem me acolhido e me amarem como filha. Saibam que tenho um carinho

enorme por vocês e os amo demais.

Agradeço ao apoio canino de SNP, Théo, Nina e Rubéns que me deram muitas

lambeijocas nos momentos que sentia falta de minhas filhas.

Agradeço a meu grupo de pesquisa pelo apoio em especial a Carla, Geraldo,

Alessandro Caio e Adriana, amigos que pretendo levar para a vida inteira.

Agradeço ao grupo do laboratório de biotecnologia animal da ESALQ por todo o

apoio e estrutura durante todo o doutorado. Em especial ao professor Coutinho por ter

aceito me co-orientar e ter aberto um espaço em seu grupo de pesquisa durante o período

que passei lá.

Agradeço ao professor Gerson e sua esposa Luciana pelo apoio.

Agradeço ao programa de pôs graduação em zootecnia pela oportunidade e as

agências de fomento FAPESB e CNPq pelo apoio financeiro.

E por fim, mas tão especial quanto os outros, quero oferecer meus sinceros

agradecimentos ao meu orientador Luís Fernando, pelo apoio durante este tempo.

Obrigada a todos que torcem pelo meu sucesso.

Obrigada de coração, que Deus abençoe a todos.

viii

LISTA DE SIGLAS

A – Adenina

AOL – área de olho de lombo

ARCO – Associação Brasileira de Criadores de Ovinos

C – Citosina

CAPN1 – Gene da calpaína 1

CAST - Gene da calpastatina

Embrapa – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

G – Guanina

GH – Gene do hormônio do crescimento

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IGF1 - Gene do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1

KB – Quilobase

LEP – Gene da leptina

MAS – seleção assistida por marcadores

pb – pares de bases

PCR - Reação em cadeia da polimerase

PROMOVI – Programa de Melhoramento Genético em Ovinos

SNP – polimorfismo de base única

T – Timina

ix

LISTA DE FIGURAS

Identificação de polimorfismos nos genes LEP, GH, IGF1, CAPN1 e CAST e associação com

características de qualidade de carne e carcaça em ovinos Santa Inês

Página

Figura 1. Ação e secreção da Leptina em ratos............................................................. 20

x

LISTA DE TABELAS

Capitulo 1 - Polimorfismos no gene LEP e associações com atributos da carne e da

carcaça de ovinos Santa Inês

Paginas

Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas ....... 39

Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no

gene LEP ...................................................................................................

44

Tabela 3. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-

padrão (EP) nos testes de associação com polimorfismos no gene

LEP.............................................................................................................

47

Capítulo 2 - Polimorfismos nos genes GH e IGF1 e associações com atributos da carne

e da carcaça de ovinos Santa Inês

Paginas

Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas ....... 62

Tabela 2. Primers Forward (F) e reverse (R) e ciclos de amplificação das regiões

investigadas em cada gene ......................................................................

64


gene IGF1 ...............................................................................................

68

Tabela 4. Frequências genotípica e alélica dos marcadores identificados no gene

GH ........................................................................................................... 72


padrão (EP) nos testes de associação ......................................................

75

Capítulo 3 - Polimorfismo nos genes CAPN1 e CAST e associações com atributos da

carne e da carcaça de ovinos Santa Inês

Paginas

Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas..... 92


gene CAST ..............................................................................................

97


gene CAPN1 ...........................................................................................

105


padrão (EP) nos testes de associação com polimorfismos no gene CAST

.....................................................................................................

112


padrão (EP) nos testes de associação com polimorfismos no gene

CAPN1 ...................................................................................................

117

xi

SUMÁRIO

Identificação de polimorfismos nos genes LEP, GH, IGF1, CAPN1 e CAST e

associação com características de qualidade de carne e carcaça em ovinos Santa Inês

......................................................................................................................................... 12

Resumo geral ................................................................................................................... 12

Abstract ........................................................................................................................... 13

Introdução geral ............................................................................................................... 14

Referencial teórico ........................................................................................................... 15

Referências bibliográficas .............................................................................................. 26

CAPÍTULO 1 ................................................................................................................. 32

Polimorfismos no gene LEP e associações com atributos da carne e da carcaça de

ovinos Santa Inês........................................................................................................... 32

Resumo ............................................................................................................................ 33

Abstract ............................................................................................................................ 34

Introdução ........................................................................................................................ 35

Material e Métodos .......................................................................................................... 36

Resultados e Discussão .................................................................................................... 42

Conclusões.......................................................................................................................50

Referências Bibliográficas ............................................................................................... 51

CAPÍTULO 2 ................................................................................................................. 55

Polimorfismos nos genes GH e IGF1 e associações com atributos da carne e da

carcaça de ovinos Santa Inês ....................................................................................... 55

Resumo ............................................................................................................................ 56

Abstract ............................................................................................................................ 57

Introdução ........................................................................................................................ 58



Conclusões.......................................................................................................................80

Referências Bibliográficas ............................................................................................... 81

CAPÍTULO 3 ................................................................................................................. 85

Polimorfismo nos genes CAPN1 e CAST e associações com atributos da carne e da carcaça

de ovinos Santa Inês .................................................................................................... .....85

Resumo ............................................................................................................................ 86

Abstract ............................................................................................................................ 87

Introdução ........................................................................................................................ 88



Conclusões.....................................................................................................................121

Referências Bibliográficas ............................................................................................. 122

Considerações Finais ................................................................................................... 125

12

Identificação de polimorfismos nos genes LEP, GH, IGF1, CAPN1 e CAST e

associação com características de qualidade de carne e carcaça em ovinos Santa

Inês

RESUMO GERAL

O objetivo desta pesquisa foi identificar, em ovinos Santa Inês, polimorfismos do tipo

SNP (Single Nucleotide Polymorphis) nos genes IGF1 (Insulin Like Growth Factor 1),

GH (Growth Hormone), LEP (Leptin), CAPN1 (Calpain 1) e CAST (calpastatin) e

verificar se estão associados a características que evidenciam qualidade de carne ou de

carcaça. Para tanto, foram sequenciados fragmentos destes genes em até 191 animais. Na

região estudada do IGF1, cerca de 4.550 pb (pares de base), foram detectados 18 SNPs

em região de intron. Nos 2.045 pb estudados do gene da leptina foram identificados 21

SNPs, sendo um em região de exon. No gene GH, onde 1.194 pb foram sequenciados, 21

polimorfismos foram identificados, sendo 3 localizados em exon. Nos 3.927 pb estudados

do gene CAPN1, foram identificados 45 SNPs, um deles localizado em exon. No gene

CAST, 4.108 pb foram sequenciados e 58 polimorfismos identificados, sendo um em

exon. Deste total de polimorfismos, 115 SPN apresentaram distribuição de frequência que

permitiu utilizá-los para estimar efeitos aditivo e de dominância, sendo 6 no IGF1, 16 no

LEP, 52 no CAST, 5 no GH e 36 no CAPN1. Para alguns marcadores as frequências

genotípicas e alélicas diferiram de forma expressiva entres os dois grupos de animais

estudados (Embrapa e UFBA). Isso indica que há variação nas frequências de alguns

marcadores dentro dos rebanhos da raça Santa Inês e a resposta ao processo de seleção

dependerá muito da frequência do alelo favorável no rebanho sob seleção. Vários

marcadores tiveram efeito aditivo significativo sobre atributos de carne e de carcaça e

podem ser boa fonte de informação para a seleção de ovinos da raça Santa Inês. Muitos

desses efeitos ainda não haviam sido reportados em ovinos, o que torna o presente estudo

uma fonte de referência para outros trabalhos com esta espécie.

Palavras-chave: biotecnologia, genética, marcadores moleculares, melhoramento

animal, sequenciamento

13

Identification of polymorphisms at the genes LEP, GH, IGF1, CAPN1 and CAST

and association with meat and carcass quality traits in Santa Ines sheep

ABSTRACT

This study aimed to identify single nucleotide polymorphisms (SNP) in the IGF1 (Insulin

Like Growth Factor 1), GH (Growth Hormone), LEP (Leptin), CAPN1 (Calpain 1) and

CAST (Calpastatin) genes and to test association with economic meat and carcass quality

traits. For this purpose, they were sequenced fragments of these genes in up to 191

animals. In the IGF1 gene, about 4,550 bp (base pairs) were sequenced and 18 SNPs were

found in intron region. In the Leptin gene were sequenced 2045 bp and 21 SNPs were

identified, only one in exon region. In the GH gene were sequenced 1,194 bp and 21

polymorphisms were identified, of which three in exon. For the CAPN1 gene were

sequenced 3,927 bp and 45 SNPs were found, one into exon. In the CAST gene were

sequenced 4,108 bp and 58 polymorphisms were identified, one in exon. Frequency

distribution of 115 polymorphisms allowed to estimate additive and dominance effects

for phenotypic traits (6 in IGF1, 16 in LEP, 52 in CAST, 5 in GH and 36 in CAPN1). For

some markers, the genotypic and allelic frequencies differed expressively between the

two groups of animals studied (Embrapa and UFBA). This indicates that there is variation

in the frequencies of some markers within the Santa Ines herds and the response to the

selection process will depend greatly on the frequency of the favorable allele in the herd

under selection. Several markers had a significant additive effect on meat and carcass

attributes and may be a good source of information for selection of Santa Ines sheep.

Many of these effects were not reported in sheep, which makes the present study a source

of reference for other research around this species.

Key words: biotechnology, genetics, molecular markers, animal breeding, sequencing

14

INTRODUÇÃO GERAL

Os ovinos da raça Santa Inês vêm sendo avaliados ao longo do tempo para pesos

e ganhos de pesos em vários estudos da área de melhoramento genético no Brasil, como

Sousa et al. (1999), Sarmento et al. (2006) e Carvalho et al. (2014). Pesos e ganhos de

pesos são bons critérios de seleção relacionado ao crescimento e para a ovinocultura de

corte a melhoria do crescimento é um objetivo de grande importância econômica.

Contudo, muitas características associadas a qualidade de carne e de carcaça, que também

são importantes para a ovinocultura de corte, vem sendo negligenciadas devido a

necessidade de abater os animais, pois, para ser realizado as análises relacionadas a

textura, cor, pH, rendimento de carcaça, dentre outras, torna-se necessário abater os

animais. Uma alternativa moderna que pode trazer bons resultados para a melhoria dessas

características complexas é a utilização de informações moleculares no processo de

seleção dos animais (Gao et al., 2007).

A abordagem de genes candidatos tem sido uma das principais estratégias para

identificar associação entre polimorfismos moleculares e características complexas na

ovinocultura. Como exemplo de aplicação desta estratégia têm-se os estudos envolvendo

qualidade de carne e carcaça (COCKETT et al., 2005); produção de leite (MOIOLI et al.,

2007); características reprodutivas (HUA e YANG, 2009); e a resistência a endoparasitas

(PERIASAMY et al., 2014). Um dos principais problemas dessa abordagem é a

necessidade de se conhecer a função dos genes, para que eles de fato sejam considerados

candidatos. Contudo, o sequenciamento do genoma ovino tem possibilitado ampliar o

conhecimento da função de vários genes em ovinos, como pode ser observado em Jiang

et al. (2014). Assim, a indisponibilidade de genes com função conhecida não é mais um

grande entrave para a abordagem de genes candidatos. Outro problema dessa estratégia é

a natureza poligênica das características complexas, o que leva ao fato dos polimorfismos

encontrados muitas vezes explicarem percentuais reduzidos da variação das

características. Isso pode ser um problema para fins de melhoramento genético, pois para

se obter um ganho efetivo no processo de seleção é necessário conhecer os efeitos dos

muitos genes que estão atuando no controle da expressão da característica de interesse.

No entanto, a busca do conhecimento de como polimorfismos podem alterar a estrutura

de proteínas e influenciar as características de interesse ainda é uma grande justificativa

para estudos dessa natureza, como pode ser visto em Bahrami et al., (2015).

15

Apesar do crescente interesse nas informações de marcadores moleculares em

ovinos, pouco se sabe sobre polimorfismos que estejam associados a características de

interesse econômico em raças naturalmente adaptadas no Brasil, como a raça Santa Inês.

O principal trabalho publicado com a raça Santa Inês refere-se ao gene GDF9 e seu efeito

sobre prolificidade, como pode ser observado em Silva et al., (2010). Assim, o presente

trabalho tem por objetivo sequenciar e identificar polimorfismos nos genes GH, IGF1,

LEP, CAST e CAPN1 (conhecidos candidatos para características de crescimento,

deposição de gordura e maciez da carne, dentre outras variáveis), para testar associações

com rendimentos de carcaça e de cortes nobres, bem como características que evidenciam

qualidade de carne.

REFERENCIAL TEÓRICO

Ovinocultura no Brasil

Os ovinos foram trazidos para o Brasil há cerca de 500 anos e suas criações eram

feitas por pequenos produtores como cultura complementar, para a produção de carne,

leite e lã (McMANUS, et al. 2010). Nos anos 90 houve a crise internacional da lã e a

ovinocultura sofreu muitas mudanças. Na época, as principais criações de ovinos no

Brasil tinham como principal objetivo a produção da lã, mas com a queda no preço das

fibras têxteis, muitos criadores de ovinos no sul do país desistiram da atividade. Assim,

ainda que de forma indireta, os programas de melhoramento em ovinos também foram

prejudicados (VIANA, 2008; MORAIS, 2012). Contudo, na década seguinte houve um

grande aumento na ovinocultura de corte nas regiões centro-oeste e sudeste do Brasil

(MORAIS, 2012). A carne passou a ser o principal produto na criação ovina, fazendo da

ovinocultura de corte uma atividade atraente e lucrativa, considerando a praticidade de

não precisar tosquiar e o preço pago pelo produto. Com isso, as raças deslanadas

tornaram-se as mais populares naquele momento (VIANA, 2008; MORAIS, 2012).

Muitos produtores redirecionaram suas criações para a produção de carne, criando um

panorama alternativo para a produção de carne ovina de qualidade (SILVEIRA, 2005).

Segundo o censo pecuário do IBGE, o rebanho ovino no Brasil no de 2014 era de

aproximadamente 17,6 milhões de cabeças. O Nordeste apresenta o maior rebanho efetivo

do Brasil, cerca de 57,5%. A Bahia é o segundo maior Estado na criação de ovinos, com

aproximadamente 2,8 milhões de cabeças, o que corresponde a 27,8% do rebanho

16

Nordestino e 16% do rebanho nacional. Esse quantitativo é inferior apenas ao Estado do

Rio Grande do Sul, com quase 4,2 milhões de cabeças e que representa aproximadamente

23,9% do rebanho efetivo nacional (IBGE, 2012).

A produção de carne ovina vem mostrando aumento significativo em todo território

nacional, atingindo a exigência do mercado em relação a qualidade do produto, mas a

carência de oferta de animais jovens para o abate inibe o avanço do setor (BARCHET et

al., 2011). Assim, a ovinocultura vem demostrando ser um mercado bastante promissor,

pois as pessoas estão adquirindo novos hábitos, favorecendo o consumo e a apreciação

da carne ovina, aumentando a demanda pelos cortes e seus derivados (LARA et al., 2009;

ÁVILA et al., 2013).

Viana (2008) cita que os ovinos (Ovis aries) são uma espécie bastante difundida em

todos os continentes e isso se deve especialmente ao seu poder de adaptação a diferentes

climas, relevos e vegetações. Essa capacidade de adaptação despertou o interesse de

criadores de ovinos na região Nordeste do Brasil, onde o sistema de criação de ovinos é

tradicionalmente de produção extensiva, caracterizada por pequenos produtores que

investem poucos recursos no sistema de criação. Assim, a ovinocaprinocultura no Brasil

pode ser dividida em duas partes, uma tradicional e com pouco investimento em

tecnologias e outra mais tecnificada. Ambas contribuem para o desenvolvimento

socioeconômico do Brasil e requerem novos conhecimentos técnicos para ampliar todo

seu potencial de produção (COSTA, et al., 2010; GOUVEIA, 2003, apud ALENCAR, et

al., 2010, p 132).

Melhoramento genético de ovino no Brasil

No início da domesticação das espécies começou-se a seleção instintiva dos

melhores fenótipos para a procriação, dando início ao que conhecemos por melhoramento

genético; onde as primeiras mudanças alélicas instintivas foram realizadas (BORÉM,

2009). Contudo, o melhoramento de ovinos ainda é uma atividade em crescimento, pois

a maioria dos produtores fazem seleção individual nos rebanhos, enquanto que bancos de

dados para fins de melhoramento genético de ovinos são escassos no Brasil (MCMANUS,

et al., 2010). Segundo Morais (2012) a ovinocultura tem um papel fundamental na

economia de muitos países, como na Nova Zelândia e Austrália, onde a realização do

melhoramento genético ocorre de forma sistemática e orientada.

17

Uma das primeiras inciativas de melhoramento de ovinos no Brasil foi a criação do

PROMOVI (Programa de Melhoramento Genético dos Ovinos), coordenado pela ARCO

(Associação Brasileira de Criadores de Ovinos). O objetivo era avaliar ovinos no Rio

Grande do Sul, para a produção de lã e carne entre o fim da década de 70 e meados da

década 90, porém apesar dos esforços, não houve ganho genético expressivo (MORAIS,

2012). O mesmo autor relata que após este período o programa não conseguiu convencer

os produtores e a associação a continuar, o que levou muitos produtores a abandoarem o

programa logo após a crise da lã.

Depois da crise, a ovinocultura de corte começou a ganhar impulso e os produtores

começaram a importar reprodutores para alavancar a produção de carne através da

geração de cordeiros meio sangue (cruzados) para o abate (LÔBO, 2002). O autor também

relata que a ARCO alterou o PROMOVI, que passou a incluir nas suas análises o teste de

velocidade de crescimento, próprio para as raças importadas e passou a atender não

apenas o Rio Grande do Sul, mas toda a região Sul e o Estado de São Paulo. Contudo,

atualmente o PROMOVI não tem gerado avaliações genéticas e mesmo outras iniciativas

que surgiram depois dele ligadas a associações de criadores regionais, como a ASCCO

(Associação Sergipana dos Criadores de Caprinos e Ovinos), ou a Embrapa (GENECOC

- Programa de melhoramento genético de caprinos e ovinos de corte) não tem feito

avaliações continuadas. Assim, o criador de ovinos no Brasil continua a encontrar

dificuldade na aquisição de reprodutores, devido à falta de avaliações genéticas.

Marcadores moleculares na seleção animal

Na década de 80 ocorreram grandes avanços no mapeamento de genes e no

conhecimento de regiões genômicas responsáveis por controlar características de

interesse econômico (GUIMARÃES et al., 2009). Isso foi possível devido aos avanços

nas tecnologias que geraram marcadores moleculares de diversos tipos. Os primeiros

marcadores moleculares foram os fragmentos de DNA gerados a partir da digestão usando

enzimas de restrição (BORÉM, 2009). Atualmente os marcadores moleculares estão mais

viáveis e avançados, graças a descobertas de inúmeros polimorfismos de base única

(SNP), identificados a partir de sequenciamento dos genomas e de transcriptomas

(GUIMARÃES et al., 2009).

18

As novas tecnologias utilizadas para a seleção assistida por marcadores moleculares

englobam o mapeamento de genes, estudos de expressão gênicas em tecidos-alvo, dados

de produção, ferramentas biotecnológicas como as sequências genômicas e ferramentas

de bioinformática aplicadas (McMANUS et al., 2010). Tais informações são usadas para

selecionar genótipos associados a características quantitativas, ou seja, que explicam as

variações de características de interesse econômico, como na produção e composição de

leite e carne (DODDS et al., 2007; McMANUS et al., 2010).

Os estudos com marcadores moleculares em programas de melhoramento genético

de ovinos encontram-se em acedência e abrangem resistência a doenças, prolificidade e

marcadores para produção e qualidade de carne na seleção de indivíduos que possa suprir

a necessidade do mercado (DODDS et al., 2007). Exemplos de gene usados em

programas de melhoramento de ovinos são: Booroola (aumentar a produção de ovócito

por ciclo), Inverdale (aumenta a prolificidade), Callipyge (aumento da massa muscular

da garupa), miostatina (musculatura dupla), scrapie (resistência e suscetibilidade)

(GALLOWAY et al., 2000; JOHNSON et al., 2005; McMANUS, et al., 2010). Contudo,

McManus et al. (2010) citam que para utilizar informações de marcadores moleculares

em programa de melhoramento de ovinos é preciso ter uma base confiável para a coleta

de dados, com gravações de dados genealógicos padronizados, pois sem este controle não

haverá impacto sobre a criação de ovinos no Brasil.

Genes Candidatos

Genes candidatos são aqueles que possuem algum impacto funcional, com ações

biologicamente conhecidas, ou seja, que estão diretamente relacionadas com o

desenvolvimento ou fisiologia de características de interesse (ROTHSCHILD et al.,

1997). Grande parte dos genes candidatos estão envolvidos em via metabólicas e uma

alteração na sequência pode causar variações genéticas, influenciando na resposta da via

metabólica podendo ocorrer, assim, alterações no fenótipo. A necessidade de se abordar

os genes candidatos está no conhecimento da importância da variação genética dentro de

um gene associado com um fenótipo quantitativo conhecido, podendo investigar a causa

de mutações e o funcionamento do gene investigado (ZHU et al., 2007).

A associação de genes com importantes características de produção advém de uma

relação estatística entre um loco e uma característica em particular. Polimorfismos em

genes que codificam substâncias como o hormônio da Leptina, o hormônio de

19

crescimento e hormônio de crescimento semelhante à insulina I – IGF1, foram associados

à composição corporal, taxas de crescimento, peso nascimento e peso ao abate, dentre

outras variáveis, exercendo um efeito em vários sistemas metabólicos e energético

fundamentais para a produção animal (HOSSNER, 2005).

Kadarmideen et al., (2006) citam algumas etapas antes de implementar a

abordagem de um gene candidato. Primeiro deve-se formar uma população de referência;

depois coletar dados das características (fenotípicos de interesse); então realizar a

genotipagem dos animais; e por fim analisar os dados para verificar se existe associação

entre os fenótipos e os genótipos obtidos. Porém, este tipo de abordagem requer um

conhecimento prévio da ação do gene de interesse, que algumas vezes não foram

totalmente elucidadas. Além disso, as principais características de interesse econômico

sofrem atuação de diversos genes, que contribuem de alguma forma para a sua expressão.

Assim, pode ser difícil encontrar um gene candidato que explique grande percentual da

variação da característica de interesse (ANDERSSON, 2001; BURT e HOCKING, 2002).

Gene da Leptina

O gene da Leptina, também conhecido como o gene da obesidade (ob), é

considerado um gene candidato para a associação com característica de deposição de

gordura corporal em animais de produção e está relacionado com a regulação do

metabolismo energético, consumo de ração e composição corporal (BOUCHER et al.,

2006; CAUVERI et al., 2014). Logo, também pode ser um bom gene candidato para

avaliar pesos e ganhos de peso, ou seja, crescimento de animais de interesse pecuário.

As vias metabólicas do gene da Leptina estão sendo estudadas detalhadamente em

várias espécies, incluindo os ruminantes. Observa-se que o metabolismo de lipídios está

associado e o balanço energético está diretamente relacionado com a expressão da Leptina

e seus receptores, os quais desempenham papel importante em diversas etapas

metabólicas (PASSOS, 2006).

O hormônio da Leptina, sintetizado e secretado nos tecidos adiposos, é uma

descoberta relativamente nova. Foi em 1994 que Friedman e colaboradores conseguiram

descobrir um sinal de adiposidade presente em ratos, usando ratos que não apresentavam

sinal de saciedade. Neste estudo, foi observado que uma mutação que interrompia a

transcrição dos exons do gene da Leptina resultava em um stop prematuro da molécula de

mRNA, levando ao aumento de gordura corporal nos ratos. Após alguns testes utilizando

20

o hormônio da Leptina como tratamento, foi observada uma diminuição na ingestão de

alimentos e da gordura corporal (HOSSNER, 2005). O gene da Leptina foi descrito em

vários animais domésticos, incluindo suínos, bovinos, ovinos e aves (HOSSNER, 2005).

A figura 1 ilustra a ação e secreção da Leptina em ratos e ela é similar em várias espécies.

Houseknecht et al. (1998) ilustram que a Leptina produzida é secretada pelos tecidos

adiposos na corrente sanguínea, até atingir os tecidos alvos e cérebro, causando a

estimulação ou inibição da libertação de neurotransmissores, como o neuropéptidio Y

(NPY), os quais agem sobre a inibição da ingestão de alimentos e estimulam a termogênese.

Figura 1. Ação e secreção da Leptina em ratos. Adaptado de Houseknecht et al., (1998)

Os níveis de Leptina no sangue de ruminantes estão associados ao aumento linear

da massa corporal gorda e ao aumento do balanço energético. Uma mutação neste gene

pode interferir na regulação da expressão genica e afetar o metabolismo e o ganho de peso,

podendo ser útil em programas de melhoramento genético, sobretudo no contexto de

variáveis como deposição de gordura na carcaça dos animais (BLACHE et al., 2000;

EHRHARDT et al., 2000; COUTINHO et al., 2010).

O gene da Leptina está entre os melhores marcadores biológicos que indicam a

deposição da gordura corporal em animais e humanos (NASSIRY, et al., 2007). Coutinho

et al., (2010) afirmaram que o marmoreio na carne é decorrente da deposição de gordura

intramuscular, responsável pelo sabor e suculência da carne. Este gene pode ser muito útil

na escolha de animais de maior valor econômico e na seleção de melhores reprodutores.

Tecidos Periféricos -Fígado -Pâncreas - Músculo, etc.

Célebro

Leptina

(+/-) (+)

Hormônios (-) Consumo de alimento (+) Gasto de energia (+) Atividade física

(+)

(-)

(-)

(+)

21

A Leptina está liga a regulação do apetite e metabolismo de energia, atuando em

núcleos hipotalâmicos, responsáveis por regular processos metabólicos e liberação de

hormônios (HOUSEKNECHT et al., 1998). O hipotálamo atua na sinalização da saciedade

e no aumento do metabolismo para a queima de gordura, fazendo com que a atuação do

hormônio da Leptina regule a ingestão de alimento (AUWERX e STAELS, 1998; BARSH

et al., 2000). Assim, a investigação do hormônio da Leptina trouxe melhor concepção do

controle da energia corporal, possibilitando o entendimento do funcionamento e do

potencial desde gene como marcador, na regulação do consumo de gorduras e a distribuição

e armazenamento desta no corpo dos animais (CAUVERI et al., 2014).

Outro papel importante da atuação do gene da Leptina é a regulação do

metabolismo da produção de insulina, da secreção do hormônio do crescimento e do

estímulo da glicogenólise (degradação do glicogênio), indicando que o hormônio da

Leptina pode influenciar diretamente o metabolismo de energia nos tecidos musculares

(HOUSEKNECHT, et al., 1998; BUCHANAN et al., 2002; CHILLIARD et al., 2005).

O gene da Leptina e seus receptores podem influenciar diretamente o ganho de

peso e a conformação da carcaça, através da deposição de gordura. Além disso, pode

influenciar diretamente o desempenho reprodutivo, pois é necessário o mínimo de condição

corporal para inicializar as atividades reprodutivas e manter o ciclo estral regular (SPICER,

2001; PASSOS, 2006). Muitas características fisiológicas do gene da Leptina e seus

receptores, principalmente a influência sobre a gordura na carcaça, torna-o forte candidato

para o estudo de associação com características de produção (LIEFERS, 2004).

Localizado no cromossomo 4 dos ovinos, com aproximadamente 16.000pb (pares

de base) de comprimento, o gene da Leptina possui 3 exons e 2 introns, e apenas 615pb

participam da transcrição do gene. He et al. (1995) afirmam que apesar do gene da Leptina

possuir três exons, apenas o segundo e o terceiro exons participam da transcrição do gene.

Muitos polimorfismos vêm sendo estudados no gene da Leptina e alguns estão

associados a características de interesse econômico. Robert et al. (1998) detectaram

associação de polimorfismo no gene da Leptina com peso vivo de suínos e também

informaram que níveis altos de RNA mensageiro da Leptina estavam relacionados com

maior espessura de gordura subcutânea. Silva et al. (2012) encontraram associação

significativa entre o marcador E2FB (C→T) no exon 2 do gene da Leptina e espessura de

gordura subcutânea na garupa, ganho de peso e área de olho de lombo em bovinos da raça

Nelore. O mesmo marcador foi estudado por Nkrumah et al. (2004), os quais encontraram

também associação significativa para as características de espessura de gordura e ganho

22

de peso diário em bovinos. Shojaei et al. (2010) em pesquisas com ovinos da raça

Kermani, observaram alta densidade de polimorfismos no gene da Leptina. Os autores

identificaram 10 perfis genotípicos distintos, onde 8 deles foram associados ao ganho de

peso e peso vivo aos 3 e 12 meses de idade. Contudo, há poucos estudos de associação

de polimorfismo do gene da Leptina com características de interesse econômico em

ovinos, evidenciando a necessidade de pesquisar mais a influência e o impacto dos

polimorfismos neste gene sobre fenótipos de interesse.

Gene GH

O gene do hormônio de crescimento (GH) também é um forte candidato para

estudos de associação com características de interesse econômico na ovinocultura. O GH,

membro da família somatotropina/prolactina, é sintetizado e secretado pelas células

somatotropos (células da hipófise) da glândula pituitária anterior, sendo formado por uma

proteína de cadeia simples, onde na maioria das espécies é constituído por 191

aminoácidos (HOSSNER, 2005). Nos ovinos, o gene GH está localizado no cromossomo

11 e tem aproximadamente 1800 pb de extensão, sendo dividido em cinco exons e quatro

introns. O GH em ovinos possui 98,7% de similaridade com o da espécie bovina.

A síntese do GH é ativada com a presença de mais dois hormônios: a grelina,

produzida no estômago e o hormônio de liberação do GH (GHRH), produzido no

hipotálamo, estimulando também a secreção do GH pelas glândulas pituitárias (KOJIMA

et al., 1999). Porém a liberação do hormônio de crescimento depende da espécie, sexo e

idade do animal (HOSSNER, 2005). Hossner (2005) também explica que a liberação do

GH pode ser estimulada pelos níveis de glicose no sangue, pois níveis elevados de

insulina, IGF1, ácidos graxos livres e Leptina inibem a secreção de GH.

O gene GH atua em vários órgãos e sistemas, agindo sobre o crescimento pós-

natal e desenvolvimento em mamíferos, na lactação, na reprodução, mudanças nas

proteínas, lipídios e metabolismo de carboidratos, destacando-se como gene candidato

para a melhoria de produção de carne e leite (GLUCKMAN, et al., 1981; MIN et al.,

2005; AYUK e SHEPPARD, 2006; AKERS, 2006; HAJIHOSSEINLO e

NEGAHDARY, 2013). Os efeitos do GH para o desenvolvimento muscular, são

regulados na sua maioria pelo fator de crescimento semelhante à insulina (IGF1),

podendo ser mediados também pelo hipotálamo e outros fatores como o estado

nutricional, hormônios sexuais e função hepática (LE-ROITH et al., 2001; ZULU et al.,

23

2002; AYUK e SHEPPARD, 2006). O efeito do gene GH no crescimento pode ser

observado em vários tecidos (musculares, esqueléticos e adiposo). O efeito direto do GH

sobre o metabolismo de lipídio e proteína apresenta-se similar ao da insulina na produção

de cortisol nas ações lipolíticas. Contudo, o GH também participa da multiplicação celular

e das ações metabólicas associadas a deposição de proteína (SILVA et al., 2006; BOYD

e BAUMAN, 1989, apud HAJIHOSSEINLO e NEGAHDARY, 2013).

Pesquisas recentes mostram que polimorfismos no gene GH e IGF1 tiveram

associação significativa com peso vivo em diferentes idades em bovinos da raça Canchim

(PEREIRA et al., 2005). Zhou et al. (2005a) encontram associação entre polimorfismo no

gene GH e produção de leite em vacas da raça Holandesa. Cheng et al. (2000) ao estudar

suínos das raças Duroc, Landrace e Tao-yuan observaram associações de polimorfismo

no GH com o ganho de peso médio diário e eficiência de ganho de peso. Contudo, estudos

de associação de polimorfismo no gene GH com características de carcaça em ovinos não

foram encontrados.

Gene IGF1

Localizado no cromossomo 3 em ovelhas, o gene IGF1 possui aproximadamente

74.000 pares de base (pb). Ele divide-se em quatro exons e três introns, onde 591pb fazem

parte da transcrição do gene. A família do gene IGF é composta por três genes: IGF1,

IGF2 e a insulina, encontrados na circulação e fluidos extracelular. O IGF1 e o IGF2 são

muito importantes na diferenciação celular, na embriogênese, no crescimento e na

regulação do metabolismo, pois o IGF1 atua como receptor de muitos efeitos biológicos,

como a absorção de glucose, estímulo a miogênese, ativação de genes do ciclo celular

que induzem a síntese de lipídeos, na intervenção na síntese de DNA, proteína e a

propagação da molécula de RNA (ETHERTON, 2004; SIADKOWSKA et al., 2006;

MORADIAN et al., 2013).

O IGF1 são pequenos peptídeos que regulam muitos dos efeitos do gene GH. Este

gene desempenha um papel importante no crescimento e desenvolvimento dos animais.

Hossner (2005) cita que a ação do gene IGF1 possui efeitos semelhantes aos da insulina

sobre o metabolismo, efeitos de GH no crescimento dos animais e os efeitos sobre a

divisão e diferenciação de células em tecidos derivados do mesoderme embrionário.

Logo, o IGF1 está diretamente relacionado com a taxa de crescimento e produção de

24

carne em animais domésticos (IMAM-GHALI et al., 1991), podendo ser destacado como

gene candidato para programas de melhoramento animal.

O IGF1 vêm sendo estudado como gene candidato para a associação com as

características de ganho de peso nas diferentes idades na espécie bovina no Brasil. O gene

IGF1 já foi associado ao peso ao nascer, mas não influenciou os pesos à desmana e ao

sobreano (SILVA et al., 2006). Já Andrade et al. (2008) identificaram uma associação

entre polimorfismo no gene IGF1 e os pesos ao nascer, à desmama ajustado a 240 dias

em bovinos. Zhou et al. (2005b) associaram polimorfismo no gene IGF1 com

características de crescimento, aumento da massa muscular de peito diminuição da

gordura abdominal, e integridade do esqueleto em frangos. Em ovinos não há muitos

relatos de associação com o IGF1. Contudo, He et al. (2012) estudaram o gene IGF1

como gene candidato para a alta prolificidade em ovelhas, observando que os

polimorfismos encontrados neste gene poderiam ser usados em seleção assistida por

marcadores moleculares (MAS) em programas de melhoramento de ovinos.

Genes CAPN1 e CAST

O CAPN1 (calpaína) em ovinos está localizado no cromossomo 21 e possui

aproximadamente 25.000 pares de base (pb) e está dividido em 21 exons e 22 introns.

Enquanto o gene CAST (calpastatina) está localizado no cromossomo 5 com

aproximadamente 90KB, com 27 exons e 26 introns.

O gene CAPN1 codifica enzima proteolítica μ-calpaína, é também conhecido

como o gene da protease neutra ativada por cálcio, que degrada as proteínas miofibrilares

do músculo no período post-mortem (KOOHMARAIE, 1996; SMITH et al., 2000).

Segundo Warriss, (2000), as calpaínas são ativadas por íons de cálcio e tem atividade

máxima em condições alcalinas (pH próximo de 5). As calpaínas são divididas em dois

grupos, as que são ativadas por níveis milimolar de Ca2+ (m-calpains) e as de nível

micromolar (µ-calpains). Ambas são inibidas por uma terceira proteína chamada de

calpastatina, codificada pelo gene CAST, que impede a ligação das calpaínas às

membranas (LAWRENCE e FOWLER, 2002).

As calpaínas degradam específicamente as proteínas musculares, tais como a

titina, desmina e troponina T, assim como pequenas proteínas do músculo esquelético

(HOSSNER, 2005). A miosina é degradada lentamente pelas calpaínas, já a actina não

sofre nenhum efeito desta enzima. Assim, a ação das calpainas é de enfraquecimento do

25

disco Z do músculo (LAWRENCE e FOWLER, 2002; HOSSNER, 2005). Segundo Page

et al. (2002) o CAPN1 trata-se de um gene candidato para maciez da carne. Por outro

lado, a calpastatina inibi a maciez da carne (WARRISS, 2000). Estudos associando a

maciez da carne com polimorfismo identificados no gene CAPN1 e CAST já estão sendo

avaliados a algum tempo como pode ser visto em Fortes (2007), Curi et al. (2009) e

Pereira et al. (2015). Mais recentemente trabalhos tentando associar genótipos nos genes

da CAPN1 e CAST à qualidade de carne ovina foram publicados por Ranjbari et al.,

(2012). Contudo, não há relatos de polimorfismos afetando caraterísticas de carcaça em

ovinos.

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32

Capítulo 1


ovinos Santa Inês

33


ovinos Santa Inês

RESUMO

O objetivo deste estudo foi identificar polimorfismos no gene LEP (Leptina) em ovinos

da raça Santa Inês e testar se estão associados ao pH pós-abate (pH0) e 24 horas post

mortem (pH24), área de olho de lombo do músculo, caracterização cromática da carne

(L*, a* e b*), força de cisalhamento, perda de peso por cocção, pesos e rendimentos de

carcaças quente e fria, pesos e rendimentos de pescoço, perna, costelas, paleta e lombo,

comprimentos externo e interno da carcaça, comprimento da perna, larguras da carcaça

nas regiões do peito e da garupa, além de escores de conformação e acabamento de

gordura da carcaça. Foi sequenciado um fragmento com 2.045pb localizado entre os

exons dois e três do gene da leptina, no qual foram identificados 21 polimorfismos, sendo

nove polimorfismos identificados pela primeira vez em ovinos. O SNP g.92501206C>T

foi o único localizado em exon e trata-se de uma mutação sinônima, pois a troca do

nucleotídeo não alterou o aminoácido na sequência da proteína. Um total de 16 SNP,

todos em intron, apresentaram boa distribuição de frequência genotípica e foram

utilizados nos testes de associação. Foram consideradas associações significativas

aquelas cujo P<0,001593 e associações sugestivas aquelas cujos P<0,05. O SNP

g.92501372G>A apresentou efeito aditivo significativo para rendimento de pescoço e

efeito aditivo sugestivo para peso do pescoço. O SNP g.92501543A>G apresentou efeito

aditivo sugestivo para os rendimentos de carcaça quente e fria, comprimento interno da

carcaça, rendimento biológico e rendimento de pernil. O SNP g.92502947A>C teve

efeito aditivo sugestivo para rendimento verdadeiro. O SNP g.92503024G>A apresentou

efeito aditivo sugestivo para escore de terminação de carcaça. Por fim, o marcador g.

92503044A>G teve efeito aditivo sugestivo para L* e b*. Portanto, existem

polimorfismos no gene da Leptina que podem fornecer informações para programas de

seleção visando melhorar atributos de carcaça e carne em ovinos da raça Santa Inês.

Palavras-chave: marcadores moleculares, melhoramento animal, ovinocultura,

sequenciamento

34

Polymorphisms in the LEP gene and association with meat and carcass traits in

Santa Ines sheep

ABSTRACT

this study aimed to identify single nucleotide polymorphisms in the LEP gene (Leptin) in

Santa Ines sheep and testing association with pH post-slaughter (pH0) and 24 hours

postmortem (pH24), loin eye area of the Longissimus muscle, L*, a* and b* color

parameters, shear force, weight loss by cooking, weights and yields of hot and cold

carcasses, weights and yields of neck, leg, ribs, shoulder and loin, external and internal

carcass length, leg length, carcass widths in the breast and croup regions, as well as

carcass conformation and carcass finishing score. A 2.045bp fragment located between

exons two and three of the leptin gene was sequenced, in which 21 mutations were found,

nine mutations were identified for the first time in sheep. The SNP g.92501206C>T was

the only mutation in exon and it is a synonymous mutation, since the nucleotide exchange

did not alter the amino acid in the protein sequence. Sixteen SNPs, all in intron, showed

good genotype frequency distribution and were used in association tests. Significant

associations were those whose P<0.001593 and suggestive associations were those whose

P <0.05. The SNP g.92501372G>A showed significant additive effect for neck yield and

suggestive additive effect for neck weight. The SNP g.92501543A>G presented a

suggestive additive effect for hot and cold carcass yields, internal carcass length,

biological yield and leg yield. The SNP g.92502947A>C had suggestive additive effect

for true yield. The SNP g.92503024G>A presented a suggestive additive effect to the

carcass finishing score. Finally, the marker g.92503044A>G had suggestive additive

effect on L* e b* color parameters. Therefore, there are polymorphisms in the Leptin

gene that can provide information for selection programs of Santa Ines sheep for

improving carcass and meat traits.

Key words: molecular markers, animal breeding, sheep farming, sequencing

35

INTRODUÇÃO

A raça Santa Inês é formada por animais deslanados e possui atributos de

crescimento (JUCÁ et al., 2014) e carcaça (JUCÁ et al., 2016) que permitem explorá-la

para produção de carne. O principal objetivo dos programas de melhoramento da raça

Santa Inês sempre foi o aumento dos pesos e ganhos de peso. Tal objetivo vem sendo

alcançado via seleção, pois as estimativas de herdabilidade para pesos e ganhos de peso

nesta raça são moderadas (SOUSA et al., 1999; SARMENTO et al., 2006; e

CARVALHO et al., 2014). No entanto, atributos de carcaça não foram objeto de seleção

devido a necessidade de abater os animais, o que tem inviabilizado a seleção em grande

escala.

Informações moleculares podem ajudar a contornar essa dificuldade (GAO et al.,

2007) e neste contexto a abordagem de genes candidatos tem sido uma das principais

ferramentas nos estudos com ovinos. O sequenciamento do genoma ovino permitiu

ampliar o conhecimento da sequência de vários genes em ovinos (JIANG et al., 2014) e

facilitou o uso da estratégia de genes candidatos nesta espécie. Dentre as muitas

possibilidades, tem-se o gene da leptina (LEP). A Leptina é um hormônio produzido pelo

tecido adiposo e tem um papel importante na regulação do peso vivo em mamíferos

(FRIEDMAN et al., 2002), pois atua no controle do balanço energético e por isso

influencia o consumo de alimento, o impacta o peso vivo e a composição deste peso em

mamíferos. Zhang et al. (2005) e Klok et al., (2007) citam que deficiência deste hormônio

estão associados a problemas como obesidade, diabetes e até infertilidade. Logo, trata-se

de um hormônio que pode estar direta ou indiretamente ligado a várias funções

fisiológicas do organismo e por isso o gene LEP é um bom candidato a estudos de

associação, apesar de Altmann e Von Borell (2007) ressaltarem a necessidade de validar

resultados de associação.

Polimorfismos no gene LEP vem sendo testados em estudos de associação com

características de interesse econômico em ruminantes. Nkrumah et al., (2004) e Schenkel

et al., (2005) reportaram associações com características de carcaça em bovinos de corte.

Estudos com ovinos também reportaram associações com características reprodutivas

(BAKHTIAR et al., 2017), consumo de alimento (JONAS et al., 2016), crescimento

(SHOJAEI et al., 2010; TAHMOORESPUR et al., 2010; HAJIHOSSEINLO et al., 2012)

e carcaça (BARZEHKAR et al., 2009). Contudo, não há relatos sobre a avaliação de

atributos como rendimentos de carcaça e de cortes nobres. Além disso, os polimorfismos

reportados em prévios estudos com ovinos podem não ser os mesmos que explicam a

36

variação na raça Santa Inês. Portanto o presente estudo teve como objetivo identificar

polimorfismo no gene LEP em ovinos Santa Inês e testar se eles estão associados a

atributos de carcaça e qualidade de carne.

MATERIAL E MÉTODOS

Animais e fenótipos avaliados

Foram avaliados 191 cordeiros Santa Inês com aproximadamente 240 dias de

idade; Destes, 105 nasceram entre 2010 e 2012 no campo experimental Pedro Arle, da

Embrapa Tabuleiros Costeiros, no município de Frei Paulo / Sergipe. Enquanto que os

outros 86 cordeiros foram criados na fazenda experimental da Escola de Veterinária

Medicina e Zootecnia da UFBA, localizada em São Gonçalo dos Campos / Bahia, todos

nascidos em 2014. Todos os animais tiveram o peso vivo ao abate (PV) aferido após jejum

prévio de 16 horas. Após o abate foram mensurados os pesos do sangue, da cabeça, das

patas, do aparelho reprodutor e da carcaça quente (PCQ). As vísceras foram pesadas

individualmente cheias e vazias, para determinação do conteúdo do trato gastrointestinal

e do peso do corpo vazio (PCV). Além disso, foram calculados os rendimentos (%) de

carcaça quente (RCQ = PCQ/PV x 100), verdadeiro (RV = PCQ/PCV x 100) e biológico

(RB = PCV/PV x 100). As carcaças foram resfriadas em câmara fria por 24 horas a 2° C

e pesadas para obtenção do peso da carcaça fria (PCF) e cálculo do seu rendimento RCF

(%) = PCF/PV x 100.

Foi mensurado o pH da carcaça até 45 minutos pós-abate (pH0) e 24 horas post

mortem (pH24) com o auxílio de um peagâmetro digital. Foi feito um corte no músculo

Longissimus dorsi entre a 12ª e 13ª costelas para a introdução do eletrodo do peagâmetro,

e realizado 3 medidas sequenciadas. A média das triplicatas foram usadas como valor das

características.

A caracterização cromática da carne foi realizada após o descongelamento dos

músculos Longissimus dorsi (4° C por 12h e posteriormente exposto a temperatura

ambiente por 30 minutos). Utilizou-se o colorímetro MINOLTA CR-400 atuando no

sistema CIE/Lab com fonte D65, ângulo de 10° e calibrado no branco. Foram apurados

os valores das coordenadas cromáticas, sendo L* a luminosidade (com valores de 0 para

preto a 100 para branco); a* a intensidade da cor vermelha (com valores negativos para

a cor verde e positivos para a cor vermelha); e b* a intensidade da cor amarela (com

37

valores negativos para a cor azul e positivos para a cor amarela). Foram feitas medidas

para cada lombo, sendo a média das triplicatas o valor utilizado.

Depois do descongelamento dos músculos Longissimus dorsi, em temperatura

ambiente, foi realizada a avaliação da maciez pela força de cisalhamento via Warner

Bratzler Shear Force. Para tal, utilizou-se um vazador cilíndrico do próprio equipamento,

com a finalidade de retirar cinco fragmentos da parte central das porções com

aproximadamente 1,27 cm de diâmetro; o corte foi perpendicularmente as suas fibras e

livre de gorduras e nervos. O pico da força do cisalhamento (kgf) foi anotado, e a média

das cinco amostras de cada lombo foi considerada a força de cisalhamento.

A perda de peso por cocção foi aferida direto de cinco pedaços do lombo de

aproximadamente 2,0 cm cada. Os bifes foram pesados e expostos ao calor, usando um

grill até atingir uma temperatura interna do centro geométrico de aproximadamente 71°C,

controlado pelo termopar equipado com leitor digital. O valor da característica de perda

de peso por cocção foi medido pela diferença de peso inicial e final das amostras, após

serem submetidas ao tratamento térmico e expressa em porcentagem.

As medidas morfométricas foram aferidas na carcaça com auxílio de fita métrica

e compasso, sendo o comprimento interno (distância máxima entre a borda cranial do

púbis e a borda cranial da primeira costela em seu ponto médio); comprimento externo

(distância máxima entre a articulação cérvico-torácica e a primeira articulação

intercoccígea); comprimento da perna (distância máxima entre o trocânter maior do fêmur

e a borda lateral da articulação tarso-metatarsiana); largura do tórax (largura máxima

mensurada ao nível das costelas); profundidade do tórax (distância máxima entre o

esterno e a cernelha); largura da garupa (largura máxima entre os trocânteres dos

fêmures); perímetro da garupa (perímetro tomando como base os trocânteres dos

fêmures). O índice de compacidade da carcaça foi calculado como a razão entre o peso

da carcaça fria e o comprimento interno da carcaça, expresso em kg/cm.

Para classificação e tipificação das carcaças foram determinados escores de um a

cinco, por observação visual, para a conformação e o acabamento das mesmas. Para a

conformação os escores foram atribuídos de acordo com o perfil da musculatura da

carcaça, sendo: escore 1 (perfil côncavo – conformação ruim); escore 2 (perfil retilíneo –

conformação razoável); escore 3 (perfil subconvexo – conformação boa); escore 4 (perfil

convexo – conformação muito boa) e escore 5 (perfil hiperconvexo – conformação

excelente). Para o acabamento foram atribuídos escores de acordo com a quantidade de

gordura de cobertura, sendo escore 1 (muito baixa quantidade – carcaça muito magra);

38

escore 2 (baixa quantidade – carcaça magra); escore 3 (média quantidade – carcaça

média); escore 4 (quantidade elevada – carcaça gorda) e escore 5 (quantidade muito

elevada – carcaça muito gorda).

A carcaça foi seccionada ao meio e na meia carcaça esquerda foi efetuado um

corte transversal à altura da 12a e 13a costelas para mensuração da área de olho de lombo

do músculo Longissimus dorsi, com o contorno da porção cranial do referido músculo em

folhas de transparências com caneta apropriada, para cálculo da área após a digitalização

das imagens em software computacional. A espessura de gordura subcutânea foi

mensurada acima do referido músculo com paquímetro. A espessura de gordura máxima

foi aferida a 11 cm da linha mediana do corpo com auxílio de fita métrica e paquímetro.

A meia carcaça esquerda foi subdividida em cinco cortes cárneos: paleta (base

óssea: escápula, úmero, rádio e ulna); pescoço (entre a primeira e a sétima vértebra

cervical); costela (entre a primeira e a 13a vértebra torácica); pernil (secção entre a última

vértebra lombar e a primeira sacra); e lombo (vértebras lombares e músculos desta

região). Foram calculados os rendimentos dos cortes cárneos em função do peso vivo ao

abate. Os lombos direito e esquerdo de cada animal foram dissecados e pesados. Os

rendimentos destes cortes foram calculados em função do peso da meia-carcaça. Os

valores médios e respectivos desvios-padrão de todas as variáveis analisadas no presente

estudo podem ser observados na Tabela 1.

Extração de DNA genômico e reação em cadeia da polimerase

Coletou-se 5 ml de sangue em tubos de vacutainer contendo EDTA. Logo após

foram armazenados e refrigerados a 4 ºC. Para então extrair leucócitos, seguindo o

protocolo descrito por Oliveira et al., (2007). Os leucócitos foram encaminhados à Escola

Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ / USP, onde foi realizada a extração do

DNA genômico, seguida da amplificação da região alvo e subsequentemente da

preparação da biblioteca. A extração de DNA foi realizada utilizando método de

precipitação de sal e soluções de proteinase K segundo Oliveira et al., (2007).

O desenho do primer para o gene da leptina foi feito com base na sequência

disponível no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) de

ovinos Genoma (Ovis aries), onde selecionou a região entre o segundo e terceiro exon do

gene.

39

Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas

Característica N Média DP

Peso de carcaça quente 185 16,08 3,72

Peso de carcaça fria 185 16,08 3,81

Rendimento de carcaça quente 185 46,50 14,45

Rendimento de carcaça fria 185 46,40 14,21

Rendimento verdadeiro 67 58,2 2,83

Rendimento biológico 67 76,56 3,17

Compacidade da carcaça 185 0,26 0,053

Escore de conformação de carcaça 185 2,22 0,35

Escore de terminação da carcaça 185 2,06 0,56

Comprimento interno da carcaça 185 60,47 5,78

Comprimento externo da carcaça 185 64,20 7,34

Comprimento do pernil 185 40,21 6,66

Perímetro da carcaça na região da garupa 185 60,69 11,27

Largura da carcaça na região da garupa 185 23,92 6,16

Largura da carcaça na região do tórax 185 22,59 10,21

Profundidade da carcaça na região do tórax 185 25,31 3,57

Peso da paleta 185 2,20 0,75

Rendimento da paleta 185 6,47 2,91

Peso do pescoço 185 1,12 0,39

Rendimento do pescoço 185 3,27 1,45

Peso da costela 184 3,25 1,19

Rendimento da costela 185 9,47 4,27

Peso do lombo 185 1,14 0,46

Rendimento do lombo 185 3,34 1,70

Peso da perna 176 3,71 1,80

Rendimento da perna 185 10,97 6,35

Peso do lombo desossado 144 0,59 0,38

Área de olho de lombo (cm2) 184 11,27 3,62

Espessura de gordura subcutânea 97 0,19 0,044

L* - luminosidade 181 44,69 4,31

a* - intensidade de vermelho 181 21,15 2,68

b* - intensidade de amarelo 185 8,49 1,82

Força de cisalhamento (kgf) 182 1,71 0,66

pH0 106 6,67 0,19

pH24 101 5,57 0,19

Perdas de peso por cocção (%) 180 15,23 5,53

O desenho dos oligonucleotídios foi realizado a partir do programa Primer 3

(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/), que gerou possíveis sequências dos iniciadores. Para

testar a qualidade das sequências geradas e a escolha do primer, utilizou-se o net primer

(http://www.premierbiosoft.com). Após a escolha dos melhores primers forward e

reverse do gene, foi realizado o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que é

http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/

http://www.premierbiosoft.com/crm/jsp/com/pbi/crm/clientside/EligibleForDiscountLoginForm.jsp?LoginForFreeTool=true&PID=3

40

utilizado como uma ferramenta de busca para o alinhamento das sequências no NCBI

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), para confirmar a similaridade com a espécie

Ovis aries e a região desejada.

Os primers utilizados para a amplificação da região alvo foram

5’GGACCCCTGTATCGATTCCT3’ forward e 3’CAAACTCAGGAGAGGGTGGA5’

reverse com 2045pb do tamanho de fragmento localizado entre o exon dois e três do gene.

Para a amplificação do fragmento utilizou-se um touch down com as seguintes condições:

desnaturação inicial de 98°C por 5 minutos, seguido de 20 ciclos com desnaturação a

98°C por 10 segundos, anelamento a 67°C descendo a 57°C variando em -0,5°C a cada

ciclo por 30 segundos e a extensão a 72°C por 3 minutos. Logo após os primeiros ciclos

seguiu-se com mais 20 ciclos para desnaturação a 98°C por 10 segundos, anelamento a

57°C por 30 segundos e a extensão a 72°C por 3 minutos, finalizando com uma extensão

final de 72°C por 5 minutos. Para a amplificação foram utilizados 15 ul de reação de

mistura contendo 0,3 mM de cada iniciador, Taq polimerase (Emeraldamp Max Hs

(Takara Bio, EUA) e 100 ng de DNA molde. A amplificação foi realizada pelo

termociclador Verity® (Applied Biosystems, EUA).

Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 1% e as bandas

amplificadas foram coradas com GelRed (Biotium, EUA). O produto amplificado foi

avaliado quanto à presença de bandas desejadas, utilizando como controle positivo um

pool de DNA de ovelha da raça Santa Inês.

Purificação dos Amplificados

Após a amplificação das amostras, foi realizada a purificação dos amplicons, com

esferas magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA) e volume

recomendado para Agencourt AMPure XP (beads), homogenizando para as beads se

ligarem aos produtos de amplificados. Logo após esta etapa, realizou a purificação das

amostras com etanol 70% para remover os contaminates. Em seguida, o sedimento foi

diluído e as pérolas foram removidas.

As amostras foram diluídas a 2 nM, levando em consideração o tamanho em pares

de base do amplificado. As amostras foram quantificadas com fluorômetro Qubit® (Life

Technologies, USA), sendo diluído para 0,2 ng/μl e encaminhado para o preparo da

biblioteca e em seguida o sequenciamento.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

41

Preparação e sequenciamento das bibliotecas

Para o preparo da biblioteca utilizou-se o kit Nextera® XT DNA Sample

Preparation e Nextera® XT Index (Illumina, San Diego, USA) e todas as etapas foram

realizadas com base no protocolo Nextera XT. O sequenciamento foi realizado na

plataforma MiSeq (Illumina, San Diego, USA) usando o kit MiSeq Reagent Kit v2

(500cycle).

Limpeza e alinhamento das reads

Após o sequenciamento, as qualidades das leituras foram verificadas pelo

software FastQC (www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/). Para a primeira filtragem

de dados, foi utilizado o software SeqyClean, versão 1.3.12 (ZHBANNIKOV et al.,

2013), adotando um parâmetro de qualidade de 24 (Phred score) para cada base e um

comprimento mínimo de 50 pb.

Após filtragem dos dados, foi realizado o alinhamento das reads contra o genoma

referência de ovinos depositado no NCBI Genoma Ovis aries (versão Oar_v4.0), com o

auxílio do programa Bowtie2 (LANGMEAD e SALZBERG, 2012).

Detecção de Polimorfismo

A detecção de polimorfismos (SNPs e INDELS) foi realizada com base na posição

no genoma de referência (Versão Oar_v4.0). Nesta etapa foi utilizado o software

SAMtools, versão 1.4 (LI e DURBIN, 2009). Em seguida, realizou-se a conversão dos

arquivos do formato SAM (do inglês, Sequence Alignment/Map) para o formato BAM.

Logo após fez-se a remoção das duplicatas de PCR, ordenamento das posições das

sequencias e index do arquivo ordenado. A chamada de variantes foi realizada usando a

opção mpileup do SAMtools cobrindo um valor definido para a qualidade do mapeamento

através da referência do genoma (-q20) e qualidade de filtragem ≥ 40 bases na escala de

Phred (-Q40). Finalmente utilizando o comando bcftools para converter o arquivo em

*.bcf para *.vcf, neste passo é executado o filtro que define a leitura de profundidade

máxima dos marcadores para a chamada. Neste caso, mais de 99.999 leituras para essa

variante. Este parâmetro (-D99999) é um valor superestimado para cobertura de variante.

A nomenclatura dos marcadores está de acordo com as regras definidas por

Human Genome Variation Society (HGVs).

42

Anotação estrutural

Por fim, realizou-se a anotação estrutural dos SNPs e INDELs usando a

ferramenta VEP (Variant Effect Predictor) para anotação funcional online, do Ensembl,

para identificar as localizações das mutações nas diferentes regiões do genoma (região

intergênica, exon, intron, sítio de splicing alternativo etc.) e prováveis efeitos funcionais

das variantes.

Determinação das frequências genotípicas e alélicas

As frequências de alelos e genótipos foram estimadas para cada loco por contagem

simples de alelos e genótipos, respectivamente, utilizando-se o software Statistical

Analysis System (SAS, 2004). O teste de Qui-quadrado foi utilizado para comparar as

frequências genotípicas e alélicas entre os dois grupos (Embrapa e UFBA) assumindo 5%

de probabilidade. Para tanto foi utilizado o PROC FREQ (SAS, 2004).

Testes de Associação

Os testes de associação foram realizados com o programa Qxpak 5 (PÉREZ-

ENCISO e MISZTAL, 2011), que realiza um teste razão de verossimilhanças entre um

modelo completo e um modelo reduzido. O modelo completo usado na análise de

variância para detectar o efeito de SNP foi: Y𝑖𝑗𝑘lm = 𝑢 + F𝑖 + Yj + Mk + ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 + β𝑖𝑗𝑘lm

Age + Al + Dm + 𝑒𝑖𝑗𝑘lm Onde: Y𝑖𝑗𝑘lm é o valor fenotípico da característica em análise; u é

a média geral dessa característica; F𝑖, Yj e Mk são efeitos fixos da fazenda, ano e mês de

nascimento, respectivamente; ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 e β𝑖𝑗𝑘lm Age são as covariáveis peso corporal e

idade no abate; Al e Dm são os efeitos aditivo e de dominância, respectivamente; e 𝑒𝑖𝑗𝑘lm

é o resíduo experimental. Já o modelo reduzido foi construído retirando-se do modelo

completo apenas o efeito que se deseja testar. A correção de Bonferroni foi usada para

estabelecer o nível de significância em 0,001391, mas efeitos sugestivos (P<0,05)

também são apresentados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O gene LEP em ovinos tem cerca de 16kb de comprimento e é dividido em 3

exons e dois introns, porém apenas os exons 2 e 3 participam da transcrição da proteína

funcional (HE et al., 1995). No presente estudo foi sequenciado um fragmento com

http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Tools/VEP?db=core

43

2045pb entre os exons dois e três do gene LEP, no qual foram identificados 21

polimorfismos (Tabela 2), sendo que 12 já estão depositados no NCBI e, portanto, nove

novos polimorfismos foram identificados no presente estudo.

O SNP g.92502367C>T é o único que está fixado nos animais do grupo UFBA

(Tabela 2), que são todos homozigotos CC. Os SNPs g.92502821C>T e g.92502987delA

estão praticamente fixados no grupo Embrapa. Sendo que este último também está

praticamente fixado no grupo UFBA. Também foram observadas diferenças (P<0,05)

entre os grupos estudados para as frequências alélicas e genotípicas dos marcadores

g.92501372G>A, g.92501407C>T, g.92501543A>G, g.92502245A>G,

g.92502283T>C, g.92502367C>T, g.92502623G>C, g.92502642A>G, g.92502663T>C,

g.92502821C>T, g.92502922G>T, g.92502947A>C, g.92503024G>A, g.92503025C>T

e g.92503086G>A (Tabela 2). Essas diferenças entre os grupos podem ser devidas a

diferenças no fluxo gênico de cada rebanho. A fazenda da Embrapa mantém um rebanho

fechado a cerca de 30 anos, enquanto os animais do grupo UFBA são oriundos de

rebanhos comerciais abertos. Assim, há variação nas frequências de alguns marcadores

aqui identificados e a resposta ao processo de seleção dependerá muito da frequência do

alelo favorável no rebanho sob seleção.

O SNP g.92501206C>T foi o único polimorfismo localizada em exon, mas é

considerada uma mutação sinônima, pois a troca do nucleotídeo não implica em mudança

de aminoácido, tirosina, na sequência da proteína. Este sNP não influencia, portanto, na

função da proteína sendo considerada uma mutação silenciosa. Polimorfismos no exon-2

do gene LEP vem sendo estudados em diferentes espécies, em especial uma troca C/T em

bovinos (BUCHANAN et al., 2002), a qual provoca a substituição de arginina por cisteína

e está associada a acabamento de gordura na carcaça. Outros autores também vêm

estudando mutações, no mesmo exon, associadas com diversas característica de interesse

zootécnico, como características de crescimento em peixe (WEI et al., 2013).

Polimorfismos em região de exon do gene LEP em ovinos são pouco comuns. Contudo,

Cauveri et al. (2014) estudando o exon 3 do gene LEP em ovinos da raça Nilagiri,

encontraram uma troca C/T com boa distribuição de frequências, sendo 0,77 CC e 0,23

CT, enquanto o genótipo TT não pareceu na população. Já nas raças Dorset e Suffolk,

Boucher et al. (2006) identificaram 3 SNPs, 2 em regiões de intron e 1 na região 3’ UTR

do gene, mas apenas a troca (A/G) no intron teve distribuição genotípica adequada para

realização de testes de associação.

44

Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene LEP

Marcadores Número de Animais

Genótipos

Frequência

genotípica (%) Prob.

(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

existente

(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA

g.92501206C>T*

7 4 CC 6,7 4,7 C 6,7 4,7

- 0 0 CT 0,0 0,0 0,5626 T 93,3 95,3 0,4129

98 82 TT 93,3 95,3

g.92501356A>G**

21 12 AA 20,0 14,0 A 45,2 41,3

rs408463464 53 47 AG 50,5 54,7 0,5642 G 54,8 58,7 0,4313

31 27 GG 29,5 31,4

g.92501372G>A**

76 80 GG 72,4 93,0 G 82,4 96,5

rs419596134 21 6 GA 20,0 7,0 0,0007 A 17,6 3,5 <,0001

8 0 AA 7,6 0,0

g.92501407C>T**

79 29 CC 75,2 33,7 C 86,2 62,2

rs398357543 23 49 CT 21,9 57,0 <0,0001 T 13,8 37,8 <,0001

3 8 TT 2,9 9,3

g.92501438G>A

99 79 GG 94,3 91,9 G 97,1 95,9

rs409675427 6 7 GA 5,7 8,1 0,4966 A 2,9 4,1 0,5042

0 0 AA 0,0 0,0

g.92501543A>G**

19 2 AA 18,1 2,3 A 46,2 21,5

rs421064645 59 33 AG 56,2 38,4 <0,0001 G 53,8 78,5 <0,0001

27 51 GG 25,7 59,3

20 16 GG 19,0 18,6 G 44,3 43,6

g.92501808G>A** 53 43 GA 50,5 50,0 0,9838 A 55,7 56,4 0,8853 rs410864710

32 27 AA 30,5 31,4

85 29 AA 81,0 33,7 A 89,0 62,8

g.92502245A>G** 17 50 AG 16,2 58,1 <0,0001 G 11,0 37,2 <0,0001 rs422219521

3 7 GG 2,9 8,1

http://www.ensembl.org/Ovis_aries/Variation/Explore?db=core;tl=xRSjZL4cMOd2PiKX-1631458;v=rs408463464







45


Continuação


Genótipos

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

existente


g.92502283T>C**

78 30 TT 74,3 34,9 T 85,7 63,4

rs400734857 24 49 TC 22,9 57,0 <0,0001 C 14,3 36,6 <0,0001

3 7 CC 2,9 8,1

g.92502367C>T

87 86 CC 82,9 100,0 C 90,5 100,0

rs423196216 16 0 CT 15,2 0,0 0,0003 T 9,5 0,0 <0,0001

2 0 TT 1,9 0,0

g.92502623G>C**

78 29 GG 74,3 33,7 G 85,7 62,8

- 24 50 GC 22,9 58,1 <0,0001 C 14,3 37,2 <0,0001

3 7 CC 2,9 8,1

g.92502642A>G**

78 51 AA 74,3 59,3 A 85,7 75,0

- 24 27 AG 22,9 31,4 0,0502 G 14,3 25,0 0,0104

3 8 GG 2,9 9,3

90 42 TT 85,7 48,8 T 91,4 69,8

g.92502663T>C** 12 36 TC 11,4 41,9 <0,0001 C 8,6 30,2 <0,0001 -

3 8 CC 2,9 9,3

104 73 CC 99,0 84,9 C 99,5 92,4

g.92502821C>T 1 13 CT 1,0 15,1 0,0002 T 0,5 7,6 0,0002 -

0 0 TT 0,0 0,0

47 66 GG 44,8 76,7 G 68,6 88,4

g.92502922G>T** 50 20 GT 47,6 23,3 <0,0001 T 31,4 11,6 <0,0001 -

8 0 TT 7,6 0,0

77 29 AA 73,3 33,7 A 85,2 62,8

g.92502947A>C** 25 50 AC 23,8 58,1 <0,0001 C 14,8 37,2 <0,0001 -

3 7 CC 2,9 8,1



46


Continuação


Genótipos

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

existente


g.92502987delA***

103 85 CACA 98,1 98,8 CA 98,6 99,4

1 1 CAC 1,0 1,2 0,6584 C 1,4 0,6 0,4236 -

1 0 CC 1,0 0,0

g.92503024G>A**

81 30 GG 77,1 34,9 G 87,1 63,4

21 49 GA 20,0 57,0 <0,0001 A 12,9 36,6 <0,0001 -

3 7 AA 2,9 8,1

g.92503025C>T**

80 30 CC 76,2 34,9 C 86,7 63,4 rs596008192

22 49 CT 21,0 57,0 <0,0001 T 13,3 36,6 <0,0001

3 7 TT 2,9 8,1

g.92503044A>G**

25 14 AA 23,8 16,3 A 46,7 43,0 rs429879457

48 46 AG 45,7 53,5 0,4161 G 53,3 57,0 0,4717

32 26 GG 30,5 30,2

g.92503086G>A**

80 30 GG 76,2 34,9 G 86,7 62,8 rs404287904

22 48 GA 21,0 55,8 <0,0001 A 13,3 37,2 <0,0001

3 8 AA 2,9 9,3

Prob. FG e Prog. FA – Probabilidades do teste qui-quadrado ao comparar os grupos Embrapa e UFBA quanto as frequências genotípicas e alélicas, respectivamente.

ID do cromossomo 4 que se localiza o gene da leptina no genoma de ovinos versão 4.0: NC_019461.2.

ID do gene da leptina no genoma de ovinos versão 4.0: 443534

*Mutação localizada no exon 2

**Marcadores usado no teste de associação

**INDEL




47

No presente estudo, 16 SNP, todos em região de intron, apresentaram frequência

em todos os três genótipos o que permitiu a utilização para estimar os efeitos aditivo e de

dominância nos testes de associação com características de interesse econômico. Apesar

destes SNPs estarem em região de intron, eles podem estar influenciando a expressão do

gene e dessa forma podem potencialmente influenciar características de interesse

econômico. No presente estudo quatro marcadores apresentaram ao menos efeito aditivo

sugestivo (P<0,05) com alguma característica de carcaça e qualidade de carne (Tabela 3),

mas efeitos de dominância não foram significativos (P>0,05).

Tabela 3. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-padrão (EP)

nos testes de associação com polimorfismos no gene LEP

Variável a(EP) LRT Prob.

g.92501372G>A

Peso do Pescoço 0,0964(0,0344) 7,69 0,556E-02

Rendimento de pescoço 0,7331(0,1898) 14,35 0,152E-03*

g.92501543A>G

Rendimento de carcaça quente 1,5847 (0,6990) 5,07 0,244E-01

Rendimento de carcaça fria 1,5133 (0,6837) 4,83 0,279E-01

Comprimento interno da carcaça 0,9147 (0,3731) 5,91 0,150E-01

Rendimento de perna -1,5589 (0,7238) 4,58 0,324E-01

Rendimento biológico 1,6453(0,5597) 8,13 0,436E-01

g.92502947A>C

Rendimento Verdadeiro -1,5064(0,5927) 6,17 0,130E-01

g.92503024G>A

Escore de Terminação de carcaça 0,1607 (0,0641) 6,18 0,129E-01

g. 92503044A>G

Intensidade de brilho (L*) -1.0885 (0.4349) 6,16 0,131E-01

Intensidade de amarelo (b*) -0.4449 (0.1903) 5.39 0.203E-01

LRT - Likelihood ratio test; Prob - Probabilidade do teste LRT

*Efeito significativo ao nível da correção de Bonferroni (P<0,001593)

O SNP g.92501372G>A apresentou efeito aditivo significativo ao nível da

correção de Bonferroni (P<0,001593) para rendimento de pescoço, e efeito aditivo

sugestivo (P<0,05) para peso do pescoço (Tabela 3). O alelo A foi o responsável por

aumentar o peso e o rendimento de pescoço e este alelo teve maior frequência no grupo

Embrapa quando comparado ao grupo UFBA (Tabela 2). O corte de pescoço não possui

grande valor comercial no mercado da carne ovina, logo em um processo de seleção o

alelo favorável seria o G. Este alelo está em grande frequência nos grupos estudados

(Tabela 2), pois 72,4% e 93% dos animais apresentam genótipo GG nos grupos Embrapa

e UFBA, respectivamente.

48

Já o SNP g.92501543A>G apresentou efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para os

rendimentos de carcaça quente e fria, comprimento interno da carcaça, rendimento de

pernil e rendimento biológico (Tabela 3). Neste caso o alelo A aumentou a média de todas

as variáveis, exceto o rendimento de pernil. Logo a seleção de animais AA pode ajudar a

ampliar os rendimentos de carcaça e biológico, mas a seleção para esse genótipo pode

diminuir o rendimento de pernil, o que não é desejável. A raça Santa Inês é formada por

animais que apresentam em média pernil com pouco desenvolvimento muscular (JUCÁ

et al., 2016), logo, ampliar o rendimento deste corte é um objetivo de seleção na raça.

Portanto, a informação desta associação deve ser considerada com cuidado nos processos

de seleção para evitar perdas de qualidade de carcaça, seja por diminuição do seu

rendimento ou por queda no rendimento de pernil. Ainda no contexto de rendimento, o

SNP g.92502947A>C teve efeito sobre o rendimento verdadeiro. Neste caso o alelo C

aumenta o valor médio dessas variáveis. As frequências genotípicas e alélicas desse

marcador diferem entre os grupos Embrapa e UFBA. Contudo, em ambos os grupos a

frequência do alelo C é consideravelmente menor que a do alelo A. Logo, trata-se de mais

um alelo favorável com baixa frequência e que, portanto, apresenta amplo espaço para a

seleção e obter ganhos com a ampliação de sua frequência.

Até o presente momento não é do conhecimento dos autores do presente estudo

que os rendimentos de carcaça ou de cortes nobres da carcaça e qualidade de carne

tenham sido avaliados em estudos de associação com ovinos. Contudo, Barzehkar et al.

(2009) reportaram associação de um polimorfismo no intron 2 de ovinos (A113G) com

peso de carcaça fria em ovinos das raças Iranianas Shal e Zel. Esse achado é um forte

indício de que os efeitos aditivos aqui encontrados para os SNP g.92501372G>A,

g.92501543A>G e g.92502947A>C, apesar de em muitos casos serem apenas sugestivos

(P<0,05), são de fato verdadeiros. Além disso, os efeitos de polimorfismos no gene LEP

sobre peso vivo e ganhos de peso em ovinos, reportados por Shojaei et al., (2010),

Tahmoorespur et al., (2010) e Hajihosseinlo et al., (2012), também são forte indício que

este gene pode ter efeito sobre características de carcaça em ovinos, pois estas variáveis

geralmente estão correlacionadas com peso vivo.

O SNP g.92503024G>A apresentou efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre

escore de acabamento da carcaça, tendo o alelo G aumentado o valor desse escore. Este

alelo tem grande frequência nos dois grupos estudados, sendo maior no grupo Embrapa.

O escore de acabamento de carcaça aqui avaliado é uma medida do nível de gordura

subcutânea na carcaça. A espessura de gordura subcutânea em ovinos Santa Inês é

49

pequena (JUCÁ et al., 2016) e geralmente inferior àquela observada em raças lanadas.

Isso é um problema para abate de animais jovens, pois a falta de gordura recobrindo a

carcaça pode causar perda de qualidade na carcaça durante o resfriamento. Assim, a

seleção de animais com o genótipo GG pode ajudar a ampliar a gordura de acabamento

na raça Santa Inês. As frequências desse genótipo são altas tanto no grupo Embrapa

quanto no grupo UFBA (Tabela 2), indicando que a raça tem um grande número de

animais com esse genótipo, mas essa frequência pode ser ampliada, pois também há

muitos animais AG nos dois grupos avaliados (Tabela 2).

Por fim, o SNP g. 92503044A>G teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre a

luminosidade da carne (L*) e intensidade da cor amarela (b*) (Tabela 3). O alelo G foi o

responsável pelo aumento dos valores dessas variáveis e as frequências alélicas e

genotípicas não diferem entre os dois grupos estudados (Tabela 2). A frequência do alelo

G é um pouco mais alta que a doa alelo A, mas ambos estão presentes em grande

frequência nos grupos estudados. Fatores como alimentação, pH, idade e raça

influenciam a cor da carne em ovinos (AMSA 2012) e por isso espera-se ampla variação

de valores dessas variáveis de cor, mesmo dentro de uma determinada raça.

Boucher et al. (2006) foi o primeiro estudo a reportar associação de polimorfismos

no gene LEP com características de interesse econômico em ovinos. Eles avaliaram

apenas três polimorfismos nas raças Suffolk e Dorset, sendo dois SNP no Intron 2

(A103G e C154T) e um na região 3’URT (C617G), tendo identificado associação do SNP

A103G com espessura de gordura subcutânea obtida por ultrassonografia do músculo

Longissimus dorsi. Apesar do polimorfismo reportado por Boucher et al. (2006) não ser

o mesmo avaliado no presente estudo, esse achado reforça a ideia de que o efeito aqui

encontrado seja real, apesar de não ter sido significativo a nível da correção de

Bonferroni. Barzehkar et al. (2009) também reportaram polimorfismo no intron 2 do gene

LEP (A113G) em ovinos da raça iraniana Shal associado a gordura corporal total e

deposição de gordura na calda. Esse achado é mais uma evidência de que polimorfismo

em região de intron do gene LEP de ovinos podem afetar deposição de gordura nesta

espécie. Além disso, em outras espécies como bovinos (OPRZADECK et al., 2005) e

suínos (FLORIS et al., 2004) também há relatos de efeito de polimorfismo em região de

intron do gene da Leptina afetando gordura subcutânea. Os estudos de expressão gênica

e de concentração plasmática de leptina em tecido adiposo também reforçam os achados

do presente estudo. Kumar et al. (1998) indicam que a expressão do RNAm da Leptina é

ligeiramente maior na gordura subcutânea de cordeiros, do que nas gorduras omental e

50

perirenal. Altman et al. (2006a) demonstraram que concentrações plasmáticas de Leptina

estão correlacionadas com tamanho das células de gordura em ovinos, mas (2006b)

reportam que o nível plasmático de Leptina está mais associado com gordura visceral do

que com gordura na carcaça de ovinos. Por outro lado, alta correlação entre a Leptina

plasmática e a gordura subcutânea (0,76) foi reportada por Bellman et al. (2004) em

bovinos da raça Charolês. Logo, há evidências de que a Leptina pode ter relação com a

gordura na carcaça de animais domésticos e por isso polimorfismos neste gene podem

ser uma útil informação no processo de seleção destes animais para terminação de

carcaça.

Os efeitos aditivos aqui reportados foram causados por mutações localizadas em

intron e não temos como afirmar neste momento qual o mecanismo de ação que essas

mutações utilizaram para afetar essas características. Uma possível hipótese é que essas

mutações estejam em desequilíbrio de ligação com mutações em região de exon, no

próprio gene LEP ou em outro gene próximo. Também não se pode descartar a hipótese

de que essas mutações em intron sejam de fato funcionais, pois mutações nos sítios de

junção de exon-intron (KRAWCZAK et al., 2006) ou mesmo afastadas deste sitio

(COOPER, 2010), mais ainda dentro de região de intron, podem afetar a transcrição do

gene ou a eficiência do splicing. Saravanaperumal et al., (2012) cita que um evento de

splicing no intron 5 do gene SCF (Stem cell factor) em ovinos levou a formação de dois

tipos de proteína SCF, uma solúvel e outra insolúvel, as quais possuem número diferente

de aminoácidos. Assim, maiores estudos devem ser desenvolvidos em busca de

identificar o mecanismo de ação que essas mutações em intron do gene LEP utilizam para

influenciar características de interesse econômico em ovinos.

CONCLUSÃO

O gene LEP em ovinos Santa Inês apresenta pelo menos 21 mutações em relação

a sequência do gene depositado no NCBI, sendo nove dessas mutações reportadas pela

primeira vez em ovinos.

O SNP g.92501206C>T foi o único polimorfismo localizado em exon, mas trata-

se de uma mutação sinônima, visto que a troca do nucleotídeo não altera o aminoácido na

sequência da proteína. Portanto, as regiões de Exon do gene LEP aparentemente estão

bem conservadas em ovinos Santa Inês.

Os SNP g.92501372G>A, g.92501543A>G, g.92502947A>C, g.92503024G>A e

g. 92503044A>G apresentaram efeito aditivo para pelo menos uma característica de

51

carcaça ou qualidade de carne aqui avaliada e, portanto, fornecem informações que

podem ser úteis para programas de seleção de ovinos da raça Santa Inês.

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55

Capítulo 2



56



RESUMO

Polimorfismos nos genes do hormônio do crecimento (GH) e do fator de

crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1) vem sendo testados para saber se estão

associados a caracteristicas de interesse econômico em animais de produção. Porém,

estudos dessa natureza com ovinos ainda são raros. Assim, este estudo teve como objetivo

identificar polimorfismos nos genes GH e IGF1 em ovinos da raça Santa Inês e testar se

estão associados ao pH pós-abate (pH0) e 24 horas post mortem (pH24), área de olho de

lombo do músculo Longissimus, caracterização cromática da carne (L*, a* e b*), força

de cisalhamento, perda de peso por cocção, pesos e aos rendimentos de carcaças quente

e fria, pesos e rendimentos de pescoço, perna, costelas, paleta e lombo, comprimentos

externo e interno da carcaça, comprimento da perna, larguras da carcaça nas regiões do

peito e da garupa, além de escores de conformação e acabamento de gordura da carcaça.

Dezoito polimorfismos foram identificados em região de intron do gene IGF1 e 21 no

gene GH, sendo 18 em intron e três em exon. Dentre os SNPs localizados no gene IGF1,

g.171108499T>G, g.171110428C>T, g.171111426G>A e g.171112496C>T tiveram

efeito sugestivo (P<0,05) para pelo menos uma das características em estudo. Além disso,

o SNP g.171108499T>G teve efeito significativo ao nível da correção de Bonferroni

(P<0,002023) para peso de carcaça fria e para os rendimentos de carcaça quente e fria. Já

para os SNPs localizados no gene GH, g.47486424T>C e g.47486819C>A apresentaram

efeito sugestivo (P<0,05) para diversas características. Além disso, observou-se efeito

significativo ao nível da correção de Bonferroni (P<0,002023) do SNP g.47486424T>C

sobre rendimento da perna e do SNP g.47486819C>A sobre peso e rendimento de costela,

peso e rendimento de lombo, peso de paleta e peso de perna. Logo, os genes IGF1 e GH

possuem mutações que podem fornecer importantes informações para o processo de

seleção da raça Santa Inês para melhoria de carcaça.

Palavras-chave: carcaça, ovinocultura, seleção, SNP, sequenciamento

57

Polymorphisms in the GH and IGF1 genes associated with meat and carcass traits

in Santa Ines sheep

ABSTRACT

Polymorphisms in the growth hormone (GH) and insulin-like growth factor-1 (IGF1)

genes have been tested to determine if they are associated with economic traits in farm

animals. However, studies of this nature with sheep are still rare. Thus, this study aimed

to identify polymorphisms in the GH and IGF1 genes in Santa Ines sheep and to test

whether they are associated with pH post-slaughter (pH0) and 24 hours post-mortem

(pH24), area of the Longissimus muscle, color parameters (L*, a* and b*), shear force,

weight loss by cooking, weights and yields of hot and cold carcasses, weights and yields

of neck, leg, ribs, shoulder and loin, external and internal carcass lengths, leg length,

carcass widths in the breast and croup regions, as well as conformation carcass score and

finishing carcass score. Eighteen polymorphisms were identified in the intron region of

the IGF1 gene, and 21 in the GH gene (18 in intron and 3 in exon). Among the SNPs

located in the IGF1 gene, g.171108499T>G, g.171110428C>T, g.171111426G>A and

g.171112496C>T had a suggestive effect (P<0.05) for at least one of the carcass and meat

traits under study. In addition, SNP g.171108499T>G had a significant effect (P

<0.002023) for cold carcass weight and for hot and cold carcass yields. For the SNPs in

the GH gene, g.47486424T>C and g.47486819C>A presented at least suggestive effect

(P<0.05) for several carcass traits. In addition, significant effect (P<0.002023) of the SNP

g.47486424T>C on leg yield and of the SNP g.47486819C>A on weights and yields of

rib and loin, and shoulder and leg weights were observed. Therefore, in the genes IGF1

and GH there are mutations that can provide important information for the selection of

the Santa Ines breed for improve meat and carcass traits.

Key words: carcass, ovine breeding, selection, SNP, sequencing

58

INTRODUÇÃO

Ovinos Santa Inês são deslanados e apresentam duas importantes características

para criação em sistema tropical, pois são mais resistentes ao calor (MCMANUS et al.,

2009) e a endoparasitos (MEXIA et al., 2011) que algumas raças lanadas. Seu

desempenho em sistema de criação a pasto (JUCÁ et al., 2014) e seus atributos de carne

(COSTA et al., 2015) e de carcaça (JUCÁ et al., 2016) foram objeto de estudo, onde é

possível observar que a raça necessita de seleção para aprimoramento das características

de carcaça. Contudo, essas variáveis são difíceis de melhorar pelos métodos clássicos de

seleção, pois apesar de terem coeficientes de herdabilidade de moderada a alta magnitude

(MORTIMER et al., 2010), são variáveis de difícil avaliação in vivo. Marcadores

moleculares podem auxiliar a seleção, ao identificar quais animais que apresentam

genótipo favorável para um determinado atributo de carcaça.

Polimorfismos nos genes do hormonio de crescimento (GH) e do fator de

crescimento semelhante a insulina 1 (IGF1) podem conter boas informações para o

processo de seleção, pois tratam-se de moleculas que estão envolvidas em diversas etapas

do metabolismo. Assim, alguns polimorfismos no gene GH em ovinos foram testados

para associação com peso vivo e medidas morfométricas (TAHMOORESPUR et al.,

2011; MORADIAN et al., 2013; JIA et al., 2014; MALEWA et al., 2014;

HAJIHOSSEINLO et al., 2015; CAUVERI et al., 2016; HAN et al., 2016; DEPISON et

al., 2017; e ABDELMONEIM et al. 2017), produção de leite (MARQUES et al., 2006;

VACCA et al., 2013; DETTORI et al., 2015), produção e qualidade de lã (FARAG et al.,

2016) e características de carcaça (GORLOV et al., 2017). Apesar de já haver prévios

estudos de associação entre polimorfismos no gene GH e características de carcaça em

ovinos, muitos fenótipos ainda não foram avaliados w polimorfismos em uma raça podem

não estar segregando em outra raça.

Polimorfismos no gene IGF1 foram testados para associação com persistência de

lactação (SCATÀ et al., 2010), prolificidade (HE et al., 2012) e variáveis de crescimento

(GHOLIBEIKIFARD et al., 2013; PROSKURA e SZEWCZUK, 2014; TRUKHACHEV

et al., 2016; NAZARI et al, 2016). Apesar de não haver relatos de polimorfismos

associados a características de carcaça em ovinos, níveis de expressão do IGF1 foram

associados com características de carcaça nesta espécie (SU et al., 2014; e SUN et al.,

2014). Além disso, Islam et al (2009) é um dos estudos que reportaram efeitos de

polimorfismos no gene IGF1 sobre características de carcaça em bovinos de corte.

Portanto, o gene IGF1 também é um potencial candidato para estudos de associação com

59

características de carcaça em ovinos e deve ser mais explorado em testes de associação.

Assim, o objetivo deste estudo foi identificar polimorfismos nos genes GH e IGF1 em

ovinos Santa Inês, descrever suas freqüências gênicas e genotípicas e testar se estão

associados com características de qualidade de carcaça.

MATERIAL E MÉTODOS















(%) = PCF/PV x 100.





características.







60



































61






















Uma amostra de 5 ml de sangue foi coletada em tubos vacutainer com EDTA,

sendo armazenadas e refrigerados a 4 ºC. Para extrair leucócitos foi seguido o protocolo

descrito por Oliveira et al., (2007). Os leucócitos foram encaminhados à Escola Superior

de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ / USP, onde foi realizada a extração do DNA

genômico, seguida da amplificação da região estudada e subsequentemente da preparação

da biblioteca. A extração de DNA foi realizada segundo Oliveira et al., (2007).

As regiões gênicas alvo foram escolhidas aleatoriamente e tendo em conta o

tamanho do gene e a distância entre os exons. O desenho dos primers para amplificação

dos fragmentos dos genes GH e IGF1 foi feito com base na sequência disponível no banco

de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) para o genoma de

ovinos (Ovis aries, versão Oar_v4.0).

62




































pH0 106 6,67 0,19

pH24 101 5,57 0,19


O desenho do primer foi realizado a partir do programa Primer 3

(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/), que gerou as possíveis sequências dos

oligonucleotídios. Para testar a qualidade das sequências geradas e a escolha do primer,

utilizou-se o net primer (http://www.premierbiosoft.com). Após a escolha dos melhores

primers forward e reverse de cada gene (Tabela 1), foi realizado o BLAST (Basic Local



63

Alignment Search Tool), que é utilizado como uma ferramenta de busca para o

alinhamento das sequências no NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), para

confirmar a similaridade com a espécie Ovis aries e a região desejada.

Os ciclos de amplificação e os fragmentos de genes estão descritos na Tabela 1.

Para a amplificação foram utilizados 15 ul de reação de mistura contendo 0,3 mM de cada

iniciador, Taq polimerase (Emeraldamp Max Hs (Takara Bio, EUA)) e 100 ng de DNA

molde. A amplificação foi realizada pelo termociclador Verity® (Applied Biosystems,

EUA).

Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 1% e as bandas

amplificadas foram coradas com GelRed (Biotium, EUA). O produto amplificado foi

avaliado quanto à presença de bandas desejadas contendo o número de pares de bases

indicados na Tabela 2, utilizando como controle positivo um pool de DNA de ovelha da

raça Santa Inês.


Após a amplificação das amostras, foi realizada a purificação dos amplicons. Para

a purificação utilizou-se esferas magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter,

USA), com o volume recomendado do Agencourt AMPure XP (beads) para o volume de

amostra, homogenizando bem para as beads se ligarem aos produtos de amplificados.

Logo após esta etapa, com o auxilio de uma placa magnetica, fez-se a lavagem das beads

mais os produtos de amplificados, utilizando etanol 70% para remover os contaminates.

Em seguida, o sedimento foi diluído e as pérolas foram removidas.

As amostras foram diluídas para 2 nM, levando em consideração o tamanho em

pares de base do amplificado. Logo após juntou-se as amostras em um pool com os genes

estudados. O pool foi quantificado com fluorômetro Qubit® (Life Technologies, USA),

sendo diluído para 0,2 ng/μl e encaminhado para o preparo da biblioteca e em seguida

para o sequenciamento.


64

Tabela 2. Primers Forward (F) e reverse (R) e ciclos de amplificação das regiões investigadas em cada gene

Primer Tamanho do amplificado

(bp)

Localização do primer no

genome ovino Ciclos de amplificação

IGF1-F GTG CTG CTT TTG TGA TTT CTT G 4550 Cromossomo 3 => Exon 1-2 1

IGF1-R GAT AGA AGA GAT GCG AGG AGG A

GH-F GCT GCT GAC ACC TTC AAA GA 1194 Cromossomo 11 => Exon 1-5 3

GH-R TGA CCC TCA GGT ACG TCT CC

Ciclo 1: PCR Touch-down – desnaturação inicial: 98 °C / 5 minutos, seguida de 10 ciclos de desnaturação a 98 °C / 10 segundos, anelamento de 61 °C a 56

°C, reduzindo -0.5°C a cada ciclo, por 30 segundos e extensão a 72 °C / 4 minutos. Seguindo de mais 30 ciclos com temperatura de desnaturação em 98 °C /10

segundos, anelamento a 56 °C / 30 segundos e extensão a 72 °C / 4 minutos, finalizando com extensão a 72 °C / 5 minutos;

Ciclo 2: PCR Touch-down – desnaturação inicial: 98 °C / 5 minutos, seguida de 20 ciclos de desnaturação a 98 °C / 10 segundos, anelamento de 63 °C a 53

°C, reduzindo -0.5°C a cada ciclo, por 30 segundos e extensão a 72 °C / 1 minuto. Seguindo de mais 20 ciclos com temperatura de desnaturação em 98 °C /10

segundos, anelamento a 53 °C / 30 segundos e extensão a 72 °C / 1 minuto, finalizando com extensão a 72 °C / 5 minutos;

65


Para o preparo da biblioteca utilizou-se o kit Nextera® XT DNA Sample Preparation e

Nextera® XT Index (Illumina, San Diego, USA) e todas as etapas foram realizadas com base

no protocolo Nextera XT. O sequenciamento foi realizado na plataforma MiSeq (Illumina, San

Diego, USA) usando o MiSeq Reagent Kit v2 (500cycle).


Após o sequenciamento, as qualidades das leituras foram verificadas pelo software

FastQC (www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/). Para a primeira filtragem de dados, foi

utilizado o software SeqyClean versão 1.3.12 (ZHBANNIKOV et al., 2013) assumindo um

parâmetro de qualidade de 24 (Phred score) para cada base e um comprimento mínimo de 50

pb.

Após filtragem dos dados, foi realizado o alinhamento das reads contra o genoma

referência de ovinos depositado no NCBI Genoma Ovis aries (Oar_v4.0), com o auxílio do

programa Bowtie2 (LANGMEAD e SALZBERG, 2012).


Por fim realizou-se a anotação estrutural dos SNPs e INDELs usando a ferramenta

VEP (Variant Effect Predictor) para anotação funcional online, do Ensembl, para identificar as

localizações das mutações nas diferentes regiões do genoma (região intergênica, exon, intron,

sítio de scpling alternativo etc.) e prováveis efeitos funcionais das variantes.


A detecção de polimorfismos (SNPs e INDELS) foi feita em cada um dos genes

selecionados com base na sua posição no genoma de referência (Oar_v4.0): IGF1 (171108381-

171112721 bp) e GH (47485801-47486981 pb). Nesta etapa foi utilizado o software SAMtools

- versão 1.4 (LI e DURBIN, 2009). Posteriormente, realizou-se a conversão dos arquivos em

formato SAM para o BAM. Logo após fez-se a remoção das duplicatas de PCR, ordenamento

das posições das sequencias e index do arquivo ordenado. A chamada de variantes foi realizada

usando a opção do comando mpileup do SAMtools cobrindo um valor definido para a qualidade

do mapeamento através da referência do genoma (-q20) e qualidade de filtragem ≥ 40 bases na

escala de Phred (-Q40). Finalmente, foi utilizada a opção de comando bcftools para converter

o arquivo em *.bcf para *.vcf, este passo é executado o filtro que define a leitura de


66

profundidade máxima dos marcadores para a chamada, neste caso, mais de 99.999 leituras para

essa variante.

Para nomear os polimorfismos foi utilizada as regras definidas pelo Human Genome

Variation Society (HGVs).

Determinação das frequências genotípicas e alélicas e testes estatísticos


simples de alelos e genótipos, respectivamente, utilizando-se o software Statistical Analysis

System (SAS, 2004). O teste de Qui-quadrado foi utilizado para comparar as frequências

genotípicas e alélicas entre os dois grupos (Embrapa e UFBA) assumindo 5% de probabilidade.

Para tanto foi utilizado o PROC FREQ (SAS, 2004).


Os testes de associação foram realizados com o programa Qxpak 5 (PÉREZ-ENCISO e

MISZTAL, 2011), que realiza um teste razão de verossimilhanças entre um modelo completo

e um modelo reduzido. O modelo completo usado na análise de variância para detectar o efeito

de SNP foi: Y𝑖𝑗𝑘lm=𝑢+F𝑖+Yj+Mk+∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊+β𝑖𝑗𝑘lmAge+Al+Dm+𝑒𝑖𝑗𝑘lm Onde: Y𝑖𝑗𝑘lm é o valor

fenotípico da característica em análise; u é a média geral dessa característica; F𝑖, Yj e Mk são

efeitos fixos da fazenda, ano e mês de nascimento, respectivamente; ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 e β𝑖𝑗𝑘lm Age são

as covariáveis peso corporal e idade no abate; Al e Dm são os efeitos aditivo e de dominância,

respectivamente; e 𝑒𝑖𝑗𝑘lm é o resíduo experimental. Já o modelo reduzido foi construído

retirando-se do modelo completo apenas o efeito que se deseja testar. A correção de Bonferroni

foi usada para estabelecer o nível de significância em 0,002023 e associações com P<0,05 são

apresentadas e consideradas como sendo sugestivas.


Um total de 20 amostras do gene IGF1 não amplificaram, o que pode ser devido a

alguma mutação na região de alinhamento dos primers, nestes animais. Assim, 171 animais

foram sequenciados para o gene IGF1 e 191 animais para os genes GH. Após o controle de

qualidade, 18 polimorfismos foram identificados no gene IGF1 (Tabela 3) e 21 no gene GH

(Tabela 4), o que levou a uma densidade de 0,24 marcadores / Kb no gene IGF1 e de 11,13

marcadores / Kb no gene GH. Todos os 18 marcadores identificados no gene IGF1 estão

localizados no intron 1 e quatro deles (g.171108609C>A, g.171109001delA, g.171109002A>G

67

e g.171112488delCA) ainda não haviam sido depositados no NCBI. Já para o gene GH, 18

SNPs estão em intron e três em exon, sendo que os marcadores g.47485910G>C,

g.47486448T>G, g.47486453C>A, g.47486604G>A, g.47486832T>C, g.47486837A>T e

g.47486910G>T ainda não haviam sido depositados no NCBI.

Com relação ao gene IGF1, os polimorfismos g.171112440C>T e g.171112488delCA

estavam fixados no grupo UFBA (Tabela 3), da mesma forma que o SNP g.171109002A>G no

grupo Embrapa. Estas diferenças podem ocorrer devido a uma característica destes dois

rebanhos, enquanto a Embrapa é um rebanho fechado a mais de 30 anos, os animais do grupo

UFBA são provenientes de rebanhos comerciais abertos. Observa-se ainda que as frequências

genotípicas e alélicas dos marcadores g.171108499T>G, g.171108609C>A, g.171109151T>C,

g.171110428C>T, g.171110492C>T, g.171111015T>G, g.171111287C>T, g.171112440C>T

e g.171112488delCA, diferem (P<0,05) entre os rebanhos analisados (Tabela 3).

Os introns são sequências presentes no DNA que são transcritas em RNA total, mas em

uma das etapas do processo de maturação (splicing) são descartadas, não fazendo parte do RNA

mensageiro (mRNA). Sendo assim, os intron não codificam aminoácidos e não colaboram para

a formação de uma proteína. Porém Lewin (2004) cita que uma mutação no intron pode

influenciar a união dos exons inibindo o splicing e impedindo assim a formação do mRNA.

Portanto, apesar de muitos dos SNPs identificados estarem em região de intron, eles podem

estar envolvidos com mutações nas regiões regulatória do gene ou de genes próximos. Seis

marcadores do gene IGF1 (g.171108499T>G, g.171109262T>C, g.171110428C>T,

g.171111287C>T, g.171111426G>A e g.171112496C>T) apresentaram os três genótipos

possíveis e uma frequência (Tabela 3) que permitia estimar os efeitos aditivo e de dominância.

Por isso, estes foram os marcadores do IGF1 utilizados nos testes de associação.

Na Tabela 4 são apresentados os 21 marcadores identificados no gene GH. Os

polimorfismos g.47486149A>C, g.47486453C>A e g.47486781G>T estavam fixados nos

animais da UFBA, enquanto o SNP g.47486837A>T estavam fixados no grupo Embrapa,

indicando que para este gene também há variação genética entre os grupos estudados.

Observou-se ainda que os grupos UFBA e Embrapa diferem (P<0,05) quanto a frequências

genotípicas e alélicas dos marcadores g.47486059G>A, g.47486149A>C, g.47486322C>T,

g.47486453C>A, g.47486604G>A, g.47486781G>T, g.47486819C>A, g.47486832T>C,

g.47486837A>T, g.47486896A>G e g.47486914G>A (Tabela 4).

68

Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene IGF1

Marcadores Número de Animais Genótipos

Frequência


(FG)

Alelo

Frequência alélica

(%) Prob.

(FA)

Variação

existente no

NCBI Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA

g.171108499T>G*

58 34 TT 67,4 40,0

0,0015

T 81,4 65,3

0,0008

24 43 TG 27,9 50,6 G 18,6 34,7 rs430457475

4 8 GG 4,7 9,4

g.171108609C>A

82 50 CC 95,3 58,8

<0,0001

C 97,7 79,4

<0,0001

4 35 CA 4,7 41,2 A 2,3 20,6 -

0 0 AA 0,0 0,0

g.171109001delA**

83 84 GAGA 96,5 98,8

0,3173

GA 98,3 99,4

3 1 GAA 3,5 1,2 A 1,7 0,6 0,3201 -

0 0 AA 0,0 0,0

g.171109002A>G

86 82 AA 100,0 96,5

0,2134

A 100,0 97,6

0 2 AG 0,0 2,4 G 0,0 2,4 0,0430 -

0 1 GG 0,0 1,2

g.171109151T>C

9 0 AA 10,5 0,0

0,0058

A 10,5 0,6

0 1 AC 0,0 1,2 C 89,5 99,4 <0,0001 rs410261231

77 84 CC 89,5 98,8

g.171109262T>C*

52 58 TT 60,5 68,2

0,5692

T 75,0 80,0

0,2683

25 20 TC 29,1 23,5 C 25,0 20,0 rs421621914

9 7 CC 10,5 8,2

79 82 CC 91,9 96,5 C 95,3 97,6

g.171110364C>G 6 2 CG 7,0 2,4 0,3588 G 4,7 2,4 0,2481 rs401398263

1 1 GG 1,2 1,2

28 12 CC 32,6 14,1 C 56,4 40,0

g.171110428C>T* 41 44 CT 47,7 51,8 0,0081 T 43,6 60,0 0,0024 rs412470350

17 29 TT 19,8 34,1

http://www.ensembl.org/Ovis_aries/Variation/Explore?db=core;tl=sN8036zWJsm1Mw22-3166535;v=rs430457475





69


Continuação


Frequência


(FG)

Alelo


(%) Prob.

(FA)

Variação

existente no


g.171110492C>T

71 80 CC 82,6 94,1

0,0187

C 91,3 97,1

0,0228 rs402300271 15 5 CT 17,4 5,9 T 8,7 2,9

0 0 TT 0,0 0,0

g.171110600G>A

69 56 GG 80,2 65,9

0,0602

G 90,1 81,8

0,0262 rs418030625 17 27 GA 19,8 31,8 A 9,9 18,2

0 2 AA 0,0 2,4

g.171110688C>T

67 56 CC 77,9 65,9

0,0602

C 89,0 81,8

0,0599 rs425204511 19 27 CT 22,1 31,8 T 11,0 18,2

0 2 TT 0,0 2,4

g.171110860G>T

73 63 GG 84,9 74,1

0,1216

G 92,4 85,9

0,0509 rs403521045 13 20 GT 15,1 23,5 T 7,6 14,1

0 2 TT 0,0 2,4

g.171111015T>G

10 1 TT 11,6 1,2

0,0053

T 11,6 1,2

<0,0001 rs414846691 0 0 TG 0,0 0,0 G 88,4 98,8

76 84 GG 88,4 98,8

g.171111287C>T*

57 33 CC 66,3 38,8

0,0015

C 80,2 64,7

0,0013 rs430449367 24 44 CT 27,9 51,8 T 19,8 35,3

5 8 TT 5,8 9,4

18 7 GG 20,9 8,2

0,0633

G 37,2 27,1

0,0445 rs409110739 g.171111426G>A* 28 32 GA 32,6 37,6 A 62,8 72,9

40 46 AA 46,5 54,1

74 85 CC 86,0 100,0

0,0017

C 92,4 100,0

0,0003 rs421570650 g.171112440C>T 11 0 CT 12,8 0,0 T 7,6 0,0

1 0 TT 1,2 0,0









70


Continuação


Frequência


(FG)

Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

existente no


g.171112488delCA**

80 85 CCACCA 93,0 100,0

0,0132

CCA 96,5 100,0

6 0 CCAA 7,0 0,0 A 3,5 0,0 0,0140 -

0 0 AA 0,0 0,0

g.171112496C>T*

58 47 CC 67,4 55,3 C 78,5 73,5

19 31 CT 22,1 36,5 0,1179 T 21,5 26,5 0,2828 rs400113576

9 7 TT 10,5 8,2


ID do cromossomo 3 que se localiza o gene IGF1 no genoma de ovinos versão 4.0: NC_019460.2.

ID do gene IGF1 no genoma de ovinos versão 4.0: 443318

*Marcadores usado no teste de associação

**INDEL


71

Dentre os SNP detectados em região de exon do gene GH, o SNP g.47485910G>C é

uma mutação silenciosa localizada no Exon 5, pois a troca de base não altera o aminoácido

Treonina na sequência da proteína, enquanto as outras duas mutações em exon são não

sinônimas. As mutações não sinônimas são aquelas onde a troca do nucleotídeo muda a

sequência de aminoácidos na proteína, podendo ocorrer alteração da função da proteína. As

mutações não sinônimas podem ser classificadas em tolerável (quando a estrutura química do

novo aminoácido é similar ao anterior) ou não tolerável (quando os aminoácidos possuem

natureza química diferente) utilizando o escore SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) que é

gerado no programa VEP (Variant Effect Predictor) do Ensembl. O escore SIFT prediz se uma

troca de aminoácidos afeta a função da proteína. O SNP que apresenta o SIFT > 0,05 é

considerado tolerável, pois sua troca não vai alterar a função da proteína, mas mutações com

SIFT ≤ 0,05 são consideradas não toleráveis, uma vez que a troca de aminoácidos altera a

função da proteína podendo até inativar sua função (NG e HENIKOFF, 2003).

O SNP g.47486322C>T foi localizado no Exon 4 e pode ser considerado uma mutação

tolerável, pois seu escore SIFT foi 0,22, o que indica que a troca de Valina por Isoleucina na

sequência da proteína não prejudica a função da proteína. Já o SNP g.47486736C>T localizado

no Exon 3 pode ser considerado não tolerável, pois seu score SIFT foi 0,01, o que indica que a

troca do aminoácido arginina por histidina pode afetar a função da proteína.

No tocante aos testes de associação realizados com polimorfismos localizados no gene

IGF1, foram encontrados efeitos sugestivos (P<0,05) dos SNP g.171110428C>T,

g.171111426G>A e g.171112496C>T para perímetro da carcaça na região da garupa,

intensidade da cor vermelha (a*), intensidade da cor amarelo (b*), rendimento de costela e peso

do pescoço (Tabela 5). Já o SNP g.171108499T>G teve efeito significativo (P<0,002023) para

peso de carcaça fria e para os rendimentos de carcaça quente e fria (Tabela 5), além de efeitos

sugestivos (P<0,05) para comprimento interno da carcaça e peso de paleta.

72

Tabela 4. Frequências genotípica e alélica dos marcadores identificados no gene GH


Frequência


(FG)

Alelo


(%) Prob.

(FA)

Variação

existente no


g.47485910G>C

103 85 GG 97,2 98,8

0,6114

G 98,1 99,4

0,2618

2 1 GC 1,9 1,2 C 1,9 0,6 -

1 0 CC 0,9 0,0

g.47485969G>A

103 82 GG 97,2 95,3

0,5032

G 98,6 97,7

0,5072

3 4 GA 2,8 4,7 A 1,4 2,3 rs397514078

0 0 AA 0,0 0,0

g.47486059G>A

104 78 GG 98,1 90,7

0,0215

G 99,1 95,3

0,0233

2 8 GA 1,9 9,3 A 0,9 4,7 rs397514077

0 0 AA 0,0 0,0

g.47486149A>C

63 86 AA 59,4 100,0

<0,0001

A 79,7 100,0

43 0 AC 40,6 0,0 C 20,3 0,0 <0,0001 rs397514076

0 0 CC 0,0 0,0

g.47486221T>C*

1 6 TT 0,9 7,0 T 47,2 51,7

98 77 TC 92,5 89,5 0,0587 C 52,8 48,3 0,3726 rs397514074

7 3 CC 6,6 3,5

g.47486322C>T

102 70 CC 96,2 81,4

0,0008

C 98,1 90,7

0,0011

4 16 CT 3,8 18,6 T 1,9 9,3 rs397514102

0 0 TT 0,0 0,0

22 17 CC 20,8 19,8 C 57,1 58,1

g.47486418C>G* 77 66 CG 72,6 76,7 0,6020 G 42,9 41,9 0,8338 rs397514073

7 3 GG 6,6 3,5

1 4 TT 0,9 4,7 T 47,2 50,6

g.47486424T>C* 98 79 TC 92,5 91,9 0,1833 C 52,8 49,4 0,5060 rs397514072

7 3 CC 6,6 3,5

http://www.ensembl.org/Ovis_aries/Variation/Explore?db=core;tl=0rOEfA7TXSr2GRkx-3166931;v=rs397514076







73


Continuação


Frequência


(FG)

Alelo


(%) Prob.

(FA)

Variação

existente no


g.47486448T>G

1 1 TT 0,9 1,2

0,4548

T 8,0 11,6

0,2333

15 18 TG 14,2 20,9 G 92,0 88,4 -

90 67 GG 84,9 77,9

g.47486453C>A

73 86 CC 68,9 100,0

<0,0001

C 84,4 100,0

<0,0001

33 0 CA 31,1 0,0 A 15,6 0,0 -

0 0 AA 0,0 0,0

g.47486604G>A

103 70 GG 97,2 81,4

0,0003

G 98,6 90,7

0,0004

3 16 GA 2,8 18,6 A 1,4 9,3 -

0 0 AA 0,0 0,0

g.47486736C>T

95 74 CC 89,6 86,0

0,4479

C 94,8 93,0

0,4628

11 12 CT 10,4 14,0 T 5,2 7,0 rs397514070

0 0 TT 0,0 0,0

.47486781G>T

88 86 GG 83,0 100,0

<0,0001

G 91,5 100,0

<0,0001

18 0 GT 17,0 0,0 T 8,5 0,0 rs397514069

0 0 TT 0,0 0,0

g.47486819C>A*

46 84 CC 43,4 97,7

<0,0001

C 69,3 98,8

<0,0001

55 2 CA 51,9 2,3 A 30,7 1,2 rs589527314

5 0 AA 4,7 0,0

103 68 TT 97,2 79,1 T 98,6 89,5

g.47486832T>C 3 18 TC 2,8 20,9 <0,0001 C 1,4 10,5 0,0001 -

0 0 CC 0,0 0,0

4 5 CC 3,8 5,8 C 6,1 9,3

g.47486836C>T* 5 6 CT 4,7 7,0 0,6241 T 93,9 90,7 0,2423 rs397514068

97 75 TT 91,5 87,2





74


Continuação


Frequência


(FG)

Alelo

Frequência alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

existente no


g.47486837A>T

106 82 AA 100,0 95,3

0,0248

A 100,0 97,7

0,0256

0 4 AT 0,0 4,7 T 0,0 2,3 -

0 0 TT 0,0 0,0

g.47486853C>T

98 84 CC 92,5 97,7

0,1054

C 96,2 98,8

0,1102

8 2 CT 7,5 2,3 T 3,8 1,2 rs397514066

0 0 TT 0,0 0,0

g.47486896A>G

78 84 AA 73,6 97,7

<0,0001

A 86,8 98,8

<0,0001

rs397514065

28 2 AG 26,4 2,3 G 13,2 1,2

0 0 GG 0,0 0,0

g.47486910G>T

69 66 GG 65,1 76,7

0,0789

G 82,5 88,4

0,1104

-

37 20 GT 34,9 23,3 T 17,5 11,6

0 0 TT 0,0 0,0

g.47486914G>A

78 84 GG 73,6 97,7

<0,0001

G 86,8 98,8

<0,0001

rs397514064

28 2 GA 26,4 2,3 A 13,2 1,2

0 0 AA 0,0 0,0


ID do cromossomo 11 que se localiza o gene GH genoma de ovinos versão 4.0: NC_019468.2.

ID do gene GH no genoma de ovinos versão 4.0: 443329

g.47485910G>C marcador localizado no exon 5; g.47486322C>T marcador localizado no exon 4; g.47486736C>T marcador localizado no exon 3

*Marcadores usado no teste de associação




75

Tabela 5. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-padrão (EP) nos

testes de associação

Variável a(EP) d(EP) LRT Prob.

IGF1

g.171108499T>G

Comprimento interno da carcaça -0,9265 (0,4223) - 4,74 0,294E-01

Rendimento verdadeiro 1,5942(0,6066) - 6,50 0,108E-01

Rendimento da carcaça fria -0,9799 (0,9164) 2,7613(1,1347) 14,26 0,801E-03*

Rendimento da carcaça quente -0,9982 (0,8972) 2,6585(1,1108) 14,22 0,818E-03*

Peso da carcaça fria -0,4081 (0,4005) 1,1876(0,4959) 13,61 0,111E-02*

Peso de paleta -0,0575 (0,0728) 0,1406 (0,0902) 6,47 0,390E-01

g.171110428C>T

Perímetro da carcaça na garupa -2,9285 (1,1473) - 6,39 0,115E-01

Intensidade de vermelho (a*) -0,7892 (0,2636) - 8,73 0,314E-02

Intensidade de amarelo (b*) -0,4345 (0,2142) - 4,06 0,439E-01

g.171111426G>A

Rendimento de costela 1,0003 (0,4588) - 4,69 0,304E-01

g.171112496C>T

Peso do pescoço 0,0567 (0,0278) - 4,10 0,429E-01

GH

g.47486424T>C

Largura da carcaça na garupa 3,4422 (1,2693) -3,4774 (1,3183) 11,11 0,386E-02

Peso da carcaça fria 1,5081 (0,6672) - 5,04 0,248E-01

Rendimento da carcaça fria 3,6665 (1,5287) - 5,66 0,144E-01

Peso da carcaça quente 1,2612 (0,6138) - 4,17 0,410E-01

Rendimento da carcaça quente 3,8536 (1,5625) - 5,98 0,173E-01

Rendimento de pernil -5,1736 (1,5775) - 10,44 0,123E-02*

g.47486819C>A

Peso de costela -0,4380 (0,1272) - 11,49 0,699E-03*

Rendimento de costela -2,2680 (0,6970) - 10,29 0,133E-02*

Peso do lombo -0,1893(0,0516) - 13,01 0,311E-03*

Rendimento do lombo -0,9423 (0,3259) - 8,17 0,425E-02

Peso de paleta -0,2265 (0,0779) - 8,27 0,402E-02

Rendimento de paleta -0,9424 (0,4184) - 5,01 0,253E-01

Peso de pernil -0,3960 (0,1375) - 8,10 0,443E-02

Peso de pescoço -0,0851 (0,0394) - 4,61 0,318E-01

Escore de terminação de carcaça -0,1700 (0,0839) - 4,06 0,439E-01

LRT - Likelihood ratio test; Prob. - Probabilidade do teste LRT. * - Associações significativas

ao nível da correção de Bonferroni (P<0,002023).

A garupa é uma região de grande importância para os animais, pois é no posterior

que estão localizados os cortes cárneos de maior valor comercial. Além disso, garupas de

maior amplitude facilitam o parto das ovelhas. Logo, para fins de melhoramento se deseja

76

ampliar o valor do perímetro da carcaça na região da garupa e, portanto, o alelo T do SNP

g.171110428C>T pode ser considerado favorável, pois é ele que aumenta a média dessa

variável. Observa-se na Tabela 3 que a frequência do alelo T difere (P<0,05) entre os

grupos UFBA e Embrapa, sendo maior no grupo UFBA. Percebe-se também um bom

equilíbrio nas frequências dos dois alelos desse SNP, o que indica amplo espaço para a

seleção a fim de aumentar a frequência do alelo T. Observa-se também que apesar da

frequência do alelo T ser próxima do alelo C, a frequência do genótipo TT não é tão alta,

o que deixa margem considerável para ampliação de sua frequência via seleção. Ressalta-

se que este mesmo marcador também apresentou efeito sugestivo (P<0,05) para as

intensidades das cores vermelho (a*) e amarelo (b*) e por isso também pode ter

implicações na qualidade da carne. Logo, para fins de melhoramento é necessário se ater

ao fato de que o alelo T também amplia as médias de a* e b* e o aumento de sua

frequência pode ter consequências não necessariamente desejáveis sobre esses

parâmetros de cor.

A costela é um corte comercial bastante valorizado em ovinos e por isso o objetivo

deve ser ampliar o valor médio do rendimento de costela. O alelo G do SNP

g.171111426G>A pode ajudar a atingir esse objetivo. As frequências genotípicas deste

marcador não diferem entre os grupos UFBA e Embrapa (Tabela 3), mas as frequências

alélicas diferem (P<0,05), sendo o alelo G menos frequente no grupo UFBA. Ressalta-se

que este alelo tem baixa frequência em ambos os grupos estudados e o genótipo GG

também é observado em menor número de animais que os outros genótipos. Logo, há

grande espaço para ampliar as frequências do alelo G e do genótipo GG na raça Santa

Inês, o que pode trazer bons ganhos em rendimento de costela.

O pescoço é um corte comercial pouco valorizado e por isso sua redução de

tamanho pode ajudar a ampliar o rendimento de outros cortes comerciais mais

valorizados. O alelo T do SNP g.171112496C>T diminuiu o peso do pescoço e por isso

sugere-se ampliar sua frequência. Percebe-se na Tabela 3 que as frequências genotípicas

e alélicas deste marcador não diferem (P>0,05) entre os grupos estudados. A frequência

do alelo T é consideravelmente menor que a do alelo C, enquanto o genótipo TT e menos

frequente que outros genótipos. Logo, trata-se de outro marcado em que há amplo espaço

para ampliar a frequência tanto do alelo quanto do genótipo desejáveis.

Por fim, o SNP g.171108499T>G teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre

comprimento interno da carcaça e rendimento verdadeiro, efeito de dominância

significativo (P<0,002023) para o peso da carcaça fria e os rendimentos das carcaças fria

77

e quente e efeito de dominância sugestivo para peso da paleta (Tabela 5). A princípio,

quanto maior for o valor médio dessas variáveis, melhor é para o sistema de produção.

Para os pesos de paleta e carcaça fria e os rendimentos de carcaça fria e quente, não há

um alelo favorável, pois não houve efeito aditivo, mas sim apenas um desvio devido a

dominância. Como os valores do efeito de dominância foram todos positivos nestas

associações, então a média dos animais heterozigotos é superior à média dos animais

homozigotos, logo a seleção deve ser no sentido de ampliar a frequência de animais TG.

Já para as variáveis comprimento interno de carcaça e rendimento verdadeiro, tem-se

efeito aditivo e neste caso há um alelo favorável. A média do rendimento verdadeiro foi

maior em animais TT e portanto o alelo favorável é o T, enquanto maior média de

comprimento interno de carcaça foi observada em animais GG. Logo, se o objetivo for

ampliar o valor médio dessa variável, então o alelo favorável seria o G. As frequências

genotípica e alélica deste marcador diferem (P<),05) entre os grupos UFBA e Embrapa

(Tabela 3). Em ambos os grupos o alelo G é menos frequente que o alelo T, sendo ainda

menos frequente no grupo Embrapa. O genótipo TG é pouco frequente no grupo Embrapa

e bem mais frequente no grupo UFBA. Ressalta-se que o grupo UFBA é formado de

animais que são de rebanhos comerciais abertos e submetidos a processos mais intensos

de seleção, enquanto o grupo Embrapa é formado por animais que estão em um rebanho

fechado há pelo menos 30 anos, onde se espera realmente menos heterozigose.

Até o presente momento poucos estudos reportaram associação entre

polimorfismos no gene IGF1 e características de interesse econômico em ovinos.

Proskura et al. (2014) testaram se o SNP g.271C>T no gene IGF1 estava associado a

pesos e ganhos de peso de ovinos da raça Pomeranian Coarsewool, mas não encontraram

efeito significativo (P>0,05). Gholibeikifard et al., (2013) testaram se polimorfismo no

exon-2 do gene IGF1 afetava pesos em diferentes idades nos ovinos da raça Iraniana

Baluchi e também não encontraram efeito significativo (P>0,05). Nazari et al. (2016)

testaram polimorfismo no Exon-1 do gene IGF1 em ovinos da raça Iraniana Zandi e

também não encontraram efeito sobre peso e ganho de peso. Contudo, efeitos

significativos foram reportados por Trukhachev et al., (2016), que avaliaram 18 SNP no

gene IGF1 em ovinos da raça Russian Soviet Merino, sendo apenas um localizado em

exon e os demais nos introns, e encontraram que os SNP c.-5363C>T, c.-5188G>C, c.-

5186G>A e c.-4088G>A da região 5’UTR do intron-1 estavam associados a peso vivo,

com maiores médias observadas em animais heterozigotos. Enquanto o SNP c.-91A>C

teve efeito sobre peso vivo, alturas na cernelha e na garupa, além de largura e

78

comprimento de garupa. Efeitos significativos para prolificidade (HE et al., 2012) e

persistência de lactação (SCATÀ et al., 2010) também foram reportados em ovinos.

Logo, até onde sabemos, o presente estudo é o primeiro a reportar efeito de SNP no gene

IGF1 afetando características de carcaça em ovinos. Su et al., (2014) reportaram que a

expressão gênica do IGF1 no músculo Longissimus dorsi estava positivamente e

significativamente correlacionada com o diâmetro das fibras musculares, o que indica que

polimorfismos neste gene podem afetar produção de carne em ovinos. Enquanto, Sun et

al. (2014) reportaram que o nível de expressão gênica do IGF1 estava positivamente

correlacionado (P<0,01) com peso vivo e peso de carcaça (P<0,05) em ovinos da raça Hu,

o que reforça os achados do presente estudo.

Os testes de associação com polimorfismos no gene GH indicaram que o SNP

g.47486424T>C apresentou efeito sugestivo (P<0,05) para pesos e rendimentos de

caraças quente e fria e largura de carcaça na região da garupa (Tabela 5), além de efeito

significativo (P<0,002023) para rendimento de pernil. Enquanto o SNP g.47486819C>A

teve efeito sugestivo (P<0,05) para escore de terminação de carcaça, rendimento de

lombo, peso e rendimento de paleta e pesos de pernil e pescoço (Tabela 5), além de efeito

significativo (P<0,002023) para peso e rendimento de costela e peso de lombo.

As variáveis afetadas pelo SNP g.47486424T>C são de grande importância

comercial para o sistema de produção ovina e maiores valores médios são desejáveis. Os

pesos e rendimentos de carcaça quente e fria e a largura da carcaça na região da garupa

foram maiores em animais TT, indicando que o alelo que aumenta o valor dessas variáveis

é o T. Já para rendimento de pernil, maiores médias foram observadas em animais CC,

indicando o alelo C como favorável. Portanto, a seleção com base na informação deste

marcador é complexa e não permitirá ampliar o valor médio de todas as seis variáveis

simultaneamente. Logo, a seleção para qualquer um destes alelos deve ser acompanhado

de um monitoramento da média de todas as variáveis a fim de evitar que perdas

aconteçam. As frequências alélicas e genotípicas deste marcador não diferiram entre os

dois grupos estudados, e as frequências dos alelos T e C são muito parecidas (Tabela 4).

Logo, o processo de seleção para os alelos deste marcador pode trazer bons ganhos nas

variáveis estudadas, visto haver amplo espaço para ampliação da frequência alélica tanto

de T quanto de C.

O objetivo de seleção é aumentar a média das variáveis que estão sob efeito aditivo

do SNP g.47486819C>A (Tabela 5), com exceção do peso de pescoço. O alelo que

aumenta a médias de todas as variáveis neste caso é o A e a seleção deve buscar aumentar

79

a frequência do genótipo AA. As frequências alélicas e genotípicas deste SNP diferem

entre os grupos UFBA e Embrapa, sendo o alelo C bem mais frequência do que o A em

ambos os grupos, mas consideravelmente maior no grupo UFBA. Assim, o objetivo de

ampliar a frequência do genótipo AA via seleção pode trazer importantes ganhos em

qualidade de carcaça dos ovinos Santa Inês.

Associações de polimorfismos no gene GH e características de interesse

econômico em ovinos foram objetivo de vários estudos. Há relatos de polimorfismos no

gene GH associados com produção e qualidade de leite (VACCA et al., 2013; DETTORI

et al., 2015; MARQUES et al., 2006) e qualidade de lã (FARAG et al., 2016), mas

principalmente com características de crescimento, como pesos e ganhos de peso e

medidas morfométricas. Moradian et al., (2013) reportaram efeito de polimorfismo

(SSCP) no Exon-4 do gene GH afetando peso em diferentes idades nos ovinos da raça

Makooei. Malewa et al. (2014) identificaram um polimorfismo (PCR-RFLP) com efeito

sobre peso a desmama e taxa de crescimento em ovinos das raças Donggala e East Java.

Jia et al., (2014) reportaram polimorfismos (SSCP) nas regiões reguladora 5’, Exon-4 e

3’UTR afetando peso vivo, comprimento e altura do corpo e largura do peito em ovinos

das raças Tibetan e Poll Dorset. Hajihosseinlo et al., (2015) identificaram polimorfismo

(PCR-SSCP) no gene GH em ovinos da raça Makooei associados a comprimento e largura

da calda, além de espessura de gordura na mesma. Cauveri et al., (2016) encontraram

associação entre o SNP 480G>A (intron-1) com peso a desmama e ganho de peso pré-

desmama em ovinos da raça Nilagiri. Han et al. (2016) reportaram efeitos dos SNP

g.616G>A (intron 2) e g.498G>C (exon 2) sobre peso e medidas morfométricas de ovinos

de raças chinesas. Depison et al., (2017) reportaram associações entre polimorfismos

(RFLP) no gene GH e peso vivo, ganho diário de peso e medidas morfométricas em

ovinos de raças da província de Jambi, na Indonésia. Enquanto Abdelmoneim et al.

(2017) reportaram polimorfismos no intron-2 (G871A), exon-4 (G1383A) e intron-4

(A1509G) do gene GH associados a peso vivo e ganho de peso em ovinos da raça Harri,

na Arábia Saudita.

Se há tantos resultados indicando polimorfismos no gene GH afetando

características de crescimento é de se esperar que também existam efeitos sobre atributos

de carcaça, já que eles estão em algum nível correlacionados com o peso vivo dos animais.

Contudo, características de carcaça foram pouco exploradas em testes de associação com

polimorfismos no gene GH em ovinos. Gorlov et al., (2017) foram os únicos a reportar

efeito de polimorfismo no gene GH associado a características de carcaça, além de

80

relatarem efeito para peso vivo e ganho de peso. Dentre os atributos de carcaça eles

identificaram efeito sobre peso de carne na meia carcaça, rendimento de carcaça e pesos

do coração e do rim em ovinos da raça Salsk, na Rússia. Logo, o presente estudo é mais

um a reforçar a hipótese de que polimorfismos no gene GH influenciam características de

carcaça em ovinos, com a diferença de termos identificado as trocas de base que causam

os efeitos.

Todos os polimorfismos aqui identificados nos genes IGF1 e GH e associados a

atributos de carcaça, estão localizados em região de intron. Mais estudos serão

necessários para definir qual o mecanismo de ação utilizado por estes polimorfismos para

afetar essas variáveis. Contudo, algumas hipóteses podem ser lançadas. É possível que

estes polimorfismos estejam em desequilíbrio de ligação com outros polimorfismos

posicionados em exons nestes genes ou em outros genes vizinhos. Também não se pode

descartar a hipótese de que essas mutações em intron sejam de fato funcionais, pois

mutações nos sítios de junção de exon-intron (KRAWCZAK et al., 2006) ou mesmo um

pouco afastadas deste sitio (COOPER, 2010), mais ainda dentro de região de intron,

podem afetar a transcrição do gene ou a eficiência do splicing. Saravanaperumal et al.,

(2012) cita que um evento de splicing no intron 5 do gene SCF (Stem cell factor) em

ovinos levou a formação de dois tipos de proteína SCF, uma solúvel e outra insolúvel, as

quais possuem número diferente de aminoácidos. Assim, maiores estudos devem ser

desenvolvidos em busca de elucidar o mecanismo de ação que essas mutações em intron

dos genes IGF1 e GH utilizam para influenciar atributos de carcaça em ovinos. De

qualquer forma, os achados do presente estudo indicam potencial de uso de

polimorfismos nestes genes em programas de seleção para melhoria de variáveis de

qualidade de carcaça em ovinos, especialmente na raça Santa Inês.

CONCLUSÕES

Existem pelo menos 18 mutações em região de intron do gene IGF1 e 21 no gene

GH (18 em intron e três em exon) em ovinos da raça Santa Inês, sendo que 11 mutações

(seis no IGF1 e cinco no GH) apresentam boa distribuição de frequências para uso em

testes de associação.

Para muitas mutações as frequências genotípicas e alélicas diferem entre os grupos

de animais UFBA e Embrapa, o que evidenciou diferenças de fluxo gênico entre os

grupos. Fato já esperado em função do grupo Embrapa ser um rebanho fechado há pelo

81

menos 30 anos, enquanto o grupo UFBA é um rebanho comercial aberto e, portanto, com

maior fluxo gênico que o rebanho Embrapa.

Os SNPs g.171108499T>G, g.171110428C>T, g.171111426G>A e

g.171112496C>T localizados no gene IGF1 e os SNPs g.47486424T>C e

g.47486819C>A localizados no gene GH apresentaram efeito sobre vários fenótipos aqui

estudados. Logo, fornecem importantes informações para programas de seleção em

ovinos da raça Santa Inês, além de serem fontes de informação para estudos de validação

em outras raças de ovinos.


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85

Capítulo 3

Polimorfismo nos genes CAPN1 e CAST associados a atributos da carne e da

carcaça em ovinos Santa Inês

86

Polimorfismo nos genes CAPN1 e CAST associados a atributos da carne e da

carcaça em ovinos Santa Inês

RESUMO

O objetivo deste estudo foi identificar e descrever as freqüências alélicas e

genotípicas de polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 em 191 ovinos da raça Santa

Inês e testar se estão associados ao pH pós-abate (pH0) e 24 horas post mortem (pH24),

área de olho de lombo do músculo Longissimus dorsi, caracterização cromática da carne

(L*, a* e b*), força de cisalhamento, perda de peso por cocção, pesos e rendimentos das

carcaças quente e fria, pesos e rendimentos de pescoço, perna, costelas, paleta e lombo,

comprimentos externo e interno da carcaça, comprimento da perna, larguras da carcaça

nas regiões do peito e da garupa, além de escores de conformação e acabamento de

gordura da carcaça. Foram identificados 58 SNPs no gene CAST e 45 no gene CAPN1. A

maioria dos marcadores foram identificados em região de intron e dois marcadores,

g.93396113G>A no gene CAST e g.42628678C>T no gene CAPN1, foram identificados

em exon, mas ambas são mutações sinônimas. Um total de 13 SNPs no gene CAST e 11

no CAPN1 ainda não haviam sido depositadas no NCBI. Os SNPs g.93395190A>T,

g.93395218A>G, g.93395243T>G, g.93395307T>C, g.93395469G>C,

g.93395478G>A, g.93395835G>A, g.93396080A>G, g.93396154T>C,

g.93396162T>C, g.93396257T>C, g.93396809G>A, g.93397179G>A, g.93397600C>G,

g.93397718C>T e g.93397780T>C no gene CAST apresentaram efeito aditivo sugestivo

(P<0,05) para pelo menos um atributo dentre aqueles avaliados. Já para o gene CAPN1

foram os SNPs g.42625446C>T, g.42625811G>A, g.42626685G>A, g.42626996T>C,

g.42627301T>C, g.42627413T>C, g.42627702G>C, g.42628173T>C e g.42628421A>G

que apresentaram efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para pelo menos uma das

características estudadas. Estes SNPs são potenciais marcadores para programas de

seleção em ovinos Santa Inês, mas ressalta-se que para muitos destes SNPs há variação

de frequências genotípicas e alélicas entre os rebanhos Santa Inês e a resposta a seleção

dependerá dessas frequências.

Palavras-chave: carcaça, ovinocultura, seleção, SNP, sequenciamento

87

Polymorphism in the CAPN1 and CAST genes associated with meat and carcass

quality traits in Santa Ines sheep

ABSTRACT

this study aimed identifying allelic and genotypic frequencies of polymorphisms in the

CAST and CAPN1 genes in 191 Santa Ines sheep and to test whether they are associated

with pH values post-slaughter (pH0) and 24 hours post-mortem (pH24), color parameters

(L*, a* and b*), shear force, weight loss by cooking, weights and yields of hot and cold

carcasses, weights and yields of neck, leg, ribs, shoulder and loin, external and internal

carcass lengths, leg length, carcass widths in the breast and croup regions, as well as

carcass conformation score and finishing carcass score. We identified 58 SNPs in the

CAST gene and 45 in the CAPN1 gene. Most markers were identified in the intron region

and two markers, g.93396113G>A in the CAST gene and g.42628678C>T in the CAPN1

gene, were identified in exon, but both are synonymous mutations. A total of 13 SNPs in

the CAST gene and 11 in CAPN1 had not yet been deposited in NCBI. The SNPs

G.93395228A>G, g.93395248A>G, g.93395307T>C, g.93395469G>C,

g.93395478G>A, g.93395835G>A, g.93395608A>G.93396169C>G, g.93397718C>T

and g.93397780T>C, g.93396809G>A, g.93397179G>A, g.93397600C>T and

g.93397780T>C in the CAST had additive suggestive effect (P<0.05) for at least one

phenotypic trait. For the CAPN1 gene, the SNPs g.42625446C>T, g.42625811G>A,

g.42626685G>A, g.42626996T>C, g.42627301T>C, g.42627413T>C, g.42627702G>C,

G.42628173T>C and g.42628421A>G showed additive suggestive effect (P <0.05) for at

least one of the trait studied here. These SNPs are the potential markers for selection

programs in Santa Ines sheep, but for many SNPs the genotypic and allelic frequencies

differ between Santa Ines herds and the response to selection will depend on these

frequencies.

Key words: carcass, ovine breeding, selection, SNP, sequencing

88

INTRODUÇÃO

A raça Santa Inês é composta de animais deslanados e foi formada na região

Nordeste do Brasil a partir de cruzamentos que envolveram várias raças. Alguns estudos

já demonstraram que a raça Santa Inês apresenta boas taxas de crescimento (JUCÁ et al.,

2014), além de maior resistência ao calor (MCMANUS et al., 2009) e a endoparasitos

(MEXIA et al., 2011) se comparada a algumas raças lanadas. Isso a caracteriza como uma

excelente opção para regiões de clima tropical e para criadores que possuem baixa

capacidade de investimento no sistema produtivo.

Alguns atributos de carcaça do Santa Inês foram descritos por Costa et al., (2015)

e Jucá et al., (2016) e é possível observar nestes trabalhos que a raça Santa Inês precisa

de seleção para melhoria de carcaça. Contudo, esses atributos são difíceis de melhorar

pela seleção clássica, pois requerem o abate dos animais. Assim, informações de

marcadores moleculares podem ser muito úteis para a obtenção de ganhos genéticos para

qualidade de carcaça, como descrito por Gao et al. (2007). Neste contexto tem-se os genes

CAPN1 e CAST. O gene CAPN1 codifica a enzima proteolítica μ-calpaína, que é

responsável por degradar proteínas miofibrilares do músculo no período post-mortem

(KOOHMARAIE, 1996; SMITH et al., 2000). As calpaínas são divididas em dois grupos,

as que são ativadas por níveis milimolar de Ca2+ (m-calpains) e as de nível micromolar

(µ-calpains). Ambas são inibidas por uma terceira proteína chamada de Calpastatina,

codificada pelo gene CAST, que impede a ligação das calpaínas às membranas celulares

(LAWRENCE, 2002). As calpaínas degradam específicamente as proteínas musculares

(HOSSNER, 2005), sendo a miosina degradada lentamente pelas calpaínas, já a actina

não sofre nenhum efeito desta enzima. Assim, a ação das calpainas é de enfraquecimento

do disco Z do músculo (LAWRENCE, 2002; HOSSNER, 2005).

Devido as funções supracitadas, polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 vem

sendo testados para associação com várias características de interesse econômico,

sobretudo para características relacionadas a qualidade de carne. Associação de

polimorfismos no gene CAST com maciez de carne ovina foram reportadas por Knight et

al. (2012), Knight et al. (2014) e Aali et al. (2017). Contudo, também há relatos de

associação com variáveis ligadas a crescimento. Nassiry et al (2006), Khan et al. (2012)

e Yilmaz et al., (2014) reportaram marcador no gene CAST associados com ganho de peso

diário em ovinos. Polimorfismos no gene CAPN1 também foram associados a peso vivo

de ovinos (DEHNAVI et al, 2012), enquanto Mahrous et al. (2016) reportaram um SNP

no gene CAPN1 associado com peso vivo e ganhos de peso em ovinos.

89

Se polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 estão associados a peso vivo, então

é possível que também estejam associados a atributos de carcaça dada a correlação entre

essas variáveis. Contudo, apenas Yilmaz et al., (2014) e Knight et al. (2014) relataram

ter testado associação entre polimorfismos nestes genes e características de carcaça.

Yilmaz et al., (2014) avaliaram o gene CAST e encontraram efeito de polimorfismo sobre

espessura de gordura subcutânea no músculo Longissimus. Enquanto Knight et al. (2014)

estudaram ambos os genes e não encontraram qualquer associação significativo com peso

de carcaça quente, espessura de gordura e profundidade do músculo Longissimus. Assim,

o objetivo desta pesquisa foi identificar e descrever as freqüências gênicas e genotípicas

de polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 em ovinos da raça Santa Inês e verificar se

estão associados a qualidade de carne e atributos de carcaça.

MATERIAL E MÉTODOS















(%) = PCF/PV x 100.




90


características.
































91






























92




































pH0 106 6,67 0,19

pH24 101 5,57 0,19



Foram coletados 5 ml de sangue em tubos de vacutainer contendo EDTA, os quais

foram refrigerados a 4 ºC. Posteriormente foram extraídos leucócitos, seguindo o

protocolo descrito por Oliveira et al., (2007). Os leucócitos foram encaminhados à Escola

Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ / USP, onde foi realizada a extração do

93

DNA genômico, seguida da amplificação da região alvo e subsequentemente da

preparação da biblioteca. A extração de DNA foi realizada utilizando método de

precipitação de sal e soluções de proteinase K, seguindo o protocolo de Oliveira et al.,

(2007).

O desenho do primer para os genes CAST e CAPN1 foi feito com base na

sequência disponível no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology

Information) para o genoma ovino. O desenho dos oligonucleotídios foi realizado a partir

do programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/), que gerou possíveis

sequências dos iniciadores. Para testar a qualidade das sequências geradas e a escolha do

primer, utilizou-se o net primer (http://www.premierbiosoft.com). Após a escolha dos

melhores primers forward e reverse, foi realizado o BLAST (Basic Local Alignment

Search Tool), que é utilizado como uma ferramenta de busca para o alinhamento das

sequências no NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), para confirmar a

similaridade com a espécie Ovis aries e a região desejada.

Os primers utilizados para a amplificação da região alvo do gene CAST foram

5’AAAAGCCAAAGAAGAGGATCG3’ forward e 3’GGGAAACCACTTCAGAGAC

G 5’ reverse, com 4.108pb (tamanho do fragmento) localizados entre os exons 20 a 23.

Já para o gene CAPN1 foram utilizados os primers 5’TGTGCTGCGTTTCTTCTCAG3’

forward e 3’AAGGTCACCACTCCATCCAG5’ reverse, com 3.927pb (tamanho do

fragmento) localizado entre os exons 12 a 20 do gene CAPN1.

Na amplificação do fragmento do gene da CAST utilizou-se um PCR touch down

com as seguintes condições: desnaturação inicial de 98°C por 5 minutos, seguida de 10

ciclos com desnaturação a 98°C por 10 segundos, anelamento a 63°C descendo a 58°C

variando -0,5°C a cada ciclo por 30 segundos e a extensão a 72°C por 4 minutos. Logo

após os primeiros ciclos seguiu-se com mais 30 ciclos para desnaturação a 98°C por 10

segundos, anelamento a 58°C por 30 segundos e a extensão a 72°C por 4 minutos,

finalizando com uma extensão final de 72°C por 5 minutos para o gene CAST. Já na

amplificação do fragmento do gene da CAPN1 utilizou-se um PCR com as seguintes

condições: desnaturação inicial de 98°C por 5 minutos, seguida de 40 ciclos com

desnaturação a 98°C por 10 segundos, anelamento a 58°C por 30 segundos e a extensão

a 72°C por 4 minutos, finalizando com uma extensão final de 72°C por 5 minutos.

Para a amplificação foram utilizados 15 ul de solução contendo 0,3 mM de cada

iniciador, Taq polimerase (Emeraldamp Max Hs (Takara Bio, EUA) e 100 ng de DNA

molde. A amplificação foi realizada pelo termociclador Verity® (Applied Biosystems,




94

EUA). Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 1% e as bandas

amplificadas foram coradas com GelRed (Biotium, EUA). Os produtos amplificados

foram avaliados quanto à presença de bandas desejadas contendo o número de pares de

bases esperados, utilizando como controle positivo um pool de DNA de ovelha da raça

Santa Inês.


Após a amplificação das amostras, foi realizada a purificação dos amplicons, com

esferas magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA), seguindo a

recomedação do Agencourt AMPure XP (beads) para o volume de amostra,

homogenizando para as beads se ligarem aos produtos de amplificados. Logo após esta

etapa, realizou a purificação das amostras com etanol 70% para remover os contaminates.

Em seguida, o sedimento foi diluído e as pérolas foram removidas. As amostras foram

diluídas para 2 nM, levando em consideração o tamanho em pares de base do amplificado.

As amostras foram quantificadas com fluorômetro Qubit® (Life Technologies, USA),

sendo diluído para 0,2 ng/μl e encaminhado para o preparo da biblioteca e em seguida o

sequenciamento.


Para o preparo da biblioteca utilizou-se o kit Nextera® XT DNA Sample

Preparation e Nextera® XT Index (Illumina, San Diego, USA) e todas as etapas foram

realizadas com base no protocolo Nextera XT. O sequenciamento foi realizado na

plataforma MiSeq (Illumina, San Diego, USA) usando o kit MiSeq Reagent Kit v2

(500cycle).


Após o sequenciamento, as qualidades das leituras foram verificadas pelo

software FastQC (www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/). Para a primeira filtragem

de dados, foi utilizado o software SeqyClean versão 1.3.12 (ZHBANNIKOV et al., 2013)

adotando um parâmetro de qualidade de 24 (Phred score) para cada base e um

comprimento mínimo de 50 pb. Após filtragem dos dados, foi realizado o alinhamento

das reads contra o genoma Ovis aries (versão Oar_v4.0) depositado no NCBI, com o

auxílio do programa Bowtie2 (LANGMEAD e SALZBERG, 2012).

95


A detecção de polimorfismos (SNPs e INDELS) foi realizada com base na posição

no genoma de referência (Versão Oar_v4.0). Nesta etapa foi utilizado o software

SAMtools versão 1.4 (LI e DURBIN, 2009). Em seguida, realizou-se a conversão dos

arquivos do formato SAM (do inglês, Sequence Alignment/Map) para o formato BAM.

Logo após fez-se a remoção das duplicatas de PCR, ordenamento das posições das

sequencias e index do arquivo ordenado. A chamada de variantes foi realizada usando a

opção mpileup do SAMtools cobrindo um valor definido para a qualidade do mapeamento

através da referência do genoma (-q20) e qualidade de filtragem ≥ 40 bases na escala de

Phred (-Q40). Finalmente utilizando o comando bcftools para converter o arquivo em

*.bcf para *.vcf, este passo é executado o filtro que define a leitura de profundidade

máxima dos marcadores para a chamada. Neste caso, mais de 99.999 leituras para essa

variante. Os marcadores foram nomeados de acordo com as regras definidas por HGVs

(Human Genome Variation Society).


Por fim, realizou-se a anotação estrutural dos marcadores usando a ferramenta

VEP (Variant Effect Predictor) para anotação estrutural online, do Ensembl, visando

identificar as localizações das mutações nas diferentes regiões do genoma (região

intergênica, exon, intron, sítio de scpling alternativo etc.) e prováveis efeitos funcionais

das variantes.

Determinação das frequências genotípicas e alélicas


simples de alelos e genótipos, respectivamente, utilizando-se o software Statistical

Analysis System (SAS, 2004). O teste de Qui-quadrado foi utilizado para comparar as

frequências genotípicas e alélicas entre os dois grupos (Embrapa e UFBA) assumindo 5%

de probabilidade. Para tanto foi utilizado o PROC FREQ (SAS, 2004).


Os testes de associação foram realizados com o programa Qxpak 5 (PÉREZ-

ENCISO e MISZTAL, 2011), que realiza um teste razão de verossimilhanças entre um

modelo completo e um modelo reduzido. O modelo completo usado na análise de

variância para detectar o efeito de SNP foi: Y𝑖𝑗𝑘lm = 𝑢 + F𝑖 + Yj + Mk + ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 + β𝑖𝑗𝑘lm


96

Age + Al + Dm + 𝑒𝑖𝑗𝑘lm Onde: Y𝑖𝑗𝑘lm é o valor fenotípico da característica em análise; u é

a média geral dessa característica; F𝑖, Yj e Mk são efeitos fixos da fazenda, ano e mês de

nascimento, respectivamente; ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 e β𝑖𝑗𝑘lm Age são as covariáveis peso corporal e

idade no abate; Al e Dm são os efeitos aditivo e de dominância, respectivamente; e 𝑒𝑖𝑗𝑘lm

é o resíduo experimental. Já o modelo reduzido foi construído retirando-se do modelo

completo apenas o efeito que se deseja testar. A correção de Bonferroni foi usada para

estabelecer o nível de significância dos testes de associação.


Nos ovinos o gene CAST está localizado no cromossomo cinco com

aproximadamente 90 Kb e é dividido em 27 exons e 26 introns. Após a amplificação da

região alvo das 191 amostras do gene CAST, apenas uma amostra não amplificou, o que

pode ser devido a alguma mutação na região de alinhamento dos primers. Portanto, foram

sequenciados 190 animais para este gene e após filtragens de qualidade foram

identificados 58 SNP (Tabela 2), o que levou a uma densidade média de

aproximadamente 0,65 SNP/Kb.

Todos os polimorfismos identificados no gene CAST apresentaram frequências

nos três genótipos, exceto o SNP g.93396113G>A que não apresentou animais

heterozigotos tanto no grupo Embrapa quanto no grupo UFBA (Tabela 2). O marcador

g.93395643G>A foi o único localizado em região de exon no gene CAST, mas trata-se de

uma mutação sinônima, pois a troca de base não altera o aminoácido Treonina. Os SNP

g.93395190A>T, g.93395218A>G, g.93395243T>G, g.93395307T>C, g.93395316A>G,

g.93395469G>C, g.93395478G>A, g.93395517C>T, g.93396080A>G, g.93396113G>A

g.93396809G>A, g.93397007T>C e g.93399475G>A são novos polimorfismos, pois

ainda não há registro deles no banco de dados (dbSNP) NCBI. Todos os outros 45

marcadores identificados no gene CAST já possuem prévio registro no NCBI (Tabela 2).

97

Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAST

Marcadores Número de animais

Genótipo

Frequência genotípica

(%) Prob.

(FG) Alelo

Frequência alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.93395190A>T**

97 15 AA 93,3 17,4

<0,0001

A 95,2 44,2

<0,0001 - 4 46 AT 3,8 53,5 T 4,8 55,8

3 25 TT 2,9 29,1

g.93395218A>G**

97 19 AA 93,3 22,1

<0,0001

A 95,7 47,1

<0,0001 - 5 43 AG 4,8 50,0 G 4,3 52,9

2 24 GG 1,9 27,9

g.93395243T>G**

99 34 TT 95,2 39,5

<0,0001

T 97,6 61,6

<0,0001 - 5 38 TG 4,8 44,2 G 2,4 38,4

0 14 GG 0,0 16,3

g.93395307T>C**

96 19 TT 92,3 22,1

<0,0001

T 94,7 45,9

<0,0001 - 5 41 TC 4,8 47,7 C 5,3 54,1

3 26 CC 2,9 30,2

g.93395316A>G**

97 30 AA 93,3 34,9

<0,0001

A 96,2 63,4

<0,0001 - 6 49 AG 5,8 57,0 G 3,8 36,6

1 7 GG 1,0 8,1

g.93395469G>C**

97 35 GG 93,3 40,7

<0,0001

G 96,2 66,3

<0,0001 - 6 44 GC 5,8 51,2 C 3,8 33,7

1 7 CC 1,0 8,1

96 18 GG 92,3 20,9 G 94,7 45,9

g.93395478G>A** 5 43 GA 4,8 50,0 <0,0001 A 5,3 54,1 <0,0001 -

3 25 AA 2,9 29,1

103 67 CC 99,0 77,9 C 99,5 88,4

g.93395517C>T 1 18 CT 1,0 20,9 <0,0001 T 0,5 11,6 <0,0001 -

0 1 TT 0,0 1,2

87 59 GG 83,7 68,6 G 91,3 83,1

g.93395643G>A*/** 16 25 GA 15,4 29,1 0,0491 A 8,7 16,9 0,0156 rs413442067

1 2 AA 1,0 2,3

http://www.ensembl.org/Ovis_aries/Variation/Explore?db=core;tl=tEEt8oyTgsxfZSJX-1631596;v=rs413442067

98


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.93395788G>A**

87 74 GG 83,7 86,0

0,5851

G 91,3 91,9

0,8574 rs424912630 16 10 GA 15,4 11,6 A 8,7 8,1

1 2 AA 1,0 2,3

g.93395808G>A**

91 74 GG 87,5 86,0

0,7533

G 93,3 91,9

0,6008 rs403339381 12 10 GA 11,5 11,6 A 6,7 8,1

1 2 AA 1,0 2,3

g.93395835G>A**

39 27 GG 37,5 31,4 G 59,6 57,6

0,6852 rs414639908 46 45 GA 44,2 52,3 0,5336 A 40,4 42,4

19 14 AA 18,3 16,3

g.93395843A>G**

81 59 AA 77,9 68,6 A 88,5 83,1

0,1361

rs425997700 22 25 AG 21,2 29,1 0,3171 G 11,5 16,9

1 2 GG 1,0 2,3

g.93396010G>A**

75 80 GG 72,1 93,0 G 84,6 96,5

0,0001

rs415836747 26 6 GA 25,0 7,0 0,0009 A 15,4 3,5

3 0 AA 2,9 0,0

g.93396080A>G**

33 36 AA 31,7 41,9 A 33,7 44,2

0,0356

- 4 4 AG 3,8 4,7 0,3090 G 66,3 55,8

67 46 GG 64,4 53,5

95 83 GG 91,3 96,5 G 91,3 96,5

g.93396113G>A 0 0 GA 0,0 0,0 0,1451 A 8,7 3,5 0,0394 -

9 3 AA 8,7 3,5

31 27 AA 29,8 31,4 A 49,0 50,0

g.93396125A>G** 40 32 AG 38,5 37,2 0,9704 G 51,0 50,0 0,8520 rs426993921

33 27 GG 31,7 31,4

33 35 AA 31,7 40,7 A 57,7 62,2

g.93396140A>G** 54 37 AG 51,9 43,0 0,3993 G 42,3 37,8 0,3715 rs409851241

17 14 GG 16,3 16,3








99


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.93396154T>C**

36 34 TT 34,6 39,5

0,5813

T 61,1 62,2

0,8183 rs417020700 55 39 TC 52,9 45,3 C 38,9 37,8

13 13 CC 12,5 15,1

g.93396162T>C**

21 15 TT 20,2 17,4

0,7647

T 43,8 43,6

0,9773 rs428230968 49 45 TC 47,1 52,3 C 56,3 56,4

34 26 CC 32,7 30,2

g.93396180T>C**

31 33 TT 29,8 38,4 0,3779 T 56,7 60,5

0,4622 rs406915912 56 38 TC 53,8 44,2 C 43,3 39,5

17 15 CC 16,3 17,4

g.93396211C>T**

38 33 CC 36,5 38,4 0,8375 C 60,1 59,9

0,9664 rs422402447 49 37 CT 47,1 43,0 T 39,9 40,1

17 16 TT 16,3 18,6

g.93396257T>C**

25 30 TT 24,0 34,9 0,2358 T 45,2 51,7

0,2033 rs160120782 44 29 TC 42,3 33,7 C 54,8 48,3

35 27 CC 33,7 31,4

g.93396404A>G**

44 31 AA 42,3 36,0 0,6386 A 66,8 64,0

0,5575 rs408105678 51 48 AG 49,0 55,8 G 33,2 36,0

9 7 GG 8,7 8,1

43 48 AA 41,3 55,8 0,1300 A 66,8 74,4

g.93396422A>G** 53 32 AG 51,0 37,2 G 33,2 25,6 0,1071 rs419473804

8 6 GG 7,7 7,0

69 47 AA 66,3 54,7 0,2506 A 79,3 72,7

g.93396553A>C** 27 31 AC 26,0 36,0 C 20,7 27,3 0,1289 rs413404444

8 8 CC 7,7 9,3

29 16 AA 27,9 18,6 0,0981 A 55,3 44,8

g.93396619A>G** 57 45 AG 54,8 52,3 G 44,7 55,2 0,0412 rs399204438

18 25 GG 17,3 29,1










100


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.93396736T>C**

27 17 TT 26,0 19,8

0,1404

T 54,3 45,3

0,0815

rs425885251 59 44 TC 56,7 51,2 C 45,7 54,7

18 25 CC 17,3 29,1

g.93396809G>A**

51 29 GG 49,0 33,7

0,0812

G 70,2 62,8

0,1271

- 44 50 GA 42,3 58,1 A 29,8 37,2

9 7 AA 8,7 8,1

g.93396815G>A

93 54 GG 89,4 62,8 G 94,7 80,2

<0,0001

rs423099226 11 30 GA 10,6 34,9 <0,0001 A 5,3 19,8

0 2 AA 0,0 2,3

g.93397007T>C**

61 34 TT 58,7 39,5 T 75,5 66,3

0,0484

- 35 46 TC 33,7 53,5 0,0201 C 24,5 33,7

8 6 CC 7,7 7,0

g.93397044A>G**

55 56 AA 52,9 65,1 A 74,5 82,0

0,0812

rs406867092 45 29 AG 43,3 33,7 0,1657 G 25,5 18,0

4 1 GG 3,8 1,2

g.93397082T>C**

37 18 TT 35,6 20,9 T 59,1 45,9

0,0102

rs418210778 49 43 TC 47,1 50,0 0,0398 C 40,9 54,1

18 25 CC 17,3 29,1

43 30 TT 41,3 34,9 T 66,3 64,0

g.93397094T>C** 52 50 TC 50,0 58,1 0,5325 C 33,7 36,0 0,6258 rs429530795

9 6 CC 8,7 7,0

97 73 CC 93,3 84,9 C 96,6 91,3

g.93397157C>A 7 11 CA 6,7 12,8 0,0996 A 3,4 8,7 0,0261 rs408051866

0 2 AA 0,0 2,3

25 31 GG 24,0 36,0 G 46,2 53,5

g.93397179G>A** 46 30 GA 44,2 34,9 0,1790 A 53,8 46,5 0,1546 rs160120795

33 25 AA 31,7 29,1








101


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.93397195C>G**

33 22 CC 31,7 25,6

0,3795

C 49,5 48,3

0,8063

rs409258492 37 39 CG 35,6 45,3 G 50,5 51,7

34 25 GG 32,7 29,1

g.93397267G>T

93 61 GG 89,4 70,9

0,0036

G 94,7 84,3

0,0008

rs160120800 11 23 GT 10,6 26,7 T 5,3 15,7

0 2 TT 0,0 2,3

g.93397299A>G**

88 70 AA 84,6 81,4 A 91,8 89,5

0,4419

rs399091954 15 14 AG 14,4 16,3 0,6978 G 8,2 10,5

1 2 GG 1,0 2,3

g.93397418C>T**

86 69 CC 82,7 80,2 C 90,9 89,0

0,5363

rs160120803 17 15 CT 16,3 17,4 0,7323 T 9,1 11,0

1 2 TT 1,0 2,3

g.93397419G>A**

49 31 GG 47,1 36,0 G 69,7 64,0

0,2344

rs400315475 47 48 GA 45,2 55,8 0,2947 A 30,3 36,0

8 7 AA 7,7 8,1

g.93397428C>T**

25 17 CC 24,0 19,8 C 53,4 45,3

0,1198

rs411571641 61 44 CT 58,7 51,2 0,1538 T 46,6 54,7

18 25 TT 17,3 29,1

81 62 GG 77,9 72,1 G 88,0 84,9

g.93397448G>A** 21 22 GA 20,2 25,6 0,6537 A 12,0 15,1 0,3780 rs422744326

2 2 AA 1,9 2,3

91 59 CC 87,5 68,6 C 93,3 83,1

g.93397600C>G** 12 25 CG 11,5 29,1 0,0064 G 6,7 16,9 0,0019 rs418161864

1 2 GG 1,0 2,3

44 28 AA 42,3 32,6 A 66,8 61,6

g.93397631A>T** 51 50 AT 49,0 58,1 0,3798 T 33,2 38,4 0,2919 rs161885177

9 8 TT 8,7 9,3










102


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.93397705C>T**

82 58 CC 78,8 67,4

0,1917

C 88,9 82,6

0,0738

rs403866848 21 26 CT 20,2 30,2 T 11,1 17,4

1 2 TT 1,0 2,3

g.93397718C>T**

57 59 CC 54,8 68,6

0,1025

C 73,6 80,2

0,1262

rs415186098 39 20 CT 37,5 23,3 T 26,4 19,8

8 7 TT 7,7 8,1

g.93397780T>C**

86 68 TT 82,7 79,1 T 89,4 89,0

0,8832

rs430517308 14 17 TC 13,5 19,8 0,2849 C 10,6 11,0

4 1 CC 3,8 1,2

g.93397817A>G**

89 75 AA 85,6 87,2 A 92,3 92,4

0,9609

rs409125240 14 9 AG 13,5 10,5 0,6318 G 7,7 7,6

1 2 GG 1,0 2,3

g.93397857G>T**

91 67 GG 87,5 77,9 G 93,3 87,8

0,0660

rs420247553 12 17 GT 11,5 19,8 0,2056 T 6,7 12,2

1 2 TT 1,0 2,3

g.93397920C>T**

83 58 CC 79,8 67,4 C 89,4 82,6

0,0526

rs427755483 20 26 CT 19,2 30,2 0,1438 T 10,6 17,4

1 2 TT 1,0 2,3

47 35 GG 45,2 40,7 G 68,8 65,7

g.93398021G>A** 49 43 GA 47,1 50,0 0,8001 A 31,3 34,3 0,5276 rs193637301

8 8 AA 7,7 9,3

88 73 CC 84,6 84,9 C 91,8 91,3

g.93398162C>T** 15 11 CT 14,4 12,8 0,7237 T 8,2 8,7 0,8482 rs421650487

1 2 TT 1,0 2,3

10 12 AA 9,6 14,0 A 33,7 26,2

g.93398392A>G** 50 21 AG 48,1 24,4 0,0036 G 66,3 73,8 0,1136 rs400201314

44 53 GG 42,3 61,6










103

Tabela 2, Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAST

continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.93398442C>T**

80 62 CC 76,9 72,1 C 88,0 84,9

rs411539518 23 22 CT 22,1 25,6 0,6249 T 12,0 15,1 0,3780

1 2 TT 1,0 2,3

g.93398765C>T**

18 15 CC 17,3 17,4 C 43,3 43,6

rs418818682 54 45 CT 51,9 52,3 0,9968 T 56,7 56,4 0,9476

32 26 TT 30,8 30,2

g.93398827A>C**

101 82 AA 97,1 95,3 A 98,1 96,5

rs401407818 2 2 AC 1,9 2,3 0,7385 C 1,9 3,5 0,3427

1 2 CC 1,0 2,3

g.93399475G>A

91 54 GG 87,5 62,8 G 93,8 80,2

- 13 30 GA 12,5 34,9 0,0002 A 6,3 19,8 <0,0001

0 2 AA 0,0 2,3


ID do cromossomo 5 que se localiza o gene CAST no genoma de ovinos versão 4.0: NC_019462.2.

ID do gene CAST no genoma de ovinos versão 4.0: 443364






104

Os grupos Embrapa e UFBA diferiram (P<0,05) em função das frequências

alélicas e genotípicas dos marcadores g.93395190A>T, g.93395218A>G,

g.93395243T>G, g.93395307T>C, g.93395316A>G, g.93395469G>C, g.93395478,

g.93395517C>T, g.93395643G, g.93396010G>A, g.93396815G>A, g.93397007T>C,

g.93397082T>C, g.93397267G>T, g.93397600C>G e g.93399475G>A (Tabela 2). Já

para os marcadores g.93396619A>G e g.93397157C>A as diferenças entre os grupos

foram apenas na frequência alélica, enquanto para o marcador g.93398392A>G houve

diferença nas frequências genotípicas. Uma possível explicação para essas diferenças está

no fluxo gênico dentro dos rebanhos. O grupo Embrapa é formado por um único rebanho

que está fechado há mais de 30 anos, enquanto o grupo UFBA é formado por animais de

um rebanho aberto. Apesar disso, não houve qualquer diferença entre os grupos Embrapa

e UFBA para 37 marcadores no gene CAST.

Das 191 amostras avaliadas para o genes CAPN1, oito não amplificaram, o que

pode ser decorrente de mutação na região de alinhamento do primer. Assim, foram

sequenciadas 183 amostras para esse gene e, após filtragens de qualidade, foram

identificados 45 marcadores (Tabela 3), o que levou a uma densidade média de

aproximadamente 1,82 SNP/Kb. Dos 45 marcadores, 44 foram localizados em regiões de

intron do gene CAPN1 e apenas o marcador g.42628678C>T (Tabela 3) foi localizado em

região codificadora (exon 20). Trata-se de uma mutação sinônima, pois o aminoácido

gerado pelo novo códon também é a Arparagina. Os SNP g.42626539G>A,

g.42626996T>C, g.42627113G>A, g.42627152G>A, g.42627199G>A,

g.42627301T>C, g.42627382G>C, g.42627386C>T, g.42627413T>C, g.42627482A>G

e g.42627701C>T ainda não haviam sido depositados no banco de dados (dbSNP) do

NCBI, sendo os demais 34 já referenciados no NCBI (Tabela 3).

Os grupos Embrapa e UFBA não diferiram (P>0,05) em função das frequências

alélicas e genotípicas para os marcadores g.42626874C>T, g.42627152G>A,

g.42627386C>T g.42627482A>G, g.42628237G>A, g.42628555G>A (Tabela 3). Para

todos os outros 39 marcadores há diferença entre os grupos Embrapa e UFBA para pelo

menos uma das frequências (genotípica ou alélica). Novamente uma possível explicação

pode estar no fluxo gênico diferenciado entre os grupos Embrapa e UFBA.

105

Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAPN1


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.42625336G>A**

91 69 GG 93,8 80,2

0,0019

G 96,9 84,3

<0,0001 rs417411045 6 7 GA 6,2 8,1 A 3,1 15,7

0 10 AA 0,0 11,6

g.42625414G>T

92 71 GG 94,8 82,6

0,0256

G 97,4 90,7

0,0058 rs428375521 5 14 GT 5,2 16,3 T 2,6 9,3

0 1 TT 0,0 1,2

g.42625446C>T**

84 28 CC 86,6 32,6 C 93,3 60,5

<0,0001 rs407017992 13 48 CT 13,4 55,8 <0,0001 T 6,7 39,5

0 10 TT 0,0 11,6

g.42625525A>G**

39 8 AA 40,2 9,3 A 57,2 28,5

<0,0001 rs422192534 33 33 AG 34,0 38,4 <0,0001 G 42,8 71,5

25 45 GG 25,8 52,3

g.42625534T>C**

38 7 TT 39,2 8,1 T 55,2 27,3

<0,0001 rs400729075 31 33 TC 32,0 38,4 <0,0001 C 44,8 72,7

28 46 CC 28,9 53,5

g.42625600A>G**

35 7 AA 36,1 8,1 A 53,1 28,5

<0,0001 rs407944017 33 35 AG 34,0 40,7 <0,0001 G 46,9 71,5

29 44 GG 29,9 51,2

40 14 CC 41,2 16,3 C 56,7 31,4

g.42625785C>T** 30 26 CT 30,9 30,2 0,0002 T 43,3 68,6 <0,0001 rs419029128

27 46 TT 27,8 53,5

53 37 GG 54,6 43,0 G 68,0 70,3

g.42625811G>A** 26 47 GA 26,8 54,7 <0,0001 A 32,0 29,7 0,6334 rs401662939

18 2 AA 18,6 2,3

90 46 GG 92,8 53,5 G 96,4 72,1

g.42625831G>A** 7 32 GA 7,2 37,2 <0,0001 A 3,6 27,9 <0,0001 rs162278939

0 8 AA 0,0 9,3

http://www.ensembl.org/Ovis_aries/Variation/Explore?db=core;tl=ieSqeqKAxK4wjSRX-1631547;v=rs417411045








106


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.42625974T>C**

25 45 TT 25,8 52,3

0,0002

T 39,7 65,7

<0,0001 rs424143722 27 23 TC 27,8 26,7 C 60,3 34,3

45 18 CC 46,4 20,9

g.42626055G>A**

54 39 GG 55,7 45,3

0,0001

G 68,6 70,9

0,6220 rs398261375 25 44 GA 25,8 51,2 A 31,4 29,1

18 3 AA 18,6 3,5

g.42626121C>T**

43 8 CC 44,3 9,3 C 59,3 27,9

<0,0001 rs413668712 29 32 CT 29,9 37,2 <0,0001 T 40,7 72,1

25 46 TT 25,8 53,5

g.42626178T>C**

40 7 TT 41,2 8,1 T 56,2 27,3

<0,0001 rs424964941 29 33 TC 29,9 38,4 <0,0001 C 43,8 72,7

28 46 CC 28,9 53,5

g.42626214T>C**

38 6 TT 39,2 7,0 T 55,2 25,0

<0,0001 rs403309597 31 31 TC 32,0 36,0 <0,0001 C 44,8 75,0

28 49 CC 28,9 57,0

g.42626217G>A**

40 7 GG 41,2 8,1 G 57,2 27,9

<0,0001 rs410518425 31 34 GA 32,0 39,5 <0,0001 A 42,8 72,1

26 45 AA 26,8 52,3

91 72 AA 93,8 83,7 A 96,9 91,3

g.42626230A>G 6 13 AG 6,2 15,1 0,0761 G 3,1 8,7 0,0208 rs423441243

0 1 GG 0,0 1,2

42 31 GG 43,3 36,0 G 60,8 66,3

g.42626364G>A** 34 52 GA 35,1 60,5 0,0001 A 39,2 33,7 0,2797 rs417258958

21 3 AA 21,6 3,5

59 37 GG 60,8 43,0 G 71,1 70,3

g.42626539G>A** 20 47 GA 20,6 54,7 <0,0001 A 28,9 29,7 0,8691 -

18 2 AA 18,6 2,3









107


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.42626685G>A**

54 76 GG 55,7 88,4

<0,0001

G 66,0 92,4

<0,0001 rs428514817 20 7 GA 20,6 8,1 A 34,0 7,6

23 3 AA 23,7 3,5

g.42626803C>T**

28 30 CC 28,9 34,9

0,0012

C 54,6 66,3

0,0232 rs403089766 50 54 CT 51,5 62,8 T 45,4 33,7

19 2 TT 19,6 2,3

g.42626874C>T

77 60 CC 79,4 69,8 C 89,7 84,3

0,1241 rs418303621 20 25 CT 20,6 29,1 0,2215 T 10,3 15,7

0 1 TT 0,0 1,2

g.42626996T>C**

12 9 TT 12,4 10,5 T 47,9 29,1

0,0002 - 69 32 TC 71,1 37,2 <0,0001 C 52,1 70,9

16 45 CC 16,5 52,3

g.42627113G>A

70 50 GG 72,2 58,1 G 86,1 77,9

0,0411 - 27 34 GA 27,8 39,5 0,0641 A 13,9 22,1

0 2 AA 0,0 2,3

g.42627152G>A

70 54 GG 72,2 62,8 G 86,1 80,8

0,1742 - 27 31 GA 27,8 36,0 0,2607 A 13,9 19,2

0 1 AA 0,0 1,2

71 37 GG 73,2 43,0 G 86,6 65,7

g.42627199G>A** 26 39 GA 26,8 45,3 <0,0001 A 13,4 34,3 <0,0001 -

0 10 AA 0,0 11,6

67 41 TT 69,1 47,7 T 84,5 71,5

g.42627301T>C** 30 41 TC 30,9 47,7 0,0034 C 15,5 28,5 0,0025 -

0 4 CC 0,0 4,7

40 55 GG 41,2 64,0 G 69,6 80,2

g.42627382G>C** 55 28 GC 56,7 32,6 0,0047 C 30,4 19,8 0,0196 -

2 3 CC 2,1 3,5




108


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.42627386C>T

80 77 CC 82,5 89,5

0,1721

C 91,2 94,8

0,1895 - 17 9 CT 17,5 10,5 T 8,8 5,2

0 0 TT 0,0 0,0

g.42627413T>C*

54 65 TT 55,7 75,6

0,0075

T 75,8 87,8

0,0032 - 39 21 TC 40,2 24,4 C 24,2 12,2

4 0 CC 4,1 0,0

g.42627482A>G

87 71 AA 89,7 82,6 A 94,8 91,3

0,1771 - 10 15 AG 10,3 17,4 0,1609 G 5,2 8,7

0 0 GG 0,0 0,0

g.42627701C>T**

60 71 CC 61,9 82,6 C 74,2 90,7

<0,0001 - 24 14 CT 24,7 16,3 0,0013 T 25,8 9,3

13 1 TT 13,4 1,2

g.42627702G>C**

60 63 GG 61,9 73,3 G 74,2 85,5

0,0078 rs406194123 24 21 GC 24,7 24,4 0,0212 C 25,8 14,5

13 2 CC 13,4 2,3

g.42628023G>A**

94 48 GG 96,9 55,8 G 98,5 74,4

<0,0001 rs403005481 3 32 GA 3,1 37,2 <0,0001 A 1,5 25,6

0 6 AA 0,0 7,0

43 24 TT 44,3 27,9 T 59,3 55,2

g.42628173T>C** 29 47 TC 29,9 54,7 0,0031 C 40,7 44,8 0,4347 rs418468486

25 15 CC 25,8 17,4

60 47 GG 61,9 54,7 G 78,9 76,2

g.42628237G>A** 33 37 GA 34,0 43,0 0,4025 A 21,1 23,8 0,5359 rs429532201

4 2 AA 4,1 2,3

35 21 AA 36,1 24,4 A 56,7 58,7

g.42628259A>G** 40 59 AG 41,2 68,6 0,0004 G 43,3 41,3 0,6963 rs403953588

22 6 GG 22,7 7,0






109


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


g.42628421A>G**

74 74 AA 76,3 86,0

0,0148

A 80,9 91,9

0,0026 rs414993519 9 10 AG 9,3 11,6 G 19,1 8,1

14 2 GG 14,4 2,3

g.42628438T>C**

32 31 TT 33,0 36,0

<0,0001

T 52,1 65,7

0,0082 rs430307080 37 51 TC 38,1 59,3 C 47,9 34,3

28 4 CC 28,9 4,7

g.42628555G>A

89 84 GG 91,8 97,7 G 95,4 98,8

0,0519 rs161627795 7 2 GA 7,2 2,3 0,1947 A 4,6 1,2

1 0 AA 1,0 0,0

g.42628581G>A**

48 72 GG 49,5 83,7 G 68,0 91,9

<0,0001 rs427085960 36 14 GA 37,1 16,3 <0,0001 A 32,0 8,1

13 0 AA 13,4 0,0

g.42628609A>C**

91 70 AA 93,8 81,4 A 96,4 89,0

0,0057 rs409655600 5 13 AC 5,2 15,1 0,0358 C 3,6 11,0

1 3 CC 1,0 3,5

g.42628678C>T*/**

48 42 CC 49,5 48,8 C 65,5 73,8

0,0828 rs421035003 31 43 CT 32,0 50,0 0,0002 T 34,5 26,2

18 1 TT 18,6 1,2

54 82 CC 55,7 95,3 C 55,7 97,7

g.42628813C>T** 0 4 CT 0,0 4,7 <0,0001 T 44,3 2,3 <0,0001 rs590844301

43 0 TT 44,3 0,0

44 39 TT 45,4 45,3 T 61,9 71,5

g.42628830T>G** 32 45 TG 33,0 52,3 0,0002 G 38,1 28,5 0,0510 rs410614126

21 2 GG 21,6 2,3









110


continuação


Genótipo

Frequência


(FG) Alelo

Frequência

alélica (%) Prob.

(FA)

Variação

Existente


44 36 GG 45,4 41,9 G 62,9 70,3

g.42628928G>A** 34 49 GA 35,1 57,0 <0,0001 A 37,1 29,7 0,1314 rs400201468

19 1 AA 19,6 1,2 Prob. FG e Prog. FA – Probabilidades do teste qui-quadrado ao comparar os grupos Embrapa e UFBA quanto as frequências genotípicas e alélicas,

respectivamente.

ID do cromossomo 21que se localiza o gene CAPN1 no genoma de ovinos versão 4.0: NC_019478.2.

ID do gene CAPN1 no genoma de ovinos versão 4.0: 443130




111

Alguns marcadores identificados nos genes CAST e CAPN1 não foram utilizados

nos testes de associação com as características de carcaça e qualidade de carne devido à

ausência ou baixa frequência em alguma classe genotípica, o que impedia a estimação

dos efeitos de interesse (aditivo ou dominância). Um total de 52 marcadores no CAST e

36 no CAPN1 foram utilizados nos testes de associação, o que levou a um nível de

significância de 0,000253 pela correção de Bonferroni. Contudo, aquelas associações

significativas ao nível de 5% também foram apresentadas nas Tabelas 4 e 5, as quais são

aqui consideradas como ligações sugestivas.

A calpastatina é um inibidor específico das calpaínas e polimorfismos no gene

CAST estão essencialmente associados com a maciez da carne post mortem em algumas

espécies de animais domésticos, incluindo os ovinos (KNIGHT et al., 2012; KNIGHT et

al., 2014; e AALI et al., 2017). Também há relatos de efeito sobre características de

crescimento (NASSIRY et al., 2006; e KHAN et al., 2012). Contudo, apenas Yilmaz et

al., (2014) reportaram efeito de polimorfismo no gene CAST sobre característica de

carcaça, no caso espessura de gordura subcutânea. Assim, trata-se de um gene que pode

ser candidato a estudos de associção com várias características de interesse econômico,

incluindo atributos de carcaça. No presente estudo foram identificadas 26 ligações

sugestivas entre polimorfismos no gene CAST (Tabela 4) e atributos de carcaça e

qualidade de carne, mas apenas uma associação significativa ao nível da correção de

Bonferroni para a característica de perda de peso por cocção.

O SNP g.93395190A>T teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para o peso e o

rendimento de paleta e para o rendimento de costela (Tabela 4). No caso dos rendimentos,

foram observados efeitos aditivo e de dominância, mas para o peso de paleta foi

encontrado apenas efeito aditivo. Os cortes de paleta e costela são bastante valorizados

no comércio de carne ovina e por isso o objetivo de seleção deve ser ampliar o valor

médio destas três variáveis. O alelo A atende esse objetivo e ele tem boa frequência em

ambos os grupos aqui avaliados, mas é consideravelmente maior no grupo Embrapa

(Tabela 2). Ressalta-se que as frequências alélicas e genotípicas deste marcador diferem

entre os grupos estudados, logo a resposta a seleção pode variar dentro da raça Santa Inês.

O efeito de dominância observado para os rendimentos de paleta e de costela indicam que

os heterozigotos apresentam um desvio em relação à média dos homozigotos e como o

valor é negativo a média dos homozigotos é superior à média dos heterozigotos.

112


testes de associação com polimorfismos no gene CAST

Variável a(EP) d(EP) LRT P

g.93395190A>T

Peso de paleta 0,1260 (0,0615) - 4,14 0,418E-01

Rendimento de paleta 0,9377 (0,3224) -0,8779 (0,4725) 10,96 0,416E-02

Rendimento de costela 1,8187 (0,5451) -2,0732 (0,7913) 16,04 0,328E-03

g.93395243T>G

Peso de carcaça fria -0,8830 (0,3531) - 6,15 0,131E-01

Comprimento interno da carcaça -0,9105 (0,4460) - 4,12 0,423E-01

Comprimento externo da carcaça -1,8191 (0,5694) - 9,93 0,162E-02

Rendimento de lombo 0,5714 (0,2925) -0,6587 (0,3985) 10,20 0,610E-02

g.93395469G>C

Peso de pernil 0,2647 (0,1318) - 3,99 0,458E-01

Rendimento de pernil 1,9915 (0,9640) - 4,22 0,400E-01

g.93395478G>A

Peso de costela 0,2639 (0,0981) - 7,11 0,765E-02

Peso de carcaça quente 0,7166 (0,2933) - 5,87 0,154E-01

Peso de pescoço 0,0628 (0,0298) - 4,40 0,360E-01

g.93395835G>A

pH0 -0,0700 (0,0239) - 10,51 0,119E-02

g.93396080A>G

Área do músculo L. dorsi -0,3876(0,1628) - 5,58 0,182E-01

g.93396154T>C

Rendimento biológico 1,4738 (0,5412) - 7,03 0,801E-02

g.93396162T>C

Rendimento de pescoço -0,3021 (0,1318) - 5,18 0,229E-01

g.93396257T>C

Peso de lombo desossado 0,0283(0,0125) -0,0416(0,0213) 8,06 0,177E-01

g.93397179G>A

pH24 -0,0862 (0,0324) - 8,24 0,409E-02

g.93397600C>G

Perdas de peso por cocção 0,0203 (0,0051) - 14,17 0,167E-03

g.93397718C>T

Largura da carcaça na garupa 1,5625(0,5245) - 8,67 0,324E-02

Largura da carcaça no tórax 2,9299(1,1052) - 6,90 0,863E-02

Intensidade de brilho (L*) -0,9409 (0,4757) - 3,87 0,491E-01



g.93397780T>C

Escore de terminação de carcaça 0,1738(0,0752) - 5,26 0,218E-01


O marcador g.93395218A>G teve efeito aditivo sugestivo (p<0,05) para a

variável comprimento interno da carcaça, onde o alelo G é o responsável pelo aumento

113

do comprimento. Porém a frequência deste alelo nos grupos estudados foi baixa,

indicando que há espaço para a amplificação da mesma nos dois rebanhos.

O SNP g.93395243T>G teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para as variáveis

peso de carcaça fria, comprimento externo da carcaça e rendimento do lombo (Tabela 4),

sendo o alelo T responsável por aumentar a média do rendimento de lombo, enquanto o

alelo G aumentou os valores médios das demais variáveis. Este mesmo SNP também

apresentou efeito de dominância para rendimento do lombo, sendo a média dos

heterozigotos inferior à média dos homozigotos. As frequências genotípicas e alélicas

deste marcador também diferem (P<0,05) entre os grupos estudados e a frequência do

alelo T é maior que a do G, sobretudo no grupo Embrapa. A princípio o objetivo de

seleção destas variáveis é ampliar o valor médio. Contudo, as informações deste marcador

não possibilitam que esse aumento ocorra simultaneamente para essas quatro variáveis.

Logo, a seleção para um destes alelos deve ser acompanhada de um monitoramento das

outras variáveis a fim de evitar que perdas ocorram.

O SNP g.93395307T>C apresentou efeito aditivo sugestível para o peso de

costela. A costela é um corte comercial bastante apreciado em ovinos e por isso o objetivo

deve ser ampliar o valor médio do peso de costela. O alelo T pode ajudar a atingir esse

objetivo. As frequências genotípicas e alélica para o genótipo TT e o alelo T foi maior no

grupo Embrapa (Tabela 2), indicando grande espaço para ampliar as frequências do alelo

T e do genótipo TT na raça Santa Inês no grupo UFBA e pode trazer bons ganhos em

peso de costela. Os resultados das frequências para este marcador mostram que há

diferença entre os rebanhos Santa Inês e pode ser um marcador usado em seleção para a

melhoria da variável peso de costela.

O SNP g.93395469G>C teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre peso e

rendimento de pernil (Tabela 4). A raça Santa Inês apresenta pernil com pouco

desenvolvimento muscular e é um objetivo de seleção ampliá-lo. O alelo G é aquele que

aumenta o valor destas variáveis e sua frequência difere entre os grupos estudados. Sua

frequência é maior que a do alelo T, sendo bastante alta no grupo Embrapa (Tabela 2).

As frequências genotípicas também diferem entre os grupos, pois enquanto praticamente

todos os animais da Embrapa são GG, grande parte dos animais UFBA são GC. Logo, a

resposta a seleção com base neste marcado dependerá do rebanho sob seleção.

O SNP g.93395478G>A teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre os pesos de

carcaça quente e pescoço (Tabela 4). O peso de carcaça quente tem grande valor

comercial e o objetivo de seleção é ampliar suas médias, enquanto o peso do pescoço tem

114

pouco valor de mercado e por isso seu peso é pouco importante para o sistema de

produção. O alelo G proporciona maiores valores médios dessas variáveis que o alelo A

e por isso deve ser considerado o alelo favorável. No entanto, a resposta a seleção com

base nas informações deste marcador irá depender do rebanho sob seleção, pois as

frequências alélica e genotípica desse SNP diferiram entre os grupos estudados (Tabela

2). No grupo Embrapa a frequência de G é consideravelmente maior que a do alelo A,

mas no grupo UFBA os dois alelos apresentaram frequências muito próximas. Além

disso, o genótipo desejável (GG) é bem menos frequente no grupo UFBA do que no grupo

Embrapa, onde praticamente todos os animais são GG. A combinação das informações

deste SNP com as informações do SNP g.93396162T>C pode ser útil, pois este último

também está associado (P<0,05) a uma medida de pescoço, mas não com peso e sim com

seu rendimento (Tabela 4). O alelo não-mutante T diminui esse rendimento e deve ser

considerado favorável. Logo, para ambos os SNP a seleção deve priorizar o aumento da

frequência dos alelos não-mutantes. As frequências alélicas e genotípicas do SNP

g.93396162T>C não diferem (P>0,05) entre os grupos estudados, mas o genótipo TT tem

menor frequência que os demais e o a alelo T é menos frequente que o C (Tabela 2), o

que evidencia grande espaço para ampliar as frequências do genótipo e do alelo de

interesse.

Os SNP g.93395835G>A e g.93397179G>A tiveram efeito aditivo sugestível

(P<0,05) para as variáveis pH0 e pH24, respectivamente. O pH é uma característica

importante para a qualidade da carne, pois pode influenciar vários fatores como

capacidade de retenção de água, perda de peso por cozimento, força de cisalhamento e a

cor, alterando assim a aparência e suculência da carne. Por isso, valores muito elevados

ou muito baixos, podem estar associados a carnes DFD (Dark, Firm, Dry) ou PSE (Pale,

Soft, Exudative), respectivamente. Segundo Adzitey e Nurul (2011), a carne bovina se

caracteriza como PSE quando o pH mensurado 45 minutos pós-abate apresenta um valor

inferior a seis, enquanto carne bovina com pH≥6,0 entre 12 e 48 pós-abate são DFD. O

pH inicial geralmente é maior que 6 em ovinos, como pode ser observado em Sañudo et

al. (2000) e Costa et al. (2015) e o pH24 dificilmente é superior a seis em ovinos Santa

Inês (Jucá et al., 2016). Assim, é difícil caracterizar um alelo favorável nesses casos em

que a variável não pode ter valores muito baixos ou muito altos. Nos dois SNPs, o alelo

A aumenta os valores médios de pH. As frequências alélicas e genotípicas destes

marcadores não diferem entre os grupos estudados. No caso do SNP g.93395835G>A o

alelo A é um pouco menos frequente que o G em ambos os grupos, mas para o SNP

115

g.93397179G>A o alelo A é mais frequente que o G no grupo Embrapa (Tabela 2).

Também pode se observar na Tabela 2 que a frequência dos heterozigotos é superior à

dos homozigotos, exceto para o SNP g.93397179G>A no grupo UFBA.

O marcador g.93397600C>G foi o único que teve efeito aditivo (P<0,000253)

significativo ao nível da correção de Bonferroni e influenciou a variável perda de peso do

músculo durante o processo de cozimento (Tabela 4). O alelo C aumenta as perdas por

cocção e por isso o alelo G é o desejável. As frequências alélicas e genotípicas deste

marcador diferem entre os grupos estudados, mas a frequência do alelo G é baixa nos dois

rebanhos (Tabela 2), sendo o genótipo GG observado em poucos animais. Logo, a seleção

para ampliar a frequência deste grupo pode trazer boms ganhos para essa variável.

O SNP g.93396080A>G teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre a área do

músculo Longissimus dorsi (Tabela 4). Esse músculo tem alto valor comercial e por isso

a seleção tem como objetivo ampliá-lo. O alelo A pode ajudar a atingir esse objetivo pois

foi observado maior valor médio em animais AA que animais GG. As frequências

genotípicas desse marcador são semelhantes (P>0,05) nos dois grupos estudados, mas as

frequências alélicas diferiram (P<0,05) (Tabela 2). O alelo desejável A é um pouco mais

frequente no UFBA que no grupo Embrapa. Contudo, em ambos os grupos o alelo A é

menos frequente que o alelo G. Chama atenção o fato de que o peso do lombo desossado

também sofre efeito aditivo sugestivo (P<0,05) de polimorfismo neste gene, mas por

outro SNP g.93396257T>C (Tabela 4). O alelo favorável também é o não mutante (T),

cujas frequências não diferem entre os grupos estudados (Tabela 2), mas o alelo T é

menos frequente que o alelo C em ambos os grupos. Esse marcador também tem um efeito

de dominância sobre o peso do lombo desossado, mas com sinal negativo. Logo, a média

dos heterozigotos é inferior à média dos homozigotos e a seleção deve buscar não apenas

ampliar a frequência do alelo T, mas sim a frequência do genótipo TT. O fato dos alelos

e genótipos desse dois SNP estarem em baixa frequência nos grupos estudados indica que

a seleção a partir de suas informações tem grande potencial de melhorar o tamanho do

Longissimus dorsi em ovinos Santa Inês.

Apesar de polimorfismos no gene CAST terem influenciado o rendimento de todos

os cortes da carcaça (lombo, paleta, pernil, costela e pescoço), não foram observados

efeitos sobre os rendimentos das carcaças quente e fria. Contudo, o SNP g.93396154T>C

teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre o rendimento biológico (Tabela 4), com o

alelo T aumentando o valor médio. As frequências alélicas e genotípicas desse SNP não

diferiram entre os grupos estudados (Tabela 2), mas pode se observar que apesar do alelo

116

desejável ser mais frequente nos dois grupos estudados, o genótipo desejável (TT) é

menos frequente que o heterozigoto TC, indicando que há espaço para ampliar as

frequências do alelo e do genótipo desejáveis.

O SNP g.93397718C>T teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre as larguras

da carcaça nas regiões da garupa e do tórax e para as características cromáticas da carne

(L*, a* e b*) (Tabela 4). Ampliar essas larguras pode levar as carcaças a ficarem mais

pesadas e por isso o objetivo de seleção é aumentar a médias dessas duas variáveis. O

alelo C pode ajudar a atingir esse objetivo, pois a médias dos animais homozigoto CC foi

maior que a média dos homozigotos TT. As frequências alélicas e genotípicas desse SNP

não diferem entre os grupos estudados (Tabela 2) e o alelo desejável aparece com mais

de 2/3 da frequência. Contudo, o genótipo desejável pode ter sua frequência ampliada,

pois ainda há um número elevado de animais heterozigotos nos dois grupos. Porém o

aumento da frequência deste genótipo deve ser monitorado pois pode interferir na

aparecia da carne já que o C diminui os valores de L*, a* e b*. Por isso a seleção para

qualquer um destes alelos deve ser acompanhado para evitar perdas em alguma

característica de interesse.

Por fim, o SNP g.93397780T>C teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre

escore de terminação de carcaça (Tabela 4). O escore de terminação indica qual o nível

de gordura de cobertura na carcaça dos animais e ovinos Santa Inês quando abatidos em

idades mais jovens tendem a ter pouca gordura de cobertura na carcaça (Jucá et al, 2016).

Essa gordura é importante, pois sem ela em um nível adequado a carcaça tende a perder

qualidade durante o processo de resfriamento. O alelo T responsável por aumentar o valor

médio dessa variável e por isso deve ser considerado como favorável. As frequências

alélicas e genotípicas deste SNP não diferem entre os grupos estudados (Tabela 2) e a

frequência do alelo desejável já se encontra bastante alta (>89%) em ambos os grupos.

Logo, a seleção com base neste marcador não tende a trazer grande impacto na média

dessa variável.

O gene CAPN1 em ovinos está localizado no cromossomo 21 com

aproximadamente 25 kb e se dividi em 22 exons e 21 introns. Ele é responsável pela

codificação da enzima proteolítica µ-calpaína (SMITH et al., 2000), a qual atua na

degradação de fibras musculares no post-mortem. Assim, associações significativas entre

polimorfismos no gene CAPN1 e maciez de carne foram reportadas em vários estudos

com bovinos (PINTO et al., 2010; TAIT-JR et al., 2014). Já nos ovinos há relatos de

associações entre polimorfismos no gene CAPN1 com peso vivo (DEHNAVI et al, 2012)

117

e taxa de crescimento (MAHROUS et al., 2016), mas não com variáveis de carcaça e

carne. No presente estudo foram identificadas 21 ligações sugestivas (P<0,05)

envolvendo oito polimorfismos no gene CAPN1 (Tabela 5), mas nenhuma associação

significativa ao nível da correção de Bonferroni.


testes de associação com polimorfismos no gene CAPN1

Variável a(EP) d(EP) LRT P

g.42625446C>T

Rendimento de costela - -1,7757 (0,8455) 10,34 0,130E-02

Perdas por cocção 0,2926 (0,1282) 0,3050 (0,1283) 4,15 0,415E-01

g.42625811G>A

Área do músculo L. dorsi -0,5317 (0,2316) - 5,19 0,227E-01

g.42626685G>A

Escore de terminação de carcaça 0,1399 (0,0544) - 6,49 0,108E-01

Rendimento de paleta -0,5888 (0,2696) - 4,70 0,300E-01


g.42626996T>C

pH0 -0,0910 (0,0349) - 6,57 0,104E-01

g.42627413T>C

Escore de conformação de carcaça 0,1053 (0,0469) - 4,96 0,259E-01

Comprimento de pernil 1,0045 (0,4605) - 4,69 0,302E-01

Peso de pernil -0,2971 (0,1198) - 6,04 0,140E-01

Rendimento de pernil -2,4015 (0,8787) - 7,31 0,686E-02

Intensidade de brilho (L*) -1,4828 (0,6202) - 5,62 0,177E-01


g.42627702G>C

Peso da carcaça fria 0,6152 (0,2945) - 4,31 0,378E-01

Profundidade do tórax 0,4657 (0,2104) - 4,83 0,279E-01

Peso de pescoço 0,0553 (0,0267) - 4,25 0,393E-01

g.42628173T>C

Comprimento interno da carcaça 0,6507 (0,3080) - 4,41 0,358E-01

g.42628421A>G

Peso de costela 0,3137 (0,1016) -0,4464 (0,2064) 10,22 0,603E-02

Peso do lombo desossado -0,0372 (0,0179) - 4,26 0,390E-01

Força de cisalhamento 0,1993 (0,0714) - 7,62 0,575E-02


O SNP g.42625446C>T teve efeito de dominância (P<0,05) sobre rendimento de

costela. O rendimento de costela é uma variável que os criadores desejam aumentar o

valor médio, enquanto para as perdas por cocção o objetivo é reduzir o valor médio. Para

a variável rendimento de costela o efeito de dominância foi negativo e indica que a média

dos heterozigotos é inferior à média dos dois homozigotos. Outro SNP que também afeta

uma medida de costela é o g.42628421A>G, mas neste caso além de efeito de dominância

também há efeito aditivo. Para este SNP o efeito de dominância também é negativo e

novamente a média dos heterozigotos é inferior à média dos dois homozigotos. O alelo

118

que aumenta peso de costela no SNP g.42628421A>G é o A. Para ambos os SNP as

frequências alélicas e genotípicas diferem entre os grupos estudados (Tabela 3), indicando

que a resposta a seleção pode variar em função do rebanho. Contudo, o alelo A do SNP

g.42628421A>G apesar de ser desejável, já se encontra em alta frequência nos dois

grupos aqui estudados. O SNP g.42625446C>T também teve efeito sobre perdas por

cocção, mas neste caso tem-se efeito aditivo e de dominância. Perda por cocção é um uma

variável que o objetivo de seleção visa reduzir seu valor e o alelo T pode contribuir para

atingir esse objetivo. As frequências alélicas e genotípicas desse marcador diferem

(P<0,05) entre os grupos estudados (Tabela 2), sendo a frequência do alelo T menor que

a do alelo C em ambos os grupos, mas bem menor no grupo Embrapa, no qual não foi

observado nenhum animal TT. O fato do efeito de dominância deste marcador ser

positivo indica que os heterozigotos apresentam perda por cocção maior que a média dos

heterozigotos, o que leva a necessidade de buscar animais homozigotos para TT e não

apenas ampliar a frequência do alelo T.

O SNP g.42625811G>A teve efeito aditivo sobre a área do músculo Longissimus

dorsi, sendo o alelo G responsável por aumentar o valor médio dessa variável. As

frequências genotípicas diferem entre os grupos Embrapa e UFBA (Tabela 3), mas as

frequências alélicas são semelhantes nestes. A frequência do alelo G já se encontra acima

de 65% em ambos os grupos, mas o genótipo desejável GG ainda pode ter sua frequência

ampliada de forma significativa, visto que ainda há muito animais heterozigotos,

principalmente, no grupo UFBA. Outro SNP que influencia esse músculo é o

g.42628421A>G, mas neste caso através do peso de lombo desossado e força de

cisalhamento (Tabela 5). Este SNP teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) e o alelo que

aumenta o peso do lombo é o A. Este mesmo alelo diminuo a força de cisalhamento, o

que é desejável. Contudo, como já mencionado, este alelo está em alta frequência nos

dois grupos estudados e pouco ganho é esperado com a utilização de sua informação no

processo de seleção.

O SNP g.42626685G>A teve efeitos aditivos sugestivos (P<0,05) sobre escore de

terminação de carcaça, rendimento de paleta e intensidades da cor vermelha (a*), com o

alelo G proporcionando maiores valores de escore de terminação, enquanto o alelo A

aumenta o rendimento de paleta e a intensidade da cor vermelha. Como já mencionado, a

seleção para escore de terminação visa aumentar o grau de acabamento das carcaças dos

ovinos Santa Inês, visto serem muito desprovidas de gordura quando os animais são

abatidos jovens. Por outro lado, a paleta é um corte comercial valorizado e ampliar seu

119

tamanho pode trazer benefícios, bem como a intensidade da cor vermelha que influencia

na aparência da carne. Assim, as informações deste marcador devem ser utilizadas com

cautela e seja qual for o alelo escolhido é importante manter um monitoramento das

demais variáveis para evitar perdas. As frequências alélicas e genotípicas deste SNP

diferem entre os grupos Embrapa e UFBA (Tabela 3). Contudo, em ambos os grupos o

alelo G é mais frequente que o A e o genótipo GG mais frequente que os demais. Logo,

a seleção visando ampliar o rendimento de paleta e a intensidade da cor vermelha pode

trazer maiores ganhos que a seleção para ampliar escore de terminação de carcaça.

O SNP g.42626996T>C teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre pH da carne

logo após abate (Tabela 5), sendo o alelo C responsável por aumentar o valor dessa

variável. Para este marcador as frequências alélicas e genotípicas diferem entre os grupos

estudados (Tabela 3), seno o alelo C mais frequente que o T em ambos os grupos, mas as

frequências destes alelos diferem principalmente no grupo UFBA. Por se desejar valores

de pH não muito altos, o alelo T pode ser o alelo favorável, mas em todos os genótipos o

pH foi inferior a sete que é o recomendado logo após abate.

O SNP g.42627413T>C teve efeitos aditivos sugestivos (P<0,05) sobre escore de

conformação de carcaça, comprimento de pernil, peso de pernil, rendimento de pernil,

intensidades de brilho (L*) e da cor vermelha (a*) (Tabela 5). O objetivo de seleção para

essas variáveis é aumentar o valor médio e o alelo T foi o responsável pelo aumento nos

valores médios do escore de conformação de carcaça e do comprimento de pernil,

enquanto o alelo C aumentou o valor médio do peso, rendimento de pernil, L* e a*.

Novamente tem-se as frequências genotípicas e alélicas diferindo entre os grupos

Embrapa e UFBA (Tabela 3). Tanto o alelo C quanto o genótipo CC aparecem em baixa

frequência nos grupos estudados, o que indica maior potencial de ganho com a seleção

direcionada para este alelo e genótipo do que o ganho com a seleção para o alelo T ou

genótipo TT. Ressalta-se que a raça Santa Inês carece de um trabalho de seleção que

melhore o desenvolvimento do pernil e as informações deste marcador podem ser uteis

neste processo.

O SNP g.42627702G>C teve efeitos aditivos sugestivos (P<0,05) sobre os pesos

de carcaça fria e pescoço e sobre profundidade do tórax (Tabela 5), sendo o alelo G

responsável por aumentar o valor médio das três variáveis. As frequências alélicas e

genotípicas deste marcador diferem (P<0,05) em função dos grupos Embrapa e UFBA

(Tabela 3), mas o alelo G é mais frequente que o C em ambos os grupos. A frequência do

120

genótipo GG é superior a 60% em ambos os grupos, indicando que os ganhos com a

seleção para este genótipo podem não ser tão altos.

Por fim, o SNP g.42628173T>C teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre

comprimento interno da carcaça (Tabela 5). O Alelo T aumentou o valor médio dessa

variável e sua frequência não difere entre os grupos estudados (Tabela 3), sendo maior

que a do alelo C em ambos os grupos. Já as frequências genotípicas deste SNP não são

similares entre os grupos UFBA e Embrapa, sendo o genótipo TT mais frequente que os

demais no grupo Embrapa, enquanto no grupo UFBA o genótipo TC é o mais comum.

Logo, a resposta a seleção com base na informação deste marcador dependerá das

frequências genotípicas do rebanho sob seleção.

Variáveis relacionadas com qualidade de carne e de crescimento foram mais

exploradas que aquelas relacionadas com atributos de carcaça em estudos de associação

com polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 em ovinos. Aali et al., (2017) reportaram

haplótipos no gene CAST, formados a partir dos SNPs C24T, G62A, G65T e T69- (intron

5) e c.197A>T e c.282G >T (exon 6), associados a maciez de carne, perfil de ácidos

graxos e colesterol na carne de ovinos. Knight et al., (2012) também citam efeitos dos

SNPs 101781475G>A e 101841509C>T no gene CAST sobre maciez da carne ovina, mas

nenhum efeito de polimorfismos no gene CAPN1 sobre essa variável. Enquanto Knight

et al., (2014) identificaram o SNP localizado na posição 101783060 entre os exons 1 e 2

do gene CAST, associado a maciez da carne cinco dias pós-abate, mas não identificaram

nenhum efeito do gene CAPN1 sobre essa variável. Outros estudos reportam efeito de

polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 sobre crescimento. Nassiry et al., (2006)

reportaram polimorfismo do tipo PCR-SSCP associado a ganho de peso do nascimento a

desmama em ovinos da raça Kurdi, enquanto Khan et al., (2012) reportaram associação

entre polimorfismos do tipo PCR-RFLP no exon 1 do gene CAST e ganho de peso em

ovinos das raças Balkhi e Kajli. Porém, Sutikno et al., (2011) e Denhavi et al., (2012)

também testaram associação com peso vivo, mas não encontraram efeito significativo

(P>0,05) de polimorfismo no gene CAST. Denhavi et al., (2012) reportaram associação

de polimorfismo PCR-RFLP no gene CAPN1 associado com peso aos 12 meses, enquanto

Mahrous et al., (2016) identificaram SNP no intron-5 do gene CAPN1 afetando peso vivo

e ganho de peso diário.

Polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 que influenciam peso vivo em ovinos,

então pode haver efeito para atributos de carcaça. Contudo, apenas um estudo reportou

ter realizado testes de associação de polimorfismos no gene CAST e CAPN1 com variáveis

121

de qualidade de carcaça em ovinos, até o presente momento. Knight et al., (2014)

realizaram teste de associação de polimorfismos nestes genes para três variáveis de

carcaça: profundidade do músculo Longissimus entre a 12ª e 13ª costelas, espessura de

gordura neste músculo na mesma região e o peso de carcaça quente, mas não encontraram

nenhum efeito de SNPs nos genes CAST ou CAPN1 sobres estas três variáveis. Logo, o

presente estudo é o primeiro a reportar efeitos de polimorfismos no gene CAST sobre

variáveis de carcaça em ovinos.

Os polimorfismos aqui identificados como associados a atributos de carcaça estão

localizados em região de intron. É possível que estes polimorfismos estejam em

desequilíbrio de ligação com outros polimorfismos posicionados em exons nestes genes

ou em outros genes vizinhos. Também não se pode descartar a hipótese de que essas

mutações em intron sejam de fato funcionais, pois mutações nos sítios de junção de exon-

intron (KRAWCZAK et al., 2006) ou mesmo um pouco afastadas deste sitio (COOPER,

2010), mais ainda dentro de região de intron, podem afetar a transcrição do gene ou a

eficiência do splicing. Saravanaperumal et al., (2012) cita que um evento de splicing no

intron 5 do gene SCF (Stem cell factor) em ovinos levou a formação de dois tipos de

proteína SCF, uma solúvel e outra insolúvel, as quais possuem número diferente de

aminoácidos. Assim, maiores estudos devem ser desenvolvidos em busca de elucidar o

mecanismo de ação que essas mutações em intron dos genes CAST e CAPN1 utilizam

para influenciar atributos de carcaça nos ovinos Santa Inês. De qualquer forma, os

achados do presente estudo indicam potencial de uso de polimorfismos nestes genes em

programas de seleção para melhoria de variáveis de qualidade de carcaça em ovinos,

especialmente na raça Santa Inês.

CONCLUSÕES

Existem pelo menos 58 mutações no gene CAST em ovinos Santa Inês quando

comparado ao gene referência depositado no NCBI, sendo que 13 SNPs aqui encontrados

ainda não haviam sido depositados no NCBI. Enquanto no gene CAPN1 existem pelo

menos 45 mutações, das quais 11 ainda não haviam sido depositadas no NCBI.

Apenas uma mutação (g.93395643G>A) no gene CAST foi localizada em região

de exon, indicando que o gene em questão tem regiões de exon com baixa variabilidade.

Este SNP é uma mutação sinônima, pois a troca de base não altera o aminoácido Treonina.

O Mesmo foi observado para o gene CAPN1, no qual apenas o marcador g.42628678C>T

122

foi localizado em região codificadora. Também se trata de uma mutação sinônima, pois

o novo códon não altera o aminoácido Arparagina.

Os SNPs g.93395190A>T, g.93395218A>G, g.93395243T>G, g.93395307T>C,

g.93395469G>C, g.93395478G>A, g.93395835G>A, g.93396080A>G,

g.93396154T>C, g.93396162T>C, g.93396257T>C, g.93396809G>A, g.93397179G>A,

g.93397600C>G, g.93397718C>T e g.93397780T>C no gene CAST apresentam efeito

aditivo sugestivo (P<0,05) para pelo menos uma característica aqui estudada. Já para o

gene CAPN1 os SNPs g.42625446C>T, g.42625811G>A, g.42626685G>A,

g.42626996T>C, g.42627413T>C, g.42627702G>C, g.42628173T>C e g.42628421A>G

apresentam efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para pelo menos um atributo de carcaça ou

qualidade de carne. Assim, estes SNPs são os potenciais marcadores para programas de

seleção em ovinos Santa Inês. Ressalta-se que para muitos destes SNPs há variação de

frequências genotípicas e alélicas entre os rebanhos Santa Inês e a resposta a seleção

dependerá dessas frequências.


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125

CONSIDERAÇÕES GERAIS

O presente estudo identificou um elevado número de marcadores nos genes

estudados, dos quais 115 SPN apresentaram distribuição de frequência que permitiu

utilizá-los em testes de associação, sendo 6 (IGF1), 16 (LEP), 52 (CAST), 5 (GH) e 36

(CAPN1). Contudo, grande parte dos marcadores encontram-se em introns e apenas seis

estão em exon. Isso evidencia que as regiões de exon dos genes estudados apresentam

pouca variação, o que já era de se esperar por se tratar de genes que atuam em várias

etapas importantes do metabolismo. Porém, algumas regiões de exon não foram

sequenciadas no presente estudo e é possí vel que polimorfismos nelas estejam

influenciando a variação das características aqui estudados. Assim, recomenda-se que

sejam identificados marcadores tanto nos exons quanto nos introns que não foram

estudados no presente trabalho, a fim de que uma varredura mais completa do efeito

destes genes seja efetuada.

Para alguns marcadores as frequências genotípicas e alélicas diferiram de forma

expressiva entres os dois grupos de animais estudados (Embrapa e UFBA). Isso indica

que há variação nas frequências de alguns marcadores dentro dos rebanhos da raça Santa

Inês e a resposta ao processo de seleção dependerá muito da frequência do alelo favorável

no rebanho sob seleção.

Marcadores nos genes GH, LEP, IGF1, CAPN1 e CAST apresentaram associação

com as características aqui estudadas. Alguns destes efeitos foram aditivos e podem ser

boa fonte de informação para a seleção de ovinos da raça Santa Inês.

universidade federal da bahia ufba programa de pÓs-graduaÇÃo em zootecnia · 2020-03-03 ·...

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