UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

FACULDADE DE ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIA

EDMÁLIA COSTA BARRETO

AVALIAÇÃO IN VIVO DO REPARO DE DEFEITO ÓSSEO COM BIOMATERIAL DO TIPO MICROESFERAS

CERÂMICAS

Salvador 2006

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1

EDMÁLIA COSTA BARRETO

AVALIAÇÃO IN VIVO DO REPARO DE DEFEITO ÓSSEO COM BIOMATERIAL DO TIPO MICROESFERAS

CERÂMICAS

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Odontologia da UFBA, área de concentração em Clínica Odontológica, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre. Orientador: Profa. Dra. Fabiana Paim Rosa Co-Orientador: Prof. Dr. Aryon de Almeida Barbosa Júnior

Salvador 2006

2

B817 Barreto, Edmália Costa Avaliação in vivo do reparo de defeito ósseo com

biomaterial do tipo microesferas cerâmicas. Edmália Costa Barreto. Salvador, 2006. 103f. Il Orientadora: Profa. Dra. Fabiana Paim Rosa. Co-orientador: Prof. Dr. Aryon de Almeida Barbosa Júnior.

Dissertação (Mestrado em Odontologia Clínica) – Universidade Federal da Bahia, 2006.

1. Biomaterial 2. Microesfera cerâmica. 3. Defeito crítico 4. Hidroxiapatita 5. Regeneração óssea I. Rosa, Fabiana Paim (Orientador) II. Barbosa Júnior, Aryon de Almeida (Co-orientador). III. Universidade Federal da Bahia. IV. Título.

CDU – 616.314.2-002

3

Dedico este trabalho,

aos meus pais, que não estão presentes fisicamente neste mundo, mas

vivem no meu coração e, com certeza, estão muito orgulhosos pelo desenvolvimento

deste trabalho;

aos animais, que fizeram parte deste trabalho e que deram suas vidas

para o desenvolvimento da ciência e aprimoramento do saber.

4

AGRADECIMENTOS

Agradeço, especialmente,

à Profa. Dra. Fabiana Paim Rosa, minha orientadora, por ter me

ensinado, desde o início, a sabedoria da paciência, da persistência e do saber fazer

pesquisa. Continue persistindo neste caminho. Aprendi muito com você!

ao Prof. Dr. Aryon de Almeida Barbosa Júnior, meu co-orientador,

pesquisador do Laboratório de Histopatologia do Centro de Pesquisa Gonçalo

Moniz, da Fundação Oswaldo Cruz, pela grandiosa colaboração com a descrição

das lâminas e na orientação deste trabalho;

ao Prof. Dr. Mário Barbosa e toda sua equipe do INEB-Portugal, pela

contribuição com o biomaterial utilizado neste trabalho e por toda a gentileza em

doar conhecimentos, adquiridos ao longo de anos de pesquisa, mostrando-se

sempre muito generosos. Em particular, agradeço à Profa Dra Cristina Ribeiro, pela

colaboração científica sobre o biomaterial e pela doce amizade que construímos ao

longo desse período;

aos funcionários do Biotério Central da UEFS-BA, em particular Cleóbula

e Júnior, que me deram total apoio no desenvolvimento da fase experimental desta

pesquisa. É muito bom encontrar pessoas que realizam o trabalho com amor e

dedicação e não medem esforços para ajudar o próximo. Adorei conhecer vocês!

5

Agradeço ainda,

aos meus grandes amigos e colegas, que foram e são grandes incentivadores neste

caminho: Márcia Brandão, Maria Olímpia e Luiz Rogério;

aos novos amigos, Fúlvio, Vítor, Isabela, Fabiana e Tatiana, pela grande

colaboração no desenvolvimento deste trabalho. Especialmente a Fúlvio, que me

acompanhou no início dos procedimentos cirúrgicos, e pude com ele compartilhar

aqueles nobres momentos;

aos colegas de mestrado, Rivail, Marta, Ana, Max, Luciano, Flávia, Fátima e Márcia

pelo convívio nesta jornada. Especialmente a Riva, pela ajuda na formatação e

leitura deste trabalho. Aprendi muito com vocês;

ao Grupo de Professores de Implante da UFBA, André Freitas, Luiz Rogério Duarte,

Robson Mendonça e Sergio Wendel, do curso de especialização em implante, pelo

incentivo ao meu caminho acadêmico;

ao Prof Dr. Urbino Tunes, um dos grandes responsáveis pelo início do meu caminho

acadêmico;

à Profa Dra Luciana Ramalho que, quando comecei, era a coordenadora deste

mestrado e ao Prof. Dr. Edmar Santana, atual coordenador;

aos professores e funcionários do programa de pós-graduação em Odontologia da

FOUFBA, pelo empenho e apoio neste mestrado;

a todos os amigos da ortodontia da FOUFBA, pelo incentivo, em particular à Profa

Dra Telma Martins, pela amizade e doação de um instrumental para este

experimento;

à Aída Gláucia e aos amigos do grupo de quarta-feira, por compartilharem o meu

caminhar nesta trilha;

6

às técnicas de laboratório, Cristina e Lucijane, pela preparação laboratorial deste

trabalho;

aos meus queridos irmãos, por existirem e permitirem que o amor seja a base das

nossas relações e por entenderem a minha ausência;

ao meu cunhado, Alfredo Gama, pela elaboração do “esquema 1”, neste trabalho;

às minhas funcionárias, Cida, Sueli e Ilza, pela ajuda e compreensão ao longo

desses anos;

à FAPESB, pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa;

à CAPES, pela bolsa de estudo concedida.

por fim, a todos que contribuíram e apoiaram, direta ou indiretamente, no

desenvolvimento deste trabalho.

7

E se, na verdade, não importa o que você faz e sim como você faz, seja

lá o que for?

Oriah Mountain Dreamer

8

RESUMO

O objetivo deste estudo foi analisar, histomorfologicamente, o reparo de defeito ósseo com a implantação de microesferas de hidroxiapatita (HA). Utilizaram-se 36 ratos, nos quais foi confeccionado, em calvária, um defeito ósseo com dimensões consideradas críticas para uma regeneração óssea espontânea. Para o Grupo I (controle), os defeitos foram mantidos preenchidos apenas com o coágulo, sem implantação de biomaterial. Para o Grupo II, os defeitos foram preenchidos com a implantação de microesferas de HA. Os espécimes de ambos os grupos foram avaliados nos pontos biológicos de 15, 45 e 90 dias pós-operatórios, e analisados por microscopia de luz. Concluiu-se que, nas condições experimentais utilizadas, as microesferas de HA foram biocompatíveis e somente osteocondutoras, quando localizadas próximas às bordas ósseas do defeito ou na região supra-dural, sendo, na maioria das vezes, envoltas por tecido fibroso. As microesferas de HA atuaram principalmente como material de preenchimento do defeito. Palavras-chave: Biomaterial; Microesfera cerâmica; Defeito crítico; Hidroxiapatita; Regeneração óssea.

9

ABSTRACT

The aim of this study was to make a histomorphological analysis of the in vivo repair process in critical bone defects in the rat calvaria. Thirty-six (36) transfixed bone defects of 8 mm diameter were made surgically in adult animals, distributed equally in two groups: G I without implant material (control) and GII implanted with hydroxyapatite ceramic microspheres (HA). The results were analyzed at the biological points of 15, 45 and 90 days, by optical microscopy. We concluded that HA microspheres, under these experimental conditions, are biocompatible and osteoconductive only at the bone edges of the defect or in the supra-dural region, and are encompassed mainly by dense, connective tissue. Thus, hydroxyapatite ceramic microspheres behaved as a suitable biomaterial for filling surgical wounds. Keywords: Biomaterial, Ceramic microsphere, Critical size, Hydroxyapatite, Bone regeneration

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estrutura cristalina da hidroxiapatita 37

Figura 2 Preparação das microesferas de hidroxiapatita 47

Figura 3 (a) Imagem de MEV (ampliação 170X) de uma microesfera

sinterizada de hidroxiapatita. (b) Imagem de M0 (ampliação 57X)

de várias microesferas sinterizadas de HA

48

Figura 4 Imagem de MEV de uma zona de uma microesfera sinterizada de

HA evidenciando a existência de poros: a) ampliação 1000X, b)

ampliação 5000X

49

Figura 5 Incisão bicoronal na porção posterior da calvária. 51

Figura 6 Confecção do defeito com fresa trefina. 51

Figura 7 Defeito ósseo criado (diâmetro = 8,5mm). 52

Figura 8 Defeito preenchido com microesferas de HA. 53

Figura 9 Vista dorsal da área de seleção do fragmento.

Figura 10 Neoformação óssea restrita às bordas do defeito com presença de

matriz osteóide e osteoblastos (HE 400X).

57

Figura 11 Defeito preenchido por tecido fibroso de arranjo menos denso com

proliferação moderada de capilares sangüíneos (HE 40X).

57

Figura 12 Defeito preenchido por tecido fibroso de espessura delgada, com

arranjo menos denso (PIFG 40X)

58

Figura 13 Defeito preenchido por tecido fibroso de espessura delgada, de

aspecto mais denso (AA 40X).

59

11

Figura 14 Ossificação reparativa entre as microesferas próximas às bordas

do defeito, e com disposição supra-dural (HE 40X).

61

Figura 15 Microesferas deslocadas (à direita) da área de preenchimento do

defeito (HE 40X).

61

Figura 16 Osteoblastos presentes nas áreas de mineralização (HE 40X). 62

Figura 17 Tecido conjuntivo denso, com proliferação de fibroblastos, entre as

microesferas, com microfragmentos do material de permeio (HE

400X).

62

Figura 18 Fragmentação das microesferas. Há inflamação granulomatosa,

com células gigantes multinucleadas englobando partículas do

material (HE 400X).

63

Figura 19 Neoformação óssea entre as microesferas na região central supra-

dural, associada a inflamação granulomatosa conspícua (HE

200X).

63

Figura 20 Neoformação óssea adjacente à microesfera e presença de

estruturas fibrilares colagênicas no seu interior (PIFG 400X).

64

Figura 21 Área de mineralização entre as microesferas, próxima a região

supra-dural, de localização central. Notar a presença de

inflamação granulomatosa na superfície dos materiais, inclusive no

seu interior (AA 400X).

64

Figura 22 Neoformação óssea próxima às bordas do defeito, completamente

preenchido pelas microesferas (HE 20X).

66

Figura 23 Material disposto em múltiplas camadas em toda a extensão do

defeito com tecido fibroso de permeio (HE 40X).

66

12

Figura 24 Focos de mineralização entre as microesferas. Partículas

fragmentadas presentes entre o tecido fibroso e em células

gigantes multinucleadas (HE 200X).

67

Figura 25 Múltiplas áreas de mineralização entre as microesferas (HE 200X). 67

Figura 26 Áreas confluentes de mineralização (PIFG 400X). 68

Figura 27 Núcleo de mineralização com GAGs entre as microesferas (AA

400X).

68

Figura 28 Defeito preenchido em toda a sua extensão pelas microesferas

(HE 20X).

70

Figura 29 Neoformação óssea lamelar reparativa nas bordas ósseas do

defeito (HE 40X).

70

Figura 30 Área central do defeito preenchido pelo material implantado. Notar

a presença de veia central sub-dural (HE 40X).

71

Figura 31 Capilares neoformados no interstício formado pela intersecção das

microesferas no defeito. Observar reação granulomatosa muito

discreta na superfície dos materiais em contato com tecido

conjuntivo frouxo, contrastando com a sua ausência na região

adjacente ao tecido fibroso (HE 400X).

71

Figura 32 Reação granulomatosa circundando completamente as

microesferas. Presença de material eosinofílico, semelhante à

matriz osteóide, envolvendo parcialmente a microesfera central

(HE 200X).

72

Figura 33 Fragmentos do material entre o tecido fibroso e também contidos

em matriz osteóide (HE 400X).

72

13

Figura 34 Mineralização confluente entre os materiais. Microesferas com

permeação de material fibrilar colagênico (PIFG 200X).

73

Figura 35 Fibras colágenas circundando e permeando centripetamente as

esferas (PIFG 100X).

73

Figura 36 Fibrose mais adensada na região subcutânea de recobrimento do

defeito, sem reação granulomatosa e sem atividade osteogênica,

com presença de capilares neoformados entre as microesferas

(HE 200X).

74

14

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1 Número de animais de acordo com os grupos e pontos biológicos

(dias)

15

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AA Azul de alciano

BCP Bifasic calcium phosphate = fosfato de cálcio bifásico

BMP Bone Morphogenetic Protein = proteína óssea morfogenética

CTP Calcium Titanium Phosphate = fosfato de cálcio e titânio

DFDBA Demineralized Freeze-Dried Bone Allograft = osso liofilizado

desmineralizado congelado seco

ePTFE Expanded Polytetrafluorethylene = politetrafluoretileno expandido

FGF Fibroblast Growth Factor = fator de crescimento de fibroblasto

GAGs Glicosaminoglicanos

HA Hidroxiapatita

HE Hematoxilina eosina

MEC Matriz extracelular

MEV Microscopia eletrônica de varredura

OP Osteogenic protein = proteína osteogênica

PDGF Platelet-derived growth factor = fator de crescimento derivado de

plaquetas

PIFG Picrossírius vermelho

Rpm Rotação por minuto

TCP Tricalcium Phosphate = fosfato tricalcio

TGF-β Transforming growth factor beta = fator de crescimento

transformador beta

16

UEFS-BA Universidade Estadual de Feira de Santana - BA

VEGF Vascular Endotelial Growth Factor = fator de crescimento

endotelial vascular

µm Micrometro

17

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 19

2 REVISÃO DA LITERATURA 22

2.1 Tecido ósseo e a Bioengenharia Tecidual 22

2.2 Biomateriais 33

2.2.1 Tipos de biomateriais 35

2.2.1.1 Biocerâmicas 36

2.2.1.2 Biocerâmicas de Fosfato de Cálcio 37

1.2.1.3 Microesferas cerâmicas de fosfato de cálcio 44

3 OBJETIVOS 46

3.1 Geral 46

3.2 Específico 46

4 METODOLOGIA 47

4.1 Modelo animal 47

4.2 Procedimentos 48

4.2.1 Preparação das microesferas 48

4.2.2 Caracterização das microesferas 49

4.2.3 Esterilização do biomaterial 51

4.2.4 Procedimento cirúrgico 51

4.2.4.1 Preenchimento dos defeitos 54

4.2.6 Obtenção das peças e clivagem 55

4.2.7 Processamento laboratorial 57

5 RESULTADOS 58

6 DISCUSSÃO 77

18

7 CONCLUSÕES 91

REFERÊNCIAS 92

ANEXOS 101

19

1 INTRODUÇÃO

Em condições fisiológicas, o tecido ósseo apresenta um grande potencial

regenerativo. Entretanto, em determinadas situações limitantes a este potencial

regenerativo, como em algumas desordens sistêmicas que interferem no

metabolismo ósseo, ou em defeitos ósseos com dimensões consideradas críticas ao

seu reparo espontâneo, decorrentes de traumas, seqüelas pós neoplásicas,

infecções e anomalias de desenvolvimento, a tendência é que ocorra um reparo por

tecido fibroso, dificultando ou mesmo impossibilitando a regeneração do tecido

ósseo (SEAL; OTERO; PANITCH, 2001; THOMSON et al., 1995).

Para o reparo desses defeitos são utilizados alguns tipos de enxertos,

como: os autógenos, os homógenos, os heterógenos e os aloplásticos ou

biomateriais (BERNARD, 1991). Entretanto, todo tipo de enxerto apresenta

vantagens e desvantagens quanto a sua indicação. O enxerto ósseo autógeno é o

de primeira escolha devido ao seu potencial osteogênico já bem definido, embora

existam os aspectos desfavoráveis para esta indicação, tais como: dificuldade de

obtenção em quantidades maiores, morbidade cirúrgica do sítio doador, expondo o

indivíduo a riscos, como hemorragia, danos ao tecido nervoso e infecções, custo

financeiro adicional e internação hospitalar (BEGLEY et al., 1995; CHAN et al., 2002;

20

LANE; SANDHU, 1987; LEE et al., 2000; LEONETTI; RAMBO; THRONDSON, 2000;

MARDEN et al., 1994; ONG et al., 1998; WU et al., 2004; YAKAMOTO; LUZ;

ARAÚJO, 1994).

Os biomateriais são uma das alternativas aos enxertos autógenos. Estes

são substâncias de origem natural ou sintética, com excessão de fármacos e

quimioterápicos, biocompatíveis, que podem substituir, de forma transitória ou

permanente, diversos tecidos, estimulando reações químicas e biológicas favoráveis

à sua função (CARVALHO; BASSI; VIOLIN, 2004; GURGEL, 2000; SANTOS, 2002;

VALLET-REGÍ, 1997).

Para tanto, a Bioengenharia Óssea tem possibilitado melhorias na

preparação e composição físico-química dos biomateriais já utilizados, bem como o

desenvolvimento de novas técnicas e/ou materiais para o reparo de defeitos ósseos

(THOMSON et al., 1995).

Dentre os vários tipos de biomateriais sintéticos projetados para a

regeneração óssea, incluem-se os metais, polímeros e cerâmicas (VALLET-REGÍ,

1997). Várias cerâmicas de fosfato de cálcio são consideradas biocompatíveis e têm

merecido destaque por não apresentarem toxicidade local ou sistêmica. Destas, a de

hidroxiapatita (HA) é a mais estudada, por ser muito semelhante ao principal

componente presente na fase mineral do tecido ósseo (KAWACHI et al., 2000; LIU

et al., 2000; SCHNETTLER et al., 2004) e por suas características de

biocompatibilidade e osteocondução (HSU et al., 2005; KAWACHI et al., 2000;

SANDEEP et al., 2006).

A forma e a porosidade das cerâmicas porosas de HA têm uma influência

direta na formação óssea (KOMLEV; BARINOV, 2002; RIPAMONTI, 2000). Elas

atuam como uma matriz tridimensional para a proliferação e diferenciação celular,

21

seguidas de um crescimento ósseo interno através dos seus poros. Atualmente,

têm-se pesquisado novas formas dessas cerâmicas, como por exemplo, a esférica,

constituída de micro ou nano partículas, para serem utilizadas como formulações

injetáveis em defeitos ósseos, o que caracteriza uma terapêutica menos invasiva.

Além disso, estas microesferas podem estar associadas a agentes terapêuticos,

para potencializar a regeneração local (RIBEIRO; BARRIAS; BARBOSA, 2004;

SIVAKUMAR; MANJUBALA; PANDURANGA RAO, 2002; TEMENOFF; LU; MIKOS,

2000; WILLI; NESAMONY; SHARMA, 2002; WU et al., 2004).

Diante do potencial promissor da utilização de microesferas de HA na

bioengenharia óssea, é premente se avaliar o comportamento biológico deste

biomaterial na regeneração de defeitos ósseos com dimensões críticas.

22

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 TECIDO ÓSSEO E A BIOENGENHARIA TECIDUAL

A Bioengenharia Óssea é uma área da saúde, de atuação interdisciplinar,

promissora, que aplica princípios da Engenharia, da Química, da Física e das

Ciências Biológicas para o desenvolvimento de substitutos ósseos, associados ou

não a células e fatores de crescimento, que possibilitam restaurar e melhorar as

funções teciduais (JONES et al., 2004; SHALAK; FOX, 1988). Os elementos

necessários à aplicação dos princípios da Bioengenharia Óssea são as células,

dentre elas as células-tronco e as de linhagem osteoblástica, assim como as

moléculas sinalizadoras, a exemplo dos fatores de crescimento polipeptídicos e das

proteínas de adesão. Tais elementos devem estar associados a uma biomatriz

como: colágeno, osso, minerais, polímeros, dentre outros (UEDA et al., 2000;

VASCONCELOS et al., 2003; WILLIAMS, 1985).

A biomatriz deve se apresentar como uma estrutura tridimensional porosa

e interconectada, para possibilitar migração, inserção, adesão, proliferação e

diferenciação celulares (JONES et al., 2004; TEMENOFF; LU; MIKOS, 2000) e atuar

como carreador biocompatível de fatores solúveis e insolúveis que modulem a

função celular local (ISHAUG et al., 1997; THOMSON et al., 1995). A biomatriz deve

ainda ser bioabsorvível por meio de degradação controlada, favorecer a síntese da

23

matriz extracelular (MEC) e possuir propriedades mecânicas para se assemelhar (ou

suportar) àquelas do sítio de implantação (JONES et al., 2004), mimetizando, desta

forma, o tecido ósseo.

O osso é um tecido conjuntivo especializado, mineralizado, constituído em

grande parte por um componente inorgânico representado, em sua maioria, por

fosfato de cálcio sob a forma de cristais de hidroxiapatita (HA). Em menor proporção,

apresenta uma matriz orgânica formada predominantemente por colágeno tipo I,

associado às proteínas não colagênicas, incluindo osteonectina, osteocalcina,

proteína óssea morfogenética (BMP), proteoglicanas e sialoproteínas ósseas

(ANSELME, 2000; SEAL; OTERO; PANITCH, 2001). O osso tem como principais

funções apoiar e proteger os órgãos vitais e a medula óssea, propiciar inserção e

suporte muscular e comportar-se como reserva metabólica de íons, principalmente

de cálcio e fosfato (KATCHBURIAN; ARANA, 1999; MEGHJI, 1992).

Em relação à sua composição celular, podem ser observados quatro tipos

principais de células, as osteoprogenitoras, os osteoblastos, os osteócitos e os

osteoclastos. As osteoprogenitoras estão presentes na medula óssea, no periósteo e

no endósteo. Quando induzidas, diferenciam-se em osteoblastos, responsáveis pela

síntese de matriz osteóide, que posteriormente será mineralizada, formando assim o

tecido ósseo. Os osteoblastos aprisionados na matriz óssea, denominados

osteócitos, são indispensáveis na manutenção da homeostase óssea (AUBIN,

2000). Os osteoclastos são células derivadas da linhagem monocítica-fagocitária e

estão envolvidas na remodelação tecidual por meio da reabsorção óssea (AL-

SAFFAR; REVELL, 2000).

Do ponto de vista macroscópico, os ossos são classificados em longos ou

chatos. Entre os longos estão a fíbula, o fêmur e a tíbia. São exemplos de ossos

24

chatos, os do crânio, o esterno, a escápula e a pelve. De acordo com a arquitetura

interna, o osso pode ser compacto ou esponjoso e, com base em seu grau evolutivo,

primário, secundário ou lamelar (KATCHBURIAN; ARANA, 1999).

O osso maduro, tanto do tipo compacto quanto do trabecular, é

histologicamente idêntico por ser constituído de camadas ou lamelas microscópicas,

as quais, no osso compacto, estão densamente arranjadas (YASZEMSKI et al.,

2000). Esses dois tipos de tecido ósseo ocorrem em distintos locais do esqueleto

axial e apendicular, têm funções biológicas e propriedades mecânicas diferentes. As

funções mecânicas do osso trabecular estão relacionadas principalmente às forças

compressivas e às biológicas, com o alojamento da medula e de seus elementos

hematopoiéticos. O osso compacto suporta cargas de compressão, tensão e torção.

Ambos os tipos são reservatórios de elementos como cálcio e fósforo, cujas

concentrações séricas são altamente controladas. Por isso são constantes as

mudanças entre o fluido tissular e o tecido ósseo (YASZEMSKI et al., 2000).

Duas membranas revestem os ossos. O periósteo e o endósteo. O

primeiro, externo, é uma membrana de tecido conjuntivo osteogênico e consiste de

duas camadas, sendo que a camada interna, próxima ao osso, é rica em células e

vasos, enquanto a externa é mais fibrosa. Internamente, o osso compacto e o

esponjoso são revestidos e separados da medula óssea pelo endósteo. Este se

constitui de uma camada contínua e geralmente única de osteoblastos ou células de

revestimento ósseo. Geralmente apresenta mais atividade que o periósteo e, na

maioria das vezes, as células que revestem o osso exercem funções de formação

óssea, encontrando-se, portanto, diferenciadas em osteoblastos.

Estas membranas têm um papel fundamental na regeneração óssea. O

periósteo tem sido apontado como fonte de células-tronco mesenquimais

25

osteogênicas e como promotor de reparo espontâneo em ossos longos (HOLY et al.,

2000).

O desenvolvimento e o reparo do tecido ósseo se processam por dois

mecanismos distintos: ossificação endocondral, que ocorre sobre uma matriz

cartilaginosa prévia. Após a morte dos condrócitos, por apoptose, ocorrem as

diferenciações dos brotos vasculares e das células mesenquimais indiferenciadas

em osteoblastos, formando a matriz orgânica que posteriormente será calcificada.

Este processo acontece nas metáfises e epífises de todos os ossos longos, nas

vértebras e nas costelas, bem como no côndilo da mandíbula e na base do crânio. O

outro processo é a ossificação intramembranosa, que ocorre no interior de uma

membrana conjuntiva, onde as células mesenquimais se diferenciam em

osteoblastos, iniciando a formação óssea. Este tipo ocorre nos ossos da calota

craniana (frontal, parietal, parte do occipital e as porções timpânica e escamosa do

temporal), na maxila, no corpo e parte do ramo da mandíbula, em parte do

esfenóide, além da clavícula e das diáfises dos ossos longos (KATCHBURIAN;

ARANA, 1999; MEGHJI, 1992; STREET et al. 2002).

O tecido ósseo apresenta crescimento e remodelação durante toda a vida

do organismo. A sua remodelação fisiológica é um processo complexo, que resulta

em reabsorção e neoformação óssea, garantindo à massa configuração e

propriedades inerentes ao tecido (LIEBSCHNER, 2004). A homeostase deste tecido

é controlada sistemicamente por fatores hormonais e localmente por forças

mecânicas, fatores de crescimento e citocinas (SODECK; CHEIFETZ, 2000). No

remodelamento ósseo a população de células osteogênicas é derivada de células

perivasculares, que migram para o local através do tecido conjuntivo perivascular

primitivo. Diferentemente, em um reparo de ferida, em fratura óssea ou na utilização

26

de enxertos, a população celular é derivada da medula, incluindo pericitos

vasculares, células do estroma, células-tronco mesenquimais e, em menor grau, os

osteócitos e osteoblastos das superfícies ósseas existentes. Neste caso, as células

migram através de um arcabouço temporário formado, pelo extravasamento e pela

coagulação sanguíneos (DAVIES; HOSSEINI, 2000).

O reparo ósseo requer o desenvolvimento de um sistema vascular para

sinalizar a liberação de oxigênio e nutrientes para a área lesada. Este processo de

indução vascular é denominado de angiogênese e é um componente fundamental

para o reparo tecidual. É regulado por sinais moleculares mediado por fatores de

crescimento como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o fator de

crescimento de fibroblastos (FGF), o fator de crescimento transformador beta (TGF-

β) e o fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) (LAKEY; AKELLA;

RANIERI, 2000). Pode ainda promover, temporariamente, um fluxo regulado de

população celular capaz de expressar o fenótipo osteogênico (RIPAMONTI, 2000). A

vascularização insuficiente é um dos maiores problemas encontrados durante o

reparo de defeitos ósseos com dimensões críticas, resultando em formação de

tecido fibroso. Além do pobre suprimento sangüíneo, outros fatores de risco

impedem a regeneração óssea, dentre eles, a interposição de tecido mole ou osso

necrótico entre os fragmentos ósseos, a inadequada imobilização, a infecção, o uso

de drogas como corticosteróides e nicotina, a idade avançada e as desordens

sistêmicas como diabetes ou doenças nutricionais (CARANO; FILVAROFF, 2003).

O osso é um dos poucos tecidos de mamíferos com grande potencial

regenerativo e em grande parte isso se deve à habilidade dos fatores de

crescimento em direcionar as células-tronco para as vias condrogênica e

osteogênica e ao papel das forças mecânicas que estimulam a remodelação óssea

27

(SICCA et al., 2000). Alguns fatores limitam este potencial, são eles: as doenças

sistêmicas degenerativas, as ressecções cirúrgicas decorrentes de neoplasias

malignas e as lesões traumáticas extensas. No entanto, nas últimas décadas, os

avanços técnico-científicos têm possibilitado melhorias dos biomateriais já utilizados,

bem como o desenvolvimento de novas técnicas e/ou materiais para o reparo destas

lesões (THOMSON et al., 1995).

A Bioengenharia Óssea vem desenvolvendo materiais para testar, em

modelos de defeitos ósseos in vivo, o potencial de cicatrização e a regeneração

óssea. Estes defeitos, definidos como de tamanho crítico, devem apresentar

determinadas características morfológicas de extensão e largura que impeçam a

regeneração espontânea. Conceitualmente, são os menores defeitos ósseos que

não possuem a capacidade de se regenerar espontaneamente durante a vida do

animal, a não ser que algum tipo de enxerto com capacidade osteogênica seja

implantado (SCHMITZ; HOLLINGER, 1986; TAKAGI; URIST, 1982). Para tanto, têm-

se discutido vastamente na literatura qual o modelo animal ideal para avaliar e

comparar diversos materiais utilizados para regeneração óssea. Modelos animais

apresentam melhor propriedade reparadora quando comparados aos humanos.

Portanto, deve-se tomar cuidado para não extrapolar resultados encontrados nestes

modelos, para humanos, de maneira diretamente proporcional. A espécie e o tipo do

animal, sua idade, localização anatômica do defeito ósseo, tipo de osso, presença

ou ausência do periósteo ou da dura-máter são importantes na escolha deste

modelo (BOSCH; MELSEN; VARGERVIK, 1998; LeGUEHENNEC et al., 2005).

Para se avaliar o potencial regenerativo destes biomateriais e/ou técnicas,

necessita-se que o modelo experimental e suas variações, como métodos cirúrgicos,

sítios de implantação e espécies animais, estejam bem consolidados. Além disso,

28

deve-se conhecer intrinsecamente o tecido no qual ocorrerá implementação da

bioengenharia tecidual, pois, de acordo com o sítio de implantação, como em várias

arquiteturas ósseas corticais e trabeculares, em que o estresse mecânico é

diferente, podem-se esperar resultados de diferentes reparos ósseos e

remodelamento. Dessa forma, é importante testar novos materiais em diferentes

sítios ósseos de vários espécimes de animais, como ratos, coelhos, cães, ovelhas e

cabras, para se obter resultados mais detalhados e, assim, tirar conclusões mais

assertivas quanto à indicação do material pesquisado (LeGUEHENNEC et al., 2005).

A calvária é um sítio de escolha para avaliação da capacidade

osteogênica de biomateriais, pois se trata de uma região anatômica pobre em

suprimento sangüíneo e osso medular, o que dificulta a regeneração óssea.

Anatomicamente, a calvária consiste de duas placas corticais paralelas, separadas

por pequena quantidade de tecido ósseo trabecular. Em contraste com muitos ossos

longos que contêm uma artéria nutriente primária, os ossos cranianos recebem

suprimento sangüíneo de arteríolas, provenientes da artéria dural e de outras

superfícies adjacentes como o músculo temporal (SCHMITZ; HOLLINGER, 1986).

Takagi e Urist (1982) criaram defeitos cirúrgicos, com diâmetro de 8mm na

calvária de ratos adultos com seis meses de idade, para avaliar o potencial de

regeneração óssea das proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs). Os sítios que não

receberam o material (controle) foram reduzidos para 5mm em quatro semanas,

ficando um tecido conjuntivo fibroso denso no centro do defeito, no período de

quatro a doze semanas. Nos defeitos preenchidos com BMPs houve substituição do

material por novo tecido ósseo ao final de doze semanas. Nesse trabalho, os

autores identificaram, também, a participação da duramáter na regeneração óssea

nos defeitos que receberam a BMP. Com a intenção de excluir a duramáter do

29

defeito criado, foram implantadas membranas de acetato de celulose no grupo

controle e no grupo que recebeu a BMP. Nesse último grupo, houve uma indução

transmembrana de formação óssea abaixo da membrana, em duas semanas, e

acima desta formou-se um tecido condrosteóide em torno de sete dias após a

cirurgia.

A escolha de animais adultos para este modelo é muito importante, pois a

calvária destes animais tem uma limitada fonte de precursores de osteoblastos e

estes são recrutados das bordas ósseas remanescentes e do tecido conjuntivo dural

perivascular, para que a regeneração óssea seja completa na presença de materiais

osteogênicos. Conseqüentemente, somente o animal adulto seria o melhor modelo

para avaliar o potencial regenerativo de qualquer tipo de material (TAKAGI; URIST,

1982).

Bosch, Melsen e Vargervik (1998) desenvolveram um estudo com defeitos

de 5mm criados em calvária de rato, para avaliar se eles correspondem à

classificação de defeitos de tamanho crítico. Foram criados dois defeitos de 5mm

nos ossos parietais de ratos adultos, sendo um controle e o outro teste, utilizando-se

os seguintes biomateriais: membrana de politetrafluoretileno expandida (ePTFE),

membrana de colágeno, matriz óssea desmineralizada, HA e blocos ósseos, com o

objetivo de avaliar o potencial regenerativo. Exames macroscópicos e histológicos

foram realizados até o período de um ano. Os sítios controles apresentavam-se

flexíveis à palpação e os sítios testes com uma consistência dura. Histologicamente,

nenhum sítio controle demonstrou qualquer sinal de regeneração óssea no período

de seis meses a um ano do pós-operatório. Concluíram que este é um modelo

adequado para avaliação de regeneração óssea, preenchendo os requisitos do

defeito com dimensões críticas.

30

Schmitz et al. (1990) analisaram, por microscopia de luz e eletrônica, o

reparo ósseo de defeitos com dimensões de 3, 4 e 8mm de diâmetros, criados em

calvária de ratos adultos. Os defeitos de 8mm de diâmetro foram analisados após a

morte dos animais, nos períodos de 1, 3, 7, 10, 14, 21 28 e 42 dias, enquanto que os

de 3 e 4mm foram analisados em 28 dias, visando assegurar a máxima resposta

reparadora. Os resultados mostraram que a capacidade regenerativa dos defeitos na

calvária de rato é dependente de suas dimensões. Os defeitos de 3 e 4mm possuem

melhor capacidade regenerativa, com evidências de ilhotas ósseas em toda a sua

extensão. Por outro lado, defeitos de 8mm não se regeneram espontaneamente,

apresentando um reparo por tecido conjuntivo fibroso.

Baseados nos resultados histomorfológicos, os autores caracterizaram o

reparo dos defeitos de 8mm em três fases, designadas como: inflamatória,

estabelecida e de maturação. A fase inflamatória corresponde aos dez primeiros

dias pós-operatórios, onde se observaram agregado de fibrina e plaquetas

precursoras da formação do coágulo sangüíneo, e ainda sinais de neutrófilos sendo

substituídos lentamente por células semelhantes a fibroblastos. A fase estabelecida,

que ocorreu no período de dez a 21 dias, caracterizou-se pela diminuição do

hematoma presente anteriormente, com áreas ativas de fibroblastos dispostos em

arranjos de fibras do tipo colágeno. Capilares e pequenas arteríolas foram

observados dentro da matriz intercelular. Ocasionalmente, foram vistas ilhotas

ósseas na região periférica do defeito, enquanto que, na região central, não se

evidenciaram cristais de HA nas vesículas da matriz, nem entre a formação do

colágeno. A fase de maturação iniciou-se aos 21 dias, com a presença de

fibroblastos inativos e tecido conjuntivo fibroso, tanto na região central quanto na

área periférica do defeito, caracterizando um tecido cicatricial maduro. Com 42 dias,

31

a maturação do tecido apresentava um denso arranjo de fibras colágenas, altamente

organizado, presente em todo o defeito (SCHMITZ et al., 1990).

Vários enxertos são utilizados para o preenchimento de defeitos ósseos e

são classificados como: autógenos, homógenos ou alógenos, heterógenos ou

xenógenos e aloplásticos (BERNARD, 1991). Os enxertos autógenos,

transplantados de uma área doadora para outra receptora de um mesmo indivíduo,

são considerados como padrão de excelência na reparação óssea. A área doadora

pode ser selecionada de acordo com o tipo e o volume de osso desejado, podendo

conter osso cortical e córtico-medular. Os sítios doadores mais utilizados são: a

crista ilíaca, a mandíbula, o túber maxilar, a costela, a tíbia e a fíbula (LEKHOLM et

al., 1999). Embora considerada padrão-ouro como enxerto, essa técnica implica em

uma intervenção cirúrgica adicional, que está associada à morbidade (BEGLEY et

al., 1995; CHAN et al., 2002; LANE; SANDHU,1987; LEE et al., 2000; LEONETTI et

al., 2000; MARDEN et al., 1994; ONG et al., 1998; WU et al., 2004; YAKAMOTO;

LUZ; ARAÚJO, 1994).

Os enxertos homógenos ou alógenos são obtidos de indivíduos da mesma

espécie, porém geneticamente diferentes. Possíveis efeitos adversos, relacionados

à antigenicidade e à possibilidade de transmissão de doenças infecto-contagiosas,

são reduzidos pelos processos de liofilização, congelamento, radiação e agentes

químicos (MISCH; DIETSH,1993; QUATTELBAUM; MELLONING; HENSEL, 1988).

Estudos sugerem que a desmineralização desse enxerto expõe BMPs, atuando

como um material com potencial osteoindutor (MISCH; DIETSH, 1993; TAKAGI;

URIST, 1982).

32

Os enxertos heterógenos ou xenógenos são obtidos de um doador e

implantados em um leito receptor de indivíduos de espécies diferentes. Os mais

utilizados são os de origem bovina (LeGEROS, 1990).

Outra opção como enxertos ósseos são os materiais aloplásticos ou

biomateriais, que são sintéticos ou naturais, produzidos ou manipulados em

laboratório (LeGEROS, 2002).

2.2 BIOMATERIAIS

Os biomaterias são definidos como compostos ou substâncias de origem

natural ou sintética, com excessão dos fármacos e quimioterápicos, biocompatíveis,

que podem substituir, de forma transitória ou permanente, diversos tecidos que

constituem os órgãos dos seres vivos, estimulando reações químicas e biológicas

favoráveis à função deles (CARVALHO; BASSI; VIOLIN, 2004; GURGEL, 2000;

SANTOS, 2002; VALLET-REGÍ, 1997).

A biocompatibilidade é uma propriedade imprescindível a um biomaterial

e pode ser definida como a habilidade de um material desempenhar uma resposta

tecidual apropriada em uma aplicação específica (GURGEL, 2000; MISCH, 2004),

ou seja, com a ausência ou mínima presença de linfócitos e plasmócitos, ausência

de polimorfonucleares e mínima presença de células gigantes, em avaliações que

duram de duas a doze semanas (STANFORD, 1980). Portanto, os biomateriais

deverão ser atóxicos, não carcinogênicos, induzirem mínima resposta inflamatória, e

ainda ser química e fisicamente projetados para exercerem suas funções

(biofuncionalidade), apresentarem estabilidade mecânica adequada e também

fabricação, acesso e custo acessíveis (PARK, 1984). Estas propriedades, somadas

à forma de apresentação, como esferas, membrana, matriz, esponja, gel, pó e,

33

particularmente, na conformação de uma matriz tridimensional, favorecem a adesão,

a inserção, a proliferação e a diferenciação celular (VASCONCELOS et al., 2003;

WILLIAMS, 1985).

Os biomateriais podem ser classificados, de acordo com o

comportamento fisiológico, em biotoleráveis, bioinertes e bioativos. São biotoleráveis

quando os tecidos adjacentes os isolam por meio da formação de uma camada

envoltória de tecido fibroso, induzida pela liberação de compostos químicos, íons,

produtos de corrosão e outros liberados pelo material implantado. Bioinertes, quando

muito pouco ou nenhuma resposta tecidual se apresenta por serem quimicamente

muito estáveis, todavia, este termo é inadequado, já que todo material induz algum

tipo de resposta do tecido hospedeiro, mesmo que seja mínima. E os bioativos,

quando ocorrem reações de natureza química na interface entre o material e o

tecido ósseo (KAWACHI et al., 2000; VALLET-REGÍ, 1997).

Em relação à sua composição, os biomateriais podem ser classificados

como biomédicos (CARVALHO; BASSI; VIOLIN, 2004), de origem artificial, a

exemplo de metal, cerâmica, polímero, dentre outros e de origem natural ou

biológica, como colágeno, elastina, cerâmica, dentre outros (VALLET-REGÍ, 1997).

De acordo com sua porosidade, em microporoso ou denso e macroporoso; em

relação à sua cristalinidade, em amorfos e cristalinos e quanto à solubilidade, em

absorvíveis e não-absorvíveis (GARG, 1999).

As propriedades físicas, químicas e biológicas dos biomateriais têm

influência importante na função, na velocidade e extensão do processo de absorção

destes (BURG; PORTER; KELLAM, 2000; OONISHI et al., 1997). A forma, a

porosidade, a cristalinidade e a área de superfície específica são propriedades

físicas, enquanto que a composição química, a substituição iônica e as impurezas

34

constituem as propriedades químicas dos biomateriais. A proliferação dos

osteoblastos e a adsorção de proteínas são sensíveis às suas propriedades físico-

químicas (YANG; DENNISON; ONG, 2005).

Os biomateriais podem atuar no reparo ósseo por meio de

osteocondução, osteoestimulação ou osteoindução. A osteocondução possibilita a

angiogênese e o crescimento de células ósseas, a partir de células

osteoprogenitoras do leito receptor, pela superfície do material enxertado, dando

origem a osteoblastos responsáveis pela neoformação óssea no local. A

osteoestimulação promove o crescimento ósseo pela transferência de osteoblastos

juntamente com o enxerto ou pela estimulação dos osteoblastos existentes no sítio

receptor. Os enxertos ósseos autógenos intra e extra-bucais são exemplos. A

osteoindução promove a diferenciação de células-tronco mesenquimais

perivasculares em osteoprogenitoras, sob o estímulo de uma ou mais substâncias

indutoras liberadas pela matriz óssea do enxerto, como as BMPs (CARVALHO;

BASSI; VIOLIN, 2004; LANE, 1995; MISCH; DIETSH, 1993; URIST et al., 1997).

Os biomateriais podem ser indicados como enxerto ósseo na área

médica, para a reconstrução de defeitos decorrentes de doenças como osteoporose,

neoplasmas e traumas, a exemplo dos provenientes de acidentes automobilísticos

que afetam cada vez mais pessoas jovens (KAWACHI et al., 2000). Na odontologia,

para aumento de rebordos alveolares atróficos e no preenchimento dos alvéolos de

dentes extraídos para preservar a altura e a espessura óssea do rebordo alveolar

(CARVALHO; BASSI; VIOLIN, 2004). Em cerca de 10% de todas as grandes

reconstruções cirúrgicas de defeitos ósseos, causados por problemas congênitos,

traumas ou doenças, são necessários materiais substitutos ósseos (SCHNETTLER

et al., 2004). A escolha do biomaterial vai depender da indicação cirúrgica,

35

principalmente em relação à localização e ao tamanho do defeito ósseo

(COSTANTINO et al., 1991; MUNTING; MIRTCHI; LEMAITRE, 1993). Quando se

deseja regeneração, o enxerto deve se comportar como uma matriz tridimensional

ou arcabouço, para que as células osteoprogenitoras possibilitem o crescimento de

novo osso para dentro deste. Ao mesmo tempo em que ele é absorvido ou

dissolvido, a regeneração ocorre, o que resulta no remodelamento ósseo (LU;

CURRIER; YASZEMSKI; 2000). O enxerto deve possuir também as seguintes

características: ser altamente poroso, com uma rede interconectada de poros, para

possibilitar o crescimento celular, angiogênese e transporte de nutrientes; ser

biocompatível e bioabsorvível, com processos controlados de degradação e

absorção, permitindo dessa forma a substituição pelo tecido; possuir características

químicas adequadas em sua superfície para adesão, proliferação e diferenciação

celular; e apresentar propriedades mecânicas semelhantes àquelas dos tecidos do

local de implantação (THOMSON et al., 1995).

Quando o objetivo for somente o preenchimento do defeito, sem requerer

a regeneração do tecido ósseo, o biomaterial deve apresentar propriedades físicas e

mecânicas apropriadas, assim como biocompatibilidade, estabilidade, fácil

manipulação clínica e capacidade de se incorporar ao tecido ósseo (WILLIAMS,

1985).

2.2.1 Tipos de biomateriais

Nos últimos 20 anos, os biomateriais tiveram um significante avanço no

campo dos substitutos ósseos (SANDEEP et al., 2006) e dentre os sintéticos mais

pesquisados, incluem-se os metais, os polímeros compósitos, as cerâmicas e os

vidros (KAWACHI et al., 2000; VALLET-REGÍ, 1997). Neste contexto, as cerâmicas

36

têm recebido especial atenção dos pesquisadores devido à sua propriedade de

biocompatibilidade, fato que as denomina de biocerâmicas.

2.2.1.1 Biocerâmicas

Os materiais cerâmicos são utilizados como biomateriais há mais de um

século. Um dos primeiros foi o gesso (CaSO4.1/2H2O), empregado como possível

substituto ósseo. Como ele apresenta uma resistência mecânica muito baixa e a

absorção pelo organismo é completa e rápida, a sua utilização foi praticamente

excluída como biocerâmica implantável (KAWACHI et al., 2000). A partir da década

de 1970, as cerâmicas obtiveram um uso mais intenso devido às propriedades de

biocompatibilidade e bioatividade, que as classificam como biocerâmicas, sendo

então definidas como biomateriais capazes de provocar reações de formação

tecidual e, se possível, com uma ligação de natureza química entre eles e os tecidos

adjacentes (KAWACHI et al., 2000; SANTOS, 2002; VALLET-REGÍ, 1997).

A primeira biocerâmica utilizada nesse período foi a alumina densa,

considerada bioinerte. Devido à boa biocompatibilidade e elevada resistência

mecânica deste material, seu uso ainda é corriqueiro até hoje em próteses

ortopédicas, que exijam esforços elevados durante a atividade funcional. Outras

cerâmicas como zircônia, dióxido de titânio, carbonos pirolíticos, fosfatos de cálcio e

vitrocerâmicas de sílica/fosfato de cálcio apresentam uso difundido atualmente

(KAWACHI et al., 2000).

As biocerâmicas, além de serem classificadas como bioinertes e

bioativas, são agrupadas em mais duas classes, de acordo com a resposta

desenvolvida in vivo na interface tecido/implante: porosas, quando o crescimento

37

interno dos tecidos ocorre através dos poros e absorvíveis, que são degradadas e

substituídas pelos tecidos onde foram implantadas (HENCH, 1998).

2.2.1.2 Biocerâmicas de Fosfato de Cálcio

Várias cerâmicas de fosfato de cálcio são consideradas biocompatíveis e

têm merecido destaque por apresentarem ausência de toxicidade local ou sistêmica.

Estas características se devem à natureza química basicamente formada por íons

cálcio e fosfato, presentes no tecido ósseo (SCHNETTLER et al., 2004; WANG,

2003). Particularmente, dentre as de origem sintética, disponíveis como alternativa

ao enxerto ósseo autógeno, para reparar, substituir ou aumentar o volume ósseo,

incluem-se as cerâmicas de vidro ou vidros bioativos; os fosfatos de cálcio, como:

HA, fosfato tricálcio (TCP) e fosfato de cálcio bifásico (BCP) (DACULSI, 2004); os

carbonatos de cálcio e materiais originados de estruturas naturais, como a HA

bovina e a coralina (LeGEROS, 2002). Apesar de serem bastante utilizadas, estas

biocerâmicas apresentam uma baixa resistência mecânica, impossibilitando o uso

em possíveis áreas de estresse (ONG et al., 1998).

Uma forma conveniente de classificar os vários fosfatos de cálcio é por

meio de sua razão molar Ca/P. Vários fosfatos de cálcio que possuem razão

variando de 0,5 a 2,0 podem ser sintetizados por precipitação, a partir de soluções

contendo íons cálcio e fosfato, sob condições alcalinas ou ácidas. Estes fosfatos

podem ser transformados em cerâmicas biocompatíveis e osteocondutoras

(KAWACHI et al., 2000).

Na interface, entre o biomaterial e o osso, acontecem reações em escala

molecular do tipo dissolução de íons do material, adsorção, desorção e

desnaturação de proteínas (HUNT; MCLAUGHLE; FLANAGAN, 1997). No caso da

38

superfície em contato com os fluidos corporais ser um fosfato de cálcio, pode ocorrer

absorção do mesmo ou transformação em outro tipo mais estável (HELMUS;

TWENDEN, 1995). A maioria degrada quando exposta a ambientes fisiológicos, com

uma velocidade de absorção na ordem de solubilidade, que incluem: fosfato

tetracálcio (Ca4P2O9), fosfato de cálcio amorfo, α-Fosfato tricálcio (Ca3(PO4)2), β-

Fosfato tricálcio (Ca3(PO4)2), HA (Ca10(PO4)6(OH)2). A absorção dos materiais é

causada pela dissolução, que depende do seu produto de solubilidade e do pH local

no meio fisiológico, pela desintegração física em partículas menores e, ainda, por

fatores biológicos, como a fagocitose, a presença de leucócitos e de mediadores

químicos que causam a redução do pH local. A velocidade de absorção pode

aumentar com a ampliação da área superficial (pó>sólido poroso>sólido denso), com

o decréscimo de cristalinidade e, no caso da HA, pela substituição de carbonatos

nos sítios de fosfato e por íons magnésio e estrôncio nos sítios de cálcio (HENCH,

1991).

Das biocerâmicas de fosfato de cálcio, a HA, com razão molar Ca/P igual

a 1,67, é a mais utilizada em cirurgias de reconstrução óssea, por ser o principal

componente presente na fase mineral dos ossos (KAWACHI et al., 2000; LIU et al.,

2000; SCHNETTLER et al., 2004). Apresenta composição, estequiometria

(Ca10(PO4)6(OH)2) e cristalografia definidas. Os cristais são formados por centenas

ou milhares de unidades, que se mantêm unidas por meio de atrações covalentes

dos átomos que as compõem. A estrutura cristalina está representada na figura 1.

39

Figura 1. Estrutura cristalina da HA (e: http://people.alfred.edu/~misture/demo/hy_sin_atomstruc.html)

Esta biocerâmica é termodinamicamente estável em pH fisiológico e

participa ativamente na ligação óssea, formando ligações químicas fortes com os

ossos em volta (KRIEGER, 2003), possui propriedades de biocompatibilidade e de

osteocondução, que a coloca entre os mais importantes substitutos ósseos da

atualidade. As cerâmicas de HA podem ser utilizadas em defeitos ósseos sem carga

ou em falhas em que cargas, estresses torcionais ou cisalhamentos são

neutralizados por implantes rígidos, como placas e parafusos (KAWACHI et al.,

2000). Podem se apresentar em diferentes formas e tamanhos, de acordo com as

suas preparações e aplicações. Quanto à forma, classificam-se em particuladas e

em bloco. Os materiais particulados podem apresentar uma configuração geométrica

em forma esférica ou irregular, de acordo com o método de fabricação (DACULSI,

2004) e podem ser preparados nas seguintes formas: microporoso ou macroporoso

(KOMLEV; BARINOV, 2002).

As cerâmicas densas ou microporosas são preparadas pela compactação

ou compressão sob alta pressão e sinterizadas em altas temperaturas (1100-

13000C). As HAs densas, dentre outras, são descritas como tendo no máximo 5% de

porosidade por volume, com a microporosidade de no máximo 1µm em diâmetro

(KARAGEORGIOU; KAPLAN, 2005). As cerâmicas macroporosas apresentam poros

40

de 100-500µm, que compreendem 15% ou mais do volume total do biomaterial.

Quanto maior a porosidade, maior a velocidade de absorção, sendo, portanto, a

arquitetura interna, inclusive tamanho e forma dos poros, e a interconexão entre eles

propriedades importantes no comportamento in vivo do biomaterial (CHU et al.,

2002).

As cerâmicas porosas de HA são utilizadas tanto para a bioengenharia

tecidual como para o sistema de liberação de drogas. A forma e a porosidade delas

têm uma influência direta na formação óssea (KOMLEV, BARINOV, 2002;

RIPAMONTI, 2000). Elas funcionam como uma matriz tridimensional para

proliferação e diferenciação celular, seguidas de um crescimento ósseo interno

através dos poros. Estes processos são influenciados pelo tamanho, pela

morfologia, pelo volume e pela interconexão dos poros (LU; CURRIER;

YASZEMSKI, 2000). A macroporosidade favorece o crescimento ósseo para o

centro da cerâmica, enquanto a microporosidade promove mineralização, adsorção

de proteínas e adesão celular (LeGUEHENNEC et al., 2005). Tsuruga et al. (1997)

sugerem que o tamanho do poro ótimo, em cerâmicas, para formação óssea é de

300-400µm. Já Yamamoto et al. (2000) preconizam entre 110–350µm. Algumas

contradições existem na literatura quanto aos tamanhos dos poros que favoreçam o

crescimento tecidual e infiltração das células, sendo que um ótimo tamanho mínimo

para que ocorra a colonização óssea dentro dos poros é da ordem de 100-135µm

(HING et al., 1999).

Flautre et al. (2001) avaliaram o crescimento ósseo e a eficiência da média

do tamanho dos poros e interconexão entre eles em uma cerâmica porosa de HA.

Implantaram cilindros de HA de 10mm de comprimento e 5mm de diâmetro em

fêmur de 27 coelhas, com quatro diferentes tamanhos de interconexão: 130, 100, 60

41

ou 30µm, com o mesmo diâmetro dos poros (175-260µm). Para avaliar a quantidade

e a qualidade de tecido ósseo recém-formado dentro dos poros, três diâmetros de

poros foram utilizados: 175-260, 260-350 ou 350-435µm, com tamanho de

interconexão de 130µm. O melhor resultado da osteocondução para o centro da

cerâmica foi obtido com a interconexão de 130µm e poros de 175-260µm.

Karageorgiou e Kaplan (2005) recomendam que os materiais tenham

poros com tamanho maior que 300µm, para ocorrer uma adequada vascularização e

crescimento ósseo no seu interior.

Atualmente, alguns autores têm observado propriedades osteoindutivas,

além de osteocondutivas, das HAs porosas implantadas em abdome de macacos

adultos (RIPAMONTI, 1991; RIPAMONTI; CROOKS; KIKBRIDE 1999). Ripamonti,

Crooks e Kikbride (1999) salientaram a importância da geometria e porosidade da

HA, para que esta promova adsorção, armazenagem e liberação controlada de

fatores de crescimento, como BMPs e proteínas osteogênicas, iniciando a formação

óssea local como resposta secundária. Ripamonti (1991) mostrou formação de novo

osso em bloco de HA porosa coralina, com média de porosidade de 500µm,

implantado em estromas não osteogênicos de macacos adultos.

Além da porosidade, a área superficial específica é um parâmetro

importante, pelo fato de ambas estarem diretamente relacionadas com a solubilidade

dos biomateriais (CHU et al., 2002; JOSCHECK et al. 2000; KARAGEORGIOU;

KAPLAN, 2005; ROSE et al., 2004; TAMPIERI et al., 2001). Joscheck et al (2000),

analisando grânulos de HA, obtiveram área de superfície específica de 0,1 m2/g, a

qual consideraram pequena em contraste com valores obtidos do osso mineral

natural, que, segundo alguns estudos, foram de 87 e 100 m2/g. Neste mesmo

trabalho, os autores sugerem que uma pequena área de superfície apresenta

42

desvantagens para incorporação de drogas por adsorção. Uma área de superfície

entre 32-50 m2/g dos materiais porosos possibilita a osteogênese (LIU et al., 2000).

Outra propriedade que interfere na interação dos biomateriais com o

tecido ósseo é a cristalinidade. Toda substância é composta de átomos e todo sólido

tem estrutura cristalina (AOKI, 1991). Estruturas altamente cristalinas são mais

resistentes às alterações e à absorção a longo prazo (AOKI, 1994). Yang, Dennison

e Ong (2005) avaliaram o efeito de diferentes cristalinidades de discos de HA (0%,

30%, 50%, 70% e 100%) na adsorção de proteínas e na adesão de células

precursoras de osteoblastos. Observaram que a liberação de íons fosfato foi

significativamente menor na HA com 100%, em comparação com os outros grupos.

Sugerindo, assim, que a quantidade de íons fosfato liberados se origina dos

componentes amorfos dos materiais. Houve uma significante diminuição na

adsorção de proteína e na adesão celular na HA 100. Os autores concluíram que a

diferença na cristalinidade entre os materiais tem sido associada com variações na

taxa de dissolução, em que cristais menores e imperfeitos apresentam uma maior

dissolução.

O tamanho e a forma das partículas são duas características importantes

de diferentes tipos de biomateriais para o sucesso do reparo ósseo (MANKANI et al.,

2001). Entretanto, Fucini et al. (1993) não encontraram diferença, estatisticamente

significante, no tratamento de defeitos periodontais de pacientes utilizando partículas

de osso liofilizado desmineralizado congelado seco (DFDBA) de diferentes

tamanhos (250-500 e 850-1000µm). Cardoso (2003) também concluiu não haver

diferença estatisticamente significante ao comparar resultados de dois biovidros com

diferentes tamanhos de partículas (300-355 e 90-710µm) implantados em defeitos

críticos de calvária de rato. Sicca et al. (2000) avaliaram, comparativamente, a

43

resposta celular ao enxerto de osso bovino desproteinizado a 100ºC na forma

microgranular (250-1000µm) e macrogranular (1000-2000µm) em subcutâneo de

ratos. Concluíram que este biomaterial, quer seja micro ou macrogranular, promoveu

uma resposta tecidual semelhante à implantação subcutânea de osso autógeno ou

alógeno mineralizado.Todavia, Mankani et al. (2001), associando células do estroma

de medula óssea humana (BMSCs) com partículas de HA/TCP e HA implantadas em

subcutâneo de ratos, verificaram que partículas de HA/TCP com 100-250µm de

tamanho resultaram na maior formação de osso, quando comparadas com outros

tamanhos, e que as partículas de HA, neste mesmo tamanho, não resultaram em

formação óssea. Segundo os mesmos autores acima, partículas com diâmetro

medindo 500-1000µm de HA/TCP, associadas a BMSCs, já foram aprovadas para o

uso clínico pela propriedade osteocondutiva que apresentam. Borden et al. (2003)

utilizaram microesferas sinterizadas de polímero biodegradável de diversos

tamanhos e concluíram que as partículas de diâmetro entre 600-710µm, com poros

de tamanho médio de 210µm e com 35% de porosidade resultram numa ótima

estrutura biomimética, quando submetidas à cultura de osteoblastos humanos, in

vitro. Rosa et al., (1998) demosntraram em um trabalho, utilizando três diferentes

marcas de HA com tamanhos de grânulos diferentes, implantadas em arco

zigomático de ratos, que os de tamanhos aproximados de 300-400µm e 297-420µm

permitiram uma maior formação óssea do que grânulos de tamanho entre 425-

600µm. E quanto às micropartículas, Ferreira et al. (2004) demonstraram que as

com tamanho de 5µm de HA associadas a um pool de BMPs bovinas, em tratamento

de defeito crítico em calvária de rato, não induziram a formação óssea, devido à

formação de numerosos aglomerados destas partículas de HA que promoveram

44

uma forte reação granulomatosa, do tipo corpo estranho, que inibiu marcadamente a

formação de um novo osso.

2.2.1.2.1 Microesferas Cerâmicas de Fosfato de Cálcio

Cerâmicas de fosfato de cálcio têm sido utilizadas como matrizes

tridimensionais porosas ou densas, substitutas de enxertos ósseos, devido às suas

propriedades físico-químicas e biológicas. Atualmente, as pesquisas mostram novas

formas dessas cerâmicas, a exemplo de micro ou nano partículas, para serem

utilizadas como formulações injetáveis em defeitos ósseos. Aplica-se, assim, uma

técnica regenerativa minimamente invasiva, associando ou não esses materiais a

agentes terapêuticos, como enzimas ou proteínas, para, juntamente com a

osteocondutividade do biomaterial, potencializar a regeneração local (RIBEIRO;

BARRIAS; BARBOSA, 2004; SIVAKUMAR; MANJUBALA; PANDURANGA RAO,

2002; TEMENOFF; LU; MIKOS, 2000; WILLI; NESAMONY SHARMA, 2002; WU et

al., 2004). Esta nova tecnologia de liberação local de agentes bioativos tem

interesse interdisciplinar de toda a área biomédica e da engenharia de biomateriais,

química e farmacêutica (RIBEIRO; BARRIAS; BARBOSA, 2004).

Ribeiro, Barrias e Barbosa (2004) propuseram uma nova preparação de

microesferas cerâmicas porosas. Utilizaram dois pós de cerâmicas, fosfato de titânio

e cálcio (CTP) e HA, misturados com solução de alginato sódio, o que possibilitou a

preparação de partículas esféricas, usando a combinação do método de extrusão de

gotas e gelificação ionotrópica na presença de cálcio. As partículas esféricas foram

sinterizadas e o polímero foi removido pelo alto aquecimento provocado por esta

técnica. Obtiveram-se microesferas de fosfato de cálcio com tamanhos uniformes e

uma rede de poros interconectados. As microesferas de CTP resultaram em

45

diâmetros de 513 ± 24 a 792 ± 35µm, com poros de aproximadamente 40µm. As de

HA apresentaram diâmetros de 429 ± 46 a 632 ± 40µm e poros de 2µm.

Neste sistema de liberação, as partículas esféricas com dimensões

uniformes têm sido mais apropriadas para a implantação do que as não

homogêneas, pois se acomodam melhor ao sítio de implantação e, além disso,

apresentam propriedades mais previsíveis durante o curso da injeção (SIVAKUMAR;

MANJUBALA; PANDURANGA RAO, 2002). No mais, espera-se que, depois de

implantadas em sítios irregulares, acomodem-se de tal forma que promovam

adesão, migração, proliferação e diferenciação celular local. E ainda, que os

interstícios entre as partículas se apresentem com tamanho adequado para

promover angiogênese e crescimento tecidual (BARRIAS; RIBEIRO; BARBOSA,

2004; BARRIAS et al., 2006).

Barrias, Ribeiro e Barbosa (2004) investigaram o potencial de

microesferas de HA, com a mesma caracterização acima mencionada, em suportar a

aderência e proliferação de células osteoblásticas humanas in vitro e constataram a

capacidade de osteoblastos crescerem aderidos às suas superfícies.

Em outro estudo, Ribeiro, Barrias e Barbosa (2004) descreveram a

preparação e caracterização de microesferas cerâmicas porosas de CTP e HA

associadas à alginato com a intenção de serem utilizadas como matrizes para

liberação de enzimas e como substitutos ósseos. Eles observaram que o alginato

não modificou as propriedades das cerâmicas e que a enzima utilizada

(glucocerebrosidase) foi adsorvida em ambas, sendo que em quantidade muito

maior na microesfera de CTP em relação à de HA, 41,28ng/cm2 para 1,94ng/cm2

respectivamente.

46

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o potencial osteogênico de um biomaterial cerâmico de HA em

forma de microesferas no reparo ósseo.

3.2 OBJETIVO ESPECÍFICO

Analisar histomorfologicamente, por microscopia de luz, o reparo ósseo

decorrente da implantação de microesferas cerâmicas de HA em defeito crítico na

calvária de ratos.

47

4 METODOLOGIA

4.1 MODELO ANIMAL

Este experimento em animais seguiu as normas de conduta de

experimentação animal da Universidade Estadual de Feira de Santana-Bahia

(UEFS-BA) e foi realizado após a aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de

Animais (CEUA) daquela Instituição (anexo A), de acordo com as Normas para a

Prática Didático-Científica da Vivissecção de Animais, recomendada pela Lei 6638,

de 08 de maio de 1979 (anexo B).

Foram selecionados 36 ratos Wistar albinus, machos, adultos, com massa

corpórea entre 400 a 480g, clinicamente sadios, fornecidos pelo Biotério Central da

UEFS-BA e operados no centro cirúrgico do mesmo. Estes animais foram mantidos

em gaiolas metálicas individuais, em espaço climatizado, com ração sólida (Purina

LabinaTM), água ad libitum e condições ideais de temperatura e luminosidade, sem

necessidade de qualquer medicação pós-operatória.

Inicialmente, os animais foram distribuídos aleatoriamente para

composição de dois grupos, avaliados em três pontos biológicos pós-operatórios,

com seis animais em cada, conforme demonstrado no quadro 1, a seguir.

48

Pontos Biológicos (Dias)

Grupos 15 45 90 Total

I 6 6 6 18

II 6 6 6 18

TOTAL 12 12 12 36

Quadro 1. Número de animais de acordo com os grupos e pontos biológicos (dias) Grupo I – defeito ósseo com coágulo sangüíneo (controle); Grupo II – implantação de microesferas de HA.

4.2 PROCEDIMENTOS

As microesferas de HA foram preparadas, caracterizadas e fornecidas

pelo Grupo de Biointerface, do Instituto de Engenharia Biomédica (INEB) da

Universidade de Porto - Portugal.

4.2.1 Preparação das microesferas

Na preparação das microesferas foi utilizada hidroxiapatita comercial em

pó (Captal SPlasma Biotal®). O pó cerâmico foi disperso numa solução de alginato

de sódio (Pronova Biopolymers®), com uma concentração de 3% (percentagem

peso/volume), sob agitação, até se obter uma pasta homogênea, sendo usada uma

razão cerâmico/solução de polímero de 0,2. A pasta foi extrudida gota a gota para

uma solução de reticulação de cloreto de cálcio (CaCl2 0,1 M), onde partículas de

forma esférica se formaram instantaneamente. As partículas permaneceram na

solução durante 30 minutos, tendo sido posteriormente lavadas em água

desionizada para remover o excesso de CaCl2. O tamanho das microesferas foi

controlado regulando-se a velocidade de extrusão da pasta através de uma seringa

49

e aplicando-se um fluxo de ar co-axial. Finalmente, as partículas foram secas a

30ºC, numa estufa de vácuo e seguidamente sinterizadas com um ciclo térmico de

30 minutos, a 800ºC, seguido de permanência de uma hora a 1200ºC. Foi usada

uma velocidade de aquecimento de 5ºC/minuto.

Cerâmico+

Alginato

Cerâmicos: HApAlginato: 3% p/v

Fluxo de ar co-axial

Lavageme secagem

Reticulação

0.1M CaCl230 min

20% p/pSinterização

Cerâmico+

Alginato

Cerâmicos: HApAlginato: 3% p/v

Fluxo de ar co-axial

Lavageme secagem

Reticulação

0.1M CaCl230 min

20% p/pSinterização

Cerâmicos: HApAlginato: 3% p/vCerâmicos: HApAlginato: 3% p/v

Fluxo de ar co-axial

Lavageme secagem

Reticulação

0.1M CaCl230 min

20% p/pSinterização

Figura 2. Preparação das microesferas de HA (Esquema cedido pela Profa. Cristina Ribeiro do INEB-Portugal).

4.2.2 Caracterização das microesferas

As microesferas apresentaram um diâmetro médio (n=20) de 534±33µm,

o qual foi medido usando-se um microscópio de platina invertida, equipado com uma

ocular micrométrica, com uma precisão de 10µm. As partículas apresentavam uma

área de superfície específica de 0,8040m2/g, quantificada por adsorção gasosa de

acordo com o método BET (Brunauer, Emmel and Teller). Foi determinada a

percentagem em volume de poros por comparação do volume correspondente a um

dado número de microesferas (n=1000) com o volume obtido após moagem e

compactação das mesmas, tendo-se chegado a um valor aproximado de 38%.

Procedeu-se igualmente à caracterização físico-química e morfológica das

50

microesferas, por meio das técnicas de difração de raios X (DRX) e de microscopia

eletrônica de varredura (MEV), respectivamente. Em termos de composição,

verificou-se que as microesferas eram constituídas por HA cristalina, tendo sido

observada a presença de óxido de cálcio em concentração residual. Por MEV

verificou-se que as microesferas obtidas eram bastante homogêneas quanto ao

tamanho e forma, existindo, no entanto, uma percentagem reduzida de partículas de

forma ovalada. A sinterização das microesferas resultou na criação de poros nas

partículas como resultado da queima do alginato. A fase polimérica foi assim

substituída por uma rede porosa interconectada, sendo o tamanho médio dos poros

de aproximadamente 2,5µm.

(a) (b) Figura 3. (a) Imagem de MEV (ampliação 170X) de uma microesfera sinterizada de hidroxiapatita. (b) Imagem de M0 (ampliação 57X) de várias microesferas sinterizadas de HA.

51

(a) (b) Figura 4. Imagem de MEV de uma zona de uma microesfera sinterizada de HA evidenciando a existência de poros: (a) ampliação 1000X, (b) ampliação 5000X.

4.2.3 Esterilização do biomaterial

As microesferas foram acondicionadas em frascos ependorf milimetrados

com aproximadamente 0,43g (0,5mL) em cada, e colocados em embalagens

apropriadas para esterilização em autoclave, sendo então submetidas a uma

temperatura de 120ºC por 30 minutos.

4.2.4 Procedimento cirúrgico

Os animais foram submetidos à anestesia geral, com injeção

intramuscular de cloridrato de quetamina1, na proporção de 0,12mL/100g de massa

corpórea, e a sedação e analgesia, com dose única de uma injeção intramuscular de

cloridrato de xilazina2, na proporção de 0,06mL/100g de massa corpórea. Em

seguida, os animais foram tricotomizados na calvária e, depois de realizada a anti-

sepsia com iodopovidine do campo operatório, foram posicionados em decúbito

ventral para acesso à calvária.

__________________________________________________

1Vetaset 1g ® – VIRBAC do BRASIL IND. COM. LTDA 2Copazine ® 2% - VIRBAC do BRASIL IND. COM. LTDA

52

Utilizou-se a técnica cirúrgica descrita por Miguel et al. (2006), que

consistiu na elevação de retalho bicoronal cutâneo na porção posterior da calvária,

com aproximadamente 3,0cm de extensão, realizada com bisturi de lâmina

intercambiável no15, para acesso ao periósteo. O retalho foi divulsionado com uma

tesoura de extremidade reta e romba, elevado com a extremidade maior da espátula

no7 e mantido afastado com uma pinça hemostática do tipo mosquito.

Na porção mediana do crânio realizou-se uma incisão periosteal linear

transversal, com bisturi de lâmina intercambiável no15, com aproximadamente

9,0mm de extensão, sendo o periósteo elevado com a extremidade menor da

espátula no7 e removido com uma tesoura de ponta reta, para exposição do tecido

ósseo. Defeito ósseo circular transfixado foi confeccionado na porção mediana da

calvária, a partir do vértice da sutura craniana posterior, medindo aproximadamente

8,5mm de diâmetro por 1,0mm de altura, a partir da remoção total do tecido ósseo.

Utilizou-se para isto uma fresa trefina3 com diâmetro de 8,5mm, montada em contra-

ângulo4 com redução de 1:16, acoplado em motor cirúrgico5 com 1500rpm, sob

irrigação constante de solução fisiológica.

__________________________________________________

33i – 3i Implantes do Brasil 4Dabi Atlante® Brasil 5BML 600 Plus Driller, Driller® Brasil

53

Figura 5. Incisão bicoronal na porção posterior da calvária.

Figura 6. Confecção do defeito com fresa trefina.

54

Figura 7. Defeito ósseo criado (diâmetro = 8,5mm).

4.2.4.1 Preenchimento dos defeitos

Após a confecção do defeito na calvária, estabeleceu-se o seu

preenchimento das seguintes formas:

a) no grupo I, o defeito foi preenchido apenas por coágulo sangüíneo,

sem a implantação de enxerto, caracterizando-o como grupo controle;

b) no grupo II, as microesferas de HA foram implantadas no defeito,

embebidas previamente em soro fisiológico, sendo que as partículas foram

acomodadas em toda a extensão do defeito, com ajuda de uma espátula no 7.

A sutura da calvária, em todos os grupos, foi realizada com fio de seda

4.06 em um único plano cutâneo.

__________________________________________________

6Ethicon, Johnson & Johnson

55

Figura 8. Defeito preenchido com microesferas de HA.

4.2.6 Obtenção das peças e clivagem

Após os pontos biológicos correspondentes aos 15, 45 e 90 dias de pós-

operatório, os animais foram mortos pela injeção com dose letal de anestésico

cloridrato de quetamina via peritoneal. Em seguida, foi removida toda a porção

superior da calvária retirando-se o tecido mole, com exceção da dura-máter e do

periósteo. Utilizou-se para isso alicate de corte e tesoura de extremidade reta e

romba. Os espécimes obtidos foram colocados em recipientes plásticos, contendo

álcool 70º para fixação (tempo mínimo de sete dias), identificados e acondicionados

em geladeira.

Após o período de fixação, as peças foram clivadas por meio de discos

diamantados montados em contra-ângulo, em baixa rotação. O fragmento tissular

obtido da porção posterior do defeito foi destinado ao processamento

histotecnológico, conforme figura 9, de 12,5mm de comprimento, onde foram

56

incluídos 2mm de osso remanescente de cada lado. O corte na margem anterior

estendeu-se aproximadamente 1,5mm além da região central do defeito, resultando

num fragmento de 12,5mm de comprimento por 8mm de altura e aproximadamente

1,5mm de espessura (Figura 9).

Figura 9. Vista dorsal da área de seleção do fragmento.

4.2.7 Processamento laboratorial

Os materiais foram processados histologicamente na Unidade de

Histopatologia do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz

(Fiocruz-BA) e no Laboratório de Bioengenharia, Biomateriais e Cultura de Células

do Instituto de Ciências da Saúde (ICS-UFBA).

Após a fixação dos espécimes, estes foram submetidos ao processo de

inclusão em resina polimetilmetracrilato, cujos blocos resultantes foram recortados

57

com discos de corte nº 420 (Dremel®), montados em um motor elétrico (Dremel®),

num formato adequado à inserção destes ao micrótomo de alto impacto para corte

em tecidos não descalcificados (Leica RM 2255 – Microsystems®). Os cortes

histológicos seriados de 6µm de espessura foram corados por hematoxilina-eosina

(HE), picrossírius-vermelho (PIFG) para colágeno e azul de alciano (AA) para

glicosaminoglicanas (GAGs) e examinados em microscopia de luz.

58

5 RESULTADOS

4.1 – ANÁLISE HISTOMORFOLÓGICA

GI – 15 dias

Observou-se neoformação óssea reparativa, restrita às bordas ósseas do

defeito. Este foi preenchido por tecido fibroso, de arranjo menos denso, com

proliferação moderada de capilares sangüíneos, mais conspícua próxima às bordas

ósseas. Inflamação crônica discreta e focal. De permeio, houve proliferação discreta

de células mesenquimais fusiformes e fibroblastos, com a presença de raros e

pequenos núcleos de mineralização na área central do defeito.

59

Figura 10. GI 15D - Neoformação óssea restrita às bordas do defeito com presença de matriz osteóide e osteoblastos (HE 400X).

Figura 11. GI 15D - Defeito preenchido por tecido fibroso de arranjo menos denso, com proliferação moderada de capilares sangüíneos (HE 40X).

60

GI – 45 dias

Observou-se uma discreta ossificação reparativa nas bordas ósseas,

acompanhada de um tecido fibroso mais adensado e de espessura muito delgada na

área de preenchimento do defeito e neovascularização capilar sangüínea

praticamente restrita às proximidades das bordas ósseas. Notou-se ausência de

células inflamatórias e presença de células fusiformes (fibroblastos), dispostas

paralelamente entre si, bem como ausência de núcleos de mineralização na área

central do defeito.

Figura 12. GI 45D - Defeito preenchido por tecido fibroso de espessura delgada, com arranjo menos denso (PIFG 40X).

61

GI – 90 dias

Identificou-se ossificação reparativa escassa restrita às bordas ósseas do

defeito e a presença de tecido fibroso de arranjo bastante denso em toda a sua

extensão, com proliferação vascular moderada mais acentuada nas bordas ósseas.

Notou-se ausência de células inflamatórias, bem como de mineralização,

identificando-se células fusiformes (fibroblastos) paralelas entre si.

Figura 13. GI 90D - Defeito preenchido por tecido fibroso de espessura delgada, de aspecto mais denso (AA 40X).

62

GII – 15 dias

As bordas do defeito apresentaram ossificação reparativa, extendendo-se

entre as microesferas que estavam localizadas nestas imediações, especialmente

com disposição supra-dural. O defeito ósseo foi preenchido completamente pelo

material implantado com tecido fibroso de arranjo menos denso de permeio.

Observou-se uma proliferação vascular abundante em toda a extensão do defeito e

inflamação granulomatosa pouco organizada caracterizada pela presença de

fibroblastos, macrófagos e células gigantes multinucleadas, em torno de todas as

microesferas implantadas, limitada à superfície do material. Algumas células

linfocitárias vistas escassamente. Presença de osteoblastos nas áreas de

mineralização e fibroblastos de disposição frouxa proliferados nas áreas centrais do

defeito. A espessura do preenchimento do defeito equivaleu à espessura da calvária

normal, o que representa aproximadamente três vezes a do grupo controle, no

mesmo ponto biológico. Na maioria das vezes, o material implantado apresentou-se

sobreposto em três a quatro camadas, com microesferas de tamanhos semelhantes,

densamente dispostas com tecido fibroso de permeio entre elas. Ocasionalmente, as

microesferas estavam dispostas em menor número de camadas, e mesmo em

monocamadas em áreas da região central do defeito, possivelmente por

deslocamento do material. A maioria das microesferas mostrou fragmentação

superficial, em direção centrípeta, com deposição de material particulado no tecido

fibroso adjacente, ocasionalmente encontrado no interior de células gigantes

multinucleadas. Algumas áreas de mineralização na porção supra-dural, em regiões

centrais do defeito, algumas vezes circundando parcialmente as microesferas.

63

Figura 14. GII 15D - Ossificação reparativa entre as microesferas próximas às bordas do defeito, e com disposição supra-dural (HE 40X).

Figura 15. GII 15D - Microesferas deslocadas (à direita) da área de preenchimento do defeito (HE 40X).

64

Figura 16. GII 15D - Osteoblastos presentes nas áreas de mineralização (HE 40X);

Figura 17. GII 15D - Tecido conjuntivo denso, com proliferação de fibroblastos, entre as microesferas, com microfragmentos do material de permeio (HE 400X)

65

Figura 18. GII 15D - Fragmentação das microesferas. Há inflamação granulomatosa, com células gigantes multinucleadas englobando partículas do material (HE 400X).

Figura 19. GII 15D - Neoformação óssea entre as microesferas na região central supra-dural, associada a inflamação granulomatosa conspícua (HE 200X).

66

Figura 20. GII 15D - Neoformação óssea adjacente à microesfera e presença de estruturas fibrilares colagênicas no seu interior (PIFG 400X).

Figura 21. GII 15D - Área de mineralização entre as microesferas, próxima a região supra-dural, de localização central. Notar a presença de inflamação granulomatosa na superfície dos materiais, inclusive no seu interior (AA 400X).

67

GII – 45 dias

As bordas ósseas do defeito exibiam neoformação óssea restrita,

envolvendo parcialmente algumas microesferas localizadas nestas proximidades. O

defeito foi preenchido completamente pelo material implantado, cuja espessura

equivaleu a da calvária com tecido fibroso mais adensado, com raras áreas de

hialinização permeando as microesferas. Ainda neste ponto biológico, havia

proliferação vascular proeminente em toda a extensão do defeito e presença de

inflamação granulomatosa, pouco organizada, em torno de todas as microesferas,

limitada à superfície do material. Escassos linfócitos foram vistos difusamente,

havendo, contudo, osteoblastos presentes nas áreas de ossificação e fibroblastos

abundantes no tecido fibroso, dispostos paralelamente entre si. O material estava

disposto em múltiplas camadas, três ou quatro, em toda a extensão do defeito, com

tecido fibroso de permeio. Apenas em uma amostra, na região central do defeito,

observou-se uma camada de microesferas. O tamanho das microesferas era similar,

com fragmentação superficial e com disposição de fragmentos minúsculos no tecido

fibroso, estando muitas vezes contido em células gigantes multinucleadas. Havia

áreas de deposição de matriz osteóide, com focos de mineralização ao longo do

defeito, algumas vezes circundando parcialmente as microesferas.

68

Figura 22. GII-45 - Neoformação óssea próxima às bordas do defeito, completamente preenchido pelas microesferas (HE 20X).

Figura 23. GII-45 - Material disposto em múltiplas camadas em toda a extensão do defeito com tecido fibroso de permeio (HE 40X).

69

Figura 24. GII-45 - Focos de mineralização entre as microesferas. Partículas fragmentadas presentes entre o tecido fibroso e em células gigantes multinucleadas (HE 200X).

Figura 25. GII-45 - Múltiplas áreas de mineralização entre as microesferas (HE 200X).

70

Figura 26. GII-45 - Áreas confluentes de mineralização (PIFG 400X).

Figura 27. GII-45 - Núcleo de mineralização com GAGs entre as microesferas (AA 400X).

71

GII – 90 dias

As bordas ósseas apresentavam neoformação óssea reparativa e restrita

às microesferas localizadas nestas proximidades. A espessura do preenchimento do

defeito era equivalente a da calvária, com material em toda a sua extensão.

Observou-se um tecido fibroso de arranjo mais denso, com muitas áreas (placas) de

hialinização, indicativas de hipocelularidade, e proliferação vascular moderada em

toda a extensão do defeito. Observou-se ainda inflamação granulomatosa pouco

organizada, localizada na superfície das microesferas e muitas vezes fragmentando-

as. Moderado número de linfócitos foi visto difusamente, assim como osteoblastos

presentes nas áreas de mineralização próximas às bordas ósseas e nas áreas

centrais do defeito. Fibroblastos encontravam-se arranjados paralelamente entre si,

muitas vezes circunscrevendo as microesferas, as quais estavam dispostas em

múltiplas camadas, três ou quatro, em toda a extensão do defeito. Aparentemente,

as microesferas apresentavam tamanhos diversos, possivelmente decorrente da

fragmentação pela reação granulomatosa. Havia partículas do material incorporadas

ao tecido fibroso, células gigantes multinucleadas e também contidas em matriz

osteóide. Áreas de deposição de matriz osteóide e de mineralização entre as

microesferas foram vistas de permeio, bem como microesferas com permeação de

fibras colágenas na periferia, em direção centrípeta. Focalmente, foi identificada

fibrose bastante densa, recobrindo esferas sem reação granulomatosa e sem

atividade osteogênica.

72

Figura 28. GII 90D - Defeito preenchido em toda a sua extensão pelas microesferas (HE 20X).

Figura 29. GII 90D - Neoformação óssea lamelar reparativa nas bordas ósseas do defeito (HE 40X).

73

Figura 30. GII 90D - Área central do defeito preenchido pelo material implantado. Notar a presença de veia central sub-dural (HE 40X).

Figura 31. GII 90D – Capilares neoformados no interstício formado pela intersecção das microesferas no defeito. Observar reação granulomatosa muito discreta na superfície dos materiais em contato com tecido conjuntivo frouxo, contrastando com a sua ausência na região adjacente ao tecido fibroso (HE 400X).

74

Figura 32. GII 90D - Reação granulomatosa circundando completamente as microesferas. Presença material eosinofílico, semelhante à matriz osteóide, envolvendo parcialmente a microesfera central (HE 200X).

Figura 33. GII 90D - Fragmentos do material entre o tecido fibroso e também contidos em matriz osteóide (HE 400X).

75

Figura 34. GII 90D - Mineralização confluente entre os materiais. Microesferas com permeação de material fibrilar colagênico (PIFG 200X).

Figura 35. GII 90D - Fibras colágenas circundando e permeando centripetamente as esferas (PIFG 100X).

76

Figura 36. GII 90D - Fibrose mais adensada na região subcutânea de recobrimento do defeito, sem reação granulomatosa e sem atividade osteogênica com presença de capilares neoformados entre as microesferas (HE 200X).

77

6 DISCUSSÃO

O osso é um tecido com alta capacidade regenerativa, principalmente

pela atuação dos fatores de crescimento, que direciona as células-tronco para as

vias condrogênica e osteogênica e também pelo papel das forças mecânicas que

estimulam a remodelação (LIEBSCHNER, 2004). A complexidade da arquitetura

osso e variabilidade de suas propriedades biológicas e físico-químicas, assim como

diferenças de idade e estado nutricional do indivíduo estabelecem grandes desafios

à engenharia tecidual para desenvolver substitutos ósseos, com o intuito de reparar

sítios específicos em determinado paciente (CARVALHO; BASSI; VIOLIN, 2004;

GURGEL, 2000; KARAGEORGIOU, KAPLAN, 2005; SANTOS, 2002; VALLET-

REGÍ, 1997).

Os limites e desvantagens dos enxertos já utilizados em defeitos ósseos,

como os autógenos (BEGLEY et al., 1995; CHAN et al., 2002; LANE,

SANDHU,1987; LEE et al., 2000; LEONETTI; RAMBO; THRONDSON, 2000;

MARDEN et al., 1994; ONG et al., 1998; WU et al., 2004; YAKAMOTO; LUZ;

ARAÚJO, 1994), os homólogos (MISCH; DIETSH, 1993; QUATTELBAUM;

MELLONING; HENSEL, 1988; TAKAGI; URIST, 1982) e os heterólogos (LeGEROS,

1990), já se encontram efetivamente consolidados. Portanto, são de fundamental

importância as pesquisas no desenvolvimento de um enxerto aloplástico ou

78

biomaterial, que mimetize o tecido ósseo, com suas propriedades biológicas e físico-

químicas, que favoreçam a osteogênese.

Um dos mais significantes avanços dos biomateriais nos últimos vinte

anos tem sido no campo dos substitutos ósseos e apresenta vantagens em relação

aos autógenos, homólogos e heterólogos como: quantidade desejável, natureza não

alergênica e nem tóxica, fácil esterilização e estocagem (SANDEEP et al., 2006).

Esses biomateriais podem ser de origem natural ou sintética, como colágeno,

elastina, cerâmica, metal, polímero, dentre outros (VALLET-REGÍ, 1997).

As biocerâmicas, assim denominadas pela sua biocompatibilidade e/ou

bioatividade, têm sido muito pesquisadas nos últimos trinta anos e, dentre as de

fosfato de cálcio, a HA é a mais pesquisada e utilizada em reconstruções ósseas,

por ser muito semelhante ao componente inorgânico principal do tecido ósseo

(KAWACHI et al., 2000; SCHNETTLER et al., 2004; WANG, 2003). Atualmente,

novas formas dessas biocerâmicas, a exemplo de microesferas, vêm sendo

desenvolvidas para utilização como formulações injetáveis em defeitos ósseos, com

o objetivo de promover a regeneração óssea (RIBEIRO; BARRIAS; BARBOSA,

2004; SIVAKUMAR, MANJUBALA; PANDURANGA RAO, 2002; TEMENOFF; LU;

MIKOS, 2000; WILLI; NESAMONY; SHARMA, 2002; WU et al., 2004).

Para análise do potencial osteogênico de um novo biomaterial é

importante a escolha do modelo animal a ser utilizado (LeGUEHENNEC et al.,

2005). Quanto ao modelo animal - ratos - utilizado neste trabalho, além da facilidade

de aquisição, armazenamento e manuseio em ambiente experimental, esses

animais não têm custo elevado, apresentam defeitos estáveis com mínimo risco de

fratura e possibilitam acompanhamento e avaliação radiográfica e histológica da

região óssea (BOSCH; MELSEN; VARGERVIK, 1998).

79

A morfologia do defeito utilizado foi baseada no trabalho de Takagi e Urist

(1982), que observaram nos defeitos críticos de 8mm criados em calvária de rato,

sem implantação de biomaterial, um pequeno reparo de 2 a 3mm correlacionados às

suas margens. Defeitos menores de 8mm em calvária de ratos também são

considerados críticos, pois não se regeneram totalmente ao longo da vida do animal

e são utilizados por vários pesquisadores (BOSCH; MELSEN; VARGERVIK, 1998;

HSU et al., 2005), mas sabendo-se da capacidade regenerativa das suas margens

estes deixariam de ter dimensões críticas e a implantação de um biomaterial

osteocondutor poderia possibilitar a regeneração do defeito, como observado nos

trabalhos anteriormente citados. Desta forma, estes defeitos deixariam de ser um

modelo confiável para avaliar o comportamento osteogênico de novos biomateriais.

A avaliação experimental da regeneração óssea com o modelo de defeito crítico

maior ou igual a 8mm já está bem definida em calvária de rato em vários trabalhos

(TAKAGI; URIST, 1982; SCHMITZ; HOLLINGER, 1986; SCHMITZ et al., 1990;

MIGUEL, 2003; CARDOSO, 2003; MARINS, 2004; MURPHY et al., 2004; JUNG et

al., 2006).

Outro fator importante para a escolha deste modelo experimental é que a

calvária tem a mesma origem embriológica e morfológica da região maxilofacial e

existe uma similaridade fisiológica entre esta e a mandíbula atrófica (TAKAGI;

URIST, 1982), sendo esta região de interesse para a Odontologia.

Neste estudo, puderam ser constatados resultados compatíveis com os

trabalhos acima citados e verificou-se no GI (controle) a presença de neoformação

óssea reparativa restrita às bordas do defeito e, em alguns espécimes, raros núcleos

de mineralização no centro do defeito, próximos à dura-máter, o que foi observado

aos 15 dias do pós-operatório. Aos 90 dias, o reparo do defeito ficou caracterizado

80

por um tecido fibroso, de arranjo mais denso em toda a sua extensão, sem qualquer

mineralização central senão aquela próxima às bordas ósseas remanescentes,

ratificando dessa forma o conceito de defeito crítico. Segundo Schmitz et al (1990),

quando o defeito apresenta dimensões críticas à regeneração é devido à falta de

mediadores químicos locais para estimular este processo, pois as vesículas da

matriz tornam-se improdutivas e, dessa forma, a matriz extracelular não se

mineralizando, um tecido conjuntivo fibroso cicatricial ocupa toda a extensão do

defeito. A implantação de um biomaterial com propriedades osteogênicas de

osteocondução, osteoestimulação e/ou osteoindução é necessária para a

regeneração deste defeito. A propriedade osteocondutora por si não favorece a

completa regeneração de defeitos com estas dimensões, portanto, mais uma vez,

pode-se ressaltar a confiabilidade de pesquisas com novos materiais somente em

modelos de estudo com defeitos de dimensões críticas para uma avaliação mais

pormenorizada das propriedades osteogênicas do biomaterial pesquisado.

As cerâmicas de HA apresentam aplicações clínicas favoráveis, devido às

suas características de biocompatibilidade e osteocondução (KAWACHI et al., 2000;

HSU et al., 2005; SANDEEP et al., 2006). A biocompatibilidade de um material é

avaliada pela capacidade de desempenhar uma resposta tecidual apropriada em

uma aplicação específica (GURGEL, 2000; MISCH, 2004). Nos resultados obtidos

neste trabalho, o biomaterial implantado apresentou um relativo grau de

irritabilidade, caracterizado pela presença de infiltrado linfocitário e reação

granulomatosa em torno do material em quase toda a extensão do defeito e em

todos os pontos biológicos de avaliação. Segundo Anderson (2000), um estímulo

inflamatório persistente resulta numa inflamação crônica. Tanto as propriedades

físico-quimicas quanto a mobilidade do biomaterial implantado pode levar a uma

81

resposta inflamatória crônica, contudo uma reação de corpo estranho, com

desenvolvimento de tecido de granulação, é considerada uma resposta normal aos

biomateriais implantados. Embora as células gigantes multinucleadas possam

persistir por toda a vida na interface biomaterial/tecido, ainda não se sabe se elas

permanecem ativadas ou se tornam quiescentes (ANDERSON, 2000). Champagne

et al. (2002) sugerem que na ausência de infecção bacteriana os macrófagos

secretem fatores de crescimento como TGF-β1 e BMP-2 para promover a

cicatrização da ferida e regeneração óssea. Aos noventa dias, na porção

subcutânea do defeito, observou-se na região de interface entre algumas

microesferas e o tecido, a deposição direta de tecido conjuntivo fibroso, sem reação

inflamatória nem atividade osteogênica. Concomitante à formação de matriz

osteóide com presença de osteoblastos havia micro-fragmentos das microesferas

incorporadas nesta matriz, denotando a biocompatibilidade das hidroxiapatitas,

ratificada por outros autores (NANCI et al., 2000; SILVA, et al., 1998; HSU, et al.,

2005).

De acordo com Shors (1999), os três pré-requisitos para o sucesso do uso

de HA sintética ou coralina em defeitos ósseos consistem numa tríade: estabilidade

rígida do material no sítio implantado, proximidade deste com o tecido ósseo e

viabilidade do tecido, definida pelo autor como “tríade da osteocondução”. Uma das

desvantagens na utilização da HA particulada é o deslocamento das partículas do

local implantado, tornando-as estruturalmente instáveis até que um tecido fibro-

ósseo se desenvolva, o que compromete o reparo ósseo (COSTANTINO et al, 1991;

ALPASLAN, ALPASLAN e OYGÜR, 1994; OONISHI et al., 1997). As microesferas

utilizadas neste trabalho apresentaram tal comportamento. Em alguns espécimes, as

partículas se deslocaram e a espessura da calvária não se manteve similar em

82

relação à originalmente existente. Estes achados foram encontrados também por

Mendonça (2005) e Rosa (1997), em que a neoformação óssea da região cortical de

um defeito córtico-medular foi diminuída em sua espessura, devido ao

extravasamento das partículas implantadas. Nos casos em que as microesferas

ficaram retidas no defeito elas atuaram como material de preenchimento, mantendo

a espessura da calvária em toda a extensão do defeito. A propriedade

osteocondutiva foi confirmada, quando se observou a neoformação óssea, com

presença de osteoblastos originados da periferia do defeito, restrita às bordas

ósseas, envolvendo as microesferas localizadas nesta região e, em alguns casos,

também nas áreas centrais próximas à dura-máter. A presença desta neoformação

óssea, próxima à dura, denota o potencial osteogênico desta, observado em outros

trabalhos como os de Takagi e Urist (1982), Mueller et al. (2002) e Gosain et al.

(2003).

Dentre as propriedades físicas de um biomaterial, a porosidade, o

tamanho de poros e a geometria são muito pesquisados no âmbito da bioengenharia

óssea e alguns trabalhos enfatizam estas propriedades (RIPAMONTI, 1991, 2000;

TSURUGA et al., 1997; KARAGEORGIOU, KAPLAN, 2005; JOSCHEK et al., 2000;

KOMLEV, BARINOV, 2002). Pesquisas têm mostrado a capacidade osteoindutiva,

além da osteocondutiva, de blocos de HA com tamanhos de poros de

aproximadamente 500µm, quando implantados em abdome de macacos

(RIPAMONTI, 1991; RIPAMONTI; CROOKS; KIKBRIDE 1999). Os autores sugerem

que a HA atua como um substrato para adsorção, retenção e liberação de proteínas

osteogênicas (OPs) e BMPs endógenas circulantes, as quais iniciam a formação

óssea local, como uma resposta secundária. Por outro lado, estudos com o mesmo

modelo animal, utilizando HA particulada, não obtiveram o mesmo resultado de

83

formação óssea (van EEDEN; RIPAMONTI, 1994). Estes autores reforçam a

importância da geometria do material a ser utilizado, para se obter a osteoindução.

Já em outro estudo de Le Nihouannen et al. (2005), em que foram utilizados

grânulos de fosfato de cálcio bifásico microporoso em sítios não osteogênicos em

ovelhas, observou-se formação óssea após seis meses, demonstrando capacidade

osteoindutiva. Nas condições experimentais deste trabalho não é possível afirmar

que as microesferas utilizadas tenham propriedades osteoindutivas. Para tanto, elas

devem ser testadas em sítios heterotrópicos.

Quanto ao tamanho dos poros, existem vários estudos enfatizando a sua

importância para que o biomaterial promova a osteogênese (LeGUEHENNEC et al.,

2005; SANDEEP et al. 2006; TSURUGA et al., 1997; YAMAMOTO et al., 2000;

FLAUTRE et al. 2001; KARAGEORGIOU; KAPLAN, 2005). Controvérsias existem na

literatura quanto aos tamanhos dos poros que favoreçam o crescimento tecidual e

infiltração das células, sendo que o tamanho mínimo ideal para que ocorra a

colonização óssea dentro dos poros é da ordem de 100-135µm (HING et al., 1999).

Os poros com tamanhos variando entre 100 e 200µm permitem o crescimento de

osteoblastos acima e dentro deles, levando à formação de matriz osteóide que

mineraliza em seu interior. As condições de processamento que resultem na

presença de microporosidade de aproximadamente 1µm nas paredes dos poros são

importantes para a fixação efetiva das células e para o crescimento interno

(KRIEGER, 2003).

As microesferas porosas de HA utilizadas neste trabalho, preparadas e

caracterizadas por Ribeiro, Barrias e Barbosa (2004), possuem diâmetro de

aproximadamente 534µm, poros de tamanho médio de 2,5µm, área superficial

específica de 0,804m2/g, volume de 38% e uma vasta rede de poros interconectados

84

entre si. A microporosidade deste biomaterial foi comprovada em todas as

microesferas, quando os cortes histológicos foram corados com PIFG, nos quais

notava-se a presença de matriz extracelular rica em colágeno, na periferia destas,

em direção centrípeta, em todos os pontos biológicos avaliados. Quanto maior a

porosidade e área de superfície específica, maior também a adsorção de proteínas.

Para Liu et al (2000), uma área de superfície específica ideal para facilitar a

osteogênese, de 32-50m2/g, associada a uma alta porosidade, maior ou igual a 57%

(JOSCHECK et al, 2000), aumentaria a adsorção de proteínas. A área de superfície

das microesferas utilizadas neste trabalho é muito pequena, segundo Joscheck et al

(2000) e isto seria uma desvantagem para a incorporação de proteínas ou fármacos

por adsorção, caso seja utilizada como carreador para sistema de liberação de

drogas. Portanto, como foi observada a adsorção de proteínas da matriz extracelular

em todas as microesferas, possivelmente isso foi devido a uma porosidade de 38%,

que é relativamente alta. De acordo com Nanci et al. (2000), a capacidade de um

biomaterial adsorver proteínas é de suma importância no processo de interação que

ocorre na interface entre este e o tecido no qual foi implantado. As moléculas,

inicialmente adsorvidas, podem servir como mediadoras da dinâmica local

(sinalização celular, atração, adesão) no comportamento de células inflamatórias,

angiogênicas e osteogênicas. Adesão e proliferação de células osteoblásticas

humanas foram observadas por Barrias, Ribeiro e Barbosa (2004), no estudo in vitro

com as microesferas de HA, com a mesma caracterização das utilizadas neste

trabalho. Borden et al. (2003) ressaltam a importância de que os interstícios entre as

microesferas sejam maior que 100µm para que os osteoblastos possam proliferar e

fazer ligações entre as superfícies das microesferas.

85

Um aspecto interessante quanto ao tamanho dos poros na regeneração

óssea em relação à osteogênese é evidenciado nos trabalhos em que, a depender

do tamanho dos poros e da interconexão destes, tanto em blocos como em

partículas de HA, a osteogênese pode ser precedida de condrogênese (JIN et al.,

2000; KUBOKI; JIN; TAKITA, 2001). Nestes casos, os tamanhos dos poros são

pequenos, longos ou curvos, lembrando um favo de mel, não favorecendo a

angiogênese e, conseqüentemente, a formação de cartilagem será iniciada pela

baixa tensão de oxigênio na região (JIN et al., 2000). Poros maiores de 300µm são

recomendados, pois promovem o aumento de angiogênese e consequentemente

maior neoformação óssea (KARAGEORGIOU; KAPLAN, 2005). No presente

trabalho, a formação de novo osso não foi precedida de condrogênese, observando-

se a presença de matriz osteóide e de osteoblastos nos três pontos biológicos, nas

áreas próximas às bordas ósseas e, em alguns casos, no centro do defeito,

indicando uma atividade crescente de formação óssea.

Acredita-se que os interstícios criados entre as microesferas, quando

implantadas no defeito, e que permaneceram in loco em múltiplas camadas,

possibilitaram a angiogênese em toda a extensão do defeito e a osteocondução,

quando as mesmas estavam próximas às bordas ósseas e à dura-máter, indicando a

possibilidade de uma alta tensão de oxigênio na região. Estes interstícios com

tamanhos adequados à angiogênese e neoformação óssea possivelmente deveram-

se à forma esférica das partículas e aos seus diâmetros similares, sendo estas

características observadas aqui como uma das vantagens do biomaterial. Além

disso, a forma arredondada apresenta uma menor resposta inflamatória em relação

às partículas que não apresentam este formato, como os grânulos com ângulos

agudos na sua topografia (ROSA et al., 1998).

86

Algumas divergências existem na literatura quanto ao tamanho das

partículas utilizadas em defeitos ósseos para possibilitar a osteogênese, uma vez

que as características físico-químicas de cada material e/ou do defeito ósseo

também afetam a resposta tecidual ao enxerto. Todavia, Mankani et al. (2001)

verificaram que partículas de HA/TCP com 100-250µm de tamanho resultaram em

maior formação de osso. Borden et al. (2003) utilizaram microesferas sinterizadas de

polímero biodegradável de diversos tamanhos e concluíram que as partículas de

diâmetro entre 600-710µm resultaram em uma ótima estrutura biomimética, quando

submetidas à cultura de osteoblastos humanos, in vitro. Ferreira et al. (2004)

demonstraram que micropartículas de 5µm, associadas a um pool de BMPs bovina,

em tratamento de defeito crítico em calvaria de rato não induziram a formação

óssea. Em outros trabalhos, utilizando-se biomateriais com diferentes tamanhos de

partículas, embora com diferentes metodologias, não foram observadas diferenças

estatisticamente significantes na osteogênese (CARDOSO, 2003; SICCA et al.,

2000; FUCINI et al., 1993; JUNG et al., 2006). As microesferas utilizadas neste

trabalho, com tamanho de diâmetro de 534µm, são compatíveis com o tamanho das

partículas já aprovadas clinicamente, segundo indicação de Mankani et al. (2001).

As reações que ocorrem na interface entre o biomaterial e o osso são de

caráter molecular, do tipo dissolução de íons do material, adsorção, desorção e

desnaturação de proteínas (HUNT et al. 1997). A superfície da hidroxiapatita permite

a interação de ligações do tipo dipolo, fazendo com que moléculas de água e

também proteínas e colágeno sejam adsorvidos na superfície, possibilitando assim a

regeneração tecidual (RIGO et al., 1996). De acordo com Rey (1998), a mais comum

reação que pode ocorrer na degradação dos materiais de fosfato de cálcio é a

dissolução dos grãos superficiais e liberação de constituintes particulados no meio

87

implantado. Dependendo da natureza, tamanho e quantidade de partículas liberadas

seria induzida uma resposta inflamatória adicionando células fagocitárias à

degradação química.

A dissolução de HA sinterizada de grãos superficiais depende da pureza e

da temperatura de sinterização: HA sinterizada pura, a altas temperaturas, mostra

muito menos degradação e é geralmente considerada não-absorvível, embora

alguma alteração na superfície tenha sido reportada. Neste trabalho, observou-se a

presença de reação inflamatória granulomatosa pouco organizada, em torno das

microesferas implantadas, limitadas à superficie do material, principalmente nos

pontos biológicos de 15 e 45 dias, embora aos 90 dias a presença de macrófagos e

células gigantes multinucledas estivesem evidentes. Desde os primeiros pontos

analisados, a desagregação das microesferas foi observada e micro-fragmentos

destas foram incorporados em células gigantes multinucleadas, no tecido fibroso e,

aos 90 dias, também em tecido osteóide.

Resultados semelhantes foram encontrados por outros autores, mesmo

utililizando modelos experimentais diferentes, como Liu et al. (2000), que

implantaram grânulos de HA em mandíbula e crista ilíaca de ovelhas e Rosa et al.

(1998) que utilizaram diferentes tipos de HA particulada em arco zigomático de

ratos. Segundo Kawachi et al. (2000), as cerâmicas de HA são degradadas

lentamente in vivo e começam a ser absorvidas após quatro a cinco anos de

implantação. Por este motivo, elas têm indicações clínicas limitadas, pois a absorção

é uma propriedade importante ao biomaterial, por ser é concomitante à formação

óssea, devendo, portanto, as cerâmicas de HA serem utilizadas em defeitos que

requeiram, além da regeneração óssea, um preenchimento para reforçar ou

88

melhorar a qualidade do tecido ósseo formado em relação à sua densidade como,

por exemplo, em casos de osteoporose.

Outro fator importante na implantação de um biomaterial para o reparo de

um defeito ósseo é a angiogênese. A biointegração e a biodegradação são

processos que ocorrem entre a superfície do biomaterial e o tecido ósseo. Para cada

um dos fenômenos, o suprimento sangüíneo, a vitalidade celular mantida, assim

como as reações físicas e bioquímicas são importantes (LIU et al., 2000).

O reparo ósseo requer o desenvolvimento de um sistema vascular para

sinalizar a liberação de oxigênio e nutrientes para a área lesada. Dessa forma a

angiogênese é um componente fundamental para o reparo tecidual, pois precede a

formação óssea (SCHMID et al., 1997), sendo regulada por sinais moleculares

mediado por VEGF, FGF, TGF-β e PDGF (LAKEY; AKELLA; RANIERI, 2000). Estes

fatores e outros mediadores angiogênicos influenciam na migração e diferenciação

dos osteoblastos (MAYR-WOHLFART et al., 2002).

Observou-se, neste trabalho, neovascularização abundante num tecido

fibroso de arranjo menos denso, em toda a extensão do defeito, permeando as

microesferas, com neoformação óssea reparativa nas bordas do defeito e áreas de

matriz osteóide com focos de mineralização no centro e osteoblastos presentes,

algumas vezes circundando as microesferas, nos pontos biológicos avaliados.

Diferentemente do grupo controle, no qual a angiogênese foi moderada e mais

acentuada próxima às bordas do defeito, observou-se neoformação óssea

reparativa, restrita a esta área, e na área central um tecido cicatricial fibroso. Murphy

et al. (2004) mostraram a importância da angiogênese em aumentar a regeneração

óssea em defeitos críticos de 9mm criados em calvária de ratos, quando utilizaram

VEGF associada a uma matriz biomineralizada. Estes autores sugerem que a

89

angiogênese aumenta a velocidade de diferenciação e/ou maturação de células

precursoras de osteoblastos, durante o desenvolvimento de novo osso,

provavelmente pela liberação de sinais solúveis osteoindutores.

Além da angiogênese em um reparo ósseo, a população celular derivada

da medula, incluindo pericitos vasculares, células do estroma, células-tronco

mesenquimais e, em menor grau, os osteócitos e osteoblastos das superfícies

ósseas existentes (DAVIES; HOSSEINI, 2000) são importantes para o

desenvolvimento de uma matriz osteóide e posterior mineralização para a

regeneração do tecido ósseo. Nos defeitos com dimensões muito amplas, os

elementos celulares osteogênicos são escassos e, consequentemente, não há

formação de um novo osso. O espaço do defeito é preenchido por um tecido fibroso

cicatricial (SCHMITZ et al., 1990).

Comparando-se, histomorfologicamente, os dois grupos utilizados neste

trabalho, vê-se uma diferença em relação às placas de mineralização observadas no

GII, as quais foram mais predominantes, principalmente entre as microesferas

localizadas centralmente e próximas à dura-máter, nos três pontos biológicos

observados, com presença de matriz osteóide e osteoblastos. No GI, aos 15 dias,

observou-se em alguns espécimes formação de raros núcleos de mineralização

nesta área, contudo aos 45 e 90 dias, não foram mais localizados, posto que um

tecido cicatricial conjuntivo fibroso ocupou toda a extensão do defeito. Concomitante

à neoformação óssea no GII, observou-se também um tecido conjuntivo fibroso, que

foi adensando-se progressivamente, de acordo com o ponto biológico estudado e

que, aos 90 dias, este tecido circundava quase todas as microesferas. Em algumas,

notava-se entre a interface direta e o novo tecido circunvizinho, a ausência de

reação inflamatória granulomatosa.

90

Os aspectos descritos acima denotam a biocompatibilidade destas

microesferas, quando implantadas em defeitos com dimensões críticas em calvária

de rato, atuando como material de preenchimento, e também como material

osteocondutor nas regiões em que células osteoprogenitoras estavam presentes.

Portanto, sabe-se que adicionalmente a esta característica osteocondutora da

microesfera estudada, é necessária a utilização de biomateriais com propriedades

osteoindutora e/ou osteoestimuladora para a regeneração de defeitos críticos.

Diante disso, sugere-se a realização de novos estudos com este biomaterial,

associando-o a adjuvantes para a regeneração óssea.

91

7 CONCLUSÃO

Nas condições experimentais deste trabalho, conclui-se que:

• as microesferas de HA são biocompatíveis, exibindo apenas

moderada inflamação granulomatosa;

• o potencial osteogênico dessas microesferas restringiu-se à

osteocunditividade, observada somente quando estavam próximas

às bordas ósseas do defeito ou na região supra-dural, sendo

freqüentemente envoltas por tecido fibroso;

• as microesferas de HA atuaram, principalmente, como material de

preenchimento do defeito.

92

REFERÊNCIAS

ALPASLAN, C.; ALPASLAN, G.; OYGÜR, T. Bone reaction to superiosteslly hydroxyapatite/collagen/glycosaminoglycans and coral in the guines pig. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, v. 77, p. 335-340, 1994.

AL-SAFFAR, N.; REVELL, P.A. Frustrated wound healing: the immunopathogenesis of bone resorption. In: Bone Engineering, Davies J, editor. Toronto: in squared incorporated, cap.13, p.152-160, 2000.

ANSELME K. Osteoblast adhesion on biomaterials. Biomaterials, v.21, n.7, p.667-681, 2000.

ANDERSON, J.M. The cellular cascades of wound healing. In: Bone Engineering, Davies J, editor. Toronto: in squared incorporated, cap.7, p.81-93, 2000.

AOKI, H. Medical application of hydroxyapatite, 1 e edição, Tokyo, Ishiyaku, Euro Americana, 1994.

AOKI, H. Science and Medical applications of Hydroxyapatite. Tokyo, Takayama Press System Center Co., Inc. JAAS, 1991.

AUBIN, J. E. Osteogenic cell differentiation. In: Bone Engineering, Davies J, editor. Toronto: em squared incorporated, cap.3, p.19-30, 2000.

BARRIAS, C.C., RIBEIRO, C.C., BARBOSA, M.A. Adhesion and proliferation of human osteoblastic cells seeded on injectable hydroxyapatite microspheres. Key Engineering Materials.:v. 254-256; p. 877-880, 2004.

BARRIAS, C.C. et al. Calcium Phosphate Microsphere for Localised Delivery of a Therapeutic Enzyme. Key Engineering Materials, v, 309-311, p. 903-906, 2006.

BEGLEY, C.T. et al. Comparative study of the osteoconductive properties of bioceramic, coral and processed bone graft substitutes. Biomaterials, v.16, n.15, p.1181-1185, 1995.

BERNARD, G.W. Healing and repair of osseous defects. Dent. Clin. North Am., v.35, p.469-477, 1991.

BORDEN, M. et al. Stuctural and human cellular assessment of a novel microsphere- based tissue engineering scaffold for bone repair. Biomaterials, v.24, p.597-609, 2003.

BOSCH, C.; MELSEN, B; VARGERVIK, K. Importance of the critical-size bone defect in testing bone-regenerating materials. J. Craniofac. Surg., v.9, p.310-316, 1998.

BURG, K.J.L.; PORTER, S.; KELLAM, J.F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials, v.21, p.2347-2359, 2000.

93

CARANO, R.A.D.; FILVAROFF, E.H. Angiogenesis and bone repair. Drug Discovery Today. v. 8, p. 980 – 989, 2003.

CARDOSO, A.K.M.V. Análise histomorfológica da implantação de biovidros em defeito crítico criado em calvária de rato. 2003. 130f Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica), Faculdade de Odontologia, Universidade Federal da Bahia, Salvador.

CARVALHO, P.S.P.; BASSI, A.P.F.; VIOLIN, L.A. Revisão e proposta de nomenclatura para os biomateriais. Implant News, v.1, p.255-259, 2004.

CHAMPAGNE, C.M., et al. Macrophage cells lines produce osteoinductive siganals that include bone morphogenetic protein-2. Bone, v. 30, p. 26 – 31, 2002.

CHAN, C; et al. Evaluation of Bioglass/dextran composite as a bone graft substitute. Int. J. Oral Maxillofac. Surg, v.31, p.73-77, 2002.

CHU, G. et al. Mechanical and in vivo performance of hydroxyapatite implants with controlled architectures. Biomaterials, v.23 p.1283-1293, 2002.

COSTANTINO, P.D. et al. Hidroxyapatite cement. Arch Otolaryngol Head Neck Surg., v.117, p. 379-384, 1991.

DACULSI, G. Micro Macroporous Calcium Phosphate Bioceramics, Business Briefing: Global Surgery, p.1-4, 2004.

DAVIES, J.E.; HOSSEINI, M.M. Histodynamics of Endosseus Wound Healing. In: Bone Engineering, Davies J, editor. Toronto: em squared incorporated, cap.1, p.1-14, 2000.

FERREIRA, G.R. et al. Lack of repair of rat skull critical size defect treated with bovine morphometric protein bound to microgranular bioabsorbable hydroxyapatite. Braz Dent J., v. 15, p. 175-180, 2004.

FLAUTRE, B et al. Porous HA ceramic for bone replacement: Role of tha pores and interconnections – experimental study in the rabbit. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. v.12, p.679-682, 2001.

FUCINI, S.E. et al. Small versus large particles of demineralized freeze-dried bone allografts in human intrabony periodontal defects. J. Periodont., v.64, p.844-877, 1993.

GARG, A.K. Grafting Materials in Repair and Restoration. In: Tissue Engineering – Applications in Maxillofacial. Surgery and Periodontics. Cap. 5, Quintessence. Books (Publishing) 1999.

GOSAIN, A.K. et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribuition of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plast Reconstr Surg, v. 112, p. 515–527, 2003.

94

GURGEL, M.F.C. Preparação e caracterização de mantas colágeno-aniônico: hidroxiapatita para reconstrução de tecido ósseo. 2000. 63f. Dissertação (Mestrado em Bioengenharia) – Instituto de Química de São Carlos, Escola de Engenharia de São Carlos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Carlos.

HELMUS, M.N.; TWENDEN, K. 1995. Materials selection. In: Encyclopedic handbook of biomaterials and bioengineering, Part A: Materials (eds) D L Wise, D J Trantolo, D E Altobelli, M J Yaszemski, J D Gresser, E R Schwartz (New York: Marcel Dekker) p. 27-45.

HENCH, L.L. Bioceramics: from concept to clinic. J. Am. Ceram. Soc. v.74, p.1487-1510, 1991.

HENCH, L.L. Bioceramics. J. Am. Ceram. Soc., v.81, p.1705-1728, 1998.

HING, K.A. et al. Quantification of bone ingrowth within bone-derived porous hydroxiapatite implants of varying density. J. Mater. Sci.: Mater. Med. v.10, p.663-670, 1999.

HOLY, C.E. et al. In Vivo Models for Bone Tissue-Engineering Constructs. In: Bone Engineering, Davies J, editor. Toronto: in squared incorporated, cap.46, p.496-504, 2000.

HSU, F.Y. et al. An in vivo study of a bone grafting material consisting of hydroxyapatite and reconstituted collagen. J Mat Scienc: Mat Med, v. 16, p. 341–345, 2005.

HUNT, J.A.; MCLAUGHLIN, P.J.; FLANAGAN, B.F. Techniques to investigate cellular and molecular interactions in the host response to implanted biomaterials. A review Biomaterials, v.18, p.1449-1459, 1997.

ISHAUG, S.L. et al. Bone formation by three-dimensional stromal osteoblast culture in biodegradable polymer scaffolds. J Biomed Mater Res, v. 36, p.17-28, 1997.

JOSCHEK, S. et al. Chemical and physicochemical characterization of porous hydroxyapatite ceramics made of natural bone. Biomaterials, v. 21, p. 1645-1658, 2000.

JIN, Q. et al. Effects of geometry of hydroxyapatite as a cell substratum in BMP-induced ectopic bone formation. J Biomed Mater Res, v. 51, p. 491–499, 2000.

JONES, A.C. et al. Analysis of 3D bone ingrowth into polymer scaffolds via micro-computed tomography imaging. Biomaterials, v. 25, p. 4947-4954, 2004.

JUNG, U.W. et al. The effect of varying the particle size of beta tricalcium phosphate carrier of recombinant human bone morphogenetic protein-4 on bone formation in rat calvarial defects. J Periodontol, v. 77, p.765-772, 2006.

95

KARAGEORGIOU, V.; KAPLAN, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials, v.26, p.5474-5491, 2005.

KATCHBURIAN, E.; ARANA V. Histologia e Embriologia Oral. Medicina Panamericana Editora, São Paulo, 1999.

KAWACHI, E.Y. et al. Biocerâmicas: tendências e perspectivas de uma área interdisciplinar. Química Nova, v.23, p.518-522, 2000.

KOMLEV, V.S.; BARINOV, S.M. Porous hydroxyapatite ceramics of bi-modal por size distribuition. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. v.13, p.295-299, 2002.

KRIEGER, S. (2003), Biocerâmica geociência, www.regeirk.compdfuspgmg497bioceramica.pdf

KUBOKI, Y.; JIN, Q.; TAKITA, H. Geometry of Carriers Controlling Phenotypic Expression in BMP-Induced Osteogenesis and Chondrogenesis J. Bone Joint Surg. Am., v. 83, p.105–115, 2001.

LAKEY, L.A.; AKELLA, R.; RANIERI, J.P. Angiogenesis: implications for tissue repair. In: Bone Engineering, Davies J, editor. Toronto: in squared incorporated, cap.11, p.137-142, 2000.

LANE, J.M. Bone graft substitutes. West J. Med., v.163, p.565-566, 1995.

LANE, J.M., SANDHU, H.S. Current approaches to experimental bone grafting. Orthop Clinics of NA v. 2, p. 213–225, 1987.

LANGER, R.; VACANTI, J.P. Tissue engineering. Science, v. 260, p. 920-926, 1993.

LEE, Y.M. et al. Tissue engineeded bone formacion using chitosan/tricalcium phosphate sponges. J. Periodontol. v.71, p.410-417, 2000.

LeGEROS, R. Z. Materials for bone repair, augmentation and implant coatings. In: Intern Seminar of Orthopedic Rese, 1990.

LeGEROS, R.Z. Properties of osteoconductive biomaterials: calcium phosphates. Clin Orthopedic and Related Res, n.395, p.81-98, 2002.

LeGUEHENNEC, L. et al. Small-animal models for testing macroporous ceramic bone substitutes. J Biomed Mater Res B. Appl Biomater., v.15, p.69-78, 2005.

LEKHOLM, U et al. Oral implants in combination with bone grafts: a 3-years retrospective multicenter study using the Branemark implant system. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v.28, p-181-187, 1999.

Le NIHOUANNEN, D. et al. Ectopic bone formation by microporous calcium phosphate ceramic particles in sheep muscles. Bone, v. 36, p. 1086-1093, 2005.

96

LEONETTI, J.A.; RAMBO, H.M.; THRONDSON, R.R. Osteotome sinus elevation and implant placement with narrow size bioactive glass. Implant. Dent., v.9, p.177-182, 2000.

LIEBSCHNER, M.A.K. Biomechanical considerations of animal models used in tissue engineering of bone. Biomaterials, v.25, p.1697-1714, 2004.

LIU, Y.L. et al. Bone healing in porous.implants: a histological and histometrical comparative study on sheep, J. Mat Sci: Mat Med., v.11, p.711-717, 2000.

LU, L.; CURRIER, B.L.; YASZEMSKI, M.J. Synthetic bone substitutes. Current Opinion Orthopedics, v.11, p.383-390, 2000.

MANKANI, M.H. et al. In vivo bone formation by human bone marrow stromal cells : effect of carrier particle size and shape. Biotechnology and Bioengineering, v.72, p.96-105, 2001.

MARDEN, L.J. et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 is superior to demineralized bone matrix in repairing craniotomy defects in rats. J. Biomed. Mater. Res., v.28, n.10, p.1127-1138, 1994.

MARINS, L.V. et al. Radiographic and histological study of perennial bone defect repair in rat calvarial after treatment with blocks of porous bovine organic graft material. J Appl Oral Sci, v. 12, p. 62-69, 2004.

MAYR-WOHLFART, U. et al. Vascular endothelial growth factor stimulates chemotatic migration of primary human Osteoblast. Bone, v. 30, p. 472-477, 2002.

MEGHJI, S. Bone remodeling. Br. Dent. J., v.172, n.6, p.235-242, 1992.

MENDONÇA, R.G. Avaliação comparativa da reparação óssea após implantação em ratos de proteínas morfogenéticas ósseas (bBMPs) e proteína-2 morfogenética óssea recombinante humana (rhBMP-2). 2005.120f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Faculdade de Odontologia, Universidade Federal da Bahia, Salvador.

MIGUEL, F.B. Avaliação morfológica do comportamento de matrizes tridimensionais de colágeno aniônico na regeneração óssea em rato. 2003. 115f Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica)- Faculdade de Odontologia, Universidade Federal da Bahia, Salvador.

MIGUEL, F.B., et al. (2006) Morphological assessment of the behavior of three-dimensional anionic collagen matrices in bone regeneration in rats. Wiley Periodicals, Inc. J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater. http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/112400635/ABSTRACT DOI: 10.1002/jbm.b.30492

MISCH, C.C. Dental Implants Prosthetics. Ed Elsivier, 2004.

97

MISCH, C.E.; DIETSH, F.D. Bone-grafting materials in implant dentistry. Implant. Dent., v.2, p.158 -167, 1993.

MUELLER, A.A. et al. Early dural reaction to polylactide in cranial defects of rabbits. European Cells Materials, v. 3, p. 5 – 6, 2002.

MUNTING, E.; MIRTCHI, A.; LEMAITRE, J. Bone repair of defects filled with a phosphocalcic hydraulic cement: an in vivo study. J of Mat Sci: Mat in Med, v. 4, p. 337-344, 1993.

MURPHY, W.L. et al. Bone regeneration via a mineral substrate and induced angiogenesis. J Dent Res, v. 83, p. 204-210, 2004.

NANCI, A. et al. Incorporation of circulating bone-matrix proteins by implanted hydroxyapatite and at bone surfaces: implications for cement-line formation and structuring of biomaterials. In: Bone Engineering, Davies J, editor. Toronto: em squared incorporated, cap.27 p.305 -312, 2000.

ONG, M.M. A. et al. Evaluation of a bioactive glass alloplast in treating periodontal intrabony defects. J. Periodontol., v.69, p.1346-1354, 1998.

OONISHI, H. et al. Particulate bioglass compared with hydroxyapatite as a bone graft substitute. Clin Orthop Relat Res, v. 334, p. 316-325, 1997.

PARK, J. (Eds) Biomaterials science and engineering. New York. Plenum Press, 1984.

QUATTELBAUM, J.B.; MELLONING, J.T.; HENSEL, N.F. Antigenicity of freeze-dried cortical bone allograft in human periodontal osseous defects. J. Periodontol., v.59, p.394-397, 1988.

REY, C. “Calcium Phosphates for Medical Applications”. In: Zahid Amjad, editor. Calcium Phosphates in Biological and Industrial Systems. Boston, USA: Kluwer Academic Publishers, 217-251, 1998.

RIBEIRO, C.C; BARRIAS, C.C.; BARBOSA, M.A. Calcium phosphate-alginate microspheres as enzyme delivery matrices. Biomaterials, v.25, p.4363-4373, 2004.

RIGO, E.C.S. et al. “Implantes Metálicos Recobertos com Hidroxiapatita”. Anais do IX Seminário de Metais Não Ferrosos, São Paulo – SP, novembro, 1996.

RIPAMONTI, U. Smart biomaterials with intrinsic osteoinductivity: geometric control of bone differentiation. In: Bone Engineering. Davies J, editor. Toronto: em squared incorporated, p.215-222, 2000.

RIPAMONTI, U.; CROOKS, J.; KIKBRIDE, A.N. Sintered porous hydroxyapatites with intrinsic osteoinductive activity: geometric induction of bone formation. S. Afr. J. Sci., v. 95, p.335-343, 1999.

98

RIPAMONTI, U. The morphogenesis of bone in replicas of porous hydroxyapatite obtained from conversion of calcium carbonate exoskeletons of coral. J. Bone Joint Surg Am. v.73. n.5, p.692-703, 1991.

ROSA, F.P. Avaliação histológica de três diferentes tipos de hidroxiapatitas implantadas em arco zigomático de rato. 1997. 109f. Dissertação (Mestrado em Periodontia) – Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista, Araraquara.

ROSA, F.P. et al. A. Avaliação histológica de três diferentes tipos de hidroxiapatitas implantadas em arco zigomático de rato. Rev. Odontol. UNESP, São Paulo, v. 27, p. 495-508, 1998.

ROSE, F.R., et al. In vitro assessment of cell penetration into porous hydroxyapatite scaffolds with a central aligned channel. Biomaterials, v.25, p.5507-5514, 2004.

SANDEEP, G. et al. Characterization of novel bioactive glass coated hydroxyapatite granules in correlation with in vitro and in vivo studies. Trends Biomater Artif Organs, v. 19, p. 99–107, 2006.

SANTOS, L.A. Desenvolvimento de cimento de fosfato de cálcio reforçado por fibras para uso na área Médico-Odontológica. 2002. 247f. Tese (Doutorado em Materiais e Processos de Fabricação) – Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas.

SCHMID, J. et al. The significance of angiogenesis in guided bone regeneration. Clin Oral Impl Res, v. 8, p. 244 – 248, 1997.

SCHMITZ, J.P.; HOLLINGER, J.O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clin. Orthop., v.225, p.299-308, 1986.

SCHMITZ, J.P. et al. Characterization of rat calvarial nonunion defects. Act Anat., v.138, p. 185-192, 1990.

SCHNETTLER, R. et al. Calcium Phosphate- based bone substitutes. European Journal of Trauma. n.4, p.219-229, 2004.

SEAL, B.L.; OTERO, T.C.; PANITCH, A. Polymeric biomaterials for tissue and organ regeneration. Materials Science Engineering R, v.34, p.147-230, 2001.

SHALAK, R; FOX, C.F. (1988). Preface. In: Tissue Engineering. Shalak, R, Fox, C. F., eds. Alan R.Liss, New York. p. 26-29.

SHORS, E.C. Coralline bone graft substitutes. Orthop Clin of North America, v.30, p. 599–613, 1999.

SICCA, C.M. et al. Avaliação microscópica e bioquímica da resposta celular a enxertos de osso cortical bovino em subcutâneo de ratos. Efeito do tamanho da partícula. Rev. FOB., v.8, p.1-10, 2000

99

SILVA, M.F. Estudo comparativo entre silicona e silicona revestida de hidroxiapatita com fins de inclusão. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 12, p. 1 – 9, 1998.

SIVAKUMAR, M; MANJUBALA, I; PANDURANGA RAO, K. Preparation, characterization and in-vitro release of gentamicin from coralline hydroxyapatite-chitosan composite microspheres. Carbohydrate Polymers, v.49, p.281-288, 2002.

SIVAKUMAR, M; PANDURANGA RAO, K. Preparation, characterization and in-vitro release of gentamicin from coralline hydroxyapatite-chitosan composite microspheres. Biomaterials, v.23, p.3175-3181, 2002.

SODECK, J., CHEIFETZ, S. Molecular regulation of osteogenesis. In: Bone Engineering, Davies J, editor. Toronto: em squared incorporated, cap.4, p.31-43, 2000.

STANFORD, J.W. Recommended standart practices for biological evaluation of dental materials. Int. Dent. J. v.30, p.141-188,1980.

STREET, J. et al. Vascular endothelial growth factor stimulates bone repair by promoting angiogenesis and bone turnover. PNAS, v. 99, p. 9656-9661, 2002.

TAKAGI, K.; URIST, M.R. The reaction of the dura to bone morphogenetic protein (BMP) in repair of skull defects. Ann. Surg., v.196, p.100-109, 1982.

THOMSON, R.C et al. Biodegradable polymer scaffolds to regenerate organs. Adv. Polym. Sciece, v.122, p.245-274, 1995.

TAMPIERI, A. et al. Porosity-graded hydroxyapatite ceramics to replace natural bone. Biomaterials, v.22, p.1365-1370, 2001.

TEMENOFF, J.S.; LU, L.; MIKOS, A.G. Bone-tissue engineering using synthetic biodegradable polymer scaffolds. In: Bone Engineering. Davies J, editor. Toronto: in squared incorporated, cap.42, p.454-461, 2000.

TSURUGA, E. et al. Pore size of porous hidroxyapatite as the cell-substratum controls BMP – induced osteogenesis. J. Biochem., v.121, p.317-324, 1997.

WANG, M. Developing bioactive composite materials for tissue replacement. Biomaterials. v.24, p.2133-2151, 2003.

WILLI, P., NESAMONY, J., SHARMA, C.P. Delivery of insulin from hydroxyapatite ceramic microspheres: Preliminary in vivo studies. J. Biomed Mater Res, v.61, p.660-662, 2002.

WILLIAMS, D.F. (Eds.) Definitions in biomaterials. New York, Elsevier, 1985.

WU, T.J. et al. Studies on the microspheres comprised of reconstituted collagen and hydroxyapatite. Biomaterials, v.25, p.651-658, 2004.

100

UEDA, M. et al. Tissue engineering: applications for maxillofacial surgery. Mat Sci Eng C. v.13, p.7-14, 2000.

URIST, M.R. et al. Bone morphogenetic protein: the molecularization of skeletal sistem development. J. Bone Miner Res., v. 12, p. 343-345, 1997.

VASCONCELOS, B.C.E. et al. Reconstrução alveolar com enxerto ósseo autógeno intrabucal. Rev Bras Cir Periodont, v.1, p.31-35, 2003.

VALLET-REGÍ, M. Introduction to the world of biomaterial. An. Quim. Int. Educ., v.93, p.6-14, 1997.

van EEDEN, S.; RIPAMONTI, U. Bone differentiation in porous hydroxyapatite is regulated by the geometry of the substratum: implications for reconstructive craniofacial surgery. Plast Reconstr Surg, v. 93, p. 959-966, 1994.

YAMAMOTO, M et al. Promotion of fibrovascular tissue ingrowth into porous sponges by basic fibroblast growth factor. J. Mat. Sci: Mat. Méd., v.11, p.213-218, 2000.

YAKAMOTO,M.K.; LUZ, J.G.C.; ARAÚJO, V.C. Resposta tecidual óssea frente à hidroxiapatita granular implantada em defeitos criados em mandíbula de ratos. Rev. Odontol. Univ. São Paulo, v.8, p.281-286, 1994.

YANG, Y.; DENNISON, D.; ONG, J.L. Protein adsorption and osteoblast precursor cell attachment to hydroxyapatite of different crystallinities. The Int. Journ. Oral & Maxillo of. Implants., v.20, p.187-192, 2005.

YASZEMSKI, M.J. et al. Clinical needs for bone tissue-engineering technology. In: Bone Engineering. Davies J, editor. Toronto: in squared incorporated. cap. 51, p.541-547, 2000.

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