universidade estadual paulista “jÚlio de … · biografia do autor edvar de sousa da silva –...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
ENXERTIA NO CONTROLE DA MURCHA BACTERIANA, NA
ATIVIDADE DE ENZIMAS E PRODUÇÃO EM TOMATEIRO
EDVAR DE SOUSA DA SILVA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agronômicas da UNESP – Campus de
Botucatu, para obtenção do título de Doutor
em Agronomia – Horticultura.
BOTUCATU – SP
Março 2013
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
ENXERTIA NO CONTROLE DA MURCHA BACTERIANA, NA
ATIVIDADE DE ENZIMAS E PRODUÇÃO EM TOMATEIRO
EDVAR DE SOUSA DA SILVA
Orientadora: Profa. Drª. Rumy Goto
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agronômicas da UNESP – Campus de
Botucatu, para obtenção do título de Doutor
em Agronomia – Horticultura.
BOTUCATU – SP
Março 2013
BIOGRAFIA DO AUTOR
EDVAR DE SOUSA DA SILVA – Nasceu em Sítio Novo do
Tocantins – TO, no dia 14 de julho de 1984. Cursou da pré-escola até a 8º serie do ensino
fundamental na Escola Estadual Manoel Estevão de Souza em Sítio Novo do Tocantins. Entre
2001 e 2003 cursou o ensino médio e técnico agrícola na antiga Escola Agrotécnica Federal de
Aráguatins-TO (EAFA-TO), atualmente Instituto Federal do Tocantins, campus Araguatins.
Em abril de 2004, iniciou o curso de graduação em Licenciatura em Ciências Agrícolas na
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRuralRJ), localizada em Seropédica – RJ.
Durante o curso foi bolsista de Iniciação Científica no programa PIBIC/CNPq - UFRuralRJ
entre agosto de 2005 e julho de 2007, e monitor na disciplina de Didatica de Ciências
Agrícolas do Departamento de Teoria e Planejamento de Ensino do Instituto de Educação da
UFRuralRJ de junho a agosto de 2007. Concluiu o curso de Licenciatura em Ciências
Agrícolas em 2007. Obteve título de mestre em Agronomia/Horticultura pela Universidade
Estadual Paulista (Unesp), campus de Botucatu, o qual foi cursado entre 2008 e 2010, com
orientação da Profª Drª Rumy Goto. Nesta mesma instituição e com a mesma orientadora,
cursou o doutorado também em Agronomia/Horticultura, entre 2010 e 2013, que gerou esta
tese. Ainda em 2013, ingressou como professor no Instituto Federal do Acre.
I
DEDICO
Aos meus pais,
Joaci da Silva e Francisca Bernardo de Sousa (In memoriam),
responsáveis pelos verdadeiros valores da vida que tenho.
À Luciana Castello Branco, pelo apoio, incentivo, companheirismo e compreensão em todos
os momentos.
Aos meus irmãos, Eduardo, Edvaldo, Edvan, Edna, Edileuza, Zilda, Maria, Odete, Joseane,
Joceane, Josilene, a minha madrasta Anizete, por me fazerem sempre compreender como é
bom ter uma família e por serem em muitos momentos minha inspiração e minha força,
principalmente quando eu acordo todas as manhãs e olho a foto deles.
AGRADEÇO
À DEUS,
Por estar presente na minha vida em todos os momentos e também na vida daqueles que fazem
parte da minha caminhada. Por me mostrar que ao vê-lo no próximo, eu consigo observar além
dos que os olhos podem vê e encarar tudo como aprendizagem.
II
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Agronômicas / Universidade Estadual
Paulista – Júlio de Mesquita Filho;
À CAPES pela concessão da bolsa para minha manutenção no curso;
À Fundunesp e ao CNPq pelo auxílio financeiro para realização da
pesquisa;
À Profa Dr
a Rumy Goto, pela orientação, por passar seus preciosos
conhecimentos em horticultura e pela amizade construída em meio à sinceridade, amor pela
horticultura e pela docência;
À Profa Dr
a Giuseppina Pace Pereira Lima, por ter compartilhado seus
conhecimentos em bioquímica, pelo espaço em seu laboratório e em seu precioso tempo, além
de participar na realização dos experimentos;
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Maringoni, por ter compartilhado seus
conhecimentos em fitopatologia e estruturas laboratoriais, além de participar na realização dos
experimentos;
Às bolsistas de iniciação cientifica (Pibic-Cnpq) Daniele Vieira de
Menezes (Instituto de Biociências – UNESP/Botucatu) e Laís Busca Consoline (Faculdade de
Ciências Agronômicas – UNESP/Botucatu) pela amizade, trabalho e comprometimento
comigo e com o projeto;
Às empresas: Nunhems, Takii do Brasil Ltda, Sakata Seed
Sudamerica Ltda, pelo fornecimento de materiais e estrutura;
Aos funcionários da Fazenda Experimental de Pesquisa e Produção
(FEPP) da UNESP em São Manuel – SP, pelo auxílio prestado durante o experimento e por
passarem seus conhecimentos durante os proveitosos e agradáveis dias de convivência;
Aos amigos, como diz a Adelana, Hermanos Ewerton Gasparetto,
Miguel Sandri, Adelana Santos, Thais Botamede, estagiários Jéssica, Leonardo Tatsuo, Lucas
Guimarães, Victor Montanaro, Tárik Hanai, Milton Vinicius, Lucas Isidoro, Daniel, Carine
Zanfirov, Aline Retz, Fernando Martini, que fazem parte do Grupo de Estudos em Produção
de Hortaliças (GEPH), filhos da formação da nossa querida professora Rumy Goto.
III
A todos coorientados, agregados, estagiários da Professora Rumy
Goto e colegas de pós-graduação em Agronomia-Horticultura que de forma direta e indireta
contribuíram com este estudo e principalmente com a minha formação através de momentos
inesquecíveis que sempre farão parte da minha vida;
Aos colegas Miguel, Willian, Arleneo e Rene pela as análises de pós-
colheita dos frutos do tomateiro;
Aos colegas do laboratório de Bioquímica da professora Fina – IB.
pelo acolhimento, auxílio, amizade e momentos agradáveis de descontração;
Ao funcionário José Marcelo Soman do laboratório de Bacteriologia –
Departamento de Proteção Vegetal – UNESP Botucatu, por auxiliar e passar seu precioso
conhecimento em bacteriologia;
Aos meus amigos e companheiros de república, Manoel, Luís Vieira
(Braquiária), Arleneo por terem compartilhado diversos momentos, como a amizade de
família e contribuírem muito para meu desenvolvimento como pessoa;
À Ana Claudia pelo auxílio, principalmente nas avaliações de trocas
gasosas das plantas;
Aos que já não chamo mais de amigos, mas de irmãos da Renovação
Carismática Católica de Botucatu, Jackson e Adriana, Arthur e Nilce, Renata Marques, Eleide,
Amilton, Maila Brito, Paulo Luvizutto, Tiago Alexandre, Meirinha, e demais irmãos que
nasceram pela fé.
IV
Sumário
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ VII
LISTA DE FIGURAS ...............................................................................................................IX
1 RESUMO ............................................................................................................................ 1
2 ABSTRACT ........................................................................................................................ 3
3 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 5
4 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 7
5 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 8
5.1 A cultura do tomateiro .................................................................................................. 8
5.2 Murcha Bacteriana (Ralstonia solanacearum) ........................................................... 10
5.3 Enxertia em hortaliças ................................................................................................ 12
5.4 Enzimas antioxidativas e os mecanismos de defesa da planta .................................... 14
5.5 Trocas gasosas em plantas .......................................................................................... 19
6 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 21
6.1 EXPERIMENTO 1: Avaliação do estresse causado pela enxertia em tomateiro
através da variação da atividade enzimática e teor de fenóis ................................................ 21
6.1.1 Produção de mudas e condução do experimento ................................................. 21
6.1.2 Delineamento do experimento 1 e avaliação da cicatrização das mudas
enxertadas .......................................................................................................................... 23
6.1.3 Coletas das plantas para análises bioquímicas dos experimentos 1 e 2............... 24
6.1.4 Determinação da atividade enzimática e teor de fenóis totais dos experimentos 1
e 2...................... ................................................................................................................ 24
6.1.5 Superóxido dismutase (SOD) .............................................................................. 24
6.1.6 Catalase (CAT) e polifenoloxidase (PPO)........................................................... 25
6.1.7 Peroxidase (POD) ................................................................................................ 25
6.1.8 Fenilalanina amônia liase (PAL) ......................................................................... 25
6.1.9 Fenóis totais ......................................................................................................... 26
6.2 EXPERIMENTO 2: Incidência da murcha bacteriana do tomateiro, trocas gasosas,
atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de tomateiro enxertadas e
inoculadas com R. solanacearum .......................................................................................... 26
6.2.1 Delineamento experimental ................................................................................. 27
V
6.2.2 Transplante das plantas ........................................................................................ 28
6.2.3 Preparo do inóculo de R. solanacearum .............................................................. 28
6.2.4 Inoculação das plantas ......................................................................................... 29
6.2.5 Avaliação da incidência da murcha bacteriana.................................................... 29
6.2.6 Medidas de trocas gasosas nas plantas ................................................................ 29
6.2.7 Coletas das plantas do experimento 2.................................................................. 30
6.3 EXPERIMENTO 3: Avaliação da produção do tomateiro em função de três métodos
de enxertia e pé-franco .......................................................................................................... 30
6.3.1 Preparo da área e produção das mudas ................................................................ 30
6.3.2 Condução do experimento ................................................................................... 31
6.3.3 Delineamento experimental ................................................................................. 32
6.3.4 Avaliação das características quantitativas da produção ..................................... 32
6.3.5 Avaliação das características qualitativas da produção ....................................... 33
6.3.6 Vitamina C ........................................................................................................... 33
6.3.7 Licopeno e β-caroteno ......................................................................................... 33
6.3.8 Firmeza ................................................................................................................ 34
6.3.9 Acidez titulável (AT) ........................................................................................... 34
6.3.10 pH ........................................................................................................................ 34
6.3.11 Sólidos solúveis (SS) ........................................................................................... 34
6.3.12 Relação SS/AT (“Ratio”)..................................................................................... 34
6.3.13 Análise estatística dos experimentos 1, 2 e 3 ...................................................... 35
7 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 37
7.1 EXPERIMENTO 1: Avaliação do estresse causado pela enxertia em tomateiro
através da variação da atividade enzimática e teor de fenóis ................................................ 37
7.1.1 Cicatrização do local da enxertia das mudas em função do método de enxertia . 37
7.1.2 Atividade das enzimas SOD, CAT, POD, teor de Fenóis e PPO em função dos
métodos de enxertia e do dia após a enxertia .................................................................... 38
7.2 EXPERIMENTO 2: Incidência da murcha bacteriana do tomateiro, trocas gasosas,
atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de tomateiro enxertadas e
inoculadas com R. solanacearum .......................................................................................... 45
VI
7.2.1 Incidência da murcha bacteriana em plantas de tomateiro enxertadas e pé-franco
de tomateiro ....................................................................................................................... 45
7.2.2 Trocas gasosas em plantas de tomateiro enxertadas e pé-franco e inoculadas com
R. solanacearum ................................................................................................................ 47
7.2.3 Atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de tomateiro
enxertadas e inoculadas com R. solanacearum ................................................................. 52
7.3 EXPERIMENTO 3: Produção do tomateiro em função de três métodos de enxertia e
pé-franco ................................................................................................................................ 64
7.3.1 Produtividade comercial, não comercial e total do tomateiro em função dos
métodos de enxertia e pé-franco ........................................................................................ 64
7.3.2 Características qualitativas da produção de tomateiro em função dos métodos de
enxertia e pé-franco ........................................................................................................... 70
8 CONSIDERAÇÕES GERAIS ........................................................................................... 71
9 CONCLUSÕES ................................................................................................................. 73
10 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 74
VII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Arranjo dos tratamentos para avaliação das atividades enzimáticas e teor de fenóis.
UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. ........................................................................................... 28
Tabela 2. Análise química do solo e teores de macro e micronutrientes. FEPP/FCA/UNESP,
2011. .......................................................................................................................................... 31
Tabela 3. Esquema da análise de variância dos experimentos. ................................................. 36
Tabela 4. Atividade da enzima SOD (U g-1
proteína) em função do método de enxertia e do dia
após enxertia. UNESP-FCA, 2010. ........................................................................................... 39
Tabela 5. Atividade da enzima CAT (μmol H2O2 min-1
mg-1
proteína) em função do método de
enxertia em tomateiro. UNESP-FCA, 2010. ............................................................................. 40
Tabela 6. Atividade da enzima POD (μmol H2O2 decomposto min-1
mg-1
proteína) em função
do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. ......................................... 41
Tabela 7. Teor de fenóis (mg g-1
massa fresca) em função do método de enxertia e do dia após
enxertia. UNESP-FCA, 2010. ................................................................................................... 42
Tabela 8. Atividade da enzima PPO (µmol catecol oxidado min-1
µg-1
proteína) em função do
método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010. .............................................. 44
Tabela 9. Porcentagem de folhas murchas em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado em
porta-enxerto ‘Guardião’, inoculado e não-inoculado com R. solanacearum. UNESP-FCA,
Botucatu, SP, 2011. ................................................................................................................... 46
Tabela 10. Massa fresca (g) e massa seca (g) em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado
em porta-enxerto ‘Guardião’, inoculado e não-inoculado com R. solanacearum, aos 15 DAI.
UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. ........................................................................................... 47
Tabela 11. Trocas gasosas (gs: condutância estomática; E: taxa de transpiração; A: Taxa de
assimilação liquida de CO2) em plantas de tomateiro enxertadas e pé-franco aos 0 e 15 dias
após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011. ......................... 49
Tabela 12. Correlação linear entre características porcentagem de folhas murchas (%), massa
fresca (MF), massa seca (MS), condutância estomática (gs), transpiração (E) e taxa de
assimilação liquida de CO2 (A), baseado no coeficiente de correlação (%). UNESP-FCA,
Botucatu, SP, 2011. ................................................................................................................... 51
VIII
Tabela 13. Atividade da enzima SOD (U g-1
proteína) em função da enxertia e do dia após a
inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. ........................................................... 53
Tabela 14. Atividade da enzima CAT (μmol H2O2 min-1
mg-1
proteína) em função da enxertia
e do dia após a inoculação de R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. ..................................... 54
Tabela 15. Atividade da enzima POD (μmol H2O2 decomposto min-1
mg-1
proteína) em função
da enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. ................ 56
Tabela 16. Atividade da enzima PAL (μmols min-1
mg-1
de proteína) em função da enxertia e
do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. ..................................... 59
Tabela 17. Teor de fenóis (mg g-1
massa fresca) em função da enxertia e do dia após a
inoculação de R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. .............................................................. 61
Tabela 18. Atividade da enzima PPO (µmol catecol oxidado min-1
µg-1
proteína) em função da
enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011. .................... 63
Tabela 19. Produtividade comercial, não comercial e total do tomateiro em função dos
métodos de enxertia, baseado no número e massa dos frutos por m2. UNESP-FCA-FEPP, São
Manuel, SP, 2011. ..................................................................................................................... 65
Tabela 20. Produtividade comercial do tomateiro, baseado no número, massa (kg) dos frutos
comerciais por m2 e na classe do fruto (CQH-CEAGESP 2003), em função dos métodos de
enxertia e pé-franco. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011. .......................................... 69
Tabela 21. Produtividade não comercial do tomateiro em função dos métodos de enxertia e pé-
franco, baseado na massa dos frutos por m2. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011. ..... 69
Tabela 22. Ácido ascórbico (AA - mg de ácido ascórbico 100 g-1
de polpa), licopeno, β-
caroteno, acidez titulável (AT - g de ácido málico 100g-1
), sólidos solúveis (SS - °Brix),
relação sólidos solúveis/acidez titulável (SS/AT - Ratio), potencial hidrogeniônico (pH),
Firmeza (N), em função de métodos de enxertia de tomateiros, Botucatu – SP, 2011. ............ 70
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Câmara úmida de enxertia. UNESP/FCA, Botucatu, SP. Foto: Edvar Silva, 2010. .. 23
Figura 2. Vista geral do segundo experimento. UNESP/FCA, Botucatu, 2011. Foto: Edvar
Silva. .......................................................................................................................................... 27
Figura 3. Vista do experimento 3. UNESP/FCA/FEPP, São Manuel, SP, 2011. Foto: Edvar
Silva. .......................................................................................................................................... 32
Figura 4. Porcentagem de cicatrização do local da enxertia em função dos métodos de enxertia
em tomateiro. UNESP-FCA, 2010. ........................................................................................... 38
Figura 5. Planta de tomateiro enxertada pelo método Fenda garfagem. Foto: Edvar Silva,
2010. .......................................................................................................................................... 41
Figura 6. Planta de tomateiro enxertada pelo método Encostia. Foto: Edvar Silva, 2010. ....... 41
Figura 7. Porcentagem de frutos comerciais e não comerciais na produção de tomateiro em
função do método de enxertia e pé-franco. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011. ........ 66
Figura 8. Porcentagem da massa fresca (kg m-2
) dos frutos comerciais e não comerciais na
produção de tomateiro em função do método de enxertia e pé-franco. UNESP-FCA-FEPP, São
Manuel, SP, 2011. ..................................................................................................................... 67
X
Anexos
Anexo 1. Temperatura máxima, mínima e média dentro do ambiente protegido de 23/06/2011
a 16/11/2011, UNESP/FCA/FEPP, São Manuel, SP, 2011. ...................................................... 87
Anexo 2 . Umidade relativa do ar máxima, mínima e média dentro do ambiente protegido de
23/06/2011 a 16/11/2011, UNESP/FCA/FEPP, São Manuel, SP, 2011. .................................. 88
1
ENXERTIA NO CONTROLE DA MURCHA BACTERIANA, NA ATIVIDADE DE
ENZIMAS E PRODUÇÃO EM TOMATEIRO. Botucatu, 2013. 88 p.Tese (Doutorado em
Agronomia/Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas. Universidade Estadual
Paulista.
Autor: EDVAR DE SOUSA DA SILVA
Orientadora: RUMY GOTO
1 RESUMO
A enxertia é uma técnica utilizada com a finalidade de controlar
patógenos de solo, como a R. solanacearum, porém em porta-enxerto resistente tem-se
observado sintomas da doença no enxerto, devido a passagem do patógeno. A enxertia e a
bactéria podem causar estresse na planta de tomateiro e algumas enzimas e o teor de fenóis
podem ser usados como respostas bioquímicas a estes estresses. Para avaliar a eficiência desta
técnica sobre a bactéria e na produção de tomateiro foram medidas, a incidência da doença,
trocas gasosas das plantas, a atividade de algumas enzimas como superoxido dismutase
(SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), fenilalanina amônia-liase (PAL), polifenoloxidase
(PPO), teor de fenóis e produção em plantas de tomateiro ‘Pizadoro’ pé-franco e enxertadas no
porta-enxerto ‘Guardião’. Para tanto foram realizados dois experimentos na Faculdade de
Ciências Agronômicas da UNESP de Botucatu-SP e um experimento na Fazenda de ensino,
pesquisa e produção (FEPP) em São Manuel, SP. No primeiro experimento foi avaliada a
variação da atividade enzimática (SOD, CAT, POD, PPO) e teor de fenóis em mudas do
tomateiro, em função dos métodos de enxertia Contato em bisel, Fenda garfagem, Encostia,
enxerto pé-franco e cinco coletas das plantas, aos 0, 3, 6, 9 e 12 dias após a enxertia (DAE).
No segundo, foram avaliadas a incidência da murcha bacteriana, trocas gasosas nas folhas,
além da atividade das enzimas SOD, CAT, POD, PAL, PPO e teor de fenóis, aos 0, 2, 4, 6, 8 e
15 dias após a inoculação com R. solanacearum, em plantas enxertadas de tomateiro
conduzidas em casa de vegetação. No terceiro experimento foram avaliados três métodos de
enxertia (Contato em bisel, Fenda garfagem e Encostia) e pé-franco na produção de tomateiro
sob ambiente protegido. O método Fenda garfagem é melhor para cicatrização do local da
2
enxertia e produção de tomateiro ‘Pizzadoro’ enxertado em ‘Guardião’. A murcha das folhas
causada pela infecção de R. solanacearum reduz as trocas gasosas em tomateiro ‘Pizzadoro’
pé-franco e enxertado no porta-enxerto ‘Guardião’. A enzima PAL pode ser utilizada como
marcador bioquímico em plantas de tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertadas no porta-
enxerto ‘Guardião’ em resposta à infecção de R. solanacearum.
______________________
Palavras chave: Solanum lycopersicum, Ralstonia solanacearum, estresse, atividade
enzimática e trocas gasosas
3
GRAFTING TO CONTROL BACTERIAL WILT, ENZYME ACTIVITY
AND YIELD IN THE TOMATO PLANTS. Botucatu, 2013. 88 p. Thesis (PhD in
Agronomy/Horticulture) – College of Agronomical Sciences. State University of São Paulo.
Author: EDVAR DE SOUSA DA SILVA
Supervisor: RUMY GOTO
2 ABSTRACT
Grafting is a technique used in order to control soil pathogens, such as
R. solanacearum bacteria. The symptoms of the disease, however, have been observed in
resistant rootstock, due to the passage of the pathogen to the graft. Both grafting and the
bacteria can cause stress in tomato plant and some enzymes and phenols can be used as
biochemical marker to this stress. In order to evaluate the efficiency of grafting to control the
bacteria in the tomato yield, the disease incidence, plant gas exchange, phenol contents and the
activity the enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD),
phenylalanine ammonia lyase (PAL), polyphenoloxidase (PPO), as well as tomato fruit yield
were measured. The study considered ungrafted and grafted tomato plants 'Pizzadoro' on
rootstock 'Guardian' in two experiments carried out at the College of Agricultural Sciences,
UNESP, in Botucatu-SP, and one experiment at the Farm of Teaching, Research and
Production (FEPP), in São Manuel-SP. The enzymes activity of SOD, CAT, POD, PPO and
phenol content in tomato seedlings were evaluated in the first experiment, as a function of the
grafting methods Contact bevel, Cleft grafting, Supported grafting, graft ungrafted in five
harvests at 0, 3, 6, 9 and 12 days after grafting (DAG). In the second experiment, the incidence
of bacterial wilt, leaf gas exchange, as well as the activity of enzymes SOD, CAT, POD, PAL,
PPO and phenol content were evaluated, at 0, 2, 4, 6, 8 and 15 days after inoculation with R.
Solanacearum, in grafted tomato plants growing at greenhouse. In the third experiment, three
grafting methods (Contact bevel, Cleft grafting and Supported grafting) and ungrafted tomato
were evaluated considering the production under protected environment. The Cleft grafting
method was the best for the site healing of grafting and tomato fruit yield, on the 'Pizzadoro'
plants grafted in 'Guardian'. The leaves wilt caused by the bacterium R. Solanacearum
4
infection decreases the gas exchange in tomato plants 'Pizzadoro' ungrafted and grafted on
rootstock 'Guardian'. The enzime PAL can be used as a biochemical marker in tomato plants
'Pizzadoro' ungrafted and grafted on rootstock 'Guardian' in response infection of R.
solanacearum.
______________________
Keywords: Solanum lycopersicum, Ralstonia solanacearum, stress, enzyme activity and gas
exchange
5
3 INTRODUÇÃO
O cultivo do tomateiro no Brasil até 2011 ocupava uma área de
aproximadamente 45 mil hectares de tomate para mesa e 20 mil hectares de tomate para
indústria, com uma produção de 2.667.232 toneladas para mesa e 1.436.202 toneladas para
indústrias e produtividade média de 62,88 t ha-1
. Isto é resultante do uso das tecnologias
geradas pelas pesquisas de instituições oficiais e privadas em parceria com os tomaticultores,
tanto no cultivo em ambiente protegido quanto em campo aberto. O sistema de produção do
tomateiro demanda muitas tecnologias, dentre as quais, condução, entendimento da fisiologia
da cultura, nutrição, manejo fitossanitário, são muito importantes.
O uso intensivo do ambiente protegido causam problemas de
salinização do solo e infestação de fitopatógenos, que podem inviabilizar o cultivo de
hortaliças neste ambiente como, por exemplo, a bactéria Ralstonia solanacearum (Smith),
causadora da murcha bacteriana na cultura do tomateiro.
A murcha bacteriana é uma das mais importantes doenças de solo em
solanáceas no Estado de São Paulo e nos demais estados do Brasil. Devido a bactéria R.
solanacearum atuar no sistema vascular, ser habitante do solo e estar associado a um grande
número de espécies botânicas e o controle da doença se torna extremamente difícil.
No cultivo de hortaliças, dentre elas o tomateiro, a enxertia é um
técnica realizada através de vários métodos, praticada comercialmente em diversos países do
6
mundo, com a finalidade de controle de patógenos de solo, dentre eles R. solanacearum e
aumento da produtividade . Em 2009, foram comercializadas nos principais viveiros de
hortaliças do estado de São Paulo, 2.347.670 mudas enxertadas de pimenteiro, 1.972.210 de
pepineiro, 776.010 de tomateiro 70.400 de berinjeleira, 3.400 de jiló, 7.500 de abobrinha Mini.
Tem-se observado que híbridos de tomateiro enxertados em porta-
enxertos resistentes a R. solanacearum têm apresentado sintomas da murcha bacteriana, que
ao decorrer do tempo pode afetar a produção comercial das plantas. Algumas formas de
avaliar até quando o porta-enxerto resiste à doença e a sua presença no enxerto seriam a
avaliação da incidência da doença, trocas gasosas nas folhas das plantas, observação da
alteração da atividade de enzimas antioxidantes e teores de fenóis totais. No entanto, poucos
estudos relacionam a incidência da murcha bacteriana com trocas gasosas nas folhas, atividade
de enzimas antioxidativas e teores de fenóis totais em plantas de tomateiro enxertado e
inoculado com R. solanacearum.
7
4 OBJETIVOS
Avaliar a fixação da enxertia em função do método de enxertia
utilizado.
Avaliar a enxertia no controle da murcha bacteriana, através da
incidência da doença e trocas gasosas nas folhas das plantas de tomateiro.
Avaliar atividade das enzimas superoxido dismutase (SOD), catalase
(CAT), peroxidase (POD), fenilalanina amônia liase (PAL), teor de fenóis e polifenoloxidase
(PPO) como respostas bioquímicas aos estresses da enxertia e àquele relacionado à defesa
contra R. solanacearum em tomateiro.
Avaliar métodos de enxertia na produção do tomateiro sob ambiente
protegido.
8
5 REVISÃO DE LITERATURA
5.1 A cultura do tomateiro
A primeira descrição botânica do tomateiro foi feita por Píer Andréa
Mattioli, do jardim botânico de Pádua, Itália, onde publicou em seu herbário em 1554. O
tomateiro, cuja espécie é Solanum lycopersicum L. pertencente à família solonaceae, originou-
se da espécie andina e silvestre Lycopersicon esculentum var. cerasiforme (TAYLOR, 1986), a
qual produz frutos tipo cereja (FILGUEIRA, 2007). Tem como centro de origem a região
andina, desde o Equador, passando pela Colômbia, Peru, Bolívia, até o norte do Chile. Nesta
área, crescem espontaneamente diversas espécies do gênero Solanum (NUEZ, 2001).
Parece não haver dúvidas de que à sua domesticação ocorreu no
México (NUEZ, 2001). Na chegada dos espanhóis à América, o tomateiro já estava integrado
à cultura asteca e era conhecido como “tomatl”, originando o nome tomate. Esses primeiros
tempos os frutos eram muito pequenos e altamente perecíveis, apodrecendo em poucas horas
depois de colhidos. Os espanhóis levaram as sementes para o velho mundo e após rejeição em
que muitos consideravam o tomateiro uma planta tóxica, foi incorporado à culinária europeia,
retornando às Américas e hoje é um alimento cosmopolita (NUEZ, 2001).
Segundo Filgueira (2007), o tomateiro é uma planta herbácea com
caule flexível e incapaz de suportar a massa dos frutos e manter a posição vertical. A forma
9
natural lembra uma moita, com abundante ramificação lateral, sendo profundamente
modificada pela poda. Embora sendo uma planta perene, a cultura comporta-se como anual: da
semeadura até a produção de novas sementes, o ciclo biológico varia de quatro a sete meses,
incluindo-se um a três meses de colheita; em casa de vegetação, o ciclo pode prolongar-se
ainda mais. Primeiro ocorre a fase vegetativa, e em seguida esta fase ocorre junto com a
floração e frutificação. As folhas, pecioladas, são compostas por número ímpar de folíolos.
A planta de tomateiro apresenta dois hábitos de crescimento, os quais
são: determinado e indeterminado. A maioria das cultivares e híbridos de hábito determinado
são as consideradas para cultivo rasteiro, com finalidade agroindustrial, porém alguns híbridos
para mesa. As cultivares e híbridos de hábito indeterminado são as consideradas para cultivo
tutorado e com realização de podas, com finalidade para mesa, ou seja, consumo in natura
(FILGUEIRA, 2007).
A planta se desenvolve bem em ampla escala de latitudes, tipos de
solos, temperaturas e modos de cultivo, é também moderadamente tolerante a salinidade.
Prefere ambientes quentes, com boa iluminação e drenagem. A exposição prolongada a
temperaturas inferiores a 10oC e uma iluminação diurna inferior a 12 horas, afetam
desfavoravelmente a planta (ALVARENGA 2004b), podendo ocorrer encurtamento dos
entrenós, diminuição do porte da planta, inibição da formação de frutos e, consequentemente,
uma colheita tardia (FILGUEIRA, 2007).
A composição dos frutos de tomate varia de acordo com a cultivar,
nutrição, condições de cultivo e com as condições ambientais nas quais foi produzido. O fruto
fresco apresenta baixo poder calórico, baixo teor de matéria seca e é muito rico em sais
minerais e vitamina C (ALVARENGA, 2004b). O tomate é um alimento altamente nutritivo,
rico em licopeno, sadio, apresenta excelente palatabilidade e o seu baixo valor energético
torna-o recomendável àqueles em dieta, ou que precisam de um alimento de baixa digestão
(RAO, 2002; SHAMI & MOREIRA, 2004).
O tomateiro foi introduzido no Brasil por imigrantes europeus no fim
do século XIX (CANÇADO JÚNIOR et al., 2003) e o surgimento do tomate Santa Cruz no
Rio de Janeiro, por volta de 1940, que assinalou um importante marco na trajetória do
tomateiro no país (ALVARENGA, 2004c). Desde então, o seu cultivo consolidou-se,
10
tornando-se a hortaliça de fruto mais importante do Brasil, a ponto de ocupar o primeiro lugar
em valor e volume de produção (SCHMIDT, 2000; AGRIANUAL, 2012).
Os maiores produtores do Brasil são, Goiás com área de 17.860 ha e
produção de 1.384.181 toneladas (produtividade igual a 77,50 t ha-1
) sendo este mais voltado
para agroindústria, em seguida, São Paulo com área de 10.160 ha e 651.256 toneladas (64,1 t
ha-1
), Minas Gerais com 7.327 ha de área e 480.069 toneladas (65,52 t ha-1
) (AGRIANUAL,
2012). É importante ressaltar que em Goiás a maior parte do tomate produzido é para a
indústria.
5.2 Murcha Bacteriana (Ralstonia solanacearum)
Ralstonia solanacearum (Smith) (YABUUCHI et al., 1995), agente
causal da murcha bacteriana, é uma bactéria habitante do solo, aeróbica, em forma de
bastonetes Gram-negativos, com aproximadamente 0,5 x 1,5 μm, não formadora de esporos.
Isolados virulentos são essencialmente não flagelados e não móveis, enquanto os isolados
avirulentos têm alta mobilidade sendo providos de 1 a 4 flagelos. A bactéria é tolerante a sais e
cresce em temperatura entre 25 a 35°C, variando de acordo com os isolados (MEHAN et al.,
1994).
Tradicionalmente, a espécie tem sido agrupada em cinco raças e cinco
biovares, com base na gama de hospedeiros e nas propriedades bioquímicas, respectivamente
(FEGAN & PRIOR, 2005).
Em tomateiro, R. solanacearum raça 1, biovares 1 e 3, causa a murcha
bacteriana, a mesma que causa a doença em pimenteiro e outras solanáceas. Esta raça está
amplamente disseminada pelas principais áreas de produção no Brasil, principalmente nas
regiões norte, nordeste, centro-oeste e sudeste (MARQUES et al., 1994; MALAVOLTA JR. et
al., 2008).
A murcha bacteriana é uma das mais importantes e prejudiciais
doenças de plantas no Brasil e no mundo. Esta importância está relacionada ao grande número
de espécies afetadas, possuindo mais de 200 hospedeiros distribuídos em cerca de 50 famílias
botânicas, e as perdas econômicas difíceis de quantificar. É particularmente limitante em áreas
11
de clima úmido, com altitudes baixa a média, em regiões tropicais e subtropicais
(HAYWARD, 1991).
A epidemiologia da murcha bacteriana é considerada complexa, por
envolver a interação de vários fatores (BUDDENHAGEN & KELMAN, 1964).
R. solanacearum penetra por ferimentos nas raízes invade os espaços
intercelulares do córtex da raiz em menos de 4 horas e após 2 a 3 dias coloniza inteiramente
esses espaços e o parênquima vascular (SAILE et al., 1997), movimentando-se em direção à
parte superior da planta.
A presença do grande número de células bacterianas e a produção de
exopolissacarídio (EPS), considerado o principal fator de virulência deste patógeno, resulta na
redução do transporte de água e conseqüente murcha das folhas (HIKICHI et al., 2007)
progredindo para morte da planta, sem alteração na coloração, semelhantemente ao que ocorre
na deficiência hídrica. Após corte transversal do caule, observa-se o escurecimento do sistema
vascular. Quando o teste do copo é realizado, revela a exsudação do pus bacteriano (LOPES &
QUEZADO-SOARES, 1997).
Os fitopatógenos podem afetar a eficiência fotossintética de seus
hospedeiros de diversas maneiras (JOHNSON, 1987; SHTIENBERG, 1992). No caso da R.
solanacearum, sua presença inibe o transporte de água na planta, ocasionando déficit hídrico,
e segundo Souza et al. (2010), este estresse aumenta a resistência à difusão de vapor de água
planta-atmosfera, em razão do fechamento dos estômatos, reduzindo a transpiração e,
conseqüentemente, o seqüestro de CO2, o que limita o processo fotossintético.
O controle de R. solanacearum é extremamente difícil, principalmente
devido a ampla gama de hospedeiros, a alta variabilidade genética e à sobrevivência no solo
por longos períodos em grandes profundidades tornando o controle químico inviável e
antieconômico (LOPES et al., 1994; LOPES & REIFSCHNEIDER, 1999).
Estudos sobre hortaliças no Estado de São Paulo mostraram que a
principal demanda levantada por extensionistas, foi a necessidade de novos híbridos
resistentes a pragas e doenças como, por exemplo, à murcha bacteriana e que estes sejam mais
produtivos e adaptados às condições locais de cultivo. Acrescenta-se, ainda, a ineficiência do
controle químico da maioria das doenças bacterianas por agrotóxicos, além do seu alto custo e
12
riscos ao meio ambiente, produtores e trabalhadores rurais, bem como ao consumidor através
da contaminação do produto final (RIBEIRO & CRUZ, 2001).
5.3 Enxertia em hortaliças
Enxertar é unir duas porções de tecido vegetal vivo visando o
desenvolvimento de uma única planta. Seu sucesso é representado pela união morfológica e
fisiológica dessas duas partes. Para tal efeito, é fundamental que o câmbio do enxerto fique em
contato estreito com o câmbio do porta-enxerto (JANICK, 1966).
O início da enxertia em hortaliças ocorreu em melancia (Citrullus
lanatus) no Japão e na Korea, em 1920, com objetivo de controlar de forma preventiva, a
doença ocasionada por Fusarium oxysporum, utilizando porta-enxertos resistentes
(YAMAKAWA, 1982).
A partir de 1970, a enxertia em hortaliças tem sido muito valorizada,
desenvolvendo-se vários trabalhos objetivando o controle de patógenos de solo, modificação
da expressão sexual, compatibilidade, nutrição, desenvolvimento, produção e qualidade de
frutos (CAÑIZARES, 2001), como por exemplo, o controle de Ralstonia solanacearum,
Fusarium oxysporum, Pyrenochaeta lycopersici, Meloidogyne incognita, Verticillium dahliae
na cultura do tomateiro (ODA, 1995).
No Brasil, começou-se a utilizar enxertia em hortaliças a partir da
década de 80, por produtores de pepino da extinta Cooperativa Agrícola de Cotia (CAC-CC) e
tem sido adotada comercialmente nas culturas do pimenteiro, tomateiro e pepineiro. As
regiões sul e sudeste do Brasil são as que mais utilizam esta técnica.
Os primeiros estudos no Brasil foram na década de 90, com trabalhos
relacionados à resistência/tolerância a doenças e efeitos da enxertia na qualidade e
produtividade. Observou-se níveis de resistência entre diferentes porta-enxertos de tomateiro à
Verticillium dahliae (Kobori, 1994). Em 1999, este mesmo autor estudou a viabilidade do uso
de porta-enxertos de Capsicum annuum resistentes a Phytophthora capsici no controle da
murcha de fitóftora em pimenteiro. Santos (2001) confirmou a estabilidade de resistência
desses porta-enxertos e a capacidade produtiva das plantas enxertadas. Posteriormente ficou
13
comprovada a tolerância dos mesmos porta-enxertos a M. incognita, raça 2 ( SANTOS et al.,
2002).
Existem estudos relacionando a enxertia com a nutrição e fisiologia
das hortaliças, como por exemplo: resistência de meloeiro rendilhado a Didymella bryoniae,
em função da enxertia e concentrações de potássio (SILVA et al., 2012); acúmulo de
nutrientes e desempenho agronômico do pimenteiro (Capsicum annum L.), em função dos
métodos de enxertia (SILVA, 2012); ação conjunta de citocinina, giberelina e auxina em
pimenteiro enxertado e não enxertado sob cultivo protegido (PALANGANA et al., 2012).
Em ambiente protegido, os patógenos de solo têm se constituído um
desafio, devido à utilização intensa deste ambiente. Em razão do surgimento de raças
fisiológicas, estirpes ou grupos de diferentes patógenos, a obtenção de variedades resistentes
tem sido morosa. Com base nisso, a adoção da enxertia utilizando porta-enxertos resistentes,
porém, com boas características comerciais, constitui-se em alternativa de controle a curto
prazo (SANTOS et al., 2003).
A enxertia é mais interessante quando comparadas às outras formas de
controle isolado na tolerância à temperaturas adversas, à salinidade do solo, ao vigor, à
desordens fisiológicas das plantas e à produção de frutos de melhor qualidade (GOTO et al.,
2003).
A cultura do tomateiro é uma das mais estudadas com relação a técnica
da enxertia. Porém o foco dos estudos têm sido principalmente objetivando o controle de
doenças. Existem relatos de que na Amazônia, em pequenas culturas, a enxertia de tomateiro
em jurubeba é uma prática utilizada há muito tempo, para controle da murcha bacteriana
(SANTOS & GOTO, 2004).
Obteve-se resultados interessantes em solos infestados com R.
solanacearum com produção 800% maior em plantas da cultivar Santa Clara enxertadas no
porta enxerto acesso CNPH 1048, comparadas ao pé-franco (MENDONÇA et al., 2005).
Entretanto em solos com condições favoráveis à cultura do tomateiro, são menores as
diferenças de produção entre as plantas enxertadas e o pé-franco, segundo valores obtidos por
Lopes et al. (2003).
A resistência proporcionada pela enxertia está relacionada à melhoria
da fotossíntese e ao aumento da atividade de enzimas antioxidantes (HE et al., 2009). Em
14
estudo com tomateiro enxertado em um porta-enxerto tolerante a salinidade, foi observado que
as plantas enxertadas tiveram maior eficiência fotossíntética com relação à condutância
estomática (gs) e eficiência do uso da água (EUA), além de manterem maior atividade
fotoquímica do fotossistema II (PSII) e aumento das atividades das enzimas peroxidase e
catalase (HE et al., 2009). Porém, não foi observado influência da enxertia nas trocas gasosas
em um estudo com meloeiro rendilhado inoculado com Didymella bryoniae e comparado com
plantas não enxertadas (SILVA, 2010).
A enxertia é uma técnica muito utilizada em hortaliças no Brasil, além
de ser um dos segmentos que mais utiliza tecnolgias e aumenta rendimento nos viveiros
produtores de mudas de hortaliças. Em 2009, foram comercializadas nos principais viveiros de
hortaliças do estado de São Paulo, 2.347.670 mudas enxertadas de pimenteiro, 1.972.210 de
pepineiro, 776.010 de tomateiro 70.400 de berinjeleira, 3.400 de jiló, 7.500 de abobrinha Mini
(GOTO, 2010)1.
Com relação aos métodos de enxertia, alguns autores comentam que
não existe nenhum capaz de predizer o resultado de uma enxertia, entretanto, em linhas gerais,
se pode dizer que quanto maior a afinidade botânica entre as espécies, maior a probabilidade
de sobrevivência do enxerto (PEIL, 2003).
Existe uma variedade de métodos de enxertia para hortaliças. Os mais
utilizados são fenda garfagem, aproximação ou contato em bisel, encostia e perfuração. A
eleição do método de enxertia deve considerar, além da espécie, as vantagens e desvantagens
de cada um e relacioná-las com a realidade do produtor de mudas (PEIL, 2003).
5.4 Enzimas antioxidativas e os mecanismos de defesa da planta
Nas plantas sob estresse, seja por injúrias causadas por patógenos ou
hídrico, salino, osmótico, temperatura, luminosidade, efeito de herbicidas, ocorre a formação
de espécies reativas de oxigênio (ERO’s). Em folhas de tomateiro foi observado aumento da
1 GOTO, R. (Departamento de Produção Vegetal, Faculdade de Ciências Agronômicas, UNESP – Campus de
Botucatu, SP). Comunicação pessoal, 2010.
15
concentração de ERO’s, em função do aumento da concentração de R. solanacearum, medida
em unidade formadora de colônia (UFC) (FLORES-CRUZ & ALLEN, 2009).
Estas ERO’s, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), radical
superóxido (O-2
) e o radical hidroxila (OH-) são conhecidos por oxidar importantes
constituintes celulares, tais como ácidos nucléicos, fosfolipídeos de membrana (camada
bipolar) e proteínas, podendo levar as células à morte (SAROWAR et al., 2005).
O superóxido formado tem algumas transformações, na redução a
hidroxila (OH¯, radical que tem grande afinidade por moléculas biológicas em seu sítio de
produção) (SOARES & MACHADO, 2007), conversão a H2O e O2 pela ação da catalase e
conversão a H2O pela ação oxidação de substratos, como ascorbato, via peroxidases.
A consequência imediata da formação de ERO traduz-se em
alterações da permeabilidade seletiva e efluxo de íons (ALSCHER et al., 1997). Segundo os
mesmos autores, no complexo protéico, pode ocorrer mudança na estrutura conformacional.
No caso de enzimas, pode haver alterações no sítio ativo, influenciando a atividade e
consequentemente, outras alterações metabólicas, como aumento da síntese de proteases,
responsáveis pela degradação das proteínas.
Para combater os danos causados pelo estresse oxidativo, as plantas
desenvolveram um sistema de defesa, em que se destaca as variações nas atividades de
enzimas do sistema antioxidativo, que agem como eliminadores (YOSHIMURA et al., 2004)
das formas reativas de oxigênio (MURGIA et al., 2004). Esta defesa é de natureza química e
podem atuar entre outros, na síntese de metabólitos secundários tóxicos aos patógenos,
espécies reativas de oxigênio e ativação de genes que codificam PR-proteínas (proteínas que
se acumulam em resposta a um ataque de patógenos) (VAN LOON et al., 2006), tratamento
com indutores de resistência ou outro tipo de estresse (WHALEN, 2005).
Dentre as enzimas relacionadas ao estresse da patogênese se destacam
peroxidase, ß-1,3-glucanase, quitinase, fenilalanina amônia liase e polifenoloxidase
(CAVALCANTI et al., 2005) e relacionadas ao estresse causado pela enxertia, se destaca a
peroxidase e catalase (FERNÁNDEZ-GARCIÁ et al., 2004). Nas plantas em geral, como por
exemplo, em tomateiro, a POD é uma das enzimas envolvidas no último passo na lignificação
(NICHOLSON & HAMMERSCHMIDT, 1992), em resposta ocorrida logo depois do estresse
causado por ferimentos e ataque de patógenos. Em plantas de tomateiro, quando infectadas por
16
R. solanacearum, algumas enzimas apresentam alterações nas atividades, como as
peroxidases, quitinase, fenilalanina amônia liase e polifenoloxidase (SILVA et al., 2007).
A superóxido dismutase (SOD) (EC 1.15.1.1) é responsável pela
dismutação do O2- em H2O2, influenciando na concentração de O2
- e H2O2 na célula. Três tipos
distintos de isoenzimas SOD têm sido detectados em plantas, que são classificados de acordo
com seu metal cofator Fe, Mn e Cu/Zn (GRATÃO et al., 2005). Fe-SOD tem se mostrado
associada com os cloroplastos; Mn-SOD está localizada na mitocôndria e peroxissomos,
enquanto a Cu/Zn-SOD está localizada no citosol, cloroplastos e peroxissomos (GRATÃO et
al., 2005).
A SOD constitue a primeira linha de defesa contra ERO dentro de uma
célula (ALSCHER et al., 2002). Kawaradani et al. (1994) ao estudarem atividade de algumas
enzimas em plantas de berinjela contra patógenos de solo, observaram atividade elevada da
SOD nas plantas infectadas com R. solanacearum. Em plantas de tomateiro enxertadas e não
enxertadas submetidas a três temperaturas 10°C, 25°C e 35°C, Rivero et al. (2003) observaram
elevada atividade da SOD em função da temperatura 35°C, porém a enxertia não influenciou
na variação da atividade da enzima.
A catalase (CAT) (EC 1.11.1.6) é outra enzima importante do sistema
de defesa em plantas. Como resposta antioxidativa esta enzima decompõe o H2O2 gerado nos
peroxissomos durante a fotorrespiração, reduzindo-o à água, assim como o H2O2 gerado da
reação da SOD, ou seja, esta enzima funciona como canal de limpeza do H2O2 celular
(BREUSEGEM et al., 2001).
As peroxidases (POD) (EC 1.11.1.7) são enzimas que utilizam o H2O2
para oxidar um grande número de doadores de hidrogênio nos compostos fenólicos, os quais
participam de vários processos fisiológicos, como na síntese da lignina e na incompatibilidade
do enxerto com porta-enxerto (GASPAR et al., 1982) e defesa da planta a patógenos (VAN
LOON et al., 2006). Há relatos que durante a formação da lignina, a POD fornece H2O2
necessário para oxidação do ácido cinâmico e convertem o ácido ferúlico em diferúlico, o qual
age na ponte de hemicelulose unindo o ácido cinâmico às proteínas e aos carboidratos da
parede celular favorecendo a consolidação (GASPAR et al., 1982).
Existem relatos que POD e CAT têm suas atividades alteradas após a
enxertia, uma técnica agronômica que pode promover estresse em plantas (FERNÁNDEZ-
17
GARCIÁ et al., 2004). Em plantas de pimenteiro foi observado aumento da transcrição
(alteração da atividade) de POD após as plantas serem infectadas com Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria. Nestas plantas a atividade da POD atingiu um pico de atividade em
18 horas (h) após a infecção e em seguida, entre 24 e 30 h diminuiu, quando o acúmulo de
H2O2 foi máximo (DO et al., 2003).
Outra enzima relacionada com estresse de plantas atacadas por
microrgarnismos e que tem sua atividade alterada é a fenilalanina amônia liase (PAL) (EC
4.1.3.5), a principal enzima na via dos fenilpropanóides, que leva à conversão de fenilalanina
em ácido trans-cinâmico com a eliminação de amônia. PAL tem sido demonstrada na
atividade metabólica de muitas plantas superiores e considerada a enzima chave na síntese de
vários compostos secundários como fenóis e ligninas relacionados com a defesa (HEMM et
al., 2004). A presença de compostos fenólicos em plantas e sua síntese em resposta à infecção,
está associada com resistência a doenças. Isto tornou a enzima PAL uma das mais estudadas
no metabolismo secundário de plantas (WHETTEN & SEDEROFF, 1995).
A atividade da PAL pode ser alterada por fatores ambientais, tais como
baixos teores de nutrientes, luz e infecção por patógenos (ENGELBERTH, 2009). Em muitas
espécies vegetais, a regulação da atividade da PAL tornar-se mais complexa pela existência de
múltiplos genes que codificam essa enzima, alguns dos quais são expressos somente em
tecidos específicos ou sob certas condições ambientais (LOGEMANN et al., 1995)
Em cultivares de tomateiro resistentes à murcha bacteriana e
inoculadas com R. solanacearum foi observado aumento significativo da atividade das
enzimas PAL, PPO e do teor de fenóis totais (VANITHA, et al., 2009). Os mesmos autores
indicaram que as enzimas PAL e PPO foram envolvidas no desenvolvimento da resistência a
murcha bacteriana e podem ser usadas como marcadores bioquímicos a
resitência/suscetibilidade de tomaterio a R. solanacearum.
Os compostos fenólicos se originam do metabolismo secundário das
plantas, sendo essenciais para o seu crescimento e reprodução, além de atuarem como agente
antipatogênico e contribuírem na pigmentação (NACZK & SHAHIDI, 2004). Eles se formam
em condições de estresse como, infecções, ferimentos, radiação ultravioleta, dentre outros
(SHAHIDI & NACZK, 1995). Estes compostos fenólicos interagem com as EROs e são
consumidas durante a reação (ANGELO & JORGE, 2007).
18
Os compostos fenólicos são encontrados abundantemente em plantas e
são um grupo muito diversificado de fitoquímicos derivados da fenilalanina e tirosina
(SHAHIDI & NACZK, 1995). A fenilalanina é um produto da rota do ácido chiquímico, rota a
qual se localiza a enzima PAL (ENGELBERTH, 2009).
Outra enzima que também apresenta alteração na atividade é a
polifenoloxidase (PPO) (EC 1.14.18.1), uma classe conhecida como tirosinase, cresolase,
catecolase, difenolase e fenolase. São enzimas intracelulares que ocorrem em plantas, animais
e fungos (WHITAKER, 1994). Estas enzimas contêm cobre no centro ativo e catalisam dois
tipos de reações, ambas envolvendo oxigênio. A primeira reação corresponde a hidroxilação
de monofenóis formando orto-difenóis e a segunda, à oxidação de orto-difenóis formando
orto-quinonas (VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981).
PPO’s catalisam a oxidação de compostos fenólicos próximo ao local
da degradação celular provocada por patógenos. Um dos resultados mais estudados deste
fenômeno é o aparecimento de substâncias escuras provenientes da polimerização oxidativa
das quinonas (THIPYAPONG et al., 2007; VANITHA, et al., 2009). A PPO tem participação
na defesa da planta contra patógenos, porém existem poucos relatos do seu papel nesta defesa
(VANITHA, et al., 2009). Plantas transgênicas de tomate têm a sua resistência reforçada a
Pseudomonas syringae com expressão de PPO (LI & STEFFENS, 2002).
A detecção e quantificação de ERO’s em sistemas biológicos são
particularmente difíceis devido à rápida destruição e detoxificação (eliminação) desses
radicais (RESENDE et al., 2003). Além disso, segundo os mesmos autores, as ERO’s não
podem ser medidas diretamente por métodos espectrofotométricos ou CLAE (Cromatografia
liquida de alta eficiência), normalmente aplicados ao estudo de compostos de carbono. Por
isso, a maioria das técnicas de detecção de ERO’s baseia-se na oxidação ou redução de certos
compostos pelas próprias ERO’s. Isto pode ser evidenciado através da determinação da
atividade de enzimas antioxidantes. Por exemplo, na medição de H2O2, o mais comum é
utilizar a enzima peroxidase e um substrato oxidável (MOLLER, 2001).
A dificuldade de monitoramento das ERO’s em células vegetais deve-
se ao fato de que muitas são de vida curta e sujeitas aos mecanismos antioxidantes celulares
tais como compostos fenólicos, enzimas PAL, PPO, POD, SOD, CAT e ciclo do
ascorbato/glutationa (RESENDE et al., 2003).
19
5.5 Trocas gasosas em plantas
A produtividade das plantas é influenciada por características
morfológicas e fisiológicas da fonte (órgãos fotossintetizantes) e do dreno (órgãos
consumidores dos metabólitos fotossintetizados, carboidratos principalmente) (BRANDÃO
FILHO et al., 2003). Toda produção de fitomassa depende da atividade fotossintética da fonte,
porém a assimilação do CO2 é apenas um dos muitos fatores que influenciam o crescimento e
desenvolvimento vegetal (FOYER & GALTIER, 1996).
O estresse recebido pela planta pode afetar os processos fisiológicos e
consequentemente a atividade fotossintética da fonte, como por exemplo, a murcha causada
por R. Solanacearum, que afeta diretamente as folhas do tomateiro, a qual é importante fonte
para a planta. Isto pode interferir na produção da matéria seca e sua produtividade da cultura.
A fotossíntese é essencial para o metabolismo das plantas, que
ocasiona uma ligação entre processos internos das plantas e o ambiente externo (FONTES,
2008). A avaliação das trocas gasosas podem ajudar no estudo da capacidade fotossintética das
plantas, a qual tem sido muito utilizada, por ser um método não destrutivo que permite a
análise qualitativa e quantitativa da fotossíntese das plantas.
As trocas gasosas são medidadas pela taxa de assimilação líquida de
CO2, condutância estomática e taxa de transpiração. No Brasil, existem estudos em hortaliças
que relacionam trocas gasosas com enxertia, nutrição mineral, água enriquecida com CO2,
doenças e fungicidas de efeitos fisiológicos (BRANDÃO FILHO, et al., 2003; CAÑIZARES,
2004; SILVA, 2010; AMARO, 2011; MACEDO, 2012).
Em um trabalho relacionando a técnica da enxertia com trocas gasosas
em dois híbridos de berinjeleira, foi observado que a enxertia não afetou a capacidade
fotossintética dos mesmos, porém, as plantas enxertadas apresentaram menores valores de
condutância estomática e transpiração nos dois híbridos, ocasionando maior eficiência no uso
da água, efeito este que na prática pode resultar em menor demanda de água pelas plantas
(BRANDÃO FILHO, et al., 2003).
20
Cañizares et al. (2004) estudaram o crescimento e índices de troca
gasosa em plantas de pepino irrigadas com água enriquecida com CO2 e observaram que a
produção pode ser influenciada pelo enriquecimento da água com CO2. Amaro (2011) e
Macedo (2012) estudaram fungicidas com efeitos fisiológicos em pepino “japonês” e meloeiro
rendilhado e baseado em dados de trocas gasosas e produção concluíram que os fungicidas
testados apresentam efeitos fisiológicos positivos.
Em estudo com doses de potássio e a doença crestamento gomoso do
caule em meloeiro rendilhado, enxertado e pé-franco, Silva (2010) observou que as doses de
potássio influenciaram de forma positiva na condutância estomática e transpiração das plantas.
No entanto, não foi encontrado estudo relacionando murcha bacteriana e trocas gasosas em
tomateiro.
A capacidade fotossintética das plantas é influenciada por vários
fatores: genética, condições climáticas (luz, umidade relativa do ar, temperatura), morfologia
vegetal, condições nutricionais, disponibilidade de água, concentração de CO2 no ambiente.
Esta capacidade fotossintética depende das trocas gasosas, as quais também são influenciadas
por estes fatores.
21
6 MATERIAL E MÉTODOS
6.1 EXPERIMENTO 1: Avaliação do estresse causado pela enxertia em tomateiro
através da variação da atividade enzimática e teor de fenóis
6.1.1 Produção de mudas e condução do experimento
O experimento foi conduzido entre outubro e dezembro de 2010. As
semeaduras do porta-enxerto ‘Guardião’® (Takii do Brasil) e híbrido Pizzadoro
® (Nunhems)
para enxertia foram feitas 30 dias antes da enxertia e o híbrido Pizzadoro® pé-franco 15 dias,
na Fazenda Experimental São Manuel da FCA/UNESP – Botucatu – SP. Foi utilizado
substrato comercial Tropstrato® HT Hortaliças para a semeadura e desenvolvimento das
mudas nas bandejas.
O hibrido Guardião® é considerado resistente a Murcha bacteriana
(Ralstonia solanacearum); Verticillium (Verticillium dahliae); Fusarium raças 1 e 2
(Fusarium oxysporum f. SP. lycopersici 1 & 2); Fusarium (Fusarium oxysporum f. SP radicis-
lycopersici); Vírus do Mosaico do Tomate (ToMV) (Tomato Mosaic Virus, Tm-2a.);
Nematóides Meloidogyne arenaria (Ma); Meloidogyne javanica (Mj); Meloidogyne incógnita
(Mi) (TAKII, 2013). O ‘Guardião’® é compatível com híbridos que apresentam resistência ao
22
Tomato Mosaic Virus - estirpe 2. Em épocas de temperaturas mais baixas, a empresa
produtora recomenda semear entre 2 a 3 dias antes do cavaleiro (enxerto).
O híbrido Pizzadoro® é um tomate para mercado fresco do tipo
Saladete (Italiano) com hábito de crescimento indeterminado. Apresenta elevada resistência a
Murcha de verticílio (Va e Vd), Murcha de fusário (Fol:0,1), Pinta bacteriana (Pst), Vírus do
Mosaico do Tomate (ToMV) e resistência intermediária aos nematóides (Ma, Mi, Mj)
(NUNHEMS, 2013).
As enxertias foram feitas no Departamento de Horticultura da
FCA/UNESP-Botucatu – SP, de acordo com Goto et al. (2003), utilizando-se três métodos de
enxertia (Contato em bisel, Fenda garfagem, Encostia). Os cortes foram realizados com
auxilio de lâminas, acima das folhas cotiledonares do porta-enxerto para os métodos Contato
em bisel e Fenda garfagem, e acima da primeira folha definitiva para método da Encostia. No
enxerto deixou-se três folhas definitivas.
Os enxertos foram fixados pelo clipe de enxertia recomendado para o
tomateiro e tutoradas com um palito de bambu colocado na célula da muda enxertada,
passando através do grampo de enxertia para melhor fixar a planta.
Após o processo da enxertia, as mudas enxertadas foram recolocadas
em bandejas e juntamente com as mudas pé-franco (testemunha) foram rapidamente
acondicionadas em câmara úmida e cobertas por tela de sombreamento de 75% (Figura 1).
Houve o cuidado de manter câmara de enxertia com umidade relativa sempre próxima a 100%
e temperatura entre 26 e 29ºC, fazendo a troca de ar, ou seja, abertura da câmara duas a três
vezes por dia, quando a temperatura estava muito elevada. Foi feito também o molhamento
dos jornais que forraram a base da câmara, para suprir a necessidade de água e umidade das
plantas.
Para evitar estresse das plantas pertencentes às coletas posteriores foi
feita uma câmara úmida de enxertia para cada coleta no experimento 1 (Figura 1).
23
Figura 1. Câmara úmida de enxertia. UNESP/FCA, Botucatu, SP. Foto: Edvar Silva, 2010.
6.1.2 Delineamento do experimento 1 e avaliação da cicatrização das mudas
enxertadas
Foi utilizado delineamento inteiramente casualizado em esquema
fatorial 4 x 5. Os 20 tratamentos resultaram das plantas enxertadas através dos métodos
Contato em bisel, Fenda garfagem, Encostia e enxerto pé-franco (testemunha) com cinco
épocas de coletas das plantas (0, 3, 6, 9 e 12 dias após a enxertia) para análise enzimática.
Foram utilizadas quatro plantas por repetição.
Foi avaliada a porcentagem de cicatrização baseado na quantidade
total de plantas enxertadas e quantidade de plantas que obtiveram a cicatrização da região de
enxertia e que estavam aptas para transplante.
24
6.1.3 Coletas das plantas para análises bioquímicas dos experimentos 1 e 2
As plantas ao serem coletadas, para análise da atividade enzimática,
foram lavadas em água, secas com papel para retirada do excesso de umidade, envoltas em
papel alumínio, etiquetadas e congeladas em nitrogênio líquido. Em seguida foram levadas em
caixas térmicas para o laboratório de Analises Bioquímicas, pertencente ao Departamento de
Química e Bioquímica, do Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu. As
amostras foram acondicionadas em freezer -80 oC, para posterior determinação da atividade
das enzimas e teor de fenóis totais.
6.1.4 Determinação da atividade enzimática e teor de fenóis totais dos experimentos
1 e 2
As atividades enzimáticas e teor de fenóis foram determinadas entre os
anos de 2011 e 2012. Estas determinações foram feitas em espectrofotômetro. No experimento
1, as amostras foram os caules das mudas e no experimento 2, as amostras das plantas
enxertadas também foram os caules, porém em três partes nas plantas enxertadas, acima,
abaixo e no local da enxertia.
6.1.5 Superóxido dismutase (SOD)
A atividade da SOD (EC 1.15.1.1) (Beauchamp & Fridovich, 1973) foi
avaliada pela capacidade da enzima em inibir a fotorredução do azul de nitrotetrazólio (NBT)
em um meio de reação composto por metionina 5 mmol L-1
, EDTA 0,66 mmol L-1
, NBT 33
µmol L-1
e riboflavina 0,00165 mmol L-1
, em 3,0 mL de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,8).
A produção de formazana azul, resultante da fotorredução do NBT foi determinada pela
absorção a 560 nm. Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima
necessária para a inibição de 50% da fotorredução do NBT. A atividade enzimática foi
expressa em U g-1
de proteína.
25
6.1.6 Catalase (CAT) e polifenoloxidase (PPO)
A atividade da CAT (EC 1.11.1.6) foi determinada por adaptação do
método de Kar & Mishra (1976), o ensaio foi composto de 150 μL de amostra, que foi extraída
em tampão fosfato de potássio + EDTA + DTT + PVPP 100 mmol L-1
pH 7,5. Utilizou – se
1950 μL de tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1
(pH 7,5) como tampão de determinação
e 750 μL solução de peróxido de hidrogênio 50 mM como substrato enzimático. As leituras
foram feitas a 240 nm. A atividade enzimática foi expressa em μmol H2O2 min-1
mg-1
de
proteína.
A atividade da PPO (EC 1.14.18.1) também foi determinada pelo
método adaptado de Kar & Mishra (1976), pela mensuração da conversão do catecol em
quinona. O substrato utilizado foi composto por catecol 0,1 M em tampão acetato de sódio
(pH 5,0). Para a reação, que ocorreu a 30 ºC por 30 minutos foi utilizado 0,3 mL da amostra +
1,85 mL de catecol 0,1 M. As leituras foram feitas após a adição de 0,8 mL de ácido
perclórico, a 395 nm. A atividade enzimática foi obtida em µmol catecol oxidado min-1
µg-1
de
proteína.
6.1.7 Peroxidase (POD)
A atividade da POD (EC 1.11.1.7) foi estimada pelo método de Lima
et al. (1999). O ensaio foi realizado em 5,0 mL de tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0). O
substrato utilizado foi composto por 0,5 mL de 30% peróxido de hidrogênio em tampão
fosfato de potássio 0,2 M (pH 6,7) e 0,5 mL de solução de fenol e aminoantipirina. A reação
iniciou-se pela adição do extrato bruto e após cinco minutos, adicionou-se 2 mL de álcool
etílico absoluto. A atividade enzimática foi realizada em 505 nm e expressa em µmol H2O2
decomposto min-1
mg-1
de proteína.
6.1.8 Fenilalanina amônia liase (PAL)
A atividade da PAL (EC 4.3.1.5) foi determinada somente no segundo
experimento, pois segundo a literatura esta enzima tem grande relação com estresse causado
por doenças. Utilizou-se o método adaptado de Peixoto et al., 1999. Foi misturado 200 mg de
26
amostra com 10 mL de 0,1 M de tampão de borato (pH 8,8) contendo 1,2 mL de β
mercaptoetanol, 50g (5%) de polivinilpolipirrolidona (PVPP). Esta mistura foi centrifugado
por 20 minutos à 4oC (12.500 x g) e depois filtrado em lã de vidro, gerando o extrato. A reação
foi iniciada pela adição 1mL do extrato + 1mL de tampão borato 0,2M (pH 8,8) e 1 mL de
fenilalanina após 5 minutos de banho-maria. Na amostra controle, o extrato foi substituído por
1 mL tampão borato 0,1M. A reação foi finalizada pela adição de 0,1mL (100L) de HCl 6N.
A leitura foi feita a 290 nm. Um coeficiente de extinção de 104 mM
-1 cm
-1 foi utilizada para
calcular a atividade de PAL, que foi expressa como μmols min-1
mg-1
de proteína.
6.1.9 Fenóis totais
A análise de fenóis totais foi realizada de acordo com o método
espectrofotométrico, usando o reativo de Folin-Ciocalteu (SINGLETON & ROSSI JR., 1965).
As amostras do material fresco e moídas foram pesadas e colocadas em tubos de centrífuga,
que continham acetona a 50% em água. As amostras foram incubadas em banho de ultra-som
durante 20 minutos e depois centrifugada a 6000 × g (Hettich Zentrifugen, Mikro220R),
durante 10 minutos. Os sobrenadantes foram re-extraídos e combinados. Foi adicionado o
reagente de Folin-Ciocalteau e após 3 minuots a 25ºC, uma solução saturada de Na2CO3 foi
adicionada, e a mistura de reação foi incubada durante 1 h. A absorbância foi medida a 760
nm (Pharmacia Biotech, Ultrospec 2000) e os resultados foram expressos em fenóis mg g-1
de
massa fresca (MF) em equivalentes de ácido gálico.
6.2 EXPERIMENTO 2: Incidência da murcha bacteriana do tomateiro, trocas
gasosas, atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de
tomateiro enxertadas e inoculadas com R. solanacearum
O experimento foi conduzido entre outubro e dezembro de 2011, em
casa de vegetação do Departamento de Horticultura da FCA/UNESP – Botucatu – SP (Figura
2), com temperatura ajustada para não ultrapassar 30oC e manutenção da umidade em torno de
70%. A produção das mudas foi com porta-enxerto ‘Guardião’® (Takii do Brasil) e híbrido
27
Pizzadoro® (Nunhems), como já descrito no item 6.1.1 e o método de enxertia utilizado foi o
Contato em bisel.
Figura 2. Vista geral do segundo experimento. UNESP/FCA, Botucatu, 2011. Foto: Edvar
Silva.
6.2.1 Delineamento experimental
O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado com dez
repetições para a avaliação da incidência da murcha bacteriana, cinco repetições para
avaliação das trocas gasosas e quatro repetições para avaliação das atividades enzimáticas e
teor de fenóis. Foram utilizadas três plantas por repetição.
Para avaliação da incidência da murcha bacteriana e trocas gasosas, os
tratamentos foram: 1) plantas enxertadas inoculadas com R. solanacearum; 2) enxerto pé-
franco inoculado com R. solanacearum; 3) porta-enxerto pé-franco inoculado com R.
solanacearum e 4) enxerto pé-franco não-inoculado (Testemunha).
Para avaliação das atividades enzimáticas e teor de fenóis foram
acrescentados aos tratamentos acima, porta-enxerto e planta enxertada, ambos não-inoculado.
28
Além disso, as plantas enxertadas inoculadas e não inoculadas foram divididas em três
amostras diferentes (Tabela 1). Os 60 tratamentos em esquema fatorial, foram resultantes do
local da planta e dias após a inoculação (DAI), ou seja, as épocas de coleta das amostras
(Tabela 1).
Tabela 1. Arranjo dos tratamentos para avaliação das atividades enzimáticas e teor de fenóis.
UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011.
Fator 1: Local da amostra
Fator 2: Dias após a inoculação (DAI)
Épocas de coletas das amostras
Acima enxertia inoculado
0
2
4
6
8
15
Local enxertia inoculado
Abaixo enxertia inoculado
Enxerto PF# inoculado
Porta-enxerto PF# inoculado
Enxerto PF# não-inoculado
Porta-enxerto PF# não-inoculado
Acima enxertia não-inoculado
Local enxertia não-inoculado
Abaixo enxertia não-inoculado # PF = Pé-franco
6.2.2 Transplante das plantas
As plantas foram transplantadas em vasos de 4 L com substrato
constituído de solo (67%), composto orgânico (22%), substrato comercial (11%), previamente
autoclavado e enriquecido com 0,95 g de termofosfato + 0,85 g de superfosfato simples e 0,20
g de cloreto de potássio, por litro de substrato, visando a nutrição das plantas.
6.2.3 Preparo do inóculo de R. solanacearum
Para o preparo do inóculo, foi utilizado o isolado TOM-3145 de
Ralstonia solanacearum, proveniente da coleção de fitobactérias do Laboratório de
Bacteriologia Vegetal, FCA/UNESP, oriundo da empresa Sakata Sudamérica Ltda. O mesmo
foi cultivado em meio de Tetrazolium (peptona – 10,0g, glicose – 5,0g, caseína hidrolisada –
1,0g, solução de tetrazolium a 1% - 5,0mL, ágar – 15,0g, água destilada- q.s.p. 1000 mL, pH
29
7,0) durante 48 horas em estufa a 27 ºC. As colônias de bactérias patogênicas (brancas) foram
selecionadas e repicadas para NSA (peptona – 5,0g, extrato de carne – 3,0g, sacarose – 5,0g,
ágar – 15,0g, água destilada- q.s.p. 1000 mL) nas mesmas condições anteriores, para a
obtenção do inóculo.
6.2.4 Inoculação das plantas
Para a inoculação, foi preparada uma suspensão bacteriana em água
destilada que foi ajustada por colorimetria (A540nm = 0,1) à concentração de 108 UFC.mL
-1
(WILLIAMSON et al., 2002). A inoculação foi feita pela adição de 5 mL da suspensão de
inóculo no solo, ao redor do colo de cada planta, cujas raízes foram previamente feridas pela
introdução de um bisturi esterilizado (DEMOSTHENES & BENTES, 2011).
6.2.5 Avaliação da incidência da murcha bacteriana
As avaliações da incidência da doença sobre as plantas de tomateiro
enxertadas e pé-franco foram feitas aos 0, 5, 10, 15 dias após a inoculação com R.
solanacearum, com base na porcentagem de folhas murchas (número de folhas murchas x 100
/ número total de folhas da planta) e peso da massa fresca e seca das plantas de cada
tratamento (SILVA et. al., 2007).
6.2.6 Medidas de trocas gasosas nas plantas
As medidas foram realizadas sempre das 8:00 às 11:00 horas da manhã
utilizando o medidor portátil de fotossíntese, com sistema aberto e analisador de CO2 por
radiação infravermelha (“Infra Red Gas Analyser – IRGA”, modelo LI-6400 da LI-COR). Os
parâmetros mensurados foram: taxa de assimilação líquida de CO2 nas folhas (A) em μmol m-2
s-1
; condutância estomática (gs) em mol m-2
s-1
e taxa de transpiração nas folhas (E) em mmol
m-2
s-1
.
30
6.2.7 Coletas das plantas do experimento 2
No experimento 2 as plantas foram coletadas aos 0, 2, 4, 6, 8 e 15 dias
após a inoculação com R. solanacearum, em plantas conduzidas em casa de vegetação, devido
não haver estudos sobre épocas definidas para essas coletas. Foram amostradas três plantas por
tratamento, em cada bloco.
O procedimento das coletas das plantas para análise da atividade
enzimática e teores de fenóis foram de acordo com a descrição no item 6.1.3 e a determinação
da atividade enzimática e teor de fenóis como descrito nos itens 6.1.5.; 6.1.6; 6.1.7.; 6.1.8;
6.1.9.; 6.1.10.
6.3 EXPERIMENTO 3: Avaliação da produção do tomateiro em função de três
métodos de enxertia e pé-franco
6.3.1 Preparo da área e produção das mudas
Na preparação do solo, entre março e maio de 2012 fez-se o plantio de
Crotalaria juncea L. visando controle preventivo de nematoides e utilização como adubação
verde.
A adubação de plantio foi realizada a base de composto orgânico (4 kg
m-2
). A nutrição mineral após o plantio foi feita via fertirrigação, a base de nitrato de amônio,
fosfato monoamônico (MAP), nitrato de potássio, sulfato de magnésio e calcio e boro via
foliar, de acordo com a análise de solo (Tabela 2).
31
Tabela 2. Análise química do solo e teores de macro e micronutrientes. FEPP/FCA/UNESP,
2011.
Profundidade pH M.O. Presina Al3+
H+Al K Ca Mg SB CTC V%
(cm)
CaCl2 g/dm
3 mg/dm
3
_ _ _ _ _ _ mmolc/dm
3 _ _ _ _ _ _ _ _
0-20 6,7 9 125 0 10 2,6 64 6 72 82 88
20-40 6,6 7 83 0 10 1,7 32 3 36 46 78
BORO COBRE FERRO MANGANÊS ZINCO
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _
mg/dm3 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
0-20 0,37 4,1 18 4,5 0,5
20-40 0,33 2,1 21 16,0 6,9
A produção das mudas foi de acordo com item 6.1.1.
6.3.2 Condução do experimento
O experimento foi conduzido entre junho e novembro de 2011, sob
ambiente protegido, estrutura tipo arco, de 7 x 25 m coberto por filme de polietileno de baixa
densidade (PEBD) transparente de 100 µm de espessura, com 3,5 m de pé direito, em área da
Fazenda Experimental de Ensino, Pesquisa e Produção (FEPP), no município de São Manuel,
SP, pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA) da Universidade Estadual
Paulista (UNESP) de Botucatu, nas coordenadas geográficas aproximadas de 22o44’ latitude
sul e 48o34’de longitude oeste, com altitude em torno de 750 m. O clima local é do tipo
mesotérmico, subtropical úmido (Cfa) e a precipitação média anual é de 1.445 mm, sendo a
temperatura média anual de 21oC, com a temperatura do mês mais quente 23,8
o C e do mês
mais frio 17,5oC.
As mudas foram transplantadas em espaçamento 1,0 x 0,4 m. Foram
conduzidas com uma haste, eliminando os brotos excedentes quando necessário (Figura 3). Foi
realizado também manejo fitossanitário de acordo com a necessidade da cultura. O ciclo da
cultura do tomateiro neste trabalho durou aproximadamente 190 dias, desde a semeadura até a
última colheita.
32
Figura 3. Vista do experimento 3. UNESP/FCA/FEPP, São Manuel, SP, 2011. Foto: Edvar
Silva.
6.3.3 Delineamento experimental
Foi utilizado delineamento em blocos casualizados, com quatro
tratamentos e quatro repetições. Utilizaram-se quatro plantas por parcela. Os tratamentos
foram três métodos de enxertia: Contato em bisel, Fenda garfagem e Encostia e mais as
plantas pé-franco (testemunha).
6.3.4 Avaliação das características quantitativas da produção
As características de produção avaliadas foram: diâmetro equatorial
(mm), para classificação dos frutos em classe, de acordo com o programa brasileiro para
modernização da horticultura (CQH/CEAGESP, 2003); produtividade comercial em frutos m-2
e quilogramas (kg) m-2
; produtividade não comercial em kg m-2
.
33
6.3.5 Avaliação das características qualitativas da produção
Foram avaliadas teor de ácido ascórbico (vitamina C), licopeno, β-
caroteno, acidez titulável (AT), sólidos solúveis (SS), relação sólidos solúveis/acidez titulável
(“Ratio”), potencial hidrogeniônico (pH) e firmeza dos frutos.
6.3.6 Vitamina C
O teor de vitamina C foi determinado pelo teor de ácido ascórbico, no
qual 20 g de polpa foram homogeneizadas com 20 mL de ácido oxálico a 1% e tituladas com
solução de 2,6-diclorofenol-indofenol (CARVALHO et al., 1990) e os resultados expressos
em mg de ácido ascórbico por 100 g de polpa.
6.3.7 Licopeno e β-caroteno
Para determinar o licopeno e o β-caroteno, foi utilizada a metodologia
de Nagata & Yamashita (1992), em que a extração e reação foram feitas no escuro. A amostra
do fruto de tomateiro foi macerada em nitrogênio líquido, em seguida pesou-se 1 g da amostra
em um tubo falcon de 50 mL e adicionou-se a solução extratora a base de acetona absoluta (4
mL) e hexano absoluto (6 mL) e homogeneizou no “Turrax”. Depois de homogeneizado o
extrato apresentou duas fases distintas e foi recolhido 4 mL da primeira fase e colocado em
uma cubeta de vidro para fazer a leitura em espectrofotômetro em 663 nm (clorofila a), 645
nm (clorofila b), 505 nm (licopeno), 453 nm (β-caroteno).
Clorofila a (mg/100 mL): 0,999 A663 – 0,0989 A645
Clorofila b (mg/100 mL): 0,328 A663 – 1,77 A645
Licopeno (mg/100 mL): - 0,0458 A663 + 0,204 A645 + 0,372 A505 –
0,0806 A453
β-Caroteno (mg/100 mL): 0,216 A663 – 1,22 A645 – 0,304 A505 + 0,452
A453
34
6.3.8 Firmeza
A textura foi medida nos frutos inteiros utilizando-se texturomêtro
Stevens LFRA Texture Analyser, com ponta de prova A 9/1000. A velocidade de penetração
foi de 2,0 mm/seg a uma profundidade de 5mm. Através destes dados foi determinada a
firmeza dos frutos e expressa em Newtons (N).
6.3.9 Acidez titulável (AT)
A acidez titulável (AT) foi determinada de acordo com metodologia
recomendada pelo Instituto Adolfo Lutz (2005), utilizando-se 2 gramas de polpa
homogeneizada e diluída em 100 mL de água destilada. Em seguida foi feita a titulação com
solução padronizada de NaOH 0,1N, usando como indicador o ponto de viragem da
fenolftaleína. Os resultados foram expressos em g de ácido málico 100g-1
da amostra.
6.3.10 pH
O pH foi determinado na polpa, utilizando medidor de pH digital
(AOAC, 1992).
6.3.11 Sólidos solúveis (SS)
Determinou-se o conteúdo de sólidos solúveis (SS) por leitura em
refratômetro digital, modelo PR - 100 Schmidt (Haensch Co., LTD. Japão) com compensação
automática de temperatura. Os conteúdos de SS foram expressos em ºBrix (AOAC, 1992).
6.3.12 Relação SS/AT (“Ratio”)
Para avaliar o equilíbrio doce-ácido do fruto durante o
amadurecimento, foi calculada a relação entre sólidos solúveis e a acidez titulável (SS/AT =
“Ratio”). Os resultados foram expressos em número puro, com duas casas decimais.
35
6.3.13 Análise estatística dos experimentos 1, 2 e 3
A análise estatística dos experimentos foi realizada por meio da análise
de variância (teste F) a 5% de probabilidade (Tabela 3). O teste de Tukey a 5% de
probabilidade foi utilizado para comparar as médias (Tabela 3).
36
Tabela 3. Esquema da análise de variância dos experimentos.
Causa de variação
EXP 1 GL
C. de variação
EXP 2.1 GL
C. de variação
EXP 2.2 GL
C. de variação
EXP 2.3 GL
C. de variação
EXP 3 GL
Métodos enxertia (F1) 3 Tratamentos 3 Tratamentos 3 Local da planta (F1) 9 Blocos 3
Dias após enxertia (F2) 4 Resíduo 36 Resíduo 16 Dias após inoculação (F2) 5 Tratamentos 3
Interação F1xF2 12 Total 39 Total 19 Interação F1xF2 45 Resíduo 9
Tratamentos 19
Tratamentos 59 Total 15
Resíduo 60
Resíduo 180
Total 79 Total 239 EXP 1 e EXP 3: Experimentos 1 e 3.
EXP 2; EXP 2.1 e EXP 2.2: Incidência da murcha bacteriana; trocas gasosas; atividade das enzimas e teor de fenóis no segundo experimento.
GL: Grau de liberdade
37
7 RESULTADOS E DISCUSSÃO
7.1 EXPERIMENTO 1: Avaliação do estresse causado pela enxertia em tomateiro
através da variação da atividade enzimática e teor de fenóis
7.1.1 Cicatrização do local da enxertia das mudas em função do método de enxertia
O método de enxertia Fenda garfagem apresentou maior porcentagem
de cicatrização no local da enxertia (95,8%). Porém o método Encostia obteve menor
porcentagem de cicatrização (78,5%). O método Contato em bisel obteve porcentagem de
cicatrização do local de enxertia de 89,6% (Figura 4).
O método Fenda garfagem é bastante utilizado em culturas da família
botânica solanácea, como por exemplo, tomateiro e pimenteiro. Os viveiristas e alguns
produtores têm adotado principalmente o método Contato em bisel, o qual facilita
principalmente a rapidez na realização da enxertia. Já o método de Encostia é raramente
utilizado em solanáceas, o qual não seria recomendado para o tomateiro de acordo com os
resultados deste estudo, pois apresentou a menor porcentagem de cicatrização no local de
enxertia (Figura 4).
38
Figura 4. Porcentagem de cicatrização do local da enxertia em função dos métodos de
enxertia em tomateiro. UNESP-FCA, 2010.
7.1.2 Atividade das enzimas SOD, CAT, POD, teor de Fenóis e PPO em função dos
métodos de enxertia e do dia após a enxertia
Houve interação do método de enxertia com o dia após a enxertia
(DAE) na atividade das enzimas SOD, POD, teor de fenóis e PPO (Tabelas 4, 6, 7 e 8). Por
outro lado, não ocorreu interação do método e do dia após enxertia na atividade da enzima
CAT, porém a atividade dessa enzima variou em função do dia após a enxertia (Tabela 5).
A maior atividade da SOD observada (1,22 U g-1
proteína) ocorreu nos
métodos de enxertia Contato em bisel e Fenda garfagem no terceiro DAE (Tabela 4). Esta
maior atividade pode ter sido em função do aumento do radical superóxido (O-2
) que
provavelmente deve ter sido formado em resposta ao estresse causado pelo corte e cicatrização
do local da enxertia. A SOD é responsável pela a dismutação do O2- em H2O2 (GRATÃO et
al., 2005).
Após o pico da atividade observado no terceiro dia, notou-se uma
tendência de diminuição até os 12 DAE, época em que as plantas já podem ir para o
transplante. A menor atividade da SOD (1,16 U g-1
proteína) ocorreu em função da interação
entre os métodos de enxertia e aos 9 DAE (Tabela 4).
39
Tabela 4. Atividade da enzima SOD (U g-1
proteína) em função do método de enxertia e do
dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010.
Dias após a enxertia (DAE)
Métodos enxertia 0 3 6 9 12
Contato em bisel 1,20 aB 1,22 aA 1,19 aB 1,16 aC 1,18 aB
Fenda garfagem 1,20 aB 1,22 aA 1,17 bC 1,16 aC 1,18 aBC
Encostia 1,20 aA 1,17 bB 1,17 bB 1,16 aB 1,18 aB
Enxerto pé-franco 1,19 aA 1,16 bBC 1,17 abBC 1,16 aC 1,18 aAB
CV = 0,87 % F = 7,90*
* Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Como não ocorreu interação entre os fatores métodos de enxertia e
dias após a enxertia para a atividade da enzima CAT, os resultados desta enzima foram
apresentados por fator (Tabela 5) e não com interação como as demais.
Não houve diferença na atividade da CAT entre os métodos de
enxertia (Tabela 5), porém o DAE influenciou sobre a atividade da enzima. A maior atividade
da CAT foi obtida aos 12 DAE, mas esta atividade não diferiu estatisticamente da ocorrida no
dia da enxertia (Tabela 5). Esta maior atividade é possivelmente devido ao aumento de
espécies radicalares, como H2O2, gerado em resposta a enxertia, ou ainda, pelo H2O2
resultante da reação da SOD.
40
Tabela 5. Atividade da enzima CAT (μmol H2O2 min-1
mg-1
proteína) em função do método de
enxertia em tomateiro. UNESP-FCA, 2010.
Fatores Médias
Métodos enxertia CAT1
Contato em bisel 2,0 x 10-09
a
Fenda garfagem 1,8 x 10-09
a
Encostia 1,8 x 10-09
a
Enxerto pé-franco 2,0 x 10-09
a
Dias após a enxertia (DAE)
0 2,2 x 10-09
a
3 1,8 x 10-09
b
6 1,6 x 10-09
b
9 1,6 x 10-09
b
12 2,3 x 10-09
a
CV (%) = 13,97 F = 7,59* 1 Dados originais transformados em 1/√X
* Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Os dias após a enxertia influenciaram a atividade da POD ocorrida nos
métodos Contato em bisel e Fenda garfagem (Tabela 6). Esta atividade diminuiu aos 3 DAE,
quando então, ocorre aumento gradativo da atividade da peroxidase (Tabela 6). Este efeito
pode ser atribuído ao enxerto ser totalmente desligado do sistema radicular (Figura 5) e no
método Encostia, procedimento o qual é popularmente conhecido como desmame, este
desligamento só foi realizado aos 12 DAE (Figura 6), e não foi observado diferenças entre as
atividades enzimáticas.
A maior atividade da POD (0,15 μmol H2O2 min-1
mg-1
proteína) foi
observada na combinação Contato em bisel, Fenda garfagem, aos 12 DAE (Tabela 6).
Entretanto, ao se comparar os valores obtidos nesses tratamentos com os demais (Encostia e
Enxerto pé-franco), não foi observado diferença estatística neste dia (Tabela 6).
41
Tabela 6. Atividade da enzima POD (μmol H2O2 decomposto min-1
mg-1
proteína) em função
do método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010.
Dias após a enxertia (DAE)
Métodos enxertia 0 3 6 9 12
Contato em bisel 0,13 aAB 0,11 bB 0,13 aAB 0,14 aA 0,15 aA
Fenda garfagem 0,13 aAB 0,11 bC 0,12 aBC 0,14 aAB 0,15 aA
Encostia 0,14 aA 0,13 aA 0,13 aA 0,12 aA 0,14 aA
Enxerto pé-franco 0,14 aA 0,14 aA 0,13 aA 0,12 aA 0,14 aA
CV = 7,74 % F = 3,03*
* Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Figura 5. Planta de tomateiro enxertada
pelo método Fenda garfagem. Foto: Edvar
Silva, 2010.
Figura 6. Planta de tomateiro enxertada
pelo método Encostia. Foto: Edvar Silva,
2010.
42
A maior produção de fenóis (0,70 mg g-1
massa fresca) ocorreu nos
tratamentos Contato em bisel e Fenda gafargem, ambos em interação com o nono DAE e nos
tratamentos Fenda garfagem e Encostia, ambos em interação com os 12 DAE (Tabela 7). Esta
maior produção de fenóis nestes tratamentos coincide com elevadas atividades da PPO nestas
mesmas interações de tratamentos (Tabela 8).
É importante ressaltar que a enzima PPO tem como substrato os fenóis,
que se formam geralmente, em condições de estresse como, infecções, ferimentos, radiação
ultravioleta, dentre outros (ANGELO & JORGE, 2007). Isto reforça a ocorrência deste maior
teor de fenóis nas plantas enxertadas que sofreram maior estresse, devido ao corte para se
fazer a enxertia e o processo da cicatrização do local da enxertia.
A menor produção do teor de fenóis (0,62 mg g-1
massa fresca) foi
observada na testemunha em interação com o dia da enxertia (Tabela 7), possivelmente porque
as plantas deste tratamentos não sofreram corte para se fazer a enxertia, condição pela qual
pode ter induzido nos demais tratamentos o aumento no teor de fenóis. Esta menor produção
de fenóis na testemunha no dia da enxertia coincide com baixa atividade da PPO observada
(tabela 8).
Tabela 7. Teor de fenóis (mg g-1
massa fresca) em função do método de enxertia e do dia após
enxertia. UNESP-FCA, 2010.
Dias após a enxertia (DAE)
Métodos enxertia 0 3 6 9 12
Contato em bisel 0,66 aAB 0,68 aAB 0,67 aAB 0,70 aA 0,63 bB
Fenda garfagem 0,65 aB 0,66 aAB 0,65 aB 0,70 aA 0,70 aA
Encostia 0,64 aB 0,65 aAB 0,64 aB 0,63 bB 0,70 aA
Enxerto pé-franco 0,62 aB 0,69 aA 0,64 aB 0,64 bB 0,63 bB
CV = 3,75 % F = 3,31*
* Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
43
Assim como na atividade da enzima POD e teor de Fenóis, a interação
dos fatores métodos e dias após a enxertia também influenciaram sobre a atividade da enzima
PPO (Tabela 8).
Todos os métodos de enxertia apresentaram as maiores atividades da
PPO aos 12 DAE (Tabela 8), sendo que neste dia, o método Fenda garfagem e Encostia
apresentaram as maiores atividades da PPO (Tabela 8).
De acordo com o desdobramento de DAE dentro dos métodos de
enxertia, observou-se que a atividade da PPO diminuiu no terceiro DAE e aumentou logo em
seguida nas plantas enxertadas pelos métodos Contato em bisel e Fenda garfagem (Tabela 8).
Já as plantas enxertadas por Encostia e a testemunha apresentaram variação na atividade da
PPO, sendo que a menor atividade das plantas enxertadas por Encostia foi no terceiro DAE e a
da testemunha no sexto DAE (Tabela 8).
No nono DAE, as mudas submetidas aos métodos de enxertia
apresentaram maior atividade da PPO que a testemunha (Enxerto pé-franco), porém ao
comparar Fenda garfagem e Encostia, não pode ser observada diferença (Tabela 8).
A menor atividade da PPO ocorreu no terceiro DAE nas plantas
enxertadas por Fenda garfagem, que não diferiram das plantas do método Contato em bisel
(Tabela 8).
A variação da atividade da PPO na testemunha pode ter sido devido ao
calor dentro da câmara úmida, já que este tratamento não sofreu corte, pois o mesmo não era
enxertado.
44
Tabela 8. Atividade da enzima PPO (µmol catecol oxidado min-1
µg-1
proteína) em função do
método de enxertia e do dia após enxertia. UNESP-FCA, 2010.
Dias após a enxertia (DAE)
Métodos enxertia 0 3 6 9 12
Contato em bisel 128,08 aB 97,02 bcD 100,51 aD 109,70 aC 145,15 aA
Fenda garfagem 129,09 aB 96,19 cD 105,58 aC 108,36 abC 149,96 aA
Encostia 128,98 aB 103,67 abC 106,24 aC 104,43 abC 149,52 aA
Enxerto pé-franco 127,08 aB 105,71 aC 99,50 aC 102,50 bC 145,97 aA
CV = 3,24 % F = 3,12*
* Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Houve variações tanto da atividade das enzimas SOD, POD, PPO
quanto do teor de fenóis em função do método de enxertia utilizado e do tempo após a
realização da enxertia. Em boa parte destas variações foram observadas diferenças estatísticas
significativas.
As plantas enxertadas apresentaram maiores atividades das enzimas
SOD, POD, PPO e teores de fenóis que as pé-franco (testemunha), sendo que as plantas
enxertadas por Contato em bisel e Fenda garfagem se destacaram com valores maiores,
principalmente na atividade das enzimas POD e PPO.
As variações nas atividades da CAT e POD em função do tempo em
plantas enxertadas de tomateiro também foram observadas por Fernandez-García et al. (2004),
que constataram aumento na atividade de POD ao longo do período após a enxertia (4, 8 e 15
DAE). Porém, estes mesmos autores perceberam que neste período a atividade da CAT
aumenta até os 8 DAE e diminui aos 15 DAE. Foram observadas variações parecidas na
atividade da POD entre os 3 e 12 DAE nas plantas enxertadas por Contato em bisel e Fenda
garfagem (Tabela 6), entretanto, não se observou o mesmo para atividade da CAT (Tabela 5).
No período após a enxertia, a planta passa por estresse, que é o
processo de cicatrização do local de enxertia, que exige gasto energético. Em situação de
estresse, o metabolismo destas plantas sofre alterações e as enzimas também tem variações em
45
suas atividades fazendo com que a planta se recupere desse estresse com menor gasto
energético.
As enzimas POD e PPO foram as que melhor responderam ao estresse
causado pela enxertia. Em tomateiro, a POD é uma das enzimas envolvidas no último passo na
lignificação (NICHOLSON & HAMMERSCHMIDT, 1992), em resposta ocorrida logo depois
do estresse causado, seja por ferimentos ou pelo ataque de patógenos.
Com relação a PPO existem relatos da participação desta enzima na
defesa da planta contra patógenos (SILVA et al., 2007; VANITHA, et al., 2009), porém não
foi encontrado estudo relacionando a atividade desta enzima com estresse causado pela
enxertia. Baseado no fato que esta enzima catalisa a oxidação de compostos fenólicos próximo
ao local estressado, onde há degradação celular (THIPYAPONG et al., 2007), e de acordo com
os resultados deste estudo da técnica da enxertia e enzimas, podemos afirmar que além da
POD, há também participação da PPO na defesa ao estresse causado pela enxertia.
7.2 EXPERIMENTO 2: Incidência da murcha bacteriana do tomateiro, trocas
gasosas, atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de
tomateiro enxertadas e inoculadas com R. solanacearum
7.2.1 Incidência da murcha bacteriana em plantas de tomateiro enxertadas e pé-
franco de tomateiro
Não houve diferença da porcentagem de folhas murchas aos 0 e 5 dias
após a inoculação (DAI) (Tabela 9). Nestes dias as plantas ainda não apresentavam sintomas
da doença, porém aos 10 e 15 DAI foi observado diferença entre os tratamentos e elevada
incidência da doença.
As plantas enxertadas e o porta-enxerto pé-franco inoculados com R.
solanacearum apresentaram menor porcentagem de folhas murchas, tanto aos 10 DAI, quanto
aos 15 DAI (Tabela 9). Por outro lado, o enxerto pé-franco inoculado com R. solanacearum
apresentou maior porcentagem de folhas murchas (Tabela 9) e, portanto, considerado
suscetível.
46
O porta-enxerto pé-franco foi considerado resistente, pois aos 15 DAI
não diferiu do enxerto não-inoculado (testemunha) quanto a porcentagem de folhas murchas
(Tabela 9). Apesar das plantas enxertadas inoculadas diferirem do enxerto não-inoculado, as
mesmas não diferiram do porta-enxerto pé-franco inoculado e apresentaram baixa incidência
da murcha bacteriana, principalmente quando comparadas ao enxerto inoculado (Tabela 9).
Isto caracteriza as plantas enxertadas como moderadamente resistentes, e dependendo da
infestação da área por R. solanacearum, a enxertia pode ser uma alternativa de controle.
Tabela 9. Porcentagem de folhas murchas em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado em
porta-enxerto ‘Guardião’, inoculado e não-inoculado com R. solanacearum. UNESP-FCA,
Botucatu, SP, 2011.
Tratamentos 0 DAI 5 DAI 10 DAI1 15 DAI
Plantas enxertadas inoculadas 0,00 a 0,00 a 22,78 b 29,23 b
Enxerto pé-franco inoculado 0,00 a 0,00 a 80,57 a 100,00 a
Porta-enxerto pé-franco inoculado 0,00 a 0,00 a 15,41 b 14,91 bc
Enxerto pé-franco não-inoculado 0,00 a 0,00 a 0,00 c 0,00 c
F ns
ns
26,78* 101,25
*
CV (%) 0,0 0,0 58,7 38,6 * ou
ns Teste F significativo ou não significativo a 5 % de probabilidade
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
DAI: Dias após a inoculação.
1 Dados originais transformados para √X
A resistência do porta-enxerto ‘Guardião’ foi reconfirmada, assim
como o descrito no catalago da empresa Takii do Brasil. A moderada resistência das plantas
enxertadas e a suscetibilidade do enxerto ‘Pizzadoro’ pode ser confirmada com a massa fresca
e seca das plantas aos 15 DAI (Tabela 10).
47
Tabela 10. Massa fresca (g) e massa seca (g) em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado
em porta-enxerto ‘Guardião’, inoculado e não-inoculado com R. solanacearum, aos 15 DAI.
UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011.
Tratamentos Massa fresca1 Massa seca
1
Plantas enxertadas inoculadas 115,87 a 12,76 ab
Enxerto pé-franco inoculado 20,28 b 1,85 c
Porta-enxerto pé-franco inoculado 123,99 a 10,53 b
Enxerto pé-franco não-inoculado 141,93 a 15,16 a
F 52,98* 40,35
*
CV (%) 15,9 19,7 * ou
ns Teste F significativo ou não significativo a 5 % de probabilidade
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
DAI: Dias após a inoculação.
1 Dados originais transformados para √X
A enxertia estudada neste trabalho ocasionou menor porcentagem de
folhas murchas que os indutores de resistência acibenzolar-S-metil, extratos aquosos de
Agaricus blazei e Lentinula edodes testados por Silva et al. (2007). Isto reforça a enxertia
como uma boa alternativa de controle para a murcha bacteriana, porém seria importante o uso
desta técnica juntamente com o manejo integrado.
7.2.2 Trocas gasosas em plantas de tomateiro enxertadas e pé-franco e inoculadas
com R. solanacearum
No dia da inoculação (0 DAI) as plantas não apresentaram diferença
para condutância estomática (gs), taxa de transpiração (E) (Tabela 11), porém apresentaram
diferença para taxa de assimilação liquida de CO2 (A). Aos 15 DAI foi observado grande
porcentagem de folhas murchas (Tabela 9) e diferença entre as trocas gasosas dos tratamentos
(Tabela 11).
Aos 15 DAI, o enxerto pé-franco inoculado apresentou menor gs, E e
A que os demais tratamentos (Tabela 11), que coincidiu com maior porcentagem de folhas
murchas causada pela doença (Tabela 9). Porém com relação a gs, não diferiu do porta-enxerto
48
pé-franco inoculado e do enxerto não-inoculado, e com relação a E não diferiu do enxerto não-
inoculado (Tabela 11).
As plantas enxertadas inoculadas apresentaram maiores gs, E e A aos
15 DAI (Tabela 11), que coincidiram com a baixa porcentagem de folhas murchas (Tabela 9),
e maiores massa fresca e seca (Tabela 10) destas plantas. As plantas enxertadas infectadas não
diferiram do enxerto pé-franco não-inoculado com relação às trocas gasosas (Tabela 11). Isto
mostra que mesmo com a presença da doença, estas plantas mantiveram boa capacidade
fotossintética. Isto ocorreu também com porta-enxerto pé-franco inoculado (Tabela 11).
Plantas enxertadas de tomateiro submetidas a elevadas concentrações
de NaCl, também apresentaram bom desempenho da fotossíntese, em avaliação realizada
através de trocas gasosas (HE et al., 2009). Isto mostra a enxertia como alternativa para o
tomateiro em superar situações de estresse, além de melhorar a fotossíntese.
49
Tabela 11. Trocas gasosas (gs: condutância estomática; E: taxa de transpiração; A: Taxa de assimilação liquida de CO2) em plantas
de tomateiro enxertadas e pé-franco aos 0 e 15 dias após a inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011.
0 DAI 15 DAI
Tratamentos gs E A gs1 E
2 A
1
Plantas enxertadas inoculadas 0,30 a 6,93 a 21,24 b 0,21 a 5,86 a 16,29 a
Enxerto pé-franco inoculado 0,30 a 7,06 a 24,34 b 0,03 b 1,03 b -0,50 b
Porta-enxerto pé-franco inoculado 0,24 a 6,77 a 29,63 a 0,17 ab 4,75 a 11,32 a
Enxerto pé-franco não-inoculado 0,30 a 8,07 a 24,71 b 0,16 ab 4,00 ab 16,60 a
F 2,85 ns
1,97 ns
10,63* 3,27
* 5,59
*
29,78*
CV (%) 14,76 12,98 9,51 3,07 31,16 23,52 * ou
ns Teste F significativo ou não significativo a 5 % de probabilidade
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
DAI: Dias após a inoculação.
1 e 2 Dados originais transformados para X+3 e √X
50
De acordo com análise de correlação, constatou-se correlação linear
entre as características avaliadas em todos os tratamentos, exceto para a característica % de
folhas de murchas nos tratamentos Enxerto pé-franco inoculado ou não com R. solanacearum
(Tabela 12). Não foi possível fazer correlação entre esta característica e as demais nestes
tratamentos, devido os dados da % de folhas murchas não apresentarem variação, pois os
mesmos já haviam atingindo 100% no Enxerto pé-franco inoculado e 0 % no Enxerto pé-
franco não inoculado.
Em plantas enxertadas inoculadas à medida que aumentou a % de
folhas murchas, diminuiu a matéria fresca e matéria seca (Tabela 12). Quando aumentou MF,
também aumentou MS e quando aumentou gs, aumentou também E (Tabela 12). Estas
variações eram esperadas, já que ao influenciar em MF influencia também em MS e o mesmo
ocorre para gs e E. Quando aumenta a gs nas plantas, consequentemente aumenta a velocidade
nas trocas de vapor d’água pelas mesmas.
Constatou-se nas plantas dos tratamentos Enxerto pé-franco, Porta-
enxerto pé-franco inoculados e Enxerto pé-franco não-inoculados resultados semelhantes aos
descritos acima, para as características MF e MS, gs e E (Tabela 12).
A produtividade das plantas é influenciada por características
morfológicas e fisiológicas da fonte (órgãos fotossintetizantes) e do dreno (órgãos
consumidores dos metabólitos fotossintetizados, carboidratos principalmente) (BRANDÃO
FILHO et al., 2003). Toda produção de fitomassa depende da atividade fotossintética da fonte,
porém a taxa de assimilação do CO2, condutância estomática, taxa de transpiração são apenas
uns dos muitos fatores que influenciam o crescimento e desenvolvimento vegetal (FOYER &
GALTIER, 1996).
Em situação de estresse, como, por exemplo, a presença da murcha
bacteriana, as plantas de tomateiro reduzem sua capacidade fotossintética e consequentemente
a produção fitomassa.
51
Tabela 12. Correlação linear entre características porcentagem de folhas murchas (%), massa fresca (MF), massa seca (MS),
condutância estomática (gs), transpiração (E) e taxa de assimilação liquida de CO2 (A), baseado no coeficiente de correlação (%).
UNESP-FCA, Botucatu, SP, 2011.
Características
Plantas enxertadas
Inoculadas
Enxerto pé-franco
inoculado
Porta-enxerto pé-franco
inoculado
Enxerto pé-franco
não-inoculado
% Folhas murchas x MF -88* s.v ns s.v
% Folhas murchas x MS -93* s.v ns s.v
% Folhas murchas x gs Ns s.v ns s.v
% Folhas murchas x E Ns s.v ns s.v
% Folhas murchas x A Ns s.v ns s.v
MF x MS 95* 95* 99* 96*
gs x E 100* 100* 100* 100*
gs x A Ns Ns ns ns
E x A Ns Ns ns ns * ou ns: Coeficiente de correlação significativo ou não significativo. Foi aplicado o teste t a 5% de probabilidade.
s.v: Sem variação nos dados da característica % de folhas murchas. Não foi possível fazer correlação.
52
7.2.3 Atividade de enzimas antioxidantes e teor de fenóis em plantas de tomateiro
enxertadas e inoculadas com R. solanacearum
A atividade das enzimas SOD, POD, PAL, teor de Fenóis e PPO foram
influenciados pela interação dos fatores locais da planta e dia após a inoculação (DAI)
(Tabelas 13, 15, 16, 17 e 18), enquanto que a atividade da enzima CAT foi influenciada
somente pelo fator dia após a inoculação (Tabela 14).
A maior atividade da enzima SOD (1,82 U g-1
proteína) ocorreu nos
tratamentos Local da enxertia e Abaixo da enxertia não-inoculados aos 15 DAI (Tabela 13).
Tanto neste dia, quanto aos 2 DAI, estes tratamentos apresentaram maior atividade da SOD
que os demais (Tabela 13).
53
Tabela 13. Atividade da enzima SOD (U g-1
proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R. solanacearum.
UNESP-FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 1,32 aB 1,32 bB 1,51 aA 1,51 aA 1,51 aA 1,52 cA
Local enxertia inoculado 1,34 aB 1,32 bB 1,52 aA 1,49 aA 1,49 aA 1,49 cA
Abaixo enxertia inoculado 1,33 aB 1,32 bB 1,52 aA 1,51 aA 1,51 aA 1,53 cA
Enxerto PF inoculado 1,33 aB 1,32 bB 1,51 aA 1,50 aA 1,52 aA 1,51 cA
Porta-enxerto PF inoculado 1,32 aB 1,31 bB 1,52 aA 1,51 aA 1,50 aA 1,51 cA
Enxerto PF não-inoculado 1,32 aB 1,33 bB 1,52 aA 1,50 aA 1,51 aA 1,51 cA
Porta-enxerto PF não-inoculado 1,33 aB 1,34 bB 1,51 aA 1,49 aA 1,52 aA 1,52 cA
Acima enxertia não-inoculado 1,34 aC 1,35 bC 1,52 aB 1,51 aB 1,53 aB 1,68 bA
Local enxertia não-inoculado 1,34 aC 1,55 aB 1,49 aB 1,51 aB 1,53 aB 1,82 aA
Abaixo enxertia não-inoculado 1,34 aC 1,52 aB 1,52 aB 1,53 aB 1,50 aB 1,82 aA
CV (%) = 2,49 F = 10,05* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
54
A interação dos fatores locais da planta e DAI não influenciaram na
atividade da enzima CAT (Tabela 14). Ao analisar os fatores separadamente, foi observado
influencia do fator DAI e de forma significativa (Tabela 14).
Independente do local da planta, a maior atividade da CAT foi
observada aos 0 e 2 DAI. A menor atividade ocorreu aos 15 DAI, entretanto, não diferiu das
atividades observadas aos 4, 6 e 8 DAI (Tabela 14). Apesar de não ocorrer diferença estatística
entre os dias com menores atividades, pode-se observar tendência à diminuição da atividade
da CAT ao longo do tempo após a inoculação (Tabela 14).
Tabela 14. Atividade da enzima CAT (μmol H2O2 min-1
mg-1
proteína) em função da enxertia
e do dia após a inoculação de R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011.
Fatores Médias
Locais da planta CAT1
Acima enxertia inoculado 6,9 x 10-10
a
Local enxertia inoculado 7,9 x 10-10
a
Abaixo enxertia inoculado 7,3 x 10-10
a
Enxerto PF inoculado 7,2 x 10-10
a
Porta-enxerto PF inoculado 7,7 x 10-10
a
Enxerto PF não-inoculado 7,5 x 10-10
a
Porta-enxerto PF não-inoculado 6,5 x 10-10
a
Acima enxertia não-inoculado 7,3 x 10-10
a
Local enxertia não-inoculado 7,0 x 10-10
a
Abaixo enxertia não-inoculado 7,2 x 10-10
a
Dias após a inoculação (DAI) CAT1
0 1,0 x 10-09
a
2 1,0 x 10-09
a
4 5,9 x 10-10
b
6 6,1 x 10-10
b
8 5,7 x 10-10
b
15 5,3 x 10-10
b
CV (%) = 17,34 F = 30,19* 1 Dados originais transformados em 1/√X
* Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
55
A maior atividade da POD (0,15 μmol H2O2 min-1
mg-1
proteína)
ocorreu no local da enxertia das plantas enxertadas inoculadas com R. solanacearum no dia da
inoculação ( DAI). Esta atividade ainda foi maior que os demais tratamentos aos 2 e 15 DAI,
porém não diferiu do local da enxertia não-inoculado aos 4, 6 e 8 DAI (Tabela 15).
Estes resultados mostram que houve aumento da atividade da POD no
local de enxertia logo após a inoculação, porém a diferença entre o local da enxertia com e
sem R. solanacearum não foi tão representativa (Tabela 15). Este aumento após a inoculação
também foi observado por Mandal et al (2011), entre 0 e 3 DAI em plantas pé-franco de
tomateiro resistentes com relação as suscetíveis. As plantas enxertadas do estudo em
discussão, apresentaram maior nível de resistência a R. solanacearum que as plantas pé-franco
do enxerto (Tabela 9 e 10) e, segundo Mandal et al. (2011), plantas de tomateiro com
resistência podem apresentarem sistema antioxidante mais eficiente, menor taxa de
peroxidação lipídica e deposição de lignina na parede celular, que podem contribuir para
resistência destas plantas a R. solanacearum.
A ausência de diferença na atividade da POD no local da enxertia,
entre os 4 e 8 DAI (Tabela 15), sugere que a elevada atividade dessa enzima neste local com e
sem a presença da R. solanacearum, durante este período, pode não ser devido a bactéria e sim
ao processo de enxertia. O melhor desenvolvimento de plantas enxertadas de tomateiro pode
estar relacionado à melhoria da fotossíntese e aumento da atividade de enzimas antioxidantes,
dentre elas a peroxidase (HE et al., 2009).
O local abaixo da enxertia não-inoculado em interação com os 15 DAI
ocasionaram a menor atividade da POD (0,05 μmol H2O2 min-1
mg-1
proteína). Porém, neste
dia, este local da planta não diferiu dos locais acima da enxertia, abaixo da enxertia, enxerto
PF, porta-enxerto PF, ambos inoculados e porta-enxerto PF e acima da enxertia não-
inoculados (Tabela 15), apesar de estes tratamentos terem apresentado atividade da CAT um
pouco acima da atividade apresentada pelo abaixo enxertia não-inoculado.
56
Tabela 15. Atividade da enzima POD (μmol H2O2 decomposto min-1
mg-1
proteína) em função da enxertia e do dia após a
inoculação com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 0,08 cA 0,08 cdAB 0,07 bABC 0,06 bC 0,06 bBC 0,06 cdC
Local enxertia inoculado 0,15 aA 0,14 aAB 0,12 Ac 0,13 aBC 0,12 aC 0,12 aC
Abaixo enxertia inoculado 0,08 cdBC 0,08 cdB 0,07 bBC 0,13 aA 0,06 bC 0,06 cdC
Enxerto PF inoculado 0,08 cA 0,08 cdA 0,07 bA 0,07 bA 0,07 bA 0,07 cdA
Porta-enxerto PF inoculado 0,08 cAB 0,08 cA 0,07 bB 0,07 bB 0,07 bB 0,07 cdB
Enxerto PF não-inoculado 0,06 dB 0,08 cdA 0,06 bB 0,07 bAB 0,07 bAB 0,07 cAB
Porta-enxerto PF não-inoculado 0,08 cAB 0,08 cdA 0,06 bBC 0,06 bC 0,07 bABC 0,07 cdABC
Acima enxertia não-inoculado 0,08 cA 0,08 cdAB 0,07 bABC 0,07 bBC 0,06 bC 0,06 dC
Local enxertia não-inoculado 0,13 bA 0,12 bAB 0,13 aA 0,12 aA 0,12 aA 0,10 bB
Abaixo enxertia não-inoculado 0,08 cA 0,07 dAB 0,06 bBC 0,07 bAB 0,06 bABC 0,05 dC
CV (%) = 9,46 F = 6,35* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
57
Independente dos dias em que foram coletadas as amostras do caule,
quase todos os locais das plantas infectados com R. solanacearum apresentaram maiores
atividades da PAL que os locais das plantas não-inoculados, exceto o porta-enxerto inoculado
(Tabela 16).
O local da enxertia das plantas inoculadas apresentou maiores
atividades da enzima PAL que os demais tratamentos em todos os dias após a inoculação
(Tabela 16). A maior atividade da PAL (12,35 μmols min-1
mg-1
de proteína) deste local da
enxertia infectado ocorreu aos 2 DAI (Tabela 16).
Esta maior atividade da PAL, pode estar relacionada com a resistência
da planta enxertada ao patógeno, e isto faz com que a enzima PAL aumente sua capacidade
catalisadora para formação de fenóis. Shou et al. (2005) e Vanitha et al. (2009) apontaram a
enzima PAL como marcador bioquímico na resitência/suscetibilidade de tomaterio a R.
solanacearum, baseados no aumento da atividade desta enzima em plantas pé-franco de
tomateiro resistentes em relação as suscetíveis. Porém, não foi encontrado estudos
relacionando esta resistência à R. solanacearum em plantas enxertadas de tomateiro.
Quando ocorre aumento da atividade da enzima PAL, também ocorre
aumento da formação de ácido trans-cinâmico na rota do ácido chiquímico e aumento no teor
de fenóis (ENGELBERTH, 2009) em resposta a infecção com R. solanacearum em tomateiro
pé-franco (MANDAL et al., 2011). Entretando o aumento no teor de fenóis (Tabela 17) não
acompanhou o aumento da atividade da PAL (Tabela 16) neste estudo com tomateiro
enxertado e R. Solanacearum.
A atividade da PAL pode ser alterada por fatores ambientais, tais como
baixos teores de nutrientes, luz e infecção por patógenos. A presença de fenóis em plantas e
sua síntese em resposta à infecção estão associadas com resistência a doenças (WHETTEN &
SEDEROFF, 1995). Isto tornou a enzima PAL uma das mais estudadas no metabolismo
secundário de plantas (ENGELBERTH, 2009), principalmente em pesquisas com tomateiro
pé-franco e R. solanacearum (BYTH, et al., 2001; SHOU et al., 2005; SILVA et al., 2007;
VANITHA et al., 2009).
As menores atividades da PAL ocorreram nas plantas não-inoculadas
com a bactéria e também nas plantas do porta-enxerto PF inoculado (Tabela 16). Sendo que a
58
menor atividade da PAL (5,60 μmols min-1
mg-1
de proteína) ocorreu abaixo da enxertia nas
plantas não-inoculadas aos 15 DAI (Tabela 16).
59
Tabela 16. Atividade da enzima PAL (μmols min-1
mg-1
de proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação com R.
solanacearum. UNESP-FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 10,25 abA 10,17 bAB 9,19 bBCD 9,42 bABC 8,37 bcD 8,51 bCD
Local enxertia inoculado 11,31 aB 12,35 aA 10,96 aB 11,18 aB 10,69 aB 10,87 aB
Abaixo enxertia inoculado 9,75 bAB 9,91 bA 8,70 bC 8,99 bABC 8,78 bBC 9,10 bABC
Enxerto PF inoculado 10,14 bA 9,96 bAB 9,15 bABC 9,06 bBC 7,82 bcdD 8,57 bCD
Porta-enxerto PF inoculado 7,78 cABC 7,22 cBC 6,88 cC 7,75 cABC 8,28 bcA 8,18 bAB
Enxerto PF não-inoculado 6,76 cAB 7,01 cA 6,52 cAB 6,14 eAB 6,47 eAB 5,84 cB
Porta-enxerto PF não-inoculado 7,44 cA 7,27 cAB 6,16 cC 6,28 deBC 6,32 eBC 5,93 cC
Acima enxertia não-inoculado 7,41 cA 7,23 cA 6,95 cA 6,77 cdeA 7,01 deA 6,50 cA
Local enxertia não-inoculado 7,31 cA 6,58 cAB 7,26 cA 7,03 cdeAB 6,79 deAB 6,11 cB
Abaixo enxertia não-inoculado 7,24 cA 6,76 cA 6,93 cA 7,32 cdA 7,40 cdeA 5,60 cB
CV (%) = 6,12 F = 3,81* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
60
A maior produção do teor de fenóis (0,95 mg g-1
massa fresca)
ocorreu também no local da enxertia das plantas inoculadas, porém no quarto dia após a
inoculação (4 DAI). É importante destacar ainda que o teor de fenóis neste local da planta aos
4 DAI, só diferenciou estatisticamente do local abaixo da enxertia inoculado, que apresentou a
menor produção de fenóis (0,86 mg g-1
massa fresca) (Tabela 17).
Esta maior produção de fenóis no local da enxertia das plantas
inoculadas aos 4 DAI (Tabela 17) foi precedida pela maior atividade de PAL observada aos 2
DAI (Tabela 16), além de coincidir com alta atividade desta enzima aos 4 DAI (Tabela 15). A
PAL é responsável pela síntese de fenóis relacionados à defesa da planta à patógenos.
As classes mais abundantes de compostos fenólicos ou fenóis em
plantas são derivadas da fenilanina, por meio da eliminação de uma molécula de amônia
(NH3) para formar ácido trans-cinâmico. Essa reação é catalisada pela PAL, a qual está situada
em um ponto de ramificação entre os metabolismos primário e secundário e é uma etapa
reguladora importante na formação de muitos fenóis (ENGELBERTH, 2009).
O menor teor de fenóis (0,84 mg g-1
massa fresca) foi observado aos
15 DAI acima da enxertia em plantas não-inoculadas(Tabela 17). Porém neste dia só diferiu
dos tratamentos abaixo da enxertia, enxerto PF inoculados e enxerto PF não-inoculado que
apresentaram teores de fenóis superiores (Tabela 17).
61
Tabela 17. Teor de fenóis (mg g-1
massa fresca) em função da enxertia e do dia após a inoculação de R. solanacearum. UNESP-
FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 0,84 bB 0,89 aAB 0,90 abAB 0,90 aAB 0,89 aAB 0,91 abcA
Local enxertia inoculado 0,85 bC 0,91 aAB 0,95 aA 0,87 aBC 0,91 aAB 0,88 abcBC
Abaixo enxertia inoculado 0,84 bC 0,90 aAB 0,86 bBC 0,92 aA 0,92 aA 0,91 aAB
Enxerto PF inoculado 0,82 bB 0,92 aA 0,92 abA 0,93 aA 0,91 aA 0,91 abA
Porta-enxerto PF inoculado 0,84 bC 0,89 aABC 0,92 abA 0,90 aAB 0,92 aA 0,86 abcBC
Enxerto PF não-inoculado 0,87 abB 0,91 aAB 0,93 aA 0,92 aAB 0,92 aAB 0,92 aAB
Porta-enxerto PF não-inoculado 0,92 aA 0,91 aA 0,92 abA 0,93 aA 0,89 aA 0,90 abcA
Acima enxertia não-inoculado 0,92 aA 0,93 aA 0,91 abA 0,91 aA 0,89 aAB 0,84 cB
Local enxertia não-inoculado 0,92 aA 0,93 aA 0,93 aA 0,92 aA 0,92 aA 0,85 bcB
Abaixo enxertia não-inoculado 0,92 Aa 0,91 aA 0,90 abA 0,91 aA 0,92 aA 0,87 abcA
CV (%) = 3,13 F = 3,32* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
62
A maior atividade da PPO (15,86 µmol catecol oxidado min-1
µg-1
proteína) ocorreu no local abaixo da enxertia inoculado, no segundo dia após a enxertia (2
DAI), quando é observado aumento do teor de fenóis em relação ao dia da inoculação. A
atividade da PPO neste local das plantas inoculadas ainda foi maior que os demais locais nos
0, 4, 6 e 15 DAI (Tabela 18), exceto aos 8 DAI.
O fato da maior atividade da PPO ter ocorrido abaixo da região de
enxertia, pode ser devido a oxidação de compostos fenólicos, catalisada pela PPO
(THIPYAPONG et al., 2007) no porta-enxerto próximo ao local da enxertia. Isto pode ser
devido o porta-enxerto ser resistente a bactéria R. solanacearum.
A PPO tem participação na defesa da planta contra patógenos, porém
existem poucos relatos do seu papel nesta defesa (VANITHA, et al., 2009). Os resultados
deste estudo com plantas enxertadas e pé-franco infectadas com R. solanacearum mostram
essa relação da PPO com a defesa do tomateiro à esta bactéria, assim como, os encontrados
por Chen et al. (2003) e Vanitha et al. (2009), que relacionaram o aumento na atividade da
PPO com as alterações do metabolismo das plantas de tomateiro e resistência a R.
solanacearum.
A combinação local da enxertia não-inoculado e 15 DAI ocasionou a
menor atividade da PPO (6,18 µmol catecol oxidado min-1
µg-1
proteína). Porém neste dia,
este valor só diferiu do valor obtido para o local abaixo da enxertia inoculado (Tabela 18).
63
Tabela 18. Atividade da enzima PPO (µmol catecol oxidado min-1
µg-1
proteína) em função da enxertia e do dia após a inoculação
com R. solanacearum. UNESP-FCA, 2011.
Dias após a inoculação (DAI)
Locais da planta 0 2 4 6 8 15
Acima enxertia inoculado 7,54 bA 10,01 bA 9,54 bcA 7,77 bA 8,64 aA 8,07 bcA
Local enxertia inoculado 7,53 bB 10,46 bA 10,15 bcAB 9,21 bAB 8,54 aAB 8,35 bcAB
Abaixo enxertia inoculado 14,44 aA 15,86 aA 15,13 aA 15,19 aA 10,38 aB 13,41 aA
Enxerto PF inoculado 6,88 bB 9,51 bAB 10,45 bA 8,44 bAB 8,46 aAB 8,41 bcAB
Porta-enxerto PF inoculado 7,67 bA 10,05 bA 7,95 bcA 8,04 bA 10,38 aA 7,82 bcA
Enxerto PF não-inoculado 8,32 bA 8,36 bA 8,29 bcA 9,36 bA 8,29 aA 8,54 bcA
Porta-enxerto PF não-inoculado 9,19 bA 8,07 bA 7,64 bcA 7,94 bA 10,38 aA 9,44 bA
Acima enxertia não-inoculado 8,24 bA 8,96 bA 8,99 bcA 8,84 bA 7,81 aA 6,62 bcA
Local enxertia não-inoculado 8,36 bA 8,65 bA 7,92 bcA 7,51 bA 7,52 aA 6,18 cA
Abaixo enxertia não-inoculado 8,12 bA 8,87 bA 7,07 cA 8,34 bA 8,09 aA 7,31 bcA
CV (%) = 15,55 F = 2,20* * Teste F significativo a 5 % de probabilidade.
Letras minúsculas comparam nas colunas e letras maiúsculas comparam nas linhas.
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
64
7.3 EXPERIMENTO 3: Produção do tomateiro em função de três métodos de
enxertia e pé-franco
No experimento conduzido sob ambiente protegido para avaliar a
produção do tomateiro em função de métodos de enxertia e pé-franco, a temperatura máxima
variou entre 14 e 39ºC, a mínima entre 7 e 23ºC e a média entre 9 e 27ºC; a umidade relativa
do ar máxima variou entre 60 e 97%, a mínima entre 19 e 94% e a média entre 41 e 96%,
conforme as figuras 1 e 2 do anexo.
7.3.1 Produtividade comercial, não comercial e total do tomateiro em função dos
métodos de enxertia e pé-franco
Não houve diferença na produção de frutos comerciais e não comercial
do tomateiro (Tabela 19). Porém o método Fenda garfagem produziu 17,5 frutos comerciais
m-2
a mais e 0,7 kg de massa comercial m-2
a menos que o pé-franco (testemunha) (Tabela 19).
Isto corresponde à produtividade estimada de 175 mil frutos comerciais a mais por hectare e
que faz diferença na relação custo benefício do produtor, já que o tomateiro em algumas
regiões é comercializado pelo produtor, em caixas e não em kg, como por exemplo, em
algumas cidades do interior de São Paulo.
Isto fará diferença ainda maior se o mercado consumidor não for
exigente em frutos grandes, pois o método Fenda garfagem produziu maior numero de frutos
que os demais tratamentos na classe de 0-39 mm de diâmetro equatorial (Tabela 20). Porém
não diferiu do método Encostia (Tabela 20).
Também com tomateiro, Branco et al. (2007) não obtiveram diferenças
significativas na produção das plantas enxertadas comparadas as de pé-franco.
65
Tabela 19. Produtividade comercial, não comercial e total do tomateiro em função dos
métodos de enxertia, baseado no número e massa dos frutos por m2. UNESP-FCA-FEPP, São
Manuel, SP, 2011.
Comercial Não comercial Total Comercial Não comercial Total
Tratamentos ..................Frutos m-2
....................... .....................kg m-2
..........................
Contato em bisel 111,25 a 1,56 a 112,81 12,52 a 0,14 a 12,66
Fenda garfagem 138,44 a 1,88 a 140,32 13,48 a 0,16 a 13,64
Encostia 108,13 a 1,56 a 109,69 11,66 a 0,22 a 11,88
Pé-franco 120,94 a 1,25 a 122,19 14,18 a 0,13 a 14,31
F 3,79ns
0,21ns
1,77ns
0,34ns
CV (%) 11,69 16,80 12,76 11,20 * ou
ns Teste F significativo ou não significativo a 5 % de probabilidade
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
O tratamento pé-franco apresentou melhor aproveitamento na
produção do tomateiro, pois a produtividade comercial das plantas deste foi maior (98,98%
para frutos e 99,09 % para massa dos frutos) e não comercial menor (1,02% para frutos e 0,91
para massa dos frutos) que a das plantas enxertadas, independente do método de enxertia
utilizado (Figuras 7 e 8). As plantas do método de enxertia que mais se aproximou das plantas
pé-franco com relação ao aproveitamento da produção foram as do Fenda garfagem (98,66
para frutos) e as do Contato em bisel (98,89% para massa dos frutos) (Figuras 7 e 8).
66
Figura 7. Porcentagem de frutos comerciais e não comerciais na produção de tomateiro em
função do método de enxertia e pé-franco. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011.
Neste experimento 3 não foi inoculado a bactéria R. solanacearum nas
plantas de tomateiro. Porém apesar de não haver alta diferença entre plantas enxertadas e pé-
franco com relação à produção de tomateiro, é importante ressaltar que em áreas infestadas por
esta bactéria, a produção através de plantas pé-franco é muito difícil, e neste tipo de área é
visível a diferença de produção entre plantas enxertadas e pé-franco.
67
Figura 8. Porcentagem da massa fresca (kg m-2
) dos frutos comerciais e não comerciais na
produção de tomateiro em função do método de enxertia e pé-franco. UNESP-FCA-FEPP, São
Manuel, SP, 2011.
Ao classificar os frutos de acordo com diâmetro equatorial, constatou-
se que as plantas pé-franco e as enxertadas pelo método Fenda garfagem produziram maior
quantidade e massa de frutos na faixa de diâmetro equatorial entre 60-69 mm, porém não
diferiram das plantas enxertadas pelo método Contato em bisel (Tabela 20). O método
Encostia produziu o menor numero de frutos nesta faixa, porém com relação a massa de frutos
nesta faixa não diferiu estatisticamente dos métodos Contato em bisel e Fenda
garfagem(Tabela 20).
Na faixa 50 – 59 mm, apesar de não ter existido diferença estatística, o
Fenda garfagem produziu maior numero de fruto (Tabela 20). É importante destacar a
produção de frutos dentro desta faixa de diâmetro, pois o maior numero e massa dos frutos
deste estudo foi dentro desta faixa de diâmetro equatorial (50 – 59 mm), e é também dentro
dessa faixa que se classifica a maior parte dos frutos produzidos pelo tomate ‘Pizzadoro’® que
é do tipo italiano e foi utilizado neste estudo. Este tipo de classificação de frutos é muito
importante, pois influencia no volume comercializado pelo produtor e faz parte dos padrões
exigidos pelos consumidores.
68
As plantas enxertadas através do método Fenda garfagem produziram
maiores numero e massa de frutos com diâmetro equatorial entre 0 – 39 mm que os métodos
Contato em bisel e plantas pé-franco (Tabela 20). Estes resultados mostram que as plantas
enxertadas com o método Fenda garfagem resultaram na produção de frutos menores e com
menor massa em relação aos outros dois métodos de enxertia e plantas pé-franco. Nas demais
faixas de diâmetro equatorial não houve diferenças entre os métodos de enxertia e pé-franco.
A maior produtividade não comercial ocorreu nas plantas enxertadas
por Encotia, seguidas pelas plantas enxertadas por Fenda garfagem, Contato em bisel e pé-
franco (Tabela 21). As plantas pé-franco apresentaram menor produtividade não comercial,
porém não diferiu estatisticamente dos demais tratamentos e as plantas enxertadas que mais se
aproximaram das plantas pé-franco, foi as enxertadas por Contato em bisel (Tabela 21).
Baseado na tabela 21 pode-se observar que os defeitos que
ocasionaram a produtividade não comercial foram manchas, podridão apical, cancro,
rachaduras e queimaduras do sol. Os frutos das plantas enxertadas por Contato em bisel
apresentaram problemas de manchas e cancro. As enxertadas por Fenda garfagem obtiveram
frutos com problemas de manchas, cancro e queimadura do sol. O principal defeito encontrado
nos frutos das plantas enxertadas por Encostia foram as rachaduras, além das manchas, cancro
e queimaduras do sol. As plantas pé-franco apresentaram maior massa de frutos com sintomas
de cancro, porém não diferiu dos demais tratamentos. As plantas pé-franco foram as únicas a
apresentarem frutos com problema de podridão apical de forma representativa (Tabela 21).
69
Tabela 20. Produtividade comercial do tomateiro, baseado no número, massa (kg) dos frutos comerciais por m2 e na classe do fruto
(CQH-CEAGESP 2003), em função dos métodos de enxertia e pé-franco. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011.
Diâmetro equatorial (mm)
0 a 39 40 a 49 50 a 59 60 a 69 70 a 79
Tratamentos 1Frutos
2Massa
3Frutos
4Massa Frutos Massa
5Frutos
6Massa
7Frutos
8Massa
Contato em bisel 0,00 b 0,00 b 15,63 a 0,91 a 80,00 a 9,49 a 15,00 a 2,05 ab 0,63 a 0,08 a
Fenda garfagem 2,19 a 0,06 a 16,25 a 1,18 a 102,50 a 9,78 a 17,50 a 2,46 ab 0,00 a 0,00 a
Encostia 0,31 ab 0,01 ab 11,56 a 0,80 a 83,44 a 9,18 a 12,19 b 1,55 b 0,63 a 0,12 a
Pé-franco 0,00 b 0,00 b 10,94 a 0,66 a 89,06 a 10,62 a 20,63 a 2,85 a 0,31 a 0,05 a
F 5,10* 4,70
* 0,43
ns 1,11
ns 2,67
ns 0,38
ns 19,82
* 7,44
* 0,67
ns 0,61
ns
CV (%) 17 2,47 26,55 22,19 6,71 20,54 27,58 27,46 13,53 12,07 * ou
ns Teste F significativo ou não significativo a 5 % de probabilidade. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
, Dados originais transformados consecutivamente para X+5, X+1, 1/√X, √X, √X, X+1, X+5, X+1.
Tabela 21. Produtividade não comercial do tomateiro em função dos métodos de enxertia e pé-franco, baseado na massa dos frutos
por m2. UNESP-FCA-FEPP, São Manuel, SP, 2011.
1 Massa Total
1 Mancha
1 Podridão Apical
1 Cancro
1 Rachado
1 Queimado do sol
Tratamentos ..............................................................kg m-2
..............................................................................
Contato em bisel 0,14 a 0,06 a 0,00 a 0,05 a 0,00 a 0,03 a
Fenda garfagem 0,16 a 0,04 a 0,00 a 0,06 a 0,00 a 0,06 a
Encostia 0,22 a 0,03 a 0,00 a 0,04 a 0,09 a 0,05 a
Pé-franco 0,13 a 0,00 a 0,03 a 0,10 a 0,00 a 0,00 a
F 0,34ns
0,46ns
1,00ns
0,29ns
3,00ns
0,83ns
CV (%) 11,2 7,5 2,54 9,86 5,29 6,06 * ou
ns Teste F significativo ou não significativo a 5 % de probabilidade. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade. 1 Dados originais transformados para X+1.
70
7.3.2 Características qualitativas da produção de tomateiro em função dos métodos
de enxertia e pé-franco
Houve diferença entre os tratamentos para o teor de ácido ascórbico
(Tabela 22). Porém não foi observado diferença para licopeno, β-caroteno, acidez titulável
(AT), sólidos solúveis (SS), relação sólidos solúveis/acidez titulável (SS/AT - Ratio),
potencial hidrogeniônico (pH) e firmeza dos frutos (Tabela 22), entre os tratamentos
avaliados.
Os frutos das plantas enxertadas pelo método Encostia apresentaram
maior teor de ácido ascórbico (17,8 mg de ácido ascórbico 100 g-1
de polpa) que os outros
tratamentos (Tabela 22). Os frutos das plantas pé-franco (testemunha) apresentaram o menor
teor de ácido ascórbico (15,8 mg de ácido ascórbico 100 g-1
de polpa), porém não diferiu dos
tratamentos Contato em bisel e Fenda garfagem (Tabela 22).
Tabela 22. Ácido ascórbico (AA - mg de ácido ascórbico 100 g-1
de polpa), licopeno, β-
caroteno, acidez titulável (AT - g de ácido málico 100g-1
), sólidos solúveis (SS - °Brix),
relação sólidos solúveis/acidez titulável (SS/AT - Ratio), potencial hidrogeniônico (pH),
Firmeza (N), em função de métodos de enxertia de tomateiros, Botucatu – SP, 2011.
Tratamentos AA Licopeno β-caroteno AT SS SS/AT pH Firmeza
Contato em bisel 16,0 b 0,25 a 0,05 a 0,05 a 4,55 a 87,65 a 4,59 a 272,00 a
Fenda garfagem 16,0 b 0,26 a 0,04 a 0,05 a 4,75 a 90,51 a 4,57 a 163,83 a
Encostia 17,8 a 0,22 a 0,06 a 0,04 a 4,2 a 86,61 a 4,56 a 281,58 a
Pé-franco 15,8 b 0,23 a 0,07 a 0,05 a 4,6 a 87,61 a 4,62 a 287,25 a
F 7,47* 0,38ns
3,16ns
0,33ns
3,82ns
0,14ns
2,19ns
4,17ns
C.V.(%) 4,18 24,99 19,87 9,24 3,72 7,44 0,54 16,14 * ou
ns Teste F significativo ou não significativo a 5 % de probabilidade.
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Esta diferença no teor de ácido ascórbico entre os tratamentos pode
está relacionada ao grau de maturação dos frutos. Segundo estudo realizado por Lima-Silva et
al., (2012), o teor de ácido ascórbico em frutos de tomate está relacionado ao estado oxidativo
do fruto e não à expressão genica que é responsável pela biossíntese deste antioxidante na
planta.
71
8 CONSIDERAÇÕES GERAIS
As hortaliças estão extremamente ligadas à alimentação saudável e a
menor predisposição a doenças em seres humanos. O tomateiro é uma cultura muito
importante na alimentação e na economia do mercado agrícola mundial e com grandes
desafios para sua produção, principalmente na parte de manejo fitossanitário. Sendo assim, se
tornou uma hortaliça muito pesquisada no setor de Horticultura.
R. solanacearum é uma das mais importantes doenças da cultura do
tomateiro e de difícil controle, e todas as pesquisas possíveis que possam ajudar viabilizar a
produção desta cultura, principalmente em regiões com poucas condições de cultivo é de suma
importância. É importante ressaltar que esta pesquisa não procurou resolver todos os
problemas do tomateiro, mas pelo menos tentou auxiliar e buscar alternativas para viabilizar a
produção desta cultura.
Sabe-se que uma pesquisa ao ser realizada pode resolver problemas e
muitas vezes criar outros. Ao criar outros problemas, outras dúvidas, pode-se ter a certeza de
que algo ainda pode ser resolvido, e isto serve como estímulo para o conhecimento e para as
novas descobertas.
Em áreas infestadas por R. solanacearum é possível produzir tomate,
porém depende do nível de infestação das áreas. A técnica da enxertia pode ser uma boa
alternativa para melhorar a produção nestas áreas, porém é necessário desenvolver porta-
72
enxertos mais resistentes e observar até quando esta planta enxertada pode resistir à infecção
do patógeno.
Neste estudo foi observado aumento da enzima PAL nas plantas
enxertadas e pé-franco após a inoculação com a bactéria. A análise desta enzima em plantas de
tomateiro com possível infecção por R. solanacearum pode ser uma ferramenta para detecção
da doença.
O aumento da atividade da PAL pode aumentar a síntese de fenóis, e
consequentemente aumentar a resistência das plantas. O aumento desta enzima está
relacionado com estresse provocado por patógenos e talvez o uso de patógenos não
prejudiciais à produção poderiam aumentar a atividade da PAL e a resistência em plantas.
Outra possibilidade seria estudar produtos que induza aumento na
atividade desta enzima, visando aumento da resistência das plantas á patógeno.
Algumas enzimas como POD e PPO, não responderam tanto como a
enzima PAL e talvez estudos relacionando horas após a inoculação com atividade destas
enzimas em vez de dias, poderia mostrar melhor se há variação destas enzimas no inicio do
estresse causado pela presença da bactéria. Uma vez que o estudo em discussão analisou a
atividade destas enzimas a cada 48 horas (2 dias) e observou-se que a variação destas enzimas
é menor dos 4 dias da inoculação em diante.
Para fazer a análise das enzimas e fenóis em amostras do caule foram
realizadas coletas destrutivas das plantas. Talvez a utilização de folhas das plantas em vez de
caule, poderia ser uma alternativa para uma análise menos destrutiva, porém seria importante
fazer um estudo comparando atividades das enzimas nas folhas e no caule.
73
9 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos nos experimentos pode-se
concluir que:
O método Fenda garfagem é melhor para fixação do local da enxertia e
produção de tomateiro ‘Pizzadoro’ enxertado em ‘Guardião’.
A murcha das folhas causada pela infecção de R. solanacearum reduz
as trocas gasosas em tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertado no porta-enxerto ‘Guardião’.
A enzima PAL pode ser utilizada como marcador bioquímico em
plantas de tomateiro ‘Pizzadoro’ pé-franco e enxertadas no porta-enxerto ‘Guardião’ em
resposta à infecção de R. solanacearum.
74
10 REFERÊNCIAS
AGRIANUAL. Anuário da agricultura brasileira. São Paulo: FNP – Negócios e
Consultoria, 2012. 482p.
ALSCHER, R.G.; DONAHUE, J.L.; CRAMER, C.L. Reative oxygen species and
antioxidants: Relashionships in green cells. Physiol. Plant., v. 100, p. 224-233, 1997.
ALSCHER, R.G.; ERTURK, N.; HEATH, L.S. Role of superoxide dismutases (SODs) in
controlling oxidative stress in plants. J. Exp. Bot., v. 53, n. 372, p. 1331-1341, 2002.
ALVARENGA, M.A.R. Cultivares. In: _____. (Ed.). Tomate: produção em campo, em
casa-de-vegetação e em hidroponia. Lavras: UFLA, 2004a. p.37-49.
ALVARENGA, M.A.R. Origem, botânica e descrição da planta. In: _____. (Ed.). Tomate:
produção em campo, em casa-de-vegetação e em hidroponia. Lavras: UFLA, 2004b. p. 14-
23.
ALVARENGA, M.A.R. Valor Alimentício. In: _____.(Ed.). Tomate: produção em campo,
em casa-de-vegetação e em hidroponia. Lavras: UFLA, 2004c. p.25-30.
75
AMARO, A.C.E. Efeitos fisiológicos de fungicidas no desenvolvimento de plantas de
pepino japonês enxertadas e não enxertadas,cultivadas em ambiente protegido. 2011. 86f.
Dissertação (Mestrado em Horticultura) - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade
Estadual Paulista, Botucatu, 2011.
AMERICAN ORGANIZATION OF ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods as
analysis of the association of official analytical chemistry. Washington: AOAC, 1992.
1115p.
ANGELO, P.M.; JORGE, N. Compostos fenólicos em alimentos - uma breve revisão. Rev.
Inst. Adolfo Lutz, v. 66, n. 1, p.1-9, 2007.
BEAUCHAMP, C.O.; FRIDOVICH, I. Isoenzymes of superoxidase dismutase from wheat
germ. Biochim. Biophys. Acta, v. 317, p. 50- 64, 1973.
BRANCO, R.B.F. et al.Transporte do 15N e produtividade do tomateiro enxertado irrigado
com água carbonada. Hortic. Bras., v. 25, n. 1, p. 77-81, 2007.
BRANDÃO FILHO, J.U.T.; GOTO, R.; GUIMARÃES, V.F.; HABERMANN, G.;
RODRIGUES, J.D.; CALLEGARI, O. Influência da enxertia nas trocas gasosas de dois
híbridos de berinjela cultivados em ambiente protegido. Horticultura Brasileira, Brasília, v.
21, n. 3, p. 474-477, 2003. Doi:10.1590/S0102-05362003000300012.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Métodos físico-
químícos para análise de alimentos. 4.ed. Brasília: Ministério da Saúde, 2005. 1018p.
BREUSEGEM, F.V. et al. The role of active oxygen species in plant signal transduction.
Plant Sci., n. 161, p. 405-414, 2001.
76
BUDDENHAGEN, I.W.; KELMAN, A. Biological and physiological aspects of bacterial wilt
caused by Pseudomonas solanacearum. Annu. Rev. Phytopathol., v. 2, p. 203-230, 1964.
BUENO, A.F. et al. Photosynthetic response of soybean to twospotted spider mite (Acari:
Tetranychydae) injury. Braz. Arch. Biol. Technol., , v.52, p. 825-834, n. 4, 2009.
doi:http://dx.doi.org/10.1590/S1516-89132009000400005.
BYTH, H.A.; KUUN, K.G.; BORNMAN, L. Virulence-dependent induction of Hsp70/Hsc70
in tomato by Ralstonia solanacearum. Plant Physiol. Biochem., v. 39, n. 7-8, p. 697-705,
2001. doi: http://dx.doi.org/10.1016/S0981-9428(01)01284-0.
CANÇADO-JÚNIOR, F.L. et al. Aspectos econômicos da produção e comercialização do
tomate para mesa. Inf. Agropec., v. 24, n. 219, p. 7-18, 2003.
CAÑIZARES, K.A.L. Enxertia, potássio e magnésio na nutrição, desenvolvimento e
produção de pepino. 2001. 157f. Tese (Doutorado em Agronomia/Horticultura) - Faculdade
de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista, Botuctau, 2001.
CANIZARES, K.A.L. et al. Crescimento e índices de troca gasosa em plantas de pepino
irrigadas com água enriquecida com CO2. Hortic. Bras., v. 22, n. 4, p. 706-711, 2004.
doi:http://dx.doi.org/10.1590/S0102-05362004000400008.
CARVALHO, C.R.L. et al. Análises químicas de alimentos. Campinas: ITAL, 1990. 121p.
CAVALCANTI, L.S.; BRUNELLI, K.R.; STANGARLIN, J.R. Aspectos bioquímicos e
moleculares da resistência induzida. In: CAVALCANTI, L.S. et al. (Eds.). Indução de
resistência em plantas a patógenos e insetos. Piracicaba: FEALQ, 2005. p. 81-124.
CENTRO DE QUALIDADE EM HORTICULTURA. CEAGESP. Programa brasileiro para
modernização da horticultura normas de classificação do tomate. São Paulo: Centro de
Qualidade em Horticultura/CEAGESP, 2003.
77
CHEN, Q.; WENG, Q.; HU, F. Biochemical mechanism of induced resistance to tomato
bacterial wilt with the treatment of avirulent strains of Ralstonia solanacearum. J. Fujian
Agric. Forestry Univ. (Nat. Sci.), v. 32, n. 3, p. 296-300, 2003. Disponível em
http://europepmc.org/abstract/CBA/546761. Acesso em: 7 fev. 2013.
COUTO, E.F. Resistência de algodoeiro a murcha de fusário: métodos de obtenção de
plântulas e inoculação; avaliação de germoplasmas; indução de resistência e caracterização da
atividade enzimática. 2008. Tese (Doutorado em Fitopatologia) – Universidade Federal Rural
de Pernambuco, Recife, 2008.
DEMOSTHENES, L.C.R.; BENTES, J.L.S. Fontes de resistência à murcha bacteriana em
germoplasma de Capsicum spp. do estado do Amazonas. Acta Amazôn., v. 41, n. 3, p. 435-
438, 2011.
DO, H.M. et al. Expression of peroxidase like genes, H2O2 production, and peroxidase activity
during the hypersensitive response to Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Capsicum
annuum. Mol. Plant. Microbe Int., v. 16, p. 196-205, 2003.
ENGELBERTH, J. Metabólitos secundários e defesa vegetal. In.: TAIZ, L.; ZEIGER, E.
Fisiologia vegetal. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. p. 342-372.
FEGAN, M.; PRIOR, P. How complex is the Ralstonia solanacearum species complex? In:
ALLEN, C.; PRIOR, P.; HAYWARD, A.C. (Eds.). Bacterial wilt disease and the Ralstonia
solanacearum species complex. St Paul: APS Press, 2005. p. 449-461.
FERNÂNDEZ-GARCIA, N.; CARVAJAL, M.; OLMOS, E. Graft union formation in tomato
plants: peroxidase and catalase involvement. Ann. Bot., v. 93, p. 53-60, 2004.
FILGUEIRA, F.A.R. Novo manual de olericultura: agrotecnologia moderna na produção e
comercialização de hortaliças. 3. ed. Viçosa: Edidora UFV, 2007. 421p.
78
FLORES-CRUZ, Z.; ALLEN, C. Ralstonia solanacearum Encounters an Oxidative
Environment During Tomato Infection. Mol. Plant Microbe Int., v. 22, n. 7, p. 773-782,
2009.
FONTES, R.V. et al. Atividade da redutase do nitrato e fluorescência da clorofila a em
mamoeiro. Rev. Bras. Fruticult., v. 30, n. 1, p. 251-254, 2008.
FOYER, C.H.; GALTIER, N. Source-sink interaction and communication in leaves. In:
ZAMSKI, E.; SCHAFFER, A.A. (Eds.). Photoassimilate distribution in plants and crops.
Source-sink relationships. New York: Marcel Dekker, 1996. p. 331-340.
GASPAR, T.H. et al. Peroxidases: a survey of their biochemical and physiological roles in
higher plants. Genève: Université de Genève, Centre de Botanique, 1982. 313p.
GOTO, R. Qualidade e produção de frutos de pepino japonês em função dos métodos de
enxertia. 2001. 60f. (Tese livre docência) - Faculdade de Ciências Agronômicas,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2001.
GOTO, R.; SANTOS, H.S.; CAÑIZARES, K.A.L. Enxertia em hortaliças. Botucatu: Editora
UNESP, 2003. 85p.
GRATÃO, P.L. et al. Making the life of heavy metal-stressed plants a little easier. Funct.
Plant Biol., v. 32, p. 481-494, 2005.
HAYWARD, A.C. Biology and pidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas
solanacearum. Annu. Rev. Phytopathol., v. 29, p. 65-87, 1991, 2005.
HE, Y. et al. Grafting increases the salt tolerance of tomato by improvement of photosynthesis
and enhancement of antioxidant enzymes activity. Environ. Exp. Bot., v. 66, p. 270-278,
2009.
79
HEMM, M.R. et al. Light induces phenylpropanoid metabolism in Arabidopsis roots. Plant J.,
v. 38, p. 765-778, 2004.
HIKICHI, Y. et al. Global regulation of pathogenicity mechanism of Ralstonia solanacearum.
Plant Biotechnol., v. 24, n. 1, p. 149-154, 2007.
HORWITZ, H. Official method of analysis of the association of official agricultural
chemists. 8. ed. Washington: Association of Agricultural Chemistry, 1995. p.144.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Quantidade produzida,
valor da produção, área plantada e área colhida da lavoura temporária: tomate. Rio de
Janeiro, 2007. Disponível em: http://www.sidra.ibge.gov.br. Acesso em: 12 jun. 2007.
JANICK, J. A ciência da horticultura. Rio de Janeiro: Freitas Bastos, 1966. 485p.
JOHNSON, K.B. Defoliation, disease and growth: a reply. Phytopathology, v.77, p. 1495-
1497, 1987.
KAR, M.; MISHRA, D. Catalase, peroxidase and polyphenoloxidase activities during rice leaf
senescense. Plant Physiol., v. 57, p. 315-319, 1976.
KAWARADANI, M. et al. The enzyme activities in eggplant infected with the soilborne
diseases and application to diagnosis for diseases. Ann. Phytopathol. Soc. Japan, v. 60, n. 4,
p. 507-513, 1994.
KOBORI, R.F. Controle da murcha de fitóftora (Phytophthora capsici) em pimentão
(Capsicum annuum L.) através da enxertia. 1999. 138f. Dissertação (Doutorado em
Agronomia/Proteção de Plantas) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade
Estadual Paulista, Botucatu, 1999.
80
KOBORI, R.F. Enxertia em tomateiro com um método alternativo de controle da murcha
de Verticillium e comportamento de introdução à doença. 1994. 131f. Dissertação
(Mestrado em Agronomia/Proteção de Plantas) – Faculdade de Ciências Agronômicas,
Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 1994.
LI, L.; STEFFENS, J.C. Overexpression of polyphenol oxidase in transgenic tomato plants
results in enhanced bacterial disease resistance. Planta, v. 215, p. 239-247, 2002.
LOPES, C.A. Doenças bacterianas da batata. Inf. Agropec., v. 7, p. 40-42, 1981.
LOPES, C.A.; QUEZADO-SOARES, A.M. Doenças bacterianas das hortaliças: diagnose e
controle. Brasília: Embrapa – CNPH, 1997. 70p.
LOPES, C.A.; QUEZADO-SOARES, A.M.; MELO, P.E. Differential resistance of tomato
cultigens to biovares I e III of Pseudomonas solanacearum. Plant Dis., v. 78, n. 11, p. 1091-
1094, 1994.
LOPES, C.A.; REIFSCHNEIDER, F.J.B. Manejo integrado das doenças da batata. Inf.
Agropec., v.20, p. 56-60, 1999.
LOPES, C.A.; REIS, A.; AVILA, A. C. Doenças do tomateiro para mesa, causadas por
fungos, bactérias e vírus. Inf. Agropec., v. 24, n. 219, p. 66-78, 2003.
MACEDO, A.C. Efeitos fisiológicos de fungicidas no desenvolvimento de plantas de
melão rendilhado, cultivadas em ambiente protegido. 2011. 86f. Dissertação (Mestrado em
Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista,
Botucatu, 2011.
MAKI, H.; MOROHASHI, Y. Development of polyphenol oxidase activity in the micropylar
endosperm of tomato seeds. J. Plant Physiol. v. 163, p. 1-10, 2006.
81
MALAVOLTA JUNIOR,V.A. et al. Bactérias fitopatogênicas no Brasil: uma atualização.
Summa Phytopathol., v. 34, n. esp., supl., p. 1-88, 2008.
MANDAL, S.; DAS, R. K.; MISHRA, S. Differential occurrence of oxidative burst and
antioxidative mechanism in compatible and incompatible interactions of Solanum
lycopersicum and Ralstonia solanacearum. Plant Physiol. Biochem., v. 49, n. 2, p. 117–123,
2011. doi:dx.doi.org/10.1016/j.plaphy.2010.10.006>
MEHAN, V.K. et al. Bacterial wilt of Groundnut. Patancheru: Internacional Crops
Research Institute for the Semi-Arid Tropics, 1994. 28p. (Information Bulletin, 35).
MENDONÇA, J.L. et al. Avaliação da lobeira (Solanum lycocarpum St Hill) e do
tomateiro CNPH 1048 para porta-enxertos de cultivares de tomateiro em solo infestado
com RS( R. solanacearum). 2005. Disponível em:
<http://200.210.234.180/HORTA/Download/Biblioteca/45_0446.pdf>. Acesso em: 12 out.
2011.
MISZALSKI, Z. et al. Subcellular localization and stress response of superoxide dismutase
isoforms from leaves in the C3-CAM intermediate halophyte Mesembryanthemum
crystallinum L. Plant Cell Environ., v. 21, p. 169-179, 1998.
MOLLER, I.M. Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover,
and metabolism of reactive oxygen species. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., v.
52, p. 561-591, 2001.
MURGIA, I. et al. Arabidopsis thaliana plants overexpressing thylakoidal ascorbate
peroxidase show increased resistance to paraquat-induced photooxidative stress and to nitric
oxide-induced cell death. Plant J., v. 38, p. 940-953, 2004.
NACZK, M.; SHAHIDI, F. Extraction and analysis of phenolics in food. J. Chromatogr. A,
v. 1054, n. 1-2, p. 95-111, 2004.
82
NAGATA, M.; YAMASHITA, I. Simple method for simultaneous determination of
chlorophyll and carotenoids in tomato fruit. J. Jpn. Soc. Food Sci. Techol. (Nippon
Shokuhim Kogyo Gakkaishi), n. 39, v. 10, p. 925-928, 1992.
NICHOLSON, R.L.; HAMMERSCHMIDT, R. Phenolic compounds and their role in disease
resistance. Annu. Rev. Phytopathol., v. 30, p. 369-389, 1992.
NUEZ, F. El cultivo del tomate. Madrid: Ediciones Mundi-Prensa, 2001. 793p.
NUNHEMS. Porta-enxerto guardião. Disponível em
http://nunhems.com.br/www/NunhemsInternet.nsf/CropData/BR_PT_TOF/$file/BR_TOF_Piz
zadoro.pdf. Acesso em 06-05-13.
ODA, M. New grafting methods for fruit bearing vegetables in Japan. Jpn. Agric. Res. Q., v.
29, p. 187-94, 1995.
PALANGANA, F.C. et al. Ação conjunta de citocinina, giberelina e auxina em pimentão
enxertado e não enxertado sob cultivo protegido. Hortic. Bras., v. 30, n. 4, p. 751-755, 2012.
PEIL, R. M. A enxertia na produção de mudas de hortaliças. Cienc. Rural, Santa
Maria, v.33, n.6, dez. 2003. Disponível em
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-
84782003000600028&lng=pt&nrm=iso>. Acessos em 12 abr. 2013.
http://dx.doi.org/10.1590/S0103-84782003000600028.
PEIXOTO, E.A. Aluminum effects on lipid peroxidation and on the activities of enzymes of
oxidative metabolism in sorghum. Rev. Bras. Fisiol. Veg., v.11, p.137-143, 1999.
RAO, A.V. Lycopene, tomatoes, and the prevention of coronary heart disease. Exp. Biol.
Med., v. 227, p. 908-913, 2002.
83
RESENDE, M.L.V.; SALGADO, S.M.L.; CHAVES, Z.M. Espécies ativas de oxigênio na
resposta de defesa de plantas a patógenos. Fitopatol. Bras., v. 28, n. 2, p. 123-130, 2003.
RIBEIRO, C.S.C.; CRUZ, D.M.R. Hortaliças - tendências de mercado. 2001. Disponível
em: <http://www.grupocultivar.com.br/artigos/artigo.asp?id=475>. Acesso em: 29 jan. 2010.
RIVERO, R.M. et al. Does grafting provide tomato plants an advantage against H2O2
production under conditions of thermal shock? Physiol. Plant., v. 117, p. 44-50, 2003.
SAILE, E. et al. Role of extracellular polysaccharide and endoglucanase in root invasion and
colonization of tomato plants by Ralstonia solanacearum. Phytopathology, v. 87, n. 12, p.
1264-1271, 1997.
SANTOS, H.S. Enxertia em plantas de pimentão (Capsicum annuum L.) no controle da
murcha de fitóftora (Phytophthora capsici) em ambiente protegido. 2001. 86f. Dissertação
(Mestrado em Agronomia/Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade
Estadual Paulista, Botucatu, 2001.
SANTOS, H.S.; GOTO, R. Enxertia em plantas de pimentão no controle da murcha de
fitóftora em ambiente protegido. Hortic. Bras., v. 22, n. 1, p. 45-49, 2004.
SANTOS, H.S.; WILCKEN, S.R.S.; GOTO, R. Reprodução de Meloidogyne incognita, Raça
2 em diferentes porta-enxertos de pimentão. Nematol. Bras., v. 26, n. 2, p.209-211, 2002.
SANTOS, H.S. et al. (Org.). Enxertia em hortaliças. São Paulo: Editora UNESP, 2003.
p.15-19.
SAROWAR, S. et al. Overexpression of a pepper ascorbate peroxidase-like 1 gene in tobacco
plants enhances tolerance to oxidative stress and pathogens. Plant Sci., v. 169, p. 55-63,
2005.
84
SCHMIDT, D. et al. Potencial produtivo de tomate cultivado com alta densidade, em
hidroponia. Hortic. Bras., v. 18, supl., p. 273-274, 2000.
SHAHIDI, F.; NACZK, M. Food phenolics: sources, chemistry, effects and applications.
Lancaster: Technomic, 1995.
SHAMI, N.J.I.E.; MOREIRA, E.A.M. Licopeno como agente antioxidante. Rev. Nutr., v. 17,
n. 2, p. 227-236, 2004.
SHOU, S. et al. Biochemical and physiological differences between resistant and susceptible
tomato cultivars infected by Ralstonia solanacearum Smith. J. Zhejiang Univ. Sci., n.5.
2005. Disponível em < http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTAL-
ZJNY200505007.htm>. Acesso em: 7 fev. 2013.
SHTIENBERG, D. Effects of foliar diseases on gas exchange processes: a comparative study.
Phytopathology, v. 82, p. 760-765, 1992.
SILVA, E.G. Acúmulo de nutrientes e desempenho agronômico do pimenteiro (Capsicum
annum L.) em função dos métodos de enxertia. 2012. 80f. Dissertação (Mestrado em
Agronomia/Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual
Paulista, Botucatu, 2012.
SILVA, E.S. et al. Net melon resistance to Didymella bryoniae according to grafting and
potassium levels. Summa Phytopathol., v. 38, n. 2, p.139-143, 2012.
SILVA, E.S. Porta-enxertos, concentrações de potássio na resistência à didymella
bryoniae e relações fisiológicas do meloeiro. 2010. 73f. Dissertação (Mestrado em
Agronomia/Horticultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual
Paulista, Botucatu, 2010.
SILVA, R.F.; PASCHOLATI, S.F.; BEDENDO, I.P. Indução de resistência em tomateiro por
extratos aquosos de Lentinula edodes e Agaricus blazei contra Ralstonia solanacearum.
Fitopatol. Bras., v. 32, n. 3, p. 189-196, 2007 .
85
SINGLETON, V.L.; ROSSI JR, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybidic-
phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Viticult., v. 16, p. 144-158, 1965.
SOARES, A.M.; MACHADO, O.L.T. Defesa de plantas: Sinalização química e espécies
reativas de oxigênio. Rev. Trop. Ciênc. Agrar. Biol., v.1, n.1, p. 9, 2007.
SOUZA, J.A.R.; MOREIRA, D.A.; COELHO, D.F. Crescimento e desenvolvimento de
tomateiro fertirrigado com água residuária da suinocultura. Ambi-Agua, v. 5, n. 2, 144-157,
2010.
TAKII. Porta-enxerto guardião. Disponível em http://www.takii.com.br/portaguardiao.html.
Acesso em 06-05-13.
THIPYAPONG, P.; STOUT, M.J.; ATTAJARUSIT, J. Functional Analysis of Polyphenol
Oxidases by Antisense/Sense Technology. Molecules, v. 12, p. 1569-1595, 2007.
UMESHA, S. Phenylalanine ammonia lyase activity in tomato seedlings and its relationship to
bacterial canker disease resistance. Phytoparasitica, v. 34, p. 68-71, 2006.
VÁMOS-VIGYÁZÓ, L. Polyphenoloxidase and peroxidase in fruits and vegetables. CRC
Crit. Rev. Food Sci. Nutr., v. 15, p. 49-127, 1981.
VAN LOON, L.C.; REP, M.; PIETERSE, C.M.J. Significance of inducible defencerelated
proteins in infected plants. Annu. Rev. Phytopathol., v. 44, p. 135-162, 2006.
VANITHA, S.C.; NIRANJANA, S.R.; UMESHA, S. Role of phenylalanine ammonia lyase
and polyphenol oxidase in host resistance to bacterial wilt of tomato. J. Phytopathol., v. 157,
p. 552-557, 2009.
86
WHALEN, M.C. Host defence in a developmental context. Mol. Plant Pathol., v. 6, n. 3, p.
347-360, 2005.
WHETTEN, R.; SEDEROFF, R. Lignin biosynthesis. Plant Cell., v. 7, p. 1001-1013, 1995.
WHITAKER, J.R. Polyphenol oxidase. In: FENNEMA, O.R. (Ed.). Principles of
Enzymology for the Food Sciences. New York: Marcel Dekker, 1994. p. 543-556.
WILLADINO, L. et al. Estresse salino em duas variedades de cana-de-açúcar: enzimas do
sistema antioxidativo e fluorescência da clorofila. Rev. Ciênc. Agron., v. 42, n. 2, p. 417-422,
2011. doi:http://dx.doi.org/10.1590/S1806-66902011000200022.
WILLIAMSON, L. et al. Ralstonia solanacearum race 3, biovar 2 strains isolated from
geranium are pathogenic on potato. Plant Dis., v. 86, p. 987-991, 2002.
YABUUCHI, E. et al. Transfer of two Burkholderia and an Alcaligenes species to Ralstonia
gen. nov.: proposal of Ralstonia pickettii (Ralston, Palleroni and Doudoroff, 1973) comb.
nov., Ralstonia solanacearum (Smith 1896) comb. nov. and Ralstonia eutropha (Davis 1969)
comb. nov. Microbiol. Immunol., v. 39, n. 11, p. 897-904, 1995.
YAMAKAWA, K. Use of rootstocks in solanaceous fruit vegetable production in Japan. Jpn.
Agric. Res. Q., v. 15, n. 3, p. 175-179, 1982.
YOSHIMURA, K. et al. Enhancement of stress tolerance in transgenic tobacco plants
overexpressing Chlamydomonas glutathione peroxidase in chloroplasts or cytosol. Plant J., v.
37, p. 21-33, 2004.
87
Anexos
Anexo 1. Temperatura máxima, mínima e média dentro do ambiente protegido de 23/06/2011 a 16/11/2011, UNESP/FCA/FEPP,
São Manuel, SP, 2011.
88
Anexo 2. Umidade relativa do ar máxima, mínima e média dentro do ambiente protegido de 23/06/2011 a 16/11/2011,
UNESP/FCA/FEPP, São Manuel, SP, 2011.