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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY

RIBEIRO

VAGNER RICARDO DA SILVA FIUZA

CRIPTOSPORIDIOSE EM SUÍNOS (Sus scrofa domesticus) NAS

REGIÕES NORTE E NOROESTE FLUMINENSE: DIAGNÓSTICO E

FATORES DE RISCO ASSOCIADOS AO SISTEMA DE CRIAÇÃO

Campos dos Goytacazes

2008

VAGNER RICARDO DA SILVA FIUZA

CRIPTOSPORIDIOSE EM SUÍNOS (Sus scrofa domesticus) NAS

REGIÕES NORTE E NOROESTE FLUMINENSE: DIAGNÓSTICO E

FATORES DE RISCO ASSOCIADOS AO SISTEMA DE CRIAÇÃO

Orientador: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira

Campos dos Goytacazes

2008

Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Produção Animal, na Área de Concentração de Sanidade Animal.

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 017/2008

Fiuza, Vagner Ricardo da Silva

Criptosporidiose em suínos (Sus scrofa domesticus) nas regiões Norte e Noroeste Fluminense: diagnóstico e fatores de risco associados ao sistema de criação / Vagner Ricardo da Silva Fiuza. – 2008. 65 f. : il.

Orientador: Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira Dissertação (Mestrado em Produção Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. Campos dos Goytacazes, RJ, 2008. Bibliografia: f. 55 – 63.

1. Cryptosporidium 2. Suíno 3. Morfometria 4. Fatores de risco I. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. II. Título.

CDD – 636.40896

Aos meus pais,

por todo amor e carinho

DEDICO

AGRADECIMENTOS

A Deus, por toda a luz que ilumina meus caminhos;

Aos meus pais, JORGE PESSANHA FIUZA e ANA MARIA RICARDO DA

SILVA, por serem o meu porto-seguro;

À minha namorada, LUCIANA SALLES VASCONCELOS HENRIQUES por

todo o amor, carinho e amizade que me completam, em todos os sentidos de minha

vida;

Ao técnico de nível superior Dr. LÉRIO GAMA SALES, por todo o auxílio

prestado nas coletas de material;

À amiga RACHEL INGRID JULIBONI COSENDEY, pela grande amizade

nestes últimos anos;

A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), pelas

oportunidades oferecidas;

Aos meus amigos e familiares;

Aos colegas da Graduação em Medicina Veterinária e da Pós-Graduação em

Produção Animal da UENF;

Aos estagiários e funcionários da UENF;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

pela bolsa de estudo concedida;

À Banca Examinadora, pelas sugestões, conselhos e atenção dispensada;

Ao orientador Prof. Dr. FRANCISCO CARLOS RODRIGUES DE OLIVEIRA

pelos ensinamentos e amizade, dentro e fora da vida acadêmica.

“All you need is Love”

(Lennon / McCartney, 1967)

RESUMO

FIUZA, Vagner Ricardo da Silva, M. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Fevereiro de 2008. Criptosporidiose em suínos (Sus scrofa domesticus) nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense: diagnóstico e fatores de risco associados ao sistema de criação. Professor orientador: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira. A crescente produção de carne suína no Brasil exige maiores cuidados com a saúde destes animais, principalmente relacionados a parasitoses intestinais, pois são responsáveis diretos por queda de produtividade. O presente trabalho teve como objetivo diagnosticar a presença de oocistos do gênero Cryptosporidium nas fezes de suínos criados em granjas com sistema de criação dos tipos familiar e tecnificada, localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, realizar análise morfométrica destes oocistos e estudar os principais fatores de risco associados à presença do parasito. Foram coletadas, por conveniência, 103 amostras em 10 propriedades (5 familiares e 5 tecnificadas), utilizando para diagnóstico as técnicas de Ziehl-Neelsen modificada (ZN-M) e de centrífugo-flutuação em microscopia de Contraste de Fase (CF). Foram encontrados 31,1% de animais positivos por ZN-M e 62,1% por CF, que diferiram significativamente. O maior percentual em CF é explicado, entre outros fatores, pela maior concentração de oocistos obtida pela técnica de centrífugo-flutuação. Não houve diferença significativa quanto à presença de animais positivos entre as propriedades familiares e tecnificadas, apesar das grandes diferenças de manejo encontradas. Pela Técnica de ZN-M foi observado 3,70±0,48 µm para o diâmetro maior (DM) e 3,51±0,46 µm para o diâmetro menor (dm) e 1,06±0,04 de índice morfométrico (IM), com correlação positiva, r = 0,9547. Pelo CF, observou-se 5,36±0,81 µm para o DM, 4,72±0,75 µm para o dm com IM de 1,14±0,11, com correlação positiva, r = 0,8151. A morfometria entre estas duas técnicas foi considerada estatisticamente diferente. Foram considerados para o estudo dos fatores de risco o piso das instalações, o número de animais na propriedade, a presença nas granjas de outras espécies de animais e de pessoas alheias à criação e o destino dos dejetos. Após análise dos resultados encontrados, observou-se que a deposição das fezes no ambiente, tais como lavoura e rios, após limpeza das instalações, foi o principal fator de risco associado à presença de oocistos de Cryptosporidium spp. Palavras-chave: Cryptosporidium spp.; suínos; oocisto; coccídio.

ABSTRACT

FIUZA, Vagner Ricardo da Silva, MSc., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. February; 2008. Criptosporidiosis in pigs (Sus scrofa domesticus) in the North and Northwest regions of the Rio de Janeiro State: diagnostic and risk factors associated with the production systems. Prof. Advisor: Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira. The increasing production of swine meat in Brazil demands greater care with the health of these animals, mainly related with the intestinal parasitism, therefore they are responsible for productivity fall. The purpose of this study was to verify the presence of Cryptosporidium sp. oocysts in swine farms of familiar and technical production systems, located in the North and Northwest Regions of the Rio de Janeiro State, realize the morphometric analysis of these oocysts and study the main risk factors associated with the presence of the parasite. One-hundred and three fecal samples of 10 properties were collected, of which five were familiar and five technical, using for diagnosis the modified Ziehl-Neelsen technique (ZN-M) and centrifugal-flotation in phase contrast optic microscopy (CF). Thirty-one point one percent of positive animals for ZN-M and 62.1% for CF were found, and they were statistically different. The greater percentage in CF is explained, among other factors, due the biggest concentration of oocysts obtained by the centrifugal-flotation technique. The presence of positive animals between familiar and technical farms did not have significant difference, despite the differences of handling. By the technique of ZN-M, 3.70±0.48 µm of larger diameter (DM), 3.51±0.46 µm of smaller diameter (dm) and 1.06±0.04 of index shape (IS) were observed, with positive correlation, r = 0.9547. For the CF, 5.36±0.81 µm of DM, 4.72±0.75 µm of dm and 1.14±0.11 of IS were observed, with positive correlation, r = 0.8151. The morphometric results between these two techniques were significantly different. The following risk factors were observed: the floor of the installations, the number of animals in the property, the presence of other species of animals and other people in the farms and the destination of the manure. After analysis of the observed results, it was observed that the deposition of the manure in the environment, such as farming and rivers, after cleaning of the installations, was considered the main risk factor associated with the occurrence of Cryptosporidium spp. oocysts. Key words: Cryptosporidium spp.; swines; oocysts; coccidian.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Oocisto de Cryptosporidium spp., de acordo com LINDSAY et al. (2000)....................................................................................... 17

Figura 2 Esporozoíto de Cryptosporidium spp., adaptado de SMITH et al. (2005)............................................................................................ 18

Figura 3 Ciclos de transmissão da criptosporidiose entre humanos e animais, de acordo com CACCIO et al., 2005. A seta tracejada representa as transmissões menos comuns................................. 24

Figura 4 Oocistos de Cryptosporidium spp. isolados de fezes de suínos. Em A e B, diagnóstico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada com setas indicando a parede do oocisto marcado pela fuccina. Em C e D, diagnóstico em Microscopia de Contraste de Fase com setas evidenciando os núcleos dos esporozoítas.................................................................................. 32

Figura 5 Granjas visitadas para pesquisa de oocistos de Cryptosporidium sp. em fezes de suínos nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, com destaque para parte do município de Campos dos Goytacazes-RJ. Em A, B, C, D e E, propriedades com sistema de produção do tipo Familiar; e em F, G, H, I e J, propriedades do tipo Tecnificada.................................................. 34

Figura 6 Correlação dos diâmetros maior e menor para 87 medidas de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, diagnosticado pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada, onde P <0,0001, r = 0,9547 com intervalo de confiança de 95% (0,9311 a 0,9701) e R2 = 0,9112................................................... 40

Figura 7 Correlação dos diâmetros maior e menor para 248 medidas de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, diagnosticado por Microscopia de Contraste de Fase, onde P <0,0001, r = 0,8151 com intervalo de confiança de 95% (0,7685 a 0,8530) e R2 = 0,6643................................................................

40

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Caracterização de espécies de Cryptosporidium.......................... 19

Tabela 2 Diagnóstico da presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos das Regiões Norte e Noroeste Fluminense.................................................................................... 33

Tabela 3 Diagnóstico da presença de oocisto de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos em propriedades das Regiões Norte e Noroeste Fluminense.................................................................................... 35

Tabela 4 Participação do sistema de criação na presença de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnóstico feito pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada........................................... 38

Tabela 5 Participação do sistema de criação na presença de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnóstico feito por centrifugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase................................................ 38

Tabela 6 Medidas de oocistos de Cryptosporidium sp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, observadas através de microscópio óptico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada e por microscopia de Contraste de Fase......................................................................... 39

Tabela 7 Medidas de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, corados pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada e observadas em microscópio óptico............................................ 41

Tabela 8 Medidas de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, observados em microscopia de Contraste de Fase...............................................................................................

42

Tabela 9 Participação do tipo de piso das instalações na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada................ 43

Tabela 10 Participação do tipo de piso das instalações na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase............................. 43

Tabela 11 Participação do número de animais nas propriedades relacionado à presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada....................................................................... 44

Tabela 12 Participação do número de animais nas propriedades relacionado à presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase............................................................................................... 44

Tabela 13 Participação de outras espécies de animais na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada................ 45

Tabela 14 Participação de outras espécies de animais na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase.............................

45

Tabela 15 Participação de pessoas alheias às criações na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada................ 46

Tabela 16 Participação de pessoas alheias às criações na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase............................. 46

Tabela 17 Participação do destino dado às fezes na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada................ 47

Tabela 18 Participação do destino dado às fezes na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase............................. 47

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO…………..……………………………................………… 14

2 REVISÃO DE LITERATURA………………………………….................. 15

2.1 HISTÓRICO…………..…………………………………………................. 15

2.2 GÊNERO Cryptosporidium…...……………………………….................. 17

2.3 CICLO BIOLÓGICO…………………………………………….................. 20

2.4 CRIPTOSPORIDIOSE…………………………………………................. 21

2.4.1 Criptosporidiose suína……………………………………….................. 22

2.4.2 Criptosporidiose humana……………………………………................. 23

2.5 EPIDEMIOLOGIA……………………………………………….................. 24

2.6 DIAGNÓSTICO…………………………………………………................. 26

2.7 TRATAMENTO E CONTROLE………………………………................... 26

3 MATERIAL E MÉTODOS………………………………………................ 28

3.1 LOCAIS DE EXECUÇÃO………………………………………................. 28

3.1.1 Coleta do material fecal………………………………………................. 28

3.1.2 Processamento do material fecal…………………………................... 28

3.2 ENTREVISTAS………………………………………………….................. 29

3.3 DIAGNÓSTICO…………………………………………………................. 29

3.3.1 Técnica de Ziehl-Neelsen modificada................................................ 29

3.3.2 Concentração dos oocistos................................................................ 30

3.4 MORFOMETRIA.................................................................................... 31

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................ 31

4 RESULTADOS...................................................................................... 32

4.1 DIAGNÓSTICO...................................................................................... 32

4.2 SISTEMAS DE PRODUÇÃO................................................................. 33

4.2.1 Familiar................................................................................................. 36

4.2.2 Tecnificada........................................................................................... 37

4.2.3 Familiar x Tecnificada......................................................................... 37

4.3 MORFOMETRIA.................................................................................... 38

4.4 FATORES DE RISCO............................................................................ 42

4.4.1 Piso das instalações............................................................................ 43

4.4.2 Número de animais na propriedade................................................... 44

4.4.3 Presença de outros animais............................................................... 45

4.4.4 Presença de outras pessoas na criação............................................ 46

4.4.5 Destino das fezes................................................................................. 47

5 DISCUSSÃO.......................................................................................... 48

5.1 DIAGNÓSTICO...................................................................................... 48

5.2 SISTEMAS DE PRODUÇÃO................................................................. 49

5.3 MORFOMETRIA.................................................................................... 50

5.4 FATORES DE RISCO............................................................................ 52

6 CONCLUSÕES...................................................................................... 54

7 REFERÊNCIAS..................................................................................... 55

APÊNDICE............................................................................................ 64

14

1 INTRODUÇÃO

Atualmente, o Brasil está entre os dez maiores produtores de carne suína do

mundo, com o rebanho nacional estimado em cerca 35 milhões de suínos. As

principais criações industriais brasileiras se encontram nas regiões sul e sudeste,

onde são obtidos bons níveis de produtividade através dos avanços nos

conhecimentos de genética, nutrição, reprodução, manejo e sanidade. No entanto,

esta crescente substituição do sistema extensivo pelo industrial de confinamento

propicia a proliferação e permanência de agentes patogênicos, caso sejam

empregadas técnicas inadequadas de criação. Entre estes agentes patogênicos,

destacam-se os parasitas intestinais que causam, entre outros fatores, diarréias e

retardo no crescimento, principalmente em leitões em desenvolvimento, resultando

em queda na produtividade.

A criptosporidiose é uma doença causada por um protozoário intestinal do

gênero Cryptosporidium, que pode acometer os seres humanos e diversas espécies

de animais. Parasitam preferencialmente as células epiteliais dos intestinos delgado

e grosso, causando disenterias tanto em hospedeiros imunocompetentes como nos

imunodeficientes.

Atualmente são descritas 17 espécies de Cryptosporidium, diferenciados

geneticamente, morfologicamente e quanto ao seu local de infecção. Possui um ciclo

de vida monoxeno e eurixeno, onde os oocistos infectantes são liberados juntamente

com as fezes do hospedeiro, possuindo dessa forma, uma grande capacidade de

contaminação ambiental.

Como a criptosporidiose suína geralmente ocorre de forma assintomática, a

sua presença pode passar despercebida nas criações, provocando graves perdas

econômicas, além de representar uma importante fonte de infecção para humanos e

animais que tenham contato com suas fezes, direta ou indiretamente.

O presente trabalho teve como objetivo diagnosticar a presença de oocistos

do gênero Cryptosporidium nas fezes de suínos criados em granjas com sistema de

criação dos tipos familiar e tecnificada, localizadas nas Regiões Norte e Noroeste

Fluminense, realizar análise morfométrica destes oocistos e estudar os principais

fatores de risco associados à presença do parasito.

15

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 HISTÓRICO

Os protozoários do gênero Cryptosporidium foram observados pela primeira

vez no ano de 1907 pelo pesquisador Ernest Edward Tyzzer, em células das

glândulas gástricas de camundongos, cujo nome Cryptosporidium muris foi sugerido

para este novo protozoário, de apenas 7 e 5 µm de diâmetro maior (DM) e menor

(dm), respectivamente (TYZZER, 1907, apud SMITH et al., 2005). Três anos depois,

o ciclo do C. muris foi descrito pelo mesmo pesquisador e, em 1912, Tyzzer

encontrou um protozoário semelhante ao C. muris em células das vilosidades do

intestino delgado de camundongos de laboratório. No entanto, devido à sua diferente

localização e pelos oocistos serem um pouco menores, com cerca de 4 a 5 µm de

DM, ele sugeriu o nome de uma nova espécie para o gênero Cryptosporidium: C.

parvum (TYZZER, 1912, apud por XIAO et al., 2004). Porém, somente em 1955 este

gênero foi reconhecido como uma potencial causa de enfermidades, quando Slavin

(1995) associou sua presença a frangos com casos de diarréia.

O primeiro relato de caso em humanos foi descrito por Nime et al. (1976), nos

Estados Unidos da América (EUA) em uma criança de três anos de idade que

apresentava um quadro de enterocolite aguda e severa, na qual o protozoário foi

encontrado após a realização de uma biópsia retal. Os pesquisadores sugeriram que

Cryptosporidium spp. foi o provável causador da enfermidade, baseados nas

alterações patológicas do reto, associadas aos graves sinais clínicos.

Poucos casos foram relatados a partir de então até a década de 80

(SUNNOTEL et al., 2006). Nesta década os estudos sobre a criptosporidiose

ganharam um grande impulso, resultado da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

(SIDA), uma emergente doença infecciosa que acometia os seres humanos

(CASEMORE et al., 1985). Em virtude do enfraquecimento do sistema imunológico

do indivíduo soropositivo, o protozoário se mostrou oportunista e causou casos

graves de diarréia profusa e morbidade (LAURENT et al., 1999). Inúmeros surtos

foram relatados em vários países ao redor do mundo nas décadas de 80 e 90

(FAYER et al., 2000), sendo que os três maiores surtos ocorreram nos EUA, todos

16

associados à ingestão de água contaminada. Em 1986, cerca de 12.960 pessoas

entraram em contato com o protozoário na cidade de Carrollton, Geórgia (HAYES et

al., 1989); outras 15.000 pessoas desenvolveram a enfermidade em Jackson

County, Oregon, no ano de 1992 (FROST et al., 1998); e o mais grave surto

registrado até hoje, que ocorreu em 1993 na cidade de Milwaukee, Wisconsin, onde

cerca de 403.000 pessoas (aproximadamente 25% do total de habitantes) foram

contaminadas pelo protozoário, das quais mais de 100 vieram a óbito,

principalmente idosos e pacientes soropositivos para o vírus HIV (MacKENZIE et al.,

1994). Na ocasião, foram gastos 31,7 milhões de dólares apenas em custos

médicos, sendo que o prejuízo total ao país chegou aos 96,2 milhões (CORSO et al.,

2003). A causa deste surto foi atribuída à contaminação de uma, das duas centrais

de abastecimento de água, que era responsável pela distribuição a

aproximadamente 800.000 habitantes da cidade (MacKENZIE et al., 1994).

Em 1977, Bergeland et al., apud de Graaf et al. (1999), e Kennedy et al.

(1977) relataram os primeiros casos de criptosporidiose suína. Estes últimos

observaram a presença do protozoário nas células epiteliais do intestino grosso de

três suínos durante uma necropsia. Além disso, relatou-se uma inflamação

moderada associada à infecção, porém sem sinais de enterite (KENNEDY et al.,

1977). Após estes primeiros relatos, a enfermidade passou a ser diagnosticada em

todo o mundo e, durante vários anos, a causa foi atribuída apenas ao C. parvum

(VITOVEC et al., 2006).

Somente em 1999 foi realizada a primeira caracterização molecular de

Cryptosporidium encontrados em suínos (MORGAN et al., 1999), identificando assim

dois tipos distintos de C. parvum, que diferiam tanto biologicamente quanto

geneticamente: um deles possuía o “genótipo suíno”, aparentemente espécie-

hospedeiro e que não produzia infecção em camundongos de laboratório, e um outro

que possuía o “genótipo bovino” que, por sua vez, produzia infecções nos

camundongos. Esta demonstração de infecção sugeria que os ratos poderiam atuar

como reservatórios e fontes de infecção para os suínos. Além disso, ficou provado

que os suínos também albergam o “genótipo bovino” de conhecido potencial

zoonótico, representando uma potencial fonte de infecção para humanos e animais

(MORGAN et al., 1999).

Em pesquisa posterior foram isolados dois tipos distintos do “genótipo suíno”

(RYAN et al., 2003): um deles era idêntico àquele identificado anteriormente por

17

Morgan et al. (1999), agora conhecido como Crypotosporidium genótipo suíno tipo I,

e um novo “genótipo suíno” que passou a ser chamado de Cryptosporidium genótipo

suíno tipo II. Das 28 amostras que puderam ser seqüenciadas neste estudo, os

genótipos suínos dos tipos I e II estavam presentes em números iguais (14 de cada).

No ano seguinte, Ryan et al. (2004) apresentaram justificativas de que o

Cryptosporidium genótipo suíno tipo I poderia ser considerado como uma nova

espécie. Este foi reconhecido, e passou então a ser uma espécie válida, conhecida

agora como C. suis.

2.2 GÊNERO Cryptosporidium

Cryptosporidium é um protozoário desprovido de flagelos e pseudópodes,

com oocistos de forma esferoidal a elipsóide, com diâmetros variando em média de

3,3 a 8,4 µm, pertencente ao Filo Apicomplexa, Classe Sporozoa, SubClasse

Coccidia e Família Cryptosporidiidae (ICZN, 2007). São parasitas intracelulares

obrigatórios, cujo desenvolvimento culmina na produção de um oocisto infectante

(Figura 1), que é eliminado juntamente com as fezes do hospedeiro. Estes oocistos

têm parede dupla, não possuem esporocistos, e apenas quatro esporozoítos livres

são observados em seu interior.

Figura 1: Oocisto de Cryptosporidium spp., de acordo com LINDSAY et al. (2000).

18

Os esporozoítos (Figura 2) têm em média 3,8 - 5,2 x 0,6 - 1,2 µm de

comprimento e largura, respectivamente, e possuem um formato de vírgula com

duas extremidades claramente distintas, nas quais a apical é estreita e a posterior é

arredondada. Possuem um único núcleo oval em sua porção posterior e vários

microtúbulos que percorrem o corpo do esporozoíto longitudinalmente, presos aos

anéis polares localizados na porção apical. Estes microtúbulos têm fundamental

importância na excistação e no âncoramento e invasão da célula alvo (SMITH et al.,

2005).

Figura 2: Esporozoíto de Cryptosporidium spp., adaptado de SMITH et al. (2005).

Até o presente momento são descritas 17 espécies de Cryptosporidium

(SUNNOTEL et al., 2006), cujos hospedeiros, locais de infecção e respectivos

tamanhos estão apresentados na Tabela 1.

19

Tabela 1: Caracterização de espécies de Cryptosporidium1.

Criptosporidium spp. Hospedeiro Órgão / Tecido Parasitado

Tamanho dos oocistos (µm)2

C. andersoni Bovinos Abomaso 5,5 x 7,4 C. baileyi Aves domésticas Bursa de Fabricius 4,8 x 6,4 C. bovis Bovinos Intestino 4,6 x 4,9 C. canis Cães Intestino 4,7 x 4,9 C. felis Gatos Intestino 4,0 x 4,6 C. galli Aves Proventrículo 6,3 x 8,5 C. hominis Humanos Intestino 4,9 x 5,2 C. meleagridis Aves silvestres Intestino 4,4 x 5,0 C. molnari Peixes Estômago 4,5 x 4,7 C. muris Roedores Estômago 4,6 x 8,4 C. nasorum Peixes Intestino 4,5 x 4,7 C. parvum Bovinos, Homem Intestino 4,5 x 5,0 C. saurophilum Lagartos Intestino 4,7 x 5,0 C. scophithalmi Peixes Intestino 3,0 x 5,0 C. serpentis Serpentes Estômago 5,3 x 6,2 C. suis Suínos Intestino 4,4 x 5,1 C. wrairi Cobaio Intestino 4,6 x 5,4 1 segundo SUNNOTEL et al. (2006) 2 em média, dos diâmetros menor e maior respectivamente.

Os oocistos do gênero Cryptosporidium estão entre os menores estágios

exógenos do filo apicomplexa, cujo tamanho torna inviável a distinção entre espécies

baseando-se apenas em suas características morfológicas (FALL et al., 2003). Além

disso, a diferença entre tamanhos dos oocistos de espécies diferentes é muito

pequena ou nenhuma (FAYER et al., 2000).

Para o estabelecimento de uma nova espécie, pelo menos quatro condições

devem ser satisfeitas (RYAN et al., 2004): 1) devem ser realizados estudos

morfométricos; 2) o protozoário deve ser caracterizado geneticamente; 3) deve

haver uma demonstração de uma especificidade com um hospedeiro, natural ou

experimentalmente; e 4) estar de acordo com o Código Internacional de

Nomenclatura Zoológica.

20

2.3 CICLO BIOLÓGICO

O gênero Cryptosporidium possui um ciclo de vida monoxeno e eurixeno, que

inclui estágios de multiplicação assexual e de reprodução sexual (LAURENT et al.,

1999). A fase endógena é iniciada após a ingestão do oocisto e do rompimento de

sua parede devido às ações da temperatura e dos compostos gástricos, liberando os

esporozoítos que migram para as células do trato gastrintestinal (MULLER, 1999).

Este é englobado pela membrana celular, formando um vacúolo intracelular, porém

extracitoplasmático, no qual os esporozoítos se diferenciam em trofozoítos. Esta

peculiaridade de infecção confere grande proteção aos agentes antimicrobianos, ao

mesmo tempo em que é suprido de energia e nutrientes da célula hospedeira

(TZIPORI e WARD, 2002). No entanto, os mecanismos de penetração celular ainda

não estão completamente elucidados (ELLIOT et al., 2001).

Os trofozoítos se multiplicam por divisão do núcleo (esquizogonia), dando

origem a merontes multinucleados do tipo 1, formando seis a oito merozoítos no seu

interior que, após liberação, infectam as células adjacentes desenvolvendo-se em

novos merontes. Estes merozoítos também podem dar origem a merontes do tipo 2,

que por sua vez liberam quatro merozoítos que darão início ao ciclo sexuado

(gametogonia). Após infecção de novas células, ocorre diferenciação destes

merozoítos em macrogametócitos e em microgametócitos; estes sofrem divisão

nuclear, dando origem a vários microgametas que são liberados do vacúolo e

fertilizam, individualmente, um macrogametócito (SMITH et al., 2005). Em casos de

infecção mista, ou seja, infecções com mais de um genótipo de Cryptosporidium

spp. simultaneamente, existe a possibilidade de um microgameta de um genótipo

fertilizar um macrogametócito de outro genótipo diferente e, conseqüentemente

haver recombinação sexual, que origina novos genótipos contendo características

provenientes das duas linhagens parentais (FENG et al., 2002).

Após a formação do zigoto, ocorre um processo de divisão celular por meiose,

que forma quatro esporozoítos no seu interior, dando origem aos oocistos

esporulados, que são liberados na luz intestinal já com capacidade de causar novas

infecções. Estes oocistos podem ser de parede espessa, que são eliminados para o

meio externo juntamente com as fezes do hospedeiro reiniciando a fase exógena do

ciclo (FAYER et al., 2000), ou de parede delgada, que podem romper-se no próprio

21

intestino do hospedeiro, causando uma auto-infecção (MULLER, 1999). Dessa forma

em pacientes imunossuprimidos, nos quais o sistema imunológico não tem forças

para combater a doença, o parasitismo pode permanecer por um longo período de

tempo sem que o indivíduo precise ser exposto novamente a um oocisto (de GRAAF

et al., 1999).

2.4 CRIPTOSPORIDIOSE

A criptosporidiose pode acometer os seres humanos e diversas espécies de

animais (GUSELLE et al., 2003), nas quais os protozoários parasitam, em sua

grande maioria, as células epiteliais do intestino delgado, causando a enfermidade

tanto em hospedeiros imunocompetentes como nos imunodeficientes

(BRACARENSE et al., 1999; RYAN et al., 2004). Porém, pesquisas demonstram que

pacientes imunossuprimidos, jovens e idosos são mais suscetíveis à parasitose

(SUNNOTEL et al., 2006). A principal sintomatologia clínica da criptosporidiose é

uma diarréia autolimitante que, se for prolongada, pode resultar em morbidade

grave, desidratação, anorexia, perda de peso, febre e nos casos mais graves, a

morte (LAURENT et al., 1999).

Esta doença, assim como a giardíase, pode ser considerada como a causa

mais comum de diarréia causada por protozoários em todo o mundo, tanto em

países desenvolvidos quanto aqueles em desenvolvimento (CACCIO et al., 2005). A

transmissão ocorre pela ingestão de oocistos através de comidas e águas

contaminadas, contato com pessoas ou animais infectados e superfícies

contaminadas (CACCIO et al., 2005; FAYER et al., 2000). Estes oocistos mantêm

sua infectividade no ambiente externo por vários meses, principalmente em águas e

ambientes com elevado grau de umidade (SUNNOTEL et al., 2006).

Widmer (1998) comprovou, através de técnicas de biologia molecular, que

uma mesma espécie de Cryptosporidium pode acometer humanos e animais, o que

torna o estudo epidemiológico da criptosporidiose um trabalho extremamente

complexo.

22

2.4.1 Criptosporidiose suína

Até o presente momento, três espécies de Cryptosporidium já foram isoladas

de suínos: C. suis, C. parvum e C. muris, além do Cryptosporidium genótipo suíno

tipo II. Destas, as mais prevalentes em suínos são C. suis e Cryptosporidium

genótipo suíno tipo II (SUÁREZ-LUENGAS et al., 2007; XIAO et al., 2006). Zintl et al.

(2007) observaram que, de 29 amostras de fezes, 14 eram positivas para C. suis; 11

positivas para o “genótipo suíno” tipo II; 1 positiva para C. muris e 2 para C. parvum,

estes possuindo filogenia 99% homóloga a outros C. parvum já isolados de bovinos,

ratos e seres humanos. Foi isolado ainda, de um único animal, um outro genótipo

ainda desconhecido que, de acordo com sua filogenia, é semelhante ao C. parvum.

De acordo com Fayer et al. (2000), os suínos podem ser considerados como

potenciais fontes de infecção para pessoas e outros animais que possam vir a ter

contato com suas fezes.

Quando ocorre de forma natural, a infecção geralmente se apresenta de

forma assintomática ou com poucas alterações clínicas no animal (QUÍLEZ et al.,

1996; VITOVEC et al., 2006). Por outro lado, estas infecções podem causar redução

no ganho de peso, principalmente nos animais mais jovens (BILIC e BILKEI, 2006),

e aumentar a suscetibilidade a outras infecções, pois, segundo Enemark et al.

(2003), não há dúvidas de que Cryptosporidium atua como um patógeno secundário,

agravando os quadros patológicos de etiologia multifatorial. Sinais clínicos, tais

como diarréia aquosa e anorexia foram observadas através de infecção

experimental, 4 a 6 dias pós-infecção por C. suis, em suínos de dois dias de idade

(ENEMARK et al., 2003).

Segundo Suárez-Luengas et al. (2007), a idade parece não influenciar na

infecção em suínos, ao contrário do que ocorre nos bovinos (SANTIN et al., 2004)

pois, em sua pesquisa, os autores diagnosticaram o parasitismo em animais de

todas as idades. No entanto, a idade do animal pode ter relação com o grau de

infecção apresentado. Guselle et al. (2003) realizaram coletas de fezes semanais de

33 suínos, desde o desmame até que alcançassem o peso de abate, aos seis meses

de idade. Os oocistos foram observados nas fezes de todos os animais da nona à

décima quinta semana de vida, em média, e o número de oocistos encontrados foi

reduzindo com o avançar da idade. Outra pesquisa demonstrou o auge da

23

eliminação de oocistos em animais de 4 a 10 semanas de vida e, assim como na

pesquisa citada anteriormente, o número de oocistos foi decrescendo à medida que

o animal envelhecia (ZINTL et al., 2007).

2.4.2 Criptosporidiose humana

A principal sintomatologia da criptosporidiose humana em hospedeiros

imunocompetentes é uma diarréia autolimitante durando cerca de 10 a 14 dias e,

caso o paciente tenha uma debilidade em seu sistema imunológico, a doença pode

assumir maiores proporções, com conseqüências mais graves como diarréias

aquosas, desidratação, dor abdominal, náuseas, febres, gastroenterites e morte

(LAURENT et al., 1999).

Entre os grupos de pessoas com mais riscos de adquirir a doença estão

crianças, idosos, portadores da SIDA e de outras doenças infecciosas,

transplantados, aqueles em tratamento com quimioterápicos e as que têm contato

próximo com animais que estejam eliminando oocistos nas fezes (FAYER et al.,

2000; SUNNOTEL et al., 2006).

Das 17 espécies reconhecidas de Cryptosporidium, pelo menos 7 delas já

foram diagnosticadas em humanos (C. hominis, C. parvum, C. suis, C. felis, C.

muris, C. canis e C. meleagridis) e, dentre estas, o C. hominis e o C. parvum são as

mais comumente associadas à criptosporidiose humana (CACCIO et al., 2005;

MEAMAR et al., 2007). Na Inglaterra, de 2.414 casos confirmados, 41,7% foram

causados pelo C. hominis e 56,1% pelo C. parvum (LEONI et al., 2006). Em outro

estudo recente, de 58 crianças que apresentavam diarréia causada por

Cryptosporidium, em 47 (81%) foram identificadas C. hominis e em 7 delas (12,1%)

C. parvum foi isolado (AJJAMPUR et al., 2007).

A transmissão zoonótica é de primordial importância no estudo da

criptosporidose em humanos, uma vez que C. parvum é encontrado em uma ampla

variedade de espécies (XIAO et al., 2004). Os ciclos de transmissão entre humanos

e animais estão representados na figura 3.

24

ANIMAIS HUMANOS HUMANOS ANIMAIS

Figura 3: Ciclos de transmissão da criptosporidiose entre humanos e animais, de acordo com CACCIO et al., 2005. A seta tracejada representa as transmissões menos comuns.

Em uma pesquisa realizada em Porto Alegre, RS, Brasil, foram entrevistados

91 médicos de diferentes especialidades através de questionários, na qual 83

(91,2%) admitiram necessitar de maiores conhecimentos sobre a doença

(WIEBBELLING et al., 2002). Dessa forma, acredita-se que os casos diagnosticados

da doença representam apenas uma pequena fração do total que ela realmente

ocorre (FAYER et al., 2000).

2.5 EPIDEMIOLOGIA

O gênero Cryptosporidium possui importantes características que influenciam

diretamente em sua epidemiologia, das quais podem ser citados: a pequena

quantidade de oocistos necessários para causar infecção (de um a dez oocistos são

suficientes, em média); a liberação de oocistos esporulados já infectantes pelo

hospedeiro e a sua estabilidade no ambiente (CACCIO et al., 2005).

Vários insetos já foram relacionados à transmissão de oocistos (FAYER et al.,

2000). Em um estudo com moscas domésticas sob condições laboratoriais, Graczyk

et al. (1999) detectaram oocistos na superfície externa destas após terem contato

com fezes bovinas que continham oocistos de C. parvum. Resultado semelhante

também foi encontrado em abelhas por outros pesquisadores (MATHISON e

DITRICH, 1999). Zerpa e Huicho (1994), por sua vez, identificaram oocistos no trato

gastrintestinal de baratas, que foram encontradas no esgoto de uma casa onde

residia uma criança com criptosporidiose.

A dispersão dos oocistos pelo ambiente pode fazer com que a água e

alimentos utilizados no consumo humano venham a ser contaminados. A

C. parvum C. hominis

C. suis, C. felis, C. muris

C. canis, C. meleagridis

25

contaminação de águas potáveis é uma das grandes preocupações em saúde

pública, visto que os maiores surtos de criptosporidiose já registrados foram devido a

essa forma de contaminação (LAURENT et al., 1999).

A água recreacional, como piscinas, onde várias pessoas têm acesso ao

mesmo tempo, também tem importante papel na epidemiologia da doença, pois

mesmo sob ótimas condições de manutenção, não é possível prevenir com

segurança a disseminação de oocistos na água, devido à sua resistência ao cloro

(CARPENTER et al., 1999).

Os alimentos podem ser contaminados de diversas formas tais como

utilização de água de irrigação contaminada, uso de fezes de animais positivos

como adubo, mãos de trabalhadores com pouca higiene, exposição ao ar em

plantações e mercados, entre outras (SMITH et al., 2007). A presença de oocistos

em alimentos já foi demonstrada em diversas pesquisas, nas quais sempre foi

ressaltada essa fundamental forma de transmissão (BIER, 1991; MONGE e

CHINCHILLA, 1996; SILVA et al., 2005). No Brasil, Silva et al. (2005) identificaram

oocistos em alfaces comercializadas in natura no Recife, PE, onde, de 12 unidades

estudadas, 4 (33,3%) continham oocistos de Cryptosporidium spp. em suas folhas.

A criação consorciada de animais de espécies diferentes se destaca devido

aos seus vários pontos positivos. Um exemplo de criação consorciada de

comprovado sucesso é a integração da suinocultura com a piscicultura, na qual se

aproveitam as fezes dos suínos nos tanques de peixes obtendo-se resultados

positivos em ambas as criações, tais como redução do impacto ambiental que é

provocado pelas fezes dos suínos, alimentação direta para os peixes, favorecimento

do crescimento do plâncton e fertilização natural e de baixo custo para o produtor

(PALHARES, 2005). Neste sistema, os suínos são preferencialmente criados em

instalações de piso ripado e construídos sobre os tanques, dos quais as fezes caem

diretamente na água (LOPERA-BARRERO et al., 2006). Entretanto, sabe-se que os

suínos são importantes reservatórios da criptosporidiose e que a presença de

animais positivos pode contribuir para a disseminação da doença para o ambiente e

outros animais.

Estudos relacionados à resistência dos oocistos sob diferentes condições de

temperatura revelam que, a 20ºC muitos oocistos permanecem infecciosos por até 6

meses, enquanto que, de 25 a 30ºC, sua infectividade é diminuída a apenas 3

meses (ANDERSON, 1985; FAYER et al., 1998). Tanto em altas (71,7ºC) quanto

26

baixas (-70ºC) temperaturas, os oocistos são destruídos em poucos segundos

(HARP et al., 1996).

2.6 DIAGNÓSTICO

O diagnóstico comumente é feito através da observação direta dos oocistos

nas fezes dos animais. São utilizadas técnicas de centrífugo-flutuação em solução

saturada de sacarose seguida de microscopia de contraste-de-fase, e técnicas

colorimétricas, tais como Giemsa e Ziehl-Neelsen, que tem como princípio a

concentração por sedimentação (BOMFIM e LOPES, 1994). Entretanto, apesar de

detectarem com eficiência a presença dos oocistos nas fezes dos animais, estas

técnicas não possibilitam a identificação da espécie envolvida (SUNNOTEL et al.,

2006).

Para diferenciação das espécies de Cryptosporidium encontradas nas fezes é

necessária a realização de uma análise molecular dos oocistos, na qual seu DNA é

extraído e em seguida analisado geneticamente pelo método da Reação em Cadeia

pela Polimerase (PCR) (ENEMARK et al., 2003).

Outras técnicas, tais como o Ensaio Imunoabsorvente de Ligação de Enzimas

(ELISA), que detecta coproantígenos em fezes, e Imunofluorescência Direta (IFD),

que utiliza anticorpos monoclonais anti-Cryptosporidium marcados, também podem

ser utilizadas para o diagnóstico. No entanto, estas técnicas são pouco comuns em

países em desenvolvimento (SUNNOTEL et al., 2006).

2.7 TRATAMENTO E CONTROLE

Até o presente momento não existem drogas de efeito consistente para o

tratamento e controle da criptosporidiose humana e animal (MEAMAR et al., 2006).

O antiparasitário nitazoxanida foi aprovado recentemente nos EUA para o

tratamento da doença em pessoas imunocompetentes (SUNNOTEL et al., 2006),

entretanto o seu efeito em imunossuprimidos ainda não está claro (CDC, 2007).

27

Em criações de animais de produção devem ser adotadas medidas visando à

prevenção da parasitose, tais como isolamento dos animais doentes, evitar super

lotação, evitar fornecimento de alimentos in natura, não permitir contato com animais

de outras espécies, limpeza das instalações, amamentação do colostro, ter um

destino adequado para as fezes, higiene dos tratadores, entre outras (SESTI et al.,

1998). Tais medidas dificilmente irão erradicar a criptosporidiose da criação, porém

certamente vão contribuir para que a doença se mantenha em um baixo nível de

prevalência (MADDOX-HYTELL et al., 2006). Além disso, cuidados na manipulação

de alimentos são medidas igualmente importantes na prevenção da criptosporidiose

(de GRAAF et al., 1999).

28

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 LOCAIS DE EXECUÇÃO

3.1.1 Coleta do material fecal

Foram selecionadas, por conveniência, 10 granjas de criação de suínos das

Regiões Norte e Noroeste Fluminense, localizadas nos municípios de Campos dos

Goytacazes e Itaperuna, respectivamente, que possuíam sistema de criação do tipo

familiar ou tecnificada. Suas coordenadas foram obtidas por um aparelho de Sistema

de Posicionamento Global (GPS)1. Um total de 103 amostras foi coletado

diretamente do solo, após o animal defecar (VÍTOVEC et al., 2006), tendo-se o

cuidado de coletar as partes que não estivessem diretamente em contato com o

piso. Para tanto, foram utilizados sacos plásticos individuais que, após a coleta,

foram numerados, identificados e acondicionados em caixas isotérmicas para

transporte ao laboratório a 8-10 oC.

3.1.2 Processamento do material fecal

O material coletado foi processado no Hospital Veterinário da Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Setor de Clínica Médica do Laboratório

de Sanidade Animal, do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias.

1 eTrex GARMIN®

29

3.2 ENTREVISTAS

Os proprietários e/ou responsáveis pelas propriedades foram entrevistados

através de questionários (Apêndice), com intuito de se avaliar o tipo de produção e

criação, além de possíveis fatores de risco associados à presença de oocistos de

Cryptosporidium spp. nas fezes de suínos.

3.3 DIAGNÓSTICO

Para diagnóstico da presença de oocistos nas fezes coletadas de suínos,

foram utilizadas duas técnicas: a Técnica de Ziehl-Neelsen modificada (ZN-M), que é

uma técnica colorimétrica baseada em concentração por sedimentação (RITCHIE,

1948, modificada por ALLEN e RIDLEY, 1970), e a técnica de isolamento dos

oocistos através de centrífugo-flutuação (SHEATHER, 1923), com posterior

observação dos oocistos em microscopia óptica de Contraste de Fase (CF).

3.3.1 Tecnica de Ziehl-Neelsen modificada

Foram utilizadas três gramas2 de fezes de cada animal; essas foram

acondicionadas em tubos plásticos tipo “Falcon” cônicos com tampa rosquiavel e

identificadas individualmente. Em seguida foram adicionadas 10 ml de solução de

formol a 10% em água destilada para fixação do material para posterior coloração.

As amostras foram filtradas em camada dupla de gaze onde o filtrado, cerca

de 7 a 8 ml de cada solução, foi transferido para novos tubos cônicos de 15 ml. A

estes foram adicionados 4 ml de éter etílico e a solução de cada tubo foi

homogeneizada em agitador de tubos tipo “Vortex”3, onde em seguida foram

2 Balança digital GEHAKA® BK3000 3 PHOENIX® AP 56

30

centrifugadas4 a 500g por 10 minutos. Após esta etapa foram visualizadas quatro

diferentes fases, onde todo o sobrenadante de cada tubo foi descartado.

Os esfregaços em lâminas foram feitos a partir dos sedimentos restantes,

com o auxílio da parte romba de palitos de madeira, executando-se movimentos

circulares. As lâminas foram secas em temperatura ambiente por aproximadamente

duas horas. Após este período, foram fixadas com metanol absoluto por cinco

minutos e deixadas secar, inclinadas, por 15 minutos em temperatura ambiente.

Foi então colocada por sobre todas as lâminas, solução de fucsina5, por cinco

minutos, e em seguida, lavadas com álcool etílico a 50% e depois em água corrente.

As lâminas foram então submersas por duas a quatro vezes em álcool ácido a 1%5 e

posteriormente, lavadas em água corrente. Finalmente uma solução de azul de

metileno5 foi colocada por sobre as lâminas por três minutos; e estas foram

novamente lavadas em água corrente e secas à temperatura ambiente.

As lâminas coradas e secas foram montadas com duas gotas de bálsamo-do-

Canadá sintético6 e lamínula que, após um período de secagem completa, foram

observadas em microscópio óptico em objetiva de 100x (imersão).

Os oocistos presentes nas laminas positivas foram submetidos à análise

morfométrica.

3.3.2 Concentração dos oocistos

De cada amostra foram diluídos 15 gramas de fezes em 50 ml de água

destilada7. Esta solução foi filtrada em camada dupla de gaze e posteriormente em

tamis com 325 malhas de aço por polegada, e o filtrado centrifugado em seguida por

10 minutos a 250g em tubos cônicos de 50 ml. Após esta etapa o sobrenadante foi

descartado, e o sedimento ressuspendido em água destilada até alcançar um

volume de 25 ml; logo após foram adicionados 25 ml de solução de sacarose6

(1,1g/ml) e depois de realizada a homogeneização da solução os tubos foram

novamente centrifugados a 250g por 20 minutos.

4 Centrífuga RDE® 36-88 5 Conjunto para coloração de Ziehl Neelsen NEWPROO 6 VETEC®

7 Destilador QUIMIS® Q341-25

31

Foram aspirados 4 ml do sobrenadante e pipetados em tubos cônicos para

centrífuga, onde foi adicionada água destilada para que fosse obtido o volume final

de 15 ml em cada tubo; esta solução foi centrifugada a 250g por 10 minutos e o

sobrenadante descartado logo em seguida. O sedimento foi então ressuspendido em

500 µl de água destilada, do qual foi extraída uma gota que foi examinada entre

lâmina e lamínula, em CF para a análise morfométrica dos oocistos.

3.4 MORFOMETRIA

A análise morfométrica dos oocistos foi realizada utilizando-se um

microscópio óptico binocular digital8 e software de análise de imagens9, onde foram

mensurados o DM e o dm dos oocistos corados pela técnica de ZN-M e por CF. O

índice morfométrico (IM) foi obtido após divisão do DM sobre o dm.

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para verificar a associação entre as variáveis foram utilizados o teste t, além

do teste estatístico do Chi-quadrado (χ2) ou Teste exato de Fischer para análise dos

fatores de risco, com intervalo de confiança de 95% (PIMENTEL GOMES, 2000).

8 Marca OPTON®, modelo TNB-04D® 9 Microscopy Image Processing System-DN2® para Windows®

32

4. RESULTADOS

4.1 DIAGNÓSTICO

Os resultados obtidos para o diagnóstico por ZN-M e CF (Figura 4) diferiram

significativamente (Tabela 2).

Figura 4: Oocistos de Cryptosporidium spp. isolados de fezes de suínos. Em A e B, diagnóstico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada com setas indicando a parede do oocisto marcado pela fucsina. Em C e D, diagnóstico em microscopia de Contraste de Fase com setas evidenciando os núcleos dos esporozoítas.

33

Tabela 2: Diagnóstico da presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos das Regiões Norte e Noroeste Fluminense.

Variáveis Criação

χχχχ2 a

Valor de P

Risco relativo

(Rr)

Intervalo de confiança

(95%)b Positiva Negativa

Ziehl-Neelsen

modificada

32 (31,1%)

71 (68,9%)

18,747 <0,0001 1,821 1,377-2,407 Contraste de Fase

64 (62,1%)

39 (37,9%)

a Com correção de Yates. b Com aproximação de Katz.

4.2 SISTEMAS DE PRODUÇÃO

Um total de 10 granjas de criação de suínos foi visitado, do qual cinco era de

sistema de produção do tipo familiar e cinco do tipo tecnificada (Figura 5; Tabela 3).

34

Figura 5: Granjas visitadas para pesquisa de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, com destaque para parte do município de Campos dos Goytacazes-RJ. Em A, B, C, D e E, propriedades com sistema de produção do tipo Familiar; e em F, G, H, I e J, propriedades do tipo Tecnificada.

35

Tabela 3: Diagnóstico da presença de oocisto de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos em propriedades das Regiões Norte e Noroeste Fluminense.

1 número de amostras examinadas 2 Técnica de Ziehl-Neelsen modificada 3 microscopia óptica de Contraste de Fase

PROPRIEDADES Cryptosporidium spp.

Sistema de

Criação Coordenadas

n1

Positivos

ZN-M2 CF3

A Familiar 21°45'37.24"S

41°17'27.46"O

10 8 (80%) 5 (50%)

B Familiar 21°45'37.39"S

41°17'31.81"O

10 5 (50%) 4 (40%)

C Familiar 21°45'38.35"S

41°17'25.53"O

10 5 (50%) 3 (30%)

D Familiar 21°44'26.35"S

41°20'39.07"O

10 2 (20%) 10 (100%)

E Familiar 21°44'24.63"S

41°20'41.69"O

10 0 8 (80%)

F Tecnificada 21°42'40.09"S

41°20'29.10"O

10 4 (40%) 9 (90%)

G Tecnificada 21°57'39.72"S

41°07'54.98"O

16 4 (25%) 13 (81%)

H Tecnificada 21°09'24.72"S

42°07'55.86"O

16 1 (6%) 5 (31%)

I Tecnificada 21°09'54.48"S

42°05'35.63"O

7 0 4 (57%)

J Tecnificada 21°06'36.30"S

41°56'44.15"O

4 3 (75%) 3 (75%)

TOTAL 103 32 (31,1%) 64 (62,1%)

36

4.2.1 Familiar

As propriedades familiares observadas neste estudo são criações rústicas de

suínos localizadas bem próximas às residências dos donos/criadores, ou dividindo o

mesmo terreno de suas casas. Em todas estas propriedades familiares visitadas não

há qualquer forma de acompanhamento veterinário. Os animais não são vacinados e

a everminação, quando ocorre, é esporádica e sem qualquer critério de intervalos

entre aplicações, princípios-ativos ou diagnóstico prévio das espécies de

parasitismo. Na alimentação são utilizados restos de alimentos hortifrutigranjeiros

obtidos de descarte de supermercados e do chão do mercado público municipal (que

após uma mistura são chamados popularmente de “lavagem”). Algumas criações

utilizam sobras de açougue e abatedouros incluindo sebo e ossos de bovinos e

vísceras de aves. Estes são cozidos em latões e depois de misturados são

oferecidos aos animais. Ocasionalmente são incluídos farelos de trigo às misturas,

mas nunca são utilizadas rações comerciais ou de fabricação própria.

Os suínos são separados em diferentes baias por sexo a partir do desmame,

porém, não há uma divisão criteriosa entre as diversas faixas-etárias. Assim, os

animais jovens são separados dos adultos de acordo com a conveniência do

tratador. O estado geral destes animais encontrava-se de bom a regular, nos quais

os principais achados clínicos observados foram lesões de pele, diarréia e tosse.

Também foram observados alguns casos de prostração e alterações no Sistema

Nervoso Central (SNC).

Os dejetos eram eliminados no rio Paraíba do Sul sem qualquer tipo de

tratamento, juntamente com a água utilizada na lavagem das instalações. Os pisos

são de alvenaria e/ou terra, onde os animais têm acesso aos dois tipos de piso

quando presentes em uma mesma propriedade.

Devido ao fato destas criações se localizarem próximas a residências, é

comum a presença de pessoas alheias à produção no entorno das instalações,

incluindo crianças e adultos. Também é constante a presença de outras espécies de

animais tais como cães, gatos e aves, além de ratos que circulam com mais

intensidade durante a noite, segundo relatos dos próprios criadores.

Os animais são vendidos para o comércio local como açougues, mercados e

supermercados próximos, quando atingem cerca de 70 kg de peso.

37

4.2.2 Tecnificada

As propriedades tecnificadas estudadas nesta pesquisa são criações

empresariais ou pré-empresariais exclusivas para a criação de suínos, que

apresentam instalações adequadas para o desenvolvimento das atividades até a

terminação destes, com pisos de alvenaria predominante, presença de

acompanhamento veterinário e alimentação a base de ração comercial ou de

produção própria, mas com formulação técnica, e que durante a fase de creche são

suplementadas com coccidiostáticos. As fezes são destinadas a lagoas de

estabilização, construídas na maioria das propriedades visitadas.

Os animais são separados de acordo com sua faixa-etária da seguinte forma:

reprodutores e matrizes (utilizados em monta natural); maternidade; creche;

desmame; crescimento e terminação.

A vacinação é feita segundo a assistência veterinária e a everminação ocorre

ao desmame e quando o animal chega às baias de terminação. Os animais recebem

uma suplementação de Ferro (injetável) aos três dias de vida e no desmame, e

apresentavam-se saudáveis de uma forma geral. No entanto, alguns casos de

diarréia esporádicas em leitões foram relatados.

Apesar dos cuidados quanto à presença de outras pessoas, que não os

tratadores nas instalações, foi observada a presença de cães e gatos bem próximos

aos suínos em algumas destas propriedades.

Os animais são abatidos em frigoríficos e vendidos para açougues e

supermercados do município e cidades vizinhas ao final da fase de terminação.

4.2.3 Familiar x Tecnificada

Foi observada uma alta prevalência de Cryptosporidium spp. em fezes de

suínos em ambos os sistemas de criação, não havendo diferença significativa entre

elas nas duas técnicas de diagnóstico empregadas (Tabelas 4 e 5).

38

Tabela 4: Participação do sistema de criação na presença de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnóstico feito pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada.


χχχχ2 a

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Familiar 20

(40,0%) 30

(60,0%) 2,855 0,0911 0,7756 0,5926-1,015

Tecnificada 12

(29,3%) 41

(70,7%) a Com correção de Yates. b Com aproximação de Katz.

Tabela 5: Participação do sistema de criação na presença de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnóstico feito por centrifugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase.


χχχχ2 a

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Familiar 30

(60,0%) 20

(40,0%) 0,0533 0,8174 1,116 0,6801-1,831

Tecnificada 34

(64,1%) 19

(35,9%) a Com correção de Yates. b Com aproximação de Katz.

4.3 MORFOMETRIA

Foi constatado maiores dimensões dos oocistos observados em CF, quando

comparados com a Técnica de ZN-M. O índice morfométrico dos oocistos

diagnosticados por ZN-M ficou próximo de 1, diferindo estatisticamente do índice

morfométrico diagnosticado através de CF (Tabela 6).

39

Tabela 6: Medidas de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de

criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, observadas através de microscópio óptico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada e por microscopia de Contraste de Fase.

a valores entre parênteses são as medidas máximas e mínimas observadas Teste t de student a 95% de intervalo de confiança

Foi observada uma correlação extremamente significativa entre as medidas

do DM e dm tanto para o diagnóstico por ZN-M como para CF (Figuras 6 e 7).

Técnica n

Diâmetros (µm) Índice Morfométrico

maior menor

Ziehl-Neelsen modificada

87 3,70±0,48

(5,04-3,01)a

3,51±0,46

(4,70-2,88)

1,06±0,04

(1,17-1,00)

Contraste de Fase

248 5,36±0,81

(7,08-3,23)

4,72±0,75

(6,92-3,03)

1,14±0,11

(1,56-1,00)

Valor de P <0,0001 <0,0001 <0,0001

40

Figura 6: Correlação dos diâmetros maior e menor para 87 medidas de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, diagnosticado pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada, onde P <0,0001, r = 0,9547 com intervalo de confiança de 95% (0,9311 a 0,9701) e R2 = 0,9112.

Figura 7: Correlação dos diâmetros maior e menor para 248 medidas de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, diagnosticado por microscopia de Contraste de Fase, onde P <0,0001, r = 0,8151 com intervalo de confiança de 95% (0,7685 a 0,8530) e R2 = 0,6643.

DIÂMETRO MAIOR

Diâ

met

ro m

eno

r

DIÂMETRO MAIOR

Diâ

met

ro m

eno

r

41

Pela Técnica de ZN-M, observou-se não haver diferença significativa no

tamanho dos oocistos, independentemente do sistema de criação (Tabela 7).

Tabela 7: Medidas de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, corados pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada e observadas em microscópio óptico.

Sistema de criação

n Diâmetros (µm) Índice

morfométrico maior menor

Familiar 54 3,66±0,50

(5,04-3,01)a 3,45±0,46

(4,68-2,90) 1,06±0,01

(1,17-1,00)

Tecnificada 33 3,77±0,45

(4,75-3,07) 3,59±0,45

(4,70-2,88) 1,05±0,01

(1,15-1,00)

Valor de P 0,3147 0,1729 0,2543 a valores entre parênteses são as medidas máximas e mínimas observadas Teste t de student a 95% de intervalo de confiança

Em microscopia de CF, foi observada diferença significativa entre os

tamanhos dos oocistos nos diferentes sistemas de criações (Tabela 8).

42

Tabela 8: Medidas de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, observados em microscopia de Contraste de Fase.

Sistema de criação

n Diâmetros (µm) Índice

morfométrico maior menor

Familiar 112 5,05±0,72 (6,66-3,23)a

4,40±0,59 (5,79-3,03)

1,15±0,12 (1,53-1,00)

Tecnificada 136 5,61±0,79 (7,08-3,89)

4,98±0,77 (6,92-3,53)

1,13±0,11 (1,56-1,00)

Valor de P <0,0001 <0,0001 0,2041 a Valores entre parênteses são as medidas máximas e mínimas observadas Teste t de student a 95% de intervalo de confiança

4.4 FATORES DE RISCO

Nesta pesquisa foram avaliados levando-se em consideração a presença de

oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos criados nas regiões Norte e

Noroeste Fluminense, independente do sistema de criação.

43

4.4.1 Piso das instalações

Os pisos das instalações não representaram fatores de risco para a presença

de oocistos de Cryptosporidium spp. em ambas a técnicas utilizadas (Tabelas 9 e

10).

Tabela 9: Participação do tipo de piso das instalações na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada.


χχχχ2

Valor de P

Risco relativo

(Rr)


(95%)a Positiva Negativa

Alvenaria 13 44

- 0,3747 1,188 0,8358-1,687

Terra 7 13

a Com aproximação de Katz.

Tabela 10: Participação do tipo de piso das instalações na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase.


χχχχ2

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Alvenaria 33 24

- 0,6089 1,203 0,6153-2,352

Terra 13 7


44

4.4.2 Número de animais na propriedade

A quantidade de animais presente nas criações, levando-se em consideração

propriedades com menos de 100 e mais de 100 animais, não foi considerada como

fator de risco em ambas as técnicas utilizadas para o diagnóstico (Tabelas 11 e 12).

Tabela 11: Participação do número de animais nas propriedades relacionado à presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada.


χχχχ2

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Até 100 21 35

- 0,3845 0,8705 0,6562-1,155 Acima de

100 11 28

a Com aproximação de Katz. Tabela 12: Participação do número de animais nas propriedades relacionado à

presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase.


χχχχ2 a

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Até 100 38 18

1,216 0,2701 0,7194 0,4380-1,181 Acima de

100 26 21


45

4.4.3 Presença de outros animais

Das 103 amostras de fezes examinadas pela Técnica de ZN-M, 32 foram

consideradas positivas e destas, apenas em uma não havia presença de outros

animais no entorno das instalações, o que determinou risco extremamente

significativo à presença de outros animais (Tabela 13).

Tabela 13: Participação de outras espécies de animais na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada.


χχχχ2

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Sim 31 39

- <0,0001 0,5746 0,4623-0,7141

Não 1 32


Para as mesmas 103 amostras de fezes examinadas pela microscopia de CF,

a presença de outros animais perto das criações não foi considerada como fator de

risco (Tabela 14).

Tabela 14: Participação de outras espécies de animais na presença de oocistos de

Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase.


χχχχ2 a

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Sim 47 23

1,711 0,1908 0,6777 0,4169-1,101

Não 17 16


46

4.4.4 Presença de outras pessoas na criação

Quando se determinou o diagnóstico da presença de oocistos de

Cryptosporidium spp. em fezes dos suínos pela Técnica de ZN-M, a presença de

pessoas alheias à criação foi determinante como fator de risco e quando o

diagnóstico foi feito em microscopia de CF para os mesmo critério, este não foi

considerado como fator de risco (Tabelas 15 e 16).

Tabela 15: Participação de pessoas alheias às criações na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada.


χχχχ2

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Sim 24 32

- 0,0056 0,6886 0,5303-0,8942

Não 8 39


Tabela 16: Participação de pessoas alheias às criações na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase.


χχχχ2 a

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Sim 35 21

0,00691 0,9337 0,9792 0,5962-1,608

Não 29 18


47

4.4.5 Destino das fezes

O despejo das fezes no meio ambiente foi considerado como fator de risco

para a presença de Cryptosporidium spp. nas fezes dos suínos independentemente

dos métodos de diagnóstico utilizados (tabelas 17 e 18).

Tabela 17: Participação do destino dado às fezes na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico pela Técnica de Ziehl-Neelsen modificada.


χχχχ2

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Lagoa de estabilização 4 23

- 0,0141 1,407 1,132-1,749

Ambiente 28 48


Tabela 18: Participação do destino dado às fezes na presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense. Diagnostico por centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose e microscopia de Contraste de Fase.


χχχχ2

Valor de P

Risco relativo

(Rr)



Lagoa de estabilização

12 15

- 0,0376 1,759 1,097-2,822

Ambiente 52 24


48

5 DISCUSSÃO

5.1 DIAGNÓSTICO

A maior prevalência observada no diagnóstico por CF, 62,1%, contra 31,1%

pela Técnica de ZN-M em suínos desta pesquisa (Tabelas 2 e 3)

independentemente do tipo de criação, provavelmente ocorreu devido a uma maior

concentração de oocistos quando as fezes são processadas por técnica de

centrífugo-flutuação em solução de sacarose, quando comparadas com técnicas de

concentração por sedimentação, que é utilizada na Técnica de ZN-M. Esta tem

como desvantagem a grande quantidade de detritos fecais presentes no sedimento,

tornando a identificação muito mais difícil do que pelos procedimentos de flutuação

(De Carli, 1994), o que explica este menor percentual de diagnóstico de oocistos de

Cryptosporidium spp. encontrados por ZN-M, nas mesmas fezes examinadas em

CF. Garcia et al. (1983), ao compararem 15 técnicas de diagnóstico de

Cryptosporidium spp. em fezes humanas, inclusive ZN-M e CF, concluíram que o

ZN-M é a técnica recomendada para a realização do diagnóstico dos oocistos em

seres humanos. Entretanto, ficou demonstrada no presente estudo que há uma

maior dificuldade de observação dos oocistos em fezes de suínos por ZN-M,

provavelmente devido à diferente composição de suas fezes quando comparadas

com as dos seres humanos.

Pela Técnica de ZN-M, Suárez-Luengas et al. (2007) encontraram 22,5% de

suínos eliminando oocistos de Cryptosporidium spp. em suas fezes, de 15

propriedades diferentes. Outro estudo diagnosticou o protozoário em fezes de 21,9%

de 136 suínos estudados (QUÍLEZ et al. 1996). Estes resultados foram similares aos

encontrados nesta pesquisa, não somente pela percentagem de animais

parasitados, mas também pelo fato de que os autores não observaram casos

expressivos de diarréia nos plantéis, nem qualquer outro sintoma clínico que

pudesse ser associado à presença do parasita.

Pela técnica de observação em CF, uma pesquisa recente diagnosticou 12%

de suínos positivos para criptosporidiose, identificando a espécie C. parvum como a

mais prevalente entre estes animais (CHEN e HUANG, 2007).

49

Através de outras técnicas de diagnóstico, a criptosporidiose suína é relatada

com diversas taxas de prevalência em diversos países ao redor do mundo, com

positividade variando de 1,4% a 100% (ATWILL et al, 1997; GUSELLE et al. 2003;

RYAN et al. 2003; WIELER et al. 2001; YU e SEO, 2004; ZINTL et al. 2007). No

Brasil, entretanto, os dados ainda são muito escassos e os resultados até então

obtidos diferem dos encontrados no presente trabalho. Nishi et al. (2000) realizaram

um trabalho de identificação de parasitos intestinais de suínos nos estados de MG e

de SP, no qual foram identificados oocistos de Cryptosporidium spp. em apenas 2

(1,7%) amostras de MG e 32 (7,6%) de SP. Em outra pesquisa realizada em SP, de

174 leitões lactentes que apresentavam casos de diarréia, apenas 2 (1,2%)

amostras foram positivas para criptosporidiose. Como outros agentes patogênicos

também foram encontrados nestas fezes, a diarréia não pôde ser atribuída à

criptosporidiose (CALDERARO et al., 2001). Martins et al. (1993), apud Nishi et al.

(2000) analisaram somente fezes diarréicas de leitões, e encontraram 2,1% de

positividade. O baixo percentual observado por estes autores pode ter sido

decorrência de subdiagnóstico, pois em nenhuma destas pesquisas foram realizadas

técnicas de diagnóstico específicas para Cryptosporidium spp., e sim técnicas

genéricas com finalidade de descobrir quais eram os principais parasitas presentes

nestas criações. Outro estudo analisou 750 amostras de fezes de leitões, também

de SP, das quais 77 (10,27%) foram positivas, contendo oocistos de

Cryptosporidium spp. (COUTINHO et al., 2003).

5.2 SISTEMAS DE PRODUÇÃO

Apesar das grandes diferenças quanto às instalações e manejo nos dois tipos

de propriedade, foi observada uma alta prevalência de oocistos em fezes dos suínos

em ambos os sistemas, que foram consideradas estatisticamente semelhantes

(Tabelas 4 e 5), independentes das técnicas de diagnóstico.

Resultado semelhante foi observado em pesquisa realizada por Coutinho et

al. (2003), na qual os suínos foram estudados em separado de acordo com o grau

de limpeza das granjas em bom, regular ou ruim, observando respectivamente

66,7%, 50,0% e 75,0% de positividade. Os autores concluíram que a

50

criptosporidiose ocorreu, independentemente do seu grau de limpeza. Os resultados

encontrados diferem, entretanto, de um estudo realizado por Xiao et al. (1994).

Neste, foram comparados dois diferentes sistemas de criação, dos quais um possuía

elevados padrões de higiene e o outro possuía padrões mais modestos. O resultado

obtido foi de que houve maior eliminação de oocistos no sistema em que havia

menores condições de higiene.

Tendo em vista estes resultados, a alta prevalência nestes sistemas

provavelmente está ocorrendo devido a uma ausência de diagnóstico prévio para

Cryptosporidium spp., que é inexistente em todas as criações visitadas nesta

pesquisa. Como não ocorre esta precaução, não há isolamento dos animais que

estão eliminando oocistos nas suas fezes e assim, por mais cuidados que se tenha

quanto à higienização das instalações e administração de medicamentos, deve estar

havendo transmissão de oocistos entre os animais, que convenientemente estão

trocando de baias e se juntando a outros não-parasitados. Convém ressaltar que o

produtor não percebe que o animal está parasitado pelo protozoário, visto que a

criptosporidiose suína geralmente ocorre de maneira assintomática (VITOVEC et al.,

2006). Como não há medicação específica disponível, é imprescindível a descoberta

das baias onde se encontram animais positivos para isolamento de todos estes

animais, em virtude da impraticabilidade do diagnóstico individual dos suínos de uma

criação.

5.3 MORFOMETRIA

Foi verificada alteração no tamanho e forma dos oocistos de Cryptosporidium

spp. em relação ao método de diagnóstico, dados pela extrema diferença estatística

das medidas do DM, dm e IM (Tabela 6). Em pesquisa desenvolvida por Cardozo et

al. (2005) com oocistos de C. baileyi isolados em fezes de frangos de corte, os

oocistos tiveram alteração no tamanho, e não na forma, em técnica colorimétrica

(ZN-M) e centrífugo-flutuação em observação em campo brilhante. No entanto, os

oocistos corados tiveram tamanhos maiores que os concentrados em solução

saturada de açúcar diferentemente dos resultados da presente pesquisa, onde os

oocistos concentrados em solução de sacarose foram maiores que os corados.

51

Importante realçar que nas técnicas colorimétricas o material fecal é fixado em

formol a 10%, o que provavelmente diminuiu o tamanho dos oocistos da presente

pesquisa. Esta hipótese, no entanto, ainda precisa de confirmação.

A forma dos oocistos observados após coloração (ZN-M) teve aspectos mais

esferoidais, que foram confirmados pelo IM = 1,06 e r = 0,9547 e, quando

observados diretamente em CF, os oocistos foram mais elipsóides (IM= 1,15 e r =

0,8151), o que determinou a diferença estatística do IM. No entanto, dentro da

mesma técnica, a correlação positiva (Figuras 6 e 7) entre o DM e dm dos oocistos

permite inferir que mesmo de tamanhos diferentes, estes mantêm a

proporcionalidade de suas formas reforçando a hipótese de infecção mista. Segundo

Oliveira (2002), o valor de “r” e a distribuição espacial da relação do DM sobre o dm

(Figuras 6 e 7) é o melhor parâmetro para se avaliar a forma dos oocistos,

diferenças em uma mesma espécie e em espécies de um mesmo gênero.

Os tamanhos dos oocistos observados nesta pesquisa (Tabela 6) são

semelhantes aos encontrados por Bomfim e Lopes (1994), que observaram medidas

do DM: 3,20±0,01 µm e dm: 3,10±0,10 µm quando corados pela Técnica de ZN-M.

Não foi observada diferença no DM e dm mensurados após coloração em

relação aos sistemas de criação (Tabela 7), no entanto, ocorreram diferenças

observadas entre o DM e dm mensurados quando em CF (Tabela 8). Isto

provavelmente se deu devido à presença de espécies de Cryptosporidium em um

sistema e que não em outro, do qual o suíno seja o portador (XIAO et al., 2006). Os

resultados obtidos por CF sugerem que estes oocistos são menores quando

comparados com os encontrados por Bomfim e Lopes (1994), que observaram

medidas de 6,39±0,56 µm para o DM e 6,22±0,56 µm para o dm. Porém, são

semelhantes às mensurações de oocistos de espécies já relatadas por outros

autores em suínos, tais como o C. suis (5,1 µm de DM e 4,6 µm de dm) e o C.

parvum (5,0 µm de DM e 4,5 µm de dm) (SUNNOTEL, et al., 2006).

A modificação no tamanho e não na forma dos oocistos mensurados após

coloração em ZN-M, provavelmente mascararam uma possível observação de

oocistos morfologicamente diferentes entre os diferentes sistemas de produção.

Com isso, pelos motivos apresentados, acredita-se que em suínos o diagnóstico por

microscopia em CF é uma técnica mais confiável que a Técnica de ZN-M. No

entanto, esta hipótese deve ser confirmada com a utilização de técnicas moleculares

de diagnóstico.

52

5.4 FATORES DE RISCO

O tipo de construção das baias (piso de alvenaria ou de terra) além do

número de animais por criações parece não exercer influência sobre a presença de

Cryptosporidium spp. nas fezes dos suínos, visto pela não observação de risco

relativo para estes parâmetros nesta pesquisa em ambas as técnicas de diagnóstico

(Tabelas 9 e 10). Estes resultados assemelham-se aos observados por Almeida

(2006) para alojamentos de bezerros, onde o tipo de construção não ofereceu risco

para a presença do parasita nas fezes dos animais. O número de animais da criação

também não pareceu ter influência sobre o diagnóstico do parasita nas fezes

(Tabelas 11 e 12), ao contrário do que tem sido observado em bovinos (GARBER et

al., 1994). Segundo Atwill et al. (1997), a maior densidade populacional em uma

criação tem uma relação direta na presença da criptosporidiose suína.

A presença de outros animais e de pessoas alheias à criação foi considerada

como fator de risco quando o diagnóstico foi feito em esfregaços de fezes coradas

pelo ZN-M (Tabelas 13 e 15), no entanto, quando o diagnóstico foi feito por exame

por microscopia em CF os resultados foram contrários, não havendo risco para estes

parâmetros em relação à presença de Cryptosporidium spp. nas fezes dos suínos

desta pesquisa (Tabelas 14 e 16). Como visto anteriormente, a pesquisa de oocistos

por microscopia em CF parece ser mais confiável e por isso, os resultados do risco

relativo em lâminas coradas, embora corroborando com os de Mohammed (1999)

para criações de bezerros, não podem ser confirmados nesta pesquisa.

Logo, o que realmente parece influenciar no diagnóstico de Cryptosporidium

spp. em fezes de suínos é o destino das fezes após a limpeza das instalações, uma

vez que este parâmetro foi considerado como de risco em ambas as técnicas de

diagnóstico (Tabelas 17 e 18). Os suínos possuem fezes altamente concentradas,

tendo na sua composição altos valores de matéria orgânica e nutrientes, além de

grande produção média diária de dejetos líquidos, da ordem de 8,6 litros/suíno nas

diferentes fases produtivas (MEDRI, 1997). Quando lançados no ambiente, estes

dejetos podem ser bastante prejudiciais. Hooda et al. (2000) alertam que o despejo

em rios acarreta rápida diminuição do oxigênio dissolvido, causando eutrofização e

conseqüente morte de diversas espécies aquáticas que são incapazes de sobreviver

neste ambiente. Segundo este mesmo autor, o principal responsável pela

53

contaminação poluente dos dejetos suínos não é a carga orgânica, e sim os

nutrientes presentes, tais como fósforo e nitrogênio. Além destes graves prejuízos

ambientais, é importante destacar os problemas relacionados à saúde pública, na

questão de disseminação de doenças (MEDRI e MEDRI, 2004), dentre elas a

criptosporidiose, como ficou demonstrado nos resultados do presente estudo,

relacionado ao fator de risco associado a esta prática. As principais conseqüências

são disseminação dos oocistos para outras localidades, possível disseminação para

outras espécies e maiores dificuldades de controle da parasitose. Portanto, é de

fundamental importância o tratamento adequado das fezes destes animais,

recomendando-se para isso, as lagoas de estabilização.

54

6 CONCLUSÕES

Após análise dos resultados da presença de Cryptosporidium spp. em fezes

de suínos de criações localizadas nas Regiões Norte e Noroeste Fluminense, pelas

técnicas de ZN-M e microscopia de CF, pode-se concluir que:

1. Cryptosporidium spp. ocorrem de maneira enzoótica independente

do sistema de criação;

2. A Técnica de ZN-M acarretou modificações no tamanho e não na

forma dos oocistos;

3. O diagnóstico de oocistos de Cryptosporidium spp. em microscopia

de CF após centrífugo-flutuação em solução de sacarose foi mais

efetivo que a técnica de ZN-M;

4. A deposição das fezes no ambiente, após limpeza das instalações,

foi o principal fator de risco da ocorrência de Cryptosporidium spp.

55

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64

APÊNDICE

Nº____

QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO PARA CRIPTOSPORIDIOSE EM SUÍNOS

Data:___/___/___

Nome:__________________________ Raças:_______________________________

Local:__________________________________________________________________

Nº de animais:__________ Nº de amostras coletadas:__________________________

1. INSTALAÇÕES

• Água: ( ) Torneira

( ) Filtrada

( ) ___________

• Tipo de piso:_______________________________________________________

• Banheiros: ( ) Fossa

( ) Céu aberto

• Além dos tratadores, há acesso de outras pessoas? ( ) Sim

( ) Não

• Outros animais? ( ) Cães

( ) Gatos

( ) _______________________

• Histórico de ratos? ( ) Sim Qual frequência? _________

( ) Não

2. MANEJO

• Sistema de produção: ( ) Empresarial

( ) Pré-empresarial

( ) Familiar

• Sistema de manejo: ( ) Intensivo

( ) Semi-intensivo

( ) Extensivo

65

• Dias de desmame: _________

• Idade de abate: _________

• Peso de abate:________

• Alimentação: ( ) Ração

( ) Comida caseira

( ) Ambos

• Destino dos dejetos:_________________________________________________

3. SANIDADE

• Vacinação: ( ) Sim Quais:________________________________________

( ) Não

• Everminação: ( ) Sim Quais:_______________________________________

( ) Não

• Outros medicamentos administrados:_____________________________________

• Quadros esporádicos de: ( ) Diarréia

( ) Vômito

• Presença de ectoparasitos? ( ) Sim Quais:_____________________________

( ) Não

• Estado geral: ( ) Saudáveis

( ) Bom

( ) Regular

• Achados clínicos gerais:

( ) Febre ( ) Anorexia ( ) Diarréia

( ) Vômito ( ) Lesões de pele ( ) Alterações no SNC

( ) Prostração ( ) Desidratação ( ) Outros

____________________________________

Autorizo a utilização das fezes destes animais para fins de estudos científicos,

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