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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
FRANCISCO RENAN ARAGÃO LINHARES
EFEITO DE DIFERENTES TAXAS DE DILUIÇÃO E PROTOCOLOS
DE CONGELAÇÃO SOBRE A CINÉTICA E MORFOLOGIA DE
ESPERMATOZOIDES DE CARPA COMUM (Cyprinus carpio)
CRIOPRESERVADOS EM ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP-104)
FORTALEZA
2012
1
FRANCISCO RENAN ARAGÃO LINHARES
EFEITO DE DIFERENTES TAXAS DE DILUIÇÃO E PROTOCOLOS DE
CONGELAÇÃO SOBRE A CINÉTICA E MORFOLOGIA DE
ESPERMATOZOIDES DE CARPA COMUM (Cyprinus carpio)
CRIOPRESERVADOS EM ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP-104)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução de Carnívoros, Onívoros,
Herbívoros e Aves.
Orientador: Prof. Dr José Ferreira Nunes
Co-Orientadora: Profa. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito-
Vanderley
FORTALEZA
2012
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecário(a) Responsável – Giordana Nascimento de Freitas CRB-3 / 1070
L728e Linhares, Francisco Renan Aragão
Efeito de diferentes taxas de diluição e protocolos de congelação sobre a cinética e morfologia de espermatozoides de carpa comum (Cyprinus carpio) criopreservados em água de coco em pó (ACP – 104) / Francisco Renan Aragão Linhares. — 2012.
CD-ROM. 80f. il. (algumas color); 4 ¾ pol. ―CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico,
acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)‖. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade
de Veterinária, Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2012.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof. Dr. José Ferreira Nunes. Co-orientação: Profa. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley. 1. Cyprinus carpio. 2. Criopreservação seminal. 3. Motilidade
espermática. Título. CDD: 636.089
3
4
Dedico,
A minha avó materna, Francisca Aragão
Aos meus pais, José Vytal e Dina Aragão
A minha noiva, Liliane Pascoal
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AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias - PPGCV, da Faculdade de
Veterinária, da Universidade Estadual do Ceará, pela oportunidade de fazer parte do corpo
discente.
Ao Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB), da Universidade Estadual do Ceará
(UECE) que através do uso de suas instalações e equipamentos, tornou possível a conclusão
do experimento.
Ao Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), pelo apoio de
laboratórios e estruturas de pesquisa para realização do experimento.
Ao CNPq pela bolsa de estudo durante o período de mestrado.
A Deus por toda a oportunidade que me foi concedida durante minha vida.
Aos meus pais pelo exemplo de determinação para cumprir com eficiência minhas
tarefas diárias.
Ao Professor Dr José Ferreira Nunes, por toda a orientação que me foi passada e
confiança de fazer parte de sua equipe do Núcleo Integrado de Biotecnologia desde o início de
minha vida acadêmica.
A Dra Cristiane Clemente de Mello Salgueiro, pelo meu acompanhamento durante o
início de minha iniciação científica no Laboratório de Tecnologia de Sêmen de Caprinos e
Ovinos e pela sua disponibilidade em sempre estar me ajudando nas horas que mais preciso.
A Dra Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley por ter acreditado no meu trabalho
desde o início da graduação, me acolhendo na monitoria e iniciação científica durante um
período de desmotivação do curso. Além disso, pela sua co-orientação durante todo esse
período.
Ao Professor Paulo César de Almeida, pela realização da estatística.
Ao Dr. Marcelo José Ascensão Feitosa Vieira pelos ensinamentos práticos durante a
realização dos experimentos e José Agenor Galvão pelo total apoio a minha pesquisa
científica no DNOCS.
As mestrandas Fátima de Cássia Evangelista de Oliveira por não ter me negado uma
viagem mesmo durante sua pré-defesa sempre me ajudando a cumprir com perfeição a missão
―Cyprinus carpio‖ durante minhas viagens a Pentecoste e Mônica Aline Parente Melo por me
fazer entender o meu próprio experimento diante do desespero no DNCOS além do papel
fundamental na lembrança da mistura.
6
Ao Doutorando Francisco José Lopes Cajado pelo apoio fornecido durante as viagens
a pentecoste para a realização dos experimentos.
À doutoranda Maria Audália Marques de Carvalho pelo apoio intelectual durante o
período de desenvolvimento da pesquisa e pelos ensinamentos de suas experiências em
campo.
Aos alunos de iniciação científica Júlia Trugilio Lopes, João Paulo Pinheiro, Jordana
Leite Sampaio, Mayara Setubal Oliveira, Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro, Larissa Teixeira
Nunes, Maria Eduarda Magalhães de Souza e Priscila Silva pela disponibilidade e disposição
para cumprir com eficiência suas tarefas.
Aos integrantes do Núcleo Integrado de Biotecnologia, em especial a Iraci Clemente
de Melo, Bárbara Mara Santas, Gyselle Viana Aguiar, Henna Roberta Quito.
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RESUMO
A carpa comum, Cyprinus carpio, é considerada uma das espécies domesticadas com grande
tolerância e resistência a uma ampla variedade de habitats aquáticos, tendo sida introduzida
no nordeste do Brasil pelo Departamento Nacional de Obras Contras às Secas (DNOCS) no
ano de 1977. A carpa comum é uma espécie de alto valor comercial, forte apelo culinário e
esportivo, sendo uma das espécies mais cultivadas em todo o mundo. O objetivo desse
trabalho foi avaliar um protocolo de criopreservação de sêmen de carpa comum em ACP-104
e CCSE2 (NaCl e sacarose) utilizando dois métodos de congelação. A partir do sêmen
coletado de 30 machos maduros foram determinadas as características seminais. Para a
avaliação da concentração espermática, o sêmen fresco foi diluído na proporção de 1:4000 em
solução de citrato-formol 4%. Para verificar o efeito dos diluentes e métodos de congelação
foram formados onze pools e diluídos em ACP-104 + DMSO 10% ou CCSE2 + DMSO 10%,
na taxa de diluição de 1:3 e envasados em palhetas de 0,25 mL. Para cada tratamento
resultante foram congeladas quatro palhetas em vapores de nitrogênio líquido em dry shipper
ou caixa térmica de poliestireno, sendo depois transferidas e armazenadas em botijões
criogênicos. Para verificar o efeito das taxas de diluição os pools também foram diluídos em
ACP-104 + DMSO 10% e submetido às diluições de 1:1 e 1:3. As amostras foram envasadas
em palhetas de mesmo volume e número de replicatas, sendo congeladas em vapores de
nitrogênio líquido em caixa térmica de poliestireno e depois transferidas e armazenadas em
botijões criogênicos. O sêmen foi descongelado em banho Maria a 25°C por 30 segundos e os
parâmetros de motilidade e velocidade seminal foram avaliados com uso do Sperm Class
Analyser (SCA). A análise das patologias espermáticas do sêmen fresco, diluído em 1:500, e
pós-descongelado, diluído em 1:250 em citrato- formol 4%, foram realizados utilizando o
corante azul de bromofenol. Os dados foram agrupados como média ± desvio padrão e
comparados utilizando ANOVA e teste de Games-Howell, adotando um nível de significância
de 0,05. Não houve diferença significativa (p<0,05) entre os diluentes, os métodos de
congelação e as taxas de diluição empregadas sobre os parâmetros espermáticos e
morfológicos de sêmen pós-descongelação de carpa comum. Embora todos os parâmetros
espermáticos e morfológicos analisados entre os tratamentos tenham apresentado diferença
significativa (p<0,05) em relação ao sêmen fresco (controle), os resultados foram favoráveis
para a criopreservação do sêmen de Cyprinus carpio.
Palavras-chave: Sêmen. Cyprinus carpio. Criopreservação seminal. Motilidade espermática.
8
ABSTRACT
The common carp, Cyprinus carpio, is considered one of domesticated species with high
tolerance and resistance to a wide variety of aquatic habitats, being introduced in northeastern
Brazil by the National Department of Works Cons Drought (DNOCS) in 1977. The common
carp is a species of high commercial value, strong appeal culinary and sports, one of the most
cultivated species in the world. The aim of this study was to evaluate a protocol for semen
cryopreservation of common carp in ACP-104 and CCSE2 using two freezing methods. The
semen collected from 30 sexually mature males were analysed seminal characteristics.The
fresh semen was diluted 1:4000 in solution in the proportion of citrate-formaldehyde 4% for
the evaluation of sperm concentration. Eleven pools were diluted in 10% DMSO combined
with ACP-104®
or CCSE2 the dilution rate of 1:3 using 0.25 ml straws to determine the effect
of diluent and freezing methods. For each treatment resulting four straws were frozen in liquid
nitrogen vapors in dry shipper or styrofoam cooler, and later transferred to cryogenic
cylinders. The pools were also diluted in 10% DMSO and ACP-104®
at dilutions of 1:1 and
1:3 to check the effect of dilution rates. These samples were packaged into straws same
volume and number of replicates, and frozen in liquid nitrogen vapors in styrofoam cooler and
then transferred to cryogenic cylinders. The semen was thawed in a water bath at 25 °C for 30
seconds and evaluated parameters of motility and velocity through the seminal program
computerized semen analysis (SCA). The analysis of sperm pathologies of fresh semen,
diluted 1:500, and post-thawed, diluted 1:250 in citrate-formaldehyde 4%, were performed
using the bromophenol blue dye. All data were expressed as mean ± standard deviation and
compared using ANOVA and Games-Howell test, considered at 5% of significance level. No
significant difference (p<0.05) between the two extenders, two freezing methods and the two
dilution rates on sperm and morphological parameters post-thawed semen of common carp.
Although all sperm and morphological parameters analyzed between treatments showed
significant differences (p<0.05) compared to fresh semen (control), they were favorable
results for the cryopreservation of semen of Cyprinus carpio.
Keywords: Sperm. Cyprinus carpio. Sperm cryopreservation. Sperm motility.
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Carpa comum (Cyprinus carpio) 15
Capítulo 1
Figura 1 – Morfologia observada no sêmen fresco e pós-descongelação de Cyrinus carpio 43
após ser submetido a diferentes taxas de diluição.
Capítulo 2
Figura 1 – Morfologia do sêmen fresco e pós-descongelação de Cyrinus carpio 57
após ser submetido a quatro tratamentos.
10
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Tabela 1 – Efeito de diferentes taxas de diluição sobre os parâmetros espermáticos de 40
sêmen descongelado de Cyprinus carpio.
Tabela 2 - Efeito de diferentes taxas de diluição sobre os parâmetros morfológicos de 41
sêmen descongelado de Cyprinus carpio.
Capítulo 2
Tabela 1 – Efeito de diferentes criosoluções e métodos de congelação sobre os 56
parâmetros espermáticos de sêmen descongelado de Cyprinus carpio.
Tabela 2 - Efeito de diferentes criosoluções e métodos de congelação sobre os 56
parâmetros morfológicos de sêmen descongelado de Cyprinus carpio.
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LISTA DE ABREVIATURAS
DNOCS – Departamento Nacional de Obras Contra às Secas
EHC - Extrato hipofisário de carpa
DMSO – Dimetilsulfóxido
CASA - Análise espermática auxiliada por computador
ACP - Água de coco em pó
CCSE2 – Solução a base de sais e açucares (0,3427g NaCl e 3,4314g sacarose)
mOsm – Miliosmole
hCG – Gonadotrofina coriônica humana
GnRHa – Análago do hormônio liberador de gonadotrofinas
sptz – Espermatozoide
SCA - Sperm Class Analyser
VCL – Velocidade do percurso curvilinear
VSL – Velocidade em linha reta
VAP – Velocidade média do percurso
LIN – Linearidade
WOB – Oscilação
STR – Retilinearidade
BCF - Frequência de batimento cruzado
ALH - Deslocamento lateral da cabeça
ATP – Adenosina trifosfato
CEUA - Comitê de Ética para o Uso de Animais
CPAq - Centro de Pesquisas em Aquicultura
NIB - Núcleo Integrado de Biotecnologia
LBRP - Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes
12
UECE – Universidade Estadual do Ceará
N – Espermatozoide normal
Mc - Macrocefalia
Cd - Cauda dobrada
Ce - Cauda enrolada
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................14
2 REVISÃO DE LITERATURA...........................................................................................15
2.1 Espécie................................................................................................................................15
2.2 Taxonomia..........................................................................................................................16
2.3 Reprodução.........................................................................................................................16
2. 3.1 Regulação hormonal.......................................................................................................16
2.4 O sêmen dos teleósteos.......................................................................................................17
2.5 Criopreservação..................................................................................................................18
2.5.1 O processo de congelação................................................................................................19
2.5.2 Diluentes seminais...........................................................................................................21
2.5.3 Diluentes à base de água de coco.....................................................................................22
2.6 Avaliação seminal...............................................................................................................23
2.6.1 Características seminais...................................................................................................23
2.6.2 Concentração espermática................................................................................................24
2.6.3 Morfologia espermática...................................................................................................26
2.6.4 Avaliação subjetiva da motilidade espermática...............................................................27
2.6.5 Avaliação da cinética espermática através de análise seminal auxiliada por computador
(CASA).....................................................................................................................................27
3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................................29
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS..............................................................................................30
5 OBJETIVOS.........................................................................................................................31
5.1 Objetivos gerais...................................................................................................................31
5.2 Objetivos específicos..........................................................................................................31
6 CAPÍTULO 1........................................................................................................................32
7 CAPÍTULO 2........................................................................................................................47
8 CONCLUSÕES....................................................................................................................68
9 PERSPECTIVAS.................................................................................................................69
10 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA GERAL..................................................................70
14
1 INTRODUÇÃO
A exploração de espécies aquáticas através da aquicultura vem desempenhando papel
importante para a conservação das espécies, sendo responsável pela produção de 43 milhões
de toneladas de pescado por ano (FAO, 2007). Nesse contexto, o uso de rações balanceadas,
associadas ao profundo conhecimento da biologia das espécies e o estudo do meio ambiente
onde vivem têm contribuído sobremaneira para aumentar a produção de pescado, permitindo
o crescimento deste setor mundialmente.
Estudos de biologia molecular aliadas à biotécnicas como a reprodução artificial em
cativeiro a partir da indução hormonal e a criopreservação seminal vêm proporcionando a
recuperação de espécies ameaçadas ou em vias de extinção. Durante a elaboração de
protocolos de criopreservação de sêmen, pesquisas específicas relacionadas às taxas de
diluição e volume de sêmen por palheta são de grande importância para a realização de
programas de fertilização, uma vez que os danos causados pelo frio influenciam a
sobrevivência espermática através da redução do número de células viáveis. Para tanto, a
determinação da dose inseminante ideal, ou seja, a proporção mínima de espermatozoides por
ovócito capaz de produzir a máxima sobrevivência em termos de larvas eclodidas vem sendo
estudada (LINHART et al., 2000).
A carpa comum (Cyprinus carpio) é uma espécie de alto valor comercial,
representando cerca de 6,14% (3.172.488 toneladas) do total da produção mundial aquícola
(FAO, 2008). Entretanto, após sua introdução no ano de 1977 no nordeste do Brasil, a
renovação do plantel nesta região não foi devidamente realizada nos últimos 25 anos,
elevando-se o grau de endocruzamentos do estoque reprodutor. A introdução de novos
gametas no plantel, via transporte e criopreservação, possibilitará renovação e aumento da
variabilidade genética, favorecendo o bem estar, a saúde e o crescimento dos estoques
nordestinos em cativeiro. Além disso, o desenvolvimento e aplicação da criopreservação
seminal associada à fertilização assistida nesta espécie possibilitará rapidez e eficiência na
reversão deste quadro.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Espécie
A carpa comum (Cyprinus carpio) é considerada uma das espécies de peixes de água
doce domesticadas mais antigas, cultivadas há mais de 2000 anos na China (BALON, 1995)
(Fig. 1). Devido a sua tolerância e resistência a uma ampla variedade de habitats aquáticos
(PAGE; BURR, 1991; FROESE; PAULY, 2002), estes animais foram introduzidos
largamente, sendo encontrados em todo o mundo, exceto nos polos e norte da Ásia
(NELSON, 1976).
São animais que vivem em grupo, apresentando hábito alimentar onívoro, com
tendência à iliofagia (FROESE; PAULY, 2007). É uma espécie típica de ambientes lênticos,
capaz de suportar baixos níveis de oxigênio dissolvido (3,2 mg/L) (MACÊDO et al., 2007). A
temperatura ideal para seu bom desenvolvimento varia de 24 a 28 °C, porém, apresenta uma
faixa tolerável de 8 a 30 °C, sendo assim, um peixe rústico e de fácil adaptação (GRAEFF;
PRUNER, 1999). As carpas geralmente apresentam um comprimento variando entre 30 e 60
cm e pesam entre 0,5 e 4 kg (TOMELLERI; EBERLE, 1990).
No Brasil, a carpa comum foi introduzida no final do século XIX com a chegada dos
primeiros imigrantes. No Nordeste do Brasil, a carpa foi introduzida através do Departamento
Nacional de Obras Contras às Secas (DNOCS), no ano de 1977 (DNOCS, 2009). A carpa
comum é uma espécie de alto valor comercial, forte apelo culinário e esportivo, sendo uma
das espécies mais cultivadas em todo o mundo. A produção de carpa no mundo cresceu de
7.490.870 toneladas em 1993 para 16.692.147 toneladas em 2002. Já no Brasil, a produção é
de 45.170 toneladas, principalmente no Sul e Sudeste, que correspondem a 76,7% da
produção nacional (ECHEVENGUÁ, 2006).
Figura 1 – Carpa comum (Cyprinus carpio)
16
2.2 Taxonomia
Reino: Animalia
Filo: Chordata
Classe: Actinopterygii
Ordem: Cypriniformes
Família: Cyprinidae
Gênero: Cyprinus
Espécie: Cyprinus carpio
2.3 Reprodução
A carpa comum não necessita migrar para se reproduzir (CASTAGNOLLI, 1992). Nas
regiões temperadas, a reprodução da espécie se restringe às estações mais adequadas para sua
sobrevivência (primavera e início do verão). Quando as fêmeas são mantidas sob uma
temperatura constante de 20 a 24 °C, a desova pode ocorrer até cinco vezes por ano
(LINHART et al., 1995). Porém, quando induzidas hormonalmente com extrato de hipófise de
carpa, a espécie Cyprinus carpio se reproduz durante todo o ano nas regiões temperadas e
tropicais (CHRIST et al., 1996). A maturação sexual dos peixes depende de vários fatores
dentre eles a temperatura, a disponibilidade de alimento adequado, o ambiente, a idade e o
tamanho. Em áreas tropicais, a carpa comum atinge maturação sexual após o primeiro ano de
vida. No ambiente natural, as fêmeas desovam em águas paradas com a presença de
macrófitas, liberando cerca de 100 a 230 g de ovócitos por quilograma de peso corporal, uma
média de 100.000 a 300.000 ovócitos.Kg-1
(LINHART et al., 1995). Sem o cuidado parental,
os ovócitos são colocados sobre plantas aquáticas que, ao entrarem em contato com a água,
adquirem adesividade e aumentam de três a quatro vezes seu volume. A fertilização ocorre
externamente e os ovócitos eclodem de dois a três dias pós-fertilização. Os alevinos recém-
eclodidos tornam-se capazes de se alimentar de minúsculos animais aquáticos após o
desaparecimento do saco vitelínico (WOYNAROVICH, 1993).
2.3.1 Regulação hormonal
Como nos mamíferos, o eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal controla de forma
dinâmica o ciclo hormonal reprodutivo dos peixes. Além disso, fatores ambientais como o
17
fotoperíodo, temperatura, salinidade, precipitação pluviométrica e vários aspectos
relacionados a estímulos envolvidos na interação entre machos e fêmeas, como sinais táteis,
visuais, auditivos e elétricos, interferem nos hormônios reprodutivos dos peixes teleósteos
(VAN WEERD et al., 1990; CHAUDHURI, 1994).
A aquicultura, cujo meio de produção baseia-se na água, tornou-se a melhor
alternativa para manter a oferta dos alimentos de origem aquática. Porém muitas espécies de
peixes, incluídas as de piracema, apresentam disfunção reprodutiva, impedindo a desova e
impossibilitando a produção de alevinos em cativeiro (MOON et al., 2003). O problema foi
superado a partir do desenvolvimento de trabalhos de indução à desova de peixes reofílicos
conhecida como ―hipofisação‖, obtendo-se resultados positivos de indução à maturação final
dos gametas a partir da aplicação de hormônios naturais presentes na hipófise de peixes
maduros (ZANIBONI; WEINGARTNER, 2007).
Alguns dos hormônios empregados para a reprodução artificial utilizam hipófises
extraídas de peixes maduros, para a coleta de alta concentração de gonadotrofina. Li et al.
(2010) utilizaram 1 mg de extrato hipofisário de carpa (EHC) por Kg de peso vivo para
induzir a espermiação de machos e 2,5 mg/kg de EHC para induzir a desova de fêmeas de
carpa comum (Cyprinus carpio), enquanto Alvarez et al. (2003) utilizaram 2 mg/kg de EHC
para induzir a espermiação e desova de carpas prateadas (Hypophthalmichthys molitrix). Os
procedimentos usuais para administração dos hormônios podem ser por via intramuscular ou
intraperitoneal e o veículo pode ser aquoso (água ou solução salina 0,6% NaCl) ou ―pellet‖ de
colesterol ou celulose com liberação gradual do hormônio (GOREN et al., 1995). A indução
hormonal pode ser empregada para aumentar o volume de sêmen liberado por reprodutor,
facilitando assim a formação de diversos grupos durante pesquisas experimentais.
2.4 O sêmen de teleósteos
Os testículos dos peixes teleósteos consistem de um par de estruturas alongadas
compostas de túbulos seminíferos ramificados, onde se encontram células da linhagem
germinativa em diferentes fases de diferenciação. Em um número limitado de espécies as
glândulas acessórias reprodutivas, geralmente chamadas de vesículas seminais, são
responsáveis pelo armazenamento de sêmen ou produção de derivados de andrógeno, que
atuam como feromônios durante a reprodução (FISHELSON, 1991). Após completar o
processo de espermatogênese, os espermatozoides, imóveis e protegidos pelo plasma seminal
18
durante seu armazenamento nos testículos (STOSS, 1983; COSSON et al., 1999), serão
lançados nos ductos testiculares onde serão capacitados pela ação hormonal para adquirir
motilidade (MIURA, 1995).
Na maioria dos peixes, esses gametas não possuem estrutura acrossomal, portanto a
fertilização ocorre por meio da entrada dos gametas masculinos diretamente na micrópila dos
ovócitos (MORALES, 1986). Após liberados no meio, os espermatozoides têm pouco tempo
de mobilidade para alcançar o ovócito, visto que produção de energia é muito mais lenta do
que o consumo (PERCHEC et al., 1995). Os espermatozoides dos peixes de água doce são
quiescentes na osmolaridade do plasma seminal (aproximadamente 300 mOsmol/kg) e
iniciam sua movimentação em solução hipotônica (<300 mOsml/kg), enquanto os
espermatozoides dos peixes de água salgada começam a se movimentar em solução
hipertônica (>300 mOsmol/kg) (MORISAWA; SUZUKI, 1980).
A aquisição de motilidade varia entre as espécies de peixes, influenciando no
percentual de motilidade dos gametas durante a estação reprodutiva. No robalo europeu, por
exemplo, a motilidade dos espermatozoides diminuiu mais de 95% no meio da época
reprodutiva para 40% no final (RAINIS et al., 2003). Além disso, a redução da motilidade
pode ser resultado do envelhecimento dos espermatozoides e redução da esteroidogênese
testicular no final da época reprodutiva (NAGAHAMA, 1994). Contudo, Mylonas et al.
(2003) observaram que a motilidade espermática no pargo permaneceu alta até o final do
período reprodutivo, enquanto Christ et al. (1996) verificaram em carpa comum que o
percentual de células móveis foi significativamente maior nos meses de verão (maio, junho e
julho) quando comparado a primavera (março).
2.5 Criopreservação
A criobiologia é a ciência que estuda o comportamento dos sistemas celulares vivos
sobre as mudanças de temperaturas abaixo de 0 ºC (PETRUNKINA, 2007). Desde que Polge
(1949) descobriu que o glicerol era capaz de preservar a motilidade dos espermatozoides
congelados de frango, Blaxter (1953) realizou os primeiros estudos de criopreservação de
gametas de peixes, eliminando a assincronia reprodutiva entre duas espécies de arenque
(Clupea harengu) separadas geograficamente. Posteriormente, muitas pesquisas têm sido
voltadas para a criopreservação do sêmen de várias espécies de peixes como: matrinxã,
Brycon orthotaenia (SILVEIRA, 2000); curimbatá, Prochilodus lineatus (CRUZ, 2001);
tilápia-nilótica, Oreochromis niloticus (AMORIM, 2002) e carpa comum, Cyprinus carpio
19
(IRAWAN et al., 2010). Desde então, esta técnica tem sido de grande importância para a
aquicultura, apresentando vários benefícios como a criação de bancos de germoplasma e sua
utilização para elaboração de programas de melhoramento genético, repovoamento de
espécies ameaçadas ou em vias de extinção, redução de custos com a manutenção de
reprodutores, introdução de novas linhagens genéticas com risco reduzido de transmissão de
patógenos desconhecidos para os peixes cultivados e facilidade de transporte do material
genético a longas distâncias (LUBZENS et al., 1997).
2.5.1 O processo de congelação
O desenvolvimento de protocolos de criopreservação de sêmen podem variar devido
às diferenças espécie-específicas do volume, composição seminal e suas características
bioquímicas (YANG; TIERSCH, 2009). Durante a coleta de sêmen, deve-se levar em
consideração a maturação intra testicular, o envelhecimento dos espermatozoides e a
contaminação do sêmen com fezes, urina ou sangue, pois estes fatores podem reduzir a
qualidade da amostra, comprometendo a conservação dos gametas (SUQUET et al., 2000).
Os espermatozoides, quando submetidos às alterações rigorosas de temperaturas, estão
sujeitos à danos ocasionados pelo frio, denominados crionjúrias. Estas são representadas por
danos morfológicos e funcionais às células associadas a mudanças osmóticas, ou seja, durante
a congelação e solidificação da água, as altas concentrações de sais presentes na solução
provocarão desidratação celular, e durante a descongelação, o re-equilíbrio osmótico,
decorrente da fusão da água, submeterá as células ao estresse hipotônico, prejudicando a
permeabilidade celular. Além disso, a rápida transição da fase de água para o gelo favorecerá
a formação de cristais de gelo nos ambientes intra e extracelular, danificando a maquinaria
celular (JUN et al., 2006). Estes danos podem levar a um decréscimo nas características
espermáticas, como a velocidade, motilidade, capacidade de fertilização e subsequente
redução das taxas de eclosão (LI et al., 2010).
Dessa forma, após a coleta, o sêmen é submetido à etapa de diluição resultante da
adição de soluções protetoras capazes de minimizar os danos causados pelas crioinjúrias.
Estas soluções são chamadas de crioprotetores, atuando na diminuição do ponto de
congelação da água, reduzindo o estresse osmótico e os efeitos da cristalização sobre a
estrutura celular. Além disso, os diluentes seminais devem: controlar as condições físico-
químicas do meio durante o armazenamento; serem isotônicos, para que não haja ativação
prévia da motilidade espermática; tenham condutividade térmica elevada, permitindo a rápida
transferência de temperatura do meio externo para os espermatozoides; serem estéreis; e
20
servirem de carreadores de crioprotetores (BILLARD; LEGENDRE, 1982). Na literatura,
Irawan et al. (2010) testaram seis diluentes (CCSE1 a CCSE6 combinados ao DMSO 10%)
resultantes da combinação de sais e açucares para a criopreservação seminal de carpa comum.
Durante a adição de diluentes, o sêmen pode ser submetido à diferentes taxas de
diluição para verificação da melhor proporção entre as quantidades de diluente e sêmen.
Sultana et al. (2010) testaram oito taxas de diluição (1:1, 1:2, 1:4, 1:5, 1:7, 1:9, 1:12 e 1:15)
para a criopreservação de sêmen de carpa comum, obtendo melhores taxas de motilidade
espermática nas proporções 1:7 e 1:9. Os resultados dos mesmos autores citados
anteriormente ainda revelam que as baixas e altas concentrações de DMSO (5% e 15%) são
prejudiciais a viabilidade espermática para a espécie estudada, demonstrando que as etapas de
diluição seminal são fundamentais para a sobrevivência dos gametas. Além disso, o ajuste de
altas concentrações espermáticas podem garantir um maior número de espermatozoides
viáveis após a criopreservação (BOZKURT et al., 2005).
Para o armazenamento em nitrogênio líquido essa mistura deve ser envasada em
recipientes padronizados para uniformizar o processo de resfrigeração e evitar variações de
transferência de calor. Para tal finalidade, podem ser utilizados os criotubos (2,0 mL) e as
palhetas (0,25 mL, 0,5 mL, 1,8 mL, 2,5 mL e 4,0 mL) (SANTAMARÍA et al., 2006;
IRAWAN et al., 2010). As palhetas de 0,5 ml, disponíveis em menor custo, são comumente
utilizadas industrialmente para a criopreservação de sêmen de bovinos. Além disso, a maioria
dos experimentos utilizam palhetas de 0,5 ml para realizar muitas repetições, pois o volume
de sêmen é frequentemente pequeno. Em seguida, o sêmen é submetido a uma queda gradual
de temperatura que influenciará o equilíbrio osmótico e o pH de soluções intra e
extracelulares durante a congelação. O ideal é que a taxa de resfrigeração seja rápida o
suficiente para minimizar o tempo de exposição às soluções concentradas e lenta o suficiente
para minimizar a quantidade de formação de gelo intracelular (YANG; TIERSCH, 2009).
Os equipamentos utilizados para congelar as amostras de sêmen são as caixas térmicas
de poliestireno, dry shippers, freezers reguláveis e botijões criogênicos. A caixa térmica de
isopor é formada por poliestireno, dentro da qual é adaptada uma bandeja metálica distante do
fundo alguns centímetros acima da superfície do nitrogênio líquido. A temperatura na caixa
dependente da quantidade de nitrogênio líquido despejado. As amostras são suspensas na
bandeja e congeladas por um período específico em vapor de nitrogênio líquido. O método de
congelação de sêmen em caixa térmica de poliestireno é tão eficaz quanto a utilização de um
refrigerador programável (IRAWAN et al., 2010). Entretanto, a altura ideal para a congelação
21
de sêmen acima da superfície do nitrogênio líquido varia entre as espécies de peixes e os tipos
de diluentes utilizados. Irawan et al. (2010) obtiveram melhores taxas de motilidade
espermática (91,7±7,8%) quando o sêmen de carpa comum foi diluído em CCSE2 com
dimetilsulfóxido (DMSO) e mantido por 10 min. a 2 cm da superfície no nitrogênio líquido.
Porém, Horváth et al. (2003) observaram que o sêmen da mesma espécie diluído em glicose e
metilglicol obteve taxas de motilidade (63 ± 9%), fertilização (74 ± 15%) e eclosão (67±17%)
satisfatórias quando mantidos por 3 min. a 3 cm da superfície do nitrogênio líquido.
O dry shipper é um contêiner para transportar com segurança amostras em
temperaturas criogênicas. Trata-se de um botijão em alumínio, cujo interior está recoberto por
um material de absorção de nitrogênio líquido responsável pela congelação a vapor de
amostras de sêmen a uma taxa de resfrigeração de aproximadamente 25–40 °C min-1
com
estabilização gradual de -181 °C em 3 min (TAITSON et al., 2007). O equipamento já foi
utilizado com sucesso para as espécies nativas brasileiras tais como Brycon insignis e Brycon
opalinus obtendo boas taxas de motilidade, fertilização e eclosão (VIVEIROS et al., 2012a,b).
Após o equilíbrio térmico, o sêmen congelado é transferido para um botijão de nitrogênio
líquido, onde pode ser conservado durante anos à -196 °C sem efeitos deletérios
(ASHWOOD-SMITH, 1980).
O sucesso do protocolo de criopreservação é verificado através da descongelação do
sêmen em banho-Maria e avaliação da qualidade espermática em microscopia ótica ou
eletrônica. Após a descongelação, a avaliação dos parâmetros seminais podem ser realizadas
de forma subjetiva, ou seja, por meio de critérios arbitrários impostos pelo homem
(CHAMBEYRON; ZOHAR, 1990) ou avaliação mais objetiva e detalhada das características
gerais dos espermatozoides (RURANGWA et al., 2001). Dentre os equipamentos utilizados
para estas análises, destaca-se o sistema de análise espermática auxiliado por computador, o
CASA.
2.5.2 Diluentes seminais
Segundo Maisse et al. (1998), os meios diluentes ideais compõem-se de uma
substância orgânica que atue como crioprotetor externo (gema de ovo ou leite desnatado),
protegendo as células contra o choque térmico produzido ao se resfrigerar o sêmen desde os
20 ºC aos 5 ºC, uma fonte de energia (glicose ou frutose), um componente com capacidade
tamponante (citrato de sódio ou tris-hidroximetil-aminometano) e um crioprotetor interno que
22
proteja os espermatozoides durante a congelação (glicerol, DMSO ou etilenoglicol). A
eficiência crioprotetora varia entres as espécies já que eles atuam de modo específico na
célula espermática. Sultana et al. (2010) utilizaram os diluentes Alsever ou gema de ovo ou
NaCl 0,9% combinados com os crioprotetores internos etanol ou metanol ou DMSO para a
criopreservação de sêmen de carpa comum, enquanto Viveiros et al. (2010) utilizaram os
diluentes ACP-104 ou solução comercial de glicose 5% combinados com o crioprotetor
metilglicol para a criopreservação do sêmen de curimba (Prochilodus lineatus).
2.5.3 Diluentes à base de água de coco
Pesquisadores da Universidade Estadual do Ceará desenvolveram uma tecnologia
capaz de liofilizar a água de coco para produzir a água de coco em pó (ACP), um produto
estável e padronizado composto de sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras
(MELO et al., 2010), indutores da divisão celular e eletrólitos diversos, que conferem
densidade e pH compatíveis com o plasma sanguíneo, proporcionando os nutrientes
necessários para a manutenção da sobrevivência e viabilidade de gametas masculinos e
femininos criopreservados (BLUME; MARQUES, 1994). Além disso, a suplementação
alimentar com vitaminas, também presentes na composição do ACP, aumenta a produção de
anti-oxidantes no plasma seminal, evitando a degradação do material genético pelos radicais
livres (METWALLY; FOUAD, 2009). Estudos com a água de coco têm sido realizados com
sucesso em mamíferos (BARROS; TONIOLLI, 2011).
Estudos iniciais em peixes mostraram resultados satisfatórios na combinação do ACP-
104®
com DMSO ou metilglicol para a criopreservação seminal (VELASQUEZ-MEDINA,
2008; VIVEIROS et al., 2008; VIEIRA, 2010). A água de coco (Cocos nucifera L.) também
obteve melhores resultados para o prolongamento da motilidade espermática de sêmen de
carpa (Cyprinus carpio L.) quando comparada a solução de Alsever modificada (cloreto de
sódio 4,2 g; citrato sódio 5%; ácido cítrico 0,5 g; dextrose 20,50 g; água destilada 1000 ml),
ambos com a osmolaridade média de 150 mOsm/Kg (CARVALHO et al., 2002). Farias et al.
(1999) verificaram em tambaqui (Colossoma macropomum, Cuvier, 1818) que as
osmolaridades 125 e 150 mOsm/Kg da água de coco ―in natura‖ aumentaram a motilidade e
sobrevivência espermática de sêmen fresco diluído em comparação com água ―in natura‖
(água do tanque). Estes resultados demonstram que o ACP-104 pode ser utilizado com
sucesso como diluente para o sêmen de peixes.
23
2.6 Avaliação seminal
O método ideal para predizer a fertilidade dos machos reprodutores é pelo exame das
características seminais à campo. Portanto, a qualidade espermática torna-se um pré-requisito
para a seleção dos animais em programas de reprodução artificial. A avaliação do ejaculado
deve ser rápida e eficiente, preservando a qualidade inicial e a capacidade fertilizante.
Amostras seminais são avaliadas tendo em vista várias características físicas como o aspecto,
a cor, o volume, o pH, a osmolaridade, a concentração, a morfologia e a motilidade
espermática. A partir desses resultados qualquer desvio para os padrões de uma determinada
espécie pode ser correlacionado com a fertilidade (HAFEZ, 1995).
2.6.1 Características seminais
O aspecto seminal pode ser facilmente classificado de forma subjetiva, porém este
parâmetro varia de acordo com os critérios adotados pelos pesquisadores. Segundo Suquet et
al. (1992) o aspecto seminal de turbot (Scophthalmus maximus) foi classificado em viscoso,
líquido e indeterminado, enquanto para Andrade-Talmelli et al. (2001) o sêmen da piabanha
(Brycon insignis) foi analisado macroscopicamente quanto a coloração e fluidez. A cor do
sêmen indica uma maior ou menor quantidade de fluido seminal, que terá influência direta na
concentração de espermatozoides.
Viveiros e Godinho (2009) referem-se ao volume seminal como um fator importante
no processo reprodutivo e variável tanto em espécies migratórias na época de reprodução
quanto em animais induzidos com hormônio. Em muitas espécies de bagres a quantidade de
sêmen liberado por extrusão é mínima, necessitando do sacrifício do animal para obtenção de
um maior volume de sêmen (BIEGNIEWSKA et al., 2010). Na carpa comum, o volume de
sêmen produzido varia durante o ano, com produção de 2,88 ml em março e 6,5 ml em maio
(CHRIST et al., 1996). Andrade-Talmelli et al. (2001) encontraram em machos de piabanha
(Brycon insignis) uma produção média de 4,68 ml de volume seminal após 16 horas de
indução hormonal com hCG. De acordo com Kobayashi et al. (1986), o aumento da produção
de sêmen após aplicação de hCG elevou os níveis de gonadotropina (GtH) circulante e
induziu a espermiação e a hidratação seminal. Além disso, Moon et al. (2003) também
demonstraram a participação de progestágenos nestes processos, verificando em linguado
(Platichthys stellatus) uma correlação positiva entre a produção de volume seminal e os níveis
de 17-hidroxiprogesterona liberados no plasma sanguíneo em resposta a indução hormonal
com um análogo do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRHa).
24
Segundo Tabares et al. (2005) o pH do sêmen de peixes de água doce varia de 6,5 a
8,5. Morisawa e Morisawa (1988) relataram que os espermatozoides de peixes adquirem
motilidade durante a transição do testículo ao ducto espermático, onde o pH é alto. Uma
relação linear positiva entre pH do plasma seminal e a porcentagem de espermatozoides
móveis foi mostrado em ciprinídeos (Alburnus alburnus) (LAHNSTEINER et al., 1996a).
Clearwater e Crim (1998) também verificaram um aumento tanto da motilidade espermática
quanto do pH do plasma seminal em linguado (Pleuronectes ferrugineus) submetidos ao
tratamento com GnRHa.
De acordo com Morisawa e Susuki (1980) a osmolaridade do sêmen de peixes
apresenta-se em torno de 300 mOsm/Kg. A variabilidade deste parâmetro está relacionada
com características individual e espécie-específicas, como os valores encontrados em
ciprinídeos (254 a 346 mOsm/Kg) e salmonídeos (232 a 322 mOsm/Kg) (ALAVI; COSSON,
2006). Nos peixes, a motilidade espermática inicia se quando os espermatozoides entram em
contato com meios hiposmóticos. Assim, o conhecimento deste parâmetro, é importante para
a padronização de criodiluentes que evitem a ativação dos gametas masculinos antes da
criopreservação.
Órfão et al. (2011), ao diluir o sêmen de Brycon opalinus, não observaram motilidade
espermática quando utilizaram diluentes ajustados a altas osmolaridades (325 e 365
mOsm/kg). Entretanto, os mesmos espermatozoides foram ativados quando diluídos a baixa
osmolaridade (245 mOsm/kg). Além disso, o aumento da osmolaridade dos criodiluentes
também pode resultar num choque hiperosmótico afetando a sobrevivência dos gametas
durante a criopresevação (URBÁNYI et al., 2006).
2.6.2 Concentração espermática
A concentração espermática é uma das medidas quantitativas mais importantes
utilizadas na pesquisa e rotina de avaliação do sêmen de peixes (SILVEIRA et al., 1987). A
determinação da concentração espermática contribui para a padronização da taxa de diluição
sêmen:diluidor apropriada para a criopreservação seminal e posterior utilização em programas
de fertilização assistida. Lahnsteiner et al. (1996b) verificaram que a taxa de diluição não
poderia exceder o valor de 2,0–2,5x109 espermatozoides x ml
-1diluente para se obter uma boa
taxa de fertilização utilizando sêmen criopreservado de salmonídeos. Dessa forma, a avaliação
da produção espermática dos reprodutores permite maximizar a utilização de machos durante
os trabalhos de reprodução assistida.
25
Este parâmetro pode ser determinado por meio da contagem dos espermatozoides em
câmara hematimétrica, que é considerado o método mais preciso, porém é mais demorado e
menos prático para uso no momento da criopreservação e fertilização assistida, que exige um
manejo rápido entre a coleta e a manipulação do sêmen (DONG et al., 2005; CRUZ-
CASALLAS et al., 2007). Para a contagem dos espermatozoides em câmara hematimétrica,
os gametas são submetidos à diluição em soluções fixadoras apropriadas.
Suquet et al. (1992) utilizaram a solução Triton X-100 (0,25%) para evitar a
aglutinação dos gametas durante a diluição do sêmen de turbot (Scophthalmus maximus),
enquanto Ciereszko e Dabrowski (1993) utilizaram a solução de NaCl (0,7%) para a diluição
do sêmen de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) e Andrade-Talmelli et al. (2001) fixaram o
sêmen da piabanha (Brycon insignis) em formol salino. Após a diluição seminal em solução
fixadora a contagem dos gametas em câmara hematimétrica é auxiliada por um microscópio
óptico. Durante a leitura, a média das contagens feitas nos dois retículos da câmara é
multiplicada por um fator que varia de acordo com a diluição seminal utilizada. Para a
piabanha, Andrade-Talmelli et al. (2001) utilizaram o fator de 50000, porém Vieira (2010)
utilizou o fator de 200 x 106
para tambaqui (Colossoma macropomum).
Segundo Taitson e Godinho (2003) a concentração espermática nas diversas espécies
peixes é bastante variada. Biegniewska et al. (2010) encontraram 18,5 ± 1,8 x 109 sptz/ml em
bagre africano, enquanto Yaron (1995) encontrou, em regiões temperadas, uma produção
espermática anual em carpa comum (Cyprinus carpio) de 1,9 ± 0,2 x 1012
sptz/ml. A
concentração espermática pode variar entre indivíduos de uma mesma espécie (BABIAK et
al., 1997). Piironen (1985) verificou em salmão (Salmo salar sebago) um aumento da
densidade espermática no final da estação reprodutiva, enquanto Christ et al. (1996)
observaram em carpa comum (Cyprinus carpio) tratadas hormonalmente com E.H.C. um
aumento gradual até abril e maio (9,63 x 109 para 2,38 x 10
10 sptz/ml de sêmen), diminuição
em junho e julho (1,83 x 1010
sptz/ml de sêmen), seguido por um aumento considerável em
agosto (2,74 x 1010
sptz/ml de sêmen). A idade do animal também pode ser considerada um
fator relevante. Segundo Njiwa et al. (2004) a quantidade, a motilidade e o tempo de vida dos
espermatozoides de peixes zebrafish (Danio rerio) mais jovens foram superiores aos dos mais
velhos. Além disso, Rzemieniecki et al. (2004) observaram que o volume seminal, a
concentração e motilidade espermática de esturjão (Acipenser ruthenus) são influenciadas
pelos tipos de tratamentos hormonais utilizados. A produção espermática ainda pode ser
influenciada pela exposição dos machos às fêmeas, por meio dos feromônios
26
(DEFRAIPONT; SORENSEN, 1993; POOLE; DILLANE, 1998) e pelo manejo aplicado à
coleta de sêmen. Kavamoto et al. (1997) concluíram que machos de curimbatá (Prochilodus
scrofa) com três anos de idade, podem ser utilizados até três vezes durante o período
reprodutivo, sem perda significativa da qualidade do sêmen produzido.
2.6.3 Morfologia espermática
A morfologia das células espermáticas é um fator importante na avaliação da
qualidade do sêmen descongelado, visto que estas patologias podem comprometer a função
dos espermatozoides. Galo et al. (2011) e Streit Jr. et al. (2009) relataram que o aumento das
patologias espermáticas reduziram a motilidade e o vigor espermático de sêmen descongelado
de piracanjuba (Brycon orbignyanus) e pacu (Piaractus mesopotamicus) respectivamente.
Fabbrocini et al. (2000) afirmam que o aparecimento de patologias espermáticas pós-
congelação está relacionada com a toxidez dos crioprotetores e a ineficiência no processo de
criopreservação como os principais responsáveis pelas crio-injúrias. Streit Jr. et al. (2009)
avaliaram as patologias seminais de Piaractus mesopotamicus em patologias primárias, que
compreendiam cauda quebrada, enrolada, curta, degenerada e corrugada; macrocefalia e
microcefalias, e patologias secundárias, que consistiam em cauda dobrada; cauda e cabeça
solta; gota citoplasmática proximal e distal. Estas patologias foram observadas a partir da
contagem de 100 a 130 espermatozoides, após a realização de esfregaços corados com Rosa
Bengala do sêmen fresco ou descongelado diluído em formol-salina tamponada (1:2000).
Em mamíferos, as anormalidades primárias são decorrentes de falhas da
espermatogênese, enquanto que as anormalidades secundárias ocorrem durante o percurso dos
espermatozoides através dos ductos testiculares (HAFEZ, 1995). O padrão normal
preconizado para anormalidades espermáticas em mamíferos domésticos é de 15%, visto que
o sêmen da maioria dos machos apresenta alguns espermatozoides defeituosos durante sua
formação (CBRA, 1998). Em peixes ainda não existe normatização quanto ao padrão
aceitável de anormalidades espermáticas, sendo provável que seja aceito um maior percentual.
Este parâmetro pode variar entre as espécies. Moraes et al. (2004) observaram a incidência de
espermatozoides com anormalidade primária de 13,8% em C. carpio, de 12,5% em L.
macrocephalus e 14,3% em P. lineatus, quando induzidos hormonalmente para a reprodução
com extrato de hipófise de carpa.
27
2.6.4 Avaliação subjetiva da motilidade espermática
A qualidade espermática está diretamente relacionada com a motilidade dos gametas
masculinos, uma vez que esta característica constitui um pré-requisito para a fertilização dos
ovócitos (RURANGWA et al., 2004). A técnica convencional, baseada na observação através
de microscópio óptico, é utilizada pela maioria dos laboratórios para realizar análise seminal.
Embora sujeita a distintos graus de imprecisão, devido à subjetividade da avaliação a partir de
escalas arbitrárias (CHAMBEYRON; ZOHAR, 1990), este método é tão confiável quanto à
análise objetiva desde que realizada por um técnico treinado. De fato, Viveiros et al. (2010)
não obtiveram diferença estatística entre a motilidade em sêmen descongelado (78±11%;
72±13%) determinado subjetivamente por meio de microscópio de luz e objetivamente por
meio de análise seminal computadorizado (CASA) (85±12%; 75±10%) utilizando sêmen de
curimba (Prochilodus lineatus) criopreservado ACP-104 + metilglicol ou glicose 5% +
metilglicol, respectivamente.
2.6.5 Avaliação da cinética espermática através de análise seminal auxiliada por
computador (CASA)
O sistema de análise seminal auxiliado por computador consiste basicamente de um
microscópio de contraste de fase acoplado a uma câmera de vídeo. As imagens geradas são
reproduzidas e analisadas de forma eficiente e objetiva por meio do software Sperm Class
Analyser – SCA instalado no sistema operacional de um computador adaptado a estes
equipamentos. A automatização desta análise permite maior objetividade e rapidez, uma vez
que é realizada numa menor fração do tempo requerido pela avaliação subjetiva. A utilização
deste equipamento contribuiu para a produção de trabalhos mais detalhados sobre a atividade
dos espermatozoides, avaliando os parâmetros de rápidos, médios, lentos, estáticos,
velocidade do percurso curvilinear (VCL), velocidade do percurso médio (VAP), velocidade
em linha reta (VSL), retilinearidade (STR), linearidade (LIN), oscilação (WOB), frequência
de batimento cruzado (BCF), e deslocamento lateral da cabeça (ALH).
Os parâmetros de velocidade, VCL, VAP e VSL, descrevem o movimento do
espermatozoide, enquanto, os parâmetros LIN, STR e WOB representam as relações entre
estas velocidades VSL e VCL; VSL e VAP; VAP e VCL, respectivamente. Viveiros et al.
(2010) relataram uma correlação positiva entre as velocidades espermáticas (VCL, VSL e
VAP) e as taxas de fertilização de sêmen de curimba (Prochilodus lineatus), demonstrando
28
que a velocidade espermática é um fator importante para as espécies de peixes de fecundação
externa. A velocidade dos espermatozoides pode variar dentro ou entre ejaculados e depende
da quantidade de ATP armazenado nas mitocôndrias antes da ejaculação (BURNESS et al.,
2004; HAUGLAND et al., 2009).
29
3 JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento e aplicação da criopreservação seminal na carpa comum
possibilitará rapidez e eficiência na renovação e no aumento da variabilidade genética,
eliminando o grau de endocruzamentos e favorecendo o bem estar, a saúde e o crescimento
dos estoques nordestinos em cativeiro. Além disso, a padronização da técnica de conservação
de gametas masculinos contribuirá para a implantação de um banco de sêmen de carpa
comum, visando à produção de alevinos durante todo o ano.
Cada processo de congelação é espécie-específico, por isso é preciso ter informações
sobre as particularidades do sêmen da espécie (aspecto, pH e osmolaridade seminal, volume
coletado de sêmen, concentração e motilidade espermática subjetiva e objetiva), o que permite
padronizar as técnicas, definir os componentes crioprotetores e os meios diluentes a testar,
bem como os procedimentos adequados para a congelação e posterior descongelação dos
espermatozoides (CARNEIRO, 2007). Também é importante conhecer as morfoanomalias do
sêmen antes e depois da criopreservação, já que estas representam o estado dos gametas no
momento da congelação e os criodanos causados após este processo.
30
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS
O diluente à base de água de coco em pó (ACP-104) conserva as características
morfofisiológicas dos espermatozoides de carpa comum criopreservados em dry
shipper.
O diluente ACP-104 conserva a taxa de motilidade tanto quanto o meio CCSE2
após o processo de criopreservação em dry shipper.
O diluente ACP-104 na taxa de diluição de 1:3 conserva a motilidade após o
processo de criopreservação em caixa térmica de poliestireno.
31
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Definir um protocolo de criopreservação de sêmen de carpa comum diluído em
água de coco em pó (ACP-104).
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar as características seminais da carpa comum criadas em cativeiro no
Ceará como: aspecto, volume, pH seminal, concentração e osmolaridade
espermática;
Avaliar a cinética espermática em sêmen fresco e diluído em ACP-104 ou CCSE2
acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO) pós-descongelação utilizando duas taxas de
diluição (1:1 e 1:3) nos métodos de congelação em caixa térmica de poliestireno e
dry shipper.
Observar as principais patologias do sêmen fresco e descongelado entre duas taxas
de diluição (1:1 e 1:3) nos métodos de congelação em caixa térmica de poliestireno
e dry shipper.
32
6 CAPÍTULO 1
Efeito de diferentes taxas de diluição sobre a cinética e morfologia de espermatozoides
de carpa comum (Cyprinus carpio) criopreservados em meio à base água de coco em pó
(ACP-104)
[Effect of different rates of dilution and freezing protocols on the kinetics and morphology of
sperm of common carp (Cyprinus carpio) cryopreserved in powdered coconut water (ACP-
104)]
Periódico: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (ABMVZ)
Submetido em 20/10/2012
Fator de impacto: 0.1305
33
Efeito de diferentes taxas de diluição sobre a cinética e morfologia de espermatozoides
de carpa comum (Cyprinus carpio) criopreservados em meio à base água de coco em pó
(ACP-104)
[Effect of different rates of dilution and freezing protocols on the kinetics and morphology of
sperm of common carp (Cyprinus carpio) cryopreserved in powdered coconut water (ACP-
104)]
F. R. A. Linhares1, C. S. B. Salmito-Vanderley
2, M. A. M. Carvalho
3, R. R. R. Pinheiro
4, F.
C. E. Oliveira5, J. F. Nunes
6
Universidade Estadual do Ceará – UECE – Fortaleza, CE
Resumo
Avaliou-se um protocolo de criopreservação de sêmen de carpa comum em diferentes taxas de
diluição. Do sêmen fresco coletado de 20 machos sexualmente maduros, foram determinadas
as características seminais (aspecto, pH, osmolaridade, volume, morfologia, motilidade
subjetiva e objetiva e velocidade espermática) e a concentração espermática (diluído a 1:4000
em solução de citrato formaldeído 4%). Em seguida, nove pools seminais foram formados e
diluídos em ACP-104 + DMSO 10% nas taxas de diluições de 1:1 ou 1:3, envasados em
palhetas de 0,25 mL e congelados em vapores de nitrogênio líquido em caixa térmica de
poliestireno (-100°C) por 10 minutos, sendo então imersos em nitrogênio líquido (-196 °C) e
armazenados em botijões criogênicos. O sêmen descongelado foi avaliado para os parâmetros
motilidade e velocidade através do programa de análise seminal computadorizada (CASA). A
morfologia espermática do sêmen fresco e criopreservado foram avaliadas em microscopia
óptica usando esfregaços corados com azul de bromofenol. Os dados foram agrupados como
média ± desvio padrão e comparados utilizando ANOVA e teste de Games-Howell,
considerando um nível de significância de 5%. Não houve diferença entre as taxas de
diluições sobre os parâmetros espermáticos e morfológicos de sêmen descongelado de carpa
comum (p>0,05). Embora todos os parâmetros espermáticos e morfológicos analisados entre
as taxas de diluição avaliadas do sêmen criopreservado apresentaram diferença em relação ao
sêmen fresco (controle) (p<0,05), os mesmos são favoráveis para a criopreservação do sêmen
de Cyprinus carpio, apresentando resultados satisfatórios de motilidade total (59,8-67,8%),
velocidades espermáticas (VCL 42,6-46,5μm/s; VSL 33,2-37,1μm/s; VAP 38,9-43,2μm/s) e
baixos índices de anormalidades espermáticas (19,3-19,5%).
Palavras-chave: Cyprinus carpio, sêmen, criopreservação, motilidade espermática
34
Abstract
The objective of this study was to evaluate a cryopreservation protocol of common carp
sperm at different dilution rates. Fresh semen from 20 sexually mature males, seminal
characteristics and concentration (diluted at 1:4000 in a solution of citrate-formaldehyde 4%)
were analysed. Then, nine pools were formed and diluted in ACP-104 or CCSE2 extenders
added of DMSO 10% as cryoprotectant at dilutions rates of 1:1 or 1:3, packed in 0.25 ml
straws and frozen in liquid nitrogen vapor in a styrofoam cooler (-100 °C) for 10 minutes and
then stored in liquid nitrogen (-196 °C). The sperm samples were thawed in water bath at
25°C for 30 seconds and the sperm motility and velocity were estimated using computer
assisted sperm analysis software (CASA). Spermatic abnormalities in fresh and cryopreserved
sperm were analyzed in optical microscopy using bromophenol blue dye. All data were
expressed as mean ± standard deviation and compared using ANOVA and Games-Howell
test, considered at 5% of significance level. There was no difference between the dilution
rates on spermatic and morphological parameters of post-thawed semen of common carp
(p<0.05). Although all spermatic and morphological parameters analyzed between the dilution
rates evaluated showed differences (p<0.05) compared to fresh semen (control) (p<0.05), they
were favorable for the cryopreservation of semen of Cyprinus carpio, yielding satisfactory
results of total motility (59.8-67.8%), sperm velocity (42.6-46.5μm/s VCL, 33.2-37.1μm/s
VSL e 38.9-43.2μm/s VAP) and low rates of sperm abnormalities (19.3-19.5%).
Keywords: Cyprinus carpio, sperm, cryopreservation, sperm motility
Introdução
A carpa comum é uma espécie de alto valor comercial, e com forte apelo culinário e
esportivo, sendo uma das espécies mais cultivadas em todo o mundo, representando 6,14% do
total da produção mundial aquícola (FAO, 2008) e 76,7% da produção de pescado do Brasil
(Echevenguá, 2006). Neste país, a carpa comum foi introduzida no final do século XIX com a
chegada dos primeiros imigrantes (Silva, 2005) e no Nordeste, através do Departamento
Nacional de Obras Contras às Secas (DNOCS) no ano de 1977 (DNOCS, 2009). Entretanto,
nesta região, a renovação do plantel não foi devidamente realizada, elevando-se o grau de
endocruzamentos do estoque reprodutor, comprometendo a saúde, o crescimento e o bem-
estar destes animais.
35
Desde que Blaxter (1953) realizou os primeiros estudos de conservação de gametas de
peixes a baixas temperaturas, a criopreservação seminal vem sendo empregada como uma
ferramenta essencial para a reprodução artificial, possibilitando a preservação de espécies de
peixes ameaçadas de extinção (Viveiros et al., 2012), além da renovação e do aumento da
variabilidade genética de peixes comerciais. Assim, com o objetivo de elaborar protocolos
satisfatórios para a conservação da motilidade espermática de sêmen de carpa comum
(Cyprinus carpio), Irawan et al. (2010) testaram diferentes diluentes e métodos de
criopreservação seminal, obtendo resultados promissores com o diluente CCSE2 combinado
com DMSO 10% e criopreservado em caixa térmica de poliestireno. Já Sultana et al. (2010)
obtiveram melhores taxas de motilidade utilizando o diluente Alsever combinado com etanol
e criopreservado em congelador controlado por computador.
Carvalho et al. (2002) utilizaram com sucesso a água de coco (Cocos nucifera L.)
como diluente de sêmen de carpa (Cyprinus carpio) obtendo resultados satisfatórios na
duração da motilidade espermática quando comparada com a solução de Alsever. A partir
dessas observações, pesquisadores da Universidade Estadual do Ceará desenvolveram uma
tecnologia para liofilizar a água de coco e produzir a água de coco em pó (ACP
Biotecnologia, Fortaleza, Ceará, Brasil), um produto estável e padronizado (Melo et al.,
2010).
Contudo, nenhuma pesquisa foi realizada para investigar o efeito do método de
criopreservação em caixa térmica de poliestireno associado ao diluente água de coco em pó
específico para sêmen de peixes (ACP-104) sobre a qualidade seminal de carpa comum.
Assim, o objetivo da pesquisa foi avaliar os parâmetros cinéticos e de morfologia espermática
em sêmen criopreservado em ACP-104 acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO 10%) sob duas
taxas de diluição de 1:1 e 1:3 pós-descongelação utilizando o método de criopreservação em
caixa térmica de poliestireno.
Material e métodos
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade
Estadual do Ceará (UECE) com a seguinte numeração 11516665-3/63. Vinte machos de carpa
comum (Cyprinus carpio), com idade média de três anos, foram selecionados e mantidos em
viveiros de 350 m2 do Centro de Pesquisas em Aquicultura (CPAq) do Departamento
Nacional de Obras Contra às Secas (DNOCS) no município de Pentecoste – Ceará, local onde
se deram as medições de temperatura da água dos viveiros, coletas de sêmen e as primeiras
avaliações seminais. Após os procedimentos iniciais de aferição do aspecto, pH, volume e
36
motilidade subjetiva seminal, as análises subsequentes de osmolaridade, concentração,
morfologia, motilidade objetiva e velocidades espermáticas foram realizadas no Laboratório
de Biotecnologia da Reprodução de Peixes do Núcleo Integrado de Biotecnologia (LBRP-
NIB) da UECE (Fortaleza, Ceará, Brasil), durante o ano de 2012.
Os animais que liberaram sêmen a partir de uma leve massagem abdominal foram
selecionados, pesados e medidos para receber aplicação única de extrato de pituitária de carpa
(Danúbio Aquicultura Ltda., SC, Brasil) na proporção de 1 mg/Kg de peso vivo, por via
intracelomática, na base da nadadeira peitoral. Doze horas após a indução hormonal da
espermiação, os animais foram previamente anestesiados por meio de imersão de
aproximadamente dois minutos em solução contendo Eugenol (Eugenol, Cequímica Ltda.)
diluído em álcool absoluto e água (1:10:1000). Em seguida, cada animal foi mantido em
decúbito lateral sobre uma esponja (D33) e seu orifício urogenital foi enxuto com papel toalha
para evitar a contaminação do sêmen. O sêmen foi coletado em tubos graduados de
polietileno, realizando-se uma pressão abdominal no sentido ântero-posterior.
Durante as análises seminais, as amostras mantiveram-se conservadas sobre gelo em
escamas em caixas térmicas a uma temperatura de aproximadamente 5 °C. O volume seminal
foi aferido por meio dos tubos graduados. O aspecto seminal foi observado quanto à coloração
e viscosidade considerando-se satisfatórios branco-cremoso ou branco-leitoso (VIEIRA et al.,
2011). O pH foi obtido através da deposição de 20 µL de sêmen sobre as fitas de pH
(MERCK-Alemanha). A análise microscópica subjetiva da motilidade foi estimada utilizando
um microscópio óptico (Nikon Eclipse E200 – ampliação de x400) após a mistura de uma
alíquota de 2 µL de sêmen e 100 µL de água dos viveiros, considerando-se como 0% (zero)
nenhum espermatozoide móvel e 100% todos espermatozoides móveis. Somente as amostras
com o valor superior a 80% de motilidade foram utilizadas, enquanto aquelas contaminadas
com água, fezes, urina ou sangue foram descartadas.
Para cada três animais foram formados um pool, resultando no final em nove pools. Os
pools foram divididos em duas alíquotas e diluídos na proporção 1:1 ou 1:3 (sêmen:diluidor)
em meio à base de água de coco em pó específico para peixes (ACP-104; 300 mOsm.Kg-1
H2O; ACP Biotecnologia, Fortaleza, Ceará, Brasil) acrescido de DMSO 10%
(Dimetilsulfóxido, 315 mOsm.Kg-1
H2O, Cequímica Ltda., Brasil). Durante as diluições o
sêmen e os crioprotetores mantiveram-se em caixas térmicas a aproximadamente 5 °C.
Simultaneamente, três litros (5 cm de profundidade) de nitrogênio líquido foi despejado numa
caixa térmica feito de poliestireno com dimensões de 40 cm de comprimento, 24 cm de
37
largura e 28 cm de altura. Após estabilização da temperatura em -100 °C, os dois tratamentos
foram envasados em seis palhetas francesas de 0,25 mL, resultando em doze palhetas por pool
de sêmen. Um total de 108 palhetas foram distribuídas nas raques e colocadas
horizontalmente sobre um suporte feito de malha de metal a 3 cm da superfície do nitrogênio
líquido. A caixa de poliestireno foi fechada com no máximo quatro raques no seu interior para
evitar variações bruscas de temperatura. Esta foi registrada a cada minuto utilizando um
termômetro de sonda (Headerterm 200, tipo Pt-100, Header Instrumentos Ltda.). A
temperatura média no interior da caixa térmica foi de -100 °C. Após dez minutos, as amostras
foram transferidas para um botijão de nitrogênio líquido (-196 °C). O material criopreservado
foi transportado do DNOCS - Pentecoste até o LBRP-NIB, onde foram estocados por uma
semana.
A osmolaridade (mOsm/Kg) dos nove pools conservados em caixa térmica foi
mensurado por meio de osmômetro digital de refrigeração Peltier (Roebling, Alemanha). Para
a determinação da concentração espermática, 1 µL de sêmen foi diluído em 4 mL de solução
citrato-formol e uma alíquota de 20 µL foram depositados em câmara de Neubauer sob
microscópio óptico em objetiva de 40x. As contagens foram realizadas em cinco quadrantes
nos dois retículos após 15 minutos de sedimentação da amostra, sendo realizadas quatro
repetições por amostra. Os valores que diferiam de 10% foram descartados e uma nova leitura
foi realizada. As médias do número de células contadas nos dois retículos foram
multiplicadas pelo fator 200 x 106, segundo Vieira et al. (2011).
Para a análise morfológica do sêmen foram realizados esfregaços com azul de
bromofenol (1 g azul de bromofenol; 4 g citrato de sódio; 100 mL água destilada; pH 8,0) a
partir da diluição do sêmen fresco (1:500) e descongelado (1:250) em solução citrato-formol a
4%. Em um tubo de polietileno foram misturadas uma alíquota de 6 μL da solução de fixação
com sêmen fresco ou descongelado com 6 μL de azul de bromofenol. Desta mistura foram
depositadas alíquotas de 4 μL em duas lâminas para a realização das leituras em microscópio
óptico (Nikon 102 Eclipse E200 - x400). Assim, para cada tratamento foram confeccionadas
duas lâminas. O exame consistiu na observação das morfoanomalias encontradas na cabeça,
peça intermediária e cauda de 100 espermatozoides por lâmina.
A avaliação do sêmen fresco, considerado grupo controle, foi realizada por meio do
CASA adicionando-se em câmara de contagem Makler®
uma alíquota de 2 µL de sêmen e 100
µL de solução ativadora de NaCl (100 mOsm). Uma semana depois do processo de
criopreservação o sêmen foi descongelado em banho-Maria a 25 °C por 30 segundos e
38
alocado em tubos de polietileno de 2 mL a temperatura ambiente (26 ºC). Uma alíquota de 2
µL de sêmen descongelado foi homogeneizado com 100 µL de solução ativadora de NaCl
(100 mOsm) em câmara de contagem Makler®
e colocado sobre um microscópio de contraste
de fase (Nikon®
H550S, ECLIPSE 50i, Japan), numa ampliação de 400x, com o filtro verde e
posição em pH1.
O microscópio foi conectado a uma câmera de vídeo (Basler Vision Technologies®
A312FC, Ahrensburg, Alemanha) no qual gerou 25 imagens/s. A gravação do vídeo foi
iniciada de três a quatro segundos após a ativação. O vídeo foi analisado usando as
configurações padrões para peixes do software Sperm Class Analyzer®
(SCA®
, Microptics-
Barcelona - Espanha, versão 3.2). Espermatozoides com velocidade menor que 10 µm/s foram
considerados imóveis. O parâmetro para a análise da motilidade foi espermatozoides móveis
totais. Os parâmetros cinéticos avaliados foram: velocidade curvilinear (VCL - μm/s),
velocidade em linha reta (VSL - μm/s) e velocidade média do percurso (VAP - μm/s). Para
determinar essas velocidades, a trajetória de cada espermatozoide (pelo menos 500
espermatozoides/palheta) foi calculada ao longo das 25 imagens/s geradas.
Inicialmente os dados foram submetidos aos Testes de Kolmogorov-Smirnov e de
Levene para confirmação da distribuição normal e homogeneidade de variância entre
tratamentos, respectivamente. O parâmetro cauda enrolada só apresentou normalidade após
transformação logarítima. Confirmado o atendimento das exigências para realização da
Análise de Variância (ANOVA), esta foi executada por meio do software SPSS versão 14.0 e
o teste de Games-Howell foi empregado para comparação das médias. Os resultados foram
expressos como média ± desvio padrão e as diferenças foram consideradas significativas
quando p<0,05.
Resultados e discussão
A temperatura da água dos tanques de manuseio oscilou entre 28 e 29 °C. Os 20
exemplares selecionados de carpa comum (Cyprinus carpio) apresentaram comprimento
médio de 60±2,2 cm e peso médio de 3,0±0,56 Kg. Quatorze horas após a aplicação hormonal
15 machos liberaram sêmen fluido e de coloração branco-leitosa, enquanto cinco machos
liberaram sêmen de coloração branco-cremoso. No presente trabalho a concentração
espermática média encontrada foi de 20,68±2,85x109
espermatozoides/mL, inferior à
concentração espermática de 24,5x109 espermatozoides/mL observado por Kaspar et al.
39
(2007) em carpa comum. Este valor abaixo do encontrado na literatura pode estar relacionado
com a maior quantidade de animais que liberaram sêmen fluido-leitoso, pois quanto maior a
produção de plasma seminal menor será a proporção do número de espermatozoides no
ejaculado.
O valor médio do pH seminal 8,52 encontrado neste trabalho foi próximo ao pH 8,06
do sêmen de exemplares de carpa comum coletados por Akçay et al. (2004) e corrobora com
o pH do sêmen de peixes de água doce que pode variar de 6,5 a 8,5 (Tabares et al., 2005). A
osmolaridade seminal média encontrada foi de 277,6±21,2 mOsm/Kg, estando também de
acordo com os valores encontrados em ciprinídeos (254 a 346 mOsm/Kg) (Alavi e Cosson,
2006).
No presente trabalho o volume médio produzido foi de 28,45 mL, sendo superior aos
volumes 13,26 mL e 6,5 mL encontrados em Cyprinus carpio por Akçay et al. (2004) e Christ
et al. (1996) respectivamente. A maior produção seminal encontrado no estudo pode ter sido
influenciada pelas mudanças físico-químicas (pH, osmolaridade, temperatura, etc.) nas águas
dos viveiros oriundas do período chuvoso durante as coletas seminais (Chaudhuri, 1994). A
taxa média de motilidade subjetiva encontrada foi de 97%, sendo superior aos 88,3%
observados por Akçay et al. (2004) e considerado ótimo para a fertilização encontrada em
ciprinídeos por Kaspar et al. (2007).
Não houve diferença entre as taxas de diluições sobre os parâmetros espermáticos de
sêmen descongelado de carpa comum (p>0,05). No entanto, todos os parâmetros espermáticos
analisados entre as taxas de diluições apresentaram diferença (p<0,05) em relação ao controle
(Tab. 1). A taxa de diluição ideal pode variar dentro de uma mesma espécie conforme o
diluente utilizado para a criopreservação seminal. Irawan et al. (2010) obtiveram uma boa
motilidade espermática (91,7±7,8%) com sêmen descongelado de carpa comum diluído em
CCSE2 e DMSO 10% numa taxa de diluição de 1:1. Por outro lado, Sultana et al. (2010)
obtiveram bons resultados de motilidade espermática (76,67±4,5%) com sêmen descongelado
da mesma espécie diluído em gema de ovo, citrato e DMSO 10% numa taxa de diluição de
1:9. Linhart et al. (2000) também obteveram um valor médio de motilidade espermática
(69±14%) satisfatória utilizando os diluentes Kurokura e DMSO 10% numa taxa de diluição
de 1:5.
40
Tabela 1. Efeito de diferentes taxas de diluição sobre os parâmetros espermáticos de
sêmen descongelado de Cyprinus carpio (n=20) diluído em ACP-104 e DMSO 10%.
Criosolução Diluições Parâmetros espermáticos (μm/s)
Motilidade Total VCL VSL VAP
ACP-104 +
DMSO
1:1 59,8±12,5b 42,6±10,7
b 33,2±9,5
a 38,9±10,6
b
1:3 67,8±10,1b 46,5±7,3
b 37,1±6,8
a 43,2±7,6
b
Controle Sem
diluição
97,1±2,0a 68,9±20,7
a 29,7±9,1
b 45,8±13,2
a
Letras minúsculas distintas, na mesma coluna, indicam diferença significativa entre os
tratamentos (p<0,05).
Além das taxas de diluições, a eficiência crioprotetora aumenta quando os
constituintes criopreservantes apresentam uma combinação de ação interna e externa à célula
espermática (Godinho et al., 2003). Em geral, os diluentes acrescidos de açucares são capazes
de melhorar a motilidade espermática após a descongelação seminal de algumas espécies de
ciprinídeos (Urbányi et al., 2006). O ACP, um produto também formado por açúcares (frutose
e glicose), obteve taxas de motilidade semelhantes aos diluentes padrões para a conservação
de sêmen das espécies curimba (Prochilodus lineatus), piapara (Leporinus obtusiden) e
piracanjuba (Brycon orbignyanus) (Viveiros et al., 2008). No presente estudo, o sêmen
descongelado da carpa obteve resultados próximos dos apresentados pela literatura, portanto
satisfatórios de motilidade espermática de 59,8±12,5% e 67,8±10,1% para as taxas de
diluições 1:1 e 1:3, respectivamente, utilizando o diluente ACP-104 + DMSO 10%.
As velocidades espermáticas para as diluições 1:1 e 1:3 foram, respectivamente de
42,6 e 46,5 μm/s para VCL; 33,2 e 37,1 μm/s para VSL; e 38,9 e 43,2 μm/s para VAP. Estes
valores foram abaixo dos encontrados por Christ et al. (1996) (142-193 μm/s em VCL, e 64-
129 μm/s em VSL) com sêmen fresco de carpa comum tratadas hormonalmente com extrato
hipofisário de carpa. No entanto, segundo Haugland et al. (2009), a velocidade dos
espermatozoides pode variar dentro ou entre ejaculados. Viveiros et al. (2010), utilizando o
ACP-104 para a conservação de sêmen de curimba (Prochilodus lineatus), obtiveram valores
médios de velocidade espermática (VCL 53,7±25,1 µm/s; VSL 23,6±8 µm/s; e VAP
36,8±14,8 µm/s) semelhantes aos valores encontrados na presente pesquisa. Além disso, o
ACP-104 equiparou-se ao diluidor padrão (glicose) utilizado na criopreservação seminal de
41
curimba (Prochilodus lineatus) (49,1±19,3 µm/s; 24,3±7,4 µm/s; e 36,0±13,1 µm/s),
demonstrando que o mesmo é eficiente para a conservação de gametas de algumas espécies de
peixes.
Não houve diferença entre as taxas de diluição sobre os parâmetros morfológicos de
sêmen descongelado de carpa comum (p>0,05). No entanto, todos os parâmetros
morfológicos analisados entre as taxas de diluição apresentaram diferença (p<0,05) em
relação ao controle (Tab. 2). No presente estudo, observou-se um total de 4,7% de
anormalidades espermáticas com sêmen fresco e uma média de 19,4% de anormalidades
espermáticas entre as taxas de diluição com sêmen descongelado.
Tabela 2. Efeito de diferentes taxas de diluições sobre os parâmetros morfológicos
de sêmen descongelado de Cyprinus carpio (n=20) diluído em ACP-104 e DMSO
10%.
Criosolução
Diluições
Parâmetros morfológicos (%)
Normal Macrocefalia Cauda
Enrolada
Cauda
Dobrada
ACP-104 +
DMSO
1:1 80,4±4,7b 4,5±2,9
a 7,6±5,5
a 7,4±3,8
a
1:3 81,4±2,8b 4,6±4,2
a 6,2±6,3
a 8,5±4,1
a
Controle Sem
diluição
95,1±1,8a 0,03±0,1
b 2,2±1,5
b 2,5±1,6
b
Letras minúsculas distintas, na mesma coluna, indicam diferença significativa
entre os tratamentos (p<0,05).
As anormalidades mais frequentes encontradas no sêmen fresco e descongelado foram
macrocefalia, cauda enrolada e cauda dobrada (Fig. 1), não existindo a ocorrência das
anormalidades cabeça estourada, gota citoplasmática distal, gota citoplasmática proximal e
cauda quebrada. Este aumento de 14,7% de alterações morfológicas espermáticas entre o
sêmen fresco e o descongelado podem ter sido ocasionadas pelas crioinjúrias sofridas pelos
espermatozoides durante a conservação a baixas temperaturas. Segundo Fabbrocini et al.
(2000), as crioinjúrias são provocados pela ineficácia do processo de congelação e pela
toxicidade do crioprotetor.
42
No presente trabalho, o DMSO foi escolhido por ser um crioprotetor comumente
utilizado para criopreservar sêmen de peixes (Routray et al., 2007). Porém, seus efeitos
nocivos ao sêmen de carpa, já relatado por Lubzens et al. (1997), podem ter contribuído para
o surgimento das alterações morfológicas espermáticas. Apesar disso, a ocorrência de 19,4%
de patologias espermáticas encontradas no sêmen descongelado de carpa comum poderá ter
pouca influência sobre o sucesso da fertilização, visto que ainda não existe uma definição do
número aceitável de anormalidades espermáticas para sua utilização em programas de
fertilização assistida. Além disso, este índice encontra-se abaixo do recomendado pelo
Congresso Brasileiro de Reprodução Animal que preconiza a utilização de sêmen com índices
de anormalidade de até 30%, em bovinos e equinos, e de 20%, em ovinos e suínos (CBRA,
1998).
Em conclusão, o diluente ACP-104 combinado ao DMSO 10% mostrou-se eficaz na
criopreservação de sêmen de carpa comum não havendo diferença significativa entre as taxas
de diluição 1:1 e 1:3 nos parâmetros avaliados, de modo que esta tecnologia poderá promover
futuramente o aumento da variabilidade genética destas espécies no estado do Ceará em
programas de fertilização assistida.
43
Figura 1. Morfologia observada no sêmen fresco de Cyrinus carpio e descongelado em
diferentes taxas de diluição. N - espermatozoide normal; Mc - espermatozoides com
macrocefalia; Ce - espermatozoide com cauda enrolada; Cd - espermatozoide com cauda
dobrada. Corante azul de bromofenol. Aumento x400.
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47
7 CAPÍTULO 2
EFEITO DE DIFERENTES TAXAS DE DILUIÇÃO E PROTOCOLOS DE
CONGELAÇÃO SOBRE A CINÉTICA E MORFOLOGIA DE ESPERMATOZOIDES
DE CARPA COMUM (Cyprinus carpio) CRIOPRESERVADOS EM ÁGUA DE COCO
EM PÓ (ACP-104)
Periódico: Animal Reproduction Science
Será brevemente submetido
Fator de impacto: 1.750
48
EFEITO DE DIFERENTES TAXAS DE DILUIÇÃO E PROTOCOLOS DE
CONGELAÇÃO SOBRE A CINÉTICA E MORFOLOGIA DE ESPERMATOZOIDES
DE CARPA COMUM (Cyprinus carpio) CRIOPRESERVADOS EM ÁGUA DE COCO
EM PÓ (ACP-104)
F. R. A. Linhares1, C. S. B. Salmito-Vanderley
2, C. C. M. S. Salgueiro
3, J. F. Nunes
4
Universidade Estadual do Ceará – UECE – Fortaleza, CE
Resumo
O objetivo desse trabalho foi avaliar um protocolo de criopreservação de sêmen de carpa
comum em meio à base de água de coco em pó específico para peixes (ACP-104) e solução à
base de NaCl e sacarose (CCSE2) utilizando dois métodos de congelação. Após a coleta do
sêmen fresco foram determinadas as características seminais e a concentração espermática.
Em seguida, onze pools seminais foram formados e diluídos em ACP-104 + DMSO 10% ou
CCSE2 + DMSO 10% na taxa de diluição de 1:3 usando palhetas de 0,25 mL. Os quatro
tratamentos resultantes foram duplicados e congelados em vapores de nitrogênio líquido em
dryshipper ou caixa térmica de poliestireno, sendo imersos em nitrogênio líquido após 10
minutos. O sêmen foi descongelado em banho-Maria a 25 °C por 30 segundos e avaliados os
parâmetros de motilidade e velocidade seminal utilizando o CASA. A análise das anomalias
espermáticas do sêmen fresco e descongelado foi realizada utilizando o corante azul de
bromofenol. Não houve diferença entre os quatro tratamentos envolvendo os dois diluidores
(ACP-104 e CCSE2) e os dois métodos de congelação (dry shipper ou caixa térmica de
poliestireno) sobre os parâmetros espermáticos e morfológicos de sêmen descongelado de
carpa comum (p>0,05). Embora todos os parâmetros espermáticos e morfológicos analisados
entre os quatro tratamentos apresentaram diferença (p<0,05) em relação ao controle, os
mesmos são favoráveis para a criopreservação do sêmen de Cyprinus carpio, apresentando
resultados satisfatórios de motilidade total (61,8-66,0%), velocidades espermáticas (39,5-
49
50,1μm/s VCL; 30,2-40,6μm/s VSL; e 35,5-47,4μm/s VAP) e baixos índices de
anormalidades espermáticas (17,3-19,8%).
Palavras-chave: Cyprinus carpio. Sêmen. Criopreservação. Motilidade espermática. ACP-
104.
Introdução
A carpa comum, cultivada pelos chineses há mais de 2000 anos (Balon, 1995), é uma
espécie de alto valor comercial, forte apelo culinário e esportivo (FAO, 2008), sendo uma das
espécies mais cultivadas em todo o mundo devido a sua tolerância e resistência a uma ampla
variedade de habitats aquáticos (Page e Burr, 1991; Froese e Pauly, 2002). A carpa comum foi
introduzida no Brasil no final do século XIX (Silva, 2005) e atualmente sua produção já
representa 76,7% da produção nacional (Echevenguá, 2006). Entretanto, no nordeste do Brasil
a renovação do plantel não foi devidamente realizada, elevando-se o grau de endocruzamentos
do estoque reprodutor, comprometendo a saúde, o crescimento e o bem-estar destes animais.
Neste âmbito, estudos de biologia molecular associado à biotécnicas como a
reprodução artificial em cativeiro a partir da indução hormonal e a criopreservação seminal
vêm contribuindo para maximizar a reprodução e o melhoramento genético de espécies
comerciais, prevenindo também a extinção destes animais (Viveiros et al., 2012). A
conservação de gametas masculinos a baixas temperaturas utiliza-se de protocolos específicos
para cada espécie.
Durante elaboração da biotécnica, pesquisas relacionadas aos equipamentos de
congelação e criodiluentes são de grande importância para a realização de programas de
fertilização, uma vez que os danos causados pelo frio influenciam a sobrevivência
espermática através da redução do número de células viáveis. Dentre os diluentes utilizados,
50
destaca-se a água de coco em pó, um bioproduto desenvolvido por pesquisadores da
Universidade Estadual do Ceará (Melo et al., 2010). A água de coco (Cocos nucifera L.) foi
utilizada com sucesso como diluente de sêmen de carpa (Cyprinus carpio L.) obtendo
resultados satisfatórios na duração da motilidade espermática quando comparada com a
solução de Alsever (Carvalho et al., 2002).
O ACP-104, específico para peixes, também vem obtendo bons resultados de
motilidade espermática com espécies de peixes nativas brasileiras como o tambaqui (Vieira,
2010; Leite, 2011) e a pirapitinga (Velásquez-Medina, 2008; Pessoa, 2009). Contudo,
nenhuma pesquisa foi realizada para investigar o efeito dos diferentes métodos de
criopreservação utilizando o diluente seminal água de coco em pó (ACP-104) sobre a cinética
e morfologia de espermatozoides de carpa comum. O desenvolvimento de um protocolo de
criopreservação seminal de carpa comum (Cyprinus carpio) com água de coco em pó poderá
contribuir para a padronização de um protocolo simples e eficaz.
Assim, o objetivo da pesquisa foi avaliar os parâmetros cinéticos e de morfologia
espermática de sêmen fresco e diluído em ACP-104 e CCSE2 (Irawan et al., 2011) acrescido
de 10% dimetilsulfóxido (DMSO 10%) descongelado utilizando os métodos de
criopreservação em dry shipper e caixa térmica de poliestireno.
Materiais e métodos
Coleta dos gametas e início da avaliação seminal
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade
Estadual do Ceará (CEUA) com a seguinte numeração 11516665-3/63. As coletas de sêmen
foram realizados no Centro de Pesquisas em Aquicultura (CPAq) do Departamento Nacional
de Obras Contra as Secas (DNOCS) em Pentecoste - Ceará, local onde se deram as onde se
51
deram as medições de temperatura da água dos viveiros, e as primeiras avaliações seminais.
Após os procedimentos iniciais de aferição do aspecto, pH, volume e motilidade subjetiva
seminal, as análises subsequentes de osmolaridade, concentração, morfologia, motilidade
objetiva e velocidades espermáticas foram realizadas no Laboratório de Biotecnologia da
Reprodução de Peixes do Núcleo Integrado de Biotecnologia (LBRP-NIB) da UECE
(Fortaleza, Ceará, Brasil), durante o ano de 2012.
Os 30 machos (Cyprinus carpio) sexualmente maduros foram mantidos em viveiros
(350 m2). Os animais selecionados foram pesados, medidos e receberam, por via intra
celomática na base da nadadeira peitoral, uma aplicação única de extrato de pituitária de carpa
(Danúbio Aquicultura Ltda., SC, Brasil) na proporção de 1 mg/Kg de peso vivo. Doze horas
após a indução hormonal, os animais foram mergulhados individualmente num tanque em
solução anestésica de Eugenol (Eugenol; Cequímica Ltda.) diluído em álcool absoluto e água
(1:10:1000) por aproximadamente dois minutos. Durante a coleta do sêmen, os animais foram
contidos em decúbito lateral sobre uma esponja (D33) e envolvidos com um pano úmido
sobre os olhos para minimizar o estresse. O orifício urogenital foi enxuto com papel toalha e o
sêmen foi coletado em tubos graduados de polietileno realizando-se uma pressão abdominal
no sentido ântero-posterior.
As amostras mantiveram-se conservadas sobre gelo em escamas em caixas térmicas a
uma temperatura de aproximadamente 5 °C durante as análises seminais. O volume (ml)
seminal foi aferido por meio de tubos graduados e o aspecto seminal a partir da observação
visual quanto à coloração e viscosidade considerando-se satisfatórios branco-cremoso ou
branco-leitoso (Vieira et al., 2011). O pH (0-14) foi obtido através da deposição de 2 µl de
sêmen sobre as fitas de pH (MERCK-Alemanha). A análise microscópica subjetiva da
motilidade foi estimada utilizando um microscópio óptico (Nikon Eclipse E200 – ampliação
de x400) após a mistura de uma alíquota de 2 µL de sêmen e 100 µL de água do tanque,
52
considerando-se como 0% (zero) nenhum espermatozoide móvel e 100% (cem) todos
espermatozoides móveis. Somente as amostras com o valor superior a 80% de motilidade
foram utilizadas, enquanto aquelas contaminadas com água, fezes, urina ou sangue foram
descartadas.
Criopreservação seminal
Os ejaculados de cada três animais formaram um pool, resultando no final em 11
pools. Os pools foram diluídos na proporção 1:3 (sêmen:diluente) ao diluente à base de água
de coco em pó específico para peixes ACP-104 (ACP Biotecnologia, Fortaleza, Ceará, Brasil;
300 mOsm.Kg-1
H2O) ou CCSE2 (0,3427g NaCl, 3,4314g sacarose, 100 mL água destilada,
21 µL NaOH, 0,5 mL antibiótico, pH 7,7, osmolalidade 325 mmol/Kg; Irawan et al., 2010)
acrescidos de DMSO 10% (Cequímica Ltda.; 315 mOsm.Kg-1
H2O). Os dois criodiluentes,
juntamente com o sêmen, mantidos em caixas térmicas a aproximadamente 5 °C, foram
criopresevados nos métodos de dry shipper ou caixa térmica de poliestireno. Os quatro
tratamentos resultante da combinação diluente x método de congelação foram envasados em
seis palhetas francesas de 0,25 mL, totalizando 24 palhetas por pool de sêmen formado. Do
total de 264 palhetas para os 11 pools formados, 132 foram imediatamente congeladas em
dryshipper (Cryofarm) por 10 minutos numa taxa de refrigeração de aproximadamente 25–40
°C/min com estabilização gradual de -181 °C em 3 min (Taitson et al., 2007), e em seguida,
transferidas para um botijão de nitrogênio líquido a -196 °C.
Simultaneamente, foi despejado três litros (5 cm de profundidade) de nitrogênio
líquido numa caixa térmica de poliestireno com dimensões de 40 cm de comprimento, 24 cm
de largura e 28cm de altura. Após estabilização da temperatura em -100 °C, o restante das
palhetas foram distribuídas nas raques e colocadas horizontalmente sobre um suporte feito de
malha de metal a 3 cm da superfície do nitrogênio líquido. A caixa de poliestireno era fechada
com no máximo quatro raques no seu interior para evitar variações bruscas de temperatura.
53
Esta foi registrada a cada minuto utilizando um termômetro de sonda (Headerterm 200, tipo
Pt-100, Header Instrumentos Ltda.). Após 10 minutos as amostras foram transferidas para um
botijão criogênico (-196 °C). O material criopreservado foi transportado do DNOCS -
Pentecoste até o LBRP-NIB, onde foram estocados por uma semana.
Concentração espermática e análise morfológica do sêmen
No LBRP-NIB os valores de osmolaridade (mOsm/Kg) dos 11 pools foram
mensurados por meio de osmômetro digital de refrigeração Peltier (Roebling, Alemanha). O
sêmen também foi diluído em solução citrato-formol a 4% na proporção de 1:4000 (1 µL
sêmen: 4 mL do diluente). Desta diluição, 20 µL foram depositados em câmara de Neubauer
sob microscópio óptico em objetiva de 40x. As contagens foram realizadas em cinco
quadrantes nos dois retículos após 15 minutos de sedimentação da amostra, sendo realizadas
quatro repetições por amostra. Os valores que diferiam de 10% foram descartados e uma nova
leitura foi realizada. As médias do número de células contadas nos dois retículos foram
multiplicadas pelo fator 200 x 106, segundo Vieira et al. (2011).
Para a análise morfológica do sêmen foram confeccionados esfregaços com azul de
bromofenol (1 g azul de bromofenol; 4 g citrato de sódio; 100 ml água destilada; pH 8,0) a
partir da diluição do sêmen fresco (1:500) e descongelado (1:250) em solução citrato-formol a
4%. Em um tubo de polietileno foram misturadas uma alíquota de 6 μL da solução de fixação
com sêmen fresco ou descongelado com 6 μL de azul de bromofenol. Desta mistura foram
depositadas alíquotas de 4 μl em duas lâminas para a realização das leituras em microscópio
óptico (Nikon 102 Eclipse E200 - x400). Assim, para cada tratamento foram confeccionadas
duas lâminas. O exame consistiu na observação das morfoanomalias encontradas na cabeça,
peça intermediária e cauda de 100 espermatozoides por lâmina focalizados em diversos
campos ao longo de toda a lâmina.
54
Avaliação do sêmen auxiliada por computador (CASA)
A avaliação do sêmen fresco, considerado grupo controle, foi realizada por meio do
CASA adicionando-se em câmara de contagem Makler®
uma alíquota de 2 µL de sêmen e 100
µL de solução ativadora de NaCl (100 mOsm). Uma semana depois do processo de
criopreservação, o sêmen foi descongelado em banho-Maria a 25 °C por 30 segundos e
alocado em tubos de polietileno de 2 mL à temperatura ambiente de 26 ºC. Uma alíquota de 2
µL de sêmen descongelado foi homogeneizado com 100 µL de solução ativadora de NaCl
(100 mOsm) em câmara de contagem Makler®
e colocado sobre um microscópio de contraste
de fase (Nikon®
H550S, ECLIPSE 50i, Japan), numa ampliação de x400, com o filtro verde e
posição em pH1. O microscópio foi conectado a uma câmera de vídeo (Basler Vision
Technologies®
A312FC, Ahrensburg, Alemanha) no qual gerou 25 imagens/s. A gravação do
vídeo foi iniciada de três a quatro segundos após a ativação.
Cada imagem (n=25) foi analisada usando as configurações padrões para peixes do
software Sperm Class Analyzer®
(SCA®
, Microptics-Barcelona - Espanha, versão 3.2).
Espermatozoides com velocidade menor que 10 µm/s foram considerados imóveis. O
parâmetro para a análise da motilidade foi espermatozoides móveis totais. Dentre os
parâmetros espermáticos cinéticos foram avaliados: velocidade curvilinear (VCL - μm/s),
velocidade em linha reta (VSL - μm/s) e velocidade média do percurso (VAP - μm/s). Para
determinar essas velocidades, a trajetória de cada espermatozoide (pelo menos 500
espermatozoides/palheta) foi calculada ao longo das 25 imagens/s geradas.
Análise estatística
Inicialmente os dados foram submetidos aos Testes de Kolmogorov-Smirnov e de
Levene para confirmação da distribuição normal e homogeneidade de variância entre
tratamentos, respectivamente. O parâmetro cauda enrolada só apresentou normalidade após
transformação logarítima. Confirmado o atendimento das exigências para realização da
55
Análise de Variância (ANOVA), esta foi executada por meio do software SPSS versão 14.0 e
o teste de Games-Howell foi empregado para comparação das médias, considerando um nível
de significância de 5%. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão.
Resultados
Os 30 exemplares selecionados de carpa comum, Cyprinus carpio, apresentaram
comprimento médio de 60±2,2 cm e peso médio de 3,0±0,56 Kg. A temperatura da água dos
tanques de manuseio oscilou entre 28 e 29 °C. Quatorze horas após a aplicação hormonal 20
machos liberaram sêmen fluido e de coloração branco-leitosa, enquanto dez machos liberaram
sêmen de coloração branco-cremoso. O valor médio do pH foi de 8,48 e o volume seminal
encontrado foi de 25,14 mL. A taxa média de motilidade subjetiva encontrada foi de 96,45%,
enquanto a concentração espermática média foi 20,56±3,08x109
espermatozoides/mL e a
osmolaridade média foi 286,7±46,3 mOsm/Kg.
Não houve diferença entre os quatro tratamentos envolvendo os dois diluentes (ACP-
104 e CCSE2) e os dois métodos de congelação (dry shipper ou caixa térmica de poliestireno)
sobre os parâmetros espermáticos (Tab. 1) e morfológicos (Tab. 2) do sêmen descongelado de
carpa comum (p<0,05). No entanto, todos os parâmetros espermáticos e morfológicos
analisados entre os quatro tratamentos apresentaram diferença significativa (p<0,05) em
relação ao controle.
56
Tabela 1. Efeito dos métodos de congelação dry shipper ou caixa de poliestireno sobre os parâmetros
espermáticos de sêmen descongelado de Cyprinus carpio (n=30) diluído em ACP-104 e DMSO 10%
ou CCSE2 e DMSO 10%.
Criosoluções
Métodos de
congelação
Parâmetros espermáticos
Motilidade
Total
VCL VSL VAP
ACP-104 +
DMSO 10%
Dry shipper 62,3±13,4b
50,1±12,4b
40,6±11,9a
47,4±13,8b
Caixa de
poliestireno
66,0±10,5b
47,0±6,9b
37,6±6,2a
43,7±7,2b
CCSE2 +
DMSO 10%
Dry shipper 64,4±15,6b
42,9±8,0b
32,6±7,3a
38,6±8,1b
Caixa de
poliestireno
61,8±10,7b
39,5±7,1b
30,2±6,5a
35,5±7,1b
Controle Nenhum 96,8±2,2a
66,8±19,1a
28,4±8,9b
43,9±12,6a
Letras minúsculas distintas, na mesma coluna, indicam diferença significativa entre os tratamentos
(p<0,05).
Tabela 2. Efeito dos métodos de congelação dry shipper ou caixa de poliestireno sobre os parâmetros
morfológicos de sêmen descongelado de Cyprinus carpio (n=30) diluído em ACP-104 e DMSO 10%
ou CCSE2 e DMSO 10%.
Criosoluções
Métodos de
congelação
Parâmetros morfológicos
Normal Macrocefalia Cauda
Enrolada
Cauda
Dobrada
ACP-104 +
DMSO 10%
Dry shipper 80,4±6,7
b 5,8±5,7
a 5,1±6,0
a 8,9±5,0
a
Caixa de
poliestireno 81,9±2,8b
4,1±4,0a
6,4±6,0a
8,1±3,8a
CCSE2 +
DMSO 10%
Dry shipper 82,3±6,1b
4,2±2,5a
6,1±6,0a
7,0±5,4a
Caixa de
poliestireno
82,3±6,3b
6,2±2,3a
4,5±3,1a
6,6±4,9a
Controle Nenhum 95,0±1,6a
0,02±0,09b
2,1±1,4b
2,5±1,5b
Letras minúsculas distintas, na mesma coluna, indicam diferença significativa entre os tratamentos
(p<0,05).
57
A motilidade média total encontrada entre os tratamentos foi de 63,6% e as
velocidades espermáticas variaram de 39,5-50,1 μm/s em VCL; 30,2-40,6 μm/s em VSL; e
35,5-47,4 μm/s em VAP. No presente estudo, observou-se um total de 4,6% de anormalidades
espermáticas com sêmen fresco e uma média de 18,2% de anormalidades espermáticas entre
os quatro tratamentos com sêmen descongelado. As anormalidades mais frequentes
encontradas no sêmen fresco e descongelado foram macrocefalia, cauda enrolada e cauda
dobrada (Fig. 1), não existindo a ocorrência das anormalidades cabeça estourada, gota
citoplasmática distal, gota citoplasmática proximal e cauda quebrada.
Figura 1. Morfologia observada no sêmen fresco de Cyrinus carpio e descongelado após
submetido a quatro tratamentos. N - espermatozoide normal; Mc - espermatozoides com
58
macrocefalia; Ce - espermatozoide com cauda enrolada; Cd - espermatozoide com cauda
dobrada. Corante azul de bromofenol. Ampliação x400.
Discussão
O valor médio do pH seminal 8,48 e mL e a concentração espermática média
encontrada 20,56±3,08x109
espermatozoides/mL foram semelhantes aos resultados de
Bozkurt et al. (2005) que encontraram também para a carpa comum um pH seminal de
7,9±0,21 e concentração seminal de 19,71±3,91x109 espermatozoides/ml. No entanto, a
concentração espermática na pesquisa foi inferior a concentração espermática 24,5x109
espermatozoides/mL observada por Kaspar et al. (2007) e pode estar relacionada a maior
quantidade de animais que liberaram sêmen fluido-leitoso diminuindo a proporção do número
de espermatozoides no ejaculado.
O volume seminal encontrado de 25,14 mL foi superior ao relatado por Bozkurt et al.
(2005) de 13,9±11,4 ml de sêmen e por Akçay et al. (2004) de 13,26 mL encontrados em
Cyprinus carpio. A maior quantidade de sêmen produzido durante o período das coletas
seminais pode ter sido pelas mudanças físico-químicas (pH, osmolaridade, temperatura, etc.)
nas águas dos viveiros oriundas do período chuvoso durante as coletas seminais (Chaudhuri,
1994). A osmolaridade média encontrada de 286,7±46,3 mOsm/Kg corrobora com os valores
encontrados em ciprinídeos (254 a 346 mOsm/Kg) (Alavi e Cosson, 2006).
Os quatro tratamentos não diferiram sobre os parâmetros espermáticos de sêmen
descongelado de carpa comum. Porém, todos os tratamentos obtiveram bons resultados de
motilidade total, demonstrando que os dois diluentes combinados com os dois métodos de
congelação podem ser utilizados para a criopreservação seminal de carpa comum. O sucesso
do procedimento de conservação de gametas pode ser atribuída a eficiência crioprotetora dos
constituintes criopreservantes que apresentam uma combinação de ação interna e externa à
59
célula espermática (Godinho et al., 2003). Isto se deve provavelmente a sacarose presente na
composição do CCSE2 que atua como um crioprotetor não penetrante estabilizando a
membrana plasmática durante a congelação (Gwo, 2000).
O ACP-104, um composto também formado por açucares, obteve taxas de motilidade
semelhantes aos diluentes padrões para a conservação de sêmen das espécies curimba
(Prochilodus lineatus), piapara (Leporinus obtusiden) e piracanjuba (Brycon orbignyanus)
(Viveiros et al., 2008). No presente trabalho o DMSO foi escolhido como crioprotetor em
relação ao glicerol, metanol e dimetil-acetamida por apresentar boas taxas de motilidade e
fertilização em muitas pesquisas com ciprinídeos (Alvarez et al., 2003; Warnecke e Pluta,
2003).
As velocidades espermáticas VCL (39,5-50,1 μm/s) e VSL (30,2-40,6 μm/s) foram
abaixo dos valores encontrados por Christ et al. (1996) (142-193 μm/s em VCL e 64-129 μm/s
em VSL). Entretanto, este parâmetro pode variar dentro ou entre ejaculados, pois de acordo
com Haugland et al. (2009) a alta velocidade individual de alguns espermatozoides dentro de
um ejaculado podem ser suficientes para se obter boas taxas de fertilização. Essa diferença já
foi relatado por Li et al. (2010) que observou que as amostras de sêmen descongelado de
carpa comum separadas por um gradiente de percol obtiveram uma a proporção de
espermatozoides móveis (65,81±5,19%) e velocidade (77,58±31,07µm/seg)
significativamente superiores em relação a motilidade (23,36±2,98%) e velocidade
espermática (55,55±19,03µm/seg) das mesmas amostras não separadas pelo gradiente. Isto
demonstra que alguns espermatozoides são mais resistentes ao processo de criopreservação.
Assim, Billard et al. (2004) obteve 73% a 93% de taxas de fertilização com apenas 10% de
motilidade espermática de sêmen descongelo de esturjão, enquanto Menezes et al. (2008)
obteve 76% de taxas de fertilização com 20% de motilidade espermática de sêmen
criopreservado de Colossoma macropomum. Dessa forma, as baixas taxas de velocidades
60
espermáticas encontradas no trabalho para a espécie Cyprinus carpio ainda podem
proporcionar resultados satisfatórias nas taxas de fertilização.
Além disso, os dois métodos de congelação seminal empregados também foram
eficientes. No presente estudo o sêmen de carpa comum diluído em ACP-104 ou CCSE2 e
congelado a 3 cm da superfície do nitrogênio líquido por 10 min. em caixa térmica de
poliestireno contribuiu para obtenção de bons resultados de motilidade total com média de
63,9%. Na literatura, Irawan et al. (2010) obteve as melhores taxas de motilidade espermática
(91,7%) quando o sêmen de carpa comum diluído em CCSE2 com DMSO foi mantido a 2cm
da superfície no nitrogênio líquido por 10 min. Os bons resultados de motilidade total com
média de 63,3% também se repetiram quando o sêmen da mesma espécie foi diluído em
qualquer um dos dois diluidores utilizados na pesquisa e congelado em dryshipper por 10
min. O mesmo fato ocorreu com Viveiros et al. (2012) que utilizou o equipamento dryshipper
com sucesso para a criopreservação de sêmen da espécie Brycon insignis obtendo boas taxas
de motilidade (67%) e velocidade espermática (122 µm/seg VCL, 87 µm/seg VSL e 103
µm/seg VAP).
No presente estudo observou-se um total de 4,6% de anormalidades espermáticas com
sêmen fresco e uma média de 18,2% de anormalidades espermáticas entre os quatro
tratamentos com sêmen descongelado. O aumento de 13,6% de alterações morfológicas
espermáticas entre o sêmen fresco e criopreservado devem ter sido ocasionadas pelas
crioinjúrias sofridas pelos espermatozoides durante a conservação a baixas temperaturas.
Streit Jr. et al. (2009) relatam que o processo de criopreservação e o tempo de exposição a
solução crioprotetora DMSO pode ter ocasionado choque osmótico, aumentando a ocorrência
de espermatozoides com anomalias. Fabbrocini et al. (2000) também afirmam que o
aparecimento de patologias espermáticas após a congelação pode estar relacionada com a
ineficiência no processo de criopreservação.
61
Dessa forma, os métodos de congelação utilizados no presente trabalho assim como a
exposição dos gametas ao DMSO podem ter contribuído para o aumento do número de
alterações morfológicas espermáticas do sêmen descongelado de carpa comum. No entanto, o
Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1998) recomenda não utilizar, na inseminação
artificial ou monta natural de mamíferos, sêmen com índices acima de 30% de
espermatozoides com anormalidades. Neste trabalho, os índices de espermatozoides com
anormalidades registrados em carpa comum atingiram valores em torno de 18,2%. Este valor
pode ser julgado baixo, se comparado ao considerado aceitável para mamíferos, porém, em
peixes, essas referências ainda não foram estabelecidas.
No presente trabalho ocorreu aglutinação gelatinosa de sêmen descongelado nos
tratamentos envolvendo os diluentes ACP-104 combinado com DMSO 10% e congelado em
dry shipper ou caixa térmica de poliestireno. Este fenômeno pode estar relacionado com o
efeito da interação da composição do diluente, crioprotetor e o método de cogelação, uma vez
que os tratamentos com sêmen diluídos em CCSE2 combinado com o mesmo crioprotetor e
congelados com os mesmos métodos de congelação não produziram aglutinação após a
descongelação. A aglutinação de sêmen descongelado de carpa já foi relatado por Irawan et
al. (2010) que encontraram o mesmo fenômeno com sêmen diluído em CCSE6 e DMSO ou
propilenoglicol. Horváth et al. (2003) também relataram uma aglutinação do sêmen
descongelado de carpa comum diluído em solução a base de açúcar (sacarose, glicose ou
frutose) independentemente dos crioprotetores (DMSO ou metilglicol) usados. Enquanto Gwo
e Arnold (1992) observaram uma aglutinação de sêmen de Micropogonias undulatus
criopreservado em solução de citrato acrescido de DMSO. Dessa forma, a presença de citrato
e açúcares na composição do ACP-104 pode ser responsável pela aglutinação do sêmen
descongelado ocorridos em alguns tratamentos. Entretanto, esse fenômeno observado por
Horváth et al. (2003) após a criopreservação do sêmen diluído em soluções a base de açucares
62
não reduziram as taxas de fertilização e eclosão. Com base nestes resultados, as amostras de
sêmen de carpa criopreservadas que sofreram aglutinação podem ser utilizados para a
fertilização assistida.
A água de coco em pó (ACP-104) é uma substância estável, padronizada e facilmente
estocada favorecendo seu transporte e utilização durante os processos de diluição seminal
(Melo et al., 2010). O uso do diluente ACP-104 associado ao DMSO 10% para congelar o
sêmen de carpa comum em vapor de nitrogênio líquido utilizando o equipamento dry shipper
pode contribuir para o desenvolvimento de um protocolo simples de criopreservação seminal
objetivando a elaboração de programas de melhoramento genético para piscicultura,
repovoamento dos estoques nativos, preservação de material genético de espécies em risco de
extinção e na formação de bancos de genes no estado do Ceará. No entanto, o protocolo de
criopreservação seminal utilizando o equipamento caixa térmica de poliestireno é considerado
um método subjetivo e complexo para sua execução, descartando a possibilidade de utiliza-lo
para tal finalidade.
Agradecimentos
Ao Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), pelo apoio de
laboratórios e estruturas de pesquisa, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro e a empresa ACP Biotecnologia, pela doação da
água de coco em pó (ACP-104).
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68
8 CONCLUSÕES
Em conclusão, o diluente ACP-104 combinado ao DMSO 10% mostrou-se eficaz na
criopreservação de sêmen de carpa comum não havendo diferença significativa entre as taxas
de diluição 1:1 e 1:3 nos parâmetros avaliados. Além disso, o sêmen desta espécie pode ser
preservado com sucesso utilizando os diluentes ACP-104 ou CCSE2 adicionado a DMSO
10% na taxa de diluição de 1:1 ou 1:3 e congelados em dry shipper ou caixa térmica de
poliestireno.
69
9 PERSPECTIVAS
A água de coco em pó (ACP-104) é uma substância estável, padronizada e facilmente
estocada favorecendo seu transporte e utilização durante os processos de diluição seminal. O
uso do diluente ACP-104 associado ao DMSO para congelar o sêmen de carpa comum em
vapor de nitrogênio líquido utilizando caixa térmica pode contribuir para o desenvolvimento
de um protocolo simples de criopreservação seminal objetivando a elaboração de programas
de melhoramento genético para piscicultura, repovoamento dos estoques nativos, preservação
de material genético de espécies em risco de extinção e na formação de bancos de genes. Esta
tecnologia poderá auxiliar na produção de animais geneticamente melhorados, promovendo o
aumento da variabilidade genética das espécies de carpa comum no estado do Ceará. Serão
necessárias pesquisas sobre o uso dos protocolos atuais em programas de fertilização
assistida, visando a estocagem de espermatozoides e futuramente a criopreservação de óvulos
para a constituição de um banco de germoplasma.
Assim, o trabalho tem como perspectivas estudar a viabilidade do sêmen de carpa
comum, diluído em água de coco em pó (ACP-104) e DMSO 10% nas taxas de diluições 1:1 e
1:3 e congelados no método de dry shipper na fertilização assistida.
70
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