UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

FACULDADE DE VETERINÁRIA Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

AÇÃO BIOLÓGICA DOS EXTRATOS HEXÂNICO E ETANÓLICO DAS FOLHAS DE Momordica charantia L. SOBRE A RESPOSTA IMUNE E A CICATRIZAÇÃO EM

ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO

Ana Karinne Paiva Vasconcelos

Fortaleza – Ceará Dezembro, 2006

2UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Ana Karinne Paiva Vasconcelos

AÇÃO BIOLÓGICA DOS EXTRATOS HEXÂNICO E ETANÓLICO DAS FOLHAS DE Momordica charantia L. SOBRE A RESPOSTA IMUNE E A CICATRIZAÇÃO EM

ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO

Fortaleza – Ceará Dezembro, 2006

3UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

Ana Karinne Paiva Vasconcelos

AÇÃO BIOLÓGICA DOS EXTRATOS HEXÂNICO E ETANÓLICO DAS FOLHAS DE Momordica charantia L. SOBRE A RESPOSTA IMUNE E A CICATRIZAÇÃO EM

ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO

Dissertação apresentada ao Curso de

Mestrado em Ciências Veterinárias –

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial

para obtenção do grau de Mestre em Ciências

Veterinárias.

Área: Reprodução e Sanidade Animal.

Orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Sousa

Nunes Pinheiro.

Fortaleza – Ceará Dezembro, 2006

4Universidade Estadual do Ceará

Curso de Pós-Gradução em Ciências Veterinárias Título do Trabalho: Ação biológica dos extratos hexânico e etanólico das folhas de

Momordica charantia L. sobre a resposta imune e a cicatrização em animais de

experimentação

Autora: Ana Karinne Paiva Vasconcelos

Defesa em: 21/12/2006 Conceito obtido: SATISFATÓRIO

Banca Examinadora

__________________________________________

Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro Orientadora

________________________________ __________________________________

Profª. Drª. Adriana da Rocha Tomé Profª. Drª. Lúcia de Fátima Lopes dos Santos

Membro da banca examinadora Membro da banca examinadora

____________________________

Profª. Drª. Erika Freitas Mota

Membro da banca examinadora

5DEDICATÓRIA

Não apenas essa dissertação de

mestrado, mas todas as minhas

conquistas profissionais são dedicadas a

minha família, que em nenhum momento

deixou de me apoiar e ao meu namorado,

Robson Mendes.

6AGRADECIMENTOS

À minha querida orientadora, Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro pela

compreensão e valiosa orientação, para mim um exemplo diário de disciplina. A quem devo

os meus primeiros passos na área científica e iniciais conhecimentos em Imunologia.

Aos meus pais, Sandra Regina Paiva Vasconcelos e Rubem Chagas Vasconcelos,

pelo incentivo e apoio em todos os meus planos e por constituirem o meu alicerce de vida.

Aos meus avós, Maria Nely de Paiva Costa e Osmar dos Reis Costa, por serem

pessoas que sempre acreditaram no meu potencial, oferecendo carinho, atenção e palavras

de estímulo, para que eu continuasse a jornada por mais árdua que parecesse.

Ao meu irmão, Rubem Guilherme de Paiva Vasconcelos, presença fundamental nas

dificuldades e alegrias com as quais me deparei.

Ao meu namorado, Robson Mendes, por estar sempre ao meu lado, depositando

todo amor, confiança e compreensão, sendo assim uma das principais fontes de apoio e

incentivo da minha vida.

Aos meus sogros, Rosemary Ferreira Costa e Fernando Mendes, por me acolherem

tão bem na nova família que escolhi para mim.

Aos meus tios, Henrique Herbster Costa e Rita de Cássia Caldas Magalhães, que

mesmo estando distante, sei que são torcedores fervorosos a favor do meu sucesso

profissional.

Ao meu tio, Frederico Jorge de Paiva Costa, por sempre transmitir paz, força, fé e

esperança de que um dia tudo vai ser melhor.

À minha “tia-mãe”, Maria Argentina Pereira, uma pessoa extremamente importante

na minha vida, a quem tenho grande estima.

Ao meu “bebê”, Cearazinho, por ser o principal responsável pela minha dedicação à

Veterinária e por trazer tanta alegria a minha vida.

À professora Adriana da Rocha Tomé pelo precioso auxílio na parte prática e teórica

deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.

À professora Adriana Queiroz pelo fornecimento de material biológico e apoio

técnico.

À vice-coordenadora do curso de Medicina Veterinária, Lúcia de Fátima Lopes, por

ter me atendido prontamente nos momentos em que precisei.

7À todos os docentes do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias pelos

conhecimentos transmitidos, seja através das aulas, seminários e esclarecimentos

informais.

Às “meninas da secretaria“, Adriana Maria Sales Albuquerque e Ana Cristina Sabóia,

pela inestimável ajuda e agradável convivência.

À Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa (FUNCAP), por ter confiado

plenamente na realização do projeto e concedido apoio financeiro durante o mestrado para

que fosse possível a execução do mesmo.

Agradeço às minhas amigas da iniciação científica, Juliana Furtado Lima Verde e

Renata Sá de Castro Pires por sempre me ajudarem e por me proporcionarem bons

momentos nesse período em que convivemos.

Agradeço à minha companheira de pós-graduação, Bárbara Sucupira Pereira, pelo

apoio, amizade e por tudo o que passamos juntas.

Aos Biotérios da UFC e da UECE, pelo fornecimento dos animais de experimentação

e de ração para manutenção dos mesmos.

Ao seu José Lino e ao José Gomes Xavier por terem me auxiliado na manutenção

dos animais de experimentação.

À Deus por mais esta oportunidade de trabalho, pela qual me permitiu exercitar e

aprimorar minha paciência, tolerância e autoconfiança. Obrigado senhor, por tudo e por

todos em minha vida.

8RESUMO

No presente estudo, objetivou-se avaliar a ação do extrato hexânico (EH) e etanólico

(EE) das folhas de Momordica charantia sobre a resposta imune de animais de

experimentação. Para tanto, os extratos foram preparados, avaliados quanto a presença de

fitoquímicos e quanto a sua atividade antioxidante. Em seguida, foram realizados protocolos

experimentais para investigar os efeitos do EH e do EE sobre a produção de anticorpos

específicos induzidos pela imunização de camundongos com hemácia de carneiro (HC) e

ovalbumina (OVA), no D0, sendo dado um reforço no D7 para os animais sensibilizados com

HC e no D14 e D35 após imunização com OVA. Os grupos receberam tratamento prévio por

5 dias, via i.p. Os tratamentos consistiram de um grupo controle que recebeu salina a 0,9%

e dos grupos testes, representados pelo EH e pelo EE nas concentrações de 10 e 100

mg/Kg. Os títulos de anticorpos específicos anti-HC (IgM e IgG) foram determinados por

hemaglutinação, enquanto os títulos anti-OVA (IgG e IgE) foram dosados por PCA. Para

avaliação da resposta imune celular através da RHR, os animais foram previamente

imunizados com 0,1 ml de PPD, por via s.c, no D1 do ensaio experimental e os tratamentos

ministrados por 14 dias, após a imunização. No D14, o antígeno foi injetado

intradermicamente no dorso dos animais, no lado direito. Para efeito comparativo, no lado

esquerdo, foi injetada, salina a 0,9%. A RHR foi determinada pela diferença do grau de

endurecimento da pele entre o lado direito e o esquerdo após 24, 48 e 72 horas do desafio,

através de um paquímetro. Ainda relacionado à resposta imune celular, realizou-se a análise

macroscópica e histológica das lesões cutâneas induzidas experimentalmente e tratadas

com um ungüento a base dos extratos por 4 e 14 dias. Os resultados obtidos sugerem que o

EH apresenta ação estimulatória sobre a resposta imune humoral e celular em relação ao

controle, por aumentar a produção de anticorpos específicos anti-HC e anti-OVA (P<0,05),

bem como estimular a RHR (P<0,05) e contribuir para a evolução do processo de

cicatrização (P<0,01). Enquanto o EE, não exerceu ação sobre a resposta imune, sendo os

dados obtidos com esse extrato similares ao do grupo controle. Isso tem sido atribuído ao

fato de que apesar de ambos os extratos apresentarem esteróides na sua composição

fitoquímica, a diferença de polaridade entre os solventes possibilita que estes esteróides

contenham estruturas que lhes confiram características particulares. Além disso, o poder

antioxidante do EH é superior ao do EE, possibilitando a captação de radicais livres e

facilitando a cicatrização. Os resultados obtidos permitiram concluir que o extrato hexânico

confirmou seu efeito estimulatório sobre a resposta imune celular e humoral, além de ter

revelado efeito benéfico no processo de cicatrização, sendo o mesmo não verificado em

relação ao extrato etanólico.

9ABSTRACT

In the present study, it was aimed at to evaluate the action of the hexane (EH) and

ethanol (EE) from the leaves of Momordica charantia L. on the immune answer of

experimentation animals. For so much, the extracts were prepared and appraised

phitoquimically and with relationship your antioxidant activity. Right after, experimental

protocols were accomplished to investigate the effects of the HE and EE about the

production of specific antibodies induced by the immunization of mice with HC and OVA, in

D0, being given a reinforcement in D7 for the animals sensitized with HC and in D14 and

D35 after immunization with OVA. The groups received previous treatment for 5 days,

through i.p. The treatments consisted of a control group, that received 0,9% saline and the

test group, represented by the HE and EE in the concentrations of 10 and 100 mg/Kg. The

titles of antibodies specific anti-HC (IgM and IgG) were determined for hemaglutination, while

the titles anti-OVA (IgG and IgE) were dosed by PCA. For evaluation of the cellular immune

answer through RDH, the animals were previously immunized with 0,1 ml of PPD, for s.c

way, in the D1 of the experimental rehearsal and the treatments supplied by 14 days, after

the immunization. On the D14, intradermically was injected the antigen in the back of the

animals, on the right side. For comparative effect, on the left side, it was injected, 0,9 %

saline. The RHR was determined by the difference of the degree of hardening of skin

between the right side and the left, after 24, 48 and 72 hours of the challenge, through a

measure calliper. Still regarding the cellular immune answer, took place the macroscopic

analysis and histologic of cutaneous lesions induced experimentally and treated with an

ointment made from extracts, during 4 and 14 days. The obtained results suggest that the

HE shows estimulactory action on the immune humoral and celullar answer in relation to the

control for increasing the production of antibodies specific anti-HC and anti-OVA (P<0,05), as

well as to stimulate RDH (P<0,05) and to contribute for the evolution of the healing process

(P<0,01). While EE didn't show any action on the immune answer, being the data obtained

similar to the of the control group. That has been attributed to the fact that in spite of both

extracts presents steroids in your composition phitoquimic, the polarity difference among the

solvents allows that these steroids contains structures that give to it particular characteristics.

In addition, the antioxidant activity of HE is higher than the EE one, making possible the

reception of free radicals and facilitating the healing process. The results allowed to observe

that the HE confirmed its stimulatory effect above the imune and humoral celular answer,

besides, it showed its postive effect in the wound healing process. Unfortunatelly the same

results could not be observed in the EE experiments.

10SUMÁRIO

RESUMO 08

ABSTRACT 09

Lista de Figuras 12

Lista de Tabelas e Gráficos 13

Lista de Abreviaturas 14

1. Introdução 16

2. Revisão de Literatura 18

2.1. Mecanismos de Cooperação Celular da Resposta Imune 18

2.2. Imunomodulação 22

2.3. Principais Agentes Imunomoduladores 23

2.3.1. Imunopotencializadores 24

2.3.2. Imunossupressores 25

2.4. Plantas medicinais com atividade imunomoduladora 27

2.5. Momordica charantia L. 29

3. Justificativa 31

4. Objetivos 32

4.1. Objetivo Geral 32

4.2 Objetivos Específicos 32

5. Material e Métodos 33

5.1. Animais 33

5.2. Material Vegetal

5.2.1. Coleta da Planta

33

33

5.2.2. Preparo dos extratos 34

5.2.3. Prospecção fitoquímica

5.2.4. Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos hexânico e

etanólico das folhas de M. charantia pelo método de varredura do radical livre

DPPH

35

37

5.3. Imunidade humoral e imunidade celular e sua modulação in vivo por

extratos hexânico e etanólico de M. charantia 37

5.3.1. Imunização de camundongos com hemácias de carneiro e os efeitos

dos extratos etanólico e hexânico sobre a produção de anticorpos circulantes 37

5.3.2. Imunização de camundongos com ovalbumina e os efeitos dos extratos

etanólico e hexânico sobre a produção de anticorpos circulantes

5.3.2.1.Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA) para IgE e IgG

38

40

115.4 Imunização de coelhos com derivado de proteína purificada (PPD) e os

efeitos dos extratos etanólico e hexânico de M.charantia sobre a reação de

hipersensibilidade retardada 44

5.5. Indução de lesões cutâneas experimentais em coelhos e o efeito da

aplicação tópica dos extratos hexânico e etanólico de Momordica charantia L.

sobre a resposta imune celular 45

5.6 Análise Estatística 46

6. Resultados 47

6.1. Prospecção fitoquímica

6.2. Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos das folhas de

Momordica charantia L.pelo método de varredura do radical livre DPPH

6.3. Efeito do EE e do EH de M. charantia sobre a resposta imune humoral

induzida por hemácias de carneiro em camundongos

47

47

47

6.4. Efeito do EE e do EH de M. charantia sobre a produção de anticorpos

específicos anti-ovalbumina 49

6.5. Efeito do EE e do EH de M. charantia sobre a reação de hipersensibilidade

retardada em animais imunizados com derivado de proteína purificada (PPD) 54

6.6. Efeito imunomodulador da aplicação tópica do EE e do EH de M. charantia

em lesões cutâneas experimentais em coelhos 55

7. Discussão 61

8. Conclusões Gerais 67

9. Perspectivas 68

10. Referências Bibliográficas 69

ANEXOS 78

12LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Resposta Imune Humoral 19

Figura 2. Resposta Imune Ceular 21

Figura 3. Momordica charantia L. 30

Figura 4. Animais de experimentação. (a) Camundongo Swiss (b) Rato Wistar (c)

Coelho da Nova Zelândia

33

Figura 5. Coleta da M. charantia 34

Figura 6. Folhas de M. charantia: (a) frescas (b) após secagem. 34

Figura 7. Extratos Hexânico (EH) e Etanólico (EE) das folhas de M. charantia 35

Figura 8. Tratamentos (a) Grupos de animais (b) Administração intraperitoneal 39

Figura 9. Imunização com o antígeno (a) Ovalbumina + adjuvante (b) Admninistração

via subcutânea no dorso dos animais

39

Figura 10. (a) Coleta de sangue (b) Retração do coágulo 39

Figura 11. (a) Centrifugação do sangue (b) Obtenção do soro 40

Figura 12 . Anestesia em câmara de éter e depilação do dorso do animal 41

Figura 13. (a) Injeção intradérmica das diluições dos soros no dorso do animal

(b) Desencadeamento da PCA via plexo retroorbital

41

Figura 14. Dissecação da pele para leitura da reação 41

Figura 15. Extensão da pele para leitura da reação 42

Figura 16. Anestesia de rato Wistar em câmara de éter 42

Figura 17. Tricotomia para injeção das diluções dos soros no dorso do animal 43

Figura 18. Desencadeamento da PCA via peniana 43

Figura 19. PCA em ratos Wistar (a) Positiva (b) Negativa 44

Figura 20. Sonda orogástrica 44

Figura 21. Demarcação das áreas das feridas experimentais 45

Figura 22. Aspectos histológicos de lesões cutâneas experimentais (4x) em coelhos

tratados com ungüentos a base dos extratos hexânico (EH) e etanólico (EE) de M.

charantia nas concentrações de 10 e de 20%, por 4 e 14 dias.

60

13LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS

Tabela 1. Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos das

folhas de Momordica charantia L. pelo método de varredura do

radical livre DPPH. 47

Tabela 2. Efeito do EH e EE de Momordica charantia L. sobre os títulos de

anticorpos específicos anti-HC. 49

Tabela 3. Efeito do EH e do EE sobre a RHR em coelhos imunizados com

PPD.

55

Tabela 4. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre

a retração da área (mm) do processo inflamatório. 56

Tabela 5. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre

as células mononucleares. 57

Tabela 6. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre

os fibroblastos. 58

Tabela 7. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre

os vasos sanguíneos. 59

Gráfico 1. Cinética da síntese de IgG sérica anti-OVA avaliada por PCA em

camundongos tratados com EH. 51

Gráfico 2. Cinética da síntese de IgG sérica anti-OVA avaliada por PCA em

camundongos tratados com EE. 51

Gráfico 3. Cinética da síntese de IgE sérica anti-OVA avaliada por PCA em

camundongos tratados com EH. 53

Gráfico 4. Cinética da síntese de IgE sérica anti-OVA avaliada por PCA em

camundongos tratados com EE. 53

14LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SÍMBOLOS

ACTH Hormônio adrenocorticotrófico

BCG Bacilo Calmette-Guérin (Mycobacterium Bovis)

CAAs Células apresentadoras de antígenos

Células T Linfócitos T

Células B Linfócitos B

Célula Th Célula T auxiliadora

Célula Tc Célula T citotóxica

Célula NK Célula natural killer (matadoras naturais)

CSA Ciclosporina A

°C Graus Celsius

CRD Cranial direito

CRE Cranial esquerdo

CND Central direito

CNE Central esquerdo

CDD Caudal direito

CDE Caudal esquerdo

D Dias EE Extrato etanólico de M. charantia

EH Extrato hexânico de M. charantia

ELISA Técnica de imunoabsorbância ligada à enzima

et al., E colaboradores

FAVET Faculdade de Veterinária

FK506 Tracolimus

HC Hemácias de carneiro

HIV Vírus da imunodeficiência humana

h Horas

IFN Interferon

Ig Imunoglobulina

L Linn

IL Interleucina

LAK Células exterminadoras ativadas por linfocinas

LIBA Laboratório de imunologia e bioquímica animal

LPF Fator promotor de linfocitose

LPS Lipopolissacarídeos

MDP Muramildipeptídeo

15MHC Complexo de histocompatibilidade principal

MIM Monofosfato de inosina de metil

mL Mililitros

mg Miligramas

mg/kg Miligramas por kilograma de peso do animal

NaCl Cloreto de sódio

nm Nanômetros

OVA Ovalbumina

pA:U Ácido poliadenílico-poliuridínico

PCA Anafilaxia cutânea passiva

pH Potencial hidrogeniônico

pI:C Polinosínico-policitidílico

PPD Derivado protéico purificado da tuberculina

® Marca registrada

RHR Reação de hipersensibilidade retardada

TCGF Fator de crescimento da célula T

TCR Receptor da célula T

TNF Fator de necrose tumoral

UFC Universidade Federal do Ceará UECE Universidade Estadual do Ceará

μg Micrograma

μl Microlitro

% Por cento

α Alfa

β Beta

γ Gama

μ Mi

1000X Aumento de 1000 vezes

161. INTRODUÇÃO

O conflito saúde X enfermidade sempre existiu para toda espécie de ser vivo. Na

antiguidade, o homem parecia agir instintivamente como os animais no tratamento das

enfermidades e desde já as civilizações tinham o hábito de recorrer às propriedades

curativas de certos vegetais. A exploração da virtude das plantas com o objetivo de adquirir

novas estratégias de combater doenças foi a mais vislumbrada e especulada pelo homem.

(LUENGO, 2005).

As atividades farmacológicas destas plantas, em particular suas ações

imunológicas, tem sido foco de pesquisas no intuito de prevenir e curar doenças, já que

algumas plantas medicinais demonstraram capacidade de promover a saúde física e mental,

estimular os mecanismos de defesa do corpo e aumentar a longevidade. A capacidade de

induzir um efeito sobre as funções imunes específicas e inespecíficas em animais

experimentais despertou o interesse para a identificação dos constituintes fitoquímicos

imunoativos (BHATTACHARYA, 2000).

Podemos citar como exemplos de plantas com atividade imunomoduladora, a

Thymus broussonetii gerando uma maior capacidade adaptogênica em face de fatores

estressantes (ELHABAZI et al., 2006) e a ação imunoestimulatória do extrato metanólico de

Curculigo orchioides e da fração bioativa de Sphaerantus indicus Linn em ratos

imunossuprimidos (BAFNA et al., 2006). Pesquisas recentes verificaram que determinados

constituintes presentes em plantas medicinais como a Aloe barbadensis Miller e a Calendula

officinalis são capazes de modular a resposta inflamatória, estimulando as células

envolvidas no processo cicatricial (DORNELES et al., 2003).

A Momordica charantia L., planta alvo do nosso estudo, é uma trepadeira, comum

na beira de estradas do semi-árido nordestino, pertencente à família Curcubitaceae, sendo

conhecida popularmente conhecida como melão-de-São-Caetano (SOUZA, 2001). Várias

propriedades medicinais já foram descritas, dentre estas se destacam: atividade

hipoglicemiante (VIRDI et al., 2003); antibacteriana (KHAN et al., 1998); antiviral (CUNNICK

et al., 1990), anti-HIV (AU et al., 2000), antitumoral (RIBAK et al., 1994, LEE-HUANG et al.,

1995), antiulcerogênica (GURBUZ et al., 2000), anti-helmíntica (YESILADA et al., 1999) e

imunomoduladora (LEUNG et al., 1987).

A Momordica charantia L. foi usada em diferentes protocolos experimentais para

estudar os mecanismos envolvidos na resposta imune.

Em um estudo in vivo, Leung et al., (1987) observaram que injeções de

microgramas de uma proteína inibidora obtida da M. charantia em camundongos retardavam

a rejeição de aloenxertos da pele incompatíveis em decorrência da redução na atividade das

células NK e do aumento de macrófagos, intermediando espontaneamente a citotoxicidade.

17 In vitro, a proteína inibidora da M. charantia inibiu as células linfóides estimuladas

pela fitohemoaglutinina e concavalina A, mas não para o lipopolissacarídeo (LPS) e

notadamente aumentou a citotoxicidade dependente de macrófagos (SPREAFICO et al.,

1983).

A administração intraperitoneal de alfa-mormocharin e beta-mormocharin (50 µg

semanalmente por cinco semanas) em camundongos Baby resultou em altos níveis de

produção de IgE (título de PCA) (ZHENG et al., 1999). Contudo, sua atividade

imunoestimulante tem sido atribuída a um aumento na produção de interferon e atividade

das células natural killer (CUNNICK et al., 1990). Alfa-mormocharin e beta-mormocharin

mostraram atividade imunosupressora via linfocitotoxicidade ou pela mudança nos

parâmetros cinéticos da resposta imune (LEUNG et al., 1987).

A ação da Momordica charantia L. sobre a resposta imune em diferentes

protocolos experimentais mostrou que esta planta atua em algumas situações como

imunosupressora, para evitar rejeição de aloenxertos (LEUNG et al., 1987; SPREAFICO et

al., 1983). Entretanto, em outras (HIV), esta planta exibe atividade imunoestimulatória

(ZHENG et al., 1999).

Estudos enfocando a atuação da Momordica charantia L. sobre o sistema imune

são necessários devido aos diferentes padrões de resposta imunológica por ela

estabelecida, já que estes nos permitirão compreender a função e regulação das células T e

B nos mecanismos envolvidos na patogênese, resistência e susceptibilidade a diversas

doenças. Quanto à cicatrização, este estudo é importante já que esta planta é largamente

utilizada na medicina popular no tratamento de lesões cutâneas, sendo necessário

confirmação científica da veracidade de seu efeito cicatrizante.

182. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Mecanismos de Cooperação Celular da Resposta Imune A resposta imunológica é um processo de acomodação variável, que leva os animais

a produzirem anticorpos e células reativas, em resposta a uma grande variedade de

moléculas e de macromoléculas orgânicas. Constitui o principal meio de defesa do

organismo, não somente contra agentes infecciosos, como também outros agentes (por

exemplo: enxertos, hemácias, drogas) e mesmo a constituintes do próprio organismo nos

processos de auto-imunidade (PARKIN & COHEN, 2001).

O sistema imunológico possui uma arquitetura de múltiplas camadas, com

mecanismos de regulação e defesa espalhados em vários níveis. As principais barreiras

entre os hospedeiros e seu ambiente são os epitélios da pele e dos tratos gastrintestinal e

respiratório. No entanto, se microorganismos forem capazes de atravessar esses epitélios,

irão se deparar com as barreiras bioquímicas, que incluem os fluidos como a saliva, o suor,

as lágrimas e os ácidos estomacais, além de fatores como o pH e a temperatura corporal. A

próxima camada de proteção é representada pela imunidade inata, formada por células

fagocitárias, como os macrófagos e os neutrófilos, além de fatores solúveis como o

complemento e algumas enzimas (JANEWAY & MEDZHITOV, 2002). As células do sistema

imune inato desempenham um papel crucial na iniciação e posterior direcionamento das

respostas imunes adquiridas (DELVES & ROITT, 2000).

Os linfócitos T e B são as principais células do sistema imune adquirido e

apresentam memória imunológica, que permite o reconhecimento de um estímulo antigênico

caso ele entre novamente em contato com o organismo, evitando assim o restabelecimento

da doença e resultando na imunidade contra a reinfecção ao mesmo agente infectante

(DEFRANCO & WEISS, 1998; DUTTOM et al., 1998).

As respostas imunes adquiridas dos linfócitos T e B antígeno-específicos são

denominadas, respectivamente de imunidade celular e humoral. A imunidade celular

defende o organismo contra os microorganismos intracelulares e a imunidade humoral atua

sobre os microorganismos extracelulares e suas toxinas (JANEWAY & MEDZHITOV, 2002).

O mecanismo de reconhecimento e ativação da resposta imune específica tem início

quando os antígenos são captados pelas células apresentadoras de antígenos (CAAs)

(BANCHEREAU et al., 2000). Os principais tipos de CAAs são os monócitos sangüíneos, os

linfócitos B, os macrófagos e as células dendríticas foliculares. As CAAs circulam pelo

corpo fagocitando os patógenos encontrados, fragmentando-os em peptídeos antigênicos.

Partes destes peptídeos se ligam a moléculas do complexo de histocompatibilidade principal

19

Figura 1. Resposta Imune Humoral. Fonte: TIZARD, 1998.

(MHC) e são apresentados na superfície celular sob a forma de um complexo MHC/peptídeo

(ZINKERNAGEL & DOHERTY, 1997).

As moléculas coestimulatórias que interagem durante a apresentação do antígeno

fornecem um segundo sinal para a ativação dos linfócitos T (MURTAUGH & FOSS, 2002).

Sem este segundo sinal não há uma resposta adequada e as células T tornam-se inativas,

produzindo um estado de tolerância imunológica específica, conhecido por anergia clonal

(KAMRADT& MITCHISON, 2001).

A resposta imune humoral mediada por anticorpos é resultante de uma série de

interações celulares que ocorrem em uma seqüência ordenada (HARLOW & LANE, 1988);

onde inicialmente as células T são ativadas quando os antígenos são apresentados pelas

CAA, em seguida as células B interagem com as células T auxiliares antígeno-específicas e

só então, os linfócitos B ativados proliferam e se diferenciam em plasmócitos e células B de

memória (MCHEYZER-WILLIAMS & MCHEYZER-WILLIAMS, 2005) (Figura 1).

20 O receptor de antígeno das células B é formado por glicoproteínas

transmembranares Ig-α e Ig-β juntamente com a imunoglobulina de membrana, na qual se

liga o antígeno. Com exceção dos antígenos T-independentes, o contato com o antígeno é

insuficiente para ativar as células B, sendo necessário auxílio das células T para produzir

resposta. As células B são eficientes na captação do antígeno através do mecanismo de

endocitose mediada por receptor, e isso se deve ao fato de que a imunoglobulina atua como

receptor de alta afinidade (SRIVASTAVA, 2002). No entanto, estas células são ineficazes na

captação de antígenos por fagocitose ou pinocitose (BANCHEREAU et al., 2000). Após a

captação, o antígeno é processado e combina-se com moléculas recém sintetizadas de

MHC (PINET et al., 1995).

A resposta por anticorpos pode ser induzida por dois tipos de antígenos. A maioria

dos antígenos protéicos requer o auxílio das células T antígeno-específicas para produzir

uma resposta humoral (antígenos T-dependentes), dentre estes podemos citar, as hemácias

de carneiro e a ovalbumina. Porém alguns antígenos, como o LPS, não necessitam da

presença de células T auxiliares, sendo denominados T-independentes (JANEWAY et al.,

2002).

Os antígenos T-independentes caracterizam-se por constituírem grandes moléculas

poliméricas, altamente resistentes à degradação, sendo a maioria de origem bacteriana, que

provocam geralmente respostas mais fracas que os antígenos T-dependentes. Estes

antígenos geram, principalmente, resposta IgM, no entanto não induzem a diferenciação de

células B de memória (JANEWAY et al., 2002).

Na resposta imune celular, os principais componentes compreendem os mecanismos

especializados que envolvem a citotoxicidade mediada por linfócitos T e a ativação de

macrófagos pelas células T efetoras (JANEWAY et al., 2002) (Figura 2).

Os linfócitos T apenas reconhecem o antígeno na forma de fragmentos peptídicos

ligados a moléculas da classe I ou II do MHC próprio, através do TCR (receptor de células

T). Os antígenos de histocompatibilidade MHC classe I são expressos em quase todas as

células nucleadas do organismo e são responsáveis pela transdução de sinais para ativação

das células T CD8+ citotóxicas. Já os antígenos de histocompatibilidade MHC de classe II

são expressos pela dendríticas,

linfócito B e são responsáveis pela ativação das células T CD4+ (EFFROS et al., 2003).

s células imunocompetentes, incluindo macrófagos, células

s

21

A identificação de subpopulações distintas de linfócitos Th CD4+ (auxiliares) em

ão da diversidade funcional das células no

sistema

na resposta inflamatória mediada por macrófagos e dirigida a patógenos intracelulares. As

ução de anticorpos

por cél

estas expressam sinais estimulatórios. No entanto, na maioria das vezes, eles precisam

Figura 2. Resposta Imune Celular. Fonte: TIZARD, 1998.

camundongos, de acordo com as citocinas secretadas, denominadas Th1 e Th2

(MOSMANN et al., 1986), facilitou a compreens

imune.

Deste modo, citocinas de Th1, IL-2, TNF-β, IFN-y, estão principalmente envolvidas

células Th2 produzindo IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 auxiliam na prod

ulas B e participam da maturação e ativação de mastócitos e eosinófilos (MOSMANN

& COFFMAN, 1989).

Os linfócitos T CD8+ citotóxico podem ser ativados diretamente pelas CAAs, quando

de cooperação das células CD4+ Th1 para serem ativados. Uma vez ativados os linfócitos T

citotóxicos (Tc) interagem com as células-alvo e liberam o conteúdo de seus grânulos. Os

grânulos dos linfócitos Tc possuem perforina e granzimas (MCHEYZER-WILLIAMS et al.,

2005).

22As moléculas de perforina formam poros na membrana plasmática da célula-alvo,

porém estes não são suficientes para destruir as células. Através dos poros, as granzimas

entram na célula-alvo e deflagram a apoptose (FROELICH et al., 1998). Outra forma pela

qual o LT CD8+ extermina outra célula é através da glicoproteína Fas através do seu ligante

fasL presente na célula alvo (EFFROS et al., 2003).

As respostas imunes adquiridas declinam à medida que o antígeno vai sendo

eliminado e a imunidade inata vai se extinguindo, cessando com os estímulos que são

necessários para a sobrevivência dos linfócitos. Grande parte desse declínio é devida à

morte apoptótica dos linfócitos ativados (LENARDO et al., 1999; SCAFFIDI et al., 1999,

REVILLARD et al., 1998), que ficam privados dos sinais para a sobrevivência. Esse

processo mantém a homeostase do sistema imune, fazendo-o retornar ao seu estado de

repouso basal (MURTAUGH & FOSS, 2002).

2.2 Imunomodulação

A imunomodulação pode alterar o funcionamento do sistema imune de um indivíduo.

O sistema imune pode suprimir ou promover as respostas imunológicas de modo antígeno-

específico (HOLLAND & VIZI, 2002).

Muitos são os fatores que modulam o resultado de qualquer resposta imune e estes

incluem o próprio antígeno. Quanto a natureza química do antígeno, os antígenos protéicos

induzem imunida o incapazes de

estimular células T através das moléculas de MHC classes I e II. No tocante as quantidades,

duzem uma resposta imune, sendo, portanto, considerados como

JANEWAY et al., 2002).

A

SON, 2001). Já as células dendríticas e macrófagos ativados são CAAs

de celular e humoral. Os polissacarídeos e lipídeos sã

doses elevadas do antígeno podem induzir tolerância específica das células T ou, algumas

vezes, das células B (KAMRADT & MITCHISON, 2001). A via de administração do antígeno

também influencia a resposta imune, os antígenos administrados por via subcutânea ou

intradérmica in

imunogênicos, enquanto que os antígenos administrados por via endovenosa, oral ou

aerossol, muitas vezes induzem a falta de imunidade específica. O histórico anterior da

exposição ao antígeno em questão também influencia na resposta imune. Se o animal já

estiver sido exposto a um determinado antígeno, a memória imunológica permitirá uma

resposta mais rápida (

s células apresentadoras de antígenos podem interferir na resposta imune através de

sua capacidade de fornecer coestímulo as células T (STITES & TERR, 1995). As células

acessórias como macrófagos e linfócitos B em repouso são deficientes na função de co-

estimuladores, já que os antígenos apresentados por estas CAAs podem deixar de

estimular as células Th virgens e induzir tolerância as células T (KAMRADT &

MITCHI

23compe

A

uroendócrino afete as funções imunológicas,

abe-se que o estresse pode induzir a liberação de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH)

o a liberação de glicocorticosteróides que são imunossupressores e

tuam controlando negativamente as respostas das células Th1 e a ativação dos

macróf

istema imune, mas que são capaz de acarretar uma

2.3 P

tentes, pois expressam co-estimuladores, altos níveis de MHC-II e secretam

citocinas (BANCHEREAU et al., 2000).

A migração seletiva das subpopulações de linfócitos para os diferentes sítios pode

modular o tipo e o local da resposta imune, uma vez que as células Th1 e Th2 respondem a

diferentes grupos de citocinas (ROMAGNANI, 1997).

s ações das citocinas sobre as células T e B também correspondem a fatores de

imunorregulação (OPPENHEIM & FELDMAN, 2000).

Os componentes genéticos do indivíduo desafiado com o antígeno afetam o nível das

respostas imunes, a susceptibilidade à infecção e às doenças auto-imunes. Defeitos em

muitos dos genes envolvidos podem levar a uma imunodeficiência ou a anormalidades das

respostas imunes (JANEWAY et al., 2002).

Existem evidências de que o sistema ne

s

pela hipófise, provocand

a

agos (VACCA et al., 1992).

A desnutrição e a falta de nutrientes (ferro, zinco, cobre, selênio) e vitaminas (A, B, C,

E) constituem fatores extrínsecos ao s

imunodepressão celular e humoral. Desta forma, a nutrição e uma dieta bem equilibrada

compõem ferramentas fundamentais na redução da ocorrência de doenças e mortes por

infecções oportunistas (CHANDRA, 1997).

Outra forma de regulação é o “feedback” pelo anticorpo, onde a ligação de complexos

antígeno-anticorpo a receptores de Fc na superfície do linfócito B suprimem a ativação

do linfócito, sendo um mecanismo de retroalimentação negativa após produção máxima

de anticorpos (RAVETCH & CLYNES, 1998).

Esse mecanismo imunoregulador assegura que as respostas sejam apropriadas

tanto qualitativamente quanto quantitativamente (HOLLAND & VIZI, 2002). No entanto, em

algumas situações, a ativação do sistema imune pode culminar em patologias, necessitando

de substâncias imunossupressoras para o controle, em contrapartida, fatores ambientais,

parasitas e imunodeficiências tornam necessário o uso de substâncias imunoestimulantes.

rincipais agentes imunomoduladores

Nos últimos anos, ocorreram avanços significativos na compreensão dos eventos que

controlam o sistema imune e nos efeitos seletivos de medicamentos de origem natural ou

sintética, capazes de modificar a função imune produzindo não apenas uma

imunodepressão, como também uma imunopotencialização (HOLLAND & VIZI, 2002).

24

transplantes, como forma de evitar a rejeição e no

contr

bacterianos, químicos, como os

polinu

te com o antígeno. Inúmeras dessas

subst

imunoterapia sistêmica serão descritos a seguir.

cias semelhantes a hormônios. Extratos puros do timo

bovin

de células T (MASIHI, 2000)

diferenciação de linfócitos T, aumentar a

prolife

,

erpes zoster, influenza e rinovírus (DUTTA, 2002).

eno glicopeptídeo, usado como adjuvante. O

DP – Lis (L18) é um potente indutor de uma variedade de citocinas, tais como IL-1, IL-6,

são

A imunossupressão descreve os recursos normalmente utilizados para reduzir as

respostas imunes, particularmente nos

ole das doenças alérgicas e auto-imunes (STITES & TERR, 1995).

A imunopotencialização inclui compostos que modificam a resposta imune, no sentido de

potencializá-la. Estes agentes incluem produtos

cleotídeos, moléculas fisiologicamente ativas como as citocinas, bem como os

verdadeiros adjuvantes que são ministrados juntamen

âncias vêm sendo utilizadas como tentativas de potencializar as reações imunes em

pacientes com câncer, em indivíduos susceptíveis a invasões de agentes devido a fatores

ambientais e em aidéticos (STITES & TERR, 1995).

Os agentes mais comumente usados na

2.3.1 Imunopotencializadores

O timo é um órgão linfóide primário responsável pela maturação dos linfócitos T

através de secreções de substân

o têm sido usados para isolar e identificar hormônios responsáveis pelas funções

fisológicas do mesmo. Esses extratos têm produzido misturas peptídicas tais como a fração

timosínica-5 e preparações peptídicas purificadas como timopoietina, fator humoral tímico,

timulina e timosina. Estas preparações podem induzir marcadores de superfície de linfócitos

T nos pró-timócitos e modular a proliferação

A timopoetina é um peptídeo sintético que combinado com a 1α-timosina, o interferon -

γ e a zidovudina é capaz de estimular a função de linfócitos T CD4 (GARACI et al., 1994).

O monofosfato de inosina de metil (MIM) é um imunomodulador timomimético capaz

de induzir a expressão de marcadores de

ração de linfócitos bem como a produção de IgM (DUTTA, 2002). No entanto, é capaz

de induzir a hipersensibilidade do tipo retardada.

A isoprinosina é um complexo do p-acetamidobenzoato de N-dimetilamino-2-

propanolol:inosine que foi desenvolvida como um agente antiviral pois aumenta a produção

de interferon. É utilizada no tratamento de doenças causadas pelos vírus herpes simples

h

O muramildipeptídeo (MDP) é um pequ

M

fatores estimuladores de colônias, TNF e interferon-γ em camundongos e humanos (DUTTA,

2002).

O uso de adjuvantes, objetiva conseguir uma lenta, porém, duradoura liberação do

antígeno e assim, obter um aumento na resposta imune específica, geralmente

25

las apresentadoras

úmero de linfócitos nos linfonodos que

células lo ais inativadas. Os polinucleotídeos sintéticos, como o ácido poliadenílico-

ico-policitidílico (pI:C) exercem apreciável ação adjuvante;

mbos atuam sobre os macrófagos, enquanto só o pA:U é ativo sobre os linfócitos T,

ativan

o na indução da

prolife

e

tardia

idas no paciente como imunoterapia do

cânce

arvum atua induzindo uma hiperplasia

linfóid

necessários nas vacinas preparadas com organismos inativados (AU et al; O’HAGAN et al.,

2001). Os adjuvantes formam depósito e estimulam o recrutamento de células, causando

uma lenta disseminação do antígeno, que vai ser processado pelas célu

e posteriormente reconhecido pelos linfócitos T e B atraídos para o sítio de injeção ou nos

próprios órgãos linfóides. Acredita-se que a estimulação dos macrófagos seja a atividade

mais importante dos adjuvantes (COX & COULTER, 1997). De fato, os agentes que

aumentam o número de macrófagos ou que potencializam suas atividades também

intensificam a resposta imune. Alguns desses agentes são lipopolissacarídeos (LPS),

zimosan, ácidos poliacrílicos e BCG (Bacilo Calmette-Guérin). Além disso, os adjuvantes,

via de regra, induzem um aumento significativo do n

drenam a área da injeção, estimulando o afluxo de células bem como a multiplicação das

c

poliuridínico (pA:U) e o polinosín

a

do T auxiliar e T citotóxico (COX et al., 1997).

O LPS compõe as paredes celulares das bactérias Gram-negativas, é mitogênico para

as células B e capaz de ativar macrófagos. O LPS exerce efeito adjuvante quando injetado

simultaneamente com o antígeno e é utilizado em diferentes modelos experimentais (COX &

COULTER, 1997; JANEWAY et al., 2002).

O levamisol é um composto sintético tradicionalmente empregado como anti-

helmíntico, cujo efeito imunoestimulante é caracterizado pelo aument

ração de linfócitos T, aumento da quimiotaxia de neutrófilos e macrófagos, aumento

da atividade fagocítica, no entanto, induz exarcebação das reações de hipersensibilidad

(BONAMIN & PAULINO, 1996; JANEWAY et al., 2002).

As células exterminadoras ativadas por linfocinas (células LAK) são linfócitos T

citotóxicos, gerados in vitro pelo tratamento das células de um indivíduo com citocinas como

a IL-2. Algumas vezes, estas células são infud

r (PARDOLL, 1998).

A Bordetella pertussis produz um fator promotor de linfocitose (LPF), que é um mitógeno

de células T e um imunoestimulante. B. pertussis é o agente etiológico da coqueluche

(MCGUIRK et al., 2002). Já o Corynebacterium p

e e ativando os macrófagos (DIBASIO & LOBUGLIO, 1996).

2.3.2 Imunossupressores

Os esteróides, incluindo os glicocorticosteróides, os hormônios corticosteróides

(cortisona, desidrocortisona e similares) e os esteróides sintéticos, como a dexametasona,

26

os linfócitos B induzindo a depressão

da sí

0). A CsA

utras ações em várias células: determina a redução da

e hiper-responsividade após provocação antigênica vivo (BACH & STROM,

otóxica, no entanto sua utilização é restrita devido aos

ecções, hipertensão arterial, hipertricose,

hiperplasia

possuem numerosos efeitos imunossupressores e antiinflamatórios, com os macrófagos

sendo as células particularmente sensíveis a estes agentes (DE JONG et al., 1999). Os

esteróides inibem a liberação do ácido araquidônico e portanto, reduzem a produção de

eicosanóides bem como a secreção de proteases neutras e de IL-1. Os esteróides

interferem na apresentação de antígenos, inibem a resposta primária por anticorpos e

reduzem o número de células T circulantes. Os corticosteróides quando administrados antes

do antígeno inibem a produção dos anticorpos no coelho e rato, enquanto o homem, o

macaco e a cobaia são mais resistentes à sua ação imunossupressora (BACH & STROM,

1986).

A azatioprina e a 6-mercaptopurina são análogos a purinas que agem sobre os

linfócitos e sobre as células em divisão, bloqueando o desenvolvimento das células efetoras

pela inibição da síntese do ácido nucléico. Estas drogas reduzem quantitativamente os

monócitos e inibem a atividade das células NK (BACH et al., 1986).

A ciclofosfamida constitui um agente alquilante que danifica o DNA e impede sua

replicação. Estes agentes atuam primariamente sobre

ntese de anticorpos. Não altera a proliferação de linfócitos T, quando administrada no

segundo dia após a administração do antígeno (BEL & BARNES, 2000).

A ciclosporina A (CsA) é um potente agente imunossupressor utilizado para prevenir a

rejeição em transplantes de órgãos, sendo efetiva em doses relativamente baixas em várias

doenças "auto-imunes" como artrite reumatóide, psoríase e doença de Crohn. É um

metabólito polipeptídico cíclico extraído de um fungo To/ypocladium inflatum, originalmente

isolado na Noruega, agindo principalmente na inibição da ativação de linfócitos T, com a

supressão da produção de citocinas pró-inflamatórias (BEL & BARNES, 200

impede a transcrição gênica de várias citocinas como IL-2, IL-4, IL-13 e em especial a IL-5.

A IL-2 era anteriormente conhecida como TCGF (T Cell Growth Factor) e tem como

principal ação a de assegurar a expansão clonal dos linfócitos T ativados (BARNES &

ADOCK, 1995). A CsA apresenta o

liberação de histamina pelos basófilos, reduz a síntese de IL-1 do fator de necrose tumoral

(TNF), do superóxido, do peróxido de hidrogênio pelos macrófagos, assim como reduz a

quimiotaxia de neutrófilos e as concentrações do receptor solúvel IL-2 (LEADFORD, 1996).

Em modelos animais a CsA inibe a resposta tardia da asma, a afluência de eosinófilos e a

subseqüent

1986). A ciclosporina não é miel

efeitos colaterais como a propensão a inf

gengival, toxicidade ao fígado, rins e sistema nervoso (BEL & BARNES, 2000).

27

respectivamente (BACH et al., 1986).

2.4 P

zes de modular o

sistema imune e são citadas a seguir.

Os extratos metanólicos da raiz da Withania somnifera (DAVIS & KUTTAN, 2000) e do caule de Tinospora cordifolia (MATHEW & KUTAN, 1999), o extrato etanólico da casca

O tracolimus (Fk506) é um composto fúngico isolado do actinomiceto do solo

Streptomyces tsukubaensis que impede a ativação da mitogênese dos linfócitos T,

possivelmente por bloquear a produção de IL-2. O seu modo de ação é semelhante ao da

ciclosporina, com potente ação imunodepressora (BACH et al., 1986).

O tosilate suplatast, desenvolvido no Japão atua prevenindo a liberação de IL-4 e IL-5

pelas células Th2 e desta forma reduz a eosinofilia brônquica em modelo animal de

hiperesponsividade brônquica (ASANO et al., 2000; ZHAO et al., 2000).

O brequinar sódico e micofenolato mofetil são inibidores da síntese de pirimidinas e

purinas,

A rapamicina inibe a capacidade dos fatores de crescimento das células T em induzir o

ciclo celular nas células T. Tanto a rapamicina quanto o tracolimus ligam-se ao mesmo

receptor, embora seus modos de ação sejam diferentes (DUMONT & SU, 1995).

lantas medicinais como imunomoduladores

Uma variedade de substâncias, como polissacarídeos, lectinas, peptídeos,

saponinas, óleos e outras, oriundas de plantas medicinais são capa

Um polissacarídeo isolado do mesocarpo de frutas de Orbignya phalerata elevou

a atividade de células fagocíticas in vivo apresentando atividade imunomoduladora (SILVA &

PARENTE, 2001). O óleo da casca de Cedrus deodora atuou sobre os neutrófilos, reduzindo

a atividade fagocítica (SHINDE et al., 1999). Já o extrato metanólico da raiz da Withania

somnifera aumentou essa atividade em macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c

(DAVIS & KUTTAN, 2000).

O extrato etanólico das sementes de Psoralea corylifolia aumentou a atividade citotóxica, além de combater as células tumorais através da ativação das células NK. Já o extrato etanólico da raiz da Boerhaavia difusa inibiu tanto a citotoxicidade mediada pelas células NK, quanto a produção de óxido nítrico por macrófagos estimulados por LPS (MEHROTTA et al., 2002). Por outro lado, o extrato metanólico do caule de Tinospora cordifolia ativou a citotoxicidade dos macrófagos contra células do carcinoma ascítico de Ehrlich e em contrapartida apresentou atividade proliferativa dos leucócitos, além de elevar a produção de anticorpos (MATHEW & KUTAN, 1999). As saponinas isoladas do extrato etanólico de Astragalus peregrinus estimularam a proliferação de esplenócitos de camundongos ativados in vitro, e não apresentaram citotoxicidade contra diferentes linhagens celulares tumorais de humanos, como tumores de mama, pulmão, cólon e próstata (VEROTTA et al., 2001).

28do ca

Janakia arayalpathra result

s de inibir a reação de hi

utos de Punica granatum (ROSS et al., 2001) aume

Boerhaavia

difusa ia a produção de IL-2,TNF-α, IL-13, IL-15, interferon-γ, IL-4, IL-5 e IL-10, citocinas élulas T e B.

O extrato aquoso de folhas da Osbeckia aspera apresentou atividade imunossup

o a proliferação de linfócitos, enquanto o extrato aquoso da

o estímulo para a atuação de células plaquetárias, neutrófilos,

macrófago

NER, 1998).

ule de Mangifera indica (MAKARE et al., 2001) e os frutos de Punica granatum (ROSS et al., 2001) aumentaram o título de anticorpos circulantes enquanto o óleo da casca de Cedrus deodora (SHINDE et al., 1999) inibiu a reação de Arthus, indicando declínio na produção de anticorpos. A administração oral de extratos de raízes de

ou em aumento dos títulos de anticorpos circulantes, quando comparado ao levamisol (SUBRAMONIAN et al., 1996).

O extrato metanólico da raiz da Withania somnifera (DAVIS & KUTTAN, 2000) e o óleo da casca de Cedrus deodora (SHINDE et al., 1999) foram capaze

persensibilidade retardada (RHR) enquanto o extrato etanólico da casca do caule de Mangifera indica (MAKARE et al., 2001) e os fr

ntaram a RHR. No entanto, os mecanismos responsáveis por estas atividades ainda são desconhecidos.

Mehrotra et al (2002) verificaram que o extrato etanólico da raiz da inib

importantes no controle das respostas mediadas por c

ressora sobre células mononucleares do sangue periférico em pacientes com hepatite crônica do tipo C (NICHOLL et al., 2001).

O suco das folhas da Kalanchoe brasiliensis (IBRAHIM et al., 2002) apresentou atividades imunossupressoras, inibind

s flores de Tília cordata (ANESINI et al., 1999) demonstrou ação estimulatória sobre os linfócitos, associada à presença de flavonóides. Já o extrato metanólico das folhas de Bidens pilosa L. inibiu a atividade linfoproliferativa in vitro e esta atividade está associada à presença de um poliacetileno que foi isolado da mesma (PEREIRA et al., 1999).

A literatura refere o uso de fitoterápicos como agentes estimulantes da resposta

imune celular, amplificando

s, linfócitos, mastócitos e fibroblastos sobre a regulação da vascularização,

fibroplasia e maturação das feridas crônicas. Além de constituírem importantes fontes de

citocinas, que conforme observações de Robson & Philips (1992), Candido (2001) e

Rodrigues et al (2001), são substâncias responsáveis pela comunicação nas interações

celulares e representam a descoberta mais interessante na cicatrização de feridas da

década.

Dentre as plantas medicinais, que se destacam por essa ação, podemos citar, a

Calendula officinalis, que possui na sua composição uma fração lipofílica, os triterpenóides,

responsáveis pela ação antiinflamatória (AKIHISA et al., 1996), carotenóides, flavonóides,

carboidratos, ácidos graxos e polissacarídeos, que lhe conferem ação epitelizante e

imunoestimulante (BROWN & DATT

A papaína, uma enzima de origem vegetal, vem sendo bastante utilizada por profissionais de saúde como alternativa para o tratamento de feridas, principalmente por

29

s e cicatrizar feridas, acredita-se que esta planta atue sobre a fase de

m responsáveis por validar sua utilização na medicina popular.

semi-árido nordestino, pertencent

pequeno pepino. As folhas apresentam bordos pon

et al., 1990) , ant

m algumas condições atua como imunossupressora (rejeição de aloenxertos),

ais pela promoção de efeitos

seus efeitos antiinflamatórios e cicatrizantes. Em um estudo realizado por Rocha et al (2005) foram verificados os efeitos cicatrizantes benéficos da ação da papaína sobre lesões ulcerativas principalmente por facilitar a organização do tecido de granulação. A Aloe Vera Linné, também conhecida como babosa, apresenta no parênquima da sua folha (MCKEOWN, 1987), uma mucilagem com aspecto de gel incolor e que tem sido utilizado para curar queimadura

neocapilarização, estimulando a liberação de fatores angiogênicos secretados pelos macrófagos que estimulam a proliferação de células endoteliais dos vasos sangüíneos (DORNELES et al., 2003). Verifica-se, portanto, ampla atuação das plantas medicinais nos diferentes protocolos empregados para avaliação de suas ações sobre o sistema imunológico. Muitos desses trabalhos fora

2.5 Momordica charantia L.

A Mormordica charantia L. é uma trepadeira, comum noente à família Curcubitaceae sendo conhecida popularmente como melão-de-

São-Caetano (SOUZA, 2001). Todas as partes da planta possuem sabor amargo. Os frutos são de formato retangular e se assemelham a um

tiagudos e irregulares (GROVER & YADAV, 2004) (Figura 3). Esta planta é encontrada nas áreas tropicais da Ásia, América do Sul, Índia, África e

Caribe, onde vêm sendo cultivada e utilizada como um remédio popular para diversas doenças (YESILADA et al., 1999; GROVER & YADAV, 2004).

Várias propriedades vêm sendo descritas tais como: hipoglicemiante (JAYASOORIYA et al., 2000, VIRDI et al., 2003); antibacteriana (KHAN, 1998); antiviral (CUNNICK

i-HIV (AU et al., 2000), antitumoral (RIBAK et al., 1994, LEE-HUANG et al., 1995), antiulcerogênica (GURBUZ et al., 2000), anti-helmíntica (YESILADA et al., 1999) e imunomoduladora (LEUNG et al., 1987).

A M. charantia possui glicosídeos, saponinas, alcalóides, óleos fixos, triterpenos, proteínas e esteróides que são responsáveis por suas ações biológicas (RAMAN & LAU, 1996).

Estudos têm demonstrado que a M. charantia apresenta um variável efeito no sistema imune, eporém em outras situações, esta planta exibiu atividade imunoestimulante. A atividade imunosupressora tem sido atribuída a linfocitotoxicidade ou uma troca nos parâmetros cinéticos da resposta imune. Contudo, acredita-se que a atividade imunoestimulante se deve a um aumento na produção de interferon e atividade das células NK (LEUNG et al., 1987).

Em um estudo in vivo, extratos das folhas de M. charantia demonstraram habilidade para aumentar a resistência contra as infecções virimunoestimulatórios tanto na prática clínica como no cenário experimental (CUNNICK et al., 1990).

30

Figura 3. Momordica charantia L.

313. JUSTIFICATIVA

Com a evolução de pesquisas científicas demonstrando o amplo potencial do uso de

plantas medicinais em diversas atividades terapêuticas, abriu-se mercado para o

desenvolvimento de fitoterápicos seguros e eficazes, os quais futuramente, poderão vir a

substituir as drogas sintéticas, barateando assim, os custos para a sociedade. O uso potencial de plantas medicinais com atuação sobre a resposta imune e sobre o

reparo tecidual na clínica médico-veterinária ainda é insignificante (NUNES-PINHEIRO et

al., 2003). No entanto, inúmeros estudos, t smas, como recursos

promissores em novos protocolos terapêuticos de doenças relacionadas ao sistema imune e

a regeneração cutânea (ENGEL & STARUSS, 2002).

Apesar de diversas atividades terapêuticas comprovadas, a ação dos extratos

hexânico e etanólico da folhas da M. charantia sobre a resposta imune in vivo é pouco

conhecida. Faz-se necessário, portanto, pesquisas que comprovem cientificamente se os

constituintes presentes na folhas desta planta interferem ou não sobre o sistema

imunológico e em caso de interferência, anseia-se descobrir se os extratos da planta atuam

como imunoestimulantes ou imunodepressores. Tendo como base esses conhecimentos, é

que se tornará possível à indicação ou a contra-indicação do uso destes extratos para a

população, de acordo com os quadros clínicos apresentados pelos pacientes.

êm considerado as me

32

4.1

animais imunizados com hemácias de

carne

4.2.4 Avaliar o processo de cicatrização através da aplicação tópica dos extratos hexânico e

tanólico de Momordica charantia L.em lesões cutâneas induzidas experimentalmente.

.2.5 Avaliar a atividade antioxidante dos extratos etanólico e hexânico de M.charantia.

4. OBJETIVOS

Objetivo Geral

Avaliar a ação dos extratos hexânico e etanólico das folhas de Momordica charantia

L. sobre a resposta imune e a cicatrização em animais de experimentação.

4.2 Objetivos Específicos 4.2.1 Avaliar a produção de anticorpos específicos da resposta primária e secundária após

tratamento com os extratos hexânico e etanólico em

iro.

4.2.2 Avaliar a cinética da síntese de anticorpos específicos, IgG e IgE, em animais tratados

com os extratos etanólico e hexânico e imunizados com ovalbumina.

4.2.3 Avaliar o efeito modulador dos extratos etanólico e hexânico sobre a reação de

hipersensibilidade retardada.

e

4

33MÉTODOS

Foram utilizados camundongos Swiss, entre 6 e 10 semanas de idade, ratos Wistar,

com idade superior a 6

ntral da

uanto os coelhos foram adquiridos em um

submetidos a um período de quarentena, no qual foram

s e observados quanto ao estado de saúde geral e só então, destinados à

5. MATERIAL E

5.1 Animais

meses e coelhos da raça Nova Zelândia, com idade de 2 a 6 meses,

todos machos (Figura 4). Os camundongos e os ratos foram oriundos do Biotério Ce

Universidade Federal do Ceará (UFC). Enq

estabelecimento comercial, sendo

vermifugado

realização dos experimentos.

(a) (b) (c)

o

Nova Zelândia

Os animais foram separados em grupos e mantidos no Laboratório de Imunologia e

ioquímica (LIBA) da Universidade Estadual do Ceará (UECE), em caixas plásticas

ssépticas e ou gaiolas, no caso dos coelhos, sob condições adequadas de higiene, luz e

mperatura, recebendo ração comercial e água ad libitum.

O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

niversidade Estadual do Ceará.

.2 Material Vegetal

5.2.1 Coleta da Planta

As folhas de M. charantia foram coletadas pela manhã, nos meses de março, abril e

ida Carlos Jereissati, pelos arredores do Aeroporto Internacional de

eará (Figura 5).

Figura 4. Animais de experimentação. (a) Camundongo Swiss (b) Rato Wistar (c) Coelh

B

a

te

U

5

maio de 2005, na Aven

Fortaleza, C

34

Figura 5. Coleta da M. charantia

A identificação botânica da planta foi realizada no Herbário Prisco Bezerra do

Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará - UFC, onde foi depositada,

recebendo o “voucher” de número 32441.

5.2.2 Preparo dos extratos hexânico e etanólico das folhas de M.charantia

Os extratos hexânico e etanólico foram preparados a partir das folhas de M. charantia.

a

6).

As folhas foram mantidas em um local fresco e arejado por sete dias para secagem (Figur

(a) (b)

Figura 6. Folha

s de M. charantia: (a) frescas; (b) após secagem.

35A seguir, as folhas secas foram pesadas e colocadas em um balão de vidro, de modo

que todo o material ficasse submerso em hexano. A mistura ficou em repouso por cerca de

sete dias para que se extraísse o princípio ativo das folhas. Em seguida, a solução

resultante (hexano + folhas) foi filtrada através de um funil. Esta sofreu um processo de

evaporação através de evaporador rotatório a 69°C e o extrato obtido foi colocado em

banho-maria, para total evaporação do solvente.

Para a obtenção do extrato etanólico, foi utilizado o resíduo obtido do extrato hexânico

após dois dias de repouso, tempo necessário para a evaporação do hexano residual e o

mesmo procedimento anterior foi realizado, exceto que o solvente utilizado foi o etanol e a

temperatura do evaporador rotatório subiu para 100°C, devido ao ponto de ebulição do

álcool ser superior ao do hexano

avaliação fitoquímica para detecção ou

não onóis,

avononas, flavanonóis, xantonas, esteróides, triterpenóides, saponinas, alcalóides, nos EE

e EH

.

5.2.3 Prospecção fitoquímica dos extratos hexânico e etanólico de M. charantia

Os extratos obtidos foram submetidos a uma

de fenóis, taninos, antocianidinas, antocianinas, flavonóides, catequinas, flav

fl

das folhas de M. charantia de acordo com a metodologia descrita por Matos (1997)

(Figura 7).

Fig harantia ura 7. Extratos Hexânico (EH) e Etanólico (EE) das folhas de M. c

36

antocianidinas, antocianinas e flavonóides, o tubo 2 foi

acidulado a pH 3 e o tubos 3 e 4 alcalinizados a pH 8,5 e 11, respectivamente. A

observação de mudança de coloração, no meio alcalino (pH 11) para vermelho laranja,

s

eriam indicadas pela mudança de coloração para vermelho em meio ácido, lilás no meio

ença ou ausência de flavonóis, flavononas, flavonónois e xantonas foi detectada

através do seguinte experimento: ao tubo 6 foram adicionados 0,5 g de magnésio granulado

ídrico concentrado, após o término da reação, a visualização da

mudança de coloração para vermelho indicaria a presença de flavonóis, flavononas,

flavonónois e xantonas.

A presença ou ausência de esteróides e triterpenóides foi determinada da seguinte

forma: o resíduo seco oriundo do tubo 6 foi extraído com 2 mL de clorofórmio, formando

uma solução que foi filtrada em um funil fechado com um fragmento de algodão, coberto

com 100 mg de sulfato de sódio anidro. O algodão embebido em sulfato de sódio foi

colocado em um tubo de ensaio e a este foi adicionado 1mL de anidrido acético e 3 gotas de

ácido sulfúrico concentrado. A mudança de coloração da solução de azul evanescente para

verde permanente indicaria a presença de esteróides livres, enquanto a mudança de

coloração para parda indicaria presença de triterpenóides.

A presença ou ausência de saponinas foi determinada a partir do resíduo insolúvel em

clorofórmio obtido do teste anterior. Este foi dissolvido em água destilada e filtrado para um

tubo de ensaio. O líquido obtido foi agitado por 3 minutos e a formação de espuma indicaria

a presenç rico

Um grama de cada extrato foi diluído em 200 mL de solução hidroalcoólica a 70%.

Cada solução foi dividida em porções de 4mL colocadas em 6 tubos de ensaio numerados e

duas porções de 10 mL colocados em béqueres rotulados previamente. Os béqueres foram

submetidos a banho-maria até a secagem e mantidos em dessecador até o seu uso. O

restante dos extratos foi concentrado em banho-maria até a obtenção de metade do volume,

o pH foi ajustado para 4 e o líquido obtido foi filtrado e reservado para a detecção de

alcalóides.

Para evidenciar a presença de fenóis e taninos, foram adicionadas três gotas de

solução alcoólica de cloreto férrico ao tubo 1, após o qual este foi agitado e a visualização

de mudança de coloração para azul ou vermelho indicaria a presençade fenóis, enquanto a

formação de precipitado escuro indicaria a presença de taninos.

Para detectar a presença de

indicaria a presença de flavononóis, enquanto a presença de antocianidinas e antocianina

s

alcalino (pH 8,5) e azul em pH 11.

A presença de catequinas foi detectada da seguinte forma: o tubo 5 foi acidulado pela

adição de ácido clorídrico a pH 1 a 3 e aquecido em uma lâmpada de álcool por 3 minutos.

A mudança de coloração para pardo-amarelado indicaria a presença de catequinas.

A pres

e 0,5 mL de ácido clor

a de saponinas. Para confirmação, foram adicionados 2 mL de ácido cloríd

37

ção éter-clorofórmio (3:1). A solução foi filtrada em funil de separação, obtendo-

da tubo foram adicionadas

tia pelo método de varredura do radical livre DPPH

ção da

DPPH a 6,5 x 10 -5 M em metanol. Em seguida foi adicionado ao

odulação in vivo por extratos

concentrado ao tubo que foi imerso em banho-maria a 70°C por 1 h, após o qual o líquido foi

neutralizado e agitado, de forma que a presença de precipitado e não formação de espuma

confirmaria a presença de saponinas.

A presença ou ausência de alcalóides foi determinada da seguinte forma: a 26 mL do

extrato concentrado e com pH 4, foi adicionado hidróxido de amônio elevando-se o pH para

11 e as bases orgânicas extraídas através de três lavagens sucessivas de 30, 20 e 10 mL

de uma solu

se a fração orgânica e aquosa (desprezada). A fração orgânica foi tratada com sulfato de

sódio anidro e filtrada. As frações orgânicas foram re-extraídas com 10, 5 e 3 mL de ácido

clorídrico diluído (0,01 M), obtendose uma fração orgânica que foi desprezada e a solução

aquosa ácida obtida foi dividida em três tubos de ensaios. A ca

três gotas de reagentes de precipitação de alcalóides Mayer, Hager e Dragendorff,

respectivamente, e a visualização de precipitado floculoso em pelo menos dois tubos

indicaria a presença de alcalóides.

5.2.4 Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos hexânico e etanólico das folhas de M. charan

Método varredor de radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrihidrazil), uma das técnicas

propostas por Bonted et al. (1987), é uma técnica simples e precisa para avalia

atividade antioxidante. Neste método a eficiência antioxidante é mensurada à temperatura

ambiente, eliminando o risco de degeneração térmica das moléculas testadas.

Nesta técnica, uma solução fortemente corada de um radical livre foi tratada com

uma solução do composto químico. Em um tudo de ensaio, colocou-se 3,9 mL de uma

solução do radical livre

tubo 0,1 mL da solução metanólica do extrato (10.000 ppm) e a absorbância medida a 515

nm, que é o comprimento de onda ao qual o DPPH apresenta absorbância máxima, foi

determinada por espectofotometria no intervalo de 0 a 60 minutos. O teste foi realizado em

triplicata e os resultados expressos como índice de varredura de radicais livres (IV %). Os

resultados foram considerados positivos caso houvesse decréscimo da absorbância ao

longo do tempo (YEPÉZ et al., 2002).

5.3 Imunidade humoral e imunidade celular e sua mhexânico e etanólico de M. charantia

5.3.1 Imunização de camundongos com hemácias de carneiro e os efeitos dos

extratos hexânico e etanólico sobre a produção de anticorpos circulantes

38

role – salina (0,9%); testes – EH (10 e 100 mg/Kg) e

s de sangue foram centrifugadas e os soros btidos foram armazenados a –20°C para uso posterior. O título de anticorpos específicos

para ),

posteriormente, adicionou-se igual volume de hemácias de carneiro a 1 %. As placas foram leveme

5.3.2 Imunihexânico e etanólico sobre a produção de anticorpos circulantes

e foram obtidas através do plexo retro-orbital (Figura 10) no dia 0 antes do tratamento e nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após a imunização e

s dias 14 e 35 após a imunização inicial foram plicados reforços nas mesmas condições da imunização inicial.

Camundongos de ambos os sexos foram divididos em sete grupos (n=10). Os animais receberam, por via i.p, diariamente, por cinco dias consecutivos (DAVIS & KUTTAN, 2000), os seguintes tratamentos: contEE (10 e 100 mg/Kg); referência – ciclosporina (5mg/kg). Vale ressaltar, que a ciclosporina como droga de referência foi administrada somente no 5º dia de tratamento, devido ao seu potente efeito imunosupressor sobre os animais.

As hemácias de carneiro (HC) foram obtidas por punção da veia jugular de carneiros oriundos da FAVET (Faculdade de Veterinária), armazenadas e mantidas em solução salina estéril, após serem lavadas três vezes com salina apirogênica (NaCl, 0,9%) e ajustadas na concentração 20% para imunização. No dia zero, os camundongos foram imunizados com

20μl de uma suspensão de hemácias de carneiro intraperitonealmente (i.p) e as amostras de sangue foram coletadas através do plexo retroorbital no dia 7 para a obtenção dos títulos de anticorpos primários (IgM) e no dia 14 para os títulos de anticorpos secundários (IgG). (SARANG et al., 2005). No sétimo dia, foi administrado um reforço, nas mesmas condições do protocolo de imunização inicial. As amostrao

HC foi determinado pelo método da hemaglutinação. Para tanto, uma alíquota de 50 µL do soro de cada animal foi diluído em série em salina em placas de 96 poços (Figura 11

nte agitadas por cerca de 5 minutos e incubadas a 37°C por 1 hora. A reação de aglutinação foi observada ao microscópio óptico e o título de anticorpos de cada animal foi expresso como o título da maior diluição positiva, em logaritmo na base 2 (log2).

zação de camundongos com ovalbumina e os efeitos dos extratos

Para analisar a capacidade imunoreguladora dos extratos etanólico e hexânico de M.

charantia, grupos de animais (n=10) foram imunizados no dorso por via subcutânea com 0,1

mL de uma mistura contendo o antígeno OVA (10 μg) e 1,0 mg do adjuvante (gel de hidróxido de alumínio) dissolvidos em salina esterilizada (Pan et al., 2005) (Figura 9). Os animais receberam previamente a imunização, os seguintes tratamentos, via i.p., por 5 dias consecutivos: controle – salina (0,9%); testes – EH ( 10 e 100 mg/Kg ) e EE ( 10 e 100 mg/Kg) (Figura 8). Amostras de sangu

centrifugados para obtenção de soro imune, a fim de dosar IgG e IgE pela técnica de anafilaxia cutânea passiva (PCA). Noa

39

(a) (b)

Figura 8. Tratamentos (a) Grupos de animais (b) Administração intraperitoneal

(a) (b)

Figura 9. Imunização com o antígeno (a) Ovalbumina + adjuvante (b) Admninistração via

subcutânea no dorso dos animais

(a) (b)

Figura 10. (a) Coleta de sangue (b) Retração do coágulo

40

(a) (b)

Figura

5

O método utilizado para as reações de anafilaxia cutânea passiva (PCA) foi descrito por Ovary (1952) e modificado por Mota & Wong (1969).

Para a detecção de IgG por anafilaxia cutânea passiva foram utilizados camundongos e para detecção de IgE, foram usados ratos velhos (mais de 6 meses de idade). Após a depilação do dorso dos animais, foram injetados os soros diluídos. Em cada camundongo, foram injetados 4 soros, já nos ratos, foram marcadas três fileiras, e em cada uma foram injetadas 8 soros (24 diluições de soro /animal). As PCAs foram realizadas em duplicata. Após 2 e 18h foi injetado por via endovenosa a ovalbumina associada ao corante azul de Evans. A detecção de IgG e IgE foi determinada pelo grau de extravasamento do corante azul de Evans

Os títulos de PCA correspondem ao logaritmo na base 2 do inverso da diluição

A - Detecção de IgG em camundongos por Anafilaxia Cutânea Passiva

Os testes para determinação qualitativa e quantitativa de IgG foram feitos em

camundongos Swiss. A pele da região dorsal dos animais foi depilada, e as diluições dos

soros injetadas intradermicamente em pontos previamente marcados, em alíquotas de 25

μL. A reação foi desencadeada 2 horas mais tarde, por via endovenosa, no plexo

retroorbital, com uma suspensão do antígeno específico (OVA) para os anticorpos em

solução de azul de Evans 0,5% (Figura 13). A quantidade de antígeno utilizada para o

desencadeamento da PCA foi de 250 μg. Os camundongos foram sacrificados 30 minutos

mais tarde e a pele dissecada para a leitura da reação (Figuras 14 e 15), feita através de

manchas azuladas pr

soros diluídos.

Os animai ra 12).

11. (a) Centrifugação do sangue (b) Obtenção do soro

.3.2.1 - Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA) para IgE e IgG

provocando manchas azuladas sobre a pele dos animais. máxima capaz de provocar uma reação cutânea positiva (Figura 19).

ovocadas pelo extravasamento do corante nos sítios de injeção dos

s foram previamente anestesiados em câmara de éter (Figu

41

Figura 12 . Anestesia em câmara de éter e depilação do dorso do animal

(a) (b)

Figura 13. (a) Injeção intradérmica das diluições dos soros no dorso do animal

(b) Desencadeamento da PCA via plexo retroorbital

Figura 14. Dissecação da pele para leitura da reação

42

Figura 15. Extensão da pele para leitura da reação

B - Detecção de IgE em ratos por Anafilaxia Cutânea Passiva

A reação de anafilaxia cutânea passiva foi usada para a dosagem qualitativa e quantitativa de anticorpos IgE, como descrito por Mota & Wong (1969). Foram feitas diluições seriadas das misturas dos soros dos diferentes grupos de ratos imunizados com OVA. Estas diluições foram injetadas, em volume de 0,1 mL, no dorso de ratos previamente depilados (Figura 17) de modo a obter uma pequena pápula. Após 18 -24 horas, os ratos foram desafiados por via endovenosa, com uma suspensão do antígeno específico para os anticorpos em solução de Evans 0,5% (Figura 18). A quantidade do antígeno utilizada para o desencadeamento da PCA foi de 1,0 mg. Os ratos foram sacrificados 30 minut

Os animais for ura 16).

os mais tarde e a leitura das reações foi realizada na pele dissecada invertida, feita através de manchas azuladas provocadas pelo extravasamento do corantenos sítios de injeção das diluições dos soros contendo anticorpos a serem detectados.

am previamente anestesiados em câmara de éter (Fig

Figura 16. Anestesia de rato Wistar em câmara de éter

43

Figura 17. Tricotomia para injeção das diluções dos soros no dorso do animal

Figura 18. Desencadeamento da PCA via peniana

44

(a) (b)

Figura 19. PCA em ratos Wistar (a) Positiva (b) Negativa

5.4 Imunização de coelhos com derivado de proteína purificada (PPD) e os efeitos dos extratos hexânico e etanólico de M. charantia sobre a reação de hipersensibilidade retarda

Para avaliação da resposta imune celular, os animais foram previamente imunizados om 0,1 ml de um derivado proteíco purificado de tuberculina (PPD) (Ministério da

Brasil), por via subcutânea, no dia 1 (D1) do ensaio experimental. Os tratamentos tiveram início no D1, duas horas após a imunização dos animais e se estenderam por 14 dias consecutivos, sendo administrados por via oral através da utilização de um sonda orogástrica (Figura 20) somente uma vez ao dia, no período matutino, sendo 5 ml/animal. Os animais foram divididos em 6 grupos (n=3), os quais receberam os seguintes tratamentos: um grupo serviu como controle, recebendo apenas solução salina a 0,9%, a outro, foi ministrado, o extrato etanólico na dose de 10 mg/kg, o terceiro grupo, recebeu o extrato etanólico na dose de 100 mg/kg. O quarto e o quinto grupos receberam o extrato hexânico, nas doses de 10 e 100 mg/kg, respectivamente. A droga de referência utilizada foi o levamisol (20 mg/kg), sendo esta destinada ao tratamento do sexto grupo.

da (RHR)

cAgricultura,

Figura 20. Sonda orogástrica

45 No dia 14, foram injetados no dorso dos animais 0,1 ml de PPD (0,5 mg mL –1) por

via intradérmica, paralelamente à coluna vertebral do lado direito, entre a escápula e a

tuberosidade ilíaca. Para efeito comparativo, no lado esquerdo, foi injetada, salina a 0,9%,

em um ponto correspondente ao contra-lateral. Vale ressaltar, que essas regiões foram

submetidas a uma tricotomia prévia. A reação de hipersensibilidade retardada foi

determinada pela diferença do grau de endurecimento da pele entre o lado direito (teste) e o

esquerdo (controle), após 24, 48 e 72 horas do desafio, através de um paquímetro digital,

modelo Hauptner nº 33865 (KENNETH, 1982).

5.5 Indução de lesões cutâneas experimentais em coelhos e o efeito da aplicação tópica dos extratos hexânico e etanólico de Momordica charantia L. sobre a migração

Para a produção das eral

dos e a sua duração foi de aproximadamente duas horas (Figura 21).

celular feridas experimentais, os coelhos sofreram anestesia g

realizada por via intramuscular na região do quadríceps, utilizando-se cloridrato de ketamina

44 mg/kg, xilazina 4 mg/kg e valium 0,43 mg/kg. O período de indução da anestesia variou

de 90 a 120 segun

Figura 21. Demarcação das áreas das feridas experimentais

Foram produzidas seis feridas no dorso de cada animal, sendo três de cada lado,

paralelamente a coluna vertebral a 2 cm de distância, entre a escápula e a tuberosidade

ilíaca (Figura 21). As feridas foram promovidas com um punch de 5mm, incluindo

lesionamento da pele, tecido celular subcutâneo e músculo cutâneo do tronco. A

identificação das feridas seguiu a sua localização, portanto, foram denominadas cranial

direita (CRD), cranial esquerda (CRE), central

direita (CDD) e caudal esquerd 3).

direita (CND), central esquerda (CNE), caudal

a (CDE) (DORNELES et al., 200

46

nestésico, similar ao utilizado para indução

as feridas, para a secção das lesões, as quais foram encaminhadas para análise

bebidas em parafina e secções de 4 μm de espessura foram preparadas. As

minas foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) e observadas ao microscópio óptico

luz

é o

14, considerando os seguintes parâmetros: edema, hiperemia e presença de exsudato.

Realizou-se também a mensuração do halo da ferida no dia da indução da ferida no 4° (D4)

e 14° (D14) dias após a indução, através da colocação de plástico transparente sobre a

ferida e demarcação com caneta de retroprojetor, submetendo-se este traçado a

mensuração com planímetro, com 3 repetições de cada medida (MARTINS et al., 2003).

5.6 Análise estatística Todos os resultados obtidos foram submetidos ao programa estatístico STATVIEW

(1992-1998, SAS Inc Instituto), sendo expressos como média e desvio padrão.

Para análise da titulação de anticorpos específicos para hemácias de carneiro e para

os títulos de PC e em seguida,

submetidos a análise variância (ANOVA) ao teste t-Student, ao nível de 5% de

signific

Para o tratamento das lesões, preparou-se um unguento, obtido pela mistura de 10 e

20% dos extratos etanólico ou hexânico de M. charantia com uma base de lanolina e

vaselina (2: 1) (Farmácia de manipulação Ethicall). Em cada ferida, aplicou-se topicamente e

de forma padronizada: CRD e CRE (base), CND e CNE (extratos hexânico e ou etanólico a

10% + base), CDD e CDE (extratos hexânico e ou etanólico a 20% + base) (DORNELES et

al., 2003). Cada tratamento foi administrado uma vez ao dia no mesmo horário. As feridas

do lado direito foram tratadas por 4 dias e as do lado esquerdo por 14 dias. Após 4 e 14

dias, procedeu-se a realização do protocolo a

d

histológica. Para tanto, as lesões foram inicialmente submetidas a fixação em formol

tamponado a 10% por 6 horas, seguida de desidratação em álcool a 70%. As amostras

foram em

lâ

de comum. Foram avaliados três sítios de cada corte histológico, visando avaliar a

qualidade de epitelização dos diferentes tratamentos através da quantificação das células

mononucleares inflamatórias, fibroblastos e vasos (1000X) (DALAZEN et al., 2005).

As lesões foram também submetidas à avaliação macroscópica diária at

D

A anti-OVA, os resultados foram transformados em logaritmo

e

ância.

Os valores da reação de hipersensibilidade retardada e da retração da área da

ferida (mm) foram avaliados através da análise variância (ANOVA) e posteriormente

sumetidos ao teste t-Student. Já os resultados da contagem de células e vasos de 3 áreas

de cada lesão foram tabulados e analisados através do teste estatístico de Kruskall Wallis.

As diferenças significativas foram consideradas como (P< 0,05).

476. RES

o EH

prese ou ma

(mg/mL) (IV%)

ULTADOS 6.1 Prospecção Fitoquímica O estudo fitoquímico revelou a presença de esteróides e a ausência para alcalóides,

saponinas, catequinas, taninos, fenóis, flavonas, flavonóis, leucoantocianidinas, xantonas,

triterpenóides e resinas em ambos os extratos.

6.2 Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos das folhas de

Momordica charantia L. pelo método de varredura do radical livre DPPH Os resultados demonstraram que o EE das folhas de M. charantia nas doses de 2, 5

e 10 mg/mL apresentaram índice de varredura (IV) de 28,66%; 38,73% e 39,75%,

respectivamente. O EH das folhas de M. charantia nas doses de 2, 5 e 10 mg/mL

apresentaram IV de 40,07%; 76,64% e 79,79%, respectivamente. Os grupos controle BHT e

quercetina apresentaram IV de 90,89% e 90,32%, respectivamente.Portanto,

a nt ior poder antioxidante que o EE.

Tabela 1. Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos das folhas de

Momordica charantia L. pelo método de varredura do radical livre DPPH.

Amostras Dose Índice de varredura

2 28,66

5 38,73 EE

trole positivo) 0,5% 90,32

10 39,75

2 40,07 5 76,64 EH 10 79,79

BHT (controle positivo) 0,5% 90,89

Quercetina (con

6.3 Efeito do EH e EE de Momordica charantia L. sobre o título de anticorpos específicos anti-hemácias de carneiro em camundongos

48ostra o efeito dos tratamentos com EH e EE de M. charantia, nas doses

e 10 e 100 mg/kg sobre os títulos de anticorpos primários e secundários induzidos pela

arneiro (HC). O título da reação de hemaglutinação foi usado

ara avaliar a resposta imune humoral.

de 159,93 ± 1,97 e 164,95 ± 1,12,

spectivamente. Já nos grupos tratados com EE nas doses de 10 e 100 mg/kg, os títulos

e 82,51 ± 1,63

para o controle, os títulos atingiram uma média de 103,78 ± 0,94.

Na avaliação da resposta imune secundária no D14, sete dias após o reforço,

o EE, os títulos foram de 318,16 ± 2,22 e 323,45 ± 1,11, nas doses

de 10 e 10 pectivamente. O grup role apresentou ,99

± 1,11 enquanto que para a CSA, os títulos 33 ± 2,09.

Com base nos resultados, pode-se afirmar que no D14 os níveis de anticorpos dos

grupos tratados com o EH a 10 e a 100 mg/kg aumentaram significativamente (P<0,05),

diferindo do controle, não havendo diferença entre as doses analisadas (P 0,05). Com

relação à droga de referência imunossupressora, verificou-se que esta inibiu

significativamente o título de anticorpos em relação ao grupo controle. Os grupos tratados

com EE em ambas concentrações mantivera s de anticorpos semelhantes ao

controle (P

grupos

atisticamente (P<0,05), no tocante aos intervalos de tempo analisados dentro de

A Tabela 2 m

d

imunização com hemácias de c

p

Na avaliação da resposta imune primária através da produção de anticorpos

específicos anti-HC, os grupos que receberam tratamento com EH nas doses 10 e 100

mg/kg, apresentaram títulos de anticorpos

re

encontrados, foram de 119,96 ± 0,61 e 124,03 ± 1,08, respectivamente. No grupo tratado

com a ciclosporina (5mg/kg, droga de referência), verificou-se uma titulação d

e

Desta forma, no D7 após a imunização, verificou-se que não houve diferença

significativa (P>0,05), no título de anticorpos primários (TAP) nos animais tratados com EE

nas concentrações de 10 e 100 mg/kg em relação ao grupo controle. Já os animais tratados

com EH em ambas concentrações produziram um aumento significativo (P<0,05) do título de

anticorpos específicos anti-HC, enquanto que ciclosporina reduziu estes títulos

significativamente (P<0,05) em comparação ao controle.

observou-se que os títulos de anticorpos secundários (TAS), nos grupos tratados com EH

nas doses de 10 e 100 mg/kg, corresponderam a 369,16 ± 1,67 e 378,09 ± 1,14,

respectivamente. Para

0 mg/kg, res o cont uma titulação de 305

foram de 2

>

m os título

>0,05).

Comparando-se os TAP (D7) e os TAS (D14), observou-se que todos os

diferiram est

cada grupo.

49Tabela

anticorpos

2. Efeito do EH e EE de Momordica charantia L. sobre os títulos de anticorpos

específicos anti-HC.

Título de

TAP (D7) TAS (D14) Tratamento Dose (mg/kg)

i.p. X ± D.P X ± D.P

Controle - 103,78 ± 0,94 a,A 305,99 ± 1,11 a,B

10 159,93 ± 1,97 b,A 369,16 ± 1,67 b,B

EH 100 164,95 ± 1,12 b,A 378,09 ± 1,14 b,B

10 119,96 ± 0,61 a,A 318,16 ± 2,22 a,B

EE 100 124,03 ± 1,08 a,A 323

HC

,45 ± 1,11 a,B

CSA 5 82,51 ± 1,63 b,A 233,83 ± 2,09 b,B

Dados representados em média e desvio padrão (n=10).

a,b P<0,05 significativamente diferente do grupo controle.

A,B P<0,05 diferença estatística entre os intervalos de tempo analisados dentro de cada grupo.

TAP, Título de anticorpos primários; TAS, Título de anticorpos secundários.

de IgG anti-OVA que foi detecta

E em ambas concentrações mantiveram títulos de anticorpos IgG anti-

OVA si

No D14 os animais receberam um 1° reforço do antígeno, sendo o rpos do grupo controle de 2,81 ± 0,02. Para o EH nas doses de 10 e 100

ulos foram de 3,45 ± 0,02 e de 3,52 ± 0,02, respectivamente. Já para o EE nas 0 e de 100 mg/kg, os títulos ficaram em torno de 3,21 ± 0,02 e de 2,99 ± 0,06,

respectivamente.

6.4 Efeito do EH e do EE sobre a produção de anticorpos específicos anti-OVA

Os títulos de PCA para a detecção de IgG e IgE anti-OVA estão apresentados nos gráficos 1, 2, 3 e 4, e foram expressos como logaritmo na base 2.

Os gráficos 1 e 2 demonstram a cinética da síntese da a partir do D7. Os títulos de anticorpos encontrados no D7 para o grupo controle

foram de 2,23 ± 0,06. Nos grupos tratados com EH nas doses de 10 e 100 mg/kg, verificou-se um titulação de 2,74 ± 0,06 e 2,75 ± 0,01, respectivamente. Para o EE, os títulos respectivos a estas concentrações, foram de 2,53 ± 0,01 e 2,31 ± 0,01. Desta forma,

verificou-se um aumento significativo (P<0,05) dos títulos de anticorpos anti-OVA nos grupos tratados com o EH nas concentrações de 10 e 100 mg/kg em relação ao controle. Os grupos que receberam o E

milares ao controle (P>0,05).

No D14 houve um aumento significativo (P<0,05) do título de anticorpos IgG anti-OVA em relação ao D7.título de anticomg/kg, os títdoses de 1

50

mento. Os títulos para o controle foram de 3,45 ± 0,06. O EH e o EE,

as doses de 10 e 100 mg/kg apresentaram títulos de 4,30 ± 0,03, 4,39 ± 0,04, 3,57 ± 0,06,

3,57 ± 0,04, respectivamente. tam uma diferença significativa do EH

em ambas concentrações em o con ,05).

Acompanhando a cinética de IgG anti-OVA, verificou-se que do D21 para o D28

houve um aumento significativo (P<0,05) no título destes anticorpos. No D28 a titulação para

o grupo controle foi de 5,23 ± 0,05 EH e d sentaram

títulos de 6,28 ± 7, 6,39 ± 0,0 86 ± 0 te. Como

verificado anteriormente, apenas o EH nas du e estimulou

um aumento no título de anticorpo 0,05), s

grupos tratados com o EE foram simi es ao co

Do D28 para o D35 os títulos de anticorpos permaneceram estáveis (P>0,05). No

tígeno, sendo os títulos de anticorpos

as concentrações de 10 e 100mg/kg,

0,04,

7,18 ± 0,02 e na dose

mg/kg o título encontrado foi de 7,20 ± 0,05, no entanto os grupos tratados com este

xtrato mantiveram títulos que não diferem estatisticamente dos encontrados para o grupo

No D42 houve um aumento significativo (P<0,05) no título de IgG anti-OVA, sendo

9,74 ±

No D21 os títulos de anticorpos permaneceram estáveis em relação ao D14 (P>0,05)

independente do trata

n

Esses resultados deno

relação ao grup trole (P< 0

. O o EE nas doses e 10 e 100, apre

0,0 6, 5, 0,03 e 5,99 ± 0, 6, respectivamen

as concentrações studadas é que

s (P< enquanto que o títulos verificados para os

lar ntrole.

D35, os animais receberam o 2° reforço com o an

encontrados para o controle de 6,20 ± 0,08. O EH n

diferiu significativamente do controle, apresentando títulos de 7,76 ± 0,05 e 7,97 ±

respectivamente. O EE na dose de 10 mg/kg apresentou um título de

de 100

e

controle (P>0,05).

alcançado o pico máximo da síntese de anticorpos. Os títulos de anticorpos chegaram a

0,07 para o grupo tratado com EH 10, 9,98 ± 0,08 para o grupo tratado com EH 100.

Nos grupos tratados com EE 10 e EE 100, a titulação foi de 9,30 ± 0,07 e 9,68 ± 0,06,

respectivamente. No grupo controle, o título foi de 8,07 ± 0,02. Como aconteceu nos

intervalos de tempo anteriores, o EH apresentou efeito imunoestimulatório em relação ao

controle, independente da dose. Entretanto, o EE não apresentou comportamento

imunomodulador, pois os níveis de anticorpos não diferiram estatisticamente daqueles

apresentados pelo grupo controle.

51

Gráfico 1. Cinética da síntese de IgG sérica anti-OVA avaliada por PCA em camundongos tratados com EH.

Gráfico 2. Cinética da síntese de IgG sérica anti-OVA avaliada por PCA em camundongos tratados com EE.

5

obre a síntese de anticorpos IgE anti-OVA em ratos. A IgE foi detectada

omente a partir do D14 em todos os grupos que foram sensibilizados. Neste intervalo de

mpo, o título de anticorpos encontrado para o grupo controle foi 4,23 ± 0,01. Para o EH

nas doses de 10 e 100 mg/kg, os títulos de anticorpos determinados por PCA foram de 5,14

± 0,07 e 5,27 ± 0,04, respectivamente, enquanto que para o EE, nas mesmas doses, os

títulos foram de 4,99 ± 0,06 e 5,02 ± 0,03, respectivamente. Desta forma, verificou-se que

houve um aumento significativo (P<0,05) nos títulos de IgE em relação ao controle nos

grupos tratados com o EH.

Com a administração de um reforço no D14, os títulos de anticorpos IgE anti-OVA

aumentaram significativamente (P<0,05) no D21. Os valores encontrados para o controle,

EH a 10 e 100 mg/kg e EE nas mesmas doses foram de 5,42 ± 0,05, 6,54 ± 0,05, 6,72 ±

0,07, 6,30 ± 0,05 e 6,50 ± 0,04, respectivamente. Analisando estatisticamente estes dados

verificou-se que apenas o EH independente da dose, diferiu do grupo controle, induzindo um

aumento significativo na titulação de IgE anti-OVA (P<0,05).

No D28 os títulos de anticorpos permaneceram estáveis (P>0,05) em relação ao

D21. O EH nas doses 10 e 100 mg/kg apresentaram títulos de 7,07 ± 0,05 e 7,30 ± 0,04,

respectivamente. Para o EE os títulos foram de 6,41 ± 0,05 e 6,56 ± 0,08, respectivament

para as doses de 10 e 100 mg/kg, enquanto que o controle apresentou uma titulação para

do EH continuou a ocorrer, bem como EE continuou a não diferir

estatisticamente do controle, independente da dose estudada. Do D28 para o D35, a curva

de IgE apresentou um decréscimo significativo (P<0,05), tendo os títulos do grupo controle,

EH e EE nas doses de 10 e a 100 mg/kg apresentado os seguintes valores 4,68 ± 0,06, 5,82

± 0,02 5,79 ± 0,03 5,07 ± 0,04 e 5,28 ± 0,02, respectivamente.

No D35, foi administrado um 2° reforço com o antígeno específico. Verificou-se que

após este reforço, os títulos de anticorpos voltaram a aumentar, alcançando o máximo da

síntese de anticorpos IgE anti-OVA no D42. O título máximo alcançado foi 9,70 ± 0,03 sendo

verificado no grupo tratado com o EH100, seguido pelo EH10, com um título de 9,53 ± 0,08,

no entanto não houve diferença significativa entre as doses do tratamento com EH. Os

títulos para o EE nas doses de 10 e 100 mg/kg foram 8,08 ± 0,05 e 8,49 ± 0,09,

respectivamente, enquanto o controle apresentou um título de 7,88 ± 0,08. Diante dos

resultados, mais uma vez, o EH demonstrou capacidade em aumentar o título de anticorpos

em relação ao controle (P<0,05).

Diante das evidências, sugere-se que o EH apresenta efeito imunoestimulatório de

IgE sérica anti-OVA independente da dose, enquanto que o EE não causou mudança

significativa no título de anticorpos em relação ao grupo controle (P>0,05).

2

Os gráficos 3 e 4 nos mostram o efeito do tratamento com EH e EE de M. charantia

espectivamente, sr

s

te

e

IgE anti-OVA de 5,79 ± 0,08. Como verificado anteriormente, o mesmo comportamento

imunoe timulatórios

53

Gráfico 3. Cinética da síntese de IgE sérica anti-OVA avaliada por PCA em camundongos tratados com EH.

Gráfico 4. Cinética da síntese de IgE sérica anti-OVA avaliada por PCA em camundongos tratados com EE.

nimais imunizados com derivado de proteína purificada (PPD)

A Tabela 3 mostra o efeito dos tratamentos com EH e EE de M. charantia sobre a

RHR em coelhos imunizados com PPD no D14 após a imunização.

No tempo de 24 h após o desafio, o grupo controle apresentou, um resultado de RHR

expresso como média e desvio padrão, em torno de 2,90 ± 0,05 mm. Nos grupos tratados

com o EH nas concentrações de 10 e 100 mg/kg, obteve-se como resultado da reação, 5,59

± 0,09 e 5,88 ± 0,09 mm, respectivamente. Para EE nas doses de 10 e a 100 mg/kg, os

valores foram de 3,37 ± 0,09 e 3,45 ± 0,12 mm, respectivamente. Já para a droga de

referência (levamisol - 20mg/kg), o valor obtido foi 6,01 ± 0,10 mm. Verificou-se que nos

grupos tratados com EH em ambas concentrações e com a droga de referência

imunoestimulatória houve uma RHR mais acentuada, diferindo estatisticamente do controle

(P<0,05).

De 24 para 48 h, houve um aumento significativo (P<0,05) da resposta imune celular

eterminado pelo aumento da RHR, sendo alcançado seu valor máximo. No tempo de 48 h

pós a inoculação do PPD, o valor encontrado para o grupo controle foi de 3,68 ± 0,20 mm e

e 7,10 ± 0,15 e 7,19 ± 0,09 mm, respectivamente. O EE nas doses

de 10 e 100 mg/kg apresentou uma reação de 4,35 ± 0,12 e de 4,32 ± 0,08 mm,

respectivamente. Observou-se que o EH, bem como o levamisol, estimulou a RHR em

relação ao controle (P<0,05).

No tempo de 72 h o valor da reação encontrada para o grupo controle foi de 3,28 ±

0,14 mm. O EH nas doses de 10 e 100 mg/kg aumentaram significativamente a RHR

(P<0,05), com resultados de 5,98 ± 0,05 e 5,96 ± 0,05 mm, respectivamente. O valor

referente ao levamisol foi de 6,70 ± 0,07 mm, que por sua vez, também diferiu do grupo

controle. Já o EE na dose de 10 mg/kg apresentou um valor reacional de 3,89 ± 0,08 mm

enquanto o EE100 apresentou uma reação de 3,94 ± 0,07 mm.

Portanto, os tratamentos a base de EH e da droga imunoestimulatória induziram um

aumento significativo na RHR (P<0,05) em relação ao controle em todos os intervalos de

tempo analisados, sendo este aumento mais pronunciado com 48 h.

54

6.5 Efeito do EH e do EE sobre a reação de hipersensibilidade retardada (RHR) em

54

a

d

a

para o grupo tratado com levamisol foi de 7,20 ± 0,10 mm. O EH a 10 e a 100 mg/kg

apresentou uma RHR d

55

Tabela 3. Efeito do EH e do EE sobre a RHR em coelhos imunizados com PPD.

RHR (mm)

24 h 48 h 72 h T

X ± D.P

ratamento Dose (mg/kg i.p.)

X ± D.P X ± D.P

Controle 2,90 ± 0,05 a,A 3,68 ± 0,20 a,B 3,28 ± 0,14a,B

10 5,59 ± 0,09 b,A 7,10 ± 0,15 b,B 5,98 ± 0,05b,B EH

100 5,88 ± 0,09 7,19 ± 0,09 5,96 ± 0,05

a,A a,B a,B

b,A b,B b,B

10 3,37 ± 0,09 a,A 4,35 ± 0,12 a,B 3,89 ± 0,08a,B EE

100 3,45 ± 0,12 4,32 ± 0,08 3,94 ± 0,07

Levamisol 20 6,01 ± 0,12 b,A 7,20 ± 0,10 b,B 6,70 ± 0,07b,B

sentados em média e desvio padrão (n=3).

a,b P<0,05 si

A,B P<0,05 diferen s

nas concentrações de 10 e 20% obedeceram a mesma seqüên

hiperemia e presença de exsudato foram discretos nas feridas tratadas com o extrato

nos dias iniciais após a indução das feridas experimentais, fazendo-se necessário um maior

e um colar em torno do pescoço de cada animal, além de permanecerem alojados em gaiolas individuais.

Dados repre

gnificativamente diferente do grupo controle.

ça estatística entre os intervalos de tempo anali ados dentro de cada grupo.

6.6 Efeito da aplicação tópica do EH e do EE de Momordica charantia L. em lesões cutâneas experimentais em coelhos

A avaliação macroscópica foi realizada diariamente até o D14. Nesse estudo foi observado que as lesões teciduais experimentais nos grupos controle e tratados com o EE de Momordica charantia L.

cia de eventos dependente do tempo. No entanto, os grupos tratados com EH a 10 e 20%, apresentaram uma evolução cicatricial mais precoce em relação ao controle. No decorrer de toda a investigação observou-se que os sinais de inflamação como edema,

hexânico adicionado ao unguento. Nos animais tratados com unguento associado ao extrato etanólico, contatou-se moderada exsudação a partir do quarto dia permanecendo até o último dia analisado (14° dia).

Nos exames físicos diários foram observadas manifestações de dor e inapetência

cuidado na manipulação dos coelhos, para que estes, não interferissem na aplicação e manutenção dos tratamentos sobre as lesões, desta forma, utilizou-s

56

Tabela 4. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre a retração da

rea (mm) do processo inflamatório.

a (mm)

á

Áre

D4 D14 Tratamentos ão

X

Controle ,1 a,A 8 a,B

Concentraç%

(X ± D.P) ( ± D.P)

- 2 3 ± 0,06 2,7 ± 0,06

10 2,5 b,A b,B

,6 b,A 0 b,B

,1 a,A 8 a,B

Ungüento (Lanolina -

Glicerina 2:1)

,2 6

8 ± 0,08 3,37 ± 0,09EH

20 2 9 ± 0,17 3,5 ± 0,12

10 2 7 ± 0,05 2,8 ± 0,10EE

20 2 1 ± 0,11a,A 2,9 ± 0,10a,B

Dados representados em média e desvio padrão (n=3).

a,b P< 0,05 significativamente diferente do grupo controle.

A,B P< 0,05 diferença estatística entre os intervalos de tempo analisados dentro de cada grupo.

A Tabela 4 demonstra os efeitos do EH e EE das folhas de M. charantia sobre a área

No D4, o grupo controle apresentou uma área de retração correspondente a 2,13 ±

0,06 m

e a 20%, os resultados foram de 2,88 ± 0,10 e 2,96 ± 0,10

respec

evoluído

de retração de lesões cutâneas determinada pela mensuração do halo da ferida após 4 (D4)

e 14 (D14) dias de tratamento.

m. Os grupos tratados com os ungüentos a base do EH a 10 e a 20%, apresentaram

valores de 2,58 ± 0,08 e 2,69 ± 0,17mm, respectivamente. Os ungüentos a base de EE nas

mesmas concentrações induziram retração de 2,17 ± 0,05 e 2,21 ± 0,11 mm,

respectivamente. Pode-se verificar que o ungüento associado ao EH, independente da dose,

provocou uma retração significativa (P<0,05) na área das lesões induzidas

experimentalmente em relação ao controle.

No D14, o grupo controle apresentou como média de retração 2,78 ± 0,06 mm. Os

grupos tratados com o ungüento a base do EH a 10 e a 20% apresentaram uma área de

retração de 3,37 ± 0,09 e 3,50 ± 0,12 mm, respectivamente. Para as lesões tratadas com

ungüentos a base de EE a 10

tivamente. Desta forma, também foi verificada uma retração da ferida mais

significativa nos grupos tratados com EH a 10 e a 20% em relação ao controle.

Com base nos resultados do estudo morfométrico pela mensuração do halo da

ferida, observou-se que no D14 o processo de cicatrização tecidual havia

57

significativamente em comparação ao D4, já que a área de retração das feridas foi

significativamente maior neste intervalo de tempo (P<0,05). Diante dos dados obtidos,

ugere-se que o EH é capaz de aumentar o estímulo para que ocorra a regeneração

cutânea, atuando desta forma como agente estimulante da ci ntretanto o EE não

foi capaz de ntração

A contagem de células mononucleares, fibroblastos e vasos sanguíneos na região da

lesão para todos os tratamentos avaliados está apr as Ta e 7 e na

Figura 22. As células sangu os foram avé io de três

campos histológicos em aumento de 100

Tabela tratamentos com os ungüentos à base

mononucleares.

N° células mononucleares

s

catrização, e

favorecer a co das lesões.

esentada n belas 5, 6

e os vasos íne contados atr s do somatór

X.

5. Efeito dos de EH e EE sobre as células

Tratamentos Concentração % (X ± D.P)

D4 D14 Controle - 32,66 ± 0,83 12,12 ± 0,14

10 14,83 ± 1,52* 4,20 ± 0,18** EH

20 13,45 ± 1,62* 4,33 ± 0,13**

ngüento (Lanolina - Glicerina

2:1) 10 27,12 ± 1,00 10,40 ± 0,10

U

EE 20 28,35 ± 1,75 10,83 ± 0,07

Dados representados em média e desvio padrão (n=3).

*Diferença estatisticamente significativa (P<0,01) em relação ao grupo controle no tempo de 4 dias.

**Diferença estatisticamente significativa (P<0,01) em relação ao grupo controle no tempo de 14 dias.

Em relação às células mononucleares no D4, a média do somatório de três campos

histológicos foi de 32,66 ± 0,83, para o tratamento controle, 14,83 ± 1,52 para a lesão

tratada com EH10 e 13,45 ± 1,62 para aquela tratada com EH20. A contagem destas células

na lesão tratada com o EE a 10 e a 20% foi de 27,12 ± 1,00 e 28,35 ± 1,75 células,

respectivamente. No D14, a lesão controle apresentou 12,12 ± 0,14 células, enquanto a

ferida cutânea que recebeu o EH10 e o EH20, apresentou 4,20 ± 0,18 e 4,33 ± 0,13 células,

respectivamente. Já para as lesões tratadas com EE10 e o EE20, foram contadas 10,40 ±

0,10 e 10,83 ± 0,07 mononucleados, respectivamente.

58

A Tabela 5 indica que o ungüento que demonstrou capacidade de estimular a

resposta inflamatória, fazendo com que esta ocorra mais precocemente, foi aquele

associado ao extrato hexânico em ambas concentrações, já que este gerou uma redução

significativa na quantidade de células mononucleares em relação ao controle nos dois

intervalos de tempo analisados. A diminuição do número de células mononucleares também

é estat

s ungüentos à base de EH e EE sobre os

broblastos.

N° fibroblastos

isticamente significante (P<0,01) quando avaliada entre os tempos 4 e 14 dias do

mesmo grupo.

Tabela 6. Efeito dos tratamentos com o

fi

(X ± D.P) Tratamentos Concentração %

D4 D14

Controle - 26,00 ± 2,25 23,33 ± 1,20

10 20,90 ± 0,86 14,66 ± 1,16*

20 21,43 ± 1,28 16,16 ± 1,23*

10 21,84 ± 0,83 22,55 ± 1,37

Ungüento (Lanolina-

EE 20 22,46 ± 1,02 21,98 ± 1,93

EH Glicerina

2:1)

os representados em média e desvio padrão (n=3).

a estatisticamente significativa (P<0,01) em relação ao grupo controle no tempo de 14 dias.

10 e a 20% apresentaram 20,90 ± 0,86 e 21,43 ± 1,28 fibroblastos, respectivamente. Já nas

lesões

o ungüento a base de EH a 10 e a

20% em relação ao controle no tempo de 14 dias.

Dad

*Diferenç

No tocante a quantificação de fibroblastos observou-se que no D4, a lesão controle

apresentou 26 ± 2,25 fibroblastos, enquanto aquelas tratadas com ungüento a base do EH a

tratadas com ungüento a base do EE a 10 e a 20% contou-se 21,84 ± 0,83 e 22,46 ±

1,02 células. No D14, foram achados 23,33 ± 1,20 fibroblastos, para a lesão controle e uma

média de 14,66 ± 1,16 e 16,16 ± 1,23 para os grupos que receberam o ungüento associado

ao EH a 10 e a 20%, respectivamente. Já para os grupos que receberam o ungüento

associado ao EE a 10 e a 20%, a quantificação de fibroblastos revelou valores de 22,55 ±

1,37 e 21,98 ± 1,93 respectivamente.

Os dados expressos na Tabela 6 revelam que houve redução significativa (P< 0,01)

no número de fibroblastos entre os grupos tratados com

59

Tabela 7. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre a formação

dos vasos sangüíneos.

N° vasos sanguíneos

(X ± D.P) Tratamentos Concentração %

D4 D14

Controle - 7,23 ± 0,50 6,78 ± 0,70

10 6,48 ± 0,56 4,96 ± 0,67* EH

20 6,74 ± 0,40 5,03 ± 0,42*

10 6,97 ± 0,72

ento (Lanolina- Glicerina

2:1) E

6,39 ± 0,7 3 ± 0,73

Ungü

0,71 5,74 ±E

20 9 5,9

Dados representados desvio padrão (n=3).

*Difer amente significativa (P ) em re ntrole dias.

7 demonstra que no D4 o número de vasos no grupo controle era 7,23 ±

0,50. A quantificação de vasos nas lesões tratadas com o ungüento associado ao extrato

hexânico a 10 e a 20 %, revelou a presença de 6,48 ± 0,56 e 6,74 ± 0,40, respectivamente.

á para as lesões tratadas com ungüento a base de EE nas concentrações de 10 e 20%, os

o D14, a contagem de vasos para as lesões controle foi 6,78 ± 0,70. Para o EH e

EE a 1

em média e

ença estatistic

A Tabela

<0,01 lação ao grupo co no tempo de 14

J

valores obtidos corresponderam a 6,97 ± 0,71 e a 6,39 ± 0,79, respectivamente.

N

0 e a 20%, os resultados obtidos foram 4,96 ± 0,67, 5,03 ± 0,42, 5,74 ± 0,72, 5,93 ±

0,73, respectivamente.

A Tabela 7 indica que a quantidade de vasos sanguíneos foi significativamente

menor (P<0,01) no grupo tratado com o ungüento associado ao extrato hexânico nas

concentrações de 10 e de 20% em relação ao controle no tempo de 14 dias.

60

igura 22. Aspectos histológicos de lesões cutâneas experimentais (4x) em coelhos

atados com ungüentos a base dos extratos hexânico (EH) e etanólico (EE) de M. charantia

as concentrações de 10 e de 20%, por 4 (D4) e 14 (D14) dias.

) controle D4 b) controle D14 c) EE10 D4 d) EE10 D14 e) EE20 D4

EE20 D14 g) EH10 D4 h) EH10 14 i) EH20 D4 j) EH20 D14

Ftr

n

a

f)

61

7. DISCUSSÃO

A Momordica charantia L. pertencente à família Cucurbitaceae, é uma planta

medicinal que vêm ganhando espaço no cenário científico. Constitui uma trepadeira,

bastante comum no semi-árido nordestino, sendo popularmente conhecida por melão-de-

São-Caetano. Estudos prévios comprovaram inúmeras propriedades farmacológicas desta

planta. Recentemente, tem aumentado o interesse por fitoterápicos, destacando-se aqueles

com potencialidade para atuar sobre o sistema imunológico e sobre o processo de

regeneração cutânea. A abordagem fitoquímica dos extratos hexânico e etanólico das folhas de M.

charantia revelou a presença de esteróides em ambos. A atividade imunomoduladora e

cicatrizante de muitas plantas medicinais é atribuída a diferentes princípios ativos. Desta

forma, as ações do EH das folhas de M. charantia pode ser atribuída aos princípios ativos

contidos nos esteróides. Entretanto, vale ressaltar que como os solventes apresentam

diferenças de polaridade, os esteróides encontrados no método qualitativo devem conter

estruturas que conferem características particulares. Desta forma, é necessário que seja

dada uma maior ênfase ao isolamento e purificação dos constituintes imunoativos.

O sistema imune está envolvido na etiologia bem como nos mecanismos

patofisiológicos de muitas doenças. A modulação da resposta imune para aliviar doenças

tem sido de interesse por muitos anos. Algumas plantas medicinais são ricas em fontes de

substâncias as quais contribuem para o aumento da imunidade específica e não específica

dos granulócitos, macrófagos, células NK e sistema complemento, prevenindo o

envelhecimento e melhorando as funções mentais pelo fortalecimento do eixo psico-neuro-

imune (SHARMA et al., 1996).

São relatadas na medicina tradicional, plantas medicinais com propriedades

imunomoduladoras e que vêm sendo validadas cientificamente. Muitos modelos

experimentais têm sido utilizados para avaliação desta atividade (ROSS et al., TIWARI et al.,

2004; PAN et al., 2005; GHULE et al., 2006).

A imunidade humoral envolve a interação das células B com o antígeno e sua

proliferação e diferenciação em células plasmáticas secretoras de anticorpos. Os anticorpos

funcionam como efetores da resposta humoral por sua capacidade de ligar-se ao antígeno e

neutralizá-lo ou facilitando a sua eliminação pela ligação cruzada, através das quais se

formam agrupamentos, que são mais prontamente ingeridos pelas células fagocíticas.

xia cutânea passiva (PCA),

Para avaliar o efeito dos extratos hexânico e etanólico das folhas de Momordica

charantia L. sobre a produção de anticorpos específicos para hemácias de carneiro e

ovalbumina, utilizou-se às técnicas de hemaglutinação e anafila

respectivamente.

62

Os títulos de anticorpos da reação de hemaglutinação foram determinados para

stabelecer a resposta humoral contra hemácias de carneiro em camundongos após 7 e 14

dias d

05) em comparação ao controle. No D14, observou-se um aumento

signific

o dorso

de PCA. Através desta reação acompanhou-se a cinética de

todos os grupos que foram sensibilizados, o

OVA

alcança

. Entretanto, o EE não apresentou comportamento imunomodulador,

e

e tratamento, para avaliação da resposta imune primária e secundária,

respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que não houve diferença significativa

(P>0,05), no TAP e no TAS nos animais tratados com EE nas concentrações de 10 e 100

mg/kg em relação ao grupo controle. Já os animais tratados com EH em ambas

concentrações produziram um aumento significativo (P<0,05) do título de anticorpos

específicos anti-HC no D7 e no D14, enquanto que ciclosporina reduziu estes títulos

significativamente (P<0,

ativo no título de anticorpos anti-HC em todos os grupos (P<0,05) em relação ao D7

(Tabela 2). Estes resultados estão de acordo, com o descrito por Holland & Vizi (2002) que

atribuem a titulação de anticorpos mais alta no D14, ao fato da resposta imune secundária

acontecer muito mais rapidamente que a primária, em decorrência da memória imunológica.

A ovalbumina é uma proteína de baixo peso molecular, que quando usada como

antígeno, estimula a síntese de IgG e de IgE. A técnica de anafilaxia cutânea passiva in vivo

foi utilizada para dosar anticorpos específicos IgG em camundongos e IgE em ratos, após

imunização com OVA. Nesse teste, foram injetadas diluições dos soros-teste, sobre

dos animais. Após o tempo de imunização, injetou-se endovenosamente a solução

antigênica associada ao corante azul de Evans. Em uma reação positiva, cada local da

reação mostrou uma resposta inflamatória imediata. O corante se conjuga com a albumina

sérica e não sai normalmente da corrente sanguínea. Nos locais de inflamação aguda, onde

se aumenta a permeabilidade vascular, a albumina marcada com corante entra no fluido

tecidual e forma uma mancha azul nítida. Utilizou-se o tamanho e a intensidade dessa

mancha como medida do título

IgG e IgE através da obtenção de soros de animais tratados com EE e EH e imunizados

com ovalbumina.

A síntese de anticorpos IgG anti-OVA foi detectada a partir do 7° dia, enquanto a IgE

foi verificada somente a partir do 14º dia em

que demonstra a resposta tardia desta imunoglobulina. No 14° e 35º dias, os animais

receberam um reforço do antígeno. Verificou-se uma tendência contínua no aumento de IgG

com o passar do tempo. Entretanto para a IgE, a titulação permaneceu crescente até o 28°

dia, havendo no 35° dia um decréscimo destes anticorpos. Porém, após o 2° reforço no D

35, é que se percebeu o pico máximo da síntese de anticorpos IgG e IgE anti-

do no D42. Verificou-se um aumento significativo dos títulos de IgG e IgE anti-OVA

nos grupos tratados com EH nas doses de 10 e 100 mg/kg em relação ao controle em todos

os intervalos de tempos analisados, sugerindo que este extrato tenha efeito

imunoestimulatório

63

manten

respos

1983). Os efeitos integrais dessas citocinas consistem em recrutar macróf

do os níveis de anticorpos compatíveis com os do grupo controle (Gráficos 1, 2, 3 e

4).

Vale ressaltar que as hemácias de carneiro e a ovalbumina, constituem antígenos T-

dependentes, havendo a necessidade de auxílio das células T antígeno-específicas para a

produção da resposta humoral.

A estimulação da resposta humoral pelo extrato hexânico de Momordica charantia L.

indica uma responsividade aumentada dos macrófagos e linfócitos T e B, envolvidos na

síntese de anticorpos. O tratamento com o EH estimula a resposta imune humoral, isto

demonstra ser muito promissor para o tratamento de pacientes imunossuprimidos, como no

caso dos aidéticos ou cancerosos. No entanto, são necessários maiores estudos para

assegurar o efeito prolongado da administração do extrato no organismo e desvendar o seu

papel na prática clínica moderna.

Já para verificar a ação dos extratos etanólico e hexânico de M. charantia sobre a ta imune celular, utilizou-se a RHR, usando como antígeno o PPD. A análise

macroscópica de lesões cutâneas induzidas experimentalmente em coelhos, bem como mensuração da área da ferida após 4 e 14 dias de tratamento com um ungüentos a base de EH e EE e a avaliação do processo de cicatrização através da análise histológica foram outros parâmetros utilizados para analisar este efeito.

A RHR é caracterizada pelo aumento no influxo de células inflamatórias não-específicas, onde os macrófagos são os principais participantes. A reação de hipersensibilidade tipo IV ocorre quando o antígeno ativado sensibiliza as células T. Essas células geralmente se apresentam sob a forma de uma subpopulação de Th1, entretanto, outras vezes, as células T citotóxicas são também envolvidas. A ativação das células T se dá pela apresentação do antígeno através das células apresentadoras de antígeno

apropriadas, resultando na secreção de várias citocinas incluindo interleucina-2, interferon-γ, fator de inibição da migração de macrófagos e fator-β de necrose tumoral (ASKENASE & VAN LOVEREN,

agos dentro da extensão e ativação delas, promovendo um aumento da atividade fagocítica pelo aumento da concentração de enzimas líticas para uma matança mais efetiva. Várias linhas de evidências sugerem que a reação de hipersensibilidade retardada é um importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra parasitas e bactérias que podem viver e proliferar intracelularmente.

O EH independente da concentração e do intervalo de tempo analisado promoveu

uma ação imunoestimulatória sobre os linfócitos e demais células necessárias para a

expressão da reação, bem como da participação das citocinas pro-inflamatórias, em relação

ao controle. Isso pode ser percebido pela formação de uma pápula, no local da

sensibilização (Tabela 3). No tempo de 48 h, verificou-se uma reação mais intensa

independente do grupo, o que está concordante com o indicado por Janeway (2002), o qual

64

cita que uma resposta inflamatória poderia atingir a sua maior intensidade entre 24 e 72

horas.

l) permaneceram dentro dos limites fisiológicos de variação

para a

001) e do extrato aquoso de Capparis zeylanica (GHULE

et al., 2

a resposta inflamatória. Os neutrófilos

são as

eis pela síntese de componentes da matriz de tecido

conjun

entre o 3º e o 10º dia após a lesão. Para a eficiência da fibroplasia é necessária a ocorrência

É válido ressaltar que, nenhum animal apresentou qualquer alteração clínica em seu

estado geral. Durante o experimento, as funções vitais (frequência respiratória, batimentos

cardíacos e temperatura corpora

espécie cunícola. Este fato pode ser explicado, pois o teste tuberculínico estimula

uma reação de hipersensibilidade retardada (tipo IV) geralmente sem manifestações

sistêmicas, caracterizada por uma resposta inflamatória no local da aplicação da tuberculina.

Essse estudo demonstra a ação do extrato hexânico de M. charantia na estimulação da

resposta imune celular. Outras plantas foram capazes de provocar imunoestimulação

associada à resposta imune celular, como foi o caso da suspensão aquosa de frutos da

Punica granatum (ROSS et al., 2

006).

Danos tissulares de qualquer natureza (física, química ou biológica) desencadeiam

de imediato uma série de eventos que de forma simplista se traduzem como rubor, tumor,

calor e dor. Estes sinais resultam da ativação de células nervosas, estromais, vasculares e

circulatórias por estímulos físicos ou por sinalização química. A sinalização química orienta

a migração das células envolvidas com a instalação d

células mais abundantes no sangue, com capacidade de migrar para a superfície da

ferida a fim de formar uma barreira contra a invasão de microorganismos e promover o

recrutamento ativo de mais neutrófilos a partir dos vasos adjacentes não lesados

(ENGELHARD et al., 1998). Ao final de um dia após a lesão, eles constituirão 50% das

células locais. Contudo, na dependência do estímulo, outros tipos celulares podem

predominar, desde eosinófilos (reações de hipersensibilidade) e até macrófagos. O influxo

destas células para o sítio da lesão durante a fase inflamatória, revelou no 4º dia de

tratamento uma redução destas células nos grupos tratados com o ungüento à base de

extrato hexânico a 10 e a 20% em relação ao controle, indicando que este tratamento foi

capaz de modular o processo inflamatório neste intervalo de tempo.

Com a presença local de macrófagos e a produção e liberação dos mediadores

químicos produzidos por eles, a migração e ativação de fibroblastos é intensificada. Essas

células são as principais responsáv

tivo, que, na ocorrência de inflamação encontram um meio e fatores favoráveis ao

seu desenvolvimento. O fibroblasto é a principal célula para a formação de tecido de

granulação, sintetizando ácido hialurônico, fibronectina, colágenos tipos I e II, elastina e

proteases, como a colagenase, importante para o debridamento e o remodelamento das

fibras colágenas (KITCHEN & YOUNG, 1998). O aumento de fibroblastos na regeneração

tecidual encontra seu ápice na fase proliferativa deste processo, que ocorre geralmente

65

em paralelo da formação de novos vasos sangüíneos, ou seja, é necessária a

neovascularização da região, já que esta permite a troca de gases e a nutrição das células

metabo

foi ainda mais significativa em relação ao grupo controle, sugerindo que este

extrato

idas experimentais foi

conside

licamente ativas (ECKERSLEY & DUDLEY, 1988). Além da ação direta de fatores de

crescimento sobre as células da vasculatura, a indução da angiogênese é, em parte,

creditada à baixa tensão de oxigênio característica que ocorre no centro de uma ferida

(KNIGHTON et al., 1981).

No início da fase de remodelação, que corresponde aos grupos analisados no 14°

dia neste experimento, observou-se uma redução no número de células mononucleares,

fibroblastos e vasos sanguíneos (Tabelas 5, 6 e 7, respectivamente) e isto se justifica pela

mudança de fase do processo inflamatório, isto é, da fase de proliferação passa-se para a

fase de remodelamento, onde há aumento de colágeno e redução de células e vasos.

Sendo que nos grupos experimentais tratados com ungüento à base do extrato hexânico

essa redução

acelerou a reparação tecidual na fase tardia da reação inflamatória, possibilitando o

alcance da fase de remodelamento mais precocemente que os demais grupos. Neste

mesmo intervalo de tempo, o leito da ferida apresentou-se totalmente preenchido pelo tecido

de granulação (GUIDUGLI-NETO, 1987), com uma rede capilar atravessando-o e a rede

linfática em franca regeneração, devido a sua reconstrução ter início posterior ao da

vasculatura. O tecido de granulação vai sendo enriquecido com mais fibras de colágeno e

começa a adquirir a aparência de massa fibrótica característica da cicatriz. Ao final da fase

de remodelamento, os anexos da pele, como folículos pilosos e glândulas sofrem

regeneração limitada e a coloração da cicatriz permanece pálida, pois a regeneração dos

melanócitos é deficiente (JOHNSTON, 1990) e as cicatrizes são hipovascularizadas devido

ao desaparecimento dos neocapilares, o que justifica a redução dos vasos sanguíneos com

14 dias de tratamento, observada em todos os tratamentos.

As etapas do processo de cicatrização foram observadas no presente trabalho tanto

nas lesões tratadas com os extratos hexânico e etanólico de M. charantia, como nas não-

tratadas, conforme os dias analisados. A evolução cicatricial das fer

rada clinicamente normal. No entanto, a presença de exsudato no grupo controle e

tratado com extrato etanólico, prejudicou a cicatrização, já que este é capaz de promover a

desagregação do tecido de granulação em formação e o desenvolvimento de

microorganismos (OLIVEIRA, 1992).

As infecções microbianas causam um aumento nas complicações no processo de

cicatrização. Estudos prévios revelaram que a M. charantia apresenta um amplo espectro de

atividade antimicrobiana (KHAN, 1998). A determinação da atividade antimicrobiana in vitro

dos extratos das folhas demonstrou eficácia contra Escherichia coli, Salmonella paratiphy,

Shigella dysenterae, Streptomyces griseus e Mycobacterium tuberculosis (OMOREGBE et

al., 1996; FRAME et al., 1998).

66

O estudo morfométrico revelou que no D14, o processo de cicatrização tecidual

evoluiu significativamente em relação ao D4, sendo que o EH foi capaz de promover um

maior estímulo para a ocorrência da regeneração cutânea. Isto pôde ser verificado pela

maior área de retração das feridas em relação às lesões do controle (Tabela 4).

Quanto aos aspectos histológicos das lesões cutâneas induzidas experimentalmente,

verificou-se que os tratamentos a base do extrato hexânico de M. charantia nas

concentrações de 10 e de 20% induziram uma melhor e mais rápida regeneração tecidual

(Figura 21).

Através da avaliação da atividade antioxidante, verificou-se resultados mais

satisfatórios relacionados ao extrato hexânico, enquanto que o extrato etanólico apresentou

índices de varredura baixos em relação ao controle (Tabela 1). A atividade antioxidante

contribui favoravelmente para a cicatrização de feridas, porque a produção de oxigênio

durante o processo inflamatório agrava as desordens nos tecidos. As propriedades anti-

radicais observadas no extrato hexânico provavelmente favorecem a cicatrização.

A sinergia de todos esses fatores avaliados pode estar envolvida com a capacidade

estimulatória de atuação do extrato hexânico sobre a resposta imune e sobre o processo

cicatricial.

67

8. CON

rodução de

estimulante sobre a resposta imune celular, estimulando a reação de

er

o dos mecanismos de ação.

5. sentou maior atividade antioxidante in vitro do que o EE, estando as

s anti-radicais observadas no extrato hexânico relacionadas com o

to da cicatrização.

CLUSÕES GERAIS

1. O tratamento com EH das folhas de M. charantia apresentou atividade

imunoestimulante sobre a resposta imune humoral, aumentando a p

anticorpos específicos em animais sensibilizados com antígenos B dependentes de

T, hemácias de carneiro e ovalbumina. 2. O tratamento com EH das folhas de M. charantia apresentou atividade

imuno

hipersensibilidade retardada em animais sensibilizados com PPD.

3. O tratamento com EE das folhas de M. charantia não exerceu efeito sobre a resposta

imune humoral e celular diante dos parâmetros avaliados.

4. Apesar dos extratos hexânico e etanólico apresentarem sua composição fitoquimica

semelhante, revelando apenas esteróides. Acredita-se que devido às diferenças de

polaridade dos solventes, os esteróides encontrados em cada extrato devem cont

estruturas que lhes conferem características particulares. Entretanto, é necessário,

que seja dada uma maior ênfase ao isolamento e purificação dos constituintes

imunoativos para o esclareciment

O EH apre

propriedade

favorecimen

68

9. PERSPECTIVAS

Em determinadas situações faz-se necessário à supressão ou a estimulação do

imunológico. A redução das respostas imunes é útil como forma de evitar a rejeição

plantes e no controle das doenças auto-imunes. Já a imunopotencialização visa

tar as reações imunes em pacientes

sistema

a trans

aumen com câncer, em indivíduos susceptíveis a

inva

As plan

de nos gias. No entanto,

o s m

ainda é

é basta

de-São

proces

os ung

como Em decorrência das

par

espécie

determ

O surgimento de uma medicina sustentável voltada para os animais objetivando a

integração entre a medicina veterinária tradicional com um sistema veterinário moderno

cipalmente fitoterápicos, já é uma realidade.

Não havia na literatura científica trabalhos que relatassem a ação do EH e do EE das

lhas de M. charantia sobre a resposta imune e a cicatrização em animais experimentais.

orém os resultados aqui encontrados estimulam novas pesquisas, uma vez que o extrato

exânico de M. charantia apresentou ação estimulatória sobre o sistema imune e sobre o

rocesso de regeneração cutânea. Sendo considerado de extrema importância para a

edicina veterinária.

sões de agentes devido a fatores ambientais e em aidéticos (STITES & TERR, 1995).

tas medicinais com atividade imunomoduladora, como é o caso da M.charantia, alvo

so estudo, têm surgido como alternativa no tratamento dessas patolo

eu ecanismo de ação associado aos princípios ativos responsáveis por esta atividade

pouco esclarecido.

Na medicina veterinária, a utilização de algumas plantas medicinais como cicatrizante

nte comum, dentre estas podemos citar a babosa, a aroeira e em especial, o melão-

-Caetano. No entanto se faz necessário avaliar a eficácia destes fitoterápicos no

so de reparação cutânea, para que seu uso possa ser difundido para a sociedade e

üentos preparados a partir de extratos destas plantas possam ser comercializados

agente terapêutico de feridas em animais domésticos.

ticularidades fisiológicas de cada espécie, é preciso testar o ungüento em várias

s, para realmente obter o efeito confirmatório ou não do poder cicatrizante de

inado extrato.

baseado em medicamentos alternativos, prin

fo

P

h

p

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69

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ANEXO Artigo submetido à Acta Scientiae Veterinarie

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Avaliação dos ungüentos à base de extratos hexânico ou etanólico das folhas de

Momordica charantia L. sobre as lesões cutâneas experimentais em coelhos

Evaluation of the ointment containing the hexanic or ethanolic extracts of leaves of

Momordica charantia L. on experimental cutaneous wounds in rabbits

Ana Karinne Paiva Vasconcelos, Adriana Rocha Tomé, Bárbara Sucupira Pereira,

Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro

Trabalho originado da Dissertação de Mestrado do primeiro autor. Programa de Pós-

graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará, Avenida

Paranjana, 1700 - CEP 60740-000. Campus do Itaperi, Fortaleza-CE, Brasil.

CORRESPONDÊNCIA: D.C.S. Nunes-Pinheiro [diana@uece.br; Fone +81 31019840]

RESUMO

Entre as inúmeras plantas empregadas na medicina tradicional destaca-se a

Momordica charantia, que vem ganhando notoriedade científica por suas diversas

propriedades biológicas e farmacológicas. O objetivo deste trabalho foi investigar a

regeneração de lesões cutâneas em coelhos, tratadas diariamente com ungüento

contendo os extratos hexânico (EH) e etanólico (EE) das folhas de M.charantia nas

concentrações de 10 e 20%, comparadas com o controle (base do ungüento). Lesões

cutâneas de cerca de 5 mm foram induzidas experimentalmente por um punch, tendo

os coelhos sido anestesiados previamente e após 4 (D4) e 14 (D14) dias de

tratamento, as lesões foram removidas cirurgicamente e encaminhadas para análise

histopatológica. O processo de reparo cutâneo foi avaliado nestes intervalos de tempo

através da observação macroscópica, mensuração da área de retração da ferida e

avaliação microscópica através da contagem do número de células mononucleares e

fibroblastos e dos vasos sanguíneos. O ungüento contendo o EH (10 e 20%)

80

demonstrou ser o mais eficaz por acelerar (P<0,01) o processo de regeneração

cutânea. Isto demonstra o potencial farmacológico desta planta para uso Veterinário.

Descritores: Momordica charantia, Cucurbitaceae, cicatrização cutânea, análise

histopatológica, observação macroscópica, coelhos.

ABSTRACT

Among the countless plants maids in the traditional medicine stands out the

Momordica charantia, which is winning scientific fame, for many biological and

pharmacological properties. This work investigated the healing process on excisional

wounds in the skin of rabbits, treated daily with ointment containing 10 and 20 % of the

hexanic and ethanolic extracts of the leaves of M.charantia, compared with the control.

A skin wound area of about 5 mm was excised trough of punch on anaesthetised

rabbits and after 4 (D4) and 14 (D14) days of treatment, the lesions were surgically

removed and histologically processed. Wound healing activity was determined by

macroscopic observation, measure of the area of contraction and microscopic

evaluation on the count of the number of fibroblasts and mononuclear inflammatory

cells, and blood vessels. The ointment containing HE (10 and 20%) was demonstrated

effective for accelerating (P<0,01) the process of cutaneous regeneration. So, the

results demonstrate the potential pharmacological of this plant for Veterinary use.

Key words: Momordica charantia, Cucurbitaceae, cutaneous cicatrization,

histopathological analysis, macroscopic observation, rabbits.

INTRODUÇÃO

A Momordica charantia L. é uma planta medicinal, pertencente à família

Cucurbitaceae, que vêm ganhando espaço no cenário científico mundial. Constitui

uma trepadeira, bastante comum no nordeste brasileiro, sendo popularmente

81

conhecida por melão-de-São-Caetano. Estudos prévios comprovaram inúmeras

propriedades farmacológicas desta planta como agente fitoterápico. Dentre estas,

destacam-se sua atividade hipoglicemiante [16], antibacteriana [7], antiviral [9], anti-

HIV [1], antitumoral [2, 14], anti-helmíntica [18] e abortiva [10]. Recentemente, tem

aumentado o interesse por drogas obtidas a partir de plantas medicinais, destacando-

se aquelas com potencialidade para promover a cicatrização de feridas.

O processo de cicatrização tecidual consiste de um fenômeno fisiológico que

se inicia a partir da perda de integridade da pele, gerando uma solução de

continuidade que atinge os planos subjacentes em diversos graus, e depende de uma

série de reações químicas [6]. Este processo está classicamente dividido em três

fases: inflamação, reparação e deposição de matriz extracelular e remodelação.

Existem relatos do uso popular da M. charantia como cicatrizante. No entanto,

ainda não existe literatura que comprove a atividade cicatrizante da aplicação tópica

de extratos desta planta in vivo.

Desta forma, o presente trabalho propõe avaliar ungüentos à base de extrato

hexânico (EH) ou etanólico (EE) de M. charantia na regeneração de feridas cutâneas

de coelhos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Material vegetal e preparação do extrato

As folhas de M. charantia foram coletadas pela manhã no mês de maio de

2005, na cidade de Fortaleza, Estado do Ceará, Nordeste do Brasil. A identificação

botânica da planta foi realizada no Herbário Prisco Bezerra do Departamento de

Botânica e Biologia da Universidade Federal do Ceará, recebendo o voucher 32441.

Folhas secas (150g) da planta foram colocadas em um balão de vidro com 500

ml de hexano, por 7 dias na ausência de luz. Em seguida, a solução resultante

82

(hexano + folhas) foi filtrada através de um funil. Esta sofreu um processo de

evaporação através do evaporador rotatório a 69°C e o extrato foi colocado em banho-

maria para total evaporação do solvente. Para a obtenção do extrato etanólico, foi

utilizado o resíduo das folhas após 2 dias de repouso e o mesmo procedimento foi

realizado, exceto que o solvente utilizado foi o etanol e a temperatura do

rotaevaporador foi 100°C.

Prospecção fitoquímica dos extratos hexânico (EH) e etanólico (EE) de M.

Charantia

Os extratos obtidos foram submetidos a uma avaliação fitoquímica para

detecção ou não de fenóis, taninos, antocianidinas, antocianinas, flavonóides,

catequinas, flavonóis, flavononas, flavanonóis, xantonas, esteróides, triterpenóides,

saponinas, alcalóides, em EH e EE das folhas de M.charantia de acordo com a

metodologia descrita por Matos [12].

Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos hexânico (EH) e

etanólico (EE) das folhas de M.charantia

A atividade antioxidante dos extratos hexânico e etanólico das folhas de

M.charantia foi determinada pelo método varredor de radical livre DPPH (1,1-difenil-2-

picrihidrazil) [17].

Preparação do ungüento

O ungüento foi obtido pela mistura de 10 e ou 20% dos extratos (EH e EE) das

folhas de M. charantia com uma base de vaselina e lanolina (1:2). As lesões controle

foram tratadas com a base do ungüento, sem adição dos extratos.

83

Animais de experimentação

Foram utilizados quinze coelhos da raça Nova Zelândia, pesando 2 kg, com

idade de 2 a 6 meses, machos. Os animais foram adquiridos de um estabelecimento

comercial, sendo submetidos a um período de quarentena em que foram vermifugados

e observados quanto ao estado de saúde geral e só então, destinados à realização

dos experimentos. Os animais foram separados em grupos e mantidos em gaiolas no

Laboratório de Imunologia e Bioquímica (LIBA) na Universidade Estadual do Ceará

(UECE), sob condições adequadas de higiene, luz e temperatura, recebendo ração

comercial e água ad libitum. Os procedimentos experimentais foram realizados de

acordo com as normas de experimentação animal do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA).

Indução e tratamento das lesões experimentais

Previamente, os coelhos sofreram anestesia geral realizada por via

intramuscular na região do quadríceps, utilizando-se cloridrato de ketamina 44 mg.kg-1,

xilazina 4 mg.kg-1 e valium 0,43 mg.kg-1. Foram produzidas seis lesões no dorso de

cada animal, sendo três de cada lado, paralelamente a coluna vertebral a 2 cm de

distância, entre a escápula e a tuberosidade ilíaca com um punch de 5 mm (técnica

modificada), incluindo lesionamento da pele, tecido celular subcutâneo e músculo

cutâneo do tronco. A identificação das feridas seguiu a sua localização, portanto,

foram denominadas craniais direita (CRD), craniais esquerda (CRE), centrais direita

(CND), centrais esquerda (CNE), caudais direita (CDD) e caudais esquerda (CDE) [3].

Em cada ferida, foi aplicada topicamente e de forma padronizada: CRD e CRE

(base), CND e CNE (EH ou EE a 10% + base), CDD e CDE ( EH ou EE a 20% +

base). Cada tratamento foi administrado uma vez ao dia no mesmo horário. As lesões

84

do lado direito foram tratadas por 4 dias e as do lado esquerdo por 14 dias. No D4 e

no D14, as lesões foram seccionadas e encaminhadas para análise histológica.

Avaliação das lesões

As lesões foram submetidas a avaliação macroscópica diária, verificando-se os

seguintes parâmetros: edema, hiperemia e presença de exsudato [11].

Foi também realizado um estudo morfométrico visando a mensuração do halo

da ferida no dia da indução da ferida no 4° e 14° dia pós-indução, através da

colocação de plástico transparente sobre a ferida e demarcação com caneta de

retroprojetor, submetendo-se este traçado a mensuração com planímetro. A área de

retração da ferida foi calculada subtraindo-se a área previamente estipulada (A0 = 5

mm) da área da ferida em D4 e D14 (R = A0 – A). Os resultados das diferenças entre

as feridas experimentais e controle foram comparadas.

Após a realização do protocolo anestésico, similar ao utilizado para indução

das feridas, as lesões foram removidas e submetidas à fixação em formol tamponado

a 10% por 48 h, seguida de desidratação em álcool a 70%. As amostras foram

embebidas em parafina e secções de 5 μm de espessura foram preparadas. As

lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina (H&E) e observadas ao microscópio

óptico. Para análise histopatológica foram avaliados três sítios de cada corte

histológico (3 cortes/animal) em cada intervalo de tempo. Nestas áreas foi realizada a

contagem do número de células mononucleares inflamatórias, fibroblastos e vasos

sanguíneos de cada sítio (1000X).

Análise estatística

A análise de variância (ANOVA) foi realizada para todas as medidas

obtidas relativas a área da ferida (mm), sendo os dados posteriormente submetidos ao

85

teste t Student, aceitando-se 5% (P<0,05) como nível de significância para

interpretação dos resultados. Os resultados relativos à contagem de células e vasos

foram tabulados e analisados através do teste estatístico Kruskall Wallis.

RESULTADOS

Prospecção fitoquímica e atividade antioxidante in vitro dos extratos hexânico

(EH) e etanólico (EE) de M. Charantia

O estudo fitoquímico revelou a presença de esteróides e a ausência para

alcalóides, saponinas, catequinas, taninos, fenóis, flavonas, flavonóis,

leucoantocianidinas, xantonas, triterpenóides, resinas e alcalóides em ambos os

extratos.

Os resultados da atividade antioxidante in vitro dos extratos (EH e EE) das

folhas de Momordica charantia pelo método de varredura do radical livre DPPH

demonstraram que o EE das folhas de M. charantia nas doses de 2, 5 e 10 mg.mL-1

apresentaram índice de varredura (IV) de 28,66; 38,73 e 39,75%, respectivamente. O

EH das folhas de M. charantia nas doses de 2, 5 e 10 mg.mL-1 apresentaram IV de

40,07; 76,64 e 79,79%, respectivamente. Os grupos controle BHT e quercetina

apresentaram IV de 90,89 e 90,32%, respectivamente. Desta forma, o EH demonstrou

maior capacidade em captar os radicais livres.

Avaliação macroscópica

A avaliação macroscópica foi realizada diariamente até o D14. Nesse estudo foi

observado que as lesões teciduais experimentais nos grupos controle e tratados com o

EE (10 e 20%) de M. charantia obedeceram à mesma seqüência de eventos

dependente do tempo. No entanto, os grupos tratados com EH (10 e 20%)

86

apresentaram uma evolução cicatricial mais precoce em relação ao controle. No

decorrer de toda a investigação foram observados que os sinais de inflamação como

edema, hiperemia e presença de exsudato foram discretos nas feridas tratadas com

ungüento à base de EH. Nos animais tratados com ungüento à base de EE, foi

verificada moderada exsudação a partir do quarto dia permanecendo até o último dia

analisado (D14).

Estudo morfométrico

A Tabela 1 demonstra os efeitos do EH e EE das folhas de M.charantia sobre a

área de retração de lesões cutâneas determinada pela mensuração do halo da ferida

após 4 e 14 dias de tratamento.

O estudo morfométrico revelou que houve aumento significativo (P< 0,05) da

área de retração das feridas em todos os tratamentos no decorrer dos dias analisados.

Os ungüentos associado ao EH (10 e 20%) induziram maior área de retração

em relação ao controle (P<0,05). Em contrapartida os ungüentos a base de EE não

exerceram efeito significativo na retração das feridas.

Estudo histológico

A contagem de células mononucleares, fibroblastos e vasos sanguíneos na

região da lesão para todos os tratamentos avaliados está apresentada nas Tabelas 2,

3 e 4.

A Tabela 2 indica que o ungüento que demonstrou capacidade de modular a

resposta inflamatória foi aquele associado ao EH em ambas as concentrações, já que

este gerou uma redução significativa (P<0,01) na quantidade de células

mononucleares em relação ao controle nos dois intervalos de tempo analisados.

87

No tocante a quantificação de fibroblastos expressa na Tabela 3 foi observado

que houve uma redução significativa (P<0,01) no número de fibroblastos entre os

grupos tratados com o ungüento a base de EH (10 e a 20%) em relação ao controle

nos tempo 14 dias.

A Tabela 4 indica que a quantidade de vasos sanguíneos foi significativamente

menor (P< 0,01) no grupo tratado com o ungüento associado ao EH (10 e 20%) em

relação ao controle no tempo de 14 dias.

O EE não apresentou ação sobre o processo de regeneração cutânea quanto

aos parâmetros analisados, não diferindo significativamente das lesões tratadas

apenas com a base do ungüento (P >0,01).

DISCUSSÃO

A importância da pele como barreira de proteção contra agentes nocivos [13]

aliada a alta incidência de feridas resultantes de acidentes traumáticos em animais

domésticos motivaram a realização deste experimento. Além disto, os constantes

avanços científicos no ramo da fitoterapia levando a mudanças nos vários conceitos

tradicionais no tratamento de feridas reforçaram a necessidade de estudos nesta área.

As etapas do processo de cicatrização foram observadas no presente trabalho

tanto nas lesões tratadas com EH e EE de M. charantia, como nas não-tratadas,

conforme os dias analisados. A evolução cicatricial das feridas experimentais foi

considerada clinicamente normal.

A análise macroscópica revelou que a presença de exsudato no grupo controle

e tratado com EE prejudicou a cicatrização, já que este é capaz de promover a

desagregação do tecido de granulação em formação e o desenvolvimento de

microorganismos.

88

As infecções microbianas causam um aumento nas complicações no processo

de cicatrização. Estudos prévios revelaram que a M.charantia apresenta um amplo

espectro de atividade antimicrobiana [7].

A medida da retração da área do processo inflamatório revelou que durante o

tratamento, houve diferença significativa (P< 0,01) nas áreas de retração das lesões

que receberam ungüento a base do EH de M. charantia, as quais cicatrizaram com

maior rapidez que às lesões controle e as tratadas com ungüento associado ao EE.

O influxo de macrófagos e neutrófilos para o sítio da lesão durante a fase

inflamatória revelou uma redução (P< 0,01) destas células nos grupos tratados com o

ungüento à base de EH (10 e 20%) em relação ao controle no D4, indicando que este

tratamento foi capaz de modular o processo inflamatório neste intervalo de tempo.

Com a presença local de macrófagos e a produção e liberação dos mediadores

químicos produzidos por eles, a migração e ativação de fibroblastos é intensificada.

Essas células são as principais responsáveis pela formação de tecido de granulação,

sintetizando ácido hialurônico, fibronectina, colágenos tipos I e II, elastina e proteases,

como a colagenase, importante para o debridamento e o remodelamento das fibras

colágenas. O aumento de fibroblastos na regeneração tecidual encontra seu ápice na

fase proliferativa deste processo, que ocorre geralmente entre o 3° e o 10° dia após a

lesão. Para a eficiência da fibroplasia é necessária a ocorrência em paralelo da

neovascularização da região, já que esta permite a troca de gases e a nutrição das

células metabolicamente ativas [4, 5]. Além da ação direta de fatores de crescimento

sobre as células da vasculatura, a indução da angiogênese é, em parte, creditada à

baixa tensão de oxigênio característica que ocorre no centro de uma ferida [8].

No início da fase de remodelação, que corresponde aos grupos analisados no

D14 neste experimento, observa-se redução no número de células mononucleares,

fibroblastos e vasos sanguíneos (Tabelas 2, 3 e 4, respectivamente) e isto se justifica

pela mudança de fase do processo inflamatório.

89

Numa etapa avançada do reparo tecidual acredita-se que os fibroblastos

estejam relacionados com o fenômeno de remodelação dos feixes de colágeno, no

sentido de conferir maior resistência a este tecido lesionado [15]. Isto reforça ainda

mais a idéia de que o EH acelerou a atividade de fibroblastos fazendo com que o

tecido lesionado apresentasse uma organização muito maior em comparação ao

controle.

Nos grupos experimentais tratados com ungüento à base do EH houve uma

redução significativa no número de fibroblastos e vasos sanguíneos em relação ao

controle no D14, sugerindo que este extrato acelerou a reparação tecidual na fase

tardia da reação inflamatória, possibilitando o alcance da fase de remodelamento mais

precocemente que os demais grupos.

A sinergia de todos esses fatores avaliados pode estar envolvida com a

regeneração cutânea observada nas lesões tratadas com os extratos estudados. Os

efeitos sinérgicos foram mais pronunciados nas lesões tratadas com ungüento

associado ao EH de M. charantia, e isso têm sido atribuído às propriedades anti-

radicais observadas no extrato hexânico e aos constituintes imunoativos presentes no

extrato. No entanto, maiores estudos são necessários para desvendar esse

mecanismo de ação.

CONCLUSÃO

O ungüento associado ao extrato hexânico (EH) das folhas de M.charantia,

dentro dos parâmetros utilizados, demonstra ser eficaz por acelerar o processo de

regeneração cutânea.

Agradecimentos. A Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa (FUNCAP), por ter

concedido apoio financeiro. Agradecimento especial à Drª Selene Maia de Morais.

90

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92

Tabela 1. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base dos extratos hexânico (EH)

e etanólico (EE) sobre a retração da área (mm) da lesão com 4 (D4) e 14 (D14) dias

de tratamento. Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3

animais/grupos). Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa (P<0,05)

na mesma coluna em relação ao grupo controle. Letras maiúsculas indicam diferença

significativa (P<0,05) entre D4 e D14.

Área (mm) Tratamentos Concentração

% D4 D14

Controle - 2,13 ± 0,06a,A 2,78 ± 0,06a,B

10 2,58 ± 0,08b,A 3,37 ± 0,09b,B

EH 20 2,69 ± 0,17b,A 3,50 ± 0,12b,B

10 2,17 ± 0,05a,A 2,88 ± 0,10a,B

Ungüento (Lanolina -

Glicerina 2:1)

EE 20 2,21 ± 0,11a,A 2,96 ± 0,10a,B

93

Tabela 2. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base dos extratos hexânico (EH)

e etanólico (EE) sobre as células mononucleares com 4 (D4) e 14 (D14) dias de

tratamento. Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3

animais/grupos). Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3

animais/grupos). * Indica diferença significativa (P<0,01) no D4 em relação ao grupo

controle. ** Indica diferença significativa (P<0,01) no D14 em relação ao grupo

controle.

N° células mononucleares Tratamentos Concentração

% D4 D14

Controle - 32,66 ± 0,83 12,12 ± 0,14

10 14,83 ± 1,52* 4,20 ± 0,18** EH

20 13,45 ± 1,62* 4,33 ± 0,13**

10 27,12 ± 1,00 10,40 ± 0,10

Ungüento (Lanolina -

Glicerina 2:1)

EE 20 28,35 ± 1,75 10,83 ± 0,07

94

Tabela 3. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base dos extratos hexânico (EH)

e etanólico (EE) sobre os fibroblastos com 4 (D4) e 14 (D14) dias de tratamento. Os

dados são representados em média e desvio padrão (n=3 animais/grupos). Os dados

são representados em média e desvio padrão (n=3 animais/grupos). * Indica diferença

significativa (P<0,01) no D14 em relação ao grupo controle.

N° fibroblastos Tratamentos Concentração

% D4 D14

Controle - 26,00 ± 2,25 23,33 ± 1,20

10 20,90 ± 0,86 14,66 ± 1,16* EH

20 21,43 ± 1,28 16,16 ± 1,23*

10 21,84 ± 0,83 22,55 ± 1,37

Ungüento (Lanolina-

Glicerina 2:1)

EE 20 22,46 ± 1,02 21,98 ± 1,93

95

Tabela 4. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base dos extratos hexânico (EH)

e etanólico (EE) sobre a formação dos vasos sangüíneos com 4 (D4) e 14 (D14) dias

de tratamento. Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3

animais/grupos). Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3

animais/grupos). * Indica diferença significativa (P<0,01) no D14 em relação ao grupo

controle.

N° vasos sanguíneos Tratamentos Concentração

% D4 D14

Controle - 7,23 ± 0,50 6,78 ± 0,70

10 6,48 ± 0,56 4,96 ± 0,67* EH

20 6,74 ± 0,40 5,03 ± 0,42*

10 6,97 ± 0,71 5,74 ± 0,72

Ungüento (Lanolina- Glicerina

2:1)

EE 20 6,39 ± 0,79 5,93 ± 0,73