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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
RONALDO COSTA ARGÔLO FILHO
IDENTIFICAÇÃO, SOROTIPAGEM E DIFERENCIAÇÃO PELA PCR-DGGE DE SOROTIPOS DE SALMONELLA ISOLADOS DE TEIÚS CRIADOS EM CATIVEIRO
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Fevereiro de 2007
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RONALDO COSTA ARGÔLO FILHO
IDENTIFICAÇÃO, SOROTIPAGEM E DIFERENCIAÇÃO PELA PCR-DGGE DE SOROTIPOS DE SALMONELLA ISOLADOS DE TEIÚS CRIADOS EM CATIVEIRO
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigêcias para a obtenção do título de mestre em Genética e Biologia Molecular. Área de Concentração: Microbiologia Aplicada
Genética Molecular Orientadora: Prof.ª Rachel Passos Rezende
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Fevereiro de 2007
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RONALDO COSTA ARGÔLO FILHO
IDENTIFICAÇÃO, SOROTIPAGEM E DIFERENCIAÇÃO PELA PCR-DGGE DE SOROTIPOS DE SALMONELLA ISOLADOS DE TEIÚS CRIADOS EM CATIVEIRO
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigêcias para a obtenção do título de mestre em Genética e Biologia Molecular. Área de Concentração: Microbiologia Aplicada
Genética Molecular Orientadora: Prof.ª Rachel Passos Rezende
Ilhéus – BA, 27 de fevereiro de 2007
João Carlos Teixeira Dias – D.S. João Luciano Andrioli – D.S. UESC/DCB UESC/DCB
Mara Lúcia Albuquerque Pereira – D.S. Rachel Passos Rezende – D.S. UESB/DEBI UESC/DCB
(Orientadora)
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DEDICATÓRIA
À minha família que, com muito carinho e apoio, estiveram presentes nos bons e
maus momentos não medindo esforços para que eu vencesse
mais esta etapa na minha vida.
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AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me iluminado em mais uma jornada e me dado forças para chegar até aqui.
Aos meus pais, Ronaldo e Marinez, que por muitas vezes renunciaram seus desejos e sonhos para me proporcionarem mais esta vitória. Minha eterna gratidão.
Aos meus irmãos, Rogério, Lizziane e Ramon, pela compreenção e amor dedicados. Muito obrigado.
À minha noiva Katiane pelo carinho, compreensão, paciência e por estar ao meu lado durante todos os momentos dessa caminhada. Com amor, obrigado.
Ao Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular. A todos os professores que participaram desta jornada, sempre solícitos, até mesmo fora do horário do curso, porque sem eles não haveria enriquecedoras idéias. Meus sinceros agradecimentos.
À minha orientadora, que se portou como só o fazem os mestres. Acreditando no meu trabalho, deu-me a liberdade necessária dividindo comigo as expectativas, conduziu-me a maiores reflexões que ajudaram a transformar idéias em palavras. Minha especial admiração e gratidão.
A Bianca e João que sempre estavam por perto quando eu precisava de um conselho ou uma palavra amiga de incentivo. Com respeito, admiração e carinho, muito obrigado.
Aos meus colegas do Mestrado em Genética e Biologia Molecular, pelos momentos de convívio, estresses e alegrias. Obrigado.
Aos amigos do laboratório de Monitoramento Ambiental, pelo companherismo, ajuda, carinho e dedicação. Com saudades, obrigado.
À profª Selene e a Teti que contribuiram e incentivaram a realização deste trabalho. Obrigado.
À Fiocruz na pessoa da Dr.ª Eliane Falavina dos Reis que contribuiu com a identificação das amostras. Meus sinceros agradecimentos.
À Universidade Estadual de Santa Cruz e ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular pela oportunidade e auxílio na execução deste trabalho. Obrigado.
Finalmente, a todos que, de uma forma ou de outra, me ajudaram. Meu muito obrigada.
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IDENTIFICAÇÃO, SOROTIPAGEM E DIFERENCIAÇÃO PELA PCR-DGGE DE SOROTIPOS DE SALMONELLA ISOLADOS DE TEIÚS CRIADOS EM CATIVEIRO
RESUMO
A Salmonella é um bacilo Gram-negativo, flagelado, anaeróbio facultativo, causadora da salmonelose. Esse gênero compreende duas espécies: S. enterica e S. bongori, sendo a primeira subdividida em seis subespécies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica). De acordo com fatores antigênicos, essas subespécies foram divididas em mais de 2.500 sorotipos. A maioria das infecções por Salmonella é causada pela ingestão de alimentos contaminados, principalmente os de origem animal. Os répteis merecem destaque, pois a Salmonella é considerada pertencente a sua microbiota intestinal normal. O Teiú (Tupinambis sp.) é um dos maiores lagartos do Brasil, sendo importante devido ao alto valor de sua pele, sua utilização na alimentação e como animal de estimação. Com o aumento da popularidade dos animais exóticos, aumenta-se o risco de infecções devido ao contato inadequado com esses animais. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a prevalência de Salmonella nesses animais, identificar os níveis de resistência dos isolados a antibióticos e diferenciar os sorotipos por meio da PCR-DGGE. Para isso, foram coletadas amostras fecais de teiús (Tupinambis merianae) criados em cativeiro em dois períodos. No primeiro período, 86,67% dos animais foram positivos para Salmonella. Todos os isolados foram sensíveis a Gentamicina e Ampicilina. A S. Carrau, S. Rubislaw e S. Infantes foram os sorotipos que apresentaram maior resistência aos antibióticos testados. No segundo período, após a introdução de limpeza semanal das baias, verificou-se a presença de 81,48% de positividade para Salmonella. Devido a intermitência na liberação de Salmonella nas fezes pelos répteis, quatro animais negativos no primeiro período foram considerados positivos no segundo. Podemos assim considerar que 100% dos teiús eram portadores dessa bactéria. A PCR-DGGE tem sido amplamente utilizada por permitir o estudo filogenético de comunidades microbianas. Doze sorotipos isolados dos Teiús e mais sete isolados de serpentes foram submetidos à PCR-DGGE. Quando amplificados com o par de iniciadores ST11-ST15, somente as cepas rugosas de Salmonella apresentaram um padrão eletroforético diferente dos demais, demonstrando um alto grau de conservação desta região. A região V3 do 16S RNAr mostrou-se também bastante conservada não diferenciando a maioria dos sorotipos. Quanto a região V6-V8 do 16S RNAr, esta também não diferenciou eficientemente os diferentes sorotipos, mas foi possível formar grupos de similaridade. Este é o primeiro estudo a aplicar esta técnica na análise da variedade genética de Salmonella e nosso estudo revelou o grande risco do contato com répteis. Torna-se imperativo o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico e tipagem mais rápidos e eficazes, que sejam capazes de identificar cepas novas ou que não são classificadas pelos métodos tradicionais e que também sirvam para análises evolutivas. Palavras-chave: Salmonelose; Réptil; Tupinambis sp.; PCR; DGGE.
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IDENTIFICATION, SEROTYPING AND DIFFERENTIATION BY PCR-DGGE OF SALMONELLA SEROTYPES ISOLATES FROM CAPTIVITY TEGUS
ABSTRACT
Salmonella is a Gram-negative bacillus, flagellate, facultative anaerobe and etiologic agent of salmonellosis. This genus encloses two species: S. enterica and S. bongori, being the first one subdivided in six subspecies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae and indica). In accordance with antigenic factors, these subspecies has been subdivided in more than 2.500 serotypes. The majority of the Salmonella infections are caused by the contaminated food ingestion, mainly of animal origin. The reptiles deserve prominence, because the Salmonella is considered pertaining to its normal enteric microbiota. The Tegu (Tupinambis sp.) is one of the biggest brazilian lizards, being important because to the high value of its skin, use in the feeding and as pet animal. With the increase of the exotic animals popularity, the risk of infections have grown due to the inadequate contact with these animals. Thus, the aim of this work was to study the Salmonella prevalence in these animals, to identify the antibiotic resistance levels exhibited by the isolates and to differentiate the serotypes by PCR-DGGE. For this, fecal samples of the captivity tegus (Tupinambis merianae), in two periods, were collected. In the first period, 86.67% of the animals were positive for Salmonella. All the strains were sensible the Gentamicin and Ampicilin. The S. Carrau, S. Rubislaw and S. Infants were the serotypes that had presented greater resistance to the tested antibiotics. In the second period, after the introduction of weekly cleanness in the cages, it verified presence of 81.48% Salmonella. Four negative animals in the first period had been considered positive in second, by the intermittent release of Salmonella in the reptile’s feces. Thus, we can consider that 100% of tegus were carrying of this bacterium. The PCR-DGGE has been widely used for filogenetic studies of microbial communities. Twelve Tegu’s isolates serotypes and seven serpent’s isolates serotypes were submitted to the PCR-DGGE. With the pair of primers ST11-ST15, only Salmonella rough strains had presented a different eletrophorretic profile from others, demonstrating a high degree of region conservation. The region V3 of 16S rRNA also revealed very conserved, it did not differentiate the majority of the sorotypes. Also the region V6-V8 of 16S rRNA did not differentiate efficiently the Salmonella serotypes. But, it was possible group the strains in clusters of similarity. This is the first study to apply this technique in the analysis of the genetic variety of Salmonella, and our study showed the great risk of the contact with reptiles. It’s imperative the development of faster methods of diagnosis and typing, that they are capable to identify new strains or unclassified strains by the traditional methods and that also serve for evolutionary analysis.
Keywords: Salmonellosis; Reptile; Tupinambis sp.; PCR; DGGE.
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LISTA DE TABELAS
1. Exemplos de Salmonella e seus hospedeiros....................................................6
2. Aparência da Salmonella nos meios seletivos mais comumente usados........18
3. Reações bioquímicas típicas de Salmonella spp.............................................19
4. Sorotipos de Salmonella isolados de serpentes...............................................49 5. Correlação entre os sorotipos de Salmonella enterica encontrados e a idade e
baias dos animais analisados...........................................................................54
6. Padrões de resistência a antibióticos dos sorotipos de Salmonella enterica isoladas de 30 teiús..........................................................................................60
7. Grupos de similaridade gerados a partir da DGGE da região V6-V8 do 16S RNAr.................................................................................................................66
VIII
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LISTA DE FIGURAS
1. Prevalência da S. Enteretidis, Typhimurium e outros sorotipos na Europa de 1998-2003..........................................................................................................7
2. Esquema da infecção por Salmonella por diferentes vias de administração (oral, intraperitoneal e intravenosa)...................................................................11
3. Invasão da mucosa intestinal pela Salmonella (setas pretas). Notar a destruição da mucosa após a invasão (setas vermelhas).................................12
4. Demonstração esquemática do desenvolvimento da diarréia...........................13
5. Princípio da Reação da Polimerase em Cadeia. Pequenas seqüências específicas de DNA (iniciadores) são utilizados para se ligarem às fitas de DNA desnaturado pelo aquecimento. Uma enzima termoestável (DNA polimerase) extende os iniciadores para formar a nova fita complementar...........................23
6. Sequência da região JEO402-1 isolado do cromossomo da S. Typhimurium LT2. A sequência sublinhada destaca a região utilizada para o desenho dos iniciadores..........................................................................................................25
7. Estrutura secundária do RNAr 16S. As regiões conservadas estão representadas pelas linhas em negrito e as variáveis (V1-V9) pelas linhas finas ...................................................................................................................27
8. Figura representativa do teiú (Tupinambis merianae)........................................42
9. Realização da coleta da amostra utilizando swab estéril...................................43
10. Aspecto das culturas de Salmonella em Agar XLT4 (esquerda) e SS (direita) e aspectos das colônias (detalhe).........................................................................44
11. Esquema representativo das principais provas bioquímicas para identificação de Salmonella.....................................................................................................46
12. Representação dos halos de inibição de crescimento pelo método de disco-difusão.......................................................................................................48
13. Esquema de preparação do gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante utilizando um “gradient maker”, sistema para produção do gradiente linear...................................................................................................52
14. Prevalência dos Sorotipos de Salmonella enterica encontrados nos 26 animais positivos da 1° análise................................................................................56
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15. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR das amostras dos teiús e serpentes, (A) utilizando os iniciadores ST11GC-ST15 (469 pb); (B) iniciadores F357GC-R518 (200 pb) e (C) iniciadores F984GC-R1378 (473 pb); 1, Marcador de peso molecular pGEM® (Promega); 2, Salmonella Carrau; 3, S. Rubislaw; 4, S. Agona; 5, S. Infantis; 6, S. Saintpaul; 7, S. Panama; 8, S. Brandenburg; 9, S. I (O:6,14,24); 10, S. I (O:6,7:-:1,5); 11, S. I (O:6,14,24:y:-); 12, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 13, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 14, S. Gaminara ; 15, S. Newport; 16, S. IV (O:61:c:1,5); 17, S. IIIb (O:47); 18, S. I (O:4,5:b:-); 19, S. I (O:4,5); 20, S. I (O:11:r:-).............................................................................................................62
16. DGGE dos produtos da PCR, (A) utilizando os iniciadores ST11GC-ST15; (B) iniciadores F357GC-R518 e (C) iniciadores F984GC-R1378; 1, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 2, S. I (O:6,14,24:y:-); 3, S. Rubislaw; 4, S. Panama; S. I (O:6,7:-:1,5); 6, S. Infantis; 7, S. Agona; 8, S. Brandenburg; 9, S. I (O:6,14,24); 10, S. Carrau; 11, S. Saintpaul; 12, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 13, S. Newport; 14, S. I (O:11:r:-); 15, S. IV (O:61:c:1,5); 16, S. Gaminara ; 17, S. I (O:4,5:b:-); 18, S. IIIb (O:47); 19, S. I (O:4,5)..........................................................................................................65
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LISTA DE SIGLAS
A Adenosina
AMP Monofosfato de Adenosina
C Citosina
Clֿ Íon cloreto
DCB Departamento de Ciências Biológicas
DGGE Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante
DNA Ácido Desoxirribonucleico
GM-CSF Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos
G Guanina
HCO3ֿ Íon hidrogenocarbonato
IL Interleucina
IFN Iterferon
K+ Potássio
MCP Proteína Quimiotactante de Monócitos
Na+ Sódio
pb Pares de Base
PCR Reação da Polimerase em Cadeia
pH Potencial Hidrogeniônico
RNA Ácido Ribonucleico
rpm Rotações por minuto
UESC Universidade Estadual de Santa Cruz
TAE Tris-Base, Ácido Acético e EDTA
T Timina
TNF Fator de Necrose Tumoral
V Volts
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SUMÁRIO
RESUMO.....................................................................................................VI ABSTRACT.................................................................................................VII
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................1
1.1. Objetivos ................................................................................................3
2. A SALMONELLA........................................................................................4
2.1. Morfologia e Taxonomia........................................................................4
2.2. Importância Epidemiológica.................................................................6
2.3. Patogênese da Infecção por Salmonella.............................................9
2.4. Imunidade dos Animais à Salmonella.................................................14
2.5. Detecção de Salmonella.......................................................................15
2.5.1. Detecção Microbiológica.........................................................................16
2.5.1.1. Identificação Bioquímica....................................................................19
2.5.1.2. Detecção sorológica...........................................................................20
2.5.2. Detecção Molecular.................................................................................21
2.5.2.1. Reação da Polimerase em Cadeia.....................................................21
2.5.2.2. Caracterização Molecular...................................................................26
2.6. Prevenção da Salmonelose...................................................................31
2.7. Tratamento da Salmonelose.................................................................32
2.7.1. Sensibilidade a Antibióticos.....................................................................33
2.8. Salmonella em Répteis..........................................................................35
2.8.1. O Teiú......................................................................................................40
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................42
3.1. Amostragem...........................................................................................42
3.2. Cultivo e Identificação da Salmonella..................................................43
3.3. Teste de Sensibilidade a Antibióticos..................................................47
3.4. Análise Estatística.................................................................................48
3.5. Reação da Polimerase em Cadeia (PCR).............................................48
3.5.1. Extração do DNA.....................................................................................48
3.5.2. Iniciadores................................................................................................49
3.5.3. Amplificação ............................................................................................50
3.5.4. Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE)....................51
XII
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4. RESULTADOS E DISCUSSÂO..................................................................53
4.1. Análise Bacteriológica..........................................................................53
4.2. Sorotipagem......................................................................................55
4.3. Antibiograma..........................................................................................58
4.4. Caracterização Molecular......................................................................61
5. CONCLUSÕES............................................................................................68
REFERÊNCIAS...........................................................................................69
ANEXO........................................................................................................83
XIII
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1. INTRODUÇÃO
O Teiú é um dos maiores lagartos encontrados em território brasileiro, sendo
economicamente importante devido ao alto valor de sua pele. Além disso, a
população do interior do país, assim como os povos indígenas, utilizam a carne
deste animal como fonte de proteína em sua dieta, e sua gordura para fins
medicinais.
A salmonelose é um dos mais importantes problemas de saúde pública,
afetando mais pessoas e animais que qualquer outra simples doença. O habitat
natural dos membros do gênero Salmonella é o intestino de vertebrados de sangue
quente e sangue frio, de onde os microrganismos são disseminados em ambientes
podendo prontamente sobreviver e se multiplicar. É normalmente difícil avaliar a
situação da salmonelose em países em desenvolvimento devido à escassez de
estudos e da falta sistemática da vigilância epidemiológica.
Répteis de vida livre bem como domesticados têm sido demonstrados como
reservatórios de Salmonella. Estes animais podem portar o agente sem demonstrar
qualquer sinal clínico. Estima-se que 60 a 90% de todos os répteis portam e
disseminam Salmonella continuamente, porque ela faz parte de sua microbiota
intestinal normal.
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No Brasil, poucos estudos epidemiológicos têm sido realizados demonstrando
a prevalência de Salmonella spp. em répteis. Essas informações são de grande
importância, visto que no Brasil grande parte da população vive no meio rural e em
tribos indígenas, consumindo a carne de animais silvestres, assim como os répteis,
sem saber sobre o grande risco de contrair infecções por Salmonella, caso a carne
não seja devidamente preparada e cozida. A carência de pesquisas sobre a
prevalência de Salmonella em répteis no município de Ilhéus/BA, como também em
todo país, motivou-nos a estudá-la, a fim de verificar quais são os sorotipos mais
freqüentes isolados de teiús nessa região.
O uso crescente de antibióticos por criadores e vendedores no tratamento
profilático de animais pode contribuir para o desenvolvimento de cepas de
Salmonella resistentes a antibióticos, que podem causar infecções que não
respondam a antibioticoterapia. O monitoramento da susceptibilidade a
antimicrobianos da Salmonella é importante para substanciar a escolha de
antimicrobianos para o tratamento da salmonelose clínica e para avaliar o risco de
transferência de Salmonella para o homem.
Em microbiologia clínica, a identificação rápida e correta dos agentes
infecciosos é um requisito essencial para o diagnóstico e a posterior aplicação de
um tratamento adequado. Assim, técnicas moleculares têm sido desenvolvidas com
o intuito de aumentar a especificidade e sensibilidade dos diagnósticos, reduzindo
tempo, custos e a subjetividade de protocolos microbiológicos.
As atividades de elucidação de agentes de enfermidades transmitidas por
répteis devem ser sistematizadas pela notificação destes eventos. As informações
de expostos/afetados, período de incubação e sinais e sintomas prevalentes são de
importância para que programas de controle sejam mais específicos e eficazes.
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Assim, a ameaça imposta por zoonoses de répteis merece mais consideração e
estudos, pois o contato com estes animais consiste em uma grande ameaça a saúde
pública.
1.1. Objetivos
1.1.1. Objetivo Geral
• Estimar a prevalência de infecções por Salmonella em Teiús (Tupinambis
merianae) criados em cativeiros e diferenciar os sorotipos utilizando a técnica da
PCR-DGGE.
1.1.2. Objetivos Específicos
• Identificar os sorotipos;
• Verificar a sensibilidade dos isolados à uma seleção de antibióticos;
• Analisar os riscos do consumo e manipulação desses animais;
• Verificar a capacidade dos iniciadores ST11-ST15, F357-R518 e F984-R1378 em
diferenciar sorotipos de Salmonella pela PCR-DGGE.
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2. A SALMONELLA
2.1. Morfologia e Taxonomia
O gênero Salmonella, pertencente à família Enterobacteriaceae, é composta
por bactérias anaeróbias facultativas, gram-negativas em forma de bacilos, que
possuem tipicamente 0,7 à 1,5µm de lagura e 2 à 5µm de comprimento, embora
longos filamentos possam ser formados (Pelczar, 1997).
A classificação atual do gênero Salmonella é baseada em características
bioquímicas e homologia de DNA (Aabo, 1993) que divide o gênero Salmonella em
duas espécies: Salmonella enterica, que está dividida em seis subespécies, e
Salmonella bongori. A sorotipagem é usada para identificar esse microrganismo
além do nível de subespécie, a partir de um esquema desenvolvido por Kauffman e
White (Brenner et al., 2000), que divide o gênero em tipos sorológicos (sorotipos ou
sorovares), tendo por base a composição antigênica das Salmonellas com relação
aos seus antígenos “O” (somático), “Vi” (capsular – presente em alguns sorotipos) e
“H” (flagelar), estando o antígeno “O” relacionado com a virulência da Salmonella
(Brenner et al., 2000; Tindall et al., 2005). Quando uma cepa não expressa o
antígeno O, esta é designada como variante “Rugosa” no lugar do antígeno O na
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sua fórmula antigênica. Uma outra variante que impede a sorotipagem da
Salmonella é a “Mucoide” que expressa uma cápsula, impedindo a detecção
também do antígeno O, sendo também designada no local do antígeno O em sua
fórmula antigênica (CDC, 2005).
A caracterização antigênica da Salmonella é uma poderosa ferramenta
epidemiológica. Entretanto, não é amplamente utilizada por laboratórios de
diagnóstico de processos infecciosos, o que restringe um melhor conhecimento da
dinâmica de circulação deste patógeno. Atualmente, o gênero é composto por cerca
de 2.541 (CDC, 2005) sorotipos diferentes, sendo aproximadamente 60%
pertencentes a Salmonella enterica subespécie enterica (I), que coloniza o trato
entérico de animais de sangue quente, sendo responsáveis por 99% das infecções
humanas, enquanto que os outros 40% pertencem às outras subespécies salamae
(II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV), indica (VI) e à espécie S. bongori,
estas comumente encontradas em animais de sangue frio e no ambiente (Brenner et
al., 2000; Solari et al., 2003). Os sorotipos de Salmonella podem estar estritamente
adaptados a um hospedeiro ou podem ser encontrados em um grande número de
espécies animais (Tabela 1) (Baumler, 1998; Campos, 1999).
Para pesquisa veterinária e humana as cepas mais importantes pertencem a
S. enterica subsp. enterica como habitantes de animais sangue-quente. A
nomenclatura da Salmonella é complexa, com cientistas que usam muitos sistemas
diferentes. Anteriormente a cepa descrita, por exemplo, como Salmonella enterica
subsp. enterica serovar Typhimurium é atualmente chamada de Salmonella
Typhimurium, utilizando uma nova designação do CDC que encurta os nomes
(Brenner et al., 2000).
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Tabela 1. Exemplos de Salmonella e seus hospedeiros
Hospedeiro Sorotipos
Humano S. Typhi, S. Paratyphi, S. Sendai, S.
Schottmuelleri, S. Hirschfeldii
Bovino S. Dublin
Suino S. Choleraesuis, S. Typhisuis
Frango S. Pullorum, S. Gallinarum
Ovino S. Abortusovis
Equino S. Abortusequi
Fonte: (Baumler, 1998)
Entretanto existem sorotipos que, embora não sejam adaptados a alguma
espécie hospedeira, pode causar a doença tanto em humanos como em outros
animais. As mais importantes são S. Typhimurium e S. Enteretidis, que têm sido
envolvidas em muitos surtos de salmonelose (CDC, 2005).
2.2. Importância Epidemiológica
A Salmonella tem sido recuperada a partir do intestino de um grande número
de animais incluindo peixes, répteis, aves, e mamíferos (Wray; Sojka, 1977; Cox et
al., 1999). A sua excreção com as fezes pode comtaminar água, solo, outros
animais e alimentos. Os animais são infectados pelo contato direto, pelo contato
com as fezes de animais infectados ou com água e alimentos contaminados. Um
estudo americano indicou que a grande maioria (95%) dos casos de salmonelose
em humanos foram transmitidos por alimentos, e que crianças, idosos, gestantes e
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pessoas imunodeprimidas fazem parte do grupo de risco à infecção (Olsen et al.,
2001). A figura 1 mostra o número de casos de salmonelose humana reportados em
24 países da Europa de 1998 a 2003, onde mais de 80% dos casos foram causados
pela S. Enteretidis e S. Typhimurium (Fisher, 2004).
Perdas financeiras resultantes de infecções por Salmonella são
consideráveis. Em 1996 o Serviço de Recursos Econômicos dos Estados Unidos
(ERS) estimou que infecções por Salmonella, veiculadas por alimentos, em
humanos causaram um custo total de $0.6 a $3,5 bilhões de dólares anualmente em
despesas médicas e perdas na produtividade (Dargatz et al., 1998).
Atualmente, cerca de 1,4 milhão de casos de salmonelose ocorre a cada ano
nos EUA, resultando em cerca de 600 mortes. Apenas 2,5% desses casos são
isolados e sorotipados (Brenner et al., 2000). No Brasil, entre os anos de 1999 e
2003 foram notificados 724 surtos de salmonelose, onde 654 foram por Salmonella
spp., 55 S. Enteretidis, 10 S. Typhi e 5 por S. Paratyphi (Salmonella spp., 2007).
Uma grande variedade de alimentos tem sido implicada como veículo de
020000
400006000080000
100000
120000140000160000180000
200000220000
1998 1999 2000 2001 2002 2003
Anos
Nº.
de
Cas
os
No
tifi
cad
os
Enteretidis
Typhimurium
Outras
Figura 1. Prevalência da S. Enteretidis, Typhimurium e outros sorotipos na Europa de 1998-2003.
Fonte: (Adaptado de Fisher, 2004)
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transmissão da salmonelose, incluindo carne, ovos, leite, frutas, sucos e vegetais. A
contaminação pode ocorrer ao longo da cadeia produtiva do alimento incluindo
produção, beneficiamento, distribuição, venda em mercados, manuseio e preparo
(Olsen et al., 2001; Zhao et al., 2003).
A resistência das Salmonellas às adversidades ambientais é um ponto de
destaque na epidemiologia das toxinfecções alimentares, pois esta se mantém
virulenta por 89 dias em água de tanques, 120 dias em solo seco, 280 dias em
gramados, 28 meses em fezes de aves, 30 meses em fezes de vaca e de répteis
(Grespan, 2001; Vasconcellos, 2001; Laidlaw, 2003).
Registra-se em todo mundo aumento da incidência de salmonelose humana
causada por S. Enteritidis, principalmente por ser veiculada por aves e ovos. Este
sorotipo também é importante por também causar infecções extra-intestinais muitas
vezes fatais (Lírio et al., 1998; Hamada et al., 2003). Em São Paulo ocorreu um
aumento no número de casos de salmonelose de 1992 a 1996 de aproximadamente
5% para mais de 50%. Alimentos de origem animal continuam sendo os principais
responsáveis pelas infecções por Salmonella, demonstrando o risco que este
alimento representa à saúde pública, se consumidos mal cozidos, indevidamente
manipulados ou deteriorados (Lírio et al., 1998).
A produção industrial de alimentos de origem animal e o intercâmbio
comercial intensivo de animais e produtos destinados ao consumo humano têm
favorecido a introdução e disseminação de novos sorotipos de Salmonella na cadeia
alimentar. Alguns estão associados a diferentes fontes específicas de contaminação,
e são isolados em uma área específica, outros podem ser freqüentemente isolados
em diferentes países, a exemplo da S. Typhimurium e S. Enteritidis (Almeida et al.,
2000).
9
2.3. Patogênese da Infecção por Salmonella
A salmonelose caracteriza-se por uma enfermidade aguda, apresentando
variações geográficas na freqüência dos sorotipos, atingindo a sua maior incidência
em populações com baixa qualidade de higiene que não contam com medidas de
saúde públicas satisfatórias (Gutiérrez-Cogco et al., 2000).
A patologia de infecções por Salmonella é extremamente variável. Sua
severidade é influenciada pelo sorotipo, virulência, resistência natural ou adquirida
do hospedeiro, rota e quantidade da dose infectante (Reed et al., 1986). Embora a
Salmonella possa entrar no corpo através da faringe, trato respiratório ou
conjuntivas, a bactéria usualmente infecta o hospedeiro por via oral e se deposita no
intestino, onde invadem os enterócitos (Wray; Sojka, 1977). A maior parte das
infecções por Salmonella está confinada a região gastrintestinal, e são geralmente
erradicadas por mecanismos de defesa natural dos hospedeiros. Estas defesas são
importantes na resistência à colonização e invasão intestinal. Em indivíduos
saudáveis, o número de Salmonella ingerido é reduzido no estômago, que tem uma
acidez normal de pH menor que 3,5, sendo letal para ela. A motilidade intestinal
também protege o intestino por arrastar a Salmonella ingerida. A microflora normal,
provavelmente protege o intestino por meio de microrganismos anaeróbios que
liberam cadeias de peptídeos (lactoferrina e lisozima) que são nocivos à Salmonella,
e a secreção de anticorpos de mucosa (IgA) também protege o intestino contra esse
patógeno (Giannella, 2000; Laidlaw, 2003).
Como em outros bacilos Gram-negativos, o envelope celular da Salmonella
contém um complexo de lipopolissacarídeos (LPS) estrutura que é liberada na lise
10
dos microrganismos. O LPS funciona como uma endotoxina, e é importante na
determinação da virulência dos organismos, além de ser responsável pela
especificidade do antígeno O. Eles provocam febre, ativam o sistema complemento,
sistemas de coagulação, depressão na função do miocárdio, e altera a função
linfocítica (Giannella, 2000).
Para ser completamente patogênica, a Salmonella deve possuir uma
variedade de atributos chamados fatores de virulência. Estes incluem a habilidade
de invadir células, uma camada completa de lipopolissacarídeos, habilidade de se
replicar intracelularmente, e possibilidade de produzirem toxinas (Giannella, 2000).
Pesquisas indicam que o locus inv, encontrado em várias espécies de Salmonella e
está relacionado com a aderência e invasão de células, sendo homólogo a fatores
de virulência em outros patógenos (Finlay, 1994).
A estratégia de virulência comum a Salmonella é invadir a mucosa intestinal,
onde os tecidos linfóides associados ao intestino (Placas de Peyer’s) tentam limitar a
multiplicação da bactéria. Se este mecanismo de defesa não obter sucesso, a
Salmonella é drenada dos tecidos intestinais infectados para linfonodos regionais,
onde entram em contato com os macrófagos que revestem os ductos linfáticos. Se
esses mecanismos de defesa limitarem com sucesso a expansão bacteriana, a
infecção permanece localizada no intestino e as bactérias são incapazes de se
propagar. Caso contrário, a Salmonella pode causar bacteremia. A figura 2 mostra
um esquema de três diferentes caminhos da infecção por Salmonella; infecções por
via oral, intravenosa e intraperitoneal. Depois de uma infecção localizada, os
patógenos se disseminam pelo corpo a partir do tecido linfóide associado ao
intestino via ductos linfáticos eferentes e torácico até a veia cava (Baumler et al.,
2000).
11
Figura 2. Esquema da infecção por Salmonella por diferentes vias de administração (oral, intraperitoneal e intravenosa).
Fonte: (Baumler, 2000).
A figura 3 mostra que após a invasão do intestino, a maioria das Salmonellas
induz uma resposta inflamatória aguda, que pode causar destruição do epitélio e
ulcerações. A invasão na mucosa intestinal leva as células epiteliais a sintetizar e
liberar várias citocinas pré-inflamatórias incluindo: IL-1; IL-6; IL-8; TNF-2; IFN-U;
MCP-1 e GM-CSF. Esta resposta inflamatória aguda causa sintomas como febre,
apatia, dor abdominal, e diarréia (Giannella, 2000; Laidlaw, 2003).
Infecção
sistêmica
Infecção
localizada
Infecção oral
Colonização do intestino delgado
Invasão dos enterócitos e entrada nas
Placas de Peyer
Drenagem para linfonodos
mesentéricos
Infecção
intraperitoneal
Drenagem para
linfonodos
mediastinais
Disseminação via ducto torácico até
grandes vasos
Sobrevivência e multiplicação em
macrófagos de fígado e baço
Sangue Infecção
intra venosa
12
A invasão da mucosa intestinal é seguida pela ativação da adenilciclase (AC),
resultando no aumento dos níveis de AMP-cíclico e induzindo secreção de fluidos
devido ao desequilíbrio hidroeletrolítico (H2O, Na+, Clֿ, K+, HCO3ֿ) (Figura 4). O
mecanismo pelo qual adenilciclase é estimulada não é bem conhecido, podendo
envolver o local de síntese de prostaglandinas ou outros componentes da reação
inflamatória. Em adição, cepas de Salmonella elaboram uma ou mais enterotoxinas
como substâncias que podem estimular secreção intestinal, agravando ainda mais a
diarréia (Giannella, 2003).
Durante a infecção de ratos com S. Enteretidis, aproximadamnete 80% das
bactérias que sobreviveram a passagem através do estômago são liberadas com as
fezes dentro de 6 a 10 horas após a infecção. Aproximadamente 15% permanecem
localizadas no lúmen do ceco e intestino grosso, e somente 5% conseguem penetrar
na parede do intestino delgado (Carter; Collins, 1974).
Figura 3. Invasão da mucosa intestinal pela Salmonella (setas pretas). Notar a destruição da mucosa após a invasão (setas vermelhas).
Fonte: (Gianella, 2000)
13
Em mamíferos, folículos linfáticos do intestino delgado estão agrupados nas
Placas de Peyer. Estes funcionam como principal porta de entrada para a
Salmonella, e sua colonização contribui com o desenvolvimento da doença durante
as infecções localizadas e sistêmicas. O fígado e o baço geralmente se encontram
aumentados durante a infecção sistêmica (Baumler et al., 2000). Se a resposta
imune local nos tecidos associados ao intestino é eficiente, uma distribuição
equilibrada pode aparecer conduzindo a colonização ou até mesmo comensalismo
das bactérias. Isto significa que os microrganismos sobrevivem no animal sem
causar uma resposta imune específica ou uma infecção (Casadevall; Pirofski, 2000).
De acordo com a patogênese, a salmonelose pode apresentar-se de várias
formas, como febre entérica, gastroenterite, septicemia (infecção generalizada),
infecções focais, e até mesmo um estado assintomático (Giannella, 2000;
Casadevall; Pirofski, 2000; Baumler et al., 2000). É uma doença aguda de variável
Figura 4. Demonstração esquemática do desenvolvimento da diarréia em uma infeção por Salmonella.
Fonte: Elaborado a partir de Gianella (2000).
Citocinas
Enterotoxinas
ATP ATP
AMPc AMPc
AC AC
INATIVA ATIVA
AC AC
H O2 Na+
CL-K+
HCO3
H O2
HCO3
K+
Na+
Cl-
ENTERÒCITO
MEMBRANACELULAR
LUZ INTESTINAL
INFLAMAÇÃO
14
severidade comumente manifestada por náuseas, vômitos, dores abdominais e
diarréia (com ou sem sangue), geralmente é autolimitante, mialgia, cefaléia, febre
(38º a 39ºC) e calafrios são comuns, no entanto, o sintoma patognomônico é a
diarréia. Outros sintomas são sonolência e prostração (Meehan, 1996; Woodward et
al., 1997; Giannella, 2000; Mermin, 2004). A Salmonella pode ser transportada
pelos ductos linfáticos dos linfonodos regionais e migrar para os vasos sanguíneos
eferentes, caindo na circulação sanguínea, causando septicemia, meningite,
encefalite e osteomielite, podendo levar à morte (Woodward et al., 1997; Mermin,
2004). O período de incubação da Salmonella é de 12 a 72 horas, mas pode se
extender por até uma semana. Em alguns surtos, onde um grande número de
microrganismos são ingeridos, períodos de incubação tão curtos quanto 02 horas e
30 minutos têm sido reportados (DDTHA/CVE, 2005).
2.4. Imunidade dos Animais à Salmonella
O sistema imune consiste em duas grandes categorias, imunidade natural e
específica. Imunidade natural ou não-específica inclui as barreiras físicas e
químicas, componentes do soro, assim como sistema complemento, células de
defesa não-específicas, como neutrófilos polimorfonucleares, macrófagos e células
natural killer (Portnoy, 1992). A imunidade específica ou adquirida está dividida em
dois tipos, imunidade humoral e celular. Os anticorpos, produzidos pelos linfócitos B,
provêm a função efetora ativa para a imunidade humoral. Esses anticorpos
protegem o hospedeiro contra infecções pela ligação à superfície do organismo
15
infectante impedindo a invasão das células hospedeiras (Michetti et al., 1992), e
aumentando sua fagocitose (Johnson et al., 1985). A imunidade celular é mediada
por Linfócitos T e estas células podem também possuir função efetora (Linfócitos T
citolíticos) ou função reguladora (células T auxiliares e supressores) pela
modificação e ativação das células B ou outras células T. Este componente da
resposta imunológica é importante na proteção contra patógenos intracelulares,
como os vírus, parasitas e algumas espécies bacterianas, e atua pela eliminação
direta da célula hospedeira infectada ou pela ativação de células fagocíticas de
defesa (Schat, 1993). Ambas imunidades humoral e celular parecem atuar na
proteção contra a infecção por Salmonella, embora ainda seja controversa a
importância de cada uma delas em proteger o hospedeiro (Mastroein, 1993).
2.5. Detecção de Salmonella
A confirmação do diagnóstico faz-se pelo isolamento do agente etiológico das
matérias fecais do paciente ou do alimento suspeito através de provas bioquímicas e
sorológicas, ou ainda através de alguns métodos de detecção rápida, como enzyme-
liked immunoassay (ELISA), imunodifusão, hibridização de DNA, hemoaglutinação e
imunoflorescência, mas muitos destes métodos falham na especificidade (Rahn et
al., 1992; Aabo et al., 1993; Burkhalter et al., 1995). Todos estes sistemas de rápida
detecção requerem pré-enriquecimento seguido por enriquecimento seletivo e um
pós-enriquecimento (Rahn et al., 1992).
16
O método de cultivo tradicional para Salmonella envolve um mínimo de três
dias para amostras negativas e cinco dias para confirmação de amostras positivas
desde o pré-enriquecimento até a confirmação bioquímica (Bailey et al., 1994; Lantz
et al., 1994; Trkov; Avgustin, 2003). Para uma análise bacteriológica, as condições
em que as amostras são transportadas e a escolha dos meios de cultivo podem
drasticamente afetar os níveis de recuperação de Salmonella. Os protocolos
rotineiros podem, certamente, subestimar a real prevalência de alguns biotipos tais
como, lactose positivos e S. enterica subsp. IIIa e IIIb, que requerem meios
especiais para não serem confundidos com coliformes (Tang et al., 1998; Corrente
et al., 2004). Assim para controlar uma infecção com eficiência, a utilização de um
rápido e preciso teste de diagnóstico é necessário .
A Salmonella pode ser isolada a partir de fezes, pele, cavidade oral, vísceras
e qualquer superfície que o hospedeiro tenha tido contato (Martino, 1999; Fegan et
al., 2005).
2.5.1 Detecção Microbiológica
O isolamento por meio da cultura de Salmonella é muito comum na produção
animal e indústrias de alimentos. A maioria dos métodos microbiológicos foi
desenvolvida para o diagnóstico clínico de salmonelose em humanos e animais
(Flowers et al., 1992).
Salmonella pode crescer a uma temperatura que varia de 2 a 54°C. Embora
cresça abaixo de 7°C, essa propriedade tem sido amplamente observada somente
17
quando cultivada em meios bacteriológicos, não em alimentos. Enquanto que, o
crescimento acima de 48°C é confinada a cepas mutantes. A ótima temperatura para
seu crescimento é 37°C. A ecologia natural de muitas cepas de Salmonella que
preocupam a saúde pública é o trato grastrointestinal de animais de sangue-quente
(Cox et al., 1999; Brenner et al., 2000). O pH ótimo para o crescimento da
Salmonella está entre 6,5-7,5, mas podem crescer em pH que varie de 4,05-9,5
(limites máximos) em meio líquido (Cox et al., 1999).
Um grande número de meios para pré-enriquecimento tem sido proposto. O
Caldo Lactosado (LB) foi, talvez, o primeiro a ser amplamente utilizado. Mas este foi
alvo de críticas, pois a fermentação da lactose acaba por acidificar o meio a níveis
inibitórios ou letais a Salmonella (Hiker, 1975). A Água Peptonada Tamponada
(APT) tem sido usada por não possuir um açúcar fermentável. Fricker (1987) propôs
que a APT é mais apropriada que o LB para o isolamento da Salmonella.
Meios de enriquecimento seletivo são formulados para inibir seletivamente
outras bactérias enquanto permite que a Salmonella se multiplique a níveis
detectáveis. Atualmente existem três principais tipos de caldos para enriquecimento
seletivo: Tetrationato, Selenito-Cistina e Rappaport-Vassiliadis (RV) (Nascimento et
al., 2000). Alguns pesquisadores preferem utilizar o Selenito (Cox et al., 1972),
enquanto outros preferem o Tetrationato (Cherrington et al.,1993) ou o RV (Bager;
Petersen, 1991). A superioridade de um caldo sobre outro é variável. Segundo
alguns autores, melhor que os resultados apresentados por um caldo sobre outro,
seria a utilização combinada dos mesmos (Nascimento et al., 2000).
Meios para plaqueamento não podem ser julgados somente por sua
capacidade seletiva, mas também por sua habilidade em diferenciar colônias de
Salmonella de outras bactérias. Diferentes tipos de meios foram desenvolvidos para
18
o isolamento de Salmonella, de onde as colônias suspeitas podem ser utilizadas
para futuras investigações (Nascimento et al., 2000). A Tabela 2 resume a aparência
das colônias de Salmonella em uma variedade dos mais frequentemente meios de
cultivo utilizados.
O ágar Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4) tem sido apontado como um dos mais
específicos na identificação da Salmonella, e com uma sensibilidade equivalente ao
Agar Entérico Hektoen (HE) (Dusch; M Altwegg, 1995). Nascimento et al. (2000)
relatou que o ágar Salmonella-Shigella (SS), o ágar Xilose Lisina Desoxilato (XLD) e
o HE quando associados entre si aumentam a sensibilidade na detecção de
Salmonella.
Tabela 2. Aparência da Salmonella nos meios seletivos mais comumente usados
Meio de Cultura Aparência das colônias de Salmonella
Agar Sulfito de Bismuto Preta metálica brilhante
Agar Verde Brilhante Vermelha
Agar Entérico Hektoen (HE) Azul-esverdeado com centro negro
Agar MacConkey Clara
Agar Rambach Vermelho com bordas pálidas
Agar Salmonella-Shigella (SS) Clara com centro negro
Agar Xilose Lisina Desoxilato (XLD) Vermelha
Agar Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4) Vermelha com centro negro
Fonte: Elaborado a partir de Littell (1977).
19
2.5.1.1. Identificação Bioquímica
Colônias típicas de Salmonella encontradas em ágar seletivo devem ser
confirmadas por testes bioquímicos. Os principais testes para a identificação de
Salmonella estão listados na Tabela 3. Testar todas estas reações requer
consideráveis recursos. Consequentemente, é frequente o uso de meios compostos
como o ágar de três açúcares e ferro (TSI), que contém glicose, lactose e sacarose,
um sistema para detecção de H2S (sulfeto) e um indicador de pH (Koneman et al.,
2001).
Tabela 3. Reações bioquímicas típicas de Salmonella spp.
Teste Reação Teste Reação
Fermentação de: Redução do Nitrato + Glicose + Oxidase - Manitol + Oxidação/Fermetação F Maltose + Hidrólise da Uréia - Lactose - Indol - Sacarose - Produção de H2S + Salicina - Utilização do Citrato + Adonitol - Malonato de Sódio - Duleitol + Crescimeto em KCN - Lisina Descarboxilase + MR + Arginina Dihidrolase + VP - Ornitina Decarboxilase + Liquefação de Gelatina - Deaminação da
Fenilalanina -
KCN- Cianeto de Potássio; MR- Vermelho de Metila; VP- Voges-Proskauer; F-Fermenta Fonte: (Koneman et al., 2001).
20
2.5.1.2. Detecção Sorológica
Estruturas antigênicas presentes na superfície de bactérias podem ser
identificadas pela utilização de soro poli ou monovalente. Os antígenos Somático
(O), Flagelar (H) e Capsular (Vi) da Salmonella causam aglutinação das colônias no
soro e os sorotipos podem então ser identificados (Brenner et al., 2000). A
sorotipagem é mundialmente utilizada na classificação das salmonelas, mas este
método tem um limitado poder discriminatório e não revela relações filogenéticas
das cepas de mesmo sorotipo ou entre sorotipos diferentes (Sukhnanand et al.,
2005), além de estar sendo implicado como caro, laborioso e requerente de mais de
150 soros específicos, o que a torna indisponível para a maioria dos laboratórios,
justificando a pouca notificação dos casos e surtos (Baudart et al., 2000; Sonne-
Hansen; Jenabian, 2005).
A habilidade da Salmonella em transferir, adquirir e recombinar os genes da
flagelina fase 1 (fliC) e para o antígeno O (rfb) pode explicar a existência de tão
grande número de sorotipos, mas este é apenas mais uma das limitações da
sorotipagem. De fato, estudos revelam que cepas de mesmo sorotipo podem estar
distantemente relacionadas (Lagatolla et al., 1996). As mudanças epidemiológicas
das infecções por Salmonella e a emergência de novas cepas (ex. S. Typhymurium
DT104 e S. Newport resistentes a múltiplas drogas) torna imperativo o
desenvolvimento de novos métodos de subtipagem, que não apenas discriminem os
subtipos mas que também possa ser usado em análises evolutivas (Sukhnanand et
al, 2005).
21
2.5.2 Detecção Molecular
As provas moleculares apresentam as vantagens de serem altamente
específicas e usadas em condições adversas para detectar um gene ou seqüências
de ácidos nucléicos de um organismo particular ou de um grupo de organismos;
serem usadas para detectar e identificar organismos sem a necessidade de cultivo e
isolamento em cultura pura, descartando a subjetividade dos testes microbiológicos;
serem designadas e usadas para detectar organismos específicos ou grupos
taxonômicos amplificados como é o caso de provas de regiões alvo da molécula de
RNA ribossômico (RNAr) com diferentes níveis de variabilidade (Coutinho et al.,
1999). Durante muito tempo as técnicas moleculares eram caras e laboriosas para
serem executadas de forma rotineira, mas este quadro tem mudado
consideravelmente nos últimos anos (Sonne-Hansen; Jenabian, 2005).
2.5.2.1. Reação da Polimerase em Cadeia
A extraordinária habilidade da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) de
replicar exponencialmente uma determinada sequência de DNA, a tornou uma
poderosa ferramenta para a epidemiologia, medicina e biologia molecular. A PCR é
baseada na capacidade que iniciadores específicos, para determinada região do
DNA de um organismo, tem em anelar somente com a sequência desejada através
da complementariedade de bases. A Taq DNA polimerase, uma enzima responsável
pela extensão do DNA alvo, reconhece o complexo formado pelo iniciador e a fita do
22
DNA molde, que resulta na cópia simultânea de ambos os sentidos do segmento do
DNA entre os dois iniciadores anelados. Os passos de desnaturação, anelamento e
extenção ocorrem de forma cíclica, graças a termoestabilidade da Taq DNA
polimerase, até que a sequência alvo se encontre em quantidades detectáveis
(Oste, 1988; Aabo et al., 1993; Van der Zee; Huis, 1997). O princípio da PCR é
explicado na Figura 5. Antes de iniciar o primeiro ciclo no termociclador, o DNA, os
iniciadores, a polimerase, os desoxirribonucleotideos trifosfatados (dATP, dTTP,
dCTP, dGTP), cloreto de magnésio (MgCl2) e um tampão são misturados em um
tubo. Então a sequência alvo do genoma da Salmonella é amplificada pela repetição
de três passos (Kreuzer; Massey, 2002):
I. Desnaturação do DNA fita-dupla em fita-simples por aquecimento;
II. Anelamento específico por complementariedade dos iniciadores ao DNA
fita-simples pelo resfriamento;
III. Extensão enzimática dos iniciadores para produzir uma cópia exata da
sequência alvo fita-dupla.
Este processo do I ao III é usualmente repetido em 30 a 40 ciclos. Depois a
amplificação é confirmada realizando-se uma eletroforese em gel de agarose.
Stone 1994 aperfeiçoou os métodos de detecção de DNA bacteriano através
do PCR em combinação com o enriquecimento das culturas. Antes da PCR é
necessário extrair e purificar o DNA do material testado, pois a amplificação é inibida
por um extenso número de substâncias químicas como componentes alimentares e
ambientais, ácido húmico, urina, sais biliares, meios seletivos usados no isolamento
dos patógenos. A remoção de substâncias inibitórias é um passo importante na
preparação das amostras para a PCR (Rahn et al., 1992; Aabo et al., 1993; Lantz et
al., 1994; Jeníková et al., 2000; Sibley et al., 2003). A PCR tem sido frequentemente
23
usada para identificar Salmonella em amostras clínicas e alimentos (Cohen et al.,
1993; Rahn et al., 1992).
Figura 5. Princípio da Reação da Polimerase em Cadeia. Pequenas sequências específicas de DNA (iniciadores) são utilizados para se ligarem às fitas de DNA desnaturado pelo aquecimento. Uma enzima termoestável (DNA polimerase) estende os iniciadores para formar a nova fita complementar
Fonte: (Kreuzer; Massey, 2002).
As principais vantagens da PCR como método de diagnóstico são: a
velocidade e facilidade de utilização; a sua sensibilidade, pois é capaz de amplificar
seqüências a partir de discretas quantidades do DNA-alvo e até mesmo do DNA de
1
2
DNA
DNA polimerase
Desoxirribonucleotídeos
MgCl2
Tampão
Primeiro Ciclo
Desnaturação
+
Anelamento dos
Iniciadores
1
2
Anelamento + Extensão
1
2
2
Segundo Ciclo
1
2
Reação
1
24
uma única célula (Li et al., 1988); e por sua robustez, ou seja, por permitir a
amplificação de seqüências específicas a partir de material no qual está gravemente
degradado em um meio onde o isolamento de DNA é problemático. Como
desvantagens desta técnica, nota-se a necessidade de informação sobre as
seqüências-alvo de DNA e a infidelidade na replicação do DNA (Strachan; Read,
2002).
Muitos iniciadores têm sido usados na identificação da Salmonella. Alguns
destes foram selecionados a partir de genes associados com a virulência do
microrganismo, como o invA e fimA. O gene invA está relacionado com a
capacidade da Salmonella invadir as células hospedeiras (Rahn et al., 1992; Aabo et
al., 1993; Burkhalter et al., 1995; Cohen et al., 1996) e tem sido considerado como
um dos iniciadores mais específicos para este gênero (Malorny et al., 2003), e o
gene fimA que é encontrado na unidade fimbrial da bactéria (Cohen et al., 1996). Os
iniciadores ST11 e ST15 (Aabo et al., 1993) foram selecionados de uma região,
específica do cromossomo da S. Typhimurium LT2, denominada JEO402-1 de 2,3
kilobases (Figura 6) obtida pela utilização da endonuclease de restrição Sau 3A
(Olsen et al., 1999). Esta região demonstrou ser altamente sensível e específica
para todo o gênero Salmonella, identificando 185 cepas de 93 sorotipos diferentes
através de testes de hibridização cruzada (Olsen et al., 1999). Aabo et al. (1993)
demonstraram que o par de iniciadores ST11-ST15 também é altamente sensível e
específico, não apresentando nenhum resultado falso-positivo quando utilizado com
outras enterobactérias e somente dois sorotipos da Salmonella arizonae (subespécie
IIIa) não foram identificadas, o que não invalida a eficiência dos iniciadores já que
esta subespécie é raramente encontrada em associação a casos humanos.
25
Figura 6. Sequência da região JEO402-1 isolado do cromossomo da S. Typhimurium LT2. A sequência sublinhada destaca a região utilizada para o desenho dos iniciadores. Fonte: (Olsen et al., 1999)
ST11 -
ST15 -
26
2.5.2.2. Caracterização Molecular
O Sequenciamento de genes e de fragmentos cromossomais ou ribossomais
(16S, 23S e 16S-23S), RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism), MLST
(Multilocus Sequence Typing), PCR Ribotyping, IS200 Fingerprinting, têm sido
utilizados para tentar diferenciar a Salmonella ao nível molecular (Pelkonen et al.,
1994; Sonne-Hansen; Jenaiban, 2005; Sukhnanand et al., 2005). Entretanto, muito
destes métodos tem sido descritos como caros e laboriosos ou pouco sensíveis e
específicos, não diferenciando cepas estreitamente relacionadas. O par de
iniciadores ST11-ST15 tem sido utilizado na identificação de Salmonella,
demonstrando ser altamente conservado dentro deste gênero (Aabo et al., 1993;
Gouws et al., 1998; Maciorowski et al., 2005). Devido a esta característica estes
iniciadores podem ser utilizados, por exemplo, em análises genéticas de filogenia ou
caracterização molecular. Mas, pouco se sabe sobre o real poder destes iniciadores
em diferenciar a Salmonella aos níveis de espécie, subespécie ou sorotipo.
Os RNArs são bastante conservados tanto funcionalmente como em sua
sequência e está associado com regiões de moderada variação (Ward, 2002,
Woese, 1987). Assim, a comparação de sequências de RNAr se tornou uma
poderosa ferramenta para deduzir relações filogenéticas e evolutivas de organismos
(Weisburg et al., 1991), assim como, sua própria identificação (Rodício; Mendoza,
2004).
A molécula amplamente utilizada para análises filogenéticas em procariontes
é a 16S, subunidade menor do RNAr. É um polirribonucleotídeo de
aproximadamente 1500 nucleotídeos, codificado pelo gene rrs (DNAr). Como
27
qualquer sequência de cadeia simples, o RNAr 16S se dobra em uma estrutura
secundária que intercala cadeias simples e cadeias duplas (Figura 7) (Rodício;
Mendoza, 2004). O número de cópias do operon ribossômico no genoma bacteriano
varia de 1 a 15, sendo relativamente constante a nível de gênero e espécie (Luz et
al., 1998; Rodício; Mendoza, 2004). Contudo, na maioria dos casos, todas as cópias
do DNAr 16S de um organismo são idênticas ou quase idênticas. O DNAr 16S é a
molécula preferida pelo seu tamanho e por ser melhor manejável experimentalmente
(Rodício; Mendoza, 2004).
Figura 7. Estrutura secundária do RNAr 16S. As regiões conservadas estão representadas pelas linhas em negrito e as variáveis (V1-V9) pelas linhas finas.
Fonte: (Rodício; Mendoza, 2004)
28
Por meio da análise do RNAr 16S, Woese (1987) percebeu que o Reino
Procaryota era inválido pelo fato das Eubactérias e Archeobactérias serem tão
distantes entre si como são dos Eucariotos. Assim, introduziu-se o termo Domínio
para substituir o Reino e dividiram-se os organismos celulares em três domínios:
Bacteria, Archea e Eucarya. Desde então, a análise do RNAr 16S tem sido utilizada
para estabelecer relações filogenéticas, causando um grande impacto na
classificação e identificação bacterianas (Rodício; Mendoza, 2004).
Os principais problemas com a identificação e nomenclatura de bactérias são
(Clarridge III, 2004):
1. Bactérias com mesmo genótipo mas fenótipos diferentes (Mycobacterium
tuberculosis ATCC 27294 e M. bovis ATCC 19210);
2. Bactérias com genótipos similares mas fenótipos diferentes (E. coli ATCC
11775 e Shigella dysenteriae ATCC 13313);
3. Bactérias com fenótipos similares mas genótipos diferentes (Nocardia
asteroides ATCC 19247 e N. farcinica ATCC3318);
4. Bactérias muito distantes para pertencerem à mesma espécie
(Enterobacter (Pantoea) agglomerans (bg1) e E. (Pantoea) agglomerans
(bg2));
5. Bactérias muito distantes para pertencerem ao mesmo gênero (Clostridium
tetani ATCC 19406 e C. Innocuum ATCC14501);
6. Bactérias muito próximas para serem de diferentes gêneros (Enterobacter
cloacae ATCC 13047 e Citrobacter werkmanii).
Diversas técnicas têm sido criadas para a análise do RNAr 16S (Leblond-
Bourget et al., 1996; Espejo et al.,1998; Rodício; Mendoza, 2004; McAuliffe et al.,
2005), mas poucas têm sido usadas na caracterização e diferenciação da
29
Salmonella em nível molecular. As mais comumente utilizadas para este fim é o
sequenciamento (Woo et al., 2001) e RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) (Pelkonen et al.,1994). Contudo, várias pesquisas indicam que a
região RNAr 16S não é adequada para grupos bacterianos proximamente
relacionados (Leblond-Bourget et al., 1996; Cilia et al., 1996). Entretanto, Van Beek
e Priest (2002) otimizaram a separação de Lactobacillus por intermédio da DGGE,
utilizando a região variada V6-V8 do RNAr 16S.
O RNAr 23S tem ganhado destaque por possuir maior número de regiões
variáveis, o que permite análises filogenéticas ao nível de espécie e subespécie. O
estudo desta região pode, portanto, ser usado de forma complementar ao RNAr 16S
(Christensen et al., 1998).
O espaço entre os genes 16S e 23S do DNAr é chamado de ITS (Internal
Transcribed Spacer). Este espaço contém um maior grau de variabilidade do que as
regiões 16S e 23S. Estas variações têm sido utilizadas na diferenciação de espécies
bacterianas e análises filogenéticas (Leblond-Bourget et al., 1996). O estudo desta
região tem sido amplamente realizado para a análise da diversidade de cepas de
Salmonella, encontrando resultados bastante promissores (Baudart et al., 2000;
Christensen et al., 2000).
A Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) tem sido
amplamente utilizada por permitir o estudo filogenético de comunidades microbianas
(Muyzer et al., 1993). A DGGE é baseada na eletroforese dos fragmentos de DNA,
previamente amplificados pela PCR, em gel com gradiente desnaturante. Esses
fragmentos ficam sujeitos a um ambiente com crescentes níveis de desnaturação,
que acabam por promover mudanças conformacionais na molécula, reduzindo sua
migração (Sigler et al., 2004; Ercolini, 2004). Assim, fragmentos com mesmo
30
tamanho mas com composição de bases diferentes irão apresentar diferentes
padrões eletroforéticos, diferenciando cada microrganismo (Coutinho et al., 1999;
Ercolini, 2004). Fischer e Lerman (1983) relataram que esta técnica é capaz de
detectar uma simples mudança de base no DNA.
A adição de um grampo contendo 30 a 40 pb GC a um dos iniciadores da
PCR garante que o fragmento de DNA irá permanecer parcialmente como fita-dupla,
impedindo sua completa desnaturação, o que acarretaria a perda da definição dos
padrões eletroforéticos (Sheffield et al., 1989; Ercolini, 2004). Segundo Sheffield
(1989), a adição deste grampo aumentou a capacidade da DGGE em detectar
mudanças em uma única base no DNA.
Em microbiologia ambiental a DGGE tem sido amplamente empregada como
ferramenta para obtenção do perfil de populações microbianas complexas sem a
necessidade de cultivá-las, sendo superior a clonagem com subsequente
sequenciamento (Muyzer; Smalla, 1998). Mas, ainda é muito pouca sua utilização na
identificação e diferenciação de bactérias patogênicas. A região RNAr 16S tem sido
a mais utilizada na DGGE, tanto na microbiologia ambiental quanto na clínica. No
entanto, alguns pesquisadores tem proposto o uso de outros iniciadores mais
específicos quando a análise envolver microrganismos estreitamente relacionados,
pois tem sido demonstrado que outras regiões do genoma bacteriano podem
oferecer melhores resultados na diferenciação de organismos de mesma espécie do
que o 16S RNAr (Ercolini, 2004; Yergeau et al., 2005; Tacão et al.,2005;). Tacão et
al. (2005) conseguiram melhores resultados com a DGGE quando utilizaram uma
região específica para desenhar os iniciadores e, assim, conseguiram diferenciar a
maioria das espécies de Aeromonas. Visto que, a utilização de iniciadores universais
requerem o passo de cultivo das amostras para que somente a espécie alvo seja
31
amplificada, com o desenvolvimento de iniciadores específicos, a DGGE pode ser
aplicada diretamente do material clínico, diminuindo custos e o tempo de
processamento.
Uma grande vantagem da DGGE é a possibilidade de comparar múltiplas
amostras em um único gel (Davies et al., 2004). A maior limitação desta técnica é
que seqüências muito grandes podem não ser eficientemente separadas. O produto
do PCR não deve ultrapassar 500 pb, o que acaba limitando as informações para
inferências filogenéticas (Muyzer; Smalla, 1998). Entretanto, Clarridge III (2004)
relatou que sequências de no mínimo 500 pb já são suficientes para análise
filogenéticas.
2.6. Prevenção da Salmonelose
As medidas de controle são de fundamental importância devido ao interesse
do consumidor, cada vez mais exigente, sobre as doenças transmitidas por
alimentos. O controle da Salmonella se apresenta como um desafio a toda indústria
de alimentos. É importante ressaltar que este controle está baseado no
conhecimento detalhado da epidemiologia da infecção e em um programa de
controle específico para cada empresa.
Existe no mercado uma vacina bastante efetiva contra febre tifóide. Mas, ela
não é eficaz para o restante das espécies não-tifoidais. Todo alimento deve ser
tratado contra a SalmoneIla antes da distribuição, realizar práticas para reduzir
contaminação cruzada de carcaças de animais (Cordano; Virgilio, 1996),
32
providenciar treinamento em práticas de higiene para todos os manipuladores de
alimentos, restaurantes, e matadouros e expandir programas de vigilância sanitária.
O correto cozimento e refrigeração dos alimentos também são efetivos no controle
da salmonelose (Giannella, 2000). A exemplo disso, foi observada uma baixa
prevalência de Salmonella em abatedouros que empregam programas rigorosos de
higiene (Rheault; Quessy, 1999). Manipuladores de répteis devem lavar suas mãos
imediatamente após contato direto ou indireto. Os aquários e as jaulas dos répteis
devem ser devidamente limpos em locais onde não ocorra preparação de alimentos
para consumo humano. Os répteis devem ficar confinados em seus aquários ou
jaulas e não terem livre acesso para áreas ocupadas por pessoas, principalmente
crianças (Woodward et al. 1997).
2.7. Tratamento da Salmonelose
O tratamento geral para salmonelose é a reposição de fluidos via oral ou
intravenosa, controle da dor, náuseas e vômitos. A terapia específica consiste na
administração de antibióticos (Giannella, 2000). Os antibióticos geralmente não são
recomendados para a terapia de gastroenterites não invasivas causadas por
Salmonella não tifoidal, porque a terapia não restringe a doença, a menos que
meningite ou infecções complicadas ocorram. Além disso, a antibioticoterapia pode
prolongar a liberação de bactérias pelas fezes (Campos, 1999; James, 2000; Wooley
et al., 2001; Giannella, 2000), sendo somente indicada, principalmente, em casos de
crianças menores de 3 anos de idade, idosos, pessoas imunocomprometidas ou
33
com hemoglobinopatias, devendo sempre ser baseada no antibiograma (Campos,
1999; Giannella, 2000).
2.7.1 Sensibilidade a Antibióticos
A distribuição mundial da resistência antimicrobiana é uma realidade. A
crescente taxa de emergência de novos fenótipos resistentes, as oportunidades para
cepas semelhantes se disseminarem de pessoa a pessoa, e entre pessoas e
animais são altamente reconhecidos. A disseminação de microrganismos resistentes
ocorre mais freqüentemente em países em desenvolvimento do que em países
desenvolvidos, pois este último apresenta programas mais adequados de higiene. A
resistência antimicrobiana é um problema mundial que requer respostas locais,
regionais, nacionais e mundiais. A vigilância é a chave para entender a dimensão e
a tendência da resistência antimicrobiana, sendo importante também para avaliar os
impactos das intervenções de controle (Williams, 2001).
Um fator que contribuiu para o desenvolvimento de resistência foi o uso
indevido de antibióticos na medicina humana e veterinária, pecuária, agricultura e
aqüicultura. (Woodward et al., 1997; Laidlaw, 2003). Na pecuária, antibióticos são
usados no tratamento e prevenção de doenças bem como na promoção de
crescimento. Esta rotina de práticas tem levado a emergência de bactérias
resistentes a diversos tipos de antibióticos, causando um sério problema de saúde
pública, primariamente pelo crescente risco de falhas em tratamentos, impondo
limitações na escolha de drogas para terapia (Velonakis et al. 2001; Zhao et al.,
34
2003; Woodward et al., 1997). Como exemplo disto a S. Typhimurium DT 104,
apareceu em 1988 como um grande problema mundial, porque se apresentou
resistente a múltiplos antibióticos, ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina,
sulfonamidas, tetraciclina, e em alguns casos a trimetropima (Threlfall et al., 1996;
James, 2000). Estudos moleculares mostraram que na DT 104 multiresistente, todos
os genes de resistência estão localizados no DNA cromossomal, que é um
fenômeno raro para S. Typhimurium (Threlfall et al., 1996; Williams, 2001).
Avanços recentes na caracterização molecular dos mecanismos de
resistência a antibióticos destacam a existência de estruturas genéticas, chamadas
integrons, envolvidas na aquisição de genes de resistência. Os integrons promovem
a captura de um ou mais conjuntos de genes com o mesmo sítio de ligação,
formando assim “clusters” (grupos) compostos de genes de resistência a
antibióticos. Vários estudos têm demonstrado que os integrons estão amplamente
distribuídos em cepas de S. enterica (Threlfall et al., 1994). Estes genes de
resistência a drogas são transferidos entre as espécies de Salmonella junto com os
integrons classe 1 presente em transposons e plasmídios conjugativos. (Taddei et
al., 1997; Chopra et al., 2003; Hamada et al., 2003). Em condições intestinais, o
material genético que confere resistência a antibióticos é prontamente transmitido
entre as enterobactérias (Blake et al., 2003).
A resistência a antibióticos também foi relatada em animais exóticos. Em
1998 foi encontrada, em cepas de Salmonella isoladas de cobras, resistência a três
antibióticos, a estreptomicina, tetraciclina e o ácido nalidixico. No mesmo ano foi
encontrada, em cepas isoladas de lagartos, resistência a oito antibióticos diferentes,
ampicilina, kanamicina, sulfamethoxazole, tetraciclina,
trimethoprim/sulfamethoxazole, estreptomicina e ácido nalidixico (Headrick et al.,
35
2001). A prevalência de resistência adquirida por cepas isoladas de répteis é baixa,
mas o contato cada vez maior destes animais com o homem tem contribuído para
aumentar esta taxa (Pasmans et al., 2005).
O monitoramento da susceptibilidade a antimicrobianos da Salmonella é
importante, pois além de auxiliar na escolha do antibiótico correto é uma ferramenta
importante na documentação epidemiológica de cepas de Salmonella resistentes
(Wall et al., 1995; Van der Wolf, 1999).
2.8. Salmonella em Répteis
É um fato que os répteis assumem cada vez mais uma maios importância
mundial. Os animais exóticos têm sido introduzidos em áreas geográficas
específicas com finalidades distintas: produção de alimentos, modelo biológico para
investigações científicas, educação e preservação (zoológicos e similares),
participação em feiras ou exposições, atividades de lazer (circos), esportivas
(competições) e inclusive como animais de companhia ou adorno (Vasconcellos,
2001). Além disso, é comum a população do interior do país, assim como povos
indígenas, utilizarem a carne destes animais como fonte de proteína em sua dieta,
mas de todas estas possibilidades o animal de companhia ou adorno é o que
estabelece o grau máximo de proximidade com os seres humanos e, com isto, cria o
maior risco para a introdução de zoonoses no próprio domicílio (Vasconcellos,
2001).
Cada espécie de réptil possui seus próprios requerimentos biológicos e
36
comportamentais que devem ser satisfeitos para que se alcance a homeostase, um
equilíbrio do estado fisiológico com seu ambiente. A biologia natural de várias
espécies de répteis ainda não é completamente entendida e muitos répteis em
cativeiro vivem em condições que se assemelham apenas superficialmente ao seu
habitat natural. Portanto, sua biologia e comportamentos específicos precisam
rotineiramente permanecer inalterados. Esta situação cria numerosos estressores
que prejudicam a homeostase. Como os outros animais, os répteis respondem ao
estresse tipicamente envolvendo uma crescente atividade endócrina,
particularmente da glândula adrenal. Longo tempo de cativeiro e estresse, associado
a crescente produção de adrenalina e outros hormônios podem resultar em um
desequilíbrio das funções normais do organismo (Laidlaw, 2003). A incapacidade de
resistir satisfatoriamente ao estresse crônico pode resultar em deteriorações gerais
da saúde, bem como emergência de doenças diretamente relacionadas com a
dificuldade de adaptação ao cativeiro (Grespan, 2001; Laidlaw, 2003). Esta é
usualmente referida como a "Síndrome da má adaptação" e pode também envolver
um decréscimo na capacidade de resistir aos parasitas, mesmo àqueles que fazem
parte da microbiota normal, por ter sido quebrada a relação de simbiose entre o
parasita e o hospedeiro (Laidlaw, 2003).
Uma grande variedade de patógenos pode ser transmitida por répteis para
humanos por contato direto ou contato indireto, como superfícies contaminadas com
fezes ou por partículas de material fecal na pele ou garras e água contaminada
(CDC, 1995, 1999; Laidlaw, 2003). Algumas das zoonoses mais comumente
relatadas são por Campilobacter, E. coli, Mycobacterium e Streptococcus, mas a
mais freqüente é por Salmonella (Laidlaw, 2003).
A gravidade dessas doenças em algumas pessoas é elevada, por isso elas
37
devem evitar entrar em contato com répteis. As crianças menores de 5 anos de
idade, pessoas imunodeprimidas, recém operadas, usando drogas
imunodepressoras, que estejam recebendo radioterapia, mulheres grávidas,
pessoas com deficiência nutricional, com infecções crônicas e que recentemente
receberam antibioticoterapia (Laidlaw, 2003).
Os répteis tomam-se infectados por Salmonella via transmissão
transovariana, contato direto com outro réptil ou contato com as fezes de outro réptil
direta ou indiretamente. Os animais jovens de algumas espécies de répteis ingerem
as fezes dos adultos adquirindo a bactéria (Mitchell; Shane, 2000).
A infecção por Salmonella spp. em répteis foi primeiramente descrita em
cobras no ano 1944 e em tartarugas e lagartos em 1946. Até 1960, casos de
salmonelose associado a répteis eram raros. Répteis em cativeiro são
rotineiramente identificados como portadores de Salmonella. Durante a década de
70 cerca de 4% das famílias americanas possuíam tartarugas como animais de
estimação e estes animais foram responsáveis por 14% (300.000) de todos os
casos de salmonelose em crianças menores de dez anos de idade nos Estados
Unidos. Em 1975, a Administração de Alimentos e Drogas (FDA) proibiu a
distribuição e venda de tartarugas menores que 10 cm, e muitos estados proibiram a
venda de qualquer tartaruga. Esta ação resultou na prevenção de estimados
100.000 casos de salmonelose por ano. Contudo, desde 1986, a popularidade de
outros répteis, como as iguanas, aumentou e com ela a incidência de infecções
causadas por sorotipos associados a répteis (CDC, 1995).
Mais recentemente, relatos de répteis, que não as tartarugas, como
reservatórios têm ganhado atenção. O número de infecções por sorotipos raros de
Salmonella aumentou de 3,3% em 1987 para 7,3% em 1991 e teve uma pequena
38
queda de 1,1 % em 1997 (Olsen et al., 2001), evidenciando a importância desses
animais para a saúde pública.
O número de proprietários de répteis é crescente assim como o número de
lojas e criadores, pois este além de ser exótico é de fácil criação. Durante os anos
de 1991-2001 o número de casas com répteis dobrou de 850.000 para 1,7milhão
(CDC, 2003). Estimam-se que nos Estados Unidos e Canadá 3 a 5% de todos os
casos de salmonelose estejam associados com contato com animais exóticos
(Headrick et al., 2001; Geue; Löschner, 2003). O Centro de Controle e Prevenção de
Doenças (CDC) relatou que aproximadamente 93.000 casos de salmonelose
ocorridos nos Estados Unidos em um ano resultaram do contato com répteis e
anfíbios. Isto representa aproximadamente 7% de todos os casos de salmonelose
ocorridos (Headrick et al., 2001).
Estudos demonstraram que no Brasil a maior prevalência de Salmonella é
encontrada em lagartos (62,5%), ficando em segundo lugar as cobras (53,3%) e
depois os quelônios (25,8%) (Sá; Solari, 2001).
Répteis são conhecidos como portadores de sorotipos raros de Salmonella
não comumente associados com infecções humanas, incluindo alguns da
subespécie arizonae que são particularmente associados a cobras. Com o
crescimento da popularidade dos répteis como animais de estimação, infecções por
estes sorotipos têm aumentado principalmente em crianças (Chishoin et al., 1999).
Devido a Salmonella fazer parte da microbiota normal de 60 a 90% dos répteis e ser
excretada intermitentemente, o risco de infecção é grande e imprevisível (James,
2000; Headrick et al., 2001). Apesar de a Salmonella fazer parte da microbiota
normal dos répteis, um estudo estimou que um terço dos répteis morrem por
complicações dessa doença (Weil et al., 2001). Tentativas de erradicar estas
39
bactérias dos répteis com uso de antibióticos têm falhado, contribuindo apenas para
o desenvolvimento de cepas resistentes (Laidlaw, 2003).
Determinar se um animal é ou não infectado depende de uma série de
exames durante dias ou semanas, porque o microrganismo pode não ser detectado
em todas as vezes que as fezes são evacuadas. Um réptil pode ser negativo em um
exame, mas positivo em outro subseqüente (Weil et al., 2001;).
Uma grande variedade de sorotipos de Salmonella de todas as subespécies
tem sido isolada de répteis, algumas vezes mais de um sorotipo simultaneamente no
mesmo animal (Corrente et al., 2004; Pasmans et al., 2005), muitos destes
representam raros ou também chamados 'exóticos' sorotipos (Mitchell; Shane, 2000;
Geue; Löschner, 2003). Os sorotipos mais comumente encontrados em répteis e
relatados como causa de salmonelose humana são S. Java, S. Stanley, S. Marina,
S. Poona, e S. Pomona, enquanto que as cepas mais comumente encontradas em
animais domésticos e produtos alimentícios, causadoras de salmonelose em
humanos, são a S. Typhimurium e S. Enteretidis (Headrick et al., 2001; Laidlaw,
2003). Os sorotipos S. Flint, S. Kintambo, S. Ealing, S. Carrau e S. Abaetetuba
também estão relacionados com infecções transmitidas por répteis (Olsen et al.,
2001).
Médicos Veterinários desempenham um papel importante para a saúde
pública informando o grande risco que há do contato de humanos com animais
suspeitos de salmonelose. Eles devem acentuar a importância de um rigoroso
programa de saúde pública (Wall et al., 1995). É fundamental que as autoridades
empreguem controle sanitário e promovam campanhas informativas à população
(Sá; Solari, 2001). O recente declínio das infecções por S. Marina que começou em
1997 deve-se a crescente educação por veterinários, pediatras, e donos de lojas de
40
animais sobre o risco da salmonelose associadas a répteis (Olsen et al., 2001).
Carne de répteis usadas para consumo humano também representam um
risco à saúde pública (Weil et al., 1995; Gonzáles et al., 1999). Existem relatos de
contaminação de carne de crocodilo, usada para o consumo humano, por
Salmonella na Austrália (Weil et al., 1995). A contaminação da carne pode ocorrer
nos matadouros pela excreção de animais assintomáticos, equipamentos do
matadouro e paredes contaminados. Contaminação cruzada de carcaças e produtos
cárnicos pode ocorrer durante subseqüente manipulação, processamento,
preparação e distribuição (Rhealt; Quessy, 1999; McEvoy et al., 2003; Molla et al.,
2003).
2.8.1 O Teiú
O teiú (Tupinambis sp.) é um lagarto de ampla distribuição geográfica em toda
América do Sul (Abe, 1983). Possui o corpo robusto e mandíbulas fortes, sendo um
apto caçador. Onívoro, inclui na sua dieta animais mortos, frutas, lesmas, insetos, e
pequenos vertebrados (Fitzgerald et al., 1991). As duas espécies deste lagarto (T.
merianae e T. teguixin) são altamente exploradas devido ao alto valor de sua pele.
Cada ano, mais de 1 milhão de peles são exportadas da Argentina para os Estados
Unidos, Canadá, México, China, Japão e vários países europeus. Centenas de
pessoas caçam os teiús, pois a venda de cada pele é equivalente ao salário de um
dia de um trabalhador rural na Argentina. Muitas famílias comem a sua carne e sua
gordura é de grande valor para propósitos medicinais (Fitzgerald et al., 1991;
41
Gonzáles et al., 1999; Nogueira Filho; Nogueira, 1999; Flores, 2000). Os teiús
alcançam a maturidade sexual com 3 anos de idade, são animais ovíparos com o
tamanho da postura proporcional ao tamanho da fêmea, oscilando entre 20-50 ovos
(Noriega et al., 1996). Sua criação em cativeiro tem sido proposta para o seu
aproveitamento racional (Noriega et al., 1996; Nogueira Filho; Nogueira, 1999), e
tem demonstrado índices econômicos satisfatórios (Gonzáles et al., 1999).
A particular razão para o foco na Salmonella em répteis advém de estudos
indicando que ela é mais virulenta para humanos que cepas carreadas por outros
hospedeiros (Scott; Foster, 1997). A ameaça imposta por zoonoses de répteis
merece maior consideração e estudos, pois o contato com estes animais consiste
em uma grande ameaça a saúde pública.
42
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Amostragem
Teiús (Tupinambis merianae), criados em cativeiro na fazenda Almada
pertencente à Universidade Estadual de Santa Cruz, localizada no município de
llhéus / BA, foram analisados neste estudo (Figura 8) Todos os teiús foram
utilizados, a fim de determinar a real prevalência de Salmonella nestes animais. Eles
estavam agrupados por tamanho e idade em dez baias, sendo dois aquários (baias I
e 2) e oito baias de concreto com pequenas áreas de vegetação e com tocas,
também de concreto, cobertas com telhas de amianto. A água era servida em
bebedouros coletivos por baia e a dieta era basicamente pedaços de frango cru.
Figura 8. Figura representativa do teiú (Tupinambis merianae).
43
Swabs cloacais dos trinta animais existentes foram acondicionados e
processados, em no máximo seis horas após a coleta das fezes, no Laboratório de
Microbiologia da Universidade Estadual de Santa Cruz para identificação de
Salmonella spp. (Figura 9).
3.2. Cultivo e Identificação da Salmonella
O isolamento de bactérias das amostras fecais foi realizado de acordo com
APHA (Flowers et al. 1992), com algumas modificações. As amostras fecais foram
coletadas, inoculadas em 3 ml de Água Peptonada Tamponada (MERCK), para
recuperação das bactérias que são encontradas em pequenas quantidades nas
fezes, e incubadas em estufa bacteriológica a 43°C. Depois de 18-24h,
aproximadamente, 1ml de cada amostra foi transferido para tubos contendo 9 ml de
Caldo Tetrationato (MERCK) e outros com 9ml de Caldo Selenito-Cistina (Micromed)
e incubados a 43°C por 24 horas. Estes meios garantem condições ótimas para o
Figura 9. Realização da coleta da amostra utilizando swab estéril.
44
crescimento da Salmonella enquanto inibe o crescimento de outras enterobactérias.
Utilizando a alça bacteriológica, uma alíquota de cada caldo de
enriquecimento seletivo foi plaqueada em ágar Xilose-Tergitol 4 (XLT4) (MERCK) e
ágar Salmonella-Shigella (SS) (MERCK) pelo método de esgotamento em quadrante
para o melhor isolamento das colônias. As placas foram incubadas a 43°C por 24
horas. Colônias de coloração vermelha, com ou sem precipitado negro no centro,
crescidas no ágar XLT4 e as colônias transparentes, com ou sem precipitado negro
no centro, crescidas no ágar SS foram consideradas como prováveis colônias de
Salmonella spp. (Figura 10).
Três colônias suspeitas para Salmonella foram repicadas de cada placa de
ágar XLT4 e SS para a realização dos testes bioquímicos complementares,
compreendendo o ágar Tríplice Açúcar e Ferro (TSI), prova do Vermelho de Metila
(VM), produção de urease, de H2S, de Indol, mobilidade e descarboxilação da lisina.
Primeiramente, as colônias suspeitas foram repicadas em tubos contendo ágar TSI
(MERCK) inclinado com o auxílio de uma agulha bacteriológica, a colônia foi
introduzida até a profundidade do ágar e estriada na superfície inclinada. O que
caracteriza a Salmonella neste meio é a fermentação da glicose e ausência de
Figura 10. Aspécto das culturas de Salmonella em ágar XLT4 (esquerda) e SS (direita) e aspéctos das colônias (detalhe).
45
fermentação da lactose, acidificando somente a profundidade do meio tornando-o
amarelo. A superfície inclinada torna-se vermelha à medida que se formam aminas
alcalinas a partir da descarboxilação oxidativa de peptídeos na superfície (Figura 11)
(Koneman et al., 2001).
As amostras suspeitas no TSI foram repicadas para realização das demais
provas. A produção de urease foi medida inoculando as bactérias em meio líquido
contendo uréia e indicador de pH vermelho de fenol, que em pH ácido ou neutro
torna o meio amarelo e em pH neutro vermelho. Bactérias produtoras de urease
produzem amônia alcalinizando o meio que fica vermelho. A Samonella não produz
urease, por tanto a cor do meio permanece inalterada. As provas de mobilidade,
produção de Indol e de H2S foram mensuradas a partir do Agar Sulfeto-Indol-
Mobilidade (SIM) (MERCK). Como as bactérias do gênero Salmonella são
flageladas, portanto móveis, o teste de mobilidade é importante na identificação
deste patógeno. A mobilidade é caracterizada, ao exame macroscópico, pela
turvação do ágar a partir da linha de inoculação. O Indol é um dos produtos de
degradação do metabolismo do Triptofano. A Salmonella não possui a enzima
triptofanase, por isso não são produtoras de Indol. O Indol foi detectado a partir do
aparecimento da cor vermelha após a adição do reativo de Kovac (Mikrobiologie),
uma solução de p-dimetilaminabenzaldeído. A prova do Vermelho de Metila foi
realizada a partir da inoculação das bactérias suspeitas em Caldo VM-VP (MERCK),
sendo caracterizadas pela produção de ácidos fortes a partir da glicose, mantendo o
pH do meio abaixo de 4,4, desenvolvendo cor vermelha após a adição do VM
indicando prova positiva. A Salmonella é VM positiva. A descarboxilação da lisina
pela Salmonella foi detectada através da inoculação das bactérias em ágar Ferro-
Lisina (LIA) (DlFCO) com o mesmo procedimento realizado no ágar TSI. Ao
46
descarboxilar a lisina, a Salmonella produz aminas que alcalinizam o meio tornando-
o vermelho, sendo assim detectado macroscopicamente (Figura 11) (Koneman et
al., 2001).
As amostras positivas foram repicadas para tubos contendo Tripticase Soy
Agar (TSA) (MERCK), incubadas a 43°C por 24 horas e enviadas ao Laboratório de
Enterobactérias da Fundação Oswaldo Cruz-RJ (Fiocruz) para sorotipagem, usando
antígenos específicos para cada sorogrupo.
Estes procedimentos foram repetidos com os mesmos animais após 4 meses,
depois de terem sido implantados procedimentos de limpeza das baias, utilizando
água sanitária (2-3% de hipoclorito de sódio), com a finalidade de diminuir a carga
bacteriana local e a contaminação cruzada entre os animais.
TSI
LIA
VM
SIM
Urease
Figura 11. Esquema representativo das principais provas bioquímicas para identificação de Salmonella. Fonte: Elaborado a partir de Koneman et al. (2001).
47
3.3. Teste de Sensibilidade a Antibióticos
Os isolados de Salmonella foram testados quanto à sensibilidade a
antibióticos pelo método de disco-difusão em ágar. As bactérias foram inoculadas
em Tripticase Soy Broth (TSB) (MERCK) e incubadas a 43°C por 24 horas para o
desenvolvimento do inóculo. Uma alíquota de cada suspensão bacteriana foi
semeada em placa de ágar Mueller-Hinton (MERCK), estriando, com o auxílio de um
swab, a amostra três vezes sobre toda a superfície do ágar, girando a placa em 60°
antes da segunda e terceira vezes para assegurar uma distribuição uniforme do
inóculo. Os discos com antibióticos foram colocados com o auxílio de uma pinça
logo após o estriamento, sendo pressionados cuidadosamente contra o ágar para
melhor adesão do disco, e incubados a 37°C por 18 horas (Koneman et al., 2001).
Foram utilizados discos de Ampicilina (AMP 10mcg-CECON), Cloranfenicol (CLO
30mcg-CECON), Estreptomicina (EST 10mcg-CECON), Sulfonamida (SF 300mcg-
CECON), Tetraciclina (TET 30mcg-CECON) e Gentamicina (GEN 10mcg-CECON).
O diâmetro dos halos de inibição do crescimento foi mensurado, com o auxílio de
uma régua, e classificados em sensível, intermediário e resistente de acordo com a
tabela fornecida pelo fabricante dos discos de antibióticos (Figura 12).
48
3.4. Análise Estatística
O modelo estatístico usado para a análise da prevalência foi o teste não
paramétrico de Wilcoxon. Significância estatística das diferenças entre os
tratamentos foi baseado no teste - t (p<0,01).
3.5. Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)
3.5.1. Extração do DNA
Todos os sorotipos de Salmonella isolados a partir dos teiús e mais 7
diferentes sorotipos isolados de serpentes por Argôlo (2004) (Tabela 4) foram
Figura 12. Representação dos halos de inibição de crescimento pelo método de disco-difusão.
49
cultivados em Tripticase Soy Agar (TSA) para posterior extração do DNA. Foram
coletadas aproximadamente 10 colônias de cada placa e transferidas para tubos tipo
eppendorf de 200µL contendo 100µL de água Mili-Q estéril. A amostra foi
homogeneizada com o auxílio de um agitador para tubos tipo Vortex e colocada a
95°C por 10min para a lise das células. Após este passo, a amostra foi centrifugada
por 1min a 5.000rpm e coletado o sobrenadante (DNA) (Adaptado de Christensen et
al. 1998).
Tabela 4. Sorotipos de Salmonella isolados de serpentes Sorotipos
S. I (O 11:r:-) S. IV (O:61:c:1,5)
S. IIIb (O:47) S. I (O:4,5)
S. I (O:4,5:b:-) S. Newport
S. Gaminara Fonte: (Argôlo, 2004)
3.5.2. Iniciadores
Foram utilizados os iniciadores específicos para Salmonella, ST11-F com
grampo de GC (5’-CGCCCGCCGCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGG
GGAGCCAACCATTCTAAATTGGCGCA-3’) e ST15-R (5'-GGTAGAAATTCCCAGCG
GTACTG-3') (Invitrogen) (Aabo et al., 1993), e os iniciadores universais para as
regiões variáveis V3, F357 com grampo de GC (5’-CGCCCGCCGCGCCGCG
CGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGTACGGGAGGCAGCAG-3’) e R518 (5’-
50
ATTACCGCGGCTGC TGG-3’) (Promega) (Mcewan et al., 2005), e V6-V8 do 16S
DNAr, F984 com grampo de GC (5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGG
GCGGGGGCAGGGGGGGAACGCGAAGAACCT-3’) e R1378 (5’-CGGTGTGTACA
AGGCCCGGGAACG-3’) (Invitrogen) (Heuer et al., 1997). A utilização do grampo de
GC acoplado a um dos iniciadores impede a completa separação das fitas do DNA,
aumentando a sensibilidade da Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação
(DGGE) (Sheffield et al., 1989). A escolha dos iniciadores foi baseada na
necessidade de acelerar o método de diagnóstico e identificação de sorotipos,
assegurando um eficiente combate e controle da doença.
3.5.3. Amplificação
Foram transferidos 2 µL do sobrenadante (DNA) para tubos tipo eppendorf de
200µL contendo 48 µL de uma mistura de 33,50 µL de Água Milli-Q autoclavada,
10mM do Tampão da Taq polimerase (Promega), 2,5mM de MgCl2 (Promega), 10
pmol de cada iniciador (Invitrogen), 200µM de cada dos dNTP (Promega), 1,25 U da
Taq DNA Polimerase (Promega) (Aabo et al., 1993).
A PCR para ambos pares de iniciadores, ST11GC-ST15 e F984GC-R1378, foi
realizada utilizando as seguintes condições: uma desnaturação inicial a 94ºC por 5
minutos seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a
60ºC por 2 minutos e extensão a 72ºC por 1 minuto e uma extensão final de 10
minutos, adaptado de Aabo et al. (1993) e Heuer et al. (1997). Para o par de
iniciadores F357GC-R518 foi realizada uma PCR de 30 ciclos com as seguintes
51
condições: uma desnaturação inicial a 94ºC por 4 minutos seguida de 35 ciclos de
desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 55ºC por 1 minutos e extensão a
72ºC por 1 minuto e uma extensão final de 5 minutos (Mcewan et al., 2005). O
produto da reação foi visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta (UV)
após eletroforese em gel agarose a 1% (100V por 30min.) pré-corado com brometo
de etídio.
3.5.4. Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE)
A DGGE se baseia no padrão eletroforético dos fragmentos de DNA,
previamente amplificados pela PCR, que estaciona de acordo com a sua sequência
nucleotídica. A análise por DGGE foi realizada conforme Muyzer et al. (1993) e
Sigler et al. (2004). A DGGE foi realizada utilizando-se Sistema para análise de
mutações CDC 20x20cm (BioAgency Biotecnologia LTDA.). Dez microlitros dos
produtos de PCR foram colocados em um gel vertical de poliacrilamida a 6%
(acrilamida-bisacrilamida 37,5:1, Promega) com gradiente crescente e linear de
desnaturante de 40% a 50%, onde a solução 100% desnaturante contém 40% (v/v)
de formamida (VETEC) e 7M de Urea (Promega) e a solução 0% sem nenhum dos
agentes desnaturantes. O gel foi sujeito a eletroforese, primeiramente por 15min a
60V e em seguida por 5 horas a 200V (Sigler et al., 2004) em tampão TAE 1x, a uma
temperatura constante de 60ºC. Posteriormente, o gel foi corado durante 30min com
1x SYBR SafeTM DNA Gel Stain (Invitrogen) diluído a partir do estoque em tampão
TAE. As bandas foram observadas e fotografadas em um transiluminador ultravioleta
52
(KODAK Electrophoresis Documentation and Analysis System 290). A Figura 13
mostra um esquema de como foi preparado o gel de DGGE para a eletroforese.
_
+
Menor
Gradiente
Maior Gradiente
Sob Agitação
Cuba de Eletroforese
Figura 13. Esquema de preparação do gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante utilizando um “gradient maker”, sistema para produção do gradiente linear.
53
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Análise Bacteriológica
O teiú (Tupinambis merianae), como qualquer outro réptil, é um potencial
reservatório de Salmonella spp. principalmente por ser, na maioria das vezes,
portador assintomático desta bactéria. Estima-se que 60 a 90% dos répteis são
portadores de Salmonella constituindo um grave problema para a saúde pública
(Almeida, 2000; Departament for..., 2000; James, 2000). Répteis de vida livre bem
como domesticados têm sido demonstrados como reservatórios de Salmonella.
Estes animais podem portar o agente sem demonstrar qualquer sinal clínico (Geue;
Löschner, 2003).
Na primeira análise para a detecção de Salmonella em teiús, 86,67% das
amostras analisadas foram consideradas positivas para Salmonella enterica subsp.
enterica, discordando de Brenner et al. (2000) que descreveu que a subespécie
enterica é comumente encontrada em animais de sangue-quente e que as demais
subespécies em animais de sangue-frio, como os répteis. Todas as baias
apresentaram pelo menos um animal positivo e todos os animais negativos estavam
em baias diferentes (Tabela 4).
54
Tabela 5. Correlação entre os sorotipos de Salmonella enterica encontrados e a idade e baias dos animais analisados
1ª análise 2a análise Baia Idade(anos)
Positivas/Total de animais
Positivas/Total de animais
Sorotipos encontrados
1 2 1/1 0/1 S. Rubislaw e S. Infantis
2 2 2/2a 2/2 S. Rubislaw, S. I (O:6,7:-:1,5) e S. Infantis
3 2 4/5b 3/4 S. I (O:6,14,24:y:-) e S. Carrau
4 3 1/1 1/1 S. Rubislaw
5 3-5 6/6 6/6 S. Rubislaw e S. Agona
6 3-5 4/5 3/3
S. Carrau, S. Saintpaul, S. Brandenburg e Salmonella sp. (Rugosa)
7 5 2/3b 3/3
S. Rubislaw, Salmonella sp. (Rugosa) e S. Saintpaul
8 5 4/5 4/5 S. Rubislaw, S. I (O:6,14,24), S. Agona e S. Carrau
9 6 1/1c 0/1 S. Panama (02 cepas díferentes)
10 6 1/1d 0/1 S. Rubislaw (03 cepas diferentes)
Total positivo/ Total de animais
26/30 22/27 Total de Sorotipos: 09
aUm animal portador de dois sorotipos diferentes (S. I (O:6,7:-:1,5) e S.Rubislaw) e duas cepas diferentes do sorotipo Rubislaw; bUm animal portador de dois sorotipos diterentes, Baia 3- S. Carrau e S. I (O:6,14,24:y:-) e Baia 7- S. Saintpaul e Salmonella sp. 'Rugosa'; cAnimal portador de duas cepas diferentes do mesmo sorotipo; dAnimal portador de três cepas diferentes do mesmo sorotipo.
Na segunda coleta, foram repetidas as análises de amostras de 27 animais.
Mesmo com a introdução da limpeza semanal das baias, 81,48% foram
consideradas positivos para Salmonella enterica e os quatro animais negativos da
55
primeira análise foram considerados positivos, enquanto que outros cinco
mostraram-se negativos, concordando com o estudo de Weil et aI. (1995), que
observaram o fato de que a Salmonella não é liberada em todas as coletas de fezes,
apesar de colonizar normalmente o trato intestinal destes animais, levando a um alto
número de diagnósticos falso-negativos e mascarando a real prevalência da
SalmoneIla nestes animais. Pode-se inferir portanto, que 100% dos teiús analisados
são portadores dessa bactéria, já que, foram isoladas de todos os animais em um
curto período de tempo. Apesar da limpeza semanal das baias não ter surtido o
efeito esperado, esta prática não deve ser descartada pois pode diminuir o risco de
infecção por parte dos tratadores.
Não houve diferença significativa entre a prevalência de Salmonella da
primeira para segunda análise (p>0,01).
4.2. Sorotipagem
É crescente o número de infecções humanas causadas por sorotipos raros de
Salmonella. A sorotipagem representa um importante instrumento epidemiológico
que permite avaliar a prevalência de determinados sorotipos, e auxiliar num possível
programa de controle de salmoneloses. As amostras positivas da primeira análise
foram enviadas a Fiocruz-RJ para a realização da sorotipagem. Um total de nove
diferentes sorotipos de Salmonella enterica foram encontrados, dos quais 23,33%
representam a Salmonella Rubislaw; 20% S. Carrau e S. Agona; 6,67% S. Infantis,
S. Saintpaul e a cepa rugosa e 3,33% S. Panama, S. Brandenburg, S. I (O:6,14,24),
56
S. I (O:6,14,24:y:-) e S. I (O:6,7:-:1,5) (Figura 14). Estes resultados se opõem aos
resultados descritos por Sá e Solari (2001) que, em estudos realizados com répteis
no Brasil, não isolaram nenhum dos sorotipos encontrados no presente estudo. Aqui,
sugerimos fortemente a ocorrência de variação geográfica na distribuição dos
sorotipos de Salmonella spp (Gutiérrez-Cogco et al., 2000).
Figura 14 - Prevalência dos Sorotipos de Salmonella enterica encontrados nos 26 animais positivos da 1° análise.
Das 26 amostras positivas na primeira coleta, 30 cepas diferentes de
Salmonella foram encontradas, onde três animais apresentaram dois sorotipos
3% 3% 3%
3%
3%
7%
7%
7%20%
24%
20%
S. enterica (O:6,14,24) S. enterica (O:6,14,24:y:-) S. enterica (O:6,7:-:1,5)
S. Brandenburg
S. Panama
Salmonella. sp. - Rugosa
S. Saintpaul S. Infantis
S. Agona S. Carrau
S. Rubislaw
57
diferentes (Tabela 4). Algumas vezes, mais de um sorotipo podem ser encontrados
simultaneamente no mesmo animal (Corrente et al., 2004; Pasmans et al.; 2005),
muitos destes são chamados raros ou exóticos. A maioria dos sorotipos de
Salmonella, isolados de répteis, associados com a salmonelose humana são da
subspécie enterica (Headrick et al., 2001; Olsen et al., 2001; Laidlaw, 2003). Estes
dados corroboram nossos resultados onde todos os sorotipos encontrados nos teiús
são da subespécie I (enterica), que é a que possui maior capacidade invasiva de
acordo com Pasmans et al. (2005), e todos eles têm sido isolados de fontes
humanas, alimentares e ambientais (Rheault; Quessy, 1999; Jakabi et al., 1999;
Gutiérrez-Cogco et al., 2000; Mitchel; Shane, 2000; Cox et al., 2002; Geue;
Löschner, 2002).
Dos 30 teiús analisados oito eram jovens, apresentando idade entre 0 e 2
anos (baias 1-3), onde sete (87,5%) foram considerados positivos para Salmonella.
Dos 19 animais maiores de 3 anos (baias 5-10), 16 (84,2%) foram considerados
positivos (Tabela 4).
O sorotipo mais frequente entre os animais jovens foi S. Carrau com 57,14%
e entre os animais adultos foi a S. Agona com 27,27% do total encontrado. O
sorotipo Rubislaw foi amplamente distribuído entre as idades (Tabela 4).
Os sorotipos Rubislaw e Carrau foram isolados de cães da região de Ilhéus
(Maciel et al., 2004), sugerindo que estes sorotipos devem ser endêmicos dessa
região. A S. Rubislaw também foi associada a infecções humanas associadas com
répteis no Canadá e nos Estados Unidos, ocorrendo casos de meningites fatais em
crianças (Van der Wolf, 1999; Epidemiology section, 1999; Fatal neonatal..., 2000). A
S. Infantis e S. Saintpaul estão entre os cinco sorotipos mais prevalentes no Japão e
Finlândia (Pelkonen et al., 1994; Hamada et al., 2003; Hata et al., 2003) e a S.
58
Agona entre os cinco mais prevalentes sorotipos em São Paulo, Brasil (Tavechio et
al., 2002). A S. Saintpaul, S. Carrau e S. Panama também têm sido descritas como
causas de infecções humanas associadas com répteis (Weil et al., 1995; Olsen et
al., 2001; Geue; Löschner, 2002). Enquanto que, a S. Brandenburg tem sido
associada à ocorrência de abortos em pequenos ruminantes, causando prejuízos
econômicos aos criadores (Surveillance report, 2002).
Alimentos de origem animal constituem um dos principais responsáveis por
casos de salmonelose humana, entre eles ovos, carne e derivados (Lírio et al.,
1998). A carne de várias espécies de répteis são utilizadas para consumo humano, a
qual se não adequadamente manipulada e processada, traz grande risco a saúde
pública (Weil et al., 1995; Gonzales et al., 1999). A S. Saintpaul, S. Brandenburg e a
S. Infantis têm sido isoladas de matadouros e amostras de carne (Rheault; Quessy,
1999; James, 2000), demonstrando a necessidade de programas rigorosos de
higiene nos locais que lidam com esse tipo de alimento.
4.3. Antibiograma
Cepas de Salmonella resistentes a múltiplas drogas têm emergido (Cordano;
Virgílio, 1996; Davis et al., 2002; Zhao et al., 2003). O teste de sensibilidade a
antibióticos realizado com as cepas de Salmonella isoladas dos teiús revelou a
Gentamicina e Ampicilina como sendo as drogas mais potentes in vitro, e a
sulfonamida foi o antibiótico com maior nível de resistência (83%) (Tabela 5),
concordando com os dados de Corrente et al. (2004). Entretanto, a Gentamicina não
59
é comumente usado para tratamento de infecções intestinais. Dos sorotipos
encontrados a S. Carrau, S. Rubislaw e S. Infantes foram as que apresentaram
maior resistência aos antibióticos, onde a S. Carrau foi a única que apresentou
resistência a tetraciclina, e a S. Rubislaw e S. Infantes foram as únicas que
apresentaram resistência ao cloranfenicol (Tabela 5). Pasmans et al. (2005)
identificaram dois sorotipos isolados de répteis resistentes a Nitrofurantoin e dois
isolados de humanos, um resistente a Ampicilina e Espectiomicina, e outro a
Sulfonamida. Também relataram que existe uma tendência em isolados de humanos
possuírem maior resistência a antibióticos do que isolados de répteis. Assim, uma
possível causa da grande taxa de resistência encontrada em isolados de teiús é a
pressão antropogênica que estes animais sofrem no cativeiro
Foi observado que um animal da baia dois era portador de duas cepas
diferentes de S. Rubislaw, uma sensível e outra resistente ao cloranfenicol. O animal
da baia nove era portador de duas cepas diferentes de S. Panama, uma com
resistência à estreptomicina e com resistência intermediária à tetraciclina e outra
com resistência intermediária à estreptomicina e sensível à tetraciclina. O animal da
baia dez era portador de três cepas diferentes da S. Rubislaw, uma resistente à
estreptomicina e das outras duas, uma possuía resistência intermediária e a outra
era sensível à tetraciclina (Tabela 5). Esses resultados sugerem que genes de
resistência a antibióticos estejam sendo transferidos lateralmente entre as cepas, o
que representa um dado importante quanto à variabilidade genética entre
microrganismos de mesma sorotipagem e quanto à importância da realização do
antibiograma para um direcionamento específico de tratamentos. Ainda, concordam
com Blake et al. (2003) que notificaram a transferência de genes de resistência entre
enterobactérias em condições intestinais e com Hamada et al. (2002) que
60
comprovaram esta transferência entre a S. Typhimurium e S. Infantis. A única forma
de limitar a transmissão de características de resistência é diminuir a prevalência de
bactérias resistentes e, mais diretamente, controlar a prescrição e utilização de
antibióticos. Como o tratamento de répteis com antibióticos não é viável para
eliminar a bactéria de seu intestino, boas práticas de higiene são recomendadas
para os donos de répteis e o pessoal envolvido em criações para diminuir o risco de
infecção.
Tabela 6. Padrões de resistência a antibióticos dos sorotipos de Salmonella enterica isoladas de 30 teiús
Antibiótico
Sorotipos
Gentamicina Estreptomicina Tetraciclina Ampicilina Sulfonamida Cloranfenicol
S. Infantis S I/R S/I S R S/R
S. I (O:6,14,24:y:-) S S S S R S
S. I (O:6,14,24) S S I S R S
S. I (O:6,7:-:1,5) S R I S S S
S. Agona S R S/I S R S
S. Carrau S S/R S/R S R S
S. Rubislaw S I/R S/I S S/R S/R
S. Saintpaul S R S S R S
S. Brandenburg S R S S R S
S. Panama S I/R S/I S R S Salmonella sp. (Rugosa)
S R S/I S R S
Percentual (%)
S (Sensível) 100 20 53 100 17 85
I (Intermedíário) - 20 41 - - -
R (Resistente) - 60 6 - 83 15
61
4.4. Caracterização Molecular
Diversas características morfológicas, bioquímicas, sorológicas e genéticas
têm sido utilizadas na identificação e diferenciação da Salmonella. Intervenções
clínicas e de saúde pública dependem da rápida e apurada identificação de
bactérias patogênicas. A PCR, utilizando os iniciadores específicos ST11-ST15, tem
demonstrado ser mais sensível e específica do que os métodos tradicionais na
identificação de Salmonella (Argôlo, 2004). Antes da PCR é necessária a extração
do DNA, principalmente quando se trabalha com comunidades complexas. A PCR
realizada a partir de culturas puras com posterior utilização na DGGE atesta o grau
de pureza das linhagens além de possibilitar a distinção de linhagens com diferentes
sequências no DNA.
Todos os iniciadores, ST11GC-ST15, F357GC-R518 e F984GC-R1378,
anelaram eficientemente no cromossomo da Salmonella pela PCR, gerando
produtos compatíveis com a DGGE de 469 pb, 200pb e 473 pb, respectivamente
(Figura 15). Segundo Clarridge III (2004), fragmentos de DNA com 500 a 1500 pb
são comuns para sequenciamento e comparações em bancos de dados.
62
469pb
473pb
Figura 15. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR das amostras dos teiús e serpentes, (A) utilizando os iniciadores ST11GC-ST15 (469 pb) ; (B) iniciadores F357GC-R518 (200 pb) e (C) iniciadores F984GC-R1378 (473 pb); 1, Marcador de peso molecular pGEM®
(Promega); Isolados dos Teiús: 2, Salmonella Carrau; 3, S. Rubislaw; 4, S. Agona; 5, S. Infantis; 6, S. Saintpaul; 7, S. Panama; 8, S. Brandenburg; 9, S. I (O:6,14,24); 10, S. I (O:6,7:-:1,5); 11, S. I (O:6,14,24:y:-); 12, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 13, Salmonella sp. ‘Rugosa’; Isolados de serpentes: 14, S. Gaminara ; 15, S. Newport; 16, S. IV (O:61:c:1,5); 17, S. IIIb (O:47); 18, S. I (O:4,5:b:-); 19, S. I (O:4,5); 20, S. I (O:11:r:-).
C
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
200pb
B
63
A DGGE talvez seja a técnica molecular mais comumente utilizada para
análise de comunidades microbianas sem a necessidade de cultivo, pois consegue
aliar a grande quantidade de informação contida no genoma microbiano com a
facilidade e baixo custo de uma eletroforese para obter o perfil de comunidades
complexas. Com a sua utilização foi possível identificar microrganismos não-
cultiváveis ou ainda as variações presentes entre organismos de mesma espécie
(Muyzer et al. 1993). A PCR-DGGE pode ser usada para detectar as diferenças
dentro dos genes de importância tecnológica, para monitoramento de espécies de
interesse alimentar e clínico e também para diferenciar cepas que pertencem à
mesma espécie. Neste caso, as principais áreas de atuação da PCR-DGGE são a
taxonomia e a aplicação tecnológica e clínica.
As bandas na DGGE podem ser reveladas por brometo de etídio ou SYBR
green. Entretanto, o procedimento mais sensível é com nitrato de prata, mas,
corados desta forma, os géis não podem ser usados para experimentos de
hibridização e DNA fita-simples também é corado dificultando a análise do perfil das
bandas (Ercollini, 2004). O SYBR safe, utilizado neste estudo, tem surgido como
uma nova alternativa para a visualização de géis de DGGE, obtendo melhores
resoluções que o brometo de etídio, além de não trazer riscos à saúde (MIT, 2006).
A DGGE demonstrou uma boa resolução com a utilização do protocolo
segundo Sigler et al. (2004), que identificaram o tempo de 5h a 200V como sendo o
melhor para a obtenção de uma melhor separação das bandas no gel. Estes
mesmos autores perceberam que longos períodos de eletroforese acabam por
instabilizar o gradiente desnaturante, causando a perda da capacidade em separar
as bandas no gel de acordo com sua sequência nucleotídica. Assim, um menor
tempo é indicado para a DGGE, aumentando seu poder de separação das bandas.
64
A DGGE demonstrou pouca eficiência na separação das bandas dos produtos
de PCR gerados pelos três pares de iniciadores. Com os iniciadores ST11GC-ST15,
que amplificaram eficientemente parte da região JEO402-1 específica para
Salmonella, somente as cepas rugosas puderam ser diferenciadas das demais, mas
não entre si. Com os iniciadores F357GC-R518 somente uma cepa ‘Rugosa’ e o
sorogrupo (O:11:r:-) puderam ser diferenciados. Com os produtos de amplificação
dos iniciadores F984GC-R1378 também não foi possível diferenciar as salmonelas
em nível de sorotipo, mas podemos formar 4 grupos de similaridade (Figura 16;
Tabela 6). Também não foi possível a separação das subspécies encontradas,
ficando as subspécies diarizonae e houtenae em grupos onde a subespécie enterica
também faz parte (Tabela 6). Essa pouca diferenciação pode ser explicada pelo,
suposto, alto nível de similaridade das regiões amplificadas entre as diferentes
subespécies e sorotipos de Salmonella. Outro fator que pode ter causado isto é a
co-migração de fragmentos do DNA, mesmo possuindo diferentes sequências
alguns fragmentos se comportam de maneira similar no gel, o que é um problema
para a obtenção de bandas individuais (Muyzer; Smalla, 1998). Melhores
discriminações podem ser obtidas com a utilização de iniciadores para regiões mais
variáveis, como a região ITS ou 23S, que têm conseguido satisfatoriamente
distinguir espécies de Mycobcterium e Streptococcus (Clarridge III, 2004).
Apesar da pouca eficiência na separação das cepas de Salmonella, diversos
pesquisadores têm demonstrado a capacidade da DGGE em diferenciar bactérias
nos mais variados ecossistemas. Ercolini (2004) e McAuliffe et al. (2005)
descreveram a capacidade da PCR-DGGE em identificar bactérias ácido-láticas e
Mycoplasmas, respectivamente, por meio da amplificação da região V3 do DNAr
16S. Pepe et al. (2003) conseguiram identificar membros do gênero Bacillus ao nível
65
de espécie e Cocolin et al. (2002) diferenciaram ao nível de sorotipo algumas
espécies de Listeria.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Figura 16. DGGE dos produtos da PCR, (A) utilizando os iniciadores ST11GC-; (B) iniciadores F357GC-R518 e (C) iniciadores F984GC-R1378; Isolados dos Teiús: 1, Salmonella sp. ‘Rugosa’; 2, S. I (O:6,14,24:y:-); 3, S. Rubislaw; 4, S. Panama; 5, S. I (O:6,7:-:1,5); 6, S. Infantis; 7, S. Agona; 8, S. Brandenburg; 9, S. I (O:6,14,24); 10, S. Carrau; 11, S. Saintpaul; 12, Salmonella sp. ‘Rugosa’; Isolados de serpentes: 13, S. Newport; 14, S. I (O:11:r:-); 15, S. IV (O:61:c:1,5); 16, S. Gaminara ; 17, S. I (O:4,5:b:-); 18, S. IIIb (O:47); 19, S. I (O:4,5).
A
C
4 1 4 3 4 3 2 2 3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 B
66
Tabela 7. Grupos de similaridade gerados a partir da DGGE da região V6-V8 do 16S RNAr
Grupo Sorotipos 1 S. Brandenburg
2 S. Gaminara
S. IIIb (O:47)
3
S. I (O:6,14,24)
S. Newport
S. IV (O:61:c:1,5)
S. I (O:4,5)
S. I (O:11:r:-)
4
Salmonella sp. ‘Rugosa’
Salmonella sp. ‘Rugosa’
S. I (O:6,14,24:y:-)
S. Carrau
S. Infantis
S. Saintpaul
S. Agona
S. Rubislaw
S. Panama
S. IV (O:61:c:1,5)
S. I (O:4,5:b:-)
A região ITS do DNAr tem sido utilizada associada à DGGE como uma opção
para se conseguir diferenciar microrganismos ao nível de subspécie e sorotipo, por
esta região possuir sequências tanto conservadas como hipervariáveis (Leblond-
Bourget et al., 1996). Buchana et al. (2001) identificaram a grande diversidade intra-
específica da E. coli utilizando esta região e Park e Kilbane II (2005) conseguiram
diferenciar variedades de Streptomyces mais eficientemente com a região ITS do
que com a 16S DNAr.
Contrariando a alta sensibilidade deste método, algumas espécies distintas
mostraram posição de bandas similar na DGGE, como relatado em outros estudos
67
de PCR-DGGE (Tacão et al., 2005; Yergeau et al., 2005). Apesar de possuir
resolução máxima de 1 pb entre fragmentos de DNA (Fischer; Lerman, 1983), este
poder de separação depende do tamanho e da sequência dos produtos amplificados
pela PCR. Assim, fragmentos obtidos de espécies diferentes com diferentes
sequências entre si podem migrar de forma similar, tomando a mesma posição no
gel (Muyzer et al., 1993; McAuliffe et al., 2005). Esta limitação somente poderá ser
solucionada com a ecisão da banda para o sequenciamento.
Como relatado anteriormente, foram encontrados mais de um sorotipo em
alguns animais. Mas, este dado pode ter sido mascarado devido a subjetividade do
diagnóstico microbiológico. Além disso, algumas cepas de Salmonella não podem
ser identificadas pelos métodos tradicionais (Rugosa e Mucóide). A capacidade da
DGGE em diferenciar espécies poderia evitar estes tipos de problemas.
68
5. CONCLUSÕES
• Os teiús representam um importante reservatório de sorotipos raros de
Salmonella e que ocorrem diferentes padrões de sensibilidade a antibióticos
entre eles.
• É fundamental que as autoridades sanitárias promovam campanhas educativas e
incentivem a notificação dos casos ocorridos para uma melhor atuação da
vigilância sanitária no controle dessa doença.
• Rápidos e sensíveis métodos diagnósticos se fazem necessários para assegurar
um eficiente combate à doença. A medida que os recursos técnicos aumentam,
os custos laboratoriais diminuem, tornando os preços destes tipos de
diagnósticos mais competitivos.
• A tipagem da Salmonella baseada na PCR-DGGE utilizando os iniciadores ST11-
ST15, F357-R518 e F984-R1378 não alcançou níveis de subspécie ou sorotipo.
Apesar disto, novas pesquisas devem ser realizadas com regiões mais variáveis
do cromossomo da Salmonella, pois esta técnica tem um grande poder
discriminatório, sendo uma poderosa e promissora ferramenta na identificação de
organismos, sem a necessidade de meios específicos e metodologias laboriosas
para a identificação.
69
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ANEXO
Anexo A – Artigo intitulado: “Prevalence, serotype and antibiotic sensitivity of Salmonella spp. isolated in a population of captive tegus (Tupinambis merianae)”. Submetido para publicação pelo periódico Research in Veterinary Science.