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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

AMANDA TEIXEIRA MESQUITA

ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM 16 ESPÉCIES

PERTENCENTES À FAMÍLIA SOLANACEAE JUSS.

CHROMOSOMAL STUDIES IN 16 SPECIES BELONGING TO

THE FAMILY SOLANACEAE JUSS.

CAMPINAS

2016

AMANDA TEIXEIRA MESQUITA

ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM 16 ESPÉCIES

PERTENCENTES À FAMÍLIA SOLANACEAE JUSS.

CHROMOSOMAL STUDIES IN 16 SPECIES BELONGING TO

THE FAMILY SOLANACEAE JUSS.

Dissertação apresentada ao Instituto de

Biologia da Universidade Estadual de

Campinas como parte dos requisitos exigidos

para a obtenção do Título de Mestra em

Biologia Vegetal.

ORIENTADORA: ELIANA REGINA FORNI MARTINS

COORIENTADORA: MARÍA VICTORIA ROMERO DA CRUZ

CAMPINAS

2016

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA

PELA ALUNA AMANDA TEIXEIRA MESQUITA E

ORIENTADA PELO PROFA. DRA. ELIANA

REGINA FORNI MARTINS.

Campinas, 17 de fevereiro de 2016

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Eliana Regina Forni Martins

Profa. Dra. Giovana Augusta Torres

Prof. Dr. André Olmos Simões

Prof. Dr. João Semir

Prof. Dr. Ricardo Augusto Lombello

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa,

que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

Aos meus pais, Edilson e Isabel,

sinônimos de coragem e determinação,

dedico.

AGRADECIMENTOS

O ingresso na pós-graduação foi para mim, mais uma etapa para a realização do sonho de uma

criança curiosa, que queria ser cientista, pesquisadora e com igual entusiasmo, uma docente.

Desde o primeiro dia como mestranda aqui na Instituição, tive o prazer de conviver com

pesquisadores incríveis já consolidados e também com aqueles que, assim como eu estão no

processo de formação como acadêmicos. Tudo isso, foi uma motivação, fazendo com que esse

percurso fosse muito prazeroso.

Por isso, tenho muito a agradecer à Unicamp pela oportunidade, ao Programa de pós-graduação

em Biologia Vegetal e ao Laboratório de Biossistemática e Polinização, por fornecer todos os

subsídios necessários à minha formação.

Agradeço também ao Cnpq pela concessão da bolsa de estudos que possibilitou a condução

dessa pesquisa.

Agradeço imensamente à minha orientadora, Profa. Dra. Eliana Regina Forni Martins, por ter

confiado no meu trabalho desde o início e apoiado minhas aspirações. Agradeço pelos

ensinamentos compartilhados, pelas longas conversas sobre o fantástico mundo dos

cromossomos, a atenção dada em todos os momentos e pela paciência acima de tudo. Sua

postura e dedicação com a pesquisa e docência, são um grande exemplo que quero levar para o

resto da vida!

Agradeço também à minha coorientadora Dra. Maria Victoria Romero da Cruz, por me

apresentar às Solanaceae e instigar a minha paixão por elas! Agradeço por direcionar meu

trabalho desde o primeiro dia de mestrado e ensinar pacientemente todas as técnicas utilizadas

no desenvolvimento dessa pesquisa. Além de tudo agradeço pela amizade, conselhos e grande

exemplo de dedicação profissional!

Agradeço aos professores pela troca de experiência e por compartilhar seus conhecimentos que

só os longos anos de pesquisa, campo e docência podem proporcionar. Não posso me esquecer

também de todos os funcionários do departamento que, com desempenho de suas funções na

Instituição contribuíram para a realização desse trabalho, em especial agradeço à secretária do

programa Maria Roseli.

Ao Marcelo Monge e ao Prof. Dr. João Vascocellos Neto agradeço pela ajuda no envio de frutos

e sementes.

Agradeço aos membros da minha banca de qualificação e pré banca, Profa. Dra. Eliane

Kaltchuk dos Santos, Prof. Dr. João Semir, Dra. Luana Olinda Tacuatiá, Prof. Dra. Lisete

Chamma Davide e Profa. Dra. Giovana Augusta Torres, pelas valiosas contribuições para a

finalização desse trabalho.

Agradeço também, à toda equipe do Laboratório de Citogenética da Universidade Federal de

Lavras, pela ajuda concedida em vários momentos no decorrer no desenvolvimento da minha

pesquisa.

Agradeço aos meus queridos amigos de laboratório de Biossistemática: João, Luana, Vic,

Raquel, Rafael e Thaíssa. Cada um com suas qualidades e particularidaes, foram amigos,

conselheiros e companheiros! Acima de tudo, se tornaram parte da minha família em Campinas,

e fizeram os meus dias mais felizes dentro e fora do laboratório.

Aos colegas de pós-graduação, agradeço pela ótima convivência, troca de experiências e longas

conversas que de fato despertaramem mim, a paixão pela botânica!

Agradeço também, às minhas amigas da Casamarela por serem mais uma parte da minha família

em Campinas, ajudando assim a conviver melhor com a saudade de casa.

Aos meus pais, Edilson e Isabel, maiores exemplos de vida que eu poderia ter, agradeço pelo

otimismo que me faz tentar perceber a melhor parte de todas as situações, mesmo as mais

adversas. Por acreditarem e me fazer acreditar na capacidade de realizar todos os meus sonhos!

Agradeço o apoio, a confiança e, acima de tudo pelo nosso lar sempre receptivo nas minhas

voltas pra casa!

Aos meus irmãos, Lucas e Marco Tulio, agradeço à amizade que nos une, o companheirismo e

os momentos tão divertidos que partilhamaos ao longo desses anos!

Ao Murilo, grande incentivador dos meus sonhos, por ser grande parte do que falta em mim,

principalmente calma e paciência. Agradeço pelos nossos momentos e pela cumplicidade, por

viver comigo mesmo que à distância, essa etapa tão importante para a minha formação, se

interessando pelo meu trabalho e apoiando as minhas idéias. Te amo!

Aos meus familiares, agradeço pelo carinho, torcida e orações.

Ao Claudio, Elenice e família, agradeço pela receptividade e hospitalidade, pelos momentos

tão incríveis que fizeram com eu me sentisse parte da família de vocês!

Por fim, agradeço às muitas outras pessoas que partilharam comigo vários momentos durante

essa etapa, que de alguma forma contribuíram para a realização desse sonho, cujos nomes não

cabem aqui, mas estarão para sempre em minha memória e no meu coração!

RESUMO

A família Solanaceae Juss. é uma das mais representativas entre as angiospermas, reunindo

cerca de 2.500 espécies e 100 gêneros. Possui ampla distribuição geográfica, com maior

diversidade em regiões neotropicais. O uso da citogenética clássica e molecular vem sendo

amplamente documentado em alguns grupos da família, mas ainda existem muitas espécies e

gêneros ainda não caracterizadas citogeneticamente. O presente trabalho apresenta estudos

cromossômicos em 16 espécies de Solanaceae dos gêneros Acnistus Schott, Brunfelsia L.,

Cestrum L., Physalis L. e Solanum L., objetivando fornecer subsídios taxonômicos e

evolutivos. Foram elaborados cariótipos, incluindo bandamento CMA/DAPI e hibridização in

situ (DNAr 18S e 5S), e calculadas a assimetria cariotípica e a proporção de heterocromatina

em relação ao comprimento total do lote haploide (CTLH). Acnistus arborescens Schltdl., P.

pubescens L. e todos os representantes de Solanum apresentaram número cromossômico 2n=24,

ao passo que Brunfelsia uniflora D. Dom, 2n=22 e Cestrum laevigatum Schltdl.e C. mariuitense

Kunth, 2n=16. Foi observada constância de número cromossômico em cada gênero e

predominância de cromossomos metacêntricos. Exceções à simetria cariotípica ocorreram em

P. pubescens, S. acerifolium Humb. & Bonpl. ex Dunal, S. concinnum Schott ex Sendtn., S.

inodorum Vell. e S. palinacanthum Dunal. O bandamento cromossômico evidenciou padrões

distintos de distribuição de heterocromatina entre as espécies estudadas, CMA+/DAPI-,

CMA+/DAPI0, CMA+/DAPI+, CMA-/DAPI+, CMA0/DAPI+, nas posições terminais,

intercalares e associadas à NOR. A proporção da heterocromatina no complemento

cromossômico não está relacionada ao aumento do CTLH. Foi observada diferenciação na

distribuição das sequências de DNAr entre os cinco gêneros. As espécies de Solanum e Acnistus

possuem um par cromossômico que porta um sítio de DNAr 18S na região terminal do braço

curto, coincidente com regiões CMA+, diferentemente de Physalis e Cestrum que apresentam

dois locos. Em B. uniflora o sítio ocorre na região pericentromérica e Solanum inodorum

diferenciou-se por apresentar dispersão de DNAr 18S (18 locus). O sítio de DNAr 5S mostrou-

se presente em regiões intersticiais do braço curto em A. arborescens, B. uniflora e na maioria

dos representantes de Solanum, exceto em S. diploconos (Mart.) Bohs, (região

pericentromérica). Solanum acerifolium e S. flaccidum apresentam um segundo locus ocupando

a posição terminal e pericentromérica do braço curto, respectivamente. Em P. pubescens o sítio

de DNAr 5S ocorre na posição terminal do braço curto de um par cromossômico, em C.

laevigatum na região pericentromérica do braço longo e Cestrum intermedium possui dois sítios

na região pericentromérica do braço longo. Os resultados obtidos mostram que apesar da

uniformidade em alguns caracteres cariotípicos presente na família, as diferenças na

distribuição de heterocromatina e DNAr podem ser úteis na separação dos cinco gêneros e na

melhor compreensão das tendências evolutivas em Solanaceae. No gênero Solanum,

considerado megadiverso, as características cariotípicas distintas encontradas em S. diploconos,

o tamanho cromossômico e o padrão de bandas heterocromáticas, podem reforçar a

consideração dessa espécie (e outras relacionadas) como um gênero à parte (Cyphomandra).

As diferenças encontradas também nas outras espécies podem auxiliar no entendimento da

diversidade morfológica e ecológica presente em Solanum.

Palavras chave: Acnistus, Brunfelsia, Cestrum, Physalis, Solanum, números cromossômicos,

bandamento CMA/DAPI, FISH (DNAr).

ABSTRACT

The family Solanaceae Juss. is one of the most representative among the angiosperms,

comprising around 2,500 species and 100 genus. It has a broad geographic distribution, with

greatest diversity in neotropical regions. The use of classical and molecular cytogenetics has

been widely documented in some family groups, but there are many species and genus not

characterized cytogenetically yet. This work presents chromosomal studies in 16 Solanaceae

species belonging to the genus Acnistus Schott, L. Brunfelsia L., Cestrum L., Physalis L. and

Solanum L., and aims to provide taxonomic and evolutionary subsidies. Fluorescence banding

(CMA/DAPI) and ribosomal DNA mapping (rDNA 5S and 18S) data were used for karyotype

description. The karyotype asymmetry and the proportion of heterochromatin of the total length

of the haploid lot (CTLH) were calculated. Acnistus arborescens Schltdl., P. pubescens L. and

all Solanum species studies here showed chromosome number 2n= 24, while Brunfelsia uniflora

D. Dom presented 2n= 22 and Cestrum laevigatum Schltdl. e C. mariuitense Kunth 2n= 16.

The chromosome number was regular in each genus with predominance of metacentric

chromosomes. Exceptions in karyotype symmetry were observed in P. pubescens, S.

acerifolium Humb. & Bonpl. ex Dunal, S. concinnum Schott ex Sendtn., S. inodorum Vell. and

S. palinacanthum Dunal. Flurescence banding showed distinct patterns of heterochromatin

distribution among some species (CMA+/ DAPI-, CMA+/ DAPI0, CMA+/ DAPI+, CMA-/ DAPI

+, CMA0/ DAPI+) at positions (terminal, interstial position, and NOR associated). The amount

of heterochromatin present in chromosome complement is not related to CTLH increased.

Differentiation in the distribution of rDNA sequences was observed between the five genus.

The species of Solanum and Acnistus have a chromosome pair that carries one 18S rDNA site

in the terminal position of the short arm, coincident with CMA+ regions, while Physalis and

Cestrum presented two loci. Brunfelsia uniflora, presented one site at the pericentromeric

region while Solanum inodorum presented dispersion of 18S rDNA (18 loci). The 5S rDNA

site was observed in interstitial region of the short arm of A. arborescens, B. uniflora and in

most of the species of Solanum, except in S. diploconos (Mart.) Bohs (pericentromeric region).

Solanum acerifolium and S. flaccidum have a second site in terminal and pericentromeric

position of the short arm, respectively. In P. pubescens the 5S rDNA site occurs in the terminal

position of the short arm of a chromosome pair, in C. laevigatum in the pericentromeric region

of the long arm and Cestrum intermedium has two sites in the pericentromeric region of the

long arm. Although the uniformity in some karyotypic characters present in the family, the

results show that, the differences in the distribution of repetitive DNA and rDNA may be useful

in the genusidentification and better understanding of the evolutionary trends in Solanaceae. In

the genus Solanum, considered megadiverse, the karyotypic features found in S. diploconos

(chromosomal size and heterochromatin band pattern) can strengthen the consideration of this

species (and other related) as an apart genus (Cyphomandra). Differences also found in other

species may help to understand the morphological and ecological diversity present in Solanum.

Keywords: Acnistus, Brunfelsia, Cestrum, Physalis, Solanum, chromosome numbers, CMA /

DAPI banding, FISH (rDNA).

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

INTRODUÇÃO GERAL

Figura 1. Cladograma da Ordem Solanales (Angiosperm Phylogeny Website, versão 12,

novembro de 2015) ..................................................................................................................16

Figura 2. Relações filogenéticas entre os maiores clados em Solanaceae. Modificado de

Särkinen et al. (2013) ...............................................................................................................18

Figura 3: Acnistus arborescens. A: detalhe das flores; B: aspecto geral do ramo fértil, C: vista

geral dos ramos ........................................................................................................................26

Figura 4. Brunfelsia uniflora. A, B: detalhe das flores; C: detalhe dos frutos, D: vista geral do

hábito ........................................................................................................................................27

Figura 5: C. mariquitense (A e B), C. laevigatum (C e D). A: detalhe das flores; B, C: Detalhe

dos frutos; D: vista geral do hábito ..........................................................................................28

Figura 6: Physalis pubescens. A, B: detalhe das flores; C: vista geral do hábito; D: detalhe do

fruto ..........................................................................................................................................29

Figura 7: Solanum pseudocapsicum (A e B), S. palinacanthum (C e D). A, B, C: detalhe da

flor; D: detalhe do fruto ...........................................................................................................30

ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM 16 ESPÉCIES DE SOLANACEAE: NÚMERO,

TAMANHO E MORFOLOGIA DOS CROMOSSOMOS, BANDAMENTO CMA/DAPI

E FISH

Figura 1. Representação gráfica da análise de variância do comprimento total do lote haploide

(CTLH) das espécies de Solanaceae estudadas. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P-

Physalis e S-Solanum ................................................................................................................47

Figura 2. Representação gráfica da variância da quantidade de heterocromatina evidenciada por

bandamento CMA/DAPI das espécies de Solanaceae estudadas. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C-

Cestrum, P-Physalis e S-Solanum .............................................................................................53

Figura 3: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em

Acnistus arborescens. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de

DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm.}, par

heteromórfico ...........................................................................................................................57


Brunfelsia uniflora. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de

DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm

...................................................................................................................................................58


Cestrum laevigatum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de


heteromórfico ...........................................................................................................................59


Cestrum mariquitensse. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de


heteromórfico ...........................................................................................................................60


Physalis pubescens. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de

DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm .............61


Solanum acerifolium. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de



Solanum adspersum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de



Solanum concinnum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de



Solanum diploconos. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de



Solanum flaccidum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de


...................................................................................................................................................66


Solanum inodorum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de


heteromórfico ...........................................................................................................................67


Solanum palinacanthum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de


...................................................................................................................................................68


Solanum pseudocapsicum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas

de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm .........69


Solanum sanctae-catharinae. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com

sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm

...................................................................................................................................................70


Solanum scuticum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr

5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ........................71


Solanum variabile. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr

5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ........................72

Figura 19. Relações filogenéticas em Solanum. Modificado de Särkinen et al. (2013) ..........77

LISTA DE TABELAS

INTRODUÇÃO GERAL

Tabela 1. Maiores gêneros em número de espécies da família Solanaceae ................................17

ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM 16 ESPÉCIES DE SOLANACEAE: NÚMERO,

TAMANHO E MORFOLOGIA DOS CROMOSSOMOS, BANDAMENTO CMA/DAPI

E FISH

Tabela 1. Lista de espécies de Solanaceae coletadas, voucher e local de coleta .........................41

Tabela 2. Pré-tratamentos utilizados para representantes de cada gênero de Solanaceae estudado

...................................................................................................................................................45

Tabela 3: Teste de Tukey Alfa para o comprimento total do lote haploide (CTLH) de espécies

de Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C- Cestrum, P-Physalis e S-

Solanum.....................................................................................................................................48

Tabela 4. Características cariotípicas de espécies da família Solanaceae...................................49

Tabela 5. Teste de Tukey Alfa para quantidade de heterocromatina evidenciada por bandamento

CMA/DAPI de espécies de Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C- Cestrum, P-Physalis e S-

Solanum ....................................................................................................................................52

Tabela 6. Localização dos diferentes tipos de heterocromatina evidenciada por bandamento

CMA/DAPI em Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P-Physalis e S-Solanum

...................................................................................................................................................51

Tabela 7. Porcentagem de heterocromatina (evidenciada por bandamento CMA/DAPI) na

composição do cariótipo e sítios de DNAr em espécies de Solanaceae .....................................56

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................................................... 17

1.1 A Família Solanaceae ..................................................................................................... 17

1.2 A utilização da citogenética na taxonomia de plantas .................................................... 21

1.3 Estudos citogenéticos em Solanaceae ............................................................................. 24

1.4 Materiais estudados ......................................................................................................... 26

1.4.1 Acnistus Schott ......................................................................................................... 26

1.4.2 Brunfelsia L. ............................................................................................................. 27

1.4.3 Cestrum L. ................................................................................................................ 28

1.4.4 Physalis L. ................................................................................................................ 29

1.4.5 Solanum L. ............................................................................................................... 30

2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 32

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 39

2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 40

2.1 Material vegetal e preparo de lâminas ............................................................................ 40

2.2 Análise morfométrica do cariótipo ................................................................................. 42

2.3 Bandamento CMA/DAPI ................................................................................................ 43

2.4 Hibridização in situ fluorescente (FISH) ........................................................................ 44

3 RESULTADOS ..................................................................................................................... 44

3.1 Pré tratamentos ............................................................................................................... 44

3.2 Análise e morfométrica do cariótipo............................................................................... 45

3.3 Bandamento CMA/DAPI ................................................................................................ 50

3.4 Hibridização in situ fluorescente (FISH) ........................................................................ 55

4 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 73

4.1 Número cromossômico ................................................................................................... 73

4.2 Características cariotípicas.............................................................................................. 74

4.3 Bandamento cromossômico ............................................................................................ 80

4.4 Número e localização de DNAr ...................................................................................... 83

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................ 86

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 88

ANEXOS .................................................................................................................................. 95

17

1 INTRODUÇÃO GERAL

1.1 A Família Solanaceae

A família Solanaceae A. L. Jussieu (1789) é considerada uma das maiores famílias

botânicas entre as plantas vasculares, reunindo cerca de 2500 espécies agrupadas em

aproximadamente 100 gêneros (Olmstead & Bohs, 2007). De acordo com APG II (2003),

Solanaceae está inserida na ordem Solanales Dumort. (1829), juntamente com as famílias

Convolvulaceae Juss. (1789), Hydroleaceae Bercht. & J. Presl (1820), Montiniaceae Nakai

(1943) e Sphenocleaceae (Lindl.) Baskerville (1839) (Figura 1), sendo Colvolvulaceae

considerado grupo irmão de Solanaceae (Soltis et al., 2000). O que difere as Solanaceae das

outras famílias da ordem são caracteres como: óvulos e semente numerosos, dois carpelos

obliquamente orientados, ausência de látex, cotilédones não plicados, estilete simples e estigma

único, pouco ou nada lobado (Cronquist, 1988)

Entre os gêneros agrupados em Solanaceae, cinco deles reúnem cerca de 50% de todos

dos representantes da família (Tabela 1) e, Solanum L. é o mais diverso com 1500 espécies

reconhecidas até o momento (Knapp, 2002 a).

Figura 1. Cladograma da Ordem Solanales (Angiosperm Phylogeny Website, versão 12, novembro de

2015).

18

Tabela 1. Maiores gêneros em número de espécies da família Solanaceae

Gênero Número de espécies

Solanum L. 1000-1500

Lycianthes Bitter ca.200

Cestrum L. ca.175

Nicotiana L. 75-80

Physalis L. ca.75

Brunfelsia L. 45

Nierembegia Ruiz & Pavón 36

De acordo com as classificações tradicionais de Solanaceae, baseadas em caracteres

morfológicos, Cestroideae e Solanoideae, são consideradas as duas únicas subfamílias dentro

do grupo (Hunziker, 2001; Olmstead & Palmer, 1992). Dentre as principais características em

Solanoideae, destaca-se o embrião curvo contido em sementes discoides e frutos tipo baga

(D’Arcy, 1979; Hunziker, 1979). A subfamília Cestroideae é caracterizada pelo embrião reto

ou levemente curvado, contido em sementes angulares a subglobosas e fruto tipo cápsula

(D’Arcy, 1979; Hunziker, 1979). No entanto, com a utilização de caracteres moleculares em

estudos evolutivos e filogenéticos, outras classificações vêm sendo propostas, de maneira a se

obter um melhor entendimento sobre a organização e evolução desse grupo (Olmstead &

Palmer, 1992; Hunziker, 2001).

Olmstead et al (2008), através do estudo das regiões de DNA cloroplastidial ndhF e

trnLF, em 190 espécies e 89 gêneros, propôs uma nova organização para Solanaceae em quatro

subfamílias, Cestroideae, Goetzeoideae, Nicotianoideae e Solanoideae, 14 tribos, e três

subtribos. Esse estudo, no entanto, possui uma amostragem baixa, uma vez que abrange apenas

cerca 7,3% das espécies pertencentes à família. Särkinen et al. (2013), mediante dados

moleculares e fósseis, conseguiram reunir informações sobre aproximadamente 40% das

espécies de Solanaceae, e assim estabelecer uma visão geral do conhecimento sistemático para

o grupo. O trabalho, o mais completo até o momento, suporta as quatro subfamílias

reconhecidas por Olmstead et al. (2008) (Figura 2A) e outros clados previamente estabelecidos,

principalmente aqueles pertencentes ao gênero Solanum (Figura 2B).

19

Figura 2. Relações filogenéticas entre os maiores clados em Solanaceae. Retirado de Särkinen

et al. (2013)

20

Em relação à distribuição, a família é considerada cosmopolita, ocorrendo em todos os

continentes, em regiões tropicais e temperadas, mas a maior diversidade está presente em

regiões neotropicais. O principal centro de diversidade taxonômica e provável centro de origem

da família são as América Central e do Sul, onde já foram documentados cerca de 50 gêneros

e mais de 400 espécies endêmicas (D’Arcy, 1991; Olmstead, 2013). As evidências da

diversificação de grupos próximos à família (por exemplo Convolvulaceae), bem como o

grande número de espécies presentes na América do Sul, sugere que as Solanaceae se

diversificaram após o isolamento da América do Sul, no fim do período Cretáceo (Olmstead et

al., 2013). Com a ocorrência de representantes da família também no Velho Mundo, acredita-

se que cerca de 10 clados foram envolvidos em 8-9 eventos de dispersão (Tu et al., 2010;

Olmstead, 2013). Os primeiros clados divergentes possuem hoje uma distribuição temperada

e/ou andina, refletindo as preferências originais dos mesmos (Olmstead et al., 2013).

Na América do Sul, onde há a maior diversidade de Solanaceae, é possível encontrar

representantes da família em todos os ecossistemas. A maioria dos grandes clados, por exemplo,

Solaneae, Capsiceae, Physalinae / Iochrominae, Petunieae e Nicotiana L., têm representação

significativa em ambientes secos e úmidos, além de atingirem grandes amplitudes latitudinais,

chegando a habitar locais de clima temperado (Olmstead, 2013). Essa grande amplitude

ecológica pode estar relacionada a eventos de dispersão e também à grande variabilidade

morfológica encontrada entre os seus representantes, favorecendo a ocupação dos mais diversos

nichos.

As Solanaceae possuem hábito arbóreo, herbáceo ou arbustivo e, em sua maioria,

encontram-se como ervas anuais, bianuais ou perenes, subarbustos, pequenas árvores ou

trepadeiras e, raramente, como grandes árvores de dossel (Duckeodendron) (Knapp, 2010). A

morfologia floral na família também é muito diversa. Alguns grandes grupos exibem flores

completamente simétricas ou actinomorfas (Solanum) e outros, flores assimétricas ou

zigomórficas. Entre os indivíduos que se inserem nesse último grupo existem ainda duas

divisões: zigomorfia funcional (Physalis), que envolve principalmente a ordem de maturação e

deiscência das anteras e zigomorfia morfológica, que se relaciona à forma dos órgãos florais,

podendo ocorrer em um ou em todos os tratos florais (Nicotiana) (Knapp, 2002a). Diante da

grande variabilidade foral exibida pela família, muitas síndromes de polinização são relatadas

(abelhas, moscas, mariposas, outros insetos). A família também é muito diversificada nos tipos

21

de frutos, podendo-se encontrar cápsulas, drupas, bagas e vários tipos de frutos deiscentes não-

capsulares (Knapp, 2002b).

A família Solanaceae agrupa espécies cultivadas de grande importância na alimentação,

como batata (S. tuberosum L.), um dos alimentos mais utilizado em todo o mundo como fonte

de carboidrato, berinjela (S. melongena L.), tomate (S. lycopersicum L.), pimentão (Capsicum

annum L.) e pimentas em geral (Capsicum spp.), entre outras (Hawkes, 1999). Algumas

espécies pertencentes à família também são amplamente utilizadas para fins ornamentais, como

o manacá-de-cheiro (Brunfelsia uniflora D. Don), algumas espécies de petúnia, como Petunia

hybrida E.Vilm. e as damas-da-noite (Cestrum spp.) (Souza & Lorenzi, 2001). Alguns

representantes da família (“tabaco”, “batata”, “tomate”) são utilizados como organismos

modelo para diversos estudos em biologia celular, desenvolvimento e genética (Doganlar et al.,

2002; Gebhardt et al., 2003; Lim et al., 2006). Na atualidade, está disponível o sequenciamento

do genoma completo da batata, tomate e pimentão (Fernandez-Pozo et al., 2015) de grande

importância para a área do melhoramento vegetal. Uma característica marcante na família é a

produção de grande quantidade e variedade de metabólitos secundários, que conferem proteção

contra herbívoros (alcaloides, esteroides, flavonoides, terpenos, etc). Muitos desses metabólitos

secundários têm sido utilizados na indústria farmacêutica para fins medicinais como a atropina

(Atropa belladonna) e psicotrópicos como a nicotina (Nicotiana tabacum), além de grande

utilidade na culinária como a capsaicina (Capsicum) (Heiser, 1969). Nicotiana tabacum é uma

das plantas mais utilizadas no mundo para extração de drogas (Chase et al., 2003). As

Solanaceae também são conhecidas pelo seu papel como colonizadores em áreas perturbadas,

frequentemente encontradas em pastagens, clareiras, estradas e margens florestais e assim,

consideradas espécies pioneiras (Bohs, 1995; Tabarelli et al., 1999). Com isso, as solanáceas

possuem uma função fundamental na estruturação de comunidades vegetais.

1.2 A utilização da citogenética na taxonomia de plantas

Os primeiros estudos cromossômicos foram relatados no fim do século XIX, na

descrição dos processos relacionados à mitose e, o envolvimento de “uma figura cromática

nuclear” (cromossomos). Posteriormente, foram publicadas descrições de cromossomos

mitóticos em plantas e animais por Strasburguer, em 1875 e Flemming, em 1879-1882 e esses

trabalhos constituem a base dos modernos estudos cromossômicos, principalmente dos

processos de divisão celular (Sumner, 2003). Outros trabalhos importantes são os de Balbiane

(1881), que descreveu pela primeira vez os cromossomos politênicos e de Flemming (1883),

que encontrou os cromossomos plumosos, estudando anfíbios (Guerra, 1988). Diante de todas

22

as descobertas na área da citologia nesse período e, baseada nas Leis Mendelianas da herança,

foi proposta a “Teoria da herança cromossômica”, que possibilitou a união de duas áreas,

genética e citologia em uma nova vertente de estudos, a “Citogenética” (Guerra, 1988; Sumner,

2003). Sendo assim, a Citogenética atual agrega todo estudo relativo aos cromossomos, isolados

ou em conjunto, e tudo o que se relaciona à sua morfologia, organização, função, replicação

além de sua variação e evolução (Guerra, 1988).

Estudos citogenéticos podem ser empregados em muitas áreas do conhecimento e, a

utilização de informações cromossômicas em estudos taxonômicos de grupos vegetais vem

sendo relatada desde o início do século XX (Guerra, 1990), uma vez que alterações numéricas

e estruturais nos cromossomos são fatores muito importantes nos processos de evolução e

especiação (Leitch & Leitch, 2008; Levin, 2002; Soltis et al., 2009)

O número cromossômico é o caráter cariotípico mais utilizado na citotaxonomia vegetal,

pois além da sua fácil obtenção, geralmente é uma característica conservada dentro de

determinados grupos, e pode auxiliar no estabelecimento das relações filogenéticas entre

espécies ou grupos próximos (Guerra, 2008).

Segundo Stebbins (1971), o cariótipo de determinada espécie geralmente é sujeito a

pouca variação, ainda que duas espécies podem ser diferenciadas de acordo com rearranjos

cromossômicos (estruturais ou numéricos) relacionados à distância filética entre elas. Com isso,

além da determinação do número cromossômico, o tamanho de cada cromossomo, bem como

o comprimento total da cromatina, a relação entre braços (que fornece um índice para a

classificação morfológica dos mesmos), a presença de constrição secundária, os padrões

diferenciais de coloração longitudinal, são de grande utilidade em estudos taxonômicos e

evolutivos (Stace, 2000). Mas muitas vezes, a descrição do cariótipo deve ser associada a outras

informações, como conteúdo de DNA, além de uma filogenia bem sustentada, para que sejam

possíveis inferências evolutivas em grandes ou pequenos grupos (Guerra, 2012; Weiss-

Schneeweiss & Schneeweiss 2003).

Outras características cariomorfológicas frequentemente utilizadas na citotaxonomia

relacionam-se ao padrão de distribuição de heterocromatina, bem como de determinadas

sequências de DNA repetitivo, como os sítios de DNAr 45S, 5S e DNA satélite (Guerra 2000,

2002; Roa & Guerra, 2012; Heslop-Harrison &Schwarzacher 2011). Para a diferenciação

dessas regiões cromossômicas, é necessária a utilização de técnicas de coloração diferencial,

denominadas bandamento cromossômico e de hibridização de DNA in situ fluorescente (FISH),

23

que fornecem a distinção longitudinal de algumas regiões, permitindo identificar

individualmente os cromossomos (Schwarzacher & Heslop-Harrison, 2000; Sumner, 2003;

Vosa, 1985).

O conceito de heterocromatina talvez seja o mais controverso dentro do estudo dos

cromossomos. Caracteriza-se por sequências de DNA altamente repetitivas, com composição e

tamanho variado, desde regiões altamente ricas em A-T até altamente ricas em G-C e desde

dois até centenas ou milhares de pares de bases (Beridze 1986, Sumner 1990). Embora já tenha

sido considerada sem atividade transcricional, situação oposta tem sido descrita em alguns

grupos de plantas. (Nagaki et al., 2004; Wang et al., 2006; Carchilan et al. 2007) e mamíferos

(Saksouk et al., 2015). A heterocromatina também tem sido associada a replicação tardia, porém

nem toda região cromossômica com replicação tardia é heterocromatina. (Sumner 2003).

Na era molecular, o conceito de heterocromatina esta evoluindo em função aos avanços

no conhecimento do genoma. Porém, para o estudo da heterocromatina em plantas, duas

principais técnicas (bandeamento C e bandeamento CMA/DAPI) têm sido empregadas

historicamente e tem mostrando sua utilidade até hoje nos estudos evolutivos (Acosta et al.

2015). O bandamento C identifica a ocorrência e distribuição de heterocromatina através do

uso de soluções que eliminam proteínas e também regiões eucromáticas, evidenciando as

porções altamente heterocromáticas (Holmquist, 1979). Já o bandamento fluorescente CMA

DAPI, utiliza a especificidade dos fluorocromos cromomicina A3 (CMA) e 4’,6-diamidino-2-

fenilindol (DAPI) por regiões do DNA ricas em sequências CG e AT, respectivamente,

possibilitando identificar a composição de bases da heterocromatina (Guerra, 2000; Sumner,

2003). O fato de se detectar a ocorrência e a posição física de diferentes famílias de DNA

altamente repetitivo (heterocromatina) permite maior compreensão de como os genomas estão

organizados e as relações entre espécies, gêneros e famílias. Também permite entender os

mecanismos de ajustes que ocorrem nos cariótipos de diferentes organismos durante o processo

evolutivo (Soares-Scott et al., 2005).

Com o advento da biologia molecular, tem sido possível muitos avanços importantes na

citogenética de plantas, como a identificação do número e posição de sítios de DNAr 45S e 5S,

DNA satélite e elementos transponíveis (Heslop-Harrison, 2000; Heslop-Harrison, 2011; Roa

& Guerra, 2012). Tais análises são feitas através da técnica de hibridização in situ fluorescente,

que consiste na utilização de segmentos de DNA ou RNA marcados (que funcionam como

sondas) para localizar as sequências do DNA cromossômico complementares a ela

(denominado DNA-alvo). Para visualizar as regiões hibridizadas com a sonda é necessário

24

associar um corante à sonda e outro ao restante dos cromossomos (Soares-Scott et al., 2005). A

identificação dessas regiões tem sido muitas vezes usada como uma ferramenta adicional para

estimar similaridades cariotípicas entre as espécies ou compreender a evolução cromossômica

nesses grupos (Heslop-Harrison, 2000; Guerra et al., 2012)

1.3 Estudos citogenéticos em Solanaceae

As descrições citogenéticas sobre Solanaceae mostram predominância do número

básico de cromossomos de x=7 a x=13, embora outros números básicos derivados como x=17,

x=19 e x=23 já tenham sido reportados (Bolkhovskikh et al., 1969; Hunziker et al., 2001;

Moscone, 1992). Entretanto, x=12 é o mais frequente, encontrado em mais de 50% das espécies

de Solanaceae já estudadas citogeneticamente, e também considerado o número básico

ancestral para a família (Grant, 1982; Raven, 1975).

Em alguns gêneros de Solanaceae (Solanum, Lycium L. Capsicum e Cestrum) é possível

encontrar certa uniformidade cariotípica, principalmente em relação ao número, tamanho e

morfologia dos cromossomos. O número cromossômico constante (2n=24), cariótipo simétrico

composto por cromossomos pequenos (< 4μm), predominantemente metacêntricos e

submetacêntricos, têm sido reportados para os gêneros Solanum (Acosta et al., 2005, 2012;

Bernardello et al., 1994; Bernardello & Anderson, 1990; Chiarini et al., 2014; Chiarini &

Bernadello, 2006; Moyetta et al., 2013; Rego et al., 2009), Lycium (Stiefkens et al., 2010, 2012),

Lycianthes (Acosta et al., 2005; Rego et al., 2009) e Vassobia (Rego et al., 2009). Já em

Capsicum, apesar de um grande número de espécies apresentarem 2n=24 cromossomos e

cariótipo simétrico, é possível encontrar também espécies com 2n=26 cromossomos e cariótipo

mais assimétrico (Moscone et al., 2007). O gênero Cestrum também possui certa uniformidade

cariotípica, com 2n=16, cromossomos grandes (6 μm a 12 μm) e cariótipo simétrico (Fernandes

et al., 2009; Fregonezzi et al., 2006).

Apesar da uniformidade no número cromossômico (a nível genérico), a poliploidia tem

sido importante na evolução de algumas espécies de Solanaceae, principalmente nos gêneros

Atropa L., Hyoscyamus L., Lycium, Nicotiana, Physalis, Salpiglossis Ruiz & Pav., Solanum e

Withania Pauq. (Badr et al., 1997; Moscone et al., 1992). Entre tais gêneros é possível encontrar

espécies tetraploides, como Lycium (Stiefkens & Bernadello, 2005; Stiefkens et al., 2010,

Venter & Spies, 2008), Physalis (Badr et al., 1997; Gupta & Roy, 1981; Zhao & Turner, 1993),

Solanum (Melo et al., 2011) e Nicotiana (Badr et al., 1997; Leitch et al., 2008), com 2n=4x=48

e Hyoscyamus com 2n=4x=68 (Badr et al., 1997; Srivastava & Lavania 1987) e Withania com

25

2n=4x=44 (Badr et al., 1997). Espécies hexaploides também já foram reportadas para os

gêneros Lycium (Stiefkens et al., 2010, Venter & Spies, 2008), Physalis (Badr et al., 1997,

Gupta & Roy, 1981), Solanum (Melo et al., 2011) e Nicotiana (Badr et al., 1997), com

2n=6x=72. Solanum e Lycium são os gêneros que apresentam o maior nível de ploidia

encontrado até o momento para a família, com 2n=8x=96 cromossomos (Edmonds et al., 1972;

Chen et al., 2013).

Diante dessa estabilidade em alguns caracteres cariotípicos em nível genérico, dados de

bandamento cromossômico e localização de sequências por FISH, associados a análises

cariotípicas convencionais têm sido muito úteis na identificação de pares cromossômicos e

tendências evolutivas para alguns grupos da família, como nos gêneros Capsicum (Moscone et

al., 2007; Romero-da Cruz et al., 2015), Nicotiana (Lim et al., 2004b), Cestrum (Fernandes et

al., 2009, Fregonezi et al., 2006, Urdampilleta et al., 2015) e Solanum (Chiarini et al., 2014).

Alguns grupos em Solanaceae têm sido bastante estudados, apresentando grande

variação na ocorrência e distribuição de DNA repetitivo. Pode-se citar, por exemplo, o gênero

Capsicum, que apresenta diferenças na distribuição de heterocromatina bem como de sítios de

DNAr 45S (Moscone et al., 1993, 1996a). Nicotiana kawakamii Y. contém regiões

heterocromáticas ricas em AT, caso pouco reportado para a família (Nakamura et al., 2001),

enquanto a tribo Cestrae (subfamília Cestroideae) evidencia diferentes tipos de DNA repetitivo

na composição do cariótipo (Fregonezi et al., 2006; Fernandes et al., 2009; Urdampilleta et al.,

2015). No gênero Solanum, também têm sido mostrada uma variação na composição e

localização da heterocromatina (Chiarini et al., 2014), bem como alterações no número e

posição de DNAr 45S e 5S (Rego et al., 2009; Chiarini et al. 2014).

Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo ampliar o conhecimento

cromossômico em Solanaceae afim de se mapear as tendências taxonômicas e evolutivas para

a família. Foram obtidos dados cariotípicos, incluindo número cromossômico, bandamento

CMA/DAPI e hibridização in situ para 16 espécies pertencentes a cinco gêneros, Acnistus,

Brunfelsia, Cestrum, Physalis e Solanum. Para Acnistus, Brunfelsia e Physalis, foram estudas

uma espécie de cada gênero (A. arborescens, B. uniflora e P. pubescens). Em Cestrum, foram

amostradas duas espécies, C. Laevigatum e C. mariquitense. Já em Solanum, foram obtidos

dados sobre espécies pertencentes à quatro clados (sensu Bohs, 2005; Weese & Bohs, 2007):

Lepstotemonum seção Acanthophora (S. palinacanthum e S. acerifolium) e seção Torva (S.

adspersum, S. scuticum e S. variabile), clado Geminata (S. pseudocapsicum), Cyphomandra (S.

26

diploconos) e Dulcamaroid (S. flaccidum e S. inodorum). As espécies S. concinnum e S.

sanctae-catharinae ainda não possuem uma posição bem definida na filogenia.

1.4 Materiais estudados

Nesse trabalho foram estudados cinco gêneros pertencentes à família Solanaceae. A

seguir, uma breve caracterização de cada um deles.

1.4.1 Acnistus Schott

Gênero monotípico, descrito por Hunziker (1992), está inserido na subfamília

Solanoideae Kostel, tribo Physaleae Miers, subtribo Ichrominae (Miers) Hunz. Apresenta

distribuição no México, América Central, Antilhas e América do Sul, incluindo o Brasil. A

única espécie é A. arborescens, conhecida popularmente por marianeira ou fruto-do-sabiá

(Carvalho et al., 2001). A espécie apresenta-se como uma pequena árvore, medindo de 2 a 4

metros, sendo até mesmo considerada um arbusto. Possui folhas simples e grandes (30cm) e

flores branco-esverdeadas pendentes do tronco, em cachos (Figura 3). Os frutos são pequenos

(1cm) com sementes numerosas e polpa adocicada, sendo assim extremamente atrativos à

fauna. Por ser uma planta pioneira e rústica, tem utilização em projetos de revegetação. O

número cromossômico relatado para a espécie é 2n=24 (Fedorov, 1974).

27

Figura 3: Acnistus arborescens. A: detalhe das flores; B: aspecto geral do ramo fértil, C: vista

geral dos ramos. Fotos: E. S. Cândido

1.4.2 Brunfelsia L.

O gênero Brunfelsia reúne cerca de 45 espécies e está inserido na subfamília

Solanaoideae e tribo Petuniae Horan. que também agrupa os gêneros Petunia L. Bouchetia

Dunal, Calibrachoa La Llave & Lex, Fabiana Ruiz & Pav., Hunzikeria D’Arcy, Leptoglossis

Benth., Nierembergia Ruiz & Pav. e Plowmania Hunz. & Subilis (Olmstead et al. 2008).

Brunfelsia possui dois centros de diversidade, a América do Sul, onde aproximadamente metade

das espécies são nativas e a América Central, mais especificamente as ilhas Antilhas, onde

ocorrem 23 espécies endêmicas (Filipowicz & Renner, 2010). Em geral suas espécies possuem

hábito arbustivo lenhoso e algumas apresentam-se como pequenas árvores. A inflorescência

geralmente é terminal e ou axilar com flores zigomórficas. Extremamente perfumadas à noite,

as flores de Brunfelsia são um grande atrativo para a polinização por mariposas noturnas

(Plowman, 1998). As espécies de Brunfelsia caracterizam-se pela produção de compostos

alucinógenos ou tóxicos muito utilizados por grupos indígenas. Além disso, são ornamentais já

que suas flores apresentam uma coloração muito atrativa, que muda ao longo do seu ciclo de

vida (Figura 4), devido à degradação de antocianinas (Filipowicz & Renner, 2010). Apenas 9

espécies do gênero já foram estudadas citogeneticamente, Brunfelsia americana L., Brunfelsia

28

australis Benth., Brunfelsia dwyeri D'Arcy, Brunfelsia grandiflora D. Don, Brunfelsia lactea

Krug & Urb., Brunfelsia latifolia hort. ex Steud., Brunfelsia nitida Benth., Brunfelsia pauciflora

Benth. e Brunfelsia undulata Sw. e, as contagens disponíveis mostram que n=11 e 2n=22 é o

número cromossômico predominante (Darlington & Wylie, 1955).

Figura 4. Brunfelsia uniflora. A, B: detalhe das flores; C: detalhe dos frutos, D: vista geral do

hábito. Fotos: Fotos: E.S.Cândido, J.R.Stehmann e R.M. Machado

1.4.3 Cestrum L.

O gênero Cestrum pertence à subfamília Cestroideae Burnett, tribo Cestreae G. Don,

juntamente com Sessea Ruiz & Pav. e Vestia Willd e agrupa cerca de 175 espécies (D’Arcy,

1986). Geralmente, os representantes do gênero são arbustos ou pequenas árvores com

distribuição neotropical (Hunzinker, 1979) (Figura 5). As flores actinomorfas com corola

tubular, presença de cinco estames inclusos e soldados ao tubo da corola, poucas sementes

compridas e embrião reto são características morfológicas diagnósticas para o gênero

(Cronquist, 1988). Alguns representantes de Cestrum são utilizados como ornamentais e

também para fins medicinais, embora algumas sejam tóxicas (Peixoto et al., 2000). As espécies

29

de Cestrum possuem número cromossômico constante de 2n=16, e a única alteração numérica

encontrada no cariótipo está relacionada à ocorrência de um ou dois cromossomos B, nas

espécies Cestrum intermedium Sendtn. e C. strigilatum Ruiz & Pav (Fregonezi et al., 2004;

Fernandes et al., 2009; Urdampilleta et al., 2015).

Figura 5: C. mariquitense (A e B), C. laevigatum (C e D). A: detalhe das flores; B,C: Detalhe

dos frutos; D: vista geral do hábito. Fotos: E. S. Cândido e R.M. Machado

1.4.4 Physalis L.

O gênero Physalis pertence à subfamília Solanoideae, tribo Physaleae, subtribo Physalinae

(Miers) Huz e reúne entre 60 e 70 espécies, com centro de diversidade no México e América

do Norte (Olmstead et al., 2008). Physalis é dividido em quatro subgêneros e 12 seções

taxonômicas (Martinez, 1999). O gênero é pouco diverso morfologicamente, com hábito

predominantemente herbáceo, flores solitárias, axilares e amarelas, polinizadas por abelhas

(Sullivan, 1984). O formato do cálice, inflado, é uma característica importante para a

identificação de representantes desse grupo, já que é extremamente raro em outras Solanaceae

(Whitson & Manos, 2005) (Figura 6). O gênero reúne muitas espécies de importância

econômica, utilizadas na alimentação, ornamentação e também na medicina popular, como

30

antitérmico e diurético (Nurit & Agra, 2005; Whitson & Manos, 2005). Os estudos

citogenéticos disponíveis na literatura mostram que 49 espécies já foram estudadas

citogeneticamente com uma predominância do número cromossômico n=12 e 2n=24. No

entanto, já foram encontrados alguns números cromossômicos distintos como n=10 em Physalis

virginiana var. sonorae (Torr.) Waterf. (Gupta & Roy, 1979), n=11 em Physalis lobata Torr.

(Averet & Powell, 1972), n=24 em Physalis angulata L., Physalis divaricata D. Don, Physalis

minima L. e Physalis peruviana L. (Averet & Powell, 1972, Rao & Prasad, 1984; Stober &

Parks, 1985) e 2n=48 em Physalis angulata L., Physalis divaricata D. Don, Physalis hederifolia

A. Gray, Physalis longifolia Nutt., Physalis minima L., Physalis peruviana L. e Physalis

pubescens L. (Badr et al., 1997, Ganapathi et al., 1991).

Figura 6: Physalis pubescens. A, B: detalhe das flores; C: vista geral do hábito; D: detalhe do

fruto. Fotos: E. S. Cândido

1.4.5 Solanum L.

O gênero Solanum está inserido na subfamília Solanoideae, tribo Solaneae Dumort.e é

considerado um dos maiores em número de representantes entre as angiospermas, agrupando

cerca de 1500 espécies, divididas em 12 (D’ arcy, 1991; Bohs, 2005; Särkinen et al., 2013).

Solanum é extremamente diverso em termos morfológicos e ecológicos e ocorre nos continentes

31

tropicais e temperados, embora a maior diversidade esteja presente nas Américas Central e do

Sul, com cerca de 500 espécies endêmicas (D’arcy, 1999; Wesse & Bohs, 2007). A maioria das

espécies possui hábito herbáceo ou arbustivo, com poucos representantes arbóreos (Figura 7).

De grande importância econômica, o gênero agrupa espécies amplamente utilizadas na

alimentação como o tomate (S. lycopersicum) e a batata (S. tuberosum), além de outras espécies

com uso medicinal, devido à produção de metabólitos secundários (Bohs, 2005). Alguns grupos

em Solanum vêm sendo amplamente estudados cariologicamente e o número cromossômico

n=12, 2n=24 é o mais encontrado entre seus representantes, presente em 79% das espécies

estudadas até o momento (Acosta et al. 2005; Chiarini & Bernardello 2006; Melo et al. 2011;

Rego et al. 2009).

Figura 7: Solanum pseudocapsicum (A e B), S. palinacanthum (C e D). A, B, C: detalhe da

flor; D: detalhe do fruto. Fotos: R. M. Machado

32

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1 INTRODUÇÃO

A família Solanaceae, inserida no clado das Asterídeas (Euasterídias I), ordem

Solanales, agrupa aproximadamente 2500 espécies e 100 gêneros com distribuição

cosmopolita. Embora os representantes do grupo ocorram em todas as regiões, tropicais e

temperadas, a maior diversidade encontra-se na região neotropical (D’Arcy, 1991; Hunziker,

2001). O Brasil apresenta grande riqueza de espécies de Solanaceae, com cerca de 470 espécies,

sendo 221endêmicas e 33 gêneros, sendo quatro endêmicos (Stehmann et al., 2015).

Os membros da família exibem grande diversidade morfológica e ecológica,

características que favoreceram a ocupação dos mais diversos habitats, tanto regiões desérticas

como florestas tropicais úmidas e até mesmo áreas de vegetação secundária (D’Arcy, 1991;

Knapp, 2002a).

Entre os membros da família, incluem-se importantes culturas alimentícias, como o

tomate (Solanum lycopersicum L.) e a batata (S. tuberosum L.), além de plantas utilizadas como

drogas, como Nicotiana tabacum L., da qual se extrai a nicotina, além de muitas ornamentais,

como espécies dos gêneros Brunfelsia L. e Petunia Juss. Além disso, os genomas do tomate e

tabaco estão entre os mais bem estudados entre as angiospermas, comparáveis aos de gramíneas

de importância econômica e Arabidopsis Heynh., que é um organismo modelo para diversos

estudos biológicos (Knapp, 2004).

Desde o início da década de 90, muitos estudos moleculares vêm sido conduzidos em

Solanaceae a fim de obter uma filogenia consistente para o grupo (Olmstead et al., 1999; Weese

& Bohs, 2007). Segundo taxonomistas tradicionais, baseando-se em caracteres morfológicos, a

família é dividida em apenas duas subfamílias, Cestroideae e Solanoideae (D’Arcy, 1991,

Olmstead & Palmer, 1992). Com o uso de caracteres moleculares (DNA plastidial e nuclear)

outras organizações vêm sendo propostas, de maneira a se obter uma filogenia que explique

melhor as relações entre os grupos pertencentes à família. Com isso, a circunscrição de quatro

subfamílias Solanoideae, Cestroideae, Goetzeoideae e Nicotianoideae tem sido bem suportada

por estudos moleculares (Olmstead et al., 2008; Särkinen et al., 2013). Outros grandes grupos

monofiléticos como as tribos Petunieae, Physaleae, Capsiceae e Solaneae, e o clado Atropina

também possuem uma posição bem definida na filogenia e as relações infragenéricas de alguns

grupos do gênero Solanum já são bem resolvidas (Särkinen et al., 2013). Alguns clados, no

entanto, ainda não possuem uma posição definida na árvore filogenética para Solanaceae, por

isso mais estudos são necessários a fim de entender melhor essas relações.

40

Alguns grupos em Solanaceae têm sido amplamente estudados do ponto de vista

citogenético, enquanto em outros há pouca ou nenhuma informação sobre seus cromossomos.

Dentro da maioria dos gêneros estudados, nota-se uniformidade em relação ao número

cromossômico. Lycium L. e Solanum L., apresentam um número cromossômico predominante

de 2n=24, embora existam relatos de polipliodia, em cerca de 20% das espécies já estudadas.

(Bernadello et al., 1990, 1994; Chiarini et al., 2006, 2014; Melo et al., 2011; Rego et al., 2009;

Rice et al., 2014; Stiefkens et al., 2010). Em Capscicum L., são reportados 2n=24 e 2n=26

cromossomos (Aguilera et al., 2014; Moscone et al., 1992, 1993, 1995, 2007). Para a tribo

Cestreae, composta pelos gêneros Cestrum L., Sessea Ruiz et Pav e Vestia Willd., o único

número cromossômico reportado até o momento é de 2n=16 (Fernandes et al., 2009; Fregonezi

et al., 2006; Las Penas et al., 2006; Urdampilleta et al., 2015). A maior variação é encontrada

no gênero Nicotiana no qual já foram relatados n=9, n=10, n=12, n=20 e n=24 cromossomos e

50% das espécies já estudadas citogeneticamente são poliploides (Rice et al., 2014)

No entanto, maiores variações no cariótipo das espécies de Solanaceae estão presentes

quando se trata do estudo de DNA repetitivo (heterocromatina e DNAr). Em geral, a quantidade

e a distribuição de heterocromatina apresenta é bem distinta entre e dentro dos diferentes

gêneros. Caso semelhante ocorre com os sítios de DNAr, que variam em número e posição nos

cromossomos de espécies relacionadas sistematicamente (Acosta et al., 2012; Chiarini et al.,

2014; Rego et al., 2009; Moscone et al., 2007; Fregonezi et al., 2006; Urdampilleta et al., 2015).

O estudo dessas regiões do DNA pode auxiliar no entendimento da organização do genoma das

espécies e assim, tentar compreender um pouco mais os aspectos evolutivos da família.

Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo ampliar o conhecimento

cromossômico na família Solanaceae para mapear tendências taxonômicas e evolutivas,

analisando espécies da região sudeste do Brasil.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material vegetal e preparo de lâminas

Para os estudos cromossômicos, foram coletados frutos com sementes de 16 espécies

(Tabela 1), de cinco dos 21 gêneros de Solanaceae que ocorrem no estado de São Paulo

(Stehmann et al., 2015; Biral & Lombardi, 2012; Lombardi et al., 2012). Foram confeccionadas

exsicatas a partir do material botânico, coletado que foram depositadas no Herbário UEC. A

identificação das espécies foi realizada através de bibliografias especializadas, análise

comparativa com exsicatas e consultas a especialistas.

41

Tabela 1. Lista de espécies de Solanaceae coletadas, classificação infragenérica (clados

informais sensu Bohs 2005) para os representantes de Solanum, voucher e local de coleta

Espécies Voucher Localização

Acnistus arborescens

Schltdl.

Monge 2787/

Mesquita 23

Aratinga-RS/

Ubatuba-SP

Brunfelsia uniflora D. Don Mesquita 15 Campinas-SP

Cestrum laevigatum Schltdl. Mesquita 12 Campinas-SP

Cestrum mariquitense Kunth Mesquita 14 Campinas-SP

Physalis pubescens L. Vasconcellos Neto 00-068 Jundiaí-SP

Solanum

Clado Cyphomandra

S. diploconos (Mart.) Bohs Mesquita 23 Jundiaí-SP

Clado Dulcamaroid

S. flaccidum Vell. Mesquita 7 Campinas-SP

S. inodorum Vell. Vasconcellos Neto 20401 Jundiaí-SP

Clado Geminata

S. pseudocapsicum L. Mesquita 24 Jundiaí-SP

Clado Leptostemonum

Seção Acanthophora

S. acerifolium Sendt. Mesquita 2 Campinas-SP

S. palinacanthum Dunal Mesquita 20 Ubatuba-SP

Seção Torva

Solanum adspersum Witasek Monge 2748 c 240 Arraial do Cabo-RJ

S. scuticum M. Nee Vasconcellos Neto 8503 Jundiaí-SP

S. variabile Mart Monge 2324 Itacaré-SP

Posição incerta

S. concinnum Schott ex

Sendtn.

Mesquita 8 Campinas-SP

S. sanctae catharinae Dunal Vasconcellos Neto 20873 Jundiaí-SP

As sementes foram germinadas em caixas de germinação (Gerbox®) com papel filtro

umedecido, em temperatura ambiente (TA) e, em alguns casos, foi utilizado 1 ml de ácido

42

giberélico (GA3) 0,01% para a quebra de dormência (Ellis et al., 1985 apud Acosta et al., 2005).

Os seguintes pré-tratamentos, utilizados para inibir o fuso mitótico, foram testados em

representantes de cada gênero, a fim de se obter um bom padrão de condensação cromossômica:

solução saturada de paradiclorobenzeno por 2-5 horas (h) em TA, 8-hidroxiquinoleína (8-HQ)

a 0,002M por 6 h a 14ºC, 8-HQ a 0.002M + cicloexamida 25mg/L (1:1) por 8h a 4ºC e

colchicina 0,1% por 6h em TA.

Em seguida, as raízes foram fixadas em solução Farmer 3:1 (etanol: ácido acético, v: v)

por no mínimo12 h em TA, sob agitação, e armazenadas a -20ºC até o preparo das lâminas.

Os meristemas das raízes pré-tratadas e fixadas foram utilizados para a confecção das

lâminas após digestão enzimática (1% macerozima, 2% celulase e 20% pectinase) por 10-15

minutos a 37°C. Após a digestão, foi feita a dissecação das células meristemáticas sobre uma

lâmina, em ácido acético 45%, seguida do esmagamento com uma lamínula de vidro de

18x18mm. A lâmina foi congelada em nitrogênio líquido por pelo menos 15 minutos para a

remoção da lamínula. As lâminas foram envelhecidas por no mínimo três dias em TA, para

serem utilizadas no bandamento CMA/DAPI e FISH. As lâminas não utilizadas após nesse

período foram armazenadas a -21ºC.

Pelo menos dois indivíduos de cada uma das 16 espécies foram analisados pela técnica

de bandamento cromossômico e, pelo menos uma lâmina de cada espécie, contendo no mínimo

10 metáfases foi selecionada para a utilização na FISH. Dessa maneira, 10-30 células por

espécie foram fotografadas em microscópio Olympus® BX51, com câmera DP72 acoplada e

as imagens foram capturadas utilizando programa Olympus® DP2 BSW (Olympus

Corporation). O programa Adobe Photoshop® CS6 PT-BR (Adobe Systems, Inc.) foi utilizado

para auxiliar no balanceamento uniforme de cores, brilho e contraste.

2.2 Análise morfométrica do cariótipo

As medidas cromossômicas foram realizadas através do software Micro Measure© (3.3)

em cinco células de cada indivíduo com padrão semelhante de condensação. Para cada

metáfase, foi obtida a medida absoluta do braço curto (S) e longo (L), o comprimento absoluto

e relativo de cada cromossomo e o tamanho das regiões heterocromáticas presentes em cada

cromossomo.

Para cada cromossomo a posição do centrômero foi calculada pelo índice r (relação entre

braços) = L/S e a classificação foi feita de acordo com Levan et al. (1964): m-metacêntrico (r

43

=1,0-1,69), sm-submetacêntrico (r = 1,70-2,99), st-subtelocêntrico (r = 3,0-6,99) e t-

telocêntrico (r = 7,0 -∞).

O comprimento total do lote haploide (CTLH), calculado através da soma do tamanho

médio dos pares cromossômicos de cada espécie, bem como o tamanho médio da

heterocromatina (% de heterocromatina em relação ao CTLH), foram calculados para a

montagem dos ideogramas. Na representação dos ideogramas, os cromossomos foram

agrupados primeiramente de acordo com a morfologia cromossômica (m, sm e st) e, dentro de

cada grupo, de acordo com o tamanho decrescente.

A fim de se comparar o CTLH e a quantidade de heterocromatina entre as espécies

estudadas, foi realizada uma análise de variância simples (ANOVA) com nível de significância

de p < 0,05. A fim de se verificar a normalidade da distribuição das amostras foi realizado o

teste de Shapiro Wilk e, para a comparação das médias, foi realizado o teste de Tukey Infestat©

(versão 2015, grupo Infostat). Posteriormente, foram plotados gráficos de barras com a

variância encontrada em cada espécie, para uma melhor visualização dos resultados obtidos.

Para medir a simetria cariotípica, foram utilizados os índices A1= 1-[Ʃbi/Bi)/n]

(bi=média do braço curto de cada par cromossômico, B= média do braço longo de cada par

cromossômico, n= número de pares cromossômicos) e A2= s/x (desvio padrão, x= média do

comprimento do complemento cromossômico) (Zarco, 1986). O índice A1 mede a assimetria

intracromossomal isto é, indica diferenças no tamanho dos braços cromossômicos. Já o índice

A2 mede a assimetria intercromossomal e indica a variação existente no tamanho do

complemento cromossômico.

2.3 Bandamento CMA/DAPI

Lâminas envelhecidas foram coradas com CMA (cromomicina A3) por 90 minutos e

contracoradas com DAPI (4’- 6- diamidino- 2- fenilindol) por 30 minutos, segundo Schweizer

(1976), com algumas adaptações. As lâminas foram montadas com meio glicerol/McIlvaine

(1:1) e armazenadas a 37ºC no escuro por pelo menos cinco dias. Após observação e registro

dos dados, as melhores lâminas foram descoradas para posterior aplicação da técnica de FISH.

Para a retirada da coloração CMA/DAPI, primeiramente as lâminas foram colocadas em

uma cuba contendo água destilada sob agitação até a remoção lamínulas. Em seguida, foi

utilizada solução Farmer a 4 ºC overnight para posterior desidratação em álcool 100% por 3

minutos.

44

Uma banda foi designada positiva (CMA+ ou DAPI+) quando a região apresentou

coloração mais brilhante em relação ao restante do cromossomo, com o respectivo corante

(fluorocromo), CMA e DAPI. A banda foi considerada neutra (CMA0 ou DAPI0) quando o

cromossomo não apresentou coloração diferenciada por um dos corantes, apesar de se mostrar

positiva com o outro. E, foi considerada banda negativa (CMA- ou DAPI-) aquela região

cromossômica que não apresenta qualquer coloração com um dos corantes, apesar de aparecer

corada positivamente com o fluorocromo contrário.

2.4 Hibridização in situ fluorescente (FISH)

As sequências dos genes ribossomais 5S e 18S foram obtidas por PCR a partir de DNA

genômico de Capsicum chinense. Para o DNAr 5S, foram utilizados os primers 5S DNAr-3 e

5S DNAr-4, com as respectivas sequências, 5’- GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA- 3’ e 5’-

GGT GCG TTA GTG CTG GTA TG-3’ (Kitamura et al., 2001). Já para o DNAr 18S os primers

usados foram NS1 e NS4, com sequência 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e5’-CTT

CCG TCA ATT CCT TTA AG-3’, respectivamente (White et al., 1990).

As sondas de DNAr 5S e 18S foram marcadas por nick translation (Roche

Biochemicals®, UK) utilizando digoxigenina-11-dUTP (Roche Biochemicals®, UK) e biotina-

14-dATP (Roche Biochemicals®, UK), respectivamente. A hibridização in situ foi realizada

segundo Schwarzacher & Heslop-Harrison (2000), com modificações. As lâminas foram

tratadas com RNase por 1 hora a 37°C, fixadas em paraformaldeído 4% por 10 minutos a TA e

desidratadas em série alcoólica 70% e 100% por 10 minutos cada. A mistura de hibridização

foi composta por formamida 100%, dextran 10%, SDS 10%, 2X SSC, sondas DNAr 5S e 18S

(ambas 3,33ng/μl). As lavagens de estringência (72%) foram realizadas em 0,1XSSC a 42°C,

2XSSC à temperatura ambiente (TA), 2XSSC a 42ºC, 4XSSC TA e 4XSSC a 42ºC. As sondas

foram detectadas por anticorpos ligados ao fluorocromo, sendo o DNAr 5S detectado por anti-

digoxigenina-Rodamina (Roche Biochemicals®, UK) e o DNAr18S pela Avidina-FITC (Roche

Biochemicals®, UK). As lâminas foram montadas em DAPI/Vectashield (1:1) (Vector®).

3 RESULTADOS

3.1 Pré tratamentos

Os melhores pré tratamentos foram escolhidos para cada gênero e padronizados, como

mostrado na Tabela 2.

45

Tabela 2. Pré-tratamentos utilizados para representantes de cada gênero de Solanaceae

estudado

Gênero Pré-tratamento

Acnistus e

Physalis

8-hidroxiquinoleína (8-HQ) 0.002M + cicloexamida

25mg/L (1:1) ,8h, 4ºC

Brunfelsia 8-hidroxiquinoleína (8-HQ) 0.002M, 6 h, 14ºC

Cestrum Colchicina 0,1% 6h, TA

Solanum solução saturada de paradiclorobenzeno 2h, TA

Solanum (S. diploconos) solução saturada de paradiclorobenzeno 5h, TA

3.2 Análise e morfométrica do cariótipo

Foram encontrados números cromossômicos somáticos 2n=24 (Acnistus, Physalis e

Solanum), 2n=22 (Brunfelsia) e 2n=16 (Cestrum) (Tabela 3, Figuras 3 a 18). A espécie que

apresentou menor valor de CTLH foi Solanum sanctae-catharinae com 24,33 µm e variação de

1,68-2,35 µm do menor para o maior par cromossômico. Já os maiores valores de CTLH foram

encontrados em S. diploconos, com 72,29 µm (4,63-7,49 µm), C. mariquitense, 75,51 µm (7,35-

11,39 µm) e C. laevigatum, 77,41 µm (7,92-10,88 µm).

As espécies diferiram estatisticamente quanto ao CTLH (Figura 1; Tabela 4). A espécie

que apresentou menor valor foi S. sanctae-catharinae (22,15 µm), estatiscamente distinto das

médias apresentadas por A. arborescens, P. pubescens e espécies de Solanum (exceto S.

diploconos) que formam um grupo com valores intermediários de CTLH. Brunfelsia uniflora,

por sua vez, apresenta média de CTLH diferente das espécies citadas anteriormente (50,26 µm),

mas não se encaixa no grupo dos indivíduos com maiores médias. Cestrum laevigatum, C.

mariquitense e S. diploconos se diferenciam em um grupo por apresentar maior CTLH que

todas as outras espécies estudadas, e suas médias são estatisticamente semelhantes (75,51 µm;

77,41 µm e 72,29 µm, respectivamente) (Tabela 4) (Figura 1).

Além disso, foi encontrada grande diversidade na fórmula cariotípica, mas a maioria das

espécies analisadas mostra uma predominância de cromossomos metacêntricos (Tabela 3).

Acnistus arborescens foi a única espécie em que o cariótipo é composto unicamente por

cromossomos metacêntricos, enquanto P. pubescens, S. inodorum e S. palinacanthum

apresentaram predominância de cromossomos submetacêntricos, ao passo que S. concinnum

possui um cariótipo composto por 6m+6sm.

46

A assimetria cariotípica foi calculada pelos índices A1 e A2, e apresentaram valores para

cada espécie, entre os intervalos 0,17 a 0,39 e 0,04 a 0,23 respectivamente. Ambos os índices

fornecem valores de 0 a 1, indicando que quanto mais próximo de 0, maior a simetria cariotípica

inter e intracromossomal. Espécies com baixos valores de A2 (próximo à 0) apresentam pouca

variação entre o tamanho dos pares cromossômicos e com valores A1 próximo a 0,

caracterizam-se por pequenas diferenças em relação ao tamanho dos braços de cada par

cromossômico. Assim, as espécies aqui estudadas, possuem cariótipos relativamente simétricos

sendo que, S. palinacanthum (A1+A2=0,49), S. acerifolium e S. inodorum (0,54) são os mais

assimétricos enquanto A. arborescens é a espécie que apresenta o cariótipo mais simétrico

(0,27), além de C. laevigatum (0,32), C. mariquitense e S. adspersum (0,34).

47

Figura 1. Representação gráfica da análise de variância do comprimento total do lote haploide (CTLH) das espécies de Solanaceae estudadas. A-

Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P-Physalis e S-Solanum

48

Tabela 3. Teste de Tukey Alfa para o comprimento total do lote haploide (CTLH) de espécies de Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C- Cestrum,

P-Physalis e S-Solanum

Espécie Médias n E.E.

S. sanctae-catharinae 22,15 5 1,26 A

S. adspersum 25,17 5 1,26 A B

S. flaccidum 26,04 5 1,26 A B

S. pseudocapsicum 27,99 5 1,26 A B C

S. scuticum 28,03 5 1,26 A B C

S. concinnum 30,71 5 1,26 B C D

P. pubescens 31,29 5 1,26 B C D

S. variabile 32,78 5 1,26 C D

S. acerifolium 35,71 5 1,26 D E

S. palinacanthum 36,90 5 1,26 D E

S. inodorum 39,75 5 1,26 E F

A. arborescens 45,55 5 1,26 F G

B. uniflora 50,26 5 1,26 G

S. diploconos 72,29 5 1,26 H

C. mariquitense 75,51 5 1,26 H

C. laevigatum 77,41 5 1,26 H Médias com uma letra comum não são significativamente diferentes (p< 0,05)

49

Tabela 4: Características cariotípicas de espécies da família Solanaceae

2n=número somático de cromossomos; m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico; NOR= região organizadora do nucléolo; CTLH=comprimento total do lote

haploide; A1=índice de assimetria intracromossomal; A2= índice de assimetria intercromossomal; DP: desvio padrão

Espécie 2n Fórmula

cariotípica

CTLH

(µm)

(DP)

Sítios de

DNAr

18S

Variação do

tamanho

cromossômico

A1 A2

Acnistus arborescens 24 12m 45,55(0,36) 1 (par 8) 3,17-4,38 0,17 0,10

Brunfelsia uniflora 22 7m+4sm 50,26(0,45) 1(2) 3,89-5,37 0,32 0,10

Cestrum laevigatum 16 6m+2sm 77,41(0,92) 2(2,6) 7,92-10,88

0,23 0,10

C. mariquitense 16 7m+1sm 75,51(1,15) 2(7,8) 7,35-11,39

0,21 0,12

Physalis pubescens 24 3m+8sm+1st 30,76(0,30) 2 (8,12) 2,14-3,15 0,27 0,10

Solanum acerifolium 24 10m+2sm 35,71(0.70) 1(3) 1,71-3,87

0,26 0,23

S. adspersum 24 9m+3sm 25,17(0,2) 1(3) 1,77-2,44 0,25 0,09

S. concinnum 24 6m+6sm 30,7 (0,2) 1(2) 2,26-2,86 0,39 0,08

S. flaccidum 24 9m+2sm+1st 26,33(0,22) 1(12) 1,89-2,59 0,27 0,10

S. inodorum 24 5m+7sm 39,75(0,31) 18(tods

os pares)

2,83-3,86 0,39 0,09

S. palinacanthum 24 5m+7sm 36,9(0,39) 1(6) 2,51-3,86 0,41 0,13

S. pseudocapsicum 24 9m+3sm 27,85(0,3) 1(11) 1,76- 2,72 0,28 0,13

S. sanctae-catharinae 24 10m+2sm 24,33(0,2) 1(6) 1,68-2,35 0,26 0,09

S. diploconos 24 8m+4sm 72,29(0,87) 1(12) 4,63-7,49 0,32 0,14

S. scuticum 24 9m+3sm 29,82(0,28) 1(11) 1,95-2,79 0,31 0,04

S. variabile 24 9m+3sm 32,77(0,31) 1(3) 2,15-3,26 0,24 0,11

50

3.3 Bandamento CMA/DAPI

O bandamento cromossômico CMA/DAPI possibilitou identificar diferentes padrões de

composição e distribuição de heterocromatina entre os representantes de Solanaceae estudados

(Figuras 3 a 18). Além disso, também pode-se notar que a porcentagem de heterocromatina

(totalizada pela soma de bandas grandes e puntiformes) (Figuras 3 a 18) na composição do

cariótipo (CTLH) foi variável (Tabela 7), sendo possível separar os grupos com valores

menores, intermediários e maiores, fato comprovado pela análise de variância. As espécies que

apresentaram a menor quantidade de heterocromatina na composição do cariótipo foram B.

uniflora (1,51%), S. diploconos (1,85%), S. mariquitense (2,21%), S. palinacanthum (2,57%) e

S. concinnum (5,93%). Já S. acerifolium (51,92%), S. inodorum (38,96%), P. pubescens

(34,27%) e S. sanctae-catharinae (20,34%) apresentarm as maiores quantidades. As outras

espécies analisadas possuem valores intermediários de heterocromatina na composição do

cariótipo (Tabelas 4 e 5) (Figura 2).

Em todas as espécies foi possível visualizar pelo menos um par cromossômico com forte

sinal CMA+, correspondendo à NOR (região organizadora do nucléolo). Em A. arborescens

(Figura 3) e em todos os indivíduos do gênero Solanum (Figuras 8 a 18) foi encontrado um par

cromossômico portando a NOR, enquanto em C. laevigatum (Figura 5), C. mariquitense

(Figura 6) e P. pubescens (Figura 7) foi possível identificar dois pares cromossômicos portando

tal região. Diferentemente de todos os indivíduos analisados, a NOR em B. uniflora, está

presente na região pericentromérica de um par cromossômico (Figura 4), ao passo que em todos

os outros, localiza-se na região terminal. Os pares cromossômicos que portam a NOR

apresentaram morfologia variável, sendo possível observá-la em cromossomos metacêntricos

(nove espécies), submetacêntricos (cinco espécies) e subtelocêntricos (duas espécies) (Figuras

3 a 18). A composição da heterocromatina na NOR é variável, sendo na maioria das espécies

DAPI-, exceto em, S. adspersum (Figura 9) e S. concinnum (Figura 10) (DAPI0) e P. pubescens

(Figura 7) (DAPI+) (Tabela 7). As bandas CMA+ indicam a alta repetitividade de sequências

GC associadas à NOR.

Acnistus arborescens, P. pubescens e S. sanctae-catharinae foram as únicas espécies

em que foi possível encontrar bandas DAPI+ sempre terminais (Tabela 7) (Figuras 3, 7 e 16,

respectivamente). Entretanto, somente A. arborescens apresentou bandas CMA+/DAPI+ sem

51

associação à NOR, ao passo que em P. pubescens, o único par de CMA+/DAPI+encontra-se

associado à NOR (Tabela 8) (Figuras 3 e 7, respectivamente).

Em outras espécies foi possível ver claramente em um par cromossômico uma banda

CMA+ intersticial. Em B. uniflora, C. laevigatum, C. mariquitense, S. concinnum e S. sanctae-

catharinae essa banda é CMA+/DAPI0 (Figuras 4, 5, 6, 10 e 16 respectivamente), enquanto em

A. arborescens, S. acerifolium, S. diploconos, S. inodorum, S, scuticum e S. variabile é

CMA+/DAPI- (Tabela 8) (Figuras 3, 8, 11, 13, 17 e 18 respectivamente).

Além disso, pequenos blocos heterocromáticos terminais foram visualizados em

algumas espécies. Em S. adspersum, S. concinnum, S. flaccidum, S. scuticum e S. variabile

foram encontradas regiões CMA+/DAPI0 em todos os pares cromossômicos (Figuras 9, 10, 12,

17 e 18 respectivamente) e, em S. pseudocapsicum, além de pequenas bandas CMA+/DAPI0,

também foram visualizadas bandas CMA+/DAPI- (Figura 15) (Tabela 7). Por outra parte, em S.

sanctae-catharinae foram observadas bandas CMA+/DAPI0, CMA+/DAPI+ e CMA0/ DAPI+

(Figura 16).

As únicas espécies que apresentaram grandes blocos de heterocromatina terminais e

intersticiais CMA+/DAPI- foram S. acerifolium e S. inodorum (Tabela 7) (Figuras 8 e 13

respectivamente). Nessas duas espécies também foram visualizadas pequenas regiões terminais

CMA+/DAPI- além de regiões com heterocromatina dispersa, padrão bem distinto de todos os

outros indivíduos estudados. Após a FISH, também foi possível visualizar bandas DAPI + em

S. diploconos, S. flaccidum e S. palinacanthum (Figuras 11, 12 e 14, respectivamente) .

Finalmente, foram observadas bandas terminais do tipo CMA-/DAPI+ nos

representantes de Physalis (Figura 7) e Acnistus. No gênero Acnistus também foram reveladas

bandas do tipo CMA+/DAPI+, CMA+/DAPI- e CMA0/ DAPI+ (Figura 3) (Tabela 7).

52

Tabela 5. Teste de Tukey Alfa para quantidade de heterocromatina evidenciada por bandamento CMA/DAPI de espécies de Solanaceae. A-

Acnistus, B-Brunfelsia, C- Cestrum, P-Physalis e S-Solanum

médias com uma letra comum não são significativamente diferentes (p< 0,05)

Especie Medias n E.E.

B. uniflora 1,51 5 0,75 A

S. diploconos 1,85 5 0,75 A

C. laevigatum 2,17 5 0,75 A

C. mariquitense 2,21 5 0,75 A B

S. palinacanthum 2,57 5 0,75 A B

S. concinnum 5,93 5 0,75 B

S. adspersum 10,60 5 0,75 C

A. arborescens 11,49 5 0,75 C

S. scuticum 12,44 5 0,75 C

S. variabile 12,92 5 0,75 C

S. flaccidum 13,04 5 0,75 C

S. sanctae-catharinae 20,34 5 0,75 D

P. pubescens 34,27 5 0,75 E

S. inodorum 38,96 5 0,75 F

S. acerifolium 51,92 5 0,75 G

53

Figura 2. Representação gráfica da variância da quantidade de heterocromatina evidenciada por bandamento CMA/DAPI das espécies de

Solanaceae estudadas. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P-Physalis e S-Solanum

54

Tabela 6. Localização dos diferentes tipos de heterocromatina evidenciada por bandamento CMA/DAPI em Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P-

Physalis e S-Solanum

Espécies

Heterocromatina

NOR Intercalar Terminal

CMA+/DAPI- CMA+/DAPI0 CMA+/DAPI+ CMA+/DAPI- CMA+/DAPI0 CMA+/DAPI- CMA+/DAPI0 CMA+/DAPI+ CMA-/DAPI+ CMA0/DAPI+

A. arborescens x x x x x x

B. uniflora x x - - - - -

C. laevigatum x x - - - - -

C. mariquitense x x - - - - -

P. pubescens x - - - - x

S. acerifolium x x x

S. adspersum x - - x

S. concinnum x x x

S. flaccidum x - - - x

S. inodorum x x x

S.palinacanthum x - - - - - - -

S.

pseudocapsicum

x - - x x

S.sanctae-

catharinae

X x x x x

S. diploconos X x - - - - -

S. scuticum X x x

S. variabile X x x

55

3.4 Hibridização in situ fluorescente (FISH)

A maioria dos indivíduos avaliados possuem um par cromossômico portando o sítio de

DNAr 18S terminal co-localizado com uma região CMA+ (Figuras 3 a 18). Somente em B.

uniflora, o sítio se encontra nas proximidades do centrômero (Figura 4). Cestrum laevigatum,

C. mariquitense e P. pubescens apresentaram mais um par cromossômico portando o locus de

DNAr 18S (Figuras 5, 6 e 7, respectivamente) e S. inodorum apresentou 18 sítios para o gene

(Figura 13).

Resultado semelhante foi obtido para o sítio de DNAr 5S, já que também foi encontrado

um par cromossômico com o locus na maioria das espécies. Acnistus arborescens, C.

mariquitense, S. acerifolium e S. flaccidum foram as espécies que apresentaram dois sítios de

DNAr 5S (Figuras 3, 6, 8, 12, respectivamente). O loco de DNAr apresentou grande variação

de distribuição, ocorrendo tanto no braço curto quanto no braço longo dos pares cromossômicos

e em regiões terminais, subterminais ou pericentromérico (Figuras 3 a 18, Tabela 7).

Em C. laevigatum, C. mariquitense e S. inodorum foi encontrado heteromorfismo no

par cromossômico portador da NOR (Figuras 5, 6 e 13, respectivamente). Três indivíduos de

cada espécie foram analisados e, para os representantes de Cestrum, dois deles apresentaram

heteromorfismo, enquanto para S. inodorum, todos os indivíduos apresentaram um par

cromossômico heteromórfico em relação à NOR. Acnistus arborescens também apresentou

heteromorfismo cromossômico entre as duas populações estudadas, mas, para essa espécie tal

situação ocorreu em relação a um dos sítios de DNAr 5s (o maior deles). Na população coletada

em Aratinga/RS o maior sítio de DNAr 5s está localizado na posição intersticial no braço longo

do par cromossômico 6. Já na população coletada em Ubatuba/SP o locus está co-localizado no

par cromossômico 8, que porta o sítio de DNAr 18s (Figura 3).

56

Tabela 7. Porcentagem de heterocromatina (evidenciada por bandamento CMA/DAPI) na

composição do cariótipo e sítios de DNAr em espécies de Solanaceae

NOR-assoc=heterocromatina associáda à região NOR, Interc.=intercalar, T=terminal, St=subterminal,

Peric.=pericentromérica, (BL)= braço longo, (BC)=braço curto

Espécies Heterocromatina

(%)

Sítios DNAr

Total NOR-

assoc

Interc. 5s 18s

T Subt Per

Acnistus arborescens 11,49 0,59 10,91 2(BL)/1(BC) 1

Brunfelsia uniflora 1,51 1,11 0,40 1(BC) 1

Cestrum mariquitense 2,21 1,60 0,45 2(BL) 2

Cestrum laevigatum 2,17 2,12 0,61 1(BL) 2

Physalis pubescens 34,27 1,37 32,93 1(BC) 2

Solanum acerifolium 51,92 2,77 49,12 1(BC) 1(BC) 1

S. adspersum 10,60 0,40 10,05 1(BC) 1

S. concinnum 5,93 1,79 4,14 1(BC) 1

S. flaccidum 13,04 1,97 9,57 1(BC) 1(BC) 1

S. inodorum 38,96 0,88 35,04 1(BL) 18

S. palinacanthum 2,57 2,66 - 1(BC) 1

S. sanctae-catharinae 20,34 2,34 18,04 1(BL) 1

S. scuticum 12,44 1,04 10,70 1(BC) 1

S. pseudocapsicum 19,82 1,26 18,56 1(BC) 1

S. diploconos 1,85 1,24 0,62 1(BC) 1

S. variabile 12,92 1,50 12,45 1(BC) 1

73

4 DISCUSSÃO

Os dados de número cromossômico, bandamento CMA/DAPI e FISH são inéditos para

B. uniflora, S. adspersum, S. concinnum, S. inodorum, S. flaccidum, S. inodorum e S. sanctae-

catharinae. Para todas as outras espécies aqui estudadas, os números cromossômicos aqui

obtidos, corroboram os já disponíveis na literatura. A. arborescens e P. pubescens, já existem

trabalhos anteriores com contagem cromossômica, porém com nenhuma informação referente

a bandamento ou FISH para DNAr (Ganapathi et al., 1991; Heiser 1956, 1963a; Venkateswarlu

et al., 1979; Pedrosa, 1999). A espécie S. diploconos já foi estudada anteriormente através de

análise convencional do cariótipo e bandamento C, mas nenhum trabalho com bandamento

fluorescente e FISH havia sido realizado para essa espécie até o momento (Pringle e Murray,

1993). Para S. pseudocapsicum, os dados de DNAr (5S e 18S) aqui obtidos são inéditos, mas já

haviam informações sobre número cromossômico e bandamento CMA/DAPI disponíveis na

literatura que corroboram as obtidas nesse trabalho (Acosta et al., 2005; 2012). Os resultados

obtidos nesse estudo em S. variabile e S. scuticum confirmam dados obtidos por Rego et al.

(2009). Em C. laevigatum foram encontradas diferenças na morfologia de um par

cromossômico e no bandamento CMA/DAPI em relação aos trabalhos realizados por Fernandes

et al. (2009), mas a distribuição de DNAr apresentou padrão semelhante. Cestrum mariquitense

(sin. C. sendtherianum) apresentou diferenças no número de sítios de DNAr 5S e bandamento

CMA/DAPI comparando-se ao trabalho feito por Fregonezi et al. (2006). Em Solanum

palinacanthum e S. acerifolium, embora o número e posição de sítios de DNAr sejam

coincidentes com estudos prévios (Rego et al., 2009; Chiarini et al., 2014), a distribuição de

heterocromatina apresentou padrões distintos no presente trabalho, indicando uma variabilidade

entre populações dessas espécies, possivelmente relacionada à ocorrência de rearranjos em

sequências de DNA repetitivo (Flavel et al., 1986; Fregonezi et al., 2006, Heslop-Harrison,

2000).

4.1 Número cromossômico

Os números cromossômicos encontrados nesse trabalho em Acnistus, Physalis e

Solanum (subfamília Solanoideae), 2n=24, corroboram informações disponíveis na literatura

para os gêneros estudados. O número cromossômico x=12, considerado por Raven (1975)

ancestral para a família, foi reconhecido como uma sinapomorfia unindo a subfamília

Solanoideae, a tribo Anthocercideae G. Don e o gênero Nicotiana em um clado reconhecido

informalmente como “x=12” (Olmstead & Palmer, 1992; Olmstead et al., 2008). Embora o

74

gênero Nicotiana apresente variação em relação ao número cromossômico (n=12, 11, 9, 8, 7 e

6), n=12 é o mais frequentemente observado, encontrado na maioria dos subgêneros do grupo

(Chase et al., 2003; Hunziker, 2001; Moscone, 1992; Stehmann et al., 1997) e também em

aproximadamente 50% das Solanaceae estudadas citogeneticamente até o momento (Huzinker

2001). Alguns exemplos em que esse número cromossômico é frequente (2n=24) são as tribos

Solaneae, composta pelos gêneros Solanum e Jaltomata Schlecht., a tribo Capsiceae (gêneros

Capsicum e Lycianthes) e a tribo Lycieae com três gêneros, Grabowskia Schltdl., Lycium L. e

Phrodus Miers.

Outros grupos em Solanaceae apresentam números diferentes de x=12, como a

subfamília Cestroideae e a tribo Petuniaeae Horan. Os dados obtidos no presente trabalho para

B. uniflora e para os dois representantes de Cestrum confirmam os números cromossômicos já

relatados para esses grupos.

Brunfelsia uniflora, inserida na tribo Petunieae, apresenta 2n=22 cromossomos. De

acordo com contagens cromossômicas já realizadas para a tribo Petunieae, uma série disploide

de x=7 a x=11 é relatada para os diferentes gêneros que a compõem. Em Petunia é possível

observar o número básico x=7, enquanto em Hunzikeria D'Arcy, Bouchetia DC. ex Dunal e

Nierembergia Ruiz & Pav.é relatado x=8, embora Nierembergia também apresente x=9. Os

representantes de Calibrachoa Cerv. estudados citogeneticamente até o momento, apresentam

x=9, diferentemente de Leptoglossis Benth.(x=10) e Brunfelsia (x=11) (Chase et al., 2003;

Hunziker, 2001; Moscone, 1992; Stehmann et al., 1997)

Por fim, C. mariquitense e C. laevigatum, apresentaram número cromossômico 2n=16,

único número reportado até o momento para a tribo Cestreae (Fernandes et al., 2009; Fregonezi

et al., 2006, 2009; Las Peñas et al., 2006; Urdampilleta et al., 2015). Em C. intermedium e C.

strigilatum já foi reportada a ocorrência de cromossomos B em algumas populações do sul do

Brasil, resultando em diferenças no número cromossômico (Fregonezi et al., 2004).

4.2 Características cariotípicas

A família Solanaceae caracteriza-se por uma certa estabilidade cariotípica em relação

ao tamanho e morfologia de seus cromossomos, além de baixa ocorrência de poliploides e

rearranjos cromossômicos (Wu & Tanksley, 2010).

Em relação ao tamanho da cromatina, os resultados aqui obtidos para Solanum mostram

que, exceto S. diploconos que é estatisticamente distinto de todos os outros membros de

Solanum, o gênero apresenta cariótipos pequenos. O CTLH em Solanum variou de 24,33 μm

em S. sancthae-catharinae a 39,75 μm em S. inodorum, sendo aproximadamente um terço ou

75

metade do encontrado em S. diploconos (72,29 μm). O tamanho cromossômico relativamente

pequeno em Solanum tem sido amplamente documentado em estudos citogenéticos para o

gênero. Acosta et al. (2005), estudando quatro subgêneros de Solanum, encontrou CTLH

variando de 16,30 a 38,75 μm, com o menor par cromossômico medindo 1.36 μm em S. palustre

e o maior par medindo 3.23 μm em S. sisymbriifolium. Bernadello & Anderson (1990)

encontraram os menores valores de tamanho cromossômico reportados para o gênero estudando

a seção Basarthrum (Bitter) Bitter (subgênero Leptostemonum), variando de 12,14 a 18,84 μm.

Outros trabalhos realizados em diferentes subgêneros e seções de Solanum também têm

corroborado essa tendência (Chiarini et al., 2006; Melo et al., 2011; Moyetta et al., 2013; Rego

et al., 2009).

Além do gênero Solanum, outros clados em Solanaceae também exibem cromossomos

relativamente pequenos, como a espécie aqui estudada Physalis pubescens, que apresentou

cromossomos medindo de 2,14μm a 3,15μm. Rego et al. (2009) encontraram cromossomos

medindo em média 2μm em Lycianthes e Vassobia, gêneros filogeneticamente próximos a

Solanum. Em Lycium, foi reportado tamanho cromossômico variando de 1,67 μm a 2,07 μm

(Stiefkens & Bernadello, 2002). Outros grupos em Solanaceae apresentam cromossomos com

tamanhos intermediários, como o gênero Capsicum (Guerra, 2001; Moscone, 1996) e as

espécies aqui estudadas, A. arborescens e B. uniflora. Apesar do tamanho intermediário do

complemento cromossômico, a uniformidade cariotípica relatada para a família é mantida

nesses grupos.

Diferentemente dos cromossomos pequenos reportados para alguns grupos em

Solanaceae, a tribo Cestreae (subfamília Cestroideae) é caracterizada por apresentar os maiores

tamanhos cromossômicos da família. As duas espécies do gênero Cestrum estudadas nesse

trabalho apresentaram os maiores valores de CTLH (77,41 μm em C. laevigatum e 75,51 μm

em C. mariquitensis), chegando a ser até três vezes maior que algumas espécies de Solanum,

como S. sanctae-catharinae (24,33 μm) e S. adspersum (25,17 μm). Muitos outros trabalhos

têm corroborado essa tendência para a tribo. Fregonezi et al. (2006), estudando o gênero

Cestrum, encontraram CTLH variando de 63.3 μm, (C. strigilatum Ruiz & Pav, com o menor

cromossomo do cariótipo medindo 7,2 μm e o maior 8,6 μm) a 77,3 μm (C. intermedium Sendtn,

com cromossomos variando de 7,3 a 11,8 μm). As espécies Sessea corymbiflora Goudot ex

Rich. Taylor & R. Phillips e Vestia foetida Hoffmanns., pertencentes aos outros gêneros da

tribo, apresentam CTLH de 84,20 μm e 57,70 μm, respectivamente e, a média do tamanho

cromossômico para essas espécies é de 10,52μm em Sessea e 7,21μm em Vestia (Las Penas et

al., 2006). Sykorova et al. (2003) propôe que esse incremento do tamanho cromossômico na

76

tribo pode ser devido à substituição da sequência telomérica “tipo Arabidopsis” por sequências

teloméricas curtas (ITSs) que se dispersam por todo o genoma levando à sua ampliação.

Diferenças no tamanho cromossômico podem ser úteis na delimitação de alguns grupos

em Solanum. O gênero Solanum é extremamente diverso em termos morfológicos e ecológicos,

sendo considerado um dos mais ricos entre as angiospermas, agrupando cerca de 1500 espécies,

com cerca de 500 endemismos nas Américas Central e do Sul (D’Arcy, 1999; Wesse & Bohs,

2007). De acordo com a classificação formal (sensu D’Arcy 1972, 1991), Solanum é dividido

em sete subgêneros: Archaesolanum, Bassovia, Leptostemonum, Lyciosolanum, Minon,

Potatoe, e Solanum. Porém, estudos filogenéticos atuais apontam outas subdivisões para o

gênero. Segundo Bohs (2005) e Weese & Bohs (2007), Solanum agrupa 12 clados principais e,

Sarkinem (2013) apontam uma subdivisão em um menor número de clados (Särkinen et al.,

2013) (Figura 19).

No presente trabalho foram amostradas espécies de quatro clados dos 12 propostos por

Bohs (2005) e Weese & Bohs (2007): Lepstotemonum seção Acanthophora (S. palinacanthum

e S. acerifolium) e seção Torva (S. adspersum, S. scuticum e S. variabile), Geminata (S.

pseudocapsicum), Cyphomandra (S. diploconos) e Dulcamaroid (S. flaccidum e S. inodorum).

As espécies S. concinnum e S. sanctae-catharinae ainda não possuem uma posição bem

definida na filogenia.

O clado Cyphomandra (sensu Bohs 2005; Weese & Bohs 2007) (Figura 19),

anteriormente considerado um gênero distinto (Cyphomandra), foi incluído em Solanum após

análises filogenéticas baseadas nos genes plastidiais ndhF e rbcL (Bohs 1995, 2004, 2005; Bohs

& Olmstead 1997, 1999; Olmstead et al., 1999; Olmstead & Palmer 1997). Entretanto é de

grande importância a consideração de algumas características morfológicas, como anteras com

conectivos espessos e glandulares, para a manutenção desse grupo como um gênero

independente (Bohs 1989, 1994; Hunkinker 2001; Child & Lester 2001). Adicionalmente, o

maior tamanho cromossômico das espécies pertencentes ao antigo gênero Cyphomandra como

observado nesse trabalho na espécie S. diploconos, tem sido observado em muitos trabalhos,

como o de Miguel et al. (2012), Moscone et al. (1992), Pringle & Muray (1993), Rego et al.

(2009) (Tabela 3). Dessa maneira, existem fortes indícios para a separação do clado

Cyphomandra do gênero Solanum, como proposto por Child & Lester (2001), Moscone (1992)

e Hunziker (2001).

77

Figura 19. Relações filogenéticas em Solanum. Modificado de Särkinen et al. (2013)

Além do número cromossômico, outros caracteres cariotípicos amplamente

conservados em Solanaceae são a morfologia cromossômica e a simetria cariotípica. Quatro

dos cinco gêneros aqui estudados possuem cariótipo com predominância de cromossomos

metacêntricos e cariótipo simétrico. Acnistus arborescens foi a única espécie que apresenta

cromossomos exclusivamente metacêntricos, tendo assim o cariótipo mais simétrico. Entre os

representantes de Solanum e Cestum, bem como em B. uniflora, essa tendência também foi

observada. Em Solanum foram encontradas três espécies com o cariótipo mais assimétrico, S.

inodorum e S. palinacanthum com a predominância de cromossomos submetacêntricos e S.

acerifolium com predominância de cromossomos metacêntricos.

78

Exemplos ilustrativos dessa tendência á simetria cariotípica na família são os trabalhos

realizados nos gêneros Solanum (Acosta et al., 2005; Chiarini et al., 1996), Capsicum (Guerra

et al., 2001; Moscone et al., 1990, 1993; Pozzoboon et al. 2006) Lycium (Stiefkens &

Bernadello, 2012), Cestrum (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006; Las Peñas et al.,

2006), Brunfelsia (Boaventura et al., 1993), Lycianthes e Vassobia (Rego et al., 2009) os quais

mostram que a maioria das espécies desses gêneros já estudadas possuem cariótopos simétricos

segundo índices A1 e A2 (Zarco, 1986) com predominância de cromossomos metacêntricos.

A predominância de cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos no cariótipo de

algumas espécies é uma exceção que ocorre em alguns grupos da família, como visto no

presente trabalho na espécie P. pubecens. Algumas espécies do gênero Nicotiana (Burns, 1982;

Villa, 1984) e em alguns clados em Solanum (Acosta et al., 2005; Bernardello & Anderson,

1990; Chiarini et al., 2014), ocorre situação semelhante.

Entre as angiospermas em geral, o incremento da assimetria cariotípica está associada a

táxons mais derivados (Stebbins, 1971). Em alguns clados da família Solanaceae essa tendência

pode ser observada, como na tribo Cestreae (Las Peñas et al., 2006), Solanum seção

Acanthophora (Chiarini et al., 2014) e Nicotiana subgêneros Tabacum e Petunoides

(Goodspeed, 1954). Entretanto, geralmente a assimetria cariotípica não está associada à posição

basal ou derivada dos táxons na filogenia. O gênero Solanum aqui estudado, pertencente à

subfamília Solanoideae, considerada um grupo basal na filogenia (Martins & Barkman, 2005)

agrupa algumas espécies com o cariótipo assimétrico. Por outro lado, os representantes de

Cestrum, mais derivado segundo Martins & Barkman (2005), reúne espécies com o cariótipo

simétrico.

No gênero Solanum seção Basarthum (subg. Leptostemonum), composto por 22

espécies, a assimetria cariotípica associa-se a um incremento no tamanho do genoma, visto que

em sete espécies em o que CTLH apresenta valores superiores a 15μm, o cariótipo é mais

assimétrico, com a presença de cromossomos subtelocêntricos e telocêntricos (Bernadello &

Anderson, 1990). Já na seção Lisocarpa do mesmo subgênero, o cariótipo de seus

representantes é predominantemente simétrico, não sendo possível detectar nesse grupo uma

associação entre assimetria cariotípica e tamanho do genoma como na seção Basarthrum

(Bernadello & Anderson, 1990), já que aquelas espécies com cariótipo mais assimétrico

possuem os menores valores de CTLH (Bernadello et al., 1994). Nos dois grupos estudados não

foram identificadas inversões ou translocações em análises meióticas, assim a assimetria não

pode ser explicada por esses fatores.

79

No presente estudo foram analisadas cinco espécies de outras seções (sect. Acantophora

e Torva) do clado Leptostemonum e, na seção Acantophora, pode-se observar um aumento de

CTLH e assimetria cariotípica diferentemente das espécies da outra seção do mesmo clado. Na

seção Torva, o CTLH foi 25,17 µm em S. adspersum, 29,82 µm em S. scuticum e 32,77 µm em

S. variabile, porém todas as espécies apresentaram a mesma fórmula cariotípica (9m + 3sm), e

a soma dos índices A1+A2 atingindo o máximo em S. scuticum (0,36), evidenciando assim

cariótipos simétricos. Na sect. Acantophora, as espécies apresentaram maior CTLH, sendo

35,71 µm em S. acerifolium e 36,89 µm em S. palinacanthum. Essa última espécie apresentou

também maior número de cromossomos submetacêntricos (5m + 7sm) e o maior valor nos

índices entre as espécies aqui estudadas, A1+A2= 0, 54. Na seção Acanthophora, subg.

Leptostemonum, a assimetria cariotípica já havia sido relatada para o grupo (Chiarini et al.,

2014)

Em outros casos, a assimetria ocorre aleatoriamente em determinado grupo, como nos

clados de Solanum, Morelloid e Dulcamaroid (Moyetta et al., 2013) (Figura 20). As duas

espécies aqui estudadas pertencentes ao clado Dulcamaroid corroboram esses dados, já que S.

flaccidum apresenta cariótipo mais simétrico (9m + 2sm + 1st e A1+A2= 0,37) do que S.

inodorum (5m + 7sm e A1+A2 =0,49), portanto com cariótipo mais assimétrico.

A tribo Lyaceae que também é caracterizada por um cariótipo simétrico, com

predominância de cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, possui um gênero

monotípico, Phrodus, considerado basal na filogenia da tribo com o cariótipo mais assimétrico,

se opondo da mesma maneira à tendência postulada por Stebbins (1971). Caso semelhante

ocorre no gênero Capsicum (Sehr et al. submetido) e outros exemplos em muitos grupos de

plantas mostram que um incremento da assimetria não está associado a caracteres mais

derivados (e.g. Moretti 1990; Cota & Wallace 1995).

As espécies analisadas nesse trabalho apresentam certa uniformidade cariotípica

relatada para alguns gêneros de Solanaceae, relacionada ao número e morfologia

cromossômicos, bem como simetria do cariótipo. Entre as 16 espécies analisadas, apenas quatro

apresentaram um cariótipo mais assimétrico e P. pubescens e S. flaccidum foram as únicas que

apresentaram um par cromossômico subtelocêntrico. Em relação à assimetria cariotípica, não

foi encontrada uma tendência nos gêneros analisados, e nem mesmo entre os representantes de

Solanum. Na subfamília Solanoideae, considerada ancestral na família, a assimetria apareceu

no gênero Solanum.

Essa estabilidade no cariótipo conferida a alguns gêneros em Solanaceae, inclusive nos

estudados nesse trabalho, é uma evidência de ortoseleção cariotípica, que preserva

80

complementos cromossômicos semelhantes, independentemente do tamanho dos cromossomos

(Acosta et al., 2005; Moscone et al., 2003). Segundo Wu et al. (2010), inversões têm ocorrido

na história evolutiva da família em uma taxa bem maior que translocações, preservando assim

a morfologia cromossômica. Assim, o acúmulo de pequenos rearranjos cromossômicos

derivados de mudanças estruturais crípticas pode alterar a morfologia cromossômica em

algumas espécies ou grupos (Stebbins, 1971).

Entre as angiospermas, a ortoseleção cariotípica é encontrada em algumas espécies,

gêneros e famílias (Brandham et al., 1998). Existem situações em que os cariótipos de espécies

de determinado gênero são quase indistinguíveis. O gênero Billevalia Lapeyr. (família

Asparagaceae) é um exemplo em que todas as espécies apresentam cariótipos idênticos, com

x=4 e um par de cromossomos metacêntrico e três acrocêntricos (Ozhatay & Johnson, 1996).

A nível familiar, em Agavaceae Dumort.e Aloaceae Batch. também ocorre ortoseleção

cariotípica.

4.3 Bandamento cromossômico

O estudo das regiões heterocromáticas presentes no genoma da família Solanaceae tem

mostrado que existe uma grande diversidade em relação à composição e dispersão dessas

sequências no cariótipo dos gêneros estudados (Acosta et al., 212; Chiarini et al., 2014;

Fregonezi et al., 2006; Moscone et al., 1993). Variações no padrão de distribuição de

heterocoromatina (HC) são amplamente documentados, mas grandes mudanças em espécies

relacionadas de determinado grupo de plantas é um fato raro (Guerra, 2000).

Os cinco gêneros aqui estudados também apresentaram essa diversidade na composição

e distribuição da heterocromatina ao longo dos cromossomos. Foi possível encontrar diferentes

distribuições de DNA repetitivo (CMA+/DAPI-, CMA+/DAPI0, CMA+/DAPI+, CMA-/DAPI+,

CMA0/DAPI+) nas posições terminais, intercalares e associadas à NOR. Nesse trabalho foram

estudadas as regiões heterocromáticas com alta repetitividade de sequências AT e CG. No

entanto, podem existir outras regiões de heterocromatina distribuídas ao longo dos

cromossomos não evidenciadas pela técnica de bandamento utilizada, que poderiam ser

visualizadas através do bandamento C, por exemplo. Isso ocorre devido às variações que podem

ocorrer na heterocromatina constitutiva em relação ao tamanho e sequências que a compõem

(Sumner 2003).

A presença de heterocromatina rica em sequências GC, marcada por bandas

CMA+/DAPI-, associadas à NOR, tem sido observada em muitas espécies de Solanum,

http://www.ipni.org/ipni/idPlantNameSearch.do?id=50023895-1&back_page=%2Fipni%2FeditSimplePlantNameSearch.do%3Ffind_wholeName%3DAloaceae%26output_format%3Dnormal

81

Capsicum e Lycium (Brasileiro-Vidal et al., 2009; Chiarini et al., 2014; Melo et al., 2011;

Miguel et al., 2012; Moscone et al., 2007; Rego et al., 2009, Romero-da Cruz et al., 2015;

Stiefkens & Bernadello et al., 2010), bem como em espécies de outros grupos de plantas

(Guerra, 2000). As espécies aqui estudadas também apresentaram esse padrão, exceto S.

adspersum e S. concinnum, em que a HC associada à NOR é CMA+/DAPI0. O heteromorfismo

presente na NOR das espécies de Cestrum aqui estudadas, já foi observado em outras espécies

de Solanaceae (Brasileiro-Vidal et al., 2009; Moscone et al., 1995; Brasileiro-Vidal et al.,

2009). Esse fato pode ser atribuído a rearranjos que ocorrem na heterocromatina associada ao

satélite ou à NOR, promovendo eventual heteromorfismo nessas regiões (Sato, 1981).

Outros padrões de bandas heterocromáticas foram bem distintos entre os cinco gêneros

estudados, como a composição da heterocromatina na região terminal dos cromossomos.

Acnistus arborescens foi a espécie em que foi encontrada a maior diversidade na composição

das sequências repetitivas (CMA+/DAPI-, CMA+/DAPI+, CMA-/DAPI+, CMA0/DAPI+), ao

passo que em P. pubescens a heterocromatina presente nas regiões terminais é rica em

sequências AT (CMA-/DAPI+). Os dois representantes de Cestrum e B. uniflora não

apresentaram bandas terminais além das bandas visualizadas na região da NOR e, entre todos

os indivíduos de Solanum estudados, houve grande variação na composição das sequências

terminais. A localização terminal de bandas heterocromáticas tem sido reportada em algumas

espécies pertencentes ao gênero Solanum como, S. platense (Chiarini et al., 2014) S.

nitidibaccatum e S. luteum (Melo et al., 2011), S. eleagnifloium, S. pseodocapscium, S.

sisymbriifolium e S. chenopodioides (Acosta et al. 2012) e em muitas espécies do gênero

Capsicum (Moscone et al., 2007; Romero-da Cruz et al., 2015).

Na posição intercalar também foram encontradas regiões heterocromáticas marcadas

por bandas CMA+/DAPI- em algumas espécies, exceto em B. uniflora e S. sanctae-catharinae,

em que as bandas intercalares são CMA+/DAPI0. As bandas heterocromáticas intersticiais

possuem distribuição equilocal em diferentes grupos de espécies. Em A. arborescens, B.

uniflora, S. acerifolium, S. inodorum e S. sanctae-catharinae as bandas intersticiais localizam-

se no braço longo dos pares cromossômicos. Já em C. laevigatum e C. mariquitense essa

heterocromatina está presente nas proximidades do centrômero, também no braço longo. Por

outro lado, em S. diploconos, S. scuticum e S. variabile as bandas aparecem no braço curto de

um par cromossômico, embora em S. diploconos esteja mais proximamente ao centrômero.

A ocorrência de bandas CMA+ intersticiais tem sido observada no gênero Solanum.

Chirini et al. (2014) observaram bandas CMA+/DAPI- em quatro espécies do gênero Solanum

82

subg Lepstotemonum. Em S. mammosum L., S. platense Dieckmann e S. palinacanthum, essas

bandas possuem distribuição equilocal, em regiões intersticias e subterminais do braço longo

dos cromossomos, enquanto em S. aculeatissimum Jacq., ocorrem no braço curto. Em Solanum

subgênero Cyphomandra, também ocorre essa distribuição intersticial equilocal da

heterocromatina, como mostrado por Miguel et al. (2012), corroborando os dados aqui obtidos

para S. diploconos que pertence ao mesmo subgênero. Em Capsicum, bandas CMA+/DAPI e

CMA+/DAPI0 intersticiais também têm sido observadas em algumas cultivares de espécies

pertencentes ao gênero Capsicum (Moscone et al., 2007; Romero-da Cruz et al., 2015).

Outros padrões de distribuição de heterocromatina têm sido observados através do

bandamento C na família Solanaceae e, em alguns casos, esse bandamento é associado a

corantes fluorescentes (bandamento C-CMA e C-DAPI). Em trabalhos realizados com o gênero

Capsicum, por exemplo, tem sido mostrado a ocorrência de bandas C em na região centromérica

de todos os pares cromossômicos (Moscone et al., 1993). Em Cestrum ocorre grande

variabilidade na distribuição de bandas C-CMA+ e C-DAPI+, em regiões intersticiais, terminais

e pericentroméricas (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006). A localização de bandas

C-DAPI+ pericentroméricas também podem ser observadas em Lycianthes australe (C.V.

Morton) Hunz. & Barboza (Rego et al., 2009) e em algumas espécies de Solanum, bem como

em Vassobia breviflora (Sendtn.) Hunz. ocorrem bandas C-CMA+ na região terminal de todos

os pares cromossômicos (Rego et al., 2009). No gênero Nicotiana também é possível visualizar

grandes blocos C-DAPI+ no braço longo dos maiores pares cromossômicos de algumas espécies

(Nakamura et al., 2001).

Em geral, existe uma correlação positiva reportada para muitas famílias de plantas entre

o tamanho do cariótipo e o número e tamanho de bandas heterocromáticas uma vez que as

sequências codificantes do DNA são altamente conservadas ao longo da evolução (Chiarini et

al., 2014; Greilhuber, 1984; Pringle & Murray, 1993; Moscone et al., 1996; Benko-Iseppon &

Morawetz, 2000). Entretanto, nas espécies de Solanaceae aqui estudadas essa correlação não é

sustentada. As espécies com maior CTLH, C. laevigatum, C. mariquitense e S. diploconos,

apresentam os menores valores de heterocromatina na composição do genoma 2,73%, 2,05% e

1,87%, respectivamente. As espécies com maiores valores de heterocromatina, S. acerifolium

(51,95%), S. inodorum (35,92%) e P. pubescens (34,30%) apresentaram valores intermediários

de CTLH e S. sanctae-catharinae (20,34%) apresenta o menor valor de CTLH entre as espécies

estudadas. Essa correlação negativa já foi relatada e outros grupos de plantas, como por

exemplo, o gênero Pyrrhocactus A. Berger (Cactaceae) (Las Peñas et al., 2008). No entanto,

83

essas espécies com maior quantidade de heterocromatina citadas anteriormente, possuem um

cariótipo assimétrico e, essa correlação entre assimetria e número de bandas heterocromáticas

já foi reportada no gênero Solanum (Chiarini et al., 2014) e também em Pyrrhocactus

(Cactaceae) (Las Peñas et al., 2008).

Para essas espécies com alto valores de CTLH, o incremento do genoma pode estar

associado à inserção de elementos transponíveis nas regiões intergênicas de eucromatina. Sabe-

se que os retrotansposons das classes Gypsy e Copia são as sequências repetitivas mais

abundantes no genoma da maioria das plantas (Flavell et al., 1992a, 1992b). Esses

retroelementos também já foram sequenciados no genoma do tomate (S. lycopersicumL.)

(Morgante, 2006) e, em alguns cereais, onde esses elementos têm contribuído para o incremento

do tamanho do genoma (Morgante, 2006).

Diante da grande diversidade em relação ao número de bandas, composição, posição,

par cromossômico e proporção de heterocromatina em relação ao CTLH, entre os diferentes

gêneros estudados, bem como entre as espécies do gênero Solanum, é possível inferir que

diferentes modos de amplificação e dispersão dessas sequências podem estar ocorrendo no

genoma das Solanaceae a nível específico, gerando tal diversidade (Schweizer & Loidl 1987).

4.4 Número e localização de DNAr

Os sítios de DNAr 18S correspondentes à NOR em todos os indivíduos foram

fortemente marcados por bandas CMA+, a maioria DAPI-, exceto em P. pubescens (DAPI+) e

S. adpersum e S. concinnum (DAPI0). Nem todas as regiões CMA+, apresentam-se associadas

ao DNAr, mostrando que essas sequências CG podem ser independentes de genes de DNAr (Jo

et al., 2009). Em muitos grupos de plantas essa localização comum tem sido observada (Guerra

et al., 2000), bem como na família Solanaceae, como no gênero Solanum (Acosta et al., 2012;

Brasileiro-Vidalet al., 2009; Chiarini et al., 2014; Melo et al. 2011; Miguel et al. 2012) e

Cestrum (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006).

A localização dos sítios de DNAr 18-5.8-26S segue um padrão comum de distribuição

na grande maioria das espécies de plantas, preferencialmente em regiões terminais do braço

curto dos cromossomos (Roa & Guerra, 2012). A maioria das espécies aqui estudadas

apresentaram esse padrão de localização, exceto B. uniflora, em que o sítio de DNAr localiza-

se na região pericentromérica, e S. inodorum, que apresenta alguns sítios em posição intersticial

no braço longo. Em diferentes gêneros de Solanaceae já estudados, esses segmentos são

encontrados em diferentes números, mas na maioria das vezes em regiões terminais como

84

Cestrum (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006; Urdampilleta et al., 2014), Capsicum

(Moscone et al., 1995), Nicotiana (Lim et al., 2000) e Solanum (Chiarini et al., 2014).

A maioria das espécies aqui estudadas apresentaram um sítio de DNAr 18S, exceto C.

laevigatum, C. mariquitense e P. pubescens, que apresentaram dois sítios, e S. inodorum que

apresentou 18 sítios. Variações no número de sítios de DNAr 18S já foram reportadas em outros

estudos realizados para a família. No gênero Cestrum, já foi encontrada uma variação de quatro

a oito sítios (Fregonezi et al., 2006). Em Capsicum já foi reportada uma variabilidade de um a

oito pares cromossômicos com o locus (Aguilera et al., 2014; Kown e Kim, 2009, Romero-da

Cruz et al., 2015).

Em todas as espécies estudadas foi encontrado um par cromossômico portando o sítio

de DNAr 5S, exceto em A. arborescens, C. mariquitense, S. acerifolium e S. flaccidum, em que

foram encontrados dois pares cromossômicos com o locus para o gene. Essas variações também

já foram encontradas em estudos prévios realizados na família (Fregonezi et al., 2006; Rego et

al., 2009; Urdampilleta et al., 2014).

Em geral, os sinais de DNAr 5S são encontrados no braço curto de cromossomos

pequenos em Solanum (Rego et al., 2009; Chiarini et al., 2014). Entretanto, algumas vezes os

sinais estão presentes no braço longo (Rego et al., 2009) ou em cromossomos maiores (Dong

et al., 2000). Em outros gêneros, como Nicotiana (Lim et al., 2000) e Cestrum (Fregonezi et

al., 2006), o DNAr 5S está localizado em regiões pericentroméricas. Nas espécies aqui

estudadas também foi encontrada variabilidade em relação à posição dessas sequências.

Além disso, sítios de DNAr 5S intercalares estão co-localizados com regiões ricas em

sequências GC em A. arborescens, B. uniflora, C. laevigatum, C. mariquitense, S. concinnum,

S. sanctae-catharinae, S. diploconos, S. scuticum e S. variabile. A localização desses sítios em

regiões eucromáticas, como mostrada nas outras espécies, já foi reportada para outros

representantes de Solanaceae (Brasileiro-Vidal et al., 2009), evidenciando que algumas regiões

cromossômicas, contendo pequenas porções de DNA repetitivo podem estar distribuídas no

cariótipo e não serem diferenciadas por técnicas de bandamento.

Em geral, o número de sítios de DNAr 18-5.8-26S é mais polimórfico que os sítios de

DNAr 5S (Garcia et al., 2012). Mas na família Solanaceae tanto os sítios de DNAr 18S quanto

5S têm se mostrado altamente variáveis em relação ao número e posição. Esse tipo de variação

tem sido frequentemente encontrada entre espécies filogeneticamente relacionadas (Cai et al.,

2006; Melo & Guerra, 2003; Nani et al., 2015; Shishido et al., 2000) e até mesmo entre

85

cultivares ou acessos pertencente à uma mesma espécie (Bustamente et al., 2014; Rocha et al.,

2015; Pedrosa-Harand et al., 2006, Raskina et al., 2004b). Essa variabilidade documentada tem

levantado a hipótese de que os sítios de DNAr podem ser elementos móveis que compõem o

genoma e, diferentes mecanismos têm sido propostos para explicar tal mobilidade (Schubert &

Wobus 1985; Dubcovsky & Dvorak 1995).

Em Lotus japonicus (Regel) K. Larsen foi demonstrado que rearranjos estruturais, como

translocações podem ser responsáveis por mudanças em relação à localização dos sítios de

DNAr (Hayashi et al., 2001). A organização terminal ou subterminal desses segmentos pode

levar à ocorrência de rearranjos sem efeitos deletérios para a célula (Hanson et al., 1996;

Pedrosa-Harand et al., 2006). Por outro lado, mecanismos de dispersão, amplificação e deleção

do locus DNAr parecem ser os responsáveis por mudanças na posição de tais regiões na

radiação de espécies de Triticaceae (Dubcovsky and Dvorak, 1995). Outro possível evento

responsável pela dispersão de locus de DNAr seria a associação a elementos transponíveis. Já

foi mostrado em Cestrum (Fregonezi et al., 2007) e em Arabidopsis (Franz et al., 2000) que

elementos transponíveis se associam a NOR e podem estar envolvidos na mobilidade de tais

regiões. Estudos em Aegilops L. também sugerem que a mobilidade de tais regiões do DNA

pode ser mediada por elemento transponíveis (Raskina et al., 2004 a, b). A recombinação

ectópica, ocasionada por um crossing over desigual de determinados segmentos cromossômicos

também pode resultar na dispersão desses sítios de rDNA e, alguns estudos têm mostrado que

esse mecanismo está associado a variabilidade de locus terminais de DNAr (Pedrosa-Harand et

al., 2006; Raskina et al., 2004 a). Esses dados sugerem que os sítios de DNAr 5S e 18S não

apresentam uma localização e número de sítios conservados em Solanaceae e essa característica

parece ser comum em outros grupos de plantas, como por exemplo Sapindaceae Juss.

(Urdampilleta et al., 2006).

Tais mecanismos citados anteriormente, podem explicar também o heteromorfismo em

relação à posição e tamanho de regiões de DNAr presente em A. arborescens, C. laevigatum,

C. mariquitense e S. inodorum. Adicionalmente, estudos realizados em Asparagales mostram

que a perda da sequência telomérica tipo Arabidopsis pode favorecer a ocorrência de

recombinação ectópica nessa região (Pich et al., 1996; Adams et al., 2000). A presença de

sequências teloméricas diferentes de Arabidopsis em espécies do gênero Cestrum (Sycorova et

al., 2003) pode ser um mecanismo reponsável pela ocorrência do hetermorfismo encontrado no

tamanho dos sítios de DNAr 18s terminais em em C. laevigatum e C. mariquitense.

86

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

As espécies de Solanaceae aqui estudadas apresentaram certa uniformidade em alguns

caracteres cariotípicos, mas grande diversidade em outros, principalmente nos padrões de

distribuição de heterocromatina (analisado pelo bandamento CMA/DAPI) e de DNAr 5S e 18S.

O número cromossômico parece ser um caráter conservado dentro de cada gênero aqui

estudado. Para os gêneros que tiveram mais de uma espécie estudada, Solanum (2n=24) e

Cestrum não ocorreram variações quanto ao número cromossômico; os representantes de

Acnistus (2n=24), Brunfelsia (2n=22) e Physalis (2n=24) também apresentam a estabilidade,

relatada para os grupos, segundo a literatura.

Outro parâmetro cariotípico que se mostrou pouco variável foi a simetria cariotípica,

com predominância de cromosssomos metacêntricos no complemento, fato também bem

suportado pela literatura disponível para a família. Embora alguns representantes de Solanum

não apresentem essa característica, é possível associar essas diferenças a alterações pontuais a

nível específico que ocorrem no cariótipo, como inversões pericentroméricas, que podem

alterar a morfologia dos cromossomos. Diante disso, pode-se inferir que existe uma evidência

de ortoseleção cariotípica ocorrendo na família Solanaceae.

Os valores obtidos de CTLH mostraram diferenças significativas entre algumas espécies

estudadas e assim foi possível identificar um grupo de espécies que possui cromossomos

maiores formado pelos dois representantes de Cestrum e S. diploconos (subg Cyphomandra).

Dessa forma, conclui-se que S. diploconos possui CTLH estatisticamente diferentes dos outros

representantes do gênero, fornecendo mais uma evidência à manutenção de Cyphomandra

como um gênero distinto de Solanum.

As medidas da heterocromatina também mostraram diferenças significativas entre

algumas espécies, mas não mostrou uma correlação positiva com o aumento do CTLH. Com

isso, é possível inferir que o incremento do tamanho cromossômico em algumas espécies pode

estar relacionado à inserção de elementos transponíveis na eucromatina.

O padrão de distribuição da heterocromatina e DNAr foi bem distinto entre os cinco

gêneros estudados e essas diferenças podem ser úteis na separação dos gêneros e no

entendimento da evolução cariotípica da família. No entanto, entre os representantes de

Solanum, embora tenha ocorrido uma uniformidade no número e localização dos sítios de DNAr

5S e 18S (exceto em S. acerifolium e S. flaccidum), a distribuição da heterocromatina foi bem

87

variável. Com isso, devido à grande diversidade no número de espécies do gênero, essa

diferenciação da heterocromatina pode auxiliar no entendimento das diferenças morfológicas

ou ecológicas que ocorrem em espécies relacionadas.

88

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ANEXOS

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