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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
EUPÍDIO SCOPEL
APROVEITAMENTO INTEGRAL DO CAPIM ELEFANTE NA PRODUÇÃO DE
ETANOL CELULÓSICO
CAMPINAS
2019
EUPÍDIO SCOPEL
APROVEITAMENTO INTEGRAL DO CAPIM ELEFANTE NA PRODUÇÃO DE
ETANOL CELULÓSICO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química
da Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em
Química na área de Físico-Química.
Orientadora: Profa. Dra. Camila Alves de Rezende
O arquivo digital corresponde à versão final da Dissertação defendida pelo
aluno Eupídio Scopel e orientada pela Profa. Dra. Camila Alves de Rezende.
CAMPINAS
2019
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Camila Alves de Rezende (Orientador)
Profa. Dra. Ljubica Tasic (Instituto de Química - Unicamp)
Prof. Dr. Roberto Rinaldi Sobrinho (Imperial College London)
A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no
SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da
Unidade.
Este exemplar corresponde à redação
final da Dissertação de Mestrado
defendida pelo(a) aluno(a) Eupídio
Scopel, aprovada pela Comissão
Julgadora em 30 de julho de 2019.
À minha mãe, Adriana,
minha avó, Maria José
e minha irmã, Gabriela
“Nós só podemos ver um pouco do futuro,
mas o suficiente para perceber que há muito a
fazer.”
Alan Turing
“We are souls dressed up in biochemical
garments and our bodies are the instruments
through which our souls play their music.”
Albert Einstein
AGRADECIMENTOS
Esse trabalho e essa lista de agradecimentos (maior do que eu
imaginava, por sinal) só reforçam que eu fiz uma ótima escolha quando resolvi sair
do Espírito Santo para uma nova experiência no mestrado. Esses últimos dois anos
foram marcados por muitas pessoas que eu queria agradecer. Pessoas que não
somente contribuíram para a realização do trabalho, mas também para o meu
crescimento pessoal.
Agradeço à professora Camila, por toda a atenção e acolhimento desde
as primeiras conversas por e-mail, que se estenderam por toda a condução do
trabalho. Seu exemplo como professora e pesquisadora marcaram a minha visão
sobre ciência, docência e o cuidado com escrita e apresentações. Além de tudo,
lembrarei e serei eternamente grato por ter feito muito mais do que deveria por mim
durante seu período de licença maternidade. Muito obrigado!
A todos do LaQuiMoBio, Henrique, Elisa, Camilla, Bruna Sussai, Lidiane,
Sandra, Helena, José e Bruna Botelho, pelas discussões nas reuniões de grupo e
nos cafés, que enriqueceram esse trabalho, além, é claro, dos piqueniques na Praça
da Paz e outros tantos momentos de (muita) comida e diversão. Vocês fizeram eu
sentir como se eu tivesse estado na Unicamp desde a graduação. Muito obrigado!
À Andreza e ao Douglas, técnicos do laboratório, por toda a
disponibilidade em sempre resolver os problemas cotidianos e por terem sido
sempre tão prestativos. Além disso, agradeço aos técnicos dos laboratórios
institucionais, Ricardo, Hugo, Pri, Claudinha, Renata e Deborah, pelas ajudas nas
análises, treinamentos, dicas e resolução dos problemas que apareciam. Também a
todos da CPG, especialmente à Bel, à Janaína e ao Diego, pelas ajudas nas
soluções das dúvidas burocráticas.
Ao professor Celso Bertran, por ter permitido realizar os ensaios de
moagem no moinho de bolas; também ao Vitor e à Mari por terem me ajudado nas
moagens.
À professora Susanne Rath e todo pessoal do laboratório Paracelsus,
pela ajuda com as análises no PLE, especialmente à Nati e ao Rudson, que me
acompanharam para a realização dos experimentos.
Ao professor Julian Martínez, por ter permitido a realização dos ensaios
com CO2 supercrítico no seu laboratório, e à Luana por ter me acompanhado e
discutido comigo os resultados das extrações. Também ao Matheus por ter discutido
comigo os resultados das caracterizações dos extratos.
À professora Rosana Goldbeck e à Guta, pela ajuda com os experimentos
de fermentação no laboratório LEMeB, na FEA. Além dos experimentos, agradeço
também à professora Rosana e à professora Taícia Fill, pelos comentários no
Exame de Qualificação de Área à professora Ljubica Tasic e ao professor Roberto
Rinaldi por terem participado da banca de defesa.
Ao LNNano e à Bruna, pelos experimentos no micro-CT.
Além do pessoal do laboratório, quero agradecer a todos que fizeram
parte dessa etapa da minha vida em Campinas, Thiago, Laris, Victor, Robson,
Roney, Gesiane, Tsu, Mari, Gerion, PT, Murilo e Rafa e aos amigos de casa, Ana,
Elisa, Sarah e Walter, por todos as saídas para festas, comidas, passeios, viagens,
que tornaram tudo mais divertido. Também agradeço aos amigos do Espírito Santo,
Júlia, Guilherme, Márcio, Danilo, Rafael, Gabriel e Patrick pelas visitas à SP, aos
acolhimentos e saídas no ES, que marcaram esse período.
Ao Cleocir, à Carla e à Maristela, meus professores da Ufes, pelo convite
para a participação na III SEQUINES para ministrar o minicurso e participar da mesa
redonda. Ao Cleocir e à Carla, agradeço também por terem sido meus orientadores
e terem contribuído também para a publicação dos artigos e do capítulo do livro
nesses últimos dois anos.
Agradeço imensamente à minha mãe, Adriana, minha avó, Maria José e
minha irmã, Gabriela, por terem acreditado em mim, investido na minha educação,
por aceitarem quem eu sou. Amo vocês, e o mais legal é saber que esse sentimento
é mútuo. Muito obrigado!
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de
Financiamento 001.
Ao CNPq, pela bolsa do mestrado e pelo financiamento do projeto do
grupo de pesquisa (420031/2018-9).
À Fapesp, pelo auxílio financeiro para a pesquisa no grupo (projetos
2016/13602-7 e 2018/23769-1).
À FAEPEX, pelo auxílio para a apresentação do trabalho no 41st SBFC,
em Seattle.
A Deus, por ter me guiado para que meus caminhos me trouxessem até
aqui.
RESUMO
O cenário ideal para viabilizar a utilização da biomassa como fonte para
combustíveis, materiais e outros insumos químicos é o de uma biorrefinaria. Nele, o
máximo dos seus componentes é aproveitado, de modo integrado e com o menor
gasto possível de insumos e energia. Neste trabalho, o capim elefante foi utilizado
como substrato para uma biorrefinaria, visando à produção de etanol celulósico
como produto principal e acoplando a esse processo a recuperação de extrativos,
hemicelulose e lignina. A maior recuperação de extrativos foi obtida na extração com
líquidos pressurizados (cerca de 7% da biomassa in natura), levando a obtenção de
extratos ricos em fenólicos e esteroides, principalmente. A utilização de tratamentos
com ácidos diluídos levou a extração de cerca de 70% da hemicelulose do substrato
e possibilitou a recuperação de cerca de 190 kg de xilose/ton de biomassa a partir
do licor ácido. Para a lignina, pode-se recuperar 138 kg/ton de folhas e 85 kg/ton de
colmos quando se aplica um tratamento com base diluída sequencialmente. No
entanto, maiores quantidades de etanol foram obtidas quando o tratamento alcalino
foi aplicado diretamente à biomassa in natura (70 e 78 kg/ton de folhas e colmos,
respectivamente) quando comparados aos tratamentos sequenciais ácido-base (62
e 60 kg/ton. para folhas e colmos, respectivamente). A moagem em moinho de bolas
aplicada à biomassa também levou ao aumento da taxa de conversão de celulose
até aproximadamente 100%.
A caracterização química e morfológica dos substratos pré-tratados foi
utilizada para explicar os resultados de hidrólise enzimática obtidos, que possuem
forte relação com a remoção dos componentes, como hemicelulose e lignina, no
processo de exposição das fibras de celulose, aumento da área superficial e
porosidade. A partir das discussões, três diferentes cenários foram propostos
visando à obtenção integrada de etanol e lignina (Cenário 1), etanol, hemicelulose e
lignina (Cenário 2) e etanol, extrativos e lignina (Cenário 3). Essa abordagem
representa uma possibilidade para a viabilização de biorrefinarias para diversificar as
fontes de obtenção de produtos tradicionalmente obtidos de fontes não renováveis.
ABSTRACT
The ideal scenario to enable the production of fuels, materials and other
chemicals from ligocellulosic biomass is a biorefinery. In this work, elephant grass
was used as raw material in a biorefinery scheme, aiming at the production of
cellulosic ethanol mainly, but also at the recovery of extractives, hemicellulose and
lignin. Higher extractive recovery was achieved using pressurized liquid extractions
(ca. 7% of biomass in natura), leading to extracts rich in phenolics and steroids.
Diluted acid treatments extracted ca. 70% of hemicellulose and allowed the recovery
of 190 kg of xylose/ton biomass. For lignin, 138 kg/ton of leaves and 85 kg/ton of
stems were recovered by a sequential treatment using diluted acid and alkali
solutions. However, a higher amount of ethanol was obtained when the alkaline
treatment is applied alone and directly on the biomass (70 and 78 kg/ton of leaves
and stems, respectively). Under sequential treatments, 62 and 60 kg/ton of leaves
and stems were obtained, respectively. The use ball milling as a pretreatment step
increased the conversion of cellulose into glucose.
Chemical and morphological characterizations of pretreated substrates
were used to explain the enzymatic hydrolysis results, which are strongly associated
to the removal of hemicellulose and lignin from cellulosic fibers, to substrate
exposure and to the increase of surface area and porosity. Finally, three scenarios
were proposed, aiming at an integrated production of ethanol and lignin (Scenario 1);
ethanol, hemicellulose and lignin (Scenario 2); or ethanol, extractives and lignin
(Scenario 3). From these scenarios, elephant grass was used to produce fuels,
materials and chemicals traditionally produced from non-renewable sources.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Comparação entre processos para a obtenção de combustíveis, insumos
químicos e materiais de uma refinaria de petróleo e uma biorrefinaria. Adaptado de
Ragauskas e colaboradores1. ................................................................................... 20
Figura 2. Representação esquemática da composição da parede celular vegetal,
formada por cadeias de celulose estruturadas em microfibrilas e envoltas por
hemicelulose e lignina, formando as macrofibrilas. ................................................... 22
Figura 3. Estrutura da celobiose, unidade repetitiva da celulose, formada pela união
de duas moléculas de glicose por meio de uma ligação β-1,4. ................................. 23
Figura 4. Modelo para a estruturação das fibras de celulose em regiões amorfas e
cristalinas. ................................................................................................................. 24
Figura 5. a) Exemplos de monossacarídeos que compõem a hemicelulose nas suas
formas cíclicas: glicose, manose e galactose (hexoses) e xilose e arabinose
(pentoses); b) Estruturação dos açúcares na biomassa lignocelulósica. .................. 25
Figura 6. a) Estrutura dos três monolignois (álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e
álcool sinapílico) constituintes da lignina; b) Exemplo de estrutura proposta para a
macromolécula de lignina, formada pela união dos monolignois. ............................. 27
Figura 7. Mecanismo proposto para a solubilização da sílica em meio alcalino por
meio da despolimerização iniciada pelo ataque nucleofílico da hidroxila ao silício,
seguido pela quebra das ligações Si-O ..................................................................... 31
Figura 8. Esquema das etapas para a produção de etanol celulósico. .................... 33
Figura 9. Esquema para os pré-tratamentos da biomassa lignocelulósica visando o
aumento da digestibilidade enzimática. ..................................................................... 34
Figura 10. Número de artigos utilizando a palavra-chave “Biorefinery” indexados na
base de dados Web of Science em cada ano entre 2004 e 2018. ............................ 37
Figura 11. Mecanismo esperado para a hidrólise da hemicelulose em seus
monômeros, utilizando como exemplo uma cadeia de xilano. .................................. 42
Figura 12. Principais ligações envolvidas na união covalente entre lignina e cadeias
de celulose. ............................................................................................................... 42
Figura 13. Mecanismo para a fragmentação da lignina por meio da quebra das
ligações β-O-4 em decorrência da hidrólise básica. .................................................. 43
Figura 14. Esquema para a moagem em moinho de bolas planetário, utilizado para
reduzir a cristalinidade da celulose.. ......................................................................... 44
Figura 15. Fotografia da plantação de capim elefante do Instituto de Zootecnia
(Nova Odessa, SP) de onde as amostras foram colhidas. ........................................ 45
Figura 16. Modelo do capim elefante e diferenciação ente colmos e folhas. ........... 51
Figura 17. Representação esquemática do sistema de extração com fluidos
pressurizados. ........................................................................................................... 52
Figura 18. a) Equipamento utilizado para as extrações com líquidos pressurizados
(Dionex ASE 350, Thermo Scientific); b) Esquema de funcionamento do processo. 53
Figura 19. Esquema para a determinação da composição química da biomassa
lignocelulósica. .......................................................................................................... 58
Figura 20. Rampa de aquecimento utilizada para a calcinação de matéria inorgânica
e determinação de cinzas totais ................................................................................ 59
Figura 21. Produtos formados na hidrólise para a quantificação da biomassa
lignocelulósica. .......................................................................................................... 61
Figura 22. Indicação dos picos da celulose (002 e 101) e do vale amorfo (Iam) nos
difratogramas de raios-X de capim elefante.. ............................................................ 63
Figura 23. Esquema geral da biorrefinaria de capim elefante proposta no trabalho. 65
Figura 24. Perfil do ensaio cinético realizado para as extrações com scCO2 em: a)
folhas; e b) colmos. ................................................................................................... 68
Figura 25. Rendimentos de extração para folhas e colmos e folhas ........................ 69
Figura 26. Composição percentual dos extratos caracterizados por GC-MS para
folhas (a e c) e colmos (b e d). .................................................................................. 76
Figura 27. Percentual das classes de compostos presentes nos extratos
considerando os rendimentos de extração. ............................................................... 77
Figura 28. Percentual mássico restante de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas
após os pré-tratamentos para as folhas em relação à massa inicial: a) folhas; b)
colmos. ...................................................................................................................... 81
Figura 29. Composição da matéria inorgânica do capim elefante determinada por
XRF. .......................................................................................................................... 83
Figura 30. Índice de cristalinidade das amostras pré-tratadas antes e após a
moagem em moinho de bolas (12 bolas de 20 mm a 250 rpm por 2 h). ................... 85
Figura 31. Massa de açúcar liberada pela hidrólise enzimática dos substratos após a
extração com scCO2 e PLE. ...................................................................................... 86
Figura 32. Imagens de FESEM das folhas in natura (a e b); submetidas à extração
com scCO2 (c e d); somente com PLE, utilizando água e etanol (e e f); e sequencial
scCO2-PLE (água e etanol) (g e h). ........................................................................... 88
Figura 33. Imagens de FESEM dos colmos in natura (a); submetidos à extração com
scCO2 (b); somente com PLE, utilizando água e etanol (c); sequencial scCO2-PLE
(água e etanol) (d). .................................................................................................... 89
Figura 34. Quantidade de açúcares liberados por grama de substrato após a
hidrólise enzimática das amostras submetidas ao tratamento com ácido e base
diluídos. ..................................................................................................................... 90
Figura 35. Correlações entre teores de um determinado componente no sólido e a
quantidade de glicose liberada pela hidrólise enzimática para folhas e colmos:
celulose (a e b); carboidratos (soma de celulose e hemicelulose) (c e d); lignina (e e
f). ............................................................................................................................... 92
Figura 36. Imagens de FESEM para as folhas: In natura (a); Ácido (b); Ácido-Base
(20 min) (c); Ácido-base por 100 min (d); Somente básico por 20 min (e); Somente
básico por 100 min (f); PLE e básico por 20 min (g); PLE e básico por 100 min. ..... 94
Figura 37. Imagens de FESEM para os colmos: In natura (a); Ácido (b); Ácido-Base
(20 min) (c); Ácido-base por 100 min (d); Somente básico por 20 min (e); Somente
básico por 100 min (f); PLE e básico por 20 min (g); PLE e básico por 100 min. ..... 95
Figura 38. Imagens de micro-CT das folhas de capim elefante: In natura (a);
Submetidas a tratamento ácido (b); tratamento sequencial ácido-base (c); e somente
a tratamento básico (d). ............................................................................................ 97
Figura 39. Imagens de micro-CT dos colmos de capim elefante: In natura (a);
Submetidas a tratamento ácido (b); tratamento sequencial ácido-base (c); e somente
a tratamento básico (d). ............................................................................................ 98
Figura 40. Quantidade de açúcares liberados por grama de substrato após a
hidrólise enzimática das amostras submetidas ao tratamento com ácido e base
diluídos e após moagem. .......................................................................................... 99
Figura 41. Imagens de FESEM das amostras moídas em moinho de bolas: folhas
submetidas a tratamento sequencial ácido-base por 20 min (a e b); somente básico
por 20 min (c e d); colmos submetidos a tratamento sequencial ácido-base por 20
min (e e f); e somente básico por 20 min (g e h). .................................................... 100
Figura 42. Resumo da liberação de açúcares das amostras in natura e submetidas a
tratamentos químicos e físicos. ............................................................................... 102
Figura 43. Relação entre a quantidade de glicose liberada pela hidrólise enzimática
e o percentual de conversão de celulose em glicose: a) folhas; e b) colmos. ......... 103
Figura 44. Massas de açúcares fermentáveis obtidos a partir de 1 tonelada de
biomassa. ................................................................................................................ 104
Figura 46. Ensaio cinético para a fermentação e obtenção de etanol: a) folhas; b)
colmos. .................................................................................................................... 107
Figura 46. Esquema do Cenário 1 para a biorrefinaria de capim elefante para folhas
(acima) e colmos (abaixo): obtenção de etanol e recuperação de lignina. .............. 109
Figura 47. Esquema do Cenário 2 para a biorrefinaria de capim elefante para folhas
(acima) e colmos (abaixo): obtenção de etanol, recuperação de hemicelulose e
lignina. ..................................................................................................................... 111
Figura 48. Esquema do Cenário 3 para a biorrefinaria de capim elefante para folhas
(acima) e colmos (abaixo): obtenção de etanol, recuperação de hemicelulose e
lignina. ..................................................................................................................... 113
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resumo das aplicações do capim elefante publicadas no período de
janeiro de 2004 a maio de 2019 de acordo com a base de dados Web of Science
(Palavras-chave: Elephant grass), com exceção das aplicações para alimentação
animal. ....................................................................................................................... 47
Tabela 2. Conclusões a respeito da otimização dos pré-tratamentos ácido-base. ... 49
Tabela 3. Condições experimentais para a escolha da condição de moagem em
moinho de bolas. ....................................................................................................... 55
Tabela 4. Significado dos códigos utilizados para nomear as amostras. .................. 56
Tabela 5. Fatores de conversão utilizados para a determinação dos teores de
celulose e hemicelulose a partir dos açúcares, ácidos orgânicos e produtos de
degradação determinados por HPLC. ....................................................................... 61
Tabela 6. Cálculo da constante S/F para a extração com scCO2. ............................ 68
Tabela 7. Compostos presentes nos extratos quantificados por GC-MS. ................. 71
Tabela 8. Composição química e massa de sólido remanescente após pré-
tratamentos com ácidos e bases diluídos. As análises foram realizas em duplicata e
os erros correspondem ao desvio padrão. ................................................................ 78
Tabela 9. Planejamento experimental para a moagem em moinho de bolas. .......... 84
Tabela 10. Caracterização dos componentes presentes nas frações líquidas dos
tratamentos químicos. ............................................................................................. 106
Tabela 11. Quantidade de etanol produzida a partir de 1 tonelada de biomassa e
rendimento do processo. ......................................................................................... 107
Tabela A1. Percentual mássico de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas
considerando o rendimento após os tratamentos. ................................................... 128
Tabela A2. Quantidade açúcar liberado após a hidrólise enzimática por grama de
biomassa e percentual de conversão de celulose em glicose. ................................ 129
Tabela A3. Quantidade de açúcares obtidos a partir de 1 ton. de biomassa
considerando rendimentos ...................................................................................... 130
SUMÁRIO
1. Introdução ......................................................................................................... 19
1.1 Composição da biomassa lignocelulósica .............................................. 21
1.1.1 Celulose ................................................................................................. 22
1.1.2 Hemicelulose ......................................................................................... 25
1.1.3 Lignina ................................................................................................... 26
1.1.4 Extrativos ............................................................................................... 29
1.1.5 Cinzas .................................................................................................... 30
1.2 Produção de etanol celulósico.................................................................. 32
1.2.1 Pré-tratamentos ..................................................................................... 33
1.2.2 Hidrólise enzimática ............................................................................... 35
1.2.3 Fermentação.......................................................................................... 36
1.3 Biorrefinarias .............................................................................................. 36
1.4 Métodos para o fracionamento e melhoria da digestibilidade enzimática
utilizados neste trabalho ..................................................................................... 39
1.4.1 Extrações com CO2 supercrítico ............................................................ 39
1.4.2 Extrações com líquidos pressurizados .................................................. 40
1.4.3 Tratamentos com ácidos e bases diluídos ............................................. 41
1.4.4 Moagem em moinho de bolas................................................................ 43
1.5 Capim elefante ............................................................................................ 45
1.5.1 Características ....................................................................................... 45
1.5.2 Aplicações do capim elefante ................................................................ 46
1.5.3 Trabalhos anteriores do grupo de pesquisa .......................................... 47
2. Objetivos ........................................................................................................... 50
3. Materiais e métodos ......................................................................................... 51
3.1 Preparo da biomassa..................................................................................... 51
3.2 Pré-tratamentos e fracionamento dos componentes .............................. 51
3.2.1 Extração com CO2 supercrítico .............................................................. 52
3.2.2 Extrações com líquidos pressurizados .................................................. 53
3.2.3 Tratamentos com ácido diluído .............................................................. 54
3.2.4 Tratamento com base diluída ................................................................ 54
3.2.5 Moagem em moinho de bolas................................................................ 54
3.2.6 Nomenclatura das amostras .................................................................. 56
3.3 Hidrólise enzimática ................................................................................... 57
3.4 Fermentação ............................................................................................... 57
3.5 Determinação da composição química dos sólidos ............................... 57
3.5.1 Cinzas totais .......................................................................................... 58
3.5.2 Extrativos ............................................................................................... 59
3.5.3 Celulose, hemicelulose e lignina............................................................ 59
3.5.4 Quantificação dos açúcares liberados ................................................... 60
3.6 Determinação da composição química das frações líquidas ................. 62
3.7 Determinação dos açúcares obtidos após a hidrólise enzimática ........ 62
3.8 Caracterizações .......................................................................................... 62
3.8.1 Identificação dos extratos ...................................................................... 62
3.8.2 Índice de cristalinidade .......................................................................... 63
3.8.3 Composição química das cinzas ........................................................... 64
3.8.4 Análise morfológica ............................................................................... 64
4. Resultados e Discussão .................................................................................. 65
4.1 Proposta de biorrefinaria ........................................................................... 65
4.2 Fracionamento dos extrativos .................................................................. 67
4.2.1 Ensaio cinético para a extração com scCO2 .......................................... 67
4.2.2 Rendimentos das extrações .................................................................. 69
4.2.3 Composição dos extratos ...................................................................... 69
4.3 Fracionamento de hemicelulose e lignina ............................................... 78
4.4 Composição das cinzas ............................................................................. 82
4.5 Efeito da moagem em moinho de bolas ................................................... 83
4.5.1 Escolha da condição de moagem .......................................................... 83
4.5.2 Efeito da moagem na cristalinidade da biomassa.................................. 84
4.6 Efeito dos tratamentos na digestibilidade enzimática ............................ 86
4.6.1 Efeito das extrações .............................................................................. 86
4.6.2 Análise morfológica dos substratos após as extrações ......................... 87
4.6.3 Efeito dos tratamentos com ácidos e bases diluídos ............................. 89
4.6.4 Alterações morfológicas dos substratos após os tratamentos com ácidos
e bases diluídos ................................................................................................. 93
4.6.5 Efeito da moagem em moinho de bolas ................................................ 99
4.6.6 Visão geral do efeito dos processos na digestibilidade enzimática ..... 101
4.6.7 Conversão de celulose em glicose ...................................................... 102
4.6.8 Avaliação dos açúcares liberados considerando os rendimentos ....... 103
4.7 Caracterização das frações líquidas ...................................................... 105
4.8 Fermentação ............................................................................................. 106
4.9 Propostas de cenários ............................................................................. 108
4.9.1 Cenário 1: Produção de etanol e recuperação de lignina .................... 108
4.9.2 Cenário 2: Produção de etanol, recuperação de hemicelulose e lignina
..............................................................................................................110
4.9.3 Cenário 3: Produção de etanol, recuperação de extrativos e lignina ... 112
5. Conclusões ..................................................................................................... 114
6. Referências bibliográficas ............................................................................. 116
7. APÊNDICES .................................................................................................... 128
19
1. Introdução
A biomassa lignocelulósica, composta majoritariamente por celulose,
hemicelulose e lignina, além de extrativos e matéria inorgânica, é uma fonte
promissora para a produção de combustíveis, materiais e outros insumos químicos.
Dentre os possíveis produtos derivados desse substrato, destaca-se o etanol de
segunda geração (2G), também chamado de etanol celulósico, que é obtido a partir
da hidrólise dos carboidratos em açúcares que são fermentáveis.
A utilização de combustíveis de origem vegetal apresenta uma vantagem
frente à produção de combustíveis fósseis, por serem obtidos a partir de uma fonte
renovável, que não interfere no ciclo do carbono, sendo considerados uma “energia
limpa”1,2. No entanto, apesar das claras vantagens ambientais, para que o etanol
celulósico possa competir com o petróleo e com o etanol de primeira geração (obtido
a partir da sacarose ou do amido), alternativas que viabilizem seu custo são
necessárias.
São apontados dois possíveis caminhos para a viabilização do etanol
celulósico: a otimização dos processos produtivos, pela redução de quantidades de
insumos químicos, tempo e energia; e o aproveitamento dos subprodutos que são
gerados no fracionamento da biomassa, em um processo integrado3. Esses
caminhos recebem o nome de biorrefinaria, em analogia a uma refinaria petrolífera,
em que o máximo dos componentes da biomassa seria utilizado, de forma similar ao
que ocorre com o petróleo, como esquematizado na Figura 1. Atualmente, a maioria
dos combustíveis, materiais e insumos químicos utilizados são provenientes do
refino e processamento do petróleo; o que se deseja é alterar esse paradigma para
utilizar a biomassa lignocelulósica como fonte desses produtos, tornando o processo
produtivo mais sustentável. Além disso, o CO2 liberado na decomposição ou
combustão dos produtos é utilizado para o crescimento das plantas, o que não
desregula o ciclo do carbono e não contribui para o aumento do efeito estufa.
20
Figura 1. Comparação entre processos para a obtenção de combustíveis, insumos químicos
e materiais de uma refinaria de petróleo e uma biorrefinaria. Adaptado de Ragauskas e
colaboradores1.
Embora a biomassa possua características que justifiquem e permitam
sua utilização como fonte de carbono, somente 14,1% do total de energia consumido
mundialmente é proveniente de fontes renováveis4. Desses, a utilização de
biomassa para geração de energia representa 73%, sendo que o principal modo de
obtenção é pela queima direta desse substrato. Quanto aos combustíveis utilizados
no transporte, apenas 2,8% são biocombustíveis, destacando-se o bioetanol, o
biodiesel e o biogás. No Brasil, o percentual de utilização de fontes renováveis no
cenário energético é acima da média global (41,0%), devido, dentre outros fatores, à
utilização em larga escala do etanol de primeira geração, obtido a partir da
fermentação do caldo da cana-de-açúcar, como combustível.
A composição química da biomassa lignocelulósica, além da sua alta
disponibilidade, a tornam, portanto, um substrato de alto valor biotecnológico para
21
ser utilizado como fonte de carbono nesses processos, agregando maior valor
quando comparado com a queima direta deste material para a produção de energia.
Portanto, as biorrefinarias representam uma possibilidade de valorizar a biomassa e
contribuir para um panorama energético mais sustentável.
Neste contexto, as próximas seções abordarão os aspectos mais
importantes relacionados à proposta de uma biorrefinaria: as características
químicas dos componentes da biomassa lignocelulósica, que permitem que ela seja
utilizada para a produção de etanol celulósico, foco deste trabalho, e também de
outros insumos químicos e materiais; os métodos de fracionamento destes
componentes, que impactam em quais produtos podem ser obtidos e são um dos
principais fatores no custo do processo; o processo de produção do etanol
celulósico, que envolve, além da obtenção de um substrato rico em celulose, etapas
de hidrólise e fermentação; por fim, será feita uma pequena introdução a respeito do
capim elefante, justificando as razões pela qual foi a biomassa escolhida para ser
investigada nesse trabalho.
1.1 Composição da biomassa lignocelulósica
A Figura 2 apresenta um modelo para a estruturação dos componentes
principais na parede celular vegetal5. De modo simplificado, cerca de 36 cadeias de
celulose estão unidas principalmente por meio de ligações de hidrogênio inter e
intramoleculares, além de interações de van der Waals, formando as microfibrilas de
celulose. Hemicelulose e lignina unem as fibrilas em estruturas maiores, chamadas
de macrofibrilas, que compõem a parede celular das plantas. Além desses
componentes, certa quantidade de matéria inorgânica está presente, denominada
como cinzas, além de outras moléculas orgânicas, chamadas de extrativos.
22
Figura 2. Representação esquemática da composição da parede celular vegetal, formada
por cadeias de celulose estruturadas em microfibrilas e envoltas por hemicelulose e lignina,
formando as macrofibrilas. Adaptado de Volynets e colaboradores5.
Devido à complexa estruturação dos componentes na parede celular
vegetal, um dos principais desafios para viabilizar a utilização da biomassa na
produção de insumos foi desenvolver métodos eficientes para a separação dos
componentes. Diferentemente do petróleo, onde os componentes são, em sua
maioria, voláteis, na biomassa lignocelulósica os métodos de extração utilizando
líquidos são os principais caminhos para o fracionamento1. Por serem métodos mais
específicos, também são mais caros. Portanto, é indispensável avaliar as
propriedades químicas desses componentes para o planejamento dos métodos mais
adequados de fracionamento e conversão.
1.1.1 Celulose
A celulose é um polímero formado por moléculas de glicose unidas por
ligações glicosídicas β-1,4, conforme demonstrado na Figura 3. Na planta, as
cadeias de celulose podem conter de 2000 a 25000 resíduos de glicose, formando
as microfibrilas, que são regiões relativamente impermeáveis e resistentes à ação
química ou à degradação biológica6.
23
Eq. 1
Figura 3. Estrutura da celobiose, unidade repetitiva da celulose, formada pela união de duas
moléculas de glicose por meio de uma ligação glicosídica β-1,4.
A celulose é sintetizada pelas plantas a partir da conversão de CO2 e
água pela ação da luz nos cloroplastos7 (Equação 1). Esse é um processo
biossintético para o armazenamento de carbono na forma de macromoléculas de
celulose; portanto, o saldo de CO2 liberado na decomposição dos materiais e
combustíveis é compensado por sua utilização para o crescimento de novas plantas,
mais rapidamente do que ocorre com o petróleo.
nCO2 + nH2O + luz → (CH2O)n + nO2
Devido ao arranjo supramolecular de suas cadeias, as fibrilas de celulose
na planta apresentam regiões cristalinas e regiões amorfas, conforme ilustrado na
Figura 4. As regiões amorfas são mais susceptíveis à ação química e enzimática, e,
geralmente, são mais facilmente hidrolisadas para a formação de nanoestruturas8,9,
justamente pela menor organização das cadeias, quando comparadas às regiões
cristalinas.
24
Figura 4. Modelo para a estruturação das fibras de celulose em regiões amorfas e
cristalinas.
Devido à combinação dessas diversas características, a celulose é
insolúvel em solventes convencionais. Alguns métodos para a solubilização da
celulose envolvem sua modificação química, por meio da produção de derivados
celulósicos, como o acetato de celulose10, pela dissolução com NaOH11 ou pela
utilização de líquidos iônicos12. Por outro lado, a baixa solubilidade da celulose tem
vantagens, pois permite, por exemplo, que a separação dos componentes da
biomassa lignocelulósica seja feita por meio da extração de hemicelulose, lignina,
extrativos e cinzas, obtendo-se um sólido rico em celulose.
A aplicação mais utilizada deste biopolímero é na produção de papel,
obtido principalmente de eucalipto13. De fato, a madeira é a principal fonte para a
obtenção de celulose, que também é utilizada para a produção de derivados
celulósicos, como ésteres e éteres, aplicados como coatings, filmes e aditivos em
fármacos e cosméticos13. Como mencionado, diversos estudos estão atualmente
direcionados para a obtenção de etanol a partir da celulose14,15, especialmente
usando resíduos agroindustriais e gramíneas de crescimento rápido, como o bagaço
de cana-de-açúcar14,16, a palha do milho17,18 e o capim elefante19,20.
Além disso, devido ao caráter semicristalino da celulose, nanopartículas
(nanocristais e nanofibrilas) podem ser extraídas por meio da hidrólise controlada de
suas regiões amorfas, por via ácida21, via enzimática22, via oxidativa23, por fibrilação
mecânica24 ou pela combinação destes métodos. Esses materiais podem ser
utilizados na preparação de aerogéis e hidrogéis8,25, como reforço em
25
nanocompósitos poliméricos26 e na produção de papel para substratos eletrônicos27,
dentre outras aplicações.
1.1.2 Hemicelulose
A hemicelulose também é um polissacarídeo como a celulose, mas
formado pela união de hexoses e pentoses, de modo ramificado, e com uma
composição que varia de acordo com a planta. A Figura 5 apresenta exemplos de
açúcares que podem formar a hemicelulose e como estão estruturados.
Figura 5. a) Exemplos de monossacarídeos que compõem a hemicelulose nas suas formas
cíclicas: glicose, manose e galactose (hexoses) e xilose e arabinose (pentoses); b) Exemplo
de estruturação dos açúcares na biomassa lignocelulósica.
26
Devido às ramificações, a hemicelulose é um polímero amorfo,
diferentemente da celulose, o que a torna mais suscetível à hidrólise7. Durante a
extração, a hemicelulose é convertida em oligômeros ou nos monômeros
correspondentes.
Esses açúcares obtidos podem ser convertidos em etanol, pela ação de
leveduras específicas para a fermentação de pentoses28, uma vez que as leveduras
tradicionalmente utilizadas para a fermentação de glicose, especialmente a
Saccharomyces cerevisiae, que é a mais utilizada, não são eficientes na conversão
dos derivados de hemicelulose. Um outro método para agregar valor a essa fração
da biomassa é a conversão desses açúcares em furfural, que pode ser obtido a
partir da hidrólise ácida das pentoses3 ou da utilização de catalisadores, como
zeólitas29. O furfural é uma plataforma química e pode ser convertido em plásticos,
fármacos e insumos agrícolas30, substituindo os produtos tradicionalmente obtidos a
partir do petróleo.
1.1.3 Lignina
A lignina, assim como a hemicelulose, possui estrutura e composição que
variam de acordo com a planta. A Figura 6a apresenta a estrutura dos seus
precursores, os chamados monolignois, que são formados a partir da polimerização
de derivados de fenilpropanois: álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e álcool
sinapílico. Essas estruturas precursoras estão unidas principalmente por ligações
éter arílicas β-O-4 e α-O-4, formando uma rede tridimensional (Figura 6b). A lignina
é especialmente responsável pela resistência dos tecidos vasculares da planta, pela
defesa contra micro-organismos, pela proteção ultravioleta e pelo transporte de
água6,31.
27
Figura 6. a) Estrutura dos três monolignois (álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e álcool
sinapílico) constituintes da lignina; b) Exemplo de estrutura proposta para a macromolécula
de lignina, formada pela união dos monolignois.
De modo geral, madeiras coníferas (do inglês, softwoods) possuem
ligninas formadas em maior quantidade por álcool coniferílico, enquanto madeiras
lenhosas (do inglês, hardwoods) possuem tanto álcool coniferílico como álcool
sinapílico como unidades formadoras. Por outro lado, as gramíneas contém as 3
unidades de monolignois7,32.
A biossíntese da lignina ocorre por via radicalar dos álcoois precursores
iniciada por enzimas. Devido à deslocalização dos elétrons no anel aromático, à
OH
HO
OH
HO
eO
OH
HO
eO
O e
O
HO OH
O e
O
OH
O e
OHO
HO
O e
O
OH
OH
eOO e
HO
HO
O
O e
OH
OHO
eO
O O
O e
OH
OH OH
28
dupla ligação na cadeia alifática e à presença de oxigênio (Figura 6a), a ligação
pode ocorrer em diferentes posições, levando à complexa estrutura da
macromolécula.
Atualmente, cerca de 60% da lignina que é obtida como subproduto do
processamento de papel e celulose é queimada para produzir energia consumida na
própria indústria33. No entanto, por ser a maior fonte de compostos aromáticos
disponível, a lignina tem um grande potencial para a aplicação em materiais e para a
conversão em produtos químicos e combustíveis.
A lignina pode ser utilizada para a produção de fibras de carbono, que são
feitas atualmente a partir de poliacetonitrila (PAN), um processo que encarece o
produto e dificulta a aplicação34. Para esse processo, o método pelo qual a lignina foi
extraída é fundamental nas propriedades das fibras de carbono, bem como a fonte
de biomassa. Por exemplo, ligninas extraídas pelo método Kraft (utilizado na
indústria de papel) resultam em fibras de carbono frágeis35, o que reforça a
importância do estudo dos métodos de fracionamento dos componentes.
Nanopartículas de lignina vem sendo estudadas para a produção de
nanocompósitos em diversas matrizes, como hidrogéis36 e protetores solares37.
Nessas aplicações, busca-se uma amplificação das propriedades de proteção UV,
antibacteridas e antifúngicas em regime nanométrico.
Por fim, é possível obter insumos químicos por meio da despolimerização
catalítica da lignina, por estratégias como tratamentos termoquímicos, catálise
homogênea e heterogênea e despolimerização biológica34. Isso permite a produção
de compostos aromáticos tradicionalmente obtidos a partir do petróleo, como
benzeno, tolueno e xileno. No entanto, devido à complexidade da macromolécula,
esse é um caminho ainda complexo, que está focado especialmente nos métodos
para a quebra específica das ligações.
No entanto, para que a lignina possa ser usada como fonte desses
materiais e produtos, métodos eficientes para a sua extração são necessários. Além
disso, integrar esses processos à cadeia produtiva do etanol celulósico representa
uma possibilidade de agregar valor à cadeia produtiva deste biocombustível.
29
1.1.4 Extrativos
Diversas moléculas orgânicas, como ácidos, esteroides e fenólicos,
compõem a biomassa e são chamados de extrativos. Esses compostos podem ser
aplicados como fármacos, essências, emulsificantes, dentre outros38. Embora
correspondam a uma fração significativa da biomassa, o aproveitamento dos
extrativos é um caminho muito pouco explorado na literatura para a viabilização da
produção de bioetanol. A escolha do método de extração permite a obtenção de
extratos que são ricos em determinadas classes de compostos.
Devido ao aumento da demanda pela utilização de produtos mais
naturais, de fontes verdes e renováveis, como é o caso da biomassa lignocelulósica,
a investigação dos componentes presentes nesses substratos pode contribuir para
uma indústria mais sustentável. Muitas plantas já são utilizadas como fontes de
antioxidantes naturais para cosméticos e em suplementação alimentícia, como é o
caso das vitaminas A, C e E, flavonoides, taninos, carotenoides, dentre outros39,40.
Além disso, diversas plantas, especialmente flores, são utilizadas para a obtenção
de fragrâncias. No entanto, poucos estudos investigam a presença dessas
moléculas nos substratos utilizados para a produção de etanol celulósico38,41.
Trabalhos que exploraram a composição química de extratos de resíduos
do processamento da cana-de-açúcar (bagaço, casca e folhas)38 apresentaram
diferentes tipos de compostos. Destacam-se, por exemplo, aldeídos de cadeias
longas, como o n-octacosanal, que podem ser utilizados no tratamento de
osteoporose, além de ácidos poli-insaturados, como ácidos linolênico, linoleico e
oleico, utilizados para o tratamento de hipercolesterolemia. Além disso, também são
encontrados fitosteróis, como stigmasterol e β-sitosterol, com propriedades
anticâncer. Portanto, a utilização desta fração da biomassa pode representar um
caminho para viabilizar as biorrefinarias. Devido à diversa composição química dos
componentes, os métodos de extração devem ser escolhidos visando à recuperação
de classes de compostos específicas.
30
Eq. 2
1.1.5 Cinzas
A matéria inorgânica presente na biomassa possui papel fundamental no
processo de crescimento das plantas, especialmente em gramíneas, onde atuam
como agentes de resistência a estresse e contra patógenos42. Entretanto,
dependendo do tipo de processamento da biomassa, as cinzas podem causar
problemas nos processos industriais, por entupimento das tubulações, por
exemplo43.
Os principais componentes inorgânicos da biomassa lignocelulósica são,
de modo geral, determinados como óxidos, dos quais destacam-se SiO2, CaO, K2O,
P2O5, Al2O3, MgO e Fe2O344. Os teores variam bastante dependendo do tipo de
planta (gramíneas ou árvores, por exemplo), além de poderem variar entre as partes
de uma mesma planta.
A sílica (SiO2) geralmente é o componente inorgânico presente em maior
quantidade nas gramíneas, podendo chegar a cerca de 91% do percentual de
matéria inorgânica no arroz, uma biomassa com um alto teor de cinzas (cerca de
20% de cinzas na casca e na palha)45. Embora representado por uma estrutura
monomérica, a sílica encontra-se na forma de um polímero na planta, podendo ser
solubilizado por meio da reação reversível (Equação 2). Esta reação pode ser
catalisada tanto em meio ácido como em meio básico, sendo que é favorecida em
condições alcalinas. Esse óxido encontra-se depositado em partículas coloidais e é
insolúvel em água, o que pode causar corrosão nos equipamentos usados no
processamento da biomassa43. O silício é introduzido na planta pela reação inversa
e precipita na forma de sílica cristalina44. Além disso, SiO2 pode estar presente na
biomassa lignocelulósica devido à contaminação com areia ou argila, o que pode
comprometer as operações seguintes19,44,46.
SiO2(s) + 2H2O Si(OH)4(aq)
A Figura 7 apresenta um mecanismo proposto para a despolimerização
do silício e sua solubilização em meio alcalino43. A reação é iniciada por um ataque
nucleofílico da hidroxila ao silício, seguido pela quebra da ligação entre silício e
oxigênio. Após a quebra das ligações, a sílica é solubilizada na forma de ácido silício
(Si(OH)4).
31
Figura 7. Mecanismo proposto para a solubilização da sílica em meio alcalino por meio da
despolimerização iniciada pelo ataque nucleofílico da hidroxila ao silício, seguido pela
quebra das ligações Si-O. Adaptado de Le e colaboradores43.
32
Os demais óxidos presentes na biomassa possuem solubilidades variadas
em meio ácido ou alcalino, ou mesmo em condições neutras, sendo, de modo geral,
mais suscetíveis à extração durante os tratamentos químicos.
1.2 Produção de etanol celulósico
O uso de biocombustíveis, como o bioetanol, é uma das alternativas para
a redução da poluição do ar nas cidades e do processo de acumulação do CO2
liberado na combustão, além de ser um caminho para a segurança energética, uma
vez que diversifica as fontes de combustíveis fósseis42,47. O uso de bioetanol de
primeira geração é uma realidade no Brasil desde a década de 1970, graças a
incentivos governamentais. Com a produção de veículos flexíveis, que podem utilizar
tanto gasolina como etanol, desde de 2001, houve um novo aumento na demanda e
na produção desse biocombustível, devido ao menor preço comparado à gasolina48.
Segundo a Companhia Nacional do Abastecimento (CONAB)49, a
estimativa de produção de etanol a partir da cana-de-açúcar para a safra de
2018/2019 é de 32,3 bilhões de litros, o que representa um aumento de 18,6% em
relação à safra anterior. Desses, 1,3 bilhões foram exportados entre abril e
novembro de 2018, 18% a mais do que o mesmo período de 2017. Os principais
importadores de etanol do Brasil são Estados Unidos, Coreia do Sul, Japão, Holanda
e Colômbia.
Do ponto de vista ambiental, a utilização de etanol leva à redução de 62%
dos gases causadores do efeito estufa, quando comparado à gasolina48. Esses
fatores contribuem para o estudo de métodos que aumentem a produtividade desse
biocombustível, além da redução de custos do processo de produção.
Como alternativa para o aumento da produtividade do bioetanol, a
produção do etanol 2G é um caminho promissor. Além das vantagens do
biocombustível, já discutidas, ela representa um modo de agregar valor aos resíduos
agroindustriais e às gramíneas de rápido crescimento. Além disso, as exportações
de etanol reduzem nos meses do fim da colheita da cana-de-açúcar, devido à perda
de competitividade do etanol com a gasolina49, o que reforça a necessidade de
aumentar a produtividade do etanol, especialmente nesse período. Além disso,
utilizar resíduos agroindustriais ou plantas que crescem em terrenos pouco férteis,
33
como o capim elefante, não afeta a extensão de terras cultiváveis utilizadas na
produção de alimentos50.
A produção de etanol 2G pode ser dividida em 4 etapas: pré-tratamentos,
hidrólise, fermentação e destilação, conforme ilustrado na Figura 8. No conceito de
uma biorrefinaria, esse processo deve, além de maximizar a produção de açúcares
fermentáveis (e consequentemente, de etanol), buscar alternativas para o
aproveitamento das outras frações.
Figura 8. Esquema das etapas para a produção de etanol celulósico.
1.2.1 Pré-tratamentos
Por definição, pré-tratamentos são todos os procedimentos realizados
antes da hidrólise da celulose em açúcares, podendo ser métodos físicos, químicos,
biológicos ou a combinação desses51. Pré-tratamentos efetivos devem reduzir o
gasto energético, o tempo de operação e a quantidade de resíduos19. A hidrólise é
comumente catalisada por enzimas; portanto, os pré-tratamentos são utilizados
principalmente para a obtenção de um sólido rico em celulose, que apresente pouca
lignina, maior porosidade e área superficial52, o que facilita a ação enzimática. Isso é
necessário devido à recalcitrância da biomassa, o que reduz o acesso da enzima e,
34
consequentemente, reduz a taxa de conversão de celulose em monossacarídeos
fermentáveis53, conforme indicado na Figura 9.
Figura 9. Esquema para os pré-tratamentos da biomassa lignocelulósica visando o aumento
da digestibilidade enzimática.
Dentro do conceito de uma biorrefinaria, a totalidade dos componentes da
biomassa deve ser separada e aproveitada. Para isso ser possível, a escolha dos
métodos de pré-tratamentos é fundamental, além de serem decisivos no custo e
tempo dos processos. Biorrefinarias podem representar um novo mercado para a
agricultura, podendo gerar empregos, o que contribui para o desenvolvimento
econômico das áreas onde estão implementadas54.
Processos que maximizem a conversão de celulose em açúcares
fermentáveis são cruciais para viabilizar a produção de etanol de segunda geração
em larga escala. Essa taxa de conversão pode ser aumentada por diferentes
métodos de tratamento, que agem de formas distintas. Eles podem atuar na redução
da recalcitrância da biomassa, tanto por remoção dos componentes como
hemicelulose e lignina, como pela redução da cristalinidade, do grau de
polimerização ou promovendo aumento da área superficial16,17,55,56. Além disso,
35
deve-se evitar a degradação do substrato celulósico e a produção de inibidores
enzimáticos e fermentativos57.
Os três principais desafios para a produção do etanol celulósico são: os
processos de pré-tratamento da biomassa58, que envolvem o que foi proposto neste
trabalho; o alto custo das enzimas para a hidrólise enzimática59 e a viabilização da
fermentação das pentoses em etanol60. Como uma série de métodos de pré-
tratamentos já estão bem estabelecidos, quanto aos efeitos químicos que causam
na biomassa, os passos atuais envolvem a otimização de condições, para reduzir
gastos, além de integrar os processos.
1.2.2 Hidrólise enzimática
A conversão de celulose em glicose é comumente catalisada por enzimas
chamadas celulases, que são altamente específicas nesse processo de conversão61.
Embora o processo de hidrólise possa ser também catalisado por via ácida, a
utilização de enzimas apresenta vantagens devido à maior especificidade, à não
geração de inibidores enzimáticos (como os produtos de degradação dos açúcares),
e à utilização de condições mais brandas para os equipamentos (temperaturas em
torno de 50°C e pH próximos a 5), evitando oxidação62.
Bactérias e fungos podem produzir celulases, sendo que os fungos são
mais estudados e utilizados, especialmente espécies de Trichoderma, Aspergillus e
Penicillium. Três principais grupos de enzimas compõem as celulases, responsáveis
pela conversão de celulose em glicose: as endoglucanases, que atacam as regiões
de menor cristalinidade da fibra celulósica, reduzindo o tamanho das cadeias; as
exoglucanases, que atacam as extremidades da cadeia, liberando celobiose; e as β-
glucosidades, que hidrolisam celobiose em glicose. Além disso, enzimas auxiliares,
que atacam hemicelulose podem estar presentes em coquetéis comerciais63.
O processo de hidrólise pode ser dividido em três etapas: a adsorção da
enzima na superfície da celulose, seguido pela biodegradação da celulose em
açúcares fermentáveis e pela dessorção da enzima. Grande parte da inativação da
enzima está relacionada a não-dessorção da superfície da celulose ou a adsorção
em lignina64.
36
1.2.3 Fermentação
Após a obtenção dos açúcares, estes são fermentados para a produção
de etanol. Esse processo pode ser realizado por micro-organismos, bactérias e
leveduras65. Comumente, utiliza-se a levedura Saccharomyces cerevisiae, que pode
crescer consumindo tanto glicose, como sacarose. É por essa via, por exemplo, que
é obtido o etanol de primeira geração, pela fermentação dos açúcares contidos no
caldo da cana-de-açúcar.
A hidrólise enzimática e a fermentação também podem ser realizadas
simultaneamente (SSF, do inglês simultaneous saccharification and fermentation). O
processo feito separadamente (SHF, do inglês separate hydrolysis and fermentation)
possui um maior rendimento de hidrólise, uma vez que as enzimas realizam a
conversão na sua temperatura ótima. No entanto, podem ser formadas maiores
quantidades de inibidores fermentativos e ocorre o aumento do número de passos
do processo50. Por outro lado, a utilização de SSF leva a um menor número de
inibidores fermentativos, mas é realizado em uma temperatura inferior para a
enzima, devido à possível degradação das leveduras. Após obtido por fermentação,
o etanol é então destilado e direcionado para suas aplicações.
1.3 Biorrefinarias
Conforme mencionado, a produção de materiais, combustíveis e outros
insumos químicos pode ser acoplada à produção de etanol celulósico. Essa
abordagem seria um caminho para viabilizar tanto a produção deste biocombustível,
devido ao alto custo de produção e baixo preço de venda, além de alterar o atual
paradigma, no qual grande parte dos produtos à base de carbono são obtidos a
partir de fontes não renováveis.
Portanto, nesse conceito, na etapa de pré-tratamentos é importante
considerar processos que facilitem a recuperação dos componentes da biomassa,
além do aumento da liberação de açúcares para produzir açúcares fermentáveis. Na
base de dados Web of Science, é possível notar um aumento expressivo nos artigos
publicados utilizando o termo Biorefinery nos últimos anos (Figura 10). Esses artigos
unem diversas áreas, uma vez que esse é um trabalho altamente interdisciplinar,
37
que associa conhecimentos em química, bioquímica, biotecnologia, genética,
técnicas de separação e engenharia de processos1.
Figura 10. Número de artigos utilizando a palavra-chave “Biorefinery” indexados na base de
dados Web of Science em cada ano entre 2004 e 2018.
No entanto, embora haja esse aumento expressivo na quantidade de
artigos publicados, grande parte apresenta somente as potencialidades da biomassa
para a produção de materiais, combustíveis e outros insumos químicos e os
métodos para a separação dos componentes da biomassa, sem apresentar
propostas de processos integrados1,66,67. Uma outra parte dessas publicações trata
das potencialidades de subprodutos da produção de etanol celulósico, como
lignina34,35,68–73 e hemicelulose28–30,74–76. O aproveitamento desses insumos na
produção de materiais e produtos químicos deverá agregar valor à biorrefinaria
Recentemente, Alonso e colaboradores3 utilizaram um método integrado para
obterem celulose, lignina e furfural a partir de bétula branca, uma árvore utilizada
para a produção de papel. Para isso, utilizaram como solvente γ-valerolactona para
4
mero de artigos
38
a extração de hemicelulose e lignina e posterior separação por precipitação com
água. Deste modo, os 3 principais componentes da biomassa estão disponíveis para
serem convertidos em produtos por processos químicos ou biológicos, o que agrega
valor à biomassa.
Há ainda uma parte das publicações que realizam processos integrados
de primeira e segunda geração, especialmente utilizando a cana-de-açúcar66,77–79.
Nesses trabalhos, o bagaço, resíduo do processo de produção do etanol de primeira
geração, é utilizado tanto para geração de energia para a usina como também é
estudado para a produção de etanol de segunda geração. Embora esses artigos
apresentem abordagens integradas, os demais componentes do bagaço não são
utilizados em sua máxima potencialidade, sendo utilizados exclusivamente para a
geração de energia da refinaria.
Sobre a cana-de-açúcar, a biomassa mais disponível para a utilização em
biorrefinarias no Brasil, há ainda propostas de processos integrados que realizam
análises tecno-econômicas para a produção de xilitol, ácido cítrico e ácido glutâmico,
cada um desses processos acoplado à produção de energia80 e à produção de
biogás a partir de resíduos de etanol de segunda geração, juntamente com
quantificações dos teores de lignina que podem ser recuperados77.
Justamente devido ao alto caráter interdisciplinar, nota-se nas
publicações uma evolução histórica, iniciando pelos estudos a respeito da
composição da biomassa e dos métodos para o fracionamento destes componentes.
Com esses conhecimentos atualmente mais consolidados, os esforços atuais estão
divididos entre a otimização destes processos, as aplicações de celulose,
hemicelulose, lignina, extrativos e cinzas, e a integração dos métodos, onde este
projeto de mestrado se enquadra, caracterizando uma biorrefinaria.
39
1.4 Métodos para o fracionamento e melhoria da digestibilidade enzimática
utilizados neste trabalho
Para melhorar a digestibilidade enzimática, podem ser utilizados
tratamentos físicos, como moagem81,82 ou irradiação com micro-ondas83;
tratamentos biológicos, com fungos ou bactérias84; e tratamentos físico-químicos,
principalmente com explosão de vapor85, explosão de amônia57, solventes orgânicos
(organossolve)86, líquidos iônicos87, fluidos supercríticos57, ácidos e bases diluídos16,
dentre outros. Visando o aproveitamento dos demais componentes, neste trabalho,
foram escolhidos métodos que possibilitassem a recuperação de extrativos, também
de hemicelulose e lignina, além da melhoria da digestibilidade enzimática. Nessa
abordagem, os métodos químicos se destacam por facilitarem a recuperação desses
subprodutos, além de apresentam menor custo, em relação a outros métodos52.
Assim, as próximas seções abordarão os princípios físico-químicos dos
métodos de extração e fracionamento escolhidos para a recuperação de extrativos
(extrações com CO2 supercrítico e líquidos pressurizados), hemicelulose
(tratamentos ácidos) e lignina (tratamentos alcalinos), que também podem aumentar
a liberação de açúcares fermentáveis. Combinado a esses métodos químicos, a
moagem em moinho de bolas também foi utilizada somente para a melhoria da
digestibilidade enzimática, uma vez que não é um método que possibilita o
fracionamento.
1.4.1 Extrações com CO2 supercrítico
Tradicionalmente, métodos para a recuperação de moléculas orgânicas
de plantas utilizam solventes como hexano, diclorometano e clorofórmio para a
extração41. No entanto, esses solventes são tóxicos e não seletivos, o que torna
esses processos inviáveis para aplicações que requerem compostos purificados,
além de serem nocivos ao ambiente.
Por isso, uma alternativa à utilização dos solventes orgânicos
convencionais é a utilização de extrações com dióxido de carbono supercrítico
(scCO2). O CO2 é um solvente verde por ser não tóxico e é completamente removido
após a extração, o que elimina a necessidade de etapas de purificação do extrato. É
uma extração ideal para as indústrias farmacêutica, alimentícia e cosmética88.
40
O estado supercrítico é alcançado quando a temperatura e a pressão são
aumentadas até o valor crítico. Nestas condições, o fluido possui características
tanto de líquido quanto de gás, com baixa tensão superficial, alta difusividade e
baixa viscosidade, sendo um solvente ideal para extrações89.
A utilização de CO2 supercrítico (scCO2) é estudada como substituinte
dos solventes orgânicos convencionais na extração de compostos de diversas
plantas e resíduos agroindustriais, como é o caso da extração de óleos e aldeídos
de cadeia longa de resíduos da cana-de-açúcar, como bagaço, folhas e casca38, e
de resíduos de folhas de tamareira após a extração do óleo de palma41; da extração
de fenóis de casca de cacau, seguido por processos de extração de pectina
utilizando água em estado subcrítico90; e extração de óleo de farelo de arroz91,
dentre outras aplicações. Portanto, a investigação desse tipo de extração é
interessante para processos que busquem a recuperação de extratos da planta no
aproveitamento integral da biomassa lignocelulósica.
1.4.2 Extrações com líquidos pressurizados
Na extração com líquidos pressurizados (PLE), os solventes estão no
estado subcrítico, em que são líquidos mesmo acima da temperatura de ebulição,
devido à alta pressão aplicada92, o que facilita o processo de extração. Devido à
combinação de alta pressão e temperatura, é possível reduzir a quantidade de
solvente utilizada: a temperatura elevada aumenta a solubilidade do analito e diminui
a viscosidade e tensão superficial do solvente92. Além disso, é considerado um
método verde, por utilizar menores quantidades de solventes e estes serem não
tóxicos (como água e etanol). Assim, é um método promissor na extração de
compostos de plantas, devido aos menores tempos de extração e menores gastos
com equipamento e solventes.
A extração com líquidos pressurizados (PLE) possui outras
nomenclaturas, como extração acelerada com solventes (ASE, do inglês accelerated
solvent extraction), extração aprimorada com solventes (ESE, do inglês enhanced
solvent extraction) e extração com solvente em alta pressão (HPSE, do inglês high
pressure solvent extraction)93. Devido às condições para a extração, a utilização de
41
PLE mostrou-se eficiente para a recuperação de compostos polares, como fenólicos
de resíduos de vinícolas94 e isoflavonas de soja95, sem degradação.
1.4.3 Tratamentos com ácidos e bases diluídos
Tratamentos utilizando ácidos e bases diluídos são comumente
reportados na literatura para o aumento da liberação de açúcares de biomassas
lignocelulósicas. Rezende e colaboradores16 utilizaram pré-tratamentos sequenciais
utilizando ácidos e bases diluídos em bagaço de cana-de-açúcar e obtiveram taxas
de conversão de celulose em glicose por hidrólise enzimática de aproximadamente
100%. Para o capim elefante, tratamentos utilizando base diluída foram mais
eficientes para impulsionar a hidrólise enzimática do que tratamentos organossolve,
utilizando etanol e água19.
A eficiência desse tipo de tratamento está na sinergia da utilização dos
processos sequenciais ácido-base. Na etapa ácida, ocorre principalmente a hidrólise
da hemicelulose, produzindo um licor rico em xilose (hidrolisado da hemicelulose),
conforme exemplificado pelo mecanismo da Figura 11. Esse é um método
comumente utilizado para a recuperação de hemicelulose64, já que é capaz de
remover até cerca de 90% desse componente. Nessa etapa, também são removidas
quantidades menores de lignina, cinzas e grande parte dos extrativos, caso estes
não tenham sido previamente extraídos.
42
Figura 11. Mecanismo esperado para a hidrólise da hemicelulose em seus monômeros,
utilizando como exemplo uma cadeia de xilano.
Na etapa alcalina, a desestruturação da parede celular pode acontecer
por dissolução da hemicelulose, devido ao rompimento das ligações de hidrogênio
com a celulose96, por dissolução das cinzas e pelo rompimento das ligações
covalentes existentes entre celulose e lignina. Estas ligações são, principalmente, do
tipo éter e éster, conforme indicado na Figura 12.
Figura 12. Principais ligações envolvidas na união covalente entre lignina e cadeias de
celulose.
43
Além da quebra das ligações entre celulose e lignina, também pode
ocorrer a fragmentação da macromolécula de lignina, o que auxilia no processo de
dissolução e extração da parede celular vegetal, conforme indicado na Figura 13.
Essa decomposição se deve principalmente ao rompimento das ligações éter β-
arílicas96. Após a extração da lignina da biomassa lignocelulósica, ela pode ser
precipitada a partir do fração líquida por meio da adição de ácido73
Figura 13. ecanismo para a fragmentação da lignina por meio da quebra das ligações β-
O-4 em decorrência da hidrólise básica.
Portanto, a utilização sequencial desses tratamentos é um método que
permite a extração fracionada dos dois principais subprodutos da produção de etanol
celulósico, especialmente hemicelulose, que é extraída para a fração líquida ácida,
enquanto a lignina é extraída para a fração líquida alcalina na segunda etapa.
Assim, é possível a obtenção desses componentes de modo mais purificado já no
processo de extração, sem a utilização de solventes orgânicos tóxicos, além de
realizar o processo em meio aquoso.
1.4.4 Moagem em moinho de bolas
Como já discutido, a celulose possui partes cristalinas e amorfas (Figura
4), sendo que as regiões amorfas são apontadas em muitos estudos como sendo
mais susceptíveis à ação enzimática19,97,98. Sendo assim, métodos que reduzam a
cristalinidade da biomassa devem favorecer o aumento da quantidade de açúcares
liberados na hidrólise.
O e
OOHO e
OHO e
OOH
OH
eO
+
44
A moagem em moinho de bolas é um desses métodos, que foi eficiente
para a melhoria da digestibilidade enzimática no capim elefante19, na palha de trigo81
e no bagaço de cana-de-açúcar97. A ação deste tipo de tratamento mecânico ocorre
tanto pela redução da cristalinidade como pela redução do tamanho da partícula. A
Figura 14 apresenta o esquema de como a moagem é realizada, utilizando como
exemplo um moinho de bolas planetário: o material é colocado em um jarro
apropriado, juntamente com as bolas, geralmente de ZrO2. Conforme o movimento
de rotação acontece, as bolas caem sobre o material sólido, macerando o mesmo, o
que também pode levar à desfibrilação e à redução da cristalinidade98.
Figura 14. Esquema para a moagem em moinho de bolas planetário, utilizado para reduzir a
cristalinidade da celulose. Nesse esquema, a biomassa é adicionada juntamente com as
bolas e o moinho é rotacionado, juntamente com os jarros. Após o tempo de moagem,
observa-se a redução do tamanho da partícula.
45
1.5 Capim elefante
1.5.1 Características
Uma biomassa ideal para a produção de etanol 2G deve possuir baixo
custo de produção e apresentar uma alta produtividade2,99,100. O capim elefante
(Pennisetum purpureum), fotografado na Figura 15, é considerada uma fonte de
energia alternativa para a produção de biocombustíveis101–103 porque atende a esses
requisitos. Pode ser colhida de duas a quatro vezes por ano, possui alta capacidade
de adaptação a climas e solos com baixos nutrientes, uma baixa demanda por
pesticidas e uma alta produtividade (cerca de 35 ton/ha, comparado a 21 ton/ha da
cana-de-açúcar)42.
Figura 15. Fotografia da plantação de capim elefante do Instituto de Zootecnia (Nova
Odessa, SP) de onde as amostras foram colhidas.
Grande parte dessas características do capim elefante devem-se ao fato
desta planta ser da família das gramíneas (Graminae ou Poaceae) com metabolismo
do tipo C419, ou seja, os primeiros compostos de carbono sintetizados a partir do
CO2 fixado nos cloroplastos são convertidos em espécies com 4 carbonos. Plantas
46
com esse tipo de metabolismo geralmente possuem maior tendência de
crescimento.
Além disso, o teor de celulose disponível no capim elefante (cerca de 36 a
46%, considerando a biomassa seca21,104), é semelhante ao teor presente no bagaço
de cana-de-açúcar (entre 34 e 45%)105,106. A utilização do capim elefante também é
interessante do ponto de vista da diversificação de biomassas para a produção de
etanol e, consequentemente, para o aproveitamento dos seus demais componentes.
Além disso, permite a utilização ininterrupta das refinarias de etanol de primeira
geração, que são fechadas nos períodos em que não há colheita da cana-de-
açúcar19,42. Por ser uma gramínea de rápido crescimento, a utilização desta
biomassa também não compete com a alimentação animal e humana107.
1.5.2 Aplicações do capim elefante
Atualmente, capim elefante é principalmente utilizado na alimentação
animal, tanto de ovinos108,109 quanto de bovinos110. De fato, a maioria dos resultados
encontrados na base de dados Web of Science dizem respeito a estudos que
buscam aprimorar essa aplicação. No entanto, nos últimos 10 anos, o capim elefante
começou a ser estudado também para outras finalidades, como a produção de
biogás, de bioetanol, e para aplicação em materiais. A Tabela 1 apresenta uma
compilação das aplicações do capim elefante dos últimos 15 anos, com exceção das
aplicações para alimentação animal. Destacam-se o grande leque de usos desta
biomassa não somente na produção de biocombustíveis, como também para a
produção de outros insumos químicos e materiais.
47
Tabela 1. Resumo das aplicações do capim elefante publicadas no período de janeiro de
2004 a maio de 2019 de acordo com a base de dados Web of Science (Palavras-chave:
Elephant grass), com exceção das aplicações para alimentação animal.
Aplicação Referências
Produção de biogás 111–113
Produção de ácido lático 114
Pirólise 115–120
Produção de “biocarvão” (biochar) 121
Utilização de sílica para adsorção de corantes e poluentes 122,123
Fibras como reforço polimérico na preparação de compósitos 124–126
Extração de nanoestruturas de celulose 21
Extração de lignina 127
Substrato para produção de celulases e xilanases 58,85,128–131
Produção de etanol
Tipo de pré-tratamento Referências
Ácido diluído 132
Base diluída 133,134
Base diluída com surfactantes 103
Ácido e base diluídos (sequencial) 19
Organossolve 19
Explosão de vapor 20,114,135
CO2 e água (alta pressão) 136
Moagem em moinho de bolas 19,104
1.5.3 Trabalhos anteriores do grupo de pesquisa
Nosso grupo de pesquisa utilizou o capim elefante em duas vertentes:
para a produção de nanomateriais de celulose21 e para a produção de etanol 2G19.
No primeiro trabalho, Nascimento e Rezende21 utilizaram o capim elefante para a
produção de nanocristais e nanofibrilas de celulose, caracterizando os produtos
intermediários dos tratamentos para a obtenção de um sólido rico em celulose. Esse
trabalho já adiantou a necessidade do aproveitamento dos subprodutos do processo,
uma vez que o rendimento dos nanocristais de celulose que podem ser obtidos do
capim elefante variou entre 12 e 16% (m/m) em relação à biomassa in natura. Este
valor está coerente com os rendimentos tipicamente obtidos na produção de
nanocristais de celulose de diferentes biomassas9,137. Quando os subprodutos foram
48
quantificados, o aproveitamento da biomassa inicial passou para 82%, contribuindo
assim para a sustentabilidade e para a viabilidade econômica do processo como um
todo.
No caso da utilização do capim elefante para a produção de etanol 2G,
que foi a base para este trabalho, Rezende e colaboradores19 utilizaram
planejamentos experimentais fatoriais para otimizar as condições de pré-tratamentos
ácido-base e ácido-organossolve (utilizando água e etanol como solvente). A
primeira conclusão deste trabalho foi que os tratamentos ácido-base mostraram-se
mais eficientes na liberação de açúcares redutores, em comparação ao tratamento
organossolve.
Neste trabalho, foram estudadas cinco variáveis no pré-tratamento ácido-
base, utilizando um planejamento do tipo 2V5-1, ou seja, foram avaliadas 5 variáveis
em dois níveis, de modo fracionado. A diferença entre um planejamento fracionado e
um planejamento completo é o número de experimentos: enquanto no completo,
seriam necessários 32 experimentos para este número de variáveis e níveis (além
do ponto central em triplicata, totalizando 35), no planejamento fracionado, a
quantidade de experimentos é reduzida pela metade (portanto, 16 experimentos e o
ponto central em triplicata, totalizando 19 experimentos). Como essa quantidade de
níveis, ainda é possível ajustar o modelo utilizando um planejamento fracionado, já
que não há certeza somente das interações de 3 variáveis, que são pouco
prováveis. Assim, tem-se certeza do efeito das variáveis individualmente e das suas
interações com outra variável.
Sendo assim, a Tabela 2 apresenta um resumo das variáveis analisadas
no trabalho de Rezende e colaboradores19 para avaliar o efeito na liberação de
açúcares redutores. Pode-se concluir que: a etapa ácida não contribui para a
liberação de açúcares redutores após a hidrólise enzimática; a temperatura na etapa
básica deve ser mantida no nível mais baixo, permitindo a redução de gastos
energéticos; a concentração de NaOH e o tempo em moinho de bolas deve ser
mantido no nível mais alto; o tempo na etapa básica não apresenta efeito
individualmente, mas apresenta interações com outras variáveis, como o tempo no
moinho de bolas e a temperatura.
49
Tabela 2. Conclusões a respeito da otimização dos pré-tratamentos ácido-base19.
Variável Nível inferior Nível superior Efeito
Tempo de moagem em moinho de bolas (h)
0 10 Deve ser mantida no nível
superior Concentração de H2SO4
(% v/v) 0 2
Não contribui na liberação de açúcares
Concentração de NaOH (% m/v)
0,5 4,5 Deve ser mantida no nível
superior Temperatura na etapa
alcalina (°C) 85 125
Deve ser mantida no nível inferior
Tempo na etapa alcalina (min)
20 100
Possui interação significativa com o tempo
de moagem em moinho de bolas e com a temperatura
Deve-se destacar nestas conclusões que o tempo de moagem depende
do tipo de moinho utilizado; logo, embora o tempo de moagem seja de 10 horas
neste trabalho anterior, foi possível reduzir a cristalinidade em cerca de 10% apenas.
Além disso, outro destaque são as conclusões sobre a variável “tempo na etapa
alcalina”. Conforme mencionado, embora ela não tenha apresentado um efeito
significativo individualmente, o que, a princípio, permitiria que ela fosse mantida no
nível inferior para reduzir gastos, houve interações significativas do tempo na etapa
alcalina com o tempo de moagem no moinho de bolas e com a temperatura na etapa
alcalina. De fato, essas interações devem ser levadas em conta, uma vez que a
condição que liberou a maior quantidade de açúcares (204,5 mg/g de biomassa)
neste trabalho anterior foi uma condição que utilizou 10 h de moagem em moinho de
bolas, sem etapa ácida, com concentração de 4,5% m/v de NaOH a 85 °C, por 100
min.
Sendo assim, essas conclusões, juntamente a ideia de construir uma
biorrefinaria foram utilizadas para nortear as condições de pré-tratamentos nesta
dissertação visando reduzir tempos, excesso de reagentes e energia no processo.
No entanto, como a resposta utilizada para o planejamento experimental no trabalho
de Rezende e colaboradores19 foi a liberação de açúcares redutores, o
aproveitamento dos demais componentes não foi levado em consideração, que é um
dos principais pontos nos quais este trabalho se propôs a avançar. Portanto,
melhores cenários para a liberação de açúcares devem ser avaliados juntamente
com os melhores cenários para o aproveitamento de extrativos, hemicelulose e
lignina, que podem viabilizar economicamente a utilização da biomassa.
50
2. Objetivos
O objetivo deste trabalho foi propor uma biorrefinaria de capim elefante,
estudando técnicas para melhorar a digestibilidade enzimática e para possibilitar o
aproveitamento dos demais componentes em tratamentos sequenciais e integrados.
Para tanto, foram definidos os seguintes objetivos específicos:
• Estudar métodos para o aproveitamento dos extrativos, utilizando extrações com
fluidos supercríticos e líquidos pressurizados;
• Avaliar as melhores condições de deslignificação para a melhoria da
digestibilidade enzimática e o aproveitamento da hemicelulose e da lignina;
• Avaliar a influência da moagem em moinho de bolas no aumento da liberação de
açúcares fermentáveis;
• Avaliar o efeito dos tratamentos químicos e físicos na morfologia da biomassa,
relacionando com a composição química.
51
3. Materiais e métodos
3.1 Preparo da biomassa
O capim elefante (Pennisetum purpureum), variedade guaçu, foi colhido
no Instituto de Zootecnia de Nova Odessa-SP, após 12 meses do plantio. As plantas
foram separadas em folhas e colmos (tipo de caule de gramíneas), conforme
indicado na Figura 16, e então secas em estufa com circulação de ar (TE-394/3,
Tecnal) a 60 °C por cerca de 6 h. A biomassa foi então moída em moinho de facas
(Arthur H. Thomas Co – Standard model 3) até passar por uma peneira de 2 mm e
armazenada em embalagens plásticas.
Figura 16. Modelo do capim elefante e diferenciação ente colmos e folhas.
3.2 Pré-tratamentos e fracionamento dos componentes
Para a melhoria da digestibilidade enzimática, foram testados métodos de
extração dos componentes utilizando fluidos supercríticos, solventes sob alta
pressão, ácidos e bases diluídos, além da moagem em moinho de bolas. Com
exceção da moagem, esses métodos possibilitam o fracionamento dos componentes
e o posterior aproveitamento.
52
3.2.1 Extração com CO2 supercrítico
A extração com CO2 supercrítico foi realizada a 40 °C e 350 bar, que foi
uma condição previamente utilizada para a extração de óleos e ceras de resíduos de
cana-de-açúcar (bagaço, casca e folhas)38. Os extratos foram obtidos a partir de
uma unidade laboratorial composta por um extrator de metal de 0,1 L, como indicado
na Figura 17. O CO2 foi bombeado através de uma serpentina em um banho de
resfriamento (Novatecnica NT281, Piracicaba – SP, Brasil) para ser liquefeito antes
de ser bombeado para o sistema, a fim de atingir a temperatura desejada e alcançar
a amostra presente no extrator.
Para definir a quantidade de solvente necessária para a extração dos
componentes do capim elefante, foi realizado um ensaio cinético prévio. Nesse
ensaio, o fluxo de CO2 utilizado foi 0,06x103 kg.s-1. Após a definição dos parâmetros
cinéticos, a extração foi realizada utilizando o fluxo de CO2 de 0,175x103 kg.s-1. Os
extratos foram armazenados na ausência de luz a -18°C até a caracterização. Os
sólidos foram armazenados em sacos plásticos para os tratamentos posteriores e
caracterizações.
Figura 17. Representação esquemática do sistema de extração com fluidos pressurizados
(F1 e F2: filtros; CO2: cilindro de CO2; CO: compressor; V0 a V2: válvulas de bloqueio; SV:
válvula de segurança; P: bomba pneumática; HB: banho de aquecimento; EX: vaso extrator;
PI: indicador de pressão; TI: indicador de temperatura; FI: indicador de fluxo; MV: válvula
micrométrica; FT: totalizador de fluxo).
53
3.2.2 Extrações com líquidos pressurizados
As extrações com líquidos pressurizados foram realizadas em um extrator
acelerado por solvente (Dionex ASE 350, Thermo Scientific, Waltham, MA),
mostrado na Figura 18, juntamente com o esquema de funcionamento.
Figura 18. a) Equipamento utilizado para as extrações com líquidos pressurizados (Dionex
ASE 350, Thermo Scientific); b) Esquema de funcionamento do processo: o solvente é
pressurizado e injetado na amostra, juntamente com N2; a célula fica contida em um forno
que mantém o sistema na temperatura desejada; após o tempo de extração, o extrato,
juntamente com o solvente é recolhido em um outro frasco.
Para as extrações, foram utilizados dois tipos de solventes:
▪ Água e etanol (1:1), nas extrações realizadas diretamente na biomassa in natura
e no sólido residual da extração com scCO2;
▪ Acetato de etila, na extração realizada apenas diretamente na biomassa in natura.
Ambas as extrações foram realizadas a 100 °C em 3 ciclos de 15 min,
utilizando 5 min de pré-aquecimento e 120 s para a purga do solvente.
54
3.2.3 Tratamentos com ácido diluído
O tratamento ácido foi realizado tendo como base condições utilizadas
anteriormente no grupo de pesquisa19: a biomassa seca é tratada com uma solução
de H2SO4 2% (v/v) a 121 °C por 40 min em autoclave (1,05 bar), utilizando uma
relação sólido:líquido de 1:10 (g:mL), considerando a massa de biomassa seca.
Após o tratamento, o sólido foi lavado com quantidade de água igual à adicionada
para o tratamento e o licor foi recolhido para a posterior caracterização. O sólido foi
lavado até pH neutro, seco em estufa a 60 °C por cerca de 6 h e armazenado.
3.2.4 Tratamento com base diluída
O tratamento básico foi realizado em condições otimizadas por meio de
planejamentos experimentais19: a biomassa foi tratada com uma solução de NaOH
4,5% (m/v) a 85 °C em banho de óleo, utilizando a razão sólido:líquido de 1:10
(g:mL), também considerando a massa de biomassa seca. A etapa básica foi
testada em tempos de 20 ou 100 min. Assim como na etapa ácida, após o tempo de
reação, o sólido foi lavado com o mesmo volume de água adicionado para o
tratamento e o licor foi armazenado. Em seguida, o sólido foi lavado até pH neutro,
depois seco em estufa a 60 °C por cerca de 6 h e armazenado.
3.2.5 Moagem em moinho de bolas
Para a moagem em moinho de bolas, foi utilizado um moinho de bolas
planetário (MTI Corporation, SFM-1 Desk-Top), utilizando jarros de alumina e bolas
de óxido de zircônio. Para definir as melhores condições da moagem, um
planejamento de experimentos com arranjo ortogonal L9 foi realizado, utilizando o
software MODDE Go (versão 12)138. Os experimentos desse planejamento foram
feitos só com a biomassa in natura.
Para a moagem, 10 g de biomassa foram adicionadas juntamente com a
quantidade de bolas necessárias no jarro de 250 mL e realizou-se a moagem no
tempo e velocidades do experimento, como especificado na Tabela 3. A resposta do
planejamento experimental foi o índice de cristalinidade da amostra, cujos menores
valores favorecem maiores rendimentos de hidrólise139. As variáveis analisadas para
a moagem foram:
55
1) Tamanho das bolas (12, 15 ou 20 mm);
2) Tempo de moagem (variando de 2 a 10 h);
3) Velocidade de rotação (variando de 150 a 250 rpm);
4) Quantidade de bolas (variando de 8 a 16 bolas).
Após a escolha da melhor condição determinada na biomassa in natura,
os sólidos submetidos à etapa alcalina também foram moídos nesta condição para
avaliar a influência da moagem pós tratamento na liberação de açúcares.
Realizando a moagem após os tratamentos químicos, não há interferência deste
tratamento mecânico nos processos de extração e, consequentemente, na
recuperação dos demais subprodutos.
Tabela 3. Condições experimentais para a escolha da condição de moagem em moinho de
bolas.
Nível dos fatores Nível 0 Nível 1 Nível 2
Diâmetro das bolas (mm) 12 15 20
Quantidade de bolas 8 12 16
Tempo (h) 2 6 10
Rotação (rpm) 150 200 250
Condições experimentais
Ensaio Diâmetro das
bolas (mm)
Quantidade de
bolas Tempo (h) Rotação (rpm)
1 12 8 2 150
2 12 12 6 200
3 12 16 10 250
4 15 16 2 200
5 15 8 6 250
6 15 12 10 150
7 20 12 2 250
8 20 16 6 150
9 20 8 10 200
56
3.2.6 Nomenclatura das amostras
A Tabela 4 apresenta os códigos utilizados para nomear as amostras,
conforme a parte da planta e os tipos de tratamentos.
▪ O início do código se refere à parte da planta: L para folhas (do inglês leaves) e S
para colmos (do inglês stems);
▪ IN indica a amostra in natura;
▪ As amostras submetidas à moagem em moinho de bolas possuem a letra M
adicionadas ao final do código.
▪ As extrações podem ser de 4 tipos: 1. Utilizando CO2 supercrítico (SC); 2.
Utilizando PLE com água e etanol (WE, do inglês water e ethanol,
respectivamente); 3. Utilizando extrações sequenciais (SEQ, CO2 seguido de
água e etanol); e 4. Utilizando PLE com acetato de etila (EA, do inglês ethyl
acetate);
▪ As amostras submetidas à etapa ácida estão identificadas como AC;
▪ As submetidas ao tratamento sequencial ácido-base estão indicadas com AB;
▪ As amostras submetidas somente à etapa básica estão identificadas com B;
▪ O número indica o tempo na etapa básica (20 ou 100 min);
Tabela 4. Significado dos códigos utilizados para nomear as amostras.
Código Tipo de extração Etapa
ácida?
Etapa básica?
(Tempo) Moagem?
LIN / SIN - - - -
LINM / SINM - - - Sim
LSC / SSC scCO2 - - -
LWE / SWE PLE (H2O/EtOH) - - -
LSEQ / SSEQ scCO2 – PLE
(H2O/EtOH) - - -
LEA / SEA PLE (EA) - - -
LAC / SAC - Sim - -
LAB20 / SAB20 - Sim 20 min -
LAB20M / SAB20M - Sim 20 min Sim
LAB100 / SAB100 - Sim 100 min -
LAB100M / SAB100M - Sim 100 min Sim
LB20 / SB20 - - 20 min -
LB20M / SB20M - - 20 min Sim
LB100 / SB100 - - 100 min -
LB100M / SB100M - - 100 min Sim
LWEB20 / SWB20 PLE (H2O/EtOH) - 20 min -
LWEB100 / SWEB100 PLE (H2O/EtOH) - 100 min -
57
3.3 Hidrólise enzimática
Todas as amostras foram submetidas à hidrólise enzimática, utilizando o
coquetel enzimático Cellic® CTec 2 (Novozymes). A carga enzimática utilizada foi de
25 mg por grama de substrato (aproximadamente 20 FPU), com teor de sólido de
2,5% em tampão citrato (50 mmol.L-1, pH=5). O sistema foi alocado em uma
incubadora a 50 °C por 72 h e as enzimas foram desnaturadas após o tempo
reacional a 95 °C por 5 min. O líquido sobrenadante foi filtrado para a determinação
cromatográfica dos teores de açúcares obtidos.
3.4 Fermentação
Para a fermentação, utilizou-se a levedura Saccharomyces cerevisiae
(linhagem SA – Santa Adélia). Inicialmente, preparou-se um inóculo (10 g.L-1 de
levedura, 20 g.L-1 de peptona e 20 g.L-1 de glicose), cultivado a 30 °C e 150 rpm por
12 h. A fermentação foi realizada em tubos de centrífuga de 15 mL, utilizando como
substrato os hidrolisados das amostras que tiveram os melhores rendimentos na
hidrólise enzimática. Os ensaios foram realizados nas mesmas condições que o
preparo do inóculo, sendo retiradas amostras após 6, 12, 24 e 48 h de fermentação.
3.5 Determinação da composição química dos sólidos
Para a quantificação dos teores de celulose, hemicelulose, lignina e
extrativos nas amostras in natura e após os tratamentos, seguiu-se o protocolo do
National Renewable Energy Laboratory (NREL)140, com algumas modificações.
Inicialmente, as amostras foram moídas em moinho de facas até passarem por uma
peneira de 0,8 mm e determinou-se o teor de umidade em uma balança de
infravermelho (Mettler Toledo HG63) a 105 °C.
Com exceção das cinzas, que são determinadas a partir da biomassa in
natura, as outras determinações são realizadas de modo sequencial, conforme
demonstrado na Figura 19.
58
Figura 19. Esquema para a determinação da composição química da biomassa
lignocelulósica: os extrativos são determinados após uma extração com Soxhlet; em
seguida, é realizada uma hidrólise com ácido concentrado, que leva à obtenção de uma
fração sólida, por meio da qual é determinado o teor de lignina insolúvel, e uma fração
líquida, que é utilizada para a determinação de lignina solúvel, por UV-Vis, e celulose e
hemicelulose, por HPLC (Cromatografia líquida de alta eficiência, do inglês High
Performance Liquid Chromatography).
3.5.1 Cinzas totais
Para a determinação de cinzas totais, cerca de 1 g da biomassa foi
pesada em cadinhos de porcelana previamente calcinados a 800 °C em forno mufla
(EDG 10P-S) e com a massa determinada. A amostra foi então calcinada utilizando
a rampa de temperatura indicada na Figura 20. O sistema foi pesado e as cinzas
foram recolhidas para a posterior caracterização.
59
Figura 20. Rampa de aquecimento utilizada para a calcinação de matéria inorgânica e
determinação de cinzas totais
3.5.2 Extrativos
A determinação dos extrativos foi realizada com um extrator Soxhlet em
duas etapas: a primeira utilizando cicloexano por 8 h e a segunda utilizando uma
mistura de água e etanol (1:1 v/v) por 24 h. Em cada cartucho de extração,
adicionaram-se cerca de 2 g de biomassa moída. Entre as etapas, o sólido foi
pesado para a determinação do teor de extrativos.
3.5.3 Celulose, hemicelulose e lignina
Para a determinação de celulose, hemicelulose e lignina total, realizou-se
uma hidrólise com H2SO4 em duas etapas. Para isso, 0,3 g de biomassa foi colocada
em um tubo de hidrólise apropriado para autoclave e adicionaram-se 4,5 mL de
H2SO4 72% (m/m). Alocou-se o sistema em banho-maria a 30 °C por 1 h e, após
isso, adicionaram-se 82,5 mL de água destilada para diluir o ácido até atingir uma
concentração de 4% (m/m). O sistema foi então alocado na autoclave a 121 °C por 1
h. Após despressurização da autoclave e resfriamento do sistema em banho de
gelo, o líquido foi separado do sólido por filtração a vácuo, utilizando um cadinho de
placa porosa (7 a μm).
Uma alíquota da fração líquida foi filtrada e analisada por cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC) para a determinação dos açúcares. Uma outra
alíquota teve o pH ajustado para 10 para a determinação do teor de lignina solúvel
60
por absorção UV-Vis (Agilent, modelo Cary 5000) em 280 nm, utilizando água
destilada como branco.
A fração sólida foi lavada até pH neutro para a determinação de lignina
insolúvel. O cadinho foi então seco em estufa a 105 °C até massa constante e
calcinado seguindo a rampa da Figura 20.
3.5.4 Quantificação dos açúcares liberados
Os açúcares liberados pela hidrólise enzimática e pela hidrólise para a
quantificação dos componentes foram analisados por HPLC em um cromatógrafo
Agilent (modelo 1200), acoplado com um detector de índice de refração. Foi utilizada
uma coluna de troca iônica BIORAD HPX87H a 45 °C e H2SO4 5 mmol.L-1 como fase
móvel.
Para a determinação dos teores de celulose e hemicelulose, é necessário
converter a concentração dos açúcares obtidos na fonte de carboidrato precursora,
conforme indicado na Figura 21. Após a determinação dos teores de açúcares,
ácidos orgânicos e produtos de degradação, são utilizados os fatores de hidrólise
para a obtenção dos teores de carboidratos, conforme indicado na Tabela 5.
Celobiose, glicose e hidroximetilfurfural são somados para o teor de celulose,
enquanto xilose, arabinose, ácido acético e furfural são somados para o teor de
hemicelulose.
61
Figura 21. Representação geral dos possíveis produtos formados na hidrólise para a
quantificação da biomassa lignocelulósica: a) Celulose; e b) Hemicelulose (considerandoe
pentoses equivalentes a xilose ou arabinose).
Tabela 5. Fatores de conversão utilizados para a determinação dos teores de celulose e
hemicelulose a partir dos açúcares, ácidos orgânicos e produtos de degradação
determinados por HPLC.
Componente Açúcar, ácido ou produto de
degradação Fator de hidrólise
Celulose
Celobiose 0,95
Glicose 0,90
Hidroximetilfurfural 1,29
Hemicelulose
Xilose 0,88
Arabinose 0,88
Ácido acético 0,72
Furfural 1,37
OOHO
OH
O
OH
O
HO OH
OH
OO HO
OH
O
OH
O
HO OH
OH n
+H O+ OHO
HO
OH
O
OH
O
HO OH
OH
OH
+H O+
OHO
HO
OH
OH
OH
O
OHO
O
HOOH
OO
O
HO
OCCOH
n
H O+
O
HOOH OH
HO
O
O
H O+
O
OH
H O+
O
HOOH OH
OH
H O
+H O++ H O+
H O
+H O++ H O+
H O
+H O++ H O+
62
3.6 Determinação da composição química das frações líquidas
Para a determinação da composição química dos licores, também foi
utilizada a metodologia do NREL140, de modo semelhante ao que é realizado para os
sólidos. Uma alíquota de 5 mL do licor foi diluída 10 vezes em balão volumétrico;
para os licores alcalinos, fez-se um ajuste do pH, adicionando-se ,7 μL de H2SO4
72% (m/m). Após isso, o líquido foi transferido para um tubo apropriado para
autoclave, e foi autoclavado a 121 °C por 1 h, seguindo o mesmo procedimento
descrito no item 3.3 (Determinação da composição química dos sólidos).
3.7 Determinação dos açúcares obtidos após a hidrólise enzimática
Após filtradas, as frações líquidas obtidas no processo de hidrólise
enzimática foram analisadas por HPLC utilizando o mesmo método descrito no item
3.5.4 para a determinação de glicose, xilose e arabinose.
3.8 Caracterizações
3.8.1 Identificação dos extratos
Os extratos foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massas (GC-MS) em um cromatógrafo Agilent (modelo 7890)
equipado com uma coluna capilar HP-5 S ( m x , 5 mm x , 5 μm), com
analisador quadrupolo. Os compostos foram ionizados via ionização por impacto de
elétrons e utilizou-se hélio como gás de arraste, em uma taxa de 1,0 mL.min-1. A
coluna foi aquecida a uma taxa de 10 °C.min-1 até 150 °C, permanecendo nesta
temperatura por 5 min, e continuou sendo aquecida a uma taxa de 5 °C.min-1 até
300 °C, também permanecendo nessa temperatura por 5 min.
A faixa de massas analisadas foi de 30 a 550 u. Os dados foram
processados com o software Chemstation e os compostos foram identificados por
comparação com os padrões da biblioteca do National Institute of Standards and
Technology (NIST).
63
Eq. 3
3.8.2 Índice de cristalinidade
O índice de cristalinidade (IC) foi calculado de acordo com o método da
altura do pico, por difração de raios-X139, utilizando um difratômetro Shimadzu
XRD7000, na faixa de varredura ( θ) de 5 a 5°, com velocidade de °/min e passo
de 0,02°. A voltagem aplicada ao alvo de cobre foi de 40 kV e a corrente de 30 mA.
As intensidades do pico cristalino (I002) da celulose e do vale amorfo (Iam) foram
obtidas a partir do difratograma das amostras e descontadas da intensidade do porta
amostra, conforme exemplificado na Figura 22.
Figura 22. Indicação dos picos da celulose (002 e 101) e do vale amorfo (Iam) nos
difratogramas de raios-X de capim elefante. Para o cálculo do índice de cristalinidade da
biomassa, a intensidade do porta-amostra foi descontada, seguindo a referência de Park e
colaboradores139.
Após a determinação dos valores para I002 e Iam, calculou-se o índice de
cristalinidade (IC), conforme a Equação 3.
𝐼𝐶 = 𝐼002 − 𝐼𝑎𝑚
𝐼002
Onde: I002 = intensidade do pico cristalino; Iam = intensidade do vale amorfo.
64
3.8.3 Composição química das cinzas
A composição química da matéria inorgânica foi determinada por
fluorescência de raios-X (XRF) em um espectrômetro sequencial por comprimento
de onda (Shimadzu XRF-1800). Utilizou-se um tubo de ródio como fonte de radiação
(voltagem de 40 kV e corrente de 95 mA) e a análise foi feita no modo semi-
quantitativo e de varredura, utilizando todos os canais disponíveis (Cl, S, P, Si, Al,
Mg, Na, F, Ti-U e K, Ca, Sn-Cs).
3.8.4 Análise morfológica
Para avaliar as alterações morfológicas causadas pelos tratamentos
físicos e químicos, as amostras foram analisadas por microscopia eletrônica de
varredura com fonte de emissão de campo (FESEM Quanta 650, FEI), com voltagem
de aceleração de 5 kV. As amostras foram revestidas com uma película de irídio em
um metalizador Baltec (Oerlikon-Balzers), operando com corrente de 11,3 mA
durante 120 s.
Os substratos submetidos aos tratamentos ácido e alcalino foram também
analisados por microtomografia computadorizada de raios-X (micro-CT), utilizando
um equipamento Skyscan 1272, operando a kV e 75 μA. A varredura foi
realizada com resolução de , μm. As imagens foram reconstruídas utilizando o
software o NRecon e as imagens 3D foram processadas a partir do software CTVox.
65
4. Resultados e Discussão
4.1 Proposta de biorrefinaria
O cenário ideal para o processamento de uma biomassa é o que utiliza o
máximo dos componentes, de modo integrado e com o menor gasto possível de
insumos e energia. Por isso, a Figura 23 apresenta um esquema proposto neste
trabalho para uma biorrefinaria de capim elefante, que tem como base uma
otimização prévia das condições para pré-tratamentos ácido-base19 e métodos para
o aproveitamento dos extrativos relatados na literatura38,92.
Figura 23. Esquema geral da biorrefinaria de capim elefante proposta no trabalho.
Extrativos são retirados primeiramente. Depois o sólido é submetido a um tratamento
ácido, resultando em um licor rico em hemicelulose e, em seguida, a um tratamento
básico para retirada de lignina. O sólido restante é moído e fermentado para
produção de etanol.
66
Para esse trabalho, decidiu-se separar as folhas e os colmos do capim
elefante antes da moagem em moinho de facas para que fosse possível comparar
os dois substratos. Cada uma destas partes da planta possui diferentes funções e,
em experimentos preliminares, elas apresentaram diferenças no rendimento dos pré-
tratamentos e na composição química. Além disso, no trabalho anterior do grupo19,
condições de pré-tratamento foram otimizadas apenas para as folhas do capim
elefante, o que também motivou o estudo das partes separadamente. Em uma
biorrefinaria, contudo, seria interessante processar esses dois componentes juntos.
Os primeiros procedimentos para o aproveitamento dos componentes do
capim elefante utilizados neste trabalho foram as extrações com fluídos supercríticos
(scCO2) e com líquidos pressurizados (acetato de etila e água:etanol). Como o nome
sugere, esse procedimento foi utilizado para a recuperação da fração de extrativos
da biomassa, que é composta por diversas classes de compostos, como ácidos,
esteroides, álcoois, dentre outros. Esse procedimento deve ser o primeiro a ser
realizado, uma vez que os tratamentos com ácidos e bases também removem esta
fração da biomassa sólida, fazendo com que os componentes se misturem nos
licores e dificultando sua recuperação, além da possibilidade de degradá-los.
A retirada prévia também é indicada, uma vez que esses compostos
podem ser destinados para aplicações na indústria farmacêutica e alimentícia, que
requerem substâncias extremamente puras1,38. Dessa forma, os extratos obtidos
foram caracterizados, visando escolher os melhores métodos de extração. Também
foi avaliada a influência das extrações na melhoria da digestibilidade enzimática dos
sólidos. Após as extrações, os sólidos das melhores condições foram direcionados
para os tratamentos posteriores.
Os tratamentos químicos seguintes foram conduzidos tendo como base
uma otimização prévia19. Decidiu-se estudar tanto os cenários que utilizassem
somente a etapa básica, assim como cenários que utilizassem o tratamento
sequencial ácido-base. Na etapa básica, também foram estudados dois tempos de
reação (20 e 100 min), para avaliar a influência desta variável na liberação dos
açúcares ou no efeito dos pré-tratamentos na recuperação de hemicelulose e
lignina. Os sólidos foram caracterizados quanto à composição química, para verificar
a eficiência dos tratamentos, e quanto à liberação de açúcares, para comparar as
melhores condições. Além disso, os licores também foram caracterizados para
67
avaliar os subprodutos que podem ser recuperados, agregando valor à cadeia
produtiva.
Por fim, também seguindo o indicado pela otimização anterior19,
buscaram-se condições de moagem mais eficientes para a maior redução no índice
de cristalinidade da biomassa. No trabalho anterior, a cristalinidade foi reduzida em
apenas 10% nas melhores condições possíveis de moagem, sendo que a otimização
indicava que diminuições maiores de cristalinidade favoreceriam a sacarificação.
Além dos dados experimentais deste trabalho, a redução da cristalinidade da
celulose é apontada como uma alternativa para a melhoria da digestibilidade
enzimática, uma vez que as regiões cristalinas são geralmente bastante
recalcitrantes para as enzimas139. Diferentemente do trabalho anterior19, a moagem
foi realizada após a etapa alcalina devido à maior redução no tamanho da partícula,
o que dificultava os processos de separação, caso a moagem fosse realizada
diretamente à biomassa in natura antes dos tratamentos químicos.
Sendo assim, as seções seguintes discutirão os efeitos de cada etapa da
biorrefinaria na melhoria da digestibilidade enzimática, visando à produção de
etanol, e na recuperação dos subprodutos desse processo, buscando viabilizá-lo.
4.2 Fracionamento dos extrativos
4.2.1 Ensaio cinético para a extração com scCO2
O ensaio cinético foi realizado para minimizar os gastos desnecessários
de solvente no processo de extração com scCO2. A Figura 24 apresenta o perfil
obtido, relacionando o tempo de extração com a massa de extrato acumulada para
folhas e colmos. Para as folhas, a saída do extrato foi mais contínua, permitindo que
fossem adquiridos mais pontos experimentais. Para os colmos, o extrato acumulava
na tubulação antes que fosse expulso para o frasco e contabilizado. Além disso,
após 200 min não foi observada mais a saída de extrato. Sendo assim, para os
cálculos da quantidade de CO2 que seria utilizada na extração, adotou-se o tempo
de 90 min para folhas e 63 min para os colmos, uma vez que, em tempos
superiores, não se notou aumento significativo na quantidade de extrato obtida.
68
Figura 24. Perfil do ensaio cinético realizado para as extrações com scCO2 em: a) folhas; e
b) colmos.
Como o fluxo da extração pode ser modificado, a principal variável que é
obtida após o ensaio cinético é a quantidade de CO2 necessária (S) para a extração
de uma determinada massa inicial de biomassa (F). Com os dados obtidos na Figura
24, determinou-se essa relação, que é chamada na área de razão S/F. Sendo assim,
conhecendo-se a massa de biomassa inicial e a razão S/F pode-se realizar a
extração em um fluxo mais rápido, reduzindo o tempo de operação. A Tabela 6
apresenta como essa constante foi calculada, considerando o tempo obtido na
Figura 24 e a massa inicial de biomassa.
Tabela 6. Cálculo da constante S/F para a extração com scCO2.
Folhas Colmos
Tempo de extração (min) 90 63
Massa de CO2 utilizada (S) (g) 405 311
Massa de biomassa (F) (g) 18,1905 19,0550
Razão S/F 22,3 16,3
4 4
,
,
, 4
,
,
,
,
, 4
assa acululada (g)
empo (min)
4 4
,
,
, 4
,
,
,
, assa acumulada (g)
empo (min)
colmosfol as
69
4.2.2 Rendimentos das extrações
A Figura 25 apresenta os rendimentos de cada extração, indicando que a
extração sequencial scCO2-PLE com água e etanol e a extração utilizando apenas o
PLE mostraram-se mais eficientes no rendimento global dos extratos para folhas e
colmos. A extração utilizando scCO2 apresentou menor rendimento, sendo que a
extração com acetato de etila apresentou rendimentos intermediários. Embora os
rendimentos para a extração com scCO2 sejam baixos, são próximos aos obtidos
para a cana-de-açúcar em condições similares38 (0,8% m/m para a casca, 1,6% m/m
para as folhas e 0,5% m/m para o bagaço). Entretanto, vale ressaltar que o capim
elefante possui maior velocidade de crescimento que a cana-de-açúcar, sendo,
portanto, mais produtivo103.
Figura 25. Rendimentos de extração para folhas (L) e colmos (S): (LSC/SSC: Extração com
scCO2; LWE/SWE: PLE com água e etanol; LSEQ/SSEQ: Extração sequencial com scCO2 e
PLE com água e etanol; LEA/SEA: PLE com acetato de etila).
4.2.3 Composição dos extratos
Devido à utilização de solventes e métodos de extração que levam à
obtenção de extratos ricos em compostos com a polaridade do solvente utilizado, os
rendimentos devem ser considerados juntamente com os tipos de classes de
compostos obtidos por cada método. No total, considerando folhas e colmos, foram
identificados 83 compostos por GC-MS, que estão relacionados na Tabela 7,
agrupados em 9 classes: ácidos carboxílicos (identificados somente como ácidos),
álcoois e fenólicos, aldeídos, amidas, ésteres, hidrocarbonetos, cetonas, esteróis e
70
outros. O percentual foi obtido com relação às áreas dos picos obtidos em cada
cromatograma.
Em maior percentual, destacam-se os ácidos graxos e o glicerol,
relacionados à hidrólise dos triacilgliceróis, que são fontes energéticas para a planta,
além de comporem as membranas celulares6. Moléculas de glicerol livres podem ser
convertidas em triacilgliceróis ou em glicerol 3-fosfato e direcionadas para a via da
gliconeogênese ou para via glicolítica. Industrialmente, o glicerol é utilizado como
solvente, como emulsificante e umectante na indústria alimentícia e também na
indústria farmacêutica141.
Os ácidos graxos, armazenados como triacilgliceróis, são provenientes do
piruvato sintetizado a partir do CO2 fixado nos cloroplastos. Há uma grande
diferença dos tipos de ácidos presentes em diferentes plantas, o que determina a
fluidez das bicamadas lipídicas, dependendo do tamanho da cadeia e das
insaturações6. Dentre os ácidos identificados no capim elefante, o ácido linoleico
(ômega 6), o ácido α-linolênico (ômega 3) e o ácido palmítico são frequentemente
utilizados na indústria alimentícia.
O fenol e o álcool coniferílico pertencem à classe dos metabólitos
secundários das plantas, sendo este último um dos precursores para a síntese da
lignina72. Por fim, os esteroides identificados são hormônios vegetais, sintetizados a
partir dos isoprenóides, responsáveis pelo controle do desenvolvimento da planta,
estimulando o crescimento, o desdobramento das folhas, a diferenciação do xilema,
dentre outros6. Os esteroides agem ligando-se aos receptores da membrana
plasmática, ativando os genes para a modificação celular, para a síntese do
citoesqueleto e para a síntese de outros hormônios6. Estudos demonstram a
potencialidade da aplicação do sitosterol em anti-inflamatórios, na inibição de
cânceres e na redução do colesterol142 – aplicação na qual o estigmasterol também
é utilizado. O tocoferol, conhecido popularmente como vitamina E, possui atividade
antioxidante que protege as células contra radicais livres, podendo ser utilizado em
cremes e loções para a pele.
71 Tabela 7. Compostos presentes nos extratos estimados por GC-MS com similaridade mínima de 80%.
Compostos Folhas (% no extrato) Colmos (% no extrato)
LSC LWE LSEQ LEA SSC SWE SSEQ SEA
Ácidos carboxílicos
Ácido 9,12-octadecadienoico (Ácido linoleico) 3,08 0,13 - 0,74 4,08 - - 1,61
Ácido 9,12,15-octadecatrienoico (Ácido α-linolenico) 8,07 - - 2,29 - - - -
Ácido docosanoico (Ácido beênico) 0,43 - - - - - - -
Ácido dodecanoico (Ácido láurico) 0,39 0,22 - 0,59 0,86 - - 1,01
Ácido eicosanoico 0,67 - - - 1,34 - - -
Ácido heptadecanoico (Ácido margárico) - - - - 0,16 - - -
Ácido hexadecanoico (Ácido palmítico) 7,14 1,95 1,59 5,04 6,05 - 0,52 5,17
Ácido octadecanoico (Ácido esteárico) 1,35 - - 0,30 - - - 0,51
Ácido Z-octadec-9-enoico (Ácido oleico) - - - - 5,79 - - 1,18
Ácido pentadecanoico - - - - 0,08 - - -
Ácido tetradecanoico 0,16 - - 0,22 - - - -
Ácidos (total) 21,29 2,30 1,59 9,18 18,36 0,00 0,52 9,48
Álcoois / Fenólicos
1-Heptacosanol 0,48 - - - - - - -
2,4-bis(1,1-dimetiletil)-fenol - 0,31 0,38 0,42 - 0,60 0,60 0,79
2,6-dimetoxi-4-(2-propenil)-fenol - - 0,51 - - 0,78 0,82 -
2,6-dimetoxifenol - 1,16 1,68 0,38 - 0,48 0,76 -
2-metoxi-4-propilfenol - - - 0,38 - 1,04 - -
2-metoxi-4-vinilfenol - 1,60 2,25 0,58 - 1,31 1,53 0,47
2-metoxifenol - 0,55 0,75 0,13 - - 0,59 0,13
Álcool coniferílico - 2,40 3,85 - - 7,40 0,46 1,09
4-(2-propenil)-fenol - - - - - - 0,29 -
Catecol - 0,40 0,50 - - - - -
Eritritol - - - - - 3,52 3,25 2,77
72
Álcoois e fenólicos - continuação
Eugenol - - - - - 0,24 0,29 -
Glicerol - 17,79 27,16 10,39 - 17,69 19,97 19,40
Hidroquinona - 0,29 - - - - - -
Mequinol - - - - - 0,26 - -
Fenol - 2,71 4,04 - - - - -
Fitol 0,33 0,38 0,30 2,29 - - - 0,21
Trans-isoeugenol - 0,33 0,60 - - 1,88 4,93 0,13
Álcoois e fenólicos (Total) 0,81 27,92 42,02 14,57 0,00 35,20 33,49 24,99
Hidrocarbonetos
1,19-Eicosadieno - - - 0,32 - - - 0,65
1,21-Docosadieno - - - - - - - 0,30
2-metil-hexadecano - - - - - - - 0,18
4-(4-etilciclohexil)-1-pentylciclohexeno - - - - - - - 0,15
Eicosano 4,50 - - 1,12 2,19 - - 1,08
Heneicosano - - - 1,57 - - - 0,38
Hexadecano - - - - - - - 0,58
Octacosano - - - 0,34 - - - -
Octadecano - - - 3,77 - - - 0,58
Tetracosano 5,59 - - 2,80 - - - -
Hidrocarbonetos (Total) 10,09 0,00 0,00 9,92 2,19 0,00 0,00 3,90
Esteroides
4,22-Stigmastadiene-3-ona - 0,90 - - - - - -
Tocoferol (Vitamina E) 2,77 - - 3,16 0,21 - - -
Sitosterol 3,97 1,57 0,94 7,56 7,47 1,45 - 7,52
Campesterol - - - 1,36 3,32 - - 3,74
β-amirina 1,30 - - 0,64 - - - -
73
Esteroides – continuação - - - - - - - -
Spinasterona - - - - 3,61 - - -
Squaleno 0,26 - - 0,18 - - - -
Stigmast-4-en-3-ona 3,88 3,90 - - 6,51 - - -
Stigmasterol 2,43 - - 3,10 4,66 0,92 5,12
Esteroides (Total) 14,61 6,37 0,94 16,00 25,78 2,37 0,00 16,38
Aldeídos
3,5-dimetoxi-4-hidroxi cinamaldeído - 0,19 - - - 0,76 0,75 0,32
4-hidroxi-2-metoxi cinamaldeído - 0,45 - - 1,12 - -
4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzaldeído - 0,16 - - - 0,63 0,55 0,61
4-hidroxibenzaldeído - 0,22 0,37 - - 1,95 1,64 0,68
Heptadecanal - - - 3,82 - - - -
Octadecanal - - - - - - 0,37 2,02
Pentadecanal - - - - - - - 0,23
Tetradecanal - - - - - - 0,12 -
Aldeídos (Total) 0,00 0,57 0,82 3,82 0,00 4,46 3,43 3,86
Amidas
(Z)-13-docosenamida (Erucamida) - - - - 0,34 - - -
(Z)-9-octadecenamida (Oleamida) 0,14 - - - 4,68 - - 0,33
Hexadecanamida - - - - 1,11 - - -
N-butil-benzenesulfonamida 0,35 - - - 0,37 - - -
4-etil-N-(4-octafenil)-benzylamina - - - - 0,13 - - -
Amidas (Total) 0,49 0,00 0,00 0,00 6,63 0,00 0,00 0,33
Ésteres
Diisobutilftalato - - - - - - - 0,19
Bis(2-etilhexil) isoftalato - - - - 0,66 - - -
74
Ésteres – continuação
Metil homovanilato - - - 0,22 - 0,77 0,42 -
Etilvanilato - - - - - - - 0,29
Glicerol palmitato - - 2,94 - - - 0,83 0,77
Metil palmitato - - 0,14 - - - - -
Metil lignocerato 0,12 - - - - - - -
Ésteres (Total) 0,12 0,00 3,08 0,22 0,66 0,77 1,25 1,25
Cetonas
Fenilpropilcetona - - - 0,15 - - - -
2-Nonadecanona - - - - 0,06 - - 0,83
3,5-dihidroxi-6-metil-2,3-dihidropiran-4-ona - - 0,13 - - - 0,13 -
5,6,7,7a-tetrahidro-4,4-7a-trimetil-2(4H)-
benzofuranona 0,17 - - 0,31 - - - -
6,10,14-trimetil-2-pentadecanona - - - - - - - 0,28
1,8-hidroxi-3-metoxi-6-metil-9,10-antracenediona - - - - - - - 0,48
Cetonas (Total) 0,17 0,00 0,13 0,46 0,06 0,00 0,13 1,59
Outros
Cumarona - - 4,90 0,86 - - - -
Apocinina - - - - - - - 0,22
Alose - 1,11 - - - - - -
Hexadecil-oxirano 1,64 - - 4,92 - - - 1,41
Tridecil-oxirano - - - - - - - 0,25
Vanilina - 0,40 0,63 0,31 - 0,72 0,72 0,35
Outros (Total) 1,64 1,51 5,53 6,09 0,00 0,72 0,72 2,23
75
A Figura 26 apresenta um resumo das classes de compostos identificadas
nos diferentes métodos de extração utilizados. Nota-se que os extratos de colmos e
folhas, apesar da diferença no rendimento de extração, apresentam a composição
percentual das classes de compostos semelhantes. Além disso, a composição
percentual dos extratos mostra uma tendência esperada: a extração utilizando
scCO2 obteve extratos mais ricos em compostos apolares, como ácidos de cadeias
longas, hidrocarbonetos e esteróis, além de amidas, especialmente para os colmos.
Já a utilização de solventes polares, levou à obtenção de extratos ricos em álcoois e
fenólicos, principalmente, além de aldeídos nos colmos. Os extratos obtidos com
acetato de etila, por outro lado, apresentaram uma distribuição mais uniforme das
classes de compostos, devido à polaridade desse solvente ser intermediária entre o
CO2 supercrítico e a mistura água e etanol.
76
Figura 26. Composição percentual dos extratos caracterizados por GC-MS para folhas (a e
c) e colmos (b e d).
Quando o rendimento da extração é considerado, pode-se estimar a
quantidade de cada classe de compostos que pode ser obtida a partir da biomassa
in natura (Figura 27). Nesta observação, os métodos de PLE levam a rendimentos
superiores aos rendimentos das extrações com scCO2, mesmo para as classes de
compostos que possuem menor afinidade com os solventes polares. Além disso, a
extração sequencial apresenta teores similares à extração utilizando somente PLE, o
que não justificaria, em termos de rendimento total, a utilização de scCO2. No
entanto, para a escolha do método, além dos rendimentos, devem ser analisadas as
técnicas de extração em que os compostos de interesse estão presentes e quais os
métodos de separação desses componentes, com base nas aplicações finais.
4
4
4
5
7
4
5
7
cidos lcoois / en licos Hidrocarbonetos ster ides
Aldeídos Amidas steres Cetonas Outros
endimento do extrato ( )
endimento do extrato ( )
77
Figura 27. Percentual das classes de compostos presentes nos extratos considerando os
rendimentos de extração.
A escolha pela tecnologia supercrítica pode ser feita se forem
consideradas situações em que seja necessária uma total eliminação do solvente,
como nas aplicações da indústria alimentícia e farmacêutica143, além de casos em
que a eliminação de etapas de evaporação do solvente seja importante. Apesar do
baixo rendimento, esse método de extração não adiciona toxicidade ao extrato,
como por exemplo, quando solventes como o acetato de etila ou outros solventes
orgânicos são utilizados.
O uso de compostos extraídos da biomassa lignocelulósica pode
representar um novo paradigma na redução de impactos ambientais, reduzindo a
dependência de fontes de petróleo e o gasto com processos químicos de conversão,
além de agregar valor à cadeia produtiva do etanol celulósico ou de outros produtos
e materiais bioderivados. Um gargalo para a aplicação industrial desses compostos
é a necessidade de purificação e os baixos rendimentos de algumas moléculas.
Para tanto, é necessário um estudo mais aprofundado quanto à eficácia de utilizar
métodos mais seletivos de extração ou métodos de separação após a obtenção de
um extrato rico em diversos compostos.
,
,5
,
,5
,
,5
,
,5
,
,5
,
,5
cidos lcoois / en licos
Hidrocarbonetos ster ides
Aldeídos Amidas steres
Cetonas Outros
endimento em relação extração ( )
78
4.3 Fracionamento de hemicelulose e lignina
A obtenção de etanol celulósico a partir da biomassa do capim elefante
requer substratos ricos em celulose e com composições mínimas de lignina. A
composição química das folhas do capim elefante in natura e após os tratamentos
com ácido e base diluídos está relacionada na Tabela 8, juntamente com o
somatório de percentuais dos componentes para cada amostra (Total) e com a
massa de sólido restante após cada pré-tratamento.
Tabela 8. Composição química e massa de sólido remanescente após pré-tratamentos com
ácidos e bases diluídos. As análises foram realizas em duplicata e os erros correspondem
ao desvio padrão.
Amostra Componentes (% m/m)
Massa
remanescente
(%) Celulose Hemicelulose Lignina Cinzas Total
Folhas
In natura* 30,1 ± 2,2 24,3 ± 2,1 22,5 ± 0,1 5,7 ± 0,1 102,7 ± 3,1 100,0
LAC 54,2 ± 1,5 6,9 ± 0,2 29,0 ± 0,8 7,0 ± 0,2 97,1 ± 1,7 49,1 ± 2,9
LAB20 73,4 ± 0,4 6,1 ± 0,8 14,0 ± 0,4 3,0 ± 0,2 96,5 ± 1,0 30,1 ± 2,9
LAB100 82,9 ± 2,3 4,0 ± 1,1 12,3 ± 0,1 1,4 ± 0,1 100,6 ± 2,5 28,1 ± 0,7
LB20 54,7 ± 1,5 24,3 ± 1,5 20,5 ± 1,5 6,0 ± 0,1 105,5 ± 2,6 55,7 ± 0,1
LB100 63,0 ± 1,6 22,0 ± 0,6 16,2 ± 1,5 6,3 ± 0,2 107,6 ± 2,3 46,3 ± 0,1
LWEB20 55,6 ± 0,3 20,4 ± 0,2 12,6 ± 1,1 3,7 ± 0,1 92,2 ± 1,2 53,9 ± 0,3
LWEB100 63,6 ± 5,5 19,5 ± 1,7 13,3 ± 5,5 4,4 ± 0,2 100,9 ± 7,9 46,4 ± 9,1
Colmos
In natura* 38,6 ± 0,5 21,8 ± 0,7 25,5 ± 1,9 3,2 ± 0,1 103,2 ± 2,1 100,0
SAC 58,2 ± 0,2 7,8 ± 0,2 32,8 ± 4,1 1,3 ± 0,2 100,1 ± 4,1 61,0 ± 0,6
SAB20 71,9 ± 2,1 5,7 ± 0,3 22,3 ± 1,0 1,3 ± 0,2 101,2 ± 2,4 46,0 ± 2,2
SAB100 79,0 ±2,1 3,6 ± 0,1 19,1 ± 0,1 1,0 ± 0,1 102,7 ± 2,1 41,6 ± 0,4
SB20 58,0 ± 0,2 23,2 ± 0,2 17,5 ± 0,2 2,8 ± 0,1 101,6 ± 2,1 65,8 ± 4,1
SB100 62,7 ± 0,1 20,0 ± 0,1 18,2 ± 0,2 2,2 ± 0,1 103,2 ± 0,2 58,7 ± 1,6
SWEB20 60,3 ± 1,1 20,7 ± 0,1 11,1 ± 1,1 0,4 ± 0,1 92,5 ± 1,6 66,9 ± 0,6
SWEB100 63,9 ± 1,3 18,9 ± 0,2 12,8 ± 4,1 1,2 ± 0,1 96,8 ± 4,3 61,2 ± 4,2
* Foram adicionados no somatório da amostra IN 20,2 ± 0,2% de massa referente aos extrativos para as folhas e 14,2 ± 0,6% para os colmos.
Nota-se que os colmos in natura apresentam maior teor de celulose em
comparação às folhas (cerca de 8% maior). Isso possui relação com a maior
quantidade de extrativos e cinzas que as folhas apresentam, uma vez que os teores
de hemicelulose e lignina são similares para ambas as partes da planta. No entanto,
de modo geral, a utilização dos tratamentos com ácido e base diluídos foram
79
eficientes para aumentar o teor de celulose em ambos os sólidos, especialmente
com a utilização dos tratamentos sequenciais ácido-base, nos quais o teor de
celulose passou de 30% para cerca de 83% para as folhas e de 39% para 79% para
os colmos, em maiores tempos de reação.
Observa-se também que os teores dos componentes são similares entre
folhas e colmos quando se aplica um mesmo tratamento aos diferentes substratos.
Entretanto, o rendimento de sólidos é inferior para as folhas, indicando que mais
quantidades dos componentes foram extraídas para as frações líquidas, uma vez
que não foram quantificadas nos sólidos. Nas amostras em que não foi realizada a
etapa ácida, o teor máximo de celulose obtido foi de 63% para as folhas e colmos,
devido à menor remoção de hemicelulose: nas amostras sem etapa ácida, o teor
desse carboidrato é praticamente inalterado.
A etapa ácida levou à redução de 70% no teor de hemicelulose nas folhas
e 64% nos colmos. Esse teor é apenas minimamente reduzido após a etapa alcalina
sequencial. De fato, a etapa ácida é a principal responsável pela hidrólise da
hemicelulose em seus monômeros (xilose e arabinose, no caso do capim elefante19)
e em oligômeros, o que justifica a maior redução no teor deste componente nas
amostras que foram submetidas ao tratamento ácido. Os produtos hidrolisados
derivados da hemicelulose são solubilizados na fração líquida e podem ser
posteriormente direcionados para diferentes aplicações, como na própria
fermentação desses açúcares em etanol144 ou xilitol145, que é um açúcar utilizado na
dieta de diabéticos, além da produção de materiais, como adesivos76.
O aumento no teor de celulose também está relacionado à redução no
teor de lignina, que ocorreu especialmente nas etapas alcalinas: redução de até 45%
para as folhas e 31% para os colmos. Já o tratamento alcalino age especialmente na
clivagem da ligação α-aril-éter que une os monômeros da lignina, quebrando a
macromolécula em fragmentos menores, que também são solubilizados na fração
líquida16. Deste modo, a etapa alcalina mostra-se fundamental para a remoção de
lignina, conforme pode ser notado na Tabela 8, comparando as amostras in natura e
LAC com as demais. A remoção de lignina é um efeito desejado, já que sua
presença é apontada na literatura como um dos principais entraves para o acesso
das enzimas hidrolíticas ao substrato celulósico146. Além disso, a lignina removida
pode ser utilizada para a geração de energia na biorrefinaria71, para a produção de
80
materiais, como nanopartículas147 e para a produção de outros insumos químicos,
como a vanilina68, por meio de quebras catalíticas das ligações entre os monômeros
e a posterior conversão.
Além disso, a etapa alcalina também foi aplicada às amostras que foram
submetidas previamente à extração PLE utilizando água e etanol como solvente
(LWEB20, LWEB100, SWEB20 e SWEB100). Esse tratamento resultou em teores de
celulose e hemicelulose similares às amostras que foram submetidas somente ao
tratamento alcalino durante o mesmo período, indicando que as extrações podem
ser utilizadas para o fracionamento dos extrativos, sem interferirem nos tratamentos
posteriores.
Os teores de celulose obtidos por esses tratamentos são semelhantes ou
superiores aos relatados na literatura utilizando tratamentos sequenciais com ácido
e base (cerca de 1 a 2% de H2SO4 e entre 2 e 4,5% de NaOH)19,21, utilizando
apenas base (2 a 6% de NaOH)129 ou em tratamentos organossolve (40 a 80% de
etanol)19, todos aplicados a folhas de capim elefante.
Embora as etapas sequenciais levem a um maior teor de celulose, elas
resultam em hidrólise pronunciada do sólido e em menores valores de massa total
remanescente de substrato (Tabela 8), quando comparadas às amostras que não
foram submetidas à etapa ácida. Isso ocorre, pois parte da celulose acaba sendo
hidrolisada nos pré-tratamentos, na tentativa de purificá-la retirando os demais
componentes.
Na Figura 28, é possível observar o percentual restante de cada
componente nos sólidos, considerando os rendimentos dos pré-tratamentos
mostrados na Tabela 8. Nas amostras com altos teores de celulose, como as
amostras LAB20, LAB100, SAB20 e SAB100, há uma maior transferência de
celulose para a fração líquida. Contrariamente, as amostras LB20 e SB20, que são
as amostras com o menor teor de celulose dentre as amostras submetidas a algum
tratamento, não apresentem perdas de celulose. No entanto, nota-se que, mesmo
para essas amostras, há uma baixa perda de celulose nos tratamentos, o que é
desejado para o aproveitamento futuro deste componente na forma sólida. As
etapas sequenciais são as que levam à maior perda de massa celulósica, o que está
relacionado com a estrutura da parece celular, cujos componentes apresentam-se
emaranhados16.
81
Figura 28. Percentual mássico restante de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas após os
pré-tratamentos para as folhas em relação à massa inicial: a) folhas; b) colmos.
Quanto aos teores de hemicelulose, evidencia-se o que já havia sido
observado pela composição percentual dos sólidos: há uma maior transferência
deste componente na etapa ácida, sendo apenas minimamente reduzido quando se
aplica o tratamento sequencial alcalino. O aumento do tempo de reação nesta
segunda etapa não contribui significativamente para a remoção de hemicelulose. As
amostras que não foram submetidas à etapa ácida apresentam maiores quantidades
de hemicelulose na fração sólida, evidenciando que, para o fracionamento deste
carboidrato, a etapa ácida é fundamental: além de remover maiores quantidades,
comparado às situações em que apenas o tratamento alcalino é realizado, é
possível obter uma fração líquida mais pura. Caso esse componente seja extraído
diretamente pela etapa alcalina, haverá a necessidade de purificação, uma vez que
o licor será composto também em grande parte por lignina.
Quanto à remoção da lignina para a fração líquida, nota-se que uma
pequena parte é extraída na etapa ácida, que diz respeito justamente à lignina
solúvel em meio ácido, geralmente fragmentos menores que são mais facilmente
arrastados do sólido. Entretanto, é a etapa alcalina que é a maior responsável pela
extração deste componente, conforme já discutido. As etapas sequenciais ácido-
Celulose Hemicelulose Lignina Cinzas
4
restante de cada componente
na fração s lida
4
82
base, além de permitirem o melhor fracionamento de hemicelulose e lignina também
levam a uma maior remoção do componente aromático.
Quanto às cinzas, a análise deve ser avaliada com relação aos tipos de
compostos presentes em cada parte da biomassa, que possuem diferentes
características de solubilidade e, consequentemente, de extrações, que serão
discutidos na seção seguinte.
4.4 Composição das cinzas
A fração inorgânica da biomassa é chamada de cinzas e possui uma
composição dependente do tipo de biomassa e que pode ser diferente mesmo em
diferentes partes da planta. A Figura 29 apresenta a composição das cinzas para as
folhas e colmos do capim elefante, demonstrando uma grande diferença na
composição relativa. A sílica foi o principal componente encontrado nas cinzas das
folhas, enquanto para os colmos, o K2O foi majoritariamente identificado. As
quantidades de MgO foram similares para folhas e colmos, enquanto as folhas
apresentaram quantidades superiores de CaO. Embora na biomassa in natura o
percentual de cinzas fosse relativamente baixo, comparado aos outros
componentes, essa fração também dificulta a ação enzimática43. Para as folhas, o
tratamento ácido levou à remoção de 40% da matéria inorgânica, sendo que o
tratamento sequencial com base levou a até 93% de remoção na amostra LAB100,
conforme mostrado na Tabela 8. Os tratamentos sequenciais ácido-base foram mais
eficientes na remoção das cinzas, uma vez que os tratamentos que utilizaram
apenas base removeram no máximo 49% das cinzas na amostra LB100 (Tabela 8).
83
Figura 29. Composição da matéria inorgânica do capim elefante determinada por XRF.
Os compostos inorgânicos presentes no capim elefante, identificados
como óxidos por XRF, possuem diferentes solubilidades em meio ácido ou alcalino,
o que justifica essa diferença restante no sólido. A solubilização da sílica, por
exemplo, ocorre por meio da hidrólise do óxido (SiO2) em ácido silícico (Si(OH)4),
que é solúvel em água e pode ser lixiviado para o licor do pré-tratamento. Esse
processo é catalisado em meio alcalino e ácido, mas mais favorecido em pH acima
de 943. Os óxidos de magnésio e cálcio são solúveis em meio ácido, o que justifica a
menor redução de cinzas quando a etapa ácida não é realizada. Já o óxido de
potássio e o pentóxido de fósforo apresentam solubilidade em meio aquoso, e,
provavelmente, foram removidos na etapa ácida148.
4.5 Efeito da moagem em moinho de bolas
4.5.1 Escolha da condição de moagem
A redução da cristalinidade é apontada na literatura como um fator para a
melhoria da atividade enzimática139. Assim, um planejamento experimental foi
realizado com as folhas e colmos in natura separadamente para otimizar a moagem
em moinho de bolas (Tabela 9). Com base neste estudo, definiu-se a condição do
Ensaio 7 como a condição que seria utilizada para a moagem das amostras pré-
tratadas, devido ao menor tempo para alcançar cristalinidade semelhante à de
84
experimentos mais longos (como dos ensaios 3 e 8). Esse tipo de planejamento
ortogonal L9 é utilizado quando as condições experimentais não permitem a
realização de um ponto central que seja de fato a metade entre os pontos superiores
e inferiores. No caso deste estudo sobre a moagem, a quantidade de bolas
utilizadas tinha esta limitação. No entanto, foi possível, por meio da modificação de
todas as variáveis simultaneamente, definir uma condição ótima por meio da análise
multivariada.
Tabela 9. Planejamento experimental para a moagem em moinho de bolas.
Ensaio
Diâmetro
das bolas
(mm)
Quantidade
de bolas
Tempo
(h)
Rotação
(rpm)
Cristalinidade (%)
Folhas Colmos
In natura - - - - 54 65
1 12 8 2 150 52 69
2 12 12 6 200 52 53
3 12 16 10 250 23 18
4 15 16 2 200 52 54
5 15 8 6 250 53 28
6 15 12 10 150 36 35
7 20 12 2 250 29 29
8 20 16 6 150 24 29
9 20 8 10 200 17 16
4.5.2 Efeito da moagem na cristalinidade da biomassa
A Figura 30 apresenta a cristalinidade das amostras de folhas e colmos
de capim elefante pré-tratadas antes e após a moagem utilizando a condição
definida anteriormente (12 bolas de 20 mm por 2 h a 250 rpm). Considerando o
índice de cristalinidade da amostra in natura (Tabela 9), nota-se um aumento com a
realização dos tratamentos químicos, devido à remoção de frações amorfas da
biomassa, como lignina e hemicelulose9,149. Após a moagem, ocorre a redução do
índice de cristalinidade devido à amorfização da celulose cristalina.
Surpreendentemente, colmos e folhas comportam-se de modo muito diferente
quando submetidos à moagem após os pré-tratamentos: a ação do moinho é muito
mais pronunciada nos colmos do que nas folhas. Isso pode ter relação com o
contato mecânico entre as bolas e a biomassa, uma vez que as partículas das folhas
são mais finas do que as partículas dos colmos.
85
Conforme observado, a presença da etapa ácida dificulta a amorfização
da biomassa, uma vez que as amostras que não foram submetidas à etapa ácida
apresentaram uma maior redução na cristalinidade. Quando o teor de celulose e o
teor de lignina são relacionados com o índice de cristalinidade das folhas, observa-
se uma tendência: o aumento no teor de celulose leva a um aumento no IC,
enquanto um aumento no teor de lignina leva a uma redução no IC. Além disso,
esses teores também possuem uma relação: o aumento no teor de celulose está
linearmente relacionado com a remoção de lignina. Como a lignina é um
componente amorfo, isso leva ao aumento do índice de cristalinidade, que é um
valor relativo.
Figura 30. Índice de cristalinidade das amostras pré-tratadas antes e após a moagem em
moinho de bolas (12 bolas de 20 mm a 250 rpm por 2 h).
4
Sem moagem Ap s moagem
5 5
74
5
7
7
54
75
7
7
7
7
5
86
4.6 Efeito dos tratamentos na digestibilidade enzimática
4.6.1 Efeito das extrações
Para avaliar se as extrações teriam algum efeito na liberação de
açúcares, os sólidos residuais das extrações foram submetidos à hidrólise
enzimática. As amostras submetidas à extração utilizando acetato de etila não foram
estudadas nessa etapa, devido à maior toxicidade e porque os resultados obtidos
utilizando esse solvente não foram superiores aos obtidos utilizando água e etanol,
que são solventes menos tóxicos. Essa avaliação foi realizada considerando que
CO2 supercrítico em conjunto com água ou outros solventes, como etanol, já tinha
sido utilizado para a melhoria da digestibilidade enzimática, especialmente de
madeiras150,151. Portanto, era importante avaliar se haveria algum aumento na
liberação de açúcares, o que poderia ser utilizado para a obtenção dos extratos, por
meio das extrações, e de açúcares fermentáveis, após a hidrólise enzimática.
Entretanto, as extrações não contribuíram significativamente na liberação
de açúcares em nenhum dos casos, conforme observado na Figura 31. Para as
folhas, a hidrólise da biomassa in natura leva à liberação de 124,3 ± 2,7 mg de
açúcar/g biomassa, enquanto a hidrólise do substrato residual da extração
sequencial scCO2-PLE leva à liberação de 198,2 ± 20,6 mg/g de biomassa, o que
representa um aumento de cerca de 55%. No entanto, esse aumento é baixo,
comparado a outros tipos de pré-tratamentos, como o alcalino16,19,104.
Figura 31. Massa de açúcar liberada pela hidrólise enzimática dos substratos após a
extração com scCO2 e PLE.
5
5
5
mg aç car / g biomassa
licose ilose Arabinose
87
4.6.2 Análise morfológica dos substratos após as extrações
O percentual dos componentes extraídos é pequeno quando comparado
aos processos de remoção de hemicelulose e lignina, que levam a um aumento
significativo na digestibilidade enzimática. Além disso, a análise microestrutural dos
substratos in natura e após as extrações, apresentados na Figura 32 para as folhas
e na Figura 33 para os colmos, mostra que não há uma alteração significativa da
superfície dos materiais causadas pelas extrações. Como os processos removem
quantidades relativamente baixas de componentes, não ocorre uma desestruturação
da parede celular vegetal. Logo, como a ação das enzimas depende da exposição
das cadeias de celulose, que estão recobertas por hemicelulose e lignina no material
in natura, não foram observados aumentos significativos na liberação dos açúcares.
Resultados semelhantes sobre o efeito da extração com CO2 supercrítico foram
obtidos em outros substratos, como resíduos de amora152 e pimenta malagueta153.
Para os colmos, nota-se, após a extração com CO2 supercrítico, a
presença de pequenos depósitos que não foram observados no material in natura.
Isso pode indicar a redeposição do extrato no substrato, o que também já foi
relatado na literatura153 e poderia justificar o baixo rendimento de extração (Figura
25).
88
Figura 32. Imagens de FESEM das folhas in natura (a e b); submetidas à extração com
scCO2 (c e d); somente com PLE, utilizando água e etanol (e e f); e sequencial scCO2-PLE
(água e etanol) (g e h).
89
Figura 33. Imagens de FESEM dos colmos in natura (a); submetidos à extração com scCO2
(b); somente com PLE, utilizando água e etanol (c); e sequencial scCO2-PLE (água e etanol)
(d).
4.6.3 Efeito dos tratamentos com ácidos e bases diluídos
A Figura 34 apresenta um resumo da quantidade de açúcares liberados
por grama de biomassa por meio da hidrólise enzimática das amostras in natura e
que foram submetidas a tratamentos com ácido e base diluídos. Todos os
tratamentos levaram ao aumento na liberação de açúcares em relação à amostra in
natura, chegando a 6 vezes para as folhas e 3 vezes para os colmos. De modo
geral, as folhas liberaram uma maior quantidade de açúcares por grama de
biomassa do que os caules quando submetidas ao mesmo tratamento.
90
Figura 34. Quantidade de açúcares liberados por grama de substrato após a hidrólise
enzimática das amostras submetidas ao tratamento com ácido e base diluídos.
O efeito da etapa ácida na liberação de açúcares é mais pronunciado
para as folhas do que para os colmos, fato que já havia sido discutido por Santos e
colaboradores132. Devido ao efeito da etapa ácida na remoção de hemicelulose,
todas as amostras que foram submetidas a esse tratamento apresentaram menor
liberação de xilose e não apresentaram liberação de arabinose, que são os açúcares
que compõem este biopolímero.
No caso do coquetel enzimático utilizado no nosso trabalho (Cellic® CTec
2, Novozymes), a presença de hemicelulose no sólido não é um problema, já que ele
contém enzimas que atuam também na digestão dessa fração da biomassa, levando
à formação de açúcares fermentáveis. De fato, conforme mencionado anteriormente,
a otimização utilizando uma mistura dos coquetéis enzimáticos Celluclast e
Novozyme 188 já havia concluído que a etapa ácida não contribui para a liberação
de açúcares redutores19, o que foi novamente observado. Assim, no caso do
presente trabalho, a etapa ácida é estudada e proposta mais como uma forma de
promover um fracionamento seletivo da hemicelulose.
No entanto, xilose e arabinose, embora sejam fermentáveis, necessitam
de condições específicas para tanto. A fermentação diretamente utilizando a
levedura Saccharomyces cerevisiae não é possível, sendo necessário um processo
prévio de isomerização da xilose a xilulose para poder ser fermentado por esta
levedura154. Outros métodos envolvem a utilização de leveduras específicas para a
4
licose ilose Arabinosemg aç car / g biomassa
91
fermentação de pentoses, como é o caso do micro-organismo Pichia stipitis155. Além
desses métodos, também é possível realizar manipulações genéticas na levedura
Saccharomyces cerevisiae, que possibilitam a fermentação156.
A etapa alcalina teve um efeito mais expressivo na liberação de açúcares,
sendo que não houve diferença significativa entre amostras que foram submetidas a
tratamentos longos (100 min) e amostras submetidas a tratamentos curtos (20 min).
Essas conclusões são importantes para definir as condições de pré-
tratamento, pois, em uma biorrefinaria, deve-se avaliar as alternativas mais
economicamente vantajosas para a utilização dos componentes. Por exemplo, a não
utilização da etapa ácida restringe a utilização da hemicelulose para a produção de
açúcares fermentáveis, que não são tão facilmente fermentáveis, embora
representem a eliminação de uma etapa do processo (a etapa ácida). Deste modo,
caso a etapa ácida seja utilizada, a hemicelulose pode ser recuperada da fração
líquida e direcionada para a produção de materiais ou outros insumos químicos,
como o furfural75.
As amostras submetidas à extração com PLE utilizando água e etanol
como solvente, que apresentaram maior rendimento de extração e menor
quantidade de etapas no processo, foram também submetidas ao tratamento
alcalino. De modo geral, o comportamento frente à hidrólise enzimática foi
semelhante às amostras que foram submetidas apenas à etapa alcalina, indicando
que as extrações não atrapalham nos tratamentos seguintes. Os tempos mais curtos
de reação na etapa alcalina também foram mais eficientes, como para as outras
amostas. Portanto, tais métodos podem ser combinados caso deseje-se aproveitar a
fração dos extrativos e produzir etanol. Além disso, a lignina removida pelo
tratamento básico pode ser aproveitada.
A Figura 35 apresenta as correlações entre os teores dos componentes
presentes nos sólidos e os açúcares liberados na hidrólise enzimática. Nota-se uma
correlação positiva e alta entre os teores de celulose no sólido e glicose liberada
pela hidrólise (Figura 35a e b), indicando que o enriquecimento de celulose na
fração sólida está diretamente relacionada com a liberação de glicose; ou seja, os
tratamentos químicos possuem efeito no aumento da liberação de açúcares. O
mesmo ocorre quando considera-se o total de celulose e hemicelulose, relacionando
com a quantidade de glicose, xilose e arabinose liberadas (Figura 35c e e). Para a
92
lignina, há uma correlação negativa, indicando que com maiores teores de lignina há
uma menor liberação de glicose.
Figura 35. Correlações entre teores de um determinado componente no sólido e a
quantidade de glicose liberada pela hidrólise enzimática para folhas e colmos: celulose (a e
b); carboidratos (soma de celulose e hemicelulose) (c e d); lignina (e e f).
4
4
mg de glicose liberada / g de biomassa
mg de celulose / g de biomassa
4
4
mg de glicose liberada / g de biomassa
mg de celulose / g de biomassa
4
mg de aç cares liberados /
g de biomassa
mg de carboidratos / g de biomassa
4
mg de aç cares liberados /
g de biomassa
mg de carboidratos / g de biomassa
4
4
mg de glicose liberada / g de biomassa
mg de lignina / g de biomassa
4
4
mg de glicose liberada / g de biomassa
mg de lignina / g de biomassa
93
Os resultados de hidrólise enzimática obtidos no trabalho são
semelhantes, e até mesmo superiores, aos relatados na literatura para o capim
elefante tratado com NaOH 3%131 e hidrolisado com enzimas produzidas utilizando
capim elefante como substrato (carga de 10 FPU/g de substrato) que liberou 558,56
± 41,18 mg de açúcares redutores por grama de biomassa. Também são superiores
aos de amostras tratadas com explosão de vapor20, que liberaram um total de
863,42 ± 62,52 mg/g de açúcares redutores, utilizando as mesmas condições de
hidrólise.
4.6.4 Alterações morfológicas dos substratos após os tratamentos com ácidos e
bases diluídos
As imagens de SEM foram utilizadas para discutir os efeitos dos
tratamentos químicos na biomassa in natura, o que influencia na liberação de
açúcares pela hidrólise enzimática (Figura 36 para folhas e Figura 37 para os
colmos).
Conforme discutido sobre o efeito das extrações (item 4.6.1), o substrato
não tratado (Figura 36a e Figura 37a) apresenta uma camada densa,
majoritariamente composta por lignina e hemicelulose, que é sequencialmente
removida com os tratamentos químicos16,157. As alterações morfológicas possuem,
portanto, uma relação com a composição química: a etapa ácida, que remove
principalmente hemicelulose, leva a uma maior exposição das fibras de celulose
(Figura 36b e Figura 37b). No entanto, esse efeito é mais pronunciado nos
tratamentos alcalinos, devido à remoção da lignina (Figura 36c-h e Figura 37c-h).
Além disso, como a lignina atua como uma espécie de cola entre as fibras
de celulose, observa-se uma desfibrilação do substrato nos tratamentos sequenciais
ácido-base (Figura 36c-d e Figura 37c-d), observando-se o destacamento de fibras
micrométricas. Entretanto, esse efeito não é observado tão expressivamente nas
amostras que não foram tratadas previamente com ácido diluído. Efeitos de
tratamentos combinados em bagaço de cana-de-açúcar resultaram em efeitos
similares, deixando as fibras de celulose mais expostas e disponíveis para a ação
enzimática157. De fato, especialmente nas folhas, os tratamentos combinados
levaram a uma maior liberação de açúcares pela hidrólise enzimática (Figura 34).
94
Figura 36. Imagens de FESEM para as folhas: In natura (a); Ácido (b); Ácido-Base (20 min)
(c); Ácido-base por 100 min (d); Somente básico por 20 min (e); Somente básico por 100
min (f); PLE e básico por 20 min (g); e PLE e básico por 100 min.
95
Figura 37. Imagens de FESEM para os colmos: In natura (a); Ácido (b); Ácido-Base (20 min)
(c); Ácido-base por 100 min (d); Somente básico por 20 min (e); Somente básico por 100
min (f); PLE e básico por 20 min (g); e PLE e básico por 100 min.
96
Além da análise da superfície dos substratos, análises de micro-CT foram
utilizados para avaliar a estrutura interna dos materiais (Figura 38, para as folhas e
Figura 39, para os colmos). Comparando as partes da planta sem tratamento, nota-
se que os colmos apresentam poros maiores do que as folhas. De modo geral, os
tratamentos químicos criam poros na estrutura da biomassa, devido à extração dos
componentes como hemicelulose e lignina. Esse fator, juntamente com a exposição
das fibras de celulose, é importante para aumentar a digestibilidade enzimática da
biomassa62,146. Nota-se para as folhas, que o material in natura apresenta uma
estrutura mais compacta (fechada), que vai se abrindo com os tratamentos químicos.
Para os colmos, nota-se que, devido aos vasos condutores da planta, não há uma
“abertura” da amostra, e sim a criação de mais portos nas regiões densas do
substrato in natura.
97
Figura 38. Imagens de micro-CT das folhas de capim elefante: In natura (a); Submetidas a
tratamento ácido (b); tratamento sequencial ácido-base (c); e somente a tratamento básico
(d).
98
Figura 39. Imagens de micro-CT dos colmos de capim elefante: In natura (a); Submetidas a
tratamento ácido (b); tratamento sequencial ácido-base (c); e somente a tratamento básico
(d).
99
4.6.5 Efeito da moagem em moinho de bolas
A Figura 40 apresenta a comparação entre a quantidade de açúcares
liberados antes e após a moagem em moinho de bolas. O tratamento físico utilizado
levou ao aumento na digestibilidade enzimática para quase todos os casos (exceto
para as amostras LAB100M e SB100M). A amostra SB20M teve o maior aumento
em relação à amostra sem moagem (cerca de 30%), no qual a liberação de
açúcares passou de 644,5 ± 20,8 mg/g de biomassa para 849,2 ± 37,8 mg/g de
biomassa. Para as folhas, o maior aumento se deu na amostra LB20M, com
aumento de cerca de 20%. Esses aumentos, embora sejam relativamente pequenos,
devem ser analisados do ponto de vista da eficiência dos pré-tratamentos na
digestibilidade enzimática: os tratamentos utilizados já conduzem a melhorias de
cerca de 600%, comparados às amostras in natura.
Figura 40. Quantidade de açúcares liberados por grama de substrato após a hidrólise
enzimática das amostras submetidas ao tratamento com ácido e base diluídos e após
moagem.
As imagens de SEM das amostras após a moagem (Figura 41) indicam a
redução do tamanho das partículas ocasionado pelo processo físico. Além disso,
não é possível identificar as fibras anteriormente presentes, indicando a maceração
por meio da moagem. As partículas obtidas formam aglomerados, como é possível
observar nas imagens com o aumento de 1000x, além de apresentarem a superfície
mais compactada, também devido ao efeito da moagem.
4
mg aç car / g biomassa
licose ilose Arabinose
100
Figura 41. Imagens de FESEM das amostras moídas em moinho de bolas: folhas
submetidas a tratamento sequencial ácido-base por 20 min (a e b); somente básico por 20
min (c e d); colmos submetidos a tratamento sequencial ácido-base por 20 min (e e f); e
somente básico por 20 min (g e h).
101
A literatura aponta que não há uma relação muito clara entre a redução
da cristalinidade e o aumento na liberação de açúcares redutores139. Logo, como o
processo de redução da cristalinidade é acompanhado pela redução do tamanho da
partícula, os aumentos ocasionados pela moagem podem também ter relação com a
maior área superficial. A utilização da moagem como alternativa para a melhoria da
liberação de açúcares deve ser estudada do ponto de vista econômico, em uma
avaliação que conclua se a adição de uma etapa ao processo, que leva a um maior
gasto de tempo e energia, é compensada pela liberação de açúcares. Caso a
moagem não seja excessivamente dispendiosa energeticamente, estudos podem
ser direcionados para a minimização de tempos e insumos químicos que sejam
compensadas pela ação do moinho de bolas e levem à uma conversão máxima de
carboidratos em açúcares fermentáveis.
Menegol e colaboradores103, ao estudarem o efeito de diferentes
tamanhos de partícula na hidrólise enzimática de capim elefante, notaram uma
relação entre o tamanho da partícula e a liberação de açúcares: partículas maiores
liberaram menos açúcares que partículas menores. Esse mesmo efeito pode ocorrer
no caso da moagem em moinho de bolas, uma vez que o material é pulverizado
nesse processo, dificultando a diferenciação entre o efeito do tamanho da partícula e
da redução da cristalinidade na liberação de açúcares.
4.6.6 Visão geral do efeito dos processos na digestibilidade enzimática
A Figura 42 apresenta o resumo de todas as amostras submetidas a
tratamentos químicos e moagem, quanto à digestibilidade enzimática. Nota-se que a
moagem aplicada diretamente à biomassa in natura leva a um aumento significativo
da quantidade de açúcar liberada, o que indica que esse tratamento físico é eficiente
na liberação de açúcares. Entretanto, como a moagem e a hidrólise são realizadas
sem o fracionamento dos componentes, é necessário estudar a influência desses
procedimentos nas propriedades dos subprodutos e se é possível recuperá-los.
Ademais, a moagem em moinho de bolas ainda não é um método industrial, e
devem ser realizados estudos quanto ao gasto energético desse processo.
102
Figura 42. Resumo da liberação de açúcares das amostras in natura e submetidas a
tratamentos químicos e físicos.
4.6.7 Conversão de celulose em glicose
A Figura 43 apresenta a conversão de celulose em glicose, juntamente
com a quantidade de glicose liberada pela hidrólise enzimática nos tratamentos
químicos. Nota-se que após os tratamentos químicos, a conversão de glicose passa
atinge valores próximos a 100%. A conversão é aumentada com a moagem em
moinho de bolas, quando comparam-se amostras sem moer e moídas. Além disso, a
utilização da moagem diretamente ao substrato in natura já foi eficiente na
conversão de cerca de 100% de celulose em glicose. Nota-se também que tempos
maiores na etapa básica nem sempre conduzem a maiores conversões de celulose
em glicose, o que são indícios para a redução dos tempos de tratamento.
4
mg aç car / g biomassa
licose ilose Arabinose
103
Figura 43. Relação entre a quantidade de glicose liberada pela hidrólise enzimática e o
percentual de conversão de celulose em glicose: a) folhas; e b) colmos.
4.6.8 Avaliação dos açúcares liberados considerando os rendimentos
A eficiência no tratamento pode ser notada quando se compara a
quantidade de glicose liberada nas amostras que foram submetidas ao tratamento
sequencial ácido-base às que não foram. Nota-se que a quantidade de glicose
liberada pelos pré-tratamentos sequenciais é superior às que não foram submetidas,
o que tem relação com a maior quantidade de celulose disponível nestes sólidos
(Tabela 8). A quantidade de xilose é superior nas amostras que não foram
submetidas ao tratamento ácido pelo mesmo motivo: a hemicelulose é mantida no
sólido e convertida em xilose e arabinose.
Outra observação quanto à relação entre os tratamentos realizados e a
digestibilidade enzimática foi que o aumento no tempo do tratamento alcalino não
conduz a liberações de açúcares muito superiores. A amostra LAB100 libera apenas
2,5% a mais de açúcares do que a amostra LAB20, por exemplo. Além disso, como
maiores tempos levam a menores rendimentos de sólido, também há uma menor
massa total de açúcares obtidos. A Figura 44 apresenta esses valores, considerando
os rendimentos. Nota-se que, devido à menor perda de massa dos colmos durante
os tratamentos, mesmo com menor liberação de açúcares, comparados às folhas, a
massa total de açúcares liberados é superior. Esse é um resultado importante e
inesperado, uma vez que os trabalhos relatados na literatura estão focados
especialmente nas folhas do capim elefante19,20,104. Portanto, a utilização dos colmos
4
5
7
4
5
7
4
5
7
4
5
7
104
pode representar um modo de viabilizar a utilização desta biomassa em larga
escala.
Figura 44. Massas de açúcares fermentáveis obtidos a partir de 1 tonelada de biomassa.
A partir desses dados, pode-se determinar os melhores cenários, visando
à produção de etanol celulósico e utilizando ácidos e bases diluídos. Para o
fracionamento da hemicelulose, buscando a aplicação em outras áreas, é
necessária a utilização da etapa ácida. Portanto, as amostras LAB20 e SAB20,
ambas utilizando 20 minutos de reação, são mais promissoras para essa finalidade,
uma vez que gastam 1/5 do tempo das amostras LAB100 e SAB100 e liberam
quantidades semelhantes de açúcares totais. Por ser utilizada após a remoção dos
demais componentes, a moagem apresenta uma possibilidade para a melhoria da
digestibilidade enzimática que deve ser estudada, uma vez que não prejudica o
fracionamento dos subprodutos.
No cenário em que a hemicelulose é hidrolisada e fermentada em etanol,
a amostra LB20 tem um rendimento superior à amostra LB100, sendo mais
promissora; para os colmos, há uma maior liberação de açúcares na amostra
SB100. No entanto, considerando o tempo de processamento, conforme já
mencionado, a amostra SB20 possui vantagem. É importante notar que essa
avalição é superficial e não estão sendo considerados os processos intermediários,
como a lavagem e o resfriamento, que ocorrem em maior frequência nos processos
que duram 20 minutos.
4
5
7
licose ilose Arabinose
Aç car liberado a partir de
ton de biomassa (kg)
105
Conforme já discutido anteriormente, a moagem diretamente à biomassa
in natura leva a um aumento significativo de conversão de celulose em glicose e,
como não há perda de massa na moagem, há uma liberação alta de açúcares,
quando compara-se às outras amostras. No entanto, embora pareça promissor para
a produção de etanol, esse processo não permite a recuperação dos componentes
de modo seletivo e estudos devem ser realizados sobre as características da lignina
residual da hidrólise enzimática.
Sendo assim, as condições utilizando 20 minutos na etapa básica tornam-
se mais promissoras em ambos os casos, o que é positivo, uma vez que utilizam
menores tempos para a reação. Portanto, as frações líquidas dessas condições
foram quantificadas, como será discutido na próxima seção.
4.7 Caracterização das frações líquidas
A Tabela 10 apresenta a quantidade de açúcares, lignina solúvel e
insolúvel presentes nas frações líquidas das amostras submetidas ao tratamento
ácido e alcalino (por 20 min), considerando 1 ton de material de partida. Essa
caracterização é importante para determinar a quantidade de cada produto que pode
ser recuperada das frações. Analisando tais resultados, o tratamento sequencial
ácido-base é mais eficiente para a recuperação de hemicelulose e lignina, tanto para
folhas como para colmos, em termos de quantidade que pode ser recuperada e de
possibilidade de fracionamento durante a extração. Além disso, conforme já
discutido, a etapa alcalina quando aplicada aos substratos residuais das extrações
utilizando PLE com água e etanol permitem recuperar tanto os extratos quanto
lignina, em quantidades similares ou superiores às amostras cujo tratamento alcalino
foi diretamente aplicado à biomassa in natura.
106
Tabela 10. Caracterização dos componentes presentes nas frações líquidas dos
tratamentos químicos.
Amostra
Massa quantificada partindo de 1 ton de biomassa (kg)
Glicose Xilose Arabinose Lignina
solúvel
Lignina
insolúvel
Folhas
LAC 37,8 ± 0,8 190,3 ± 4,6 43,6 ± 2,0 73,1 ± 0,2 29,6 ± 6,0
LAB20 2,1 ± 0,1 7,6 ± 0,1 3,6 ± 0,2 - 137,8 ± 50,0
LB20 31,1 ± 6,8 81,8 ± 1,9 18,0 ± 1,4 23,9 ± 5,6 85,2 ± 12,5
LWEB20 20,7 ± 0,3 97,9 ± 3,2 21,8 ± 0,6 18,8 ± 2,8 85,2 ± 15,5
Colmos
SAC 32,5 ± 1,4 187,5 ± 8,1 21,4 ± 0,6 13,4 ± 0,8 -
SAB20 11,4 ± 6,6 16,8 ± 0,1 7,7 ± 0,2 11,4 ± 0,9 85,2 ± 15,5
SB20 12,8 ± 0,1 56,1 ± 0,8 0,4 ± 0,1 16,0 ± 0,1 56,9 ± 1,5
SWEB20 13,2 ± 0,7 89,5 ± 0,3 11,3 ± 0,1 18,6 ± 0,1 94,7 ± 5,0
4.8 Fermentação
A Figura 45 apresenta o ensaio cinético realizado para a obtenção de
etanol obtido a partir da fermentação dos açúcares das condições que utilizavam 20
minutos na etapa básica, utilizando ou não etapa ácida previamente. Nota-se que a
concentração de etanol mantém-se praticamente constante após 12 horas de
processo para as folhas (Figura 45a), com uma concentração de etanol de 5,14 ±
0,57 g/L para a condição sequencial ácido-base e 3,14 ± 0,12 g/L para a condição
utilizando apenas o tratamento alcalino. Para os colmos, a fermentação atingiu a
concentração máxima após 6 horas para os colmos (Figura 45b), com a
concentração de 3,26 ± 0,22 g/L para os tratamentos sequenciais e 2,95 ± 0,10 g/L
para os que utilizaram somente base. Para as folhas, esses valores estão próximos
dos valores obtidos para a fermentação de capim elefante utilizando altas
concentrações de sólidos104 (6,1 g/L).
107
Figura 45. Ensaio cinético para a fermentação e obtenção de etanol: a) folhas; b) colmos.
A partir das condições obtidas no ensaio cinético, é possível estimar a
quantidade de etanol que pode ser obtida a partir de 1 ton de biomassa, como foi
realizado para as frações líquidas e açúcares, além do rendimento de etanol,
considerando a quantidade de glicose disponível para fermentação (Tabela 11).
Portanto, nesse caso, como foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae, as
pentoses não foram convertidas a etanol. Esses valores de rendimento podem ser
utilizados para estimar a quantidade de etanol que pode ser produzida, por exemplo,
nas amostras que foram submetidas ao tratamento sequencial PLE-alcalino
(LWEB20 e SWEB20).
Tabela 11. Quantidade de etanol produzida a partir de 1 tonelada de biomassa e rendimento
do processo.
Amostra
Massa quantificada partindo de 1 ton de
biomassa (kg)
Glicose Etanol Rendimento
(%)
Folhas
LAB20 225,3 ± 23,3 61,8 ± 9,1 48,4
LB20 310,5 ± 5,5 70,0 ± 2,6 39,7
Colmos
SAB20 242,5 ± 11,6 59,9 ± 4,9 43,6
SB20 307,8 ± 23,0 77,7 ± 5,5 44,5
4 5
4
Concentração de etanol (g/L)
empo de fermentação ( )
LA L
SA S
empo de fermentação ( )
4
4 5
108
4.9 Propostas de cenários
Tendo como base os resultados obtidos para a conversão dos
carboidratos em açúcares fermentáveis, da fermentação em etanol e da
caracterização dos demais componentes extraídos, além da avaliação de tempos de
reação e redução de etapas e reagentes, foi possível traçar diferentes cenários,
dependendo do tipo de produto que se deseja obter em uma refinaria. Para isso,
dividiu-se o processo em 3 possíveis cenários. Nesses cenários, não foi considerada
a possibilidade de somente moer a biomassa em moinho de bolas, embora isso
tenha levado a resultados surpreendentes de sacarificação. Isso porque a moagem
aplicada diretamente à biomassa, seguida da sacarificação, torna mais difícil a
recuperação dos demais compostos.
Nestes cenários, considera-se que toda a fração de extrativos é extraída
com o primeiro tratamento químico aplicado; portanto, o balanço não é realizado
para esses componentes. Além disso, como geralmente a recuperação da lignina é
realizada por precipitação em meio ácido73, apenas a lignina insolúvel foi
considerada como possível de recuperação.
4.9.1 Cenário 1: Produção de etanol e recuperação de lignina
A Figura 46 apresenta o esquema para o cenário em que se deseja
produzir etanol e recuperar lignina. Conforme discutido, devido à maior transferência
de massa para a fração líquida quando são aplicados tratamentos sequenciais, a
etapa alcalina aplicada diretamente à biomassa in natura é a melhor opção quando
se deseja obter açúcares fermentáveis. Além disso, grande parte da hemicelulose
permanece no substrato, que pode ser convertida a etanol utilizando os processos
específicos para fermentação de pentoses.
No licor da etapa alcalina, encontra-se uma grande quantidade de lignina
(85 kg para as folhas e 60 kg para os colmos), que pode ser recuperada por
precipitação em meio ácido73. No entanto, devido à presença de hemicelulose, pode
ser necessário uma etapa de purificação da lignina precipitada.
Foram consideradas condições com e sem moagem em moinho de bolas,
uma vez que a literatura ainda não apresenta análises aprofundadas sobre a energia
109
gasta por esse tipo de tratamento em escala industrial. Caso esse seja um processo
que demande muita energia, no contexto deste trabalho, essa etapa pode ser
eliminada, pois encareceria o custo do processo.
Figura 46. Esquema do Cenário 1 para a biorrefinaria de capim elefante para folhas (acima)
e colmos (abaixo): obtenção de etanol e recuperação de lignina.
110
4.9.2 Cenário 2: Produção de etanol, recuperação de hemicelulose e lignina
O segundo cenário proposto (Figura 47) foi um cenário em que se deseja
fracionar a hemicelulose na fração líquida ácida e obter lignina mais purificada na
fração líquida alcalina. Conforme discutido, a partir da fração ácida é possível
recuperar cerca de 190 kg de xilose, o principal constituinte da hemicelulose, a partir
de 1 ton. de biomassa. Como os extrativos também são removidos na etapa ácida,
após a extração destes componentes para uma fração orgânica, por exemplo, é
possível obter xilose mais purificada158.
A quantidade de lignina que pode ser obtida na fração líquida da etapa
alcalina (135 kg para as folhas e 85 kg para os colmos) é superior do que no Cenário
1, indicando que o Cenário 2 também é mais interessante quando se deseja
recuperar este componente. Embora o rendimento de etanol seja menor nesse
processo (cerca de 10% menor para as folhas e 25% para os colmos), uma
avaliação integrada da possibilidade de utilizar hemicelulose e lignina para outras
aplicações com maior valor agregado é importante para viabilizar a biorrefinaria.
Além disso, os extrativos da biomassa foram extraídos na etapa ácida e podem ser
recuperados por meio de uma extração líquido-líquido, por exemplo, e podem ser
utilizados. Apesar dessa abordagem também ser possível no Cenário 1, como
lignina, hemicelulose e extrativos estão misturados na mesma fração líquida, o
processo de separação é mais difícil, com mais etapas e, consequentemente, mais
caro.
111
Figura 47. Esquema do Cenário 2 para a biorrefinaria de capim elefante para folhas (acima)
e colmos (abaixo): obtenção de etanol, recuperação de hemicelulose e lignina.
112
4.9.3 Cenário 3: Produção de etanol, recuperação de extrativos e lignina
O último cenário proposto (Cenário 3) está apresentado na Figura 48.
Neste cenário, escolheu-se a extração com PLE utilizando água e etanol para a
recuperação dos extrativos, especialmente álcoois e fenólicos (21 kg para as folhas
e 25 kg para os colmos). Embora esses teores sejam inferiores aos teores de
hemicelulose e lignina que podem ser recuperados, esses produtos são utilizados
geralmente para aplicações com maior valor agregado, conforme já discutido. Do
mesmo modo que para o Cenário 1, a etapa alcalina permite, portanto, a
recuperação de lignina da fração líquida.
113
Figura 48. Esquema do Cenário 3 para a biorrefinaria de capim elefante para folhas (acima)
e colmos (abaixo): obtenção de etanol, recuperação de hemicelulose e lignina.
114
5. Conclusões
A partir do estudo de métodos químicos e físicos para a melhoria da
digestibilidade enzimática e para a recuperação dos subprodutos do processo de
produção de etanol celulósico, foi possível propor condições mais eficientes que
permitem o aproveitamento integral do capim elefante de modo integrado. Os
diferentes tipos de extração utilizados para a recuperação de moléculas orgânicas
de alto valor agregado, além de serem métodos verdes, permitiram a caracterização
de compostos que podem ser empregados nas indústrias alimentícia, farmacêutica e
cosmética, de modo sustentável. Por meio dessa abordagem, além de viabilizar uma
biorrefinaria, é um caminho para alterar o paradigma atual de obtenção desses
produtos de fontes não renováveis.
A etapa ácida demonstrou ser fundamental para o fracionamento da
hemicelulose, além de possibilitar uma maior recuperação de lignina. Por outro lado,
o tratamento alcalino aplicado diretamente à biomassa in natura leva a valores
superiores de produção de etanol. No entanto, os produtos que podem ser obtidos
por meio da conversão da hemicelulose e lignina em materiais, outros combustíveis,
além do etanol, e demais insumos químicos, podem agregar mais valor à
biorrefinaria.
A moagem em moinho de bolas levou ao aumento da liberação de
açúcares nas condições testadas, unindo o efeito de redução da cristalinidade com a
redução do tamanho da partícula. Surpreendentemente, a ação do moinho
diretamente à biomassa in natura levou a uma conversão de celulose em glicose em
cerca de 100%, o que pode ser um caminho para a obtenção de etanol celulósico
apenas com esse tratamento mecânico. No entanto, em escala industrial, esse não é
um processo amplamente estudado, sendo necessários estudos quanto a gasto
energético e escalonamento dos moinhos para a aplicação em biorrefinarias. Além
disso, é necessário avaliar as alterações causadas pela moagem e pela hidrólise
enzimática na recuperação dos demais componentes, para que sejam utilizados de
modo integrado.
Os efeitos observados na liberação de açúcares e na recuperação dos
demais componentes possuem uma forte relação com a composição química e a
estrutura dos substratos utilizados. A combinação das análises química e
115
morfológica possibilitou a explicação dos efeitos dos tratamentos químicos e físicos
na remoção dos componentes, relacionados com remoção de hemicelulose e
lignina, e a consequente exposição das fibras de celulose, maior área superficial
para a ação enzimática e maior porosidade.
Além disso, embora a aplicação deste trabalho tenha sido utilizar a
celulose para a conversão em etanol, os tratamentos utilizados permitem que os
substratos tratados sejam utilizados para a produção de nanomateriais, derivados
celulósicos, além da conversão da celulose em insumos químicos, como é o caso do
hidroximetilfurfural (HMF).
Os resultados obtidos nesta dissertação são, portanto, motivadores, uma
vez que poucos trabalhos da literatura utilizam essa abordagem integrada. Além
disso, apresenta o capim elefante como uma possibilidade como substrato para
biorrefinarias, o que diversifica as possíveis fontes, além do fato das vantagens do
capim elefante quanto a produtividade e facilidade de crescimento.
Como sugestões para trabalhos futuros, pode ser desenvolvida uma
análise tecno-econômica para avaliar a viabilidade dos cenários e utilizar esses
cenários como base para recuperar os subprodutos e destiná-los para as outras
aplicações.
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128
7. APÊNDICES
Tabela A 1. Percentual mássico de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas considerando o
rendimento após os tratamentos.
Amostra % restante após as extrações
Celulose Hemicelulose Lignina Cinzas
Folhas
In natura 100 100 100 100
LAC 88,4 ± 1,5 14,0 ± 0,1 63,3 ± 0,4 60,3 ± 0,1
LAB20 73,4 ± 1,6 7,6 ± 0,1 18,7 ± 0,1 15,8 ± 0,1
LAB100 77,4 ± 0,7 4,6 ± 0,1 15,4 ± 0,1 6,9 ± 0,1
LB20 101,2 ± 0,8 55,9 ± 0,4 50,7 ± 0,3 58,6 ± 0,1
LB100 96,9 ± 0,7 42,1 ± 0,1 33,3 ± 0,2 51,2 ± 0,1
LWEB20 99,6 ± 0,2 45,4 ± 0,1 30,2 ± 0,1 35,0 ± 0,1
LWEB100 98,0 ± 6,2 37,4 ± 0,6 27,4 ± 0,6 35,8 ± 0,1
Colmos
In natura 100 100 100 100
SAC 92,0 ± 0,4 21,8 ± 0,1 80,9 ± 1,7 24,8 ± 0,1
SAB20 85,7 ± 2,0 12,0 ± 0,1 40,2 ± 0,2 18,7 ± 0,1
SAB100 85,1 ± 1,0 6,9 ± 0,1 31,2 ± 0,1 13,0 ± 0,1
SB20 98,9 ± 3,0 70,0 ± 0,5 45,2 ± 0,6 57,6 ± 0,1
SB100 95,3 ± 1,2 53,9 ± 0,1 41,9 ± 0,1 40,4 ± 0,1
SWEB20 104,5 ± 1,1 63,5 ± 0,1 29,1 ± 0,2 8,4 ± 0,1
SWEB100 101,3 ± 3,6 53,1 ± 0,3 30,7 ± 0,7 23,0 ± 0,1
129
Tabela A 2. Quantidade açúcar liberado após a hidrólise enzimática por grama de biomassa
e percentual de conversão de celulose em glicose.
Amostra
mg de açúcar / g de biomassa Conversão
de celulose
em glicose
(%) Glicose Xilose Arabinose Total
Folhas
In natura 93,0 ± 0,7 26,3 ± 2,3 5,1 ± 1,2 124,4 ± 23,9 27,8 ± 0,7
LINM 332,8 ± 9,9 110,4 ± 1,4 11,0 ± 0,5 454,2 ± 25,8 99,5 ± 3,7
LAC 615,0 ± 22,9 60,7 ± 1,7 - 675,7 ± 23,1 102,1 ± 4,7
LAB20 748,4 ± 27,8 60,8 ± 1,6 - 809,2 ± 29,3 91,8 ± 3,4
LAB20M 822,4 ± 32,9 72,4 ± 1,5 - 894,8 ± 34,2 100,8 ± 4,1
LAB100 800,1 ± 0,6 28,8 ± 0,2 - 828,9 ± 12,4 86,9 ± 2,4
LAB100M 690,5 ± 10,1 34,2 ± 0,2 - 724,7 ± 16,0 75,0 ± 2,3
LB20 557,5 ± 9,8 168,7 ± 7,2 33,8 ± 2,6 760,0 ± 21,0 91,7 ± 3,0
LB20M 615,2 ± 11,2 199,4 ± 1,7 32,4 ± 1,0 847,0 ± 20,4 101,2 ± 3,3
LB100 687,5 ± 14,7 152,9 ± 0,6 22,2 ± 3,0 862,6 ± 16,5 98,2 ± 3,2
LB100M 703,3 ± 3,1 157,3 ± 4,0 20,4 ± 1,1 881,0 ± 8,5 100,5 ± 2,6
LWEB20 642,5 ± 16,4 156,2 ± 8,2 33,9 ± 1,5 832,6 ± 18,6 104,0 ± 2,7
LWEB100 591,8 ± 31,2 121,0 ± 3,5 19,9 ± 2,3 732,7 ± 36,9 83,8 ± 8,4
Colmos
In natura 167,3 ± 1,3 33,1 ± 15,5 5,2 ± 0,8 205,6 ± 17,5 39,0 ± 0,6
SINM 438,2 ± 24,7 167,8 ± 2,0 9,9 ± 2,1 615,9 ± 26,1 102,2 ± 5,9
SAC 298,6 ± 5,8 34,9 ± 2,6 - 333,5 ± 6,7 46,2 ± 0,9
SAB20 527,1 ± 0,3 31,4 ± 0,4 - 558,5 ± 23,7 66,0 ± 1,9
SAB20M 634,3 ± 12,4 55,5 ± 1,7 - 689,8 ± 26,8 79,4 ± 2,8
SAB100 664,8 ± 16,0 21,5 ± 0,7 - 686,3 ± 28,6 75,7 ± 2,7
SAB100M 814,4 ± 2,3 38,5 ± 2,0 - 852,9 ± 23,9 92,8 ± 2,5
SB20 467,8 ± 19,3 162,2 ± 7,9 14,5 ± 0,4 644,5 ± 21,0 72,6 ± 3,0
SB20M 609,0 ± 34,5 221,0 ± 14,8 19,2 ± 4,4 849,2 ± 37,9 94,5 ± 5,4
SB100 646,4 ± 35,1 177,1 ± 5,4 16,3 ± 0,8 839,8 ± 35,5 92,8 ± 5,0
SB100M 657,3 ± 41,4 192,3 ± 14,5 17,6 ± 0,4 867,2 ± 43,9 94,4 ± 5,9
SWEB20 647,2 ± 32,1 199,6 ± 8,8 20,7 ± 2,9 867,5 ± 33,4 96,6 ± 5,1
SWEB100 657,5 ± 38,5 179,1 ± 13,0 18,9 ± 0,3 855,5 ± 40,7 92,6 ± 5,7
130
Tabela A 3. Quantidade de açúcares obtidos a partir de 1 ton. de biomassa considerando
rendimentos
Amostra Massa de açúcar (kg) a partir de 1 ton. de biomassa
Glicose Xilose Arabinose Total
Folhas
In natura 93,0 ± 0,7 26,3 ± 2,3 5,1 ± 1,2 124,4 ± 2,7
LINM 332,8 ± 9,9 110,4 ± 1,4 11,0 ± 0,5 454,2 ± 10,0
LAC 302,0 ± 21,1 29,8 ± 1,9 - 331,8 ± 21,2
LAB20 225,3 ± 23,3 18,3 ± 1,8 - 243,6 ± 23,3
LAB20M 247,5 ± 25,8 21,8 ± 2,1 - 263,3 ± 25,9
LAB100 224,8 ± 5,6 8,1 ± 0,2 - 232,9 ± 5,6
LAB100M 194,0 ± 5,6 9,6 ± 0,2 - 203,6 ± 5,6
LB20 310,5 ± 5,5 94,0 ± 4,0 18,8 ± 1,4 423,3 ± 7,0
LB20M 342,7 ± 6,3 111,1 ± 1,0 18,0 ± 0,6 471,8 ± 6,4
LB100 318,3 ± 6,8 70,8 ± 0,3 10,3 ± 1,4 399,4 ± 7,0
LB100M 325,6 ± 1,6 72,8 ± 1,9 9,4 ± 0,5 407,9 ± 2,5
LWEB20 346,3 ± 9,0 84,2 ± 4,4 18,3 ± 0,8 448,8 ± 10,1
LWEB100 274,6 ± 55,8 56,1 ± 11,1 9,2 ± 2,1 340,0 ± 56,9
Colmos
In natura 167,3 ± 1,3 33,1 ± 15,5 5,2 ± 0,8 205,6 ± 15,6
SINM 438,2 ± 24,7 167,8 ± 2,0 9,9 ± 2,1 615,9 ± 24,9
SAC 182,1 ± 4,0 21,3 ± 1,6 - 203,4 ± 4,3
SAB20 242,5 ± 11,6 14,4 ± 0,7 - 256,9 ± 11,6
SAB20M 291,8 ± 15,1 25,5 ± 1,4 - 317,3 ± 15,1
SAB100 276,6 ± 7,2 8,9 ± 0,3 - 285,5 ± 7,2
SAB100M 338,8 ± 3,4 16,0 ± 0,8 - 354,8 ± 3,5
SB20 307,8 ± 23,0 106,7 ± 8,4 9,5 ± 0,7 424,1 ± 24,5
SB20M 400,7 ± 33,7 145,4 ± 13,3 12,6 ± 3,0 558,8 ± 364
SB100 379,4 ± 23,1 104,0 ± 4,3 9,6 ± 0,5 493,0 ± 23,0
SB100M 385,8 ± 26,5 112,9 ±9,1 10,3 ± 0,4 509,0 ± 28,0
SWEB20 433,0 ± 21,8 135,5 ± 5,8 13,8 ± 1,9 580,4 ± 22,7
SWEB100 402,4 ± 36,3 109,6 ± 10,9 11,6 ± 0,8 523,6 ± 37,9