universidade estadual de campinas instituto de...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

FÁBIO NEVES DOS SANTOS

PERFIS MOLECULARES DE PATÓGENOS DO CACAU E METABOLÔMICA

DE SUAS INTERAÇÕES COM GENÓTIPOS RESISTENTES E SUSCETÍVEIS

POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS

CAMPINAS

2017

FÁBIO NEVES DOS SANTOS

PERFIS MOLECULARES DE PATÓGENOS DO CACAU E METABOLÔMICA

DE SUAS INTERAÇÕES COM GENÓTIPOS RESISTENTES E SUSCETÍVEIS

POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Tese de Doutorado apresentada ao

Instituto de Química da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção

do título de Doutor em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin

Co-orientadora: Profa. Dra. Edna Dora Martins Newman Luz

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE

DEFENDIDA PELO ALUNO FÁBIO NEVES DOS SANTOS, E ORIENTADA

PELO PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN

CAMPINAS

2017

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CNPq, 140743/2013-8 ORCID: http://orcid.org/0000-0001-7963-9306

Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de Química Danielle Dantas de Sousa - CRB 8/6490

Santos, Fábio Neves dos, 1986- Sa59p SanPerfis moleculares de patógenos do cacau e metabolômica de

suas interações com genótipos resistentes e suscetíveis por

espectrometria de massas / Fábio Neves dos Santos. – Campinas,

SP : [s.n.], 2017.

SanOrientador: Marcos Nogueira Eberlin.

SanCoorientadora: Edna Dora Martins Newman Luz. SanTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas,

Instituto de Química.

San1. Cacau. 2. Theobroma cacao L. 3. Patógenos. 4.

Moniliophthora perniciosa. 5. Ceratocystis cacaofunesta. 6.

Espectrometria de massas. 7. Metabolômica. I. Eberlin, Marcos

Nogueira. II. Luz, Edna Dora Martins Newman. III. Universidade

Estadual de Campinas. Instituto de Química. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Molecular profiles of cacao pathogens and

metabolomics of their interactions with resistant and susceptible genotypes by

mass spectrometry Palavras-chave em inglês: Cacao Theobroma cacao L Pathogen Moniliophthora perniciosa Ceratocystis cacaofunesta Mass spectrometry Metabolomics Área de concentração: Química Analítica Titulação: Doutor em Ciências Banca examinadora: Marcos Nogueira Eberlin [Orientador] José Luiz Bezerra Rodinei Augusti Fabio Cesar Gozzo Ana Valéria Colnaghi Simionato Cantú Data de defesa: 05-07-2017 Programa de Pós-Graduação: Química

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin (Orientador)

Profa. Dra. Ana Valéria Colnaghi Simionato (IQ-UNICAMP)

Prof. Dr. Fabio Cesar Gozzo (IQ-UNICAMP)

José Luis Bezerra (UFRB)

Rodinei Augusti (UFMG)

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no

processo de vida acadêmica do aluno.

Este exemplar corresponde à redação final da

Tese de Doutorado defendida pelo aluno

FÁBIO NEVES DOS SANTOS, aprovada pela

Comissão Julgadora em 05 de julho de 2017.

AGRADECIMENTOS

Parafraseando o bom baiano Raul Seixas: "Sonho que se sonha só, é só

um sonho que se sonha só, mas sonho que se sonha junto é realidade".

Portanto, um desafio tão grande quanto escrever essa tese foi resumir em

apenas duas páginas os agradecimentos às pessoas que estiveram comigo

uma vida inteira e durante minha trajetória de 12 anos em atividades científicas.

Agradeço primeiramente à Deus, pela vida, saúde, os dons,

determinação, perseverança, a capacidade de sonhar, e a oportunidade de

realizar os sonhos.

Aos meus pais, Domingos Pereira dos Santos e Virginia Neves, pelo

exemplo, a educação, o amor, a dedicação, o incentivo e a confiança em todos

os momentos da minha vida.

Ao prof. Marcos Nogueira Eberlin pelas grandes oportunidades, os

ensinamentos, a confiança, a interdependência, a motivação e a orientação

estimuladora da criatividade e inovação científica.

À Dilze Argôlo por acreditar nesse projeto desde o início e por viabilizar

os experimentos na CEPLAC, mas também pelos ensinamentos e amizade.

À Edna Dora pela co-orientação de doutorado e por viabilizar os

experimentos na CEPLAC, mas também pelos ensinamentos e amizade.

À Guilherme Moura, da Cacau Costanegro, pelo incentivo à inovação no

projeto do cacau e pelas oportunidades de desenvolvimento profissional.

À Luciana Melo pelo amor e companheirismo, à tia Teresa, tio João

Carlos e Fábio Leandro pelo carinho, atenção, motivação e a confiança na

realização dos meus sonhos.

Aos professores Pedro Afonso (em especial pela orientação de iniciação

científica e mestrado), Jailson Andrade e Márcia Veloso por acreditarem no

meu potencial e me motivar para a carreira acadêmica e científica.

Ao grande amigo Paulo Mesquita pela parceria científica bastante

profícua desde a graduação na UFBA, mas principalmente pela amizade e

ajuda em todos os momentos.

Aos amigos Adalberto Menezes Filho (em especial pela orientação da

iniciação científica) e Frederico Medeiros pela amizade, a confiança, os

ensinamentos e a motivação para seguir na carreira acadêmica.

Aos professores Fabio Gozzo, Ana Valéria, Rodinei Augusti e José Luís

Bezerra por fazerem parte da banca examinadora, o incentivo e exemplo

inspirador de excelentes professores e pesquisadores.

Às professoras Claudia Rezende, Isabel Jardim e Solange Cadore por

fazerem parte da banca como suplentes, os exemplos de excelentes

professoras e pesquisadoras.

Aos professores do instituto de química da Unicamp pelos ensinamentos

e contribuição acadêmica e científica na minha formação.

Ao coordenador e aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em

Química da Unicamp pela atenção e apoio em toda a minha jornada como

estudante de doutorado, mas principalmente durante a minha gestão como

presidente da Associação de Pós-Graduação em Química - APGQ.

Aos amigos e colegas do laboratório ThoMSon pelas discussões

científicas, as parcerias e colaborações, a convivência e a amizade. Em

especial, ao Jandyson Santos, Sebastian Teunissen, Daniele Rocha, Almas

awan, Soraya El Khatib, Adriana Godoi, Nicolas Schwab, Roberta Belaz,

Marcos Pudenzi, Mirela, Ligia, Ildenize Cunha, Gustavo Duarte, Damila

Moraes, Fernanda Negrão, Ingrid, José, Pedro Vendramini, Ana Fernandes,

Núbia Miranda e Dona Cida;

À Alessandra Tata por acreditar nesse projeto desde o início e a

colaboração científica na realização do mesmo e Paula Galeano pela parceria

e colaboração nos projetos de empreendedorismo do cacau;

Às professora da UnB Kelly Magalhães e Aline Martins pelo apoio,

colaboração incentivo e motivação, sobretudo na fase final do doutorado.

Ao programa “sistema de cotas das universidades brasileiras”, e ao seu

maior defensor ex-ministro Joaquim Barbosa, que me possibilitou entrar na

UFBA e ter a oportunidade de formação acadêmica, científica e profissional de

excelência. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) pelo suporte científico e financeiro através da bolsa de

doutorado (processo CNPq, 140743/2013-8).

RESUMO

Esse trabalho mostra resultados inovadores e de grande aplicabilidade para

melhorar as ações de inspeção sanitária das lavouras cacaueiras através da

identificação rápida e correta das espécies de fitopatógenos. E revela os

principais metabólitos produzidos por clones resistentes e suscetíveis às

doenças do cacau, vassoura de bruxa e murcha de Ceratocystis, visando

contribuir para o manejo, controle químico e/ou biológico. Os fitopatógenos do

cacau, Moniliophthora perniciosa, Phytophthora palmivora, P. capsici, P.

citrophthora, P. heveae, Ceratocystis cacaofunesta, C. fimbriata e C. paradoxa

foram diferenciados pela técnica MALDI-TOF/MS. Os isolados dos

fitopatógenos coletados em diferentes microregiões produtoras de cacau da

Bahia, diferentes hospedeiros e tecidos vegetais como folhas, caules, frutos e

rizosferas também foram diferenciados. A técnica de espectrometria de massas

acoplada com a cromatografia líquida de alta eficiência foi também aplicada

para avaliar clones suscetíveis e resistentes à vassoura de bruxa e murcha de

Ceratocystis. A análise metabolômica dos clones Catongo e Scavina-6,

respectivamente suscetível e resistente ao Moniliophthora perniciosa,

possibilitou a identificação dos principais metabólitos da infecção fúngica.

Baseado nos metabólitos e análise multivariada foram diferenciadas as

principais fases da infecção pelo Moniliophthora perniciosa. As fases de

infecção foram também discriminadas pelos metabólitos e suas intensidades

relativas, no decorrer do tempo da infecção. A análise metabolômica dos

clones CCN-51, TSH-1188, JACA, SJ02 e CEPEC-2002 infectados pelo

Ceratocystis cacaofunesta possibilitou classificar corretamente os níveis de

resistência e suscetibilidade com maior exatidão do que os testes agronômicos

e fitopatológicos. Baseado na análise dos metabólitos e análise multivariada de

PLS-DA os clones TSH-1188 e JACA podem ser considerados resistentes, o

clone CCN-51 moderadamente resistente, e os clones SJ02 e CEPEC-2002

altamente suscetíveis. Os principais metabólitos que discriminam os clones

mais suscetíveis dos clones mais resistentes foram sesquiterpenos,

flavonoides, ácidos orgânicos, ésteres, compostos fenólicos, oxilipinas,

alcaloides, fenilpropanóides, triterpenos, lipídios e naftoquinonas.

ABSTRACT

This work shows innovative and highly applicable results to improve the sanitary

inspections of cacao plantations through the rapid and correct identification of

phytopathogen species. It also reveals the main metabolites produced by

resistant and susceptible cacao clones for Witches´ Broom and Ceratocystis wilt

diseases. The aforementioned process aims to contribute to the chemical

and/or biological management and control of the pathogen infestation. The

phytopathogens, Moniliophthora perniciosa, Phytophthora palmivora, P. capsici,

P. citrophthora, P. heveae, Ceratocystis cacaofunesta, C. fimbriata e C.

paradoxa were differentiated by the MALDI-TOF/MS analysis. The strains of the

phytopathogens were collected in different cacao farms from Bahia, from

different hosts and plant tissues such as leaves, stems, fruits and rhizospheres

which were differentiated as well. In addition, the mass spectrometry coupled to

high performance liquid chromatography was applied to evaluate susceptible

and resistant clones for Witches´ Broom and Ceratocystis wilt diseases. The

metabolomic analysis of Catongo and Scavina-6 clones, respectively resistant

and susceptible to Moniliophthora perniciosa, made it possible to identify the

main metabolites of the fungal infection. Based on metabolites and multivariate

analysis, the main infection phases of Moniliophthora perniciosa for cacao

plants were discriminated by the metabolites and their relative intensities during

the time of infection. The metabolomic analysis of the CCN-51, TSH-1188,

JACA, SJ02 and CEPEC-2002 clones infected by Ceratocystis cacaofunesta

allowed classifying accurately levels of resistance and susceptibility with better

precision than agronomic and phytopathological tests. Based on the analysis of

the metabolites and multivariate analysis of PLS-DA the TSH-1188 and JACA

clones can be considered resistant, the clone CCN-51 moderately resistant, and

the clones SJ02 and CEPEC-2002 highly susceptible. The major metabolites

that discriminate the most susceptible clones of the most resistant clones were

sesquiterpenes, flavonoids, organic acids, esters, phenolic compounds,

oxylipins, alkaloids, phenylpropanoids, triterpenoids, lipids and

naphthoquinones.

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 Principais doenças do cacaueiro, vassoura de bruxa nos galhos (A) e nos frutos (B), monilíase-do-cacaueiro em frutos de cacau (C), podridão-parda em fruto de cacau (D), murcha de Ceratocystis nas folhas (E) e no tronco do cacaueiro (F).

21

Figura 2 Esquema característico de um espectrômetro de massas contendo as principais partes, fonte de ionização, analisador de m/z e sistema de detecção.

25

Figura 3 Esquema característico de uma fonte de ionização por Electrospray (ESI).

26

Figura 4 Esquema característico de um espectrômetro de massas com fonte de MALDI e analisador TOF para analises de biomoléculas.

27

Figura 5 Esquema do fluxo de informação genética que ocorre na célula dos organismos.

30

Figura 6 Rotas metabólicas do ácido chiquímico e do ácido mevalônico de produção de metabólitos secundários das plantas.

32

Figura 7 Modificações moleculares e fisiológicas gerais que podem ocorrer durante uma interação planta-patógeno.

32

Figura 8 Comparação dos métodos de extração de peptídeos/proteínas de Ceratocystis cacaofunesta analisados com matriz CHCA.

47

Figura 9 Comparação de matrizes MALDI para análise de peptídeos/proteínas de Ceratocystis cacaofunesta extraído com o método B.

47

Figura 10 Perfis de peptídeos/proteínas característicos dos isolados de Moniliophthora perniciosa, Ceratocystis cacaofunesta e Phytophthora palmivora.

48

Figura 11 Perfis de peptídeos/proteínas característicos dos isolados do gênero Phytophthora, P. capsici, P. citrophthora, P. palmivora, P. heveae.

49

Figura 12 Perfis de MALDI-MS de peptídeos/proteínas de Phytophthora palmivora obtidos de Theobroma cacao (isolados 1629, 1662) e Carica papaya (isolados 250, 262).

50

Figura 13 Perfis de MALDI-MS de peptídeos/proteínas de Phytophthora capsici coletados de seringueira (isolados 1454; 1597) e cacau (isolado 1442).

50

Figura 14 Perfis de MALDI-MS de peptídeos/proteínas de Phytophthora heveae coletados de folhas (isolado 989) e rizosfera de Seringueira (isolados 1170; 1144).

51

Figura 15 Perfis de MALDI-MS de peptídeos/proteínas de Phytophthora citrophthora coletados de frutos de diferentes clones de cacau cultivados em diferentes localidades.

51

Figura 16

Comparação dos perfis de peptídeos/proteínas dos isolados de M. perniciosa obtidos de ramo e fruto.

52

Figura 17

Comparação de diferentes perfis de peptídeos/proteínas obtidos por MALDI-MS. C. paradoxa coletado de Cocos nucifera (A e B), C. fimbriata coletado de Eucalyptus spp. (C e D) and Hevea brasiliensis (E e F), C. cacaofunesta coletado de T. cacao (G e H).

53

Figura 18

Dendograma dos perfis de peptídeos/proteínas das espécies de fitopatógenos do cacau. MP = M. perniciosa, F = fruto, S = caule; CC = C. cacaofunesta, CP = C. paradoxa, CF = C. fimbriata; PCA = P. capsici, PC = P. citrophthora, PH = P. heveae, PP = P. palmivora.

54

Figura 19

Perfis de lipídios característicos dos isolados de Moniliophthora perniciosa, Ceratocystis cacaofunesta e Phytophthora palmivora.

55

Figura 20

Perfis de lipídios característicos dos isolados do gênero Phytophthora, P. capsici, P. citrophthora, P. palmivora, P. heveae.

56

Figura 21 Perfis de MALDI-MS de lipídios de Phytophthora palmivora obtidos de Theobroma cacao (isolados 1629, 1662) e Carica papaya (isolados 250, 261).

57

Figura 22

Comparação dos perfis de lipídios dos isolados de M. perniciosa obtidos de caule e fruto.

58

Figura 23

Comparação de diferentes perfis de lipídicos obtidos por MALDI-MS. C. paradoxa coletado de Cocos nucifera (isolado 97), C. fimbriata coletado de Eucalyptus spp. (isolados 145 e 195) e C. cacaofunesta coletado de T. cacao (isolados 20, 91 e 138).

59

Figura 24

Dendograma dos perfis de lipídios das espécies de fitopatógenos do cacau. MP = M. perniciosa, F = fruto, S = caule; CC = C. cacaofunesta, CP = C. paradoxa, CF = C. fimbriata; PCA = P. capsici, PC = P. citrophthora, PH = P. heveae, PP = P. palmivora.

60

Figura 25

Mudas de cacau (Catongo e Scavina-6) na casa de vegetação (A) e na camara fria 24 h antes da inoculação (B e C).

64

Figura 26 Inoculação de basidiósporos de M. perniciosa (A) e sintomas em cacau após 30 dias (B).

64

Figura 27

Delineamento do experimento biológico da inoculação de basidiósporos de M. perniciosa em clones de cacau Catongo e Scavina-6.

65

Figura 28

Fluxograma de preparo de amostra do caule de cacau infectados com M. perniciosa para análise metabolômica por LC-MS.

66

Figura 29

Cromatogramas LC-MS das amostras de caule dos clones Catongo e Scavina-6 controle e inoculado, alinhados no XCMS (A) e íons extraídos dos espectros com significância estatística pela ANOVA (p<0.01) (B).

68

Figura 30

Gráfico de escores PLS-DA dos clones de cacau Catongo e Scavina-6 controle e inoculados (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras de acordo com scores de VIP (B).

69

Figura 31

Gráfico de escores PLS-DA do clone de cacau Scavina-6 inoculado (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras da fase 1 no gráfico de pesos (loadings, B).

70

Figura 32

Gráfico de escores PLS-DA do clone de cacau Scavina-6 inoculado (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras da fase 2 no gráfico de pesos (loadings, B).

70

Figura 33

Gráfico de escores PLS-DA do clone de cacau Catongo inoculado (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras da fase 1 no gráfico de pesos (loadgins, B).

71

Figura 34

Gráfico de escores PLS-DA do clone de cacau Catongo inoculado (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras das fase 2 e 3 no gráfico de pesos (loadgins, B).

71

Figura 35 Delineamento do experimento biológico da inoculação de Ceratocystis cacaofunesta em clones de cacau JACA, SJ02, CCN-51, TSH-1188 e CEPEC2002.

76

Figura 36 Cromatogramas LC-MS das amostras de caule dos clones CCN-51, TSH-1188, JACA, SJ02 e CEPEC-2002 inoculados, alinhados no XCMS (A) e íons extraídos dos espectros com significância estatística pela ANOVA (p<0.01).

78

Figura 37

Gráfico de escores O-PLS-DA dos clones de cacau CCN-51, TSH-1188, JACA, CEPEC-2002 e SJ02 inoculados (A) e gráfico de loadings dos principais íons que discriminam os grupos resistente e suscetível.

79

Figura 38 Gráfico de escores PLS-DA dos clones de cacau CCN-51, TSH-1188 e JACA inoculados (A) e gráfico de loadings dos principais íons que discriminam o clone mais resistente TSH-1188 dos clones CCN-51 e JACA.

80

LISTA DE TABELAS

Página Tabela 1 Figuras de mérito, vantagens e desvantagens

associadas às técnicas analíticas empregadas em metabolômica.

36

Tabela 2 Origem dos isolados dos fitopatógenos por patógeno, hospedeiro, órgão vegetal e local de obtenção.

43

Tabela 3 Metabólitos anotados nas amostras dos clones Scavina-6 e Catongo infectados com M. perniciosa.

72

Tabela 4 Metabólitos anotados nos clones CCN-51, JACA e TSH1188 (resistentes) infectados por C. cacaofunesta.

81

Tabela 5 Metabólitos anotados nos clones Cepec2002 e SJ02 (suscetíveis) infectados por C. cacaofunesta.

82

LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviatura Descrição em Inglês Descrição em Português

ACN

Acetonitrile

Acetonitrila

AF

Formic acid

Ácido fórmico

APCI

Atmospheric Pressure Chemical Ionization

Ionização química à pressão atmosférica

APPI

Atmospheric Pressure Photoionization

Fotoionização à pressão atmosférica

CE-MS

Capillary electrophoresis coupled to Mass

Spectrometry

Eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massa

CEPEC

----

Centro de Pesquisas do Cacau

CEPLAC

----

Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira

CN

----

Amostras controle

DNA

Deoxyribonucleic Acid

Ácido desoxirribonucleico

ESI

Electrospray ionization

----

ESI-MS

Electrospray ionization mass spectrometry

----

GC-MS

Gas Chromatography coupled to Mass

Spectrometry

Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

GC×GC-MS

Two-dimensional Gas Chromatography coupled to

Mass Spectrometry

Cromatografia gasosa bidimensional acoplada à espectrometria de massas

HCA

Hierarchical cluster analysis

Análise de agrupamentos hierárquicos

HILIC

hydrophilic interaction liquid chromatography

Cromatografia por interações hidrofílicas

IEM

Ion Evaporation Model

----

INOC

----

Amostras inoculadas

IPA

Isopropyl alcohol

Isopropanol

LC-MS

Liquid Chromatography coupled to Mass

Spectrometry

Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas

LIF

Laser induced fluorescence

Fluorescência induzida por laser

MALDI-TOF

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

Fonte de ionização e dessorção a laser assistida por matriz

MALDI-TOF/MS

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

coupled Mass Spectrometry

Ionização e dessorção a laser assistida por matriz com

analisador por tempo de vôo

MAPA

----

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento do

Brasil

MeOH

Methanol

Metanol

m/z

Mass/charge ratio

Razão massa/carga

MS

Mass spectrometry

Espectrometria de massas

MSn

Tandem Mass Spectrometry

Espectrometria de Massa sequencial

OPLS-DA

Orthogonal partial least squares–discriminant

analysis

----

PCA

Principal component analysis

Análise de componentes principais

PCR

Polymerase chain reaction

Reação em cadeia da polimerase

PLS- DA

Partial squares–discriminant analysis

Mínimos quadrados parciais

Q-TOF

Quadrupole-time of flight

Analisador quadrupolo com tempo de vôo

RMN

Nuclear Magnetic Resonance

Ressonância Magnética Nuclear

RNA

Ribonucleic acid

Ácido ribonucleico

UPLC

Ultra Performance Liquid Chromatography

Cromatografia líquida de ultra alta-eficiência

TFA

Trifluoroacetic acid

Ácido trifluoroácetico

TOF Time of flight Analisador por tempo de vôo

SUMÁRIO

Página

1- Introdução 19

1.1- As doenças do cacau causadas por fitopatógenos 19

1.2- Estratégias de manejo e controle de fitopatógenos do

cacau

21

1.3- Métodos de detecção e identificação de fitopatógenos 22

1.4 - Os princípios da Espectrometria de massas 23

1.4.1- Fontes de Ionização 25

1.4.1.1- Ionização por ESI 25

1.4.1.2- Ionização por MALDI 26

1.5- Identificação de microrganismos por MALDI-TOF MS 27

1.6- Metabolômica: fundamentos e conceitos 29

1.7 – Metabolômica da interação planta-patógeno 30

1.8 – Metabôlomica da interação cacau-fitopatógenos 35

1.9 – Técnicas analíticas empregadas em metabolômica 36

CAPÍTULO I

Diferenciação das principais espécies de fitopatógenos do cacau por

MALDI-TOF/MS

I.1- Objetivos 42

I.1.1- Objetivo geral 42

I.1.2- Objetivos específicos 42

I.2- Parte Experimental 42

I.2.1- Amostras: os isolados de fitopatógenos 42

I.2.2- Extração de peptídeos/proteínas para análise por

MALDI-TOF/MS

44

I.2.3- Extração de lipídios para análise por MALDI-TOF/MS 45

I.3- Resultados e Discussão 46

I.3.1- Análise dos perfis de peptídeos/proteínas de

fitopatógenos por MALDI-TOF/MS

46

I.3.2- Análise dos perfis de lipídicos de fitopatógenos por

MALDI-TOF/MS

55

I.4- Conclusão do capitulo I 61

CAPÍTULO II

Metabolômica de clones resistentes e suscetíveis do cacaueiro

infectados por Moniliophthora perniciosa (vassoura de bruxa)

II.1- Objetivos

II.1.1- Objetivo geral 63

II.1.2- Objetivos específicos 63

II.2- Parte Experimental 63

II.2.1- Ensaio biológico da vassoura de bruxa para avaliação

da infecção ao longo do tempo

63

II.2.2- Análise dos metabólitos da interação M. perniciosa x

T. cacao por LC-MS

66

II.2.3- Análise estatística multivariada dos dados 67

II.3- Resultados e Discussão 67

II.4- Conclusões 73

CAPÍTULO III

Metabolômica de clones resistentes e suscetíveis do cacaueiro

infectados por Ceratocystis cacaofunesta (murcha de Ceratocystis)

III.1- Objetivos 75

III.1.1- Objetivo geral 75

III.1.2- Objetivos específicos 75

III.2- Parte Experimental 75

III.2.1- Ensaio biológico da murcha de Ceratocystis para

avaliação da resistência/suscetibilidade de clones de

cacau

75

III.2.2- Análise dos metabólitos da interação C. cacaofunesta

x T. cacao por LC-MS.

76

III.2.3- Análise estatística multivariada dos dados 77

III.3- Resultados e Discussão 77

III.4- Conclusões 84

Conclusões gerais 85

Perspectivas 88

Referências bibliográficas 90

19

1 - Introdução

1.1 – As doenças do cacau causadas por fitopatógenos

O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma planta nativa da bacia amazônica

sendo originário das Américas (Teixeira et al., 2015; Motamayor et al., 2002). Na

América do Sul, principalmente no Brasil, Peru, Colômbia, Bolívia, Equador e

Venezuela existem grandes áreas de cultivo do cacau que geram emprego e renda,

como também contribuem para preservação ambiental de biomas como a mata

atlântica e a floresta amazônica (Thomas et al., 2012). O Brasil e o Equador são o 5º

e 6º maiores produtores mundiais de cacau, respectivamente, e mesmo o Paraguai,

Uruguai, Argentina e Chile que não possuem cultivos de cacau, são grandes

consumidores de chocolate (Teixeira et al., 2015). Portanto, a cultura do cacau é de

grande relevância econômica, social e ambiental para a América do Sul e outros

continentes onde o cultivo ocorre em áreas de floresta.

As condições climáticas dos países da região tropical são as ideais para o

cultivo do cacau, no entanto, também muito favoráveis à incidência de pragas que

atacam o cacau e causam elevadas perdas econômicas (Ploetz, 2007). Os

fitopatógenos representam um grande risco fitossanitário para os cultivos de cacau

dos países da América do Sul, pois devido à proximidade das fronteiras e o intenso

trânsito de pessoas e material vegetal, os fitopatógenos podem ser introduzidos e

disseminar-se rapidamente através de grandes áreas, comprometendo a cultura do

cacau no continente (Ploetz, 2007; Evans et al., 2013). As pragas podem ser

introduzidas em áreas muito distantes da sua origem devido ao aumento continuado

do fluxo de pessoas e mercadorias circulando pelas fronteiras (Thomas et al., 2012).

Um exemplo é a praga da vassoura de bruxa, presente na região amazônica, mas

ausente na Bahia até 1989, que foi introduzida na região Sul da Bahia e devastou as

lavouras de cacau da região causando grandes perdas econômicas, sociais e

ambientais decorrentes do abandono de propriedades (Evans, 2007; Evans et al.,

2013). Atualmente, as lavouras de cacau do Brasil têm uma ameaça semelhante que

é a monilíase-do-cacaueiro (causada pelo Moniliophthora roreri), mais destrutiva que

a vassoura de bruxa, porque todos os genótipos de cacau do Brasil podem ser

suscetíveis (Alvarez et al., 2014; Moraes et al., 2012). A monilíase ainda não foi

detectada no Brasil, sendo uma praga quarentenária A1, porém encontra-se

20

presente na maioria dos países da América do Sul, como Peru, Bolívia e Colômbia

onde causa grandes prejuízos econômicos (Moraes et al., 2012). Considerando o

alto risco de disseminação da monilíase no Brasil, o Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento do Brasil (MAPA) iniciou o “Plano Nacional de

Contingência da Monilíase do Cacaueiro” visando, principalmente, o monitoramento

das lavouras de cacau nas regiões de fronteira, a fiscalização do trânsito de material

vegetal em portos e aeroportos, a formação de equipes de emergência fitossanitária,

a educação sanitária e o apoio à pesquisa científica. Os principais fitopatógenos que

causam grandes perdas econômicas nas lavouras cacaueiras dos países da

América do Sul são Moniliophthora perniciosa (vassoura de bruxa) (Evans et al.,

2013; Meinhardt et al., 2008), Moniliophthora roreri (monilíase-do-cacaueiro) (Ploetz,

2007; Ortíz-García et al., 2015; Bailey et al., 2014), complexo Phytophthora

(podridão-parda) (Guest, 2007; Acebo-Guerrero et al., 2012) e o Ceratocystis

cacaofunesta (murcha de Ceratocystis) (Engelbrecht et al., 2007; Beer et al., 2014).

A vassoura de bruxa é causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa (Stahel

& Singer) que apresenta alta patogenicidade ao cacaueiro sendo responsável por

perdas de até 90% na produção de cacau (Meinhardt et al., 2008; Souza et al.,

2006). Essa praga foi responsável pela decadência das lavouras cacaueiras da

Bahia a partir de 1989, e como consequência a produção de cacau do Brasil que

correspondia por volta de 15% da mundial, foi reduzida drasticamente para apenas

cerca de 4%. O sintoma característico da vassoura de bruxa é o superbrotamento

dos ramos que se tornam semelhantes a uma vassoura (Figura 1A). Além dos

ramos, tecidos em desenvolvimento, almofadas florais e folíolos, os frutos também

são muito afetados (Figura 1B).

A monilíase é uma doença causada pelo fungo Moniliophthora roreri que

causa mais danos do que o Moniliophthora perniciosa, onde as duas doenças

ocorrem. O fungo infecta os frutos em qualquer estágio de seu desenvolvimento

produzindo grande quantidade de esporos na forma de pó cinzento ou creme

(Figura 1C) (Evans et al., 2013; Crozier et al., 2015).

A podridão-parda é uma doença causada por espécies do gênero

Phytophthora cuja ocorrência é verificada, praticamente, em todos os países

produtores de cacau da América do Sul. As espécies Phytophthora palmivora, P.

capsici, P. citrophthora e P. heveae são as mais agressivas e atualmente mais

21

prevalentes na América do Sul (Helliwell et al., 2015). Os sintomas aparecem no

fruto como uma mancha escura sobre a superfície inteira e com apodrecimento

interno (Figura 1D). São observados sintomas em almofadas florais, troncos e

raízes da planta hospedeira (Bahia et al., 2015).

A murcha de Ceratocystis é uma doença letal ao cacaueiro causada pelo

fungo Ceratocystis cacaofunesta que tem sido responsável por perdas de 20 a 30%

na produção de cacau nas lavouras cacaueiras da Bahia (Harrington et al., 2011). O

fungo penetra na planta através de ferimentos nos troncos, ramos e raízes,

obstruindo os vasos do xilema, causando o escurecimento das folhas (Figura 1E) e

o aparecimento de estrias de coloração marrom no tronco (Figuras 1F), bem como o

murchamento e até a morte da planta (Ambrosio et al., 2013).

Figura 1. Principais doenças do cacaueiro, vassoura de bruxa nos galhos (A) e nos frutos (B), monilíase-do-cacaueiro em frutos de cacau (C), podridão-parda em fruto de cacau (D), murcha de Ceratocystis nas folhas (E) e no tronco do cacaueiro (F).

1.2 – Estratégias de manejo e controle de fitopatógenos do cacau

A tentativa de controle de fitopatógenos tem sido realizada através de

diferentes estratégias de manejo, como a poda fitossanitária e também através do

controle químico utilizando agrotóxicos, do controle biológico, além do melhoramento

vegetal através da seleção de variedades mais resistentes (Bettiol & Morandi, 2009).

Entretanto, o controle de fitopatógenos é muito difícil, visto que os esporos dos

patógenos se espalham rapidamente através do vento, chuva, insetos e do homem,

22

por meio de ferramentas utilizadas no campo. Para o controle da vassoura-de-bruxa,

por exemplo, a alternativa mais adequada e eficiente atualmente têm sido a

aplicação do biofungicida TRICOVAB, desenvolvido pela Comissão Executiva do

Plano da Lavoura Cacaueira – CEPLAC, que já foi registrado pelo Ministério da

Agricultura do Brasil, e tem sido utilizado pelos produtores nas lavouras da região

cacaueira da Bahia. Esse biofungicida é baseado na ação do Trichoderma

stromaticum que é um fungo antagônico ao Moniliophthora perniciosa (Bastos, 2008;

Bailey et. al., 2008; Cordero et. al., 2010). É importante destacar que ainda não

existe um produto comercial tal como o TRICOVAB para controle da murcha de

Ceratocystis e podridão parda, portanto as atividades de pesquisas principalmente

nas áreas da biologia molecular, fitopatologia, agronomia e química são de grande

relevância para encontrar soluções para controle efetivo dos fitopatógenos do cacau.

1.3 – Métodos de detecção e identificação de fitopatógenos

A detecção e identificação rápida, correta e confiável de fitopatógenos é de

grande importância para a cacauicultura, no início e principalmente antes do

aparecimento dos sintomas nas plantações. Esta identificação tem sido realizada

através da observação das características morfológicas dos fitopatógenos ou do

sequenciamento genético do seu DNA (Mondego et al., 2008; Rincones et al., 2008;

Scarpari et al., 2005; Teixeira et al., 2012). A caracterização morfológica é realizada

pelo crescimento dos fungos em meio de cultura sofrendo a influência do ambiente e

da dificuldade de reprodução de idênticas condições em diferentes locais, e em

alguns patógenos, como os do gênero Phytophthora, é trabalhosa, demorada, difícil

e de baixa precisão, se o pesquisador não tiver experiência, devido à semelhança

morfológica entre as espécies. Entretanto, ainda é a técnica de mais baixo custo e

acessível na maioria dos laboratórios (Braga et al., 2013). Os métodos de

amplificação através da síntese de múltiplas cópias dos ácidos nucléicos DNA e

RNA são baseados na reação em cadeia da polimerase (em inglês, Polymerase

Chain Reaction - PCR) (Bowman et al., 2007; Engelbrecht et al., 2007). Como

vantagem são mais exatos do que a fenotipagem, porém demandam muito mais

tempo de trabalho de um profissional especializado e instrumentação especializada

resultando em diagnósticos demorados (Braga et al., 2013). A necessidade de um

diagnóstico rápido e seguro a fim de evitar que a praga contamine a lavoura

23

demanda novos métodos diagnósticos que não dependam do crescimento dos

patógenos em meios de cultura seletivos ou da amplificação do DNA o que

simplificaria consideravelmente a detecção e identificação, tornando-a mais rápida e

precisa (dos Santos et al., 2016). A técnica de espectrometria de massas para

identificação microbiológica baseada nos perfis de peptídeos/proteínas e/ou lipídios

característicos de cada espécie de microrganismo é uma ferramenta bastante útil na

detecção e identificação de fitopatógenos (dos Santos et al., 2016). Na área de

microbiologia clínica, um grande progresso foi alcançado através dos estudos de

proteômica por espectrometria de massas (MS) usando a técnica Matrix Assisted

Laser Desorption Ionization (MALDI-TOF) associada com uma biblioteca de

espectros para diagnóstico rápido, 5 a 15 min por amostra (Fenselau & Demirev,

2001; Marinach-Patrice et al., 2009). Isso é possível porque é conhecido que cada

espécie de microrganismo apresenta um perfil de proteínas ribossomais diferente

que pode ser detectado por espectrometria de massas (Chalupová et al., 2014;

Senga et al., 2009; Steveson et al., 2008; Van Veen et al., 2010). Desse modo, é

viável propor a utilização dos perfis de peptídeos/proteínas ribossomais, e talvez os

lipídios da membrana celular, para caracterização e discriminação dos fitopatógenos

do cacau.

1.4 – Os princípios da Espectrometria de massas

A espectrometria de massas (do inglês, Mass Spectrometry - MS) surgiu no

final do século XIX devido a duas descobertas revolucionárias. Primeiro, os

experimentos nos tubos de raios catódicos (primeiros espectrômetros de massas)

realizados por J. J. Thomson levaram à descoberta do elétron (Thomson, 1899).

Além disso, Aston descobriu os isótopos e mediu suas massas e abundâncias

relativas (Aston & Thomson, 1946). Essas duas descobertas possibilitaram a

identificação de vários elementos químicos que avançou para a identificação de

moléculas. Em meados da década de 1960 as aplicações de MS na química de

compostos voláteis se tornaram muito abundantes, principalmente na química

orgânica e de produtos naturais, através do acoplamento da cromatografia de gás

com a espectrometria de massas – GC-MS desenvolvido por Fred W. MacLafferty

(Gohlke & McLafferty, 1993). Medidas de massas exatas, padrões isotópicos

específicos e a associação com análises estruturais de íons pré-selecionados,

24

realizadas através de processos de dissociação ou reações íon/molécula, permitiram

obter informações físico-químicas bastante detalhadas de átomos e moléculas de

diferentes propriedades. Com a espectrometria de massas sequencial (Tandem

Mass Spectrometry - MSn) foi possível obter além da relação massa/carga (m/z) dos

íons, informações estruturais de cada íon, permitindo portanto a “reconstrução por

partes” da molécula precursora (Siuzdak, 1994). Análises diretas de misturas por

MSn tornaram-se viáveis, visto que os íons de cada molécula passaram a ser

individualmente separados e analisados. No início da década de 1990, grandes

avanços em instrumentação foram obtidos a partir do desenvolvimento da técnica de

MALDI-TOF (“Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time-of-Flight”)

(Christian et. al., 2004) e ESI-MS (“Electrospray”-MS) (Fenn, 2003) que estão

baseadas em conceitos simples, mas revolucionários, que possibilitaram as análises

de moléculas termolábeis, íons em solução, complexos organo-metálicos, polímeros

e biomoléculas que eram espécies até então inacessíveis pelas técnicas clássicas

de ionização.

A espectrometria de massas pode ser definida como uma técnica de estudo

da matéria em nível atômico e/ou molecular através da formação de íons que na

fase gasosa são caracterizados pela medida da massa, carga, estrutura ou

propriedades físico-químicas (Vessecchi et al., 2011). A espectrometria de massas

se baseia na produção de íons a partir de compostos orgânicos ou inorgânicos. Os

íons produzidos são separados de acordo com a razão massa/carga (m/z) e em

seguida suas respectivas abundâncias são medidas por um detector (Gross, 2004).

Portanto, um espectrômetro de massas consiste basicamente de uma fonte de

ionização, um analisador de m/z e um detector. Um esquema característico de um

espectrômetro de massas é apresentado na Figura 2. No espectrômetro de massas,

após a introdução da amostra por infusão direta com bomba de seringa,

cromatografia gasosa ou líquida, a fonte de ionização produz os íons em fase

gasosa que são direcionadas para o analisador para a separação das diferentes m/z,

seguida da medição em um detector.

25

Figura 2. Esquema característico de um espectrômetro de massas contendo as principais partes, fonte de ionização, analisador de m/z e sistema de detecção.

1.4.1 – Fontes de ionização

A abrangência da técnica de espectrometria de massas tem uma grande

contribuição da ampla variedade de técnicas de ionização que podem ser acoplados

a fim de render os melhores resultados em uma determinada análise. Devido a sua

grande importância uma grande variedade de fontes de ionização foram

desenvolvidas tais como Ionização por Elétrons (EI, do inglês Electron Ionization),

Ionização química (CI, do inglês Chemical Ionization), ionização química à pressão

atmosférica (APCI, do inglês Atmospheric Pressure Chemical Ionization),

fotoionização à pressão atmosférica (APPI, do inglês Atmospheric Pressure

Photoionization), ionização por electrospray (ESI), dessorção e ionização a laser

assistida por uma matriz (MALDI) (Vessecchi et. al., 2011). Considerando o contexto

desse trabalho envolvendo a análise de fitopatógenos e de metabólitos da interação

patógeno-planta, a ionização por Electrospray (ESI) e MALDI são as duas técnicas

de ionização mais utilizadas e serão abordadas a seguir.

1.4.1.1 - Ionização por ESI

A espectrometria de massas com ionização por eletrospray (do inglês

electrospray ionization mass spectrometry - ESI-MS) têm sido uma das técnicas

mais utilizadas na identificação estrutural e na obtenção de informação qualitativa

sobre os perfis de biomoléculas (Demarque et al., 2016). A técnica ESI consegue

gerar íons na fase gasosa a partir de moléculas em uma solução sendo aplicável a

compostos que podem variar de baixa a alta massa molecular, alta polaridade e de

complexidade estrutural variada. As moléculas são analisadas como moléculas

protonadas ou na forma de cátions (modo positivo), ou ainda como moléculas

desprotonadas ou na forma ânions (modo negativo) (Cole, 2000). A fonte ESI utiliza

um campo elétrico alto que pode variar de 1-4 kV (obtido pela diferença de potencial

26

entre o capilar e o eletrodo) o qual é aplicado à solução que passa por um capilar em

vazão baixa (1-10 µL min-1). O campo elétrico aplicado no capilar induz o acúmulo

de cargas no líquido, e como consequência, são formadas gotas altamente

carregadas na ponta do capilar. Um gás injetado coaxialmente com a solução

permite a dispersão das gotas na forma de um spray. O líquido evapora com auxílio

de aquecimento térmico e o volume das gotas é continuamente reduzido, até que a

repulsão entre os íons de mesma carga é maior do que a atração dos íons de carga

oposta. Podem-se formar então gotas contendo apenas um íon (modelo Charged

Residue Model - CRM) ou os íons são “ejetados” das gotas para fase gasosa

(modelo Ion Evaporation Model - IEM) (Hoffmann e Stroobant, 2007). A Figura 3

apresenta o esquema característico de uma fonte de ionização por ESI.

Capilar da fonte

DDP

Capilar da fonte

Cone

de Taylor

Tubo de

transferência

Evaporação

do solvente

Evaporação

do solvente

Explosão

Coulombica

Ejeção dos íons

Figura 3. Esquema característico de uma fonte de ionização por Electrospray (ESI).

1.4.1.2 - Ionização por MALDI

No início da década de 1990, grandes avanços em instrumentação foram

obtidos a partir do desenvolvimento da técnica de MALDI-TOF (“Matrix-Assisted

Laser Desorption Ionization - Time-of-Flight”, Figura 4) que possibilitou as análises

de biomoléculas que eram até então inacessíveis pelas técnicas clássicas de

ionização (Easterling et al., 1998; Fenselau, 2013; Fenselau and Demirev, 2001; Lay,

2001). A técnica MALDI-TOF/MS consiste em um sistema no qual uma mistura

amostra-matriz (substância de caráter ácido ou básico) é irradiada com um feixe de

laser, que vaporiza a mistura causando a ionização das moléculas da amostra por

27

transferência/abstração de prótons. Os íons produzidos pela fonte MALDI são

atraídos para o analisador de massas TOF onde são separados conforme a sua

razão massa/carga e, em seguida, os íons são detectados de acordo com tempo de

chegada ao detector (Singhal et al., 2015; Yates et al., 1998). As biomoléculas e

diversas outras macromoléculas intactas são detectadas com altíssima exatidão o

que tem possibilitado aplicações em diferentes áreas, tais como bioquímica,

medicina, farmácia, forense, materiais e veterinária para a caracterização de

compostos orgânicos e inorgânicos. Assim, a espectrometria de massas se

consolidou como uma ferramenta versátil e fundamental em ciência.

Figura 4. Esquema característico de um espectrômetro de massas com fonte de

MALDI e analisador TOF para analises de biomoléculas.

1.5 – Identificação de microrganismos por MALDI-TOF MS

Em 1975, Anhalt e Felselau aplicaram pela primeira vez espectrometria de

massas para caracterizar uma bactéria, porém foi a partir da década de 1990 que a

MS ganhou popularidade como ferramenta de caracterização de microrganismos

com o desenvolvimento da fonte de ionização MALDI acoplada ao analisador TOF

(Fenselau and Demirev, 2001). A técnica MALDI-TOF/MS apresenta vantagem de

ionizar biomoléculas intactas de alta massa molecular gerando espectros mais fáceis

de interpretar comparado com electrospray (Fenselau, 2013). Embora o número de

28

estudos ainda seja limitado comparado ao número de microrganismos conhecidos,

MALDI-TOF/MS têm demonstrado ser confiável para diferenciar uma enorme

variedade de microorganismos (Chalupová et al., 2014), tais como bactérias (Sauer

et al., 2008; Stevenson et al., 2008; Senga et al., 2009), cianobactérias (Erhard et al.,

1997; Sandonato et al., 2016), vírus (Calderaro et al., 2015; Cobo, 2013),

protozoários (Song et al., 2015), leveduras (Stevenson et al., 2010) e fungos

(Schulthess et al., 2014; Spanu et al., 2012; Kemptner et. Al., 2009) em diferentes

níveis taxonômicos. A partir de um extrato de peptídeos/proteínas de uma espécie

de bactéria, obtém-se um espectro de massas característico que permite a

identificação inequívoca de uma espécie.

O primeiro trabalho aplicando MALDI-TOF/MS para a análise de fungos foi

publicado em 2000, no qual foi analisado o conteúdo da parede celular de

Penicillium spp., Scytalidium dimidiatum e Trichophyton rubrum, mostrando boa

reprodutibilidade e discriminação entre as espécies (Welham et al., 2000). A primeira

biblioteca de espectros de fungos obtida por MALDI para a análise clínica de rotina

foi desenvolvida por Marinack-Patrice et al. (2009) e envolveu o estudo de 57 cepas

de Fusarium. Os resultados foram comparados com análises de sequenciamento

genético e características morfológicas, sendo o método validado por um teste em

cego com cepas conhecidas. De Carolis et. al (2012) analisaram os perfis de 55

espécies de fungos de interesse clínico dos gêneros Aspergillus, Fusarium e

Mucorales através da análise direta da superfície da colônia por MALDI-TOF,

mostrando diferenças qualitativas e quantitativas que permitem diferenciar espécies

e cepas. Os resultados foram incluídos no software Biotyper 2.0 (Bruker Daltonics),

permitindo a expansão de análises de rotina em microbiologia clínica para estes

fungos. Porém, apenas recentemente foi publicado o primeiro trabalho de

caracterização e identificação dos principais fitopatógenos do cacaueiro

(Moniliophthora spp., Phytophthora spp. e Ceratocystis) através de MALDI-TOF/MS

(dos Santos, et al., 2016). Portanto, uma biblioteca de espectros de fitopatógenos do

cacau por MALDI-TOF/MS será uma importante ferramenta de auxílio aos órgãos de

defesa sanitária das regiões produtoras de cacau, além de possibilitar a inspeção do

material vegetal infectado que transita através de portos e aeroportos. Além disso,

há uma perspectiva de aplicação da técnica MALDI-TOF/MS para identificação do

29

fungo Moniliophthora roreri ainda inexistente no Brasil, porém presente em vários

países que têm fronteiras em comum (dos Santos, et al., 2016).

Os microorganismos são isolados de hospedeiros, que no caso dos

fitopatógenos, são tecidos vegetais como folhas, galhos, frutos, raizes ou do solo. As

interações dos fitopatógenos com diferentes tecidos vegetais resulta na produção de

diferentes metabólitos, tanto por parte do microorganismo quanto da planta, quando

comparado ao nível basal do metabolismo dos mesmos. Os metabólitos produzidos

nas interações planta-patógeno estão sendo cada vez mais estudados com a

aplicação das técnicas e ferramentas da metabolômica para entender as mudanças

bioquimicas que ocorrem nas doenças causadas por fitopatógenos.

1.6 – Metabolômica: fundamentos e conceitos

Em 1990 o Departamento de Energia do Instituto Nacional de Saúde dos

Estados Unidos iniciou o projeto Genoma Humano que impulsionou o

desenvolvimento da genômica, e como consequência, transcriptômica e proteômica.

Na era genômica visava-se conhecer completamente os mecanismos de

funcionamento celular em nível molecular pelo sequenciamento do DNA (Goodacre,

2005). Apesar dos avanços, o conhecimento das sequências de todos os genes de

muitos organismos não foi suficiente para compreender suas funções, sendo

necessária a análise do nível de expressão dos genes (transcriptoma), tradução de

proteínas (proteoma) e produção de metabólitos, sendo a análise desse último

processo conhecida hoje como metabolômica (Goodacre, 2005).

A metabolômica desempenha papel fundamental na análise da expressão e

função dos genes e contribui com informações bastante abrangentes sobre os

sistemas biológicos, na medida em que ela é o resultado dos processos bioquímicos

intrínsecos do organismo que também são influenciados por fatores abióticos

(ambiente e estágio de desenvolvimento) e fatores bióticos (transcrição, degradação

de RNAm, modificação pós-tradução, dinâmica protéica, concentrações e fluxos de

metabólitos) (Goodacre, 2005; Fiehn, 2002).

Os processos até então citados, de fluxo de informação genética de um

organismo encontram-se ilustrados na Figura 5. Como o esquema sugere, o

genoma representa o conjunto completo de genes de um organismo ou de suas

organelas (mitocôndria e cloroplasto), que pode ser analisado pelo sequenciamento

30

sistemático de DNA. O transcriptoma é todo RNA mensageiro presente em uma

célula; o proteoma constitui todas as proteínas presentes em uma célula, tecido ou

órgão; e finalmente, o metaboloma é o conjunto completo dos metabólitos

produzidos (Fiehn, 2002; Ryan & Robards, 2006).

Genômica Transcriptômica Proteômica Metabolômica

Transcrição Tradução Metabolismo

DNA mRNA Proteínas Metaboloma

Hipoxantina Creatinina

Triptofano Ácido Quenodesoxicólico

GenômicaTranscriptômicaProteômicaMetabolômica

TranscriçãoTraduçãoMetabolismo

DNAmRNAProteínasMetaboloma

HipoxantinaCreatinina

TriptofanoÁcido Quenodesoxicólico











Figura 5. Esquema do fluxo de informação genética que ocorre na célula dos organismos.

A metabolômica é um campo da ciência emergente e em pleno

desenvolvimento, e uma evidência disso, é que os conceitos e definições para o

termo “metabolômica” na literatura científica ainda estão sendo discutidos e

revisados pela comunidade constantemente. A definição de metabolômica como a

“análise qualitativa e quantitativa (relativa ou absoluta) de todo o metaboloma

endógeno (metabólitos com massas inferiores a 1500 Da)” é uma das mais utilizadas

atualmente (Dieter, 2011).

Os conceitos da metabolômica têm sido utilizados, cada vez mais, em

diferentes áreas da ciência como ferramenta para diversas aplicações, tais como a

detecção do aparecimento de células tumorais que são utilizadas no diagnóstico de

câncer de pulmão (Carrola et. al., 2011), câncer de rim e colorretal (Kim et. al.,

2011); doença de Alzheimer (Xu et. al., 2012; Trushina, 2013); doenças respiratórias

em crianças (Carraro et. al., 2007; De Laurentiis 2008); fertilidade e infertilidade

masculina (Kovac et. al., 2013).

1.7 – Metabolômica da interação planta-patógeno

A metabolômica tem como objeto de estudo os produtos do metabolismo de

um organismo, o qual é o resultado de todas as reações químicas que

31

continuamente estão ocorrendo nas células. Nesse processo, enzimas específicas

direcionam as reações, estabelecendo o que se denominam rotas metabólicas (Filho

et. al., 2010). Os compostos químicos formados, degradados ou transformados

nessas rotas são chamados de metabólitos. Esses compostos bioquímicos podem

ser divididos em dois grandes grupos, denominados de metabólitos primários e

secundários (Filho et. al., 2010; Moco et. al., 2007).

O metabolismo primário das plantas envolve as reações vitais para o seu

crescimento, desenvolvimento e manutenção, incluindo os processos fotossintéticos,

a respiração celular e as biossínteses de aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos,

polissacarídeos e lipídeos. Os produtos do metabolismo primário, através de rotas

biossintéticas diversas, originam os metabólitos secundários que apresentam

diversas estruturas e importantes atividades biológicas (Filho et. al., 2010; Moco et.

al., 2007).

Os metabólitos secundários de plantas participam das interações intra e

intercelular do próprio organismo ou com células de outros organismos, atuando, por

exemplo, em processos de polinização pela produção de substâncias que atraem os

agentes polinizadores deste processo e contribuindo para a defesa da planta contra

patógenos. Assim, o metabolismo primário assume importância principal no

crescimento e desenvolvimento da planta e o metabolismo secundário contribui com

os aromas, as cores dos alimentos e com a resistência contra patógenos, mantendo

a sobrevivência nas condições ambientais favoráveis (Filho et. al., 2010). Como

exemplo de produção de metabólitos secundários dos vegetais, duas rotas

metabólicas, do ácido chiquímico e do ácido mevalônico, são mostradas na Figura

6. Uma planta submetida a condições de estresse, como variações de temperatura e

umidade do ambiente, alta salinidade, alta ou baixa umidade, alto ou baixo pH do

solo, poluentes industriais e lesões mecânicas, sofre modificações nos metabólitos,

que em muitas situações levam à alterações fisiológicas visíveis como sintomas

(Filho et. al., 2010; Palama et al., 2010). Além dos fatores físico-químicos citados, os

biológicos, tais como a ação predatória de insetos, parasitária de nematóides e

infecções por microrganismos patogênicos (fungos, bactérias, vírus) também

desencadeiam alterações fisiológicas nas células vegetais. As alterações que

constituem a resposta de defesa das plantas, frente ao estresse causado por

patógenos, têm sido intensamente estudadas visando o melhoramento vegetal (Filho

32

et. al., 2010; Palama et al., 2010). Nesse trabalho será dada ênfase à metabolômica

aplicada no estudo das interações do cacau com fitopatógenos. A Figura 7 mostra

algumas classes de metabólitos e os processos fisiológicos relacionados à defesa

das plantas em uma situação geral de infecção por patógeno.

Figura 6. Rotas metabólicas do ácido chiquímico e do ácido mevalônico de produção de metabólitos secundários das plantas.

Interação

Planta-patógeno

Detecção

MAMPs/PAMPs

fatores patogenicidas

Sinalização

óxido nítrico

etileno

oxigênio reativo

espécies

jasmonatos

salicilatos

lipídeos

Modificação para o metabolismo primário

• regulagem da energia

• homeostase celular

fotossíntese

transpiração

redox

metabolismo nitrogenado

aminas/aminoácidos

carboidratos

ácidos orgânicos

Modificação para a estrutura da planta

• composição da parede celular

• órgãos (folhas, raízes, caule)

ceras

ácido abscísico

giberelina

lípideos

fenólicos

sacarídeos

ácidos orgânicos

auxinas

Produção de metabólitos secundários

• toxicidade

• sinalização

fitoalexinas/fitoanticipinas

salicilatos de metila

jasmonatos de metila

alcalóides

polifenólicos

terpenos

glucosinolatos

Resistência

Resistência Parcial/

Tolerante

Susceptível

Figura 7. Modificações moleculares e fisiológicas gerais que podem ocorrer durante uma interação planta-patógeno.

33

A interação planta-patógeno pode ser dividida basicamente em dois tipos: a

interação compatível e a interação incompatível. Na interação compatível o patógeno

invade o tecido vegetal, se multiplica e provoca a doença na planta. Na interação

incompatível, o patógeno, ao penetrar no tecido vegetal, encontra a resistência da

planta, impedindo sua multiplicação. A diferença básica entre as interações

compatível e a incompatível está relacionada à presença ou ausência de um gene

de resistência na planta, e de um gene de avirulência no patógeno (Filho et. al.,

2010; Palama et al., 2010).

O mecanismo de indução e amplificação da resposta de defesa em plantas é

chamado de eliciação. As moléculas que induzem ou amplificam a resposta de

defesa são chamadas de eliciadoras e podem ser de origem peptídica, lipídica ou

polissacarídica (Palama et al., 2010). O estudo destas moléculas é utilizado,

atualmente, como uma das ferramentas para aumentar a resistência de plantas. A

análise dos perfis metabólicos em plantas tem demonstrado que estes estão

diretamente relacionados com os estágios de desenvolvimento dos organismos,

fornecendo dados importantes sobre as alterações metabólicas ao longo do tempo

(Palama et al., 2010; Park et al., 2007). A metabolômica aplicada ao estudo de

doenças causadas por patógenos em plantas tem possibilitado a compreensão

sobre o desenvolvimento de infecções, bem como sobre os mecanismos de

respostas frente às condições do ambiente. As variações nos teores dos metabólitos

de um organismo em relação aos teores basais, sob determinadas condições,

podem indicar padrões de comportamento em função dos fatores ambientais

(Palama et al., 2010; Park et al., 2007).

A interação patógeno-planta, em nível molecular, é mediada por várias

classes de metabólitos produzidos pelos patógenos para causar a infecção dos

tecidos da planta que responde à infecção com a produção de metabólitos gerais e

específicos de defesa. Os metabólitos produzidos pelos patógenos, tais como

proteínas, lipídios e carboidratos são responsáveis, por exemplo, pela capacidade de

adesão e penetração nos tecidos da planta e no fruto, bem como pelos diferentes

graus de patogenicidade apresentado por diferentes espécies de patógenos (Filho et

al., 2010; Palama et al., 2010; Park et al., 2007).

A resistência de uma planta infectada é desenvolvida através de mecanismos

de defesa à entrada do patógeno os quais podem ser estruturais ou bioquímicos. Os

34

mecanismos estruturais são barreiras físicas a invasão e colonização do patógeno

através de estruturas como parede celular, cutículas, estômatos, tricomas e vasos

condutores, enquanto que os mecanismos bioquímicos compreendem a produção de

metabólitos capazes de produzir condições adversas ao desenvolvimento e a

sobrevivência do patógeno (Palama et al., 2010). Os metabólitos primários proteínas

PR (pathogenesis related, proteínas relacionadas à defesa) tais como as quitinases,

glucanases, peroxidases e inibidores de proteases são algumas das classes de

metabólitos que as plantas podem produzir para se defender contra o ataque de

patógenos (Park et al., 2007). Os metabólitos secundários tais como alcalóides,

compostos fenólicos e flavonóides são compostos que sofrem alterações nos

germoplasmas infectados comparado ao nível basal dos germoplasmas não-

infectados. Os metabólitos secundários são substâncias lipofílicas, produzidas em

baixas concentrações pelas plantas sadias, principalmente para sua defesa, visto

que podem atravessar a membrana plasmática e atuar no interior das células dos

patógenos. Entretanto, a planta hospedeira precisa sintetizar uma quantidade

suficiente desses metabólitos para impedir o desenvolvimento do patógeno e o

estabelecimento do processo de infecção da planta (Filho et al., 2010; Palama et al.,

2010; Park et al., 2007).

O primeiro evento de sinalização molecular de uma infecção causada por

patógeno é o aumento na abundância de compostos específicos, não voláteis (por

exemplo, salicilato) e voláteis (por exemplo, etileno) emitidos pelas plantas (Torres et

al., 2006; Park et. al., 2007; Vicente et. al., 2013). Compostos voláteis tais como

oxido nítrico, etileno, metil jasmonato e metil salicilato são reconhecidos como

mediadores de resistência sistêmica adquirida, ou seja, as plantas infectadas

utilizam esses compostos para se comunicar com as plantas sadias indicando que

estão sendo atacadas por patógenos (Vicente et. al., 2013; Petrocelli et. al., 2012).

Espécies reativas de oxigênio tais como peróxidos e superóxidos de hidrogênio

podem atuar na sinalização da infecção do patógeno (Vicente et. al., 2013; Petrocelli

et. al., 2012). Muitos outros compostos de plantas podem atuar como metabólitos

sinalizadores de infecções, tais como os aminoácidos, homoserinas e asparaginas, e

os esfingolipídios (Vicente et. al., 2013).

35

1.8 – Metabôlomica da interação cacau-fitopatógenos

A análise metabolômica tem sido cada vez mais utilizada nos estudos de

plantas infectadas por patógenos a fim de investigar de forma bastante abrangente

as mudanças metabólicas frente aos patógenos com diferentes graus de virulência,

bem como ao longo do tempo de infecção. Através de uma comparação entre os

níveis basais de metabólitos e aqueles produzidos após uma infecção do patógeno,

as informações sobre a interação planta-patógeno podem ser obtidas, melhorando

significativamente a detecção da doença, mas também possibilita a identificação de

candidatos a biomarcadores da infecção e revela um painel de metabólitos que pode

levar a compreensão dos mecanismos bioquímicos mais relevantes em uma dada

interação planta-patógeno.

Embora muitos estudos tenham avançado na compreensão da vassoura de

bruxa (Teixeira et al., 2015; Gramacho et al., 2016) através do sequenciamento do

genoma do cacaueiro e do Moniliophthora perniciosa, esclarecendo o ciclo de

desenvolvimento do fungo (Mares et al., 2016), melhorando as práticas de manejo e

a prospecção de fungos antagônicos (Krauss and Soberanis, 2001) e de genótipos

mais tolerantes (Benjamin, et al., 2016), ainda não existe uma medida eficaz de

combate à vassoura de bruxa. Novas abordagens são necessárias para

compreender a interação patógeno/cacaueiro em nível molecular e a metabolômica

desponta como uma das áreas mais promissoras devido à capacidade de revelar a

expressão do genótipo assim como do fenótipo. Um estudo de apenas três

metabólitos revelou que os ácidos salicílico (AS), fenil-lático e mandélico são

produzidos pelo fungo Moniliophthora perniciosa e o AS é relatado como causador

da necrose das folhas do cacaueiro (Chaves and Gianfagna, 2006). As procianidinas

(Chaves and Gianfagna, 2007), os alcaloides (Aneja and Gianfagna, 2001), auxinas

(Kilaru et al., 2007), carboidratos e açucares ocorrem em maior concentração em

tecidos de cacaueiro infectado do que sadio (Scarpari et al., 2005).

As analises qualitativas e quantitativas são de grande relevância para revelar,

respectivamente, os perfis de metabólitos de uma interação planta-patógeno e para

medir as quantidades relativas dos metabólitos nas amostras. As técnicas analíticas

têm proporcionado, portanto, um grande avanço nos estudos das doenças de

plantas causadas por fitopatógenos.

36

1.9- Técnicas analíticas empregadas em metabolômica

Existem basicamente duas abordagens mais empregadas para a análise

metabolômica, denominadas por “targeted” e “untargeted”. A análise “targeted” é

direcionada para determinadas classes de compostos ou compostos específicos

relacionados a rotas metabólicas já conhecidas e pode também visar a quantificação

de metabólitos específicos. Por outro lado a análise “untargeted” busca revelar o

perfil (fingerprinting) dos metabólitos o mais abrangente possível, sendo portanto,

uma abordagem mais qualitativa (Almstetter et. al., 2012).

As principais técnicas analíticas empregadas em metabolômica recentemente

são Ressonância Magnética Nuclear (RMN) (Schripsema et. al., 2010),

Cromatografia gasosa unidimensional e bidimensional abrangente acoplada à

espectrometria de massas (GC-MS e GC×GC-MS, respectivamente) (Almstetter et.

al., 2012), e Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS)

(Forcisi et. al., 2013), embora outras técnicas como a eletroforese capilar acoplada à

espectrometria de massa (CE-MS) também tem sido cada vez mais empregada e

com aplicações muito relevantes (Cevallos-Cevallos et. al., 2009; Khakimov et. al.,

2014). Todas estas técnicas e métodos podem ser aplicados a uma grande

variedade de metabólitos, porém cada um deles apresenta diferentes vantagens e

desvantagens em relação aos limites de detecção e quantificação, a sensibilidade,

interferências, resolução, repetibilidade, reprodutibilidade e características físico-

químicas dos compostos, como pode ser sumarizado na Tabela 1 (Schripsema et.

al., 2010; Almstetter et. al., 2012; Forcisi et. al., 2013; (Cevallos-Cevallos et. al.,

2009; Khakimov et. al., 2014).

Tabela 1. Figuras de mérito, vantagens e desvantagens associadas às técnicas analíticas empregadas em metabolômica.

Técnicas Vantagens Desvantagens

LC-MS Separações rápidas com alta

resolução (UHPLC);

Alta sensibilidade, resolução e

repetibilidade

Alto consumo de solvente e

baixa capacidade de

separação do HPLC

comparado ao UHPLC.

37

CE-MS Alta sensibilidade (picograma),

capacidade de pico, poder de

resolução dos analitos;

Detecção de moléculas termolábeis e

termoestáveis;

Baixo consumo de solvente e

amostra;

Analitos iônicos e moleculares

Tampões não voláteis que são

incompatíveis com MS;

Baixa repetibilidade e

reprodutibilidade;

GC-MS Alta sensibilidade, capacidade de

pico, poder de resolução dos analitos

e repetibilidade;

Compostos voláteis e semivoláteis;

Não voláteis;

Preparo de amostra (extração,

derivatização)

CG×GC-

MS

Alta sensibilidade e repetibilidade;

Altíssima capacidade de pico e poder

de resolução dos analitos;

Compostos voláteis e semivoláteis;

Não voláteis;

Preparo de amostra (extração,

derivatização)

MS Diferentes tipos de fontes de

ionização para compostos apolares e

polares (APPI, APCI, ESI e fontes

combinadas APPI/APCI, ESI/APCI)

Diferentes tipos de analisadores de

massas (íon trap, quadrupolo, triplo-

quadrupolo, trasformada de Fourier,

Orbitrap)

Efeito de supressão iônica da

matriz;

Separação de isobários;

Preparo de amostra

(extração);

Alto custo de instrumentação;

RMN Completa elucidação estrutural de

moléculas desconhecidas;

Não destrutiva;

Análise de sólidos e líquidos;

Quantificação absoluta

Baixa sensibilidade e

resolução;

Difícil acoplamento com

técnicas de separação;

Análises lentas; amostras

concentradas;

No que se refere às técnicas cromatográficas, a cromatografia em fase

gasosa bidimensional abrangente (GC×GC) comparado a unidimensional (GC) tem o

38

poder de resolução cromatográfica superior, que é particularmente adequado para a

separação de analitos de baixa massa molecular em amostras complexas (Mondello

et. al., 2008; Almstetter et. al., 2009). O efeito de focalização da segunda coluna

(segunda dimensão) possibilita o aumento de resolução, da altura do pico e da

sensibilidade de detecção. A técnica GC×GC é geralmente acoplada com sistemas

de detecção de ionização por elétrons (EI) e tempo de vôo (TOF) (Koek et. al.,

2008).

No que diz respeito ao emprego da cromatografia líquida, LC-MS é uma

técnica aplicada a uma grande variedade de metabólitos de alta massa molecular,

polares e apolares, mediante a utilização de colunas cromatográficas e fases móveis

adequadas. Para essas análises, a fonte de ionização por electrospray (ESI) é

geralmente utilizada para ionização dos compostos, no entanto, as fontes de

ionização química à pressão atmosférica (APCI, do inglês Atmospheric Pressure

Chemical Ionization) e fotoionização a pressão atmosférica (APPI, do inglês

Atmospheric Pressure Photoionization) também podem ser utilizadas para

compostos apolares (Izumi et. al., 2009). Vale ressaltar que a LC-MS era uma

técnica insatisfatória para a análise de metabólitos hidrofílicos (aminoácidos, ácidos

orgânicos, ácidos nucleicos, etc), mas a utilização de fases estacionárias baseadas

em pentafluorofenilpropil e HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) em

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) solucionou essa limitação, sem a

necessidade de derivatização. Outro avanço que pode ser citado foi a utilização da

cromatografia líquida de ultra alta-eficiência (UHPLC) que, a partir de 2004,

desempenhou um papel importante no avanço da metabolômica baseada em LC-

MS. Melhorias significativas fornecidas pelo sistema UHPLC incluem o uso de

coluna resistente a alta pressão, fases estacionárias Poroshell com partículas de 1,7

µm e uma bomba com uma pressão máxima de 100 MPa. Isso resultou em menor

tempo de análise, maior sensibilidade e capacidade de resolução do pico (Plumb et.

al., 2004). A caracterização desses metabólitos tem sido realizada por várias

técnicas cromatográficas acoplada com diferentes sistemas de detecção (Chaves

and Gianfagna, 2007; Scarpari et al., 2005), no entanto a espectrometria de massas

pode realizar a identificação de biomoléculas como os metabólitos primários e

secundários de forma mais confiável devido a medição da razão (m/z) exata dos

39

íons, detecção de padrões isotópicos característicos e fragmentação de íons que

possibilitam a identificação estrutural das moléculas.

Ainda no que se refere às técnicas de separação, a eletroforese capilar (CE)

vem ocupando um espaço crescente na química analítica, visto que apresenta alta

resolução e eficiência na separação de uma ampla gama de moléculas. Outra

vantagem é o baixo custo da instrumentação e operacional, pois, mesmo nas

condições em que se empregam solventes orgânicos, os volumes consumidos de

amostra e eletrólito são desprezíveis comparados à cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC). Porém a maior contribuição que a CE oferece é sua

complementaridade aos métodos já estabelecidos, devido à variedade de modos de

separação existentes os quais permitem a análise de várias classes de compostos.

Outro importante avanço foi o desenvolvimento da CE acoplada à espectrometria de

massas (CE-MS) que alia o alto poder de resolução e eficiência da CE com a

universalidade e sensibilidade que a MS oferece frente a outros sistemas de

detecção como, por exemplo, espectrofotometria na região do UV-visível, bem como

fluorescência induzida a laser (LIF - laser induced fluorescence), que são pouco

informativos em relação à estrutura do analito (Plumb et. al., 2004; Cevallos-Cevallos

et. al., 2013).

A técnica de RMN se destaca por ser versátil, não destrutiva e possibilitar a

caracterização estrutural de metabólitos, além da sua identificação e quantificação.

As amostras podem ser analisadas em solução ou no estado sólido, dependendo da

sua solubilidade. A RMN de 1H unidimensional é uma das metodologias que atende

estes pré-requisitos, embora as metodologias de análise dos núcleos de 13C e 15N

também podem ser utilizadas para obter informação estrutural (Schripsema et. al.,

2010; Kim et. al., 2011). A RMN é empregada também para análise de misturas, no

entanto a sobreposição de sinais dos compostos dificulta a identificação, sobretudo

quando a mistura possui grande quantidade de substâncias. Porém, essa dificuldade

pode ser superada pela utilização das técnicas bidimensionais (RMN 2D). Vale

ressaltar que RMN não é limitada pela polaridade e massa molecular dos

compostos, podendo ser aplicada a compostos apolares e polares (Schripsema et.

al., 2010; Kim et. al., 2011).

40

Tendo apresentado os conceitos sobre o metabolômica de plantas, os

envolvidos na interação planta-patógeno, bem como as técnicas analíticas que

podem ser utilizadas na análise metabolômica, a seguir, serão apresentados alguns

trabalhos que mostram a aplicação no estudo de interação Theobroma cacao-

Moniliphthora perniciosa e Theobroma cacao-Ceratocystis cacaofunesta para avaliar

resistência e suscetibilidade de diferentes clones de cacau cultivados no Brasil.

41

CAPÍTULO I

DIFERENCIAÇÃO DAS PRINCIPAIS ESPÉCIES DE FITOPATÓGENOS DO

CACAU POR MALDI-TOF/MS

42

I.1 – Objetivos

I.1.1 – Objetivo geral da tese

Desenvolver metodologias analíticas por espectrometria de massas para

detectar e diferenciar as principais espécies de fitopatógenos do cacau, bem como

para diferenciar plantas infectadas em diferentes tempos de inoculação

compreendendo as fases assintomática e sintomática e diferenciar os genótipos

resistentes dos suscetíveis aos fitopatógenos.

I.1.2 – Objetivo específico do capítulo I

Diferenciar as espécies Phytophthora palmivora, Phytophthora capsici,

Phytophthora citrophthora, Phytophthora heveae, Ceratocystis cacaofunesta,

Ceratocystis fimbriata, Ceratocystis paradoxa e Moniliophthora perniciosa

através dos perfis de peptídeos/proteínas e/ou lipídios analisados por MALDI-

TOF/MS;

I.2 – Parte Experimental

I.2.1 – Amostras: os isolados de fitopatógenos

As culturas puras de Moniliophthora perniciosa, Phytophthora palmivora, P.

citrophthora, P. heveae, P. capsici, Ceratocystis cacaofunesta, C. paradoxa e C.

fimbriata que foram utilizadas neste estudo pertencem a Coleção de Phytophthora

Arnaldo Medeiros e a Coleção de Ceratocystis do Centro de Pesquisas do Cacau

(CEPEC), da Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC),

Ilhéus-BA. Os isolados de Phytophthora foram coletados de cacau (Theobroma

cacao), mamão (Carica papaya), coco (Cocos nucifera), eucalipto (Eucalyptus spp.),

seringueira (Hevea brasiliensis) e solo (rizosfera). Os isolados de M. perniciosa

coletados de cacau foram cultivados em Agar de batata (PDA) acidificado, em placas

de Petri de 90 mm a 25°C durante 5 dias. Os isolados de Phytophthora foram

cultivados em Agar de cenoura acidificado, em placas de Petri de 90 mm a 25°C

durante 10 dias. Os isolados de Ceratocystis foram cultivados em meio PDA, em

placas de Petri de 90 mm a 22° C durante 10 dias (protocolos realizados pelos

colaboradores da CEPLAC). É importante destacar que alguns isolados da mesma

espécie, hospedeiro e localidade foram coletados em diferentes fazendas. As

43

informações detalhadas dos isolados são mostradas na Tabela 2 (dos Santos et al.,

2016).

Tabela 2. Origem dos isolados dos fitopatógenos por patógeno, hospedeiro, órgão

vegetal e local de obtenção.

Espécies Isolados Hospedeiros Órgão vegetal

Localidade (cidade/Bahia)

M. perniciosa VB-S Theobroma cacao Caule Ilhéus – Bahia

VB-F Theobroma cacao Fruto Ilhéus – Bahia

C.cacaofunesta 20 Theobroma cacao Caule Ilhéus – Bahia

68 Theobroma cacao Caule Mutuípe – Bahia

74 Theobroma cacao Caule Ipiaú – Bahia

91 Theobroma cacao Caule Uruçuca – Bahia

97 Theobroma cacao Caule Santo Amaro – Bahia

120 Theobroma cacao Caule Belmonte – Bahia*

122 Theobroma cacao Caule Belmonte – Bahia*

125 Theobroma cacao Pecíolo/folha Belmonte – Bahia

138 Theobroma cacao Pecíolo/folha Ipiaú – Bahia

145 Theobroma cacao Pecíolo/folha Una – Bahia

195 Theobroma cacao Caule Ituberá – Bahia

C. paradoxa 30 Cocos nucifera Pecíolo/folha Una – Bahia

155 Cocos nucifera Pecíolo/folha Itacaré – Bahia**

156 Cocos nucifera Pecíolo/folha Itacaré – Bahia **

C. fimbriata 118 Eucalyptus spp. Caule Belmonte – Bahia

119 Eucalyptus spp. Pecíolo/folha Belmonte – Bahia

178 Hevea brasiliensis Pecíolo/folha Belmonte – Bahia

198 Hevea brasiliensis Caule Una – Bahia

P. palmivora 250 Carica papaya Fruto Eunapolis - Bahia

262 Carica papaya Fruto Una – Bahia

1629 Theobroma cacao Fruto Gandú – Bahia

1661 Theobroma cacao Fruto Itabuna – Bahia

44

Espécies Isolados Hospedeiros Órgão vegetal

Localidade (cidade/Bahia)

1662 Theobroma cacao Fruto Itabuna – Bahia

1924 Theobroma cacao Fruto Mutuípe – Bahia

2423 Theobroma cacao Fruto Santo Amaro - Bahia

P. capsici 135 Theobroma cacao Fruto Gonguji – Bahia

161 Theobroma cacao Fruto Pau Brasil - Bahia

1442 Clone Fx25, Hevea brasiliensis

Pecíolo/folha Una – Bahia


Pecíolo/folha Una – Bahia

1597 Clone 3564, Hevea brasiliensis

Pecíolo/folha Ituberá - Bahia

2358 Theobroma cacao Fruto Camacan - Bahia

P. citrophthora 101 Theobroma cacao Fruto Juçari - Bahia


Folha Ituberá - Bahia

1811 Theobroma cacao Fruto Belmonte - Bahia

2136 Theobroma cacao Fruto Santo Amaro - Bahia

2284 Theobroma cacao Fruto Gandú - Bahia

2301 Theobroma cacao Fruto Mutuípe - Bahia

P. heveae 989 Clone IAN873, Hevea brasiliensis


1009 Clone JS, Hevea brasiliensis


1144 Solo Rizosfera Una – Bahia

1152 Solo Rizosfera Uruçuca – Bahia



*os isolados Cc120 e Cc 122 de Ceratocystis cacaofunesta foram coletados na mesma

localidade em diferentes fazendas;

**os isolados Cp155 e Cp156 de Ceratocystis paradoxa foram coletados na mesma

localidade em diferentes fazendas;

I.2.2 - Extração de peptídeos/proteínas para análise por MALDI-TOF/MS

A primeira etapa buscou estabelecer um protocolo eficiente para a

diferenciação dos isolados de fitopatógenos testando quatro diferentes métodos de

extração de peptídeos/proteínas e quatro tipos de matrizes de MALDI, que foram o

45

ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA), ácido sinapínico (SA), 6-aza-2-tiotimina

(ATT) e 2,6-dihidroxiacetofenona (DHAP). Os micélios foram raspados dos meios de

cultura com uma alça metálica estéril, transferidos para microtubos contendo 1 mL

de solução de etanol 75% em água e mantidos em freezer -20ºC até o momento das

análises (etapa feita pelo doutorando na CEPLAC e transportado até a Unicamp).

Imediatamente antes das extrações, a solução aquosa de etanol foi

descartada e o micélio seco. Foram testados os seguintes métodos:

Método A - Acetonitrila/ácido fórmico (ACN/AF): O micélio foi ressuspenso em

100 μL de acetonitrila/ácido fórmico 70% (1:1, v/v) seguido de agitação por vórtex a

1000 rpm durante 30 min. A mistura foi centrifugada a 13 000 × g durante 5 min e o

sobrenadante foi transferido para placa de MALDI.

Método B - Acetonitrila/ácido trifluoroácetico (ACN/TFA): O micélio foi

ressuspenso em 50 μL de TFA 80% e agitado por vórtex a 1000 rpm durante 30 min.

Em seguida, foram adicionados 100 μL de água Milli-Q e 150 μL de ACN. A mistura

foi centrifugada a 13 000 × g durante 5 min e o sobrenadante foi transferido para

placa de MALDI. Este método foi adaptado de uma aplicação para isolados de

Fusarium.

Método C - Isopropanol/ácido fórmico (IPA/AF): O micélio foi ressuspenso em 50

μL de ácido fórmico 70% e agitado por vórtex a 1000 rpm durante 30 min. Em

seguida, foram adicionados 100 μL de água Milli-Q e 50 μL de isopropanol. A

mistura foi centrifugada a 13 000 × g durante 5 min e o sobrenadante foi transferido

para placa de MALDI.

Método D - Metanol/ácido fórmico (MeOH/AF): O micélio foi ressuspenso em 50

μL de ácido fórmico 70% e agitado por vórtex a 1000 rpm durante 30 min. Em

seguida, foram adicionados 100 μL de água Milli-Q e 150 μL de MeOH. A mistura foi

centrifugada a 13 000 × g durante 5 min e o sobrenadante foi transferido para placa

de MALDI.

I.2.3 - Extração de lipídios para análise por MALDI-TOF/MS

O método relatado por Bligh/Dyer (Bligh and Dyer, 1959) foi utilizado na extração

dos lipídios. O micélio foi suspenso em 150 μL de água Milli-Q. Em seguida,

adicionou-se 190 μL de clorofórmio e 375 μL de metanol e a mistura foi agitada por

vórtex a 1000 rpm durante 5 min (uma fase). Em seguida, 190 μL de clorofórmio e

46

150 μL de água foram adicionados e a mistura foi agitada por vórtex a 1000 rpm

durante 1 min. A mistura foi centrifugada a 14 000 × g durante 5 min para induzir a

separação de fases. A fase orgânica rica em clorofórmio (inferior) foi recolhida,

concentrada utilizando um aparelho Speed-Vac, e reconstituído em 100 μL de

clorofórmio/metanol (1:1). A fase orgânica inferior foi então depositada na placa de

MALDI (1 μL da mistura) e depois seca ao ar. Em seguida, adicionou-se 1 μL de

matriz de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico (DHB), 10 mg mL-1 em MeOH.

I.3 – Resultados e Discussão

I.3.1 – Análise dos perfis de peptídeos/proteínas de fitopatógenos por

MALDI-TOF/MS

A análise de microrganismos por MALDI-MS é precedida por uma etapa de

extração de peptídeos/proteínas e/ou lipídios. A otimização da extração de

peptídeos/proteínas e da matriz de MALDI é uma etapa fundamental para serem

obtidos espectros representativos dos microrganismos. Foram testados quatro

métodos de extração de peptídeos/proteínas e quatro matrizes de MALDI já

detalhados no tópico I.2.2. Os experimentos foram realizados combinando os quatro

solventes e as quatro matrizes para selecionar o melhor par, método de

extração/matriz de MALDI. Considerando o número de íons detectados e a

intensidade relativa o método de extração B (ACN/ácido trifluoroacético 80%) com a

matriz CHCA, resultaram nos melhores espectros como pode ser visto nas Figuras

8 e 9, respectivamente.

47

4375

390487067237

01000200030004000

45228581

717936151

2

3

x104

45217180

3607

0.51.01.52.0

71804521

3617

0

1

2

3

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000

m/z

Método A

Método B

Método C

Método D

x104

x104

Inte

nsi

dad

eA

B

C

D

Figura 8. Comparação dos métodos de extração de peptídeos/proteínas de Ceratocystis cacaofunesta analisados com matriz CHCA.

6-aza-2-tiotimina (ATT)

0

200

400

ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA)

0

1

2

3

4x104

2,6-dihidroxiacetofenona (DHAP)

0

100

200

300

ácido sinapínico (SA)

0

200

400

600

4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000

m/z2000

Inte

nsi

dad

e

Figura 9. Comparação de matrizes MALDI para análise de peptídeos/proteínas de Ceratocystis cacaofunesta extraído com o método B.

A extração de peptídeos/proteínas com acetonitrila/ácido trifluoroacético 80%

e a matriz CHCA foram utilizadas para caracterização de todos os fungos. Os

resultados das análises MALDI-MS dos perfis de peptídeos/proteínas extraídos dos

48

isolados de Moniliophthora perniciosa, Ceratocystis cacaofunesta e Phytophthora

palmivora, que pertencem a gêneros distintos, são claramente diferentes (Figura 10)

indicando a viabilidade de caracterização e diferenciação confiável e correta dessas

espécies de fitopatógenos por espectrometria de massas.

4878

2032

2857

31523413 5173 6206 6618 7903

0

1

2

3

4

5

x104

7234

6093361530462376 6777

0.0

0.5

1.0

1.5

5328

2086

6380

7016

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

m/z

Moniliophthora perniciosa

Ceratocystis cacaofunesta

Phytophthora palmivora

x104

x104

Inte

nsid

ad

e

Figura 10. Perfis de peptídeos/proteínas característicos dos isolados de Moniliophthora perniciosa, Ceratocystis cacaofunesta e Phytophthora palmivora.

As espécies do gênero Phytophthora, P. capsici, P. citrophthora, P. palmivora,

P. heveae foram caracterizadas e discriminadas a partir dos perfis de

peptídeos/proteínas que foram muito distintos para cada espécie (Figura 11), os

quais são suficientes para identificação confiável e correta desses fitopatógenos. Os

resultados foram confirmados através da análise de 12 cepas dos fitopatógenos,

tendo sido feitas triplicatas de cada uma das cepas e registrados oito espectros de

cada réplica, totalizando 24 espectros de cada cepa. Esse resultado é muito

relevante, visto que as espécies do gênero Phytophthora spp. são muito difíceis de

identificar por observação das características morfológicas devido a grande

semelhança entre elas.

49

6271

3698

5318

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0x10

4

5877

6371

61773693 5343

1

2

3

4

62973695

82424114

5642

0.0

0.5

1.0

1.5

6174

4853 58903802 5266 88956855 93297604 8085

0

2

4

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

m/z

6374

x104

x104

x104

P. palmivora

P. heveae

P. citrophthora

P. capcisi

Inte

nsid

ad

e

Figura 11. Perfis de peptídeos/proteínas característicos dos isolados do gênero Phytophthora, P. capsici, P. citrophthora, P. palmivora, P. heveae.

Embora diferenciar cada uma das espécies seja importante, foram obtidos

resultados ainda mais relevantes os quais correspondem a diferenciação de isolados

de uma mesma espécie proveniente de diferentes hospedeiros ou tecidos vegetais,

tais como caule, folha e fruto. Para nossa surpresa, os isolados de Phytophthora

palmivora obtidos de Theobroma Cacao (isolados 1629; 1662) e Carica Papaya

(isolados 250; 262) foram discriminados através dos perfis de peptídeos/proteínas

por MALDI-MS (Figura 12). Além disso, os isolados de Phytophthora capsici

coletados de seringueira (isolados 1454; 1597) e cacau (isolado 1442) mostrado na

Figura 13; os isolados de Phytophthora heveae coletados de folhas (isolado 989) e

rizosfera (isolados 1170; 1144) de seringueira, mostrado na Figura 14; e os isolados

de Phytophthora citrophthora coletados de diferentes clones de cacau cultivados em

diferentes localidades da Bahia, mostrados na Figura 15, também são claramente

distintos.

Interessante notar que os perfis de peptídeos/proteínas de Moniliophthora

perniciosa coletados de caule e fruto são bem distintos, destacando-se a presença

do peptídeo/proteína de m/z 2783 apenas nos isolados dos ramos, e o

peptídeo/proteína de m/z 2032 apenas nos isolados de frutos (Figura 16).

50

6273

3695

61401

2

3x104

62663698

6143

0.5

1.0

1.5

2.0

53526277

2085

0.25

0.50

0.75

5326

20876379

0.00.51.01.52.0

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

m/z

x104

x104

x104

0.0

0.0

6374

6376

6379

P. palmivora 1662

P. palmivora 1629

P. palmivora 262

P. palmivora 250

Inte

nsi

dad

e

Figura 12. Perfis de MALDI-MS de peptídeos/proteínas de Phytophthora palmivora obtidos de Theobroma cacao (isolados 1629, 1662) e Carica papaya (isolados 250, 262).

6173

37886998 101937576

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

x104

6174

4852 592852658900

808740413691 93297372

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

6172

3693 6999 81897408

0

1

2

3

4

5

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

m/z

x104

x104

6998

P. capsici 1454

P. capsici 1442

P. capsici 1597

Inte

nsi

dad

e

Figura 13. Perfis de MALDI-MS de peptídeos/proteínas de Phytophthora capsici coletados de seringueira (isolados 1454; 1597) e cacau (isolado 1442).

51

58796372

6180534636941

2

3

5202

3827765061813701 58781

2

3

50944588 63745879

525036896183

4281

0.0

0.5

1.0

1.5

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

m/z

x104

x104

x104

P. heveae 1170

P. heveae 989

P. heveae 1144

Inte

nsi

dad

e

Figura 14. Perfis de MALDI-MS de peptídeos/proteínas de Phytophthora heveae coletados de folhas (isolado 989) e rizosfera de Seringueira (isolados 1170; 1144).

6300

378675754108 6995 82002

4

x104

6175

3694

7575 819869980.5

1.0

1.5

5638

62933696

82430.5

1.0

1.5

6293

31525118

2000

4000

6000

6302

2396 2908 33435130

0.00

0.25

0.50

0.75

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

m/z

x104

x104

x104

8000

6175P. citrophthora 1577

P. citrophthora 2136

P. citrophthora 2284

P. citrophthora 101

P. citrophthora 161

Figura 15. Perfis de MALDI-MS de peptídeos/proteínas de Phytophthora citrophthora coletados de frutos de diferentes clones de cacau cultivados em diferentes localidades.

52

2857

4877

23192646

62075171 6914

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

x105

4878

2032

2857

31523413 5173 6206 6618 6916 7903

0

1

2

3

4

5

x104

2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

m/z

2783M. perniciosa (caule)

M. perniciosa (fruto)

Inte

nsid

ad

e

Figura 16. Comparação dos perfis de peptídeos/proteínas dos isolados de M. perniciosa obtidos de ramo e fruto.

As espécies, Ceratocystis cacaofunesta, C. fimbriata e C. paradoxa também

apresentam perfis de peptídeos/proteínas muito distintos entre si, mas também entre

isolados coletados de diferentes hospedeiros. Os isolados de Ceratocystis ssp.

obtidos de Theobroma cacao (isolados 68; 74; 120; 122; 125; 20;145; 91; 97; 138;

195), Cocos nucifera (isolados 30; 155; 156), Eucalyptus spp. (118;119) e Hevea

brasiliensis (isolados 178; 198) foram diferenciados através dos perfis de

peptídeos/proteínas analisados por MALDI-MS (Figura 17).

53

3697

4792 7105C. paradoxa (A)

1x104

71054792

3697

3697

7229

3697

3697

3697

36974531

5619

45313697 4271

02000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

m/z

C. paradoxa (B)

C. fimbriata (C)

C. fimbriata (D)

C. fimbriata (E)

C. fimbriata (F)

C. cacaofunesta (G)

C. cacaofunesta (H)

x104

x104

x104

x104

x104

x104

x104

1

2

2

2

2

1

1

Inte

nsi

tyIn

ten

sid

ade

Figura 17. Comparação de diferentes perfis de peptídeos/proteínas obtidos por MALDI-MS. C. paradoxa coletado de Cocos nucifera (A e B), C. fimbriata coletado de Eucalyptus spp. (C e D), Hevea brasiliensis (E e F), C. cacaofunesta coletado de T. cacao (G e H).

Os resultados obtidos dos perfis de peptídeos/proteínas analisados por

MALDI-MS foram confirmados através da análise de agrupamento hierárquico (HCA)

que mostra claramente oito agrupamentos distintos correspondentes às espécies

avaliadas, bem como a similaridade entre os isolados de cada uma das espécies.

Além disso, são observadas diferenças nos agrupamentos de cada espécie de

acordo com hospedeiro no qual o fungo foi isolado e/ou localidade (Figura 18).

54

P. palmivora

P. citrophthora

P . heveae

P. capsici

C. cacaofunesta

C. paradoxa

C. fimbriata

M . perniciosa

Figura 18. Dendograma dos perfis de peptídeos/proteínas das espécies de fitopatógenos do cacau. MP = M. perniciosa, F = fruto, S = caule; CC = C. cacaofunesta, CP = C. paradoxa, CF = C. fimbriata; PCA = P. capsici, PC = P. citrophthora, PH = P. heveae, PP = P. palmivora.

55

I.3.2 – Análise dos perfis de lipídios de fitopatógenos por MALDI-TOF/MS

Os resultados das análises MALDI-MS dos perfis de lipídios extraídos dos

isolados de Moniliophthora perniciosa, Ceratocystis cacaofunesta e Phytophthora

palmivora, que pertencem a gêneros distintos, também são claramente distintos

(Figura 19) indicando a viabilidade de caracterização e diferenciação confiável e

correta dessas espécies de fitopatógenos por espectrometria de massas. É

importante destacar que existem poucos trabalhos na literatura com estudos de

perfis lipídicos para fins de detecção e identificação de fitopatógenos. Para os

fungos, principalmente, esses resultados são muito relevantes, visto que esses

microrganismos possuem parede celular difícil de romper, seja por métodos

químicos ou físicos, o que dificulta muitas vezes a analise de peptídeos/proteínas.

Entretanto os lipídios são muito abundantes e revelam informações muito relevantes

da interação dos fungos com o hospedeiro do qual foi coletado, além de sua espécie

e gênero.

782.8

804.8685.6

818.8758.8 850.8 876.8

2

4

6

x104

782.8685.7

607.4

804.8758.8740.6639.71

2

3

4

780.8

758.8

796.8 826.8

730.7 842.8864.7

0

1

2

3

4

600 650 700 750 800 850 900 950 1000

m/z

x104

x104

Moniliophthora perniciosa


Phytophthora palmivora

Inte

nsid

ad

e

Figura 19. Perfis de lipídios característicos dos isolados de Moniliophthora perniciosa, Ceratocystis cacaofunesta e Phytophthora palmivora.

As espécies do gênero Phytophthora, P. capsici, P. citrophthora, P. palmivora,

P. heveae também foram caracterizadas e discriminadas a partir dos perfis de

lipídios que foram distintos para cada espécie em suas abundâncias relativas

56

(Figura 20), que é suficiente para identificação confiável e correta desses

fitopatógenos. Os resultados foram confirmados através da análise de 12 cepas dos

fitopatógenos, tendo sido feitas triplicatas de cada uma das cepas e registrados oito

espectros de cada réplica, totalizando 24 espectros de cada cepa.

780.8758.8

685.7607.4

701.6 796.8854.0828.8715.2663.7647.7 878.0731.2 902.0 950.8

P. capcisi

0.0

0.5

1.0

x104

758.8685.7607.4

780.8

804.8826.8650.6 733.1

693.7

701.6672.6 771.7 855.7629.4 880.8

P. citrophthora

1

2

3

780.8

758.8

804.8 826.8

818.7730.7 842.8 864.7768.7685.7 748.1701.6 895.8

P. palmivora

12345

685.6

607.4

758.8 780.8701.6

693.7

804.8663.6 826.7647.6 730.7 855.7617.5 885.7 923.2

P. heveae

0

2

4

600 650 700 750 800 850 900 950 1000

m/z

x104

x104

x104

Inte

nsid

ad

e

Figura 20. Perfis de lipídios característicos dos isolados do gênero Phytophthora, P. capsici, P. citrophthora, P. palmivora, P. heveae.

Embora diferenciar cada uma das espécies seja importante, foram obtidos

resultados ainda mais relevantes os quais correspondem a diferenciação de isolados

de uma mesma espécie provenientes de diferentes hospedeiros ou tecidos vegetais,

tais como caule, folha e fruto. Para nossa surpresa novamente, os isolados de

Phytophthora palmivora obtidos de Theobroma Cacao (isolados 1629; 1662) e

Carica Papaya (isolados 250; 262) foram diferenciados através dos perfis de lipídios

que apresentam diferenças notáveis nas abundâncias relativas dos compostos

analisados por MALDI-MS (Figura 21).

57

780.8

758.8

804.8826.8818.7730.7 842.8864.7685.7701.6

P. palmivora 250

12345

x104

685.6

758.8 780.7

804.8

693.7

715.7 826.7607.4 663.6 737.7 858.80.5

1.0

1.52.0

637.2659.2

826.5621.2 804.5

677.2 850.5780.5.

0.5

1.0

1.5

826.6

637.3 804.7659.3

621.3780.6 850.6758.7677.4

645.5730.6

0

1

2

600 650 700 750 800 850 900 950 1000

m/z

P. palmivora 262

P. palmivora 1661

P. palmivora 1629

x104

x104

x104

Inte

nsid

ad

e

Figura 21. Perfis de MALDI-MS de lipídios de Phytophthora palmivora obtidos de Theobroma cacao (isolados 1629, 1661) e Carica papaya (isolados 250, 262).

Interessante notar que os perfis de lipídios de Moniliophthora perniciosa

coletados de caule e fruto são bem distintos, destacando-se a presença dos íons de

m/z 876 e 794 apenas nos isolados dos ramos, e os íons de m/z 750, 804, 832 e 850

com diferentes abundâncias relativas nos isolados de fruto e ramo (Figura 22).

58

782.6

685.5

750.6

804.6

607.2674.5 706.7

629.4 832.6650.5 814.6

0

500

1000

1500

2000

2500

782.8

685.7

804.8

607.4818.8750.8663.7

850.9 876.9706.9635.7 974.9617.6

792.8

733.8

0

1

2

3

4

x104

600 650 700 750 800 850 900 950

m/z1000

M. perniciosa (fruto)

M. perniciosa (caule )Inte

nsid

ad

e

Figura 22. Comparação dos perfis de lipídios dos isolados de M. perniciosa obtidos de caule e fruto.

As espécies, Ceratocystis cacaofunesta, C. fimbriata e C. paradoxa também

apresentam perfis de lipídios muito distintos entre si, mas também entre isolados

coletados de diferentes hospedeiros. Os isolados de Ceratocystis ssp., por exemplo,

obtidos de Theobroma cacao (isolados 20, 91 e 138), Cocos nucifera (isolado 97) e

Eucalyptus spp. (145 e 195) foram discriminados (Figura 23).

59

782.2751.3905.2879.3

723.2 804.2758.2740.0 978.1853.3788.5 887.1961.2 996.0933.2

C. Cacaofunesta 201

x104

768.4751.4736.3 978.3723.4 850.3 961.4905.4882.3809.4 996.2

795.4

933.4783.3 835.4 865.42

4

911.0751.3

723.3 978.1768.2 835.2740.0 850.2782.3

996.0795.2 905.3882.2809.3 961.2865.2 933.31

2

835.3

978.1751.3782.2723.3 850.2804.2 961.2905.3736.2 768.2 996.0882.2 933.3865.2

2

750.3734.3

850.3778.4723.4 766.3 804.3 978.3866.2 905.4 996.2

0.5

750.5

772.5734.5 804.5

756.5

850.5788.5 905.6 942.3 978.40246

700 750 800 850 900 950 1000

m/z

x104

x104

x104

x105

x105

C. Cacaofunesta 91

C. paradoxa 97

C. Cacaofunesta 138

C. fimbriata145

C. fimbriata 195

Inte

nsid

ad

e

Figura 23. Comparação de diferentes perfis de lipídicos obtidos por MALDI-MS. C. paradoxa coletado de Cocos nucifera (isolado 97), C. fimbriata coletado de Eucalyptus spp. (isolados 145 e 195) e C. cacaofunesta coletado de T. cacao (isolados 20, 91 e 138).

Os resultados obtidos dos perfis de lipídios analisados por MALDI-MS foram

confirmados através da análise de agrupamento hierárquico (HCA) que demonstra

claramente oito agrupamentos distintos correspondentes às espécies avaliadas.

Diferentemente do que foi observado, para os perfis de peptídeos/proteínas, as

similaridade entre os isolados de cada uma das espécies com os perfis lipídicos são

menores e, além disso, não são tão claras as diferenças nos agrupamentos de cada

espécie de acordo com hospedeiro do qual o fungo foi isolado e/ou localidade

(Figura 24).

60

P. palmivora

P. citrophthora

P . heveae

P. capsici

C. paradoxa

C. fimbriata

C. cacaofunesta

C. paradoxa

C. fimbriata

M. perniciosa

P . heveae

Figura 24. Dendograma dos perfis de lipídios das espécies de fitopatógenos do cacau. MP = M. perniciosa, F = fruto, S = caule; CC = C. cacaofunesta, CP = C. paradoxa, CF = C. fimbriata; PCA = P. capsici, PC = P. citrophthora, PH = P. heveae, PP = P. palmivora.

61

I.4 – Conclusão do capítulo I

Os resultados obtidos na caracterização de fitopatógenos do cacau mostram

importante avanço na contribuição científica para diferenciação das pragas usando a

técnica MALDI-TOF/MS, sobretudo a discriminação de isolados de uma mesma

espécie coletado de diferentes hospedeiros. Os perfis de lipídios e

peptídeos/proteínas foram capazes de discriminar as espécies dos fitopatógenos

associados com técnicas de análise multivariada de dados. O método tem grande

aplicabilidade para solucionar os problemas de identificação de pragas nas lavouras

cacaueiras. O Monliophthora roreri não foi possível incluir no estudo visto que é uma

praga ausente no Brasil, porém o método poderá futuramente ser aplicado para

identificação dessa praga com pequenas adaptações da metodologia. Os resultados

desse capítulo foram publicados recentemente no Analytical and Bioanalytical

Chemistry no qual foi selecionado pelos editores para a capa do volume 409,

número 07 do mês de março 2017.

Por fim, espera-se que esse trabalho gere impacto científico para a sociedade

brasileira, visto que a instrução normativa IN-47 do MAPA sobre inspeção

fitossanitária do cacau está sendo revisada atualmente, devido às recentes

suspeitas de contaminação de amêndoas de cacau vindo da África. A metodologia

de diferenciação dos patógenos do cacau desenvolvida nesse trabalho foi

apresentada na 39ª reunião Câmara Setorial do Cacau (CSC) do Ministério da

Agricultura, em Brasília, para uma plateia de secretários de agricultura dos estados,

secretários de governo, técnicos do MAPA, representantes das indústrias de

processamento de cacau e chocolate (Barry Callebaut, Nestlé, Cargill, Olam) e

representantes dos produtores de cacau. Como resultado das discussões foi

solicitada a elaboração de uma nota técnica pelo presidente da Câmara Setorial do

Cacau que será enviada para o departamento de Sanidade Vegetal do MAPA.

Portanto, existe grande possibilidade da metodologia fazer parte da nova instrução

normativa IN-47 referente à inspeção fitossanitária do cacau no Brasil.

62

CAPÍTULO II

METABOLÔMICA DE CLONES RESISTENTES E SUSCETÍVEIS DO CACAUEIRO

INFECTADOS POR Moniliophthora perniciosa (VASSOURA DE BRUXA)

63

II.1 – Objetivos

II.1.1 – Objetivo geral


detectar plantas infectadas por Moniliophthora perniciosa em diferentes tempos de

infecção compreendendo as fases assintomática e sintomática e diferenciar os

genótipos resistentes dos suscetíveis aos fitopatógenos.

II.1.2 – Objetivos específicos

Identificar os principais metabólitos produzidos na interação cacau-

Moniliophthora perniciosa;

Identificar os principais metabólitos que discriminam clones de cacau

resistentes e suscetíveis;

Identificar os principais metabólitos em diferentes tempos de infecção que

possam ser marcadores das fases de infecção.

II.2 – Parte Experimental

II.2.1 – Ensaio biológico da vassoura de bruxa para avaliação da

infecção ao longo do tempo

O experimento foi conduzido em casa de vegetação no Centro de Pesquisa

do Cacau - CEPEC/CEPLAC em Ilhéus, Bahia. As plantas dos clones Catongo e

Scavina-6 foram cultivadas por aproximadamente 60 dias, e depois transferidas para

câmara fria com temperatura, umidade e luminosidade controladas para estabelecer

o ponto de orvalho (Figura 25). Após 24 h na câmara fria as plantas foram

inoculadas mecanicamente com uma suspensão de basidiósporos cuja

concentração foi 2 x 105 basidiósporos/mL de Moniliophthora perniciosa aplicado na

gema apical (Figura 26). As plantas foram mantidas por mais 48 h dentro da câmara

úmida para o estabelecimento da infecção. Em seguida, as plantas foram

transportadas novamente para a casa de vegetação e as amostras do primeiro

tratamento (2 dias) foram coletadas.

64

A

B

C

Figura 25. Mudas de cacau (Catongo e Scavina-6) na casa de vegetação (A) e na camara fria 24 h antes da inoculação (B e C).

A B C

Figura 26. Inoculação de basidiósporos de M. perniciosa (A) e sintomas em cacau após 30 dias (B e C).

65

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com dois clones

Catongo (suscetível) e Scavina-6 (resistente) e plantas não inoculadas, controle

(CN) e inoculadas (INOC) para cada clone (Figura 27). Em cada tratamento 5

plantas controle e 15 plantas inoculadas foram coletadas nos seguintes tempos de

infecção: 2, 4, 7, 10, 15, 30, 45 e 60 dias. As plantas foram imediatamente

armazenadas em freezers -20ºC do CEPEC/CEPLAC.

Metabólitos responsáveis pelos

sintomas

Metabólitos específicos de defesa

Metabólitos de defesa do cacaueiro

Germoplasmascontrastantes

Metabolômica da interação patógeno-

hospedeiro

Theobroma cacao vsMoniliophthora perniciosa

Genótipo resistente (Scavina-6)

controle inoculado

Fase assintomática

Fase sintomática

Genótipo suscetível (Catongo)

controle Inoculado

Fase assintomática

Fase sintomática

Figura 27. Delineamento do experimento biológico da inoculação de basidiósporos de M. perniciosa em clones de cacau Catongo e Scavina-6.

O preparo de amostra consistiu em macerar os caules em nitrogênio líquido e,

do pó triturado 100 mg foram pesados em microtubos. Os metabólitos foram

extraídos com 1 mL de metanol sob agitação por vórtex durante 15 min, e em

seguida, centrifugados durante 5 min a 13,000 g. O sobrenadante foi filtrado através

de um filtro de seringa (nylon 0,22 μm) e 50 µL do filtrado foi diluído pela adição de

950 µL de metanol (Figura 28).

66

Figura 28. Fluxograma de preparo de amostra dos ramos de cacau infectados com M. perniciosa para análise metabolômica por LC-MS.

II.2.2 - Análise dos metabólitos da interação M. perniciosa x T. cacao por

LC-MS

Os metabólitos foram analisados usando um sistema LC-MS Agilent 1290

Infinit acoplado com um espectrômetro de massas Agilent 6550 Q-TOF/MS equipado

com uma fonte eletrospray (ESI). Uma alíquota de 1 µL dos extratos das amostras

foi injetado automaticamente usando um amostrador automático. Os metabólitos

foram separados através de uma coluna Poroshel UHPLC Kinetex XB-C18 150 x

2,1mm, de partículas 1,7 μm. A fase móvel foi constituída de água com 0,1% de

ácido fórmico (A) e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico (B), em modo gradiente,

no qual B variou de 5 a 95% com gradiente constante de 5% min-1 durante 25 min e

permaneceu em 95% de B por 10 min, com vazão de 0,40 mL min-1, totalizando 35

min de corrida cromatográfica. O espectrômetro de massas com analisadores Q-

TOF operou nas seguintes condições: faixa de aquisição m/z 100 – 1500 e 1

espectro/s; Fonte de ionização eletrospray Dual AJS ESI operando no modo positivo

de ionização com vazão do gás de secagem (N2) 12 L min-1, temperatura do gás de

secagem (N2) 350°C, gás de nebulização (N2) 45 psig, vazão do gás de nebulização

67

(N2) 12 L min-1 e temperatura da fonte 290°C; voltagem do capilar 3,5 kV, Nozzle

Voltage 320 V, fragmentor 100 V, Skimmer 65 V, Octapolo RF 750.

II.2.3 - Análise estatística multivariada dos dados

A aquisição dos dados foi realizada utilizando o MassHunter (Agilent Software

B6.0) no qual os cromatogramas brutos foram convertidos para o formato .mzdata.

No software XCMS (Smith et al., 2006) versão online os arquivos foram processados

para correção dos tempos de retenção, alinhamento dos picos, extração dos íons e

analise de significância estatística por ANOVA e o teste paramétrico não pareado t-

test (Welch t-test). Os dados corrigidos de razão m/z, tempo de retenção e

intensidade dos íons foram convertidos para o formato .csv e processados no

Metaboanalyst 3.0 versão online (Xia et al., 2015; Xia et al., 2016). No

Metaboanalyst os dados foram processados para filtrar os íons correspondentes a

maioria das amostras, normalizados, redimensionados, centralizados para colocar

todas as amostras e variáveis em uma escala comparável e foram construídos os

modelos multivariados de partial least squares–discriminant analysis (PLS-DA),

orthogonal partial least squares–discriminant analysis (OPLS-DA).

II.3 – Resultados e Discussão

O método LC-MS desenvolvido e otimizado para análise das amostras de

caule, foi empregado nas análises dos metabólitos dos clones Catongo (CAT,

suscetível) e Scavina-6 (SCA, resistente), nos tratamentos controle e inoculado nos

tempos 2, 4, 7, 10 e 15 dias após a inoculação. Na Figura 29A são mostrados os

cromatogramas representativos das amostras e não é possível verificar diferenças

aparentes entre os perfis de metabólitos dos dois clones contrastantes, embora

tenham sido identificados 1571 íons com significância estatística pela ANOVA

(p<0.01) (Figura 29B).

68

AB

Mass Hunter Agilent

Figura 29. Cromatogramas LC-MS das amostras de caule dos clones Catongo e Scavina-6 controle e inoculado, alinhados no XCMS (A) e íons extraídos dos espectros com significância estatística pela ANOVA (p<0.01) (B).

A análise multivariada de PLS-DA foi aplicada para revelar os agrupamentos

das amostras em classes por tratamento conforme esperado para os clones

contrastantes. Interessante, pelo PLS-DA pode-se observar claramente a separação

das amostras em quatro grupos (CAT-CN, CAT-INOC, SCA-CN e SCA-INOC), como

mostrado na Figura 30A. Independentemente do tipo de clone e tempo de infecção,

há uma clara separação entre os grupos controle e inoculado mostrando que

existem metabólitos gerais de uma infecção fúngica comuns a ambos os clones. E

por tipo de clone, os grupos controle foram discriminados mostrando que há

diferença no nível basal de metabólitos, assim como os clones inoculados foram

separados, evidenciado que há metabólitos específicos da infecção de cada clone,

devido à característica de resistência/suscetibilidade intrínseca de cada clone. Os

principais metabólitos associados com os clones inoculados em comparação com os

controles podem ser visualizados no VIP (Figura 30B) o qual destaca os íons de

maior significância para diferenciação dos dois agrupamentos observados.

69

Figura 30. Gráfico de escores PLS-DA dos clones de cacau Catongo e Scavina-6 controle e inoculados (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras de acordo com scores de VIP (B).

Para compreender melhor o efeito da inoculação do patógeno no decorrer do

tempo de infecção, os clones Catongo e Scavina-6 foram avaliados separadamente.

A análise multivariada por PLS-DA do clone Scavina-6 (resistente) revelou que

existem claramente duas fases distintas que podem ser denominadas: (i) a

penetração/sinalização da entrada do patógeno que corresponde ao início da

infecção (2 a 4 dias) e (ii) a colonização/incubação que pode corresponder também à

fase de resposta de defesa da planta (7, 10 e 15 dias) etapa na qual os metabólitos

aumentam de intensidade no decorrer do tempo de inoculação (Figuras 31A e 32A).

No clone Scavina-6 os principais metabólitos da Fase 1 (penetração/sinalização)

(Figura 31B) são distintos dos principais metabólitos da Fase 2

(colonização/incubação) (Figura 32B). No clone Catongo (suscetível), no entanto,

pode-se notar a ocorrência de três eventos distintos (Figuras 33A e 34A), sendo a

Fase 3 sintomática, que pode ser seguida da morte celular. Note que, no clone

suscetível ocorre baixa produção de metabólitos na Fase 1 (penetração/sinalização)

(Figura 33B) e na Fase 2 (colonização/incubação) (Figura 33B) as quais são etapas

cruciais para ativar os mecanismos de resistência. Entretanto, a Fase 3 sitomática,

caracterizada pelo tempo 15 dias, apresenta metabólitos com maiores abundâncias

relativas que se destacam na análise estatística de PLS-DA (Figuras 33B e 34B).

Os principais metabólitos que mais discriminam as amostras inoculadas dos clones

Catongo e Scavina-6 são diferentes entre si e são distintos daqueles metabólitos que

70

discriminam as amostras controle das inoculadas. Portanto, há metabólitos

específicos da resposta de defesa de um clone de acordo com a sua característica

resistente/suscetível, assim como existem metabólitos gerais da resposta de defesa

de qualquer clone a uma infecção fúngica.

Figura 31. Gráfico de escores PLS-DA do clone de cacau Scavina-6 inoculado (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras da Fase 1 no gráfico de pesos (loadings, B).

Figura 32. Gráfico de escores PLS-DA do clone de cacau Scavina-6 inoculado (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras da Fase 2 no gráfico de pesos (loadings, B).

71

Figura 33. Gráfico de escores PLS-DA do clone de cacau Catongo inoculado (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras da Fase 1 no gráfico de pesos (loadings, B).

Figura 34. Gráfico de escores PLS-DA do clone de cacau Catongo inoculado (A) e os principais íons que discriminam os grupos de amostras das Fases 2 e 3 no gráfico de pesos (loadings, B).

72

Os metabólitos candidatos a biomarcadores dos clones resistentes e

suscetíveis, e das fases (1) penetração/sinalização da entrada do patógeno e (2)

colonização/incubação que pode ocorrer em paralelo à resposta de defesa da planta,

foram “identificados” através de dados de massa exata dos íons e dos seus

fragmentos obtidos por MS/MS. Os metabólitos foram anotados através de busca

nos bancos de dados de espectros Metlin, HMDB, Keeg, LipidMaps e MINE

utilizando o sotware CEU Mass Mediator version 2.0

(http://ceumass.eps.uspceu.es/simple_search.xhtml), como mostrado na Tabela 3.

Tabela 3. Metabólitos anotados nas amostras dos clones Scavina-6 e Catongo infectados com M. perniciosa. Features* Metabólitos Fórmula Massa

(g/mol) Erro (ppm)

M338T20 13Z-Docosenamida C22H43NO 337.33447 1.4

M149T15 Ácido 4-metiltiol-2-oxobutanóico C5H8O3S 149.02415 2.6

M279T14 Metil-abscisato Ester C16H22O4 278.34351 0.5

M293T12 Ácido cis-(+)-12-oxo-fitodienóico C18H28O3 292.20385 1.3

M188T2 Ácido 3-indolacrilato C11H9NO2 187.06331 3.1

M610T22 Peonidina-3-rutinosideo C28H33O15 609.18194 5.9

M156T1 L-Histidina C6H9N3O2 155.06947 2.1

M381T1 O-acetilserina C13H21N2O7PS 380.08071 2.0

M311T10 Botridial C17H26O5 310.17802 1.1

M235T10 Pterosina C14H18O3 234.12559 8.9

M415T11 Clausarinol C24H30O6 414.20423 9.1

M235T12 Ácido valerênico C15H22O2 234.16210 1.3

M249T13 Ácido 2E,6Z,8Z,12E-hexadecatetraenóico C16H24O2 248.17763 5.2

M205T14 Ácido anofinico C12H12O3 204.07864 2.8

M307T15 Capsiato C18H26O4 306.18310 4.0

M593T17 Feoforbídeo a C35H36N4O5 592.26857 1.1

M211T8 Ácido (+)-epijasmônico C12H18O3 210.12559 5.1

M277T13 Ácido estearidônico C18H28O2 276.20893 2.3

M295T13 Ácido 2-hidroxilinolênico C18H30O3 294.21949 1.2

M610T22 Isopeonidina 3-rutinosideo C28H33O15 609.18194 7.8

*M = razão/massa carga do feature; T = tempo de retenção do feature.

http://ceumass.eps.uspceu.es/simple_search.xhtml

73

Com relação aos metabólitos anotados na Tabela 3, pode-se destacar: o

botridial é um metabólito fúngico citotóxico isolado de tecidos vegetais infectados

pelo fitopatógeno Botrytis cinérea que é o agente causal do mofo cinzento

responsável pelo decaimento pós-colheita de frutas e hortaliças frescas, possuindo

uma ampla variedade de hospedeiros (Malmierca et. al. 2016).

O feoforbídeo a é um fotossenbilizador, intermediário chave do catabolismo

da clorofila. A acumulação de feoforbídeo a causa morte celular em plantas

transgênicas de Arabidopsis thaliana (Hirashima et al. 2009).

O ácido (+)-epijasmônico é um hormônio vegetal que ajuda a regular o

crescimento e o desenvolvimento das plantas e atua na defesa contra patógenos

(Stenzel et. al. 2003).

II. 4 – Conclusões

A análise metabolômica por espectrometria de massas possibilitou a

discriminação das fases de infecção do clone resistente (Scavina-6) e suscetível

(Catongo) infectados pelo Moniliophthora perniciosa. Os principais metabólitos

candidatos a biomarcadores das fases de infecção (i) penetração/sinalização da

entrada do patógeno, (ii) colonização/incubação que pode estar associada com a

resposta de defesa e (iii) sintomas que pode ser seguida de morte celular, foram

anotados. Os metabólitos pertencem a diversas classes, principalmente,

sesquiterpenos, flavonoides, ácidos orgânicos, ésteres, compostos fenólicos e

oxilipinas. Os resultados obtidos podem levar à melhor compreensão dos níveis de

resistência e suscetibilidade das variedades de cacaueiro Scavina-6 e Catongo

contra M. perniciosa e revelar os principais metabólitos de resistência do cacaueiro.

Por isso, pode orientar as estratégias de melhoramento vegetal, a prospecção de

micro-organismos antagônicos aos patógenos e até mesmo o melhoramento

genético do cacaueiro indicando quais os metabólitos que os novos genes

introduzidos precisariam expressar para a resistência do cacaueiro.

74

CAPÍTULO III

METABOLÔMICA DE CLONES RESISTENTES E SUSCETÍVEIS DO CACAUEIRO

INFECTADOS POR Ceratocystis cacaofunesta (MURCHA DE CERATOCYSTIS)

75

III.1 – Objetivos

III.1.1 – Objetivo geral


diferenciar os níveis de resistência/suscetibilidade de clones do cacau ao

Ceratocystis cacaofunesta.

III.1.2 – Objetivos específicos

Identificar os principais metabólitos produzidos na interação cacau-

Ceratocystis cacaofunesta;

Identificar os principais metabólitos que discriminam clones de cacau

resistentes e suscetíveis;

III.2 – Parte Experimental

III.2.1- Ensaio biológico da murcha de Ceratocystis para avaliação da

resistência/suscetibilidade de clones de cacau

O experimento foi conduzido em casa de vegetação no Centro de Pesquisa

do Cacau - CEPEC/CEPLAC em Ilhéus, Bahia, onde foram testadas mudas com

quatro meses de idade dos clones JACA (controle resistente), TSH-1188, CCN-51,

CEPEC-2002 e SJ02 (controle suscetível). Os testes de resistência/suscetibilidade

dos clones infectados por C. cacaofunesta foram realizados utilizando-se os isolados

Cc20, Cc91, Cc97, Cc138 e Cc141 da Coleção de Ceratocystis da Seção de

Fitopatologia do Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC) (Figura 35). Os isolados

foram cultivados em placas de Petri de 9 mm de diâmetro contendo BDA por 10 dias,

no escuro à 25ºC. Em seguida, adicionou-se 50 mL de água estéril às placas e a

suspensão foi transferida para tubo de ensaio, agitada por vórtex a 2000 rpm

durante 2 min. A suspensão foi filtrada em gaze dobrada quatro vezes e a

concentração foi ajustada para 3,0 x 104 UFC/mL, adicionado três gotas/mL de

Tween 20. Para inoculação das mudas dos clones foi realizada uma incisão no caule

com auxílio de bisturi, no sentido horizontal acima do primeiro entrenó e

depositando-se 30 µL do inóculo (Oliveira et al., 2009) e em seguida, abaixo da

incisão foi colocada uma mecha de algodão umedecido em água estéril preso por

uma fita vedante a base de PTFE, para formar uma câmara úmida e criar condições

para o fungo penetrar e colonizar os tecidos do hospedeiro. Após 48 h da

76

inoculação, a fita vedante e o algodão foram retirados para melhorar a aeração do

local inoculado. Aos 20 dias após a inoculação os caules foram cortados e

armazenados em nitrogênio líquido.

Infecção por C. cacaofunesta

Genótipo avaliado

Genótipo controle

Metabolômica da interação patógeno-

hospedeiroTheobroma cacao vs


Genótipo resistente (JACA)

CCN-51

Cc20, Cc91, Cc97, Cc138, Cc141

TSH-1188

Cc20, Cc91, Cc97, Cc138, Cc141

Genótipo suscetível (SJ02)

CEPEC-2002

Cc20, Cc91, Cc97, Cc138, Cc141

Fase sintomática

Figura 35. Delineamento do experimento biológico da inoculação de Ceratocystis cacaofunesta em clones de cacau JACA, SJ02, CCN-51, TSH-1188 e CEPEC2002.

O preparo de amostra consistiu em macerar os caules em nitrogênio líquido e,

do pó triturado 100 mg foram pesados em microtubos. Os metabólitos foram

extraídos com 1 mL de metanol sob agitação por vórtex durante 15 min, e em

seguida, centrifugados durante 5 min a 13,000 g. O sobrenadante foi filtrado através

de um filtro de seringa (nylon 0,22 μm) e 50 µL do filtrado foi diluído em 950 µL de

metanol.

III.2.2 - Análise dos metabólitos da interação C. cacaofunesta x T. cacao

por LC-MS

Os metabólitos foram analisados usando um sistema LC-MS Agilent 1290 Infinit

acoplado com um espectrômetro de massas Agilent 6550 Q-TOF/MS equipado com

uma fonte eletrospray (ESI). Uma alíquota de 1 µL dos extratos das amostras foi

injetado automaticamente usando um amostrador automático. Os metabólitos foram

separados através de uma coluna Poroshell UHPLC Kinetex XB-C18 150 x 2,1mm,

de partículas 1,7 μm. A fase móvel foi constituída de água com 0,1% de ácido

fórmico (A) e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico (B), em modo gradiente, no qual

B variou de 5 a 95% com gradiente constante de 5% min-1 durante 25 min e

77

permaneceu em 95% de B por 10 min, com vazão de 0,40 mL min-1, totalizando 35

min de corrida cromatográfica. O espectrômetro de massas com analisador Q-TOF

operou nas seguintes condições: faixa de aquisição m/z 100 – 1500 e 1 espectro/s;

Fonte de ionização eletrospray Dual AJS ESI operando no modo positivo de

ionização com vazão do gás de secagem (N2) 12 L min-1, temperatura do gás de

secagem (N2) 350°C, gás de nebulização (N2) 45 psig, vazão do gás de nebulização

(N2) 12 L min-1 e temperatura da fonte 290°C; voltagem do capilar 3,5 kV, Nozzle

Voltage 320 V, fragmentor 100 V, Skimmer 65 V, Octapolo RF 750.

III.2.3 - Análise estatística multivariada dos dados

A aquisição dos dados foi realizada utilizando o MassHunter (Agilent Software

B6.0) no qual os cromatogramas brutos foram convertidos para o formato .mzdata.

No software XCMS (Smith et al., 2006) versão online os arquivos foram processados

para correção dos tempos de retenção, alinhamento dos picos, extração dos íons e

analise de significância estatística por ANOVA e o teste paramétrico não pareado t-

test (Welch t-test). Os dados corrigidos de razão m/z, tempo de retenção e

intensidade dos íons foram convertidos para o formato .csv e processados no

Metaboanalyst 3.0 versão online (Xia et al., 2015; Xia et al., 2016). No

Metaboanalyst os dados foram processados para filtrar os íons correspondentes a

maioria das amostras, normalizados, redimensionados, centralizados para colocar

todas as amostras e variáveis em uma escala comparável e foram construídos os

modelos multivariados de partial least squares–discriminant analysis (PLS-DA),

orthogonal partial least squares–discriminant analysis (OPLS-DA).

III.3 – Resultados e discussão

O método LC-MS desenvolvido e otimizado para análise das amostras de

caule, foi empregado nas análises dos metabólitos dos clones SJ02 (controle

suscetível), CEPEC-2002, CCN-51, TSH-1188 e JACA (controle resistente)

inoculados com isolados de Ceratocystis cacaofunesta (Cc) de diferentes

agressividades (Cc20, Cc91, Cc97, Cc138 e Cc141). Pode-se notar diferenças de

intensidade de alguns picos cromatográficos entre os clones avaliados (Na Figura

36A). O número de íons com significância estatística pela ANOVA foi relativamente

alto, 2985 com valor de p<0.01 (Figura 36B).

78

Para reduzir a dimensão dos dados e revelar os íons com maior poder de

discriminação dos clones resistentes e suscetíveis, a análise multivariada por PLS-

DA foi aplicada aos dados. Interessante notar que, pelo PLS-DA (Figura 37A) pode-

se observar claramente a discriminação dos clones em dois agrupamentos principais

que corresponde aos clones mais suscetíveis (SJ02 e CEPEC-2002) e mais

resistentes (CCN-51, TSH-1188 e JACA). Os íons com maior poder de discriminação

e maior influência nos clones suscetíveis são mostrados no gráfico de pesos

(loadings dos íons) na Figura 37B.

A B

Mass Hunter Agilent

Figura 36. Cromatogramas LC-MS das amostras de caule dos clones CCN-51, TSH-1188, JACA, SJ02 e CEPEC-2002 inoculados, alinhados no XCMS (A) e íons extraídos dos espectros com significância estatística pela ANOVA (p<0.01).

79

A B

Clones suscetíveis

Clones resistentes

Figura 37. Gráfico de escores O-PLS-DA dos clones de cacau CCN-51, TSH-1188, JACA, CEPEC-2002 e SJ02 inoculados (A) e gráfico de loadings dos principais íons que discriminam os grupos resistente e suscetível.

A classificação dos clones a partir dos resultados de análise de metabólitos e

do PLS-DA é condizente com a classificação proposta pelos estudos que avaliaram

as características fitopatológicas e agronômicas. O estudo de inoculação de discos

de folhas dos mesmos clones, que quantificou os peritécios (unidades fúngicas

infectivas) formados nas folhas, classificou os clones JACA e TSH-1188 como

resistentes e o clone SJ02 como o mais suscetível. No entanto, esse estudo não

definiu a classificação dos clones CCN-51 e CEPEC-2002 devido a quantidade de

peritécios formados nos discos de folhas ser muito semelhantes entre os dois clones

(Magalhães et al. 2016). O estudo em mudas propagadas por estaquia classificou o

clone TSH-1188 como resistente e os clones CCN-51 e SJ02 como suscetíveis

(Sanches et al. 2008, Silva et al. 2012), o que contradiz, em princípio, os resultados

observados neste trabalho com relação ao CCN-51, visto que a análise de

metabólitos com auxílio de PLS-DA indica um comportamento do CCN-51 muito

contrastante com o grupo suscetível, sugerindo uma característica intermediária

entre o grupo muito suscetível e o grupo muito resistente.

Para compreender melhor os níveis de resistência dos clones CCN-51, JACA

e TSH-1188 e sugerir uma classificação mais coerente com os dados agronômicos e

80

fitopatologia, foi realizada a análise multivariada por PLS-DA (Figura 38A) desses

clones, retirando da análise os clones muito suscetíveis, a fim de verificar quais

metabólitos são mais discriminantes do grupo mais resistente. Os resultados

evidenciam um gradiente no nível de resistência dos clones que vai do CCN-51

(menos resistente), passando pelo JACA (resistente) até o TSH-1188 (resistente).

Os metabólitos com maior poder de discriminação no gráfico dos pesos (loadings,

Figura 38B) são responsáveis pela discriminação dos clones em diferentes níveis de

resistência como consequência da resposta de defesa dos clones à inoculação.

A B

Moderado

Alta resistência

Baixa resistência

Figura 38. Gráfico de escores PLS-DA dos clones de cacau CCN-51, TSH-1188 e JACA inoculados (A) e gráfico de loadings dos principais íons que discriminam o clone mais resistente TSH-1188 dos clones CCN-51 e JACA.

Os metabólitos candidatos a biomarcadores dos clones resistentes e

suscetíveis foram “identificados” através de dados de massa exata dos íons e dos

seus fragmentos obtidos por MS/MS. Os metabólitos foram anotados através de

busca nos bancos de dados de espectros Metlin, HMDB, Keeg, LipidMaps e MINE

utilizando o sotware CEU Mass Mediator version 2.0

(http://ceumass.eps.uspceu.es/simple_search.xhtml), como mostrado nas Tabelas 4

e 5.

http://ceumass.eps.uspceu.es/simple_search.xhtml

81

Tabela 4. Metabólitos anotados nos clones CCN-51, JACA e TSH1188 (resistentes) infectados por C. cacaofunesta. Features* Metabólitos Fórmula Massa

(g/mol) Erro (ppm)

M182T1 Metilselenopiruvato C4H6O3Se 181.94821 1.8

M198T1 L-histidina trimetilbetaína C9H15N3O2 197.11642 1.2

M104T1 Neurina C5H13NO 103.09971 1.9

M130T1 Ácido piroglutâmico C5H7NO3 129.04259 0.9

M159T1 5-hidroxiectoina C6H10N2O3 158.06914 1.3

M174T1 N-Acetil-L-glutamato 5-semialdeído C7H11NO4 173.06880 1.1

M143T1 Ectoína C6H10N2O2 142.07423 1.2

M118T1 L-valina C5H11NO2 117.07897 1.4

M116T1 Ácido 4-amino-2-metilenobutanóico C5H9NO2 115.06332 2.1

M144T1 Ácido L-2-amino-3-metilenohexanóico C7H13NO2 143.09462 1.1

M128T1 (S) -2,3,4,5-Tetrahidropiperidina-2-carboxilato C6H9NO2 127.06332 0.9

M219T7 Albaflavenona C15H22O 218.16711 3.2

M227T7 Dihidrojasmonato de metila C13H22O3 226.15689 2.2

M225T9 Metil (+)-7-isometiljasmonato C13H20O3 224.14124 3.5

M315T9 Ácido 7,8-di-hidropteroico C14H14N6O3 314.11273 9.7

M237T9 Capisidiol C15H24O2 236.17763 3.3

M343T9 Desoximiroestrol C20H22O5 342.14672 3.5

M387T9 Isogingerenona B C22H26O6 386.17293 1.3

M517T10 cucurbitacina D C30H44O7 516.30870 1.5

M191T10 Ácido 3,5,7,9,11-dodecapentaenóico C12H14O2 190.09938 2.1

M209T10 Ácido 12-oxo-5E, 8E, 10Z-dodecatrienóico C12H16O3 208.10994 2.2

M293T10 Trichodermina C17H24O4 292.16746 1.3

M295T10 Gingerol C17H26O4 294.18311 0.9

M359T10 (-) – Matairesinol C20H22O6 358.14163 1.1

M229T11 Resveratrol C14H12O3 228.07864 0.5

M337T11 Dulciol D C20H16O5 336.09977 8.7

M197T11 Acetato de linalilo C12H20O2 196.14633 1.5

M455T12 Ácido pantotênico C29H42O4 454.30830 1.2

M294T13 Nonivamida C17H27NO3 293.19909 1.5

M163T13 Cinamato de Metila C10H10O2 162.06815 2.3

M221T14 Solavetivol C15H24O 220.18272 2.1

M223T14 Germacradienol C15H26O 222.19846 1.9

M282T15 Oleamida C18H35NO 281.27186 2.8


82

Tabela 5. Metabólitos anotados nos clones Cepec2002 e SJ02 (suscetíveis) infectados por C. cacaofunesta.

Features* Metabólitos Fórmula Massa (g/mol)

Erro (ppm)

M156T1 Fosfato de (S) -1-aminopropan-2-ilo C3H10NO4P 155.03475 2.2

M143T1 Ectoína C6H10N2O2 142.07423 1.2

M146T1 Ácido 4-guanidinobutírico C5H11N3O2 145.08512 3.5

M193T5 Dehidrozingerona C11H12O3 192.07863 1.4

M235T8 Artemidiol C13H14O4 234.08920 2.3

M193T8 2,4-diisopropil-3-metilfenol C13H20O 192.15141 2.1

M225T9 Elimoclavina C16H18N2O 254.14191 5.3

M387T9 Isogingerenona B C22H26O6 386.17293 1.3

M541T10 Condurangogenina C C32H44O7 540.30875 7.9

M501T10 Ácido Ganolucídico D C30H44O6 500.31378 4.7

M309T10 Toxina ACRL II C17H24O5 308.16237 4.8

M191T10 N-butilftalida C12H14O2 190.09937 2.3

M329T10 2-Hidroxi-7,8-dehidrograndiflorona C19H20O5 328.13107 3.9

M235T10 N Piterosina C14H18O3 234.12448 4.7

M295T11 Gingerol C17H26O4 294.18159 5.1

M359T11 dihidrocubebina C20H22O6 358.14166 3.6

M167T11 Paenol C9H10O3 166.06299 2.3

M195T11 Metoxieugenol C11H14O3 194.09429 1.8

M220T11 Dodecanamida C12H25NO 199.19361 0.9

M229T11 Xantiletina C14H12O3 228.07864 3.1

M237T13 Curdiona C15H24O2 236.17765 3.8

M437T14 k-estrofantósideo C42H64O19 872.40418 7.1

M221T14 (5S) –Albaflavenol C15H24O 220.18273 3.5

M223T14 Cedrol C15H26O 222.19836 2.1

M282T15 Oleamida C18H35NO 281.27186 2.8

M600T15 N- (3E-hexadecenoil) -desoxisfing-4-eno-1-sulfonato C34H65NO5S 272.1764 4.5

M256T16 Palmitamida C16H33NO 255.25621 2.6

M311T16 2,3-desidrosalvipisona C20H22O3 310.15689 3.9

M310T16 N-hexadecanoilpirrolidina C20H39NO 309.30316 3.1

M251T17 8,11-Heptadecadienal C17H30O 250.22966 3.3


83

Com relação aos metabólitos anotados na Tabela 4, pode-se destacar: o metil

jasmonato é um importante regulador celular envolvido em diversos processos,

como germinação de sementes, crescimento de raízes, fertilidade, amadurecimento

de frutos e senescência. Além disso, os jasmonatos ativam os mecanismos de

resposta de defesa contra insetos, patógenos e estresses abióticos como seca,

baixa temperatura e salinidade (Cheong e Do Choi, 2003).

O capsidiol é a principal fitoalexina sesquiterpênica bicíclica do tabaco

(Nicotiana tabacum) e da pimenta malagueta (Capsicum annuum). A produção de

metabólitos antimicrobianos conhecidos como fitoalexinas é considerada como uma

das principais barreiras para inibir o desenvolvimento de patógenos em tecidos

vegetais infectados (Maldonado-Bonilla et. al. 2008).

O deoxymiroestrol é um fitoestrogênio altamente ativo derivado das raízes de

Pueraria candollei var. mirifica (Udomsuk et. al. 2012).

Com relação aos metabólitos anotados na Tabela 5, pode-se destacar: a

dehidrozingerona é um análogo estrutural da curcumina isolada de rizomas de

gengibre que apresenta propriedades antioxidantes, antibacterianas e antifúngicas

(Kubra et. al. 2014).

A xantiletina é uma cumarina isolada das espécies Citrus. Diversas atividades

biológicas, como atividade antitumoral e antibacteriana e inibição do fungo simbiótico

cultivado por formigas cortadeiras têm sido associadas a esse composto (Cazal et.

al. 2009).

O cedrol, um álcool sesquiterpénico, é o primeiro atrativo de oviposição

identificado para os vetores da malária africana. Estudos sugerem que o cedrol pode

ser um metabólito fúngico presente no óleo essencial de rizomas de gramíneas

(Eneh et. al. 2016).

84

III.4- Conclusões

A análise metabolômica por espectrometria de massas possibilitou a

discriminação dos clones resistentes (CCN-51, JACA e TSH-1188) e suscetíveis

(SJ02 e CEPEC2002) ao Ceratocystis cacaofunesta. Os principais metabólitos

candidatos a biomarcadores de resistência ou suscetibilidade foram anotados e

diferem principalmente entre os clones resistentes e suscetíveis. Os metabólitos

pertencem a diversas classes, principalmente, sesquiterpenos, flavonoides, ácidos

orgânicos, ésteres, compostos fenólicos, oxilipinas, alcaloides, fenilpropanóides,

triterpenos, lipídios e naftoquinonas. Os resultados obtidos podem levar à melhor

compreensão dos níveis de resistência e suscetibilidade das variedades de

cacaueiro contra Ceratocystis cacaofunesta e revelar os principais metabólitos de

resistência do cacaueiro. Por isso, pode orientar as estratégias de melhoramento

vegetal, a prospecção de micro-organismos antagônicos aos patógenos e até

mesmo o melhoramento genético do cacaueiro indicando quais os metabólitos que

os novos genes introduzidos precisariam expressar para a resistência do cacaueiro.

85

CONCLUSÕES GERAIS

86

Este trabalho mostra importantes avanços na caracterização de fitopatógenos

por perfis moleculares de peptídeos/proteínas e lipídios por MALDI-MS e na

diferenciação de oito espécies de gêneros distintos que são Moniliophthora

perniciosa, Phytophthora capsici, P. palmivora, P. citrophthora e P. heveae,

Ceratocystis cacaofunesta, C. fimbriata e C. paradoxa que são difíceis de discriminar

morfologicamente. Os resultados ainda mais relevantes são a diferenciação dos

isolados de M. perniciosa, obtidos de caule e fruto de Theobroma cacao, bem como

a diferenciação dos isolados de Phytophthora palmivora obtido de Theobroma cacao

e Carica papaya; Phytophthora capsici obtido de Theobroma cacao e Hevea

brasiliensis; Phytophthora citrophthora obtida de Theobroma cacao; Phytophthora

heveae de Theobroma cacao e solo; Ceratocystis cacaofunesta obtido de

Theobroma cacao; Ceratocystis fimbriata obtido de Eucalyptus spp. e Hevea

brasiliensis; Ceratocystis paradoxa proveniente de Cocos nucifera.

As análises metabolômicas em plantas de cacau resistentes e suscetíveis

infectadas por Moniliophthora perniciosa permitiram verificar diferentes metabólitos

produzidos em cada interação especifíca, sendo as principais classes,

sesquiterpenos, flavonoides, ácidos orgânicos, ésteres, compostos fenólicos e

oxilipinas. As três principais fases de infecção foram discriminadas, baseado nos

perfis de metabólitos produzidos: (i) penetração/sinalização da entrada do patógeno;

(ii) colonização/incubação que pode desencadear uma resposta de defesa da planta;

(iii) sintomática que pode resultar na morte celular. Os principais metabólitos em

cada uma dessas fases foram identificados.

As análises metabolômicas em plantas de cacau resistentes e suscetíveis

infectadas por Ceratocystis cacaofunesta possibilitaram discriminar corretamente os

níveis de resistência dos clones CCN-51, TSH-1188, JACA, SJ02 e CEPEC-2002.

Os metabólitos responsáveis pelos diferentes níveis de resistências dos clones

foram identificados, sendo as principais classes, sesquiterpenos, flavonoides, ácidos

orgânicos, ésteres, compostos fenólicos, oxilipinas, alcaloides, fenilpropanóides,

triterpenos, lipídios e naftoquinonas.

As metodologias analíticas desenvolvidas para detecção de plantas

infectadas na fase assintomática e avaliação dos níveis de resistência de clones

poderão ser usadas no monitoramento de plantas infectadas nas lavouras

cacaueiras contribuindo para orientar as estratégias de manejo. Finalmente, a

87

identificação dos principais candidatos à biomarcadores de resposta de defesa dos

clones poderá estimular trabalhos futuros para o biocontrole dos patógenos através

do teste da ação antifúngica desses metabólitos.

88

PERSPECTIVAS

89

Analisar diretamente frutos e amêndoas de cacau infectadas para tentar

detectar e identificar os fitopatógenos sem isolamento e discriminar misturas

de fitopatógenos;

Avaliar os metabólitos dos clones Catongo e Scavina-6 em 30, 45 e 60 dias

que corresponde à fase sintomática da doença vassoura de bruxa e identificar

os principais candidatos a biomarcadores das fases de infecção;

Avaliar os metabólitos dos clones CCN-51, TSH-1188, JACA e SJ02 em

diferentes tempos de infecção e comparar o comportamento com a tendência

observada para a doença vassoura de bruxa;

Identificar os principais candidatos a biomarcadores da infecção por

Ceratocystis cacaofunesta em diferentes tempos de infecção;

Avaliar os metabólitos em discos de folhas dos clones SIC-23, Scavina-6 e

JACA, infectados por Phytophthora palmivora, e comparar o comportamento

com a tendência observada para as doenças vassoura de bruxa e murcha de

Ceratocystis.

90

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