Universidade Estadual de Campinas Unicamp Faculdade de Engenharia de Alimentos FEA

TA514 Bioqumica Prof. Dr. Hlia Harumi Sato

Efeito do pH na Estabilidade das Enzimas

Turma C Grupo 3 Beatriz Momesso Paulino 042158 Enos Itiro Suga 043189

1. Introduo Os fatores que influenciam a estabilidade de um enzima so aqueles que afetam as estruturas secundrias, terciria e quaternria da pretena. A determinao da faixa de pH de estabilidade de uma enzima til para a manuteno da enzima na forma ativa durante a reao enzimtica ou para a inativao da mesma quando necessrio. Muitas enzimas se desnaturam irreversivelmente em solues muito cidas ou muito alcalinas. O pH de estabilidade de uma enzima freqentemente influenciado pela presena ou aunsncia de cofatores ou outras molculas de baixo peso molecular. A temperatura um parmetro extremamente crtico na determinao da estabilidade de enzima. O efeito do pH na estabilidade de uma enzima modificado por outros fatores como tipo e concentrao do tampo, presena ou ausncia de substrato, fora inica, constante dieltrica do meio (modulada pela adio de solventes orgnicos como etanol) e efeito do pH na estabilidade de cofatores e ativadores. A invertase ou b-frutofuranosidase catalisa a hidrlise da sacarose em glicose ou frutose. A invertase utilizada na produo de acar invertido. Este ltimo apresenta menor capacidade de cristalizao que a sacarose e utilizado em compotas, doces e produtos de panificao. A invertase comercial pode ser obtida de leveduras como Sacharomyces cerevisiae e de fungos como Aspergillus niger.

2. Objetivos Determinar a faixa de pH de estabilidade da invertase comercial de Sacharomyces cervisiae.

3. Reviso bibliogrfica O efeito do pH na estabilidade das enzimas pode ser claramente

distinguida do efeito do pH na atividade cataltica. Todas as enzimas so protenas, portanto fatores que influenciam a estabilidade de uma enzima so aquelas que afetam as etruturas secundrias, tercirias e/ou quaternrias. Por exemplo, a maioria das enzimas sofrem desnaturao irreversvel em solues muito cidas ou muito alkalinas. O pH em que isso ocorre varia com a enzima. A pesina, enzima proteoltica do entmago, rapidamente inativada no pH 7, uma vez que bastante estvel em pH 2. A fosfatase alcalina do leite muito estvel entre as regies de pH 7 a 9, mas acima de pH 9,5 rapidamente inativada. (WHITAKER, 1994)

A estabilidade de uma enzima modificada por um nmero de fatores. Considerando o efeito do pH na estabilidade da tripsina. A forma da curva de estabilidade funco das condies de incudao. Aps 24 horas de incubao a 30C, o pH de estabilidade mxima est em pH 2,5, enquanto a quantidade de atividade em pH 1 e 8 so bastate baixas. (WHITAKER, 1994)

As foras que mantm a cadeia de protena na sua particular forma resulta de um nmero de interaes envolvendo a estrutura peptidica (a-hlice)

e os gupos R do aminocido que formam a protena. Os grupos R do aminocido podem ser carregados positivamente ou negativamente dependendo do pH da soluo. Em um pH neutro, a maioria das protenas possuem cargas positivas e negativas disponveis ao longo da cadeira de aminocido. Cargas opostas atraem umas as outras enquanto cargas iguais se repelem. Contudo as foras no to intensas essas repulses/atraes so importantes para manter a estrutura tridimensional (terciria) da protena o qual muito importante para sua funcionalidade. (MATHEWSON, 1998)

4. Materiais e mtodos 4.1. Materiais

- Oito tubos de ensaio contendo 0,1mL de invertase previamente incubado em diferentes valores de pH (pH 2,6 a 10) durante 1 hora a 50C. (Para o estudo fdo efeito do pH na estabilidade da invertase, misturas de 5mL de soluo de invertase (50mg/100mL) + 10mL de solues tampo 0,1M de diferentes valores de pH foram previamente incubadas durante 1 hora a 50C.)

- Soluo Tampo Acetato 0,1M pH 4,5. - Soluo 1% de sacarose em Tamo Acetato 0,1M pH 4,5. - Reagente de Somogyi-Nelson I (SNI) - Reagente de Somogyi-Nelson II (SNII) - 18 tubos de ensaio - Pipetas - Espectrofotmetro - gua destilada

4.2. Mtodos 4.2.1. Ajuste das solues enzimticas pr-incubadas em diferentes valores de pH a 50C durante 1 hora, para pH 4,5

Adicionaram-se 14,9mL de soluo Tampo Acetato 0,1M pH 4,5 nos oito tubos de ensaio contendo 0,1mL de soluo de invertase pr-incubada em diferentes valores de pH a 50C durante 1 hora.

Determinou-se a atividade de invertase residual em cada tubo de ensaio como descrito a seguir.

4.2.2 Determinao da atividade residual de invertase aps incubao em solues tampo de diferentes valores de pH Distribuiram-se 4mL de soluo 1% de sacarose em Tampo Acetato 0,1M pH 4,5 em 9 tubos de ensaio previamente numerados pH 2,6 a 10 (Tabela 1) e um Branco e incubou-se por 10 minutos a 40C para equilibrar a temperatura. Adicionou-se 1mL de soluo enzimtica diluida (4.2.1) nos respectivos tubos de ensaio contendo substrato e incubaram-se durante 20 minutos a 40C. No tubo Branco adicionou-se 1mL de gua destilada no lugar da enzima e incubou-se tambm por 20 minutos a 40C.

Aps a incubao retiraram-se os tubos de ensaio do banho-maria, colocaram-se os tubos em banho de gelo para paralizar a reao enzimtica e determinar os acares redutores formados pelo mtodo de Somogyi-Nelson.

4.2.3 Determinao de acares redutores pelo mtodo de Somogyi-Nelson Pipetou-se 0,5mL de amostra + 1mL de reagente SNI em 9 tubos de

ensaio numerados conforme a Tabela 1. Agitaram-se os tubos colocando-os em banho maria em ebulio por 6

minutos. Retiraram-se os tubos e colocaram-se em banho de gelo at resfriar a

temperatura ambiente. Retiraram-se os tubos do banho de gelo e adicionou-se 1mL de reagente

SNII em cada tubo. Agitou-se os tubos deixando-os repousar por 5 minutos. Adicionaram-se

10mL de gua destilada misturando-os por inverso. Calibrou-se o espectrofotmetro com a soluo Branco, medindo ento

a absorbncia a 540nm contra tubo Branco.

5. Resultados e discuo

5.1 Resultados Aps a utilizao do espectrofotmetro e da realizao dos clculos dos

valores de atividade relativa obteve-se os dados mostrados na Tabela 1. Com esses dados foi traado o Grfico 1.

Tabela 1 - Efeito do pH na Estabilidade da Invertase Efeito do pH na Estabilidade da Invertase

Solues Tampo Abs 540nm Unidade de Atividade de Invertase (U/mL)

% Atividade Relativa

pH 2,6 (T. Citrato Fosfato) 0 0 0 pH 3,6 (T. Acetato) 0,252 5,04 48,18 pH 4,5 (T. Acetato) 0,523 10,46 100 pH 5,0 (T. Acetato) 0,447 8,94 85,46 pH 6,0 (T. Fosfato) 0,061 1,22 11,66 pH 7,0 (T. Fosfato) 0 0 0 pH 8,0 (T. Fosfato) 0 0 0 pH 10 (T. Borato-NaOH) 0 0 0

Grfico 1 - % Atividade Relativa

% Atividade Relativa

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12

A tabela 2 mostra diferentes concentraes de gicose pela absorbncia e o grfico 2 a concentrao de glicose pela Abs 540nm Femto III e a curva ajustada. Podemos ento utilizar a quarta coluna desta tabela para calcular a concentrao de glicose no pH timo.

Tabela 2 - Curva padro de glicose Curva padro de glicose

Concentrao de glicose mg/mL

Abs - 540nm Femto I

Abs - 540nm Femto II

Abs - 540nm Femto III

0,025 0,044 0,047 0,043 0,05 0,116 0,115 0,108 0,1 0,211 0,21 0,195 0,15 0,321 0,321 0,305 0,25 0,502 0,5 0,479 0,3 0,644 0,642 0,618 0,4 0,848 0,842 0,81

Grfico 2 - Concentrao de glicose mg/mL - Abs - 540nm Femto III

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0,350,4

0,45

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

A curva ajustada tem equao y = 0,000834075 + 0,494849562 * x Conclui-se que a concentrao de glicose em pH 4,5 de 0,25964mg/mL

5.2. Discues De acordo com (WANG, 1996), ao contrrio da maioria das enzimas, a

invertase exibe relativamente alta atividade por uma ampla srie de pH (3,505,5), com o timo perto de pH 4,5. A atividade da enzima atinge um mximo em torno de 55C. Os valores de Michaelis-Menten de um variedade grande de enzimas, mas para a maioria das enzimas o Km entre 2mM e 5mM. O valor de Michaelis-Menten para enzimas livres normalmente prximo de 30mM. A anlise do grfico obtido demonstra que a estabilidade mxima para as condies do experimento condizem com os resultados descritos na literatura.

A invertase uma enzima muito utilizada na indstria alimentcia e utilizada para a fabricao de acar invertido, que tambm chamado de acar lquido. Este tipo de acar utilizado, principalmente, na indstria de refrigerantes e alimentos congelados, pois tem maior poder adoante e no cristaliza em baixas temperaturas. Tambm pode substituir o mel natural, sendo utilizado como xarope. Estes xaropes tambm so usados na fabricao de medicamentos. A invertase uma enzima de baixo custo, encontrada na levedura Saccharomyces cerevisiae, mais conhecida como fermento de po ou fermento biolgico. A invertase capaz de transformar o acar de cana-de-acar em acares mais simples, ou seja, a sacarose em dextrose e levulose.

6. Concluso Este mtodo demosntrou que o pH um dos fatores que influenciam drsticamente a estabilidade das enzimas. O conhecimento dos valores de pH timo tanto para atividade como para a estabilidade de suma importncia para

o controle de processos na indstria de alimentos, pois est diretamente relacionada a rendimentos em uma linha de produo.

7. Referncias Bibliogrficas MATHEWSON, P. R. Enzymes: Practical Guide For The Food Industry, Minnesota, 1998, p. 8-9

WHITAKER, J. R. Principles of Enzimology for the Food Sciences, New York, ed. 2, p. 276-277

WANG, N. S. Experiment no 14 Enzyme Kinetics of Invertase via initial rate determination, department of Chemical & Biomolecular Engineering, Maryland, 1996