Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Os Efeitos do Laser de Baixa Potência na Cicatrização em Lesões Térmicas: Análise

Quantitativa do Colágeno.

Luís Ferreira Monteiro Neto

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.

São José dos Campos - SP

2004

Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Os Efeitos do Laser de Baixa Potência na Cicatrização em Lesões Térmicas: Análise

Quantitativa do Colágeno.

Luís Ferreira Monteiro Neto

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.

Orientador: Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco

São José dos Campos - SP

2004

Dedicatórias A minha esposa, Renata Bedaque Mugayar Monteiro, pois sem sua sabedoria, paciência e amor jamais teria suportado os obstáculos que me fizeram chegar até aqui e me deram tranqüilidade e harmonia, sabendo que nossos filhos estavam em boas mãos. Aos meus filhos Matheus e Amanda que no futuro me desculpem por ficar tanto tempo ausente e às vezes perder momentos importantes da vida de vocês, saibam que tudo isso é por vocês. Aos meus pais, Iracy e Vladimir (in memorian), que tantas vezes abriram mão dos seus sonhos para que os meus pudessem ser realizados. A minha família por todo apoio e por acreditarem em mim. A Deus por caminhar sempre ao meu lado, mesmo quando não merecia.

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco, orientador e educador pelo conhecimento, atenção e paciência e pelo pleno apoio na realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos. Aos meus diretores padres Prof. Ms. Paulo Vendrame , Prof. Dr. Afonso de Castro, Prof. Edmilson Tadeu, pelo acolhimento recebido durante a realização deste trabalho e principalmente pela ajuda espiritual. Ao meu coordenador Prof. Ms.Evandro Emanoel Sauro , que foi mais que um coordenador, muitas vezes me tratou como filho incentivando e motivando no decorrer deste tempo, obrigado por acreditar em mim.

As Colegas fisioterapeutas, Lorão, Preta, Tathiana, Rafael, Luciano, Juliana, obrigado pela imensa colaboração no trabalho. Ao Prof. Cristiano Manoe l pela atenção e ensinamentos no trabalho experimental. Ao Prof. Dr. Altino de Menenez do laboratório de analises clinicas do Hospital das Clínicas de Marilia, pela colaboração. As colegas Claudia e Ivone , da secretaria do IP&D por toda ajuda dada neste período. Aos colegas de mestrado, em especial ao colega Prof. Ms. Marcos Pereira Brito pelos ensinamentos de como a vida deve ser levada de maneira simples e com lealdade.

RESUMO

O objetivo deste trabalho é descrever, de forma comparativa, os efeitos da

irradiação Laser de baixa potência GaAlAs e InGaAlP, no processo de cicatrização

tecidual, demonstrando em estudos quantitativos se há aumento do colágeno nas

amostras analisadas. A partir dessa análise, intenciona-se demonstrar qual a técnica que

é mais eficaz, comparando estatisticamente os resultados obtidos. Sendo assim, optou-se

por realizar este estudo experimental, pois sabe-se que as agressões em um tecido

causadas por lesões térmicas atingem desde a camada mais superficial até as camadas

mais profundas da pele. No presente trabalho foram utilizados seis grupos de ratos da

raça Wistar, sendo 4 grupos experimentais, um controle e um placebo, os quais sofreram

lesões térmicas seguidas de irradiação com o Laser de 830 nm e 685 nm. Cada

comprimento de onda recebeu a densidade de energia de 4 Jcm2 e 40 J/cm2. Para todos

os grupos a potência foi 35 mW. O grupo placebo, serviu apenas para ser simulada a

irradiação com o Laser e o controle não recebeu irradiação. As amostras foram coradas

em hematoxilina eosina e tricômico de masson, e quantificadas as estruturas

representativas do colágeno. Observou-se que todos os grupos irradiados (685-4, 685-40,

830-4 e 830-40) apresentaram maior quantidade de colágeno, comparados com o

controle e placebo. As melhores respostas foram obtidas com os grupos 685 nm em

ambas as densidades de energia e no 830 nm com 40 J/cm2.

Palavras-Chaves: Laser de baixa potência, Cicatrização de ferida, Queimadura,

Colágeno

ABSTRACT

The main goal of this study is to describe in a comparative way, the effects of the

GaAIAs and InGaAlP low power Laser irradiation in the process of tissue cicatrization,

showing through quantitative studies if there is increase of the collagen in the analysed

samples. Through this analysis, we intend to demonstrate which technique is more

effective, comparing statistically the obtained results. Thus, we decided to carry out this

experimental study, because it’s known that the aggressions in a tissue caused by termal

injuries go from the superficial to the deepest layers of the skin. In the present study, we

used six groups of wistar rats, 4 experimental groups, a control group and a placebo one,

which suffered termal lesions injuries followed by a 830nm and 685nm Laser

irradiation. Every wave length received a 4 J/cm2 and 40 J/cm2 density of energy. For all

the groups, the power was 35mW. The placebo group was just to be simulated the Laser

irradiation and the control group didn’t receive irradiation. The samples were stained in

hematoxilin, eosin and tricotomic of masson and quantified the representative structures

of the collagen. It was observed that all the irradiated groups (685-4, 685-40, 830-4 and

830-40) presented the largest amount of collagen, compared to the control and placebo

groups. The best answers were obtained with the 685nm groups in both densities of

energy and in the 830nm with 40 J/cm2.

Key Words: Low power Laser, Wound cicatrisation, Burn, Collagen

Sumário Pág. 1- Introdução ...................................................................................................... 01

1.1- Pele ................................................................................................................ 03

1.1.2- Epiderme ...................................................................................... 04

1.1.3- Derme............................................................................................ 04

1.1.4- Anexos da Pele.............................................................................. 05

1.1.5- Funções da Pele............................................................................. 05

1.2- Queimadura ............................................................................................... 07

1.3- Processo Inflamatório Agudo.................................................................... 09

1.4- Processo de Cicatrização .......................................................................... 12

1.4-1. Tipos de Cicatrização................................................................................ 13

1.4-2. Fatores que Interferem na Cicatrização .................................................... 14

1.5- Laser.......................................................................................................... 17

1.5-1. Generalidades............................................................................................ 18

1.5-2. Laserterapia na cicatrização ...................................................................... 20

2. Objetivos ....................................................................................................... 24

2.1- Objetivo Geral........................................................................................... 25

2.1-1. Objetivo Específico................................................................................... 25

3- Material e Método ........................................................................................... 26

3.1 - Aprovação pelo Comitê de Ética 27

3.2- Animais de Experimentação 27

3.3 - Caracterização dos Grupos .................................................................. 27

3.4 - Local da Pesquisa ............................................................................... 28

3.5 - Equipamentos ..................................................................................... 28

3.6 - Características do Emissor Laser........................................................ 30

3.7 - Procedimento Cirúrgico...................................................................... 30

3.8 - Terapia Laser de baixa Potência ........................................................ 32

3.9 - Procedimento Laboratorial .................................................................. 34

3.10 - Análise Morfométrica ....................................................................... 34

3.11 - Análise Morfométrica ....................................................................... 34

4- Resultados ........................................................................................................ 41

4.1 – Análise Histológica por Microscopia de Luz .......................................... 42

4.2 – Análise Estatística ................................................................................... 43

4.3 – Análise Quantitativa ................................................................................ 43

4.4 – Grupo Controle (GC) .............................................................................. 44

4.5 – Grupo Placebo (GP) ................................................................................ 45

4.6 – Grupo Irradiado com Laser de 830 nm e 40 J/cm2 (830-40) ................. 46

4.7 – Grupo Irradiado com Laser de 830 nm e 4 J/cm2 (830-4) ...................... 47

4.8 – Grupo Irradiado com Laser de 685 nm e 40 J/cm2 (685-40) .................. 48

4.9 – Grupo Irradiado com Laser de 685 nm e 4 J/cm2 (685-4) ...................... 49

4.10- Espectrofotometria .................................................................................. 52

5- Discussão .......................................................................................................... 53

6- Conclusões ........................................................................................................ 58

Referências Bibliográficas ................................................................................... 60

Anexo .................................................................................................................... 74

Lista de Tabelas e Figuras

Tabela 1 – Classificação dos Laser de baixa potência e seus comprimentos de onda (TÚNER & HODE, 2003). ............................................................................................20 Tabela 2 – Características do Laser de baixa potência utilizado na pesquisa ................30 Tabela 3 – Divisão dos grupos e procedimentos. ...........................................................33 Tabela 4 – Média percentual de colágeno após sete dias da lesão .................................44 Tabela 5– Média percentual de colágeno após sete dias da lesão ..................................45 Tabela 6– Média percentual de colágeno após sete dias da lesão ..................................46 Tabela 7 – Média percentual de colágeno após sete dias da lesão .................................47 Tabela 7– Média percentual de colágeno após sete dias da lesão . ................................48 Tabela 9 – Média percentual de colágeno após sete dias da lesão .................................49 Tabela 10 – Média de colágeno entre as colorações de H&E e Masson ........................50 Tabela 11 – Média percentual de colágeno comparativa por grupo ...............................51 Tabela 12 – Resultados do teste de Tukey HSD, para o percentual de colágeno............52

Figura 1 - Aparelho lser de baixa potência e Óculos de proteção .............................29

Figura 2 – Microscopio, Câmera digital, Microcomputador .....................................29

Figura 3 – Instrumental elaborado para executar a lesão térmica e Termômetro digital...............................................................................................................................31 Figura 4 – Instrumental utilizado para fixação do laser.................................................32 Figura 5 – Tela do programa IMAGELAB, para análise de imagens...........................35 Figura 6 – Representação na forma de histograma obtida através da digitalização de uma lâmina histológica em Masson........................................................................................36 Figura 7 – Representação na forma de histograma obtida através da digitalização de uma lâmina histológica em H&E.., ........................................................................................36 Figura 8 – Campos digitalizados e equalizados na coloração de MASSON, Grupo 830nm, 40 J/cm2 ..................................................................................................37 Figura 9 – Campos digitalizados e equalizados na coloração em H&E, Grupo 685nm, 4 J/cm2 ............................................................................................................................38 Figura 10 – Histograma de cores (R:0-0,G:98-138 e B:0-0) da imagem (esquerda),imagem original (acima) e o resultado da segmentação (abaixo) usando os tons de verde (98 a 138). para definir o colágeno....................................................................................................39 Figura 11 – Determinação do percentual de colágeno em Masson, Grupo 830nm, 40 J/cm2 .........................................................................................................................................40 Figura 12 – Determinação do percentual de colágeno em H&E, Grupo 685 nm, 4 J/cm2 .........................................................................................................................................40 Figura 13 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................44

Figura 14 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................45 Figura 15 – Média de colágeno em Masson eH&E.......................................................46 Figura 16 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................47 Figura 17 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................48 Figura 18 – Média de colágeno em Masson e H&E......................................................49 Figura 19 – Média de colágeno entre os grupos............................................................50

Lista de Abreviaturas e Símbolos

A : Área

GaAs : Arseneto de Gálio

GaAlAs : Arseneto de Gálio e Alumínio

COBEA : Código Brasileiro de Experimentação Animal

CO : Comprimento de onda

C02 : Dióxido de Carbono

DE : Densidade de Energia

DP : Densidade de Potência

ATP : Adenosina Trifosfato

cm : Centímetro

cm2 : Centímetro quadrado

E : Energia

g : Gramas

H&E : Hematoxilina e Eosina

He-Ne : Hélio Neônio

InGaAIP : Fosfeto de Índ io Gálio e Alumínio

J : Joule

J/cm2 : Joule por Centímetro quadrado

LBP : Laser de Baixa Potência

LLLT : Low Level Laser Therapy

ml : Mililitro

mm : Milímetros

mm2 : Milímetros quadrados

mW : Miliwatts

Nd:YAG : Neodímio dopado em matriz cristalina de Y3Al5O12

nm : Nanômetro

W : Watts

1. INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

A utilização do laser de baixa intensidade nos processos de reparação

dos tecidos biológicos vem sendo investigados desde a década de 60, quando

Mester (1966) relatou os efeitos benéficos do na bioestimulação tecidual. A

partir daí vários trabalhos vem sendo desenvolvidos para avaliar os possíveis

efeitos do laser e seu comportamento no reparo tecidual e na melhora das

respostas em diversas condições (RIGAU i MAS, 1996; PARIZOTTO, 1999).

Com a crescente utilização do laser de baixa intensidade na área clinica

visando reduzir o tempo de reparo em lesões dermatológicas como úlceras e

lesões abertas sendo estas condições patológicas incapacitantes (LUCAS;

GEMERT; HAAN, 2003; FLEMMING; CULLUM; NELSON, 1999) leva os

pesquisadores a buscar condições e parâmetros mais favoráveis e

comprimentos de ondas mais adequados a essas condições patológicas.

Isso motivou diversos trabalhos experimentais visando descrever os

efeitos do laser utilizando diversos parâmetros e lasers para promover uma

melhor resposta no processo de reparação tecidual (VERA MENDEZ, 2002;

NASCIMENTO, 2002).

No presente trabalho desenvolveu-se um estudo experimental com ratos

submetidos a lesões térmicas a fim de investigar se o uso de diferentes

densidades de energia e comprimentos de onda aumenta a quantidade de

colágeno no processo de reparação tecidual nos primeiros oito dias nestes

animais, utilizando-se do laser de baixa intensidade. Para maior controle foi

utilizado a mesma densidade de potência para ambos comprimentos de onda.

1.1 PELE

1.1 PELE

A pele em termos de superfície e peso é um dos maiores órgãos do

corpo, sendo composta por duas camadas: a epiderme e a derme que estão

fixadas às estruturas subjacentes através da hipoderme.

A hipoderme não faz parte da pele, apenas une a derme aos órgãos

subjacentes e é responsável pelo deslizamento desta, sobre as estruturas na

qual se apóia (SLATTER,1998; SPENCE,1991). A hipoderme é composta

principalmente de gordura com trabéculas de colágeno frouxas e fibras

elásticas, sendo que os vasos cutâneos a atravessa para irrigar as regiões

superjacentes (SLATTER,1998).

1.1.1 Epiderme

A Epiderme é formada por epitélio estratificado pavimentoso

queratinizado, por ser avascular suas células obtém alimento através da difusão

dos leitos capilares da derme. Esta camada é responsável pela retenção hídrica

e regulação térmica protegendo ainda o sistema corporal contra a invasão de

agentes externos, restringindo a perda de água do corpo (O’SULLIVAN;

SCHMITZ,1993).

Para Creed (1958), Lovell e Getty (1957), a epiderme da pele de animais

de pequeno porte com pêlo áspero consiste de três camadas principais: estrato

cilíndrico, estrato espinhoso e estrato córneo.

1.1.2 Derme

A derme, é formada por 90% de fibras colágenas reticulares e elásticas

(SWAIN, 1980). Ela ainda possui nervos e receptores, vasos sangüíneos,

linfáticos, músculos eretores dos pêlos, folículos pilosos e estruturas

glandulares derivadas do ectoderma, além de células como: fibroblastos,

macrófagos, plasmócitos e mastócitos que encontram-se distribuídos por toda a

derme (SLATTER, 1998).

1.1.3 Anexos da Pele

Como anexos da pele encontramos as glândulas sudoríparas, glândulas

sebáceas, pêlos e unhas. As glândulas sudoríparas secretam solução aquosa

de cloreto de sódio, com traços de uréia, fosfatos e sulfatos, com intuito de

dissipar o calor; e as glândulas sebáceas, com função de lubrificação e a

secreção de substâncias tóxicas à determinadas bactérias (JUNQUEIRA,

1996).

1.1.4 Funções da Pele

A pele desempenha várias funções como: base dos receptores

sensoriais responsáveis pelo sentido do tato trata-se de uma fonte organizadora

e processadora de informações; mediadora de sensações; barreira entre o meio

ambiente; fonte imunológica de hormônios para diferenciação de células

protetoras; proteção contra os efeitos da radiação, traumas mecânicos e

elétricos; barreira contra materiais tóxicos e organismos estranhos; regulação

da pressão e do fluxo sangüíneo e linfático; regulação da temperatura;

metabolismo e armazenamento de gordura; reservatório de alimento e água;

importante na respiração; sintetiza compostos importantes como a vitamina D;

barreira contra microrganismos, participando também da homeostasia

(GUIRRO; GUIRRO,2002; JUNQUEIRA; CARNEIRO,1999). A pele também é

denominada como o maior órgão corporal, compreendendo 15% do peso total

de um indivíduo, além de participar da síntese de vitamina D e ser um órgão

sensorial (O’SULLIVAN; SCHMITZ,1993).

A pele é a primeira e última linha de defesa, participando ainda da

queratinização, descamação, produção de substâncias antibacterianas, ácidos

graxos livres insaturados, flora bacteriana simbiótica (GOMES; SERRA;

PELLON,1995).

1.2 QUEIMADURA

1.2 QUEIMADURA

A queimadura é uma lesão cutânea ou mucosa provocada pelo calor ou

por outros agentes físicos. Existem rês tipos de determinação dos graus de

queimaduras: a lesão de primeiro grau é aquela queimadura que atinge a

camada mais externa da pele (epiderme), não provocando modificações

hemodinâmicas, sendo que a região atingida se encontra hiperemiada na

ausência de bolhas ou flictenas,; a lesão de segundo grau atinge tanto a

epiderme quanto parte da derme e se caracteriza principalmente pela formação

de bolhas ou flictenas; já a lesão de terceiro grau acomete a totalidade das

camadas da pele e em muitos casos outros tecidos, como o tecido celular

subcutâneo, músculos e tecido ósseo (GOMES; SERRA; PELLON, 1995).

Essas lesões vão levar a um aumento da permeabilidade vascular,

fazendo com que ocorra perda de água, proteínas no local da lesão, ocorrendo

diminuição do volume sangüíneo suficiente para produzir choque e até a morte

(ROBBINS et al 1986).

Devido ao desaparecimento do tecido protetor, o ambiente torna-se

propício à infecção bacteriana e ao aumento da perda de líquidos em regime

constante de evaporação. A cicatrização, nesses casos, é feita por granulação

e migração do epitélio não agredido presente nas bordas da ferida(DOURADO

1994).

1.3 PROCESSO INFLAMATÓRIO AGUDO

1.3 PROCESSO INFLAMATÓRIO AGUDO

Trata -se de resposta imediata a uma lesão, provocando desta forma uma

reação local tecidual no organismo, a um fator irritante dependendo da

gravidade da lesão, podendo causar reação inflamatória na área circulante

devido destruição tecidual.

A inflamação é a resposta do organismo à lesão. Seu objetivo é proteger

o corpo contra a invasão de corpos estranhos e preparar o tecido lesado para a

reparação. O processo de reparo, também conhecido como cicatrização, ocorre

depois da resposta inflamatória (KNIGHT, 2000).

O processo inflamatório é uma tentativa de remover o elemento irritante,

os detritos e as células mortas. Ela também prepara o caminho para o reparo.

Ocorre diversas mudanças tissulares no local da lesão. Há uma proliferação

das células de tecido conjuntivo. Os linfócitos produzem anticorpos que

combatem a infecção e os leucócitos fagocitam as bactérias e as células mortas

ou outros materiais estranhos(THOMSON; SKINNER; PIERCY,1994).

A lesão ao tecido provoca morte celular e ruptura dos vasos sangüíneos.

A finalidade fundamental da fase inflamatória do reparo consiste em livrar a

área de debris e de tecido morto, e em destruir qualquer infecção invasora

anterior ao reparo(KITCHEN; BAZIN, 1998).

A resposta inflamatória é estreitamente entrelaçada como processo de

reparação. Durante a reparação, o tecido agredido é substituído pela

regeneração das células parenquimatosas nativas ou pelo preenchimento do

defeito por tecido fibroblástico (ROBBINS et al ,1996).

O aumento da permeabilidade vascular, que na verdade fica confinado

às pequenas vênulas, logo ocorre, sendo a chave para todos os eventos

inflamatórios subseqüentes(SLATTER, 1998). Qualquer evento que danifique a

estrutura ou a função do tecido altera a capacidade de as células realizarem

seus mecanismos homeostáticos normais ocasionando a resposta inflamatória.

1.4 PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO

1.4 PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO

A cicatrização é um evento biológico complexo, o qual envolve

inflamação, proliferação celular e diferenciação. O reparo envolve ações

integradas das células, matriz e mensageiros químicos, e visam restaurar a

integridade do tecido com maior rapidez possível(KITCHEN; BAZIN,1998).

A reparação é um estágio caracterizado pela síntese e deposição de

colágeno. Os estímulos nocivos são removidos, e inicia o crescimento de leitos

capilares na região, aumenta a atividade fibroblástica, formação de colágeno e

desenvolvimento de tecido de granulação. O fechamento de feridas em

músculos e pele leva geralmente 5 a 8 dias. Durante esse estágio é produzido

um tecido conectivo imaturo que é fino e desorganizado(KISNER;

COLBY,1992).

No caso de queimaduras são vários os fatores que entram em ação, e

contribuem invariavelmente para prolongar as curas das lesões, resultando

quase sempre em inflamação, edema e cicatrizes.

1.4.1 Tipos de Cicatrização

A cicatrização de uma ferida pode ser feita logo de início, sem

complicações (cicatrização por primeira intenção) ou lentamente, entravada por

diversos fatores tais como: infecção, necrose, perda de substância (cicatrização

por segunda intenção) ou com uma cicatriz mais marcada (MANUILA;

MANUILA; NICOULIN, 1997). O processo de cicatrização natural de queimados

se dá na maioria dos casos, através da cicatrização por segunda intenção

(VEÇOSO,1993).

A cicatrização por segunda intenção é quando a perda celular e tecidual

é mais extensa, o processo de reparação é mais complicado, a regeneração de

células parenquimatosas é incapaz de recompor integralmente a arquitetura

original. Formam-se quantidades muito maiores de tecido de granulação

(ROBBINS et al,1986).

O processo de cicatrização das queimaduras predispõe à formação de

cicatrizes hipertróficas e contraturas, como são caracterizados pelo importante

aumento na vascularização, de fibroblastos, deposição de colágeno, material

intersticial e edema (ARTZ; MONCRIEF; PRUITT,1980).

1.4.1 Fatores que Interferem na cicatrização

Embora o reparo seja poderosamente programado, algumas ocorrências

podem dificultar o seu processamento. Muitos fatores gerais e locais podem

interferir no mecanismo de reparo e influenciar a evolução natural deste

processo. 0 mais importante deles, é o estado nutricional do indivíduo. KAY et

al. (1987), através da realização de um estudo prospectivo envolvendo a

análise do processo cicatricial em pacientes submetidos à amputação das

extremidades inferiores, relataram que, no grupo representado pelos indivíduos

mal-nutridos, cerca de 40% da amostra, exibiu complicações sistêmicas ou

locais no período pós-operatório.

Durante muito tempo, vem sendo demonstrado, que a carência de

proteínas representa um sério comprometimento na síntese enzimática, bem

como na produção de moléculas essencialmente polipeptídicas, tais como

anticorpos, hormônios, colágeno, entre outros (FAULK et al., 1974). A síntese

do colágeno depende da vitamina C, a qual se constitui em um componente

fundamental na etapa de maturação molecular desta proteína, e a sua

deficiência é acompanhada de uma cicatrização defeituosa e da formação de

um colágeno imaturo, sem força tênsil (GROSS, 2000).

Segundo Ehrlichman et al. (1991), o oxigênio molecular é um fator central

no processo de reparo. Ele é necessário para a realização de todos os

fenômenos biológicos dependentes de energia, tais como a replicação celular,

síntese protéica, exportação de proteínas e a hidroxilação da prolina e lisina,

para a posterior incorporação destes aminoácidos às cadeias alfa da molécula

de colágeno. De fundamental importância, é a elevada tensão superficial do

oxigênio nos tecidos a fim de potencializar a resistência às eventuais infecções.

O oxigênio molecular é imprescindível para a produção de radicais superóxidos

tóxicos, os quais, em contrapartida, são usados para eliminar as bactérias que

tenham sido eventualmente fagocitadas pelos granulócitos (PAUL, 1999).

Como o sistema imunológico representa um elemento fundamental na

geração das diversas citocinas que participam ativamente do processo de

reparo, indivíduos em estado de imunossupressão podem apresentar um

retardo considerável na cicatrização (HULSEWÉ et al., 1999).

De acordo com Timimi et al. (1998), algumas patologias sistêmicas, tais

como o diabetes mellitus, podem dificultar a cicatrização de um ferimento,

basicamente em virtude da microangiopatia e uma maior predisposição à

infecção apresentada por parte dos seus portadores. Indivíduos com

arteriosclerose ou anormalidades venulares podem apresentar um impedimento

da cicatrização em virtude do retardo na drenagem venosa e suprimento

sangüíneo inadequado.

Do ponto de vista local, a permanência da crosta que recobre a lesão é de

vital importância para a proteção dos tecidos subjacentes em formação. A sua

remoção precoce pode resultar em atraso da cicatrização, principalmente

gerando um rompimento da fina rede capilar neoformada. A área da ferida

também precisa estar desprovida de qualquer fator de natureza infecciosa,

corpos estranhos e restos de tecidos desvitalizados, os quais poderiam

perturbar a cicatrização. Adicionalmente, alguns fatores mecânicos, como o

movimento precoce envolvendo a área do ferimento podem retardar o reparo

(ANDRADE, 1999).

1.5 LASER

1.5 LASER

1.5.1 Generalidades

Laser é o acrônimo de "Light amplification by estimuled emition of

radiation", ou seja, "luz amplificada por emissão estimulada de radiação"

(HERCH; TERESI, 1987; LOW; REED, 2001; TUNÉR; HODE, 2002).

No inicio do século XX, Albert Einstein em 1917, em seus estudos

descreveu os princípios físicos da emissão estimulada de radiação. Maiman em

1960, construiu o primeiro aparato laser de rubi, sendo este um laser de alta

potência. O primeiro laser terapêutico foi desenvolvido por Javan em 1961,

utilizando o meio ativo He-Ne com um comprimento de onda de 632,8 nm.

(KARU, 1987; KITCHEN, 1991; BAXTER, 1997; TUNÉR; HODE, 2002).

Em 1966, na Hungria, Mester publicou uma série de relatos de casos

clínicos descrevendo a propriedade de bioestimulação laser sobre o processo

de cicatrização de úlceras em membros inferiores, utilizando lasers de rubi e

argônio (MESTER, 1968; COLLS, 1984; VEÇOSO, 1999)

Nas décadas de 70 e 80, começaram a ser desenvolvidos diodos laseres

semicondutores, os quais exibiam um maior potencial de penetração tecidual, e

podiam operar nas formas contínua ou pulsada. O primeiro relato da utilização

clínica de um diodo laser de GaAlAs, surgiu em 1981, sendo um estudo

comparativo, que avaliava a resposta analgésica de pacientes tratados com

laserterapia(TUNÉR; HODE, 2002). A partir dos anos 90, houve o aparecimento

de diferentes diodos laser, com uma variedade de comprimentos de onda,

constituindo-se em aparelhos de tamanhos reduzidos, alta facilidade de

transporte e manuseio e de custo relativamente baixo ( HENDERSON, 1997).

O laser possui propriedades e características únicas diferenciando de

outras fontes luminosas, sendo elas coerência, colimação e

monocromaticidade. A coerência, diz respeito à propagação ordenada em fase

das ondas eletromagnéticas ao longo do tempo e do espaço (KITCHEN, 1991;

BAXTER, 1997; TUNÉR; HODE, 2002).

Sobre a colimação, o laser apresenta um paralelismo muito acentuado.

As suas ondas eletromagnéticas exibem um mesmo sentido e direção, de modo

que o ângulo de divergência do laser é muito pequeno (KITCHEN, 1991;

BAXTER, 1997; TUNÉR; HODE, 2002).

A emissão de uma radiação com uma linha espectral muito estreita, ou

seja, com um comprimento de onda muito bem definido, constitui o que se

reconhece por monocromaticidade, sendo importante devido a seletividade dos

tecidos (KITCHEN, 1991; BAXTER, 1997; TUNÉR; HODE, 2002).

Os diferentes tipos de lasers podem ser obtidos variando a substância

estimulada que emite a radiação. Os lasers podem ser classificados

dependendo da potência de emissão, sendo divididos em dois grandes grupos:

os lasers de alta potência e os lasers de baixa potência. O meio ativo do laser

define suas características e seu nome, podendo ser sólidos, líquidos, gasosos

ou quaisquer uns destes componentes associados um ao outro (ALMEIDA –

LOPES, 1999; VEÇOSO,1999; LOW; REED, 2001;).

Os lasers terapêuticos comumente utilizados em terapia, e seus respecti vos

comprimentos de onda estão listados na tabela 1.

Tabela 1. Classificação dos Laser de baixa potência e seus comprimentos de onda

Tipo de Laser Comprimento de Onda

HeNe 633 nm

InGaAlP 633-700 nm

GaAlAs 780-890 nm

GaAs 904nm

CO2 10.600 nm

Rubi 694 nm

Nd:YAG 1.064 nm Fonte : TÚNER & HODE

1.5.2 Laserterapia na Cicatrização

Os lasers utilizados na reparação tecidual situam-se no espectro

eletromagnético entre o visível e o infravermelho próximo (KARU, 1998).

Varias especialidades da área da saúde tem utilizado a laserterapia em

diversas aplicações clínicas, como analgesia, modulação do processo

inflamatório e reparação tecidual. Entretanto a utilização do laser de baixa

potência no reparo tecidual tem demonstrado ser a primeira indicação

terapêutica (TUNER; HODE, 2002).

Diversos estudos foram realizados descrevendo os efeitos da

laserterapia tanto em pesquisas in Vitro (ABERGEL et al., 1984;

PASSARELLA et al., 1984;KARU et al., 1995; RIGAU, 1996; YU et al., 1997;

GROSSMAN et al., 1998; HOUGHTON; BROWN, 1999; KARU; 1999; LUBART;

FRIEDMANN; LAVIE, 2000; STADLER et al., 2000; KREISLER et al., 2001;

ALMEIDA-LOPES et al., 2001) como In Vivo (BASFORD, 1995, RIGAU i MAS

et al., 1996; MORRONE et al., 1998; TATURANAS, 1998; LICHTENSTEIN,

1999; SIMUNOVIC; IVANKOVICH; AL-WATBAN; ANDRES; 2000; LAGAN et

al., 2002).

O aumento na sintese de colágeno é um dos efeitos mais importantes no

processo de cicatrização, utilizando-se a laserterapia (RIGAU, 1996). Sendo

esta estrutura biológica objeto de estudos em diversos trabalhos (PARIZZOTO,

1999; ALMEIDA-LOPES, 2001)

Entretanto resultados conflitantes a respeito da eficácia da laserterapia

na reparação foram descritos por diversas pesquisas (MALM; LUNDEBERG,

1991; SCHALAGER et al.; 2000; WALKER et al., 2000; YILMAZ et al., 2002).

Uma das justificativas encontradas vai ao encontro das afirmações de Rigau

(1998), pois estes estudos indicam que devido a escolha de parâmetros ópticos

variados, utilizando-se de fluências baixas ou extremamente elevadas podem

ter causados os efeitos indesejados nos achados (HALL,1994;

HOUGHTON;BROWN, 1999).

Bisht et al. (1994) estudaram os efeitos do laser de baixa potência,

utilizando um HeNe em feridas cutâneas abertas em ratos albinos, a densidade

de potência trabalhada foi 5mW e a densidade de energia foi de 4 J/cm2

durante cinco minutos. Foi observado uma aceleração significativa do processo

de cicatrização, com aumento do tecido de granulação e rápida reepitelização

nos grupos tratados quando comparados aos controles.

Cambier (1996), estudou os efeitos do laser de He-Ne e AsGa em

cicatrização de queimaduras, seu modelo experimental, utlizou 20 ratos Fisher,

ele realizou duas lesões térmicas em cada animal, irradiando apenas uma das

lesões. Os animais foram divididos em dois grupos e tratados com diferentes

comprimentos de onda. Nenhuma diferença foi encontrada entre os lasers

utlizados comparado com o grupo controle.

Parizotto (1999), estudou os efeitos do laser terapêutico He-Ne no

processo de reapro tecidual de tendões, o colágeno foi seu obejto de estudo,

analisados por diferentes técnicas. A densidade de potência utilizada foi de

6mW, sendo o rato o modelo experimental adotado. A microscopia eletrônica de

varredura , apresentou resultados significativos na cicatrização do colágeno nos

grupos irradiados, comparados com o grupo controle. A dose foi um fator de

dependência nos resultados encontrados, A melhor resposta foi obtida com a

dose de 5 J/cm2, entretanto as doses de 50 J/cm2 e 0,5 J/cm2 também

apresentaram respostas favoráveis.

Schlager (2000), utlizou dois comprimentos de onda em seu estudo, um

de 690nm e 635nm, para ambos os grupos a densidade de energiautlizada foi

de 1,5 J/cm2. O modelo experimental utilizado foi 30 ratos, divididos em 3

grupos, sendo 2 grupos irradiados e um grupo controle. Os parâmetros

analisados neste estudo foram, vermelhidão, diâmetro e edema. O resultado

encontrado foi que não houve diferença entre e dentre os grupos tratados

comparados com o controle.

Simunovic et al (2000), realizaram um estudo com diversos comprimentos

de onda, no processo de cicatrização. Um dos aspectos analisados em seu

estudo foi a formação do colágeno. As fluências utilizadas na pesquisa foram

de 4 J/cm2 para o laser de 632,8nm, 20 J/cm2 para o laser de 904nm e 24

J/cm2 utilizando ambos os comprimentos de onda. Em relação ao colágeno,

melhores resultados foram econtrados utilizando 4 J/cm2, sendo que com dose

mais elevadas apresentaram menor efeito ou inibição no processo de

reparação.

Nascimento (2001), elaborou um estudo com a finalidade de avaliar se a

variação na intensidade e comprimento de onda poderiam interferir no processo

de reparo em feridas cirurgicas, foram avaliados dois comprimentos de onda,

um de 670nm e outro de 685nm. O modelo experimental utilizado, foram 30

ratos, sendo 18 animais irradiados e divididos em dois subgrupos, com cada

grupo subdividido em 3 grupos diferenciando as densidades de potência

utilizadas, que foram 2, 15 e 25mW. Doze animais foram utlizados como

controle. Após o período experimental de 8 dias, os animais foram sacrificados.

Os resultados apresentaram um efeito positivo do laser no processo de

cicatrização, com o melhor efeito com o uso do laser de 670nm com 25mw de

densidade de potência. Resultados positivos fo ram encontrados com ambos os

comprimentos de onda quando comparados com o grupo controle.

Vera Mendez (2002), estudou a influência da dose e do comprimento de

onda no reparo tecidual em feridas cutâneas em ratos. Em seu estudo foi

utililizado os comprimentos de 830nm e 685nm isolados e em conjunto, com

doses de 20 J/cm2 e 50 J/cm2, os animais foram divididos em sete grupos. Após

a irradiação laser, fotam sacrificados de forma seriada no período de 3, 5 e 7

dias. Os resultados obtidos, evidenciaram um melhor aumento na produção de

colágeno quando comparados com o grupo controle. Os grupos trabalhando

com os comprimentos de onda de 830nm e 685nm com doses de 20 J/cm2 e 50

J/cm2 e o de 830nm com 50 J/cm2 apresentaram o melhor resultado no final do

período experimental.

2. OBJETIVOS

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Observar as principais alterações na quantidade de colágeno no

processo de cicatrização com enfoque no oitavo dia após a indução das lesões

térmicas cutâneas em ratos submetidos a terapia laser de baixa intensidade.

2.1.1 Objetivo especifico

Analisar o comportamento do processo de cicatrização tecidual no oitavo

dia, nos grupos experimentais com relação ao grupo controle

Registrar quais densidades de energia e comprimentos de onda

apresentam melhores respostas no processo de cicatrização tecidual

analisados através de espectrofotometria.

3. MATERIAL E MÉTODO

3. MATERIAL E MÉTODO

3.1 Aprovação pelo Comitê de Ética

Neste trabalho foram aplicados os princípios éticos de experimentação

animal de acordo com o COBEA ( Colégio Brasileiro de Experimentação

Animal), tendo sido aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade

Salesianas de Lins (ANEXO I).

3.2 Animais de experimentação

Foram utilizadas 60 ratos machos (Rattus Norvegicus Albinus) da

variedade Wistar adultos jovens, com peso corporal médio de 209 gramas

(variação 170 – 250g), fornecidas pelo Biotério das Faculdades Salesianas de

Lins. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas individuais, em

temperatura ambiente controlada, mantidos em fotoperíodo de 12 horas com

livre acesso à água e alimentação padrão. Os 60 animais foram distribuídos

aleatoriamente em 6 grupos com 10 animais em cada.

3.4 Caracterização dos grupos

Grupo Controle - (GC)

Neste grupo, os animais, não receberam qualquer tipo de tratamento e

após o período de sete dias, foram sacrificados.

Grupo Placebo – (GP)

Neste grupo, os animais, receberam apenas a simulação do protocolo de

tratamento, sem irradiação laser e após o período de sete dias, foram

sacrificados.

Grupo Experimental – 685nm – 4j/cm2 - (685-4)

Neste grupo, os animais, foram irradiados com laser meio ativo InGaAlP

com DE igual a 4J/cm2 após o período de sete dias, fo ram sacrificados.

Grupo Experimental – 685nm – 40j/cm2 (685-40)

Neste grupo, os animais, foram irradiados com laser meio ativo InGaAlP

com DE igual a 40J/cm2 após o período de sete dias, foram sacrificados.

Grupo Experimental – 830nm – 4j/cm2 – (830-4)

Neste grupo, os animais, foram irradiados com laser meio ativo AsGaAI

com DE igual a 4J/cm2 após o período de sete dias, foram sacrificados.

Grupo Experimental – 830nm – 40j/cm2 – (830-40)

Neste grupo, os animais, foram irradiados com laser meio ativo AsGaAI

com DE igual a 40J/cm2 após o período de sete dias, foram sacrificados.

Cada animal foi irradiado uma vez por dia durante sete dias.

3.5 Local da Pesquisa

A pesquisa foi realizada no Laboratório de Eletrotermofototerapia da

Faculdade Salesiana de Lins, SP. Os animais foram mantidos antes e após o

procedimento experimental no Biotério da Faculdade Salesianas, em gaiolas

individuais e apropriadas, em condições ambientais de temperatura,

luminosidade, controle de ruídos, limpeza e cuidados especiais favoráveis. A

dieta foi livre e padronizada e água “ad libidum”.

3.6 Equipamentos

Foi utilizado um aparelho de Laser de baixa potência, Microscópio óptico,

acoplado a uma câmara digital, Computador Athlon XP 1.7+ (Figura 2), para

análise e aquisição das imagens histológicas; Micrótomo para cortes das

amostras; Termômetro digital .

Figura 1 – Aparato laser e Óculos de proteção

(MONTEIRO NETO,2003)

Figura 2 – Microscópio, Câmera digital, Microcomputador

(MONTEIRO NETO, 2003)

3.7 Características do emissor Laser

O laser de baixa intensidade utilizado e suas características técnicas e

comprimentos de onda foram descritos conforme o manual do fabricante na

tabela 2.

Tabela 2. Características do Laser de baixa potência utilizado na pesquisa

EMISSOR VISÍVEL EMISSOR INFRAVERMELHO

Comprimento de onda : 685 nm Comprimento de onda : 830 nm

Potência do emissor : 50 mW

Contínuo

Potência do emissor : 400 mW

Contínuo

Meio ativo : InGaAlP Meio ativo : GaAlAs

Área do feixe : 2mm2 Área do feixe : 2mm2

Divergência : 1,5º Divergência : 1,5º

3. 8 Procedimento Cirúrgico

Os animais eram anestesiados mediante injeções Ketalar® (cloridrato de

ketamina) em proporções equivalentes na quantidade de 0,10ml da solução por

100g de peso, anestesia que se mostrou suficiente para o desenvolvimento de

todo o protocolo experimental. Foi realizada a técnica anti-séptica com

clorexidina a 1%(DM – Indústria Farmacêutica Ltda) de uso tópico e secagem

com gaze estéril, para ser feita a tricotomia nos animais com tesoura de pinça e

uma lâmina de barbear. A tricotomia foi feita na região superior do lado direito

no dorso de cada animal, e após o ato, os animais foram recolocados em

gaiolas limpas individualmente possuindo ração e água a vontade.

No segundo dia, com temperatura ambiente de 27ºC, os animais foram

novamente sedados e submetidos novamente a assepsia, seguida de lesão

térmica e aplicação do laser. Este procedimento foi adotado desta forma para

padronizar o inicio da aplicação do laser para todos os grupos.

A lesão térmica foi realizada com um instrumental elaborado com uma

haste de madeira e na extremidade uma chapa de alumínio de 1cm2,que após

ser aquecida a uma temperatura de 130ºC e aferida por termômetro digital

(Figura 3), era aplicada na região retrocitada por 3 segundos. Esse

procedimento foi realizado em cada animal.

Após cada lesão, o material era resfriado em um copo com água natural

e posteriormente era feita a anti-sepsia do mesmo.

Figura 3 – Instrumental elaborado para executar a lesão térmica e

Termômetro digital (MONTEIRO NETO, 2003)

3.9 Terapia Laser de Baixa Intensidade

A irradiação do laser foi realizada imediatamente após cada lesão, sendo

de forma contínua, nos espectros de onda vermelho (685nm) e Infravermelho

(830nm), com a mesma técnica, pontual, sem contato, em cinco regiões da

lesão, sendo um ponto em cada extremidade e um ao centro para todos os

grupos, o sentido da irradiação foi o sentido horário partindo-se da borda da

lesão mais próxima a cabeça do animal como referência. Os animais foram

imobilizados manualmente sem sedação para o procedimento de irradiação. A

caneta do laser era fixada a um instrumento que auxiliava sua aplicação

conforme a figura 4.

Figura 4 – Instrumental utilizado para fixação do laser

( MONTEIRO NETO 2003)

O aparelho era sempre calibrado antes de sua aplicação e aferido pelo

ponto de calibração do próprio aparelho, antes do inicio de cada sessão. Para

maior confiabilidade o laser utilizado foi adquirido para o propósito da pesquisa

e aferido no fabricante.

Para os animais dos grupos 685-40 e 830-40 foram realizadas

exposições diárias de 33 segundos por ponto, correspondendo à dose de

energia de 40J/cm2, perfazendo um tempo de dois minutos e quarenta e cinco

segundos, com dose total de 200 J/cm2 por sessão.

Para os animais dos grupos 685-4 e 830-4 foram realizadas exposições

diárias de 4 segundos por ponto, correspondendo a dose de energia de 4J/cm2,

perfazendo um tempo de 20 segundos, com dose total de 20 J/cm2 por sessão.

Ao final do 8º dia os animais foram identificados e sacrificados por

overdose intramuscular de anestésico geral e translocação cervical. A seguir

cada animal foi contido na mesa cirúrgica, efetuando-se a retirada das amostras

do tecido. A Tabela 3 resume a divisão dos grupos e procedimentos.

Tabela 3. Divisão dos grupos e procedimentos (MONTEIRO NETO, 2003).

Tabela 3 – Esquema de Irradiação

Dias de sacrifício após a lesão

Grupo e Período de Irradiação

(dias)

Tempo de

Irradiação em segundos/ponto

Dose (Jcm2)

No de animais

irradiados

Número Total de animais

(GC) 0 0 0 0 10

(GP) 7 33 0 10 10

(685-4) 7 4 4 10 10

(685-40) 7 33 40 10 10

(830-4) 7 4 4 10 10

8

(830-40) 7 33 40 10 10

60

3.10 Procedimento Laboratorial

Após a retirada das amostras de tecido, o material coletado era fixado

com alfinetes, em uma placa de parafina, colocado em um recipiente individual

e identificado, ficando em imersão com formol a 5%, que foi substituído 24

horas depois por formol à 10%. Todo o material foi transportado até o Serviço

de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Marilia.

Após este período, foram incluídos em blocos de parafina e submetidos a cortes

transversais de 7 µm de espessura. Os cortes foram montados em lâminas de

vidro e corados pelas técnicas de tricrômico de Masson e Hematoxilina/eosina,

para análise morfométrica da presença de colágeno. As lâminas foram

utilizadas para o cálculo da área representativa do colágeno.

.

3.11 Etapas da Análise Morfométrica

A análise morfométrica foi feita a partir de medidas de áreas de

colágeno. Foram medidos trinta campos da área da lesão em cada coloração e

realizada a média, para cada dose de laser usada, no período de irradiação,

juntamente com o grupo controle e placebo. Foi utilizado um Microscópio de

Luz (40x) acoplado a uma câmera digital com resolução de 1600x1200 pixel e

um computador, contendo o programa para análise de imagem, o IMAGELAB®

para medidas das áreas do colágeno (Figura 5). Os dados obtidos a partir da

medida das áreas, foram tratados estatisticamente.

Figura 5 – Tela do programa IMAGELAB, para análise de imagens (MONTEIRO NETO,

2003)

Antes do processo de analise e quantificação das estruturas, todos

os campos escolhidos foram digitalizados e convertidas para o formato

BMP, pois é um formato que apresenta a menor taxa de compressão da

imagem mantendo assim sua qualidade.

Após este processo as imagens foram equalizadas, esta etapa envolveu

a padronização por grupos do histograma de freqüência das imagens

digitalizadas. O histograma é obtido a partir da distribuição de intensidade dos

espectros RGB. As barras dos histogramas variam de 0 a 256, cada barra

representa uma intensidade de cor em determinado espectro. Em imagens

coloridas ele e representado por 3 histogramas ( Figura 6 e 7).

Figura 6 - Representação gráfica e na forma de histograma da mesma informação visual obtida

através da digitalização de uma lâmina histológica em Masson.

] Figura 7 - Representação gráfica e na forma de histograma da mesma informação visual obtida

através da digitalização de uma lâmina histológica em H&E.

A equalização é uma etapa para que a escala de cor ocupe o maior

intervalo possível, para que os detalhes da imagem fiquem mais visíveis para

avaliação e segmentação da quantidade de colágeno, delimitando-se assim os

intervalos de cor para analise. Neste procedimento os tons de cores são

redistribuídos para ocuparem o maior intervalo da escala, padronizando-os

entre os grupos (Figuras 8 e 9).

Foi utilizado também um filtro de média em cada imagem para

remoção de ruídos, pois isso pode interferir com as cores originais dos

pixels. Este processo foi realizado porque a interferência de campos

elétricos altera a forma com que os fotossensores lêem os comprimentos

de ondas dos espectros RGB.

Figura 8 – Campos digitalizados e equalizados na coloração de MASSON, Grupo 830nm,

40 J/cm2 (MONTEIRO NETO, 2003).

Figura 9 – Campos digitalizados e equalizados na coloração em H&E, Grupo 685nm, 4 J/cm2

(MONTEIRO NETO, 2003).

As áreas de colágeno foram delimitadas na imagem utilizando-se da

técnica de segmentação da imagem. No processo de segmentação, o colágeno

a ser quantificado representado na imagem é separado do contexto. A

segmentação, define para o computador o que deve e o que não deve ser

enfocado na análise. Para este processo, a forma direta é definir um intervalo

de cor que define a estrutura a ser quantificada ( Figura 10).

Figura 10 - Histograma de cores (R:0-0,G:98-138 e B:0-0) da imagem (esquerda),imagem original (acima) e o resultado da segmentação (abaixo) usando os tons de verde (98 a 138). para definir o colágeno.

Para cada imagem quantificada e grupo, utilizou-se o mesmo

intervalo de cor, com uma variação de +ou- 5% para separar a estrutura a

ser quantificada. O intervalo de cor foi definido de forma empírica, através

de tentativa de acerto e erro, dentro do histograma de cor verde par ambas,

as colorações de MASSON e H&E.

As estruturas então foram quantificadas em percentual de colágeno

presente em cada campo analisado de todos os grupos, dados esses

quantificados e calculados pelo IMAGELAB® (Figura 11 e 12).

Figura 11 – Determinação do percentual de colágeno em Masson, Grupo 830nm, 40 J/cm2 (MONTEIRO NETO, 2003).

Figura 12 – Determinação do percentual de colágeno em H&E, Grupo 685nm, 4 J/cm2 (MONTEIRO NETO, 2003).

4 . RESULTADOS

4 . RESULTADOS

4.1 Análise histológica Microscopia de Luz

A análise por microscopia de luz foi utilizada apenas como parâmetro

para verificar se o processo de reparação estava ocorrendo de forma natural

em todos os grupos, evitando-se uma análise comparativa entre os grupos

irradiados.

A microscopia revelou lesão de pele ulcerada, na qual ocorreu a lise

celular e a coagulação das proteínas, formando na superfície uma crosta de

material hialino, associado a edema. Observou–se uma reação inflamatória

aguda, caracterizada por infiltrados polimorfonucleares que se acumulavam no

fundo da lesão. Nos locais onde havia perda tissular, ocorria formação de tecido

conjuntivo vascular neoformado. Notava–se hiperemia com aumento da

permeabilidade vascular e grande infiltrado mononuclear, composto

principalmente de macrófagos ativados, fagocitando debris celulares. A partir

desse ponto, se iniciava uma proliferação de vasos e fibroblastos que se

dirigiam ao sitio da lesão, formando o tecido de granulação e levando ao

espessamento da lamina própria.

Seguindo a cronologia da reparação, algumas áreas apresentam

desaparecimento progressivo do infiltrado de vasos e grande deposição de

fibras colágenas, para a formação da cicatrização.

4.2 Análise Estatística

Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística pela analise

Variância, utilizando o teste de TUKEY para verificar a presença de diferenças

entre os grupos. Para verificar a significância da diferença percentual de fibras

colágenas, entre o grupo controle e os experimentais em cada amostra, fixou-se

em 0,05 ou 5% o nível de rejeição da hipótese de nulidade para ambos os

testes.

4.3 Analise quantitativa

Os dados quantificados obtidos através da digitalização de imagens para

% de fibras colágenas, correspondem à média de três campos por animal de

cada grupo obtendo-se vinte amostras, dez em cada coloração, no oitavo dia

após a lesão térmica. Estes resultados estão demonstrados nas Tabelas 4, 5,

6, 7, 8 e 9 que correspondem respectivamente às amostras retiradas no 8º dia

após a lesão térmica. Os valores da quantidade de colágeno presente em cada

campo digitalizado estão plotados nas figuras 13, 14, 15, 16,17 e 18.

MáximoMínimoMédia

Percentual de Colágeno - Grupo Controle

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

GC - Masson GC - H&E

4.4 Grupo controle (GC)

Tabela 4. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão

Figura 13. Média de colágeno em Masson e H&E.

Animal Colágeno H&E Colágeno Masson

1 47,4 46,9 2 46,8 46,9 3 48,0 47,6 4 38,7 39,2 5 47,3 48,1 6 44,5 43,7 7 49,2 48,5

8 32,2 31,3 9 40,7 39,5 10 40,8 40,2

Média

Desvio padrão 43,56 5,37

43,19 5,57

MáximoMínimoMédia

Percentual de Colágeno - Grupo Placebo

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

GP - Masson GP - H&E

4.5 Grupo Placebo (GP)

Tabela 5. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão

Animal Colágeno H&E Colágeno Masson

1 42,6 41,5

2 43,5 43,8

3 41,8 40,2

4 48,2 46,8

5 47,0 46,2

6 45,3 39,5

7 35,8 38,2

8 40,5 41,2

9 45,6 44,5

10 42,7 41,8

Média

Desvio padrão 43,3 3,56

42,37 2,86

Figura 14. Média de colágeno em Masson e H&E.

MáximoMínimoMédia

Percentual de Colágeno - Grupo IV40

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

IV40 - Masson IV40 - H&E

4.6 Grupo irradiado com laser de 830nm; DE 40J/cm2 (830-40)

Tabela 6. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão

Animal Colágeno H&E Colágeno Masson

1 62,0 63,2 2 65,1 66,3 3 64,4 66,8 4 65,3 65,1 5 63,1 64,8 6 62,0 63,8 7 62,6 63,2 8 64,3 63,2 9 61,1 62,2 10 62,6 63,5 Média

Desvio padrão 63,25 1,44

64,21 1,49

Figura 15. Média de colágeno em Masson e H&E.

MaxMinMean

Percentual de Colágeno - Grupo IV4

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

IV4 - Masson IV4 - H&E

4.7 Grupo irradiado com laser de 830nm; DE 4J/cm2 (830-4)

Tabela 7. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão

Animal Colágeno H&E Colágeno Masson

1 57,1 58,7 2 56,0 59,3

3 59,4 59,8

4 55,8 57,8

5 54,9 55,8 6 56,7 57,6 7 55,8 56,3

8 56,2 56,8

9 54,4 56,5

10 58,2 58,3 Média

Desvio padrão

56,45 1,48

57,69 1,34

Figura 16. Média de colágeno em Masson e H&E.

MáximoMínimoMédia

Percentual de Colágeno - Grupo V4

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

V4 - Masson V4 - H&E

4.8 Grupo irradiado com laser de 685nm; DE 40J/cm2 (685-40)

Tabela 8. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão

Animal Colágeno H&E Colágeno Masson

1 59,9 60,1 2 65,1 63,5 3 60,1 61,2

4 63,1 62,8 5 60,9 61,3

6 59,4 59,5 7 60,1 63,2 8 59,1 58,9

9 60,5 61,1 10 62,2 62,8

Média

Desvio padrão

61,04 1,88

61,44 1,60

Figura 17. Média de colágeno em Masson e H&E.

MáximoMínimoMédia

Percentual de Colágeno - Grupo V40

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

V40 - Masson V40 - H&E

4.9 Grupo irradiado com Laser de 685nm e DE 4 J/cm2 (685-4)

Tabela 9. Média percentual de colágeno após sete dias da lesão

Animal Colágeno H&E Colágeno Masson

1 61,3 62,5 2 65,3 64,8 3 56,8 58,2 4 59,5 60,1 5 65,1 64,7 6 58,1 59,3 7 57,0 56,9 8 66,0 64,8 9 61,4 63,2 10 58,3 59,7

Média

Desvio padrão 61,11 3,88

61,42 2,94

Figura 18. Média de colágeno em Masson e H&E.

MáximoMínimoMédia

Percentual de Colágeno entre os grupos

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

GC GP V4 V40 IV4 IV40

Para o tratamento estatístico foi calculado a média entre ambas as

colorações por grupos, demonstrados na tabela 10.

Tabela 10. Média de colágeno entre as colorações de H&E e Masson

Média de colágeno por grupo em H&E/Masson

GC GP V4 V40 IV4 IV40 47,15 42,05 61,90 60,00 57,90 62,60 46,85 43,65 65,05 64,30 57,65 65,70 47,80 41,00 57,50 60,65 59,60 65,60 38,95 47,50 59,80 62,95 56,80 65,20 47,70 46,60 64,90 61,10 55,35 63,95 44,10 42,40 58,70 59,45 57,15 62,90 48,85 37,00 56,95 61,65 56,05 62,90 31,75 40,85 65,40 59,00 56,50 63,75 40,10 45,05 62,30 60,80 55,45 61,65 40,50 42,25 59,00 62,50 58,25 63,05

Os valores médios obtidos do percentual de colágeno, comparativos por

grupo estão plotados na figura 19.

Figura 19 . Média de colágeno entre os grupos.

A média dos dados quantificados obtidos através da digitalização de

imagens para % de fibras colágenas comparativas entre os grupos, estão

demonstradas na Tabela 11.

A tabela mostra os valores médios do grupo controle e dos grupos

experimentais, no 8 dia após a lesão. Através da análise quantitativa de

colágeno dos animais submetidos ao experimento, pode-se observar, que os

animais do grupo controle e placebo apresentaram menor percentual de

colágeno em H&E (médias: 43,56% e 43,3%), como em masson (médias:

43,19% e 42,17%), quando comparados com os grupos irradiados. Dentre os

grupos irradiados o de 830nm e 40J/cm2 foi o que apresentou maior média de

colágeno em ambas as colorações (média: 63,25% e 64,21%).

Tabela 11. Média percentual de colágeno comparativa por grupo

Grupos Média dos grupos

Colágeno H&E Colágeno Masson

GC 43,56 43,19

GP 43,3 42,37

685-4 61,11 61,42

685-40 61,04 61,44

830-4 56,45 57,69

830-40 63,25 64,21

.

4.10 Espectrofotometria

Através da espectrofotometria foi possível obter e comparar os valores

da quantidade de colágeno nos diferentes grupos experimentais. A Tabela 12,

mostra os valores obtidos após o tratamento estatístico das diferenças

encontradas com a analise de variância para o colágeno. Observa-se que

ocorreram diferenças estatisticamente significativas quando relacionada o

variável colágeno dos grupos irradiados com o grupo controle e placebo.

Entre o grupo placebo e controle não houve diferença significativa. Foi

observado também diferença significativa entre os grupos de 685nm e 4J/cm2 e

40J/cm2 e 830nm e 40J/cm2 com relação ao grupo 830nm 4 J/cm2.

Tabela 12. Resultados do teste de Tukey HSD, para o percentual de colágeno

Teste de Tukey HSD; % Colágeno

GC GP 685-4 685-40 830-4 830-40

GC 0,998974 0,000138 0,000138 0,000138 0,000138

GP 0,998974 0,000138 0,000138 0,000138 0,000138

685-4 0,000138 0,000138 0,999999 0,042266 0,761461

685-40 0,000138 0,000138 0,999999 0,052356 0,708883

830-4 0,000138 0,000138 0,042266 0,052356 0,000836

830-40 0,000138 0,000138 0,761461 0,708883 0,000836

p < .005

Após a análise nota-se uma evidente diferença, entre grupos irradiados e

controles. Os efeitos do LBP podem ser observados na quantidade de colágeno

aumentada nos grupos irradiados, apresentando assim uma melhor resolução

da cicatrização nestes grupos.

5. DISCUSSÃO

5. DISCUSSÃO

O presente estudo objetivou verificar os efeitos do LBP na cicatrização

tecidual, quantificando as áreas representativas de do colágeno em animais

submetidos a lesões térmicas.

O modelo experimental utilizado foi o rato wistar,largamente difundido na

literatura e apropriadamente empregado no estudo de cicatrização envolvendo

a epiderme e derme ( colocar autores de estudo com ratos).

O período escolhido para avaliação foi o sétimo dia, após o procedimento

da lesão experimental, pois nesta fase ocorre a maior concentração de

colágeno (FONSECA et al., 1997).

O protocolo da indução da lesão térmica foi escolhido por ser de fácil

execução e isenta de complicações durante os procedimentos experimentais,

este tipo de procedimento é utilizado por diversas pesquisas por desencadear

reações inflamatórias intensas, servindo assim para poder avaliar os efeitos

biomoduladores do LBP (SANTANA-BLANK et al., 2000; SHCLAGER et al.,

2000; CAMBIER et al., 1996)

O laser escolhido foi o diodo nos comprimentos de onda de 630 nm e

830 nm, por ser de tamanho reduzido, fácil manuseio, seguro e fácil aplicação,

dentro dos espectros de onda amplamente utilizado em diversos trabalhos

(PETERSEN et al., 1999; SHCLAGER et al, 2000; LAGAN et al., 2001).

As amostras dos seis grupos foram coradas por H&E e tricômico de

masson, por serem técnicas utilizadas rotineiramente e recomendadas para

observação do colágeno (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999).

Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que todos os grupos

evoluíram o para um processo de cicatrização normal no período estudado.

Entretanto observando a estrutura analisada, nota-se uma resolução da

cicatrização mais acentuada nos grupos irradiados com LBP, quando

comparados ao controle e placebo.

Os resultados observados neste estudo indicam claramente que a

irradiação com LBP, aplicada sobre a área da lesão na forma pontual,

apresentou efeitos positivos sobre a quantidade de colágeno nos grupos

irradiados, comparados com o grupo controle e placebo os achados foram mais

significativos. Essa diferença significativa da presença do colágeno pode ser

comprovada por uma melhor resolução do processo inflamatório, traduzindo-se

em maior atividade fibroblastica e conseqüentemente um maior percentual de

colágeno na área da lesão. Esse resultado poder ser atribuído aos efeitos

desencadeados pelo LBP no processo inflamatório, melhorando a cicatrização

tecidual local (GOMEZ-VILLAMANDOS, 1995; AL-WATBAN ,1996).

Os resultados quantitativos do colágeno analisados estatisticamente ,

demonstraram que os grupos irradiados apresentaram índices muito melhores

que o controle e placebo. A média de percentagem entre ambas as colorações

utilizadas, evidenciaram um aumento significativo do colágeno nos grupos

irradiados.

As amostras do grupo 685-4 (685nm , 4J/cm2) obteve um aumento

significativo no colágeno, comparados com o grupo controle e placebo, tanto na

média percentual do colágeno, como nos índices mínimos e máximo.

Resultados de uma melhor resposta na cicatrização de pele, tem sido descritos

por diversos autores, utilizando comprimentos de onda próximos ao utilizado e

doses de energia idênticas (BRAVERMAN et al, 1989; GHAMSARI et al., 1997;

WEBB, DYSON, LEWIS; 1998; REDDY, STEHNO-BITTEL, ENWEMEKA, 1998;

BISHT et al, 1999).

As amostras do grupo 685-40 (685nm, 40J/cm2) também apresentaram

um aumento significativo do colágeno comparados com o grupo controle e

placebo. Os índices encontrados, foram ainda maiores tanto na média como

menor percentual encontrado. O índice máximo foi um pouco inferior ao grupo

V4. A literatura apresenta que densidades de energia altas poderiam apresentar

efeitos inibitórios, como os encontrados por Al-Watban et al. (2000), em seus

estudos. Por outro lado outros trabalhos corroboram com nossos achados,

demonstrando que doses maiores podem apresentar resultados positivos na

cicatrização tecidual (SCHINDL et al.,1999 e 2002).

As amostras do grupo 830-4 (830nm , 4 J/cm2) apresentaram diferença

significativa na quantidade de colágeno, quando comparadas com o controle e

placebo. Este grupo também apresentou média e índices mínimo e máximos

superiores. Por outro lado foi o grupo que apresentou menores resultados no

percentual de colágeno. Em recente estudo (VERA MENDEZ, 2002) utilizando o

mesmo comprimento de onda e uma dose maior, também apresentou uma

menor resposta de cicatrização, comparadas com doses mais elevadas. Por

outro lado a literatura consultada apresenta resultados positivos utilizando, hora

comprimentos de ondas idênticos ou próximos com doses baixas (LAGAN et al.,

2001; TATARUNAS, MATERA, DAGLI, 1998)

As amostras do grupo 830-40 (830nm, 40J/cm2) apresentaram

diferenças significativas comparadas com o grupo controle e placebo. Este

grupo foi o que apresentaram as melhores médias e limites mínimo e máximo,

superiores a todos os grupos. Na literatura consultada os comprimentos de

onda no espectro visível são os mais indicados para o processo de reparo

tecidual (RIGAU, 2000; ALMEIDA-LOPES, 2002). Entretanto a utilização deste

comprimento de onda e sua resposta na formação de colágeno, possa ser

justificado por uma maior penetração do LBP, estimulando a produção de

colágeno mais profundamente, sendo um dos possíveis indicativos dos achados

neste grupo (AL-WATBAN, 2001). Os efeitos com positivos densidade de

energia elevada, também foram encontrados no trabalho de CAPON et al.

(2001).

Na analise comparativa entre os grupos irradiados, submetidos ao

tratamento estatístico, pode-se notar que não houve diferença significativa entre

as amostras dos grupos 685-4, 685-40 e 830-40. Por outro lado as amostras

do grupo 830-4, apresentou um menor índice de percentual de colágeno,

comprovados estatisticamente, quando comparados com os outros grupos

experimentais. Embora este grupo apresentou resultados inferiores, ainda

assim foram encontrados efeitos positivos da ação do LBP na cicatrização.

Paralelamente inúmeros autores tem encontrados resultados negativos,

utilizando CO próximos ao utilizado e com densidades de energia similares

(PETERSEN et al., 1999; HALL et al., 1994; ANNEROTH et al.,1988; LONGO

et al., 1987).

Em relação ao colágeno, alguns estudos confirmam que o laser tem a

capacidade de estimular a proliferação fibroblástica e induzir tais células a

produção de grandes quantidades de colágeno. (SKINNER et al., 1996; REDDY

et al., 1998).

Após analisar os resultados obtidos nesta pesquisa, com a utilização do

LBP em lesões térmicas, foi possível verificar que a quantidade de colágeno

estava aumentada nos grupos irradiados, sendo este aumento significativo

quando defrontados com os resultados do grupo controle e placebo. Obteve-se

uma melhor resposta, utilizando-se os comprimento de onda de 830nm e 40

J/cm2 e o Comprimento de onda de 685nm com 4 J/cm2 e 40 J/cm2.

6. CONCLUSÃO

6. CONCLUSÃO

Este trabalho mostra evidências que o LBP apresentou resultados positivos

sobre o processo de cicatrização tecidual com o a metodologia empregada,

pode-se concluir que:

1 - Os grupos irradiados com LBP apresentaram melhores resultados na

quantidade de colágeno que o grupo controle e placebo. Os efeitos positivos do

LBP, pode ser observado em todos os grupos.

2 – As densidades de energia e comprimento de onda por ordem decrescente

que apresentaram repostas superiores na formação do colágeno foram 830 nm

e 40 J/cm2, 685 nm e 40 J/cm2, 685 nm e 4 J/cm2 e 830 nm e 4 J/cm2.

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