UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE

UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

WOLNEI LUIZ AMADO CENTENARO

OCORRÊNCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM SALIVA E

CAVIDADE NASAL EM AMBIENTES HOSPITALAR E

ODONTOLÓGICO.

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências da Saúde da

Universidade do Extremo Sul

Catarinense - UNESC, como requisito

parcial para a obtenção do título de

Doutor em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Felipe Dal-Pizzol

CRICIÚMA

2016

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

A ficha catalográfica é confeccionada pela Biblioteca

Central da UNESC.

Tamanho: 7cm x 10,5cm

Fonte: Times New Roman 10,5

Maiores informações em pelo e-mail rwe@unesc.net ou

pelo telefone 3431 2592.

mailto:rwe@unesc.net

WOLNEI LUIZ AMADO CENTENARO

OCORRÊNCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM SALIVA E

CAVIDADE NASAL EM AMBIENTES HOSPITALAR E

ODONTOLÓGICO.

Esta tese foi julgada e aprovada para obtenção do Grau de Doutor em

Ciências da Saúde na área de Ciências da Saúde no Programa de Pós-

Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul

Catarinense.

Criciúma, 16 de dezembro de 2016.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Felipe Dal-Pizzol – Dr. – Universidade do Extremo Sul

Catarinense - Orientador

Prof. Eduardo Rico – Dr. Membro Relator - Universidade do Extremo

Sul Catarinense

Prof. Ricardo Andrez Machado de Avila – Dr. Membro Interno -

Universidade do Extremo Sul Catarinense

Professora Cristiane Damiani Tomazi – Dra. Membro Externo -

Universidade do Extremo Sul Catarinense

Prof. Francisco Montagner – Dr. Membro Externo -

Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Wolnei Luiz Amado Centenaro

Doutorando

FOLHA INFORMATIVA

Esta tese foi elaborada seguindo o estilo Vancouver e será apresentada

no formato tradicional. Este trabalho foi realizado nas instalações do

Laboratório de Fisiopatologia Experimental do Programa de Pós-

graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul

Catarinense

“Aos meus exemplos de caráter,

ética, dedicação, valores e

humildade; meus Pais José

Centenaro e Elza Amado

Centenaro”.

AGRADECIMENTOS

“Quantas pessoas queridas o tempo (Deus) me emprestou ou me

deu para guardar, mas depois as chamou para dançar, no seu ritmo”...

Gabriel o Pensador

In memoriam, Vô José e Vô Colin.

Ao Prof. Dr. Felipe Dal-Pizzol meu orientador o apoio contínuo e

a confiança que depositou em mim. Sem ele não teria sido possível a

realização deste estudo.

Aos Diretores da Uri Campus Elisabete Maria Zanin ,Paulo

Roberto Giollo ,Paulo José Sponchiado pelo apoio financeiro e

incondicional nos momentos mais difíceis deste longo período.

A colega de Doutorado e Professora de Microbiologia da Unesc

Cleonice Maria Michelon pelos ensinamentos e ajuda necessários na

área

Aos meus colegas e minhas colegas do laboratório de

Fisiopatologia da Unesc, Priscila Ávila, Danusa Damásio que tornou

possível o trabalho no Hospital São José e em especial à Monique

Michels, sempre prestativa, amiga, participativa e conselheira. A ciência

ainda vai ouvir falar muito este nome e lhe será muito grata.

Ao Coordenador do Curso de Odontologia da UNESC-SC Renan

Antônio Ceretta pelo apoio nas Clínicas da Unesc

Aos meus colegas e professores do curso de Odontologia da Uri

Fabiane Schreiner, Roberto Carlos Soccol, Valdomiro Simoneti, Claiton

Giovani Tirello, Elize Tatiane Ribeiro Bonafe, Silvane Souza Roman e

Gabriele Fahl pelas substituições de horários, conselhos e amizade

nestes anos em que a ética e o coleguismo permeiam nosso

relacionamento.

Aos funcionários do Curso de Odontologia Tiago Ambrosio

Lazareti e Carine Pereira que estão comigo nesta caminhada desde o

início e que sempre foram imprescindíveis na nossa labuta

Aos recepcionistas da Uricepp Roberto e Sergio por me

acompanharem nas noitadas de estudos e trabalhos.

A Gabriela da Rosa Cunha PhD student, researcher Harvard

Medical School at Massachusetts Eye & Ear Infirmary, Doutoranda

UFCSPA, por saber sobrepor as barreiras e dedicar-se ao máximo na

construção deste estudo.

Aos meus irmãos Wolmir, Gustavo e Marizélia, pelas orações e

preocupações com as incontáveis viagens e quilometragens percorridos.

Aos meus filhos Carlos Eduardo e Ana Júlia, que souberam

entender que minhas ausências eram fruto de um buscar conhecimentos

que possam servir de exemplos à eles na vida e que a cada retorno o

meu amor por eles havia aumentado.

A minha esposa Analise que soube suportar minhas angústias e

incertezas com paciência, dedicação, amor e discernimento, pelas noites

em claro que passei na frente do computador estudando, pela ausência

em momentos importantes e difíceis em nossas famílias sem poder lhe

dar um ombro para chorar e ouvido para ouvir seus desabafos, pelo

exemplo de dedicação ao trabalho e ao cumprimento de deveres, pela

educação de meus filhos a ti minha eterna gratidão e amor, entendendo

que:

“Amar é acreditar no outro, dividir sonhos, receber, entregar,

perdoar, compreender, aceitar. Amar é querer estar junto, e se separados,

unidos pelo pensamento, pelos objetivos, pelos mesmos desejos”.

E por fim e não menos importante agradeço, sobretudo a DEUS

por ter me permitido chegar até aqui, porque se ele não tivesse sido

corajoso e deixado que parassem o coração dele, o meu não estaria

batendo hoje).

Letícia Gilbert

RESUMO

Staphylococcus aureus, são micro-organismos pertencentes a microbiota da cavidade nasal e podem habitar também a cavidade oral. Cepas

resistentes a antibióticos, particularmente a meticilina (MRSA) podem

trazer riscos a ambientes hospitalares, ambulatórios e para a

comunidade. O objetivo desse estudo é avaliar a prevalência de

colonização por Staphylococcus aureus, em profissionais, acadêmicos e superfícies odontológicas comparando as prevalências com as

encontradas em funcionários de uma UTI Hospitalar. Para isso,

coletamos secreção salivar e nasofaringea de profissionais de uma UTI

hospitalar, cirurgiões-dentistas, auxiliares em saúde bucal, acadêmicos

de duas Universidades distintas e também de superfícies no ambiente de

trabalho odontológico. Após coletado, material foi semeado em sal ágar

manitol. As colônias isoladas obtidas foram submetidas a coloração de

Gram para avaliação da morfologia e arranjo celular. O screening para resistência a meticilina foi realizado utilizando meio cromogênico

(MRSA), e as colônias características a resistência foram então

submetidos ao teste antimicrobiano de disco difusão para oxacilina e

cefoxitina. A confirmação genotípica foi avaliada por amplificação do

gene mecA e LukS-lukF, por meio de PCR. Cento e noventa e seis amostras foram coletadas, provenientes de 156 indivíduos e 40

superfícies. Obteve-se 93 cepas de Staphylococcus aureus em

indivíduos e 05 em superfícies. Destas, 08 provenientes de colonização

nasal e 03 de colonização salivar foram caracterizadas genotipicamente

para MRSA. Somente 04 amostras apresentaram os genes LukS-lukF,

caracterizando cepas de origem comunitária. Embora tenhamos obtido,

como resultados, um pequeno número de isolados que apresentaram

(MRSA), existe uma prevalência de associação em ambientes

odontológicos com ambientes hospitalares. Mais estudos devem ser

realizados para confirmar essa prevalência.

Palavras-chave: Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina.

Exposição à Agentes Biológicos. Resistência Microbiana a

Medicamentos. Odontologia.

ABSTRACT

Staphylococcus aureus, are bacterial belonging to the flora of the nasal cavity and may inhabit the oral cavity. Antibiotic-resistant strains,

particularly methicillin (MRSA), can pose risks to hospital, outpatient,

and community settings. The objective of this study is to evaluate the

prevalence of colonization by Staphylococcus aureus in professionals,

academics and dental surfaces comparing the prevalence with those

found in employees of a Hospital ICU. For this, we collected salivary

and nasopharyngeal secretions from professionals of a hospital ICU,

dental surgeons, oral health aides, academics from two different

universities and from surfaces in the dentistry work environment. After

being collected, material was seeded in mannitol agar. The isolated

colonies were submitted to Gram staining to evaluate the morphology

and cellular arrangement. Screening for methicillin resistance was

performed using chromogenic medium (MRSA), and the resistance-

characteristic colonies were then submitted to the antimicrobial disk

diffusion test for oxacillin and cefoxitin. Genotypic confirmation was

assessed by amplification of the mecA and LukS-lukF gene by PCR. One hundred and ninety-six samples were collected from 156 individuals and

40 surfaces. A total of 93 strains of Staphylococcus aureus were obtained in subjects and 05 on surfaces. Of these, 08 from nasal

colonization and 03 from salivary colonization were characterized

genotypically for MRSA. Only 04 samples showed the LukS-lukF genes, characterizing strains of community origin. Although we obtained, as

results, a small number of isolates that presented (MRSA), there is a

prevalence of association in dental environments with hospital

environments. Further studies need to be performed to confirm this

prevalence.

Keywords: MRSA drug Resistance. Exposure to biological agents.

Drug Resistance to microbial dentistry.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Fatores de virulência......................................................... 13

Figura 2 – Gene mecA........................................................................ 25

Figura 3 – Dinâmica de transmissão de MRSA entre pacientes e

profissionais da saúde........................................................................ 30

Figura 4 – Identificação de Staphylococcus aureus....................... 35

Figura 5 – Crescimento de colônias de MRSA em CHROMagar

MRSA............................................................................................... 36

Figura 6 – Resistência/Sensibilidade Cefoxitina e Oxacilina.......... 37

Figura 7A – Identificação de S.aureus.............................................. 41

Figura 7B – Identificação da resistência por meio cromogênico..... 42

Figura 7C – Comprovação da resistência por TSA........................... 43

Figura 8A – Associação de colonização entre os grupos por MSSA

nasal................................................................................................... 44

Figura 8B – Associação de colonização entre os grupos por MSSA

salivar................................................................................................. 44

Figura 8C – Associação de colonização entre os grupos por MRSA

nasal................................................................................................... 45

Figura 8D – Associação de colonização entre os grupos por MRSA

salivar................................................................................................. 45

Figura 8E – Associação de colonização entre os grupos por MRSA

– TSA nasal........................................................................................ 45

Figura 8F – Associação de colonização entre os grupos por MRSA

– TSA salivar..................................................................................... 45

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Determinantes de Virulência do S. aureus................. 17

Tabela 2 – Mecanismo de Resistencia aos antibióticos de S.

aureus e genes associados.......................................................... 22

Tabela 3 – Caracterização da população em estudo..................... 39

Tabela 4 – Identificação dos genes mecA e PVL.......................... 46

Tabela 5 – Variáveis com Nível de Significância Estatística......... 47

Tabela 6 – Frequência da utilização de Antimicrobianos por conta

própria..................................................................................... 48

Tabela 7 – Frequência da Troca de Máscara............................... 49

Tabela 8 – Frequência da troca do Gorro....................................50

Tabela 9 – Desinfecção do Óculos de Proteção........................... 51

Tabela10 – Risco oferecido pela colonização em profissionais de

saúde....................................................................................... 52

Tabela 11 – Aspectos relativos da jornada de trabalho................. 53

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Agr – Gene Regulador Acessório VIH - Vírus da Imunodeficiência Humana

AP- PCR - Arbitary Primer Polimerase Chain Reaction

attBscc - SCCmec attachment site

BORSA - Bordline Staphylococcus aureus

CAPF CA - MRSA. Adquiridas na comunidade

ccr - cassete cromossoma recombinase

ETA -Toxina Exfoliativa A

ETB - Toxina Exfoliativa B

FemA - fem, Factor Essential for Methicillin resistance.

HA – MRSA Adquirida em Hospital

HBR - Região Hipervariável

HCV -Vírus da hepatite C

Hla - Alfa-toxina

Hla - Alfa-hemolisina

H2O2 – Peróxido de Hidrogênio

IRAS - Infecção Relacionada à Assistência à Saúde

IPTM - Infecção de Pele e Tecidos Moles

ISS - Integration Site Sequence

JK - Região Junkiard

LPS - Lipopolissacarídeo

MCH - complexo principal de histocompatibilidade.

MGE - mobile genetic elemets

MLEE - Multilocus Enzyme Electrophoresis

MLST - multilocus sequence typing

MODSA - modified Staphylococcus aureus

MRSA - Staphylococcus aureus resistentes a meticilina MSSA - Staphylococcus aureus sensível a meticilina

MLEE - Multilocus enzimático eletroforético

MLST - Multillocus Sequence Typing

MSCRAM - - Microbial Surface Components Recognizing Adhesive

Matrix Molecules NaCl NAM N-acetilmurâmico

NAG N acetiglosoamina

NCCLS - Clinical and Laboratory Standards NDA

ORFs - Open reading frames

O2 – Gás Oxigênio

PBP Penicillin Binding Proteins

PCR Polymerase Chain Reaction

PCR - Ribotipagem ou Ribo-PCR PCR -AP-PCR - Polimorfismo

Amplificado pela Reação em Cadeia da Polimerase

PCR - RFLP - Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de

Restrição

PFGE - Pulsed-field gel electrophoresis

pH – Potencial de Hidrogênio

QS - Quorum Sensing.

rep-PCR- Palindrômicas Extragênicas Repetidas RFLP - Polimorfismos

de fragmentos de restrição.

SarA - Staphylococcal accessory regulator

S.aureus - Staphylococus aureus SCCmec Staphylococcal Cassette Chromosome mec

SCV - Small Colony Variants

SE - Enterotoxins

Taq. DNA Polimerase Termoestável

TCRs - Two Component Regulatory Systems

TSTT-1 Toxic Shock Syndrome Toxin-1

TSS - Choque Tóxico Estafilocócico

UTI – Unidade de Terapia Intensiva

VISA - Vancomycin Intermediate Resistant S. aureus

VRSA - Vancomycin Resistant S. aureus WTAs - Ácidos Teicóicos

5 CP5 – Polissacarídeo Celular Sorotipo 5

8 CP8 - Polissacarídeo Celular Sorotipo 8

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................ 11

1.1. DESCRIÇÃO DA BACTÉRIA ............................................11

1.2. EPIDEMIOLOGIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS..... 13

1.3. FATORES DE VIRULÊNCIA............................................. 16

1.4. RESISTENCIA STAPHYLOCOCCUS AUREUS A AGENTES ANTIMICROBIANOS.............................................20

1.5. GENE MECA..................................................................... .. 24 1.6. STAPHYLOCOCCAL CASSETTE CHROMOSSOME –

SCCMEC.................................................................................. ...27

1.7. COLONIZAÇÃO/CONTAMINAÇÃO................................28

1.7.1. Colonização/Contaminação em odontologia................. 30

1.8. JUSTIFICATIVA................................................................. 32

2 OBJETIVOS............................................................................. 33

2.1. OBJETIVO GERAL............................................................. 33

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................ 33

3 MATERIAS E MÉTODOS....................................................... 34

3.1. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS.............................................. 34

3.2. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO........................... 34

3.3. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS......................................... 34

3.4. CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS.......................... 34

3.4.1. Identificação de Staphylococcus aureus......................... 34

3.4.2. Identificação de MRSA................................................... 35

3.4.2.1. Meio Cromogênico...................................................... ...35

3.4.2.2. Teste de Susceptibilidade a antimicrobianos.................. 36

3.4.3. Detecção dos Genes mecA e lukS-lukF........................... 37

3.4.4. Eletroforese de campo pulsado (PFGE)......................... 37

3.5. ORGANIZAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA................. 37

4. RESULTADOS........................................................................ 38

4.1. POPULAÇÃO...................................................................... 38

4.2. IDENTIFICAÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

ENTRE OS GRUPOS................................................................. 39

4.3. IDENTIFICAÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

RESISTENTE POR CHROMagar............................................... 39

4.4. RESISTÊNCIA POR TSA E ASSOCIAÇÃO ENTRE

COLONIZAÇÃO NASAL E SALIVAR..................................... 40

4.5. SIMILARIDADE ENTRE GRUPOS COLONIZADOS...... 43

4.5.1. Colonização nasal e salivar em grupos colonizados por

S. aureus...................................................................................... 43

4.5.2. Resistencia nasal e salivar por CHROMagar................ 44

4.5.3. Resistência nasal e salivar por TSA................................45

4.6. IDENTIFICAÇÃO DO GENE MECA É RESPONSÁVEL PELA CODIFICAÇÃO DE PVL................................................. 46

4.7. INSTRUMENTO DE CARACTERIZAÇÃO

PROFISSIONAL.......................................................................... 46

4.7.1. Uso de antimicrobianos por conta própria.................... 47

4.7.2. Frequência de troca de Máscaras................................... 48

4.7.3. Frequência de troca de Gorros........................................ 49

4.7.4. Desinfecção do óculos de proteção.................................. 50

4.7.5. Profissional de saúde colonizado por germes

resistentes aos antimicrobianos oferece algum risco?.......... 51

4.7.6. Aspectos relativos a jornada de trabalho...................... 52

5 DISCUSSÃO............................................................................. 54

6 CONCLUSÃO........................................................................... 60

REFERÊNCIAS...........................................................................61

APENDICE.................................................................................. 81

APENDICE I................................................................................ 82

ANEXOS...................................................................................... 86

ANEXO I...................................................................................... 87

ANEXO II.................................................................................... 90

11

1 INTRODUÇÃO

1.1. DESCRIÇÃO DA BACTÉRIA

Taxonomicamente o micro-organismo Staphylococcus aureus,

classifica-se como pertencente ao Domínio Bactéria, Filo Firmicutes;

Classe Bacilos; Ordem Bacillales; Família Staphylococcaceae; Gênero

Staphylococcus e espécie Staphylococcus aureus, Gram-positivas.

Apresentam-se geralmente em forma de cocos (esféricas), com células

de cerca de um micrômetro de diâmetro, que se juntam em colônias

parecidas, quando vistas ao microscópio óptico com aglomerados

semelhantes a cachos de uva. O nome é derivado da palavra grega

“staphylé” que significa "cacho de uvas" e refere-se ao padrão de

crescimento do micro-organismo (Murray et al., 2008). Rosenbach,

(1884), descreveu dois tipos de colônias pigmentadas de Staphylococcus

as quais foram denominadas de Staphylococcus aureus (amarelos) e

Staphylococcus albus (brancos), esta última espécie atualmente denominada de Staphylococcus epidermidis.

Apesar de existirem mais de 40 espécies de Staphylococcus

descritos no Manual de Bergey (Garrity et al., 2001), apenas

Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, apresentam

interações significativas com seres humanos. Os primeiros colonizam

principalmente a nasofaringe e orofaringe, mas podem ser encontrados

regularmente na maioria dos outros locais anatômicos, incluindo a pele,

cavidade oral e trato gastrointestinal (Robert et al., 2005; Velázquez-

Meza, 2005). São anaeróbios facultativos, que crescem por respiração

aeróbica ou por fermentação, produzindo ácido lático, principalmente

(Murray et al., 2008). Estes micro-organismos são catalase positivos, ou

seja, a adição de H2O2 (água oxigenada) a uma cultura de

Staphylococcus aureus produz O2 (oxigênio) livre, visível através do borbulhamento, além de serem oxidases negativa e piogênicos por

excelência. Podem crescer numa gama de temperaturas de 15 a 45°C e

em concentrações de pH tão elevadas como 15% de NaCl. (Euzéby,

2004; Koneman et al., 2012; Todar, 2014). A maioria das espécies de

estafilococos são coagulase-negativos, entre as exceções estão

Staphylococcus aureus (Kloos et al., 1995; Bannerman et al., 2012).

As bactérias regulam muitos processos em resposta à

sinalização celular. Nestes processos estão incluídos os fatores de

virulência, e a produção e formação de biofilmes (Cervantes et al.,

12

2014). Além disso, estes microrganismos utilizam esta sinalização para

regular a densidade da população conhecida como percepção de

quórum. Estes sistemas em Staphylococous são denominados de sistema

“QS” (Quórum Sensing). Os mesmos possuem enorme impacto na

bactéria durante a infecção, controlando a fisiologia e os fatores de

virulência. São regulados pelo complexo gênico agr (gene acessório regulador) (Cervantes et al., 2014).

Referente à composição e estrutura dos Staphylococcus aureus, os mesmos apresentam como componente citoplasmático em suas

células, o nucleóide, onde se encontra o cromossoma do microrganismo;

os ribossomos que são responsáveis pela síntese proteica; os plasmídios

que são moléculas circulares de DNA e que são capazes de

autoduplicação independente da replicação cromossômica e que estão

envolvidos na resistência destes aos antimicrobianos (Santos et al.,

2007). Além disso, podemos encontrar, raramente, flagelos, que são

responsáveis pela movimentação das células bacterianas.

Na sua grande maioria a resistência bacteriana deste micro-

organismo pode estar presente na constituição de sua parede celular,

sendo este um componente extremamente importante para a

sobrevivência e patogenicidade do mesmo. Esta, por sua vez é

constituída por uma cápsula formada por uma única camada frouxa de

polissacarídeos que protege a bactéria ao inibir a quimiotaxia e a

fagocitose, facilitando ainda a aderência em materiais sintéticos. A

mesma é constituída ainda por um peptídeoglicano, que se trata de um

componente estrutural composto de cadeias de glicano de ligação

cruzada com peptídeos conferindo maior rigidez à parede celular (Figura

1).

Na sequência da cápsula encontra-se a proteína A que reveste a

superfície destes micro-organismos e se liga a camada de

peptídeoglicano, sendo responsável e eficaz na prevenção da eliminação

da bactéria pelo sistema imune, impedindo a opsonização da mesma.

Além disso, fazendo parte desta constituição, aparecem os ácidos

teicóicos, que são polímeros que contêm fosfatos ligados à camada de

peptídeoglicano ou à membrana plasmática e são responsáveis pela

mediação da fixação destes micro-organismos às superfícies mucosas.

Na cápsula ainda, encontramos o fator de aglutinação e por fim, a

membrana citoplasmática, formada por um complexo de carboidratos,

proteínas e lipídeos, que atuam como barreira osmótica e local para a

fixação de enzimas (Todar, 2014; Oogai et al., 2011; Kavanaugh e

Horswill, 2016).

13

Outra característica importante desta bactéria e que a torna

diferenciada, é a capacidade de produzir biofilmes. O crescimento de

micro-organismos em biofilmes fornece uma grande capacidade de

adaptação das bactérias às diferentes condições ambientais.

Figura 1: Fatores de virulência S.aureus.

Fonte: adaptada de Vaudax et. al 1994.

1.2. EPIDEMIOLOGIA DE Staphylococcus aureus

No ser humano, Staphylococcus aureus pode sobreviver como

colonizador persistente em (20%) destes (30%) como colonizador

transitório (intermitente), e em torno de 50% correspondem a não

colonizados. Seu local anatômico predileto de colonização estabelece-se

na orofaringe de adultos (Kluytmans et al., 1997). A taxa de colonização

nasal em seres humanos sadios varia de 10 a 40%, taxas mais altas

ocorrem em pacientes que por motivos de doenças diversas apresentam

graus de imunidade baixa, especialmente em pacientes submetidos a

procedimentos cirúrgicos ou à hemodiálise em que estas taxas de

colonização podem chegar acima dos 50% (Von Eiff et al., 2001;

Laupland et al., 2003; Nu et al., 1986). A taxa de colonização a nível

mundial decresce com o passar dos anos, em países com maior poderio

financeiro e em especial nos países escandinavos, nas últimas décadas.

Nos anos 30 a mesma correspondia a 35%, (Kluytmans et al., 1997), nos

anos 2000, decresceu para 27%, (Nulens, 2005). Esta realidade, no

14

entanto, não é a mesma em países subdesenvolvidos ou em

desenvolvimento.

São multifatoriais os mecanismos que levam à colonização por

esta bactéria. Existe um verdadeiro tropismo entre o microorganismo e o

hospedeiro, isto quer dizer, que são as condições do hospedeiro que vão

determinar esta colonização (Cole et al., 2001). Além do que as taxas

variam entre gênero, raça e idade. Herwaldt et al., (2004) reforça a

afirmativa feita anteriormente de que pacientes imunodeprimidos, tais

como, dependentes de insulina, usuários de hemodiálise ou diálise

peritoneal, doença hepática avançada, obesos, com histórico de

acidentes vasculares e cerebrais, HIV positivos e com doenças de pele

crônicas são os mais propensos a serem colonizados intermitentemente.

A respeito da colonização por MRSA (Staphylococcus aureus

resistentes a meticilina), na era pré-antibiótica, infecções por

Staphylococcus aureus eram geralmente fatais. Em um estudo de

revisão de casos no início dos anos 1940, a mortalidade entre os 122

pacientes participantes foi de 82%, e de 98% naqueles com idade maior

que 50 anos. Na era moderna, estima-se que 25-35% dos indivíduos

humanos saudáveis são portadores deste micro-organismo na pele ou

mucosas. Isto significa que até dois bilhões de pessoas atualmente

podem transmitir Staphylococcus aureus resistentes a meticilina em todo o mundo, e estimativas conservadoras baseadas em dados de

prevalência, holandeses e norte-americanos prevêem que entre 2-53

milhões de pessoas portadoras de MRSA, sejam a causa de infecções

associadas aos hospitais. A taxa de mortalidade associada a infecções

invasivas por MRSA é de 20%, mas varia consideravelmente entre os

estudos em diferentes contextos (Haidegge et al., 2015).

Embora os dados epidemiológicos de estudos muitas vezes não

possam ser comparáveis, devido às diferenças no desenho dos mesmos e

populações amostradas, as maiores taxas (>50%) são relatados na

América do Norte, América do Sul, Ásia e Malta. Taxas intermediárias

(25-50%) são relatadas na China, Austrália, África e alguns países

europeus como, por exemplo, Portugal (49%), Grécia (40%), Itália

(37%) e na Romênia (34%). Outros países europeus têm taxas de

prevalência geralmente baixas (Países Baixos e Escandinávia)

(Haidegge et al., 2015).

Este micro-organismo apresenta uma importância

extraordinária do ponto de vista epidemiológico e clínico. Em hospitais,

o mesmo pode apresentar-se de forma epidêmica e endêmica, levando-se

em conta que é um dos patógenos que infecta a maior quantidade de

pacientes submetidos a procedimentos invasivos (Layton et al., 1996).

15

Trata-se de um micro-organismo multirresistente (betalactâmicos e

outros antimicrobianos) o que determina geralmente o fracasso do

tratamento empírico e dificuldade no tratamento das infecções por ele

causado (Schmitz et al., 1997).

Nos últimos anos o problema ocorre além dos limites

hospitalares, pois foram descritas, recentemente, cepas de MRSA,

distintas e de aquisição comunitária. Tipicamente, colonização por

MRSA é adquirido no hospital e esta ocorre através de uma infecção,

que se manifesta após 48 horas à exposição nosocomial. Um paciente

infectado ou colonizado é o suficiente para introduzir esta colonização

nestes novos ambientes (Gorak et al., 1999). A forma de transmissão

mais aceita e conhecida é aquela que ocorre através das mãos dos

cuidadores ou através do acúmulo em superfícies, causando epidemias

tanto em ambientes hospitalares como comunitários, além disso, a

prescrição indiscriminada e empírica de antibióticos contribui para a

aquisição do fator resistência e consequentemente facilita a colonização,

por esta forma não sensível a antimicrobianos (Wilcox, 2005).

Epidemiologicamente é importante não confundir MRSA

adquiridos na comunidade, denominados (HA-MRSA), com as espécies

resistentes, adquiridas em ambientes hospitalares (CA-MRSA),

Staphylococcus aureus resistentes a meticilina de origem hospitalar, que apesar de parecer ter uma origem comunitária, são provenientes de

pacientes que estiveram em contato com algum tipo de assistência à

saúde, de onde adquiriram a bactéria (Fridkin et al., 2005). As

diferenças básicas entre os dois tipos de MRSA, são as seguintes:

ausência de fatores de risco clássicos para contrair MRSA, CA-MRSA,

incide mais em crianças e jovens e são mais sensíveis a várias classes de

antibióticos do que os de origem nosocomial. Além disso, CA-MRSA,

possui fatores de virulência específicos. São tipicamente portadores de

genes para a codificação da Leucocidina de Panton Valentine (PVL),

que é uma toxina que pode causar necrose tecidual e destruição

leucocitária, apresentam somente o cassete cromossômico SCCmec

(Staphylococcal Cassette Chromosome mec) tipo IV, causam infecções

de mucosas graves e raramente necrosantes (Lina et al., 1999; Said,

2003; Naimi et al., 2003; Robinson et al., 2005).

As causas desta proliferação e aparição de cepas comunitárias,

ainda não estão devidamente esclarecidas e supõe-se atribuídas a fatores

diversos. Assim como as demais formas de resistência aos

antimicrobianos, uma das causas possíveis pode ser o uso

indiscriminado dos mesmos. Uma particularidade em relação a estas

cepas é que todas contém o SCCmec tipo IV, que é de um tamanho

16

reduzido em relação aos demais SCCmec(s), o que teria facilitado a

transferência dos genes de resistência entre seus pares. A presença de

fatores de virulência que facilitam a infecção por este tipo de

microorganismo pode também contribuir para a proliferação do CA-

MRSA (Charlebois et al., 2004; Weber et al., 2005).

Um dos primeiros relatos de MRSA adquirido em uma

comunidade na América Latina teve origem no Uruguai, em 2001, em

quatro crianças sem fatores de risco tradicionais para infecção por HA-

MRSA (Galiana et al., 2001). Um artigo que descreveu um grande surto

de CA-MRSA em Montevidéu, Uruguai, sugere que CA-MRSA é um

problema crescente na América Latina (Mejía et al, 2010). Desde então,

MRSA vem sendo identificado como causa de infecções adquiridas na

comunidade por toda a América Latina, embora os dados publicados se

limitem a apenas alguns países, e a certos locais nesses países.

A prevalência de HA-MRSA tem diminuído nos últimos anos

em alguns países europeus, por exemplo, Áustria, França, Irlanda, Reino

Unido e Grécia. Em outros países a prevalência permaneceu

relativamente estável. No entanto, taxas muito altas de CA-MRSA são

relatados na Ásia Oriental, especialmente no Sri Lanka (86,5%), Coréia

do Sul (77,6%), Vietnã (74,1%), Taiwan (65,0%), Tailândia (57,0%) e

Hong Kong (56,8%). Em contraste, existem taxas relativamente baixas

na Índia (22,6%) e Filipinas (38,1%), (Szilagyi et al., 2013).

1.3 FATORES DE VIRULÊNCIA

A espécie resistente deste micro-organismo era um agente

patogênico humano confinado aos hospitais durante mais de 30 anos. O

CA-MRSA emergiu nas últimas duas décadas em todo o mundo como

uma das principais causas de infecções graves em indivíduos saudáveis

na comunidade. A espécie resistente e comunitária surgiu localmente,

como dito anteriormente, pela aquisição do elemento genético móvel

SCCmec que transporta o gene mecA, por Staphylococcus aureus susceptíveis à meticilina (MSSA), ou alternativamente, tiveram origem

em cepas disseminadas de hospitais.

Staphylococcus aureus é considerado o mais virulento, dentre

seu gênero, graças a sua capacidade de adaptabilidade (Plata et al.,

2009). Os principais fatores que induzem às patogenias, tanto em seres

humanos como em animais são os componentes da superfície celular da

bactéria, além disso, contribuem para esta patogenicidade toxinas e

enzimas, nominadas como fatores de virulência extracelulares (Black,

2013).

17

A expressão dos fatores de virulência, especialmente as

exotoxinas, parece ocorrer principalmente durante a fase pós-

exponencial de crescimento e são reguladas por pelo menos três

sistemas regulatórios globais, são eles: o gene regulador acessório (agr),

regulador acessório estafilocócico (sar) e o regulador de proteína

extracelular (xpr). A formação de um biofilme maduro cuja estrutura

pode ter forma de fungo ou plana e que contem canais de água que

distribuem eficazmente nutrientes e moléculas de sinalização dentro do

mesmo, constitui mais um fator de virulência deste patógeno (Bohach et

al., 1997). Estes elementos e suas respectivas ações nos tecidos do

hospedeiro estão descritos na Tabela 1.

Tabela 1. Determinantes de Virulência do S. aureus.

Determinantes Ação tecido hospedeiro

Fatores da superfície

1. Cápsula Antifagocítica.

2. Componentes da Parede Celular:

Peptídeoglicano

Piogênico – Quimioatratrivo.

Ácido Teicóico

Liberado protege contra o

complemento.

3. Proteínas da Superfície Celular

Proteína A

Protege contra a IgG do

complemento.

Proteína de ligação ao fibrinogênio Liga-se ao fibrinogênio

(precede à fibrina).

Proteína de Ligação à Fibronectina Liga-se a Fibronectina

(proteína adesiva).

Proteina de ligação à laminina

Liga-se a laminina (Apresenta

vários sítios de ligação como

para receptores celulares

específicos).

Proteina de Ligação ao Colágeno

Liga-se ao colágeno

(Sustentação da cartilagem)

Proteina de Ligação a Vitronectina Liga-se a Vitronectina (Por

isso, a vitronectiva serve para

regular a proteólise pela

ativação do plasminogênio).

18

Fatores extracelulares

4. Toxinas Extracelulares

Alfa, Beta, Gama e Delta Toxinas.

Citotóxicas para os tecidos e

leucócitos.

Leucocidina P V Destrói leucócitos (leucocida).

Toxina da Síndrome do Choque

Tóxico

Liga-se às moléculas do MHC

(major histocompatibility

complex) da classe II induz

síntese de citocinas causando

múltiplas disfunções

orgânicas.

Enterotoxinas Heméticas e diarreias

Toxina Epidermolítica Lisa a ligação da célula com o

estrato granuloso

5. Enzimas:

Coagulase

Catalisa a conversão de

fibrinogênio em fibrina

Lipase Degrada os lipídeos

Proteases

Modifica ácidos graxos

liberados na degradação

lipídica e contribui com a

formação de abscessos;

Degrada as proteínas inclusive

as de defesa do hospedeiro.

Fosfolipases Degrada Fosfolipídios.

Estafiloquinase Converte plasminogênio

plasmina fibrinolítica

Hialuronidase Degrada o acido hialurônico

Nuclease Cliva DNA ou RNA.

Fonte: Autor (2016).

19

Esta espécie de Estafilococos possui um grande poder de

adesão ao hospedeiro, mediado por interações entre adesinas com

tecidos do mesmo (pele, mucosas, células da superfície endotelial). Esta

adesão ocorre através da matriz extracelular e proteínas do plasma do

hospedeiro de forma altamente específica, permitindo uma eficiente

colonização (Tamura et al., 2006). As adesinas destes micro-organismos

são proteínas da parede celular que pertencem à mesma família

denominada MSCRAMMs (componentes da superfície microbiana que

reconhecem moléculas adesivas da matriz), e que interagem com

proteínas do hospedeiro, tais como, fibrinogênio (C, D e E (SdrC, SdrD,

e SdrE), colágeno (Coa), elastina S (EbpS), fibronectina A e B (FnBPA,

FnBPB), e com os fatores de aglutinação A e B (ClfA, ClfB), (Clarke et

al., 2006; McDevitt et al., 1994).

MSCRAMMs, além de ser essencial para o metabolismo do

micro-organismo, devido ao importante fator de ligação com a célula

hospedeira, o mesmo tem sido implicado ainda na internacilização

(proteínas de ligação à fibronectina (FnBPs) promovem a fixação de S.

aureus na superfície da célula hospedeira, e subsequente internalização

de fagócitos), evasão imune, agregação e principalmente na formação do

biofilme bacteriano. A maioria dos MSCRAMMs é codificada no

genoma do núcleo, por conseguinte, são caracteristicamente estáveis e

possuem transferência hereditária vertical. Por esta razão, o sucesso de

clones de (MRSA) não tem sido, em geral, ligado a um MSCRAMM

específico. A única exceção é a adesina recentemente descrita, (SasX),

associada com a colonização e infecção excepcional do clone de (MRSA

ST239), embora (SasX) seja codificada sobre um MGE (mobile genetic

elements) (Chavakis et al., 2005; Li et al., 2012; Sinha et al., 2010).

Apenas recentemente, Staphylococcus aureus foi reconhecido

como um agente patogênico intracelular facultativo. Esta capacidade

permite à espécie mais um tipo de proteção contra o sistema imune de

defesa do hospedeiro. A mesma pode persistir em um estado “semi-

adormecido” conhecido como (SCV) do inglês (small colony variants), pequenas colônias variantes onde a expressão da virulência é

“desligada”, o que torna o micro-organismo intrinsecamente resistente a

sediar ataques do sistema imune e antibioticoterapia (Sendi et al, 2009;

Sinha et al., 2010; Voyich et al., 2005).

A expressão coordenada desses fatores de virulência é

controlada por elementos reguladores globais, incluindo: dois sistemas

de regulação de componentes (TCTs), onde o (Agr) gene acessório

regulador e uma exoproteína (SaeRS) são os mais relevantes. O segundo

sistema de regulação é representado pelo regulador global de

20

transcrição, tal como o regulador acessório estafilocócico (SarA), e o

homólogo de (SarA), assim como (Rot) além de (SarT), (SarS), (SarR),

(SarU), (SarV), (SarX), (SarZ), (MgrA) e (TeaR). A diferença do

conteúdo genético de cepas diferentes é a base molecular de sua

diferença na capacidade infectiva, tão variada e tão específica para cada

tipo de patologia causada. A extensa gama de doenças provocadas pelo

Staphylococcus aureus resulta da ativação de uma rede de regulação

intrincada, criada pela ativação destes reguladores, a fim de responder a

estímulos ambientais (Arvidson et al., 2001; Adcock, 1998; Cheung,

2004; Cheung, 1998; Giraudo, 1999; Lowy, 1998; Luong et al., 2003;

McNamara, 2000; Novick, 2003; Rogasch, 2006; Said et al., 2003).

1.4 RESISTÊNCIA DOS S. aureus AOS AGENTES ANTIMICROBIANOS

Staphylococcus aureus tem um genoma com tamanho aproximado de 2800 Kb, que está formado por um único cromossomo circular, onde

se encontram elementos genéticos móveis, bacteriófagos, plasmideos,

transposones e sequências de inserção (Pattee et al., 1990). O estudo

destes elementos permitiu explicar os mecanismos de transferência

genética entre cepas, que ocorreu mediante processos de conjugação,

transdução, transformação e mobilização por meio de plasmídeos

conjugativos. (Archer, 1991; Skurray, 1997). Os transposones são

fragmentos móveis de DNA geralmente cercados por sequências

repetidas, seu comprimento varia de poucos a milhares de pares de

bases. A transposição tem lugar através de dois mecanismos: um

consiste na excisão do elemento móvel para posteriormente inserir-se no

DNA alvo, o outro consiste em um mecanismo de retrotransposição que

mediante os transposons gera uma cópia de si mesmo e se insere no

DNA alvo.

As enzimas que catalisam os cortes destes elementos são

específicas e são codificadas nos próprios transposons, como no caso do

(Tn551) portador do gene (ermb), que confere a resistência a

eritromicina (Khan et al., 1980), (Tn 4001), portador de genes que

codificam a resistência a kanamicina, tobramicina e gentamicina (Lyon,

1984), (Tn, 4003), codificador da resistência a trimetropin (Rouch et al.,

1989), (Tn552) contem o gene (ermA) que confere a resistência à penicilina, pela produção de penicilinase (Rowland et al., 1989);

(Tn554) que contém os genes (ermA) para a resistência a eritromicina e

o gene (spc) referente à espectinomicina (Murphy et al., 1985). Os elementos mais utilizados na transferência genética são (Tn551) e

21

(Tn554) que se encontra com grande frequência no cromossoma de

(MRSA) e são utilizados para sequenciamento epidemiológico de clones

epidêmicos (Kreiswirth et al., 1990; Figueiredo et al., 1991; Dominguez

et al., 1994).

Os antibióticos podem exercer sua ação de forma bacteriostática

(inibindo crescimento) ou de forma bactericida (matando o

microorganismo). Isto pode ocorrer mediante o processo de inibição da

síntese da parede celular, como nos betalactâmicos e glicopeptídeos que

atuam inibindo distintos processos envolvidos na síntese do

peptídeoglicano. Podem ainda inibir a síntese proteica atuando em

diferentes níveis das subunidades dos ribossomos 30S e 50S, como

ocorre com os aminoglicosídeos, tetraciclinas, macrolídeos,

lincosamidas, estreptograminas, cetolideos, cloranfenicol, acido fusídico

e mupirocina. Além disso, podem bloquear a síntese dos ácidos

nucleicos como no caso das sulfonamidas, trimetropin e quinilonas, que

atuam inibindo o metabolismo do ácido fólico, e que interfere na síntese

de replicação de DNA ou da rifampicina que afeta a transcrição inibindo

a (RNA-polimerase) dependente do DNA (Konemann et al., 2012).

Mudanças nos ecossistemas naturais, incluindo o uso de grandes

quantidades de agentes antimicrobianos, alteraram a dinâmica das

populações de micro-organismos, incluindo a seleção de resistência,

com consequências para a saúde humana difíceis de serem previstas

(Martinez, 2008).

O surgimento da ocorrência da resistência a meticilina para esta

espécie de Estafilococos limitou o tratamento que antes era bem

sucedido com antimicrobianos da classe betalactâmicos. Esta se tornou

possível graças a aquisição por parte do Staphylococous aureus do gene

(mecA) (Muligan et al., 1993; Hiramatsu et al., 2001; Deuremberg et al.,

2007; Rodriguez-Baño et al., 2006). Com o passar do tempo estes

micro-organismos desenvolveram mecanismos de resistência a outras

classes de antimicrobianos. Entre elas incluímos a estreptomicina e a

eritromicina (Grundmann, 2006; Khan e Novick, 1980), gentamicina e

quinilonas (Townsend et al., 1987). A vancomicina ou teicoplanina

(glicopeptídeos) passaram a ser o tratamento de eleição para as

infecções por (MRSA), porém também para este tipo de antimicrobiano

aparecem mecanismos de resistência (Keiich et al., 2001).

Basicamente, a resistência a meticilina em Staphylococcus aureus, esta relacionada à presença de dois genes: (mecA) e (mecC),

especialmente o (mecA), codifica a síntese de uma nova proteína

fixadora de penicilina (PBP2a), que produz uma diminuição da

afinidade por antibióticos betalactâmicos. As PBP(s) são proteínas

22

localizadas na membrana bacteriana que catalisam as reações de

transpeptidizações do peptídeoglicano durante a síntese da parede

celular. Sem isto, esta parede é instável e débil, mecanicamente haverá a

saída de líquido celular e morte bacteriana (Georgopapadakou et al.,

1986; Giesbrecht et al., 1998; Berger Bächi et al., 1998). A PBP2

confere resistência a todos betalactâmicos (incluindo cefalosporinas,

penicilinas, carbapenens e monobactnas).

Outros mecanismos de resistência são observados, tais como

quando usamos usando-se a oxacilina, para teste. Isto ocorre devendo-se

a hiperprodução das betalactamases estafilocócicas, ou ainda pela

modificação das PBP1, 2, e 4. Embora os métodos fenotípicos sejam

utilizados, especialmente em países de menor poder aquisitivo para

identificação do gene (mecA), o padrão ouro para identificação do gene

é a PCR (Polymerase Chain Reaction) (Batista et al., 2008).

Tabela 2 – Mecanismos de Resistência aos Antibióticos de S.aureus e Genes Associados

Antibiótico Ação

Celular

Genes

de

Resistên

cia

Mecanismo de

Resistência

Betalactâmicos Betalacta

mases

blaZ Hidrolise enzimática

do núcleo

betalactâmico

P B P 2 a mecA Baixa afinidade para

PBP(s)

Aminoglicosídeos RNAr 30S aacA-

aphD. aadA,

aadD,

aadD, aphA,

aphC, spc,

strA.

Modificação por

acetiltransferase,

adeniltransferase ou

alteração ribossomal

das fosfotransferases

Cloranfenicol RNAr 50S Cat Modificação por acetiltransferase

Fluoroquinolonas DNA

girase

gyrA

/gyrB norA

Mutações nos genes

de DNA girase,

bombas de expulsão,

23

grlA (ou

parC)

mutações no gene da

DNA topoisomerase

IV.

Fosfomicina

Síntese do

ácido N-

cetil-

Murâmico

fosB Modificação por

uma glutationa-

transferase

Ácido Fusídico Fator de

alongação

G

fusA/fus

B

Alteração do fator

de alongação G/

diminuição da

permeabilidade.

Glicopeptídeos Complexo

s D - A l a

- D - A l a

Desconh

ecido Van A

Sequestro pela

parede celular

Macrolídeos,

Lincosaminas

RNAr 50S ermA, ermB,

ermC,

msrA

Metilação do RNA

Bombas de expulsão

Mupirocina Isoleucil-

RNAtsinte

tase

mupA Produção de uma

isoleucil-

RNAtsintetase

Modificada

Rifampicina Subunidad

e β da

RNA

polimeras

e

r i f Alterações na RNA polimerase

Sulfonamidas Síntese de

Ácido

tetrahidrof

ólico

sulA Sobre produção de Ácido p-

aminobenzoico

Tetraciclinas RNAr 30S tetA(K)/,

tetA(L) tetA(M)

Bombas de expulsão

Proteção

Ribossomal

Trimetoprim Síntese de

Ácido

Tetrahidro

fólico

DfrA

Bypass, por uma

dihidrofolato

redutase

Fonte: Carmen Borraz Ordas, 2016.

24

1.5 GENE mecA

É o determinante genético de resistência a meticilina de

localização cromossômica que codifica a síntese da (PBP2a), (Hartman

et al., 1984; Ubukata et al.,1985; Chambers et al., 1985; Chambers et al.,

1987). Conta com dois genes reguladores o gene (mecR1), e o gene (mecI), que codifica a proteína repressora de transdução do gene (mecA)

e o gene (mecI), que codifica a proteína repressora da transcrição do gene (mecA), (De Lencastre et al., 1994). A transcrição do gene (mecA),

se produz quando um betalactâmico chega a uma célula, se une ao

receptor-domínio de união à penicilina da membrana citoplasmática

codificado pelo gene (mecR1), desencadeando-se um sinal que induz a

protease auto catalítica a unir-se a (mecI), o qual está bloqueando a

região operadora de (mecA). Desta maneira fica livre o operon de (mecA) sendo possível a expressão de (PBP2a) (Zhang et al., 2001;

Archer et al., 2001; Hiramatsu et al., 2001).

Sobre o surgimento do gene (mecA), existem várias hipóteses,

inicialmente pensava-se que o gene tinha sido adquirido de outra espécie

que não Staphylococcus aureus. (Beck et al., 1986; Berger-Bachi et al., 1994). Posteriormente surgiram hipóteses de que os mesmos poderiam

ter sido adquiridos de Staphylococcus coagulase negativos (Archer et al., 1994). Uma analogia entre o Staphylococcus aureus e o

Staphylococcus sciuri de 88% no gene (mecA), entre estas duas espécies

foi descoberta (Couto et al., 1996; Wu et al., 1996). Igualmente em

relação ao Staphylococcus epidermidis foi comprovada a transferência

do gene (mecA), de S.aureus para este (Wielders et al., 2001).

Mais recentemente os métodos baseados em PCR utilizados

foram estandardizados. Cepas sensíveis ocasionais que expressam um

gene não funcional ou não expressam (mecA), são detectados, porem a presença de (mecA), se considera geralmente potencial de resistência e

se utiliza para identificar Staphylococcus aureus resistentes a meticilina.

A resistência que não é mediada por (mecA), não será detectada (Murakami et al., 1991; Tokue et al., 1992).

25

Figura 2: Representação do Gene mecA

Legenda: Representação de um fragmento de DNA cromossômico de (MRSA)

com os seguintes elementos: região reguladora do gene mecA composta pelos

genes mecI e mecR1, plasmídeos (pUB11), sequências de inserção (IS 431),

transposons (Tn554) e genes cromossômicos das recombinases A e B (ccrA e

ccrB). Fonte: De Lencastre et al., 1999.

Duas teorias básicas tentam explicar a origem do gene (mecA),

e a distinção entre as linhas filogenéticas distintas. A primeira teoria

afirma que o gene (mecA), incorporou-se ao (MRSA), a partir de linhas evolutivas distintas (Kreiswirth et al., 1993). Teorias mais recentes

evidenciam que o gene (mecA), foi sendo transferido de linhas genéticas

distintas numa transferência horizontal do gene (mec), contribuindo para

a evolução do (MRSA) (Enright et al., 2000; Enright et al., 2002;

Wielders et al., 2002; Hiramatsu et al., 2004). Autores como Musser et

al (1992) realizaram análises de MLEE (multilocus enzyme

electrophoresis), MLST (multilocus sequence typing), Enright et al,

(2002) e Hanssen et al, (2004) realizaram PFGE (eletroforese em campo pulsado), concordam que houve uma transferência horizontal do gene

mecA entre cepas pertencentes a linhas genéticas distintas. Outros mecanismos de resistência a meticilina são descritos na

literatura hoje em cepas que não possuem o gene mecA, que se associam

a CIMs de meticilina entre 6 e 8 g/mL. Entre os mecanismos que

determinam a resistência não mediada pelo gene mecA, em cepas que

tem uma hiperprodução de penicilinase, estão as denominadas cepas

BORSA (bordline Staphylococcus aureus), que sintetizam uma

quantidade importante de lactamase e não tem nem o gene mecA.

Nestas cepas (BORSA) a sensibilidade a oxacilina pode

recuperar-se quando se associa com um inibidor de lactamase sendo este

o melhor método para sua detecção fenotípica. Como é o caso de

quando quer se detectar a resistência induzida a Clindamicina. Além

26

desta forma referenciada acima, algumas cepas são capazes de hidrolisar

a meticilina na ausência do gene mecA. Pode ocorrer ainda em termos de

resistência não mediada pelo gene mecA, modificações das PBPs, são as denominadas cepas MODSA (modified Staphylococcus aureus), são

resistentes a baixos níveis de oxacilina e não produtoras de

betalactamase (McDougal et al., 1986; Massidda et al., 1996; Sierra-

Madero et al., 1988; Tomasz et al., 1989).

Mesmo sendo um pré-requisito para a resistência a meticilina, o

gene mecA não é o único responsável pelo nível ao qual a resistência é

expressa. Sabe-se também que o nível de PBP2a, não está relacionado

diretamente ao nível fenotípico de resistência. Outros fatores

cromossomicamente determinados, tais como o operon (femAB - Fatores

essenciais para a expressão da resistência a meticilina), que atuam como

genes reguladores, são essenciais para a expressão da resistência a

meticilina em Staphylococcus aureus. A cooperação entre esses

determinantes, (femA e mecA), parece ser necessária, mas o mecanismo como isto ocorre, ainda não está devidamente elucidado. Os mesmos,

aparecem tanto em cepas sensíveis como resistentes de MRSA, (Berger-

Bachi et al.,1989; De Lencastre et al.,1994). Além disso existem genes

cromossômicos cujas mutações mantêm femAB, são os genes chr

(Zhang et al., 2001).

O operon cromossômico (femAB), pertence aos genes críticos

para o metabolismo celular (housekeeping genes) dos Staphylococcus

aureus e é encontrado em todas as cepas dessa espécie e alelos (femAB) similares na organização e na sequência foram identificados nos

Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus. O operon

surgiu por duplicação do gene e codifica para duas proteínas

citoplásmicas similares que são produzidas, principalmente, durante a

fase exponencial de crescimento, (femA) e (femB) que estão envolvidos na formação da cadeia lateral da pentaglicina que é ligada a L-lisina da

haste peptídica do peptidoglicano. Os peptídeos da pentaglicina são

longos e flexíveis, e permitem uma elevada ligação cruzada entre o

grupo funcional dos peptídeos da cadeia única de peptidoglicano,

observada em paredes celulares de Staphylococcus aureus. Enquanto em células sem o gene (femB) as pontes cruzadas de triglicina podem ser

formadas, a composição da parede celular de mutantes com (femAB)

pouco transcrito é indicativa que (femA) é responsável pela adição dos segundos e terceiros resíduos de glicina.

A perda do operon (femAB), causa resistência dos cocos ao

efeito bactericida da proteína lisostafina, uma potente hidrolase de

peptidoglicano secretada pelo Staphylococcus simulans, devido ao

27

encurtamento da ponte interpeptídica de glicina; adicionalmente, causa a

hipersusceptibilidade a meticilina, apesar da presença da proteína

(PBP2a), em Staphylococcus aureus (mecA), positivos. Portanto, a inativação do operon (femAB,) e os betalactâmicos parecem agir de

maneira sinérgica (Moussallem et al., 2009).

1.6 STAPHYLOCOCCAL CASSETTE CHROMOSOME - SCCMEC

Uma estrutura móvel no cromossoma estafilocócico

denominada de cassete juntamente com o gene mecA forma o SCCmec

(Staphylococcal Cassette Chromosome mec). É um elemento genético inserido no cromossoma de MRSA, em uma localização específica no

extremo 3’ do fragmento aberto de leitura (ORF), cuja função é

desconhecida até agora. Sua mobilidade se deve a presença dos genes

únicos e específicos (ccrA) e (ccrB), que codificam as recombinases do

cassete cromossômico (A e B) (Ito, 1998; Ito, 1999; Katayama et al.,

2000; Kuroda et al., 2001; Baba et al., 2002).

Até o momento foram descritos vários tipos de SCCmec em

função das características dos genes ccr, e sequências adjacentes, assim como a sequência da zona mec, e seus genes reguladores. Também se

diferenciam segundo os determinantes genéticos adquiridos como

resultado da integração de plasmídeos e transposons. Segundo a IWG-

SCC (International Working Group on the Classification of

Staphylococcal Cassette Chromosome Elements), já foram identificados 11 tipos de SCCmec e um determinado número de variantes e subtipos

(IA, IIIA, IIIB, IVA, IVB, IVC), classificados com base na sequência da

região J (junkyard), sendo sete as últimas variantes descritas (IIA, IIB,

IIC, IID, IIE, IVE e IVF). As variações ocorrem na composição genética

e no tamanho (20 a 60 Kb) (Ito et al., 2001; Ito et al., 2004; Oliveira et

al., 2001; Ma et al., 2002; Okuma et al., 2002).

O SCCmec é constituído de dois complexos: o complexo mec,

que contém o gene (mec), e os genes que regulam sua expressão (mecI e mecR1), e o complexo ccc, (cassete chromosome recombinase), que

contém o mecanismo de recombinação necessário para inserção no

cromossomo. Esta localização é denominada de ISS (Sítio de Integração

da Sequência ou Integration Site Sequence) (Hanssen e Sollid, 2006).

As características genéticas dos complexos (mec) e (ccr), além das estruturas intermediárias delimitadas pelas sequencias de repetição são

usadas para classificar o SCCmec com fins epidemiológicos e

representam uma tendência na filogenia destes micro-organismos, a fim

de que mundialmente as regras de definições de subespécies sejam as

28

mesmas (Hanssen e Sollid, 2006; Kondo et al., 2012; Zhang et al.,

2005).

Atualmente, sua classificação é coordenada por um grupo de

trabalho internacional para classificação de SCCmec, já referido acima

que é o International Working Group on the Classification of

Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC). Os clones mundiais que faziam parte da coleção dos isolados analisados receberam

a seguinte nomenclatura: clone USA100 (Nova Iorque/Japão), USA200

(E-MRSA-16), USA500 (clone ibérico), USA800 (clone pediátrico). O

clone brasileiro não foi encontrado nesta coleção, não sendo, portanto,

reclassificado.

Em relação aos diferentes genes mec, estes diferem por

comparação com o gene (mecA), do Staphylococcus aureus N315,

primeiro MRSA, sequenciado completamente (Ito et al., 2012). A

captação de linha genéticas de Staphylococcus aureus sensíveis a

meticilina foram dando lugar a linhas genéticas de MRSA (Hanssen e

Sollid, 2006). Além disso, a constante presença deste gene neste micro-

organismo poderia ter atuado como reservatório do mecanismo de

resistência para o Staphylococcus aureus. A aquisição horizontal da resistência a meticilina em Staphylococcus aureus se produziu a partir

de diversos eventos genéticos independentes entre si, tal como reflete a

diversidades de estruturas do SCCmec que ocorrem nestes micro-

organismos (Feil et al., 2003; Deurenberg et al., 2007). O número de

linhas genéticas de Staphylococcus aureus que adquiriram este cassete é limitado, observando-se uma maior heterogeneidade nas populações de

isolados sensíveis a meticilina (Grundmann et al., 2010; Sykes, 2010).

1.7 COLONIZAÇÃO/CONTAMINAÇÃO

Staphylococcus aureus é um micro-organismo que sobrevive de

forma comensal com o ser humano e com animais. Percebe-se

atualmente, especialmente em países com menos recursos, um aumento

na prevalência de MRSA. Em humanos o mesmo coloniza

especialmente a pele e mucosas especialmente as das narinas, apesar de

vários locais do corpo poder ser colonizados, porém as narinas são os

locais de transporte preferencial deste micro-organismo (White, 1963;

Nouwen, 2005).

A exposição repetida à Staphylococcus aureus nos ambientes

em que se vive é considerado um determinante importante na

colonização pelo mesmo, provavelmente mais que o fundo genético dos

indivíduos. Em geral uma gênese multifatorial explicaria a colonização

29

por este micro-organismo em grande parte da população. Com a

finalidade de controlar a propagação deste patógeno se faz necessário

identificar quais são os fatores mais importantes na adesão dos mesmos

aos hospedeiros. Estudos, tem sido feitos neste sentido, além de alterar o

foco de estudos dos mecanismos de aderência para os epítopos mais

prevalentes nas narinas. Até o momento não há evidências que a

descolonização das narinas de pacientes colonizados seja efetiva em

pacientes pré-cirúrgicos, da mesma forma a descolonização extra nasal

se comporta igualmente, previamente a procedimentos cirúrgicos, as

drogas utilizadas para esta finalidade (descolonização), são

principalmente a clorexidine e mupirocina (Kalmeijer, 2002; Wertheim,

2004).

Até agora, existe a preocupação apenas com o aumento do risco

de Staphylococcus aureus em portadores nasais que adquirirem infecções por este micro-organismo. No entanto, estudos da OMS

(Organização Mundial da Saúde), têm mostrado que os não-portadores

tem a possibilidade de adquirir de forma exógena infecções por S.

aureus com um aumento de quatro vezes na taxa de mortalidade em

comparação aos portadores nasais de MSSA (Wertheim, 2004). Assim,

os mecanismos imunológicos de transporte nasal desta bactéria precisam

ser elucidados em não-portadores também. Prevenir a aquisição de cepas

é a forma de controlar a proliferação de doenças estafilocócicas.

Campanhas de formas de prevenção precisam ser feitas à população em

geral neste sentido (Wertheim, 2004).

Em relação à colonização em profissionais de saúde, vários

estudos transversais e longitudinais buscam evidenciar a prevalência de

colonização tanto de Staphylococcus aureus bem como de sua forma

resistente, buscando não somente a colonização nasal como salivar e em

outras áreas anatômicas. A figura 3 ilustra como pode ocorrer o transporte de Staphylococcus aureus entre profissionais de saúde e

pacientes em ambientes hospitalares. A prevalência de transporte de

MRSA em profissionais de saúde é altamente variável, dependendo do

local, tipo de serviço hospitalar, da prevalência de MRSA entre os

pacientes e do tipo de contato (Biotech Week, 2016).

30

Figura 3 - Dinâmica da transmissão do MRSA entre pacientes,

profissionais de saúde e meio ambiente.

Figura 3 - Dinâmica da transmissão do MRSA entre pacientes, profissionais de saúde e meio ambiente. Setas sólidas representam movimento de indivíduos, e

setas interrompidas indicam a transmissão entre PS e pacientes; caixas

vermelhas e amarelas são fontes de contaminação ou de colonização. Pacientes

colonizados podem ser liberados do isolamento após um resultado falso-

negativo ou um resultado verdadeiro negativo de uma amostra para ensaio

recolhida antes da colonização. Caixa PS transitoriamente contaminado" é um

agrupamento conveniente de ambos os PS colonizados e não colonizados.PS=

Profissional de Saúde – Adaptado de (Hall et al., 2016).

Vários estudos demonstram que o cumprimento das regras

básicas de higiene, tais como o uso de soluções hidro alcoólicas, nas

mãos, durante o atendimento, pode reduzir o risco de colonização nasal

por Staphylococcus aureus. Membros da equipe médica representam um risco de infecção e são uma fonte potencial de patógenos hospitalares,

tais como MRSA (Omine, 2012; Nagahama, 2013).

1.7.1 Colonização/Contaminação em odontologia

Dentre os nove milhões de pessoas que trabalham em serviços

de saúde nos Estados Unidos, 608 mil representam equipes de saúde

31

oral (Fariba, 2010). A razão para atualmente existir uma maior

possibilidade de colonização em profissionais, pacientes e superfícies

odontológicas, deve-se a introdução de novos equipamentos nos últimos

anos na odontologia. Estes contribuem significativamente para que os

consultórios e ambientes clínicos sejam impregnados por aerossóis

biológicos (Cotone et al., 1991).

Staphylococcus aureus pode permanecer no ambiente clínico e

em superfícies por até cinco dias (Crawford et al., 1983). Isto ocorre

também em ambientes hospitalares onde as superfícies em salas

ocupadas por pacientes positivos com MRSA podem contaminar as

mãos dos profissionais de saúde mesmo na ausência de contato direto

com o paciente (Schmitz et al., 1998). Assim como os equipamentos

utilizados no atendimento dos pacientes podem estar contaminados com

MRSA, os quartos dos pacientes e os objetos neles localizados também

podem atuar como reservatórios de transmissão de agentes resistentes

(Oie et al., 1996). Em 73% dos quartos dos pacientes infectados por

MRSA tem superfícies contaminadas (Boyce et al., 1997). Estes dados,

sobre a colonização em ambientes e pacientes nosocomiais estão

inseridos pois coincidem estudos que presumem que em procedimentos

odontológicos a possibilidade de colonização é semelhante aos

trabalhadores de atuação em Unidades de Terapia Intensiva Hospitalar

(Martínez e Ruíz, 2014).

O fator proteção facial através de máscaras e respiradores é

importante, porem parece não ser suficiente nas rotinas e protocolos de

biossegurança em consultórios odontológicos e clínicas pertencentes à

academia. Chen et al., (1992), relatam que embora a máscara cirúrgica

possa ser suficiente para eliminar as bactérias exaladas pelos

profissionais de saúde, elas podem não ser suficientes para filtrar os

aerossóis de tamanho submicrométricos contendo agentes patogênicos a

que estes profissionais de saúde são potencialmente expostos.

Embora a diversidade de micro-organismos presentes na

cavidade oral, seja bem relatada na literatura, continua a haver uma

considerável controvérsia sobre se Staphylococcus aureus

desempenham um papel na ecologia da flora normal da mesma.

Pesquisadores buscam estabelecer uma relação entre o papel

desempenhado na ecologia da cavidade oral por Staphylococcus aureus

tentando estabelecer uma relação entre as patologias agudas e crônicas

da mesma e a presença deste micro-organismo, seja fazendo parte da

flora normal, seja fazendo parte da flora transitória desta cavidade.

O principal mecanismo de transmissão de MRSA, é o contato

interpessoal direto, porém como vimos anteriormente a transferência

32

indireta através de superfícies ambientais contaminadas também pode

ocorrer (Boyce et al., 1997; Boyce et al., 2002), bem como a

transmissão através do ar (Shiomori et al., 2001; Shiomori et al., 2002).

Um número crescente de aparentemente inócuas vias de transmissão têm

sido descritas incluindo equipamentos e aparelhos de uso em

odontologia (Brady et al., 2007). Além disso, múltiplos fatores próprios

do hospedeiro, tais como a qualidade da cicatrização e taxas de infecção

da ferida operatória pode contribuir para a aquisição de MRSA

(Bumpous et al., 1995). Unidades de terapias intensivas e unidades

cirúrgicas são ambientes de alto risco para a aquisição deste micro-

organismo resistente. Os pacientes com maiores tempos hospitalizados

possuem mais chances para adquirirem MRSA, exatamente pelo tempo

em que lá permanecem (maior que os demais), e pelas condições

sistêmicas e imunidades debilitadas (Plowman et al., 2000).

1.8 JUSTIFICATIVA

As possibilidades de colonização no ambiente odontológico

muito se assemelham às condições de aquisição em ambiente hospitalar,

com o agravante da geração de aerossóis de forma intermitente que

ocorre em consultórios odontológicos e em especial em clínicas

acadêmicas devido ao maior número de sprays gerados e superfícies

existentes. Somado a estes fatores os EPI(s) de proteção facial não

garantem a filtragem adequada de partículas submicrométricas

contaminadas. Ressalta-se ainda fundamentalmente o avanço na

Odontologia nas áreas cirúrgicas, onde os procedimentos se tornaram

mais invasivos a partir da introdução em larga escala de implantes e

enxertias ósseas. Considerando todos estes fatores, justifica-se o estudo

sobre a colonização em profissionais e ambientes odontológicos que em

tese possam ser tão prevalente quanto à profissionais de Unidades de

Terapias Intensiva.

33

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Comparar a colonização nasal e salivar por (MSSA) e (MRSA),

em profissionais e acadêmicos de odontologia com profissionais de uma

Unidade de Terapia Intensiva.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar a prevalência de colonização em superfícies odontológicas de Staphylococus aureus e Staphylococus aureus

resistentes a meticilina

Determinar a prevalência nasal e salivar de Staphylococus aureus e Staphylococus aureus resistentes a meticilina em

profissionais, acadêmicos e superfícies da odontologia;

Determinar a prevalência nasal e salivar de Staphylococus aureus e Staphylococus aureus resistentes a meticilina em

funcionários de uma UTI Geral em um Hospital de grande

porte;

Detectar a presença dos genes (mecA) e (lukS-lukF) em Staphylococcus aureus resistentes a meticilina;

Conhecer o perfil fenotípico dos Staphylococus aureus isolados;

34

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Os participantes do estudo foram convidados e para os mesmos

foi detalhado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE),

obtendo-se assim a voluntariedade na participação do estudo. As

assinaturas ocorreram no momento da coleta das amostras. O projeto de

estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da UNESC (Universidade do

Extremo Sul Catarinense), Brasil, conforme parecer consubstanciado

número 887.907, de 29 de Outubro de 2014.

3.2 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO:

Foram coletadas amostras de saliva e de nasofaringe de

diferentes grupos. O grupo comparação foi composto por funcionários

de uma UTI Hospitalar Geral Adulta. As demais amostram foram

obtidas de acadêmicos cursando os dois últimos anos de cursos de

odontologia e de superfícies de ambientes odontológicos referentes a

duas universidades distintas em localização geográfica e de cirurgiões-

dentistas com dois ou mais anos de atuação efetiva em consultórios

odontológicos juntamente com suas respectivas auxiliares em saúde

bucal.

Para a caracterização demográfica e profissional, além de outros

dados qualitativos dos voluntários da pesquisa (Apêndice 1), foi

utilizado um instrumento com questões abertas e fechadas. Este

instrumento foi posteriormente após prazo definido, devolvido

devidamente preenchido ao pesquisador.

3.3 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS

As amostras da nasofaringe e da saliva, bem como das

superfícies, foram coletadas com um swab denominado ESwab (Copan

Italy), e transportados em meio de Amies modificado até o laboratório

de microbiologia das Universidades I e II respectivamente e

imediatamente processadas. (Vandendriessche et al., 2014; Silbert et al.,

2014; Mukovnikova, 2014).

3.4. CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS

3.4.1 Identificação de Staphylococcus aureus

A identificação de Staphylococcus aureus, foi obtida através da

cultura em meio ágar sal manitol a 36°C por 48 horas. A positividade

para Staphylococcus aureus foi identificada quando o meio ao redor da semeadura se apresentou amarelo (Figura 4) (Konemann, 2011).

35

Figura 4: Crescimento de colônias de Staphylococcus aureus.

Fonte: O Autor (2015).

3.4.2 Identificação MRSA

3.4.2.1. Meio Cromogênico

Após a identificação da espécie Staphylococcus aureus, os isolados foram semeados em meio seletivo cromogênico (CHROMagar

MRSA PL 0297.Plastlabor – Brasil), e incubados a 36°C durante um

período máximo de 48 horas e as colônias de coloração malva foram

classificadas como MRSA. O ágar contém uma substância cromogênica

dourada para selecionar o crescimento do Staphylococous aureus e um agente antimicrobiano que permite o crescimento somente das cepas

resistente a oxacilina (Figura 5).

Como controle de qualidade foram utilizadas as cepas controle

Escherichia coli - ATCC 25922, Staphylococcus aureus - ATCC 25923

e Staphylococcus aureus - ATCC 43300 (Ohkushi et al., 2013; Merlino et al., 2000; Pao et al., 2012; Cerlana et al., 2004; Gaillot et al., 2009;

Rahman et al., 2009; Goodwin et al., 2009; Philippe et al., 2014).

36

Figura 5 Crescimento de colônias de MRSA em CHROMagar MRSA.

Fonte: O Autor (2015).

3.4.2.2. Teste de Susceptibilidade a antimicrobianos

Após o screening com meio cromogênico, amostras positivas

foram submetidas, para comprovação da resistência, ao teste de

susceptibilidade a cefotixina e oxacilina através da técnica de disco-

difusao em Agar Mueller Hinton. As amostras consideradas como

MRSA pelo método de difusão em disco foram armazenadas a uma

temperatura de -80 °C em caldo triptona de soja (TSB) acrescidas de

10% de glicerol, (James, 1993; Moncayo et al., 2015; Raddi et al., 2009;

Mimica et al., 2012; Méndez et al., 2013; Cavassin et al., 2015). Figura

6 (A e B)

37

Figura 6 – Resistência/Sensibilidade Cefoxitina e Oxacilina.

A B

Fonte: Do autor (2015).

3.4.3. Detecção dos Genes (mecA) e (lukS-lukF) Para confirmar a resistência a MRSA, as amostras positivas

foram submetidas à ensaios de PCR para detecção do gene (mecA)

baseado em ensaio descrito por Kondo et al., (2007). A detecção do

gene (lukS-lukF), responsável pela codificação da Leucocidina de

Panton-Valentine (PVL) foi realizada de acordo com protocolo descrito

por Ribeiro (2005).

3.4.4 Eletroforese de Campo Pulsado (Pulsed-Field Gel

Electrophoresis – PFGE)

A Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE), foi realizada

utilizando protocolo adaptado de Pinto, (2013), e com condições de

corrida descritas por McDougal et al., (2003).

Os fragmentos de vários tamanhos são separados utilizando eletroforese

em gel baseado no peso molecular. O chamado polimorfismo de

fragmentos de restrição (RFLP) apresenta chances bastante grandes de

ser utilizada como forma de identificação da bactéria (Hookey et al.,

1998; Rezaee et al., 2016; Chadi et al., 2016).

3.5. ORGANIZAÇÃO E ANÁLISE DE DADOS

Os dados referentes a prevalência, perfil fenotípico, detecção

dos gene (MecA e LukS-LukF) após coletados foram protocolados com

codificação previamente definida e inserida em bancos de dados em

Excel e exportada para o pacote estatístico SPSS (Statistical Package for

38

Social Sciences), versão 21.0 e analisados por meio de estatística

descritiva (frequências relativas e absolutas) e inferencial (teste qui-

quadrado) utilizando os valores de p

39

Tabela 3: Caracterização da população em estudo.

População N % Idade

(média)

Contato

direto com

paciente

(anos)

Uso

de

EPI’s

(%)

Funcionários

UTI

36 24 33,07 10,3 100

Acad. Univ. I 47 30 26,55 3,2 100

Acad. Univ. II 23 15 26,55 3,2 100

Cirurgiões

dentistas

31 20 40,39 17,27 100

ASB 17 11 31,23 8,76 100

Total 154 100 - - 100 Legenda: Univ. (Universidade); UTI (Unidade de Terapia Intensiva); ASB

(Auxiliar em saúde Bucal); Acad. (Acadêmicos).

4.2. IDENTIFICAÇÃO Staphylococcus aureus (MSSA) A figura 7A mostra os resultados da colonização nasal e salivar

por MSSA, nos diferentes grupos. Em acadêmicos da Universidade I,

86%, nasal positivos e 35% - MSSA, salivar positivo (p=0.005); Na Universidade II, 52% - MSSA, nasal positivos e 48% - MSSA, salivar

positivos (p=0.84); dos cirurgiões dentistas 47%- MSSA, nasal positivos

e 23% - MSSA, salivar positivos (p=0.54); auxiliares em saúde bucal

65% - MSSA, nasal positivos e 41.17% - MSSA, salivar positivos

(p=0.34). Finalmente 39% - MSSA, funcionários da UTI nasal positivos

e 22%- MSSA, salivar positivos (p=0.12). Além disso, as colonizações

identificadas em superfícies nas universidades indicam que na

Universidade I, 04 de 20, apresentaram colonização por Staphylococcus

aureus e na Universidade II somente 01 amostra de 20 apresentou esta

colonização.

4.3. IDENTIFICAÇÃO DA RESISTÊNCIA POR MEIO

CROMOGÊNICO

Na figura 7B, mostra os resultados da colonização nasal e

salivar por MRSA, detectados por meio cromogênico. Nos acadêmicos

da Universidade I 57% - MRSA, nasal positivos e 26% - MRSA saliva

positivos (p

40

MRSA, salivar positivos (p=0.31); Funcionários da UTI 79% - MRSA,

nasal positivos e 62% - MRSA, salivar positivos (p=0.13).

Em relação as superfícies da Universidade I, 02 áreas estavam

colonizadas por MRSA –(50% do total), enquanto na Universidade II,

01 superfície a qual estava colonizada por Staphylococcus aureus

também mostrou resistência em meio cromogênico (MRSA - 100%).

4.4. COMPROVAÇÃO DA RESISTÊNCIA POR TSA

A Figura 7C mostra os resultados da colonização nasal e salivar

por MRSA, obtidos por TSA (Testes de susceptibilidade a oxacilina e

cefoxitina) e foram realizados em todos os grupos que foram positivos

MRSA para o meio CHROMagar MRSA. Dos acadêmicos da

Universidade I 35% - MRSA, nasal positivos e 10% - MRSA, salivar

positivos (p=0.15). Já entre os acadêmicos da Universidade II, nenhum

deles apresentou resistencia (0% - MRSA) nasal e salivar. Cirurgiões

dentistas apresentaram 29% - MRSA, nasal positivo e 20% - MRSA,

salivar positivos (p=0.56); Auxiliares em saúde bucal apresentaram 17%

- MRSA nasal positivo e 33% - MRSA, salivar positivo (p=1.00). Dos

funcionários da UTI 73% - MRSA, nasal positivo e 40% - MRSA

salivar positivo (p=0.96). A proposta destes testes foi obter confirmação

da resistência.

41

Figura 7A. Identificação de S.aureus (MSSA): mostra a porcentagem de

Staphylococcus aureus nasal e salivar nos diferentes grupos. Existe diferença

significativa entre colonização nasal e salivar no grupo de acadêmicos da

Universidade I (p=0.005).

42

Figura 7B. Identificação da resistência por meio cromogênico: mostra a

porcentagem de CHROMagar MRSA nasal e salivar nos diferentes grupos

obtidos positivos para Staphylococcus aureus. Existe diferença entre

colonização nasal e salivar em acadêmicos da Universidade I (p

43

Figura 7C. Comprovação da resistência por TSA A figura mostra a

porcentagem de colonização confirmadas pelo teste TSA MRSA positiva para

nasal e salivar nos diferentes grupos obtidos da resistência a CHROMagar

MRSA. Não existe diferença significativa entre colonização nasal e salivar nos

grupos.

4.5. SIMILARIDADE ENTRE GRUPOS COLONIZADOS

4.5.1. Frequência Colonização nasal e salivar Staphylococcus aureus,

(MSSA).

Referente à colonização nasal por Staphylococcus aureus,

quando comparamos Universidade I, Universidade II, UTI e cirurgiões

dentistas, a frequência de colonização na Universidade I é maior e

estatisticamente significativa. Já nos demais grupos, não existe uma

diferença estatisticamente significativa entre os mesmos. (Figura 8A).

Na colonização salivar não apresenta diferença estatisticamente

significativa de colonização entre os grupos (Figura 8B).

44

Figura 8A e 8B. Associação de colonização entre os grupos por Staphylococcus

aureus, (MSSA) - Colonização de Staphylococcus aureus nasal (A) e salivar (B)

Na figura A, Univ. I x Univ II (p=0,005); UTI x CD (p=0,54); UTI x Univ I

(p=0,005); UTI x Univ II (p=0,84); UTI x ASB (p=0,54); CD x ASB (p=1,00);

CD x Univ I (p=0,005); CD x Univ II (p=0,68). Na figura B Univ. I x Univ II

(p=1,00); UTI x CD (p=0,12); UTI x Univ I (p=0,25); UTI x Univ II (p=0,25);

UTI x ASB (p=1,00); CD x ASB (p=1,27); CD x Univ I (p=0,69); CD x Univ II

(p=1,00).

4.5.2 Frequência Colonização nasal e salivar (MRSA) em meio

CHROMagar MRSA A figura 8C apresenta os resultados de resistência a

Staphylococcus aureus (MRSA), em meio CHROMagar, a partir das

amostras positivas obtidas anteriormente para (MSSA). Em relação à

colonização nasal, comparando Universidade I, com o grupo de

cirurgiões dentistas, temos uma maior frequência e estatisticamente

significativa de acadêmicos colonizados em relação ao grupo de

cirurgiões. Nos demais grupos não existem diferença estatisticamente

significativa de frequência de colonização entre os mesmos.

A figura 8D apresenta os resultados de frequência de

colonização salivar resistente (MRSA), em meio CHROMagar. Nestes,

a colonização na Universidade II é maior e apresenta uma diferença

estatisticamente significativa em relação ao grupo funcionários da UTI

(grupo controle) e cirurgiões dentistas. Nos demais grupos não existem

diferença estatisticamente significativa de frequência de colonização

entre os mesmos.

45

Figura 8C e 8D. Associação de colonização nasal e salivar (MRSA) em meio

CH