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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE
ANA CRISTINA ARRAIS
CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA DO COMPLEXO NUCLEAR DA
SUBSTÂNCIA NEGRA pars COMPACTA (SNc) DE RATOS WISTAR (Rattus
norvegicus), EM DIFERENTES IDADES, MEDIANTE IMUNOHISTOQUÍMICA
CONTRA S100B
MOSSORÓ/RN
2018
ANA CRISTINA ARRAIS
CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA DO COMPLEXO NUCLEAR DA
SUBSTÂNCIA NEGRA pars COMPACTA (SNc) DE RATOS WISTAR (Rattus
norvegicus), EM DIFERENTES IDADES, MEDIANTE IMUNOHISTOQUÍMICA
CONTRA S100B
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Saúde e Sociedade da Universidade
do Estado do Rio Grande do Norte como requisito
para a obtenção do grau de Mestre em Saúde e
Sociedade.
Orientador: Prof. Dr. José Rodolfo Lopes de Paiva
Cavalcanti
MOSSORÓ/RN
2018
© Todos os direitos estão reservados a Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. O conteúdo desta obra é deinteira responsabilidade do(a) autor(a), sendo o mesmo, passível de sanções administrativas ou penais, caso sejaminfringidas as leis que regulamentam a Propriedade Intelectual, respectivamente, Patentes: Lei n° 9.279/1996 e DireitosAutorais: Lei n° 9.610/1998. A mesma poderá servir de base literária para novas pesquisas, desde que a obra e seu(a)respectivo(a) autor(a) sejam devidamente citados e mencionados os seus créditos bibliográ�cos.
Catalogação da Publicação na Fonte.Universidade do Estado do Rio Grande do Norte.
A773c Arrais, Ana CristinaCARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA DO
COMPLEXO NUCLEAR DA SUBSTÂNCIA NEGRA parsCOMPACTA (SNc) DE RATOS WISTAR (Rattusnorvegicus), EM DIFERENTES IDADES, MEDIANTEIMUNOHISTOQUÍMICA CONTRA S100B. / Ana CristinaArrais. - Mossoró, 2018.
93p.
Orientador(a): Prof. Dr. José Rodolfo Lopes de PaivaCavalcanti.
Dissertação (Mestrado em Programa de Pós-Graduação em Saúde e Sociedade). Universidade doEstado do Rio Grande do Norte.
1. Astrócitos. 2. Proteínas ligantes de cálcio. 3.Substância Negra. 4. S100B. I. Cavalcanti, José RodolfoLopes de Paiva. II. Universidade do Estado do Rio Grandedo Norte. III. Título.
O serviço de Geração Automática de Ficha Catalográ�ca para Trabalhos de Conclusão de Curso (TCC´s) foi desenvolvidopela Diretoria de Informatização (DINF), sob orientação dos bibliotecários do SIB-UERN, para ser adaptado àsnecessidades da comunidade acadêmica UERN.
Aos amores da minha vida: meus filhos Tito e
Gabriela, que diariamente renovam minhas
forças, me impulsionando a seguir em frente.
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Ao nosso Deus, que com sua infinita misericórdia olhou para mim e permitiu que em meio à
tempestade eu pudesse concluir mais essa etapa em minha vida.
Ao meu amado filho Tito, meu doce menino, por me ensinar diariamente o que é força,
coragem e alegria de viver! Obrigada meu amor, por compreender todas as minhas ausências
e me receber em casa com a alegria, o sorriso e o abraço que só você tem. Meu valente
guerreiro, mamãe te ama infinitamente.
À minha amada filha Gabriela (Gabi), meu maior sonho realizado! Minha princesa, obrigada
por me ensinar o que é amar de verdade e por estar sempre ao meu lado, nos dias bons e ruins.
Mamãe te ama do fundo do coração e se orgulha do cuidado que você tem comigo, seu pai e
seu irmãozinho. Faltam palavras para definir o quanto te amo.
Ao meu esposo Manoel, que tanto se orgulha de mim. Obrigada meu amor, pelo carinho,
compreensão e por ser meu porto seguro nas maiores aflições. Só você para aguentar minhas
chatices. Te amo!
Aos meus pais, Dona Auxiliadora e “Seu Cleide”, por terem investido todo o suor de uma
vida de trabalho para nos educar. Mesmo não tendo estudos, sabiam da importância de dar aos
seus filhos uma educação de qualidade. Obrigada por acreditarem no meu potencial e me
incentivarem a crescer cada vez mais. Amo vocês!
Ao meu orientador, pela confiança, por todo o suporte não apenas como professor orientador,
mas como um amigo que sempre esteve presente e que me compreendeu no momento de
maior tribulação. Jamais esquecerei!
À minha banca de seleção e de qualificação, prof. Marco e prof. Fausto. Pessoas que eu
admiro e respeito. Obrigada por todos os conselhos e sugestões para que esse trabalho pudesse
prosseguir da melhor forma possível.
Aos professores Marco Aurélio e Vitor Aires por terem aceitado prontamente fazer parte da
minha banca de defesa.
Aos colegas de turma e de LabNeuro, por compartilhar momentos de conhecimento, de
alegrias e de vitórias.
À Samara Queiroz (Samarinha), amiga sempre fiel, que me recebeu no LabNeuro e me
ensinou tudo sobre organização, postura, cuidados com os animais, limpeza das gaiolas,
preparação de soluções, perfusão transcardíaca e protocolo de imunohistoquímica. Esteve
presente em todos os momentos dessa jornada. Obrigada por tudo!
À minha amiga Lívia Helena, pessoa que amo e admiro. Obrigada por me ouvir sempre, por
me fazer sorrir quando eu só conseguia chorar e por sempre me encorajar a continuar lutando.
Amiga, se cheguei até aqui muito devo a você!
À doce e meiga Bianca, sempre atenciosa, minha companheira das imunos nos finais de
semana. Obrigada pela parceria, ensinamentos e pelas palavras de incentivo sempre!
À Lívia Nornyan, que me orientou e me encorajou a enfrentar a seleção do mestrado. Serei
sempre grata minha amiga. Mesmo você achando que não fez nada, aquelas orientações foram
suficientes para eu tomar coragem e enfrentar a seleção.
À ex-aluna, amiga e vizinha Paula Câmara, pelos muitos cafés e açaís durante os dois últimos
anos, que me proporcionavam a energia necessária para aguentar as noites de estudos. Que
continuemos os cafés e as disputas para ver quem tem mais problemas, até um dia eles
acabarem (se é que isso é possível).
Ao Luís, que com suas brincadeiras conseguia transformar as nossas tensões em risadas.
Obrigada por tudo, sobretudo pela preocupação com a saúde do meu filho e a minha também.
Deus te abençoe!
Aos amigos Lucídio, Eligleidson, Ângela, Laurinha e Wesley pela amizade, torcida, presteza e
parceria de sempre.
Ao Tiago Teófilo (UFERSA), por todas as vezes que tive a sua colaboração quando precisei
fazer as fotos deste trabalho (inclusive em feriados). Muito obrigada!
À Luzia, secretária do programa, por ser sempre atenciosa e solícita comigo e com todos.
Você é uma pessoa iluminada.
Ao Professor Thales, coordenador do PPGSS, pela dedicação, acompanhamento e zelo pelo
programa e todos que fazem parte dele. Parabéns pelo trabalho e obrigada por toda atenção.
Aos Docentes do PPGSS, pelas excelentes aulas, sempre produtivas e enriquecedoras.
À FACENE/RN, minha segunda casa há mais de 10 anos, por me incentivar a buscar o
mestrado e pela flexibilidade nos dias de aula e de experimentos. Dona Tetê e Thiago, muito
obrigada!
A todos que me acompanharam no processo seletivo e vibraram junto comigo a aprovação.
Aos grupos Somos Pâncreas, Pâncreas Forever, Mães de diabéticos e As Migas, obrigada por
conseguirem me trazer de volta à vida além da diabetes do meu filho. Obrigada por tudo o que
aprendo diariamente com vocês. Não tenho dúvidas de que sem essa rede de apoio eu não
teria conseguido. Deixo aqui registrado todo o carinho e admiração que tenho por todas vocês.
Às Dras. Regina, Camila, Patrícia, Márcia e Polyana e ao Dr. Dirceu, por cuidarem de mim e
do meu filho com tanta atenção, proporcionando a segurança necessária para que eu pudesse
voltar ao foco para a conclusão do mestrado. Gratidão!
À minha tia Lurdimar que, durante o desenvolvimento desta dissertação, mesmo dizendo
“você não está fazendo nada”, assumiu o controle da minha casa e o cuidado com os meus
filhos. Você é especial e essencial em nossas vidas!
Aos familiares e amigos que se alegram com o meu crescimento enquanto pessoa e
profissional e a todos que direta ou indiretamente contribuíram para esta realização. Obrigada!
“Posso todas as coisas em Cristo que me
fortalece.”
Filipenses 4: 13
RESUMO
A substância negra pars compacta (SNc) é uma região do mesencéfalo contendo neurônios
que expressam dopamina, os quais sofrem degeneração progressiva durante o
envelhecimento, levando ao adoecimento. A S100B é uma proteína ligante de cálcio
encontrada predominantemente no citoplasma dos astrócitos, cujo aumento da expressão está
associado a eventos neuropatológicos como traumas, hipóxia, doenças neurológicas,
psiquiátricas e também ao envelhecimento, bem como patologias associadas a este, como o
Alzheimer e o Parkinson. Este estudo teve como principal objetivo caracterizar a
citoarquitetura do complexo nuclear da substância negra pars compacta (SNc) de Ratos
Wistar (Rattus norvegicus),em diferentes idades, mediante imunohistoquímica contra S100B.
Sendo necessário para isso, delimitar a localização do complexo nuclear da SNc a partir de
imunohistoquímica para TH; descrever os subcomponentes do complexo nuclear da SNc
mediante imunohistoquímica contra S100B e comparar, através de caracterização
citoarquitetônica, as estruturas mapeadas em três fases do ciclo vital – jovens, meia idade e
idosos. Os animais foram mantidos em laboratório em condições fisiológicas, água e ração ad
libitum. Ao atingirem a idade necessária para o estudo foi realizada a perfusão, extração dos
encéfalos, microtomia e imunohistoquímica para TH e S100B, para posterior montagem de
cortes nas lâminas e fotomicrografias. Através de análise visual comparativa foi observado
que a área da SNc apresenta marcação para S100B em todos os níveis de todas as faixas
etárias estudadas, todavia com uma intensidade mais fraca quando comparada à SNR, que
mostra marcação intensa em todas as imagens, servindo de referência para encontrar a região
de interesse para este estudo. Na SNc foram observadas intensidades diferentes na marcação,
o que permitiu delimitar e descrever a citoarquitetura da estrutura, com todas as suas
subdivisões, nos diferentes níveis e faixas etárias estudadas. A partir dos resultados obtidos
nesta pesquisa é possível concluir que: a) a SNc apresenta marcação a partir de
imunohistoquímica para S100B que varia em intensidade de acordo com a subdivisão, nível e
idade dos animais; b) as alterações na marcação não apresentam padrão específico
relacionado ao envelhecimento; c) a S100B apresentou-se como um marcador menos eficiente
para estudos relacionados à morfologia celular da SNc; quando comparado ao TH; d)
demonstrou ser um marcador que pode contribuir com estudos citoarquitetônicos, por ter se
revelado um excelente parcelador das estruturas, principalmente em ratos jovens.
Palavras-chave: Astrócitos, Proteínas ligantes de cálcio, Substância Negra, S100B.
ABSTRACT
The substantia nigra pars compacta (SNc) is a region of the midbrain containing neurons that
express dopamine, which undergo progressive degeneration during aging, leading to illness.
S100B is a calcium binding protein found predominantly in the cytoplasm of astrocytes
whose increased expression is associated with neuropathological events such as trauma,
hypoxia, neurological, psychiatric and also aging disorders, as well as associated pathologies
such as Alzheimer's and Parkinson. The main objective of this study was to characterize the
cytoarchitecture of the nuclear complex of the substantia nigra pars compacta (SNc) of Wistar
rats (Rattus norvegicus), at different ages, by immunohistochemistry against S100B. It is
necessary to delimit the location of the nuclear CNS complex from immunohistochemistry to
TH; to describe the subcomponents of the nuclear CNS complex by immunohistochemistry
against S100B and to compare, through cytoarchitectonic characterization, the structures
mapped in three phases of the life cycle - young, middle age and elderly. The animals were
kept in the laboratory under physiological conditions, water and feed ad libitum. Upon
reaching the necessary age for the study, perfusion, brain extraction, microtomy and
immunohistochemistry were performed for TH and S100B, for posterior assembly of slices
and photomicrographs. Through comparative visual analysis, it was observed that the CNS
area is marked for S100B in all levels of all age groups studied, but with a lower intensity
when compared to the SNR, which shows intense marking in all the images, serving as
reference to find the region of interest for this study. In SNc, different intensities were
observed in the marking, which allowed to delimit and describe the cytoarchitecture of the
structure, with all its subdivisions, in the different levels and age groups studied. From the
results obtained in this research it is possible to conclude that: a) SNc shows labeling from
immunohistochemistry for S100B that varies in intensity according to the subdivision, level
and age of the animals; b) changes in the marking do not present specific pattern related to
aging; c) S100B presented as a less efficient marker for studies related to the cellular
morphology of the CNS; when compared to TH; d) has been shown to be a marker that may
contribute to cytoarchitectural studies, as it has proved to be an excellent splitter of structures,
especially in young rats.
Keywords: Astrocytes, Calcium-binding proteins, Black Substance, S100B.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1: Localização da Substância Negra no encéfalo humano 18
FIGURA 2: Vias dopaminérgicas centrais 19
FIGURA 3: Localização e subdivisões da SNc. 20
FIGURA 4: Domínios de EF-hand. 22
FIGURA 5: Representação esquemática dos efeitos regulatórios intracelulares da
S100B.
25
FIGURA 6: Sinapse tripartite, demonstrando a interação dos astrócitos com
receptores pré e pós-sinápticos de neurônios, onde a liberação de neurotransmissores
no terminal pré-sináptico do neurônio ativa o aumento do Ca2+
no astrócito e estimula
a liberação de substâncias por este para o espaço sináptico, onde são captadas pelos
receptores pós-sinápticos dos neurônios.
33
FIGURA 7: Imagens de Tomografia Computadorizada de cérebro humano de um
adulto com 38 anos (esquerda) e de um idoso de 73 anos (direita), onde é perceptível
a diminuição do volume e as modificações macroscópicas de sulcos e giros.
35
FIGURA 8: Fotomicrografias em campo claro de cortes coronais de mesencéfalo de
RJ com aumento de 4x, submetidas à imunohistoquímica para TH nos níveis A
(rostral), B (médio) e C (caudal) evidenciando neurônios dopaminérgicos com intensa
marcação na VTA e SNc.
44
FIGURA 9: Chart ilustrativo de cortes coronais nos níveis rostral (A), médio (B) e
caudal (C) de mesencéfalo de ratos evidenciando a localização da SNR e subdivisões
da SNc.
45
FIGURA 10: Cortes coronais de mesencéfalo de RJ com imunohistoquímica para
S100B em níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), com aumento de 4x,
evidenciando a localização e as subdivisões da SNc encontradas em cada nível.
46
FIGURA 11: Cortes coronais de mesencéfalo de RJ, nível rostral, evidenciando as
diferentes intensidades de marcação encontradas na SNCD, SNR, SNCL e cp (à
esquerda) com aumento de 10x. À direita, com um aumento de 20x, pode-se verificar
com nitidez o parcelamento das estruturas em destaque na imagem anterior.
47
FIGURA 12: Fotomicrografias de mesencéfalo de RJ, nível médio, aumentado em 4x,
destacando as subdivisões da SNc (A). Em B, C e D, em aumento de 20x, observa-se
o parcelamento das estruturas destacadas em A.
48
FIGURA 13: Fotomicrografias de mesencéfalo de RJ em nível caudal, com aumento
de 20x, evidenciando o parcelamento e a ausência de astrócitos na SNCM (A) e o
parcelamento da SNCV (B), com marcação ligeiramente mais fraca do que a SNR.
Observa-se presença de astrócitos espalhados em toda a camada ventral da SNc.
50
FIGURA 14: Fotomicrografias da SNCL de RJ, com aumento de 20x, nos níveis
rostral (A), médio (B) e caudal (C), evidenciando um aumento na intensidade da
51
marcação no sentido caudal e presença astrócitos em maior quantidade no nível
caudal, seguido do rostral e médio.
FIGURA 15: Cortes coronais de mesencéfalo de RMI com imunohistoquímica para
S100B, nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), aumento de 4x.
52
FIGURA 16: Fotomicrografias de mesencéfalo de RMI em nível rostral com aumento
de 4x, destacando a SNCD e SNCL (A). Em B visualizam-se as diferenças na
marcação e na estrutura do ml, SNCD e SNR. As setas indicam a linha que delimita a
margem superior da SNCD, separando-a do ml. Em C observa-se a delimitação
precisa entre a SNCL e a SNR. As setas apontam para margem do cp, que marca a
divisão entre este e a SNCL.
54
FIGURA 17: Fotomicrografias de mesencéfalo de RMI em nível médio. A porção
destacada em A (aumento de 4x) equivale à figura B (aumento de 10x), onde é
perceptível a distinção entre a SNCL e a SNR pela diferença na intensidade da
marcação, enquanto que em relação ao cp os limites estão estabelecidos pelo próprio
contorno do cp, apontado pelas setas em B.
55
FIGURA 18: Fotomicrografias de mesencéfalo de RMI em nível caudal, aumentado
em 4x (A) evidenciando o ml (mais claro) e a SNR (mais escura), entre os quais
localiza-se a SNCM e a SNCD. Em B encontra-se o quadro em destaque na figura A,
com aumento de 20x. As setas indicam a delimitação da SNCM, que a separa do ml.
56
FIGURA 19: Fotomicrografias de cortes coronais de mesencéfalo de RI com
imunohistoquímica para S100B, nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C),
destacando as subdivisões da SNc, bem como as estruturas de referência para
encontrá-la. Aumento de 4x.
58
FIGURA 20: Fotomicrografias de mesencéfalo de RI, nível rostral aumentado em 4x
(A). A figura B se refere à porção destacada em A, com um aumento de 10x,
evidenciando as diferenças estruturais da SNCD, as quais as distingue das demais
regiões.
59
FIGURA 21: Fotomicrografias de mesencéfalo de RI em nível médio apresentando
em A uma área em destaque que corresponde à SNCL. Aumento de 4x. Em B temos a
imagem destacada em A, mostrando as diferentes marcações das estruturas
encontradas na imagem. As setas indicam a margem existente entre a SNCL e a
SNCD. Aumento de 10x.
60
FIGURA 22: Fotomicrografias de mesencéfalo de RI em nível caudal, evidenciando
as variações na intensidade da marcação nas diferentes estruturas (A), aumento de 4x.
Em B, imagem de corte histológico equivalente ao destacado em A, evidenciando a
SNCM com setas indicando o limite entre esta e o ml. Na imagem ainda é possível
observar as diferentes marcações na SNCD, SNCV e SNR (B), aumento de 10x.
61
FIGURA 23: Fotomicrografias de mesencéfalo de RI em nível caudal com aumento
de 10x, evidenciando em A, a SNCL, com intensa marcação, limite superior bem
delimitado e limite inferior em contato com a SNR, porém com contorno evidente
indicado pelas setas. Em B está destacada pelas setas a SNCV, com marcação
ligeiramente mais clara do que a da SNR, onde está inserida.
62
FIGURA 24: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível rostral, com aumento de 4x
evidenciando a SNR, SNCD, SNCL de RJ (A), RMI (B) e RI (C).
64
FIGURA 25: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível rostral, com aumento de
10x, evidenciando a SNCL em RJ (A), RMI (B) e RI (C). Nas imagens é possível
perceber o parcelamento da estrutura em destaque, sendo que há uma melhor nitidez
no parcelamento da estrutura no RJ.
65
FIGURA 26: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível rostral, com
imunohistoquímica para S100B, com aumento de 10x, evidenciando a SNCD em
RMI (A) e RI (B).
66
FIGURA 27: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível médio, com
imunohistoquímica para S100B, com aumento de 4x, evidenciando as subdivisões da
SN em RJ (A), RMI (B) e RI (C).
68
FIGURA 28: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível médio, submetidos a
imunohistoquímica para S100B, com aumento de 10x, evidenciando a SNCL em RJ
(A), RMI (B) e RI (C).
69
FIGURA 29: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível caudal, com
imunohistoquímica para S100B, com aumento de 4x, evidenciando as subdivisões da
SN em RJ (A), RMI (B) e RI (C).
71
FIGURA 30: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível caudal, submetidos a
imunohistoquímica para S100B, com aumento de 10x, evidenciando a SNCL em RJ
(A) e RI (B).
72
FIGURA 31: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível caudal, submetidos a
imunohistoquímica para S100B, com aumento de 10x, evidenciando a SNCM em RJ
(A), RMI (B) e RI (C).
73
FIGURA 32: Fotomicrografias de mesencéfalos em nível caudal, submetidos a
imunohistoquímica para S100B, com aumento de 10x, indicando a localização da
SNCV, ligeiramente mais clara do que a SNR em RJ (A), RMI (B) e RI (C).
74
LISTA DE ABREVIATURAS
AB: Complexo Avidina Biotina
BSA: Albumina Sérica Bovina
Ca2+
: Cálcio
CEEA: Comissão de Ética no Uso de Animais
cp: Pedúnculo Cerebral
DA: Dopamina/3-Hidroxitiramina
DAB: 3,3’,4,4’ tetrahidrocloreto-diaminobenzidina
DP: Doença de Parkinson
GABA: Ácido gama-aminobutírico
H2O2: Peróxido de Hidrogênio
ml: Lemnisco Medial
mp: Pedúnculo mamilar
MPTP: 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
MT: Núcleo Medial Terminal do Trato Óptico acessório
OMS: Organização Mundial de Saúde
PAG: Área Periaquedutal
PFA: Paraformaldeído
RAGE: Receptor de Produtos Finais de Glicação Avançada
RI: Rato Wistar Idoso (23 meses)
RJ: Rato Wistar Jovem (3 meses)
RMI: Rato Wistar de Meia Idade (13 meses)
RRF: Zona Retrorubral
SNc: Substância Negra pars Compacta
SNC: Sistema Nervoso Central
SNCD: Substância Negra Camada Dorsal
SNCL: Substância Negra Camada Lateral
SNCM: Substância Negra Camada Medial
SNCV: Substância Negra Camada Ventral
SNP: Sistema Nervoso Periférico
SNR: Substância Negra Reticulada
TH: Tirosina-Hidroxilase
VTA: Área Tegumentar Ventral
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 17 1.1 CONSIDERAÇÕES ANÁTOMO-FISIOLÓGICAS ACERCA DA SUBSTÂNCIA
NEGRA pars COMPACTA (SNc) ............................................................................................ 17 1.2 PROTEÍNA S100B E SEU PAPEL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL .................... 21 1.3 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DO ENVELHECIMENTO ....................................... 26
1.4 ENVELHECIMENTO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL ........................................ 31
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 35 2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 35 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 35
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 36
3.1 MODELO EXPERIMENTAL ............................................................................................ 36 3.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .......................................................................... 36
3.2.1 Anestesia ......................................................................................................................... 37 3.2.2 Perfusão Transcardíaca................................................................................................. 37 3.2.2.1 Posicionamento do animal ............................................................................................ 37 3.2.2.2 Toracotomia .................................................................................................................. 38 3.2.2.3 Cardiopunção ................................................................................................................ 38
3.2.3 Remoção dos Encéfalos ................................................................................................. 38 3.2.4 Microtomia ..................................................................................................................... 38 3.2.5 Imunohistoquímica ........................................................................................................ 39 3.2.6 Intensificação Pelo Ósmio ............................................................................................. 41 3.2.7 Obtenção das Imagens .................................................................................................. 41
4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 42 4.1 RATOS JOVENS ................................................................................................................ 45 4.2 RATOS DE MEIA IDADE ................................................................................................. 51 4.3 RATOS IDOSOS ................................................................................................................ 56 4.4 ABORDAGEM COMPARATIVA ...................................................................................... 61 4.4.1 Nível Rostral .................................................................................................................... 61 4.4.2 Nível Médio ..................................................................................................................... 65
4.4.3 Nível Caudal .................................................................................................................... 69
5 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 74 5.1 OBSERVAÇÕES GERAIS ................................................................................................. 74
6 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 79 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 80
ANEXO .................................................................................................................................... 92
17
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES ANÁTOMO-FISIOLÓGICAS ACERCA DA SUBSTÂNCIA
NEGRA pars COMPACTA (SNc)
Localizada no mesencéfalo (FIGURA 1), a Substância Negra (SN) fica situada
próximo aos pedúnculos cerebrais (cp), entre o tegmento e a base do mesencéfalo (Alho,
2011) que, juntamente com a Zona Retrorrubral (RRF) e Área Tegumentar Ventral (VTA),
corresponde às áreas do mesencéfalo que possuem neurônios dopaminérgicos. A identificação
de subdivisões ao longo da SNc foi possível pela densidade e morfologia dos neurônios
encontrados em cada uma dessas áreas (Cavalcanti et al., 2014).
FIGURA 1: Localização da Substância negra no encéfalo humano. Modificado de
https://bodytomy.com/function-location-of-substantia-nigra.
A SN contém um grande acúmulo de neurônios contendo melanina. Essa
pigmentação propiciou a visualização macroscópica da estrutura no final do século XVIII,
descrita por Vick d’Azyr e Von Soemmering, mais de 50 anos após a descoberta do núcleo
rubro (Usunoff et al., 2002).
A SN é o maior núcleo mesencefálico do SNC. Forma uma estrutura integral com os
gânglios da base e seus neurônios dopaminérgicos constituem a via nigroestriatal (FIGURA 2)
(Williams et al., 2014). A RRF, SN e VTA são também chamadas de A8, A9 e A10
respectivamente (Fu et al., 2012). Os neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo
desempenham papeis em diversas funções cerebrais, como o processamento de recompensa,
motivação, aprendizagem, memória e movimento (Yamaguchi et al., 2013).
18
FIGURA 2: Vias dopaminérgicas centrais. Modificado de https://www.axolbio.com/blog/axol-incubator-
1/post/as-strong-as-the-weakest-link-62. Ver lista de abreviações.
A SN possui duas grandes subdivisões: A parte Reticulada (SNR), gabaérgica e a
parte Compacta (SNc), dopaminérgica (FIGURA 3). Esta última possui as seguintes
subdivisões: Substância negra, camada dorsal (SNCD), Substância negra, camada ventral
(SNCV), Substância negra, camada lateral (SNCL) e Substância negra, camada medial
(SNCM). A SNCM e SNCD localizam-se lateralmente aos núcleos mamilar e supramamilar,
medial ao núcleo subtalâmico, ventral à zona incerta e dorsal à SNR. A SNCL está situada
lateralmente à SNCD e dorsal à SNR. A SNCV é formada por um grupo de neurônios
imunorreagentes à Tirosina Hidroxilase - TH, situadas bilateralmente na porção intermediária
ventral da SNCD e dorsal ao cp, inserido na SNR (Cavalcanti et al., 2016).
19
FIGURA 3: Localização e subdivisões da SNc. Modificado de Paxinos e Watson, 2007. Ver lista de abreviações.
As projeções dopaminérgicas procedentes da parte ventral do mesencéfalo
desempenham papel fundamental na aprendizagem de motivação e reforço, muito embora não
se tenha ainda total clareza da natureza exata da sua contribuição (Coizet et al., 2003).
A SNc e RRF têm sido identificadas como estruturas dopaminérgicas, porém também
vem sendo documentada a presença de neurônios não dopaminérgicos nessas estruturas.
Alguns desses neurônios não-dopaminérgicos utilizam GABA como sinalizador da
neurotransmissão (Yamaguchi et al., 2013). A via nigroestriatal dos neurônios dopaminérgicos
da SNc para o estriado dorsal é controlada por vários gabaérgicos inibitórios aferentes. O
estriado, o globo pálido externo e a SNR são os que mais contribuem para o controle
gabaérgico da atividade dopaminérgica na porção caudal da VTA (Bourdy et al., 2014).
Os neurônios dopaminérgicos da SNc fazem o controle de movimentos através das
suas projeções de sinalização da dopamina (DA) para o estriado dorsal (via nigroestriatal),
onde a diminuição anormal dessa sinalização ocasiona os sintomas motores da DP, enquanto
que a diminuição anormal da sinalização da dopamina originária da parte ventral do
mesencéfalo (vias nigroestriatal e mesocorticolímbica) está associada aos sintomas de
esquizofrenia, dependência tóxica e depressão (Aumann e Horne, 2012).
A principal alteração patológica associada à DP é a degeneração dopaminérgica
progressiva nos neurônios da SN, onde a TH catalisa a síntese da L-3-4-diidroxifenilalamina -
L-DOPA para tirosina, passo limite da biossíntese da dopamina, desempenhando um papel
fundamental na patogênese da DP (Wang et al., 2016). Esta é uma enzima que pode
evidenciar neurônios dopaminérgicos e os neurônios imunorreativos à TH existentes no
20
mesencéfalo são considerados produtores de dopamina, o que a torna um marcador confiável
para se pesquisar dopamina nesta região (Cavalcanti et al., 2014).
Os neurônios dopaminérgicos da SNc estão extremamente envolvidos na seleção da
aprendizagem do comportamento motor voluntário. A degeneração progressiva desses
neurônios dá origem a déficit motor e incapacidade, característicos da DP (Wild et al., 2014).
Outra característica da doença é a presença de inclusões citoplasmáticas conhecidas
histologicamente por corpos de Lewy (Oikawa et al., 2014), constituídos principalmente por
ubiquitina e α-sinucleína, alterações estas que promovem a diminuição dos níveis de DA na
via nigroestriatal, ocasionando o surgimento de déficits motores (Hohlefeld et al., 2015).
Além da perda de células, acontecem graves alterações morfológicas, como perda de espinhas
dendríticas e diminuição no comprimento destes, tanto na SNc como no estriado (Kamagata et
al., 2016).
A DP é a segunda doença neurodegenerativa mais comum associada ao
envelhecimento (Oikawa et al., 2014), perdendo o primeiro lugar para o mal de Alzheimer,
sendo este o principal fator de risco para a doença, sendo que 90% dos casos são idiopáticos
(Corradini et al., 2014). Os sintomas motores da DP incluem geralmente rigidez muscular,
bradicinesia, postura anormal, tremor estático, entre outros. Em casos avançados, os
portadores podem apresentar dificuldades no autocuidado e até paralisias. Seus mecanismos
ainda não estão totalmente esclarecidos, mas sabe-se que fatores ambientais e genéticos, como
disfunções na degradação de proteínas (Muñoz et al., 2012), o stress oxidativo, disfunção
mitocondrial, desequilíbrio da homeostase do cálcio (Ca2+
), resposta inflamatória etc., podem
induzir à perda ou degeneração dos neurônios dopaminérgicos da SN, causando a patologia
(Zhuang et al., 2015).
Sintomas não motores também podem ser verificados, como depressão, distúrbios do
sono, disfunção olfatória e déficits cognitivos, que são manifestações comuns e contribuem
para levar gradativamente o indivíduo acometido à incapacidade, afetando diretamente a sua
qualidade de vida (Ziemssen e Reichmann, 2007). Essas manifestações aparecem quando há
depleção de 60% dos neurônios dopaminérgicos da SNc e de 80% no estriado (Dauer e
Przedborski, 2003).
O stress oxidativo pode contribuir no processo de degeneração neuronal na DP, uma
vez que as reações de oxidação são catalisadas por metais como o ferro, o cobre e o
manganês, tendo o ferro a maior importância do ponto de vista biológico. As maiores
concentrações deste metal no cérebro encontram-se nos núcleos da base, principalmente no
globo pálido, núcleo rubro e SNc através da neuromelanina, seu principal armazenador.
21
Normalmente as concentrações aumentam com o avançar da idade, ocasionando acúmulo do
metal no SNC, favorecendo os processos oxidativos (Fernandes et al., 2007; Teive, 2005). A
neuroinflamação é outro processo que tem um importante papel na degeneração dos neurônios
dopaminérgicos da SNc, quando há uma intensificação na ativação das células gliais (Carmo,
2015; Mosley et al., 2006; Silva, 2014).
Sabendo que a DP é uma doença neurodegenerativa relativamente comum no
envelhecimento, que acontece a partir da degeneração de neurônios dopaminérgicos da SNc, onde
a partir dessa depleção há uma intensificação na atividade das células gliais, ajudando na
sobrevivência desses neurônios (ou causando prejuízos ao tecido, dependendo do tipo de glia) e
ainda, considerando que os astrócitos são as células gliais mais numerosas no SNC e que abrigam
em seu citoplasma a proteína S100B, a qual desempenha efeitos tróficos ou tóxicos no SNC,
dependendo da sua concentração, percebe-se na necessidade de caracterizar a citoarquitetura da
SNc mediante imunohistoquímica contra S100B em diferentes etapas do ciclo vital.
1.2 PROTEÍNA S100B E SEU PAPEL NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
A proteína S100 foi primeiramente isolada em meados da década de 1960, sendo
descrita inicialmente como uma proteína específica do tecido nervoso (Moore, 1965), presente
nas células da glia, células de Schwann e subpopulações neuronais específicas (Varrica et al.,
2015). Por muito tempo foi considerada uma proteína exclusiva do sistema nervoso, porém,
estudos posteriores atestaram sua presença em diversos tipos de tecidos, não apenas neurais
(Michetti et al., 2012). Até o momento, não foi descoberta a expressão em invertebrados,
somente em humanos e animais vertebrados de um modo geral (Li, et al., 2014).
Mais de cinquenta anos se passaram e muito se tem a descobrir sobre essa proteína.
Desde sua descoberta, grandes cientistas ainda estão pesquisando suas especificidades
funcionais. Um dos dogmas favoritos dentro da biologia “um gene, uma proteína, uma
função”, não se aplica a classe das S100. Devido à sua capacidade de ligar-se com o cálcio,
este polipeptídeo se torna capaz de desenvolver inúmeras funções intracelulares e
extracelulares (Fanò et al., 1995).
Esse grupamento de proteínas recebeu a denominação de S100 por ser parcialmente
solúvel em Sulfato de Amônia 100% saturada em PH neutro (Astrand, et al., 2012). É uma
das ligantes de Ca2+
, dentre as quais acrescentam-se a Parvalbumina, Calbidina e Calretinina
(Miki et al, 2012). São proteínas multifuncionais compostas por cerca de 20 moléculas, com
20-80% de homologia em sua sequência de aminoácidos. É expressa em tecidos e células
22
específicas, sendo que em algumas delas não se ligam apenas ao cálcio, mas também ao
Cobre (Cu2+
) e ao Zinco (Zn2+
) (Wheeler et al., 2016), em domínios do tipo EF-Hand, os
quais se caracterizam por duas estruturas α-hélices conectadas por uma volta, com topologia
semelhante a uma mão (FIGURA 4) (Costa, et al., 2013).
FIGURA 4: Domínios de EF-hand. Modificado de Caracelli e Schpector (2008).
No que se refere à estrutura, a proteína é um dímero composto por duas subunidades
descritas primariamente por “α” e “β”, atualmente denominadas “A” e “B” respectivamente,
constituindo assim, três isoformas: α-α, α-β e β-β, onde as subunidades α-β (S100A) e β-β
(S100B) são as mais comuns (Kumar et al., 2015). São proteínas de baixo peso molecular
(cerca de 10 a 12 kDa para cada subunidade), onde as S100B correspondem a 96% do total
das proteínas S100 presentes no encéfalo humano e 0,5% de todas as proteínas cerebrais
(Snyder-Ramos et al., 2004).
Essas proteínas são largamente distribuídas em diversos tipos de células. A
subunidade S100A tem uma ampla distribuição na musculatura esquelética, miocárdio, fígado,
pulmões, rins e pâncreas (Li et al., 2006). Pesquisadores sugerem que a subunidade S100A
pode estar envolvida na regulação do pH, eletrólitos e água, por ser encontrada em glândulas
salivares e sudoríparas, bem como em algumas células renais (Glenney et al., 1989).
A família é composta por 25 pequenas proteínas ácidas, que consiste em 16 S100A
(S100A1 – S100A16), bem como a S100B, S100G, S100P e S100Z (Gross et al., 2014). Esses
membros apresentam-se desregulados em alguns tipos de neoplasias e outras doenças, como
23
no câncer gástrico, que apresentam alta expressão de S100A2, S100A4, S100A8, S100A10 e
S100A11, além da S100A14, que surgiu como um grande marcador de classificação e
prognóstico para esse mesmo tipo de câncer. As proteínas ligantes de Cálcio da família das
S100 estão envolvidas na regulação de diversos processos fisiológicos celulares, como o
crescimento e diferenciação (Zhang et al., 2014). Além dos tumores gástricos, as S100A4,
S100A8 e S100A11 se apresentam alteradas em outros tipos de tumores, como os colorretais,
pâncreas e próstata. Nesses tumores, as S100A6, S100A9 e S100P também apresentam
expressão alterada (Martinez-Aguilar, et al., 2015).
A S100A pode ser encontrada no SNC, mas não no SNP, enquanto que a S100B é
encontrada predominantemente no citoplasma de astrócitos (Costa et al., 2013), e também em
menor grau em neurônios, microglia, oligodendrócitos, diversos tipos de células e tecidos,
como as células de Schwann, condrócitos, melanócitos, adipócitos, músculo esquelético e
cardíaco (Shapiro et al., 2010), células de Bergman e ependimais (Campos et al., 2015).
A S100B está envolvida em atividades regulatórias de forma intra e extracelular.
Exerce a sua função biológica interagindo com outras proteínas, afetando diretamente na
atividade destas células. Assim, intracelularmente (FIGURA 5) este dímero exerce efeitos
regulatórios na proliferação celular, forma e diferenciação, bem como no metabolismo
energético (Al-Ayadhi e Mostafa, 2012) e ainda fosforilação proteica, transcrição e
homeostase do cálcio (Donato et al., 2009).
A principal fonte intracelular da S100B são os astrócitos, mas se expressam também
em outras células neuroectodérmicas, bem como em certas populações neuronais e
melanócitos, subconjuntos de células de defesa, incluindo células dendríticas e algumas
populações de linfócitos, células endoteliais, entre outras (Cheong et al., 2014).
24
FIGURA 5: Representação esquemática dos efeitos regulatórios intracelulares da S100B.
FONTE: Donato et al., 2009.
De forma extracelular, estimula a sobrevivência neuronal, diferenciação, proliferação
dos astrócitos, degradação neuronal por apoptose e regulação da atividade inflamatória celular
(Al-Ayadhi e Mostafa, 2012). Em níveis nanomolares, a S100B exerce efeitos neurotróficos,
que podem ser relacionados à sobrevivência e desenvolvimento dos neurônios ou de estímulo
à proliferação das células neuronais, favorecendo o crescimento de neuritos e aumentando a
plasticidade sináptica (Costa et al., 2013). Por outro lado, observou-se in vitro que níveis
micromolares estimulam a expressão de citocinas pró-inflamatórias e induzem a apoptose
(Miki et al., 2012). Após o lançamento, quando a proteína atinge concentrações
micromolares, se acumula na superfície dos receptores RAGE - Receptor para produtos finais
de Glicação Avançada (Cirillo et al., 2015).
Este receptor está envolvido no reconhecimento de padrões envolvidos na ativação
da imunidade inata e a S100B interage com RAGE em diferentes tipos de células (Villarreal
et al., 2014). Os efeitos pró-inflamatórios da S100B são atribuídos a essa afinidade de se ligar
com o receptor RAGE na microglia, neurônios e astrócitos no SNC (Fujiya et al., 2014).
A expressão da S100B é detectada no tecido cerebral antes do 14º dia do
desenvolvimento embrionário e aumenta proporcionalmente durante o desenvolvimento do
sistema nervoso até a idade adulta, quando é estabilizada (Liu et al., 2011). Os valores da
S100B maiores no período neonatal são explicados pela intensa maturação da atividade
neuronal e da glia nessa fase (Martins et al., 2006). Um estudo feito com determinação da
S100B no plasma sanguíneo de humanos em diferentes fases da vida concluiu que não há
diferenças estatísticas significantes no que diz respeito ao sexo masculino e feminino nos
25
grupos com a mesma idade (Portela et al., 2002).
Outras condições psiquiátricas, como a depressão e a esquizofrenia e patologias
como o mal de Alzheimer e Síndrome de Down também mostram expressão e distribuição
celular e tecidual da S100B alteradas no encéfalo (Shapiro et al., 2010). A presença ou
ausência de imunorreatividade para S100 tem sido utilizada no diagnóstico e classificação de
tumores no SNC e como marcador de diversos outros tumores, incluindo melanomas,
condroblastomas, Schwannomas, tumores de histiócitos, entre outros (Fernandez-Flores e
Díaz-Galvez, 2014).
Em estudo clínico com pacientes acometidos por depressão profunda e indicação de
Eletroconvulsoterapia, foi utilizado S100B como marcador de danos cerebrais, sabendo que
os níveis séricos já se encontram aumentados nessa patologia. Os autores concluiram que os
níveis séricos não são afetados por esta terapia (Kranaster et al., 2014).
Em pacientes com esquizofrenia paranoide aguda verificou-se que os níveis de
S100B na admissão eram mais elevados do que na alta. Nestes pacientes, a S100B se
apresentava mais elevada ao meio-dia do que à meia-noite, fato que não foi observado no
grupo-controle, indicando que o aumento das concentrações pode estar relacionado com a
condição clínica do paciente (Morera-Fumero et al., 2017).
Estudos em animais mostraram que a exposição pré-natal à cocaína debilita o
desenvolvimento das células astrogliais e diminui a distribuição da S100B em astrócitos no
hipocampo e córtex cerebral. Em estudo clínico realizado com usuários de cocaína com grupo
controle de não-usuários, foi observado mal desempenho nos testes cognitivos e elevado
número de sintomas psiquiátricos no grupo de usuários, porém as diferenças nos níveis
séricos de S100B não foram estatisticamente relevantes comparadas ao grupo-controle.
Autores comentam que não existe relação direta entre a concentração sérica de S100B e as
funções cognitivas (Kessler et al., 2007).
O aumento da liberação da S100B pelos astrócitos está presente em situações em que
há diminuição do fluxo de oxigênio para o cérebro, tais como Traumatismo Crânio
Encefálico, Infarto Agudo do Miocárdio com lesão cerebral, hipóxia neonatal, prática
esportiva, Síndrome da Apneia Obstrutiva do Sono e o mergulho de apneia. Devido ao papel
dessas moléculas no desencadeamento da inflamação, a S100B pode ter um papel importante
na ativação da microglia em resposta à lesão cerebral (Costa et al., 2013). Trata-se de um
marcador de danos cerebrais com algumas especificidades, tais como: meia-vida curta (apenas
2 horas), estabilidade térmica, além de manter concentrações séricas inalteradas na presença
de protamina, heparina ou em hemólise (Zhang et al., 2016).
26
Existe uma correlação positiva entre S100B e disfunções neurológicas pós-cirurgia
cardíaca. Quando na cirurgia é utilizada a circulação extracorpórea (CEC), acontece hipóxia
cerebral discreta. Em tal situação, os níveis séricos de S100B aumentados imediatamente após
a cirurgia foram associados à idade e ao tempo que permaneceram em CEC. Já um aumento
persistente até 48 horas após a cirurgia foi associado à disfunção neurológica (Snyder-Ramos
et al., 2004). Em lesões encefálicas traumáticas, o acompanhamento dos níveis séricos S100B
pode ser útil como marcador para quantificar a extensão dos danos causados ao tecido no
SNC (Bellander et al., 2011).
Em pesquisa com praticantes de mergulho de apneia foi constatado um aumento
transitório nos níveis séricos de S100B, em que ocorre abertura temporária da barreira
hematoencefálica, permitindo que a proteína presente nos fluidos extracelulares cerebrais
adentre a corrente sanguínea. Em situações como a desse estudo, a concentração sérica da
S100B pode se apresentar aumentada em 100% dos casos, porém em níveis inferiores, se
comparados, por exemplo, aos níveis apresentados em pacientes que tiveram Acidente
Vascular Encefálico isquêmico ou hipóxia cerebral pós parada cardiorrespiratória (Andersson
et al., 2009). Na hemorragia subaracnóidea por aneurisma os elevados níveis séricos da
S100B foram associados aos piores prognósticos a longo prazo (Lai et al., 2015).
O encéfalo apresenta 10.000 vezes mais S100B do que qualquer outro órgão do
corpo e em mamíferos a concentração aumenta com o avançar da idade (Stefansson et al.,
1982). Em condições fisiológicas, a S100B é mais fortemente expressa em áreas como o
córtex cerebral e cerebelar, hipocampo e áreas periventriculares. A substância negra é a única
área analisada até o momento que mostra colocalização da S100B com GFAP, apenas em
condições patológicas (Campos et al., 2015).
A região da SNc foi escolhida por ser uma área que contém neurônios
dopaminérgicos, os quais sofrem depleção em uma das principais doenças associadas à idade,
que é o Parkinson, na qual os indivíduos acometidos também têm aumento na expressão de
S100B. Devido ao envelhecimento demográfico da população, a Organização Mundial da
Saúde (OMS) espera que patologias associadas ao avanço da idade venham a aumentar
diversas vezes nas próximas décadas (Moran et al., 2006), daí a necessidade de uma maior
atenção aos estudos relacionados ao envelhecimento.
1.3 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DO ENVELHECIMENTO
27
O envelhecimento populacional é um evento mundial, que ocorre naturalmente tanto
em países desenvolvidos como em desenvolvimento. É um fenômeno que ocorre devido a um
processo chamado “transição demográfica”, que consiste no aumento da expectativa de vida
de uma população, associado à redução do número de nascimentos (Fine, 2014).
A OMS define o limite de 65 anos para se considerar o indivíduo idoso em países
desenvolvidos e de 60 anos nos subdesenvolvidos (Baldoni e Pereira, 2011). O aumento da
população idosa mundial, em especial dos países desenvolvidos, está acontecendo como
consequência do aumento da expectativa de vida e da baixa fecundidade (Há et al., 2014).
Há muito tempo a humanidade procura compreender como conseguir longevidade
com uma alta qualidade de vida. Uma das alternativas encontradas para esse questionamento
foi aumentar a expectativa de vida das pessoas mediante a diminuição da mortalidade através
do controle das doenças crônicas (Crimmins et al., 2016).
Inúmeros outros fatores contribuíram para esse aumento da expectativa de vida,
dentre os quais se destacam: melhorias do acesso à educação, avanços biomédicos, progresso
socioeconômico, bem como políticas democráticas de desenvolvimento social. Esse conjunto
de fatores fez com que, em um século, alguns países conseguissem duplicar a média de idade
dos seus habitantes (Fernández-Ballesteros et al., 2013).
Esse aumento da expectativa de vida ao nascer iniciou-se na Suécia e França no
século XIX, como consequência do declínio das taxas de fecundidade e se estendeu a todos os
países desenvolvidos na década de 1950. As projeções populacionais sugerem que em 2060
nas regiões mais desenvolvidas do mundo haverá aproximadamente 165 idosos com mais de
65 anos para cada 100 crianças e jovens menores de 15 anos (Uhlenberg, 2013).
Neste sentido, o quantitativo mundial de pessoas com sessenta anos ou mais está
aumentando gradativamente. Os dados da OMS apontam que em 2025 teremos mais de 800
milhões de indivíduos com mais de 65 anos em todo o mundo (Fechine e Trompieri, 2012).
Os números postos levaram a Organização das Nações Unidas a considerar o período de 1975
a 2025 como a “Era do Envelhecimento”, sendo observado de forma mais lenta e gradativa
em países desenvolvidos e de forma mais acelerada nos ditos em desenvolvimento (Moreira et
al., 2016).
No Brasil, a estrutura etária mostrava-se extremamente jovem nas décadas de 1950 e
1960, tendo iniciado o processo de envelhecimento na década de 1970. A partir daí, passou a
ocorrer declínio progressivo nas taxas de natalidade e em paralelo a diminuição nas taxas de
mortalidade, tendo como consequência o aumento das populações em idade ativa e de idosos
em 2010 (Vasconcelos e Gomes, 2012). No caso do Brasil e outros países emergentes, essa
28
transição aconteceu de forma exponencial, acelerada e desordenada, sendo visualizado não só
como fator de avanço socioeconômico, mas como um problema que deve ser solucionado
(Brasil e Batista, 2015).
Com a explosiva transição demográfica no Brasil, o índice de envelhecimento da
população aumentou consideravelmente nas últimas décadas. O aumento pode ser
evidenciado pela diminuição da mortalidade infantil, que diminuiu de 69,10 para 22,5 por mil
nascidos vivos de 1980 a 2009, ao passo que a esperança de vida ao nascer aumentou de 62,6
anos para 73,09 no mesmo intervalo de tempo. Pelas projeções, estima-se que a população
idosa crescerá mais intensamente a partir de 2020, chegando a 52 milhões em 2040, o que
representa um quarto do total de habitantes do país (Mendes et al., 2012). Em 2050 serão 153
milhões de pessoas com mais de 80 anos no mundo, aproximadamente 3,4% da população
total mundial (Araújo et al., 2016).
Os gastos com a saúde das populações envelhecidas geram um impacto
socioeconômico considerável para a comunidade como um todo e em particular, para os
serviços de saúde, sendo necessário examinar a influência do envelhecimento nas despesas em
cuidados de saúde do país para orientar as políticas de saúde voltadas esse público (Há et al.,
2014).
Com essas estimativas, a questão do envelhecimento no Brasil torna-se preocupante
e impulsiona mudanças no cenário da saúde pública. Até a década de 1990 não existiam
políticas públicas voltadas aos idosos, mas alguns programas ou ações procedentes da
iniciativa privada, como a Sociedade Brasileira de Geriatria, fundada no Rio de Janeiro em
1961, entidade científica pioneira a se preocupar com a saúde dos idosos. Posteriormente a
mesma passou a ser conhecida por Sociedade Brasileira de Geriatria e Gerontologia (Brandão
et al., 2015).
Após a institucionalização do Sistema Único de Saúde (SUS) no final da década de
1980, surgiram no Brasil mudanças assistenciais de extrema relevância, como a criação do
Programa de Agentes Comunitários de Saúde e posteriormente Programa Saúde da Família,
que pela importância que assumiu passou a ser chamado de Estratégia Saúde da Família,
passando a ver o indivíduo não apenas na sua patologia, mas também em sua prevenção
(Torres et al., 2014).
Com o intuito de garantir a melhoria do acesso à saúde da população, inúmeros
programas e políticas foram sendo criados, dentre eles, a Política Nacional do Idoso, na
década de 1990, aprovada pela Lei nº 8842/94 e regulamentada pelo Decreto Nº 1948/96, que
reafirma o direito da pessoa idosa a ser independente, ter autonomia e cuidado com a sua
29
própria vida (Cavalini et al., 2014). A abordagem dessa política segue o conceito de
“Envelhecimento Ativo”, adotado pela OMS, em meados de 1990, com o objetivo de dar
apoio ao conceito de envelhecimento saudável e reconhecer que os cuidados com a saúde e
diversos outros fatores afetam, diretamente, o decurso do processo de envelhecimento da
população. O envelhecimento ativo tem como finalidade aumentar a qualidade e a expectativa
de vida saudável da sociedade atual à medida que as pessoas vão envelhecendo, incluindo
aqueles que são frágeis, deficientes e necessitados de cuidados, favorecendo uma alimentação
saudável e prática de atividades físicas no cotidiano, além de incentivar a redução do
tabagismo (Jhala e Christian, 2013).
Em 1999 o Ministério da Saúde, por meio da portaria nº 1.395 lança a Política
Nacional de Saúde do Idoso, que visa garantir assistência integral à saúde do idoso no âmbito
do SUS, mais uma vez com ênfase na promoção do envelhecimento ativo e saudável e
também dando apoio ao desenvolvimento de cuidados informais (Brasil, 2010).
Paralelamente ao impacto causado pelo aumento da população idosa, surge a
necessidade de políticas públicas voltadas para essa população. A partir daí é lançado em
2003 o Estatuto do Idoso que passa a garantir por lei que o idoso usufrua de todos os direitos
inerentes à pessoa humana, destacando a preservação da saúde e autonomia para as pessoas
que vivenciam a última etapa da vida (Neto et al., 2015).
Posteriormente, no ano de 2006, foi aprovada a Política Nacional de Saúde da Pessoa
Idosa, que amplia o atendimento às necessidades da pessoa idosa, direcionando medidas
coletivas e individuais de saúde voltadas à recuperação, promoção e manutenção da
independência do idoso, conforme as diretrizes do SUS (Dagios et al., 2015).
O ato de envelhecer causa alterações dinâmicas e progressivas, naturais e
irreversíveis de ordem funcional, biológica e psicológica ocorridas ao longo do tempo,
podendo ser observado em idade mais precoce ou mais avançada, dependendo da genética e
também dos hábitos de vida de cada um. Uma nutrição adequada, apoio psicológico e
atividade física podem contribuir para minimizar os efeitos do tempo no corpo do indivíduo
(Girondi et al., 2013).
Apesar das discussões e aprimoramento das garantias do acesso à saúde da
população idosa, muitas questões ainda são mal compreendidas pela sociedade em geral. Uma
delas é a diferença entre o processo de envelhecimento natural e o surgimento de doenças
crônicas. A doença necessariamente não faz parte do curso normal da velhice, mas torna-se
comum em virtude das alterações do estado geral do idoso. Para um melhor entendimento, é
importante compreender que o envelhecimento pode se dar de forma natural ou associado a
30
doença. Quando o envelhecer acontece de forma natural, conceitua-se como senescência.
Trata-se de uma etapa do ciclo vital, onde ocorrem mudanças no corpo humano ao longo do
tempo, tais como: diminuição da acuidade visual, da força e do tônus muscular, além de
dificuldades na marcha e no equilíbrio, o que pode culminar, com o passar dos anos, na
incapacidade e perda da autonomia (Paiva et al., 2015), além da diminuição do turgor da pele,
surgimento de rugas, cabelos brancos e outras características (Menezes et al., 2009).
As populações que apresentam um envelhecimento tido como normal podem ainda
ser subdivididas em dois subgrupos: os que apresentam o que se chama de envelhecimento
“bem sucedido” ou “síndrome do envelhecimento puro”, e os de envelhecimento “usual”. Os
contemplados pelo envelhecimento bem sucedido representam uma população reduzida, mas
que está em franco crescimento. Caracteriza-se por manter condições fisiológicas satisfatórias
com o decorrer dos anos e perdas mínimas em um sistema específico. Esses indivíduos
apresentam um envelhecimento saudável, independente e com alta capacidade física e
cognitiva (Camozzato et al., 2014). Já os de envelhecimento “usual” ou biológico, com
preocupações voltadas não só para o envelhecimento, mas também com a longevidade e todas
as alterações biológicas trazidas por ela. Os idosos apresentam danos significativos mesmo na
ausência de doença, além de um potencial elevado para doenças e incapacidades, mas ao
mesmo tempo manifestam capacidade de reduzir essas perdas (Janini et al., 2015).
O envelhecimento, com todas as suas fragilidades, engloba um conjunto de fatores
biopsicossociais, levando o idoso a um quadro de extrema vulnerabilidade, estando sujeitos a
hospitalizações em decorrência de declínio funcional, quedas, entre outros (Lisboa e Chianca,
2012). Neste processo, praticamente todas as funções morfológicas, biológicas e fisiológicas
perdem sua eficiência, sendo acompanhado por alterações corporais progressivas ocorridas ao
longo do tempo, onde há probabilidade da aquisição de novas doenças, geralmente crônicas,
que incapacitam ou restringem a autonomia do indivíduo e que culminam com o óbito. Ao
envelhecimento associado à doença dá-se o nome de senilidade (Lima e Delgado, 2010).
Envelhecer é um processo natural, universal, intrínseco e progressivo que caracteriza
uma etapa da vida do ser humano e se dá por mudanças físicas, psicológicas e sociais que
acometem de forma particular cada indivíduo com sobrevida prolongada, sendo acompanhada
de alterações na estrutura, função e nos processos fisiológicos do sistema nervoso
(Vaillancourt et al., 2013).
Estas são algumas hipóteses utilizadas na tentativa de explicar as causas do
envelhecimento, ainda não totalmente desvendadas. Independente de teorias, com o avançar
da idade, o indivíduo apresenta capacidade diminuída para homeostase, resultando em
31
desequilíbrio na manutenção dos sistemas vitais como o cardiovascular, respiratório, urinário
e, principalmente, o Sistema Nervoso Central (SNC), tendo o óbito como resultado final (Paz
et al., 2013).
1.4 ENVELHECIMENTO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
O tecido nervoso é composto por células neuronais, cujas funções são transmitir,
receber e processar informações, bem como por astrócitos, oligodendrócitos, células
ependimais e pela microglia no SNC (células gliais ou gliócitos), que apresentam funções
heterogêneas que vão desde a sustentação da rede neuronal até a manutenção da homeostase,
modulação e defesa desse sistema, além de células de Schwann (Chvátal et al., 2015) e
células da glia satélite no Sistema Nervoso Periférico (SNP) (Weider et al., 2015).
Os neurônios são células relativamente resistentes, mas apesar disso, a quantidade de
células nervosas e sinapses diminuem com o passar dos anos mesmo no envelhecimento
normal (Sagrado et al., 2012), sendo o hipocampo a região onde acontecem as maiores
perdas. Já a neuroglia apresenta um aumento dos 26 aos 82 anos em vários núcleos e diminui
em outros (Cançado e Horta, 2006).
Essas células neuronais, ao serem descobertas por volta do século XIX, por Rudolph
Virchow, foram associadas inicialmente à sustentação neuronal, sendo por isso denominadas
de neuroglia, que significa “cola neural” (do gr. Glia, que significa cola). Posteriormente foi
reclassificada como uma família de células distintas em morfologia e função, envolvidas em
diversos processos (Rossi et al., 2011).
As células da glia se diferenciam em macroglia (astrócitos, oligodendrócitos e
células ependimais) e microglia (Cuoghi e Mola, 2009). Os astrócitos são as células gliais
mais numerosas, que preenchem os espaços entre os neurônios. Tradicionalmente acreditou-se
que se tratavam de um componente do SNC bastante passivo, que auxiliava os circuitos
neuronais a manter sua função, fornecendo suporte, recursos estruturais e nutricionais (Marina
et al., 2016). Atuam na formação da barreira hematoencefálica e através da sua função de
suporte aos neurônios ajudam na sobrevivência destes (Neves, 2014).
Essa associação estrutural e funcional entre neurônios e astrócitos recebeu a
terminologia de “sinapse tripartite” (FIGURA 6), através do qual há o reconhecimento da
importância do papel dos astrócitos na fisiologia sináptica, e dessa forma, vitais no
processamento da informação (Halassa et al., 2009).
32
FIGURA 6: Sinapse tripartite, demonstrando a interação dos astrócitos com receptores pré e pós-sinápticos de
neurônios, onde a liberação de neurotransmissores no terminal pré-sináptico do neurônio ativa o aumento do
Ca2+
no astrócito e estimula a liberação de substâncias por este para o espaço sináptico, onde são captadas pelos
receptores pós-sinápticos dos neurônios (FONTE: Allen e Barres, 2005).
Os oligodendrócitos estão presentes apenas no SNC e formam a Bainha de Mielina,
uma membrana que envolve o axônio fornecendo isolamento elétrico e ajuda no aumento da
rapidez de condução dos impulsos nervosos. Estudos com roedores revelaram que o ambiente
estimula a mielinização e que a aprendizagem de tarefas específicas estimula a geração de
novos oligodendrócitos mielinizantes (Mensch et al., 2015).
Há ainda células não-neuronais, como as ependimais, as quais se diferenciam no
período pré-natal, constituem o assoalho epitelial que reveste os ventrículos no cérebro onde
formam uma forte barreira seletiva entre o tecido intersticial e o líquido cefalorraquidiano e
perdem essa capacidade de barreira no envelhecimento. Déficits no desenvolvimento nas
funções das células ependimais têm sido relacionados à patogênese da ventriculomegalia,
disfunções neurocognitivas e doenças neurodegenerativas como esquizofrenia e Alzheimer
(Muthusamy et al., 2015).
A microglia é de origem mesodérmica, aparece precocemente no SNC e sua função
não é totalmente definida. No SNC é considerada uma componente-chave por exercer função
fagocitária, tornando-se macrófagos no encéfalo à medida que ocorre lesão ou degeneração
neuronal (Zotova et al. 2011).
As células da glia satélite correspondem a uma população celular pouco
caracterizada, que estabelecem comunicação intensa com os neurônios através de junções gap,
33
aparentemente fornecendo-lhes nutrientes, neutrofinas, além de outras moléculas e
substâncias essenciais, o que levou ao pressuposto de que elas podem ser a contrapartida para
os astrócitos no SNP (Weider et al., 2015).
Os neurônios e células gliais, como os astrócitos e oligodendrócitos, sofrem as ações
danosas do tempo no decorrer do processo de envelhecimento. Essas ações acontecem por
fatores como genética, sexo, presença de radicais livres entre outros, denominados intrínsecos,
e também por fatores extrínsecos, como sedentarismo, tabagismo e exposição ambiental
(Cançado e Horta, 2006).
O SNC é o mais comprometido pelo envelhecimento. Alterações como a diminuição
do número de neurônios, bem como a redução da intensidade dos reflexos e condução nervosa
começam a aparecer (Fechine e Trompieri, 2012). Ao nascer, o indivíduo possui os neurônios
necessários ao funcionamento do organismo. O cérebro continua a aumentar de tamanho e
volume, atingindo, aos dois anos, 80% do tamanho adulto, continuando a crescer até a
puberdade, multiplicando as células da glia, neurônios e sinapses. A partir do início da
segunda década de vida começa a haver a eliminação de sinapses excessivas e desnecessárias,
bom como um declínio discreto do volume encefálico (cerca de 5% por década após os 40
anos), acentuando-se o declínio a partir dos 70 anos (Esquenazi et al., 2014).
Tal decréscimo se deve à “plasticidade” ou “flexibilidade” neuronal, necessária para
o desenvolvimento cerebral e das funções cognitivas e que proporcionam às crianças um
melhor prognóstico no que se refere à recuperação das lesões além de maior facilidade para o
aprendizado e para a manutenção das funções cognitivas com o avançar da idade (Morcom e
Johnson, 2015).
Além da diferença do volume e do peso, o cérebro do idoso apresenta uma série de
diferenças morfológicas em relação ao do indivíduo jovem (FIGURA 7). Macroscopicamente,
podem ser citadas: giros mais finos separados por sulcos mais delgados e profundos,
ventrículos e outras cavidades mais abertos e menor espessura do córtex. Tais alterações não
acontecem de modo uniforme. As principais aparecem nas regiões frontal e temporal, áreas
envolvidas na função cognitiva, que necessitam de memória para sua operacionalização.
Microscopicamente, queda no número total de neurônios em diferentes regiões e o surgimento
de placas senis. Em nível bioquímico, ocorre redução do fluxo sanguíneo cerebral e
consequente redução do metabolismo de oxigênio no cérebro, além da diminuição das
proteínas cerebrais (Lent, 2010).
34
FIGURA 7: Imagens de Tomografia Computadorizada de cérebro humano de um adulto com 38 anos (esquerda)
e de um idoso de 73 anos (direita), onde é perceptível a diminuição do volume e as modificações macroscópicas
de sulcos e giros.
FONTE: http://neurosciencenews.com/aging-sharpness-7281/.
As proteínas atuam de maneiras diferentes no SNC. Atuam no bloqueio ou liberação
dos neurotransmissores na vesícula sináptica, do processo de fusão das membranas, além de
ter função reguladora, controlando a entrada e/ou a saída do cálcio intraneuronal (Aguayo et
al., 2014).
A neurodegeneração decorrente do envelhecimento pode dar-se em neurônios e
áreas específicas, causando enfermidades como a DP, que tem como característica principal a
depleção dos neurônios dopaminérgicos da Substância Negra pars Compacta (SNc), área
escolhida neste estudo para caracterizar a sua citoarquitetura em três fases do ciclo vital de
Ratos Wistar, a partir de imunohistoquímica contra S100B.
35
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
- Caracterizar a citoarquitetura do complexo nuclear da substância negra pars compacta (SNc)
de Ratos Wistar (Rattus norvegicus), em diferentes idades, mediante imunohistoquímica
contra S100B.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Delimitar a localização do complexo nuclear da SNc a partir de imunohistoquímica para TH;
- Descrever os subcomponentes do complexo nuclear da SNc mediante imunohistoquímica
contra S100B;
- Comparar, através de caracterização citoarquitetônica, as estruturas mapeadas em três fases
do ciclo vital – jovens, meia idade e idosos.
36
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MODELO EXPERIMENTAL
Em pesquisas experimentais com modelo animal o pesquisador deve atentar para a
escolha, para que os resultados obtidos possam ser transpostos para seres humanos, daí
normalmente se estudar os mamíferos. Os roedores, especialmente ratos e camundongos, são
opções para pesquisas sobre envelhecimento por se tratarem de animais com tempo de vida
curto, o que possibilita a experimentação do nascimento até a morte (Netto, 2006), e também
pelo fato de os roedores mostrarem padrões genéticos e fisiológicos semelhantes aos humanos
(Carvalho et al., 2009).
Nesta pesquisa foram utilizados ao todo 18 ratos, da linhagem Wistar, machos,
divididos em três grupos de seis: Ratos Jovens - RJ, com três meses de idade e peso médio de
250g; Ratos de Meia Idade - RMI, 13 meses, pesando cerca de 320g e por fim, Ratos Idosos -
RI, com 23 meses, com peso em torno de 400g.
Os animais foram obtidos no biotério central da Universidade Estadual do Rio
Grande do Norte – UERN, transferidos para o Laboratório de Neurologia Experimental da
Faculdade de Ciências da Saúde - DCB/FACS/UERN, após a aprovação pela Comissão de
Ética em Experimentação Animal - CEEA, através do parecer Nº 07/16 e protocolo Nº
03/2016 (ANEXO).
Todos os cuidados foram tomados para evitar a dor, o sofrimento e stress dos
animais, conforme o que preza o Código de Ética e garantindo uma maior fidedignidade dos
resultados. Os animais foram acomodados em estante ventilada, com temperatura entre 23 e
26ºC, onde foram mantidos em gaiolas-padrão de polipropileno, medindo 49 x 34 x 16 cm,
forradas com cama de maravalha, contendo até três animais por gaiola (meia idade e idosos) e
até seis (no caso dos jovens). Também foi mantido o controle da luminosidade, com ciclos
claro/escuro de 12 horas cada, umidade natural, comida/água ad libitum.
Atingida a idade necessária, os animais foram submetidos à perfusão transcardíaca,
para posterior remoção dos encéfalos, os quais foram submetidos à microtomia, para posterior
marcação imunohistoquímica e análise de lâminas.
3.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
37
3.2.1 Anestesia
Material necessário: Balança para a pesagem dos animais, Equipamentos de Proteção
individual (EPI’S), marcador permanente, seringas de 1ml, agulhas 25x7mm e 13x4,5mm,
anestésicos.
Os animais foram pesados, identificados com numeração em algarismo romano na
cauda, por ordem de pesagem, em seguida sendo realizado o cálculo para a dosagem dos
anestésicos.
Em seguida foram submetidos à anestesia por via intraperitoneal, com Ketamina (na
dose de 10 mg/Kg), um anestésico de ação rápida, à base de cloridrato de cetamina, que
produz ação dissociativa sobre o córtex cerebral, promovendo a inconsciência e também uma
“narcoanalgesia” mantendo o tônus muscular e alguns reflexos. Em associação, foi utilizada a
Xilazina (na dose de 5 mg/Kg), relaxante muscular.
O processo de perfusão de cada um dos animais somente foi iniciado quando o
mesmo atingiu o plano anestésico, ou seja, 3º. plano do 3º. estágio de Guedel (Massone,
2008), onde verificou-se ausência total de reflexos.
3.2.2 Perfusão Transcardíaca
Material necessário: Duas provetas de 1000 ml, campo cirúrgico, fita de cetim para a
contenção do animal, instrumentais (tesouras, pinças, agulhas), bomba peristáltica,
mangueiras de infusão, extensores de equipo, Solução salina a 0,9%, Heparina,
Paraformaldeído (PFA) 4%.
Após atingir o plano anestésico, os animais foram submetidos à perfusão
transcardíaca, compreendendo os passos descritos a seguir.
3.2.2.1 Posicionamento do animal
Em decúbito dorsal sobre tela de arame, sob ponto de água e com contenção das
patas traseiras e dianteiras para proporcionar uma melhor exposição do tórax.
38
3.2.2.2 Toracotomia
Incisão em “V”, iniciando logo abaixo do processo xifoide, com incisão de pele,
músculos e arco costal removidos em bloco, em seguida, incisão do diafragma, para a
exposição do coração.
3.2.2.3 Cardiopunção
Com uma agulha de dimensões 17 x 1,5mm, já conectada a uma bomba peristáltica
(Cole-Parmer) a punção foi realizada no ventrículo esquerdo, em direção ao cone arterioso.
Imediatamente após a punção, foi realizada uma incisão no átrio direito, e iniciou-se a
perfusão, passando-se 300 ml de solução salina a 0,9% com heparina (Parinex, Hipolabor,
2ml/1000 ml de solução salina), a uma velocidade inicial de 30 rotações por minuto (30 rpm)
e após os primeiros 150 ml, aumentou-se a rotação para 60 rpm, infundindo os 150 ml
restantes, perfazendo um total de aproximadamente seis minutos. Em seguida, foram
infundidos 300 ml de solução fixadora de paraformaldeido 4%, passando-se metade desta
solução a um fluxo de 60 rpm, diminuindo a vazão para 40 rpm. Todo o procedimento, desde
a anestesia até o final da perfusão dura aproximadamente 60 minutos.
3.2.3 Remoção dos Encéfalos
Após uma hora da finalização da etapa de perfusão, os encéfalos foram removidos
por meio de técnicas de dissecção e armazenados por um período entre 24 e 48 horas em uma
solução contendo sacarose a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, a 4ºC. Após esse período,
foram submetidos à microtomia (cortes coronais).
3.2.4 Microtomia
Os encéfalos foram congelados e submetidos à microtomia, seccionados em
criostato, obtendo-se secções coronais, cuja espessura foi padronizada em 50 µm. À medida
que foram sendo cortados, as fatias foram coletadas em um meio líquido de tampão fostato
0,1M, pH 7,4, distribuídas em seis compartimentos, de forma sequencial e cíclica, de modo a
manter a distância entre uma secção e a outra imediatamente seguinte de um mesmo
39
compartimento de aproximadamente 300 µm. Os compartimentos contendo os cortes foram
transferidos para solução anticongelante e conservados a -20ºC para utilização posterior em
procedimentos de imunohistoquímica.
3.2.5 Imunohistoquímica
Por se tratar de uma amostra de 18 animais, foram realizadas três rodadas de
imunohistoquímica, cada uma com 6 compartimentos, sendo dois de cada idade (jovens,
meia-idade e idosos). Para evitar resultados falso positivos, todos os anticorpos foram testados
para controle negativo.
O primeiro momento da imunohistoquímica consiste em um pré-tratamento com a
finalidade de eliminar quaisquer artefatos existentes nos tecidos. Para a realização desta etapa,
utilizou-se Tampão Fosfato 0,1M, aproximadamente 100 ml, despejados em um recipiente de
vidro contendo os tubos com filtro, onde foram acondicionados os cortes cuidadosamente,
com auxílio de um pincel macio, observando a identificação correspondente entre o
compartimento e o tubo preparado para receber os cortes. Em mesa agitadora orbital, foram
realizadas 5 lavagens de 5 minutos cada, em agitador orbital a 70 RPM, trocando o Tampão
Fosfato 0,1M a cada lavagem.
Ao terminar as 5 lavagens, foi adicionado 100µL de Peróxido de Hidrogênio (H2O2)
a 30% ao recipiente contendo Tampão Fostato 0,1M pH 7,4. Com esta solução foi realizada
uma lavagem de 20 minutos e ao concluir, procederam-se mais 5 lavagens de 5 minutos cada,
trocando o Tampão Fosfato 0,1M a cada lavagem. O objetivo do peróxido é evitar marcação
inespecífica.
O segundo momento consiste na incubação dos cortes em anticorpo primário. Para
esta etapa, primeiramente foram separados os tubos de ensaio e cada um deles foi
devidamente identificado com o código correspondentes aos animais em experimentação. Em
seguida foi preparada uma solução contendo 450 µl de Albumina de Soro Bovino (BSA 5%)
(Prothemo®) com 8550 µl de Triton X-100 a 0,4%, totalizando 9000 µL da solução, onde a
Albumina evita marcações inespecíficas e o Triton X-100 tem o objetivo de tornar a
membrana mais porosa. Em seguida, com o uso de uma pipeta, foram aspirados 9 µL do
anticorpo anti-S100B obtido em camundongo (Sigma®), na proporção de 1:1000. Para os
cortes submetidos à imunohistoquímica anti – TH utilizou-se solução de 3.800 µl de Triton X-
100 a 0,4% com 200 µl de BSA 5%, acrescido do anticorpo primário obtido em rato (mouse
40
anti – TH) (Sigma®
), na diluição de 1:10.000, sendo 0,5 µl do anticorpo.
Após colocar o anticorpo primário, soltando lentamente pelas paredes com o auxílio
de uma pipeta, os tubos de ensaio receberam a solução de BSA 5% com Triton X-100 e
imediatamente após, os cortes foram transferidos para esses tubos, onde permaneceram em
incubação em homogeneizador com rotação lenta à temperatura ambiente por um período de
12 horas (Overnight).
Ao final do overnight, os cortes foram transferidos dos tubos de ensaio para os tubos
com filtro, desprezando a solução contendo o anticorpo primário e sucedendo a mais 5
lavagens de 5 minutos em Tampão Fosfato 0,1 M, pH 7,4 para em seguida realizar a
incubação no anticorpo secundário.
A incubação em anticorpo secundário consiste no terceiro momento da
imunohistoquímica e para esta etapa, foi utilizado o Goat anti Mouse (GOAT α Ms) AbCAM®
na proporção de 1:500, sendo 5 µL do anticorpo secundário e 5000 µL de Triton X-100, os
quais foram pipetados para os tubos de ensaio, que em seguida receberam os cortes para
incubação em rotor com rotação lenta por 90 minutos. Ao término da incubação, foram
realizadas mais 5 lavagens de 5 minutos em Tampão Fosfato 0,1 M com pH 7,4 em agitador
orbital.
A etapa seguinte foi a incubação a 2% no Complexo Avidina Biotina (AB) e Triton
X-100 NaCl. Foram utilizados 80 µL de AB (sendo 40µL de A e 40µL de B) e 3920 µL de
Triton NaCl, que foram inseridos nos tubos de ensaio, onde as secções foram imersas em
seguida e sucedeu-se a uma incubação por 90 minutos em rotação lenta. Ao final desta
incubação, mais 5 lavagens de 5 minutos cada, em Tampão fostato 0,1 M.
A última etapa da imunohistoquímica consiste na revelação pela DAB (3,3’,4,4’
tetrahidrocloreto-diaminobenzidina), em que se colocou os tubos com filtro contendo os
cortes em uma travessa com solução composta por 200 ml de Tampão Fosfato 0,1 M e duas
alíquotas de DAB de 25mg. Após 10 minutos com as secções imersas nesta solução,
acrescentou-se 200 µL de H2O2 e esperou-se mais alguns minutos, até que se pudesse
visualizar a coloração. Após a revelação, foram feiras mais 5 lavagens de 5 minutos cada, em
Tampão Fostato 0,1 M. Ao finalizar a 5ª lavagem, os cortes foram acondicionados na mesma
travessa, envolvidos com plástico filme e acondicionados em geladeira até a montagem nas
lâminas.
Para assegurar o procedimento livre de danos ambientais, foi realizada a
neutralização da DAB, onde foi preparada uma solução de 1 litro de água sanitária para cada 4
litros de água. Todo o material que teve contato com a DAB foi imerso nesta solução, em
41
recipiente devidamente identificado, por um período de 24 horas e só então a solução com a
DAB já neutralizada foi desprezada em rede de esgoto e os materiais foram lavados e
guardados.
3.2.6 Intensificação Pelo Ósmio
Após a imunohistoquímica, os cortes foram então montados em lâminas silanizadas,
que após secagem, passaram por um processo de intensificação da marcação, sendo imersas
primeiramente em água destilada por 30 segundos, em seguida na solução de tetróxido de
ósmio a 0,05% por aproximadamente 20 segundos, com o objetivo de intensificar a marcação.
Posteriormente as lâminas passaram por baterias de desidratação sendo imersas em álcool de
graduação crescente (70%, 95% e álcool absoluto, este último duas vezes) por um tempo de 5
minutos cada. A última etapa foi a diafanização, onde as lâminas foram imersas em dois
recipientes contendo xilol, permanecendo 5 minutos em cada.
Após a bateria de ósmio, procedeu-se a montagem com lamínulas, as quais
permaneceram previamente imersas em solução de ácido acético com álcool absoluto, com a
finalidade de retirar resíduos e artefatos que pudessem prejudicar a visualização dos cortes. As
lamínulas foram cuidadosamente montadas sobre as lâminas com o uso do erv-mount e em
seguida ficaram secando ao ar livre por uma semana. Após a secagem, foi feita a limpeza das
lâminas para visualização e obtenção das imagens.
3.2.7 Obtenção das Imagens
As secções do mesencéfalo submetidas à imunohistoquímica para S100B foram
examinadas ao microscópio óptico (Olympus BX41) em campo claro. Imagens digitais
foram obtidas de secções representativas usando uma videocâmara digital (Nikon
DXM1200). Foi utilizado aumento de 4x nas imagens que mostravam toda a área da SNc e
aumentos de 10 e de 20x para detalhar as subdivisões encontradas nos níveis rostral, médio e
caudal, em ratos jovens, de meia idade e idosos.
Na continuidade, as imagens foram analisadas, corrigidas minimamente para brilho
e contraste, montadas usando o programa Adobe Photoshop CS5® e os desenhos
esquemáticos foram montados no software Adobe Illustrator CS5®. Os resultados foram
documentados em fotomicrografias e esquemas construídos a partir das mesmas.
42
4 RESULTADOS
Após obtenção das imagens, as fotomicrografias foram arquivadas em pastas
separadas pela idade dos animais e em cada uma delas, as fotos foram identificadas de acordo
com o nível, rostral, médio ou caudal. As imagens foram analisadas na sequência: RJ – nível
rostral, médio, caudal e assim sucessivamente para os RMI e RI. Em cada uma das faixas
etárias também foram expostas as subdivisões visualizadas em cada nível, descrevendo as
principais características. Ao final, foi feita uma abordagem comparativa onde as imagens
foram descritas em cada nível, descrevendo as diferenças encontradas entre o jovem, o de
meia idade e idoso.
A imunohistoquímica para S100B caracteriza-se por uma marcação generalizada, ao
contrário da imunohistoquímica para TH, que marca apenas as áreas que contém células
dopaminérgicas. Como já mencionado no decorrer da pesquisa, a SNc é a parte
dopaminérgica da SN, por este motivo, a imunohistoquímica para TH foi fundamental para a
delimitação citoarquitetônica do núcleo estudado. Fazendo o pareamento das lâminas com
imunohistoquímica para TH e as de S100B foram identificados os cortes mesencefálicos à
altura da SNc para iniciar a análise.
Inicialmente, foi montada uma prancha contendo uma imagem de cada nível (rostral,
médio e caudal), de uma imunohistoquímica representativa para TH, mostrando onde os
neurônios dopaminérgicos estão localizados no mesencéfalo (FIGURA 8).
Observando as figuras obtidas de TH e com o auxílio do atlas Paxinos, Watson
(2007) foi construído um chart destacando a SNc a fim de nortear a localização do núcleo nas
imagens obtidas a partir de imunohistoquímica para S100B (FIGURA 9). A terminologia
utilizada para as subdivisões da SN teve como base os trabalhos de Cavalcanti et al. (2016);
Fu et al. (2012) e Manger (2005). Como forma de respaldar a visualização da SNc e suas
subdivisões, cada fotomicrografia foi comparada à figura correspondente no Atlas de Paxinos
e Watson (2007), através do qual foi possível identificar o nível em que se encontrava cada
corte fotografado, bem como as subdivisões do núcleo estudado.
Após expor os resultados a cada nível, separadamente por faixa etária, foi feita uma
abordagem comparativa, onde foram descritas as diferenças encontradas na SNc, observando
um nível de cada vez, no RJ, RMI e RI, detalhando as particularidades encontradas no
envelhecimento de cada uma das subdivisões.
43
FIGURA 8: Fotomicrografias em campo claro de cortes coronais de mesencéfalo de RJ com aumento de 4x.
submetidas à imunohistoquímica para TH nos níveis A (rostral), B (médio) e C (caudal) evidenciando neurônios
dopaminérgicos com intensa marcação na VTA e SNc. Barra 500µm.
44
FIGURA 9: Chart ilustrativo de cortes coronais nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C) de mesencéfalo de
rato evidenciando a localização da SNR e subdivisões da SNc. Modificado de Paxinos, Watson, 2007. Ver lista
de abreviações.
45
4.1 RATOS JOVENS
FIGURA 10: Cortes coronais de mesencéfalo de RJ com imunohistoquímica para S100B em níveis rostral (A),
médio (B) e caudal (C), com aumento de 4x, evidenciando a localização e as subdivisões da SNc encontradas em
cada nível. Ver lista de abreviações. Barra 500 µm.
Nos cortes de nível rostral em RJ (FIGURA 10A) à altura do Bregma -5,28mm
46
(tendo como referência a figura nº 77 no Atlas Paxinos, 2006) observa-se marcação
aparentemente inespecífica e difusa, evidenciando pouca diferença entre as áreas, sendo
verificado à primeira impressão duas áreas se destacam, uma por apresentar marcação fraca
(pedúnculo cerebral - cp, lemnisco medial - ml e o pedúnculo mamilar - mp) e a outra por
estar fortemente marcada (SNR e o núcleo terminal medial do trato óptico acessório - MT).
Ao lado do MT e acima do pedúnculo mamilar verifica-se uma pequena porção
estreita e alongada com marcação menos intensa do que a SNR e mais forte do que a do mp.
Trata-se da porção inicial da SNCD, que é acompanhada paralelamente ao MT, desaparecendo
na metade deste e aparecendo novamente na borda superior, contornando a borda lateral
superior esquerda da SNR, até unir-se à SNCL, no final do pendúnculo cerebral, acima da
SNR, a qual se destaca por apresentar marcação ainda mais fraca do que a da SNCD, porém
mais forte do que a do cp (FIGURA 11). Essas variações na marcação permitiu que essas
subdivisões e estruturas fossem observadas em comparação com o Paxinos. Em nível rostral,
as duas subdivisões da SNc encontradas apresentaram marcação pouco densa, porém
homogênea em toda a sua extensão.
FIGURA 11: Cortes coronais de mesencéfalo de RJ, nível rostral, evidenciando as diferentes intensidades de
marcação encontradas na SNCD, SNR, SNCL e cp (à esquerda) com aumento de 10x. Barra 500 µm. À direita,
com um aumento de 20x, pode-se verificar com nitidez o parcelamento das estruturas em destaque na imagem
anterior. Barra 200 µm. Ver lista de abreviações.
Em nível rostral de rato jovem, além do parcelamento nítido da SNCL e SNCD, as
duas únicas subdivisões encontradas neste nível, pode-se observar também a presença de
astrócitos bem marcados, encontrados distribuídos de forma heterogênea pelas estruturas,
verificando “aglomerados” em alguns pontos específicos (FIGURA 11B).
No nível médio (FIGURA 10B) a identificação das estruturas foi dificultada pela
fraca marcação generalizada em todo o corte. Dessa forma, tomou-se como ponto de partida a
identificação do cp e do ml, os quais se destacam por apresentarem marcação extremamente
47
fracas e também a SNR, área extensa com intensa marcação.
Em seguida procurou-se comparar o formato do corte com as figuras do Paxinos,
através do qual foi observado semelhança entre o corte em questão e a figura nº 81 (Bregma -
5,76mm). À essa altura é possível visualizar as quatro subdivisões da SNc. Comparando a
figura do Atlas com a fotomicrografia foi possível a visualização do parcelamento de todas as
subdivisões.
Abaixo do ml, com marcação mais intensa do que este e um formato ligeiramente
retangular, encontra-se o mp. Entre o mp e a SNR encontra-se a SNCM, outra pequena
estrutura, com formato circular, a qual foi possível diferenciar não pela intensidade da
marcação, mas pelo sentido das fibras que apresenta (FIGURA 12B).
FIGURA 12: Fotomicrografias de mesencéfalo de RJ, nível médio, aumentado em 4x, destacando as subdivisões
da SNc (A). Barra 500µm. Em B, C e D, em aumento de 20x, observa-se o parcelamento das estruturas
destacadas em A. Barra 200µm. Ver lista de abreviações.
Acima da SNCM, seguindo a borda da SNR verifica-se a SNCD em duas porções:
uma mais comprida e estreita que segue paralela ao ml (FIGURA 12A, B e C) e uma menor,
na porção mais superior da SNR, ligando esta à SNCL. A SNCD caracteriza-se por apresentar
48
marcação intermediária entre a do ml e da SNR, além de apresentar “fibras” ou “nervuras” em
sentido diferente das que estão ao seu redor. A SNCL é de fácil visualização, pois aparece
como um triângulo lateralizado na porção superior da SNR, com uma marcação mais fraca do
que esta, porém mais intensa do que a do cp (FIGURA 12A).
A SNCV encontra-se dentro da SNR e foi visualizada por apresentar coloração
discretamente mais clara do que esta. Dentre todas as subdivisões da SNc de rato jovem em
nível médio, a SNCV é a que apresenta visualização mais difícil por apresentar marcação com
intensidade semelhante à da SNR, onde está inserida. Apesar disso, com um maior aumento é
possível visualizar o seu parcelamento (FIGURA 12D). Neste nível do RJ os astrócitos são
escassos, sendo visualizados na SNCL e na SNCV.
Em nível caudal de ratos jovens (FIGURA 10C) foi possível visualizar as quatro
subdivisões da SNc na foto obtida. A figura se compara nº 85 do atlas, à altura do Bregma –
6,24mm.
A SNCM aparece como uma faixa estreita e comprida, com pigmentação clara e
homogêna em toda a sua extensão, situada entre o ml e a SNR na sua porção inferior,
diferenciando-se desta por apresentar marcação mais fraca. A marcação da SNCM é
semelhante à do ml, porém observa-se uma linha em apagamento, contornando toda a borda
da SNCM, o que a diferencia do ml neste nível (FIGURA 13A).
Dentro da SNR, é possível visualizar a SNCV, uma estrutura alongada e arqueada,
com pigmentação mais clara do que esta, porém mais escura do que na SNCM e SNCD
(FIGURA 13B).
A SNCD apresenta marcação mais intensa do que a da SNCM e menos do que a
SNR. Aparece como uma linha extensa e delgada, contornando a SNR, que alarga no meio e
volta a estreitar à medida que se aproxima da SNCL, onde ela termina.
A SNCL aparece com pigmentação intensa, ao final do pendúnculo cerebral e acima
da SNR, com delimitação evidente, porém sem aparente diferença na marcação, quando
comparado à SNR, o que aparece pela primeira vez, quando comparado aos níveis rostral e
médio anteriomente analisados. Nessa subdivisão observa-se alguns pontos de fraca
marcação, que pode ser confundida com danos no tecido, mas essa possibilidade é descartada
pois nesses locais é possível visualizar astrócitos e algumas ramificações (FIGURA 14C).
49
FIGURA 13: Fotomicrografias de mesencéfalo de RJ em nível caudal, com aumento de 20x, evidenciando o
parcelamento e a ausência de astrócitos na SNCM (A) e o parcelamento da SNCV (B), com marcação
ligeiramente mais fraca do que a SNR. Observa-se presença de astrócitos espalhados em toda a camada ventral
da SNc. Barra 200µm. Ver lista de abreviações.
Comparando os padrões de marcação encontrados nos ratos jovens, podemos dizer
que estes possuem particularidades nos diferentes níveis. O nível caudal é o que apresenta
maior nitidez na visualização das subdivisões da SNc, por apresentar maior variação na
intensidade da marcação das demais estruturas mesencefálicas, o que nos permite reconhecer
cada uma delas. Nos níveis rostral e médio o parcelamento das estruturas tornou-se
dificultado por apresentar respectivamente marcação forte e fraca em todas as áreas. Com
relação à presença de astrócitos, estes foram visualizados na SNCL e SNCV em quantidade
maior do que nos níveis rostral e médio.
A SNCL no rato jovem foi a subdivisão da SNc que mais se destacou pelo seu nítido
parcelamento, sendo observado um aumento na intensidade da marcação no sentido rostro-
caudal, além da presença de possíveis astrócitos nos níveis rostral e caudal (FIGURA 14).
50
FIGURA 14: Fotomicrografias da SNCL de RJ, com aumento de 20x, nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal
(C), evidenciando um aumento na intensidade da marcação no sentido caudal e presença astrócitos em maior
quantidade no nível caudal, seguido do rostral e médio. Barra 200µm. Ver lista de abreviações.
51
4.2 RATOS DE MEIA IDADE
FIGURA 15: Cortes coronais de mesencéfalo de RMI com imunohistoquímica para S100B, nos níveis rostral
(A), médio (B) e caudal (C), aumento de 4x. Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
A figura obtida de ratos de meia-idade no nível rostral (FIGURA 15A) encontra-se à
52
altura do Bregma -4,92mm – Figura nº 74 do Paxinos. Nela observa-se a maioria das áreas
com fraca marcação, com comparação com a figura referente ao rato jovem, tendo um
destaque para a SNR, que apresenta uma marcação mais intensa.
Devido à intensificação na marcação da SNR a identificação da região em estudo se
tornou mais evidente. O cp e o ml são facilmente visualizados e delimitados quando
comparada a imagem ao atlas por apresentarem marcação mais fraca. Sabendo que a essa
altura o corte deve mostrar a SNCD e a SNCL e através da figura referente a este corte no
Atlas, as áreas em maior destaque por menor ou maior marcação foram desenhadas e através
da posição anatômica e também pelas diferenças no padrão de pigmentação, a SNCD e SNCL
foram identificadas e delineadas.
A SNCD está localizada na parte superior esquerda da SNR, que se destaca por
apresentar marcação intermediária entre o ml e a SNR, seguindo paralelamente a essas duas
estruturas até se unir à SNCL. Na borda inferior essa subdivisão encontra-se dispersa na SNR,
dela diferenciando-se por apresentar uma marcação mais fraca. Já na borda superior, uma
linha fina, branca e contínua (FIGURA 16A e B) parece delimitar a margem que separa a
SNCD do ml.
A SNCL (FIGURA 15A e 16A) apresenta-se com um contorno bem delimitado,
delineando na sua porção inferior a borda superior da SNR, da qual se destaca por apresentar
intensidade de marcação bem menor. À esquerda se une à porção final da SNCD e à direita ao
cp, do qual à primeira vista o parcelamento fica dificultado pelo fato de apresentarem
marcação igualmente fracas. Porém, ao ampliar a imagem, é possível perceber com nitidez o
contorno do cp (FIGURA 16C), o qual separa esta estrutura da SNCL.
Em nível médio (FIGURA 15B), a imagem obtida de RMI encontra-se compatível
com a figura nº 81 do Paxinos, à altura do Bregma -5,76mm, porção final do nível médio,
onde verifica-se a SNR com marcação mais intensa em comparação à do rato jovem e a todas
as outras estruturas encontradas neste nível. O cp e o ml são facilmente localizados por
apresentarem baixa marcação em relação às demais áreas, assim como o mp, abaixo do ml,
que contribuiu na escolha da figura equivalente no atlas. A partir da localização foi possível
encontrar a SNc, com suas quatro subdivisões mais fracamente marcadas.
A SNCM está localizada logo acima da porção inicial do pedúnculo cerebral, abaixo
do ml e à direita do mp. Assim como no rato jovem, a estrutura foi identificada a partir da
posição anatômica em relação ao mp e à SNR e pelo sentido dos “feixes” (na horizontal,
arqueados com pontas voltadas para baixo), os quais a diferencia das demais estruturas.
53
FIGURA 16: Fotomicrografias de mesencéfalo de RMI em nível rostral com aumento de 4x, destacando a SNCD
e SNCL (A). Barra 500µm. Em B visualizam-se as diferenças na marcação e na estrutura do ml, SNCD e SNR.
As setas indicam a linha que delimita a margem superior da SNCD, separando-a do ml. Em C observa-se a
delimitação precisa entre a SNCL e a SNR. As setas apontam para margem do cp, que marca a divisão entre este
e a SNCL. Aumento de 20x em B e C. Barra 200µm. Ver lista de abreviações.
A SNCD aparece logo após a SNCM, entre o ml e a SNR, com marcação de
intensidade intermediária à das estruturas entre as quais se interpõe, que inicialmente
54
apresenta-se mais intensa e vai se tornando mais fraca à medida que se aproxima do final, na
metade da borda superior esquerda da SNR. É possível também observar que essa subdivisão
apresenta fibras na diagonal em sentido contrário às encontradas no ml, o que permite
diferenciar as duas estruturas.
A SNCL está localizada logo acima da SNR, porção superior final do cp. É a parte
que apresenta a pigmentação mais clara de todas as subdivisões da SNc encontradas em nível
médio de RMI. Por apresentar marcação mais fraca, o limite entre essa subdivisão e a SNR
fica nítida neste nível. Com relação ao parcelamento entre o cp e a SNCL, por apresentarem
aparentemente a mesma intensidade de marcação, o contorno que define a área de cada um só
foi possível visualizar através de um maior aumento (FIGURA 17).
FIGURA 17: Fotomicrografias de mesencéfalo de RMI em nível médio. A porção destacada em A (aumento de
4x) equivale à figura B (aumento de 10x), onde é perceptível a distinção entre a SNCL e a SNR pela diferença na
intensidade da marcação, enquanto que em relação ao cp os limites estão estabelecidos pelo próprio contorno do
cp, apontado pelas setas em B. Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
No corte selecionado, praticamente não se percebe a SNCV (FIGURA 15B), inserida
dentro da SNR, na sua porção inferior, sendo percebida por apresentar uma coloração
ligeiramente mais clara do que a da estrutura onde ela está inserida. A SNCV é, aparentemente
a subdivisão da SNc mais fortemente marcada em nível médio de RMI.
Em nível caudal (FIGURA 15C) a imagem capturada corresponde à figura nº 85 do
Paxinos, à altura do Bregma -6,24mm, onde é possível identificar todas as subdivisões da
SNc. Na imagem a SNR se destaca pela intensa marcação, enquanto que o cp e o ml se
destacam por estarem mais fracamente marcados. Devido à baixa marcação da SNCM e
SNCD e também pela proximidade dessas estruturas com o ml, a identificação dos seus
limites tornou-se menos evidente.
55
FIGURA 18: Fotomicrografias de mesencéfalo de RMI em nível caudal, aumentado em 4x (A) evidenciando o
ml (mais claro) e a SNR (mais escura), entre os quais localiza-se a SNCM e a SNCD. Barra 500µm. Em B
encontra-se o quadro em destaque na figura A, com aumento de 20x. As setas indicam a delimitação da SNCM,
que a separa do ml. Barra 200µm. Ver lista de abreviações.
A SNCM encontra-se entre a SNR e o ml, terminando juntamente com a ponta deste.
Em uma observação inicial não se percebe diferenças entre o ml e a SNCM, porém, com um
aumento maior (FIGURA 18B) pode-se perceber o contorno que delimita a estrutura. Essa
subdivisão apresenta marcação em nuvem (aspecto esfumaçado), sendo a porção central mais
intensa do que nos contornos.
A SNCD inicia logo após a SNCM e termina ao atingir a SNCL. Se diferencia
nitidamente da SNR por apresentar marcação mais fraca do que esta. Do lado oporto, uma
linha branca e contínua demarca o seu limite. A SNCL apresenta marcação intensa,
semelhante à encontrada na SNR. Apesar da marcação semelhante o contorno dessa
subdivisão está bem definido, o que permite identificar a sua delimitação. A SNCV encontra-
se inserida na SNR, tem formato alongado e marcação com intensidade mais fraca do que a da
região onde está localizada, porém mais forte do que a SNCM e SNCD (FIGURA 15C).
56
No nível caudal de RMI a SNCL é a que apresenta marcação mais intensa de todas as
subdivisões da SNc. A intensidade na marcação dessa subdivisão aumentou visivelmente no
sentido rostro-caudal, o que não foi possível observar nas outras partes que compõem a SNc,
por haver diferenças na localização e tamanho das estruturas, de acordo com o nível da figura.
4.3 RATOS IDOSOS
No nível rostral de ratos idosos (FIGURA 19A), a imagem capturada se refere à
figura nº 72 do Paxinos, Bregma -4,68mm, e demonstra uma melhor evidenciação das
estruturas mesencefálicas, por apresentar intensidade de marcação diferente em cada área.
A SNR apresenta-se em destaque por ter marcação mais forte e a partir da sua
visualização é possível determinar a localização da SNCD e da SNCL, com marcação mais
fraca, sendo que na SNCL a marcação é um pouco mais intensa do que na SNCD.
A SNCD começa no início da borda esquerda da SNR, delimita todo o seu contorno,
alargando ao centro, voltando a ficar estreita à medida que se aproxima do final da SNR e
início da SNCL. Essa porção da SNc é caracterizada por apresentar fraca marcação e por ser
formada por feixes na diagonal à direita, sem pigmentação. Em um maior aumento é possível
ver que o formato dos feixes da SNCD (FIGURA 20B) é suficiente para demarcar o seu
parcelamento, diferenciandoa-a das áreas entre as quais está entreposta.
A SNCL neste nível aparece ligada à esquerda com a SNCD, à direita com o cp e na
margem inferior com a SNR. Apresenta marcação heterogênea, discretamente mais forte do
que a SNCD e o cp e mais fraca do que a SNR, por esse motivo a visualização dessa estrutura
é facilmente obtida (FIGURA 19A e 20B).
No nível médio do RI (FIGURA 20B) as estruturas mesencefálicas são vistas à altura
do Bregma -5,64mm, figura nº 80 do Atlas. É uma região mais inicial do nével médio,
portanto da SNc, somente a SNCD e a SNCL são visualizadas. A delimitação da SNc neste
nível é facilitada por ser uma área de fraca marcação, em relação à SNR, porém a delimitação
das duas subdivisões tornou-se dificultada por estarem as duas no mesmo padrão de
marcação. A delimitação das duas estruturas foi feita mediante ampliação da foto e
comparação anatômica com a figura referente no Atlas. Através desse procedimento foram
identificadas as diferenças estruturais que delimitam o contorno de cada uma delas.
57
FIGURA 19: Fotomicrografias de cortes coronais de mesencéfalo de RI com imunohistoquímica para S100B,
nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), destacando as subdivisões da SNc, bem como as estruturas de
referência para encontrá-la. Aumento de 4x. Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
58
FIGURA 20: Fotomicrografias de mesencéfalo de RI, nível rostral aumentado em 4x (A). A figura B se refere à
porção destacada em A, com um aumento de 10x, evidenciando as diferenças estruturais da SNCD, as quais as
distingue das demais regiões. Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
A SNCD aparece dividida em duas porções no nível médio do RI. A primeira inicia
acima do mp e contorna metade da borda esquerda da SNR, paralelamente ao ml. Essa parte
inicial caracteriza-se por apresentar escassa. A outra parte aparece como uma pequena área
fracamente marcada, na borda superior esquerda da SNR, ao lado da SNCL (FIGURA 19B).
A SNCL apresenta marcação mais forte do que o cp e mais fraca do que a SNR neste
nível do RI. Não foi possível observar uma clara diferença na intensidade de marcação entre
ela e a SNCD, o parcelamento entre as duas subdivisões tornou-se visível com o aumento da
imagem (FIGURA 21B), onde foi possível verificar o contorno que as delimita.
59
FIGURA 21: Fotomicrografias de mesencéfalo de RI em nível médio apresentando em A uma área em destaque
que corresponde à SNCL. Aumento de 4x. Em B temos a imagem destacada em A, mostrando as diferentes
marcações das estruturas encontradas na imagem. As setas indicam a margem existente entre a SNCL e a SNCD.
Aumento de 10x. Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
Em nível caudal do rato idoso encontramos todas as subdivisões da SNc. A imagem
obtida equivale à nº 84 do Paxinos, Bregma -6,12mm. É um corte com diferentes intensidades
de marcação, o que proporcionou uma melhor visualização das áreas (FIGURA 19C). Após a
identificação do ml, cp e SNR – estruturas que apareceram em destaque em todos os níveis de
todas as idades, por apresentarem marcação fraca (ml e cp) e forte (SNR) – foi localizada a
SNc, apresentando marcação mais fraca do que a SNR e mais intensa do que o ml.
A SNCM apresenta marcação mais fraca do que a SNR, e inicia na porção inferior do
cp, seguindo o contorno da SNR, paralelamente ao ml, até atingir a metade deste, onde se une
à SNCD. Essa subdivisão apresenta alguns pontos de marcação mais intensa, mas na sua
maior parte a marcação não difere da encontrada no ml. Apesar da semelhança na marcação,
há uma diferença marcante na estrutura fisiológica das duas estruturas, além de uma espécie
de linha divisória entre o ml e a SNCM, que demarca o limite entre elas (FIGURA 22B).
60
FIGURA 22: Fotomicrografias de mesencéfalo de RI em nível caudal, evidenciando as variações na intensidade
da marcação nas diferentes estruturas (A), aumento de 4x. Em B, imagem de corte histológico equivalente ao
destacado em A, evidenciando a SNCM com setas indicando o limite entre esta e o ml. Na imagem ainda é
possível observar as diferentes marcações na SNCD, SNCV e SNR (B), aumento de 10x. Barra 500µm. Ver lista
de abreviações.
A SNCD aparece como uma faixa longa e estreita, delimitando o contorno da SNR,
até alcançar a SNCL, com marcação mais fraca do que a da parte reticulada e mais intensa do
que a da camada medial, permanecendo aparentemente com a mesma intensidade de
marcação ao longo da sua estrutura (FIGURA 19C).
A SNCL apresenta-se ao final do pedúnculo cerebral e acima da SNR. A estrutura
tem um formato triangular e nela verifica-se pelo menos três intensidades diferentes de
marcação, sendo mais clara na porção superior, um pouco mais intensa na porção inferior
próximo à SNR e uma pequena região bastante densa próximo ao local onde a SNCL se une à
SNCD (FIGURAS 19C e 23A).
Apesar de ser uma subdivisão com marcação forte, camada lateral da SNc não se
confunde com a SNR pois é visível a borda que marca a separação entre as duas. A SNCV
61
corresponde a uma estrutura extensa dentro da SNR, com marcação mais fraca do que esta e
alguns pontos de hiperpigmentação em seu interior (FIGURA 19C e 23B).
FIGURA 23: Fotomicrografias de mesencéfalo de RI em nível caudal com aumento de 10x, evidenciando em A,
a SNCL, com intensa marcação, limite superior bem delimitado e limite inferior em contato com a SNR, porém
com contorno evidente indicado pelas setas. Em B está destacada pelas setas a SNCV, com marcação
ligeiramente mais clara do que a da SNR, onde está inserida. Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
4.4 ABORDAGEM COMPARATIVA
4.4.1 Nível Rostral
No nível rostral as imagens obtidas para RJ, RMI e RI mostram a variação na
intensidade da marcação, onde se observa que, em uma visão geral, a marcação é intensa no
RJ, diminuindo no RMI e aumentando de intensidade novamente no RI, porém não com a
mesma intensidade do jovem. O RJ é o que apresenta parcelamento mais nítido, com as
62
subdivisões bem delimitadas. A esta altura, apenas duas subdivisões da SNc são encontradas:
a SNCD e a SNCL (FIGURA 24).
No RJ todas as estruturas estão fortemente marcadas, ficando em destaque as áreas
mais claras, que correspondem ao cp e ao ml e entre eles a SNc, mostrando as duas
subdivisões visíveis neste nível (FIGURA 24A). A SNCL do RJ em nível rostral é a estrutura
com parcelamento mais evidente se comparada à mesma estrutura encontrada no RMI e RI à
essa mesma altura. É possível visualizar, além do parcelamento evidente, a presença de
possíveis astrócitos, os quais não são visualizados na SNCD (FIGURA 25A).
No RMI (FIGURA 24B) há aparentemente uma diminuição na marcação da SNc,
principalmente na camada dorsal, deixando mais claro a separação desta estrutura da SNR,
porém esse clareamento dificultou a distinção do que é SNCD e ml, o que pôde ser observado
com um maior aumento (FIGURA 26A). A SNCL aparece mais clara do que no RJ, o que
permite uma diferenciação mais evidente da SNR. nesta subdivisão também é possível
visualizar células, porém em menor quantidade do que o RJ e aparentemente apresentam um
tamanho menor (FIGURA 25B).
No RI (FIGURA 24C) há um aumento na intensidade da marcação em relação ao
RMI nas duas subdivisões e com isso, a marcação da SNCL apresenta-se com intensidade
próxima à da SNR, apesar disso a borda divisória entre as duas estruturas é evidente. As
células visualizadas na SNCL do RJ e RMI também foram observadas no idoso, em menor
quantidade em relação ao RJ e maior tomando por referência a mesma estrutura e nível do
RMI (FIGURA 25C).
A SNCD no idoso em nível rostral apresenta um aumento na marcação em relação ao
RMI, levando a uma maior nitidez na visualização do parcelamento dessas estruturas,
podendo ser identificado o limite preciso das bordas superior e inferior dessa subdivisão,
delimitando o seu contorno, diferenciando-a do ml e da SNR (FIGURA 26B).
63
FIGURA 24: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível rostral, com aumento de 4x evidenciando a SNR,
SNCD, SNCL de RJ (A), RMI (B) e RI (C). Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
64
FIGURA 25: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível rostral, com aumento de 10x, evidenciando a SNCL em
RJ (A), RMI (B) e RI (C). Nas imagens é possível perceber o parcelamento da estrutura em destaque, sendo que
há uma melhor nitidez no parcelamento da estrutura no RJ. Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
65
FIGURA 26: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível rostral, com imunohistoquímica para S100B, com
aumento de 10x, evidenciando a SNCD em RMI (A) e RI (B). Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
4.4.2 Nível Médio
No nível médio são visualizadas as quatro subdivisões da SNc. No geral, os cortes
apresentam marcação mais clara no RJ, intensa no RMI, voltando a diminuir a intensidade no
RI, mesmo assim, o idoso apresenta marcação mais intensa do que o jovem (FIGURA 27).
Nas três faixas etárias é possível perceber intensidades na marcação que variam de
acordo com a estrutura mesencefálica. São essas variações na marcação, em comparação com
o atlas Paxinos (FIGURA 9) e as imagens obtidas através de imunohistoquímica para TH
(FIGURA 8), que permitem identificar a SNc e todas as suas subdivisões.
A SNCL é a que mais se destaca neste nível, por apresentar marcação mais fraca do
que a SNR e melhor nitidez no seu parcelamento, seguido da SNCM, SNCV e SNCD
(FIGURA 28). No RJ (FIGURA 28A), além da marcação mais fraca do que a da SNR e o
66
contorno bem definido, observa-se a presença de inúmeras células fortemente marcadas,
possivelmente astrócitos, também visualizadas no RMI (FIGURA 28B) e RI (FIGURA 28C),
porém em menor quantidade do que no jovem.
A SNCM aparece menos marcada do que a SNCL nos três animais, no entanto assim
como visto anteriormente (FIGURA 12B), as demais faixas etárias não demonstraram a
presença de astrócitos nesta subdivisão. A identificação da área se deu pela localização
anatômica em comparação com o Paxinos e pela diferença na estrutura tecidual da região em
comparação com as áreas circunvizinhas. A intensidade da marcação seguiu a mesma
sequência da SNCL – mais intensa no RMI (FIGURA 27B), em seguida o RJ (FIGURA 27A)
e RI (FIGURA 27C), sendo que no RJ o parcelamento da estrutura aparece de forma mais
nítida.
A SNCV aparece inserida dentro da SNR e é a subdivisão que apresenta marcação
mais intensa neste nível, com intensidade semelhante à da região onde está imersa, tornando
difícil a sua identificação. O RJ (FIGURA 27A) é a que apresenta esta subdivisão em maior
evidência. Por apresentar marcação mais fraca do que a SNR, a estrutura é facilmente
visualizada. No RI (FIGURA 27C) a SNCV apresenta marcação mais intensado que o RJ,
porém o RMI (FIGURA 27B) tem marcação mais forte ainda nesta área, tanto que a
delimitação de o que é SNR e SNCV se torna praticamente impossível.
A SNCD apresenta-se dispersa neste nível, sem limites precisos, principalmente na
borda superior. Apesar disso, nas três imagens é possível visualizar a diferença entre a parte
reticulada e a camada dorsal da SNc. Tal como nas outras subdivisões no nível médio, o RMI
(FIGURA 27B) é o que apresenta a SNCD mais fortemente marcada, em seguida o RJ
(FIGURA 27A) e por último o RI (FIGURA 27C).
67
FIGURA 27: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível médio, com imunohistoquímica para S100B, com
aumento de 4x, evidenciando as subdivisões da SN em RJ (A), RMI (B) e RI (C). Barra 500µm. Ver lista de
abreviações.
68
FIGURA 28: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível médio, submetidos a imunohistoquímica para S100B,
com aumento de 10x, evidenciando a SNCL em RJ (A), RMI (B) e RI (C). Barra 500µm. Ver lista de
abreviações.
69
4.4.3 Nível Caudal
Em nível caudal a marcação da SNc parece ser mais intensa do que nos níveis
anteriores. Neste nível, SNCL e SNCV praticamente não se diferencia da SNR em intensidade
de marcação. Já a SNCM e SNCD se distinguem da SNR por apresentarem marcação mais
fraca, semelhante à do ml, fazendo com que em algumas imagens essas estruturas se
confundam (FIGURA 29). Uma visualização com um maior aumento é suficiente para
delimitar o parcelamento das subdivisões da SNc em nível caudal nas três faixas etárias
estudadas.
Neste nível a SNCL aparece pela primeira vez com marcação de intensidade bem
próxima à da SNR, o que dificulta a delimitação do seu parcelamento. No RJ (FIGURA 30A)
a estrutura é fortemente marcada, porém discretamente mais clara do que a SNR,
apresentando células em grande quantidade. A região se caracteriza também por apresentar
vários pontos sem pigmentação dispersos na estrutura, os quais formam o desenho exato da
SNCL (FIGURA 29A). Esses apagamentos não estão presentes no RMI, onde a SNCL torna-
se visível por estar ligeiramente mais clara do que a SNR e um pouco mais intensa do que o
cp, não sendo necessário um maior aumento para visualizar seu parcelamento (FIGURA
29B). No RI (FIGURA 30B) em nível caudal há uma diminuição na intensidade da marcação,
quando comparado ao RMI e RJ, sendo que a SNCL apresenta-se com marcação intensa, bem
próxima à da SNR, porém ligeiramente mais fraca (FIGURA 29C).
A SNCM é de difícil localização nos três animais representados, por ser uma área
pequena e estreita, com marcação que pode confundir-se com o ml, localizado logo
acima.com relação à intensidade da marcação, esta é mais forte no RMI, em seguida o RJ e o
RI. Acompanha então o mesmo padrão dos outros níveis. O parcelamento é mais evidente no
RMI, pois apresenta diferenças na marcação e nas fibras encontradas na região, em
comparação com as estruturas que a circundam (SNR e ml). No RI a estrutura está com
marcação extremamente fraca, no entanto é nítida a diferença estrutural entre a SNCM e o ml,
enquanto que no RJ a diferença entre o ml e a SNCM só é perceptível por se observar um
discreto apagamento longitudinal, que forma uma espécie de linha divisória entre as duas
estruturas (FIGURA 31).
70
FIGURA 29: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível caudal, com imunohistoquímica para S100B, com
aumento de 4x, evidenciando as subdivisões da SN em RJ (A), RMI (B) e RI (C). Barra 500µm. Ver lista de
abreviações.
71
FIGURA 30: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível caudal, submetidos a imunohistoquímica para S100B,
com aumento de 10x, evidenciando a SNCL em RJ (A) e RI (B). Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
A SNCV aparece com marcação intensa em todas as imagens selecionadas para este
nível, o que dificulta diferenciá-la da SNR. No RJ, apesar da intensa marcação, é possível
visualizar a camada ventral inserida na parte reticulada da SN, com uma marcação
ligeiramente mais fraca do que esta. No RMI a SNCV apresenta marcação mais intensa do
que o jovem, porém com característica heterogênea, apresentando várias manchas sem
pigmentação em toda a região. No RI esta subdivisão apresentou a marcação mais fraca
quando comparado ao RJ e o RMI no mesmo nível, mas vale salientar que na imagem, todas
as estruturas que aparecem no corte estão menos marcadas do que as demais (FIGURA 32).
A SNCD não apresenta boa nitidez no seu parcelamento neste nível nas três faixas
etárias estudadas. A intensidade da marcação nessa estrutura aparentemente diminui
gradativamente com o avançar da idade, sendo que no RJ o parcelamento é mais evidente.
Em uma visão mais geral, no nível caudal a marcação da SNc aumenta do jovem
para o de meia idade e diminui no rato idoso, fato que difere dos níveis apresentados
anteriormente. Quanto à nitidez de visualização das estruturas, em nível caudal o RJ é o que
apresenta parcelamento mais evidente na subdivisão da SNc.
72
FIGURA 31: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível caudal, submetidos a imunohistoquímica para S100B,
com aumento de 10x, evidenciando a SNCM em RJ (A), RMI (B) e RI (C). Barra 500µm. Ver lista de
abreviações.
73
FIGURA 32: Fotomicrografias de mesencéfalo em nível caudal, submetidos a imunohistoquímica para S100B,
com aumento de 10x, indicando a localização da SNCV, ligeiramente mais clara do que a SNR em RJ (A), RMI
(B) e RI (C). Barra 500µm. Ver lista de abreviações.
74
5 DISCUSSÃO
5.1 OBSERVAÇÕES GERAIS
Conforme já mencionado no decorrer do trabalho, a S100B foi descoberta há mais de
meio século e é um dos 25 membros de uma família de proteínas ligantes de cálcio, tendo
ainda muito a se conhecer sobre ela. Desempenha atividades dentro e fora das células, sendo
que intracelularmente é encontrada difusamente no citoplasma, associando-se a membranas e
alguns elementos do citoesqueleto, sendo os astrócitos as células encefálicas que mais
expressam S100B (Gross et al., 2014).
Os níveis encontram-se aumentados na astrogliose, bem como em distúrbios
cerebrais infecciosos/ inflamatórios e na própria fisiopatologia da degeneração (Brozz et al.,
2009). A proteína encontra-se em níveis elevados em diversas patologias do SNC e algumas
associadas ao envelhecimento. O gene que abriga essa proteína está localizado no
cromossomo 21, o qual é em parte triplicado no Alzheimer e em consequência a patologia
apresenta uma maior expressão da proteína. Pacientes com Síndrome de Down também
apresentam expressão aumentada de S100B e por coincidência, apresentam tendência para o
desenvolvimento precoce do Alzheimer (Shappiro et al., 2010).
O Parkinson é outra doença associada ao envelhecimento. Trata-se de uma desordem
neurodegenerativa comum caracterizada pela perda dos neurônios dopaminérgicos da SN e
suas projeções estriatais. O diagnóstico ocorre após uma perda de 50% dos neurônios
dopaminérgicos da SN (Fricke et al., 2016), em especial os que contém neuromelanina na SN,
causando os sintomas motores característicos da patologia (Muñoz et al., 2012). Os neurônios
dopaminérgicos do mesencéfalo estão envolvidos em diversos tipos de comportamento,
doenças psiquiátricas e neurológicas, como a Doença de Parkinson, abuso de drogas e
esquizofrenia (German e Manaye, 1993). Todas essas desordens estão associadas também a
níveis elevados da Proteína S100B, conforme exposto no decorrer do referencial teórico.
Na Doença de Parkinson e epilepsia os astrócitos contribuem no disparo das reações
rítmicas anormais presentes nas duas patologias. Essas células, quando ativadas, regulam o
Ca2+
externo para desencadear o rompimento, através do qual libera a proteína S100B
(Morquette et al., 2015).
Em uma pesquisa realizada com humanos e camundongos, foi observado um
aumento considerável da expressão de S100B na região da SNc de humanos com DP post
75
mortem, em relação ao grupo controle. Já os animais, uma parte foi submetida a um
tratamento com MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina), uma toxina que induz ao
Parkinson, durante 5 dias consecutivos. Esses animais foram sacrificados imediatamente ao
témino e após 2, 4, 7, 14 e 21 dias de tratamento. No estudo foi observado que a expressão da
S100B na SNc estava aumentada nos animais sacrificados imediatamente após o tratamento,
diminuindo gradativamente com o passar dos dias, até voltar a níveis basais, comparado ao
controle, sugerindo que a S100B pode ter relação com a patogênese da doença, ou atuar como
marcador desta (Sathe et al., 2012).
Em um mapeamento neuroanatômico realizado em ratos jovens de 60 dias em
condições fisiológicas foram descritas as regiões/áreas ou estruturas encefálicas que
expressam S100B em condições fisiológicas e patológicas. De acordo com o estudo, a SN não
apresenta células que expressam S100B na SN em condições fisiológicas. Nesse estudo foi
considerada a SN como um todo, sem fazer menção à parte reticulada e à compacta, bem
como não houve distinção entre níveis rostral e caudal, pois a pesquisa não era restrita a uma
área cerebral específica, e sim com o objetivo de fazer um mapeamento geral (Campos et al.,
2015).
Vale ressaltar a necessidade de deixar explícito na pesquisa se o estudo se refere à
SNc ou SNR, pois apresentam citoarquitetura e funções distintas. A parte compacta apresenta
neurônios pigmentados, denominados neuromelanina, que tem a dopamina como seu principal
neurotransmissor e apresenta fibras nigroestriatais tanto aferentes como eferentes, enquanto
que a parte reticulada possui poucos neurônios com neuromelanina e utiliza-se de
neurotransmissores gabaérgicos inibitórios (Coelho et al., 2016).
Em 1986, Boyes e colaboradores utilizaram ratos wistar machos, com peso entre
175-200g para pesquisar a co-localização imunohistoquímica para S100B e GFAP em
encéfalo de ratos. Na pesquisa observaram que na SNR, em condições fisiológicas a dupla
imunofluorescência (S100B e GFAP) as células imunorreativas compartilhavam o mesmo
padrão de distribuição e morfologia semelhante. Não foi mencionado marcação na SNc
(Boyes et al., 1986). Apesar de não ser a área escolhida para a nossa pesquisa, foi observado
que a SNR destacou-se em todas as imagens obtidas por apresentar intensa marcação para
S100B, em relação a outras estruturas mesencefálicas, como o cp, ml e à própria SNc.
Em um estudo para caracterização da SN humana durante o envelhecimento, notou-
se que há uma tendência a diminuição no volume da estrutura da SNc de acordo com o
avançar da idade dos indivíduos, mas não foi encontrada diminuição neuronal significativa
relacionada ao envelhecimento. A pesquisa enfatiza que ainda há muito a se descobrir no
76
processo de envelhecimento da SNc. Divergências na literatura, no que diz respeito às
subdivisões e a morfologia neuronal, dificultam a caracterização das alterações sofridas ao
longo da vida; além disso, as disparidades encontradas nos estudos da SN podem ser
atribuídas a inúmeros fatores, tais como diferentes processos de coloração e processamento
dos cortes, bem como diferenças no delineamento da região e também em relação à linhagem
estudada (Alho, 2011).
Esta pesquisa se propôs a analisar a expressão da proteína S100B na SNc durante o
envelhecimento. A partir do levantamento de material bibliográfico verificamos alguns
estudos que abordam a expressão da proteína S100B na SNc, apresentam resultados que
muitas vezes não corroboram com os encontrados na nossa pesquisa.
Em seres humanos os níveis séricos estão aumentados no recém-nascido, estabilizam
na vida adulta e voltam a aumentar no envelhecimento, perfil também observado em roedores.
Essa variação nos níveis de S100B no envelhecimento está relacionada a eventos
neuropatológicos proinflamatórios, incluindo isquemia, trauma e infecções relacionadas ao
tempo de vida (Shapiro et al., 2010). Essas variações foram observadas com clareza na nossa
abordagem comparativa em nível rostral, onde foi visto que a marcação por S100B é intensa
no RJ, enfraquece no RMI e volta a intensificar no RI.
Um marcador bastante utilizado em estudos dos núcleos dopaminérgicos do
mesencéfalo é o TH (Cavalcanti et al., 2014). Nesta pesquisa foi imprescindível realizar
paralelamente as imunohistoquímicas para S100B e TH, tendo em vista que com os neurônios
dopaminérgicos da SNc bem marcados pela TH, a delimitação da área da SNc com
imunohistoquímica para S100B ficou mais evidente.
No nosso estudo verificamos que a SNc apresenta marcação a partir de
imunohistoquímica para S100B e essa marcação varia em intensidade de acordo com a
subdivisão, nível e idade dos animais. No estudo de Campos et al. (2015), os animais
utilizados estavam com 2 meses e a equipe se propôs a fazer um mapeamento da S100B no
encéfalo, enquanto que no nosso estudo consideramos jovens os ratos com 3 meses de vida e
teve apenas uma estrutura em foco, a SNc, o que favoreceu um olhar mais aprofundado,
permitindo que fosse visualizada as particularidades na marcação por S100B na região.
Analisando os grupos separadamente, observamos padrões distintos de marcação em
cada faixa etária: no RJ a marcação é intensa no nível rostral, diminui no nível médio e volta a
aumentar no nível caudal, mas ainda assim este apresenta marcação mais fraca do que no
primeiro. No RMI há um aumento progressivo na intensidade da marcação na SNc no sentido
rostro-caudal, enquanto que no RI há visualmente uma diminuição progressiva na marcação
77
da SNc no mesmo sentido.
Durante anos os núcleos A8, A9 e A10 foram classificados em três vias distintas –
mesoestriatal, mesolímbico e mesocortical e acreditava-se que suas projeções eram formadas
por grupos homogêneos de neurônios. Pesquisas mais recentes apontam para uma nova
compreensão, demonstrando subdivisões nesses núcleos e características diferentes para cada
subunidade (Cavalcanti et al., 2016).
A S100B demonstrou ser um marcador que pode contribuir com estudos
citoarquitetônicos, por ter se revelado um excelente parcelador das estruturas, não só da SNc,
mas de outras regiões, através das diferentes intensidades de marcação, principalmente em
ratos jovens, que apresentaram parcelamento mais evidente, mostrando em detalhes a
delimitação citoarquitetônica não só da SNc e suas subdivisões, mas também de outras
estruturas visualizadas nas imagens, como a SNR, cp, ml, entre outras.
Essa visualização das subdivisões através da imunohistoquímica para S100B reforça
a ideia de que os neurônios e tipo de glia encontrados nessa região não são homogêneos, o
que sugere que cada uma das subdivisões da SNc pode ter funções diferentes.
Quanto à visualização de células, possivelmente astrócitos, estes apareceram mais na
SNCL, em todos os níveis, das três faixas etárias estudadas. São perceptíveis as variações na
quantidade de células dependendo do nível e da idade. Durante o envelhecimento as células
do SNC sofrem diversas alterações funcionais, que variam de acordo com os danos no
estresse oxidativo ao longo do tempo (Nissen, 2017). A SNCL também foi a que permaneceu
com parcelamento nítido em todos os níveis de todas as faixas etárias estudadas.
Essas células também foram visualizadas na SNCV nos níveis médio e caudal nas
faixas etárias estudadas, porém é uma subdivisão de difícil delimitação por apresentar
marcação intensa, semelhante à da SNR, onde está inserida. A SNCM e SNCD não
apresentaram astrócitos em nenhuma das imagens capturadas. A camada lateral da SNc foi
relatada nos primeiros estudos de subdivisão da SN, onde Bauer (1909) e Sano (1910)
relataram três subdivisões da SN: a pars compacta, pars reticulata e pars lateralis (Alho,
2011). Outra particularidade da camada lateral da SNc é que no processo de
neurodegeneração, ela é a primeira a sofrer danos, seguindo para a SNCM, SNCV e SNCD,
padrão associado à diminuição dos transportadores da dopamina (Pereira et al., 2007) e
padrão observado também no nosso estudo, quanto à nitidez do parcelamento, pois é mais
evidente na SNCL e na sequência SNCM, SNCV e por último a SNCD, a qual segundo alguns
autores, é mal demarcada em sua borda dorsal, composta por células que não se agrupam e se
entremeiam com as perirubrais (Braak e Braak, 1986).
78
Em análise visual comparativa por nível – rostral, médio e caudal, verificamos que o
nível rostral é o único que segue o padrão descrito na literatura, estando intensa nos jovens,
diminuindo a intensidade nos RMI, tornando a aumentar no idoso, porém este menos marcado
do que o RJ. No nível médio a marcação é fraca no RJ, ficando mais intensa no RMI e torna-
se mais fraca no RI, porém ainda mais forte do que o RJ. Já na porção caudal a intensidade de
marcação na SNc aumenta no RMI em relação ao RJ, e diminui no RI, que apresenta a
marcação mais fraca neste nível, o que difere dos níveis rostral e caudal.
Isso talvez possa ser explicado pelo fato de que as alterações na expressão da S100B
no envelhecimento estão relacionadas não somente ao tempo de vida, mas também a eventos
individuais, como isquemias, traumas, infecções e diversos estressores ambientais podem
alterar a distribuição celular e tecidual da proteína no encéfalo (Shapiro et al., 2010). Os
animais utilizados no experimento não foram submetidos a estresses. Foram cuidados em
condições fisiológicas e talvez por esse fator individual da expressão da S100B, nesta
pesquisa observou-se que as alterações na intensidade da marcação não apresentam um
padrão específico relacionado ao envelhecimento.
A SNc apresenta marcação mais fraca em todas as suas subdivisões, em comparação
à parte reticulada, fato que se observa em todos os níveis nas diferentes faixas etárias dos
animais envolvidos na pesquisa. Tomando como base o cp, que aparece em destaque por
apresentar marcação ausente ou nula, comparando as imagens obtidas às figuras
correspondentes no atlas Paxinos e Watson (2007) e aos cortes com imunohistoquímica para
TH, de onde aparecem com marcação intensa os neurônios dopaminérgicos da SNc, podemos
afirmar que a S100B é expressa na SNc em todas as subdivisões em nível rostral, médio e
caudal de ratos jovens, de meia idade e idosos.
Os estudos de marcação nas células dopaminérgicas do mesencéfalo tem baseado a
subdivisão anatômica e morfológica da SN (Damier et al., 1999). A S100B apresentou-se
como um marcador menos eficiente para estudos relacionados à morfologia celular da SNc,
quando comparado ao TH ou mesmo a outras proteínas ligantes de Ca2+
não elencadas neste
estudo. Todavia, outras áreas apresentaram uma excelente marcação (ex.: PAG e SNR), o que
garante confiabilidade para estudos específicos dessas regiões. Com essa informação, podem
ser feitos estudos de dupla marcação com S100B e TH para delimitar a área da SNc através e
estudar a citoarquitetura e populações neuronais existentes em cada uma de suas subdivisões.
79
6 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos nesta pesquisa, é possível concluir que:
1. A SNc apresenta marcação a partir de imunohistoquímica para S100B e essa marcação
varia em intensidade de acordo com a subdivisão, nível e idade dos animais.
2. As alterações na intensidade da marcação não apresentam um padrão específico relacionado
ao envelhecimento.
3. A S100B apresentou-se como um marcador não confiável para estudos relacionados à
morfologia celular da SNc, quando comparado ao TH ou mesmo a outras proteínas ligantes de
Cálcio não elencadas neste estudo. Todavia, outras áreas apresentaram uma excelente
marcação (ex.: PAG, SNR), o que garante confiabilidade para estudos específicos dessas
regiões.
4. A S100B demonstrou ser um marcador que pode contribuir com estudos citoarquitetônicos,
por ter se revelado um excelente parcelador das estruturas, não só da SNc, mas de outras
regiões, através das diferentes intensidades de marcação, principalmente em ratos jovens.
80
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